CN112351991A - 肉毒杆菌毒素细胞结合结构域多肽及其用于治疗纤维化相关障碍的方法 - Google Patents

肉毒杆菌毒素细胞结合结构域多肽及其用于治疗纤维化相关障碍的方法 Download PDF

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Abstract

描述了具有对应于肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列的多肽。所述多肽调节例如胶原蛋白产生和细胞外基质组织涉及的基因的表达，并因此在治疗或减少疾病，诸如ECM的疾病、结缔或上皮组织疾病、内皮疾病或纤维化疾病(例如ECM、结缔组织或内皮的纤维化疾病)的发生中发现用途。进一步描述了编码所述多肽的核酸，以及包含所述核酸的载体、宿主细胞和系统。

Description

肉毒杆菌毒素细胞结合结构域多肽及其用于治疗纤维化相关 障碍的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月20日提交的美国临时申请号62/608,119和2018年9月6日提交的美国临时申请号62/727,640的权益，其全部内容通过引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且所述序列表以引用的方式全文并入本文。所述ASCII副本创建于2018年12月19日，命名为19980-US-A-NTB_SL.txt，大小为71,997字节。
技术领域
本公开内容总体上涉及来自肉毒杆菌毒素的细胞结合结构域的多肽以及所述多肽在治疗应用中的用途，包括与纤维化相关的疾病和病况。
背景技术
厌氧的革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生有效的多肽神经毒素——肉毒杆菌毒素(BoNT)，其具有充分记录的医疗应用。天然存在的梭菌毒素均被解释为是约50kDa包含酶促结构域的轻链(LC)和约100kDa包含N端易位结构域(HN)和C端受体结合结构域(HC)的重链的约150千道尔顿(kDa)的单链多肽。因此，全长梭菌毒素分子包含三个功能不同的结构域：(1)位于LC中的酶促结构域，其包含含有锌依赖性内肽酶的金属蛋白酶区域，其特异性地靶向神经递质释放机构的核心组分；(2)重链的氨基端一半(HN)内含有的易位结构域，其促进LC从细胞内囊泡释放到靶细胞的细胞质中；以及(3)存在于重链的羧基端一半(HC)内的结合结构域，其确定毒素与位于靶细胞表面的受体的结合亲和力和特异性。结合结构域包含两个大小大致相等的不同结构特征，称为N端亚域(HCN)和C端亚域(HCC)。
这种毒素构造存在于各种免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素中，例如，肉毒杆菌神经毒素A、B、C1、D、DC、E、F、G、X和J血清型。无论何种血清型，全长150kDa毒素蛋白以及其中的单个结构域之间存在着显著程度的结构和功能同源性。就这一点而言，BoNTs彼此具有约35％氨基酸同一性，并且具有相同功能结构域组织和整体结构构造。在每个类型的梭菌毒素内，也有一些其氨基酸序列略有不同的亚型。然而，各种结构域(例如内肽酶、易位和细胞结合结构域)的结构域构造在单个亚型中也是保守的。例如，目前有五个BoNT/A亚型，BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，其具有约89％的整体氨基酸同一性。例如，就氨基酸序列同一性而言，超家族的其它成员，例如由破伤风梭菌(C.tetani)的统一群产生的破伤风毒素(TeNT)以及由梭菌属种产生的其它相关毒素，如BaNT(由巴氏梭菌(C.baratii)产生)和BuNT(由丁酸梭菌(Cbutyricum)产生)，在结构上也类似于上述梭菌毒素(例如BoNT/F和BoNT/E)。
现有的药物制剂含有全长梭菌毒素。需要具有与全长相当的生物活性(如果不是更好的话)同时提供改善的治疗特性的梭菌毒素片段和变体，所述改善的治疗特性例如，与整个梭菌毒素相比改善的安全性、增强的稳定性和/或更好的体内功效。
发明内容
本文描述了本公开内容的BoNT多肽的各种治疗应用。例如，用含有BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽、其片段或变体处理调节了正常人原代成纤维细胞中许多基因的表达。例如，用本公开内容的多肽处理正常人原代成纤维细胞引起基质金属蛋白酶MMP1和MMP3以及金属蛋白酶抑制剂TIMP1(它们与细胞外基质(ECM)的分解和重塑有关)的上调，并且引起S100钙结合蛋白A4(S100A4)(其为一种已知的纤维化标志物和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的诱导物)的下调和α-SMA/ACTA2(肌动蛋白，α-2，平滑肌，主动脉；其已知与成纤维细胞收缩性和成肌纤维细胞形成相关)的下调。这些观察结果表明，本公开内容的多肽影响与创建、维持和修复真皮细胞外基质(ECM)有关的蛋白质的表达，例如通过去除过量或损害的ECM组分。由于瘢痕和纤维化的形成与ECM组分的异常产生相关，因此数据表明本公开内容的多肽具有抗瘢痕和抗纤维化作用。用BoNT/A的结合结构域(HC/A)处理还引起基于qPCR的18种成纤维细胞基因的表达中显著的剂量依赖性变化。值得注意的是，已知与组织和ECM体内平衡、重塑、更新和修复有关的基因的表达增加，而与纤维化相关的两种基因的表达减少。
另外，用本公开内容的多肽处理减少了来自原代真皮瘢痕衍生的成纤维细胞(primary dermal scar derived fibroblasts)的成熟胶原纤维的前体的前胶原肽的分泌，表明所述多肽影响胶原蛋白(其为真皮细胞外基质(ECM)的主要组分)的产生。由于瘢痕和纤维化的形成与胶原蛋白的异常产生相关，因此这些观察结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽具有抗瘢痕和抗纤维化作用。在该研究中，该作用与抗CTGF和抗TGFβ抗体(两种已知的抗纤维化剂)的作用相似或更高，表明本公开内容的多肽具有相似或额外的抗纤维化作用。
在纤维蛋白水凝胶测定中，用本公开内容的多肽(例如BoNT/A(HC/A))进行处理降低了原代真皮疙瘩瘢痕衍生的成纤维细胞收缩性。成纤维细胞收缩性与成纤维细胞向成肌纤维细胞的转变和瘢痕形成相关，例如当成纤维细胞收缩以愈合伤口或转化现有的瘢痕时。因此观察数据表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽可抑制收缩性并减少患者伤口愈合期间的瘢痕形成。
本公开内容的多肽，例如BoNT/A(HC/A)，影响来自纤维化上皮人乳腺癌细胞的许多蛋白质的分泌，其中纤维化通过缺氧诱导，例如，纤连蛋白、胶原蛋白IV和真皮ECM的关键结构组分的血小板反应蛋白1的分泌减少，以及与创建、维持和修复真皮ECM有关的MMP1和TIMP1、金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂蛋白的分泌增加，例如通过降解过量或损害的ECM组分。由于瘢痕和纤维化的形成与胶原蛋白和其它ECM组分的异常产生相关，因此这些观察结果表明本公开内容的多肽或其片段(例如，N端一半(HCN))具有抗瘢痕和抗纤维化作用。该作用与抗CTGF(FG-3019)抗体(一种已知的抗纤维化剂)的作用相似或比其更高。数据表明本公开内容的多肽(例如BoNT/A(HC/A))或其片段(例如BoNT/A(HCN/A))在减少缺氧诱导的纤维化(例如组织和器官的纤维化以及人类患者的瘢痕)中使用使得例如组织和器官纤维化得以抑制或逆转以及视觉瘢痕减少。特别地，在用疙瘩成纤维细胞进行的实验中，数据表明，本公开内容的多肽(例如BoNT/A(HC/A))或其片段(例如BoNT/A(HCN/A))调节来自人疙瘩瘢痕成纤维细胞(KF116R)的纤连蛋白(其为真皮ECM的关键组分和瘢痕和纤维化形成中的介体)的分泌。
另外的研究表明，本公开内容的多肽(例如BoNT/A(HC/A))，降低了来自正常人原代成纤维细胞(HDFa)的蛋白质(包括胶原蛋白和乳铁蛋白)的分泌，来自正常人原代成纤维细胞(HDFa)的蛋白质已被证明增加成纤维细胞收缩性。由于瘢痕和纤维化的形成与胶原蛋白的异常产生和增加的收缩性相关，因此这表明本公开内容的多肽具有抗瘢痕和抗纤维化作用。
对BoNT/DC(HC/DC)的并行研究显示了相似结果。例如，HC/DC处理调节了人瘢痕衍生的原代成纤维细胞中许多基因的表达，包括MMP1和MMP3以及金属蛋白酶抑制剂TIMP1(它们与细胞外基质的分解和重塑有关)的上调，以及结缔组织生长因子(CTGF；其为一种已知的纤维化标志物)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA/ACTA2；其与成纤维细胞收缩性和成肌纤维细胞形成的标志物相关)的下调。发现HC/DC相对于HCN/A在调节某些基因表达方面更有效，表明不同的BoNT血清型具有不同的作用。这些发现表明，其它另外的BoNT血清型可以类似于BoNT/A(HC/A)和BoNT/DC(HC/DC)的模式影响纤维化。
本公开内容涉及以下非限制性实施方案：
在一方面，描述了包含梭菌毒素(诸如肉毒杆菌毒素)的结合结构域序列的多肽和多核苷酸序列以及包含此类多肽或多核苷酸的组合物。在一个实施方案中，描述了参与细胞信号传导和/或调节靶细胞中的细胞基因表达以缓解或减少与细胞外基质(ECM)异常相关的病况或障碍的发生的多肽序列。在一个实施方案中，描述了通过例如上调参与ECM组织、修复、更新的基因(诸如例如MMP1(基质金属蛋白酶1)、MMP3(基质金属蛋白酶3)、TIMP1(金属肽酶抑制剂1))的表达来修复ECM的多肽序列。在另一个实施方案中，所述多肽序列通过例如下调与成纤维细胞收缩性、成肌纤维细胞形成和/或瘢痕形成相关的蛋白质的表达和/或分泌来缓解或减少纤维化障碍的发生。
在另一方面，提供了一种包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有在约1kDa至约90kDa之间的分子量。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约4kDa至约60kD之间。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约12kDa至约50kD之间。
在另一方面，所述提供了一种包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有在约1kDa至约90kDa之间的分子量。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约4kDa至约60kD之间。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约12kDa至约50kD之间。
在一些实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链的羧基或C端区段(HC)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的N端一半相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素选自：肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)、肉毒杆菌毒素B血清型(BoNT/B)、肉毒杆菌毒素C1血清型(BoNT/C1)、肉毒杆菌毒素D血清型(BoNT/D)、肉毒杆菌毒素E血清型(BoNT/E)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/F)、肉毒杆菌毒素G血清型(BoNT/G)、肉毒杆菌毒素H血清型(BoNT/H)、肉毒杆菌毒素X血清型(BoNT/X)、肠球菌属种(Enterococcus sp.)肉毒杆菌毒素J(eBoNT/J)、以及嵌合肉毒杆菌毒素和/或其变体。嵌合毒素的实例包括BoNT/DC、BoNT/CD和BoNT/FA。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素不是肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)。
在一些实施方案中，所述多肽能够调节纤维化相关蛋白的表达。在一个实施方案中，所述多肽能够或减少靶细胞中纤维化相关蛋白，诸如例如S100A4(S100钙结合蛋白A4)和ACTA2(肌动蛋白，α2，平滑肌，主动脉)。在替代的实施方案中，所述多肽能够或增加纤维化相关蛋白的表达。在一些实施方案中，所述靶细胞为成纤维细胞、瘢痕衍生的成纤维细胞、疙瘩瘢痕衍生的成纤维细胞、肥厚性瘢痕衍生的成纤维细胞、纤维化细胞、抵消细胞和成肌纤维细胞。
在一些实施方案中，所述多肽能够调节参与ECM组织、修复、更新和/或重塑的细胞外基质蛋白的表达。在其他实施方案中，所述多肽能够调节选自FGFR1(成纤维细胞生长因子受体1)、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7(成纤维细胞生长因子7)、TP63(肿瘤蛋白p63)、SOD2(超氧化物歧化酶2，线粒体)、UBD(泛素D)、HAS2、HAS3(透明质酸合酶)、ADAMTS1(具有血小板反应蛋白基序1的解联蛋白和金属蛋白酶)、IGF-1(胰岛素样生长因子1)、IL-6、IL-32(白介素)、CCL2(趋化因子(C-C基序)配体2)、BDKRB1(缓激肽受体B1)、S1000A4和ACTA2的基因的遗传特征的表达。
在一些实施方案中，所述多肽能够调节靶细胞中的选自FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7和TP63的基因。在一些实施方案中，所述靶细胞包括纤维化细胞、瘢痕衍生的成纤维细胞。
在其它实施方案中，所述多肽能够调节由靶细胞分泌的前胶原肽。在一些实施方案中，所述多肽能够减少胶原蛋白和/或参与促进靶细胞收缩性的蛋白质的表达和/或分泌。在一些实施方案中，所述靶细胞包括正常成纤维细胞、瘢痕衍生的成纤维细胞、纤维化细胞、纤维化癌细胞或其组合。
在另一个实施方案中，所述多肽能够减少靶细胞(诸如例如真皮瘢痕成纤维细胞)的收缩性，由此减少靶细胞的瘢痕形成。
在另一个实施方案中，所述多肽能够调节来自靶细胞的纤维化相关蛋白的表达。在一些实施方案中，所述纤维化相关蛋白选自纤连蛋白、胶原蛋白、乳铁蛋白、血小板反应蛋白1、MMP1、MMP3和TIMP1。在一个实施方案中，所述靶细胞选自成纤维细胞、瘢痕衍生的成纤维细胞、纤维化细胞和癌细胞。在一些实施方案中，所述多肽能够减少纤连蛋白、胶原蛋白、血小板反应蛋白1和乳铁蛋白的产生和/或分泌。在其他实施方案中，所述多肽能够增加MMP1、TIMP1的产生和/或分泌。
在另一个实施方案中，所述多肽缺乏肉毒杆菌毒素内肽酶活性。
在又一个实施方案中，所述多肽缺乏肉毒杆菌毒素易位活性。在一个实施方案中，所述多肽缺乏与肉毒杆菌毒素的重链的氨基端(HN)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在又一个实施方案中，所述多肽由与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列组成。
在又一个实施方案中，所述多肽包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21和SEQID NO：12-18的序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％同源性的氨基酸序列。
在再一个实施方案中，所述多肽与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21和SEQ IDNO：12-18的序列具有至少约90％序列同一性。
在再一个实施方案中，所述多肽基本上由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21和SEQID NO：12-18中列出的多肽序列组成。
在一些实施方案中，所述多肽包括以下列出的多肽序列、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：12-18，条件是所述多肽含有多肽序列中的1、2、3、4或5个突变。优选地，所述突变多肽含有SEQ ID NO：1的多肽序列中的1、2、3、4或5个突变，例如，突变多肽包括以下列出的多肽序列、基本上由其组成或由其组成：SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27。
在另一方面，提供了一种包含本文所述的多肽的融合蛋白。
在另一方面，提供了一种包含如本文所述的多肽或融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一个实施方案中，将所述药物组合物配制成用于局部或透皮施用。
在再一方面，描述了一种包括如本文所述的多肽或融合蛋白的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括施用说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包括一个或多个包装。
在再一方面，提供了一种缓解和/或减少与细胞外基质(ECM)异常；ECM疾病；结缔或上皮组织疾病；内皮疾病；和纤维化疾病；优选地纤维化疾病；以及特别是ECM、结缔或上皮组织或内皮组织的纤维化疾病相关的病况或障碍的发生的方法。
在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，调节皮肤质量属性不涉及面部肌肉的麻痹。在一些实施方案中，所述肉毒杆菌毒素选自：肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)、肉毒杆菌毒素B血清型(BoNT/B)、肉毒杆菌毒素C1血清型(BoNT/C1)、肉毒杆菌毒素D血清型(BoNT/D)、肉毒杆菌毒素E血清型(BoNT/E)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/F)、肉毒杆菌毒素G血清型(BoNT/G)、肉毒杆菌毒素H血清型(BoNT/H)、肉毒杆菌毒素X血清型(BoNT/X)、肠球菌属种肉毒杆菌毒素J(eBoNT/J)、以及嵌合肉毒杆菌毒素和/或其变体。嵌合毒素的实例包括BoNT/DC、BoNT/CD和BoNT/FA。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素不是肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)。
在又一方面，提供了一种用于缓解和/或减少有需要的受试者中纤维化障碍的发生的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的N端一半(HCN)具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，治疗或减少与ECM异常相关的病况或障碍的发生不涉及目标肌肉的麻痹。
在一个实施方案中，所述纤维化障碍选自特发性肺纤维化、肾纤维化、肾小球硬化、眼纤维化、骨关节炎、硬皮病、心脏纤维化和肝纤维化。纤维化可以发生在任何器官或组织中，包括选自但不限于肾脏、眼睛、肺、肝脏、心脏和皮肤的器官；或选自但不限于结缔、上皮和内皮组织的组织。结缔组织包括但不限于成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。
在一些实施方案中，提供了一种用于治疗、缓解和/或减少有需要的受试者中瘢痕的发生的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的N端一半(HCN)具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，治疗或减少与ECM异常相关的病况或障碍的发生不涉及目标肌肉的麻痹。
在一些实施方案中，所述瘢痕选自真皮瘢痕，诸如例如肥厚性、疙瘩、萎缩性、妊娠纹、包膜挛缩和脐带瘢痕、伤口瘢痕、手术瘢痕，诸如例如由剖宫产、腹部整形、隆胸、腹部手术、整容或注射填充剂后引起的瘢痕。
在一些实施方案中，提供了一种用于治疗或减少有需要的受试者中与结缔、上皮或内皮组织有关的纤维化障碍的发生的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的N端一半(HCN)具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，治疗或减少与ECM异常相关的病况或障碍的发生不涉及目标肌肉的麻痹。
在一些实施方案中，与结缔或上皮或内皮组织成纤维细胞相关的疾病或障碍包括真皮瘢痕(肥厚性、疙瘩、萎缩性(例如痤疮)、妊娠纹和脐带)、伤口瘢痕、手术瘢痕(例如剖宫产、腹部整形、隆胸、腹部手术、整容或注射填充剂后)、术后腹腔粘连、纤维瘤、肝纤维化、肝硬化、胰腺炎、良性前列腺增生、纤维性膀胱、间质性膀胱炎、肺纤维化、肾纤维化、肾小球硬化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、胶质瘢痕、动脉硬化、关节纤维化、囊性纤维化、非囊性纤维化、克罗恩病(Crohn′s disease)、杜普伊特伦氏挛缩(Dupuytren′s contracture)、纵隔纤维化、骨髓纤维化、佩罗尼氏病(Peyronie′s disease)、肾源性系统性纤维化、进行性大块纤维化、腹膜后纤维化、粘连性关节囊炎、混合结缔组织病、眼纤维化、骨关节炎、硬皮病、哮喘和眼纤维化相关病况。纤维化可以发生在任何器官或组织中，包括选自但不限于肾脏、眼睛、肺、肝脏、心脏和皮肤的器官；或选自但不限于结缔、上皮和内皮组织的组织。
在其它实施方案中，将所述组合物配制用于局部、透皮或皮内施用。
在一个实施方案中，用于任何方法中的多肽与选自SEQ ID NO：1、19、3-18和25-27的序列具有至少约90％序列同一性。
在其它方面，提供了一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
在其它方面，提供了一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
在其它方面，提供了一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量大于1kDa但小于15kDa；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量大于1kDa但小于15kDa；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量大于1kDa但小于15kDa；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
在另又一方面，提供了一种多核苷酸，其与SEQ ID NO：2的多核苷酸序列或编码选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：12-18和SEQ ID NO：25-27的多肽的核酸或其简并物或其RNA等同物具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或更高的％序列同一性。
在再一个实施方案中，所述多核苷酸基本上由SEQ ID NO：2中列出的核酸序列或其简并物或其RNA等同物组成。
在另一方面，提供了一种包含如本文所述的多核苷酸的载体。在其它方面，提供了一种包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞不是肉毒梭菌。
在其它方面，提供了试剂盒、组合物以及使用所述试剂盒和组合物的方法。在一个实施方案中，提供了一种在一个或多个包装中包括载体和用于在合适的宿主细胞中表达多核苷酸的说明书的试剂盒。在另一个实施方案中，提供了包含载体或宿主细胞和药用赋形剂的组合物。在又一个实施方案中，提供了一种治疗和/或减少纤维化障碍的发生的方法，所述方法包括给受试者施用包含载体或宿主细胞的组合物以实现多肽的表达。在又一个实施方案中，提供了一种用于治疗和/或减少瘢痕的发生的方法，所述方法包括给受试者施用包含载体或宿主细胞的组合物以实现多肽的表达。
序列的简述
SEQ ID NO：1是BoNT/A1的细胞结合结构域(HC/A)的氨基酸序列：
Figure BDA0002640530420000121
Figure BDA0002640530420000131
SEQ ID NO：19是进一步包含N端组氨酸标签(组成N端标签的氨基酸标有下划线)的BoNT/A1的细胞结合结构域(HC/A)的氨基酸序列：
Figure BDA0002640530420000132
SEQ ID NO：2是BoNT/A1的细胞结合结构域(HC/A)的DNA序列：
Figure BDA0002640530420000133
Figure BDA0002640530420000141
SEQ ID NO：3是BoNT/B、HC/B的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号BAE48264)：
Figure BDA0002640530420000142
SEQ ID NO：4是BoNT/C、HC/C的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号P18640)：
Figure BDA0002640530420000143
Figure BDA0002640530420000151
SEQ ID NO：5是BoNT/D、HC/D的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号P19321)：
Figure BDA0002640530420000152
SEQ ID NO：6是BoNT/DC、HC/DC的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号EF378947)：
Figure BDA0002640530420000153
SEQ ID NO：20是进一步包含N端组氨酸标签(组成N端标签的氨基酸标有下划线)的BoNT/DC的重链内的结合结构城区域的氨基酸序列(GENBANK登录号EF378947)：
Figure BDA0002640530420000154
Figure BDA0002640530420000161
SEQ ID NO：7是BoNT/E、HC/E的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号AFV91344)：
Figure BDA0002640530420000162
SEQ ID NO：8是BoNT/F、HC/F的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号ABS41202)：
Figure BDA0002640530420000163
Figure BDA0002640530420000171
SEQ ID NO：9是BoNT/G、HC/G的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号X74162)：
Figure BDA0002640530420000172
SEQ ID NO：10是BoNT/X、HC/X的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号BAQ12790)：
Figure BDA0002640530420000173
SEQ ID NO：11是对应于BoNT/A1的细胞结合结构域的氨基酸序列的1-218个残基的氨基酸序列，称为细胞结合结构域的N端片段，缩写为HCN/A(PDB ID：3BTA，4JRA)：
Figure BDA0002640530420000174
Figure BDA0002640530420000181
SEQ ID NO：21是包括N端组氨酸标签和BoNT/A1的细胞结合结构域(HC/A)的氨基酸序列的1-218个残基的氨基酸序列(组成N端标签的氨基酸标有下划线)：
Figure BDA0002640530420000182
SEQ ID NO：12是来自BoNT/B、HCN/B(PDB ID：2NM1)的结合结构域的N端区域的氨基酸序列：
Figure BDA0002640530420000183
SEQ ID NO：13是来自BoNT/C、HCN/C(PDB ID：3R4U)的结合结构域的N端区域的氨基酸序列
Figure BDA0002640530420000184
SEQ ID NO：14是来自BoNT/D、HCN/D(PDB ID：3N7J)的结合结构域的N端区域的氨基酸序列：
Figure BDA0002640530420000185
Figure BDA0002640530420000191
SEQ ID NO：15是来自BoNT/DC HCN/DC(PDB ID：4ISQ)的结合结构域的N端区域的氨基酸序列：
Figure BDA0002640530420000192
SEQ ID NO：16是来自BoNT/E、HCN/E(PDB：4ZKT)的结合结构域的N端区域的氨基酸序列：
Figure BDA0002640530420000193
SEQ ID NO：17是来自BoNT/F、HCN/F(PDB ID：3RSJ)的结合结构域的N端区域的氨基酸序列：
Figure BDA0002640530420000194
SEQ ID NO：18是来自BoNT/G、HCN/G(PDB ID：2VXR)的结合结构域的N端区域的氨基酸序列
Figure BDA0002640530420000195
Figure BDA0002640530420000201
附图说明
本公开内容的一个或多个实施方案的细节在附图/表格和以下描述中阐述。根据附图/表格和详细描述以及根据权利要求，本公开内容的其它特征、目的和优点将是显而易见的。
图1是显示了在用10nM(实心柱)、100nM(未填充柱)或1μM(阴影柱)具有SEQ IDNO：19的氨基酸序列的多肽处理1天(24小时)后，正常人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图，其中倍数变化相对于未处理的对照细胞表示；
图2是显示了在用1nM(水平线填充)、10nM(未填充柱)、100nM(阴影柱)或1μM(实心柱)具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的多肽处理24小时后，疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图，其中倍数变化相对于未处理的对照细胞表示。
图3是显示了在用1μM具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽处理后，由疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞分泌到培养基中的I型前胶原C肽(PIP)的量(ng/mL)的柱状图。
图4是显示了在用1μM具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽处理后，疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞的纤维蛋白水凝胶的大小(cm2)的柱状图，所述纤维蛋白水凝胶的大小用于衡量成纤维细胞收缩性和成纤维细胞-成肌纤维细胞转变。
图5A-5E是显示了在用20pM、0.1μM或1μM具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽或具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的多肽处理后，由纤维化MDA-231细胞分泌到培养基中的纤连蛋白、胶原蛋白IV、血小板反应蛋白1、MMP1和TIMP1各自的量(ng/mL)的柱状图，其中由缺氧诱导纤维化。
图6是显示了在用0(仅培养基对照，未填充柱)、20pM(水平线填充)、200pM(垂直线填充)、20nM(阴影柱)或200nM(实心柱)具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽处理1、4、7或9天后，由疙瘩瘢痕成纤维细胞(KF116R)分泌到培养基中的纤连蛋白的标准化百分比的柱状图。星号表示与仅培养基对照相比，p＜0.05有统计学显著性。
图7是显示了在用20pM具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽(实心柱)处理后，由正常人成纤维细胞(HDFa)收集的培养基中通过质谱(MS)蛋白质分析检测到的蛋白的量的柱状图。
图8是显示了在用0.1μM(实心柱)或1μM(阴影柱)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽，或1μM(未填充柱)具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的多肽处理后，疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图。
具体实施方式
将在下文中更全面地描述各个方面。然而，这些方面可以以许多不同的形式来呈现，并且不应被解释为限于本文列出的实施方案；相反，提供这些实施方案以使本公开内容将是全面和完整的。
定义
在本公开内容中提供数值范围的情况下，旨在将该范围的上限和下限之间的每个中间值和所述指定范围内的任何其它述及的值或中间值均包括在本公开内容内。例如，如果述及的范围是1μM至8μM，则旨在也明确公开了2μM、3μM、4μM、5μM、6μM和7μM以及大于或等于1μM的值的范围和小于或等于8μM的值的范围。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”(“a”，“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物。因此，例如，对”氨基酸”的提及包括单个氨基酸以及两种或多种相同或不同的氨基酸。
除非本公开内容的上下文另有指示或与这种解释不一致，否则词语“约”意指该值的正负10％的范围，例如，“约50”意指45至55，约“25,000”意指22,500至27,500等。例如，在例如“约49、约50、约55”的数值列表中，“约50”意指扩展到小于前一个值与后一个值之间的间隔一半的范围，例如大于49.5至小于52.5。
“施用(Administration)”或“施予(to administer)”意指将药物组合物给予(即施予)受试者或替代地接受药物组合物的受试者的步骤。本文公开的药物组合物可通过各种方法局部施用。例如，肌内、皮内、皮下施用、鞘内施用、腹膜内施用、局部(透皮)、灌注和植入(例如，缓释设备诸如聚合物植入物或微渗透泵)都可是适当的施用途径。
“缓解”意指疼痛、头痛或病况或病症的任何症状或原因的发生减少。因此，缓解包括一定的减少、显著减少、接近总的减少和总的减少。
术语“氨基酸”意指天然存在的或合成的氨基酸以及功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸类似物、立体异构体和氨基酸模拟物。该定义包括天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸衍生物，天然氨基酸例如：(1)组氨酸(His；H)(2)异亮氨酸(Ile；I)(3)亮氨酸(Leu；L)(4)赖氨酸(Lys；K)(5)蛋氨酸(Met；M)(6)苯丙氨酸(Phe；F)(7)苏氨酸(Thr；T)(8)色氨酸(Trp；W)(9)缬氨酸(Val；V)(10)精氨酸(Arg；R)(11)半胱氨酸(Cys；C)(12)谷氨酰胺(Gln；Q)(13)甘氨酸(Gly；G)(14)脯氨酸(Pro；P)(15)丝氨酸(Ser；S)(16)酪氨酸(Tyr；Y)(17)丙氨酸(Ala；A)(18)天冬酰胺(Asn；N)(19)天冬氨酸(Asp；D)(20)谷氨酸(Glu；E)(21)硒代半胱氨酸(Sec；U)；非天然氨基酸：(a)瓜氨酸(Cit)；(b)胱氨酸；(c)γ-氨基丁酸(GABA)；(d)鸟氨酸(Orn)；(f)茶氨酸；(g)同型半胱氨酸(Hey)；(h)甲状腺素(Thx)；氨基酸衍生物诸如甜菜碱；肉毒碱；肌肽肌酸；羟色氨酸；羟脯氨酸(Hyp)；N-乙酰半胱氨酸；S-腺苷甲硫氨酸(SAM-e)；牛磺酸；酪胺。
“氨基酸残基”意指掺入多肽中的单个氨基酸单元。
“无动物蛋白质”意指不存在血液来源的、血液汇集的和其它动物来源的产物或化合物。“动物”意指哺乳动物(诸如人类)、鸟、爬行动物、鱼、昆虫、蜘蛛或其它动物物种。“动物”不包括微生物，诸如细菌。因此，无动物蛋白的药物组合物可包括肉毒杆菌神经毒素。例如，“无动物蛋白质”药物组合物意指大体上不含或基本上不含或完全不含血清来源的白蛋白、明胶和其它动物来源的蛋白质(诸如免疫球蛋白)的药物组合物。无动物蛋白质药物组合物的实例是包含肉毒杆菌毒素(作为活性成分)和合适的多糖作为稳定剂或赋形剂或由其组成的药物组合物。
本文使用的毒素的“结合结构域”包括野生型结合结构域、其变体和/或片段。
“肉毒杆菌毒素”意指由肉毒梭菌产生的神经毒素，以及由非梭菌属种重组制备的肉毒杆菌毒素(或其轻链或重链)。如本文中所用，短语“肉毒杆菌毒素”包括肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E、F、G、H和X血清型以及它们的亚型嵌合毒素(例如BoNT/DC和BoNT/CD)和任何其它类型的其亚型，或在每种情况下任何前述类型的任何再工程化的蛋白质、类似物、衍生物、同源物、部分、子部分、变体或形式。如本文中所用，“肉毒杆菌毒素”还包括“经修饰的肉毒杆菌毒素”。如本文中所用，另外的“肉毒杆菌毒素”还包括肉毒杆菌毒素复合物(例如300kDa、600kDa和900kDa复合物)，以及不与复合蛋白缔合的肉毒杆菌毒素的神经毒性组分(150kDa)。
“梭菌毒素”是指由梭菌毒素菌株产生的任何毒素，其可执行整个细胞机制，通过所述机制梭菌毒素刺激细胞并且包括梭菌毒素与低或高亲和力梭菌毒素受体的结合、毒素/受体复合物的内化、梭菌毒素轻链至细胞质中的易位和梭菌毒素底物的酶促修饰。梭菌毒素的非限制性实例包括肉毒杆菌毒素，诸如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/CD、BoNT/DC、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H(又名FA或HA类型)、BoNT/X、eBoNT/J、破伤风毒素(TeNT)、Baratii毒素(BaNT)和酪酸毒素(BuNT)。术语“梭菌毒素”不包括不是神经毒素的BoNT/C2细胞毒素和BoNT/C3细胞毒素。术语梭菌毒素还包括单独的约150kDa的梭菌毒素(即没有NAPs)。梭菌毒素包括天然存在的梭菌毒素变体，诸如例如梭菌毒素同种型和梭菌毒素亚型；非天然存在的梭菌毒素变体，诸如例如保守梭菌毒素变体、非保守梭菌毒素变体、梭菌毒素嵌合变体及其活性梭菌毒素片段或其任意组合。梭菌毒素还包括梭菌毒素复合物，其是指包含梭菌毒素和非毒素相关蛋白(NAP)的复合物，诸如例如肉毒杆菌毒素复合物、破伤风毒素复合物、Baratii毒素复合物和酪酸毒素复合物(Butyricum toxin complex)。梭菌毒素复合物的非限制性实例包括由肉毒梭菌产生的那些复合物，诸如例如900-kDaBoNT/A复合物、500-kDa BoNT/A复合物、300-kDa BoNT/A复合物、500-kDa BoNT/B复合物、500-kDa BoNT/C1复合物、500-kDa BoNT/D复合物、300-kDa BoNT/D复合物、300-kDa BoNT/E复合物和300-kDa BoNT/F复合物。
