CN112351992A - 肉毒杆菌毒素细胞结合结构域多肽及其用于皮肤再生的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了具有对应于肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列的多肽。所述多肽调节例如胶原蛋白产生和细胞外基质组织涉及的基因的表达，并因此可用在调节皮肤质量属性(诸如弹性、紧实度等)中。此外，所述多肽抑制特定细胞中的脂肪生成，并因此可用在减少皮肤油性中，其在患有毛孔粗大和痤疮的皮肤组织中经常观察到。进一步描述了编码所述多肽的核酸，以及包含所述核酸的载体、宿主细胞和系统。

Description

肉毒杆菌毒素细胞结合结构域多肽及其用于皮肤再生的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月20日提交的美国临时申请号62/608,119和2018年9月6日提交的美国临时申请号62/727,640的权益，其全部内容通过引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且所述序列表以引用的方式全文并入本文。所述ASCII副本创建于2018年12月17日，命名为19980-US-NTB_SL19980PROV2(NTB)_SL.txt，大小为71,994字节。
技术领域
本公开内容总体上涉及来自肉毒杆菌毒素的细胞结合结构域的多肽以及所述多肽在与皮肤再生相关的美容应用中的用途。
背景技术
厌氧的革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生有效的多肽神经毒素，肉毒杆菌毒素(BoNT)，其具有充分记录的医疗应用。天然存在的梭菌毒素均被翻译为约50kDa包含酶促结构域的轻链(LC)和约100kDa包含N端易位结构域(HN)和C端受体结合结构域(HC)的重链的约150千道尔顿(kDa)的单链多肽。因此，全长梭菌毒素分子包含三个功能不同的结构域：(1)位于LC中的酶促结构域，包含含有锌依赖性内肽酶的金属蛋白酶区域，其特异性靶向神经递质释放机构的核心组分；(2)重链的氨基端一半(HN)内含有的易位结构域，促进LC从细胞内囊泡释放到靶细胞的细胞质中；(3)存在于重链的羧基端一半(HC)内的结合结构域，确定毒素与位于靶细胞表面的受体的结合亲和力和特异性。结合结构域包含两个大小大致相等的不同结构特征，称为N端亚域(HCN)和C端亚域(HCC)。
这种毒素构造存在于各种免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素中，例如，肉毒杆菌神经毒素A、B、C1、D、DC、E、F、G、X和J血清型。无论血清型，全长150kDa毒素蛋白以及其中的单个结构域之间存在着显著程度的结构和功能同源性。就这一点而言，各BoNT彼此具有约35％氨基酸同一性，并且具有相同功能结构域组织和整体结构构造。在每个类型的梭菌毒素内，也有一些其氨基酸序列略有不同的亚型。然而，各种结构域(例如内肽酶、易位和细胞结合结构域)的结构域构造在单个亚型中也是保守的。例如，目前有五个BoNT/A亚型，BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，其具有约89％的整体氨基酸同一性。例如，就氨基酸序列同一性而言，超家族的其它成员在结构上也类似于上述梭菌毒素(例如BoNT/F和BoNT/E)，所述超家族的其它成员例如由破伤风梭菌(C.tetani)的统一群产生的破伤风毒素(TeNT)以及由梭菌属种产生的其它相关毒素，例如BaNT(由巴氏梭菌(C.baratii)产生)和BuNT(由丁酸梭菌(C.butyricum)产生)。
现有的药物制剂含有全长梭菌毒素。需要梭菌毒素片段和变体，所述梭菌毒素片段和变体具有与全长相当——如果不是更好的话——的生物活性，同时提供改善的治疗特性，例如，与整个梭菌毒素相比改善的安全性、增强的稳定性和/或更好的体内功效。
发明内容
本文描述了本公开内容的BoNT多肽的各种美容应用。例如，用含有调节多个基因表达的BoNT/A(HC/A)的结合结构域的多肽、其片段或变体处理原代人皮肤成纤维细胞。具体地，用本公开内容的多肽处理导致编码基质降解酶(如基质金属蛋白酶(MMP))和蛋白质(如TP63(转化相关蛋白63，识别角膜和表皮干细胞的转录因子))的基因最初表达增加，随后编码表明细胞外基质(ECM)重塑的主要基质结构蛋白(例如胶原蛋白和弹性蛋白)的基因表达增加。用本公开内容的多肽(例如BoNT/A(HC/A))处理正常人原代成纤维细胞，已知与组织和ECM体内平衡、重塑、更新和修复有关的基因表达增加。
用本公开内容的多肽的片段(例如BoNT的结合结构域的N端一半)进行的其它研究，在正常人原代成纤维细胞上也产生了类似的细胞效应。具体地，BoNT/A的结合结构域(HC/A)和结合结构域的N端一半(HCN/A)分别在影响成纤维细胞相关基因(FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7、TP63、SOD2、UBD、HAS2、HAS3、ADAMTS1、IGF-1、IL-6、IL-32、CCL2和BDKRB1)的表达中同样有效。这些数据表明通过本公开内容的多肽可能调节人患者中皮肤真皮的结构和功能特性。
对成纤维细胞的进一步研究表明，本公开内容的多肽调节纤连蛋白的表达。由于纤连蛋白与介导皮肤的ECM结构和/或生物力学特性的改变有关，因此数据表明本公开内容的多肽对改变皮肤的物理和/或机械属性的潜在作用。
对BoNT/DC(HC/DC)在原代成纤维细胞上的并行研究显示了关于基因表达调节的相似结果。例如，HC/DC处理调节了原代成纤维细胞中许多基因的表达。发现HC/DC相对于HCN/A在调节某些基因表达方面更有效。这些发现表明，其它另外的BoNT血清型可能以类似于BoNT/A(HC/A)和BoNT/DC(HC/DC)的模式影响皮肤的特性或属性。
对皮脂腺细胞的功能研究表明，本公开内容的多肽显著抑制了皮脂腺细胞中油酸诱导的脂肪生成。由于皮脂腺细胞脂肪生成与皮肤的美容特性相关，这些数据表明本公开内容的多肽在调节皮肤特性或属性中的潜在应用。
因此，本公开内容涉及以下非限制性方面：
在一方面，描述了包含梭菌毒素(诸如肉毒杆菌毒素)的结合结构域序列的多肽和多核苷酸序列以及包含此类多肽或多核苷酸的组合物。在一个实施方案中，描述了多肽序列，所述多肽序列参与细胞信号传导和/或调节细胞基因表达以实现细胞外基质蛋白(诸如例如纤连蛋白、弹性蛋白和/或胶原蛋白)的表达增加，以及细胞表型的相应改变。在一些实施方案中，描述了显著减少靶细胞(例如皮脂腺细胞)中脂肪生成的多肽序列。
在另一方面，提供了一种包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有在约1kDa至约90kDa之间的分子量。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约4kDa至约60kD之间。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约12kDa至约50kD之间。
在另一方面，提供了一种包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有在约1kDa至约90kDa之间的分子量。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约4kDa至约60kD之间。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约12kDa至约50kD之间。
在一些实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链的羧基或C端区段(HC)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的N端一半相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素选自：肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)、肉毒杆菌毒素B血清型(BoNT/B)、肉毒杆菌毒素C1血清型(BoNT/C1)、肉毒杆菌毒素D血清型(BoNT/D)、肉毒杆菌毒素E血清型(BoNT/E)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/F)、肉毒杆菌毒素G血清型(BoNT/G)、肉毒杆菌毒素H血清型(BoNT/H)、肉毒杆菌毒素X血清型(BoNT/X)、肠球菌属种(Enterococcus sp.)BoNT/J(eBoNT/J)、以及嵌合肉毒杆菌毒素和/或其变体。嵌合毒素的实例包括BoNT/DC、BoNT/CD和BoNT/FA。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素不是肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)。
在另一个实施方案中，所述多肽能够调节成纤维细胞相关基因的表达。在一些实施方案中，所述多肽能够调节选自FGFR1(成纤维细胞生长因子受体1)、MMP1、MMP3(基质金属蛋白酶)、TIMP1(TIMP金属肽酶抑制剂1)、FGF7(成纤维细胞生长因子7)和TP63(肿瘤蛋白p63)的基因。
在其它实施方案中，所述多肽能够调节包含选自FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7、TP63、SOD2(超氧化物歧化酶2，线粒体)、UBD(泛素D)、HAS2、HAS3(透明质酸合酶)、ADAMTS1(具有血小板反应蛋白基序1的分解素和金属蛋白酶)、IGF-1(胰岛素样生长因子1)、IL-6，IL-32(白介素)、CCL2(C趋化因子(C-C基序)配体2)和BDKRB1(缓激肽受体B1)的基因的遗传特征的表达。
在其它实施方案中，所述多肽能够调节包含选自MC5R、AR、HSD3B1、HSD17B1和PPARδ的基因的遗传特征的表达。在一个实施方案中，多肽能够调节皮脂腺细胞中选自MC5R、AR、HSD3B1、HSD17B1和PPARδ的至少一种基因的诱导表达。
在其它实施方案中，所述多肽能够提高靶细胞中纤连蛋白的表达或合成。在一些实施方案中，所述靶细胞包括成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、皮脂腺细胞、脂肪细胞、神经元或其组合。
在另一个实施方案中，所述多肽能够改变靶细胞的形态或功能特征。
在另一个实施方案中，所述多肽能够改变靶成纤维细胞的形态特征。
在另一个实施方案中，所述多肽缺乏肉毒杆菌毒素内肽酶活性。
在另一个实施方案中，所述多肽缺乏肉毒杆菌毒素易位活性。在一个实施方案中，所述多肽缺乏与肉毒杆菌毒素的重链的氨基端(HN)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽由与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，所述多肽包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQID NO:12-18的序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述多肽与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:12-18的序列具有至少约90％序列同一性。
在另一个实施方案中，所述多肽基本上由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQID NO:12-18中列出的多肽序列组成。
在一些实施方案中，所述多肽包括以下列出的多肽序列、基本上由其组成或由其组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:12-18，条件是所述多肽含有多肽序列中的1、2、3、4或5个突变。优选地，所述突变多肽含有SEQ ID NO:1的多肽序列中的1、2、3、4或5个突变，例如，突变多肽包括以下列出的多肽序列、基本上由其组成或由其组成：SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27。
在另一方面，提供了一种包含本文所述的多肽的融合蛋白。
在另一方面，提供了一种包含如本文所述的多肽或融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一个实施方案中，将所述药物组合物配制成用于局部或透皮施用。
在另一方面，描述了一种包括如本文所述的多肽或融合蛋白的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括施用说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包括一个或多个包装。
在另一方面，提供了一种用于调节受试者中皮肤质量属性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，调节皮肤质量属性不涉及面部肌肉的麻痹。在一些实施方案中，所述肉毒杆菌毒素选自：肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)、肉毒杆菌毒素B血清型(BoNT/B)、肉毒杆菌毒素C1血清型(BoNT/C1)、肉毒杆菌毒素D血清型(BoNT/D)、肉毒杆菌毒素E血清型(BoNT/E)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/F)、肉毒杆菌毒素G血清型(BoNT/G)、肉毒杆菌毒素H血清型(BoNT/H)、肉毒杆菌毒素X血清型(BoNT/X)、肠球菌属种BoNT/J(eBoNT/J)、以及嵌合肉毒杆菌毒素和/或其变体。嵌合毒素的实例包括BoNT/DC、BoNT/CD和BoNT/FA。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素不是肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)。
在一个实施方案中，皮肤质量属性选自：透明度、水合作用、表皮和真皮厚度、纹理、弹性、色泽、色调、柔韧性、紧实度、紧致度、光滑度、厚度、光泽、均匀度、松弛度、肤色、细纹、皱纹、毛孔大小和油性。在另一个实施例，所述调节产生至少约20％的属性改善。
在另一方面，提供了一种刺激受试者中胶原蛋白产生的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，刺激胶原蛋白产生不涉及面部肌肉的麻痹。
在另一方面，提供了一种用于治疗与受试者的皮脂失调和/或异常有关的皮肤障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，治疗与皮脂失调和/或异常有关的皮肤障碍不涉及面部肌肉的麻痹。
在另一方面，提供了一种用于治疗与受试者的皮脂失调和/或异常有关的感染的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，治疗与皮脂失调和/或异常有关的感染不涉及面部肌肉的麻痹。
在另一方面，提供了一种用于治疗与受试者的皮脂失调和/或异常有关的炎症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，治疗与皮脂失调和/或异常有关的炎症不涉及面部肌肉的麻痹。
在另一方面，提供了一种用于调节受试者的皮脂失调和/或异常的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述多肽具有在约20kDa至约60kDa之间的分子量。在一个实施方案中，调节皮脂失调和/或异常不涉及面部肌肉的麻痹。
在其它实施方案中，将所述组合物配制用于局部、透皮或皮内施用。
在一个实施方案中，用于任何方法中的多肽与选自SEQ ID NO:1、19、3-18和25-27的序列具有至少约90％序列同一性。
在其它方面，提供了一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
在其它方面，提供了一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
在其它方面，提供了一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量大于1kDa但小于15kDa；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量大于1kDa但小于15kDa；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量大于1kDa但小于15kDa；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
在另一方面，提供了一种多核苷酸，其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或编码选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:12-18和SEQ ID NO:25-27的多肽的核酸或其简并物或其RNA等同物具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或更高的％序列同一性。
在另一个实施方案中，所述多核苷酸基本上由SEQ ID NO:2中列出的核酸序列或其简并物或其RNA等同物组成。
在另一方面，提供了一种包含如本文所述的多核苷酸的载体。在其它方面，提供了一种包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞不是肉毒梭菌。
在其它方面，提供了试剂盒、组合物以及使用所述试剂盒和组合物的方法。在一个实施方案中，提供了一种在一个或多个包装中包括载体和用于在合适的宿主细胞中表达多核苷酸的说明书的试剂盒。在另一个实施方案中，提供了包含载体或宿主细胞和药用赋形剂的组合物。在另一个实施方案中，提供了一种改善皮肤质量属性的方法，其包括给受试者施用包含载体或宿主细胞的组合物以实现多肽的表达。
序列的简述
SEQ ID NO:1是BoNT/A1的细胞结合结构域(HC/A)的氨基酸序列：
TSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO:19是进一步包含N端组氨酸标签(组成N端标签的氨基酸标有下划线)的BoNT/A1的细胞结合结构域(HC/A)的氨基酸序列：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMDTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLQ
SEQ ID NO:2是BoNT/A1的细胞结合结构域(HC/A)的DNA序列：
accagcattctgaacctgcgttatgaaagcaaccatctgattgatctgagccgttatgcgagcaaaattaacattggcagcaaagtgaactttgatccgattgataagaaccagattcagctgtttaacctggaaagcagcaaaattgaagtgattctgaagaacgcgattgtgtataacagcatgtatgaaaactttagcaccagcttttggattcgtattccgaaatattttaacagcattagcctgaacaacgaatataccattattaactgcatggaaaacaacagcggctggaaagtgagcctgaactatggcgaaattatttggaccctgcaggatacccaggaaattaaacagcgtgtggtgtttaaatatagccagatgattaacattagcgattatattaaccgttggatctttgtgaccattaccaacaaccgtctgaacaacagcaaaatttatattaacggccgtctgattgatcagaaaccgattagcaacctgggcaacattcatgcgagcaacaacattatgtttaaactggatggctgccgtgatacccatcgttatatttggattaaatattttaacctgtttgataaagagctcaacgagaaagaaattaaagatctgtatgataaccagagcaacagcggcattctgaaagatttctggggcgattatctgcagtatgataaaccgtattatatgctgaacctgtatgatccgaacaaatatgtggatgtgaacaacgtgggcattcgtggctatatgtatctgaaaggcccgcgtggcagcgtgatgaccaccaacatttatctgaacagcagcctgtatcgtggcaccaaatttattattaagaagtatgcgagcggcaacaaagataacattgtgcgtaacaacgatcgtgtgtatattaacgtggtggtgaagaacaaagaatatcgtctggcgaccaacgcgagccaggcgggcgtggaaaagattctgagcgcgctggaaattccggatgtgggcaacctgagccaggtggtggtgatgaaaagcaagaacgatcagggcattaccaacaaatgcaaaatgaacctgcaggataacaacggcaacgatattggctttattggctttcatcagtttaacaacattgcgaaactggtggcgagcaactggtataaccgtcagattgaacgtagcagccgtaccctgggctgcagctgggaatttattccggtggatgatggctggggcgaacgtccgctgtaa
SEQ ID NO:3是BoNT/B、HC/B的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号BAE48264)：
NIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
SEQ ID NO:4是BoNT/C、HC/C的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号P18640)：
SKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
SEQ ID NO:5是BoNT/D的重链内的结合结构域区域HC/D的氨基酸序列(GENBANK登录号P19321)：
SKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE
SEQ ID NO:6是BoNT/DC的重链内的结合结构域区域HC/DC的氨基酸序列(GENBANK登录号EF378947)：
SKILSLQNKKNTLMDTSGYNAEVRVEGNVQLNPIFPFDFKLGSSGDDRGKVIVTQNENIVYNAMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNENSEQDINFSYDISKNAAGYNKWFFVTITTNMMGNMMIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFQMNKIPNTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDDKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYDKEYYMINVNYMNRYMSKKGNGIVFNTRKNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGENVLYFNTTIDNKQYSLGMYKPSRNLGTDLVPLGALDQPMDEIRKYGSFIIQPCNTFDYYASQLFLSSNATTNRLGILSIGSYSFKLGDDYWFNHEYLIPVIKIEHYASLLESTSTHWVFVPASE
SEQ ID NO:20是进一步包含N端组氨酸标签(组成N端标签的氨基酸标有下划线)的BoNT/DC的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号EF378947)：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMDSKILSLQNKKNTLMDTSGYNAEVRVEGNVQLNPIFPFDFKLGSSGDDRGKVIVTQNENIVYNAMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNENSEQDINFSYDISKNAAGYNKWFFVTITTNMMGNMMIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFQMNKIPNTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDDKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYDKEYYMINVNYMNRYMSKKGNGIVFNTRKNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGENVLYFNTTIDNKQYSLGMYKPSRNLGTDLVPLGALDQPMDEIRKYGSFIIQPCNTFDYYASQLFLSSNATTNRLGILSIGSYSFKLGDDYWFNHEYLIPVIKIEHYASLLESTSTHWVFVPASEQ
SEQ ID NO:7是BoNT/E、HC/E的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号AFV91344)：
SSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNVFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
SEQ ID NO:8是BoNT/F、HC/F的重链内的结合结构域区域的氨基酸序列(GENBANK登录号ABS41202)：
NSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN
SEQ ID NO:9是BoNT/G的重链内的结合结构域区域HC/G的氨基酸序列(GENBANK登录号X74162)：
NAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE
SEQ ID NO:10是BoNT/X的重链内的结合结构域区域HC/X的氨基酸序列(GENBANK登录号BAQ12790)：
VLNLGAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNFSISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYIAFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLLDQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREYWSSFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMGISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETSKPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED
SEQ ID NO:11是对应于BoNT/A1的细胞结合结构域的氨基酸序列的残基1-218的氨基酸序列，称为细胞结合结构域的N端片段，缩写为HCN/A(PDB ID：3BTA，4JRA)：
TSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSN
SEQ ID NO:21是包括N端组氨酸标签和BoNT/A1的细胞结合结构域的氨基酸序列的残基1-218的氨基酸序列，称为细胞结合结构域的N端片段，缩写为HCN/A(组成N端标签的氨基酸标有下划线)：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMDTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSN
SEQ ID NO:12是来自BoNT/B的结合结构域的N端区域HCN/B的氨基酸序列(PDB ID：2NM1)：
NIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEY
SEQ ID NO:13是来自BoNT/C的结合结构域的N端区域HCN/C的氨基酸序列(PDB ID：3R4U)
SKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTN
SEQ ID NO:14是来自BoNT/D的结合结构域的N端区域HCN/D的氨基酸序列(PDB ID：3N7J)：
SKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQIL
SEQ ID NO:15是来自BoNT/DC的结合结构域的N端区域HCN/DC的氨基酸序列(PDBID：4ISQ)：
SKILSLQNKKNTLMDTSGYNAEVRVEGNVQLNPIFPFDFKLGSSGDDRGKVIVTQNENIVYNAMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNENSEQDINFSYDISKNAAGYNKWFFVTITTNMMGNMMIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFQMNKIPNTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDDKDINILFNSLQYTN
