RU2800604C2

RU2800604C2 - Терапевтическое и косметическое применение нейротоксина ботулина серотипа e

Info

Publication number: RU2800604C2
Application number: RU2021111910A
Authority: RU
Inventors: Лоран ПОН
Original assignee: Ипсен Биофарм Лимитед
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2023-07-25

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены способы лечения расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E (BoNT/E), а также косметические способы для подавления морщин в верхней части лица, где способы включают введение BoNT/E субъекту-человеку в дозе от 0,04 до 4 нг, где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки. Изобретения позволяют достигнуть максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения BoNT/E и снижают до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения BoNT/E, что приводит к эффективному лечению расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E. 6 н. и 25 з.п. ф-лы, 14 ил., 4 табл., 6 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к клостридиальным нейротоксинам и их терапевтическому и косметическому применению.

Бактерии рода Clostridia продуцируют сильнодействующие и специфические белковые токсины, которые могут отравлять нейроны и другие клетки, в которые они попадают. Примеры таких клостридиальных токсинов включают нейротоксины, продуцируемые C. tetani (TeNT) и C. botulinum (BoNT) серотипами A-G, и X (см. WO 2018/009903 A2), а также токсины, продуцируемые C. baratii и C. butyricum.

Среди клостридиальных нейротоксинов находятся одни из самых сильных известных токсинов. Например, нейротоксины ботулина имеют значения средней летальной дозы (LD₅₀) для мышей в диапазоне от 0,5 до 5 нг/кг в зависимости от серотипа. И столбнячный и ботулотоксины действуют, ингибируя функцию пораженных нейронов, в частности высвобождение нейромедиаторов. В то время как ботулотоксин действует на нервно-мышечные соединения и подавляет холинергическую передачу в периферической нервной системе, столбнячный токсин действует в центральной нервной системе.

В природе клостридиальные нейротоксины синтезируются в виде одноцепочечного полипептида, который посттрансляционно модифицируется в результате протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью. Расщепление происходит в определенном сайте расщепления, часто называемом сайтом активации, который расположен между цистеиновыми остатками, которые обеспечивают межцепочечную дисульфидную связь. Именно эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (Н-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. H-цепь содержит N-концевой компонент транслокации (H_N домен) и C-концевой таргетирующий компонент (H_C домен). Сайт расщепления расположен между L-цепью и компонентами домена транслокации. После связывания H_C домена с его таргетным нейроном и интернализации связанного токсина в клетку через эндосому, H_N домен транслоцирует L-цепь через эндосомальную мембрану в цитозоль, и L-цепь выполняет функцию протеазы (также известной как не цитотоксическая протеаза).

Не цитотоксические протеазы действуют через протеолитическое расщепляющие внутриклеточные транспортные белки, известный как SNARE белки (например, SNAP-25, VAMP или Syntaxin) - см. Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology” (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Акроним SNARE получен из термина Растворимый Рецептор Присоединения NSF, где NSF означает N-этилмалеимид-Чувствительнй Фактор. Белки SNARE являются неотъемлемой частью слияния внутриклеточных везикул и, следовательно, секреции молекул посредством транспорта везикул из клетки. Функция протеазы заключается в активности цинк-зависимой эндопептидазы и проявляет высокую субстратную специфичность для белков SNARE. Соответственно, после доставки в желаемую клетку-мишень, не цитотоксическая протеаза способна ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени. L-цепные протеазы клостридиальных нейротоксинов представляют собой не цитотоксические протеазы, которые расщепляют белки SNARE.

Ботулинические нейротоксины хорошо известны своей способностью вызывать паралич вялых мышц. Указанные миорелаксирующие свойства приводят к использованию ботулинических нейротоксинов (таких как BoNT/A) в различных медицинских и косметических процедурах, включая лечение межбровных морщин или гиперкинетических мимических морщин, головной боли, гемифациального спазма, гиперактивности мочевого пузыря, гипергидроза, носогубных складок, цервикальной дистонии, блефароспазма и спастичности.

Однако BoNT/A ассоциируется с длительным эффектом (например, >6 месяцев), что невыгодно в определенных терапевтических или косметических ситуациях. Таким образом, остается потребность в альтернативном терапевтическом препарате, обладающем фармакодинамическими свойствами, отличными от BoNT/A.

Настоящее изобретение решает одну или несколько из вышеупомянутых проблем.

Авторы настоящего изобретения первыми определили фармакодинамические свойства BoNT/E (например, BoNT/E, лишенного каких-либо комплексообразующих белков, которые присутствуют в естественном BoNT/E) при введении человеку. Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что BoNT/E имеет фармакодинамические свойства, отличные от BoNT/A, включая короткое время для достижения максимального ингибирования высвобождения нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени и короткую продолжительность эффекта (например, <150 дней после введения).

Хотя BoNT/E был протестирован в системах in vitro и на моделях животных, не относящихся к человеку (например, на мышах), предыдущие исследования, проведенные с существующим в природе закомплексованным BoNT/E, не подходят для прогнозирования фармакодинамических свойств незакомплексованного (например, рекомбинантного) BoNT/E, поскольку известно, что эти разные формы BoNT ведут себя по-разному in vivo. Например, закомплексованные и незакомплексованные формы BoNT демонстрируют значительно отличающийся ответ клетки-хозяина в нервных клетках человека.

На основании открытий авторов настоящего изобретения можно определить подходящее клиническое применение BoNT/E для достижения терапевтического эффекта у человека.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение представляет ботулинический нейротоксин серотипа E (BoNT/E) для применения в лечении расстройства. Связанные с этим аспекты включают способ лечения расстройства и применение BoNT/E в производстве лекарственного средства для лечения расстройства, где BoNT/E вводят субъекту-человеку.

В одном аспекте представлен ботулинический нейротоксин серотипа E (BoNT/E) для применения в лечении расстройства, BoNT/E вводят субъекту-человеку, и представлено максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и (где ингибирование секреции нейромедиатора) снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения.

В другом аспекте представлен способ лечения расстройства, где способ включает введение BoNT/E субъекту-человеку, и где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и (где ингибирование секреции нейромедиатора) снижается до >25% ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения.

В другом аспекте представлен косметический способ, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку, где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и (где ингибирование секреции нейромедиатора) снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения.

В еще одном аспекте представлено применение BoNT/E в производстве лекарственного средства для лечения расстройства, где BoNT/E вводят субъекту-человеку и это дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и (где ингибирование секреции нейромедиатора) снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения.

BoNT/E предпочтительно имеет не закомплексованную форму (т.е. не содержит комплексообразующие белки, которые присутствуют в существующих в природе BoNT/E). Примеры таких комплексообразующих белков включают нейротоксин-ассоциированные белки (NAP) и не токсический не гемагглютининовый компонент (NTNH).

Одним из преимуществ BoNT/E в незакомплексованной форме является то, что общая масса белкового содержимого предоставляет самим нейротоксином (BoNT/E). Таким образом, введение, например, 5 нг BoNT/E в незакомплексованной форме обычно соответствует введению 5 нг BoNT/E нейротоксина. Наоборот, введение, например 5 нг BoNT/E в закомплексованной форме (предпочтительно, где общая масса белкового содержания определяется абсорбцией при A280, или, например, анализом Брэдфорда) будет включать комплексообразующие белки и даст пониженное (т.е. менее 5 нг) введение BoNT/E.

BoNT/E в не закомплексованной форме (как описано выше) обычно содержит менее 50 пикограммов (пг) комплексного белка на 100 нанограммов (нг) BoNT/E белка; например, менее 20 пг комплексного белка на 100 нг BoNT/E белка. В одном варианте осуществления, BoNT/E в не закомплексованной форме содержит менее 10 пг комплексного белка на 100 нг BoNT/E белка, например, менее 5 пг комплексного белка на 100 нг BoNT/E белка.

BoNT/E по настоящему изобретению предпочтительно является рекомбинантным BoNT/E (и поэтому не содержит комплексные белки).

Термин «лечить» или «лечение» в настоящем описании охватывает профилактическое лечение (например, для предотвращения начала заболевания), а также корректирующее лечение (лечение субъекта, уже страдающего заболеванием). Предпочтительно «лечить» или «лечение» в настоящем описании означает корректирующее лечение. Термин «лечить» или «лечение» включает лечение как заболевания, так и его симптома. В некоторых вариантах осуществления, «лечить» или «лечение» относится к симптому заболевания.

Поэтому BoNT/E может вводиться субъекту-человеку в терапевтически эффективном количестве или профилактически эффективном количестве.

«Терапевтически эффективным количеством» является любое количество BoNT/E, которое при введении отдельно или в комбинации субъекту-человеку для лечения заболевания (или его симптома) является достаточным для осуществления такого лечения заболевания или его симптома.

«Профилактически эффективным количеством» является любое количество BoNT/E, которое при введении отдельно или в комбинации субъекту-человеку ингибирует или задерживает начало или рецидив заболевания (или его симптома). В некоторых вариантах осуществления, профилактически эффективное количество полностью предотвращает начало или рецидив заболевания. «Ингибирование» начала означает либо уменьшение вероятности возникновения заболевания (или его симптомов), либо полное предотвращение начала.

Термин «ингибирование высвобождения нейромедиатора из ткани» может означать ингибирование высвобождения нейромедиатора из нерва в указанной ткани.

Настоящее изобретение дополнительно представляет косметический способ, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку.

BoNT/E может быть введен субъекту-человеку любым способом, подходящим для достижения желаемого терапевтического эффекта. В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят парентерально. Такое введение может осуществляться посредством локальной инъекции. В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят подкожной инъекцией, внутрикожной инъекцией и/или внутримышечной инъекцией. Предпочтительно, BoNT/E вводят внутримышечно, например, внутримышечной инъекцией.

Общая доза BoNT/E, вводимая субъекту-человеку, обычно составляет не менее 0,03 нг и обычно не более 50 нг. Например, в некоторых вариантах осуществления, общая вводимая доза BoNT/E составляет приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40 или 50 нг.

Термин «общая доза» означает абсолютное количество (выраженное в граммах или нанограммах) BoNT/E, вводимое пациенту за схему лечения. Например, ссылка на общую дозу BoNT/E в 5 нг означает, что 5 нг BoNT/E вводят пациенту-человеку и завершают схему лечения для этого пациента.

Общая доза может быть введена посредством одной или нескольких стадий введения, составляющих часть одной и той же схемы лечения. Например, общая доза 5 нг может быть введена первым введением 2 нг BoNT/E и вторым введением 3 нг BoNT/E.

Предпочтительно, чтобы общая доза вводилась за одну стадию введения.