“细胞表型”是指在基因表达、蛋白质表达、因子的合成和/或影响细胞和/或组织(细胞是其一部分，包括细胞外基质结构和皮脂)的结构和/或功能的蛋白质和因子的分泌中的任何变化。
当应用于生物活性成分时，“有效量”意指通常足以在受试者中实现期望的变化的成分的量。例如，当期望的效应是纤维化相关蛋白的表达的减少时，成分的有效量是引起纤维化相关蛋白的表达的至少显著减少并且不会导致显著毒性的量。在该实施方案的其它方面，治疗有效浓度的梭菌毒素活性成分使与待治疗的区域(aliment)相关的症状减少例如至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多90％或至多100％。
“重链”意指肉毒杆菌神经毒素的重链。它具有约100kDa的分子量，并且可被称为H链或H。
HC意指来源于肉毒杆菌神经毒素的H链的片段(约50kDa)，其大约等同于H链的羧基端部区段或对应于完整H链中的该片段的部分。据信它含有天然或野生型肉毒杆菌神经毒素的涉及与运动神经元高亲和力突触前结合的部分。
HN意指来源于肉毒杆菌神经毒素的H链的片段(约50kDa)，其大约等同于H链的氨基端部区段或对应于完整H链中的该片段的部分。据信它含有天然或野生型肉毒杆菌神经毒素的涉及L链跨细胞内内吞体膜易位的部分。
“同源物”意指一组执行相同生物学功能的蛋白质中的蛋白质，例如，属于相同梭菌毒素家族并提供共同活性(例如受体结合活性)的蛋白质。同源物通常由同源基因表达。
“分离的”意指与野生或天然序列分离的核酸序列或多肽序列，在该野生或天然序列中天然存在该核酸序列或多肽序列，或该核酸序列或多肽序列处于不同于天然存在该序列的环境中。
“轻链”意指梭菌神经毒素的轻链。它具有约50kDa的分子量，并且可被称为L链、L或称为肉毒杆菌神经毒素的蛋白水解结构域(氨基酸序列)。
LHN或L-HN意指来源于含有L链的梭菌神经毒素的片段或联接到HN结构域的它们的功能片段。它可通过完整的梭菌神经毒素蛋白水解以便移除或修饰Hc结构域而获得。
“植入物”意指控释(例如，脉冲或连续)组合物或药物递送系统。植入物可以例如注射、插入或植入到人类身体中。
“局部施用”意指在动物身体上或动物身体内的需要药物的生物效应的部位处或在其附近直接施用药物，诸如例如经由肌内或皮内或皮下注射或局部施用。局部施用排除全身的施用途径，诸如静脉内或口服施用。局部施用是一种将药剂施用于患者皮肤的局部施用类型。
“经修饰的肉毒杆菌毒素”意指与天然肉毒杆菌毒素相比其氨基酸中的至少一者缺失、被修饰或被替换的肉毒杆菌毒素。另外，经修饰的肉毒杆菌毒素可以是重组产生的神经毒素，或重组制备的神经毒素的衍生物或片段。经修饰的肉毒杆菌毒素保留了天然肉毒杆菌毒素的至少一种生物活性，诸如结合肉毒杆菌毒素受体的能力或抑制神经元释放神经递质的能力。经修饰的肉毒杆菌毒素的一个实例是具有来自一种血清型肉毒杆菌毒素(诸如A血清型)的轻链和来自不同血清型肉毒杆菌毒素(诸如B血清型)的重链的肉毒杆菌毒素。经修饰的肉毒杆菌毒素的另一个实例是联接到神经递质(诸如物质P)的肉毒杆菌毒素。
“突变”意指天然存在的蛋白质或核酸序列的结构修饰。例如，就核酸突变而言，突变可以是DNA序列中一个或多个核苷酸的缺失、添加或置换。就蛋白质序列突变而言，突变可以是蛋白质序列中的一个或多个氨基酸的缺失、添加或置换。例如，包含蛋白质序列的特定氨基酸可以被置换为另一个氨基酸，例如，选自以下的氨基酸，包括：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或任何其它天然或非天然存在的氨基酸或化学修饰的氨基酸。蛋白质序列的突变可以由以下引起的：转录时DNA序列突变，然后所得的mRNA翻译产生突变的蛋白质序列。还可以通过将含有期望的突变的肽序列融合到期望的蛋白质序列中来产生蛋白质序列的突变。
“患者”意指接收医疗或兽医护理的人类或非人类受试者。因此，如本文所公开的组合物可用于治疗任何动物，诸如例如哺乳动物等。
“肽”和“多肽”是指由通过肽键连接的氨基酸残基链组成的任何聚合物，无论其大小。尽管“蛋白质”通常用于指相对较大的多肽，而“肽”通常用于指较小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用是重叠和变化的，因此，为简单起见，术语“多肽”将在本文中使用，尽管在某些情况下，本领域可能指与“蛋白质”相同的聚合物。除非另有说明，否则多肽的序列以从氨基端到羧基端的顺序给出。
如果氨基酸序列或核苷酸序列在给定的比较窗口中与参考序列具有至少85％的序列同一性，则氨基酸序列或核苷酸序列与参考序列“与……基本相同”或“基本类似于”。因此，基本相似的序列包括具有例如至少85％的序列同一性，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的那些序列。彼此相同的两个序列也基本相似。比较窗口或比较序列的长度通常至少是肉毒杆菌毒素的结合结构域或肉毒杆菌毒素片段(例如包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的约20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、150、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425个连续氨基酸的片段)的结合结构域的长度。基于参考序列计算序列同一性，并且用于序列分析的算法在本领域中是已知的。因此，为了确定两个氨基酸序列的序列同一性百分比，序列被比对以达到最佳比较目的(例如，可以在一个多肽的序列中引入空位以与另一个多肽进行最佳比对)。然后比较在相应的酸位置的氨基酸残基。当一个序列中的一个位置被与其它序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的序列同一性百分比是该序列具有的相同位置数目的函数(即，序列同一性百分比＝相同位置数/位置总数×100)。可以使用Vector NTI软件包(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)确定两个多肽序列之间的序列同一性百分比。空位开放罚分10和空位延伸罚分0.1可用于确定两个多肽的同一性百分比。所有其它参数可以设置为默认设置。用于确定序列同源性的另一个软件工具是来自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，(NCBI))的基本局部比对搜索工具(BLAST)。例如，BLAST可以比较蛋白质序列并计算相同或相似氨基酸残基、同源性、空位等的百分比。
“在外围施用”或“外围施用”意指皮下、皮内、透皮或皮下施用，但排除肌内施用。“外围”意指在皮下位置，并且排除内脏部位。
“药物组合物”意指包含活性药物成分(诸如例如，梭菌毒素活性成分诸如肉毒杆菌毒素)和至少一种另外的成分(诸如例如，稳定剂或赋形剂等)的组合物。因此，药物组合物是适于对受试者(诸如人类患者)进行诊断或治疗性施用的制剂。药物组合物可以为例如冻干或真空干燥状态、冻干或真空干燥药物组合物重构之后形成的溶液，或者为不需要重构的溶液或固体。
“药理学上可接受的赋形剂”与“药理学赋形剂”或“赋形剂”同义，并且是指当施用于哺乳动物时大体上不具有长期或永久有害效应的任何赋形剂，并且包括诸如例如稳定剂、膨松剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、添加剂、溶媒、载体、稀释剂或辅助剂的化合物。赋形剂通常与活性成分混合，或允许稀释或包封活性成分，并且可以是固体、半固体或液体剂。还构想包含梭菌毒素活性成分的药物组合物可包含有利于将活性成分加工成药学上可接受的组合物的一种或多种药学上可接受的赋形剂。只要任何药理学上可接受的赋形剂与梭菌毒素活性成分不相容的范围内，就可构想其在药学上可接受的组合物中的用途。药理学上可接受的赋形剂的非限制性实例可见于：例如，Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems(Howard C.Ansel等人合编，Lippincott Williams&WilkinsPublishers，第7版，1999)；Remington：The Science and Practice of Pharmacy(AlfonsoR.Gennaro编辑，Lippincott，Williams&Wilkins，第20版，2000)；Goodman&Gilman′s ThePharmacological Basis of Therapeutics(Joel G.Hardman等人合编，McGraw-HillProfessional，第10版，2001)；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(RaymondC.Rowe等人，APhA Publications，第4版，2003)，这些文献中的每一者均据此全文以引用方式并入本文。
药物组合物的组分成分可被包含在单一组合物中(即，除了任何所需的重构流体之外，所有组分成分在药物组合物的初始配混时存在)或作为双组分系统，例如，用重构载体重构的真空干燥组合物，所述重构载体可例如含有在药物组合物的初始配混中不存在的成分。双组分系统可以提供若干益处，包括允许掺入与双组分系统的第一组分的长期储存不充分兼容的成分。例如，重构载体可包括防腐剂，其在使用期间(例如，冷藏储存一周)提供足够的微生物生长防护，但不用于两年的冷冻储存期期间，因为在此期间它可能使毒素降解。可以这种方式掺入与肉毒杆菌毒素或其它成分不能长时间段兼容的其它成分；也就是说，在大致使用时添加第二载体(例如，在重构载体中)。药物组合物还可包括防腐剂，诸如苄醇、苯甲酸、酚、对羟基苯甲酸酯和山梨酸。药物组合物可包括：例如赋形剂，诸如表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；制粒剂和崩解剂；粘合剂；润滑剂；防腐剂；生理上可降解的组分，诸如明胶；含水载体和溶剂；油性载体和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂、缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；抗氧化剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合物或疏水性材料，以及本领域已知的和例如Genaro编辑，1985，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa中描述的其它成分，该文献以引用的方式并入本文。
“多糖”意指具有多于两个糖分子单体的聚合物。这些单体可以是相同或不同的。
“稳定剂(Stabilizing agent)”、“稳定剂(stabilization agent)”或“稳定剂(stabilizer)”意指用于稳定梭菌毒素活性成分使得药物组合物的效能相对于不稳定的组合物增加的物质。
“稳定剂”可包括赋形剂，并且可包括蛋白质和非蛋白质分子。
“表面活性剂”是指天然或合成的两亲化合物。表面活性剂可以是非离子的、两性离子的或离子的。表面活性剂的非限制性实例包括泊洛沙姆、聚山梨酸酯及其组合。
“治疗性制剂”意指可用于治疗并由此缓解病症或疾病的制剂，诸如例如以皮脂腺过度活跃(即皮脂溢)为特征的病症或疾病。
“治疗有效浓度”、“治疗有效量”、“有效量”、“有效剂量”和“治疗有效剂量”是指达到理想治疗效果所必需的梭菌毒素活性成分的最小剂量，以及包括足以减轻与待治疗的区域有关的症状的剂量。
“局部施用”排除神经毒素的全身给药。换言之，与常规的治疗性透皮方法不同，肉毒杆菌毒素的局部施用不会导致大量(诸如大部分的)神经毒素进入患者的循环系统。
“治疗”意指暂时或永久地缓解(或消除)病况或障碍的至少一种症状，诸如例如纤维化障碍、与细胞外基质相关的障碍、与结缔、上皮或内皮组织相关的障碍等。所述术语不仅包括疾病的治愈，而且包括疾病的预防，控制或甚至为减轻疾病或疾病症状而采取的步骤。例如，关于治疗障碍的方法，所述障碍诸如纤维化，例如特发性肺纤维化(IPF)或囊性纤维化(CF)，该实施方案通常包括施用化合物或组合物，相对于未接受所述化合物或组合物的受试者，所述化合物或组合物减少了受试者的医学病况的症状(例如，IPF或CF)的频率或延迟了其发作。这可包括以改善或稳定受试者病况(例如，肺活量衰退)的模式逆转、减轻或阻止病况的症状、临床体征以及潜在病理学。
在一些实施方案中，通过使受试者的组织(例如，气道的内皮组织)与递送系统接触来进行治疗性实施方案。如本文所定义，“接触”意指在试管、烧瓶、组织培养物、芯片、阵列、平板、微孔板、毛细管等中，将包含活性成分(例如，含有本公开内容的多肽的活性药物成分或API)的组合物引入到含有靶标(例如细胞靶标)的样品中，并在足以使肽或化合物与靶标结合的温度和时间下孵育。在体内治疗环境中，“接触”意指将多肽引入到患者或受试者中以治疗本公开内容的疾病，例如IPF，CF，并允许多肽或化合物在体内与患者的靶组织(例如上皮组织)接触。
在一些实施方案中，通过给受试者(例如患有疾病诸如IPF或CF的患者)施用组合物或试剂盒来进行治疗性应用。术语“施用”意指作为补救措施应用，诸如通过以可以接收这种药物并且有效地实现其预期目的的模式放置药物。
如本文所用，术语“本公开内容的疾病”或“本公开内容的障碍”包括以下几种疾病中的一种：细胞外基质疾病；结缔或上皮组织疾病；内皮疾病；和纤维化疾病；优选地纤维化疾病；以及特别是ECM、结缔或上皮组织或内皮组织的纤维化疾病。
如本文所用，术语“细胞外基质疾病”或“与细胞外基质(ECM)相关的疾病”是指与ECM或其一种或多种组分相关的病况、障碍或疾病。ECM除了参与其它生物学功能(包括但不限于细胞内通讯)外，还为细胞提供结构支持。ECM的组分包括但不限于蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角蛋白)、非蛋白聚糖多糖(例如透明质酸)、纤维、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。细胞外基质还充当信号分子(诸如生长因子和细胞因子)的贮库(depot)。细胞外基质疾病包括与ECM的一种或多种功能异常(例如，细胞内通讯和/或运动异常)或ECM的一种或多种组分异常(例如，ECM的一种或多种组分的活性和/或产生的增加或减少)相关的疾病。细胞外基质疾病还包括与ECM的降解和重塑改变相关的疾病，以及与ECM中的药剂(例如免疫复合物和其它免疫产物)的积累改变(例如增加或减少)相关的疾病。细胞外基质疾病包括但不限于动脉粥样硬化、癌症、淀粉样蛋白疾病、肾小球疾病、肾小球膜疾病、炎症病况和发育障碍。癌症包括急性淋巴细胞白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌(breast cancer)、乳腺癌(breast carcinoma)、神经胶质瘤和胶质母细胞瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤、粘连形成(desmoplasia)、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、纤维增生性癌、和前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌和肝癌以及其它肿瘤生长和转移。
如本文所用，术语“与结缔组织相关的疾病”或“结缔组织疾病”是指与结缔组织或其一种或多种组分相关的病况、障碍或疾病。术语“结缔组织”是指支撑、连接或分离身体的不同类型的组织和器官的组织。它是四大类动物组织中的一种。结缔组织遍布于任何地方，包括中枢神经系统中。它位于其他组织之间。所有结缔组织都具有三个主要组分：基质、纤维和细胞。优选的结缔组织是包含胶原纤维的组织。结缔组织疾病的代表性实例包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、全身性硬化、口干综合征(
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syndrome)、混合性结缔组织疾病、感染性嗜曙红细胞增多(eosinophilia infectiosa)、多肌炎、皮肌炎、结节性动脉炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener-granulomatose)、CREST-综合征和SHARP-综合征；优选地系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、全身性硬化或口干综合征。
如本文所用，术语“与上皮组织相关的疾病”或“上皮组织疾病”是指与结缔组织或其一种或多种组分相关的病况、障碍或疾病。术语“上皮组织”是指排列在全身器官和血管的外表面，以及许多内部器官的腔的内表面的组织。它是四大类动物组织中的一种。上皮或结缔组织疾病的代表性实例包括湿疹、特应性皮炎、牛皮癣、真皮瘢痕(肥厚性、瘢痕、萎缩性(例如痤疮)、妊娠纹和脐带、伤口瘢痕、手术瘢痕(例如剖宫产、腹部整形、隆胸、腹部手术、整容或注射填充剂后)、术后腹腔粘连、纤维瘤、肝纤维化、肝硬化、胰腺炎、良性前列腺增生、纤维性膀胱、间质性膀胱炎、肺纤维化、肾纤维化、肾小球硬化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、胶质瘢痕、动脉硬化、关节纤维化、囊性纤维化、非囊性纤维化、克罗恩病、杜普伊特伦氏挛缩、纵隔纤维化、骨髓纤维化、佩罗尼氏病、肾源性系统性纤维化、进行性大块纤维化、腹膜后纤维化、粘连性关节囊炎、混合结缔组织病、眼纤维化、骨关节炎、硬皮病和哮喘等。
如本文所用，术语“与内皮相关的疾病”或“内皮疾病”是指与内皮组织或其一种或多种组分相关的病况、障碍或疾病。术语“内皮”是指简单的薄层或单层的鳞状细胞，称为内皮细胞，其排列在血管和淋巴管的内表面，在内腔中的循环血液或淋巴与其余血管壁之间形成界面。在一些实施方案中，内皮障碍选自阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、糖尿病性神经病、中风、动脉粥样硬化、糖尿病、再狭窄、冠状动脉疾病、周围性血管疾病、血管渗漏、血管炎、结节性脉管炎(vasculitidis)、韦格内氏病(Wegner′s disease)、胃或口腔溃疡、肝硬化、肝肾综合征、克罗恩病、脱发、皮肤紫癜、毛细血管扩张、静脉湖形成、伤口愈合延迟、先兆子痫、败血症、缺血再灌注损伤、高血压、慢性或急性感染、月经过多、新生儿呼吸窘迫、肺纤维化、肺气肿、肾病、肾小球肾炎、硬结瘤和血管异常。在一些实施方案中，内皮疾病以血管生成不足、高血压、血管收缩、血管渗漏、血管舒缩紧张度改变、易凝状态(hypercoagulation)、抗炎特性和不良的内皮细胞健康为特征。
如本文所用，术语“纤维化障碍”或“纤维化疾病”是指以进行性和/或过度纤维化为特征的医学病况，其通常以结缔组织增厚或瘢痕为特征，例如由于受伤。在一些实施方案中，纤维化疾病以在发炎或损害的组织中和周围发生细胞外基质的过度沉积为特征。在某些实施方案中，纤维化障碍或疾病与纤维化病灶或病变中和周围的成纤维细胞的持续存在相关。过度和持续的纤维化可逐渐重塑和破坏正常组织，其可能导致受影响器官的功能障碍和衰竭，并最终死亡。
在一些实施方案中，纤维化障碍可以以“分化转化(transdifferentiation)”为特征，其是指一种细胞类型直接转化为另一种细胞类型。特别地，纤维化障碍或纤维化疾病包括ECM、结缔组织、内皮组织的纤维化，或其组合。在一些实施方案中，术语纤维化疾病不包括由正常伤口愈合触发的纤维化。
纤维化障碍或纤维化疾病的非限制性实例包括真皮瘢痕、伤口瘢痕、手术瘢痕、术后腹腔粘连、纤维瘤、肝纤维化、肝硬化、胰腺炎、良性前列腺增生、乳腺纤维化、纤维性膀胱、间质性膀胱炎、肺纤维化(例如特发性肺纤维化)、血管纤维化(动脉粥样硬化、狭窄、再狭窄)、肾纤维化、肾小球硬化、心房纤维化、心肌纤维化、心内膜心肌纤维化、胶质瘢痕、动脉硬化、关节纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化(例如肺)、慢性肾脏疾病(CKD)、肾源性系统性纤维化、克罗恩病、肥厚性瘢痕、疙瘩、硬皮病、系统性硬化(例如皮肤、肺)、肌纤维变性(athrofibrosis)(例如膝盖、肩膀，其它关节)、佩罗尼氏病、杜普伊特伦氏挛缩、粘连性关节囊炎、器官移植相关纤维化、缺血相关纤维化、囊性纤维化、非囊性纤维化、混合结缔组织病、眼纤维化、骨关节炎、硬皮病、哮喘等。优选地，纤维化障碍为纤维化乳腺疾病；疙瘩瘢痕；肝纤维化；纤维化膀胱；纤维组织增生，例如良性前列腺增生；胰腺炎；粘连，例如腹腔粘连；瘢痕，例如肥厚性瘢痕或其组合。
如本文所用，“变体”是指其生物分子(例如，多肽或核酸)的序列由于至少一种修饰或氨基酸(或核酸)置换而与亲本序列的序列不同。因此，变体多肽包含至少一个氨基酸残基的修饰或置换。引起变体多肽的修饰类型包括，例如，一个或多个氨基酸残基的添加、缺失、置换、转换等。
多肽和包含所述多肽的组合物
如上所述，在一方面，提供了一种包含与梭菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，所述梭菌毒素是肉毒杆菌毒素。在一些实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链的羧基或C端区段(HC)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的N端一半相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素是BoNT/A。在另一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素是嵌合毒素。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素是BoNT/DC。在替代实施方案中，肉毒杆菌毒素不是BoNT/A。
在另一方面，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约1kDa至约90kD之间，或约20kDa至约60kD之间，或约22kDa至约50kD之间。
肉毒杆菌毒素血清型和亚型的氨基酸序列是已知的，表1给出了易位、内肽酶和结合结构域的近似边界区域以及其示例性GENBANK/UNIPROT登录号。BoNT毒素的代表性血清型(例如A型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型)包括相关成员，所述相关成员也在美国专利号7,892,565和8,486,422中公开。潜在的第八种类型(“H型”)描述在Dover等人，J InfectDis.，209(2)：192-202，2014(PMID：24106295)中。最近的报道已将这种新神经毒素描述为BoNT/H、BoNT/FA或BoNT/HA。参见Maslanka等人，J Infect Dis.，213(3)：379-385，2016；Peck等人，Toxins(Review)，9(1)：38，2017。嵌合肉毒杆菌毒素也是已知的，诸如BoNT/DC和BoNT/CD。
表1
Figure BDA0002640530420000331
Figure BDA0002640530420000341
在一个实施方案中，梭菌毒素来源于BoNT/A。在替代实施方案中，梭菌毒素不来源于BoNT/A，例如梭菌毒素是来源于BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、BoNT/DC、BoNT/CD、BoNT/X、eBoNT/J、TeNT、BaNT、BuNT或其组合的梭菌毒素。
在另一个实施方案中，梭菌毒素来源于梭菌毒素的各种亚型。如本文所用，术语“亚型”可以指具有相同或相似的氨基酸序列的两个或多个功能相似的蛋白质中的任一个，并且其要么由不同的基因编码，要么由来自已去除了不同外显子的相同基因的RNA转录物编码。“亚型”还可以指编码此类蛋白质的任何序列，包括成熟和未成熟的序列。因此，除非上下文中指出或以其它方式理解为仅指一种或另一种，“亚型”包括编码一种或多种上述梭菌毒素的基因，以及所述基因的蛋白质产物。至少40个独特的通常称为亚型的BoNT通过DNA测序已被鉴定；一些影响BoNT功能(Rossetto等人，Nature Reviews Microbiol.，12，535-49，2014)。例如，分子研究为含有BoNT C和D血清型的结构成分的单BoNT的交叉反应血清学观察提供了证据。参见Arndt等人(J Mol Biol.，362(4)：733-42，2006)和Hill等人(JBacteriol.，189：818-32，2007)。在一些情况下，发现BoNT/F的序列特别可变(Raphael等人，Appl Environ Microbiol.，76(14)：4805-12，2012)，导致与突触囊泡膜蛋白(诸如VAMP-2)的切割有关的功能多样性(Kalb等人，Anal Chem.，86：3254-62，2014)。
在一个实施方案中，梭菌毒素来源于各种BoNT/A亚型、BoNT/B亚型、BoNT/C亚型、BoNT/D亚型、BoNT/E亚型、BoNT/F亚型、和BoNT/G亚型，BoNT/A亚型诸如例如A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A9、A10；BoNT/B亚型诸如例如B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、Bnp和Bbv；BoNT/C亚型诸如例如C和CD；BoNT/D亚型诸如例如D和DC；BoNT/E亚型诸如例如E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9；BoNT/F亚型诸如例如F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7；和BoNT/G亚型诸如例如亚型G。BoNT亚型包括嵌合BoNTs，例如BoNT/DC、BoNT/CD、BoNT/FA等。参见，Rossetto等人，NatureReviews Microbiol.，12，535-49，2014；Montecucco等人，MBio 6：e02131-14，2015；美国专利号8,841,111和美国专利号8,697,413。序列比对分析例如，通过诸如VECTOR NTI(ThermoFisher，Carlsbad，CA)的软件执行，揭示了单个BoNT/A亚型之间的高度序列同一性。例如，在一个实施方案中，存在约78.9％(例如，在75％-80％之间，取决于比对软件)整体序列同一性，以及甚至在共有位置上约99.3％(例如，在95％-99.9％之间，取决于比对软件)更高的序列同一性。
在一个实施方案中，本公开内容涉及梭菌毒素的同源物。术语“同源物”意指一组执行相同生物学功能的蛋白质中的蛋白质，例如，属于相同梭菌毒素家族并提供共同活性的蛋白质。同源物通常由同源基因表达。关于同源基因，同源物包括直向同源物，例如在不同物种中表达的基因通过物种形成从共同的祖先基因进化而来，并编码保留相同功能的蛋白质，但不包括种内同源基因，例如与复制相关但已进化为编码具有不同功能的蛋白质的基因。同源基因包括天然存在的等位基因和人工创建的变体。遗传编码的简并性提供了用不同的碱基置换基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基的可能性，而不会导致从所述基因产生的多肽的氨基酸序列发生改变。当最佳比对时，与主题蛋白(例如BoNT/A1)或包含HC结构域(特别是HCN结构域，尤其是HCN结构域的N端一半)的其片段相比，同源蛋白通常具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或更高％同一性或相似性。在本公开内容的另一方面，同源蛋白具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：3-5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID No：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：12-18的多肽具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或更高％同一性或相似性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，同源梭菌毒素根据同源性百分比分组，所述同源性百分比定义为蛋白质序列内相对于参考蛋白质序列的相同或相似残基(共有)除以参考序列的长度的百分比，在比对序列并引入空位后(如果需要)，以实现最大序列同源性百分比。共有置换是允许氨基酸用相似氨基酸置换的那些置换。氨基酸在几个特征上可以相似，例如大小、形状、疏水性、亲水性、电荷、等电点、极性、芳香性等。为了确定氨基酸序列同源性百分比的目的，比对可以以本领域技术人员的普通技术范围内的各种方式实现。在某些情况下，氨基酸序列可以使用公共可获得的计算机软件(例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件)进行比对。在一个实施方案中，同源性百分比是使用可通过NCBI获得的基本局部比对搜索工具(BLAST)计算的，所述工具进行成对比对并使用残基置换矩阵提供原始得分。本文中，通过BLAST计算的位得分是考虑序列长度和空位大小的归一化得分。如在生物信息学中所理解的，283位的得分意味着找到比所呈现的更好的比对，搜索将必须包括2283(或2x1085)个单位(例如氨基酸或核酸)的空间。因此，位得分越高，匹配的显著性就越高。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在全长比较序列上实现最大比对所需的任何算法。然后相对于较长的序列计算序列同源性，即，即使较短的序列与较长的序列的一部分显示出100％的序列同一性，整体序列同一性也将小于100％。
在一个替代实施方案中，变体梭菌毒素可包含与一种或多种上述梭菌毒素具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高％同一性的序列。例如，在一个实施方案中，变体梭菌毒素与在UNIPROT登录号P0DPI1(例如A型)；P10844(例如B型)；P18640(例如C1型)；P19321(例如D型)；Q00496(GENBANK#CAA44558)(例如E型)；P30996(例如F型)；Q60393(例如G型)；H型的GENBANK ID：KGO15617(UNIPARC ID：00052C1529)；X型的GENBANK ID：BAQ12790(UNIPARCID：0005822796)；UNIPROT登录号P04958(例如TeNT)；Q45851(例如BaNT)；或P30995(例如BuNT)中列出的氨基酸序列可具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高例如，约99.9％序列同一性。
在另一个实施方案中，变体梭菌毒素与以下列出的核酸或氨基酸序列可具有至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高例如，约99.9％序列同一性，以下的核酸或氨基酸序列包括：(a)来源于BoNT/A毒素的GENBANK登录号AF488749(核酸)和AAQ06331(蛋白质)；(b)来源于BoNT/B毒素的GENBANK登录号AB232927(核酸)或BAE48264(蛋白质)；(c)GENBANK#CAA47060(核酸)；来源于BoNT/C1毒素的UNIPROT#P18640(蛋白质)；(d)GENBANK#X54254(核酸)；来源于BoNT/D毒素的UNIPROT#P19321(蛋白质)；(e)GENBANK#EF378947(核酸)；来源于BoNT/DC毒素的ABP48747(蛋白质)；(f)GENBANK#JX424539(核酸)；来源于BoNT/E毒素的AFV91344(蛋白质)；(g)GENBANK#ABS41202(蛋白质)；编码来源于BoNT/F毒素的ABS41202的DNA(例如cDNA)；(h)GENBANK#X74162(核酸)；来源于BoNT/G毒素的UNIPROT#Q60393(蛋白质)；(i)来源于BoNT/X毒素的GENBANK ID：BAQ12790(蛋白质)；或(j)GENBANK#OTO22244；来源于eBoNT/J毒素的UNIPROT#A0A242DI27(蛋白质)。
在再一个实施方案中，变体梭菌毒素与以下列出的核酸或氨基酸序列可具有至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高例如，约99.9％序列同一性，以下的核酸或氨基酸序列包括：(1)GENBANK#AB443580(核酸)；来源于BoNT/A2千叶菌株毒素的BAH03558(蛋白质)；(b)GENBANK#X73423(核酸)；来源于京都F菌株毒素的CAA51824(蛋白质)；(c)GENBANK#DQ185900(核酸)；来源于BoNT/A3湖马里菌株毒素的ABA29017(蛋白质)；(d)来源于BoNT/A4 657Ba菌株毒素的(GENBANK#EU341307(核酸)；ABY56338(蛋白质))；(e)来源于BoNT/A5A 661222菌株毒素的(GENBANK#HM153705(核酸)；ADJ68235(蛋白质))；(f)GENBANK#FJ981696(核酸)；来源于BoNT/A6 CDC41370菌株毒素的ACW83602(蛋白质)；GENBANK#JQ954969(核酸)；来源于BoNT/A72008-148菌株毒素的AFV13854(蛋白质)。
在一些实施方案中，变体梭菌毒素包括突变体梭菌毒素或其片段。通常，突变体梭菌毒素在核心梭菌毒素多肽序列或其片段(例如，全长BoNT/A序列或SEQ ID NO：1的HC片段)中包含至少1、2、3、4、5个或更多，例如，多达10个突变。这种突变体梭菌毒素的代表性实例包括，例如，包含W1266L和Y1267S的第一BoNT/A突变体或其片段(例如，包含SEQ ID NO：1中的W391L和Y392S的BoNT/A突变体的HC片段；突变体序列在SEQ ID NO：26中列出)或包含T1145A和T1146A的第二BoNT/A突变体或其片段(例如，包含SEQ ID NO：1中的T270A和T271A的BoNT/A突变体的HC片段；突变体序列在SEQ ID NO：25中列出)或包含G1292R的第三BoNT/A突变体或其片段(例如，包含SEQ ID NO：1中的G417R的BoNT/A突变体的HC片段；突变体序列在SEQ ID NO：27中列出)。在一些实施方案中，与非突变的梭菌毒素或其片段相比，突变体多肽或其片段具有调节(例如减弱)的体外或体内活性，因此所述突变体多肽可用于调节非突变的梭菌毒素或其片段的药理特性。
多种序列比对方法中的任一种都可用于确定同一性百分比，包括但不限于全局法、局部法和混合法，诸如例如区段逼近法。确定同一性百分比的方案为在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规程序。
在一个实施方案中，变体梭菌毒素包含一个或多个氨基酸置换，其被选择以保持变体梭菌毒素的活性。半保守残基可以耐受保留电荷、极性和/或大小的变化。例如，包含上述种质的UNIPROT和/或GENBANK序列中列出的氨基酸序列的变体梭菌毒素可具有一个或多个置换，其中置换的氨基酸可以是已知的20种氨基酸中的任一种，其中所述变体梭菌毒素维持其活性，例如细胞结合活性或细胞信号活性或其组合(参见实施例部分)。优选地，氨基酸以保守或半保守的方式被置换。保守氨基酸置换的示例性类型包括，例如，将非极性(疏水的)残基置换为另一个非极性(疏水的)残基，诸如可彼此置换的I、V、L或M，将一个极性(亲水的)不带电荷的残基置换为另一个极性的不带电荷的残基，诸如Q置换为N，G置换为S，反之亦然，或者将带电荷的残基置换为另一个类似的带电荷的残基，诸如可彼此置换的K、R或H，或D置换为E，反之亦然。另一方面，非保守置换包括将非极性(疏水的)残基诸如I、V、L、A、M置换为极性(亲水的)残基诸如C、Q、D、K和/或反之亦然。在一个实施方案中，术语“保守置换”是指以下“强”基团之一内的氨基酸置换：STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY和/或FYW；和/或术语“半保守置换”是指以下“弱”基团之一内的氨基酸置换：CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、FVLIM和/或HFY。进行保守或半保守氨基酸置换的方法是本领域已知的，例如Risler等人，J.Mol.Biol.，204：1019-1029，1988；Niefind等人，J.Mol.Biol.219：481-497，1991；和Overington等人，Protein Science，1：216-226，1992。通过CLUSTAL多序列比对可观察到核心梭菌毒素序列(例如，BoNT/A序列)中的保守和半保守氨基酸替换的示例性类型，其中星号(*)表示同一性，分号(：)表示保守置换，以及句点(.)表示半保守置换。
本公开内容的梭菌毒素变体可以是天然存在的变体或非天然存在的变体。如本文所用，术语“天然存在的梭菌毒素变体”是指不借助于任何人工操作产生的任何梭菌毒素，包括但不限于，由替代拼接的转录物产生的梭菌毒素同种型，通过自发突变产生的梭菌毒素同种型和梭菌毒素亚型。如本文所用，术语“非天然存在的梭菌毒素变体”是指借助于人工操作产生的任何梭菌毒素，包括但不限于，通过基因工程使用随机诱变或合理设计产生的梭菌毒素和通过化学合成产生的梭菌毒素。非天然存在的梭菌毒素变体的非限制性实例包括，例如，保守梭菌毒素变体、非保守梭菌毒素变体和活性梭菌毒素片段。非天然梭菌毒素进一步包括例如已通过添加化学部分、标签、配体等被翻译后修饰的天然梭菌毒素。