SEQ ID NO:16是来自BoNT/E的结合结构域的N端区域HCN/E的氨基酸序列(PDB：4ZKT)：
SSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNVFDKELDETEIQTLYSNEPNTN
SEQ ID NO:17是来自BoNT/F的结合结构域的N端区域HCN/F的氨基酸序列(PDB ID：3RSJ)：
NSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPD
SEQ ID NO:18是来自BoNT/G的结合结构域的N端区域HCN/G的氨基酸序列(PDB ID：2VXR)
NAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNT
附图说明
本公开内容的一个或多个实施方案的细节在附图/表格和以下描述中阐述。根据附图/表格和详细描述以及根据权利要求，本公开内容的其它特征、目的和优点将是显而易见的。
图1是显示了在用1μM根据本公开内容的方面提供的具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的示例性多肽处理持续1、2或3天后，正常人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图，其中相对于未处理的对照细胞表达倍数变化；
图2是显示了在用10nM(实心柱)、100nM(空白柱)或1μM(阴影柱)的SEQ ID NO:19的示例性多肽处理持续24小时后，正常人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图，其中相对于未处理的对照细胞表达倍数变化。
图3是显示了在用1μM SEQ ID NO:19的示例性多肽(实心柱)或1μM根据本公开内容的方面提供的另一种具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的示例性多肽(空白柱)处理后，正常人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图。
图4A-4B是用纤连蛋白的抗体对纤连蛋白免疫染色并在SEQ ID NO:19的示例性多肽存在(图4A)或不存在(图4B)下在正常生长培养基或低浓度培养基(含250μg/ml BSA的培养基)中培养48小时的成纤维细胞的图像。
图5显示了用100nM或1μM根据本公开内容的方面提供的另一种具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的示例性多肽或用1μM的SEQ ID NO:21的示例性多肽处理持续1天，正常人原代成纤维细胞中基因表达的变化。
图6是显示了在用不同的脂肪生成刺激物(包括油酸(OA)、氯化钙(CaCl2)、乙酰胆碱(ACh)、二氢睾酮(DHT)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)或罗格列酮)处理皮脂腺细胞持续1天时，皮脂腺细胞脂肪生成增加的图。*表示与对照相比，有p<0.05的统计学显著性。
图7是显示了在用油酸(OA)处理皮脂腺细胞(SZ95)时皮脂腺细胞脂肪生成增加，以及在用20pM的SEQ ID NO:19的示例性多肽共同处理时皮脂腺细胞脂肪生成减少的图。*表示与对照相比，有p<0.05的统计学显著性。#表示与单独用OA处理相比，有p<0.05的统计学显著性。
图8是显示了在用20pM SEQ ID NO:19的示例性多肽或油酸(OA)处理皮脂腺细胞(SEB-1)时皮脂腺细胞脂肪生成增加，以及在用SEQ ID NO:19的示例性多肽共同处理时OA诱导的皮脂腺细胞脂肪生成减少的图。*表示与对照相比，有p<0.05的统计学显著性。#表示与单独用OA处理相比，有p<0.05的统计学显著性。
图9是显示了在2pM、20pM和200pM下用油酸(OA)或SEQ ID NO:19的示例性多肽处理皮脂腺细胞(SEB-1)时皮脂腺细胞脂肪生成增加，以及在2pM、20pM和200pM下用SEQ IDNO:19的示例性多肽共同处理时OA诱导的皮脂腺细胞脂肪生成减少的图。*表示与对照相比，有p<0.05的统计学显著性。#表示与单独用OA处理相比，有p<0.05的统计学显著性。
具体实施方式
将在下文中更全面地描述各个方面。然而，这些方面可以以许多不同的形式来呈现，并且不应被解释为限于本文列出的实施方案；相反，提供这些实施方案以使本公开内容是全面和完整的。
定义
在本公开内容中提供数值范围的情况下，旨在将该范围的上限和下限之间的每个中间值和所述指定范围内的任何其它述及的值或中间值均包括在本公开内容内。例如，如果述及的范围是1μM至8μM，则旨在也明确公开了2μM、3μM、4μM、5μM、6μM和7μM以及大于或等于1μM的值的范围和小于或等于8μM的值的范围。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”(“a”，“an”)和“所述”(“the”)包括复数个指示物。因此，例如，对”氨基酸”的提及包括单个氨基酸以及两个或多个相同或不同的氨基酸。
除非本公开内容的上下文另有指示或与这种解释不一致，否则词语“约”意指该值的正负10％的范围，例如，“约50”意指45至55，约“25,000”意指22,500至27,500等。例如，在例如“约49、约50、约55”的数值列表中，“约50”意指扩展到小于前一个值与后一个值之间间隔的一半的范围，例如大于49.5至小于52.5。
“施用(Administration)”或“施予(to administer)”意指将药物组合物给予(即施予)受试者或受试者接受药物组合物的步骤。本文公开的药物组合物可通过各种方法局部施用。例如，肌内、皮内、皮下施用、鞘内施用、腹膜内施用、局部(透皮)、灌注和植入(例如，缓释设备诸如聚合物植入物或微渗透泵)都可是适当的施用途径。
“缓解”意指疼痛、头痛或者病况或障碍的任何症状或原因的发生减少。因此，缓解包括一定的减少、显著减少、接近完全减少和完全减少。
术语“氨基酸”意指天然存在的或合成的氨基酸以及功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸类似物、立体异构体和氨基酸模拟物。该定义包括天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸衍生物，天然氨基酸例如：(1)组氨酸(His；H)(2)异亮氨酸(Ile；I)(3)亮氨酸(Leu；L)(4)赖氨酸(Lys；K)(5)蛋氨酸(Met；M)(6)苯丙氨酸(Phe；F)(7)苏氨酸(Thr；T)(8)色氨酸(Trp；W)(9)缬氨酸(Val；V)(10)精氨酸(Arg；R)(11)半胱氨酸(Cys；C)(12)谷氨酰胺(Gln；Q)(13)甘氨酸(Gly；G)(14)脯氨酸(Pro；P)(15)丝氨酸(Ser；S)(16)酪氨酸(Tyr；Y)(17)丙氨酸(Ala；A)(18)天冬酰胺(Asn；N)(19)天冬氨酸(Asp；D)(20)谷氨酸(Glu；E)(21)硒代半胱氨酸(Sec；U)；非天然氨基酸：(a)瓜氨酸(Cit)；(b)胱氨酸；(c)γ-氨基丁酸(GABA)；(d)鸟氨酸(Orn)；(f)茶氨酸；(g)同型半胱氨酸(Hey)；(h)甲状腺素(Thx)；氨基酸衍生物诸如甜菜碱；肉毒碱；肌肽肌酸；羟色氨酸；羟脯氨酸(Hyp)；N-乙酰半胱氨酸；S-腺苷甲硫氨酸(SAM-e)；牛磺酸；酪胺。
“氨基酸残基”意指掺入多肽中的单个氨基酸单元。
“无动物蛋白质”意指不存在血液来源的、血液汇集的和其它动物来源的产物或化合物。“动物”意指哺乳动物(诸如人类)、鸟、爬行动物、鱼、昆虫、蜘蛛或其它动物物种。“动物”不包括微生物，诸如细菌。因此，无动物蛋白的药物组合物可包括肉毒杆菌神经毒素。例如，“无动物蛋白质”药物组合物意指大体上不含或基本上不含或完全不含血清来源的白蛋白、明胶和其它动物来源的蛋白质(诸如免疫球蛋白)的药物组合物。无动物蛋白质药物组合物的实例是包含肉毒杆菌毒素(作为活性成分)和合适的多糖作为稳定剂或赋形剂或由上述成分组成的药物组合物。
本文使用的毒素的“结合结构域”包括野生型结合结构域、其变体和/或片段。
“肉毒杆菌毒素”意指由肉毒梭菌产生的神经毒素，以及由非梭菌属种重组制备的肉毒杆菌毒素(或其轻链或重链)。如本文中所用，短语“肉毒杆菌毒素”包括肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E、F、G、H和X血清型以及它们的亚型嵌合毒素(例如BoNT/DC和BoNT/CD)和任何其它类型的其亚型，或任何前述类型各自的任何再工程化的蛋白质、类似物、衍生物、同源物、部分、子部分、变体或形式。如本文中所用，“肉毒杆菌毒素”还包括“经修饰的肉毒杆菌毒素”。如本文中所用，另外的“肉毒杆菌毒素”还包括肉毒杆菌毒素复合物(例如300kDa、600kDa和900kDa复合物)，以及不与复合蛋白缔合的肉毒杆菌毒素的神经毒性组分(150kDa)。
“梭菌毒素”是指由梭菌毒素菌株产生的任何毒素，其可执行整个细胞机制，通过所述机制，梭菌毒素使细胞中毒并且包括梭菌毒素与低或高亲和力梭菌毒素受体的结合、毒素/受体复合物的内化、梭菌毒素轻链至细胞质中的易位和梭菌毒素底物的酶促修饰。梭菌毒素的非限制性实例包括肉毒杆菌毒素，诸如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/CD、BoNT/DC、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H(又名FA或HA类型)、BoNT/X、BoNT/J、破伤风毒素(TeNT)、Baratii毒素(BaNT)和酪酸毒素(BuNT)。从术语“梭菌毒素”中排除不是神经毒素的BoNT/C2细胞毒素和BoNT/C3细胞毒素。术语梭菌毒素还包括仅约150kDa的梭菌毒素(即没有NAP)。梭菌毒素包括天然存在的梭菌毒素变体，诸如梭菌毒素同种型和梭菌毒素亚型；非天然存在的梭菌毒素变体，诸如例如保守梭菌毒素变体、非保守梭菌毒素变体、梭菌毒素嵌合变体及其活性梭菌毒素片段或其任意组合。梭菌毒素还包括梭菌毒素复合物，其是指包含梭菌毒素和非毒素相关蛋白(NAP)的复合物，诸如肉毒杆菌毒素复合物、破伤风毒素复合物、Baratii毒素复合物和酪酸毒素复合物(Butyricum toxin complex)。梭菌毒素复合物的非限制性实例包括由肉毒梭菌产生的那些复合物，诸如900-kDa BoNT/A复合物、500-kDaBoNT/A复合物、300-kDa BoNT/A复合物、500-kDa BoNT/B复合物、500-kDa BoNT/C1复合物、500-kDa BoNT/D复合物、300-kDa BoNT/D复合物、300-kDa BoNT/E复合物和300-kDa BoNT/F复合物。
“细胞表型”是指在基因表达、蛋白质表达、因子的合成和/或蛋白质和影响细胞和/或组织(细胞是其一部分，包括细胞外基质结构和皮脂)的结构和/或功能的因子的分泌中的任何变化。
当应用于生物活性成分时，“有效量”意指通常足以在受试者中实现期望的变化的成分的量。例如，当期望的效应是皮脂的减少时，成分的有效量是引起皮脂的至少显著减少并且不会导致显著毒性的量。
当用于涉及添加到梭菌毒素组合物中的赋形剂或赋形剂的特定组合的量时，“有效量”是指实现梭菌毒素活性成分的期望的初始回收效能所必需的每种赋形剂的量。在该实施方案的方面，有效量的赋形剂或赋形剂的组合导致例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的初始回收效能。在该实施方案的其它方面，治疗有效浓度的梭菌毒素活性成分使与待治疗的区域(aliment)相关的症状减少例如至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多90％或至多100％。
“重链”意指肉毒杆菌神经毒素的重链。它具有约100kDa的分子量，并且可被称为H链或H。
Hc意指来源于肉毒杆菌神经毒素的H链的片段(约50kDa)，其大约等同于H链的羧基端部区段或对应于完整H链中的该片段的部分。据信它含有天然或野生型肉毒杆菌神经毒素的涉及与运动神经元高亲和力突触前结合的部分。
HN意指来源于肉毒杆菌神经毒素的H链的片段(约50kDa)，其大约等同于H链的氨基端部区段或对应于完整H链中的该片段的部分。据信它含有天然或野生型肉毒杆菌神经毒素的涉及L链跨细胞内内吞体膜易位的部分。
“同源物”意指一类执行相同生物学功能的蛋白质中的蛋白质，例如，属于相同梭菌毒素家族并提供共同活性(例如受体结合活性)的蛋白质。同源物通常由同源基因表达。
“分离的”意指与野生或天然序列分离的核酸序列或多肽序列，在该野生或天然序列中天然存在该核酸序列或多肽序列，或该核酸序列或多肽序列处于不同于天然存在该序列的环境中。
“轻链”意指梭菌神经毒素的轻链。它具有约50kDa的分子量，并且可被称为L链、L或称为肉毒杆菌神经毒素的蛋白水解结构域(氨基酸序列)。
LHN或L-HN意指来源于含有L链的梭菌神经毒素的片段或耦联到HN结构域的它们的功能片段。它可通过完整的梭菌神经毒素蛋白水解以便移除或修饰Hc结构域而获得。
“植入物”意指控释(例如，脉冲或连续)组合物或药物递送系统。植入物可以例如注射、插入或植入到人类身体中。
“局部施用”意指在动物身体上或动物身体内的需要药物的生物效应的部位处或在其附近直接施用药物，诸如例如经由肌内或皮内或皮下注射或局部施用。局部施用排除全身的施用途径，诸如静脉内或口服施用。局部施用是一种将药剂施用于患者皮肤的局部施用类型。
“经修饰的肉毒杆菌毒素”意指与天然肉毒杆菌毒素相比其氨基酸中的至少一者缺失、被修饰或被替换的肉毒杆菌毒素。另外，经修饰的肉毒杆菌毒素可以是重组产生的神经毒素，或重组制备的神经毒素的衍生物或片段。经修饰的肉毒杆菌毒素保留了天然肉毒杆菌毒素的至少一种生物活性，诸如结合肉毒杆菌毒素受体的能力或抑制神经元释放神经递质的能力。经修饰的肉毒杆菌毒素的一个实例是具有来自一种血清型肉毒杆菌毒素(诸如A血清型)的轻链和来自不同血清型肉毒杆菌毒素(诸如B血清型)的重链的肉毒杆菌毒素。经修饰的肉毒杆菌毒素的另一个实例是耦联到神经递质(诸如物质P)的肉毒杆菌毒素。
“突变”意指天然存在的蛋白质或核酸序列的结构修饰。例如，就核酸突变而言，突变可以是DNA序列中一个或多个核苷酸的缺失、添加或置换。就蛋白质序列突变而言，突变可以是蛋白质序列中的一个或多个氨基酸的缺失、添加或置换。例如，包含蛋白质序列的特定氨基酸可以被置换为另一个氨基酸，例如，选自以下的氨基酸：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或任何其它天然或非天然存在的氨基酸或化学修饰的氨基酸。蛋白质序列的突变可以是以下过程的结果：DNA序列突变，然后转录，然后所得的mRNA翻译产生突变的蛋白质序列。还可以通过将含有期望的突变的肽序列融合到期望的蛋白质序列中来产生蛋白质序列的突变。
“患者”意指接收医疗或兽医护理的人类或非人类受试者。因此，如本文所公开的组合物可用于治疗任何动物，诸如哺乳动物等。
“肽”和“多肽”是指由通过肽键连接的氨基酸残基链组成的任何聚合物，无论其大小。尽管“蛋白质”通常用于指相对较大的多肽，而“肽”通常用于指较小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用是重叠和变化的，因此，为简单起见，术语“多肽”将在本文中使用，尽管在某些情况下，本领域可能指与“蛋白质”相同的聚合物。除非另有说明，否则多肽的序列以从氨基端到羧基端的顺序给出。
如果氨基酸序列或核苷酸序列在给定的比较窗口中与参考序列具有至少85％的序列同一性，则氨基酸序列或核苷酸序列与参考序列“基本相同”、“与……基本相同”或“基本相似”。因此，基本相似的序列包括具有例如至少85％的序列同一性，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的那些序列。彼此相同的两个序列也基本相似。比较窗口或比较序列的长度通常至少是肉毒杆菌毒素的结合结构域或肉毒杆菌毒素片段(例如包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的约20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、150、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425个毗连氨基酸的片段)的结合结构域的长度。基于参考序列计算序列同一性，并且用于序列分析的算法在本领域中是已知的。因此，为了确定两个氨基酸序列的序列同一性百分比，序列被比对以达到最佳比较目的(例如，可以在一个多肽的序列中引入空位以与另一个多肽进行最佳比对)。然后比较在相应的酸位置的氨基酸残基。当一个序列中的一个位置被与其它序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的序列同一性百分比是该序列具有的相同位置数目的函数(即，序列同一性百分比＝相同位置数/位置总数×100)。可以使用Vector NTI软件包(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)确定两个多肽序列之间的序列同一性百分比。空位开放罚分10和空位延伸罚分0.1可用于确定两个多肽的同一性百分比。所有其它参数可以设置为默认设置。用于确定序列同源性的另一个软件工具是来自国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，(NCBI))的基本局部比对搜索工具(BLAST)。例如，BLAST可以比较蛋白质序列并计算相同或相似氨基酸残基、同源性、空位等的百分比。
“在外围施用”或“外围施用”意指皮下、皮内、透皮或皮下施用，但排除肌内施用。“外围”意指在皮下位置，并且排除内脏部位。
“药物组合物”意指包含活性药物成分(诸如梭菌毒素活性成分诸如肉毒杆菌毒素)和至少一种另外的成分(诸如稳定剂或赋形剂等)的组合物。因此，药物组合物是适于对受试者(诸如人类患者)进行诊断或治疗性施用的制剂。药物组合物可以为例如冻干或真空干燥状态、冻干或真空干燥药物组合物重构之后形成的溶液，或者为不需要重构的溶液或固体。
“药理学上可接受的赋形剂”与“药理学赋形剂”或“赋形剂”同义，并且是指当施用于哺乳动物时大体上不具有长期或永久有害效应的任何赋形剂，并且包括诸如稳定剂、膨松剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、添加剂、溶媒、载体、稀释剂或辅助剂的化合物。赋形剂通常与活性成分混合，或允许稀释或包封活性成分，并且可以是固体、半固体或液体剂。还设想包含梭菌毒素活性成分的药物组合物可包含有利于将活性成分加工成药学上可接受的组合物的一种或多种药学上可接受的赋形剂。只要任何药理学上可接受的赋形剂与梭菌毒素活性成分不相容，就可设想其在药学上可接受的组合物中的用途。药理学上可接受的赋形剂的非限制性实例可见于：例如，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(Howard C.Ansel等人合编，Lippincott Williams&Wilkins Publishers，第7版，1999)；Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Alfonso R.Gennaro编辑，Lippincott，Williams&Wilkins，第20版，2000)；Goodman&Gilman's The PharmacologicalBasis of Therapeutics(Joel G.Hardman等人合编，McGraw-Hill Professional，第10版，2001)；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(Raymond C.Rowe等人，APhAPublications，第4版，2003)，这些文献中的每一者均据此全文以引用方式并入本文。
药物组合物的组成成分可被包含在单一组合物中(即，除了任何所需的重构流体之外，所有组成成分在药物组合物的初始配混时存在)或作为双组分系统，例如，用重构载体重构的真空干燥组合物，所述重构载体可例如含有在药物组合物的初始配混中不存在的成分。双组分系统可以提供若干益处，包括允许掺入与双组分系统的第一组分的长期储存不充分兼容的成分。例如，重构载体可包括防腐剂，其在使用期间(例如，冷藏储存一周)提供足够的防微生物生长防护，但不用于两年的冷冻储存期期间，因为在此期间它可能使毒素降解。可以这种方式掺入与肉毒杆菌毒素或其它成分不能长时间段兼容的其它成分；也就是说，在大致使用的时间添加第二载体(例如，在重构载体中)。药物组合物还可包括防腐剂，诸如苄醇、苯甲酸、酚、对羟基苯甲酸酯和山梨酸。药物组合物可包括：例如赋形剂，诸如表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；制粒剂和崩解剂；粘合剂；润滑剂；防腐剂；生理上可降解的组分，诸如明胶；含水载体和溶剂；油性载体和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂、缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；抗氧化剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合物或疏水性材料，以及本领域已知的和例如Genaro编辑，1985，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa中描述的其它成分，该文献以引用的方式并入本文。
“多糖”意指具有多于两个糖分子单体的聚合物。这些单体可以是相同或不同的。
“稳定剂(Stabilizing agent)”、“稳定剂(stabilization agent)”或“稳定剂(stabilizer)”意指用于稳定梭菌毒素活性成分使得药物组合物的效能相对于不稳定的组合物增加的物质。
“稳定剂”可包括赋形剂，并且可包括蛋白质和非蛋白质分子。
“表面活性剂”是指天然或合成的两亲化合物。表面活性剂可以是非离子的、两性离子的或离子的。表面活性剂的非限制性实例包括泊洛沙姆、聚山梨酸酯及其组合。
“治疗性制剂”意指可用于治疗并由此缓解障碍或疾病的制剂，诸如以皮脂腺过度活跃(即皮脂溢)为特征的障碍或疾病。
“治疗有效浓度”、“治疗有效量”、“有效量”、“有效剂量”和“治疗有效剂量”是指达到理想治疗效果所必需的梭菌毒素活性成分的最小剂量，以及包括足以减轻与待治疗的区域有关的症状的剂量。
“局部施用”排除神经毒素的全身给药。换言之，与常规的治疗性透皮方法不同，肉毒杆菌毒素的局部施用不会导致大量(诸如大部分的)神经毒素进入患者的循环系统。
“治疗”意指暂时或永久地缓解(或消除)病况或障碍的至少一种症状，诸如例如皱纹、松弛、干燥、斑点、不均匀、发红、毛孔粗大、油性等。
如本文所用，“变体”是指生物分子(例如，多肽或核酸)的序列由于至少一种修饰或氨基酸(或核酸)置换而与亲本序列不同的生物分子。因此，变体多肽包含至少一个氨基酸残基的修饰或置换。产生变体多肽的修饰类型包括，例如，一个或多个氨基酸残基的添加、缺失、置换、转位等。
多肽和包含所述多肽的组合物
如上所述，在一方面，提供了一种包含与梭菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，所述梭菌毒素是肉毒杆菌毒素。在一些实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链的羧基或C端区段(HC)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的N端一半相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素是BoNT/A。在另一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素是嵌合毒素。在一个实施方案中，所述肉毒杆菌毒素是BoNT/DC。在可选实施方案中，肉毒杆菌毒素不是BoNT/A。
在另一方面，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽的分子量在约1kDa至约90kD之间，或约20kDa至约60kD之间，或约22kDa至约50kD之间。
肉毒杆菌毒素血清型和亚型的氨基酸序列是已知的，表1给出了易位、内肽酶和结合结构域的近似边界区域以及其示例性GENBANK/UNIPROT登录号。BoNT毒素的代表性血清型(例如A型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型)包括相关成员，所述相关成员也在美国专利号7,892,565和8,486,422中公开。潜在的第八种类型(“H型”)描述在Dover等人,J InfectDis.,209(2):192-202,2014(PMID:24106295)中。最近的报道已将这种新神经毒素描述为BoNT/H、BoNT/FA或BoNT/HA。参见Maslanka等人，J Infect Dis.，213(3):379–385,2016；Peck等人，Toxins(Review),9(1):38,2017。嵌合肉毒杆菌毒素也是已知的，诸如BoNT/DC和BoNT/CD。
表1
Figure BDA0002642074890000281
Figure BDA0002642074890000291
在一个实施方案中，梭菌毒素来源于BoNT/A。在可选实施方案中，梭菌毒素不来源于BoNT/A，例如梭菌毒素是来源于BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、BoNT/DC、BoNT/CD、BoNT/FA、BoNT/HA、BoNT/X、eBoNT/J、TeNT、BaNT、BuNT或其组合的梭菌毒素。
在另一个实施方案中，梭菌毒素来源于梭菌毒素的各种亚型。如本文所用，术语“亚型”可以指具有相同或相似的氨基酸序列的两个或多个功能相似的蛋白质中的任一个，所述两个或多个功能相似的蛋白质由不同的基因或由来自已去除了不同外显子的相同基因的RNA转录物编码。“亚型”还可以指编码此类蛋白质的任何序列，包括成熟和未成熟的序列。因此，除非上下文中指出或理解为仅指一种或另一种，“亚型”包括编码一种或多种上述梭菌毒素的基因，以及所述基因的蛋白质产物。至少40个独特的通常称为亚型的BoNT通过DNA测序已被鉴定；一些影响BoNT功能(Rossetto等人，Nature Reviews Microbiol.,12,535-49,2014)。例如，分子研究为含有BoNT C和D血清型的结构成分的单BoNT的交叉反应血清学观察提供了证据。参见Arndt等人(J Mol Biol.,362(4):733-42,2006)和Hill等人(JBacteriol.,189:818-32,2007)。在一些情况下，发现BoNT/F的序列特别可变(Raphael等人,Appl Environ Microbiol.,76(14):4805-12,2012)，导致功能多样性与突触囊泡膜蛋白(诸如VAMP-2)的切割有关(Kalb等人，Anal Chem.,86:3254–62,2014)。
在一个实施方案中，梭菌毒素来源于各种BoNT/A亚型、BoNT/B亚型、BoNT/C亚型、BoNT/D亚型、BoNT/E亚型、BoNT/F亚型、和BoNT/G亚型，BoNT/A亚型诸如A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A9、A10；BoNT/B亚型诸如B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、Bnp和Bbv；BoNT/C亚型诸如C和CD；BoNT/D亚型诸如D和DC；BoNT/E亚型诸如E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9；BoNT/F亚型诸如F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7；和BoNT/G亚型诸如亚型G。BoNT亚型包括嵌合BoNT，例如BoNT/DC、BoNT/CD、BoNT/FA等。参见，Rossetto等人，Nature Reviews Microbiol.,12,535-49,2014；Montecucco等人,MBio 6:e02131–14,2015；美国专利号8,841,111和美国专利号8,697,413。序列比对分析例如通过诸如VECTOR NTI(Thermo Fisher，Carlsbad，CA)的软件执行，揭示了单个BoNT/A亚型之间的高度序列同一性。例如，在一个实施方案中，存在约78.9％(例如，在75％-80％之间，取决于比对软件)整体序列同一性，以及甚至在共有位置上约99.3％(例如，在95％-99.9％之间，取决于比对软件)更高的序列同一性。