Общая доза введенного BoNT/E обычно составляет менее 50 нг, например, менее 40, 30, 20 или 10 нг.

Одно из преимуществ по настоящему изобретению состоит в том, что оно обеспечивает быстрое начало действия (например, ингибирование высвобождения нейромедиатора). Это очень желательно по многим клиническим и косметическим показаниям. Отдельное преимущество по настоящему изобретению состоит в том, что по существу предотвращается локальная диффузия BoNT/E в соседние мышцы (т.е. не наблюдается заметного эффекта).

Таким образом, согласно настоящему изобретению BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает, по меньшей мере, 15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 1 день или меньше, предпочтительно, менее чем за 15 часов, после введения. Например, BoNT/E вводят и он (например, в такой дозе) обеспечивает, по меньшей мере, 20% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 1 день или меньше, предпочтительно меньше чем через 15 часов после введения.

В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает >20%, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, или >80% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения. Например, BoNT/E предпочтительно вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения. BoNT/E может вводиться (например, в дозе, которая) обеспечивает >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14-49 день после введения.

В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает 40-95% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13, ≤12, ≤11, ≤10, ≤9, ≤8 или ≤7 дней после введения. Например, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает 40-60% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13, ≤12, ≤11, ≤10, ≤9, ≤8 или ≤7 дней после введения.

В одном варианте осуществления BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает 40-95% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤6 дней после введения. Например, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает 40-60% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤6 дней после введения.

В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят субъекту-человеку (например, в дозе, которая) обеспечивает, по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения, предпочтительно, ≤6 дней. Например, BoNT/E вводят субъекту-человеку (например, в дозе, которая) обеспечивает, по меньшей мере, 50% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения, предпочтительно, ≤6 дней.

В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение 15 дней или менее, предпочтительно, в течение 10 дней или менее, более предпочтительно, в течение 7 дней или менее после введения.

Другим преимуществом по настоящему изобретению является то, что оно также обеспечивает быстрое отклонение (т.е. после максимального ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени) относительно действия BoNT/A. Это крайне желательно для многих клинических показаний.

Согласно настоящему изобретению, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает:

по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 (предпочтительно, ≤12 или ≤10) дней после введения; и

снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >21 - <100 дней после введения.

Например, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает:

по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и

снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >21 - <80 дней после введения.

В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает:

снижает 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >40 - <100 дней после введения.

Например, BoNT/E вводят субъекту-человеку (например, в дозе, которая) обеспечивает:

снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >40 - <80 дней после введения.

Ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени (предпочтительно, из ткани-мишени) может оцениваться обычными методиками, известными специалисту в данной области техники. В одном варианте осуществления “% ингибирования секреции нейромедиатора” в настоящем документе соответствует % ингибирования мышечного потенциала действия (например, электрический вызванный ответ мышцы, CMAP). Ингибирование мышечного потенциала действия может быть оценено с применением стандартных методов. Например, потенциал действия стимулированной мышцы может быть измерен до и после введения BoNT/E с применением электродов для определения % ингибирования. Например, электроды могут применяться в электрофизиологических исследованиях для измерения потенциала действия (вызванного из-за секреции нейромедиатора) в ткани, и определения % ингибирования потенциала действия (соответствующего % ингибирования выделения нейромедиатора).

Таким образом, в одном варианте осуществления, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени измеряется с помощью электрофизиологии. Например, % ингибирования потенциала действия (измеренный электрофизиологией) может быть измерен, предоставляя значение % ингибирования секреции нейромедиатора.

Ключевым преимуществом использования электрофизиологии для измерения % ингибирования секреции нейромедиатора является то, что может быть использован стандартизированный подход с предоставлением объективных результатов. Это контрастирует с субъективными способами измерения % ингибирования секреции нейромедиатора, такими как определение % ингибирования на основе ручной/человеческой (например, практикующим врачом) оценки ответа на лечение, например ручной оценки уровня мышечной спастичности или морщин на лице, после лечения. Результаты таких субъективных способов часто отличаются высокой степенью изменчивости и, следовательно, не обладают точностью и надежностью объективных способов.

“% Ингибирования секреции нейромедиатора” может соответствовать % ингибирования, измеренному в поверхностной ткани, которая особенно доступна для электрофизиологических исследований, например, мышца короткий разгибатель пальца (EDB). Путем измерения % ингибирования секреции нейромедиатора в такой поверхностной ткани могут быть получены более точные/надежные показания (по сравнению с измерением в менее поверхностной ткани), которые могут быть успешно экстраполированы на % ингибирования секреции нейромедиатора в альтернативной ткани (таргетированной для терапевтических или косметических целей).

Оценка указанного «% ингибирования секреции нейромедиатора» продемонстрирована ссылкой на прилагаемые Примеры, Материалы и Методы, и может быть оценена с использованием методологии, описанной в настоящем документе (например, фармакодинамической модели, описанная в настоящем документе).

В одном варианте осуществления нейромедиатором является ацетилхолин.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что BoNT/E может вводиться (например, в дозе, которая) обеспечивает быстрое наступление ингибирования секреции нейромедиатора, и последующее постепенное (по существу линейное) восстановление секреции нейромедиатора (после максимального ингибировании). Такое постепенное восстановление предпочтительно может быть дозозависимым, и было продемонстрировано авторами настоящего изобретения для доз в интервале от 0,04 нг до приблизительно 4,0 нг.

Таким образом, настоящее изобретение преимущественно представляет общую дозу BoNT/E, которая обеспечивает прогнозируемое, по существу линейное снижение «% ингибирования секреции нейромедиатора» (после максимального ингибирования) у субъекта-человека, так что ответ субъекта на лечение может быть спрогнозирован вплоть до 100 дней после введения (см. фигуру 12). Например, если BoNT/E подавляет симптом расстройства, можно спрогнозировать, в какой момент времени симптом может начать повторяться, вместе с прогнозированием серьезности повторяющегося симптома в данный момент времени.

Таким образом, в одном варианте осуществления BoNT/E вводят (например, в дозе), обеспечивающей по существу линейное снижение «% ингибирования секреции нейромедиатора» после максимального ингибирования.

Термин “по существу линейное” означает, что профиль (график) значений “% ингибирования секреции нейромедиатора” может соответствовать линейной кривой (Microsoft Excel 2010, Microsoft Corporation), имеющей величину достоверности аппроксимации >0,8. В одном варианте осуществления, указанная величина достоверности аппроксимации составляет >0,85, >0,9 или >0,95. Предпочтительно, указанная величина достоверности аппроксимации может быть >0,9. Более предпочтительно, указанная величина достоверности аппроксимации может быть >0,95.

В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает по существу линейное снижение в “% ингибирование секреции нейромедиатора” после максимального ингибирования, где указанное по существу линейное снижение происходит в течение 10-56, 10-42 и/или 10-21 дней после введения.

Предпочтительно, Указанный профиль в течение 10-56, 10-42 и/или 10-21 дней после введения представляет “смещение” BoNT/E эффекта (ингибирование секреции нейромедиатора) после максимального ингибирования секреции нейромедиатора.

В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13, ≤12, ≤11, ≤10, ≤9, ≤8, ≤7 или ≤6 дней (предпочтительно, ≤6 дней) после введения, и последующее снижение % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 1-10% в день.

Указанное максимальное ингибирование (% ингибирования секреции нейромедиатора) может составлять ≥40%, ≥60%, ≥75% или ≥80% (например, ≥85%). Предпочтительно, указанное максимальное ингибирование составляет >80%.

В одном варианте осуществления, указанное максимальное ингибирование (% ингибирования секреции нейромедиатора) составляет ≥95%.

% Ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени обычно снижается на примерно 2-10% в день после максимального ингибирования.

Например, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается на примерно 1-4%, примерно 4-6%, примерно6-8% или примерно 8-10% в день в течение каждого дня после максимального ингибирования. Предпочтительно, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается на примерно 1-4% в течение каждого дня после максимального ингибирования

% Ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени обычно снижается на примерно 1-4% каждый день от дня 10-21, от дня 6-42, от дня 10-42, от дня 10-49 и/или от дня 10-56 после введения.

Для удобства, снижение % ингибирования секреции нейромедиатора может быть рассчитано как среднее снижение в рассматриваемый период времени, например от дня 10-24, от дня 6-42, от дня 10-42, от дня 10-49 и/или от дня 10-56 после введения.

% Ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени может снижаться на примерно 1-30% в неделю в течение каждой недели после максимального ингибирования. Например, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается на примерно 1-28%, 2-28%, примерно 2-22%, примерно 4-16%, примерно 9-18%, примерно 14-16% или примерно 9-12% в неделю в течение каждой недели после максимального ингибирования.

В одном варианте осуществления, % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается на примерно 9-17% каждую неделю от недели 1-3, недели 1-6 и/или от недели 2-6 после введения.

Для удобства, снижение % ингибирования секреции нейромедиатора может быть рассчитано как среднее снижение в рассматриваемый период времени, например от недели 1-6, от недели 2-6, и/или недели 1-3 после введения.

В одном варианте осуществления, указанное максимальное ингибирование (% ингибирование секреции нейромедиатора) составляет ≥95%.

% Ингибирования секреции нейромедиатора может иметь плато после указанного по существу линейного снижения “% ингибирования секреции нейромедиатора”.

В одном варианте осуществления BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает от примерно 10%-40% (предпочтительно, примерно 15%-40%) ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >49 до <100 дней, или от >49 до <90 дней после введения. В одном варианте осуществления BoNT/E вводят (например, в дозе, которая) обеспечивает от примерно 10%-40% (предпочтительно, примерно 15%-40%) ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >42 до <100 дней, или от >42 до <90 дней после введения.

При применении, общая вводимая доза BoNT/E составляет обычно менее 10 нг, например, в диапазоне от 0,04 до 5 нг. В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,5-5 нг (например, 0,9 нг или 3,6 нг). В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,1-0,5 нг (например, 0,2 нг). В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 1-5 нг (например, 3,6 нг). В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,5-2 нг (например, 0,9 нг).

В одном варианте осуществления BoNT/E вводят в дозе 0,5-5 нг (например, 0,9 нг или 3,6 нг), которая обеспечивает:

по меньшей мере, 85% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 7 дней после введения; и/или

по меньшей мере, 80% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 14 дней после введения; и/или

по меньшей мере, 70% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 21 день после введения; и/или

по меньшей мере, 50% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 28 дней после введения; и/или

по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 35 дней после введения; и/или

по меньшей мере, 30% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 42 дня после введения; и/или

по меньшей мере, 25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 49 дней после введения.

Например, BoNT/E вводят в дозе 0,5-5 нг (например, 0,9 нг или 3,6 нг), которая обеспечивает:

по меньшей мере, 15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 56 дней после введения; и/или

≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 63 дня после введения.