如本文所用，术语“保守梭菌毒素变体”是指具有至少一个氨基酸置换为具有至少一种性质与来自参考梭菌毒素序列(参见例如表1)的原始氨基酸的性质类似的另一氨基酸或氨基酸类似物的梭菌毒素。这种性质的实例包括但不限于，类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲油性、共价键合能力、氢键合能力、物理化学性质等或其任意组合。保守梭菌毒素变体可以与所述保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素基本相同的方式起作用，并且在本说明书的任何方面中都可以置换为参考梭菌毒素。保守梭菌毒素变体可以从所述保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上置换1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400或500个或更多氨基酸。保守梭菌毒素变体还可以从所述保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上置换至少5、10、15、20或25个连续氨基酸。保守梭菌毒素变体的非限制性实例包括，例如，保守BoNT/A变体、保守BoNT/B变体、保守BoNT/C1变体、保守BoNT/D变体、保守BoNT/E变体、保守BoNT/F变体、保守BoNT/G变体、保守BoNT/H变体、保守BoNT/X变体、保守eBoNT/J变体、保守TeNT变体、保守BaNT变体和保守BuNT变体。
如本文所用，术语“非保守梭菌毒素变体”是指一种梭菌毒素，其中(a)至少一个氨基酸从所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素中缺失；(b)至少一个氨基酸添加到所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素；或(c)至少一个氨基酸置换为不具有与来自参考梭菌毒素序列(参见例如表1)的原始氨基酸的性质相似的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守梭菌毒素变体可以与非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素基本相同的方式起作用，并且在本说明书的任何方面中都可以置换为参考梭菌毒素。非保守梭菌毒素变体可以从所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上删除一个或多个氨基酸、两个或多个氨基酸、三个或多个氨基酸、四个或多个氨基酸、五个或多个氨基酸和十个或多个氨基酸。非保守梭菌毒素变体可以添加一个或多个氨基酸、两个或多个氨基酸、三个或多个氨基酸、四个或多个氨基酸、五个或多个氨基酸和十个或多个氨基酸到所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素。非保守梭菌毒素变体可以从所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上置换至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400或500个或更多氨基酸。非保守梭菌毒素变体还可以从所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上置换至少5、10、15、20或25个连续氨基酸。非保守梭菌毒素变体的非限制性实例包括，例如，非保守BoNT/A变体、非保守BoNT/B变体、非保守BoNT/C1变体、非保守BoNT/D变体、非保守BoNT/E变体、非保守BoNT/F变体、非保守BoNT/G变体、非保守BoNT/H变体、非保守BoNT/X变体、非保守eBoNT/J变体、非保守TeNT变体、非保守BaNT变体和非保守BuNT变体。还可以构想，各种梭菌毒素片段中的任一种都可用于本说明书的方面，条件是这些活性片段可以执行总体细胞机制，由此梭菌毒素结合至结合伴侣，例如突触囊泡糖蛋白。因此，该实施方案的方面可包括具有长度，例如至少600、700、800、900、1000、1100或至少1200个氨基酸的梭菌毒素片段。该实施方案的其它方面可包括具有长度，例如至多600、700、800、900、1000、1100或至多1200个氨基酸的梭菌毒素片段。
本公开内容的实施方案进一步涉及变体梭菌毒素多肽。如本文所用，术语“多肽”包括包含直链或支链氨基酸、模拟肽及其药学上可接受的盐的分子。通常，多肽包含多个通过共价键(例如肽键)彼此结合的氨基酸残基，例如2、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更多氨基酸残基。“氨基酸残基”意指掺入本公开内容的多肽中的单个氨基酸单元。如本文所用，术语“氨基酸”意指天然存在的或合成的氨基酸，以及氨基酸类似物、立体异构体和功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸模拟物。该定义包括天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸衍生物，天然氨基酸诸如：(1)组氨酸(His；H)(2)异亮氨酸(Ile；I)(3)亮氨酸(Leu；L)(4)赖氨酸(Lys；K)(5)蛋氨酸(Met；M)(6)苯丙氨酸(Phe；F)(7)苏氨酸(Thr；T)(8)色氨酸(Trp；W)(9)缬氨酸(Val；V)(10)精氨酸(Arg；R)(11)半胱氨酸(Cys；C)(12)谷氨酰胺(Gln；Q)(13)甘氨酸(Gly；G)(14)脯氨酸(Pro；P)(15)丝氨酸(Ser；S)(16)酪氨酸(Tyr；Y)(17)丙氨酸(Ala；A)(18)天冬酰胺(Asn；N)(19)天冬氨酸(Asp；D)(20)谷氨酸(Glu；E)(21)硒代半胱氨酸(Sec；U)；非天然氨基酸：(a)瓜氨酸(Cit)；(b)胱氨酸；(c)γ-氨基丁酸(GABA)；(d)鸟氨酸(Orn)；(f)茶氨酸；(g)同型半胱氨酸(Hey)；(h)甲状腺素(Thx)；氨基酸衍生物诸如甜菜碱；肉毒碱；肌肽肌酸；羟色氨酸；羟脯氨酸(Hyp)；N-乙酰半胱氨酸；S-腺苷甲硫氨酸(SAM-e)；牛磺酸；酪胺。
在一个实施方案中，梭菌毒素包含亲本梭菌毒素的衍生物，例如，在UNIPROT登录号P0DPI1(例如A型)；P10844(例如B型)；P18640(例如C1型)；P19321(例如D型)；Q00496(GENBANK#CAA44558)(例如E型)；P30996(例如F型)；Q60393(例如G型)；H型的GENBANK ID：KGO15617(UNIPARC ID：00052C1529)；X型的GENBANK ID：BAQ12790(UNIPARC ID：0005822796)；UNIPROT登录号P04958(例如TeNT)；Q45851(例如BaNT)；或P30995(例如BuNT)中列出的氨基酸序列的衍生物。如本文所用，术语“衍生物”包括单个氨基酸或上述多肽(包括其片段)的盐、酰胺、酯、酸、碱、溶剂合物、水合物、多晶型物或前药。此类衍生物可以由本领域技术人员使用用于这种衍生化的已知方法易于制备。适合在本文所述方法中使用的衍生物可给动物或人类施用，其基本无毒性作用且具有生物活性或为前药。
在一个实例中，所述衍生物包括氨基酸或毒素多肽的盐。术语“盐”包括来源于本领域熟知的任何合适的有机和无机抗衡离子的盐，并且包括例如上述氨基酸的盐酸盐或氢溴酸盐或碱性或酸性盐。
如果需要，所述衍生物可以另外或替代地为溶剂加合形式，例如，溶剂合物或醇化物。溶剂合物含有化学计量或非化学计量的溶剂，并且可以在使用可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)结晶过程中形成。当溶剂为水时形成水合物；当溶剂为酒精时会形成醇化物。本文所述化合物的溶剂化物可使用常规技术易于制备或形成。
在另一个实施方案中，本文公开了梭菌毒素的多晶型物。多晶型物是指本文所述梭菌毒素的替代晶体形式。蛋白质(或多肽)样品的多晶型纯度可以使用技术(诸如粉末X射线衍射，IR/拉曼光谱)并在某些情况下利用其光学特性的差异进行检查(Thomas等人，Chemical Communications，48：10559-10561(2012))。
根据需要，所述衍生物可进一步包含氨基酸的酰胺或酯和/或氨基酸的异构体(例如互变异构体或立体异构体)。
结构域
本公开内容的实施方案进一步涉及存在于上述梭菌毒素中的结构域和位点，例如易位结构域(HN)、内肽酶结构域或细胞结合结构域，所述结构域和位点包括，包括其亚域，例如，HCN亚域或HCC亚域。在一个实施方案中，本公开内容涉及一种包含位于梭菌毒素的一个或多个结构域或亚域内的细胞结合位点的多肽。此类多肽可包含，例如梭菌毒素细胞结合结构域的一个或多个氨基酸基序。存在于示例性梭菌毒素的每个结构域和亚域的边界区域公开于例如美国专利号8,697,413，其通过引用的方式整体并入本文。各个结构域的边界区域可以使用本领域已知的生物信息学工具(例如，INTERPRO或PROSITE)来近似。因此，如公开于‘413专利的边界区域不是绝对的和微小的变化，例如，1、2、3、4、5、7、10、15、20个或更多氨基酸的差异——其各自代表单个结构域的长度和/或分子量的小于约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或更小％的变化——是允许的，如例如在美国专利号8,841,111和美国专利号8,512,992中所公开的，通过引用的方式整体并入本文。
梭菌毒素或其片段的结合活性可以使用常规技术进行测定，所述常规技术例如放射标记测定法、竞争结合测定法、体外结合测定法(诸如BIAcore表面等离子体(SPR)技术、受体磷酸化、二聚)或信号测定法等。用于评估对应于梭菌毒素片段的多肽的生物学活性的代表性测定法，包括例如评估由梭菌毒素变体介导的基因表达的调节，包括检测在实施例部分描述的多个基因的水平。在另一个实施方案中，生物学活性可以例如通过测量纤维化相关基因的表达和/或对靶细胞(诸如成纤维细胞、纤维化细胞、癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、脂肪细胞、神经元等)的作用在功能上进行评估。实施例中提供了涉及涉及量化由靶细胞(诸如正常或瘢痕衍生的成纤维细胞和癌细胞)分泌的蛋白质的量的代表性方法。
在一个实施方案中，生物活性片段包含梭菌毒素的至少100、300、500、600、800、1000、1200个或更多连续氨基酸。本文所述的梭菌毒素的片段可以通过本领域技术人员已知的方法(例如，重组生物技术技术)产生。片段多肽可以使用本领域已知的方法(例如免疫原性技术，诸如免疫印迹法或ELISA或蛋白质染色技术，诸如银染色)检测。
在某些实施方案中，当在合适的宿主(例如杆状病毒、大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中表达时，所述片段多肽可以被分泌。如本文所用，“分泌的”意指表达的多肽以可以使用常规技术(例如ELISA测定)检测到的水平从宿主细胞分泌到培养基中。合成分泌形式的蛋白质的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，本公开内容涉及包含重链的羧基端区域(HC区域)的梭菌毒素片段，所述重链的羧基端区域包含梭菌毒素结合结构域，其在结合至位于靶细胞表面的受体复合物时并调节靶细胞的基因表达和/或代谢活性。来自梭菌毒素重链的HC区域长度约为400-440个氨基酸，并包含结合结构域(表1)。因此，该实施方案的方面可包括梭菌毒素HC区域，所述梭菌毒素HC区域包含具有例如至少20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或425个氨基酸长度的结合结构域。该实施方案的其它方面可包括梭菌毒素HC区域，所述梭菌毒素HC区域包含具有例如至多20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或425个氨基酸长度的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开内容涉及以下结合结构域片段：BoNT/A的N872-L1296氨基酸(例如，UNIPROT#P0DPI1)；BoNT/B的E859-E1291氨基酸(例如UNIPROT#P10844)；BoNT/C1的N867-E1291氨基酸(例如UNIPROT#P18640)；BoNT/D的S863-E1276氨基酸(例如UNIPROT#P19321)；BoNT/E的R846-K1252氨基酸(例如UNIPROT#Q00496或GENBANK#CAA44558)；BoNT/F的K865-E1274氨基酸(例如UNIPROT#P30996)；BoNT/G的N864-E1297氨基酸(例如UNIPROT#Q60393)；BoNT/H的Y844-L1288氨基酸(例如GENBANK#KGO15617)；TeNT的I880-D1315氨基酸(例如UNIPROT#P04958)；BaNT的I858-E1268氨基酸(例如UNIPROT#Q45851)；或BuNT的K848-K1251氨基酸(例如UNIPROT#P30995)。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及一种包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链的羧基或C端区段(HC)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链的C端区段具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的N端一半的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒毒素的结合结构域的N端一半具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素选自：肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)、肉毒杆菌毒素B血清型(BoNT/B)、肉毒杆菌毒素C1血清型(BoNT/C1)、肉毒杆菌毒素D血清型(BoNT/D)、肉毒杆菌毒素E血清型(BoNT/E)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/F)、肉毒杆菌毒素G血清型(BoNT/G)、肉毒杆菌毒素H血清型(BoNT/H)、肉毒杆菌毒素X血清型(BoNT/X)以及嵌合肉毒杆菌毒素和/或其变体。嵌合毒素的实例包括BoNT/DC、BoNT/CD和BoNT/FA。在一个实施方案中，肉毒杆菌毒素不是肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及具有平均分子量在例如约1kDa至约160kDa、约5kDa至约160kDa、约20kDa至约150kDa、约40kDa至约120kDa、约50kDa至约80kDa、约5kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约20kDa至约30kDa、约30kDa至约40kDa、约40kDa至约50kDa、约50kDa至约60kDa、约60kDa至约70kDa、约70kDa至约80kDa、约80kDa至约90kDa、约90kDa至约100kDa、约100kDa至约110kDa、约110kDa至约120kDa、约120kDa至约130kDa、约130kDa至约140kDa、约140kDa至约150kDa或更大的范围内的梭菌毒素片段，包括介于之间的所有数值，例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa、33kDa、34kDa、35kDa、36kDa、37kDa、38kDa、39kDa、40kDa、41kDa、42kDa、43kDa、44kDa、45kDa、46kDa、47kDa、48kDa、49kDa、50kDa、51kDa、52kDa、53kDa、54kDa、55kDa、56kDa、57kDa、58kDa、59kDa、60kDa、61kDa、62kDa、63kDa、64kDa、65kDa、66kDa、67kDa、68kDa、69kDa、70kDa、71kDa、72kDa、173kDa、74kDa、75kDa、76kDa、77kDa、78kDa、79kDa、80kDa、81kDa、82kDa、83kDa、84kDa、85kDa、86kDa、87kDa、88kDa、89kDa、90kDa、91kDa、92kDa、93kDa、94kDa、95kDa、96kDa、97kDa、98kDa、99kDa、100kDa、101kDa、102kDa、103kDa、104kDa、105kDa、106kDa、107kDa、108kDa、109kDa、110kDa、111kDa、112kDa、113kDa、114kDa、115kDa、116kDa、117kDa、118kDa、119kDa、120kDa、121kDa、122kDa、123kDa、124kDa、125kDa、126kDa、127kDa、128kDa、129kDa、130kDa、131kDa、132kDa、133kDa、134kDa、135kDa、136kDa、137kDa、138kDa、139kDa、140kDa、141kDa、142kDa、143kDa、144kDa、145kDa、146kDa、147kDa、148kDa、149kDa、150kDa或更大，例如至约155kDa、约160kDa、约165kDa、约170kDa、约175kDa、约180kDa、约190kDa、约200kDa、约225kDa、约250kDa、约275kDa或更大。在一个实施方案中，本公开内容涉及梭菌毒素的结合结构域的N端亚域(HCN)，其具有分子量在例如约1kDa至约50kDa、约5kDa至约35kDa、约10kDa至约30kDa、约15kDa至约25kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约10kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约25kDa或大于50kDa的范围内，包括介于之间的所有数值，例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa、33kDa、34kDa、35kDa、36kDa、37kDa、38kDa、39kDa、40kDa、41kDa、42kDa、43kDa、44kDa、45kDa、46kDa、47kDa、48kDa、49kDa、50kDa或更大。在一个实施方案中，本公开内容涉及包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)基本相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容涉及一种包含与梭菌毒素的结合结构域的氨基端(N端)一半基本相同的氨基酸序列，所述梭菌毒素包含来自梭菌毒素的结合结构域的N端一半的前10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250个或更多个连续氨基酸。在这样的实施方案中，所述多肽可具有分子量在例如约1kDa至约25kDa、约5kDa至约20kDa、约6kDa至约15kDa、约8kDa至约15kDa、约8kDa至约14kDa、约6kDa至约25kDa、约8kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa的范围内，包括介于之间的所有数值，例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、5.5kDa、6kDa、7kDa、7.5kDa、8kDa、8.5kDa、9kDa、9.5kDa、10kDa、10.5kDa、11kDa、12kDa、12.5kDa、13kDa、13.5kDa、14kDa、14.5kDa、15kDa、15.5kDa，16kDa、16.5kDa、17kDa、17.5kDa、18kDa、19kDa、20kDa或更大。
在一个相关的实施方案中，本公开内容涉及一种包含与梭菌毒素的结合结构域的C端亚域(HCC)基本相同的氨基酸序列的多肽，所述梭菌毒素具有分子量在例如约1kDa至约50kDa、约5kDa至约35kDa、约10kDa至约30kDa、约15kDa至约25kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约10kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约25kDa或大于50kDa的范围内，包括介于之间的所有数值，例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa、33kDa、34kDa、35kDa、36kDa、37kDa、38kDa、39kDa、40kDa、41kDa、42kDa、43kDa，、44kDa、45kDa、46kDa、47kDa、48kDa、49kDa、50kDa或更大。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了具有上述分子量的梭菌毒素片段，所述分子量在约1kDa至约150kDa之间，特别是在约5kDa至约90kDa之间，尤其是在约10kDa至约70kDa之间，如通过还原凝胶电泳测定。
在其它实施方案中，梭菌毒素(包括其片段)的分子量使用本领域已知的生物信息学工具(例如，PROTPARAM或COMPUTE pI/MW)从理论上计算。例如，基于PROTPARAM，全长BoNT/A(UNIPROT#P0DPI1)具有约149.3kDa的理论分子量，而包含449至1296氨基酸(848个氨基酸)的HC结构域具有约98.2kDa的理论分子量(MW)。在一个特定的实施方案中，基于PROTPARAM，跨越873至1092氨基酸的BoNT/A(UNIPROT#P0DPI19)的HCN结构域具有约26.1kDa的理论分子量。仍在进一步的实施方案中，跨越873至980氨基酸的BoNT/A(UNIPROT#P0DPI1)的HCN结构域的近端N端片段具有约12.65kDa的理论分子量。
在序列比对分析中用于鉴定相同和共有序列的来源于BoNT的各种血清型的BoNTHC结构域和HCN结构域的代表性氨基酸序列在本文中被鉴定为SEQ ID NO：3-9。
修饰
在一些情况下，梭菌毒素(或其结构域或亚域)包含一个或多个修饰。例如，梭菌毒素或其片段可以被环化。作为另一个实例，梭菌毒素或其片段可以具有一个或多个氨基酸修饰，例如，包含一个或多个D-氨基酸。不改变一级序列的目的修饰包括多肽的化学衍生化，例如乙酰化或羧化。还包括糖基化的修饰，例如通过在多肽的合成和加工过程中或在进一步的加工步骤中修饰多肽的糖基化模式(例如，通过使多肽暴露于影响糖基化的酶，诸如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而制得的那些梭菌毒素。还包括具有磷酸化氨基酸残基(例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸)的多肽。
提供了梭菌毒素或其片段，所述梭菌毒素或其片段已经使用普通的分子生物学技术和/或合成化学进行了修饰，从而提高了它们对蛋白水解降解的抵抗力或优化了溶解度性特性或使它们更适合作为治疗剂。此类多肽的类似物包括含有除天然存在的L-氨基酸以外的残基(例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)的那些类似物。
为了多种目的，毒素可以与多种其它寡肽或蛋白质结合。通过提供主题多肽的表达，可以实现各种翻译后修饰。例如，通过采用适当的编码序列，可以提供法尼基化或异戊二烯化。例如，毒素可以在末端结合至脂质基团，从而能够结合至脂质膜，诸如脂质体。
对梭菌毒素或其片段的其它合适的修饰包括，例如，(1)多肽末端的封端，诸如C端的酰胺化作用和/或N端的乙酰化作用或脱氨基作用；(2)在结构中引入拟肽元素；(3)环化作用，其中多肽的环化作用可以通过天然氨基酸或非天然存在的结构嵌段发生。
经修饰的梭菌毒素或其片段可以是类肽(N-置换的寡甘氨酸)，例如，其中氨基酸侧链代替α-碳连接至多肽主链的氮，参见例如Zuckermann等人，J.Am.Chem.Soc.114，10646，1992。
主题毒素可以包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。梭菌毒素或其片段可以包含D-氨基酸、D-和L-氨基酸的组合以及各种“设计的”氨基酸(例如，β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸等)来传达多肽的特殊特性。
融合蛋白和连锁蛋白
应理解，本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素或其片段可任选地包括一种或多种其它组分。作为任选组分的非限制性实例，经修饰的梭菌毒素或其片段可进一步包含含柔性间隔子的柔性区域。柔性间隔子的非限制性实例包括例如G间隔子GGGGS(SEQ ID NO：22)或A-间隔子EAAAK(SEQ ID NO：23)。包含柔性间隔子的柔性区域可用于调节多肽区域的长度，以优化多肽的特征、属性或特性。这样的柔性区域在框内可操作地连接至作为融合蛋白的经修饰的梭菌毒素或其片段。作为非限制性实例，包含一个或多个串联的柔性间隔子的多肽区域可用于使蛋白酶切割位点更好地暴露，由此促进蛋白酶对该位点的切割。作为另一非限制性实例，包含一个或多个串联的柔性间隔子的多肽区域可用于使配体结构域更好地呈现，由此促进该配体结构域结合至其在受体上的结合结构域。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素或其片段可以进一步包含含柔性间隔子的柔性区域。在另一个实施方案中，本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素或其片段可以进一步包含含多个串联的柔性间隔子的柔性区域。在该实施方案的方面中，柔性区域可串联包含例如至少1个G间隔子、至少2个G间隔子、至少3个G间隔子、至少4个G间隔子或至少5个G间隔子。在该实施方案的其它方面中，柔性区域可串联包含例如至多1个G间隔子、至多2个G间隔子、至多3个G间隔子、至多4个G间隔子或至多5个G间隔子。在该实施方案的仍其它方面中，柔性区域可串联包含例如至少1个A间隔子、至少2个A间隔子、至少3个A间隔子、至少4个A间隔子或至少5个A间隔子。在该实施方案的仍其它方面中，柔性区域可串联包含例如至多1个A间隔子、至多2个A间隔子、至多3个A间隔子、至多4个A间隔子或至多5个A间隔子。在该实施方案的另一方面中，经修饰的梭菌毒素或其片段可包含含一个或多个拷贝的相同柔性间隔子、一个或多个拷贝的不同柔性间隔子区域或其任意组合的柔性区域。
梭菌毒素的特性
缺乏毒性谱(profile)
在一个实施方案中，本公开内容考虑了针对经修饰的毒性(包括减少的毒性或没有毒性)的梭菌毒素(例如BoNT/A)或其片段的组合物和方法。如本领域中已知的，梭菌毒素的毒性活性特别地含有在轻链中，所述轻链是选择性地切割可溶性NSF附着蛋白受体(“SNARE”)蛋白的锌(Zn2+)内肽酶。SNARE蛋白对于含有神经递质的囊泡与质膜的细胞质表面的识别和对接以及囊泡与质膜的融合至关重要。TeNT、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G导致小突触泡蛋白(也称为囊泡相关膜蛋白(VAMP))的降解，这是一种突触体膜蛋白。由于这些切割事件中的任一种，从突触囊泡表面延伸的VAMP的大部分细胞质结构域被去除。BoNT/A和BoNT/E选择性切割质膜相关蛋白SNAP-25，所述质膜相关蛋白SNAP-25主要结合至并存在于质膜的细胞质表面。BoNT/C切割突触融合蛋白，一种其大部分质量暴露于细胞质的整合蛋白。突触融合蛋白与突触前的末端活性区的钙通道相互作用。在一些实施方案中，梭菌毒素或其片段的毒性根据神经肌肉麻痹的诱导(其表明毒素分子进入细胞的能力并因此抑制神经递质的释放)来测定。在一些实施方案中，梭菌毒素或其片段的毒性根据LD50值来测定，LD50值是在腹膜内注射毒素构建体后导致一组测试动物(例如小鼠)中50％(一半)死亡的毒素的用量，参见美国专利号7,749,514和9,284,545。
在该实施方案的方面中，梭菌毒素或其片段的毒性为，例如天然存在的梭菌毒素的毒性的约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或＞99％。在该实施方案的方面中，经修饰的梭菌毒素或其片段的毒性为，例如天然存在的梭菌毒素的毒性的至多10％，毒性为天然存在的梭菌毒素的毒性的至多1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或＜95％。优选地，例如当以常规模式施用于受试者时，本公开内容的梭菌毒素片段或变体没有毒性。
在一个实施方案中，本文公开的经修饰的毒性的梭菌毒素或其片段存在应用，包括但不限于：(a)研究(即，例如，研究BoNT/A的作用机制，包括其结合、易位和药代动力学，以及用于开发和测试解毒剂)；(c)评估室内释放的风险和诊断；(d)检查包括灵长类在内的哺乳动物的药代动力学；(d)疫苗开发；(e)抗体开发(用于治疗和诊断)；以及(f)临床治疗应用。
梭菌毒素的毒性可以使用常规方法进行评估。如本领域中已知的，BoNT在细胞中毒中涉及多步机制(Chaddock等人，Trends Biochem.Sci.27，552-558，2002)。神经毒素通过重链(H)结合至神经元的突触前神经末梢，并通过受体介导的内吞作用进入(Schiand等人，Physio.Rev.80，717-755，2000)。核内体的低pH被认为通过HCN诱导通道形成，这允许LC易位到胞质溶胶中(Li等人，Biochemistry 39，6466-6474，2000)。据信，LC可作为锌内肽酶来特异性切割突触囊泡融合必不可少的三种不同的SNARE蛋白中的一种(Montecucco等人，Trends Biochem.Sci.18，324-327，1993；Li等人，Toxin Rev.18，95-112，1999)。在一个实施方案中，BoNT/A和BoNT/E独立地切割突触体相关蛋白25(SNAP-25)，这是反式SNARE复合物的组分，其被提出来是导致膜融合的特异性的原因并通过形成将突触囊泡和质膜结合在一起的紧密复合物直接执行融合。在另一个实施方案中，TeNT和/或BoNT/B、/D、/F和/G切割小细胞囊泡蛋白，一种涉及突触囊泡与突触前膜对接和/或融合的蛋白质。在一个实施方案中，BoNT/C1切割突触融合蛋白和SNAP-25。一旦SNARE蛋白被切割，就阻止了神经递质(即例如乙酰胆碱)的释放，最终导致松弛的肌肉麻痹(Montecucco等人，Q.Rev.Biophys，28：423-472(1995))。肉毒杆菌神经毒素活性位点被认为由HEXXH+E锌结合基序组成(Li等人，Biochemistry 39，2399-2405，2000)。一般构象和活性位点残基在所有梭菌神经毒素中是保守的(Agarwal等人，Biochemistry 44，8291-8302，2005)。例如，在BoNT/A活性位点的氨基酸残基包含H223-E224-L225-I226-H227+E262(“H223-E224-L225-I226-H227”公开为SEQID NO：24)，其在大多数(如果不是全部的话)BoNT亚型中是保守的。
因此，本公开内容涉及一种无内肽酶活性或易位活性或既无内肽酶活性又无易位活性的梭菌毒素的无毒形式。在一个实施方案中，本文提供了缺乏内肽酶活性的梭菌毒素变体。此类变体可包括，例如赋予内肽酶活性的构成活性位点的一个或多个氨基酸残基的突变或缺失。在另一个实施方案中，缺乏内肽酶活性的梭菌毒素变体可包含大部分的缺失，例如，组成轻链(LC)结构域的氨基酸的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约＞99％的缺失。在另一个实施方案中，梭菌毒素变体既无内肽酶活性又无易位活性。在该实施方案中，梭菌毒素变体可包含(a)组成轻链(LC)结构域的氨基酸和(b)组成易位结构域的氨基酸的大部分的缺失。
在BoNT/A的背景下，本公开内容考虑了不切割SNAP-25的片段。用于测量SNAP-25切割活性的试剂和测定法是本领域已知的，参见例如Mizanur等人，PLoS One，9(4)，e95188，2014。
本公开内容进一步涉及无活性的梭菌毒素(包括其片段)。术语“无活性的梭菌毒素”意指对细胞无毒的梭菌毒素。例如，无活性的梭菌毒素具有最小或没有能力干扰神经递质从细胞或神经末梢的释放。在一些实施方案中，无活性的梭菌毒素具有少于有活性的相同梭菌毒素的神经毒性作用(例如抑制神经递质释放的能力)的约50％，例如约40％、约25％、约10％、约5％或更少％，例如约2％。例如，无活性的肉毒杆菌毒素(iBoNT)具有少于有活性的相同BoNT(例如全长BoNT)的神经毒性作用的约50％，例如约40％、约25％、约10％、约5％或更少％，例如约2％。全长无活性的肉毒杆菌毒素公开在例如美国专利号6,051,239和美国专利号7,172,764。在一些实施方案中，无活性的梭菌毒素包含经修饰(例如糖基化)的以减少抗原性的重链。在一些实施方案中，无活性的梭菌毒素为单链多肽。优选地，本公开内容的无活性的梭菌毒素包含无轻链(LC)结构域和/或易位结构域的全长梭菌毒素的片段，其中所述梭菌毒素片段被进一步任选地糖基化以减少抗原性。
如本文所用，术语“减少的抗原性”意指无活性的梭菌毒素在哺乳动物中诱导抗体产生的能力少于全长梭菌毒素的抗原作用，例如少于全长梭菌毒素的抗原作用的约100％、少于约90％、少于约80％、少于约70％、少于约60％、少于约50％，例如约40％、约25％、约10％、约5％或更少％，例如约2％。例如，糖基化的分子可具有减少的抗原性，因为它们在哺乳动物中具有最小或没有诱导免疫应答以产生抗体的能力。此外，分子上的表位区域负责在哺乳动物中诱导抗体。因此，具有突变的或缺失的表位区域的分子可具有减少的抗原性，因为这些区域不再存在于刺激抗体产生的分子上。参见美国专利号7,172,764。例如，与全长梭菌毒素相比，在羧基端(Hc)的重链内包含突变的或缺失的表位区域的iBoNT可具有减少的抗原性。在一些实施方案中，与未糖基化的相同BoNT的施用相比，向哺乳动物中施用糖基化的BoNT诱导更少的抗体产生，减少约2倍、优选地4倍、更优选地8倍或更多。本公开内容的梭菌毒素的抗原性可以使用本领域已知的方法和工具测定，例如Atassi等人，ProteinJ.，23(1)：39-52，2004。
本文公开的实施方案进一步涉及用于测定包括其片段和变体的梭菌毒素的毒性的方法，包括例如生物化学测定法、体外细胞测定法、体内药理学测定法等。在一个实施方案中，梭菌毒素片段或变体在标准内肽酶测定法(参见美国专利号8,618,261；美国专利号8067231；美国专利号8,124,357；美国专利号7,645,570，用于体外测定法中的变体)中缺乏内肽酶活性。在另一个实施方案中，梭菌毒素片段或变体为非致死的。
细胞信号的调节
在一个相关的实施方案中，本文提供了调节一种或多种纤维化相关基因的表达的梭菌毒素、其亚域或片段或其变体，所述基因包括但不限于例如FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7、TP63、SOD2、UBD、HAS2、HAS3、ADAMTS1、IGF-1、IL-6、IL-32、CCL2、BDKRB1、S100A4和ACTA2。
这些纤维化相关基因的表达变化影响纤维化相关细胞、组织和/或器官(包括细胞外基质结构)的结构和功能特征，导致成纤维细胞增殖、成纤维细胞向肌成纤维细胞转变、成纤维细胞收缩性、细胞外基质(ECM)组分(诸如例如胶原蛋白、纤维蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖)的产生和/或分泌以及基质细胞蛋白的产生/分泌的变化。例如，如图1所示，用根据本方法提供的多肽处理正常成纤维细胞增加了涉及ECM修复和重塑的基因(诸如例如MMP1和MMP3)的表达，并且减少了与成纤维细胞收缩性和成肌纤维细胞形成相关的基因(诸如例如S100A4和ACTA2)的表达。由于纤维化和瘢痕的形成与成纤维细胞收缩性、成肌纤维细胞形成相关，因此获得的结果表明，根据本方法提供的多肽具有抗瘢痕和抗纤维化作用。通过“调节”意指梭菌毒素或其片段或变体在与靶细胞(例如成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、皮脂腺细胞、免疫细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、胶质细胞或神经元)接触时，与对照组(例如，BSA处理)相比，可实现一种或多种上述基因表达的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍、-至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍或更多的变化。测量基因表达的方法是本领域已知的，例如，微阵列分析法或定量PCR测定法。代表性的方法在实施例部分中说明。
特别地，本文提供了梭菌毒素、其亚域或片段或变体，当与靶细胞(例如正常成纤维细胞或瘢痕衍生的成纤维细胞、纤维化细胞、癌细胞)接触时，其调节选自FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7、TP63、S100A4和ACTA2的一种或多种基因的表达。特别地，梭菌毒素或其片段或变体在上述六种基因特征中将每个基因的表达调节(例如增加)至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍或更多。这些细胞外基质相关基因的表达变化影响涉及创建、维持和修复真皮外细胞基质(ECM)的蛋白质的产生或分泌。由于瘢痕和纤维化的形成与一些ECM组分的过量产生相关，因此获得的结果表明，根据本方法提供的多肽具有抗瘢痕和抗纤维化作用。
此外，本公开内容涉及调节纤连蛋白表达或分泌的梭菌毒素或其片段或变体。如本文所用，“纤连蛋白”是指结合至ECM中的组成蛋白的细胞外基质的高分子量(～440kDa)糖蛋白，例如胶原蛋白、纤维蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。在一个实施方案中，梭菌毒素或其片段或变体，当与细胞(例如成纤维细胞)接触时，调节纤连蛋白的表达或分泌至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍，至少5倍或更多。纤连蛋白表达或分泌的变化影响真皮(包括细胞外基质结构)的结构和功能，导致抗纤维化作用。
对靶细胞的作用
本公开内容进一步涉及梭菌毒素或其片段或变体，其改变靶细胞(例如与其结合的细胞)的一个或多个特征。在一个实施方案中，所述特征是一种功能属性，诸如成纤维细胞收缩性、迁移、分化、分泌(例如，ECM组分)和粘附(彼此之间以及与基质之间)。在再一个实施方案中，所述特征是基因(诸如涉及ECM修复的基因)的调节表达。在一个特定的实施方案中，所述特征是在介质存在下蛋白质的产生和分泌减弱，例如，由瘢痕衍生的成纤维细胞分泌的纤连蛋白和胶原蛋白的减弱。如实施例中所示，当与靶细胞(例如成纤维细胞)接触时，梭菌毒素片段可实现在特定的蛋白质分泌和/或基因表达的明显变化。另外，用梭菌毒素片段处理低氧诱导的纤维化癌细胞导致对蛋白质分泌的作用与已知的抗纤维化剂(例如FG-3019)相同。