在一个实施方案中，本公开内容涉及梭菌毒素的同源物。术语“同源物”意指一类执行相同生物学功能的蛋白质中的蛋白质，例如，属于相同梭菌毒素家族并提供共同活性的蛋白质。同源物通常由同源基因表达。关于同源基因，同源物包括直向同源物，例如通过物种形成从共同的祖先基因进化而来，并编码保留相同功能的蛋白质的在不同物种中表达的基因，但不包括种内同源基因，例如与复制相关但已进化为编码具有不同功能的蛋白质的基因。同源基因包括天然存在的等位基因和人工创建的变体。遗传编码的简并性提供了用不同的碱基置换基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基的可能性，而不会导致从所述基因产生的多肽的氨基酸序列发生改变。当最佳比对时，与主题蛋白(例如BoNT/A1)或包含HC结构域(特别是HCN结构域，尤其是HCN结构域的N端一半)的其片段相比，同源蛋白通常具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或更高％同一性或相似性。在本公开内容的另一方面，同源蛋白具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID No:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:12-18和SEQ ID NO:25-27的多肽具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或更高％同一性或相似性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，同源梭菌毒素根据同源性百分比分组，所述同源性百分比定义为蛋白质序列内相对于参考蛋白质序列的相同或相似残基(共有)的百分比，除以参考序列的长度，在比对序列并引入空位后(如果需要)，以实现最大序列同源性百分比。共有置换是允许氨基酸用相似氨基酸置换的那些置换。氨基酸在几个特征上可以相似，例如大小、形状、疏水性、亲水性、电荷、等电点、极性、芳香性等。为了确定氨基酸序列同源性百分比的目的，比对可以以本领域技术人员的普通技术范围内的各种方式实现。在某些情况下，氨基酸序列可以使用公共可获得的计算机软件(例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件)进行比对。在一个实施方案中，同源性百分比是使用可通过NCBI获得的基本局部比对搜索工具(BLAST)计算的，所述工具进行成对比对并使用残基置换矩阵提供原始得分。本文中，通过BLAST计算的位得分是考虑序列长度和空位大小的归一化得分。如在生物信息学中所理解的，283位的得分意味着找到比所呈现的更好的比对，搜索将必须包括2283(或2x1085)个单位(例如氨基酸或核酸)的空间。因此，位得分越高，匹配的显著性就越高。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在全长比较序列上实现最大比对所需的任何算法。然后相对于较长的序列计算序列同源性，即，即使较短的序列与较长的序列的一部分显示出100％的序列同一性，整体序列同一性也将小于100％。
在一个可选实施方案中，变体梭菌毒素可包含与一种或多种上述梭菌毒素具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高％同一性的序列。例如，在一个实施方案中，变体梭菌毒素与在UNIPROT登录号P0DPI1(例如A型)；P10844(例如B型)；P18640(例如C1型)；P19321(例如D型)；Q00496(GENBANK#CAA44558)(例如E型)；P30996(例如F型)；Q60393(例如G型)；H型的GENBANK ID:KGO15617(UNIPARC ID:00052C1529)；X型的GENBANK ID:BAQ12790(UNIPARCID:0005822796)；UNIPROT登录号P04958(例如TeNT)；Q45851(例如BaNT)；或P30995(例如BuNT)中列出的氨基酸序列可具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高例如约99.9％序列同一性。
在另一个实施方案中，变体梭菌毒素与以下列出的核酸或氨基酸序列可具有至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高例如约99.9％序列同一性，所述的核酸或氨基酸序列包括：(a)来源于BoNT/A毒素的GENBANK登录号AF488749(核酸)和AAQ06331(蛋白质)；(b)来源于BoNT/B毒素的GENBANK登录号AB232927(核酸)或BAE48264(蛋白质)；(c)GENBANK#CAA47060(核酸)；来源于BoNT/C1毒素的UNIPROT#P18640(蛋白质)；(d)GENBANK#X54254(核酸)；来源于BoNT/D毒素的UNIPROT#P19321(蛋白质)；(e)GENBANK#EF378947(核酸)；来源于BoNT/DC毒素的ABP48747(蛋白质)；(f)GENBANK#JX424539(核酸)；来源于BoNT/E毒素的AFV91344(蛋白质)；(g)GENBANK#ABS41202(蛋白质)；编码来源于BoNT/F毒素的ABS41202的DNA(例如cDNA)；(h)GENBANK#X74162(核酸)；来源于BoNT/G毒素的UNIPROT#Q60393(蛋白质)；(i)来源于BoNT/X毒素的GENBANK ID:BAQ12790(蛋白质)；或(j)GENBANK#OTO22244；来源于eBoNT/J毒素的UNIPROT#A0A242DI27(蛋白质)。
在另一个实施方案中，变体梭菌毒素与以下列出的核酸或氨基酸序列可具有至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高例如约99.9％序列同一性，所述的核酸或氨基酸序列包括：(1)GENBANK#AB443580(核酸)；来源于BoNT/A2千叶菌株毒素的BAH03558(蛋白质)；(b)GENBANK#X73423(核酸)；来源于京都F菌株毒素的CAA51824(蛋白质)；(c)GENBANK#DQ185900(核酸)；来源于BoNT/A3湖马里菌株毒素的ABA29017(蛋白质)；(d)来源于BoNT/A4 657Ba菌株毒素的(GENBANK#EU341307(核酸)；ABY56338(蛋白质))；(e)来源于BoNT/A5A 661222菌株毒素的(GENBANK#HM153705(核酸)；ADJ68235(蛋白质))；(f)GENBANK#FJ981696(核酸)；来源于BoNT/A6 CDC41370菌株毒素的ACW83602(蛋白质)；GENBANK#JQ954969(核酸)；来源于BoNT/A7 2008-148菌株毒素的AFV13854(蛋白质)。
在一些实施方案中，变体梭菌毒素包括突变体梭菌毒素或其片段。通常，突变体梭菌毒素在核心梭菌毒素多肽序列或其片段(例如，全长BoNT/A序列或SEQ ID NO:1的HC片段)中包含至少1、2、3、4、5个或更多，例如，最多达10个突变。这种突变体梭菌毒素的代表性实例包括，例如，包含W1266L和Y1267S的第一BoNT/A突变体或其片段(例如，在SEQ ID NO:1中包含W391L和Y392S的BoNT/A突变体的HC片段；突变体序列在SEQ ID NO:26中列出)或包含T1145A和T1146A的第二BoNT/A突变体或其片段(例如，在SEQ ID NO:1中包含T270A和T271A的BoNT/A突变体的HC片段；突变体序列在SEQ ID NO:25中列出)或包含G1292R的第三BoNT/A突变体或其片段(例如，在SEQ ID NO:1中包含G417R的BoNT/A突变体的HC片段；突变体序列在SEQ ID NO:27中列出)。在一些实施方案中，与非突变的梭菌毒素或其片段相比，突变体多肽或其片段具有经调节(例如减弱)的体外或体内活性，因此所述突变体多肽可用于调节非突变的梭菌毒素或其片段的药理特性。
多种序列比对方法中的任一种都可用于确定同一性百分比，包括但不限于全局法、局部法和混合法，诸如例如区段逼近法。确定同一性百分比的方案为在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规程序。
在一个实施方案中，变体梭菌毒素包含一个或多个氨基酸置换，其被选择以保持变体梭菌毒素的活性。半保守残基可以耐受保留电荷、极性和/或大小的变化。例如，包含上述编号的UNIPROT和/或GENBANK序列中列出的氨基酸序列的变体梭菌毒素可具有一个或多个置换，其中置换的氨基酸可以是已知的20种氨基酸中的任一种，其中所述变体梭菌毒素维持其活性，例如细胞结合活性或细胞信号活性或其组合(参见实施例部分)。优选地，氨基酸以保守或半保守的方式被置换。保守氨基酸置换的示例性类型包括，例如，将非极性(疏水的)残基置换为另一个非极性(疏水的)残基，诸如可彼此置换的I、V、L或M；将一个极性(亲水的)不带电荷的残基置换为另一个极性的不带电荷的残基，诸如Q置换为N，G置换为S，反之亦然；或者将带电荷的残基置换为另一个类似的带电荷的残基，诸如可彼此置换的K、R或H，或D置换为E，反之亦然。另一方面，非保守置换包括将非极性(疏水的)残基诸如I、V、L、A、M置换为极性(亲水的)残基诸如C、Q、D、K和/或反之亦然。在一个实施方案中，术语“保守置换”是指以下“强”基团之一内的氨基酸置换：STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY和/或FYW；和/或术语“半保守置换”是指以下“弱”基团之一内的氨基酸置换：CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、FVLIM和/或HFY。进行保守或半保守氨基酸置换的方法是本领域已知的，例如Risler等人，J.Mol.Biol.,204:1019-1029,1988；Niefind等人，J.Mol.Biol.219:481-497,1991；和Overington等人，Protein Science,1:216-226,1992。通过CLUSTAL多序列比对可观察到核心梭菌毒素序列(例如，BoNT/A序列)中的保守和半保守氨基酸替换的示例性类型，其中星号(*)表示同一性，分号(:)表示保守置换，以及句点(.)表示半保守置换。
本公开内容的梭菌毒素变体可以是天然存在的变体或非天然存在的变体。如本文所用，术语“天然存在的梭菌毒素变体”是指不借助于任何人工操作产生的任何梭菌毒素，包括但不限于，由可变剪接的转录物产生的梭菌毒素同种型，通过自发突变产生的梭菌毒素同种型和梭菌毒素亚型。如本文所用，术语“非天然存在的梭菌毒素变体”是指借助于人工操作产生的任何梭菌毒素，包括但不限于，通过基因工程使用随机诱变或合理设计产生的梭菌毒素和通过化学合成产生的梭菌毒素。非天然存在的梭菌毒素变体的非限制性实例包括，例如，保守梭菌毒素变体、非保守梭菌毒素变体和活性梭菌毒素片段。非天然梭菌毒素进一步包括例如通过添加化学部分、标签、配体等已被翻译后修饰的天然梭菌毒素。
如本文所用，术语“保守梭菌毒素变体”是指至少一个氨基酸被置换为具有至少一种与来自参考梭菌毒素序列(参见例如表1)的原始氨基酸的性质类似的性质的另一氨基酸或氨基酸类似物的梭菌毒素。这种性质的实例包括但不限于，类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲油性、共价键合能力、氢键合能力、物理化学性质等或其任意组合。保守梭菌毒素变体可以与所述保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素基本相同的方式起作用，并且在本说明书的任何方面中都可以置换为参考梭菌毒素。保守梭菌毒素变体可以从所述保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上置换1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400或500个或更多氨基酸。保守梭菌毒素变体还可以从所述保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上置换至少5、10、15、20或25个毗连氨基酸。保守梭菌毒素变体的非限制性实例包括，例如，保守BoNT/A变体、保守BoNT/B变体、保守BoNT/C1变体、保守BoNT/D变体、保守BoNT/E变体、保守BoNT/F变体、保守BoNT/G变体、保守BoNT/H变体、保守BoNT/X变体、保守eBoNT/J变体、保守TeNT变体、保守BaNT变体和保守BuNT变体。
如本文所用，术语“非保守梭菌毒素变体”是指一种梭菌毒素，其中(a)至少一个氨基酸从所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素中缺失；(b)至少一个氨基酸添加到所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素；或(c)至少一个氨基酸置换为不具有与来自参考梭菌毒素序列(参见例如表1)的原始氨基酸的性质相似的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守梭菌毒素变体可以与非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素基本相同的方式起作用，并且在本说明书的任何方面中都可以置换为参考梭菌毒素。非保守梭菌毒素变体可以从所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上删除一个或更多个氨基酸、两个或更多个氨基酸、三个或更多个氨基酸、四个或更多个氨基酸、五个或更多个氨基酸和十个或更多个氨基酸。非保守梭菌毒素变体可以添加一个或更多个氨基酸、两个或更多个氨基酸、三个或更多个氨基酸、四个或更多个氨基酸、五个或更多个氨基酸和十个或更多个氨基酸到所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素。非保守梭菌毒素变体可以从所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上置换1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400或500个或更多氨基酸。非保守梭菌毒素变体还可以从所述非保守梭菌毒素变体所基于的参考梭菌毒素上置换至少5、10、15、20或25个毗连氨基酸。非保守梭菌毒素变体的非限制性实例包括，例如，非保守BoNT/A变体、非保守BoNT/B变体、非保守BoNT/C1变体、非保守BoNT/D变体、非保守BoNT/E变体、非保守BoNT/F变体、非保守BoNT/G变体、非保守BoNT/H变体、非保守BoNT/X变体、非保守eBoNT/J变体、非保守TeNT变体、非保守BaNT变体和非保守BuNT变体。还可以设想，各种梭菌毒素片段中的任一种都可用于本说明书的方面，条件是这些活性片段可以执行总体细胞机制，由此梭菌毒素结合至结合伴侣，例如突触囊泡糖蛋白。因此，该实施方案的方面可包括具有长度例如至少600、700、800、900、1000、1100或至少1200个氨基酸的梭菌毒素片段。该实施方案的其它方面可包括具有长度例如至多600、700、800、900、1000、1100或至多1200个氨基酸的梭菌毒素片段。
本公开内容的实施方案进一步涉及变体梭菌毒素多肽。如本文所用，术语“多肽”包括包含直链或支链氨基酸、模拟肽及其药学上可接受的盐的分子。通常，多肽包含多个通过共价键(例如肽键)彼此结合的氨基酸残基，例如2、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更多氨基酸残基。“氨基酸残基”意指掺入本公开内容的多肽中的单个氨基酸单元。如本文所用，术语“氨基酸”意指天然存在的或合成的氨基酸，以及氨基酸类似物、立体异构体和功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸模拟物。该定义包括天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸衍生物，天然氨基酸诸如：(1)组氨酸(His；H)(2)异亮氨酸(Ile；I)(3)亮氨酸(Leu；L)(4)赖氨酸(Lys；K)(5)蛋氨酸(Met；M)(6)苯丙氨酸(Phe；F)(7)苏氨酸(Thr；T)(8)色氨酸(Trp；W)(9)缬氨酸(Val；V)(10)精氨酸(Arg；R)(11)半胱氨酸(Cys；C)(12)谷氨酰胺(Gln；Q)(13)甘氨酸(Gly；G)(14)脯氨酸(Pro；P)(15)丝氨酸(Ser；S)(16)酪氨酸(Tyr；Y)(17)丙氨酸(Ala；A)(18)天冬酰胺(Asn；N)(19)天冬氨酸(Asp；D)(20)谷氨酸(Glu；E)(21)硒代半胱氨酸(Sec；U)；非天然氨基酸：(a)瓜氨酸(Cit)；(b)胱氨酸；(c)γ-氨基丁酸(GABA)；(d)鸟氨酸(Orn)；(f)茶氨酸；(g)同型半胱氨酸(Hey)；(h)甲状腺素(Thx)；氨基酸衍生物诸如甜菜碱；肉毒碱；肌肽肌酸；羟色氨酸；羟脯氨酸(Hyp)；N-乙酰半胱氨酸；S-腺苷甲硫氨酸(SAM-e)；牛磺酸；酪胺。
在一个实施方案中，梭菌毒素包含亲本梭菌毒素的衍生物，例如，在UNIPROT登录号P0DPI1(例如A型)；P10844(例如B型)；P18640(例如C1型)；P19321(例如D型)；Q00496(GENBANK#CAA44558)(例如E型)；P30996(例如F型)；Q60393(例如G型)；H型的GENBANK ID：KGO15617(UNIPARC ID：00052C1529)；X型的GENBANK ID：BAQ12790(UNIPARC ID：0005822796)；UNIPROT登录号P04958(例如TeNT)；Q45851(例如BaNT)；或P30995(例如BuNT)中列出的氨基酸序列的衍生物。如本文所用，术语“衍生物”包括各个氨基酸或上述多肽(包括其片段)的盐、酰胺、酯、酸、碱、溶剂合物、水合物、多晶型物或前药。此类衍生物可以由本领域技术人员使用用于这种衍生化的已知方法容易地制备。适合在本文所述方法中使用的衍生物可给动物或人类施用，其基本无毒性作用且具有生物活性或为前药。
在一个实例中，所述衍生物包括氨基酸或毒素多肽的盐。术语“盐”包括来源于本领域熟知的任何合适的有机和无机抗衡离子的盐，并且包括例如上述氨基酸的盐酸盐或氢溴酸盐或碱性或酸性盐。
如果需要，所述衍生物可以同时或替代地为溶剂加合形式，例如，溶剂合物或醇化物。溶剂合物含有化学计量或非化学计量的量的溶剂，并且可以在使用可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)结晶的过程中形成。当溶剂为水时形成水合物；当溶剂为醇时会形成醇化物。本文所述化合物的溶剂合物可使用常规技术方便地制备或形成。
在另一个实施方案中，本文公开了梭菌毒素的多晶型物。多晶型物是指本文所述梭菌毒素的可选晶体形式。蛋白质(或多肽)样品的多晶型纯度可以使用技术诸如粉末X射线衍射、IR/拉曼光谱并在某些情况下利用其光学特性的差异进行检查(Thomas等人，Chemical Communications,48:10559–10561(2012))。
根据需要，所述衍生物可进一步包含氨基酸的酰胺或酯和/或氨基酸的异构体(例如互变异构体或立体异构体)。
结构域
本公开内容的实施方案进一步涉及存在于上述梭菌毒素中的结构域和位点，例如易位结构域(HN)、内肽酶结构域或细胞结合结构域，所述结构域和位点包括，包括其亚域，例如，HCN亚域或HCC亚域。在一个实施方案中，本公开内容涉及一种包含位于梭菌毒素的一个或多个结构域或亚域内的细胞结合位点的多肽。此类多肽可包含，例如梭菌毒素细胞结合结构域的一个或多个氨基酸基序。存在于示例性梭菌毒素的每个结构域和亚域的边界区域公开于例如美国专利号8,697,413，其通过引用的方式整体并入本文。各个结构域的边界区域可以使用本领域已知的生物信息学工具(例如，INTERPRO或PROSITE)来近似。因此，如公开于‘413专利的边界区域不是绝对的，并且微小的变化例如，1、2、3、4、5、7、10、15、20个或更多氨基酸的差异是允许的，上述差异各自表示单个结构域的长度和/或分子量的小于约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或更小％的变化，如例如在美国专利号8,841,111和美国专利号8,512,992中所公开的，通过引用的方式整体并入本文。
梭菌毒素或其片段的结合活性可以使用常规技术进行测定，所述常规技术例如放射标记测定法、竞争结合测定法、体外结合测定法(诸如BIAcore表面等离子体(SPR)技术、受体磷酸化、二聚)或信号测定法等。用于评估对应于梭菌毒素片段的多肽的生物学活性的代表性测定法，包括例如评估由梭菌毒素变体介导的基因表达的调节，包括在实施例部分描述的检测多个基因的水平。在另一个实施方案中，生物学活性可以例如通过测量纤连蛋白合成和/或对靶细胞(诸如成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、脂肪细胞、神经元等)的作用而在功能上评估。实施例中提供了涉及靶细胞(诸如成纤维细胞)的形态的微观评估的代表性方法。
在一个实施方案中，生物活性片段包含梭菌毒素的至少100、300、500、600、800、1000、1200个或更多毗连氨基酸。本文所述的梭菌毒素的片段可以通过本领域技术人员已知的方法(例如，重组生物技术技术)产生。片段多肽可以使用本领域已知的方法(例如免疫原性技术，诸如免疫印迹法或ELISA或蛋白质染色技术，诸如银染色)检测。
在某些实施方案中，当在合适的宿主(例如杆状病毒、大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中表达时，所述片段多肽可以被分泌。如本文所用，“分泌的”意指表达的多肽以可以使用常规技术(例如ELISA测定)检测到的水平从宿主细胞分泌到培养基中。合成分泌形式的蛋白质的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，本公开内容涉及包含重链的羧基端区域(HC区域)的梭菌毒素片段，所述重链的羧基端区域包含梭菌毒素结合结构域，其在结合至位于靶细胞表面的受体复合物时调节靶细胞的基因表达和/或代谢活性。来自梭菌毒素重链的HC区域长度约为400-440个氨基酸，并包含结合结构域(表1)。因此，该实施方案的方面可包括梭菌毒素HC区域，所述梭菌毒素HC区域包含具有例如至少20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或425个氨基酸长度的结合结构域。该实施方案的其它方面可包括梭菌毒素HC区域，所述梭菌毒素HC区域包含具有例如至多20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或425个氨基酸长度的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开内容涉及以下结合结构域片段：BoNT/A的N872-L1296氨基酸(例如，UNIPROT#P0DPI1)；BoNT/B的E859-E1291氨基酸(例如UNIPROT#P10844)；BoNT/C1的N867-E1291氨基酸(例如UNIPROT#P18640)；BoNT/D的S863-E1276氨基酸(例如UNIPROT#P19321)；BoNT/E的R846-K1252氨基酸(例如UNIPROT#Q00496或GENBANK#CAA44558)；BoNT/F的K865-E1274氨基酸(例如UNIPROT#P30996)；BoNT/G的N864-E1297氨基酸(例如UNIPROT#Q60393)；BoNT/H的Y844-L1288氨基酸(例如GENBANK#KGO15617)；TeNT的I880-D1315氨基酸(例如UNIPROT#P04958)；BaNT的I858-E1268氨基酸(例如UNIPROT#Q45851)；或BuNT的K848-K1251氨基酸(例如UNIPROT#P30995)。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及一种包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，所述多肽包含与无毒性的全长肉毒杆菌毒素具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链的羧基或C端区段(HC)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的重链的C端区段具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的N端一半的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与肉毒毒素的结合结构域的N端一半具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素选自：肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)、肉毒杆菌毒素B血清型(BoNT/B)、肉毒杆菌毒素C1血清型(BoNT/C1)、肉毒杆菌毒素D血清型(BoNT/D)、肉毒杆菌毒素E血清型(BoNT/E)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/F)、肉毒杆菌毒素G血清型(BoNT/G)、肉毒杆菌毒素H血清型(BoNT/H)、肉毒杆菌毒素X血清型(BoNT/X)、肠球菌属种BoNT/J(eBoNT/J)、以及嵌合肉毒杆菌毒素和/或其变体。嵌合毒素的实例包括BoNT/DC、BoNT/CD和BoNT/FA。在一个实施方案中，肉毒杆菌毒素不是肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及具有平均分子量在例如约1kDa至约160kDa、约5kDa至约160kDa、约20kDa至约150kDa、约40kDa至约120kDa、约50kDa至约80kDa、约5kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约20kDa至约30kDa、约30kDa至约40kDa、约40kDa至约50kDa、约50kDa至约60kDa、约60kDa至约70kDa、约70kDa至约80kDa、约80kDa至约90kDa、约90kDa至约100kDa、约100kDa至约110kDa、约110kDa至约120kDa、约120kDa至约130kDa、约130kDa至约140kDa、约140kDa至约150kDa或更大的范围内的梭菌毒素片段，包括介于之间的所有数值，例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa、33kDa、34kDa、35kDa、36kDa、37kDa、38kDa、39kDa、40kDa、41kDa、42kDa、43kDa、44kDa、45kDa、46kDa、47kDa、48kDa、49kDa、50kDa、51kDa、52kDa、53kDa、54kDa、55kDa、56kDa、57kDa、58kDa、59kDa、60kDa、61kDa、62kDa、63kDa、64kDa、65kDa、66kDa、67kDa、68kDa、69kDa、70kDa、71kDa、72kDa、173kDa、74kDa、75kDa、76kDa、77kDa、78kDa、79kDa、80kDa、81kDa、82kDa、83kDa、84kDa、85kDa、86kDa、87kDa、88kDa、89kDa、90kDa、91kDa、92kDa、93kDa、94kDa、95kDa、96kDa、97kDa、98kDa、99kDa、100kDa、101kDa、102kDa、103kDa、104kDa、105kDa、106kDa、107kDa、108kDa、109kDa、110kDa、111kDa、112kDa、113kDa、114kDa、115kDa、116kDa、117kDa、118kDa、119kDa、120kDa、121kDa、122kDa、123kDa、124kDa、125kDa、126kDa、127kDa、128kDa、129kDa、130kDa、131kDa、132kDa、133kDa、134kDa、135kDa、136kDa、137kDa、138kDa、139kDa、140kDa、141kDa、142kDa、143kDa、144kDa、145kDa、146kDa、147kDa、148kDa、149kDa、150kDa或更大，例如至约155kDa、约160kDa、约165kDa、约170kDa、约175kDa、约180kDa、约190kDa、约200kDa、约225kDa、约250kDa、约275kDa或更大。在一个实施方案中，本公开内容涉及梭菌毒素的结合结构域的N端亚域(HCN)，其分子量在例如约1kDa至约50kDa、约5kDa至约35kDa、约10kDa至约30kDa、约15kDa至约25kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约10kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约25kDa或大于50kDa的范围内，包括介于之间的所有数值，例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa、33kDa、34kDa、35kDa、36kDa、37kDa、38kDa、39kDa、40kDa、41kDa、42kDa、43kDa、44kDa、45kDa、46kDa、47kDa、48kDa、49kDa、50kDa或更大。在一个实施方案中，本公开内容涉及包含与肉毒杆菌毒素的结合结构域的氨基或N端一半(HCN)基本相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容涉及包含与梭菌毒素的结合结构域的氨基端(N端)一半基本相同的氨基酸序列，所述梭菌毒素包含来自梭菌毒素的结合结构域的N端一半的前10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250个或更多个毗连氨基酸。在这样的实施方案中，所述多肽分子量可在例如约1kDa至约25kDa、约5kDa至约20kDa、约6kDa至约15kDa、约8kDa至约15kDa、约8kDa至约14kDa、约6kDa至约25kDa、约8kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa的范围内，包括介于之间的所有数值，例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、5.5kDa、6kDa、6.5kDa、7kDa、7.5kDa、8kDa、8.5kDa、9kDa、9.5kDa、10kDa、10.5kDa、11kDa、11.5kDa、12kDa、12.5kDa、13kDa、13.5kDa、14kDa、14.5kDa、15kDa、15.5kDa、16kDa、16.5kDa、17kDa、17.5kDa、18kDa、19kDa、20kDa或更大。