В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,1 -0,5 нг (например, 0,2 нг), которая обеспечивает:

по меньшей мере, 65% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 7 дней после введения; и/или

по меньшей мере, 65% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 14 дней после введения; и/или

по меньшей мере, 50% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 21 день после введения; и/или

по меньшей мере, 30% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 28 дней после введения; и/или

по меньшей мере, 30% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 35 дней после введения; и/или

≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени за 42 дня после введения.

В одном варианте осуществления BoNT/E вводят в дозе 1-5 нг (например, 3,6 нг), которая обеспечивает:

по меньшей мере, 85% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от примерно >3 до ≤13 дней после введения; и/или

примерно 80%-90% (предпочтительно, примерно 84%-86%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >17 до <19 дней после введения; и/или

примерно 70%-80% (предпочтительно, примерно 74%-76%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >20 до <22 дней после введения; и/или

примерно 55%-65% (предпочтительно, примерно 60%-64%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >23 до <26 дней после введения; и/или

примерно 50%-60% (предпочтительно, примерно 54%-56%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >27 до <29 дней после введения; и/или

примерно 35%-45% (предпочтительно, примерно 43%-44%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >34 до <36 дней после введения; и/или

примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 34%-36%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >41 до <43 дней после введения; и/или

примерно 25%-35% (предпочтительно, примерно 29%-31%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >48 до <50 дней после введения; и/или

примерно 10%-20% (предпочтительно, примерно 15%-17%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >55 до <57 дней после введения; и/или

примерно 7%-17% (предпочтительно, примерно 13%-15%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >62 до <64 дней после введения; и/или

≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >75 дней после введения.

В другом варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,5-2 нг (например, 0,9 нг), которая обеспечивает:

по меньшей мере, 85% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >3 до ≤13 дней после введения; и/или

примерно 70%-80% (предпочтительно, примерно 77%-79%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >17 до <19 дней после введения; и/или

примерно 65%-75% (предпочтительно, примерно 71%-73%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >20 до <22 дней после введения; и/или

примерно 60%-70% (предпочтительно, примерно 65%-67%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >23 до <26 дней после введения; и/или

примерно 55%-65% (предпочтительно, примерно 58%-60%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >27 до <29 дней после введения; и/или

примерно 45%-55% (предпочтительно, примерно 50%-52%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >34 до <36 дней после введения; и/или

примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 34%-37%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >41 до <43 дней после введения; и/или

примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 33%-35% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >48 до <50 дней после введения; и/или

примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 35%-37%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >55 до <57 дней после введения; и/или

примерно 20%-30% (предпочтительно, примерно 22%-27%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >62 до <64 дней после введения; и/или

≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >75 дней (например, >85 дней) после введения.

В одном варианте осуществления BoNT/E вводят в дозе 0,1-0,5 нг (например, 0,2 нг), которая обеспечивает:

по меньшей мере, 70% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >3 до ≤13 дней после введения; и/или

примерно 47%-57% (предпочтительно, примерно 52-54%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >17 до <19 дней после введения; и/или

примерно 45%-55% (предпочтительно, примерно 50%-52%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >20 до <22 дней после введения; и/или

примерно 25%-35% (предпочтительно, примерно 29%-31%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >23 до <26 дней после введения; и/или

примерно 25%-35% (предпочтительно, примерно 31%-33%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >27 до <29 дней после введения; и/или

примерно 25%-35% (предпочтительно, примерно 30%-33%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >34 до <36 дней после введения; и/или

примерно 1%-10% (предпочтительно, примерно 4%-6%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >41 до <43 дней после введения; и/или

≤15% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение >48 дней после введения.

В некоторых вариантах осуществления, предпочтительно, чтобы общая введенная доза BoNT/E составляла <0,2 нг, например 0,04-0,15 нг (или 0,01-0,04 нг). Преимущественно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение меньших доз BoNT/E (<0,2 нг) дает, по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени. Такие меньшие дозы связаны с хорошим максимальным ингибированием секреции нейромедиатора (например, по меньшей мере, 40% или 50% ингибированием), намного более короткой длительностью эффекта и/или связаны с подобным временем до максимального эффекта. Этот последний момент является неожиданным и прямо контрастирует с BoNT, содержащими комплексные белки (например, BoNT/A, содержащими комплексные белки), в которых время до достижения максимального ингибирования намного короче при введении более высокой дозы (например, дозы ≥0,2 нг). Например, авторы данного изобретения обнаружили, что всего лишь 0,04 нг (40 пг) BoNT-E (например, рекомбинантного BoNT-E) обеспечивает ту же амплитуду эффекта (в течение дней 1-7 после введения) в дозах 20 Ед BoNT-A (Dysport®) - см. Пример 4. А именно, 20 Ед Dysport=108 пг нейротоксина (5,35-5,38 пг нейротоксина/Ед, обычно, 5,35 пг нейротоксина/Ед). Это особенно удивительно для авторов настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления, BoNT/E вводят в дозе 0,04-0,15 нг (например, 0,04 нг), которая обеспечивает:

по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >3 до ≤13 дней после введения; и/или

примерно 30%-40% (предпочтительно, примерно 33-35%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >17 до <19 дней после введения; и/или

примерно 7%-17% (предпочтительно, примерно 12%-14%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >20 до <22 дней после введения; и/или

примерно 15%-25% (предпочтительно, примерно 21%-23%) ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени от >23 до <26 дней после введения; и/или

В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является мышца. Примеры таких мышц включают затылочно-лобную, носовую, круговую мышцу рта, угловую мышцу, подкожную мышцу шеи, грудинно-подъязычную, переднюю зубчатую мышцу, прямую мышцу живота, внешнюю косую мышцу, растяжение широкой фасции, плечевые лучи, подвздошную мышцу, большую поясничную мышцу, грудную мышцу, длинную мышцу, приводящую мышцу, тонкую мышцу, широкую латеральную мышцу бедра, прямую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, сухожилие четырехглавой мышцы бедра, коленную чашечку, икроножную мышцу, камбаловидную мышцу, большеберцовую кость, длинную малоберцовую мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, связку надколенника, подвздошно-большеберцовый тракт, мышцы возвышения мизинца, мышцы возвышения большого пальца кисти, локтевые сгибатели, сгибатель пальцев кисти поверхностный, длинную ладонную мышцу, лучевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, плечевую мышцу, двуглавую мышцу плеча, трицепс плеча, большую грудную мышцу, дельтовидную мышцу, трапецию, грудинно-ключично-сосцевидную мышцу, жевательную мышцу, круговую мышцу глаза, височную мышцу, сухожильный шлем, большую круглую мышцу, разгибатель пальцев, разгибатель запястья, локтевую мышцу, длинный разгибатель большого пальца, подошвенную мышцу, сухожилие пяточной кости, камбаловидную мышцу, большую приводящую мышцу, большую ягодичную мышцу, среднюю ягодичную мышцу, широчайшую мышцу спины.

В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько тканей, выбранных из сморщивателя брови, разгибателя плеча, двуглавой мышцы плеча, плечевой мышцы и/или плечелучевой мышцы, разгибателя пальцев или их комбинации.

В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из лучевого сгибателя запястья, локтевого сгибателя запястья, глубокого сгибателя пальцев, поверхностного сгибателя пальцев, длинного сгибателя большого пальца руки, большой приводящей мышцы, плечевой мышцы, плечелучевой мышцы, двуглавой мышцы плеча, круглого пронатора, трехглавой мышцы плеча, большой грудной мышцы, подлопаточной мышцы, широчайшей мышцы спины или их комбинации (предпочтительно, если BoNT/E предназначен для лечения спастичности верхних конечностей).

В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из лучевого сгибателя запястья, локтевого сгибателя запястья или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из сгибателя пальцев кисти глубокого, сгибателя пальцев кисти поверхностного, длинного сгибателя большого пальца кисти, длинной мышцы, приводящей большой палец кисти, или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из плечевой мышцы, плечелучевой мышцы, двуглавой мышцы плеча, круглого пронатора или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из трехглавой мышцы плеча, большой грудной мышцы, подлопаточной мышцы, широчайшей мышцы спины или их комбинации.

В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из камбаловидной мышцы, икроножной мышцы (например, медиальной головки или боковой головки), задней большеберцовой мышцы, длинного сгибателя пальцев, короткого сгибателя пальцев, длинного сгибателя большого пальца, короткого сгибателя большого пальца или их комбинации (например, если BoNT/E предназначен для лечения спастичности нижних конечностей).

В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является камбаловидная мышца. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является икроножная мышца (например, медиальная головка или боковая головка). В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является задняя большеберцовая мышца, длинный сгибатель пальцев, короткий сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца, короткий сгибатель большого пальца или их комбинации.

В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является одна или несколько, выбранных из сморщивателя брови, мышцы гордецов, круговой мышцы глаз, лобной мышцы или их комбинации (предпочтительно, если BoNT/E предназначен для применения в лечении морщин в верхней части лица).

В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является сморщиватель брови, и одна или несколько, выбранных из мышцы гордецов, круговой мышцы глаз, лобной мышцы или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является мышца гордецов, и одна или несколько, выбранных из сморщивателя брови, круговой мышцы глаз, лобной мышцы или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является круговая мышца глаз, и одна или несколько, выбранных из сморщивателя брови, мышцы гордецов, лобной мышцы или их комбинации. В одном варианте осуществления, тканью-мишенью является лобная мышца, и одна или несколько, выбранных из сморщивателя брови, мышцы гордецов, круговой мышцы глаз или их комбинации.

В одном варианте осуществления клеткой-мишенью является двигательный нейрон или рецепторный нейрон. Предпочтительно, клеткой-мишенью является двигательный нейрон.

Клеткой-мишенью (используется здесь как синоним термина «нерв») может быть подмышечный нерв, диафрагмальный нерв, спинномозговой ганглий, нерв спинного мозга, цепь симпатических ганглиев, срамной нерв, общий ладонный пальцевый нерв, локтевой нерв, глубокой ветвью локтевого нерва, седалищный нерв, малоберцовый нерв, большеберцовый нерв, подкожный нерв, межкостный нерв, поверхностный малоберцовый нерв, промежуточный дорсальный кожный нерв, медиальный подошвенный нерв, медиальный дорсальный кожный нерв, глубокий малоберцовый нерв, мышечные ветви большеберцового нерва, поднаколенниковая ветвь подкожного нерва, общий малоберцовый нерв, мышечная ветвь бедренного нерва, передние кожные ветви бедренного нерва, мышечные ветви седалищного нерва, бедренный нерв, подвздошно-паховый нерв, нерв терминальной нити, подвздошно-подчревный нерв, запирательный нерв, лучевой нерв, подреберный нерв, межреберный нерв, дорсальная ветвь межреберного нерва, медиальная кожная ветвь межреберного нерва, мышечный нерв, дельтовидный нерв, блуждающий нерв, нерв плечевого сплетения, надключичный нерв, лицевой нерв, ушно-височный нерв или их комбинации. В предпочтительном варианте осуществления, клеткой-мишенью является малоберцовый нерв.

BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей (или состоящей из) SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей (или состоящей из) последовательности, которая кодон-оптимизирована для экспрессии в гетерологичной системе экспрессии (например, SEQ ID NO: 1), такой как клетка-хозяин E. coli.

BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. В одном варианте осуществления BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении содержит (или состоит из) полипептидной последовательности, показанной как SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2. Предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно, BoNT/E для применения в настоящем изобретении содержит (или состоит из) полипептидной последовательности, показанной как SEQ ID NO: 2.

BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2, при условии, что полипептидная последовательность включает одну или несколько (например, одну или несколько, две или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько, семь или несколько или восемь; предпочтительно, все восемь) из следующих аминокислот (где нумерация аминокислотных положений начинается с N-концевого метионинового аминокислотного остатка и заканчивается C-концевым аминокислотным остатком белка BoNT/E):

глицин в положении 177; серин в положении 198; аланин в положении 340; лейцин в положении 773; лейцин в положении 963; глутамин в положении 964; аланин в положении 967; аспарагин в положении 1195.

В одном варианте осуществления, BoNT/E для применения в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2, при условии, что полипептидная последовательность включает одну или несколько (например, одну или несколько, две или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько, семь или несколько или восемь; предпочтительно, все восемь) из следующих аминокислот (где нумерация аминокислотных положений начинается с N-концевого метионинового аминокислотного остатка и заканчивается C-концевым аминокислотным остатком белка BoNT/E):

Указанные аминокислоты могут быть замещениями (например, мутациями) относительно полипептидной последовательности BoNT/E дикого типа (такой как SEQ ID NO.: 3). Например:

глицин в положении 177 может быть замещение аргинина на глицин (R177G);

серин в положении 198 может быть C198S замещением;

аланин в положении 340 может быть R340A замещением;

лейцин в положении 773 может быть I173L замещением;

лейцин в положении 963 может быть F963L замещением;

глутамин в положении 964 может быть E964Q замещением;

аланин в положении 967 может быть R967A замещением; и/или

аспарагин в положении 1195 может быть вставкой (например, вставкой между G1194 и N1195 последовательности BoNT/E дикого типа, такой как полипептидная последовательность SEQ ID NO. 3).

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) глицин в положении 177; серин в положении 198; аланин в положении 340; лейцин в положении 773; лейцин в положении 963; глутамин в положении 964; аланин в положении 967; и аспарагин в положении 1195.

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) глицин в положении 177; аланин в положении 340; лейцин в положении 773; лейцин в положении 963; глутамин в положении 964; аланин в положении 967; и аспарагин в положении 1195.

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) глицин в положении 177, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) серин в положении 198, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; и аспарагина в положении 1195.

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) аланин в положении 340, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) лейцин в положении 773, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) лейцин в положении 963, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; глутамина в положении 964; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) глутамин в положении 964, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; аланина в положении 967; аспарагина в положении 1195.

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) аланин в положении 967, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аспарагина в положении 1195.

В одном варианте осуществления, указанные одна или несколько аминокислот содержат (или состоят из) аспарагин в положении 1195, и один или несколько (например, один или несколько, два или несколько, три или несколько, четыре или несколько, пять или несколько, шесть или несколько или семь) из: глицина в положении 177; серина в положении 198; аланина в положении 340; лейцина в положении 773; лейцина в положении 963; глутамина в положении 964; аланина в положении 967.

В одном варианте осуществления, присутствие указанных одной или нескольких аминокислот, как описано выше, дает BoNT/E белок, имеющий улучшенную растворимость по сравнению с BoNT/E белком, не имеющим указанные аминокислоты. Указанная улучшенная растворимость повышает выход белка в гетерологичных системах экспрессии, таких как система экспрессии E. coli.

В одном варианте осуществления, присутствие указанных одной или нескольких аминокислот, как описано выше, дает BoNT/E белок, имеющий улучшенную эффективность по сравнению с BoNT/E белком, не имеющим указанные аминокислоты. Указанная улучшенная эффективность может, предпочтительно, улучшить in vivo эффективность (более предпочтительно, улучшить in vivo эффективность у субъекта-человека).

В одном варианте осуществления BoNT/E является таким, как описан в (или кодирован нуклеотидной последовательностью, описанной в) WO 2014/068317 A1, который включен в настоящий документ в качестве ссылки.

BoNT/E образуется из двух полипептидных цепей, тяжелой цепи (H-цепи), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепи (L-цепи), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. H-цепь содержит C-концевой таргетный компонент (рецептор-связывающий домен или H_C домен) и N-концевой компонент транслокации (H_N домен). BoNT/E, который содержит и H-цепь (H_C домен и H_N домен) и L-цепь называют в настоящем документе голотоксин.

В одном варианте осуществления, BoNT/E для применения в настоящем изобретении является голотоксин.

Типовая эталонная последовательность L-цепи включает аминокислотные остатки 1-422 из BoNT/E. Однако эта эталонная последовательность должна считаться направляющей, поскольку незначительные вариации могут возникать согласно суб-серотипам. В качестве примера, в US 2007/0166332 (включен в настоящий документ в качестве ссылки полностью) указана слегка отличающаяся последовательность аминокислотных остатков M1-R422 для L-цепи BoNT/E.

Примеры эталонной последовательности для H_C домена BoNT/E включают аминокислотные остатки R846-K1252.

L-цепь BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть следующей (SEQ ID NO.: 4):

H-цепь BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть следующей (SEQ ID NO.: 5):

H_C домен BoNT/E содержит два отдельных структурных признака, которые названы H_CC и H_CN домены. Полагают, что аминокислотные остатки, вовлеченные в связывание рецептора, преимущественно расположены в H_CC домене. Пример эталонной последовательности H_CN домена BoNT/E включает аминокислотные остатки 846-1085.

Вышеуказанные положения последовательности могут незначительно варьироваться в соответствии с подтипом, и дополнительные примеры подходящих (эталонных) H_CN доменов BoNT/E включают аминокислотные остатки 848-1085.

BoNT/E может быть продуцирован C. botulinum или C. butyricum, предпочтительно, C. botulinum. В одном варианте осуществления, BoNT/E продуцируется в не клостридийной клетке. Альтернативно (предпочтительно), BoNT/E может продуцироваться в рекомбинантной форме (например, в Escherichia coli). Таким образом, в одном варианте осуществления, BoNT/E для применения по изобретению продуцируется в гетерологичной системе экспрессии, такой как E. coli. В одном варианте осуществления, клеткой E. coli является E. coli BLR (DE3).

Более подробно BoNT/E, продуцированный в гетерологичной системе экспрессии (такой как E. coli), описан в WO 2014/068317 A1, который включен в настоящий документ в качестве ссылки.

Композиция BoNT/E по настоящему изобретению, предпочтительно, по существу не содержит трипсинпротеазу (применяемую для активации одноцепочечного полипептида), таким образом, предотвращая нежелательное неспецифическое расщепление BoNT/E белка.

Композиция BoNT/E по настоящему изобретению такова, что содержание белка в композиции обеспечивается фактическим нейротоксином (BoNT/E). Таким образом, введение, скажем, 4 нг композиции BoNT/E соответствует введению 4 нг нейротоксина BoNT/E.

В одном варианте осуществления, где композиция BoNT/E (как описано выше) по существу не содержит трипсин, композиция содержит менее 100 пикограммов (пг) трипсина на 100 нанограммов (нг) белка BoNT/E; например, менее 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E. В одном варианте осуществления, композиция (как описана выше) содержит менее 10 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E, или менее 7 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E, или менее 5 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E. В предпочтительном варианте осуществления, композиция (как описана выше) содержит менее 10 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E, или менее 7 пг трипсина на 100 нг белка BoNT/E.

Таким образом, в одном варианте осуществления, фраза “по существу не содержит трипсин” означает менее 100 пг трипсина на 100 нг BoNT/E белка; например, менее 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 пг трипсина на 100 нг BoNT/E белка, предпочтительно, менее 10 пг трипсина на 100 нг BoNT/E белка или менее 7 пг трипсина на 100 нг BoNT/E белка.

Способы определения концентрации трипсина в композиции известны в данной области техники (например, описаны в WO 2014/068317). В качестве примера, концентрация трипсина в композиции по изобретению может быть определена с использованием сэндвич-ELISA (иммуноферментного анализа).

Известно, что BoNT/E расщепляет синаптосомально-ассоциированный белок 25 кДа (SNAP-25).

В некоторых вариантах осуществления BoNT/E может быть модифицирован BoNT/E или его производным, включая, но не ограничиваясь ими, такие, которые описаны ниже. Модифицированный BoNT/E или производное могут содержать одну или несколько аминокислот, которые были модифицированы по сравнению с нативной (не модифицированной) формой BoNT/E, или может содержать одну или несколько вставленных аминокислот, которые не присутствуют в нативной (не модифицированной) форме BoNT/E. В качестве примера, модифицированный BoNT/E может иметь модифицированные аминокислотные последовательности в одном или нескольких доменах относительно нативной (не модифицированной) последовательности BoNT/E. Такие модификации могут модифицировать функциональные аспекты BoNT/E, например, биологическую активность или жизнестойкость. Таким образом, в одном варианте осуществления, BoNT/E является модифицированный BoNT/E или производное BoNT/E.

Модифицированный BoNT/E может иметь одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности тяжелой цепи (такой как модифицированный H_C домен), где указанная модифицированная тяжелая цепь связывается с нервными клетками-мишенями с более высокой или низкой аффинностью, чем нативный (не модифицированный) BoNT/E. Такие модификации в H_C домене могут включать модифицирующие остатки в сайте связывания ганглиозида H_C домена или в сайте связывания белка (SV2 или синаптотагмина), которые изменяют связывание с рецептором ганглиозида и/или рецептором белка нервной клетки-мишени. Примеры таких модифицированных клостридиальных нейротоксинов описаны в WO 2006/027207 и WO 2006/114308, оба которых включены в настоящий документ в качестве ссылки полностью.

Модифицированный BoNT/E может иметь одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности легкой цепи, например модификации в связывании субстрата или каталитическом домене, которые могут изменять или модифицировать специфичность белка SNARE модифицированной L-цепи. Примеры таких модифицированных клостридиальных нейротоксинов описаны в WO 2010/120766 и US 2011/0318385, оба которых включены в настоящий документ в качестве ссылки полностью.