梭菌毒素或其片段或变体的细胞作用可以使用实施例中详细描述的技术来测定。各种靶细胞，例如成纤维细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、胶质细胞、神经元；细胞系；以及组织，包括结缔、上皮和内皮组织，可用于在细胞水平测定梭菌毒素或其片段或变体的作用。
多核苷酸
本公开内容的方面部分提供了多核苷酸分子。如本文所用，术语“多核苷酸分子”与“核酸分子”同义，并且意指任何长度的核苷酸(例如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。构想可编码本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素的任何和所有多核苷酸分子都可适用，包括但不限于天然存在的和非天然存在的DNA分子以及天然存在的和非天然存在的RNA分子。天然存在和非天然存在的DNA分子的非限制性实例包括单链DNA分子、双链DNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、载体构建体，诸如质粒构建体、噬菌粒构建体、噬菌体构建体、逆转录病毒构建体和人工染色体构建体。天然存在和非天然存在的RNA分子的非限制性实例包括单链RNA、双链RNA和mRNA。
在一个实施方案中，所述多核苷酸分子编码一种或多种上述梭菌毒素、其突变体或变体、其结构域和/或亚域，其生物活性或免疫原性片段、其多聚体、其嵌合体和融合构建体、其标签构建体、其模拟物或其其它形式的工程化或合成衍生物。特别地，所述多核苷酸分子是DNA分子，以及尤其地，所述多核苷酸是cDNA分子。还包括与编码一种或多种上述梭菌毒素的多核苷酸互补的多核苷酸，所述梭菌毒素包括突变体、变体或其片段。特别地，所述多核苷酸为编码BoNT/A或其突变体(包括其同源物)的细胞结合结构域的cDNA分子，所述突变体(包括其同源物)的细胞结合结构域，例如BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、TeNT、BaNT或BuNT的细胞结合结构域。特别优选地，所述多核苷酸为编码BoNT/A或其突变体(包括其同源物)的细胞结合结构域的重链N端亚域(HCN)的cDNA分子，所述突变体(包括其同源物)的细胞结合结构域的重链N端亚域(HCN)，例如BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、BoNT/X、eBoNT/J、TeNT、BaNT或BuNT的HCN亚域。
本公开内容还提供了包含编码一种或多种上述梭菌毒素(包括其片段)的核苷酸序列的合成核酸，例如非天然核酸。
本文包括编码在SEQ ID NO：1，19、SEQ ID NO：3-18中列出的梭菌毒素片段序列的核酸或其变体或其同源物或其RNA等同物或其互补RNA等同物，所述变体具有1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30个或更多氨基置换(优选地保守或半保守氨基酸置换)，所述同源物包括与其互补的链。
此外，本文包括编码SEQ ID NO：1，19、SEQ ID NO：3-18的梭菌毒素片段序列的核酸或其变体或其同源物或其RNA等同物或其互补RNA等同物，所述变体具有1、2、3、4、5、4-10、5-10或5至15个氨基酸置换(优选地保守或半保守氨基酸置换)，所述同源物包括与其互补的链。在一些实施方案中，本公开内容的核酸编码BoNT/A突变体的片段，所述BoNT/A突变体的片段包括以下列出的序列、由其组成或由其组成：SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或SEQID NO：27。
本公开内容进一步涉及梭菌毒素片段的核酸同源物，例如编码梭菌毒素的HC结构域，特别是HCN结构域以及尤其是HCN结构域的N端一半的片段，所述梭菌毒素选自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、BoNT/DC、BoNT/X、eBoNT/J、TeNT、BaNT、BuNT，包括其上述亚型。具有基本同源性的序列包括与SEQ ID NO：2所示的序列或编码SEQ ID NO：1，19、SEQ ID NO：3-18中的任一个的核酸具有至少50％、特别是至少65％、以及尤其是至少80％同一性或更高％同一性的核酸序列。序列同一性可以根据本领域已知的方法(例如使用BLAST v2.1)来计算。也参见Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1990；Gish等人，Nature Genet.3：266-272，1993；Madden等人，Meth.Enzymol.266：131-141，1996；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Zhang等人，Genome Res.7：649-656，1997。
本文公开的实施方案进一步涉及制备以上公开的多核苷酸的方法。对于制备本说明书中公开的编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子而言可能必需的成熟的分子生物学技术包括，但不限于，涉及以下的程序：聚合酶链反应(PCR)扩增、限制性酶反应、琼脂糖凝胶电泳、核酸连接、细菌转化、核酸纯化、核酸测序和基于重组的技术，其为完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规程序。制备编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子所必需的特定方案的非限制性实例描述于以下文献中：例如CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Frederick M.Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons，2004)。另外，多种适用于制备编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的商购的产品可广泛获得。这些方案为完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规程序。
本公开内容的另一方面提供了产生梭菌毒素或其片段或变体的方法，其包括例如将包含编码梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的表达构建体引入到细胞中并在所述细胞中表达所述表达构建体的步骤。
本说明书中公开的方法的一部分包括本说明书中公开的所有梭菌毒素或其片段或变体。因此，该实施方案的方面包括但不限于产生天然存在的梭菌毒素、天然存在的梭菌毒素变体(诸如例如梭菌毒素同种型和梭菌毒素亚型)、非天然存在的梭菌毒素变体(诸如例如保守或半保守梭菌毒素变体、非保守梭菌毒素变体)、包含一种或多种上述毒素的嵌合或融合构建体、包含梭菌毒素的至少一个结构域(例如重链的结合结构域)或亚域(例如结合结构域的N端一半)的梭菌毒素片段(例如生物活性片段或免疫原性片段)、包含此类梭菌毒素或其片段或变体的嵌合或融合构建体、标签构建体、工程构建体、合成构建体或其任意组合。
本说明书中公开的方法部分包括多核苷酸分子。特别地，所述多核苷酸分子编码本文公开的任何梭菌毒素或其片段或变体，包括包含梭菌毒素或其片段或变体的融合蛋白。构想可以使用本说明书中公开的任何和所有多核苷酸分子。因此，该实施方案的方面包括但不限于，天然存在和非天然存在的DNA分子包括单链DNA分子、双链DNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、载体构建体，诸如质粒构建体、噬菌粒构建体、噬菌体构建体、逆转录病毒构建体和人工染色体构建体。天然存在和非天然存在的RNA分子的非限制性实例包括单链RNA、双链RNA和mRNA。
本说明书中公开的方法部分包括表达构建体。表达构建体包含可操作地连接至适用于在细胞或无细胞提取物中表达本说明书中公开的多核苷酸分子的表达载体的所述多核苷酸分子。多种表达载体可用于表达编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子，所述表达载体包括但不限于病毒表达载体；原核表达载体；真核表达载体，诸如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体；和无细胞提取物表达载体。应进一步了解，适用于实施这些方法的方面的表达载体可包括在组成性、组织特异性、细胞特异性或诱导性启动子元件、增强子元件或两者控制下表达经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的那些表达载体。表达载体以及用于由这些表达载体制备和使用表达构建体的成熟的试剂和条件的非限制性实例易于从商品供应商获得。适当表达载体的选择、制备和使用为完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规程序。
因此，该实施方案的方面包括但不限于：可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的病毒表达载体；可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的原核表达载体；可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的酵母表达载体；可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的昆虫表达载体；和可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的哺乳动物表达载体。该实施方案的其它方面包括但不限于：适于使用包含可操作连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的无细胞提取物表达载体的无细胞提取物来表达本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的表达构建体。
本说明书中公开的方法的一部分包括细胞。构想可以使用任何和所有细胞。因此，该实施方案的方面包括但不限于原核细胞，包括但不限于，需氧、微需氧、嗜二氧化碳、兼性、厌氧的、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞的菌株，诸如来源于以下的菌株：例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridiaperfringens)、艰难梭菌(Clostridia difficile)、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、Neisseria meningirulls、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，和真核细胞，包括但不限于酵母菌株，诸如例如来源于以下的菌株：巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)；昆虫细胞和来源于昆虫的细胞系，诸如例如来源于以下者：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和烟草天蛾(Manduca Sexta)；属于刺胞动物门的生物体(例如，水螅、海葵、水母或珊瑚，例如鬼手属种(Aiptasia sp.))的刺细胞(具体地，刺胞细胞、线虫细胞或ptychocytes)和/或来源于刺胞动物门的经遗传转化的生物体，参见美国专利号6,923,976)和哺乳动物细胞和来源于哺乳动物细胞的细胞系，诸如例如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、猪科动物、牛科动物、马科动物、灵长类动物和人的细胞系。细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(2004)；欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)(2204)；以及德国微生物与细胞培养物保藏中心(the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(2004)。用于选择、制备和使用适当细胞系的特定方案的非限制性实例描述于以下文献中：例如INSECTCELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus EA.Goosen等人编辑，Marcel Dekker，1993)；INSECT CELL CULTURES：FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M.Vlak等人编辑，KluwerAcademic Publishers，1996)；Maureen A.Harrison&Ian F.Rae，GENERAL TECHNIQUES OFCELL CULTURE(Cambridge University Press，1997)；CELL AND TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES(Alan Doyle等人编辑，John Wiley and Sons，1998)；R.IanFreshney，CULTURE OF ANIMAL CELLS：A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss，第4版2000)；ANIMAL CELL CULTURE：A PRACTICAL APPROACH(John R.W.Masters编辑，OxfordUniversity Press，第3版2000)；MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，同上，(2001)；BASIC CELL CULTURE：A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis，Oxford Press，第2版2002)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，同上，(2004)。其中所述细胞是刺胞动物细胞，可以使用电穿孔的常规技术或使用双链RNA对其进行转化。参见Wittlieb等人，PNASUSA，103(16)：6208-11，2006；Pankow等人，PLoS One，2(9)：e782，2007；Khalturin等人，PLoS Biol.，6(11)：e278，2008。这些方案为在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规程序。
本说明书中公开的方法的一部分包括将多核苷酸分子引入到细胞中。引入到细胞中的多核苷酸分子可以由该细胞短暂或稳定地维持。稳定维持的多核苷酸分子可在染色体外且自主复制，或其可整合到细胞的染色体物质中且非自主复制。构想可使用用于将本说明书中公开的多核苷酸分子引入到细胞中的任何和所有方法。适用于将核酸分子引入到细胞中的方法包括但不限于：化学介导的转染，诸如例如磷酸钙介导、二乙基-氨基乙基(DEAE)葡聚糖介导、脂质介导、聚乙亚胺(PEI)介导、聚赖氨酸介导和聚凝胺介导的转染；物理介导的转染，诸如例如生物弹粒子递送、显微注射、原生质体融合和电穿孔；和病毒介导的转染，诸如例如逆转录病毒介导的转染，参见，例如，Introducing Cloned Genes intoCultured Mammalian Cells，第16.1-16.62页(Sambrook&Russell编辑，MolecularCloning A Laboratory Manual，第3卷，第3版2001)。本领域技术人员应了解，用于将表达构建体引入到细胞中的特定方法的选择一部分取决于所属细胞将短暂包含表达构建体还是所述细胞将稳定含有表达构建体。这些方案为在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规程序。
在该实施方案的一方面中，称为转染的化学介导的方法用于将编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子引入到细胞中。在化学介导的转染方法中，化学试剂与核酸形成促进其吸收至细胞中的复合物。此类化学试剂包括但不限于磷酸钙介导，参见，例如，Martin Jordan&Florian Worm，Transfection of Adherent and Suspended Cellsby Calcium Phosphate，33(2)Methods 136-143(2004)；二乙基-氨基乙基(DEAE)葡聚糖介导、脂质介导、阳离子聚合物介导，如聚乙烯亚胺(PEI)介导和聚赖氨酸介导和聚凝胺介导，参见，例如，Chun Zhang等人，Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery toBrain-Derived Cells，33(2)Methods 144-150(2004)。这样的化学介导的递送系统可通过标准方法制备且可商购，参见例如CELLPHECT转染试剂盒((Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA))；哺乳动物转染试剂盒，磷酸钙和DEAE葡聚糖，(Stratagene，Inc.)；LIPOFECTAMINE TM转染试剂(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，Calif.)；EXGEN 500转染试剂盒(Fermentas，Inc.，Hanover，MD，USA)，以及SUPERFECT和EFFECTINE转染试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA，USA)。
在该实施方案的另一方面中，物理介导的方法用于将编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子引入到细胞中。物理技术包括但不限于电穿孔、生物弹和显微注射。生物弹和显微注射技术在细胞壁上穿孔以将核酸分子引入到细胞中，参见，例如，Biewenga等人，J.Neurosci.Methods，71(1)，67-75(1997)；和O’Brien等人，Methods 33(2)，121-125(2004)。电穿孔(也称为电通透作用)使用短暂的高压电脉冲在膜中形成短暂的孔，核酸分子通过所述孔进入且所述孔可有效用于稳定和短暂转染所有细胞类型，参见，例如，M.Golzio等人，33(2)Methods 126-135(2004)；和Gresch等人，33(2)Methods 151-163(2004)。
在该实施方案的另一方面中，称为转导的病毒介导的方法用于将编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子引入到细胞中。在病毒介导的短暂转导方法，对病毒颗粒感染和在宿主细胞中复制的过程进行操作以使用该机制将核酸分子引入到细胞中。已经由多种病毒开发出病毒介导的方法，所述病毒包括但不限于：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、细小核糖核酸病毒、α病毒和杆状病毒，参见，例如，Blesch等人，33(2)Methods 164-172(2004)；和Federico等人，229Methods Mol.Biol.3-15(2003)；Poeschla等人，5(5)Curr.Opin.Mol.Ther.529-540(2003)；Benihoud等人，10(5)Curr.Opin.Biotechnol.440-447(1999)；Bueler等人，380(6)Biol.Chem.613-622(1999)；Lai等人，21(12)DNA Cell Biol.895-913(2002)；Burton等人，21(12)DNA Cell Biol.915-936(2002)；Grandi等人，33(2)Methods 179-186(2004)；Frolov等人，93(21)PNAS USA11371-11377(1996)；Ehrengruber等人，59(1)Brain Res.Bull.13-22(2002)；Kost等人，20(4)Trends Biotechnol.173-180(2002)；和Huser等人，3(1)Am.J.Pharmacogenomics 53-63(2003)。
腺病毒为非包膜双链DNA病毒，其常选用于哺乳动物细胞转导，因为腺病毒可操纵约36kb的相对较大多核苷酸分子，以高效价产生，且可有效感染多种正分裂细胞和非分裂细胞，参见，例如，Hermens等人，71(1)J.Neurosci.Methods 85-98(1997)；和Mizuguchi等人，52(3)Adv.Drug Deliv.Rev.165-176(2001)。使用基于腺病毒的系统的转导不支持长期蛋白表达，因为该核酸分子在细胞核中由附加体承载，而非整合到宿主细胞染色体中。腺病毒载体系统和如何使用这些载体的特定方案公开于以下文献中：例如VIRAPOWERTM腺病毒表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA，USA)和VIRAPOWERTM腺病毒表达系统说明手册25-0543版本A，Invitrogen，Inc.；和ADEASYTM腺病毒载体系统(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA，USA)和ADEASYTM腺病毒载体系统说明手册，Stratagene，Inc.。
多核苷酸分子递送也可使用单链RNA逆转录病毒，诸如例如致癌逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒介导的转导常产生接近100％的转导效率，可通过改变感染复数(MOI)来容易地控制前病毒拷贝数，且可用于短暂或稳定转导细胞，参见例如，Tonini等人，285Methods Mol.Biol.141-148(2004)；Blesch等人，33(2)Methods 164-172(2004)；Recillas-Targa等人，267 Methods Mol.Biol.417-433(2004)；和Wolkowicz等人，246Methods Mol.Biol.391-411(2004)。逆转录病毒颗粒由包装于由脂质包膜围绕的蛋白质衣壳中的RNA基因组组成。逆转录病毒通过将其RNA连同逆转录酶一起注射到细胞质中来感染宿主细胞。RNA模板接着逆转录成线性双链cDNA，所述线性双链cDNA通过整合到宿主细胞基因组中来复制其自身。病毒粒子同时垂直传播(通过前病毒从亲本细胞传播到子代细胞)和水平传播(通过病毒颗粒从细胞至细胞)。此复制策略使得能够长期持续表达，因为目的核酸分子被稳定整合到宿主细胞的染色体中，由此使得蛋白质能够长期表达。例如，动物研究表明，注射到多种组织中的慢病毒载体产生持续的蛋白质表达超过1年，参见，例如，Naldini等人，272(5259)Science 263-267(1996)。致癌逆转录病毒来源的载体系统，例如莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMLV)，已被广泛使用且感染许多不同的非分裂细胞。慢病毒也可感染许多不同的细胞类型(包括正分裂和非分裂细胞)且具有复杂的包膜蛋白，其允许实现高度特异性的细胞靶向。
逆转录病毒载体和如何使用这种载体的特定方案公开于以下文献中：例如美国专利号5,464,758；美国专利号No.5,464,758；美国专利号5,814,618；美国专利号5,514,578；美国专利号5,364,791；美国专利号5,874,534；和美国专利号5,935,934。此外，这种病毒递送系统可通过标准方法制备且可商购，参见例如BDTM TET-OFF和TET-ON基因表达系统(BDBiosciences-Clonetech，Palo Alto，CA，USA)和BDTM TET-OFF和TET-ON基因表达系统使用手册，BD Biosciences，GENESWITCHTM系统(Invitrogen，Inc.，Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA，USA)和GENESWITCHTM系统，用于哺乳动物细胞的米非司酮调控的表达系统版本D，25-0313，Invitrogen，Inc.，(2002年11月4日)；VIRAPOWER TM慢病毒表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA，USA)和VIRAPOWERTM慢病毒表达系统说明手册，Invitrogen，Inc.；和
Figure BDA0002640530420000641
逆转录病毒诱导性哺乳动物表达系统(Stratagene，LaJolla，CA，USA)和COMPLETE
Figure BDA0002640530420000642
逆转录病毒诱导性哺乳动物表达系统说明手册。
本说明书中公开的方法的一部分包括由多核苷酸分子表达经修饰的梭菌毒素或其片段或变体。构想多种表达系统中的任一种均可适用于本说明书中公开的多核苷酸分子表达经修饰的梭菌毒素或其片段或变体，包括但不限于基于细胞的系统和无细胞表达系统。基于细胞的系统包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。无细胞系统包括但不限于麦芽提取物、兔网状细胞提取物和大肠杆菌提取物，且通常等同于本文公开的方法。使用表达系统表达多核苷酸分子可包括多种特征中的任一种，所述特征包括但不限于诱导性表达、非诱导性表达、组成性表达、病毒介导的表达、稳定整合性表达和短暂表达。包括充分表征的表达载体、试剂、条件和细胞的表达系统已成分确立且易于从商品供应商获得，所述商品供应商包括但不限于Ambion，Inc，Austin，Tex；BD Biosciences-Clontech，Palo Alto，Calif；BDBiosciences Pharmingen，San Diego，Calif；Invitrogen，Inc，Carlsbad，Calif；QIAGEN，Inc，Valencia，Calif；Roche Applied Science，Indianapolis，Ind；和Stratagene，LaJolla，Calif。例如，关于选择和使用适当异源表达系统的非限制性实例描述于以下文献中：例如PROTEIN EXPRESSION.A PRACTICAL APPROACH(S.J.Higgins和B.David Hames编辑，Oxford University Press，1999)；Joseph M.Fernandez&James P.Hoeffler，GENEEXPRESSION SYSTEMS.USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION(Academic Press，1999)；和Rai等人，80(9)Curr.Sci.1121-1128，(2001)。这些方案为完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规程序。
多种基于细胞的表达程序适用于表达由本说明书中公开的多核苷酸分子编码的经修饰的梭菌毒素或其片段或变体。实例包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。病毒表达系统包括但不限于VIRAPOWERTM慢病毒(Invitrogen，Inc.)、腺病毒表达载体(Invitrogen，Inc.)、ADEASYTM XL腺病毒载体系统(Stratagene)和
Figure BDA0002640530420000651
逆转录病毒基因表达系统(Stratagene)。原核表达系统的非限制性实例包括CHAMPIONTM pET表达系统(EMDBiosciences-Novagen，Madison，WI，USA)、TRIEXTM细菌表达系统(EMD Biosciences-Novagen，Madison，WI，USA)、
Figure BDA0002640530420000653
表达系统(QIAGEN，Inc.)和
Figure BDA0002640530420000652
蛋白质表达与纯化系统(Stratagene)。酵母表达系统包括但不限于EASYSELECTTM毕氏酵母表达试剂盒(Invitrogen，Inc.)、YES-ECHOTM表达载体试剂盒(Invitrogen，Inc.)和SPECTRATM粟酒裂殖酵母表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，Calif.)。杆状病毒表达系统的非限制性实例包括BACULODIRECTTM(Invitrogen，Inc.)、BAC-TO-
Figure BDA0002640530420000654
(Invitrogen，Inc.)和BD BACULOGOLDTM(BD Biosciences-Pharmigen，San Diego，CA，USA)。昆虫表达系统包括但不限于果蝇表达系统
Figure BDA0002640530420000655
(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，Calif.)、INSECTSELECTTM系统(Invitrogen，Inc.)和INSECTDIRECTTM系统(EMD Biosciences-Novagen)。哺乳动物表达系统的非限制性实例包括T-REXTM(四环素调控的表达)系统(Invitrogen，Inc.)、FLP-INTM T-RExTM系统(Invitrogen，Inc.)、PCDNATM系统(Invitrogen，Inc.)、pSecTag2系统(Invitrogen，Inc.)、
Figure BDA0002640530420000656
系统、INTERPLAYTM哺乳动物TAP系统(Stratagene)、COMPLETE
Figure BDA0002640530420000657
诱导性哺乳动物表达系统(Stratagene)和
Figure BDA0002640530420000658
II诱导性哺乳动物表达系统(Stratagene)。
表达由本说明书中公开的多核苷酸分子编码的经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的另一个程序采用无细胞表达系统，诸如但不限于原核提取物和真核提取物。原核细胞提取物的非限制性实例包括RTS 100大肠杆菌HY试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN，USA)、ACTIVEPRO体外翻译试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX，USA)、ECOPROTM系统(EMD Biosciences)和EXPRESSWAYTM Plus表达系统(Invitrogen，Inc.)。真核细胞提取物包括但不限于RTS 100麦芽CECF试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN，USA)、
Figure BDA0002640530420000661
偶联麦芽提取物系统(Promega Corp.)、麦芽IVTTM试剂盒(Ambion，Inc.)、网状细胞溶胞物IVTTM试剂盒(Ambion，Inc.)、
Figure BDA0002640530420000662
II系统(Ambion，Inc.)和
Figure BDA0002640530420000663
偶联网状细胞溶胞物系统(Promega Corp.)。
密码子优化序列
本文包括上述核酸序列和载体的密码子优化序列。可使用免费从Integrated DNATechnologies，Inc.，Coralville，Iowa，USA获得的密码子优化工具(CODONOPT)对宿主细胞(例如细菌，诸如大肠杆菌或昆虫Hi5细胞)中的表达进行密码子优化。
组合物
本公开内容的实施方案进一步涉及含有一种或多种梭菌毒素(包括其片段或变体)和载体的组合物。进一步的实施方案涉及包含核酸、密码子优化的核酸、载体和生产系统的组合物，所述产生系统例如宿主细胞，编码一种或多种梭菌毒素，包括其片段或变体。仍进一步，本公开内容的的实施方案涉及包含特异性结合于一种或多种梭菌毒素(包括其片段或变体)的抗体的组合物。
在一方面，本公开内容涉及药学上可接受的药物组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指任何分子实体或组合物在给个体施用时不产生不良反应、过敏反应或其它意外或不当反应。如本文所用，术语“药学上可接受的组合物”与“药物组合物”同义且是指治疗有效浓度的活性成分，诸如例如本说明书中公开的任何梭菌毒素、片段、变体或嵌合体。包含梭菌毒素、梭菌毒素片段或其变体的药物组合物适用于医学和兽医应用。药物组合物可单独或与其它补充活性成分、药剂、药物或激素组合给患者施用。药物组合物可使用多种方法中的任一种制造，所述方法包括但不限于常规混合、溶解、粒化、研末、乳化、囊封、封装和冻干。药物组合物可采取多种形式中的任一种，所述形式包括但不限于无菌溶液、混悬液、乳液、冻干产物、片剂、丸剂、药丸、胶囊、散剂、糖浆、酏剂或适于施用的任何其它类型。
还构想包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素片段或变体的药物组合物可任选地包括促进活性成分加工成药学上可接受的组合物的药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指施用时基本上不具有长期或持续有害作用的任何载体，且包括诸如“药学上可接受的媒剂、稳定剂、稀释剂、添加剂、助剂或赋形剂”等术语。这种载体通常与活性化合物混合或允许稀释或包封活性化合物且可为固体、半固体或液体试剂。应了解，活性成分可溶解或可以期望载体或稀释剂中的混悬液形式递送。可使用多种药学上可接受的载体中的任一种，包括但不限于水性介质，诸如例如水、生理食盐水、甘油、透明质酸等；固体载体，诸如例如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等；溶剂；分散介质；包衣；抗细菌和抗真菌剂；等渗剂和吸收延迟剂；或任何其它无活性的成分。药学上可接受的载体的选择可取决于施用模式。除非任何药学上可接受的载体与活性成分不相容，否则预期其可在药学上可接受的组合物中的使用。这种药用载体的特定用途的非限制性实例可见于以下文献中：PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS(Howard C.Ansel等人编辑，Lippincott Williams&WilkinsPublishers，第7版1999)；REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(AlfonsoR.Gennaro编辑，Lippincott，Williams&Wilkins，第20版2000)；GOODMAN&GILMAN’S THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(Joel G.Hardman等人编辑，McGraw-HillProfessional，第10版2001)；和HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(RaymondC.Rowe等人，APhA Publications，第4版2003)。这些方案为常规程序且任何修饰完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得。
还构想本说明书中公开的药物组合物可任选地包括但不限于其它药学上可接受的组分(或药用组分)，包括但不限于缓冲剂、防腐剂、张力调节剂、盐、抗氧化剂、渗透压调节剂、生理物质、药理学物质、膨胀剂、乳化剂、湿润剂、甜味剂或调味剂等。各种缓冲剂和用于调节pH值的手段可用于制备本说明书中公开的药物组合物，条件是所得制剂为药学上可接受的。这种缓冲剂包括但不限于乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、中性缓冲盐、磷酸盐缓冲生理食盐水和硼酸盐缓冲剂。应了解，需要时，酸或碱可用于调节组合物的pH值。药学上可接受的抗氧化剂包括但不限于偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙酰基半胱氨酸、丁基化羟基苯甲醚和丁基化羟基甲苯。使用防腐剂包括但不限于苯扎氯胺、氯丁醇、硫柳汞、乙酸苯汞、硝酸苯汞、稳定化氧氯组合物(诸如例如
Figure BDA0002640530420000681
)和螯合剂(诸如例如DTPA或DTPA双酰胺、DTPA钙和CaNaDTPA双酰胺)。适用于药物组合物中的张力调节剂包括但不限于盐(诸如例如氯化钠、氯化钾)、甘露糖醇或甘油和其它药学上可接受的张力调节剂。药物组合物可以盐形式提供且可与多种不同的酸形成，所述包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐倾向于比相应游离碱形式更可溶于水性或其它质子性溶剂中。应了解，这些和药理学领域中已知的其它物质可包括于适用于本发明的药物组合物中。
在一个实施方案中，组合物包含梭菌毒素或梭菌毒素片段或变体和粘性载体。“粘性载体”意指一种生物相容性化合物，当与肉毒杆菌神经毒素一起配制时，在体内局部注射制剂时所述生物相容性化合物可提供贮库，从所述贮库释放的梭菌毒素或其片段或变体的量使梭菌毒素或其片段或变体的扩散程度远离局部注射部位和/或远离局部注射部位扩散的梭菌毒素或其片段或变体的量显著减少。根据本公开内容，可以使用任何合适的粘性载体，例如眼科上可接受的粘性载体。粘性载体以向药物递送系统提供所需的粘度的有效量存在。有利地，粘性载体的存在量为药物递送系统的约0.5重量％至约95重量％的范围。所使用的粘性载体的具体量取决于许多因素，所述许多因素包括例如但不限于所使用的具体粘性载体、所使用的粘性载体的分子量、所产生和/或所使用的本药物递送系统所需的粘度等因素。
适用的粘性载体的实例包括但不限于透明质酸、卡波姆、聚丙烯酸、纤维素衍生物、聚卡波非、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、糊精、多糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、肝素、蛋白聚糖(HSPG)、硫酸肝素(HS)、其衍生物及其混合物。粘性载体的代表性类型公开于美国专利号9,044,477；美国专利号9,622,957；美国专利号9,050,336。