在一个相关的实施方案中，本公开内容涉及一种包含与梭菌毒素的结合结构域的C端亚域(HCC)基本相同的氨基酸序列的多肽，所述多肽分子量在例如约1kDa至约50kDa、约5kDa至约35kDa、约10kDa至约30kDa、约15kDa至约25kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约10kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约25kDa或大于50kDa的范围内，包括介于之间的所有数值，例如约1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa、33kDa、34kDa、35kDa、36kDa、37kDa、38kDa、39kDa、40kDa、41kDa、42kDa、43kDa,、44kDa、45kDa、46kDa、47kDa、48kDa、49kDa、50kDa或更大。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了具有上述分子量的梭菌毒素片段，通过还原凝胶电泳测定，所述分子量在约1kDa至约150kDa之间，特别是在约5kDa至约90kDa之间，尤其是在约10kDa至约70kDa之间。
在其它实施方案中，梭菌毒素(包括其片段)的分子量使用本领域已知的生物信息学工具(例如，PROTPARAM或COMPUTE pI/MW)从理论上计算。例如，基于PROTPARAM，全长BoNT/A(UNIPROT#P0DPI1)具有约149.3kDa的理论分子量，而包含449至1296氨基酸(848个氨基酸)的HC结构域具有约98.2kDa的理论分子量(MW)。在一个特定的实施方案中，基于PROTPARAM，跨越873至1092氨基酸的BoNT/A(UNIPROT#P0DPI19)的HCN结构域具有约26.1kDa的理论分子量。在另一个实施方案中，跨越873至980氨基酸的BoNT/A(UNIPROT#P0DPI1)的HCN结构域的近端N端片段具有约12.65kDa的理论分子量。
在序列比对分析中用于鉴定相同和共有序列的来源于BoNT的各种血清型的BoNTHC结构域和HCN结构域的代表性氨基酸序列在本文中被鉴定为SEQ ID NO:3-9。
修饰
在一些情况下，梭菌毒素(或其结构域或亚域)包含一个或多个修饰。例如，梭菌毒素或其片段可以被环化。作为另一个实例，梭菌毒素或其片段可以具有一个或多个氨基酸修饰，例如，包含一个或多个D-氨基酸。不改变一级序列的目的修饰包括多肽的化学衍生化，例如乙酰化或羧化。还包括糖基化的修饰，例如通过在多肽的合成和加工过程中或在进一步的加工步骤中修饰多肽的糖基化模式(例如，通过使多肽暴露于影响糖基化的酶，诸如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而进行的那些修饰。还包括具有磷酸化氨基酸残基(例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸)的多肽。
还提供了梭菌毒素或其片段，所述梭菌毒素或其片段已经使用普通的分子生物学技术和/或合成化学进行了修饰，从而提高了它们对蛋白水解降解的抵抗力或优化了溶解度特性或使它们更适合作为治疗剂。此类多肽的类似物包括含有除天然存在的L-氨基酸以外的残基(例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)的那些类似物。
为了多种目的，毒素可以与多种其它寡肽或蛋白质结合。通过提供主题多肽的表达，可以实现各种翻译后修饰。例如，通过采用适当的编码序列，可以提供法尼基化或异戊二烯化。例如，毒素可以在末端结合至脂质基团，从而能够结合至脂质膜，诸如脂质体。
对梭菌毒素或其片段的其它合适的修饰包括，例如，(1)多肽末端的封端，诸如C端的酰胺化作用和/或N端的乙酰化作用或脱氨基作用；(2)在结构中引入拟肽元素；(3)环化作用，其中多肽的环化作用可以通过天然氨基酸或非天然存在的结构单元发生。
经修饰的梭菌毒素或其片段可以是类肽(N-置换的寡甘氨酸)，例如，其中氨基酸侧链连接至多肽主链的氮而不是α-碳，参见例如Zuckermann等人，J.Am.Chem.Soc.114,10646,1992。
主题毒素可以包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。梭菌毒素或其片段可以包含D-氨基酸、D-和L-氨基酸的组合以及各种“设计的”氨基酸(例如，β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸等)来传达多肽的特殊特性。
融合蛋白和连锁蛋白
应理解，本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素或其片段可任选地包括一种或多种其它组分。作为任选组分的非限制性实例，经修饰的梭菌毒素或其片段可进一步包含含有柔性间隔子的柔性区域。柔性间隔子的非限制性实例包括例如G间隔子GGGGS(SEQ ID NO:22)或A间隔子EAAAK(SEQ ID NO:23)。包含柔性间隔子的柔性区域可用于调节多肽区域的长度，以优化多肽的特征、属性或特性。这样的柔性区域在框内可操作地连接至作为融合蛋白的经修饰的梭菌毒素或其片段。作为非限制性实例，包含一个或多个串联的柔性间隔子的多肽区域可用于使蛋白酶切割位点更好地暴露，由此促进蛋白酶对该位点的切割。作为另一非限制性实例，包含一个或多个串联的柔性间隔子的多肽区域可用于使配体结构域更好地呈现，由此促进该配体结构域结合至其在受体上的结合结构域。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素或其片段可以进一步包含含有柔性间隔子的柔性区域。在另一个实施方案中，本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素或其片段可以进一步包含含有多个串联的柔性间隔子的柔性区域。在该实施方案的方面中，柔性区域可串联包含例如至少1个G间隔子、至少2个G间隔子、至少3个G间隔子、至少4个G间隔子或至少5个G间隔子。在该实施方案的其它方面中，柔性区域可串联包含例如至多1个G间隔子、至多2个G间隔子、至多3个G间隔子、至多4个G间隔子或至多5个G间隔子。在该实施方案的其它方面中，柔性区域可串联包含例如至少1个A间隔子、至少2个A间隔子、至少3个A间隔子、至少4个A间隔子或至少5个A间隔子。在该实施方案的其它方面中，柔性区域可串联包含例如至多1个A间隔子、至多2个A间隔子、至多3个A间隔子、至多4个A间隔子或至多5个A间隔子。在该实施方案的另一方面中，经修饰的梭菌毒素或其片段可包含含有一个或多个相同柔性间隔子的拷贝、一个或多个不同柔性间隔子区域的拷贝或其任意组合的柔性区域。
梭菌毒素的特性
缺乏毒性曲线(profile)
在一个实施方案中，本公开内容考虑了针对具有经修饰的毒性(包括减少的毒性或没有毒性)的梭菌毒素(例如BoNT/A)或其片段的组合物和方法。如本领域中已知的，梭菌毒素的毒性活性特别地含有在轻链中，所述轻链是选择性地切割可溶性NSF附着蛋白受体(“SNARE”)蛋白的锌(Zn2+)内肽酶。SNARE蛋白对于含有神经递质的囊泡与质膜的细胞质表面的识别和对接以及囊泡与质膜的融合至关重要。TeNT、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G导致小突触泡蛋白(也称为囊泡相关膜蛋白(VAMP))的降解，这是一种突触体膜蛋白。由于这些切割事件中的任一种，从突触囊泡表面延伸的VAMP的大部分细胞质结构域被去除。BoNT/A和BoNT/E选择性切割质膜相关蛋白SNAP-25，所述质膜相关蛋白SNAP-25主要结合至并存在于质膜的细胞质表面。BoNT/C切割突触融合蛋白，一种大部分质量暴露于细胞质的整合蛋白。突触融合蛋白与突触前的末端活性区的钙通道相互作用。在一些实施方案中，梭菌毒素或其片段的毒性根据神经肌肉麻痹的诱导(其表明毒素分子进入细胞并因此抑制神经递质的释放的能力)来测定。在一些实施方案中，梭菌毒素或其片段的毒性根据LD50值来测定，LD50值是在腹膜内注射毒素构建体后导致一组测试动物(例如小鼠)中50％(一半)死亡的毒素的用量，参见美国专利号7,749,514和9,284,545。
在该实施方案的方面中，梭菌毒素或其片段的毒性为，例如天然存在的梭菌毒素的毒性的约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或＞99％。在该实施方案的方面中，经修饰的梭菌毒素或其片段的毒性为，例如天然存在的梭菌毒素的毒性的至多10％，天然存在的梭菌毒素的毒性的至多1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或＜95％。优选地，例如当以常规方式施用于受试者时，本公开内容的梭菌毒素片段或变体没有毒性。
在一个实施方案中，本文公开的经修饰的毒性的梭菌毒素或其片段可应用于包括但不限于：(a)研究(即，例如，研究BoNT/A的作用机制，包括其结合、易位和药代动力学，以及用于开发和测试解毒剂)；(c)评估室内释放的风险和诊断；(d)检查包括灵长类在内的哺乳动物的药代动力学；(d)疫苗开发；(e)抗体开发(用于治疗和诊断)；以及(f)临床治疗应用。
梭菌毒素的毒性可以使用常规方法进行评估。如本领域中已知的，BoNT在细胞中毒中涉及多步机制(Chaddock等人，Trends Biochem.Sci.27,552-558,2002)。神经毒素通过重链(H)结合至神经元的突触前神经末梢，并通过受体介导的内吞作用进入(Schiand等人，Physio.Rev.80,717-755,2000)。核内体的低pH被认为通过HCN诱导通道形成，这允许LC易位到胞质溶胶中(Li等人，Biochemistry 39,6466-6474,2000)。据信，LC可作为锌内肽酶来特异性切割突触囊泡融合必不可少的三种不同的SNARE蛋白中的一种(Montecucco等人，Trends Biochem.Sci.18，324-327，1993；Li等人，Toxin Rev.18，95-112，1999)。在一个实施方案中，BoNT/A和BoNT/E独立地切割突触体相关蛋白25(SNAP-25)，这是反式SNARE复合物的组分，其被认为导致膜融合的特异性并通过形成将突触囊泡和质膜结合在一起的紧密复合物而直接执行融合。在另一个实施方案中，TeNT和/或BoNT/B、/D、/F和/G切割小细胞囊泡蛋白，一种涉及突触囊泡与突触前膜对接和/或融合的蛋白质。在一个实施方案中，BoNT/C1切割突触融合蛋白和SNAP-25。一旦SNARE蛋白被切割，就阻止了神经递质(即例如乙酰胆碱)的释放，最终导致松弛的肌肉麻痹(Montecucco等人，Q.Rev.Biophys,28:423-472(1995))。肉毒杆菌神经毒素活性位点被认为包含HEXXH+E锌结合基序(Li等人，Biochemistry 39,2399-2405,2000)。一般构象和活性位点残基在所有梭菌神经毒素中是保守的(Agarwal等人，Biochemistry 44，8291-8302，2005)。例如，在BoNT/A活性位点的氨基酸残基包含H223-E224-L225-I226-H227+E262(“H223-E224-L225-I226-H227”公开为SEQID NO:24)，其在大多数(即使不是全部)BoNT亚型中是保守的。
因此，本公开内容涉及一种无内肽酶活性或易位活性或既无内肽酶活性又无易位活性的梭菌毒素的无毒形式。在一个实施方案中，本文提供了缺乏内肽酶活性的梭菌毒素变体。此类变体可包括，例如赋予内肽酶活性的构成活性位点的一个或多个氨基酸残基的突变或缺失。在另一个实施方案中，缺乏内肽酶活性的梭菌毒素变体可包含大部分的缺失，例如，组成轻链(LC)结构域的氨基酸的约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约＞99％的缺失。在另一个实施方案中，梭菌毒素变体既无内肽酶活性又无易位活性。在该实施方案中，梭菌毒素变体可包含(a)组成轻链(LC)结构域的氨基酸和(b)组成易位结构域的氨基酸的大部分的缺失。
在BoNT/A的背景下，本公开内容考虑了不切割SNAP-25的片段。用于测量SNAP-25切割活性的试剂和测定法是本领域已知的，参见例如Mizanur等人，PLoS One,9(4),e95188,2014。
本公开内容进一步涉及无活性的梭菌毒素，包括其片段。术语“无活性的梭菌毒素”意指对细胞无毒的梭菌毒素。例如，无活性的梭菌毒素具有最小或没有能力干扰神经递质从细胞或神经末梢的释放。在一些实施方案中，无活性的梭菌毒素具有少于有活性的相同梭菌毒素的约50％，例如约40％、约25％、约10％、约5％或更少％，例如约2％的神经毒性作用(例如抑制神经递质释放的能力)。例如，无活性的肉毒杆菌毒素(iBoNT)具有少于有活性的相同BoNT(例如全长BoNT)的约50％，例如约40％、约25％、约10％、约5％或更少％，例如约2％的神经毒性作用。全长无活性的肉毒杆菌毒素公开在例如美国专利号6,051,239和美国专利号7,172,764。在一些实施方案中，无活性的梭菌毒素包含经修饰(例如糖基化)的以减少抗原性的重链。在一些实施方案中，无活性的梭菌毒素为单链多肽。优选地，本公开内容的无活性的梭菌毒素包含无轻链(LC)结构域和/或易位结构域的全长梭菌毒素的片段，其中所述梭菌毒素片段被进一步任选地糖基化以减少抗原性。
如本文所用，术语“减少的抗原性”意指无活性的梭菌毒素在哺乳动物中诱导抗体产生的能力少于全长梭菌毒素的抗原作用，例如少于全长梭菌毒素的约100％、少于约90％、少于约80％、少于约70％、少于约60％、少于约50％，例如约40％、约25％、约10％、约5％或更少％，例如约2％的抗原作用。例如，糖基化的分子可具有减少的抗原性，因为它们在哺乳动物中具有最小或没有诱导免疫应答以产生抗体的能力。此外，分子上的表位区域负责在哺乳动物中诱导抗体。因此，具有突变的或缺失的表位区域的分子可具有减少的抗原性，因为这些区域不再存在于刺激抗体产生的分子上。参见美国专利号7,172,764。例如，与全长梭菌毒素相比，在羧基端(Hc)的重链内包含突变的或缺失的表位区域的iBoNT可具有减少的抗原性。在一些实施方案中，与未糖基化的相同BoNT的施用相比，向哺乳动物中施用糖基化的BoNT诱导更少的抗体产生，减少约2倍、优选地4倍、更优选地8倍或更多。本公开内容的梭菌毒素的抗原性可以使用本领域已知的方法和工具测定，例如Atassi等人，Protein J.,23(1):39-52,2004。
本文公开的实施方案进一步涉及用于测定包括其片段和变体的梭菌毒素的毒性的方法，包括例如生物化学测定法、体外细胞测定法、体内药理学测定法等。在一个实施方案中，梭菌毒素片段或变体在标准内肽酶测定法(参见美国专利号8,618,261；美国专利号8067231；美国专利号8,124,357；美国专利号7,645,570，用于体外测定法中的变体)中缺乏内肽酶活性。在另一个实施方案中，梭菌毒素片段或变体为非致死的。
细胞信号的调节
在一个相关的实施方案中，本文提供了调节一种或多种皮肤质量相关基因的表达的梭菌毒素、其亚域或片段或其变体，所述基因包括但不限于例如FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7、TP63、SOD2、UBD、HAS2、HAS3、ADAMTS1、IGF-1、IL-6、IL-32、CCL2、BDKRB1、MC5R、AR、HSD3B1、HSD17B1和PPARδ。
这些皮肤质量相关基因的表达变化影响皮肤质量相关细胞、组织和/或器官(包括细胞外基质结构)的结构和功能特征，导致皮肤生物力学特性(诸如弹性和柔韧性)的改变。“调节”意指梭菌毒素或其片段或变体在与靶细胞(例如成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、皮脂腺细胞、免疫细胞或神经元)接触时，与对照组(例如，BSA处理)相比，可实现一种或多种上述基因表达的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍、-至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍或更多的变化。测量基因表达的方法是本领域已知的，例如，微阵列分析法或定量PCR测定法。代表性的方法在实施例部分中说明。
特别地，本文提供了梭菌毒素、其亚域或片段或变体，当与靶细胞(例如成纤维细胞或角质形成细胞)接触时，其调节选自FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7和TP63的一种或多种基因的表达。特别地，梭菌毒素或其片段或变体在上述六种基因特征中将每个基因的表达增加至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍或更多。这些皮肤质量相关基因的表达变化影响皮肤质量相关细胞、组织和/或器官(包括细胞外基质结构)的结构和功能特征，导致皮肤生物力学特性(诸如弹性和柔韧性)的变化。
此外，本公开内容涉及增加纤连蛋白表达的梭菌毒素或其片段或变体。如本文所用，“纤连蛋白”是指结合至ECM中的组成蛋白的细胞外基质的高分子量(～440kDa)糖蛋白，例如胶原蛋白、血纤蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。在一个实施方案中，梭菌毒素或其片段或变体当与细胞(例如成纤维细胞或角质形成细胞)接触时，使纤连蛋白的表达增加至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍，至少5倍或更多。纤连蛋白表达的增加影响真皮(包括细胞外基质结构)的结构和功能，导致皮肤生物力学特性(包括弹性和柔韧性)的变化。
对靶细胞的作用
本公开内容进一步涉及梭菌毒素或其片段或变体，其改变靶细胞(例如与其结合的细胞)的一个或多个特征。在一个实施方案中，所述特征是一种物理属性，诸如大小、形状、密度以及微绒毛的数量/大小。在另一个实施方案中，所述特征是一种功能属性，诸如生长、迁移、分化、分泌(例如ECM组分)和粘附(彼此之间以及与基质之间)。在另一个实施方案中，所述特征是代谢产物诸如脂质、糖、肽或激素的差异产生。在一个特定的实施方案中，所述特征是在介导物存在下代谢产物的减弱产生，例如，油酸诱导的皮脂腺细胞中的皮脂产生的减弱。如实施例中所示，当与靶细胞(例如成纤维细胞)接触时，梭菌毒素片段可实现细胞形态和/或功能的明显变化。另外，当用梭菌毒素片段处理产生皮脂的细胞(例如皮脂腺细胞)时，油酸在皮脂过量产生中的作用被显著减弱。
梭菌毒素或其片段或变体的细胞作用可以使用实施例中详细描述的技术来测定。各种靶细胞，例如成纤维细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、黑素细胞、皮脂腺细胞；神经元；细胞系；以及组织可用于在细胞水平测定梭菌毒素或其片段或变体的作用。
多核苷酸
本公开内容的方面部分提供了多核苷酸分子。如本文所用，术语“多核苷酸分子”与“核酸分子”同义，并且意指任何长度的核苷酸(例如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。认为可编码本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素的任何和所有多核苷酸分子都可适用，包括但不限于天然存在的和非天然存在的DNA分子以及天然存在的和非天然存在的RNA分子。天然存在和非天然存在的DNA分子的非限制性实例包括单链DNA分子、双链DNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、载体构建体，诸如质粒构建体、噬菌粒构建体、噬菌体构建体、逆转录病毒构建体和人工染色体构建体。天然存在和非天然存在的RNA分子的非限制性实例包括单链RNA、双链RNA和mRNA。
在一个实施方案中，所述多核苷酸分子编码一种或多种上述梭菌毒素、其突变体或变体、其结构域和/或亚域，其生物活性或免疫原性片段、其多聚体、其嵌合体和融合构建体、其标签构建体、其模拟物或其其它形式的工程化或合成衍生物。特别地，所述多核苷酸分子是DNA分子，以及尤其地，所述多核苷酸是cDNA分子。还包括与编码一种或多种上述梭菌毒素的多核苷酸互补的多核苷酸，所述梭菌毒素包括突变体、变体或其片段。特别地，所述多核苷酸为编码BoNT/A或其突变体(包括其同源物)的细胞结合结构域的cDNA分子，所述细胞结合结构域例如BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、TeNT、BaNT或BuNT的细胞结合结构域。特别优选地，所述多核苷酸为编码BoNT/A或其突变体(包括其同源物)的细胞结合结构域的重链N端亚域(HCN)的cDNA分子，所述重链N端亚域(HCN)例如BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、BoNT/X、eBoNT/J、TeNT、BaNT或BuNT的HCN亚域。
本公开内容还提供了包含编码一种或多种上述梭菌毒素(包括其片段)的核苷酸序列的合成核酸，例如非天然核酸。
本文包括编码在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:20、SEQ ID No:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:12-18中列出的梭菌毒素片段序列的核酸或其变体或其同源物或其RNA等同物或其互补RNA等同物，所述变体具有1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30个或更多氨基置换(优选地保守或半保守氨基酸置换)，所述同源物包括与其互补的链。
此外，本文包括编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID No:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:12-18的梭菌毒素片段序列的核酸或其变体或其同源物或其RNA等同物或其互补RNA等同物，所述变体具有1、2、3、4、5、4-10、5-10或5至15个氨基酸置换(优选地保守或半保守氨基酸置换)，所述同源物包括与其互补的链。在一些实施方案中，本公开内容的核酸编码BoNT/A突变体的片段，所述BoNT/A突变体的片段包括以下列出的序列、由其组成或由其组成：SEQ ID NO:25、SEQID NO:26或SEQ ID NO:27。
本公开内容进一步涉及梭菌毒素片段的核酸同源物，例如编码梭菌毒素的HC结构域，特别是HCN结构域以及尤其是HCN结构域的N端一半的片段，所述梭菌毒素选自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、BoNT/DC、BoNT/X、eBoNT/J、TeNT、BaNT、BuNT，包括其上述亚型。具有基本同源性的序列包括与SEQ ID NO:2所示的序列或编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ IDNo:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:12-18的核酸具有至少50％、特别是至少65％、以及尤其是至少80％同一性或更高％同一性的核酸序列。序列同一性可以根据本领域已知的方法(例如使用BLAST v2.1)来计算。也参见Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990；Gish等人，Nature Genet.3:266-272,1993；Madden等人，Meth.Enzymol.266:131-141,1996；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Zhang等人，Genome Res.7:649-656,1997。
本文公开的实施方案进一步涉及制备以上公开的多核苷酸的方法。制备本说明书中公开的编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子可能必需的已确立分子生物学技术包括但不限于涉及以下的方法：聚合酶链反应(PCR)扩增、限制性酶反应、琼脂糖凝胶电泳、核酸连接、细菌转化、核酸纯化、核酸测序和基于重组的技术，其为完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规方法。制备编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子所必需的特定方案的非限制性实例描述于以下文献中：例如CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(Frederick M.Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons,2004)。另外，多种适用于制备编码经修饰的梭菌毒素的多核苷酸分子的商购的产品可广泛获得。这些方案为完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规方法。
本公开内容的另一方面提供了产生梭菌毒素或其片段或变体的方法，其包括例如将包含编码梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的表达构建体引入到细胞中并在所述细胞中表达所述表达构建体的步骤。
本说明书中公开的方法部分包括本说明书中公开的所有梭菌毒素或其片段或变体。因此，该实施方案的方面包括但不限于产生天然存在的梭菌毒素、天然存在的梭菌毒素变体(诸如梭菌毒素同种型和梭菌毒素亚型)、非天然存在的梭菌毒素变体(诸如保守或半保守梭菌毒素变体、非保守梭菌毒素变体)、包含一种或多种上述毒素的嵌合或融合构建体、包含梭菌毒素的至少一个结构域(例如重链的结合结构域)或亚域(例如结合结构域的N端一半)的梭菌毒素片段(例如生物活性片段或免疫原性片段)、包含此类梭菌毒素或其片段或变体的嵌合或融合构建体、标签构建体、工程构建体、合成构建体或其任意组合。
本说明书中公开的方法部分包括多核苷酸分子。特别地，所述多核苷酸分子编码本文公开的任何梭菌毒素或其片段或变体，包括包含梭菌毒素或其片段或变体的融合蛋白。认为可以使用本说明书中公开的任何和所有多核苷酸分子。因此，该实施方案的方面包括但不限于，天然存在和非天然存在的DNA分子包括单链DNA分子、双链DNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、载体构建体，诸如质粒构建体、噬菌粒构建体、噬菌体构建体、逆转录病毒构建体和人工染色体构建体。天然存在和非天然存在的RNA分子的非限制性实例包括单链RNA、双链RNA和mRNA。
本说明书中公开的方法部分包括表达构建体。表达构建体包含可操作地连接至适用于在细胞或无细胞提取物中表达本说明书中公开的多核苷酸分子的表达载体的所述多核苷酸分子。多种表达载体可用于表达编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子，所述表达载体包括但不限于病毒表达载体；原核表达载体；真核表达载体，诸如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体；和无细胞提取物表达载体。应进一步理解，适用于实施这些方法的方面的表达载体可包括在组成性、组织特异性、细胞特异性或诱导性启动子元件、增强子元件或两者的控制下表达经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的那些表达载体。表达载体以及已确立的用于由这些表达载体制备和使用表达构建体的试剂和条件的非限制性实例易于从商品供应商获得。适当表达载体的选择、制备和使用为完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规方法。
因此，该实施方案的方面包括但不限于：可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的病毒表达载体；可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的原核表达载体；可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的酵母表达载体；可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的昆虫表达载体；和可操作地连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的哺乳动物表达载体。该实施方案的其它方面包括但不限于：适于使用包含可操作连接至编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子的无细胞提取物表达载体的无细胞提取物来表达本说明书中公开的经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的表达构建体。