Модифицированный BoNT/E может содержать одну или несколько модификаций, которые повышают или снижают биологическую активность и/или биологическую жизнестойкость модифицированного BoNT/E. Например, модифицированный BoNT/E может содержать мотив на основе лейцина или тирозина, где указанный мотив повышает или снижает биологическую активность и/или биологическую жизнестойкость модифицированного BoNT/E. Подходящие мотивы на основе лейцина включают xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL и xExxxLM (где x является любой аминокислотой). Подходящие мотивы на основе тирозина включают Y-x-x-Hy (где Hy является гидрофобной аминокислотой). Примеры модифицированных клостридиальных нейротоксинов, включающих мотивы на основе лейцина или тирозина, описаны в WO 2002/08268, который включен в настоящий документ в качестве ссылки полностью.

Термин “BoNT/E” в одном варианте осуществления охватывает гибридный и химерный BoNT/E. Гибридный BoNT/E содержит, по меньшей мере, часть легкой цепи из одного клостридиального нейротоксина или его подтипа, и, по меньшей мере, часть тяжелой цепи из другого клостридиального нейротоксина или подтипа клостридиального нейротоксина, где, по меньшей мере, один из подтипов является подтипом BoNT/E. В одном варианте осуществления, гибридный BoNT/E может содержать всю легкую цепь легкой цепи из одного подтипа клостридиального нейротоксина, и тяжелую цепь из другого подтипа клостридиального нейротоксина, где, по меньшей мере, одним из подтипов является подтип BoNT/E. В другом варианте осуществления, химерный клостридиальный нейротоксин может содержать часть (например, связывающий домен) тяжелой цепи одного подтипа клостридиального нейротоксина, и другую часть тяжелой цепи из другого подтипа клостридиального нейротоксина, где, по меньшей мере, одним из подтипов является подтип BoNT/E. Аналогично или альтернативно, терапевтический элемент может содержать части легкой цепи из разных подтипов BoNT/E. Такие гибридные или химерные BoNT/E полипептиды применяют, например, в качестве средства доставки их терапевтического преимущества пациентам, которые иммунологически резистентны к данному подтипу клостридиального нейротоксина, пациентам, которые могут иметь концентрацию рецепторов данного связывающего домена тяжелой цепи клостридиального нейротоксина меньше средней, или пациентам, которые могут иметь резистентный к протеазе вариант мембранного или везикулярного субстрата токсина (например, SNAP-25, VAMP и синтаксина). Гибридные и химерные клостридиальные нейротоксины описаны в US 8,071,110, публикация которого включена в настоящий документ в качестве ссылки полностью. Таким образом, в одном варианте осуществления, BoNT/E по изобретению является гибридным BoNT/E или химерным BoNT/E.

Настоящее изобретение также охватывает BoNT/E, имеющий не нативный сайт расщепления протеазой. В таких BoNT/E полипептидах, нативный сайт расщепления протеазой (также известный как сайт активации, как описано выше) модифицирован или замещен сайтом расщепления протеазой, которые не является нативным для BoNT/E (т.е. экзогенным сайтом расщепления). Такой сайт потребует экзогенную протеазу для расщепления, что позволяет улучшить контроль времени и расположения событий расщепления. Не нативные сайты расщепления протеазой, которые могут применяться в BoNT/E, включают:

Энтерокиназа	(DDDDK↓)
Фактор Xa	(IEGR↓ / IDGR↓)
TEV(вирус гравировки табака)	(ENLYFQ↓G)
Тромбин	(LVPR↓GS)
PreScission	(LEVLFQ↓GP)

Дополнительные сайты расщепления протеазой включают последовательности распознавания, которые расщепляются не цитотоксической протеазой, например легкой цепью клостридиального нейротоксина. Они включают последовательности распознавания белка SNARE (например, SNAP-25, синтаксина, VAMP), которые расщепляются не цитотоксическими протеазами, такими как легкая цепь клостридиального нейротоксина. Клостридиальные нейротоксины, содержащие не нативные сайты расщепления протеазой, описаны в US 7,132,259, EP 1206554-B2 и US 2007/0166332, все которые включены в настоящий документ в качестве ссылки полностью. Также термин сайт расщепления протеазой включает интеин, который является саморасщепляющейся последовательностью. Реакция самосплайсинга является контролируемой, например, через изменение концентрации присутствующего восстанавливающего агента.

Настоящее изобретение также охватывает BoNT/E, содержащий “деструктивный сайт расщепления”. В указанных BoNT/E полипептидах, не нативный сайт расщепления протеазой включен в BoNT/E в месте, выбранном так, что расщепления на указанном сайте будет снижать активность, или инактивировать, BoNT/E. Деструктивный сайт расщепления протеазой может быть подвержен расщеплению локальной протеазой, в случае, если BoNT/E, после введения, мигрирует в не целевую локацию. Подходящие не нативные сайты расщепления протеазой включают такие, которые описаны выше. Клостридиальные нейротоксины, содержащие деструктивный сайт расщепления, описаны в WO 2010/094905 и WO 2002/044199, оба которых включены в настоящий документ в качестве ссылки полностью.

В одном варианте осуществления, BoNT/E содержит нативный сайт расщепления.

В одном варианте осуществления, BoNT/E не содержит E3 мотив распознавания лигазы.

BoNT/E, особенно его компонент легкой цепи, может быть ПЭГилирован - это может помочь повысить стабильность, например, длительность действия компонента легкой цепи. ПЭГилирование, предпочтительно, включает добавление ПЭГ к N-концу компонента легкой цепи. В качестве примера, N-конец легкой цепи может быть продлен одним или несколькими аминокислотными (например, цистеиновым) остатками, которые могут быть одинаковыми или разными. Один или несколько из указанных аминокислотных остатков могут иметь свои собственные молекулы ПЭГ (например, ковалентно присоединенные), присоединенные к нему. Пример этой технологии описан в WO2007/104567, который включен в настоящий документ в качестве ссылки полностью.

BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть получен с применением технологий рекомбинантной нуклеиновой кислоты.

BoNT/E для применения в настоящем изобретении может быть получен способом, включающим экспрессирование нуклеиновой кислоты, кодирующей BoNT/E, в подходящей клетке-хозяине, лизирование клетки-хозяина с получением гомогената клетки-хозяина, содержащего одноцепочечный BoNT/E, и выделение одноцепочечного BoNT/E. Перед применением в настоящем изобретении, одноцепочечный BoNT/E, предпочтительно, протеолитически перерабатывают в соответствующий активный двухцепочечный BoNT/E посредством контакта одноцепочечного BoNT/E с протеазой, которая гидролизует пептидную связь в петле активации BoNT/E с получением двухцепочечного BoNT/E (например, где легкая цепь и тяжелая цепь соединены вместе дисульфидной связью).

Предпочтительно, указанная клетка-хозяин представляет гетерологичную (например, не-клостридиальную) систему экспрессии. Предпочтительно, клеткой-хозяином является E. coli.

BoNT/E для применения в настоящем изобретении, предпочтительно, имеет двухцепочечную форму.

BoNT/E может применяться в настоящем изобретении как часть фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать BoNT/E и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль. Таким образом, в одном варианте осуществления, BoNT/E может быть введен в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом, адъювантом и/или солью.

BoNT/E может быть составлен для парентерального, непрерывного вливания или местного применения. В одном варианте осуществления, BoNT/E составлен для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, внутрикожная инъекция и/или внутримышечная инъекция. Предпочтительно, BoNT/E составлен для парентерального введения, например, более предпочтительно, для внутримышечного введения (например, инъекцией).

Композиции, подходящие для инъекций, могут быть в форме растворов, суспензий или эмульсий, или сухих порошков, которые растворяют или суспендируют в подходящем носителе перед применением.

В случае, когда BoNT/E предназначен для местной доставки, BoNT/E может быть составлен в виде крема (например, для местного применения) или для подкожной инъекции.

Средства местной доставки могут включать аэрозоль или другой спей (например, небулайзер).

Жидкие дозированные формы обычно готовят с использованием BoNT/E и апирогенного стерильного носителя. BoNT/E, в зависимости от используемого носителя и концентрации, может быть растворен или суспендирован в носителе. При приготовлении растворов, BoNT/E можно растворять в носителе, при необходимости раствор делают изотоническим путем добавления хлорида натрия и стерилизуют фильтрованием через стерильный фильтр с использованием асептических методов перед заполнением подходящих стерильных флаконов или ампул и запечатыванием. Альтернативно, если стабильность раствора является достаточной, раствор в герметичных контейнерах можно стерилизовать в автоклаве. Преимущественно, добавки, такие как буферные, солюбилизирующие, стабилизирующие, консервирующие или бактерицидные, суспендирующие или эмульгирующие агенты и/или местные анестетики, могут быть растворены в носителе.

Сухие порошки, которые растворяют или суспендируют в подходящем носителе перед использованием, могут быть приготовлены заполнением предварительно стерилизованных ингредиентов в стерильном контейнере с использованием асептической методики в стерильной зоне. Альтернативно, ингредиенты могут быть растворены в подходящих контейнерах с использованием асептических методик в стерильной зоне. Затем продукт сушат вымораживанием, и контейнеры асептически герметично закрывают.

Парентеральные суспензии, подходящие для внутримышечной, подкожной или внутрикожной инъекции, готовят по существу таким же образом, за исключением того, что стерильные компоненты суспендируют в стерильном носителе, а не растворяют, и стерилизация не может быть выполнена фильтрацией. Компоненты могут быть выделены в стерильном состоянии или, альтернативно, они могут быть стерилизованы после выделения, например, гамма-облучением.

Преимущественно суспендирующий агент, например поливинилпирролидон, включают в композицию(и) для облегчения равномерного распределения компонентов.

Введение в соответствии с настоящим изобретением может давать преимущества множества технологий доставки, включая инкапсулирование микрочастиц, вирусные системы доставки или аэрозольную бомбардировку под высоким давлением. BoNT/E может быть введен пациенту интратекальной или эпидуральной инъекцией в позвоночный столб на уровне спинного сегмента, участвующего в иннервации пораженного органа.

Диапазоны доз для введения BoNT/E таковы, что они обеспечивают желаемый терапевтический эффект (например, описанный выше). Дозировки также могут быть основаны на единицах CBA, как описано в примерах.