真皮填充剂也可用作粘性载体。用于该目的的合适的真皮填充剂包括胶原蛋白(无菌胶原蛋白以商品名ZYDERM、ZYPLAST、COSMODERM、COSMOPLAST和AUTOLGEN出售)、
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(透明质酸)、
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(透明质酸)，SCULPTRATM(聚乳酸)、RADIESSETM(羟基磷灰石钙)和JUVEDERMTM。可获自Allergan，Inc.(Irvine，CA，USA)的JUVEDERMTM包含无菌、可生物降解、无热原、粘弹性、透明、无色的由在生理缓冲液中配制的浓度为24mg/ml的交联透明质酸组成的均质凝胶。真皮填充剂的代表性类型公开于美国专利号9,622,957；美国专利号9,161,970；美国专利号9,050,336。
目前适用的粘性载体的分子量可在约10,000道尔顿或少于约2百万道尔顿或更高的范围内。在一个特别适用的实施方案中，所述粘性载体的分子量在约100,000道尔顿或约200,000道尔顿至约1百万道尔顿或约150万道尔顿的范围内。此外，根据本公开内容适用的粘性载体的分子量基于所使用的粘性载体的类型和所讨论的本发明的药物递送系统的所需的最终粘度以及可能的其它因素，可在相当大的范围内变化。
在一个非常适用的实施方案中，所述载体为聚合透明质酸盐组分，例如金属透明质酸盐组分，优选地选自碱金属透明质酸盐、碱土金属透明质酸盐及其混合物，以及仍更优选地选自透明质酸钠和其混合物。这种透明质酸盐组分的分子量优选地在约50,000道尔顿或约100,000道尔顿至约130万道尔顿或约200万道尔顿的范围内。在一个实施方案中，本发明的组合物包含聚合透明质酸酯组分，其量为约0.05％至约0.5％(w/v)范围。在进一步的适用的实施方案中，所述透明质酸盐组分的存在量为组合物的约1％至约4％(w/v)的范围。在后一种情况下，很高的聚合物粘度形成凝胶，该凝胶将颗粒沉降速率减慢到一定程度，使得在药物递送系统的估计货架寿命(例如至少约2年)内通常无需重悬过程。由于凝胶不易于通过针和注射器从大容器中去除，因此这种药物递送系统可以在预填充的注射器中销售。
在另一个实施方案中，所述载体是热可逆胶凝剂，诸如例如在美国专利号9,107,815中描述的泊洛沙姆407。这种包含热可逆凝胶的组合物可以作为在注射后粘度迅速增加的低粘度液体施用(如通过注射)。所得高粘度基质为粘性的、可生物降解的和生物相容性的，且在施用时形成可以从其释放肉毒杆菌毒素的贮库，由此提供了持续或长期释放的药物递送系统。以这种模式，可使用较低剂量的肉毒杆菌毒素。这样的药物组合物可以预先混合或作为简单的重构载体或在施用时结合其几个隔室施用，如使用双腔注射器。热可逆胶凝剂的代表性类型公开于例如美国专利号8,168,206；美国专利第8,642,047号；和美国专利号9,278,140。
在一些实施方案中，为了增加梭菌毒素或其片段或变体在关节中的停留时间，梭菌毒素或其片段或变体在控释系统中提供，所述控释系统包括聚合物基质囊封的梭菌毒素或其片段或变体，其中少量(fractional amount)梭菌毒素或其片段或变体以受控的模式在较长时间内从聚合物基质中释放。控释神经毒素系统已经例如在美国专利号6,585,993；美国专利号6,585,993；美国专利号6,306,423；和美国专利号6,312,708中公开。
在一个实施方案中，本公开内容涉及包含梭菌毒素或其片段或变体的局部组合物。代表性实例包括，例如，包含BoNT/A片段(例如，梭菌毒素的全长重链(HC)或其N端结构域(HCN)或其变体)的局部乳膏，其通过商业上可行的离子纳米粒子技术
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(Transdermal Corp.，Birmingham，MI，USA)递送。参见美国专利号7,838,011号；美国专利号7,727,537；美国专利号8,568,740。
用于局部施用的药物化合物和制剂可包括软膏剂、洗剂(例如皮肤护理洗剂)、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。可使用常规的药物载体、水的、粉末或油基、增稠剂等。优选的局部制剂包括其中本发明的化合物与局部递送药剂(例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂)掺合的那些制剂。优选的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰基磷酸酰基DOPE乙醇胺(dioleoylphosphatidyl DOPEethanolamine)、二肉豆蔻酰基磷酸酰基胆碱(dimyristoylphosphatidyl choline)DMPC、二硬脂酰基磷酸酰基胆碱(distearolyphosphatidyl choline))、阴性的(例如，二肉豆蔻酰基磷酸酰基甘油(dimyristoylphosphatidyl glycerol)DMPG))和阳离子的(例如二油酰基四甲基氨丙基DOTP(dioleoyltetramethylaminopropyl DOTAP)和二油酰基磷酸酰基乙醇胺(dioleoylphosphatidyl ethanolamine)DOTMA)。本公开内容的梭菌毒素或其片段或变体可以被囊封在脂质体内或与其形成络合物，特别是与阳离子脂质体。或者，化合物可与脂质络合，特别是与阳离子脂质。优选的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单甘油一油酸酯(monoolein)、甘油二月桂酸酯、甘油1-单癸酸酯(glyceryl 1-monocaprate)、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮(1-dodecylazacycloheptan-2-one)、一种酰基肉碱、一种酰基胆碱或一种C1-10烷基酯(例如肉豆蔻酸异丙酯IPM)、单酸甘油酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部制剂在美国专利号6,747,014中详细描述。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及包含梭菌毒素或其片段或变体的透皮组合物，更具体地涉及能够通过皮肤或上皮(也称为“透皮递送”)运输或递送梭菌毒素或其片段或变体的此类组合物。如本文所述，此类组合物可用作用于向受试者提供肉毒杆菌毒素的局部应用，用于各种治疗、美学和/或美容目的。例如，用于局部递送的组合物可包含具有效率基团的带正电荷的载体分子，使得毒素透皮施予肌肉和/或其它皮肤相关结构。运输发生时肉毒杆菌毒素没有被共价修饰。示例性的组合物和递送系统在由Revance Therapeutics开发的贴剂中提供，例如美国专利号8,568,740；美国专利号8,518,414；美国专利号9,180,081；美国专利号8,404,249；美国专利号8,962,548；美国专利号9,211,248；美国专利号8,398,997；美国专利号8,974,774；美国专利号8,926,991；和美国专利号8092788。另参见美国专利号8,404,249；美国专利号9,144,692；和美国专利美国专利号7,704,524。在一个实施方案中，透皮递送系统为贴剂。透皮贴剂通常具有以下特征：粘胶层(可应用于人的皮肤)，用于存放药剂的贮库或储库，以及可防止药物从贮库渗漏的外表面。贴剂的外表面通常为非粘性的。根据本公开内容，将梭菌毒素或其片段或变体掺入到贴剂中，使得神经毒素在较长时间段内保持稳定。梭菌毒素或其片段或变体可掺入到稳定梭菌毒素或其片段或变体且允许梭菌毒素或其片段或变体从基质和贴剂扩散的聚合物基质中。在本公开内容的一个实施方案中，含有毒素和增强剂的组合物以粘合贴剂的形式提供。梭菌毒素或其片段或变体还可掺入到贴剂的粘胶层中，使得一旦将贴剂施用到皮肤，梭菌毒素或其片段或变体可通过皮肤扩散。用于递送蛋白质的粘性贴剂的实例是众所周知的。例如，参见美国专利号296,006(外观设计专利)；美国专利号6,010,715；美国专利号5,591,767；美国专利号5,008,110；美国专利号5,683,712；美国专利号5,948,433；和美国专利号5,965,154。在一些实施方案中，所述贴剂可包括脂质囊泡(参见美国专利号6,165,500)。在一些实施方案中，所述贴剂可包括属于刺胞动物门(例如鬼手属种)的生物体的刺细胞(具体地，刺胞细胞、线虫细胞或ptychocytes)，所述刺细胞已经用包含编码本公开内容的梭菌毒素或其片段或变体的核酸的载体转化。在一些实施方案中，所述贴剂可包括在特异性的细胞(例如刺细胞)中表达本公开内容的梭菌毒素或其片段或变体的刺胞动物门的转基因生物。
试剂盒
本公开内容的另一个方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含梭菌毒素或其片段或变体，包括编码梭菌毒素或其片段或变体的核酸，或结合于梭菌毒素或其片段或变体的抗体和说明材料。在一个实施方案中，梭菌毒素或其片段或变体为免疫原性组合物的一部分。在另一个实施方案中，梭菌毒素或其片段或变体是缀合物(例如标记蛋白)的一部分。如本文所用，“说明材料”包括出版物、记录、图表或任何其它表达介质，其用于传达梭菌毒素或其片段或变体在诊断、成像、治疗、改善、缓解、抑制、预防或减轻受试者的障碍或通过本文所述的途径施用这种组合物的有效性。所述说明材料还可以例如描述梭菌毒素或其片段或变体的合适剂量。本公开内容的试剂盒的说明材料可以例如固定在含有梭菌毒素或其片段或变体的容器上，或与含有梭菌毒素或其片段或变体的容器一起运输。或者，所述说明材料可以与容器分开运输，目的是使所述说明材料和经修饰的BoNT/A多肽由接受者配合使用。
本公开内容还包括包含梭菌毒素或其片段或变体的试剂盒以及用于将多肽递送至受试者的递送设备。例如，所述递送设备可为可压缩的喷雾瓶、定量喷雾瓶、气溶胶喷雾设备、喷雾器、干粉递送设备、自推进溶剂/粉末分配设备、注射器、针、卫生棉条或剂量测量容器。所述试剂盒可进一步包含本文所述的说明材料。
通常，所述容器可容纳一种或多种制剂以及在容器上或与容器相关的可指示重构和/或使用方向的标签。例如，所述标签可指示所述制剂被重构为如上所述的浓度。所述标签可进一步表明所述制剂是适用于或打算用于例如皮肤施用。在一些实施方案中，容器可含有单剂量的含有梭菌毒素或其片段或变体的稳定制剂。在各种实施方案中，单剂量的稳定制剂以少于约0.5ml或更少的体积存在。或者，容纳所述制剂的容器可为多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如2-6次)制剂。试剂盒或其它制品可进一步包括包含合适的稀释剂(例如，BWFI、生理食盐水、缓冲生理食盐水)的第二容器。在稀释剂和制剂混合后，重构制剂中的最终多肽浓度通常将为至少1pg/ml(例如，至少5pg/ml、至少10pg/ml、至少20pg/ml、至少50pg/ml、至少100pg/ml、至少300pg/ml、至少500pg/ml、至少1ng/ml、至少3ng/ml、至少10ng/ml、0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml或更高)。试剂盒或其它制品还可以包括从商业和用户角度考虑所需的其它材料，所述其它材料包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明的包装说明书。在一些实施方案中，试剂盒或其它制品可包括施用说明。
设备和系统
本公开内容的实施方案进一步涉及包含梭菌毒素(包括其片段或变体)的设备和/或系统。递送系统的代表性实例包括例如用于囊封和控制递送多种蛋白质药物的聚醚酯共聚物微球，所述蛋白质药物包括破伤风和肉毒杆菌抗毒素(参见美国专利号5,980,948)；包含可生物降解的聚合物的连续基质的微球颗粒，所述连续的基质包含含有肉毒杆菌毒素(美国专利号5,902,565)的离散区域。在另一个实施方案中，所述递送系统包括用于在几天到几年的时间内脉动或连续体内释放神经毒素的植入物(参见，例如，美国专利号6,383,509；美国专利号6,506,399；美国专利号6,312,708；美国专利号6,585,993；和美国专利号6,306,423)。如本文所用，“植入物”通常涉及控释(例如脉动或连续)组合物或药物递送系统。所述植入物可以例如注射、插入或植入到受试者的体内。所述植入物可被施用几天直至一年或更长，例如7天、15天、30天、1个月、3个月、6个月、1年或更长。
在一个特定的实施方案中，本文提供了用于将梭菌毒素递送到受试者的皮肤中的递送系统。人体皮肤具有两个不同的层，其厚度在约1.5到约4毫米或更多之间变化，取决于身体的区域。第一层是称为表皮的表层。它是相对较厚的上皮。表皮深处是称为真皮的第二层。真皮是纤维结缔组织且包含汗腺和支配这些汗腺的神经或神经末梢。皮肤下面是称为皮下组织的脂肪层，所述皮下组织也可以认为是皮下层的一部分。在皮下组织或皮下层下面是人体特殊结构(例如肌肉)的深筋膜投资。
因此，在一个实施方案中，所述递送将梭菌毒素或编码梭菌毒素的DNA递送至动物或人受试者的组织。在一个实施方案中，所述梭菌毒素被递送至存在神经末梢的皮肤层。例如，递送到真皮层。在另一个实施方案中，递送至皮肤的至少一层且基本递送至组织下面。例如，梭菌毒素或其片段或变体被递送至皮肤的真皮层和皮下层。在另一个实施方案中，梭菌毒素被递送至皮肤和肌肉组织下面。在又一个实施方案中，梭菌毒素基本被递送至肌肉组织。
包含载体和梭菌毒素和/或编码梭菌毒素的DNA的组合物向位点的递送可以通过本领域已知的任何方法，例如基于针的递送方法或无针的递送方法来完成。
在一个实施方案中，所述组合物通过无针递送来递送。无针注射器及其用途在本领域中是众所周知的。参见例如，公开了无针注射器的美国专利号6,053,889；美国专利号6,013,050；美国专利号6,010,478；美国专利号6,004,286和美国专利号5,899,880。在一个实施例中，无针注射器包括细长的管状喷嘴且连接到或能够连接到用于产生超声波气体流(例如氦气爆发)的合适的励磁装置，所述励磁装置使介质以较高速度向皮肤表面加速并进入到皮肤表面。这种设备可购自POWDERJECT Pharmaceuticals，Oxford，UK。在一个实施方案中，所提供的气压必须足以将组合物释放到目标位点，例如真皮中，但又不能太高以致于损害目标。在另一个实施方案中，所提供的气压足以将组合物递送至目标位点，例如真皮，但又不能太高以致于损害皮肤表面例如上皮。在另一个实施方案中，气压足以将组合物递送至真皮层，但不递送至下面的层，例如皮下层和/或肌肉组织。在另一个实施方案中，所提供的气压必须足以将药物颗粒释放到目标位点，例如真皮和/或基本到肌肉组织下面，但又不能太高以致于损害皮肤表面。
使用无针注射器的益处包括，例如，最佳递送到特定的组织层，例如真皮层。此外，在递送至真皮而不是肌肉组织的情况下，所述治疗可能不会导致被治疗区域中的运动功能丧失。此外，使用无针注射器可通过消除因针意外伤害或液体喷射注射器可能溅回的体液引起的感染风险来提高临床安全性，由此避免了诸如血源性病原体(诸如HIV和乙型肝炎)交叉污染的可能性。无针注射器还提供最佳且特定的药物颗粒递送，以治疗几乎没有疼痛或皮肤损伤(诸如挫伤或出血)的病况。含有纯化梭菌毒素的无针系统公开于美国专利号7,255,865。
在另一个实施方案中，本公开内容进一步涉及包含梭菌毒素和载体的基于针的系统。注射系统的代表性类型是本领域已知的，例如，美国专利号8,603,028(关于具有成角度尖端部分的注射设备)；美国专利号8,801,659(关于用于将粘性剂递送到软组织中的注射设备)。在某些实施方案中，组合物可通过传统的递送系统(例如注射器、导管、针和其他设备)注射到位点。
剂量
在一个实施方案中，本文公开的组合物包含有效量的梭菌毒素或其片段。当用于治疗病况时，术语“有效量”可以是足以治疗症状的剂量，例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在仅包含结合结构域和/或其片段的梭菌毒素的情况下，剂量通常在0.1-1000mg/天的范围内，以及可为例如在1-500pg/天、100-5000pg/天、1-500ng/天、100-5000ng/天、1-500μg/天、100-5000μg/天、5-1000mg/天、10-500mg/天、20-500mg/天、50-500mg/天、10-200mg/天、10-100mg/天或100-500mg/天的范围内，并由医生根据具体情况确定实际施用量，所述有关情况包括患者的年龄和体重，患者的一般身体状况以及施用途径。当使用重复施用时，施用频率部分取决于药物组合物的半衰期。
在另一个实施方案中，梭菌毒素或其片段或变体在制剂中的浓度可为在约1pg/ml至1000pg/ml毒素、1ng/ml至1000μg/ml毒素，例如，约10ng/ml至500μg/ml毒素、100ng/ml至100μg/ml毒素、200ng/ml至500μg/ml毒素、200ng/ml至5000ng/ml毒素、500ng/ml至5000ng/ml、10ng/ml至5000ng/ml、20ng/ml至5000ng/ml、50ng/ml至1000ng/ml、100ng/ml至10μg/ml、100ng/ml至5000ng/ml、100ng/ml至1000ng/ml、10ng/ml至100ng/ml、200ng/ml至10μg/ml、200ng/ml至1000ng/ml、500ng/ml至50μg/ml、500ng/ml至10μg/ml或1000ng/ml至10μg/ml毒素的范围内。在另一个实施方案中，制剂中梭菌毒素或其片段或变体的浓度可为在约1pM至500pM、0.1nM至500μM、1.0nM至500μM、1.0nM至100μM、1.0nM至50μM、1.0nM至10μM、1.0nM至500nM、1.0nM至100nM、1.0nM至10nM、10nM至100μM、10nM至50μM、10nM至10μM、10nM至5μM、10nM至1μM、50nM至500μM、50nM至100μM、50nM至10μM、50nM至1μM、50nM至500nM、50nM至100nM、1nM至10μM、10nM至10μM、20nM至10μM、100nM至10μM、1μM至1mM、1μM至500μM、1μM至500μM、5μM至500μM、10μM至100μM、1nM至500μM、10nM至100μM、10nM至10μM、20nM至1μM、1nM至500nM、10nM至100nM、20nM至50nM、1nM至100nM、3nM至50nM毒素的范围内。
剂量可以是单剂量或累积剂量(连续剂量)，并且可由本领域技术人员易于确定。例如，皮肤障碍的治疗可包括一次性施用有效剂量的本文公开的组合物。作为非限制性实例，本文公开的有效剂量的组合物可一次施予个体，例如作为单次注射或沉积在表现出美容障碍症状的位点或附近。或者，美容障碍的治疗可包括在一定时间段内进行多次施用本文公开的有效剂量的组合物，诸如例如每天、每几天、每周、每月或每年一次。作为非限制性实例，本文公开的组合物可以每年一次或两次施予个体。施用时间因人而异，取决于个体症状的严重程度等因素。例如，本文公开的有效剂量的组合物可以在不确定的时间内每月一次施予个体，或者直到个体不再需要治疗为止。本领域普通技术人员将认识到，可以在整个治疗过程中监测个体的状况，并且可相应地调整本文公开的组合物的有效量。
施用途径
使用适用于药物递送的任何可用方法和途径(包括体内和离体方法，以及系统和局部施用途径)将活性剂(例如梭菌毒素或其片段或变体)施予个体。在一个实施方案中，梭菌毒素(包括其片段或变体)根据肉毒杆菌毒素治疗的既定方案来施用。术语“肉毒杆菌毒素疗法”包括但不限于在任何制剂中，使用任何天然存在的或经修饰的或工程化形式的肉毒杆菌毒素或其结构域或片段，与任何载体或活性成分组合并通过任何施用途径施用。
使用方法
治疗应用
在一个实施方案中，本公开内容涉及使用梭菌毒素或其片段或变体用于治疗应用的方法。在另一个实施方案中，所述组合物适用于治疗和/或减少与ECM异常相关的疾病或障碍的发生。在一个实施方案中，所述组合物适用于治疗和/或减少纤维化障碍或纤维化疾病的发生。在另一个实施方案中，所述组合物适用于治疗和/或减少与结缔组织成纤维细胞相关的疾病或障碍的发生。
在一些实施方案中，本公开内容涉及选自以下疾病的治疗：细胞外基质疾病；结缔组织疾病；内皮疾病；以及纤维化疾病，其包括给有需要的受试者施用治疗有效量的包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物，其中所述多肽的分子量在约4kDa至约60kDa之间；优选地在约10kDa至约60kD之间；特别是在约12kDa至约50kDa之间。
在一些实施方案中，通过施用BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/FA、BoNT/G、BoNT/H、BoNT/DC、BoNT/CD、BoNT/X或eBoNT/J的肉毒杆菌毒素片段来进行治疗，其中所述片段具有约4kDa至约60kDa之间；优选地在约10kDa至约60kD之间；特别是在约12kDa至约50kDa之间的分子量。
在一些实施方案中，通过施用包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID No：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQID NO：12-18和SEQ ID NO：25-27的序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高％，例如99％序列同一性的氨基酸序列的肉毒杆菌毒素多肽来进行治疗。
在一些实施方案中，通过施用包含选自以下的序列、基本上由选自以下的序列组成或由选自以下的序列组成的氨基酸序列的肉毒杆菌毒素多肽来进行治疗：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：12-18和SEQ ID NO：25-27。
在一些实施方案中，本公开内容涉及细胞外基质疾病的治疗，所述细胞外基质疾病例如动脉粥样硬化、癌症、淀粉样蛋白疾病、肾小球疾病、肾小球膜疾病、炎症病况和发育障碍，其包括给有需要的受试者施用如上所提供的治疗有效量的包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及结缔组织疾病的治疗，所述结缔组织疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、全身性硬化、口干综合征、混合性结缔组织疾病、感染性嗜曙红细胞增多、多肌炎、皮肌炎、结节性动脉炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener-granulomatose)、CREST-综合征和SHARP-综合征；优选地系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、全身性硬化或口干综合征，其包括给有需要的受试者施用如上所提供的治疗有效量的包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及内皮疾病的治疗，所述内皮疾病例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、糖尿病性神经病、中风、动脉粥样硬化、糖尿病、再狭窄、冠状动脉疾病、周围性血管疾病、血管渗漏、血管炎、结节性脉管炎、韦格内氏病、胃或口腔溃疡、肝硬化、肝肾综合征、克罗恩病、脱发、皮肤紫癜、毛细血管扩张、静脉湖形成、伤口愈合延迟、先兆子痫、败血症、缺血再灌注损伤、高血压、慢性或急性感染、月经过多、新生儿呼吸窘迫、肺纤维化、肺气肿、肾病、肾小球肾炎、硬结瘤和血管异常或内皮疾病的特征在于血管生成不足、高血压、血管收缩、血管渗漏、血管舒缩紧张度改变、易凝状态、抗炎特性和不良的内皮细胞健康，其包括给有需要的受试者施用如上所提供的治疗有效量的包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及纤维化疾病的治疗，所述纤维化疾病例如真皮瘢痕、伤口瘢痕、手术瘢痕、肥厚性瘢痕、疙瘩、胶质瘢痕、术后腹腔粘连、纤维瘤、肝纤维化、肝硬化、胰腺炎、良性前列腺增生、乳腺纤维化、腹膜后纤维化(例如纤维性膀胱、间质性膀胱炎、肺纤维化(特发性肺纤维化))、血管纤维化(例如动脉粥样硬化、狭窄、再狭窄)、肾纤维化、肾小球硬化、心房纤维化、心肌纤维化、心内膜心肌纤维化、动脉硬化、关节纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、进行性大块纤维化(例如肺)、慢性肾脏疾病(CKD)、肾源性系统性纤维化、克罗恩病、硬皮病、系统性硬化(例如皮肤、肺)、肌纤维变性(例如膝盖、肩膀，其它关节)、佩罗尼氏病、杜普伊特伦氏挛缩、粘连性关节囊炎、器官移植相关纤维化、缺血相关纤维化、囊性纤维化、非囊性纤维化、混合结缔组织病、眼纤维化、骨关节炎、硬皮病或哮喘，其包括给有需要的受试者施用如上所提供的治疗有效量的包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物。优选地，本公开内容涉及选自纤维化乳腺疾病；疙瘩瘢痕；肝纤维化；纤维化膀胱；纤维组织增生，例如良性前列腺增生；胰腺炎；粘连，例如腹腔粘连；瘢痕，例如肥厚性瘢痕或其组合的纤维化疾病的治疗，其包括给有需要的受试者施用如上所提供的治疗有效量的包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及真皮瘢痕、伤口瘢痕、手术瘢痕或皮肤瘢痕的治疗。通常，皮肤瘢痕不含有真皮附属物，诸如毛囊和皮脂腺，并且通常存在于这些结构中的干细胞也是不存在的。与安慰剂相比，用肉毒杆菌毒素A治疗面部伤口已证明可改善灵长类动物的美容效果。参见Gassner等人，Plast Reconstr Surg 105：1948-1953，2000。因此，根据本公开内容，如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域可以在受试者的切除伤口附近注射以递送治疗益处。
在一些实施方案中，本公开内容涉及肥厚性瘢痕或疙瘩瘢痕的治疗。肉毒杆菌毒素A已用于通过病灶内注射治疗瘢痕。参见Zhibo等人，Plast Reconstr Surg.，124(5)：275-277，2009。因此，根据本公开内容，如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域可以在受试者的病灶内施用以递送治疗益处。
在一些实施方案中，本公开内容涉及粘连的治疗。粘连是组织和器官之间形成的纤维带，通常是手术过程中受伤的结果。它们包括内部瘢痕组织，所述内部瘢痕组织连接通常不连接的组织。在实验室动物模型中已评估了肉毒杆菌素在预防术后腹腔粘连中的作用。参见Dokur等人，Ann Surg Treat Res.，93(1)：50-56，2017。因此，根据本公开内容，如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域可被施用给受试者以递送抗粘连的治疗益处。
在一些实施方案中，本公开内容涉及纤维瘤的治疗。纤维瘤(或肌瘤(fibroids))是由纤维或结缔组织组成的良性肿瘤。它们可以在所有器官中生长，起源于间充质组织，并在眼睑中最突出。因此，根据本公开内容，如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域可被透皮或腹膜间(interperitoneally)施用给受试者以递送抗纤维瘤的治疗益处。
在一些实施方案中，本公开内容涉及肝纤维化或肝硬化的治疗。在一些实施方案中，这些肝脏的纤维化疾病用抗纤维化药物治疗，其已证明减少了肝瘢痕发生的可能性。对抗纤维化开处方通常取决于潜在的医学病况。这些治疗的实例包括例如，(a)对于慢性肝病：ACE抑制剂，诸如贝那普利(benazepril)、赖诺普利(lisinopril)和雷米普利(Ramipril)；(b)对于丙型肝炎病毒：α-生育酚或干扰素-α；(c)对于非酒精性脂肪肝炎：PPAR-α激动剂。因此，根据本公开内容，如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域可被施用给受试者以治疗肝纤维化或肝硬化。
在一些实施方案中，本公开内容涉及胰腺炎的治疗，尤其是由某些遗传性障碍诸如囊性纤维化等引起的胰腺炎。因此，根据本公开内容，如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域可被施用给受试者以治疗胰腺炎。
在一些实施方案中，本公开内容涉及良性前列腺增生(BPH)的治疗，良性前列腺增生(BPH)是以前列腺增大为特征的疾病。某些研究已经表明，BPH的发展是前列腺纤维化和肌肉组织弱化的结果。因此，根据本公开内容，如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域可被施用给受试者以治疗BPH。
在一些实施例中，本公开内容涉及乳腺纤维化(例如，乳房手术后的纤维化)的治疗。乳腺纤维化可以乳腺组织的密度增厚或增加为特征。乳腺纤维组织包括韧带、支持组织(基质)和瘢痕组织。有时这些纤维组织比乳腺区域中的脂肪组织更加突出，可能导致坚硬或坚韧的隆起。
在一些实施方案中，本公开内容涉及腹膜后纤维化或奥蒙德病(Ormond′sdisease)的治疗，所述腹膜后纤维化或奥蒙德病(Ormond′s disease)是以腹膜后腔(含有肾脏、主动脉、肾道和各种其它结构的身体隔室)中纤维组织增生为特征的疾病。所述疾病用CT扫描诊断以及疗法可包括糖皮质激素，然后是DMARD，其或者作为类固醇激发剂，或者如果难治，在类固醇上使用。在各种小型试验中，SERM他莫昔芬已证明改善病况。因此，根据本公开内容，使用本公开内容的组合物，如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域可单独或与上述药物中的一种一起施用以治疗腹膜后纤维化疾病，所述腹膜后纤维化疾病诸如纤维化膀胱、间质性膀胱炎(膀胱疼痛综合征)、肺纤维化(例如特发性肺纤维化)、血管纤维化(动脉粥样硬化、狭窄、再狭窄)、肾纤维化、肾小球硬化、心房纤维化、心肌纤维化、心内膜心肌纤维化、动脉硬化、关节纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化(例如肺)、慢性肾脏疾病(CKD)、肾源性系统性纤维化。
在一些实施方案中，本公开内容涉及肺纤维化的治疗，所述肺纤维化诸如纵膈纤维化或进行性大块纤维化(例如肺的PMF)、囊性纤维化、非囊性纤维化或哮喘。PMF是以大团块密集纤维化(通常在肺上部)的发展为特征。患有肺纤维化的受试者在纵隔膜中有不同数量的瘢痕组织，其可能会对位于那里的器官造成问题。治疗取决于纵隔膜的哪些结构受到影响，瘢痕的严重程度以及，在一些情况下，病况的原因。
在一些实施方案中，本公开内容涉及IPF的治疗，其包括给有需要的受试者施用治疗有效量的本公开内容的组合物。IPF是一种以肺实质进行性间质性纤维化为特征的限制性肺疾病，在美国影响约100,000例患者(Raghu等人，Am JRespir Crit Care Med 174：810-816，2006)。与IPF相关的这种间质性纤维化导致肺功能的逐渐丧失，导致大多数患者因呼吸衰竭而死亡。诊断后的中位生存时间为2-3年(Raghu等人，Am JRespir Crit CareMed 183：788-824，2011)。预后很差，并且肺移植通常是唯一的手段(Thabut等人，Annalsof Internal Medicine 151：767-774，2009)。IPF的常见症状包括呼吸短促；持续干燥，频嗽；疲劳；莫名其妙的体重减轻；肌肉和/或关节肌肉酸痛；杵状指(手指或脚趾的尖端变宽和变圆)。
在一些实施方案中，本公开内容涉及在有需要的受试者中治疗囊性纤维化(CF)(包括慢性肺病)，其包括施用治疗有效量的本公开内容的组合物。在CF中，气道细菌定殖通常发生在出生后的第一年或第二年内。囊性纤维化的症状包括，例如腹痛、慢性咳嗽(带血或痰)；胃肠道问题(腹泻、粪便中的脂肪、胃灼热、严重便秘或大便)；呼吸系统问题(例如肺动脉高血压、呼吸短促、鼻窦炎或喘息)；儿童的发育缺陷(例如发育延迟、青春期延迟或生长缓慢)；包括系统性问题，诸如疲劳或无法运动。其它常见症状包括，例如急性支气管炎、指甲畸形、感染、鼻息肉、肺炎、成汗或体重减轻。在一些实施方案中，本公开内容涉及非囊性纤维化的治疗，其包括给有需要的受试者施用治疗有效量的本公开内容的组合物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及使用本公开内容的组合物治疗肾纤维化，诸如慢性肾脏疾病(CKD)或肾源性系统性纤维化(NSF)。肾脏超声检查适用于CKD或NSF的诊断和预后目的，例如，鉴定潜在的病理变化是否由间质性纤维化所致。例如，NSF显示了真皮成纤维细胞和树突状细胞的增殖、胶原蛋白束增厚、弹性纤维增加和粘蛋白沉积，并且某些报道描述了由NSF患者的皮肤活检中存在硬化体(也称为弹性胶原球)。参见Scheinfeld等人，eMedicine，发布于：2018年5月22日。
在一些实施方案中，本公开内容涉及使用本公开内容的组合物治疗胃肠道纤维化障碍诸如克罗恩病。
在一些实施方案中，本公开内容涉及使用本公开内容的组合物治疗由结缔组织的纤维化引起的疾病，例如混合性结缔组织疾病、眼纤维化、骨关节炎或硬皮病。
在一些实施方案中，本公开内容涉及使用本公开内容的组合物治疗由系统性纤维化病况引起的纤维化疾病，例如系统性硬化症(例如皮肤、肺)、肌纤维变性(例如膝盖、肩膀，其它关节)。通常，为了治疗此类系统性疾病，所述组合物可系统性地施用，例如在皮肤系统性硬化症的情况下局部施用。
在一些实施方案中，本公开内容涉及使用本公开内容的组合物治疗较少见的纤维化疾病，诸如佩罗尼氏病(阴茎纤维化)、杜普伊特伦氏挛缩(手指弯曲)、粘连性关节囊炎(冻结肩)、器官移植相关纤维化。
本公开内容进一步涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物，其用于治疗选自细胞外基质(ECM)疾病、结缔组织疾病、内皮疾病或纤维化疾病；优选地，ECM、结缔组织或内皮的纤维化疾病的疾病。
在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物，其用于治疗细胞外基质(ECM)疾病。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物，其用于治疗结缔组织疾病。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物，其用于治疗内皮疾病。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物，其用于治疗纤维化疾病。
在一些实施方案中，本公开内容涉及一种用于治疗纤维化疾病的组合物，所述纤维化疾病选自真皮瘢痕、伤口瘢痕、手术瘢痕、术后腹腔粘连、纤维瘤、肝纤维化、肝硬化、胰腺炎、良性前列腺增生、乳腺纤维化、纤维性膀胱、间质性膀胱炎、肺纤维化(例如特发性肺纤维化)、血管纤维化(动脉粥样硬化、狭窄、再狭窄)、肾纤维化、肾小球硬化、心房纤维化、心肌纤维化、心内膜心肌纤维化、胶质瘢痕、动脉硬化、关节纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化(例如肺)、慢性肾脏疾病(CKD)、肾源性系统性纤维化、克罗恩病、肥厚性瘢痕、疙瘩、硬皮病、系统性硬化(例如皮肤、肺)、肌纤维变性(例如膝盖、肩膀，其它关节)、佩罗尼氏病、杜普伊特伦氏挛缩、粘连性关节囊炎、器官移植相关纤维化、缺血相关纤维化、囊性纤维化、非囊性纤维化、混合结缔组织病、眼纤维化、骨关节炎、硬皮病或哮喘，优选地，治疗选自纤维化乳腺疾病；疙瘩瘢痕；肝纤维化；纤维化膀胱；纤维组织增生，例如良性前列腺增生；胰腺炎；粘连，例如腹腔粘连；瘢痕，例如肥厚性瘢痕或其组合的纤维化疾病。
本公开内容进一步涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物在制备用于治疗选自细胞外基质(ECM)疾病、结缔组织疾病、内皮疾病或纤维化疾病的疾病的药物中的用途；优选地，用于治疗ECM、结缔组织或内皮的纤维化疾病。
在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物在制备用于治疗细胞外基质(ECM)疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物在制备用于治疗结缔组织疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物在制备用于治疗内皮疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物在制备用于治疗纤维化疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开内容涉及包含如上所提供的肉毒杆菌毒素的结合结构域的组合物在制备用于治疗纤维化疾病的药物中的用途，所述纤维化疾病选自真皮瘢痕、伤口瘢痕、手术瘢痕、术后腹腔粘连、纤维瘤、肝纤维化、肝硬化、胰腺炎、良性前列腺增生、乳腺纤维化、纤维性膀胱、间质性膀胱炎、肺纤维化(例如特发性肺纤维化)、血管纤维化(动脉粥样硬化、狭窄、再狭窄)、肾纤维化、肾小球硬化、心房纤维化、心肌纤维化、心内膜心肌纤维化、胶质瘢痕、动脉硬化、关节纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化(例如肺)、慢性肾脏疾病(CKD)、肾源性系统性纤维化、克罗恩病、肥厚性瘢痕、疙瘩、硬皮病、系统性硬化(例如皮肤、肺)、肌纤维变性(例如膝盖、肩膀，其它关节)、佩罗尼氏病、杜普伊特伦氏挛缩、粘连性关节囊炎、器官移植相关纤维化、缺血相关纤维化、囊性纤维化、非囊性纤维化、混合结缔组织病、眼纤维化、骨关节炎、硬皮病或哮喘，优选地，治疗选自纤维化乳腺疾病；疙瘩瘢痕；肝纤维化；纤维化膀胱；纤维组织增生，例如良性前列腺增生；胰腺炎；粘连，例如腹腔粘连；瘢痕，例如肥厚性瘢痕或其组合的纤维化疾病。
还预期本公开内容的多肽或组合物可彼此结合使用(例如，SEQ ID NO：1的BoNT/AHc片段和SEQ ID NO：25的突变体BoNT/A Hc片段)或与其它抗纤维化剂一起调节组合物的活性。肽或化合物与其它药剂的结合物可用于允许出于毒性考虑而以较低剂量使用抗纤维化药物，以增强功效已减少的抗纤维化药剂的活性或实现组分之间的协同作用，从而使所述结合物比任何一种独立组分的功效总和更有效。可在联合疗法中与抗微生物肽结合的抗纤维化剂包括例如吡非尼酮(pirfenidone)和尼达尼布(nintedanib)，其已被批准用于治疗IPF。
在实施前述治疗应用中，有利的是使用含有梭菌毒素或其片段或变体的组合物，其不产生面部肌肉的麻痹。
实例
本文所述的结构、材料、组合物和方法旨在作为本公开内容的代表性实例，并且应理解，本公开内容的范围不受实施例范围的限制。本领域技术人员将认识到，可通过对所公开的结构、材料、组合物和方法进行变型来实践本公开内容，并且这种变型被认为在本公开内容的范围内。
实施例1