本说明书中公开的方法部分包括细胞。考虑可以使用任何和所有细胞。因此，该实施方案的方面包括但不限于原核细胞，包括但不限于，需氧、微需氧、嗜二氧化碳、兼性、厌氧的、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞的菌株，诸如来源于以下的菌株：例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridiaperfringens)、艰难梭菌(Clostridia difficile)、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、Neisseria meningirulls、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，和真核细胞，包括但不限于酵母菌株，诸如来源于以下的菌株：巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；昆虫细胞和来源于昆虫的细胞系，诸如来源于以下者：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和烟草天蛾(Manduca Sexta)；属于刺胞动物门的生物体(例如，水螅、海葵、水母或珊瑚，例如鬼手属种(Aiptasia sp.))和/或来源于刺胞动物门的经遗传转化的生物体，参见美国专利号6,923,976)的刺细胞(具体地，刺胞细胞、线虫细胞或ptychocytes)和哺乳动物细胞和来源于哺乳动物细胞的细胞系，诸如例如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、猪科动物、牛科动物、马科动物、灵长类动物和人的细胞系。细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(2004)；欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)(2204)；以及德国微生物与细胞培养物保藏中心(the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(2004)。用于选择、制备和使用适当细胞系的特定方案的非限制性实例描述于以下文献中：例如INSECTCELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus F.A.Goosen等人编辑，Marcel Dekker，1993)；INSECT CELL CULTURES:FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M.Vlak等人编辑，KluwerAcademic Publishers，1996)；Maureen A.Harrison&Ian F.Rae，GENERAL TECHNIQUES OFCELL CULTURE(Cambridge University Press，1997)；CELL AND TISSUE CULTURE:LABORATORY PROCEDURES(Alan Doyle等人编辑，John Wiley and Sons，1998)；R.IanFreshney，CULTURE OF ANIMAL CELLS:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss，第4版2000)；ANIMAL CELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John R.W.Masters编辑，OxfordUniversity Press，第3版2000)；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，同上，(2001)；BASIC CELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis，Oxford Press，第2版2002)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，同上，(2004)。其中所述细胞是刺胞动物细胞时，可以使用电穿孔的常规技术或使用双链RNA对其进行转化。参见Wittlieb等人，PNAS USA,103(16):6208-11,2006；Pankow等人，PLoS One,2(9):e782,2007；Khalturin等人，PLoS Biol.,6(11):e278,2008。这些方案为在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规方法。
本说明书中公开的方法部分包括将多核苷酸分子引入到细胞中。引入到细胞中的多核苷酸分子可以由该细胞短暂或稳定地维持。稳定维持的多核苷酸分子可在染色体外且自主复制，或其可整合到细胞的染色体物质中且非自主复制。认为可使用用于将本说明书中公开的多核苷酸分子引入到细胞中的任何和所有方法。适用于将核酸分子引入到细胞中的方法包括但不限于：化学介导的转染，诸如例如磷酸钙介导、二乙基-氨基乙基(DEAE)葡聚糖介导、脂质介导、聚乙亚胺(PEI)介导、聚赖氨酸介导和聚凝胺介导的转染；物理介导的转染，诸如例如生物弹粒子递送、显微注射、原生质体融合和电穿孔；和病毒介导的转染，诸如逆转录病毒介导的转染，参见，例如，Introducing Cloned Genes into CulturedMammalian Cells，第16.1-16.62页(Sambrook&Russell编辑，Molecular Cloning ALaboratory Manual，第3卷，第3版2001)。本领域技术人员应了解，用于将表达构建体引入到细胞中的特定方法的选择部分取决于所述细胞将短暂包含表达构建体还是所述细胞将稳定含有表达构建体。这些方案为在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规方法。
在该实施方案的一方面中，称为转染的化学介导的方法用于将编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子引入到细胞中。在化学介导的转染方法中，化学试剂与核酸形成促进其吸收至细胞中的复合物。此类化学试剂包括但不限于磷酸钙介导，参见，例如，Martin Jordan&Florian Worm，Transfection of Adherent and Suspended Cellsby Calcium Phosphate,33(2)Methods 136-143(2004)；二乙基-氨基乙基(DEAE)葡聚糖介导、脂质介导、阳离子聚合物介导，如聚乙烯亚胺(PEI)介导和聚赖氨酸介导和聚凝胺介导，参见，例如，Chun Zhang等人，Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery toBrain-Derived Cells,33(2)Methods 144-150(2004)。这样的化学介导的递送系统可通过标准方法制备且可商购，参见例如CELLPHECT转染试剂盒(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)；哺乳动物转染试剂盒，磷酸钙和DEAE葡聚糖，(Stratagene，Inc.)；LIPOFECTAMINETM转染试剂(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,Calif.)；EXGEN 500转染试剂盒(Fermentas,Inc.,Hanover,MD,USA)，以及SUPERFECT和EFFECTINE转染试剂盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA,USA)。
在该实施方案的另一方面中，物理介导的方法用于将编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子引入到细胞中。物理技术包括但不限于电穿孔、生物弹和显微注射。生物弹和显微注射技术在细胞壁上穿孔以将核酸分子引入到细胞中，参见，例如，Biewenga等人，J.Neurosci.Methods,71(1),67-75(1997)；和O’Brien等人，Methods 33(2),121-125(2004)。电穿孔(也称为电通透作用)使用短暂的高压电脉冲在膜中形成短暂的孔，核酸分子通过所述孔进入且所述方法可有效用于稳定和短暂转染所有细胞类型，参见，例如，M.Golzio等人，33(2)Methods 126-135(2004)；和Gresch等人，33(2)Methods151-163(2004)。
在该实施方案的另一方面中，称为转导的病毒介导的方法用于将编码经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的多核苷酸分子引入到细胞中。在病毒介导的短暂转导方法中，对病毒颗粒感染和在宿主细胞中复制的过程进行操作以使用该机制将核酸分子引入到细胞中。已经由多种病毒开发出病毒介导的方法，所述病毒包括但不限于：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、细小核糖核酸病毒、α病毒和杆状病毒，参见，例如，Blesch等人，33(2)Methods 164-172(2004)；和Federico等人，229Methods Mol.Biol.3-15(2003)；Poeschla等人，5(5)Curr.Opin.Mol.Ther.529-540(2003)；Benihoud等人，10(5)Curr.Opin.Biotechnol.440-447(1999)；Bueler等人，380(6)Biol.Chem.613-622(1999)；Lai等人，21(12)DNA Cell Biol.895-913(2002)；Burton等人，21(12)DNA Cell Biol.915-936(2002)；Grandi等人，33(2)Methods179-186(2004)；Frolov等人，93(21)PNAS USA11371-11377(1996)；Ehrengruber等人，59(1)Brain Res.Bull.13-22(2002)；Kost等人，20(4)Trends Biotechnol.173-180(2002)；和Huser等人，3(1)Am.J.Pharmacogenomics 53-63(2003)。
腺病毒为非包膜双链DNA病毒，其常选用于哺乳动物细胞转导，因为腺病毒可操纵约36kb的相对较大的多核苷酸分子，腺病毒以高效价产生，且可有效感染多种正分裂细胞和非分裂细胞，参见，例如，Hermens等人，71(1)J.Neurosci.Methods 85-98(1997)；和Mizuguchi等人，52(3)Adv.Drug Deliv.Rev.165-176(2001)。使用基于腺病毒的系统的转导不支持长期蛋白表达，因为该核酸分子在细胞核中由附加体承载，而非整合到宿主细胞染色体中。腺病毒载体系统和如何使用这些载体的特定方案公开于：例如VIRAPOWERTM腺病毒表达系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA,USA)和VIRAPOWERTM腺病毒表达系统说明手册25-0543版本A，Invitrogen,Inc.；和ADEASYTM腺病毒载体系统(Stratagene,Inc.,LaJolla,CA,USA)和ADEASYTM腺病毒载体系统说明手册，Stratagene，Inc.。
多核苷酸分子递送也可使用单链RNA逆转录病毒，诸如例如致癌逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒介导的转导常产生接近100％的转导效率，可通过改变感染复数(MOI)来容易控制前病毒拷贝数，且可用于短暂或稳定转导细胞，参见例如，Tonini等人，285Methods Mol.Biol.141-148(2004)；Blesch等人，33(2)Methods 164-172(2004)；Recillas-Targa等人，267Methods Mol.Biol.417-433(2004)；和Wolkowicz等人，246Methods Mol.Biol.391-411(2004)。逆转录病毒颗粒由包装于由脂质包膜围绕的蛋白质衣壳中的RNA基因组组成。逆转录病毒通过将其RNA连同逆转录酶一起注射到细胞质中来感染宿主细胞。RNA模板接着逆转录成线性双链cDNA，所述线性双链cDNA通过整合到宿主细胞基因组中来复制其自身。病毒粒子同时垂直传播(通过前病毒从亲本细胞传播到子代细胞)和水平传播(通过病毒颗粒从细胞至细胞)。此复制策略使得能够长期持续表达，因为目的核酸分子被稳定整合到宿主细胞的染色体中，由此使得蛋白质能够长期表达。例如，动物研究表明，注射到多种组织中的慢病毒载体产生持续的蛋白质表达超过1年，参见，例如，Naldini等人，272(5259)Science 263-267(1996)。致癌逆转录病毒来源的载体系统，诸如莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMLV)已被广泛使用且感染许多不同的非分裂细胞。慢病毒也可感染许多不同的细胞类型(包括正分裂和非分裂细胞)且具有复杂的包膜蛋白，其允许实现高度特异性的细胞靶向。
逆转录病毒载体和如何使用这种载体的特定方案公开于以下文献中：例如美国专利号5,464,758；美国专利号5,814,618；美国专利号5,514,578；美国专利号5,364,791；美国专利号5,874,534；和美国专利号5,935,934。此外，这种病毒递送系统可通过标准方法制备且可商购，参见例如BDTM TET-OFF和TET-ON基因表达系统(BD Biosciences-Clonetech，Palo Alto,CA,USA)和BDTM TET-OFF和TET-ON基因表达系统使用手册，BD Biosciences，GENESWITCHTM系统(Invitrogen，Inc.，Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA,USA)和GENESWITCHTM系统，用于哺乳动物细胞的米非司酮调控的表达系统版本D，25-0313，Invitrogen，Inc.，(2002年11月4日)；VIRAPOWERTM慢病毒表达系统(Invitrogen，Inc.，Carlsbad,CA,USA)和VIRAPOWERTM慢病毒表达系统说明手册，Invitrogen，Inc.；和
Figure BDA0002642074890000591
逆转录病毒诱导性哺乳动物表达系统(Stratagene，LaJolla,CA,USA)和COMPLETE
Figure BDA0002642074890000592
逆转录病毒诱导性哺乳动物表达系统说明手册。
本说明书中公开的方法部分包括由多核苷酸分子表达经修饰的梭菌毒素或其片段或变体。认为多种表达系统中的任一种均可适用于本说明书中公开的多核苷酸分子表达经修饰的梭菌毒素或其片段或变体，包括但不限于基于细胞的系统和无细胞表达系统。基于细胞的系统包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。无细胞系统包括但不限于麦胚提取物、兔网状细胞提取物和大肠杆菌提取物，且通常等同于本文公开的方法。使用表达系统表达多核苷酸分子可包括多种特征中的任一种，所述特征包括但不限于诱导性表达、非诱导性表达、组成性表达、病毒介导的表达、稳定整合性表达和短暂表达。包括充分表征的表达载体、试剂、条件和细胞的表达系统已成分确立且易于从商品供应商获得，所述商品供应商包括但不限于Ambion，Inc，Austin，Tex；BD Biosciences-Clontech，Palo Alto，Calif；BD BiosciencesPharmingen，San Diego，Calif；Invitrogen，Inc，Carlsbad，Calif；QIAGEN，Inc，Valencia，Calif；Roche Applied Science，Indianapolis，Ind；和Stratagene，La Jolla，Calif。关于选择和使用适当异源表达系统的非限制性实例描述于以下文献中：例如PROTEINEXPRESSION.A PRACTICAL APPROACH(S.J.Higgins和B.David Hames编辑，OxfordUniversity Press,1999)；Joseph M.Fernandez&James P.Hoeffler,GENE EXPRESSIONSYSTEMS.USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION(Academic Press,1999)；和Rai等人，80(9)Curr.Sci.1121-1128,(2001)。这些方案为完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得的常规方法。
多种基于细胞的表达方法适用于表达由本说明书中公开的多核苷酸分子编码的经修饰的梭菌毒素或其片段或变体。实例包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。病毒表达系统包括但不限于VIRAPOWERTM慢病毒(Invitrogen,Inc.)、腺病毒表达系统(Invitrogen,Inc.)、ADEASYTMXL腺病毒载体系统(Stratagene)和
Figure BDA0002642074890000601
逆转录病毒基因表达系统(Stratagene)。原核表达系统的非限制性实例包括CHAMPIONTMpET表达系统(EMDBiosciences-Novagen,Madison,WI,USA)、TRIEXTM细菌表达系统(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI,USA)、
Figure BDA0002642074890000602
表达系统(QIAGEN,Inc.)和
Figure BDA0002642074890000603
蛋白质表达与纯化系统(Stratagene)。酵母表达系统包括但不限于EASYSELECTTM毕氏酵母表达试剂盒(Invitrogen,Inc.)、YES-ECHOTM表达载体试剂盒(Invitrogen,Inc.)和SPECTRATM粟酒裂殖酵母表达系统(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,Calif.)。杆状病毒表达系统的非限制性实例包括BACULODIRECTTM(Invitrogen,Inc.)、BAC-TO-
Figure BDA00026420748900006010
(Invitrogen,Inc.)和BD BACULOGOLDTM(BD Biosciences-Pharmigen,San Diego,CA,USA)。昆虫表达系统包括但不限于果蝇表达系统
Figure BDA00026420748900006011
(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,Calif.)、INSECTSELECTTM系统(Invitrogen,Inc.)和INSECTDIRECTTM系统(EMD Biosciences-Novagen)。哺乳动物表达系统的非限制性实例包括T-REXTM(四环素调控的表达)系统(Invitrogen,Inc.)、FLP-INTMT-RExTM系统(Invitrogen,Inc.)、PCDNATM系统(Invitrogen,Inc.)、pSecTag2系统(Invitrogen,Inc.)、
Figure BDA0002642074890000604
系统、INTERPLAYTM哺乳动物TAP系统(Stratagene)、COMPLETE
Figure BDA0002642074890000606
诱导性哺乳动物表达系统(Stratagene)和
Figure BDA0002642074890000605
II诱导性哺乳动物表达系统(Stratagene)。
表达由本说明书中公开的多核苷酸分子编码的经修饰的梭菌毒素或其片段或变体的另一个方法采用无细胞表达系统，诸如但不限于原核提取物和真核提取物。原核细胞提取物的非限制性实例包括RTS 100大肠杆菌HY试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)、ACTIVEPRO体外翻译试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX,USA)、ECOPROTM系统(EMD Biosciences)和EXPRESSWAYTMPlus表达系统(Invitrogen,Inc.)。真核细胞提取物包括但不限于RTS 100麦胚CECF试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)、
Figure BDA0002642074890000608
偶联麦胚提取物系统(Promega Corp.)、麦胚IVTTM试剂盒(Ambion,Inc.)、网状细胞溶胞物IVTTM试剂盒(Ambion,Inc.)、
Figure BDA0002642074890000609
II系统(Ambion,Inc.)和
Figure BDA0002642074890000607
偶联网状细胞溶胞物系统(Promega Corp.)。
密码子优化序列
本文包括上述核酸序列和载体的密码子优化序列。可使用免费从Integrated DNATechnologies,Inc.,Coralville,Iowa,USA获得的密码子优化工具(CODONOPT)对宿主细胞(例如细菌，诸如大肠杆菌或昆虫Hi5细胞)中的表达进行密码子优化。
组合物
本公开内容的实施方案进一步涉及含有一种或多种梭菌毒素(包括其片段或变体)和载体的组合物。进一步的实施方案涉及包含核酸、密码子优化的核酸、载体和生产系统的组合物，所述生产系统例如宿主细胞，编码一种或多种梭菌毒素，包括其片段或变体。进一步，本公开内容的的实施方案涉及包含特异性结合于一种或多种梭菌毒素(包括其片段或变体)的抗体的组合物。
在一方面，本公开内容涉及药学上可接受的药物组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指任何分子实体或组合物在给个体施用时不产生不良反应、过敏反应或其它意外或不当反应。如本文所用，术语“药学上可接受的组合物”与“药物组合物”同义且是指治疗有效浓度的活性成分，诸如本说明书中公开的任何梭菌毒素、片段、变体或嵌合体。包含梭菌毒素、梭菌毒素片段或其变体的药物组合物适用于医学和兽医应用。药物组合物可单独或与其它补充活性成分、药剂、药物或激素组合给患者施用。药物组合物可使用多种方法中的任一种制造，所述方法包括但不限于常规混合、溶解、粒化、研末、乳化、囊封、封装和冻干。药物组合物可采取多种形式中的任一种，所述形式包括但不限于无菌溶液、混悬液、乳液、冻干产物、片剂、丸剂、药丸、胶囊、粉剂、糖浆、酏剂或适于施用的任何其它类型。
还认为包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素片段或变体的药物组合物可任选地包括促进活性成分加工成药学上可接受的组合物的药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指施用时基本上不具有长期或持续有害作用的任何载体，且包括诸如“药学上可接受的媒剂、稳定剂、稀释剂、添加剂、助剂或赋形剂”等术语。这种载体通常与活性化合物混合或允许稀释或包封活性化合物且可为固体、半固体或液体药剂。应了解，活性成分可溶解或可以期望载体或稀释剂中的混悬液形式递送。可使用多种药学上可接受的载体中的任一种，包括但不限于水性介质，诸如例如水、食盐水、甘氨酸、透明质酸等；固体载体，诸如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等；溶剂；分散介质；包衣；抗细菌和抗真菌剂；等渗剂和吸收延迟剂；或任何其它无活性的成分。药学上可接受的载体的选择可取决于施用模式。除非任何药学上可接受的载体与活性成分不相容，否则预期其在药学上可接受的组合物中的使用。这种药用载体的特定用途的非限制性实例可见于以下文献中：PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS(Howard C.Ansel等人编辑，Lippincott Williams&WilkinsPublishers,第7版1999)；REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(AlfonsoR.Gennaro编辑，Lippincott,Williams&Wilkins,第20版2000)；GOODMAN&GILMAN’S THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(Joel G.Hardman等人编辑，McGraw-HillProfessional,第10版2001)；和HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(RaymondC.Rowe等人，APhA Publications,第4版2003)。这些方案为常规方法且任何变化完全在本领域技术人员的技能范围内和根据本文教导可获得。
还认为本说明书中公开的药物组合物可任选地包括但不限于其它药学上可接受的组分(或药用组分)，包括但不限于缓冲剂、防腐剂、张力调节剂、盐、抗氧化剂、渗透压调节剂、生理物质、药理学物质、膨松剂、乳化剂、润湿剂、甜味剂或调味剂等。各种缓冲剂和用于调节pH值的手段可用于制备本说明书中公开的药物组合物，条件是所得制剂为药学上可接受的。这种缓冲剂包括但不限于乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、中性缓冲食盐水、磷酸盐缓冲食盐水和硼酸盐缓冲剂。应了解，需要时，酸或碱可用于调节组合物的pH值。药学上可接受的抗氧化剂包括但不限于偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙酰基半胱氨酸、丁基化羟基苯甲醚和丁基化羟基甲苯。使用防腐剂包括但不限于苯扎氯胺、氯丁醇、硫柳汞、乙酸苯汞、硝酸苯汞、稳定化氧氯组合物(诸如
Figure BDA0002642074890000631
)和螯合剂(诸如DTPA或DTPA双酰胺、DTPA钙和CaNaDTPA双酰胺)。适用于药物组合物中的张力调节剂包括但不限于盐(诸如氯化钠、氯化钾)、甘露糖醇或甘油和其它药学上可接受的张力调节剂。药物组合物可以盐形式提供且可用多种不同的酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸。盐倾向于比相应游离碱形式更可溶于水性或其它质子性溶剂中。应了解，这些和药理学领域中已知的其它物质可包括于适用于本发明的药物组合物中。
在一个实施方案中，组合物包含梭菌毒素或梭菌毒素片段或变体和粘性载体。“粘性载体”意指一种生物相容性化合物，当与肉毒杆菌神经毒素一起配制时，在体内局部注射制剂时所述生物相容性化合物可提供贮库(depot)，从所述贮库释放的梭菌毒素或其片段或变体的量使梭菌毒素或其片段或变体从远离局部注射部位的扩散程度和/或从局部注射部位扩散的梭菌毒素或其片段或变体的量显著减少。根据本公开内容，可以使用任何合适的粘性载体，例如眼科上可接受的粘性载体。粘性载体以向药物递送系统提供所需的粘度的有效量存在。有利地，粘性载体的存在量为药物递送系统的约0.5重量％至约95重量％的范围。所使用的粘性载体的具体量取决于许多因素，包括例如但不限于所使用的具体粘性载体、所使用的粘性载体的分子量、所产生和/或所使用的本药物递送系统所需的粘度等因素。
适用的粘性载体的实例包括但不限于透明质酸、卡波姆、聚丙烯酸、纤维素衍生物、聚卡波非、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、糊精、多糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、肝素、蛋白聚糖(HSPG)、硫酸肝素(HS)、其衍生物及其混合物。粘性载体的代表性类型公开于美国专利号9,044,477；美国专利号9,622,957；美国专利号9,050,336。
皮肤填充剂也可用作粘性载体。用于该目的的合适的皮肤填充剂包括胶原蛋白(无菌胶原蛋白以商品名ZYDERM、ZYPLAST、COSMODERM、COSMOPLAST和AUTOLGEN出售)、
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(透明质酸)、
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(透明质酸)，SCULPTRATM(聚乳酸)、RADIESSETM(羟基磷灰石钙)和JUVEDERMTM。可获自Allergan，Inc.(Irvine,CA,USA)的JUVEDERMTM包含无菌、可生物降解、无热原、粘弹性、透明、无色的由在生理缓冲液中配制的浓度为24mg/ml的交联透明质酸组成的均质凝胶。皮肤填充剂的代表性类型公开于美国专利号9,622,957；美国专利号9,161,970；美国专利号9,050,336。
目前适用的粘性载体的分子量可在约10,000道尔顿或少于约2百万道尔顿或更高的范围内。在一个特别适用的实施方案中，所述粘性载体的分子量在约100,000道尔顿或约200,000道尔顿至约1百万道尔顿或约150万道尔顿的范围内。此外，根据本公开内容适用的粘性载体的分子量基于所使用的粘性载体的类型和所讨论的本发明的药物递送系统的所需的最终粘度以及可能的其它因素，可在相当大的范围内变化。
在一个非常适用的实施方案中，所述载体为聚合透明质酸盐组分，例如金属透明质酸盐组分，优选地选自碱金属透明质酸盐、碱土金属透明质酸盐及其混合物，以及更优选地选自透明质酸钠和其混合物。这种透明质酸盐组分的分子量优选地在约50,000道尔顿或约100,000道尔顿至约130万道尔顿或约200万道尔顿的范围内。在一个实施方案中，本发明的组合物包含聚合透明质酸盐组分，其量为约0.05％至约0.5％(w/v)范围。在进一步的适用的实施方案中，所述透明质酸盐组分的存在量为组合物的约1％至约4％(w/v)的范围。在后一种情况下，很高的聚合物粘度形成凝胶，该凝胶将颗粒沉降速率减慢到一定程度，使得在药物递送系统的估计货架寿命(例如至少约2年)内通常无需重悬过程。由于凝胶不易于通过针和注射器从大容器中去除，因此这种药物递送系统可以在预填充的注射器中销售。
在另一个实施方案中，所述载体是热可逆胶凝剂，诸如在美国专利号9,107,815中描述的泊洛沙姆407。这种包含热可逆凝胶的组合物可以作为在注射后粘度迅速增加的低粘度液体施用(如通过注射)。所得高粘度基质为粘性的、可生物降解的和生物相容性的，且在施用时形成可以从其释放肉毒杆菌毒素的贮库，由此提供了持续或长期释放的药物递送系统。以这种模式，可使用较低剂量的肉毒杆菌毒素。这样的药物组合物可以预先混合或作为简单的重构载体或在施用时结合其几个隔室施用，如使用双腔注射器。热可逆胶凝剂的代表性类型公开于例如美国专利号8,168,206；美国专利第8,642,047号；和美国专利号9,278,140。