В одном варианте осуществления расстройством по настоящему изобретению является одно или несколько из: состояния, связанного с косоглазием, блефароспазма, косоглазия, дистонии (например, спазматической дистонии, оромандибулярной дистонии, очаговой дистонии, поздней дистонии, дистонии мышц гортани, дистонии конечностей, шейной дистонии), кривошеи (например, спастической кривошеи), косметологического (косметического) применения, где полезно временное поражение клеток/мышц (через подавление или инактивацию SNARE), нервно-мышечного расстройства или состояния подвижности глаз (например, сопутствующего косоглазия, вертикального косоглазия, паралича наружной прямой мышцы, нистагма, дистироидной миопатии), писчего спазма, блефароспазма, бруксизма, болезни Вильсона, тремора, тиков, сегментарного миоклонуса, спазмов, спастичности из-за хронического рассеянного склероза, спастичности, приводящей к нарушению контроля над мочевым пузырем, анимуса, спазма спины, ушиба или разрыва мышц, головных болей напряжения, синдрома подъемника таза, расщелины позвоночника, поздней дискинезии, болезни Паркинсона, заикания, гемифациального спазма, расстройства век, церебрального паралича, очаговой спастичности, спазматического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей (например, спастичности нижних конечностей или спастичности верхних конечностей), тиков, тремора, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, дисфагии, слезотечения, гипергидроза, чрезмерного слюноотделения, чрезмерной секреции желудочно-кишечного тракта, мышечной боли (например, боли при мышечных спазмах), головной боли (например, головной боли напряжения), межбровных складок, морщин кожи (например, морщин в верхней части лица, таких как глабеллярные морщины, морщины в углах глаз и/или лобные морщины), рака, расстройств матки, мочеполовых расстройств, урогенитально-неврологических расстройств, хронического нейрогенного воспаления и расстройства гладкой мускулатуры.

В одном варианте осуществления, расстройством является спастичность нижних конечностей. Предпочтительно, спастичностью нижних конечностей страдает субъект в возрасте старше 18 лет.

В одном варианте осуществления, расстройством является спастичность верхних конечностей. Предпочтительно, спастичностью верхних конечностей страдает субъект в возрасте старше 18 лет.

Настоящее изобретение также включает косметический способ с применением BoNT/E. Например, косметический способ может быть предназначен для лечения морщин в верхней части лица (таких как глабеллярные морщины, морщины в углах глаз и лобные морщины).

В одном варианте осуществления, косметический способ предназначен для лечения глабеллярных морщин, и одной или нескольких, выбранных из морщин в углах глаз и лобных морщин. В одном варианте осуществления, косметический способ предназначен для лечения морщин в углах глаз, и одной или нескольких, выбранных из глабеллярных морщин и лобных морщин. В одном варианте осуществления, косметический способ предназначен для лечения лобных морщин, и одной или нескольких, выбранных из глабеллярных морщин и морщин в углах глаз.

Косметический способ по изобретению может включать введение (эффективного количества) BoNT/E для лечения глабеллярных морщин, морщин в углах глаз и/или лобных морщин, при этом BoNT/E вводят в участок для лечения указанных глабеллярных морщин, морщин в углах глаз и/или лобных морщин одновременно или последовательно, так что лечатся (предпочтительно, одновременно лечатся) каждая из указанных глабеллярных морщин, морщин в углах глаз и/или лобных морщин.

Предпочтительно, косметический способ предназначен для лечения глабеллярных морщин. Глабеллярные морщины могут быть умеренные или тяжелые (например, по мнению врача).

Варианты осуществления, связанные с применением BoNT/E, предназначены для равного применения к способам лечения и косметологии, описанных здесь, и наоборот.

В одном варианте осуществления, субъектом-человеком является мужчина.

ГОМОЛОГИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Для определения доли идентичности может применяться любой из множества способов выравнивания последовательностей, включая, без ограничения, глобальные способы, локальные способы и гибридные способы, такие как, например, способы сегментного подхода. Протоколы для определения доли идентичности являются обычными процедурами в пределах компетенции специалиста в данной области техники. Глобальные способы выравнивают последовательности от начала до конца молекулы и определяют наилучшее выравнивание, складывая оценки отдельных пар остатков и применяя штрафы за гэпы. Неограничивающие способы включают, например, CLUSTAL W, см., например, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); и итеративное уточнение, см., например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996). Локальные способы выравнивают последовательности через идентификацию одного или нескольких консервативных мотивов, общих для всех входящих последовательностей. Неограничивающие способы включают, например, Match-box, см., например, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); выборку Гиббса, см., например, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, см., например, Ivo Van WaIIe et al., Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).

Таким образом, доля идентичности последовательности определяется обычными способами. См., например, Altschul et al., Bull. Math.Bio. 48: 603-16, 1986 и Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. Коротко, две аминокислотные последовательности выравнивают для оптимизации оценок выравнивания с применением штрафа за открытие гэпа 10, штрафа за продление гэпа и матрицу замен "blosum 62" от Henikoff and Henikoff (там же) как показано ниже (аминокислоты обозначаются стандартными однобуквенными кодами).

«Доля идентичности последовательности» между двумя или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей. Таким образом, % идентичности может быть рассчитан как количество идентичных нуклеотидов/аминокислот, деленное на общее количество нуклеотидов/аминокислот, умноженное на 100. При расчете % идентичности последовательности также можно принимать во внимание количество гэпов и длину каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимизации выравнивания двух или нескольких последовательностей. Сравнение последовательностей и определение доли идентичности между двумя или несколькими последовательностями может быть проведено с использованием определенных математических алгоритмов, таких как BLAST, которые знакомы специалисту в данной области техники.

ОЦЕНКИ ВЫРАВНИВАНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИДЕНТИЧНОСТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Долю идентичности затем рассчитывают как:

По существу гомологичные полипептиды характеризуются наличием одного или нескольких аминокислотных замещений, делеций или добавлений. Эти изменения предпочтительно являются незначительными, то есть консервативными аминокислотными замещениями (см. ниже) и другими замещениями, которые существенно не влияют на фолдинг или активность полипептида; малыми делециями, обычно от одной до примерно 30 аминокислот; и малыми удлинениями на амино- или карбоксильном конце, такими как аминоконцевой метиониновый остаток, малый линкерный пептид вплоть до примерно до 20-25 остатков, или аффинная метка.

КОНСЕРВАТИВНЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕЩЕНИЯ

Основные:	аргинин
	лизин
	гистидин
Кислые:	глутаминовая кислота
	аспарагиновая кислота
Полярные:	глутамин
	аспарагин
Гидрофобные:	лейцин
	изолейцин
	валин
Ароматические:	фенилаланин
	триптофан
	тирозин
Малые:	глицин
	аланин
	серин
	треонин
	метионин

Помимо 20 стандартных аминокислот, нестандартные аминокислоты (такие как 4-гилроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин) могут быть замещены на аминокислотные остатки полипептидов по настоящему изобретению. Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодированы генетическим кодом, и не существующих в природе аминокислот может быть замещено на полипептидные аминокислотные остатки. Полипептиды по настоящему изобретению могут также содержать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки.

Не встречающиеся в природе аминокислотные остатки включают, без ограничения, транс-3-метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В данной области техники известно несколько способов включения не встречающихся в природе аминокислотных остатков в белки. Например, может использоваться система in vitro, в которой нонсенс-мутации подавляются с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области техники. Транскрипция и трансляция плазмид, содержащих нонсенс-мутации, осуществляется в бесклеточной системе, содержащей экстракт E. coli S30 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией. См., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; и Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). Во втором способе, трансляцию проводят в ооцитах Xenopus микроинъекцией мутированной иРНК и химически аминоацетилированной суппрессорной тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). В третьем способе, клетки E. coli культивируют в отсутствие существующей в природе аминокислоты, которую необходимо заменить (например, фенилаланина), и в присутствии желаемых не встречающейся в природе аминокислот (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Не существующая в природе аминокислота включается в полипептид вместо своего природного аналога. См., Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Существующие в природе аминокислотные остатки могут быть превращены в не существующие в природе виды химической модификацией in vitro. Химическая модификация может быть объединена с сайт-напрвленный мутагенезом для дальнейшего расширения диапазона замещений (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).

Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не существующих в природе аминокислот и ненатуральных аминокислот может быть замещено аминокислотными остатками полипептидов по настоящему изобретению.

Незаменимые аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению могут быть идентифицированы в соответствии с методиками, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Сайты биологического взаимодействия также могут быть определены физическим анализом структуры, определяемым такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоаффинное мечение, в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего сайта. См., например, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Идентичность незаменимых аминокислот также может быть выведена из анализа гомологий с родственными компонентами (например, компонентами транслокации или протеазы) полипептидов по настоящему изобретению.

Множество аминокислотных замещений может быть проведено и протестировано с применением известных способов мутагенеза и скрининга, таких, как описаны у Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Коротко, эти авторы раскрывают способы одновременной рандомизации двух или нескольких положений в полипептиде, выбора функционального полипептида и последующего секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замещений в каждом положении. Другие способы, которые могут применяться, включают фаговый дисплей (например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et al., патент США № 5,223,409; Huse, публикация WIPO WO 92/06204) и мутагенез, целенаправленно воздействующий на область (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).

Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют те же значения, которые являются общепринятыми для специалистов в области техники, к которой принадлежит настоящее описание. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) представляют специалистам в данной области техники общий словарь терминов, применяемых в настоящем описании.

Настоящее описание не ограничивается типовыми способами и материалами, описанными в настоящем документе, и любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться на практике или при тестировании вариантов осуществления этого описания. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, любые последовательности нуклеиновых кислот записываются слева направо в ориентации от 5' до 3'; аминокислотные последовательности написаны слева направо в ориентации от амино до карбокси, соответственно.

Заголовки, представленные в настоящем документе, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления этого описания.

В настоящем описании аминокислоты упоминаются с использованием названия аминокислоты, трехбуквенного сокращения или однобуквенного сокращения. Используемый здесь термин «белок» включает белки, полипептиды и пептиды. Используемый здесь термин «аминокислотная последовательность» синонимичен термину «полипептид» и/или термину «белок». В некоторых случаях, термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «пептид». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «фермент». Термины «белок» и «полипептид» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. В настоящем описании и формуле изобретения могут использоваться обычные однобуквенные и трехбуквенные коды для аминокислотных остатков. Трехбуквенный код для аминокислот определен в соответствии с IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Также понятно, что полипептид может кодироваться более чем одной нуклеотидной последовательностью из-за вырожденности генетического кода.

В описании могут встречаться и другие определения терминов. Прежде чем типовые варианты осуществления будут описаны более подробно, следует понимать, что это описание не ограничивается конкретными описанными вариантами осуществления и как таковое может варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего описания будет определяться только прилагаемой формулой изобретения.