SEQ ID NO：19的示例性多肽对正常人原代成纤维细胞中细胞基因表达的作用
用10nM、100nM或1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理正常人原代成纤维细胞1天(24小时)，产生基于qPCR的16种成纤维细胞基因表达的显著剂量依赖性变化。简而言之，将成年人真皮成纤维细胞(HDFa)(ThermoFisher Scientific，产品目录编号C0135C)在含有2％FBS的MEM培养基中培养2周，然后用10nM、100nM或1μM的SEQ ID NO：19的多肽处理1天(24小时)。评价了已知在成纤维细胞中表达并参与ECM组织、炎症或表皮自我更新(角化细胞干细胞因子)的基因的表达。使用SUPERSCRIPT VILO cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific#11754050)通过逆转录生成cDNA，然后在TAQMAN Fast Advanced反应混合物(Thermo Scientific#4444557)中进一步稀释，然后转移到TAQMAN Fast板(Thermo Scientific#4413259)中的指定孔中。使用Applied Biosystems 7500Fast实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行实时qPCR。基因表达的变化计算为每个时间点上相对于未处理的对照的倍数变化(ΔΔCT＝ΔCT(基因(测试)-GAPDH(测试))-ΔCT(基因(未处理的对照)-GAPDH(未处理的对照))；倍数变化＝2(-ΔΔCT))。倍数变化大于2或小于0.5(p值≤0.05)被认为是相关的显著变化。显示剂量依赖性变化的示例性基因在图1中示出，图1是显示了在用10nM(实心柱)、100nM(未填充柱)或1μM(阴影柱)的具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理24小时后，正常人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图，其中相对于未处理的对照细胞表示倍数变化。结果表明，已知参与细胞外基质分解和重塑的基因(包括MMP1、MMP3、TIMP1)均上调；而与纤维化相关的基因(包括S100钙结合蛋白A4(S100A4)和α-平滑肌肌动蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA/ACTA2)的诱导物)均下调。已知的纤维化标志物S100A4和α-SMA/ACTA2与成纤维细胞收缩性和成肌纤维细胞形成相关。由于成纤维细胞收缩性和成肌纤维细胞形成以及S100A4、ACTA2和其它ECM组分的过量产生在瘢痕形成和纤维化中起作用，这些结果表明SEQ ID NO：19的多肽将具有抗瘢痕和抗纤维化作用。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽可对人类患者(例如纤维组织和器官以及瘢痕)中的ECM结构和纤维化有影响，例如引起组织和器官纤维化的抑制或逆转以及视觉瘢痕的减少。
实施例2
SEQ ID NO：21的示例性多肽对疙瘩瘢痕衍生的人原代成纤维细胞中细胞基因表达的作用
用具有与BoNT/A的结合结构域的N端一半(HCN/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ ID NO：21)处理疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞，产生基于qPCR的六(6)种成纤维细胞基因表达的显著剂量依赖性变化。简而言之，将人真皮成纤维细胞(KF116R)(cellResearchCorp Pte Ltd)在含有2％FBS的MEM培养基中培养2周，然后用1nM、10nM或1μM的SEQ ID NO：21的多肽处理1天(24小时)。评价了六(6)个已知与ECM组织和重塑(MMP1、MMP3和TIMP1)，以及表皮分化和自我更新(FGFR1、FGF7和TP63)有关的成纤维细胞相关基因的表达。使用SUPERSCRIPT VILO cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific#11754050)通过逆转录生成cDNA，然后在TAQMAN Fast Advanced反应混合物(Thermo Scientific#4444557)中进一步稀释，然后转移到TAQMAN Fast板(Thermo Scientific#4413259)中的指定孔中。使用Applied Biosystems 7500Fast实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行实时qPCR。基因表达的变化计算为每个时间点上相对于未处理的对照的倍数变化(ΔΔCT＝ΔCT(基因(测试)-GAPDH(测试))-ΔCT(基因(未处理的对照)-GAPDH(未处理的对照))；倍数变化＝2(-ΔΔCT))。倍数变化大于2或小于0.5(p值≤0.05)被认为是相关的显著变化。显示剂量依赖性变化的示例性基因在图2中示出，图2是显示了在用1nM(水平线填充)、10nM(未填充柱)、100nM(阴影柱)或1μM(实心柱)的具有与BoNT/A的结合结构域的N端一半(HCN/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ ID NO：21)处理后，疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图。结果表明，用SEQ ID NO：11的多肽处理细胞改变了与创建、维持和修复真皮细胞外基质(ECM)有关的蛋白质的表达。由于ECM组分的过量产生在瘢痕形成和纤维化中起作用，这些结果表明SEQ ID NO：21的多肽将具有抗瘢痕和抗纤维化作用。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)或结合结构域的N端一半(HCN/A)的多肽可影响人类患者(例如纤维组织和器官以及瘢痕)中的纤维化，例如引起组织和器官纤维化的抑制或逆转以及视觉瘢痕的减少。
实施例3
SEQ ID NO：19的示例性多肽对由疙瘩瘢痕衍生的人原代成纤维细胞分泌胶原蛋白的作用
用1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ IDNO：19)处理疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞，使得由疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞分泌到含10％FBS的培养基中的I型前胶原C肽(PIP)显著减少约30％。该减少类似于用0.1μM TGF-β的抗体(约20％)或1μM CTGF的抗体(约30％)处理后观察到的减少。简而言之，将人真皮疙瘩成纤维细胞(KF116R)在含有2％FBS的MEM培养基中定期培养。对于实验，将细胞保存在2％FBS培养基中或转换到含有10％FBS的培养基中，用或不用1μM的SEQ ID NO：19的多肽，0.1μM的抗TGF-βmAb或1μM抗CTGF mAb处理。24小时后，收集培养基，并使用I型前胶原C肽(PIP)EIA试剂盒(Takara BIO INC.目录#MK101)测量I型前胶原(PIP)的水平。数据显示在图3中，图3是显示了在2％FBS中培养或在10％FBS中培养，用或不用1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ ID NO：19)，0.1μM TGF-β的抗体或1μM CTGF的抗体(两种已知的抗纤维化剂)处理后，由疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞分泌到培养基中的PIP的量(ng/mL)的柱状图。结果表明，SEQ ID NO：19的多肽与两种已知的抗纤维化剂在减少前胶原肽的分泌中同样有效，所述前胶原肽是成熟胶原纤维的来源，来自原代真皮瘢痕衍生的成纤维细胞。由于过量胶原蛋白产生在瘢痕形成和纤维化中起作用，这些结果表明SEQ ID NO：19的多肽将具有抗瘢痕和抗纤维化作用。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽可通过减少人类患者中的例如胶原蛋白产生来影响纤维化，引起组织和器官纤维化的抑制或逆转以及视觉瘢痕的减少。
实施例4
SEQ ID NO：19的示例性多肽对疙瘩瘢痕衍生的人原代成纤维细胞收缩性的作用
用1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ IDNO：19)预处理疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞，使得纤维蛋白水凝胶收缩性显著降低，这是成纤维细胞收缩性和成纤维细胞-成肌纤维细胞转变的一种量度，在1天(24小时)后约50％。简而言之，将人真皮疙瘩瘢痕成纤维细胞(KF116R)在含有2％FBS的MEM培养基中定期培养。对于实验，将细胞保存在2％FBS培养基中或转换到含有10％FBS的培养基中，用或不用1μM的SEQ ID NO：19的多肽。3天后，用胰蛋白酶消化细胞，将1x106个细胞/水凝胶包埋在纤维蛋白水凝胶中，所述纤维蛋白水凝胶为含有MEM培养基的1mg/mL纤维蛋白原和2.5U/mL凝血酶的混合物，2％或10％取决于治疗范例。1天(24小时)后，以固定距离拍摄照片，并使用Image J软件计算纤维蛋白水凝胶的面积(cm2)。数据显示在图4中，图4是显示了用或不用1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ ID NO：19)预处理3天，在2％FBS培养基或10％FBS培养基中包埋或培养后一天，有疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞的纤维蛋白水凝胶的大小(cm2)的柱状图。结果表明，用1μM的SEQ ID NO：19的多肽处理降低了疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞的成纤维细胞收缩性和成纤维细胞-成肌纤维细胞转变。成纤维细胞收缩性与成纤维细胞向成肌纤维细胞的转变和瘢痕形成相关，例如当成纤维细胞收缩以愈合伤口或转化现有的瘢痕时。这些结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽在降低成纤维细胞收缩性和成纤维细胞-成肌纤维细胞转变中有效，因此可影响人类患者(例如纤维组织和器官以及瘢痕)中的纤维化，例如使得在伤口愈合和/或现有组织和器官纤维化和瘢痕逆转期间瘢痕更少。
实施例5
SEQ ID NO：19和21的示例性多肽对纤维化乳腺癌细胞的作用
用20pM、0.1μM或1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ ID NO：19)或具有与BoNT/A的结合结构域的N端一半(HCN/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ ID NO：21)处理纤维化上皮人乳腺腺癌癌(MDA-MB-231)细胞，其中通过缺氧诱导纤维化，基于磁珠免疫吸附分析，引起培养基中纤连蛋白(高分子量(～440kDa))(结合于整联蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(例如，多配体蛋白聚糖)的细胞外基质的糖蛋白)、胶原蛋白IV(主要存在于通过上皮细胞分泌的一层细胞外基质的基底层中的胶原蛋白类型)和血小板反应蛋白1(结合于纤连蛋白和胶原蛋白并介导细胞间和细胞基质间相互作用的粘附糖蛋白)的分泌剂量依赖性显著减少，以及起分解包括胶原蛋白在内的细胞外基质的功能的酶基质金属蛋白酶1(MMP1)和基质金属蛋白酶的抑制调节剂TIMP金属肽酶抑制剂1(TIMP1)的分泌增加。用1μM的SEQ ID NO：19的多肽处理减少了纤连蛋白、胶原蛋白IV和血小板反应蛋白1的分泌，回到或接近常氧细胞的水平；以及用SEQ ID NO：21的多肽处理减少了纤连蛋白和血小板反应蛋白1的分泌，低于常氧细胞的水平，并减少了胶原蛋白IV的分泌，回到常氧细胞的水平。相比之下，333nM已知抗纤维化剂CTGF抗体(FG-3019)的抗体不影响血小板反应蛋白1的分泌，表明了对纤连蛋白分泌的抑制作用较小，且对胶原IV分泌的抑制作用相似。简而言之，MDA-MB-231细胞获得自ATCC(Rockville，MD)，并在37℃和5％CO2下在补充有10％FBS和1％抗生素的DMEM培养基中培养。将细胞以2×105细胞/ml接种在12孔板中。第二天，去除完全培养基，将细胞用1XPBS洗涤，并保存在无血清培养基中，用或不用在3种不同浓度(分别为20pM、0.1和1uM)的SEQ ID NO：19的多肽和SEQ IDNO：21的多肽和终浓度为333nM的抗CTGF抗体FG-3019(n＝2，每种条件2孔)。将未处理的细胞孵育；a)在标准CO2培养箱中处于常氧(～21％O2)或b)在加湿三气模型(Binder)培养箱中处于缺氧(1％O2)。将所有处理过的细胞在低氧条件下保持120小时(h)，收集细胞培养上清液，并使用磁珠免疫吸附测定法(EMD Millipore，MD)分析。使用类似ELISA的技术测定分泌到细胞培养基中的促纤维化标记物的水平，所述类似ELISA的技术：磁珠(Luminex)，由对特定蛋白质(自定义组(custom panel))(包括纤连蛋白、胶原蛋白IV、血小板反应蛋白1、MMP1和TIMP1)的抗体缀合珠组成。使用含有组中所有蛋白质的标准溶液测定每种分析物的培养基浓度。数据显示在图5中，图5是显示了用20pM、0.1μM或1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)基本相同的氨基酸序列的多肽，具有与BoNT/A的结合结构域的N端一半(HCN/A)基本相同的氨基酸序列的多肽，或333nM CTGF的抗体(FG-3019)处理后，由纤维化MDA-231细胞分泌到培养基中的纤连蛋白、胶原蛋白IV、血小板反应蛋白1、MMP1和TIMP1的量(ng/mL)的柱状图，其中通过缺氧诱导纤维化。结果表明，用SEQ ID NO：19的多肽或SEQ ID NO：21的多肽处理在减少由纤维化MDA-MB-231细胞的纤连蛋白、胶原蛋白IV、血小板反应蛋白1的分泌，并增加MMP1和TIMP1的分泌中有效，并且该作用与已知的抗纤维化剂FG-3019的作用相当或更强。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)或结合结构域的N端一半的多肽在减少缺氧诱导的纤维化中有效。
实施例6
SEQ ID NO：19的示例性多肽对由疙瘩瘢痕衍生的成纤维细胞分泌纤连蛋白的作用
用20pM、200pM、20nM或200nM具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽处理纤维化人疙瘩瘢痕成纤维细胞(KF116R)细胞1、4、7或9天，基于纤连蛋白酶免疫分析法(EIA)，使得纤连蛋白(高分子量(～440kDa))(结合于整联蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(例如，多配体蛋白聚糖)的细胞外基质的糖蛋白)分泌的时间和剂量依赖性显著减少。简而言之，KF116R细胞获得自CellResearchCrop(Singapore)，并在37℃和5％CO2的补充有10％FBS和1％抗生素的MEM培养基中培养。将细胞以2×105细胞/ml接种在24孔板中一天，然后用20pM、200pM、20nM或200nM的SEQ ID NO：19的多肽处理。对于第7天和第9天的处理，在第5天更换处理的培养基。为了测量纤连蛋白，在第一次处理后的第1、4、7和9天收集培养基，并使用Takara纤连蛋白EIA试剂盒(Clontech，目录#MK115)测量分泌到培养基中的纤连蛋白的量(ng/mL)。数据显示在图6中，图6是显示了用20pM、200pM、20nM或200nM具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽处理后，由人疙瘩瘢痕成纤维细胞(KF116R)细胞分泌到培养基中的纤连蛋白的标准量的柱状图，其中标准化至每个时间点的仅培养基对照。结果表明，用SEQ ID NO：19的多肽处理在减少由人疙瘩瘢痕成纤维细胞(KF116R)细胞的纤连蛋白的分泌中有效。由于瘢痕和纤维化的形成与纤连蛋白和其它ECM组分的过量产生相关，因此结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽具有抗瘢痕和抗纤维化作用。
实施例7
SEQ ID NO：19的示例性多肽对由正常人原代成纤维细胞分泌蛋白质的作用
用20pM具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽处理正常人原代成纤维细胞(HDFa)6天，基于收集的培养基的质谱(MS)蛋白分析，使得胶原蛋白(胶原蛋白α-1(I)链57％，胶原蛋白α-1(III)链，87％，胶原蛋白α-2(I)链，47％)和乳铁蛋白(53％)的分泌显著减少。简而言之，将成年人真皮成纤维细胞(HDFa)(ThermoFisher Scientific，产品目录编号C0135C)在含有2％FBS的MEM培养基中培养2周，然后用20pM SEQ ID NO：19的多肽处理6天，然后仅在培养基中孵育3天(n＝3)。收集培养基，并通过质谱(MS)蛋白质分析鉴定和定量蛋白质。数据显示在图7中，图7是显示了从未处理的和经处理的原代人类成纤维细胞中收集的培养基中鉴定的蛋白质和每种蛋白质的平均含量的柱状图。结果表明，用SEQ IDNO：19的多肽处理在减少胶原蛋白和乳铁蛋白的分泌中有效，胶原蛋白和乳铁蛋白已经表明增加由正常人原代成纤维细胞的成纤维细胞收缩性。由于瘢痕和纤维化的形成与胶原蛋白的过量产生和成纤维细胞收缩性相关，因此结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽具有抗瘢痕和抗纤维化作用。
实施例8
SEQ ID NO：20和21的示例性多肽对疙瘩瘢痕衍生的人成纤维细胞中细胞基因表达的影响
用100nM或1μM具有与BoNT/DC的结合结构域(HC/DC)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ ID NO：20)或1μM具有与BoNT/A的结合结构域的N端一半(HCN/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(SEQ ID NO：21)处理疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞，引起基于qPCR的成纤维细胞相关基因表达的显著变化。简而言之，将人真皮疙瘩成纤维细胞(KF116R)在含有2％FBS的MEM培养基中培养2周，然后用100nM或1μM的SEQ ID NO：20的多肽或1μM的SEQID NO：21的多肽处理1天(24小时)。评价了已知与ECM组织(COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL4A1、COL6A3、COL7A1、ELN、FBN1和FN1)和重塑(MMP1、MMP2、MMP3和TIMP1)以及纤维化和成纤维细胞-成肌纤维细胞转变(TGFB1、TGFB3、TGFBR1、TGFBR2、CTGF、S100A4、VIM、ACTA2、CD34和SERPINE1)有关的成纤维细胞相关基因的表达。使用SUPERSCRIPT VILO cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific#11754050)通过逆转录生成cDNA，然后在TAQMAN Fast Advanced反应混合物(Thermo Scientific#4444557)中进一步稀释，然后转移到TAQMAN Fast板(Thermo Scientific#4413259)中的指定孔中。使用APplied Biosystems 7500Fast实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行实时qPCR。基因表达的变化计算为每个时间点相对于未处理的对照的倍数变化(ΔΔCT＝ΔCT(基因(测试)-GAPDH(测试))-ΔCT(基因(未处理的对照)-GAPDH(未处理的对照))；倍数变化＝2(-ΔΔCT))。倍数变化大于2或小于0.5(p值≤0.05)被认为是显著变化。示例性基因(23)在图8中示出，图8是显示了在用100nM(实心柱)或1μM(阴影柱)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽或1μM(未填充柱)具有SEQID NO：21的氨基酸序列的多肽处理后，疙瘩瘢痕人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图。结果表明，用SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的多肽处理影响已知与ECM组织和重塑以及纤维化和成纤维细胞-成肌纤维细胞转变有关的基因的表达；并且由SEQ IDNO：20的多肽诱导的作用似乎比由SEQ ID NO：21的多肽诱导的作用更显著。结果表明，基本对应于BoNT/DC的结合结构域(HC/DC)或结合结构域的N端一半(HCN/A)的多肽具有抗瘢痕和抗纤维化作用。基本对应于两种不同BoNT血清型的结合结构域的多肽影响疙瘩瘢痕衍生的人成纤维细胞中细胞基因表达的观察结果表明，其他另外的BoNT血清型可具有相同的抗瘢痕和抗纤维化作用。
使用序列比对软件工具，在不同的BoNT血清型之间进行成对序列比对；其中BoNT/A1的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)(GENBANK#AF488749)与来自以下BoNT蛋白的结合结构域的氨基酸序列进行比对：BoNT/B1(GENBANK#BAE48264)；BoNT/C1(GENBANK#P18640)；BoNT/D(GENBANK#P19321)；BoNT/DC(GENBANK#EF378947)；BoNT/E(GENBANK#AFV91344)；BoNT/F(GENBANK#ABS41202)；和BoNT/G(GENBANK#X74162)。在表2中示出的结果表明，BoNT/A1与其他BoNT血清型(例如B1、C1、DC、E、F和G)之间在氨基酸水平的同一性和同源性百分比与BoNT/A1与BoNT/DC之间的同一性和同源性百分比相似。具体地，根据BLAST比对，HC/A和HC/DC在氨基酸残基水平为33％的相同和54％相似(共有)，其与所有其他血清型(31-51％相同和49-67％相似(共有))相似。如实施例5所示，BoNT/DC的结合结构域(HC/DC)在影响成纤维细胞的表达中，与BoNT/A的结合结构域同样有效。因此，BLAST比对和从实施例5获得的结果表明，除了BoNT/A和BoNT/DC之外，其他BoNT血清型也可能影响人类皮肤。
表2：使用BLAST，在来源于各种BoNT血清型的Hc蛋白之间的成对多重序列比对。
Figure BDA0002640530420000941
*所述同源性百分比定义为蛋白质序列内相对于参考蛋白质序列的相同或相似残基(共有)的百分比.除以参考序列的长度
**0得分是使用残基置换矩阵计算的原始得分，位得分是考虑序列长度和空位大小的归一化得分。例如，283位的得分意味着找到比所发现的更好的比对.必须搜索2^283个氨基酸的空间。
如表2所示，不同BoNT血清型之间的比对水平很高，如得分所示。得分以原始得分或位得分的形式提供，其中原始得分是通过使用残基置换矩阵的工具直接计算，并且位得分是考虑序列长度和空位大小的归一化得分。如在生物信息学中所理解的，283位的得分意味着找到比所呈现的更好的比对，搜索将必须包括2283(或2x1085)个单位的氨基酸的空间。因此，位得分越高，匹配的显著性就越高。
实施例9
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在治疗疙瘩瘢痕中的用途
一位拥有光VI型皮肤的20岁非洲女性表现出在她的左耳有一个在耳朵穿孔后形成了2年的疙瘩瘢痕。她每月接受一次HC/A多肽治疗，总共三个月。
将HC/A多肽粉末溶解在生理食盐水中(将4.5ng真空干燥的粉末在0.25mL无菌0.9％生理食盐水中重构)以形成1.8ng/0.1mL的溶液，并使用9号针(0.3mm x 0.8mm)注射到她的瘢痕体内，直到可见轻微的变白为止。剂量为0.9ng/cm3病灶。
在基线和治疗后6个月进行评估。
与基线相比，在治疗后6个月，根据医生的整体评估和受试者满意度得分，她的瘢痕显示出好到极好的改善，并且红斑、瘙痒和柔韧性均有显著改善。该改善与实施例1、3、5、6和7所述的实验数据一致，其中用对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽处理的成纤维细胞显示具有降低的与成肌纤维细胞形成(包括S100A4和ACTA2)相关的基因的表达，并调节了细胞外基质(ECM)蛋白和蛋白酶(包括纤连蛋白、胶原蛋白和MMP1)的表达和分泌，其起适当维持、更新和修复ECM真皮组织结构的功能。
实施例10
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在治疗肝纤维化中的用途
一位具有酗酒史的55岁男性表现出疲劳和食欲不振抱怨。从血液检测中确定他的肝酶升高，并经肝活检确认后，他被诊断为肝纤维化，即第二阶段肝脏疾病。他的肝体积(肝脏大小)通过磁共振成像(MRI)确定为约1000cm3。他每月接受一次具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)基本相同的氨基酸序列的多肽治疗，总共三个月。
将(HC/A)多肽粉末溶解在生理食盐水中，将4.5ng真空干燥的粉末溶解在0.25mL无菌0.9％生理食盐水中以形成1.8ng/0.1mL的溶液，并使用超声视觉引导经皮注射到肝脏中。剂量为0.9ng/cm3肝脏受影响区域。在每个(100)注射位点50μL(0.9ng)，总共注射了90ng。
在基线和治疗后6个月进行评估。
与基线相比，在治疗后6个月，测量肝酶和肝脏大小显著减少，并且患者报告能量水平和食欲得到改善。该改善与实施例1、3、5、6和7所述的实验数据一致，其中用对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽处理的成纤维细胞显示具有降低的与成肌纤维细胞形成(包括S100A4和ACTA2)相关的基因的表达，并调节了细胞外基质(ECM)蛋白和蛋白酶(包括纤连蛋白、胶原蛋白和MMP1)的表达和分泌，其起适当维持、更新和修复ECM组织结构的功能。
实施例11
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在治疗纤维化膀胱中的用途
一名55岁的男性患者表现出纤维化膀胱的症状，包括长期需要排尿，每天多达五十次。他被转诊至泌尿外科诊所接受治疗。推荐的泌尿科医生建议使用HC/A肽治疗他的病况。将含有1μM浓度HC/A的溶液注射到每个批准的注射范例中的30个位点(膀胱基部中的15个位点(包括三角区中的2个位点)以及在后外侧壁膀胱中线和以下的15个位点)。在第二次治疗后两周进行检查时，患者报告了生活质量的显著改善，并且排尿需求减少了50％。该改善与实施例1、3、5、6和7所述的实验数据一致，其中用对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽处理的成纤维细胞显示具有降低的与成肌纤维细胞形成(包括S100A4和ACTA2)相关的基因的表达，并调节了细胞外基质(ECM)蛋白和蛋白酶(包括纤连蛋白、胶原蛋白和MMP1)的表达和分泌，其起适当维持、更新和修复ECM组织结构的功能。
实施例12
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在治疗良性前列腺增生的症状中的用途
进行了一项2阶段、多中心、双盲、随机II期临床试验，该试验使用了两剂量HC/A肽治疗良性前列腺增生的下尿路症状。
具有临床诊断的良性前列腺增生，美国泌尿科协会症状指数为8或更大，最大尿流率小于每秒15ml，排尿量为125ml或更大，以及排尿后残留为350ml或更少的50岁或50岁以上的男性随机分配给前列腺经直肠注射2.5或5ng的HC/A肽。主要结果是美国泌尿科协会症状指数和/或最大尿流率和安全性从基线到3个月至少改善了30％。这些人被追踪了12个月。
对总共134名男性进行随机化和治疗(68名2.5ng，66名5ng)，其中131名在3个月时评估，108名在12个月时评估。每次剂量均满足3个月的主要结果标准。在2.5ng组中，美国泌尿科协会的平均基线症状指数18.8在3和12个月时分别降低了7.1和6.9。在5ng组中，基线的19.5分别降低了8.9和7.1。在2.5个单位组中，平均基线最大尿流率每秒10.0ml分别增加了2.5和2.2，以及在5ng组中，基线9.6分别增加了2.6和2.3。
2.5ng或5ng单位的HC/A肽的前列腺内注射通过了用于治疗功效和安全性的预定标准，并且保证任一剂量的随机试验。由于相似的功效，可优选2.5ng单位剂量。该改善与实施例1、3、5、6和7所述的实验数据一致，其中用对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽处理的成纤维细胞显示具有降低的与成肌纤维细胞形成(包括S100A4和ACTA2)相关的基因的表达，并调节了细胞外基质(ECM)蛋白和蛋白酶(包括纤连蛋白、胶原蛋白和MMP1)的表达和分泌，其起适当维持、更新和修复ECM组织结构的功能。
实施例13
在急性胰腺炎的天蓝素诱导的小鼠体内模型中评估根据本发明公开内容的方面提供的示例性多肽
通过每小时7次或12次腹膜内注射50mg/kg雨蛙素(caerulein)诱导过度刺激性急性胰腺炎，利用生理食盐水作对照。在首次注射雨蛙素后2小时开始，小鼠接受7次腹膜内注射10、50、100或250ng/kg的HC/A肽。疾病诱导后12小时处死小鼠，并评估其血清淀粉酶、胰腺水肿、胰蛋白酶活性、胰腺髓过氧化物酶活性和血清白介素(IL-6)(标准化至未处理的雨蛙素组)。
结果：在12小时时，观察到HC/A肽对雨蛙素急性胰腺炎的严重程度的剂量依赖性保护作用。该改善与实施例1、3、5、6和7所述的实验数据一致，其中用对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽处理的成纤维细胞显示具有降低的与成肌纤维细胞形成(包括S100A4和ACTA2)相关的基因的表达，并调节了细胞外基质(ECM)蛋白和蛋白酶(包括纤连蛋白、胶原蛋白和MMP1)的表达和分泌，其起适当维持、更新和修复ECM组织结构的功能。
实施例14
根据本发明公开内容的方面提供的示例性多肽在预防腹腔粘连中的用途
术后腹腔粘连(PIAs)是剖腹手术后外科医生必须面对的最重要的问题中的一种。在这项研究中，我们旨在评估以不同剂量局部应用HC/A肽对预防实验性腹腔粘连的大鼠中腹腔粘连的有效性。
将四十只Wistar Albino雌性大鼠随机分为4组。这4组确定如下：对照(第1组，n＝10)；假手术(第2组，n＝10)；10mg/kg低剂量HC/A肽(第3组，n＝10)和30mg/kg高剂量HC/A肽(第4组，n＝10)。在所有大鼠的盲肠上都造成了浆膜下损伤。在第五天进行剖腹手术。评估粘连得分、组织病理学检查和E-钙粘蛋白表达水平。
结果：当与第4组(高剂量HC/A肽)相比时，第1和第2组(对照和假手术)的一般粘连得分被确定为显著高(P＜0.001)。在第3组和第4组(低剂量对高剂量HC/A肽)之间，在一般粘连得分方面也被确定为显著差异(P＜0.05)。在成对比较中，当与第1组和第2组(对照和假手术)相比时，在新血管形成、成纤维细胞密度、胶原蛋白沉积和炎性细胞计数方面在高剂量HC/A肽组(第4组)有显著降低(P＜0.05)。
结论：在这项研究中，高剂量HC/A肽被确定为在预防术后PIAs中的有效药剂。该改善与实施例1、3、5、6和7所述的实验数据一致，其中用对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽处理的成纤维细胞显示具有降低的与成肌纤维细胞形成(包括S100A4和ACTA2)相关的基因的表达，并调节了细胞外基质(ECM)蛋白和蛋白酶(包括纤连蛋白、胶原蛋白和MMP1)的表达和分泌，其起适当维持、更新和修复ECM组织结构的功能。还与显示BoNT/A的结合结构域(HC/A)降低了成纤维细胞收缩性的实施例4一致。
实施例15
根据本发明公开内容的方面提供的示例性多肽在大鼠模型中在促进无瘢痕伤口愈合中的用途
在六只麻醉的范围为260g-310g的CD无毛雌性大鼠中造成伤口。无菌活检穿孔器用于在中线旁边造成两个对称的全厚度切除伤口，平均直径为11.5毫米。
将HC/A肽溶解在无菌磷酸盐缓冲生理食盐水中至终浓度5、10和20pM，并在切除边缘周围的7-9个位点以每个注射位点25μL透皮注射。为了比较，无菌磷酸盐缓冲生理食盐水的注射并行进行。
在第0、3、7、10、14和21天进行拍摄和测量单个伤口。在21天收集组织活检样品以通过组织学观察胶原蛋白结构。
结果：最初，在第3-9天，HC/A肽处理的伤口愈合较慢。但是，在第21天，在HC/A肽治疗组中，瘢痕更短，更平整，更不明显，并且胶原纤维显得更有条理。
结论：结果表明，术后立即注射HC/A肽导致伤口愈合，瘢痕少。该改善与实施例1、3、5、6和7所述的实验数据一致，其中用对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽处理的成纤维细胞显示具有降低的与成肌纤维细胞形成(包括S100A4和ACTA2)相关的基因的表达，并调节了细胞外基质(ECM)蛋白和蛋白酶(包括纤连蛋白、胶原蛋白和MMP1)的表达和分泌，其起适当维持、更新和修复ECM组织结构的功能。还与显示BoNT/A的结合结构域(HC/A)降低了成纤维细胞收缩性的实施例4一致。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
尽管与本文所描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开内容的实践或测试中，但是在前述段落中描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意图是限制性的。在发生冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。
本文引用的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请均通过引用的方式并入本文。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用的方式并入本文。本文引用的所有公开的参考文献、文件、手稿、科学文献均通过引用的方式并入本文。与本文引用的科学数据库有关的所有标识符和登录号(例如，PUBMED、NCBI、GENBANK、EBI)通过引用的方式并入本文。
序列表
<110> B·P·杰克伊
A·布里多安德森
H·尤
D·E·弗雷尔
M·F·布林
<120> 肉毒杆菌毒素细胞结合结构域多肽及其用于治疗纤维化相关障碍的方法
<130> 19980-WO-A-PCT-NTB
<140>
<141>
<150> 62/727,640
<151> 2018-09-06
<150> 62/608,119
<151> 2017-12-20
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 421
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 1
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
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Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
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Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
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Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
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Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
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Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
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Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys
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Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg
290 295 300
Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr
305 310 315 320
Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile
325 330 335
Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn
340 345 350
Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn
355 360 365
Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala
370 375 380
Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser
385 390 395 400
Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp
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<212> DNA