在一些实施方案中，为了增加梭菌毒素或其片段或变体在关节中的停留时间，梭菌毒素或其片段或变体在控释系统中提供，所述控释系统包括聚合物基质囊封的梭菌毒素或其片段或变体，其中少量(fractional amount)梭菌毒素或其片段或变体以受控的模式在较长时间内从聚合物基质中释放。控释神经毒素系统已经例如在美国专利号6,585,993；美国专利号6,585,993；美国专利号6,306,423；和美国专利号6,312,708中公开。
在一个实施方案中，本公开内容涉及包含梭菌毒素或其片段或变体的局部组合物。代表性实例包括，例如，包含BoNT/A片段(例如，梭菌毒素的全长重链(HC)或其N端结构域(HCN))或其变体的局部乳膏，其通过商业上可行的离子纳米粒子技术
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(Transdermal Corp.,Birmingham,MI,USA)递送。参见美国专利号7,838,011号；美国专利号7,727,537；美国专利号8,568,740。
用于局部施用的药物化合物和制剂可包括油膏剂、洗剂(例如皮肤护理洗剂)、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。可使用常规的药物载体、水基、粉末基或油基、增稠剂等。优选的局部制剂包括其中本发明的化合物与局部递送剂(例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂)掺合的那些制剂。优选的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰基磷脂酰基DOPE乙醇胺(dioleoylphosphatidyl DOPEethanolamine)、二肉豆蔻酰基磷脂酰基胆碱(dimyristoylphosphatidyl choline)DMPC、二硬脂酰基磷脂酰基胆碱(distearolyphosphatidyl choline))阴性的(例如，二肉豆蔻酰基磷脂酰基甘油(dimyristoylphosphatidyl glycerol)DMPG))和阳离子的(例如二油酰基四甲基氨丙基DOTAP(dioleoyltetramethylaminopropyl DOTAP)和二油酰基磷脂酰基乙醇胺(dioleoylphosphatidyl ethanolamine)DOTMA)。本公开内容的梭菌毒素或其片段或变体可以被囊封在脂质体内或与其形成络合物，特别是与阳离子脂质体。或者，化合物可与脂质络合，特别是与阳离子脂质。优选的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸单甘油酯、甘油二月桂酸酯、甘油1-单癸酸酯(glyceryl 1-monocaprate)、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-10烷基酯(例如肉豆蔻酸异丙酯IPM)、单酸甘油酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部制剂在美国专利号6,747,014中详细描述。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及包含梭菌毒素或其片段或变体的透皮组合物，更具体地涉及能够通过皮肤或上皮(也称为“透皮递送”)运输或递送梭菌毒素或其片段或变体的此类组合物。如本文所述，此类组合物可用作用于向受试者提供肉毒杆菌毒素的局部应用，用于各种治疗、美学和/或美容目的。例如，用于局部递送的组合物可包含具有效率基团的带正电荷的载体分子，使得毒素透皮施予肌肉和/或其它皮肤相关结构。运输发生时肉毒杆菌毒素没有被共价修饰。示例性的组合物和递送系统在由Revance Therapeutics开发的贴剂中提供，例如美国专利号8,568,740；美国专利号8,518,414；美国专利号9,180,081；美国专利号8,404,249；美国专利号8,962,548；美国专利号9,211,248；美国专利号8,398,997；美国专利号8,974,774；美国专利号8,926,991；和美国专利号8092788。另参见美国专利号8,404,249；美国专利号9,144,692；和美国专利美国专利号7,704,524。在一个实施方案中，透皮递送系统为贴剂。透皮贴剂通常具有以下特征：粘合层(可应用于人的皮肤)，用于存放药剂的贮库或储库，以及可防止药物从贮库渗漏的外表面。贴剂的外表面通常为非粘性的。根据本公开内容，将梭菌毒素或其片段或变体加入到贴剂中，使得神经毒素在较长时间段内保持稳定。梭菌毒素或其片段或变体可加入到稳定梭菌毒素或其片段或变体且允许梭菌毒素或其片段或变体从基质和贴剂扩散的聚合物基质中。在本公开内容的一个实施方案中，含有毒素和增强剂的组合物以粘合贴剂的形式提供。梭菌毒素或其片段或变体还可加入到贴剂的粘合层中，使得一旦将贴剂施用到皮肤，梭菌毒素或其片段或变体可通过皮肤扩散。用于递送蛋白质的粘性贴剂的实例是众所周知的。例如，参见美国专利号296,006(外观设计专利)；美国专利号6,010,715；美国专利号5,591,767；美国专利号5,008,110；美国专利号5,683,712；美国专利号5,948,433；和美国专利号5,965,154。在一些实施方案中，所述贴剂可包括脂质囊泡(参见美国专利号6,165,500)。在一些实施方案中，所述贴剂可包括属于刺胞动物门(例如鬼手属种)的生物体的刺细胞(具体地，刺胞细胞、线虫细胞或ptychocytes)，所述刺细胞已经用包含编码本公开内容的梭菌毒素或其片段或变体的核酸的载体转化。在一些实施方案中，所述贴剂可包括在专门的细胞(例如刺细胞)中表达本公开内容的梭菌毒素或其片段或变体的刺胞动物门的转基因生物。
试剂盒
本公开内容的另一个方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含梭菌毒素或其片段或变体，包括编码梭菌毒素或其片段或变体的核酸，或结合于梭菌毒素或其片段或变体的抗体和说明材料。在一个实施方案中，梭菌毒素或其片段或变体为免疫原性组合物的一部分。在另一个实施方案中，梭菌毒素或其片段或变体是缀合物(例如标记蛋白)的一部分。如本文所用，“说明材料”包括出版物、记录、图表或任何其它表达介质，其用于传达梭菌毒素或其片段或变体在诊断、成像、治疗、改善、缓解、抑制、预防或减轻受试者的障碍或通过本文所述的途径施用这种组合物的有效性。所述说明材料还可以例如描述梭菌毒素或其片段或变体的合适剂量。本公开内容的试剂盒的说明材料可以例如固定在含有梭菌毒素或其片段或变体的容器上，或与含有梭菌毒素或其片段或变体的容器一起运输。或者，所述说明材料可以与容器分开运输，目的是使所述说明材料和经修饰的BoNT/A多肽由接受者配合使用。
本公开内容还包括包含梭菌毒素或其片段或变体的试剂盒以及用于将多肽递送至受试者的递送设备。例如，所述递送设备可为可压缩的喷雾瓶、定量喷雾瓶、气溶胶喷雾设备、雾化器、干粉递送设备、自推进溶剂/粉末分配设备、注射器、针、卫生棉条或剂量测量容器。所述试剂盒可进一步包含本文所述的说明材料。
通常，所述容器可容纳一种或多种制剂以及在容器上或与容器相关的可给出重构和/或使用的指引的标签。例如，所述标签可说明所述制剂被重构为如上所述的浓度。所述标签可进一步表明所述制剂是适用于或打算用于例如皮肤施用。在一些实施方案中，容器可含有单剂量的含有梭菌毒素或其片段或变体的稳定制剂。在各种实施方案中，单剂量的稳定制剂以少于约0.5ml或更少的体积存在。或者，容纳所述制剂的容器可为多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如2-6次)制剂。试剂盒或其它制品可进一步包括包含合适的稀释剂(例如，BWFI、食盐水、缓冲食盐水)的第二容器。在稀释剂和制剂混合后，重构制剂中的最终多肽浓度通常将为至少1pg/ml(例如，至少5pg/ml、至少10pg/ml、至少20pg/ml、至少50pg/ml、至少100pg/ml、至少300pg/ml、至少500pg/ml、至少1ng/ml、至少3ng/ml、至少10ng/ml、0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml或更高)。试剂盒或其它制品还可以包括从商业和用户角度考虑所需的其它材料，所述其它材料包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明的包装说明书。在一些实施方案中，试剂盒或其它制品可包括施用说明。
设备和系统
本公开内容的实施方案进一步涉及包含梭菌毒素(包括其片段或变体)的设备和/或系统。递送系统的代表性实例包括例如用于囊封和控制递送多种蛋白质药物的聚醚酯共聚物微球，所述蛋白质药物包括破伤风和肉毒杆菌抗毒素(参见美国专利号5,980,948)；包含可生物降解的聚合物的连续基质的微球颗粒，所述连续的基质包含含有肉毒杆菌毒素的离散区域(美国专利号5,902,565)。在另一个实施方案中，所述递送系统包括用于在几天到几年的时间内脉动或连续体内释放神经毒素的植入物(参见，例如，美国专利号6,383,509；美国专利号6,506,399；美国专利号6,312,708；美国专利号6,585,993；和美国专利号6,306,423)。如本文所用，“植入物”通常涉及控释(例如脉动或连续)组合物或药物递送系统。所述植入物可以例如注射、插入或植入到受试者的体内。所述植入物可被施用几天直至一年或更长，例如7天、15天、30天、1个月、3个月、6个月、1年或更长。
在一个特定的实施方案中，本文提供了用于将梭菌毒素递送到受试者的皮肤中的递送系统。人体皮肤具有两个不同的层，其厚度在约1.5到约4毫米或更多之间变化，取决于身体的区域。第一层是称为表皮的表层。它是相对较厚的上皮。表皮深处是称为真皮的第二层。真皮是纤维结缔组织且包含汗腺和支配这些汗腺的神经或神经末梢。皮肤下面是称为皮下组织的脂肪层，所述皮下组织也可以认为是皮下层的一部分。在皮下组织或皮下层下面是人体特殊结构(例如肌肉)的深筋膜包埋部分。
因此，在一个实施方案中，所述递送将梭菌毒素或编码梭菌毒素的DNA递送至动物或人受试者的组织。在一个实施方案中，所述梭菌毒素被递送至存在神经末梢的皮肤层。例如，递送到真皮层。在另一个实施方案中，递送至皮肤的至少一层且基本递送至下面的组织。例如，梭菌毒素或其片段或变体被递送至皮肤的真皮层和至皮下层。在另一个实施方案中，梭菌毒素被递送至皮肤和至下面的肌肉组织。在另一个实施方案中，梭菌毒素基本被递送至肌肉组织。
包含载体和梭菌毒素和/或编码梭菌毒素的DNA的组合物向位点的递送可以通过本领域已知的任何方法(例如基于针的递送方法或无针的递送方法)来完成。
在一个实施方案中，所述组合物通过无针递送来递送。无针注射器及其用途在本领域中是众所周知的。参见例如，公开了无针注射器的美国专利号6,053,889；美国专利号6,013,050；美国专利号6,010,478；美国专利号6,004,286和美国专利号5,899,880。在一个实施方案中，无针注射器包括细长的管状喷嘴且连接到或能够连接到用于产生超声波气体流(例如氦气爆发)的合适的激励装置，所述激励装置使介质以较高速度向皮肤表面加速并进入到皮肤表面。这种设备可购自POWDERJECT Pharmaceuticals,Oxford,UK。在一个实施方案中，所提供的气压必须足以将组合物释放到目标位点，例如真皮中，但又不能太高以致于损害目标。在另一个实施方案中，所提供的气压足以将组合物递送至目标位点，例如真皮，但又不能太高以致于损害皮肤表面例如上皮。在另一个实施方案中，气压足以将组合物递送至真皮层，但不递送至下面的层，例如皮下层和/或肌肉组织。在另一个实施方案中，所提供的气压必须足以将药物颗粒释放到目标位点，例如真皮和/或基本到下面的肌肉组织，但又不能太高以致于损害皮肤表面。
使用无针注射器的益处包括，例如，最佳递送到特定的组织层，例如真皮层。此外，在递送至真皮而不是肌肉组织的情况下，所述治疗可不导致被治疗区域中的运动功能丧失。此外，使用无针注射器可通过消除因针意外伤害或液体喷射注射器可能溅回的体液引起的感染风险来提高临床安全性，由此避免了诸如血源性病原体(诸如HIV和乙型肝炎)交叉污染的可能性。无针注射器还提供最佳且特定的药物颗粒递送，以治疗病况而几乎没有疼痛或皮肤损伤(诸如挫伤或出血)。含有纯化梭菌毒素的无针系统公开于美国专利号7,255,865。
在另一个实施方案中，本公开内容进一步涉及包含梭菌毒素和载体的基于针的系统。注射系统的代表性类型是本领域已知的，例如，美国专利号8,603,028(关于具有成角度尖端部分的注射设备)；美国专利号8,801,659(关于用于将粘性剂递送到软组织中的注射设备)。在某些实施方案中，组合物可通过传统的递送系统(例如注射器、导管、针和其他设备)注射到位点。
剂量
在一个实施方案中，本文公开的组合物包含有效量的梭菌毒素或其片段。当用于治疗病况时，术语“有效量”可以是足以治疗症状的剂量，例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在仅包含结合结构域(和/或其片段)的梭菌毒素的情况下，剂量通常在0.1-1000mg/天的范围内，以及可为例如在1-500pg/天、100-5000pg/天、1-500ng/天、100-5000ng/天、1-500μg/天、100-5000μg/天、5-1000mg/天、10-500mg/天、20-500mg/天、50-500mg/天、10-200mg/天、10-100mg/天或100-500mg/天的范围内，并由医生根据有关情况确定实际施用量，所述有关情况包括患者的年龄和体重，患者的一般身体状况以及施用途径。当使用重复施用时，施用频率部分取决于药物组合物的半衰期。
在另一个实施方案中，梭菌毒素或其片段或变体在制剂中的浓度可在约1pg/ml至1000pg/ml毒素、1ng/ml至1000μg/ml毒素，例如，约10ng/ml至500μg/ml毒素、100ng/ml至100μg/ml毒素、200ng/ml至500μg/ml毒素、200ng/ml至5000ng/ml毒素、500ng/ml至5000ng/ml、10ng/ml至5000ng/ml、20ng/ml至5000ng/ml、50ng/ml至1000ng/ml、100ng/ml至10μg/ml、100ng/ml至5000ng/ml、100ng/ml至1000ng/ml、10ng/ml至100ng/ml、200ng/ml至10μg/ml、200ng/ml至1000ng/ml、500ng/ml至50μg/ml、500ng/ml至10μg/ml或1000ng/ml至10μg/ml毒素的范围内。在另一个实施方案中，制剂中梭菌毒素或其片段或变体的浓度可在约1pM至500pM、0.1nM至500μM、1.0nM至500μM、1.0nM至100μM、1.0nM至50μM、1.0nM至10μM、1.0nM至500nM、1.0nM至100nM、1.0nM至10nM、10nM至100μM、10nM至50μM、10nM至10μM、10nM至5μM、10nM至1μM、50nM至500μM、50nM至100μM、50nM至10μM、50nM至1μM、50nM至500nM、50nM至100nM、1nM至10μM、10nM至10μM、20nM至10μM、100nM至10μM、1μM至1mM、1μM至500μM、1μM至500μM、5μM至500μM、10μM至100μM、1nM至500μM、10nM至100μM、10nM至10μM、20nM至1μM、1nM至500nM、10nM至100nM、20nM至50nM、1nM至100nM、3nM至50nM毒素的范围内。
剂量可以是单剂量或累积剂量(连续剂量)，并且可由本领域技术人员容易地确定。例如，皮肤障碍的治疗可包括一次性施用有效剂量的本文公开的组合物。作为非限制性实例，本文公开的有效剂量的组合物可一次施予个体，例如作为单次注射或沉积在表现出美容障碍症状的位点或附近。或者，美容障碍的治疗可包括在一定时间段内多次施用本文公开的有效剂量的组合物，诸如例如每天、每几天、每周、每月或每年一次。作为非限制性实例，本文公开的组合物可以每年一次或两次施予个体。施用时间因人而异，取决于个体症状的严重程度等因素。例如，本文公开的有效剂量的组合物可以在不确定的时间段内每月一次施予个体，或者直到个体不再需要治疗为止。本领域普通技术人员将认识到，可以在整个治疗过程中监测个体的状况，并且可相应地调整施予的本文公开的组合物的有效量。
施用途径
使用适用于药物递送的任何可用方法和途径(包括体内和离体方法，以及系统和局部施用途径)将活性剂(例如梭菌毒素或其片段或变体)施予个体。在一个实施方案中，梭菌毒素(包括其片段或变体)根据肉毒杆菌毒素治疗的既定方案来施用。术语“肉毒杆菌毒素治疗”包括但不限于通过任何施用途径使用在任何制剂中任何天然存在的或经修饰的或工程化形式的肉毒杆菌毒素或其结构域或片段，所述肉毒杆菌毒素或其结构域或片段与任何载体或活性成分组合。
使用方法
美容应用
在一个实施方案中，本公开内容涉及使用梭菌毒素或其片段或变体用于美容应用的方法。在一个实施方案中，所述组合物适用于改善皮肤特征或属性，例如透明度、水合作用、表皮和真皮厚度、纹理、弹性、色泽、色调、柔韧性、紧实度、紧致度、光滑度、厚度、光泽、均匀度、松弛度、肤色、细纹、皱纹、毛孔大小或油性。
在另一个实施方案中，所述组合物适用于改善皮肤的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有上述特征。
在一个实施方案中，包含梭菌毒素或其片段或变体的组合物适用于改善受试者的皮肤透明度。皮肤透明度和/或雀斑和老年斑的减少可使用Minolta比色计评估。可在面部的每一侧进行测量并取平均值，作为左和右面部值。皮肤透明度也可使用常规的美能达仪(Minolta Meter)进行测量。所述测量是参数的组合且与皮肤亮度有关，且与皮肤光滑度和水合作用密切相关。参见，Schwarb等人，Eur J Pharm Biopharm.,47(3):261-7,1999。
在另一个实施方案中，包含梭菌毒素或其片段或变体的组合物适用于改善皮肤弹性和/或紧实度。这些参数可使用Hargens弾力计(ballistometer)(一种通过将小物体落在皮肤上并记录其前两个回弹峰来评估皮肤的弹性和紧实度的设备)测量。弾力计是一种具有相对钝的尖端(接触面积为4平方毫米)的小型轻质探头。探头会轻微探入皮肤，并根据皮肤外层(包括角质层和外表皮和一些真皮层)的特性得到测量结果。参见，Hargens等人，Ballistometry,Handbook of Non-Invasive Methods and the Skin,359-366,Cit-CPress,New York(1995)。或者，皮肤弹性和/或紧实度可使用Bonaparte等人(J Med EngTechnol.,37(3):208-12,2013)概述的方法用皮肤弹性测定仪(Cutometer)MPA580进行测量。一种代表性的方法涉及向皮肤施加吸入压力，这时，设备(皮肤弹性测定仪)开始测量皮肤随时间变形的距离。皮肤弹性测定仪提供弹性阻力(Ue)和粘弹性阻力(Uv)。一段时间(例如3秒)后，皮肤弹性测定仪吸入压力被移除，并测量皮肤的最大变形以计算整体柔韧性(Uf)。然后皮肤回位，并通过皮肤弹性测定仪测量变化。在不施加吸入的时间段结束时，测量初始回位弹性(Ur)和总弹性回位(Ua)，从中计算出Uv/Uf、Ua/Uf和Ur/Uf的比值。Uv/Ue的比值代表在吸入期间抵抗皮肤拉伸的2种成分。Bonaparte等人(JAMA Facial PlastSurg.,17(4):256-63,2015)。
在另一个实施方案中，包含梭菌毒素或其片段或变体的组合物适用于改善皮肤色泽，其可使用Fitzpatrick scale量表进行常规评估。参见Fitzpatrick等人，Archives ofDermatology,124(6):869–871,1988。
在另一个实施方案中，包含梭菌毒素或其片段或变体的组合物适用于改善皮肤光滑度和/或肤色。这些参数可以通过临床分级技术进行评估。皮肤光滑度的临床分级可通过十点模拟数字量表进行分析。评估由两名临床医生独立进行并取平均值。参见Sonti等人，Int J Cosmet Sci.,35(2),156–162,2013。
在另一个实施方案中，包含梭菌毒素或其片段或变体的组合物适用于减少皮肤干燥，所述皮肤干燥可以通过本领域已知的方法评估。例如，皮肤干燥的临床分级可通过五点标准Kligman量表(Kligman等人，J.Soc.Cosmet.Chem.,82,171-177,1987)确定。评估由两名临床医生独立进行并取平均值。
在另一个实施方案中，包含梭菌毒素或其片段或变体的组合物适用于改善皮肤光滑度和/或减少皱纹。这些参数也可通过使用Packman等人(J.Soc.Cosmetic Chem.,29:70,1978)和Packman等人(J.Soc.Cosmetic Chem.,29:70,1978)公开的方法进行视觉评估。例如，在每次受试者访问时，可以仔细地评分和记录每个受试者的深度、浅度和面部浅纹(SFL)的总数。数值分数是通过将数量因子乘以深度/宽度/长度因子得到的。获得眼睛区域和嘴巴区域(左侧和右侧)的评分，并将它们加在一起作为总皱纹评分。
在另一个实施方案中，包含梭菌毒素或其片段或变体的组合物适用于改善皮肤柔软性/柔顺性。这些参数可以使用气体轴承电力测功计(一种测量皮肤的应力/应变特性的仪器)进行评估。参见Maes et等人，Int J Cosmet Sci.,5(5):189-200,1983。皮肤的粘弹性特性与皮肤水合作用相关。通过用双面胶将探头贴在皮肤表面，可以在预定的位点(如脸颊)进行测量。可平行于皮肤表面施加约3.5gm的力，并精确测量皮肤位移。然后可计算皮肤柔顺性，并表示为动态弹簧系数(DSR)。
在其他非限制性方面，可通过使用皮肤类似物(诸如例如EpiDermFT和MELANODERMTM)来评估本公开内容的组合物的功效。可用含有本公开内容的组合物的多种碱或以仅赋形剂作为对照来处理类似物。该测试也可用于确认组合物的皮肤剥离能力。
在实施上述美容应用中，有利的是使用不产生面部肌肉的麻痹的含有梭菌毒素或其片段或变体的组合物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及使用梭菌毒素或其片段或变体减少皮肤油性的方法。在实施本公开内容的方法时，“油性”的程度通常是受试者的面部或头发上皮脂分泌量的函数。优选地，可从Courage+Khazaka Electronic GmbH(德国科隆)获得的手持式电子诊断仪器
Figure BDA0002642074890000741
用于基于“油斑光度法”测量“油性”。更具体地，从支架上分配出一块亚光带，并与皮肤或头发表面接触。在接触指定的时间间隔后，带依赖于皮肤或头发上的皮脂量变得透明。使用光电管测量光透射的量，并与皮脂的量(即程度)相关。参见Youn等人，Skin Res.Technol.,8(3),168-72,2002。还可使用用于计算皮脂水平的其它设备，包括
Figure BDA0002642074890000744
或类似技术(例如
Figure BDA0002642074890000745
)。
作为替代，或者与使用
Figure BDA0002642074890000746
一起，皮肤的“光泽”或光反射(反映“油性”)可使用视觉图像分析软件进行测量。本文中，捕获皮肤的图像，优选地在洗涤后约二十分钟，并将该图像上传到或保存在具有成像手段的电子设备(例如，视频或静态照相机)上，并使用视觉图像分析软件进行评分(例如IMAJEJ,NIH,Bethesda,MD)。
或者，使用
Figure BDA0002642074890000742
(CuDerm,Corp.,Dallas,TX,USA)评估皮肤的油性。薄膜的一侧涂有能够使薄膜在采样(即接触)期间固定到皮肤上的脂质多孔粘合剂。当皮脂到达皮肤表面时，皮脂迅速吸收到薄膜中。微腔内的空气被皮脂置换。充满皮脂的空腔变得透明。另外，皮脂输出形成“斑点”，其大小对应于液滴的体积(Kligman等人，J.Soc.Cosmet.Chem.,37,369-374,1986)。可从Courage+Khazka(德国科隆)获得的
Figure BDA0002642074890000743
箔从微孔内的皮肤表面吸收皮脂，呈现出皮脂为不同的“斑点”。箔被安装在记录指定时间段内皮脂产生的摄像机上。
“油性”还可通过以下方法进行评估：采集通过胶带剥离方法获得的体液(例如，口腔内的唾液或粘膜细胞)或角质层细胞的标本，并测量与皮脂分泌增加相关的一种或多种相关基因的表达水平，以及评估DNA、RNA、蛋白质或脂质含量的测量。
出于本公开内容的目的，“油性”的程度优选在“轻度油性”或“极度油性”之间进行区分，其中“轻度油性”皮肤的特征在于皮脂的量最少量地足以形成有效的闭塞屏障(防止过敏原和刺激物进入的保护层)，并限制表皮水分流失，但不是会引起皮肤发亮、痤疮和/或令人不快的粘腻感的皮肤表面上的皮脂量。
优选地，除了测量皮脂含量(优选地，使用
Figure BDA0002642074890000752
)或皮肤光泽度(使用视觉图像分析)中的一种或两种之外，还使用临床验证的评估工具(例如，问卷)对油性进行评估，所述评估工具可以是(a)由消费者使用交互式电子设备、计算设备(包括平板电脑或智能手机)自行管理，或(b)受过培训的护肤专业人士。临床验证的问卷的两个非限制性实例描述于以下出版物中：：Baumann等人，Journal of Cosmetics,DermatologicalSciences and Applications,4,78-84,2014；和美国专利号9,724,287(得分在34-44之间表示“极度油性”皮肤；得分在27-33之间表示“轻度油性”皮肤)。
或者，在本公开内容的上下文中，皮肤可以被分类为“干性”基皮肤水合作用状态，其可基于由皮肤表面水合作用导致的介电常数的变化来测量。优选地，皮肤水合作用用来自Courage+Khazaka Electronics GmbH(德国科隆)的手持式探头
Figure BDA0002642074890000751
来测量。
皮肤障碍的治疗
皮肤具有两个主要层，主要由角质形成细胞组成的外表皮层和主要由成纤维细胞组成的真皮间层。表皮形成了可抵抗病原细菌、真菌、寄生虫和病毒、热量、紫外线辐射和水分流失导致的环境损害的保护性屏障。真皮通过由透明质酸和蛋白聚糖中嵌入的胶原纤维、微纤维和弹性纤维组成的细胞外基质为皮肤提供拉伸强度和弹性。
对表皮和真皮细胞(包括角质形成细胞)的作用可能会影响例如皮肤质量属性，所述表皮和真皮细胞包括：产生结构蛋白(丝聚蛋白、角蛋白)、酶(蛋白酶)、脂质和抗菌肽(防御素)，并分化形成角质层和皮肤附件(例如毛囊和皮脂腺)的角质形成细胞，产生和维持细胞外基质(ECM)成分(包括胶原蛋白、血纤蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白，蛋白聚糖、葡糖胺聚糖和基质细胞蛋白)的成纤维细胞，来源于分化的角质形成细胞且组成分泌皮脂、使皮肤、头发和眼睛润滑和防水的皮脂腺和睑板腺的皮脂腺细胞，和使皮肤和眼睛产生黑色素的黑素细胞，所述皮肤质量属性包括透明度、水合作用、表皮和真皮厚度、纹理、弹性、色泽、色调、柔韧性、紧实度、紧致度、光滑度、厚度、光泽、均匀度、松弛度、肤色、细纹、皱纹、毛孔大小和油性。
本公开内容进一步涉及使用梭菌毒素或其片段或变体作为皮肤美容障碍的治疗的方法。在一个实施方案中，所述美容皮肤障碍是一种由于皮脂腺功能改变引起的障碍。皮脂腺障碍可能由皮脂腺过度活跃、皮脂腺不活跃、皮脂腺发育不良、皮脂腺阻塞、皮脂腺感染、皮脂腺发炎等引起。皮脂腺障碍的实例包括但不限于：痤疮、包括开放粉刺(黑头粉刺)和白头粉刺、丘疹(pimple)、深层痤疮、聚合性痤疮、酒渣鼻痤疮、粉刺、囊肿、微小粉刺、疹子(papule)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,P.acnes)感染、脓疱、寻常痤疮、酒渣鼻、口周皮炎、皮脂囊肿、原发性脂溢(油性皮脂溢)、继发性皮脂溢(干性皮脂溢)和脱发。该定义内还包括可通过改变皮脂腺的功能来治疗的障碍诸如头皮屑和皮肤干燥，以及“美容”皮脂腺障碍,包括干燥的头发、油腻的头发、头发和皮肤光泽,以及其他轻微的皮肤和/或肤色的美容障碍。
在一个实施方案中，本公开内容涉及使用本文所述的梭菌毒素或其片段或变体调节皮脂产生和/或皮脂组成的方法。在一些实施方案中，调节引起皮脂产生和/或皮脂组成的变化，由此引起皮肤油性/干性的变化。在一个实施方案中，调节减少皮脂产生，由此减少皮肤油性。在另一个实施方案中，调节增加皮脂产生，由此减少皮肤干性。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及使用本文所述的梭菌毒素或其片段或变体治疗与皮脂失调(产生减少或增加)和/或异常(皮脂组成改变)有关的皮肤障碍的方法。在一些实施方案中，本方法包括对需要其的受试者施予梭菌毒素、其片段或变体以调节皮脂产生和/或皮脂组成，由此治疗与皮脂失调和/或异常有关的皮肤障碍。与皮脂失调和/或异常有关的示例性皮肤障碍包括痤疮、脂溢性皮炎、红斑、酒渣鼻、牛皮癣、过敏性皮肤炎(AD)、脱发、白癜风、过敏、感染和炎症。
皮脂腺分泌含有抗菌肽的皮脂，所述抗菌肽包括皮离蛋白(dermcidin)、b-防御素和牛皮癣素和形成酸罩(acid mantle)的酸，所述酸罩是皮肤表面的一层细小的微酸性(pH4.5和pH 6.0之间)的薄膜，防止水分流失并提供针对病原体(诸如细菌、酵母、真菌、病毒和螨虫)的屏障。皮脂失调和/或异常可能会削弱该屏障，并使皮肤对病原体更易感。皮脂产生和/或组成的调节可导致与皮肤屏障功能受损、感染和炎症相关的真皮疾病的改善。在一些实施方案中，本公开内容涉及使用本文所述的梭菌毒素或其片段或变体治疗与皮脂失调和/或异常有关的感染的方法。通过本方法可治疗的示例性感染包括来自细菌、病毒、真菌、酵母、虱子和螨虫的感染，所述细菌包括痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,MRSA)、麻风(麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))和蜂窝组织炎(链球菌(Streptococcus)和葡萄球菌(Staphylococcus))；所述病毒包括带状疱疹(水痘带状疱疹)、疣(乳头瘤病毒(HPV))和单纯性疱疹；所述真菌包括毛癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、小孢菌属(Microsporum)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)；所述酵母包括马拉色菌属(Malassezia)；所述螨虫包括蠕形螨属(Demodex)和疥螨(Sarcoptesscabiei)。