Если представлен диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение, вплоть до десятой единицы нижнего предела, если контекст явно не диктует иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона также конкретно описывается. Каждый меньший диапазон между любым заявленным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим заявленным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне охвачен этим описанием. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться или исключаться из диапазона, и каждый диапазон, в котором любое, ни одно или оба ограничения включены в меньшие диапазоны, также охватывается настоящим описанием, с учетом любого специально исключенного ограничения в заявленный диапазон. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в это описание.

Следует отметить, что используемые здесь и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки во множественном числе, если контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, ссылка на «ботулинический нейротоксин» включает множество таких кандидатных агентов, а ссылка на «ботулинический нейротоксин» включает ссылку на один или несколько ботулинических нейротоксинов и их эквиваленты, известные специалистам в данной области техники, и так далее.

Обсуждаемые здесь публикации предназначены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не должно толковаться как признание того, что такие публикации составляют известный уровень техники по отношению к прилагаемой формуле изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Варианты осуществления изобретения теперь будут описаны, только в качестве примера, со ссылкой на следующие чертежи и примеры.

На фигуре 1 показано (A) расположение мышцы короткого разгибателя пальца и (B) представление записанного потенциала действия.

На фигуре 2 показана методика увеличения дозы BoNT/E и результаты.

На фигуре 3 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 12 недель после введения разных доз rBoNT/E по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).

На фигуре 4 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 26 недель после введения разных доз Dysport® по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).

На фигуре 5 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 26 недель после введения разных доз rBoNT/E по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).

На фигуре 6 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 7 дней после введения разных доз rBoNT/E по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).

На фигуре 7 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 7 дней после введения разных доз Dysport® по сравнению с плацебо (среднее +/- с.о.с).

На фигуре 8 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 26 недель после введения 0,04 нг rBoNT/E или 20 Ед Dysport® (среднее +/- с.о.с).

На фигуре 9 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 7 дней после введения 0,04 нг rBoNT/E или 20 Ед Dysport® (среднее +/- с.о.с).

На фигуре 10 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 26 недель после введения 0,2 нг rBoNT/E или 40 Ед Dysport® (среднее +/- с.о.с).

На фигуре 11 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 7 дней после введения 0,2 нг rBoNT/E или 40 Ед Dysport® (среднее +/- с.о.с).

На фигуре 12 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 10-21 дней после введения 0,04 нг rBoNT/E (среднее +/- с.о.с). Линейную кривую сопоставляют со значениями CMAP (Microsoft Excel), которая имеет величину достоверности аппроксимации 0,9642, и наклон y=3,5531x+9,9523. Значения CMAP соответствуют тем, которые показаны для этой дозы на фигуре 3.

На фигуре 13 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 10-42 дней после введения 0,9 нг rBoNT/E (среднее +/- с.о.с). Линейную кривую сопоставляют со значениями CMAP (Microsoft Excel), которая имеет величину достоверности аппроксимации 0,9926, и наклон y=1,6167x - 4,8227. Значения CMAP соответствуют тем, которые показаны для этой дозы на фигуре 3.

На фигуре 14 показан % от исходного уровня электрического вызванного ответа мышцы (CMAP) стимулированной мышцы короткого разгибателя пальца в течение 10-56 дней после введения 3,6 нг rBoNT/E (среднее +/- с.о.с). Линейную кривую сопоставляют со значениями CMAP (Microsoft Excel), которая имеет величину достоверности аппроксимации 0,9736, и наклон y=1,7325x - 9,3108. Значения CMAP соответствуют тем, которые показаны для этой дозы на фигуре 3.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Если исходный Met аминокислотный остаток или соответствующих исходный кодон указан в любой из следующих SEQ ID NOs, указанный остаток/кодон может быть необязательным.

SEQ ID NO: 1 (Нуклеотидная последовательность BoNT/E)

1 atgccaaaaa ttaatagttt taattataat gatcctgtta atgatagaac aattttatat

61 attaaaccag gcggttgtca agaattttat aaatcattta atattatgaa aaatatttgg

121 ataattccag agagaaatgt aattggtaca accccccaag attttcatcc gcctacttca

181 ttaaaaaatg gagatagtag ttattatgac cctaattatt tacaaagtga tgaagaaaag

241 gatagatttt taaaaatagt cacaaaaata tttaatagaa taaataataa tctttcagga

301 gggattttat tagaagaact gtcaaaagct aatccatatt tagggaatga taatactcca

361 gataatcaat tccatattgg tgatgcatca gcagttgaga ttaaattctc aaatggtagc

421 caagacatac tattacctaa tgttattata atgggagcag agcctgattt atttgaaact

481 aacagttcca atatttctct aagaaataat tatatgccaa gcaatcacgg ttttggatca

541 atagctatag taacattctc acctgaatat tcttttagat ttaatgataa tagtatgaat

601 gaatttattc aagatcctgc tcttacatta atgcatgaat taatacattc attacatgga

661 ctatatgggg ctaaagggat tactacaaag tatactataa cacaaaaaca aaatccccta

721 ataacaaata taagaggtac aaatattgaa gaattcttaa cttttggagg tactgattta

781 aacattatta ctagtgctca gtccaatgat atctatacta atcttctagc tgattataaa

841 aaaatagcgt ctaaacttag caaagtacaa gtatctaatc cactacttaa tccttataaa

901 gatgtttttg aagcaaagta tggattagat aaagatgcta gcggaattta ttcggtaaat

961 ataaacaaat ttaatgatat ttttaaaaaa ttatacagct ttacggaatt tgatttagca

1021 actaaatttc aagttaaatg taggcaaact tatattggac agtataaata cttcaaactt

1081 tcaaacttgt taaatgattc tatttataat atatcagaag gctataatat aaataattta

1141 aaggtaaatt ttagaggaca gaatgcaaat ttaaatccta gaattattac accaattaca

1201 ggtagaggac tagtaaaaaa aatcattaga ttttgtaaaa atattgtttc tgtaaaaggc

1261 ataaggaaat caatatgtat cgaaataaat aatggtgagt tattttttgt ggcttccgag

1321 aatagttata atgatgataa tataaatact cctaaagaaa ttgacgatac agtaacttca

1381 aataataatt atgaaaatga tttagatcag gttattttaa attttaatag tgaatcagca

1441 cctggacttt cagatgaaaa attaaattta actatccaaa atgatgctta tataccaaaa

1501 tatgattcta atggaacaag tgatatagaa caacatgatg ttaatgaact taatgtattt

1561 ttctatttag atgcacagaa agtgcccgaa ggtgaaaata atgtcaatct cacctcttca

1621 attgatacag cattattaga acaacctaaa atatatacat ttttttcatc agaatttatt

1681 aataatgtca ataaacctgt gcaagcagca ttatttgtaa gctggataca acaagtgtta

1741 gtagatttta ctactgaagc taaccaaaaa agtactgttg ataaaattgc agatatttct

1801 atagttgttc catatatagg tcttgcttta aatataggaa atgaagcaca aaaaggaaat

1861 tttaaagatg cacttgaatt attaggagca ggtattttat tagaatttga acccgagctt

1921 ttaattccta caattttagt attcacgata aaatcttttt taggttcatc tgataataaa

1981 aataaagtta ttaaagcaat aaataatgca ttgaaagaaa gagatgaaaa atggaaagaa

2041 gtatatagtt ttatagtatc gaattggatg actaaaatta atacacaatt taataaaaga

2101 aaagaacaaa tgtatcaagc tttacaaaat caagtaaatg caattaaaac aataatagaa

2161 tctaagtata atagttatac tttagaggaa aaaaatgagc ttacaaataa atatgatatt

2221 aagcaaatag aaaatgaact taatcaaaag gtttctatag caatgaataa tatagacagg

2281 ttcttaactg aaagttctat atcctattta atgaaattaa taaatgaagt aaaaattaat

2341 aaattaagag aatatgatga gaatgtcaaa acgtatttat tgaattatat tatacaacat

2401 ggatcaatct tgggagagag tcagcaagaa ctaaattcta tggtaactga taccctaaat

2461 aatagtattc cttttaagct ttcttcttat acagatgata aaattttaat ttcatatttt

2521 aataaattct ttaagagaat taaaagtagt tcagttttaa atatgagata taaaaatgat

2581 aaatacgtag atacttcagg atatgattca aatataaata ttaatggaga tgtatataaa

2641 tatccaacta ataaaaatca atttggaata tataatgata aacttagtga agttaatata

2701 tctcaaaatg attacattat atatgataat aaatataaaa attttagtat tagtttttgg

2761 gtaagaattc ctaactatga taataagata gtaaatgtta ataatgaata cactataata

2821 aattgtatga gagataataa ttcaggatgg aaagtatctc ttaatcataa tgaaataatt

2881 tggacattgc aagataatgc aggaattaat caaaaattag catttaacta tggtaacgca

2941 aatggtattt ctgattatat aaataagtgg atttttgtaa ctataactaa tgatagatta

3001 ggagattcta aactttatat taatggaaat ttaatagatc aaaaatcaat tttaaattta

3061 ggtaatattc atgttagtga caatatatta tttaaaatag ttaattgtag ttatacaaga

3121 tatattggta ttagatattt taatattttt gataaagaat tagatgaaac agaaattcaa

3181 actttatata gcaatgaacc taatacaaat attttgaagg atttttgggg aaattatttg

3241 ctttatgaca aagaatacta tttattaaat gtgttaaaac caaataactt tattgatagg

3301 agaaaagatt ctactttaag cattaataat ataagaagca ctattctttt agctaataga

3361 ttatatagtg gaataaaagt taaaatacaa agagttaata atagtagtac taacgataat

3421 cttgttagaa agaatgatca ggtatatatt aattttgtag ccagcaaaac tcacttattt

3481 ccattatatg ctgatacagc taccacaaat aaagagaaaa caataaaaat atcatcatct

3541 ggcaatagat ttaatcaagt agtagttatg aattcagtag gaaataattg tacaatgaat

3601 tttaaaaata ataatggaaa taatattggg ttgttaggtt tcaaggcaga tactgtagtt

3661 gctagtactt ggtattatac acatatgaga gatcatacaa acagcaatgg atgtttttgg

3721 aactttattt ctgaagaaca tggatggcaa gaaaaataa

SEQ ID NO: 2 (Полипептидная последовательность BoNT/E)

PKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPE

RNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGI

LLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFET

NSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSL

HGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLL

ADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSF

TEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLN

PRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINT

PKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSD

IEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKP

VQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDA

LELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVY

SFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDI

KQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYII

QHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMR

YKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKN

FSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQK

LAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNIL

FKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYL

LNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKND

QVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNN

NGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

SEQ ID NO:3 (BoNT/E - UniProt Q00496)

MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTS

LKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTP

DNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGS

IAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPL

ITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYK

DVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKL

SNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKG

IRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESA

PGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSS

IDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADIS

IVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNK

NKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIE

SKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKIN

KLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYF

NKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNI

SQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEII

WTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNL

GNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYL

LYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDN

LVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNCTMNF

KNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

SEQ ID NO: 4 (Полипептидная последовательность L-Цепи BoNT/E)

PKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPE

RNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGI

LLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFET

NSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSL

HGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLL

ADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSF

TEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLN

PRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIR

SEQ ID NO: 5 (Полипептидная последовательность H-Цепи BoNT/E)

KSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINT

PKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSD

IEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKP

VQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDA

LELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVY

SFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDI

KQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYII

QHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMR

YKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKN

FSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQK

LAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNIL

FKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYL

LNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKND

QVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNN

NGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

ПРИМЕРЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Фармакодинамическая модель

Фармакодинамическая модель применяет мышцу Короткий разгибатель пальца (EDB) (Фигура 1A). EDB является поверхностной мышцей стопы, доступной для электрофизиологических исследований. Она участвует в разгибании 2-4-го пальцев стопы, и ее слабость не мешает ходьбе.