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 2
accagcattc tgaacctgcg ttatgaaagc aaccatctga ttgatctgag ccgttatgcg 60
agcaaaatta acattggcag caaagtgaac tttgatccga ttgataagaa ccagattcag 120
ctgtttaacc tggaaagcag caaaattgaa gtgattctga agaacgcgat tgtgtataac 180
agcatgtatg aaaactttag caccagcttt tggattcgta ttccgaaata ttttaacagc 240
attagcctga acaacgaata taccattatt aactgcatgg aaaacaacag cggctggaaa 300
gtgagcctga actatggcga aattatttgg accctgcagg atacccagga aattaaacag 360
cgtgtggtgt ttaaatatag ccagatgatt aacattagcg attatattaa ccgttggatc 420
tttgtgacca ttaccaacaa ccgtctgaac aacagcaaaa tttatattaa cggccgtctg 480
attgatcaga aaccgattag caacctgggc aacattcatg cgagcaacaa cattatgttt 540
aaactggatg gctgccgtga tacccatcgt tatatttgga ttaaatattt taacctgttt 600
gataaagagc tcaacgagaa agaaattaaa gatctgtatg ataaccagag caacagcggc 660
attctgaaag atttctgggg cgattatctg cagtatgata aaccgtatta tatgctgaac 720
ctgtatgatc cgaacaaata tgtggatgtg aacaacgtgg gcattcgtgg ctatatgtat 780
ctgaaaggcc cgcgtggcag cgtgatgacc accaacattt atctgaacag cagcctgtat 840
cgtggcacca aatttattat taagaagtat gcgagcggca acaaagataa cattgtgcgt 900
aacaacgatc gtgtgtatat taacgtggtg gtgaagaaca aagaatatcg tctggcgacc 960
aacgcgagcc aggcgggcgt ggaaaagatt ctgagcgcgc tggaaattcc ggatgtgggc 1020
aacctgagcc aggtggtggt gatgaaaagc aagaacgatc agggcattac caacaaatgc 1080
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aacaacattg cgaaactggt ggcgagcaac tggtataacc gtcagattga acgtagcagc 1200
cgtaccctgg gctgcagctg ggaatttatt ccggtggatg atggctgggg cgaacgtccg 1260
ctgtaa 1266
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<211> 429
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 3
Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu
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Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn
20 25 30
Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg
35 40 45
Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe
50 55 60
Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile
65 70 75 80
Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn
85 90 95
Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr
100 105 110
Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn
115 120 125
Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr
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Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val
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Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys
275 280 285
Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr
290 295 300
Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr
305 310 315 320
Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile
325 330 335
Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp
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Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu
355 360 365
Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser
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Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp
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<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
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Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys
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225 230 235 240
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Gly Gly Asp Trp Tyr Arg His Asn Tyr Leu Val Pro Thr Val Lys Gln
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<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 5
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln Leu Asn
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Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp Lys Ile
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Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr Glu Asn
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Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp Lys Thr Ile Val
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Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln Met Leu Trp Ile Arg
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Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser Asn Glu Asp Ile Asn Ile
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Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu Arg Asn Val Ile Lys Asp Tyr Trp Gly
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Asn Pro Leu Lys Phe Asp Thr Glu Tyr Tyr Ile Ile Asn Asp Asn Tyr
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Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Pro Glu Ser Asn Val Leu Val Leu Val Gln
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Tyr Pro Asp Arg Ser Lys Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ile Lys
260 265 270
Ser Val Ser Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Arg Ile Leu Asn Gly Asp Asn
275 280 285
Ile Ile Leu His Met Leu Tyr Asn Ser Arg Lys Tyr Met Ile Ile Arg
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Asp Thr Asp Thr Ile Tyr Ala Thr Gln Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn
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Gly Ile Phe Ser Ile Lys Asn Ile Val Ser Lys Asn Lys Tyr Cys Ser
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<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 6
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Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Glu Gly Asn Val Gln Leu Asn
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Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly Ser Ser Gly Asp Asp Arg
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Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn Ile Val Tyr Asn Ala Met
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Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asn Lys Trp Val
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Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe Leu Val Phe Thr Leu Lys
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Gln Asn Glu Asn Ser Glu Gln Asp Ile Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Ser
115 120 125
Lys Asn Ala Ala Gly Tyr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Thr
130 135 140
Asn Met Met Gly Asn Met Met Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp
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Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile
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Thr Phe Gln Met Asn Lys Ile Pro Asn Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp
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Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys
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Glu Leu Asp Asp Lys Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr
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Glu Tyr Tyr Met Ile Asn Val Asn Tyr Met Asn Arg Tyr Met Ser Lys
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Asp Asn Lys Gln Tyr Ser Leu Gly Met Tyr Lys Pro Ser Arg Asn Leu
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Gly Thr Asp Leu Val Pro Leu Gly Ala Leu Asp Gln Pro Met Asp Glu
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Ile Arg Lys Tyr Gly Ser Phe Ile Ile Gln Pro Cys Asn Thr Phe Asp
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Tyr Tyr Ala Ser Gln Leu Phe Leu Ser Ser Asn Ala Thr Thr Asn Arg
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Leu Gly Ile Leu Ser Ile Gly Ser Tyr Ser Phe Lys Leu Gly Asp Asp
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Tyr Trp Phe Asn His Glu Tyr Leu Ile Pro Val Ile Lys Ile Glu His
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Tyr Ala Ser Leu Leu Glu Ser Thr Ser Thr His Trp Val Phe Val Pro
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Ala Ser Glu
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<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 7
Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr
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Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu
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Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys
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Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp
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Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr
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Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val
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Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly
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Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg Tyr
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Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Val Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu Thr
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Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr Asn Ile Leu Lys
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Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu
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Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr
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<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 8
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<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
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115 120 125
Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Phe Ser
130 135 140
Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn Ile Tyr Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn Leu Asp Arg Ile Asn
165 170 175
Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile Asn Cys Thr Asp Thr Thr
180 185 190
Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn
195 200 205
Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr
210 215 220
Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr
225 230 235 240
Leu Phe Asn Gln Gly Met Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys
245 250 255
Ala Ser Met Gly Glu Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala
260 265 270
Ile Asn Tyr Gln Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys
275 280 285
Ala Ser Asn Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly
290 295 300
Asp Tyr Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg
305 310 315 320
Val Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu
325 330 335
Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile Lys
340 345 350
Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys Glu Lys
355 360 365
Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe Val Lys Asp
370 375 380
Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe Cys Ile Ser Gln
385 390 395 400
Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn Lys Leu Arg Leu Gly
405 410 415
Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu Gly Trp Thr Glu
420 425 430
<210> 10
<211> 410
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 10
Val Leu Asn Leu Gly Ala Glu Asp Gly Lys Ile Lys Asp Leu Ser Gly
1 5 10 15
Thr Thr Ser Asp Ile Asn Ile Gly Ser Asp Ile Glu Leu Ala Asp Gly
20 25 30
Arg Glu Asn Lys Ala Ile Lys Ile Lys Gly Ser Glu Asn Ser Thr Ile
35 40 45
Lys Ile Ala Met Asn Lys Tyr Leu Arg Phe Ser Ala Thr Asp Asn Phe
50 55 60
Ser Ile Ser Phe Trp Ile Lys His Pro Lys Pro Thr Asn Leu Leu Asn
65 70 75 80
Asn Gly Ile Glu Tyr Thr Leu Val Glu Asn Phe Asn Gln Arg Gly Trp
85 90 95
Lys Ile Ser Ile Gln Asp Ser Lys Leu Ile Trp Tyr Leu Arg Asp His
100 105 110
Asn Asn Ser Ile Lys Ile Val Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Phe Asn Gly
115 120 125
Trp Asn Leu Ile Thr Ile Thr Asn Asn Arg Ser Lys Gly Ser Ile Val
130 135 140
Tyr Val Asn Gly Ser Lys Ile Glu Glu Lys Asp Ile Ser Ser Ile Trp
145 150 155 160
Asn Thr Glu Val Asp Asp Pro Ile Ile Phe Arg Leu Lys Asn Asn Arg
165 170 175
Asp Thr Gln Ala Phe Thr Leu Leu Asp Gln Phe Ser Ile Tyr Arg Lys
180 185 190
Glu Leu Asn Gln Asn Glu Val Val Lys Leu Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asn
195 200 205
Ser Asn Tyr Ile Arg Asp Ile Trp Gly Asn Pro Leu Gln Tyr Asn Lys
210 215 220
Lys Tyr Tyr Leu Gln Thr Gln Asp Lys Pro Gly Lys Gly Leu Ile Arg
225 230 235 240
Glu Tyr Trp Ser Ser Phe Gly Tyr Asp Tyr Val Ile Leu Ser Asp Ser
245 250 255
Lys Thr Ile Thr Phe Pro Asn Asn Ile Arg Tyr Gly Ala Leu Tyr Asn
260 265 270
Gly Ser Lys Val Leu Ile Lys Asn Ser Lys Lys Leu Asp Gly Leu Val
275 280 285
Arg Asn Lys Asp Phe Ile Gln Leu Glu Ile Asp Gly Tyr Asn Met Gly
290 295 300
Ile Ser Ala Asp Arg Phe Asn Glu Asp Thr Asn Tyr Ile Gly Thr Thr
305 310 315 320
Tyr Gly Thr Thr His Asp Leu Thr Thr Asp Phe Glu Ile Ile Gln Arg
325 330 335
Gln Glu Lys Tyr Arg Asn Tyr Cys Gln Leu Lys Thr Pro Tyr Asn Ile
340 345 350
Phe His Lys Ser Gly Leu Met Ser Thr Glu Thr Ser Lys Pro Thr Phe
355 360 365
His Asp Tyr Arg Asp Trp Val Tyr Ser Ser Ala Trp Tyr Phe Gln Asn
370 375 380
Tyr Glu Asn Leu Asn Leu Arg Lys His Thr Lys Thr Asn Trp Tyr Phe
385 390 395 400
Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Asp Glu Asp
405 410
<210> 11
<211> 218
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 11
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
85 90 95
Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
100 105 110
Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn
210 215
<210> 12
<211> 221
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 12
Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn
20 25 30
Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg
35 40 45
Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe
50 55 60
Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile
65 70 75 80
Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn
85 90 95
Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr
100 105 110
Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn
115 120 125
Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr
130 135 140
Ile Thr Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu
145 150 155 160
Glu Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly
165 170 175
Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile
180 185 190
Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn
195 200 205
Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr
210 215 220
<210> 13
<211> 226
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 13
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Arg Lys Asn Thr Leu Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Ser Glu Glu Gly Asp Val Gln Leu Asn
20 25 30
Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly Ser Ser Gly Glu Asp Arg
35 40 45
Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn Ile Val Tyr Asn Ser Met
50 55 60
Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asn Lys Trp Val
65 70 75 80
Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp Ser Val Lys Asn Asn Ser
85 90 95
Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe Leu Val Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Gln Asn Glu Asp Ser Glu Gln Ser Ile Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Ser
115 120 125
Asn Asn Ala Pro Gly Tyr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Val Thr Asn
130 135 140
Asn Met Met Gly Asn Met Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp
145 150 155 160
Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile
165 170 175
Thr Phe Glu Ile Asn Lys Ile Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp
180 185 190
Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys
195 200 205
Glu Leu Asp Gly Lys Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr
210 215 220
Thr Asn
225
<210> 14
<211> 215
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 14
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln Leu Asn
20 25 30
Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp Lys Ile
35 40 45
Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr Glu Asn
50 55 60
Ser Ser Val Ser Phe Trp Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Thr Asn Ser
65 70 75 80
His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Glu Gln Asn Ser Gly Trp
85 90 95
Lys Leu Cys Ile Arg Asn Gly Asn Ile Glu Trp Ile Leu Gln Asp Val
100 105 110
Asn Arg Lys Tyr Lys Ser Leu Ile Phe Asp Tyr Ser Glu Ser Leu Ser
115 120 125
His Thr Gly Tyr Thr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn
130 135 140
Ile Met Gly Tyr Met Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Glu Leu Lys Gln Ser
145 150 155 160
Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp Lys Thr Ile Val
165 170 175
Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln Met Leu Trp Ile Arg
180 185 190
Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser Asn Glu Asp Ile Asn Ile
195 200 205
Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu
210 215
<210> 15
<211> 226
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 15
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Thr Leu Met Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Glu Gly Asn Val Gln Leu Asn
20 25 30
Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly Ser Ser Gly Asp Asp Arg
35 40 45
Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn Ile Val Tyr Asn Ala Met
50 55 60
Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asn Lys Trp Val
65 70 75 80
Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp Ser Val Lys Asn Asn Ser
85 90 95
Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe Leu Val Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Gln Asn Glu Asn Ser Glu Gln Asp Ile Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Ser
115 120 125
Lys Asn Ala Ala Gly Tyr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Thr
130 135 140
Asn Met Met Gly Asn Met Met Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp
145 150 155 160
Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile
165 170 175
Thr Phe Gln Met Asn Lys Ile Pro Asn Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp
180 185 190
Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys
195 200 205
Glu Leu Asp Asp Lys Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr
210 215 220
Thr Asn
225
<210> 16
<211> 221
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 16
Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr
20 25 30
Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu
35 40 45
Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys
50 55 60
Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys
65 70 75 80
Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp
85 90 95
Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp
100 105 110
Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr
115 120 125
Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val
130 135 140
Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly
145 150 155 160
Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His Val
165 170 175
Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg Tyr
180 185 190
Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Val Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu Thr
195 200 205
Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr Asn
210 215 220
<210> 17
<211> 218
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 17
Asn Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys Phe Ile Asp Ile
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asp Val Tyr Ile Tyr
20 25 30
Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Ser Ser Lys Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn Gly Arg Tyr Gln
50 55 60
Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys
65 70 75 80
Val Asn Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asp Cys Ile Arg Asn Asn
85 90 95
Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Asn Tyr Asn Lys Ile Ile Trp Thr
100 105 110
Leu Gln Asp Thr Ala Gly Asn Asn Gln Lys Leu Val Phe Asn Tyr Thr
115 120 125
Gln Met Ile Ser Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr
130 135 140
Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn
145 150 155 160
Leu Ile Asp Glu Lys Ser Ile Ser Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser
165 170 175
Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Gly Cys Asn Asp Thr Arg Tyr Val
180 185 190
Gly Ile Arg Tyr Phe Lys Val Phe Asp Thr Glu Leu Gly Lys Thr Glu
195 200 205
Ile Glu Thr Leu Tyr Ser Asp Glu Pro Asp
210 215
<210> 18
<211> 224
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 18
Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu Ile Asp Ser
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val Ile Phe Asn
20 25 30
Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu Asn Ser Asn
35 40 45
Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser Met Phe Asp
50 55 60
Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr Asn Asn Asn
65 70 75 80
Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Ser Cys Ile
85 90 95
Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn Arg Ile Ile
100 105 110
Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile Phe Phe Glu
115 120 125
Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Phe Ser
130 135 140
Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn Ile Tyr Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn Leu Asp Arg Ile Asn
165 170 175
Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile Asn Cys Thr Asp Thr Thr
180 185 190
Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn
195 200 205
Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr
210 215 220
<210> 19
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 19
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Asp Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser
20 25 30
Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly
35 40 45
Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe
50 55 60
Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile
85 90 95
Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile
100 105 110
Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly
115 120 125
Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val
130 135 140
Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg
145 150 155 160
Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile
165 170 175
Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly
180 185 190
Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg
195 200 205
Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys
210 215 220
Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn
225 230 235 240
Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys
245 250 255
Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val
260 265 270
Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly
275 280 285
Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly
290 295 300
Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile
305 310 315 320
Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys
325 330 335
Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile
340 345 350
Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val
355 360 365
Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met
370 375 380
Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His
385 390 395 400
Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg
405 410 415
Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile
420 425 430
Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu Gln
435 440
<210> 20
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 20
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys
20 25 30
Asn Thr Leu Met Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Glu
35 40 45
Gly Asn Val Gln Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly
50 55 60
Ser Ser Gly Asp Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn
65 70 75 80
Ile Val Tyr Asn Ala Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile
85 90 95
Arg Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp
100 105 110
Ser Val Lys Asn Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe
115 120 125
Leu Val Phe Thr Leu Lys Gln Asn Glu Asn Ser Glu Gln Asp Ile Asn
130 135 140
Phe Ser Tyr Asp Ile Ser Lys Asn Ala Ala Gly Tyr Asn Lys Trp Phe
145 150 155 160
Phe Val Thr Ile Thr Thr Asn Met Met Gly Asn Met Met Ile Tyr Ile
165 170 175
Asn Gly Lys Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile
180 185 190
Asn Phe Ser Lys Thr Ile Thr Phe Gln Met Asn Lys Ile Pro Asn Thr
195 200 205
Gly Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp
210 215 220
Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Asp Lys Asp Ile Asn Ile Leu
225 230 235 240
Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val Lys Asp Tyr Trp Gly Asn
245 250 255
Asp Leu Arg Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Met Ile Asn Val Asn Tyr Met
260 265 270
Asn Arg Tyr Met Ser Lys Lys Gly Asn Gly Ile Val Phe Asn Thr Arg
275 280 285
Lys Asn Asn Asn Asp Phe Asn Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg
290 295 300
Ile Arg Gly Asn Thr Asn Asp Thr Arg Val Arg Gly Glu Asn Val Leu
305 310 315 320
Tyr Phe Asn Thr Thr Ile Asp Asn Lys Gln Tyr Ser Leu Gly Met Tyr
325 330 335
Lys Pro Ser Arg Asn Leu Gly Thr Asp Leu Val Pro Leu Gly Ala Leu
340 345 350
Asp Gln Pro Met Asp Glu Ile Arg Lys Tyr Gly Ser Phe Ile Ile Gln
355 360 365
Pro Cys Asn Thr Phe Asp Tyr Tyr Ala Ser Gln Leu Phe Leu Ser Ser
370 375 380
Asn Ala Thr Thr Asn Arg Leu Gly Ile Leu Ser Ile Gly Ser Tyr Ser
385 390 395 400
Phe Lys Leu Gly Asp Asp Tyr Trp Phe Asn His Glu Tyr Leu Ile Pro
405 410 415
Val Ile Lys Ile Glu His Tyr Ala Ser Leu Leu Glu Ser Thr Ser Thr
420 425 430
His Trp Val Phe Val Pro Ala Ser Glu Gln
435 440
<210> 21
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 21
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Asp Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser
20 25 30
Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly
35 40 45
Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe
50 55 60
Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile
85 90 95
Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile
100 105 110
Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly
115 120 125
Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val
130 135 140
Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg
145 150 155 160
Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile
165 170 175
Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly
180 185 190
Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg
195 200 205
Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys
210 215 220
Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn
225 230 235 240
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 23
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 24
His Glu Leu Ile His
1 5
<210> 25
<211> 421
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 25
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
85 90 95
Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
100 105 110
Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn
225 230 235 240
Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg
245 250 255
Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Ala Ala Asn
260 265 270
Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys
275 280 285
Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg
290 295 300
Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr
305 310 315 320
Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile
325 330 335
Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn
340 345 350
Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn
355 360 365
Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala
370 375 380
Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser
385 390 395 400
Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp
405 410 415
Gly Glu Arg Pro Leu
420
<210> 26
<211> 421
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 26
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
85 90 95
Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
100 105 110
Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn
225 230 235 240
Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg
245 250 255
Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn
260 265 270
Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys
275 280 285
Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg
290 295 300
Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr
305 310 315 320
Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile
325 330 335
Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn
340 345 350
Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn
355 360 365
Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala
370 375 380
Lys Leu Val Ala Ser Asn Leu Ser Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser
385 390 395 400
Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp
405 410 415
Gly Glu Arg Pro Leu
420
<210> 27
<211> 421
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 27
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
85 90 95
Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
100 105 110
Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn
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Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg
245 250 255
Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn
260 265 270
Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys
275 280 285
Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg
290 295 300
Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr
305 310 315 320
Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile
325 330 335
Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn
340 345 350
Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn
355 360 365
Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala
370 375 380
Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser
385 390 395 400
Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp
405 410 415
Arg Glu Arg Pro Leu
420

Claims (38)

1.一种用于治疗和/或减少有需要的受试者中细胞外基质(ECM)疾病、结缔组织疾病、内皮疾病或纤维化障碍的发生的方法，其包括：
给受试者施用包含有效量的具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物，其中所述多肽的分子量在约4kDa至约60kDa之间，并且其中调节皮肤质量属性不涉及面部肌肉的麻痹。
2.权利要求1的方法，其中所述纤维化障碍选自：真皮瘢痕、伤口瘢痕、手术瘢痕、术后腹腔粘连、纤维瘤、肝纤维化、肝硬化、胰腺炎、良性前列腺增生、纤维性膀胱、间质性膀胱炎、肺纤维化、肾纤维化、肾小球硬化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、胶质瘢痕、动脉硬化、关节纤维化、囊性纤维化、非囊性纤维化、克罗恩病、杜普伊特伦氏挛缩、纵隔纤维化、骨髓纤维化、佩罗尼氏病、肾源性系统性纤维化、进行性大块纤维化、腹膜后纤维化、粘连性关节囊炎、混合结缔组织病、眼纤维化、骨关节炎、硬皮病和哮喘。
3.权利要求1的方法，其中所述纤维化障碍选自：纤维化乳腺疾病；疙瘩瘢痕；肝纤维化；纤维化膀胱；纤维组织增生，例如良性前列腺增生；胰腺炎；粘连，例如腹腔粘连；瘢痕，例如肥厚性瘢痕或其组合。
4.权利要求3的方法，其中所述受试者为人类受试者。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述多肽的分子量在约10kDa至约60kD之间或在约12kDa至约50kD之间。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求6的方法，其中所述肉毒杆菌毒素选自：肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)、肉毒杆菌毒素B血清型(BoNT/B)、肉毒杆菌毒素C1血清型(BoNT/C1)、肉毒杆菌毒素D血清型(BoNT/D)、肉毒杆菌毒素E血清型(BoNT/E)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/F)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/FA)、肉毒杆菌毒素G血清型(BoNT/G)、肉毒杆菌毒素H血清型(BoNT/H)、肉毒杆菌D/C嵌合(BoNT/DC)、肉毒杆菌C/D嵌合(BoNT/CD)、肉毒杆菌毒素X血清型(BoNT/X)和肠球菌属种BoNT J(eBoNT/J)。
8.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述多肽包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID No：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：12-18和SEQ ID NO：25-27的序列具有至少30％同源性的氨基酸序列。
9.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述多肽包括选自以下的序列、基本上由选自以下的序列组成或由选自以下的序列组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：3-5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID No：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：12-18和SEQ ID NO：25-27。
10.一种多肽，其包含：
与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间。
11.一种多肽，其包含：
与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间。
12.权利要求10或权利要求11的多肽，其中所述多肽的分子量在约10kDa至约60kD之间或在约12kDa至约50kD之间。
13.权利要求10-12中任一项的多肽，其中所述肉毒杆菌毒素选自：肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)、肉毒杆菌毒素B血清型(BoNT/B)、肉毒杆菌毒素C1血清型(BoNT/C1)、肉毒杆菌毒素D血清型(BoNT/D)、肉毒杆菌毒素E血清型(BoNT/E)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/F)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/FA)、肉毒杆菌毒素G血清型(BoNT/G)、肉毒杆菌毒素H血清型(BoNT/H)、肉毒杆菌D/C嵌合(BoNT/DC)、肉毒杆菌C/D嵌合(BoNT/CD)、肉毒杆菌毒素X血清型(BoNT/X)和肠球菌属种BoNT J(eBoNT/J)。
14.权利要求10-12中任一项的多肽，其中所述肉毒杆菌毒素不是肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)。
15.权利要求10-14中任一项的多肽，其中所述结合结构域包含肉毒杆菌毒素的重链的结合结构域区域(HC)。
16.权利要求10-15中任一项的多肽，其中所述结合结构域包含肉毒杆菌毒素的重链的结合结构域区域的氨基端(HCN)。
17.权利要求10-16中任一项的多肽，其中所述多肽能够调节包括选自FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7和TP63的多种基因的遗传特征的表达。
18.权利要求10-17中任一项的多肽，其中所述多肽能够调节选自FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7、TP63、SOD2、UBD、HAS2、HAS3、ADAMTS1、IGF-1、IL-6、IL-32、CCL2、BDKRB1、S100A4和ACTA2的多种基因的表达。
19.权利要求10-18中任一项的多肽，其中所述多肽能够减少与成纤维细胞收缩性或成肌纤维细胞形成相关的基因的表达。
20.权利要求10-19中任一项的多肽，其中所述多肽能够提高选自成纤维细胞、瘢痕衍生的成纤维细胞、纤维化细胞、癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、皮脂腺细胞、免疫细胞或神经元的靶细胞中的基因表达。
21.权利要求10-20中任一项的多肽，其中所述多肽能够改变靶细胞的功能特征。
22.权利要求10-21中任一项的多肽，其中所述多肽具有经修饰的肉毒杆菌毒素内肽酶活性或缺乏肉毒杆菌毒素内肽酶活性。
23.权利要求10-22中任一项的多肽，其中所述多肽缺乏包含重链的氨基端(HN)的肉毒杆菌毒素易位结构域。
24.权利要求10-23中任一项的多肽，其包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQID NO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID No：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：12-18和SEQ ID NO：25-27的序列具有至少30％同源性的氨基酸序列。
25.权利要求10-23中任一项的多肽，其中所述多肽与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID No：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：12-18和SEQ ID NO：25-27的序列具有至少约90％序列同一性。
26.一种融合蛋白，其包含权利要求10-25中任一项的多肽。
27.一种药物组合物，其包含权利要求10-25中任一项的多肽或权利要求26的融合蛋白和药学上可接受的载体。
28.一种局部或透皮药物组合物，其包含权利要求10-25中任一项的多肽或权利要求26的融合蛋白和用于其局部或透皮递送的可接受的载体。
29.一种试剂盒，其在一个或多个包装中包含权利要求10-25中任一项的多肽或权利要求26的融合蛋白和施用说明书。
30.一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
31.一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
32.一种多核苷酸，其与SEQ ID NO：2的多核苷酸序列或编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：3-5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：7-10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：12-18和SEQ ID NO：25-27的核酸具有至少50％序列同源性。
33.一种载体，其包含权利要求30、权利要求31或权利要求32的多核苷酸。
34.一种宿主细胞，其包含权利要求33的载体。
35.权利要求34的宿主细胞，其中所述宿主细胞不是肉毒梭菌。
36.一种试剂盒，其在一个或多个包装中包含权利要求33的载体和用于在合适的宿主细胞中表达所述多核苷酸的说明书。
37.一种组合物，其包含：权利要求33的载体或权利要求34的宿主细胞或权利要求29的宿主细胞和药用赋形剂。
38.一种治疗或减少纤维化相关障碍的发生的方法，其包括：给受试者施用权利要求37的组合物以实现多肽的表达。
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