实施例
本文所述的结构、材料、组合物和方法旨在作为本公开内容的代表性实例，并且应理解，本公开内容的范围不受实施例范围的限制。本领域技术人员将认识到，可通过对所公开的结构、材料、组合物和方法进行变型来实践本公开内容，并且这种变型被认为在本公开内容的范围内。
实施例1
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽对正常人原代成纤维细胞中细胞基因表达的作用
用具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理正常人原代成纤维细胞持续1、2或3天，导致基于qPCR的10种成纤维细胞基因表达的显著时间依赖性变化。简而言之，将成年人真皮成纤维细胞(HDFa)(cellResearchCorp PteLtd)在含有2％FBS的MEM培养基中培养持续2周，然后用1μM具有SEQ ID NO:19的多肽处理持续持续1、2或3天。评价了已知在成纤维细胞中表达并与细胞外基质(ECM)组织或表皮自我更新(角质形成细胞干细胞因子)有关的基因的时间依赖性表达。使用来自Ambion的RNAqueous试剂盒分离总RNA，并使用Qiagen试剂按照制造商的方案生成cDNA。使用Bio-RadPCR阵列进行实时qPCR。基因表达的变化计算为每个时间点上相对于未处理的缓冲液对照的倍数变化(ΔΔCT＝ΔCT(基因(测试)-GAPDH(测试))-ΔCT(基因(未处理的对照)-GAPDH(未处理的对照))；倍数变化＝2(-ΔΔCT))。倍数变化大于2或小于0.5(p值≤0.05)被认为是相关的显著变化。显示时间依赖性变化的示例性基因在图1中示出，图1是显示了在用1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理持续1、2或3天后，正常人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图，其中相对于未处理的对照细胞表达倍数变化。结果表明，用具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理原代人真皮成纤维细胞，导致时间依赖性基因表达变化。具体地，编码基质降解酶(如基质金属蛋白酶(MMP))和蛋白质(如TP63(转化相关蛋白63)，是识别角膜和表皮干细胞的转录因子)的基因的初始表达增加(第1天和第2天)(从第1天到第3天的倍数变化，MMP1：从11到3倍，MMP3：从5到4倍，TP63：从44到25倍)，然后(第3天)编码主要基质结构蛋白(如胶原蛋白和弹性蛋白)的基因表达增加(从第1天到第3天的倍数变化，COL1A1：从2到3倍，COL1A2：从2到3倍，COL3A1：从2到3倍，ELN：从2到6倍)，表明成纤维细胞经历了细胞外基质(ECM)的重塑。预期ECM的重塑影响皮肤真皮的结构和功能特征，导致皮肤的生物力学特性(诸如例如弹性和柔韧性)的改变。因此，结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽可影响人类患者中的皮肤真皮的结构和功能，特别是皮肤真皮(包括细胞外基质结构)的结构和功能特征，导致皮肤的生物力学特性(诸如弹性和柔韧性)的改变。
实施例2
SEQ ID NO:19的示例性多肽对正常人原代成纤维细胞中细胞基因表达的作用
用10nM、100nM或1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理正常人原代成纤维细胞持续1天(24小时)，导致基于qPCR的16种成纤维细胞相关基因表达的显著剂量依赖性变化。简而言之，将成年人真皮成纤维细胞(HDFa)(ThermoFisher Scientific，产品目录编号C0135C)在含有2％FBS的MEM培养基中培养持续2周，然后用10nM、100nM或1μM的SEQ ID NO:19的多肽处理持续1天(24小时)。评价了已知在成纤维细胞中表达并与ECM组织、炎症或表皮自我更新有关的基因的表达。使用SUPERSCRIPT VILO cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific#11754050)通过逆转录生成cDNA，然后在TAQMAN Fast Advanced Master Mix(Thermo Scientific#4444557)中进一步稀释，然后转移到TAQMAN Fast板(Thermo Scientific#4413259)中的指定孔中。使用Applied Biosystems 7500Fast实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行实时qPCR。基因表达的变化计算为每个时间点上相对于未处理的对照的倍数变化(ΔΔCT＝ΔCT(基因(测试)-GAPDH(测试))-ΔCT(基因(未处理的对照)-GAPDH(未处理的对照))；倍数变化＝2(-ΔΔCT))。倍数变化大于2或小于0.5(p值≤0.05)被认为是相关的显著变化。显示剂量依赖性变化的示例性基因在图2中示出，图2是显示了在用10nM(实心柱)、100nM(空白柱)或1μM(阴影柱)的具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理持续24小时后，正常人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图，其中相对于未处理的对照细胞表达倍数变化。值得注意的是，已知与组织和ECM体内平衡、重塑、更新和修复有关的基因的表达增加。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽可能影响人类患者中的皮肤真皮的结构和功能，特别是皮肤真皮(包括细胞外基质结构)的结构和功能特征，导致皮肤的生物力学特性(诸如弹性和柔韧性)的改变。
实施例3
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽对正常人原代成纤维细胞中细胞基因表达的作用
用1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽或具有与BoNT的结合结构域的N端一半(HCN/A)基本相同的氨基酸序列的多肽处理正常人原代成纤维细胞，导致基于qPCR的16种成纤维细胞相关基因表达的相似的显著变化。简而言之，将成年人真皮成纤维细胞(HDFa)(ThermoFisher Scientific，产品目录编号C0135C)在含有2％FBS的MEM培养基中培养持续2周，然后用1μM具有SEQ ID NO:19的多肽或具有SEQ ID NO:21的多肽处理持续1天(24小时)。评价了已知与ECM组织、炎症或表皮自我更新有关的成纤维细胞相关基因的表达。使用SUPERSCRIPT VILO cDNA合成试剂盒(ThermoScientific#11754050)通过逆转录生成cDNA，然后在TAQMAN Fast Advanced Master Mix(Thermo Scientific#4444557)中进一步稀释，然后转移到TAQMAN Fast板(ThermoScientific#4413259)中的指定孔中。使用Applied Biosystems 7500Fast实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行实时qPCR。基因表达的变化计算为每个时间点上相对于未处理的对照的倍数变化(ΔΔCT＝ΔCT(基因(测试)-GAPDH(测试))-ΔCT(基因(未处理的对照)-GAPDH(未处理的对照))；倍数变化＝2(-ΔΔCT))。倍数变化大于2或小于0.5(p值≤0.05)被认为是相关的显著变化。结果在图3中示出，图3是显示了在用1μM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽(实心柱)或用1μM具有与BoNT的结合结构域的N端一半(HCN/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(空白柱)处理后，正常人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图。结果表明，分别基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)和结合结构域的N端一半(HCN/A)的这两种多肽，在影响成纤维细胞相关基因(FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7、TP63、SOD2、UBD、HAS2、HAS3、ADAMTS1、IGF-1、IL-6、IL-32、CCL2和BDKRB1)表达中同样有效。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)或结合结构域的N端一半(HCN/A)的多肽可能影响人类患者中的皮肤真皮的结构和功能，特别是皮肤真皮(包括细胞外基质结构)的结构和功能特征，导致皮肤的生物力学特性(诸如弹性和柔韧性)的改变。
实施例4
SEQ ID NO:19的示例性多肽对纤连蛋白的细胞表达的作用
基于免疫组织化学(IHC)，用600pM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理瘢痕疙瘩人原代成纤维细胞，增加了纤连蛋白糖蛋白的表达。简而言之，将瘢痕疙瘩成纤维细胞在低浓度培养基(含250μg/ml BSA的培养基，Sigma#7030)中培养持续48小时(2天)，用或不用600pM具有SEQ ID NO:19的多肽处理。用纤连蛋白的抗体(Abcam，#ab2413)对纤连蛋白进行免疫染色。代表性图像在图4A-4B中示出，图4A-4B显示用(图4A)或不用(图4B)具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽的成纤维细胞的图像。结果表明，用具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理成纤维细胞增加了纤连蛋白表达。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽可能增加人类患者皮肤的真皮中纤连蛋白的表达，导致细胞外基质结构和皮肤的生物力学特性(诸如弹性和柔韧性)的改变。
实施例5
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽对成纤维细胞中基因表达的作用
用100nM或1μM具有与BoNT/DC的结合结构域(HC/DC)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽或1μM具有与BoNT/A的结合结构域的N端一半(HCN/A)基本相同的氨基酸序列的多肽处理正常人原代成纤维细胞，导致基于qPCR的6种成纤维细胞相关基因表达的显著变化。简而言之，将人真皮成纤维细胞(HDFa)(ThermoFisher Scientific，产品目录编号C0135C)在含有2％FBS的MEM培养基中培养持续2周，然后用100nM或1μM的SEQ ID NO:20的多肽或1μM的SEQ ID NO:21的多肽处理持续1天(24小时)。评价了用HC/A或HCN/A处理后显示表达增加的6种基因(参见上述实施例2和3)的表达。使用SUPERSCRIPT VILO cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific#11754050)通过逆转录生成cDNA，然后在TAQMAN Fast AdvancedMaster Mix(Thermo Scientific#4444557)中进一步稀释，然后转移到TAQMAN Fast板(Thermo Scientific#4413259)中的指定孔中。使用Applied Biosystems7500Fast实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行实时qPCR。分析了以下基因表达的变化：FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7和TP63。基因表达的变化计算为每个时间点相对于未处理的对照的倍数变化(ΔΔCT＝ΔCT(基因(测试)-GAPDH(测试))-ΔCT(基因(未处理的对照)-GAPDH(未处理的对照))；倍数变化＝2(-ΔΔCT))。倍数变化大于2或小于0.5(p值≤0.05)被认为是相关的显著变化。结果在图5中示出，图5是显示了在用1μM具有与BoNT的结合结构域的N端一半(HCN/A)基本相同的氨基酸序列的多肽(空白)或100nM(实心)或1μM(阴影)具有与BoNT/DC的结合结构域(HC/DC)基本相同的氨基酸序列的多肽处理持续1天(24小时)后，正常人原代成纤维细胞中指示基因表达的倍数变化的柱状图。结果表明，用100nM或1μM基本对应于BoNT/DC的结合结构域(HC/DC)的多肽处理影响正常人真皮成纤维细胞中基因的表达。该作用与1μM基本对应于HC/A的N端一半的结合结构域(HCN/A)的多肽的作用相似或更高，表明与基本对应于HC/A的N端一半的结合结构域(HCN/A)的多肽相比，基本对应于BoNT/DC的结合结构域(HC/DC)的多肽在影响成纤维细胞相关基因的表达中具有同等或更高的功效。因此，结果表明，基本对应于BoNT/DC的结合结构域(HC/DC)的多肽可影响人类患者中的皮肤真皮(包括细胞外基质结构)的结构和功能，例如其决定皮肤的生物力学特性，包括弹性和柔韧性。基本对应于两种不同BoNT血清型的结合结构域的多肽影响成纤维细胞的观察结果也表明，其他BoNT血清型可影响人类皮肤。
使用序列比对软件工具，在不同的BoNT血清型之间进行成对序列比对；其中BoNT/A1的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)(GENBANK#AF488749)与来自以下BoNT蛋白的结合结构域的氨基酸序列进行比对：BoNT/B1(GENBANK#BAE48264)；BoNT/C1(GENBANK#P18640)；BoNT/D(GENBANK#P19321)；BoNT/DC(GENBANK#EF378947)；BoNT/E(GENBANK#AFV91344)；BoNT/F(GENBANK#ABS41202)；和BoNT/G(GENBANK#X74162)。在表2中示出的结果表明，BoNT/A1与其他BoNT血清型(例如B1、C1、DC、E、F和G)之间在氨基酸水平的同一性和同源性百分比与BoNT/A1与BoNT/DC之间的同一性和同源性百分比相似。具体地，根据BLAST比对，HC/A和HC/DC在氨基酸残基水平为33％的相同和54％相似(共有)，其与所有其他血清型(31-51％相同和49-67％相似(共有))相似。如实施例5所示，BoNT/DC的结合结构域(HC/DC)在影响成纤维细胞相关基因的表达中，与BoNT/A的结合结构域同样有效。因此，BLAST比对和从实施例5获得的结果表明，除了BoNT/A和BoNT/DC之外，其他BoNT血清型也能影响人类皮肤。
表2：使用BLAST，在来源于各种BoNT血清型的Hc蛋白之间的成对多重序列比对。
Figure BDA0002642074890000831
*所述同源性百分比定义为蛋白质序列内相对于参考蛋白质序列的相同或相似残基(共有)的百分比，除以参考序列的长度
**()得分是使用残基置换矩阵计算的原始得分，位的分是考虑序列长度和空位大小的归一化得分。例如，283位得分意味着找到比所发现的更好的比对，必须搜2^283个氨基酸的空间。
如表2所示，不同BoNT血清型之间的比对水平很高，如得分所示。得分以原始得分或位得分的形式提供，其中原始得分是通过使用残基置换矩阵的工具直接计算，并且位得分是考虑序列长度和空位大小的归一化得分。如在生物信息学中所理解的，283位的得分意味着找到比所呈现的更好的比对，搜索将必须包括2283(或2x1085)个单位的氨基酸的空间。因此，位得分越高，匹配的显著性就越高。
实施例6
不同脂肪生成刺激物在皮脂腺细胞上的测试
基于尼罗红染色，用不同的脂肪生成增强刺激物处理皮脂腺细胞(SEB-1)增加皮脂腺细胞脂肪生成。简而言之，将人类永生化皮脂腺细胞(SEB-1)在皮脂腺细胞生长培养基(Zen-
Figure BDA0002642074890000841
)中培养。将各种脂肪生成增强刺激物添加到生长培养基中持续1天，脂肪生成增强刺激物包括：油酸(OA)(0.05mg/mL)、氯化钙(CaCl2)(2mM)、乙酰胆碱(ACh)(300μM)、二氢睾酮(DHT)(10或100μM)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)(100nM或500nM)、α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)(500nM或5μM)或罗格列酮(100μM或1mM)。使用尼罗红脂滴荧光测定法(CaymanChemical，目录#500001)测量每孔的皮脂脂质的总量，其中将细胞用10％福尔马林固定，然后与尼罗红染色溶液孵育且使用荧光酶标仪(microplate reader)(Hidex PlateCHAMELEONTMV多标记酶标仪，Bioscan，Inc)测量荧光强度(尼罗红，FITC，激发/发射485/535nm)。结果在图6中示出，证明所有测试的脂肪生成增强刺激物显著增加了皮脂腺细胞脂肪生成，具有以下脂肪生成能力的等级顺序；DHT(100μM，5.5倍)>OA(0.025mg/mL，4.5倍)>罗格列酮(100μM，4倍)>FGF1(500nM，3.5倍)>CaCl2(2mM，3倍)>ACh(300μM，2.5倍)>α-MSH(5μM，2倍)(相对于未处理的对照的倍数变化)。应当注意的是，在测试的刺激物中，1mM罗格列酮引起细胞死亡，而500nM FGF1(FGFR的天然配体)刺激皮脂腺细胞脂肪生成。
实施例7
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在抑制皮脂脂质产生中的用途
用脂肪生成增强刺激物性油酸(OA)和20pM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽共同处理皮脂腺细胞(SZ95)，减少了OA诱导脂肪生成的能力。简而言之，将人类永生化皮脂腺细胞(SEB-1)在皮脂腺细胞生长培养基(Zen-
Figure BDA0002642074890000851
)中培养。将以下处理添加到生长培养基中持续1天：对照(不处理)；油酸(OA)(0.125mg/mL或0.25mg/mL)；SEQ ID NO:19的示例性多肽(20pM)；油酸(OA)(0.125mg/mL或0.25mg/mL)和SEQ ID NO:19的多肽(20pM)。使用尼罗红脂滴荧光测定法(CaymanChemical，目录#500001)测量皮脂脂质的总量，其中将细胞用10％福尔马林固定，然后与尼罗红染色溶液孵育。作为对细胞数量的测量，平行进行DAPI染色(1.5ng/mL终浓度)。使用荧光酶标仪(ENVISION 2102，Perkin Elmer)测量荧光强度(尼罗红，FITC，激发/发射485/535nm，DAPI，激发：358nm；发射：461nm)。将脂质值归一化为DAPI值，并绘制为“每个细胞的脂质(尼罗红/DAPI)”。
结果在图7中示出，证明通过油酸(OA)处理可显著增强皮脂脂肪生成(6-8倍，取决于OA的剂量)。然而，用20pM具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的示例性多肽(SEQ ID NO:19)对细胞的共同处理显著减少了OA的脂肪生成增强作用(约30-35％的减少，取决于OA的剂量)。单独用20pM的SEQ ID NO:19的示例性多肽处理细胞不影响皮脂脂肪生成。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽可影响皮脂腺细胞，并可能减少人类患者中的皮脂脂肪生成和皮肤油性。
实施例8
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在改善细纹和松弛度中的用途
一位拥有光II型皮肤的45岁女性希望最小化光老化面部皮肤的迹象，包括细纹和松弛度。由于相关的停工期(down-time)，她拒绝进行分数激光治疗以改善她皮肤的质量。相反，她要求用具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽进行皮内治疗。治疗之前，在治疗前30分钟将局部麻醉乳膏(2.5％利多卡因和2.5％丙胺卡因)施加在皮肤上，然后将其完全去除。
将多肽粉末溶解在食盐水中(将4.5ng真空干燥的粉末在9mL无菌0.9％食盐水中重构)以形成0.5ng/mL的溶液，并使用多针真皮注射系统将其注射到她的面部皮肤。在每个注射位点2μL(0.001ng)，总共注射了1.3ng(总共1300个位点)。上面部的注射深度为0.8mm，中和下面部的注射深度为1.0mm，间隔为2mm。
在基线和治疗后12周进行评估。
与基线相比，治疗后12周，她的面部皮肤显示出更高的医生整体评估和受试者满意度得分，并且粗糙度、水合作用、皮肤弹性和经表皮水分流失(TEWL)均有显著改善。该改善与实施例1和2所述的实验数据一致，其中用对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽处理的成纤维细胞显示具有增加的蛋白质和因子的表达，包括纤连蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白，其起适当维持、更新和修复细胞外基质(ECM)真皮结构的功能。
实施例9
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在减少油性、皮脂和毛孔大小中的用途
一位拥有光III型皮肤的35岁男性具有油性前额(皮脂溢)，并接受具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽皮内治疗。
将多肽粉末溶解在食盐水中，将4.5ng真空干燥的粉末溶解在0.25mL无菌0.9％食盐水中以形成1.8ng/0.1mL的溶液，并注射到他的前额。总共注射了1.8ng。选择十(10)个注射位点，并使用30-G针在每个位点皮内(ID)注射0.18ng HC/A多肽。处理后施用冰袋。
在基线和治疗后12周进行评估，并使用皮脂计测量皮脂的量。
与基线相比，治疗后12周，他的前额显示出更高的医生整体评估且患者报告他对结果满意，并且油性、皮脂和毛孔大小均有显著减少。皮脂减少的百分比(％)用皮脂计测量。该改善与实施例6和7所述的实验数据一致，其中用对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽处理的皮脂腺细胞显示具有减少的油酸诱导的皮脂脂肪生成，其将导致减少皮肤油性。
实施例10
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在调节皮脂脂质产生中的用途
用具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理皮脂腺细胞(SEB-1)调节了脂肪生成。简而言之，将人类永生化皮脂腺细胞(SEB-1)在皮脂腺细胞生长培养基(Zen-
Figure BDA0002642074890000871
)中培养。将以下处理添加到生长培养基中持续1天：对照(不处理)；SEQ ID NO:19的示例性多肽(20pM)；油酸(OA)(0.05mg/mL)；油酸(OA)(0.05mg/mL)和SEQ ID NO:19的多肽(20pM)。使用尼罗红脂滴荧光测定法(CaymanChemical，目录#500001)测量皮脂脂质的总量，其中将细胞用10％福尔马林固定，然后与尼罗红染色溶液孵育。使用荧光酶标仪(Hidex Plate CHAMELEONTMV多标记酶标仪，Bioscan，Inc)测量荧光强度(尼罗红，FITC，激发/发射485/535nm，DAPI，激发：358nm；发射：461nm)。将脂质值归一化为DAPI值，并绘制为“每个细胞的脂质(尼罗红/DAPI)”。
结果在图8中示出，证明皮脂脂肪生成通过20pM的SEQ ID NO:19的多肽(～5倍)或油酸(OA)处理(～15倍)显著增强。然而，将细胞用20pM的SEQ ID NO:19的多肽共同处理显著减少了OA的脂肪生成增强作用(约30-25％的减少)。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽可影响体内皮脂腺内的皮脂腺细胞，例如，通过调节皮肤皮脂的产生和/或组成，由此影响人类患者中的皮肤油性/干性。
实施例11
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在以剂量依赖性模式调节皮脂脂质产生中的用途
用具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽处理皮脂腺细胞(SEB-1)以剂量依赖性模式调节了脂肪生成。简而言之，将人类永生化皮脂腺细胞(SEB-1)在皮脂腺细胞生长培养基(Zen-
Figure BDA0002642074890000881
)中培养。将以下处理添加到生长培养基中持续1天：对照(不处理)；油酸(OA)(0.05mg/mL)；SEQ ID NO:19的示例性多肽在2pM、20pM或200pM下；油酸(OA)(0.05mg/mL)和SEQ ID NO:19的多肽在2pM、20pM或200pM下。使用尼罗红脂滴荧光测定法(Cayman Chemical，目录#500001)测量皮脂脂质的总量，其中将细胞用10％福尔马林固定，然后与尼罗红染色溶液孵育。使用荧光酶标仪(Hidex PlateCHAMELEONTMV多标记酶标仪，Bioscan，Inc)测量荧光强度(尼罗红，FITC，激发/发射485/535nm，DAPI，激发：358nm；发射：461nm)。将脂质值归一化为DAPI值，并绘制为“每个细胞的脂质(尼罗红/DAPI)”。
结果在图9中示出，证明皮脂脂肪生成通过油酸(OA)处理(～11倍)或通过SEQ IDNO:19的多肽(～4-5倍)以剂量依赖性模式显著增强。然而，将细胞用20pM或200pM的SEQ IDNO:19的多肽共同处理显著减少了OA的脂肪生成增强作用(约35-45％的减少)。结果表明，基本对应于BoNT/A的结合结构域(HC/A)的多肽可影响体内皮脂腺内的皮脂腺细胞，例如，通过调节皮肤皮脂的产生和/或组成，由此影响人类患者中的皮肤油性/干性。
实施例12
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在治疗痤疮中的用途
基于对痤疮严重程度的研究者总体评价(Investigator’s Global Assessment，IGA)，一位拥有光II型皮肤的20岁非吸烟男性表现出轻中度(mild-moderate)面部寻常痤疮，面部有30个痤疮病变，并接受具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)基本相同的氨基酸序列的多肽皮内治疗。
将多肽粉末溶解在食盐水中，将4.5ng真空干燥的粉末溶解在0.25mL无菌0.9％食盐水中以形成1.8ng/0.1mL的溶液；并注射到他的前额。总共注射了3.6ng。选择二十(20)个注射位点，前额5个，每个脸颊4个，以及嘴和下巴周围的脸下部6个；使用30-G针在每个位点皮内(ID)注射0.36ng HC/A多肽。处理后施用冰袋。
在基线和治疗后12周通过研究者总体评价(IGA)对痤疮严重程度进行了评估，并进行了痤疮病变数量的计数。
与基线相比，在治疗后12周，基于痤疮严重程度的IGA，他的痤疮从轻中度改善为轻度至几乎清除，只有5个痤疮病变，并且患者报告他对结果满意。
实施例13
根据本公开内容的方面提供的示例性多肽在治疗痤疮中的用途
基于对痤疮严重程度的研究者总体评价(IGA)，一位拥有光II型皮肤的20岁非吸烟男性表现出轻中度面部寻常痤疮，面部有30个痤疮病变，并接受含有具有与BoNT/A的结合结构域(HC/A)基本相同的氨基酸序列的多肽的溶解微针贴剂治疗。
使用施药器将用于透皮药物递送的溶解微针贴剂(每个贴剂中含有包封的2.5ng多肽)施加到患处。总共施加六个贴剂(15ng)，前额2个，每个脸颊2个，以及嘴和下巴周围的脸下部2个。将贴剂施加5分钟以使针溶解，然后去除剩余的衬垫。
在基线和治疗后12周通过研究者总体评价(IGA)对痤疮严重程度进行了评估，并进行了痤疮病变数量的计数。
与基线相比，在治疗后12周，基于痤疮严重程度的IGA，他的痤疮从轻中度改善为轻度至几乎清除，只有5个痤疮病变，并且患者报告他对结果满意。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
尽管与本文所描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开内容的实践或测试中，但是在前述段落中描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意图是限制性的。在发生冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。
本文引用的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请均通过引用的方式并入本文。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用的方式并入本文。本文引用的所有公开的参考文献、文件、手稿、科学文献均通过引用的方式并入本文。与本文引用的科学数据库有关的所有标识符和登录号(例如，PUBMED、NCBI、GENBANK、EBI)通过引用的方式并入本文。
序列表
<110> JACKY, BIRGITTE P.S.
BRIDEAU-ANDERSEN, AMY
YOU, HUI
MALIK, SHIAZAH Z.
FRAIL, DONALD E.
BRIN, MITCHELL F.
<120> 肉毒杆菌毒素细胞结合结构域多肽及其用于皮肤再生的方法
<130> 19980-WO-PCT-NTB
<140>
<141>
<150> 62/727,640
<151> 2018-09-06
<150> 62/608,119
<151> 2017-12-20
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 421
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 1
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
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Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
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Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
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Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
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Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
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Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
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Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
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Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn
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Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg
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Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg
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Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr
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Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile
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Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn
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Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn
355 360 365
Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala
370 375 380
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<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
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tttgtgacca ttaccaacaa ccgtctgaac aacagcaaaa tttatattaa cggccgtctg 480
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<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
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420 425
<210> 4
<211> 421
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 4
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Arg Lys Asn Thr Leu Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Ser Glu Glu Gly Asp Val Gln Leu Asn
20 25 30
Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly Ser Ser Gly Glu Asp Arg
35 40 45
Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn Ile Val Tyr Asn Ser Met
50 55 60
Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asn Lys Trp Val
65 70 75 80
Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp Ser Val Lys Asn Asn Ser
85 90 95
Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe Leu Val Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Gln Asn Glu Asp Ser Glu Gln Ser Ile Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Ser
115 120 125
Asn Asn Ala Pro Gly Tyr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Val Thr Asn
130 135 140
Asn Met Met Gly Asn Met Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp
145 150 155 160
Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile
165 170 175
Thr Phe Glu Ile Asn Lys Ile Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp
180 185 190
Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys
195 200 205
Glu Leu Asp Gly Lys Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr
210 215 220
Thr Asn Val Val Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asn Lys
225 230 235 240
Glu Tyr Tyr Met Val Asn Ile Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Met Tyr Ala
245 250 255
Asn Ser Arg Gln Ile Val Phe Asn Thr Arg Arg Asn Asn Asn Asp Phe
260 265 270
Asn Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg Ile Arg Gly Asn Thr Asn
275 280 285
Asp Thr Arg Val Arg Gly Gly Asp Ile Leu Tyr Phe Asp Met Thr Ile
290 295 300
Asn Asn Lys Ala Tyr Asn Leu Phe Met Lys Asn Glu Thr Met Tyr Ala
305 310 315 320
Asp Asn His Ser Thr Glu Asp Ile Tyr Ala Ile Gly Leu Arg Glu Gln
325 330 335
Thr Lys Asp Ile Asn Asp Asn Ile Ile Phe Gln Ile Gln Pro Met Asn
340 345 350
Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gln Ile Phe Lys Ser Asn Phe Asn Gly
355 360 365
Glu Asn Ile Ser Gly Ile Cys Ser Ile Gly Thr Tyr Arg Phe Arg Leu
370 375 380
Gly Gly Asp Trp Tyr Arg His Asn Tyr Leu Val Pro Thr Val Lys Gln
385 390 395 400
Gly Asn Tyr Ala Ser Leu Leu Glu Ser Thr Ser Thr His Trp Gly Phe
405 410 415
Val Pro Val Ser Glu
420
<210> 5
<211> 410
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 5
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln Leu Asn
20 25 30
Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp Lys Ile
35 40 45
Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr Glu Asn
50 55 60
Ser Ser Val Ser Phe Trp Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Thr Asn Ser
65 70 75 80
His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Glu Gln Asn Ser Gly Trp
85 90 95
Lys Leu Cys Ile Arg Asn Gly Asn Ile Glu Trp Ile Leu Gln Asp Val
100 105 110
Asn Arg Lys Tyr Lys Ser Leu Ile Phe Asp Tyr Ser Glu Ser Leu Ser
115 120 125
His Thr Gly Tyr Thr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn
130 135 140
Ile Met Gly Tyr Met Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Glu Leu Lys Gln Ser
145 150 155 160
Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp Lys Thr Ile Val
165 170 175
Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln Met Leu Trp Ile Arg
180 185 190
Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser Asn Glu Asp Ile Asn Ile
195 200 205
Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu Arg Asn Val Ile Lys Asp Tyr Trp Gly
210 215 220
Asn Pro Leu Lys Phe Asp Thr Glu Tyr Tyr Ile Ile Asn Asp Asn Tyr
225 230 235 240
Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Pro Glu Ser Asn Val Leu Val Leu Val Gln
245 250 255
Tyr Pro Asp Arg Ser Lys Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ile Lys
260 265 270
Ser Val Ser Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Arg Ile Leu Asn Gly Asp Asn
275 280 285
Ile Ile Leu His Met Leu Tyr Asn Ser Arg Lys Tyr Met Ile Ile Arg
290 295 300
Asp Thr Asp Thr Ile Tyr Ala Thr Gln Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn
305 310 315 320
Cys Val Tyr Ala Leu Lys Leu Gln Ser Asn Leu Gly Asn Tyr Gly Ile
325 330 335
Gly Ile Phe Ser Ile Lys Asn Ile Val Ser Lys Asn Lys Tyr Cys Ser
340 345 350
Gln Ile Phe Ser Ser Phe Arg Glu Asn Thr Met Leu Leu Ala Asp Ile
355 360 365
Tyr Lys Pro Trp Arg Phe Ser Phe Lys Asn Ala Tyr Thr Pro Val Ala
370 375 380
Val Thr Asn Tyr Glu Thr Lys Leu Leu Ser Thr Ser Ser Phe Trp Lys
385 390 395 400
Phe Ile Ser Arg Asp Pro Gly Trp Val Glu
405 410
<210> 6
<211> 419
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 6
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Thr Leu Met Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Glu Gly Asn Val Gln Leu Asn
20 25 30
Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly Ser Ser Gly Asp Asp Arg
35 40 45
Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn Ile Val Tyr Asn Ala Met
50 55 60
Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asn Lys Trp Val
65 70 75 80
Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp Ser Val Lys Asn Asn Ser
85 90 95
Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe Leu Val Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Gln Asn Glu Asn Ser Glu Gln Asp Ile Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Ser
115 120 125
Lys Asn Ala Ala Gly Tyr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Thr
130 135 140
Asn Met Met Gly Asn Met Met Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp
145 150 155 160
Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile
165 170 175
Thr Phe Gln Met Asn Lys Ile Pro Asn Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp
180 185 190
Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys
195 200 205
Glu Leu Asp Asp Lys Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr
210 215 220
Thr Asn Val Val Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asp Lys
225 230 235 240
Glu Tyr Tyr Met Ile Asn Val Asn Tyr Met Asn Arg Tyr Met Ser Lys
245 250 255
Lys Gly Asn Gly Ile Val Phe Asn Thr Arg Lys Asn Asn Asn Asp Phe
260 265 270
Asn Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg Ile Arg Gly Asn Thr Asn
275 280 285
Asp Thr Arg Val Arg Gly Glu Asn Val Leu Tyr Phe Asn Thr Thr Ile
290 295 300
Asp Asn Lys Gln Tyr Ser Leu Gly Met Tyr Lys Pro Ser Arg Asn Leu
305 310 315 320
Gly Thr Asp Leu Val Pro Leu Gly Ala Leu Asp Gln Pro Met Asp Glu
325 330 335
Ile Arg Lys Tyr Gly Ser Phe Ile Ile Gln Pro Cys Asn Thr Phe Asp
340 345 350
Tyr Tyr Ala Ser Gln Leu Phe Leu Ser Ser Asn Ala Thr Thr Asn Arg
355 360 365
Leu Gly Ile Leu Ser Ile Gly Ser Tyr Ser Phe Lys Leu Gly Asp Asp
370 375 380
Tyr Trp Phe Asn His Glu Tyr Leu Ile Pro Val Ile Lys Ile Glu His
385 390 395 400
Tyr Ala Ser Leu Leu Glu Ser Thr Ser Thr His Trp Val Phe Val Pro
405 410 415
Ala Ser Glu
<210> 7
<211> 403
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 7
Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr
20 25 30
Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu
35 40 45
Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys
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Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys
65 70 75 80
Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp
85 90 95
Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp
100 105 110
Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr
115 120 125
Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val
130 135 140
Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly
145 150 155 160
Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His Val
165 170 175
Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg Tyr
180 185 190
Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Val Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu Thr
195 200 205
Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr Asn Ile Leu Lys
210 215 220
Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr
245 250 255
Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu
260 265 270
Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr
275 280 285
Asn Asp Asn Leu Val Arg Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val
290 295 300
Ala Ser Lys Thr His Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr
305 310 315 320
Asn Lys Glu Lys Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn
325 330 335
Gln Val Val Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe
340 345 350
Lys Asn Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp
355 360 365
Thr Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr
370 375 380
Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp
385 390 395 400
Gln Glu Lys
<210> 8
<211> 410
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 8
Asn Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys Phe Ile Asp Ile
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asp Val Tyr Ile Tyr
20 25 30
Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Ser Ser Lys Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn Gly Arg Tyr Gln
50 55 60
Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys
65 70 75 80
Val Asn Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asp Cys Ile Arg Asn Asn
85 90 95
Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Asn Tyr Asn Lys Ile Ile Trp Thr
100 105 110
Leu Gln Asp Thr Ala Gly Asn Asn Gln Lys Leu Val Phe Asn Tyr Thr
115 120 125
Gln Met Ile Ser Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr
130 135 140
Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn
145 150 155 160
Leu Ile Asp Glu Lys Ser Ile Ser Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser
165 170 175
Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Gly Cys Asn Asp Thr Arg Tyr Val
180 185 190
Gly Ile Arg Tyr Phe Lys Val Phe Asp Thr Glu Leu Gly Lys Thr Glu
195 200 205
Ile Glu Thr Leu Tyr Ser Asp Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Arg Tyr Tyr Leu Leu Asn
225 230 235 240
Leu Leu Arg Thr Asp Lys Ser Ile Thr Gln Asn Ser Asn Phe Leu Asn
245 250 255
Ile Asn Gln Gln Arg Gly Val Tyr Gln Lys Pro Asn Ile Phe Ser Asn
260 265 270
Thr Arg Leu Tyr Thr Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Gly Ser
275 280 285
Thr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp Leu Ala
290 295 300
Tyr Ile Asn Val Val Asp Arg Asp Val Glu Tyr Arg Leu Tyr Ala Asp
305 310 315 320
Ile Ser Ile Ala Lys Pro Glu Lys Ile Ile Lys Leu Ile Arg Thr Ser
325 330 335
Asn Ser Asn Asn Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val Met Asp Ser Ile Gly
340 345 350
Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn Gly Gly Asn Ile Gly
355 360 365
Leu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Leu Val Ala Ser Ser Trp Tyr Tyr
370 375 380
Asn Asn Ile Arg Lys Asn Thr Ser Ser Asn Gly Cys Phe Trp Ser Phe
385 390 395 400
Ile Ser Lys Glu His Gly Trp Gln Glu Asn
405 410
<210> 9
<211> 430
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 9
Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu Ile Asp Ser
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val Ile Phe Asn
20 25 30
Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu Asn Ser Asn
35 40 45
Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser Met Phe Asp
50 55 60
Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr Asn Asn Asn
65 70 75 80
Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Ser Cys Ile
85 90 95
Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn Arg Ile Ile
100 105 110
Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile Phe Phe Glu
115 120 125
Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Phe Ser
130 135 140
Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn Ile Tyr Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn Leu Asp Arg Ile Asn
165 170 175
Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile Asn Cys Thr Asp Thr Thr
180 185 190
Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn
195 200 205
Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr
210 215 220
Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr
225 230 235 240
Leu Phe Asn Gln Gly Met Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys
245 250 255
Ala Ser Met Gly Glu Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala
260 265 270
Ile Asn Tyr Gln Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys
275 280 285
Ala Ser Asn Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly
290 295 300
Asp Tyr Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg
305 310 315 320
Val Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu
325 330 335
Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile Lys
340 345 350
Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys Glu Lys
355 360 365
Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe Val Lys Asp
370 375 380
Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe Cys Ile Ser Gln
385 390 395 400
Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn Lys Leu Arg Leu Gly
405 410 415
Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu Gly Trp Thr Glu
420 425 430
<210> 10
<211> 410
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 10
Val Leu Asn Leu Gly Ala Glu Asp Gly Lys Ile Lys Asp Leu Ser Gly
1 5 10 15
Thr Thr Ser Asp Ile Asn Ile Gly Ser Asp Ile Glu Leu Ala Asp Gly
20 25 30
Arg Glu Asn Lys Ala Ile Lys Ile Lys Gly Ser Glu Asn Ser Thr Ile
35 40 45
Lys Ile Ala Met Asn Lys Tyr Leu Arg Phe Ser Ala Thr Asp Asn Phe
50 55 60
Ser Ile Ser Phe Trp Ile Lys His Pro Lys Pro Thr Asn Leu Leu Asn
65 70 75 80
Asn Gly Ile Glu Tyr Thr Leu Val Glu Asn Phe Asn Gln Arg Gly Trp
85 90 95
Lys Ile Ser Ile Gln Asp Ser Lys Leu Ile Trp Tyr Leu Arg Asp His
100 105 110
Asn Asn Ser Ile Lys Ile Val Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Phe Asn Gly
115 120 125
Trp Asn Leu Ile Thr Ile Thr Asn Asn Arg Ser Lys Gly Ser Ile Val
130 135 140
Tyr Val Asn Gly Ser Lys Ile Glu Glu Lys Asp Ile Ser Ser Ile Trp
145 150 155 160
Asn Thr Glu Val Asp Asp Pro Ile Ile Phe Arg Leu Lys Asn Asn Arg
165 170 175
Asp Thr Gln Ala Phe Thr Leu Leu Asp Gln Phe Ser Ile Tyr Arg Lys
180 185 190
Glu Leu Asn Gln Asn Glu Val Val Lys Leu Tyr Asn Tyr Tyr Phe Asn
195 200 205
Ser Asn Tyr Ile Arg Asp Ile Trp Gly Asn Pro Leu Gln Tyr Asn Lys
210 215 220
Lys Tyr Tyr Leu Gln Thr Gln Asp Lys Pro Gly Lys Gly Leu Ile Arg
225 230 235 240
Glu Tyr Trp Ser Ser Phe Gly Tyr Asp Tyr Val Ile Leu Ser Asp Ser
245 250 255
Lys Thr Ile Thr Phe Pro Asn Asn Ile Arg Tyr Gly Ala Leu Tyr Asn
260 265 270
Gly Ser Lys Val Leu Ile Lys Asn Ser Lys Lys Leu Asp Gly Leu Val
275 280 285
Arg Asn Lys Asp Phe Ile Gln Leu Glu Ile Asp Gly Tyr Asn Met Gly
290 295 300
Ile Ser Ala Asp Arg Phe Asn Glu Asp Thr Asn Tyr Ile Gly Thr Thr
305 310 315 320
Tyr Gly Thr Thr His Asp Leu Thr Thr Asp Phe Glu Ile Ile Gln Arg
325 330 335
Gln Glu Lys Tyr Arg Asn Tyr Cys Gln Leu Lys Thr Pro Tyr Asn Ile
340 345 350
Phe His Lys Ser Gly Leu Met Ser Thr Glu Thr Ser Lys Pro Thr Phe
355 360 365
His Asp Tyr Arg Asp Trp Val Tyr Ser Ser Ala Trp Tyr Phe Gln Asn
370 375 380
Tyr Glu Asn Leu Asn Leu Arg Lys His Thr Lys Thr Asn Trp Tyr Phe
385 390 395 400
Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Asp Glu Asp
405 410
<210> 11
<211> 218
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 11
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
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Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
100 105 110
Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn
210 215
<210> 12
<211> 221
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 12
Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn
20 25 30
Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg
35 40 45
Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe
50 55 60
Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile
65 70 75 80
Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn
85 90 95
Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr
100 105 110
Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn
115 120 125
Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr
130 135 140
Ile Thr Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu
145 150 155 160
Glu Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly
165 170 175
Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile
180 185 190
Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn
195 200 205
Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr
210 215 220
<210> 13
<211> 226
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 13
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Arg Lys Asn Thr Leu Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Ser Glu Glu Gly Asp Val Gln Leu Asn
20 25 30
Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly Ser Ser Gly Glu Asp Arg
35 40 45
Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn Ile Val Tyr Asn Ser Met
50 55 60
Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asn Lys Trp Val
65 70 75 80
Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp Ser Val Lys Asn Asn Ser
85 90 95
Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe Leu Val Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Gln Asn Glu Asp Ser Glu Gln Ser Ile Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Ser
115 120 125
Asn Asn Ala Pro Gly Tyr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Val Thr Asn
130 135 140
Asn Met Met Gly Asn Met Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp
145 150 155 160
Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile
165 170 175
Thr Phe Glu Ile Asn Lys Ile Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp
180 185 190
Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys
195 200 205
Glu Leu Asp Gly Lys Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr
210 215 220
Thr Asn
225
<210> 14
<211> 215
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 14
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln Leu Asn
20 25 30
Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp Lys Ile
35 40 45
Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr Glu Asn
50 55 60
Ser Ser Val Ser Phe Trp Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Thr Asn Ser
65 70 75 80
His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Glu Gln Asn Ser Gly Trp
85 90 95
Lys Leu Cys Ile Arg Asn Gly Asn Ile Glu Trp Ile Leu Gln Asp Val
100 105 110
Asn Arg Lys Tyr Lys Ser Leu Ile Phe Asp Tyr Ser Glu Ser Leu Ser
115 120 125
His Thr Gly Tyr Thr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn
130 135 140
Ile Met Gly Tyr Met Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Glu Leu Lys Gln Ser
145 150 155 160
Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp Lys Thr Ile Val
165 170 175
Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln Met Leu Trp Ile Arg
180 185 190
Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser Asn Glu Asp Ile Asn Ile
195 200 205
Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu
210 215
<210> 15
<211> 226
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 15
Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Thr Leu Met Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Glu Gly Asn Val Gln Leu Asn
20 25 30
Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly Ser Ser Gly Asp Asp Arg
35 40 45
Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn Ile Val Tyr Asn Ala Met
50 55 60
Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asn Lys Trp Val
65 70 75 80
Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp Ser Val Lys Asn Asn Ser
85 90 95
Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe Leu Val Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Gln Asn Glu Asn Ser Glu Gln Asp Ile Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Ser
115 120 125
Lys Asn Ala Ala Gly Tyr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Thr
130 135 140
Asn Met Met Gly Asn Met Met Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp
145 150 155 160
Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile
165 170 175
Thr Phe Gln Met Asn Lys Ile Pro Asn Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp
180 185 190
Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys
195 200 205
Glu Leu Asp Asp Lys Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr
210 215 220
Thr Asn
225
<210> 16
<211> 221
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 16
Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr
20 25 30
Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu
35 40 45
Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys
50 55 60
Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys
65 70 75 80
Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp
85 90 95
Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp
100 105 110
Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr
115 120 125
Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val
130 135 140
Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly
145 150 155 160
Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His Val
165 170 175
Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg Tyr
180 185 190
Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Val Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu Thr
195 200 205
Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr Asn
210 215 220
<210> 17
<211> 218
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 17
Asn Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys Phe Ile Asp Ile
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asp Val Tyr Ile Tyr
20 25 30
Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Ser Ser Lys Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn Gly Arg Tyr Gln
50 55 60
Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys
65 70 75 80
Val Asn Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asp Cys Ile Arg Asn Asn
85 90 95
Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Asn Tyr Asn Lys Ile Ile Trp Thr
100 105 110
Leu Gln Asp Thr Ala Gly Asn Asn Gln Lys Leu Val Phe Asn Tyr Thr
115 120 125
Gln Met Ile Ser Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr
130 135 140
Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn
145 150 155 160
Leu Ile Asp Glu Lys Ser Ile Ser Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser
165 170 175
Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Gly Cys Asn Asp Thr Arg Tyr Val
180 185 190
Gly Ile Arg Tyr Phe Lys Val Phe Asp Thr Glu Leu Gly Lys Thr Glu
195 200 205
Ile Glu Thr Leu Tyr Ser Asp Glu Pro Asp
210 215
<210> 18
<211> 224
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 18
Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu Ile Asp Ser
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val Ile Phe Asn
20 25 30
Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu Asn Ser Asn
35 40 45
Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser Met Phe Asp
50 55 60
Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr Asn Asn Asn
65 70 75 80
Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Ser Cys Ile
85 90 95
Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn Arg Ile Ile
100 105 110
Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile Phe Phe Glu
115 120 125
Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Phe Ser
130 135 140
Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn Ile Tyr Ile Asn
145 150 155 160
Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn Leu Asp Arg Ile Asn
165 170 175
Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile Asn Cys Thr Asp Thr Thr
180 185 190
Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn
195 200 205
Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr
210 215 220
<210> 19
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 19
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Asp Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser
20 25 30
Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly
35 40 45
Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe
50 55 60
Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile
85 90 95
Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile
100 105 110
Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly
115 120 125
Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val
130 135 140
Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg
145 150 155 160
Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile
165 170 175
Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly
180 185 190
Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg
195 200 205
Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys
210 215 220
Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn
225 230 235 240
Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys
245 250 255
Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val
260 265 270
Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly
275 280 285
Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly
290 295 300
Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile
305 310 315 320
Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys
325 330 335
Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile
340 345 350
Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val
355 360 365
Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met
370 375 380
Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His
385 390 395 400
Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg
405 410 415
Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile
420 425 430
Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu Gln
435 440
<210> 20
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 20
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys
20 25 30
Asn Thr Leu Met Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Glu
35 40 45
Gly Asn Val Gln Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly
50 55 60
Ser Ser Gly Asp Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn
65 70 75 80
Ile Val Tyr Asn Ala Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile
85 90 95
Arg Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp
100 105 110
Ser Val Lys Asn Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe
115 120 125
Leu Val Phe Thr Leu Lys Gln Asn Glu Asn Ser Glu Gln Asp Ile Asn
130 135 140
Phe Ser Tyr Asp Ile Ser Lys Asn Ala Ala Gly Tyr Asn Lys Trp Phe
145 150 155 160
Phe Val Thr Ile Thr Thr Asn Met Met Gly Asn Met Met Ile Tyr Ile
165 170 175
Asn Gly Lys Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr Gly Ile
180 185 190
Asn Phe Ser Lys Thr Ile Thr Phe Gln Met Asn Lys Ile Pro Asn Thr
195 200 205
Gly Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met Trp Ile Arg Asp
210 215 220
Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Asp Lys Asp Ile Asn Ile Leu
225 230 235 240
Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val Lys Asp Tyr Trp Gly Asn
245 250 255
Asp Leu Arg Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Met Ile Asn Val Asn Tyr Met
260 265 270
Asn Arg Tyr Met Ser Lys Lys Gly Asn Gly Ile Val Phe Asn Thr Arg
275 280 285
Lys Asn Asn Asn Asp Phe Asn Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg
290 295 300
Ile Arg Gly Asn Thr Asn Asp Thr Arg Val Arg Gly Glu Asn Val Leu
305 310 315 320
Tyr Phe Asn Thr Thr Ile Asp Asn Lys Gln Tyr Ser Leu Gly Met Tyr
325 330 335
Lys Pro Ser Arg Asn Leu Gly Thr Asp Leu Val Pro Leu Gly Ala Leu
340 345 350
Asp Gln Pro Met Asp Glu Ile Arg Lys Tyr Gly Ser Phe Ile Ile Gln
355 360 365
Pro Cys Asn Thr Phe Asp Tyr Tyr Ala Ser Gln Leu Phe Leu Ser Ser
370 375 380
Asn Ala Thr Thr Asn Arg Leu Gly Ile Leu Ser Ile Gly Ser Tyr Ser
385 390 395 400
Phe Lys Leu Gly Asp Asp Tyr Trp Phe Asn His Glu Tyr Leu Ile Pro
405 410 415
Val Ile Lys Ile Glu His Tyr Ala Ser Leu Leu Glu Ser Thr Ser Thr
420 425 430
His Trp Val Phe Val Pro Ala Ser Glu Gln
435 440
<210> 21
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 21
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Asp Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser
20 25 30
Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly
35 40 45
Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe
50 55 60
Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile
85 90 95
Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile
100 105 110
Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly
115 120 125
Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val
130 135 140
Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg
145 150 155 160
Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile
165 170 175
Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly
180 185 190
Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg
195 200 205
Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys
210 215 220
Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn
225 230 235 240
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注意="人工序列的描述: 合成多肽"
<400> 23
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 24
His Glu Leu Ile His
1 5
<210> 25
<211> 421
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 25
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
85 90 95
Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
100 105 110
Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn
225 230 235 240
Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg
245 250 255
Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Ala Ala Asn
260 265 270
Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys
275 280 285
Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg
290 295 300
Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr
305 310 315 320
Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile
325 330 335
Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn
340 345 350
Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn
355 360 365
Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala
370 375 380
Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser
385 390 395 400
Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp
405 410 415
Gly Glu Arg Pro Leu
420
<210> 26
<211> 421
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 26
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
85 90 95
Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
100 105 110
Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn
225 230 235 240
Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg
245 250 255
Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn
260 265 270
Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys
275 280 285
Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg
290 295 300
Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr
305 310 315 320
Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile
325 330 335
Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn
340 345 350
Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn
355 360 365
Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala
370 375 380
Lys Leu Val Ala Ser Asn Leu Ser Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser
385 390 395 400
Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp
405 410 415
Gly Glu Arg Pro Leu
420
<210> 27
<211> 421
<212> PRT
<213> 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）
<400> 27
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
85 90 95
Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
100 105 110
Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn
225 230 235 240
Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg
245 250 255
Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn
260 265 270
Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys
275 280 285
Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg
290 295 300
Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr
305 310 315 320
Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile
325 330 335
Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn
340 345 350
Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn
355 360 365
Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala
370 375 380
Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser
385 390 395 400
Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp
405 410 415
Arg Glu Arg Pro Leu
420

Claims (37)

1.一种多肽，其包含：
与肉毒杆菌毒素的结合结构域中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间。
2.一种多肽，其包含：
与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽，其中所述多肽的分子量在约10kDa至约60kD之间或在约12kDa至约50kD之间。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中所述肉毒杆菌毒素选自：肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)、肉毒杆菌毒素B血清型(BoNT/B)、肉毒杆菌毒素C1血清型(BoNT/C1)、肉毒杆菌毒素D血清型(BoNT/D)、肉毒杆菌毒素E血清型(BoNT/E)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/F)、肉毒杆菌毒素F血清型(BoNT/FA)、肉毒杆菌毒素G血清型(BoNT/G)、肉毒杆菌毒素H血清型(BoNT/H)、肉毒杆菌D/C嵌合(BoNT/DC)、肉毒杆菌C/D嵌合(BoNT/CD)、肉毒杆菌毒素X血清型(BoNT/X)或肠球菌属种BoNT/J(eBoNT/J)。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中所述肉毒杆菌毒素不是肉毒杆菌毒素A血清型(BoNT/A)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述结合结构域包含肉毒杆菌毒素的重链的结合结构域区域(HC)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述结合结构域包含肉毒杆菌毒素的重链的结合结构域区域的氨基端(HCN)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够调节包括选自FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7和TP63的多种基因的遗传特征的表达。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够调节选自FGFR1、MMP1、MMP3、TIMP1、FGF7、TP63、SOD2、UBD、HAS2、HAS3、ADAMTS1、IGF-1、IL-6、IL-32、CCL2和BDKRB1的多种基因的表达。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够提高靶细胞中纤连蛋白的表达或合成。
11.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够提高选自成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、皮脂腺细胞、免疫细胞或神经元的靶细胞中纤连蛋白的表达或合成。
12.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够改变靶细胞的形态或功能特征。
13.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有经修饰的肉毒杆菌毒素内肽酶活性或缺乏肉毒杆菌毒素内肽酶活性。
14.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽缺乏包含重链的氨基端(HN)的肉毒杆菌毒素易位结构域。
15.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID No:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:12-18和SEQ ID NO:25-27的序列具有至少30％同源性的氨基酸序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽与选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID No:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:12-18和SEQ ID NO:25-27的序列具有至少约90％序列同一性。
17.一种融合蛋白，其包含权利要求1-16中任一项的多肽。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项的多肽或权利要求17的融合蛋白和药学上可接受的载体。
19.一种局部或透皮药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项的多肽或权利要求17的融合蛋白和用于其局部或透皮递送的可接受的载体。
20.一种试剂盒，其在一个或多个包装中包含权利要求1-16中任一项的多肽或权利要求17的融合蛋白和施用说明书。
21.一种用于调节受试者中皮肤质量属性的方法，其包括：
给受试者施用包含有效量的具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物，其中所述多肽的分子量在约4kDa至约60kDa之间，以及其中调节皮肤质量属性不涉及面部肌肉的麻痹。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述皮肤质量属性选自：透明度、水合作用、表皮和真皮厚度、纹理、弹性、色泽、色调、柔韧性、紧实度、紧致度、光滑度、厚度、光泽、均匀度、松弛度、肤色、更少细纹、更少皱纹和减少的油性；并且所述调节产生至少约20％的属性改善。
23.一种刺激受试者中胶原蛋白产生的方法，包括：
给受试者施用包含具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物，其中所述多肽的分子量在约4kDa至约60kDa之间，以及其中所述施用不引起肌肉麻痹。
24.一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量在约1kDa至约90kDa之间；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
25.一种多核苷酸，其选自：
(a)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的cDNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；
(b)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的合成DNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；
(c)编码包含肉毒杆菌毒素的结合结构域的多肽的密码子优化的DNA，其中所述多肽的分子量小于50kDa；以及
(d)与(a)-(c)中任一项的DNA互补的DNA。
26.一种多核苷酸，其与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:7-10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:12-18和SEQ ID NO:25-27的核酸具有至少50％序列同源性。
27.一种载体，其包含权利要求24、权利要求25或权利要求26的多核苷酸。
28.一种宿主细胞，其包含权利要求27的载体。
29.根据权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞不是肉毒梭菌。
30.一种试剂盒，其在一个或多个包装中包含权利要求27的载体和用于在合适的宿主细胞中表达所述多核苷酸的说明书。
31.一种组合物，其包含：权利要求27的载体或权利要求28的宿主细胞或权利要求29的宿主细胞和药用赋形剂。
32.一种改善皮肤质量属性的方法，其包括：给受试者施用权利要求31的组合物以实现多肽的表达。
33.一种用于调节受试者中皮肤油性或干性的方法，其包括：
给受试者施用包含有效量的具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物，其中所述多肽的分子量在约4kDa至约60kDa之间，以及其中调节皮肤油性或干性不涉及面部肌肉的麻痹。
34.一种用于调节受试者中皮脂产生和/或皮脂组成的方法，其包括：
给受试者施用包含有效量的具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物，其中所述多肽的分子量在约4kDa至约60kDa之间，以及其中调节皮脂产生和/或皮脂组成不涉及面部肌肉的麻痹。
35.一种用于治疗与受试者的皮脂失调或异常有关的感染的方法，其包括：
给受试者施用包含有效量的具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物，其中所述多肽的分子量在约4kDa至约60kDa之间，以及其中治疗与皮脂失调和/或异常有关的感染不涉及面部肌肉的麻痹。
36.一种用于治疗与受试者的皮脂失调和/或异常有关的皮肤障碍的方法，其包括：
给受试者施用包含有效量的具有与肉毒杆菌毒素的结合结构域具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的组合物，其中所述多肽的分子量在约4kDa至约60kDa之间，以及其中治疗与皮脂异常和/或失调有关的皮肤障碍不涉及面部肌肉的麻痹。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述皮肤障碍选自痤疮、脂溢性皮炎、红斑、酒渣鼻、牛皮癣、过敏性皮肤炎(AD)、脱发、白癜风、过敏、感染和炎症。
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