Мышцу EDB ранее применяли для определения действия BoNT/A, как опубликовано у Hamjian and Walker (1994), Muscle Nerve, 17(12): 1385-92. С тех пор эта модель широко применяется для:

- количественной оценки наступления и степени расслабления мышц человека и длительности действия после инъекции BoNT (Sloop et al (1996), Neurology, 46(5), 1382-6);

- сравнения разных подтипов BoNT (например, BoNT/B к BoNT/A) (Sloop et al (1997), Neurology, 49(1), 189-94);

- проверки эффективности составов BoNT/A (Park and Ahn (2013), J Clin Neurol, 9(3), 157-164).

Способ включает стимуляцию инъецированного EDB и регистрацию его потенциала действия (фигура 1B). BoNT/E или BoNT/A вводят введением под контролем УЗИ, и поверхностные электроды используют для стимуляции и регистрации потенциалов действия.

Фигура 2 суммирует методику повышения дозы, которая основана на обзоре данных безопасности (слепые) и фармакодинамики (анонимные) из предыдущей когорты.

Дизайн исследования и лечение

Фаза 1, осуществляют метод произвольного выбора в условиях двойной анонимности с контролем по плацебо (клиническое исследование с участием людей).

Каждый субъект получает одну внутримышечную дозу rBoNT-E или плацебо (произвольное распределение 3:1) в правую мышцу EDB.

Используют когорты субъектов, где каждой следующей когорте инъецируют более высокую дозу rBoNT-E, чем предыдущей. Все субъекты в каждой когорте получают одинаковую дозу rBoNT-E или плацебо.

Участвуют максимум восемь когорт:

- исходные когорты: четыре субъекта на когорту (три - rBoNT-E, один - плацебо).

- последующие когорты: после достижения ~50% ингибирования CMAP от исходного значения в течение трех последовательных моментов времени у, по меньшей мере, трех субъектов, инъецированных BoNT-E, когорты удваивают до восьми субъектов.

Когортам вводят последовательно, в порядке возрастания дозы:

- дозы повышают до достижения максимального ингибировании CMAP (≥85% снижения от исходного уровня) в течение трех последовательных моментов времени у, по меньшей мере, четырех из шести трех субъектов, инъецированных BoNT-E на когорту, в двух последовательных когортах.

- применяемые дозы: 0,1 единицы клеточного анализа (Ед CBA; 0,04 нг),0,5 Ед CBA (0,2 нг), 2,25 Ед CBA (0,9 нг) и 9,0 Ед CBA (3,6 нг).

Критерии включения:

- здоровые мужчины (18-55 лет) с индексом массы тела 18-30 кг/м².

- общая амплитуда EDB CMAP ≥5 мВ при стимулировании перонеального нерва для электрофизиологической проверки (при скрининге и до инъекции).

- добровольное согласие следовать протоколу исследования и оставаться в клинике в течение требуемого периода времени.

Критерии исключения:

- предыдущее лечение BoNT ≤6 месяцев до включения в исследование.

- анамнез гиперчувствиельности к компонентам состава rBoNT-E.

- медицинское состояние, которое подвергает пациента риску при воздействии BoNT.

- применение агентов нейромышечной передачи.

Клеточный анализ

Биологическую активность rBoNT/E определяют клеточным анализом (CBA) и выражают в % относительно эффективности определенного эталонного стандарта. Такой CBA имитирует in vivo механизм действия BoNT/E, т.е. связывание с рецепторами, приводящее к интернализации токсина и расщеплению синаптосомально-ассоциированного белка 25 (SNAP25) легкой цепи домена эндопептидазы. CBA применяет Neuro-2A, клеточную линию нейробластомы мышей, сконструированную для экспрессирования репортера, который применяет полноразмерный SNAP-25, фланкированный флуорофорами, голубым флуоресцентным белком и желтым флуоресцентным белком (YFP). При инкубировании сконструированных клеток с BoNT/E, токсин связывается и интернализуется через рецептор-опосредованный эндоцитоз, что приводит к выделению легкой цепи BoNT/E в цитозоль. Легкая цепь эндопептидазы расщепляет SNAP-25 в репортере, что приводит к выделению C-концевого фрагмента репортера в цитозоль, который содержит остатки SNAP-25 и YFP. Фрагмент быстро разлагается, что приводит к потере YFP флуоресценции. Биоактивность рекомбинантного BoNT/E определяется только, если токсин попадает в клетки через связывание рецептора H-цепи BoNT/E, интернализацию и транслокацию; таким образом, in vitro CBA имитирует природную биологию клетки BoNT/E. CBA единицы, соответствующие количествам BoNT/E, представлены в следующих примерах.

1 CBA единица может быть определена как количество BoNT/E, требуемое для расщепления 1 нМ субстрата (SNAP-25) за 1 минуту.

ПРИМЕР 1

Введение BoNT/E

Фигура 3 показывает, что плацебо варьируется около 100% CMAP исходного значения, и показывает четкий дозозависимый эффект для BoNT/E. Две более высокие дозы показали одинаковый фармакодинамический (ФД) профиль с достижением максимального ингибирования (более 90%), и длительность действия приблизительно 50 дней (15% отсечка ингибирования) или 30 дней (50% отсечка ингибирования).

Введение Dysport ®

Фигура 4 снова показывает, что плацебо варьируется около 100% CMAP исходного значения, и 60-70% ингибирование достигается для доз 40 и 70 Ед Dysport® (BoNT/A). Ингибирование достигает плато на несколько недель без восстановления (возврат к 15% ингибированию) к концу 26-недельного периода наблюдения.

ПРИМЕР 2

Анализ вплоть до 26 недель после введения

Сравнение Фигур 4 и 5 показывает, что исследованные диапазоны доз rBoNT-E показали быстрое наступление эффекта, больший пиковый эффект и меньшую продолжительность эффекта.

ПРИМЕР 3

Наступление действия

Время наступления действия (определенное как первый момент времени, в который регистрируют 15% ингибирование CMAP) для BoNT/E было быстрым и сопоставимым у всех субъектов и при всех исследованных уровнях доз rBoNT-E. Наступление также было обнаружено в промежуток времени от 1 дня (дня введения BoNT/E) до 2 дня, в отличие от 1 дня - 7 дня для Dysport®. Результаты представлены на Фигурах 6 и 7, и значения суммированы в таблицах ниже.

Таблица 1 показывает данные для rBoNT/E.

Уровень дозы	0,1 единиц СВА (0,04 нг) n=6	0,5 единиц СВА (0,2 нг) n=6	2,25 единиц СВА (0,9 нг) n=6	9 единиц СВА (3,6 нг) n=6
Время до наступления (день)	1,7±0,6 [1-2]	1,7±0,5 [1-2]	1,2±0,4 [1-2]	1,5±0,5 [1-2]
Время до достижения максимального ингибирования (день)	9,0±1,7 [7-10]	8,8±4,8 [2-14]	5,8±2,5 [3-10]	7,8±2,4 [5-10]
Максимальное ингибирование (%)	53,7±9,1 [43,7-61,6]	72,3±14,9 [45,1-87,8]	91,5±7,6 [77,6-100]	95,8±3,1 [91,6-98,7]
Время до восстановления (день)	21,0±0,0 [21-21]	37,9±9,3 [24-49]	57,4±15,2 [42-77]	54,6±7,7 [42-63]
Длительность эффекта (дни)	19,5±0,7 [19-20]	35,2±9,6 [22-48]	56,2±15,1 [41-76]	53,0±8,0 [40-62]

rBoNT/E ассоциируется с быстрым наступлением действия в период от 1 дня (дня введения) до 2 дня. Время до максимального эффекта было записано между 2 днем и 14 днем (самое позднее). rBoNT/E также ассоциируется с короткой длительностью действия около 50 для двух самых высоких тестированных доз.

Таблица 2 показывает данные для Dysport®.

Уровень дозы	Dysport 20 Ед (n=6)	Dysport 40 Ед (n=6)	Dysport 70 Ед (n=6)
Время до наступления (день)	3,5±2,1 [1-7]	2,3±1,0 [1-4]	2,7±1,9 [1-6]
Время до достижения максимального ингибирования (день)	56,5±42,9 [21-133]	29,3±19,3 [5-56]	15,3±6,7 [6-24]
Максимальное ингибирование (%)	52,2±13,3 [36,4-70,6]	72,5±12,8 [58,4-92,1]	70,3±7,8 [57,1-77,9]
Время до восстановления (день)	> 182 дня [а]	> 182 дня [а]	> 182 дня [а]

^аингибирование СМАР не восстановилось на 15% от исходного уровня к концу 6-месячного периода наблюдения

Dysport® демонстрирует более позднее наступление действия в период от 1 дня до 7 дня для исследованного диапазона доз, и длительность действие свыше 26-недель после введения.

ПРИМЕР 4

Сравнение 40 пг rBoNT/E и 20 Ед Dysport ®

Фигуры 8 и 9 показывают, что 40 пг rBoNT-E дает такую же амплитуду действия, как и 20 Ед Dysport®. То есть, 20 Ед Dysport=108 пг нейротоксина (5,38 пг нейротоксина/Ед).

Сравнение ФД свойств представлено в таблице ниже.

Таблица 3 показывает сравнительные данные для rBoNT/E и Dysport®.

ФД параметр	rBoNT-E - 40 пг	Dysport 20 Ед
Время наступления	D1 - D2	D1 - D7
Максимальный эффект	~ 50% ингибирование в среднем	~ 50% ингибирование в среднем
Время до максимального эффекта	9 дней в среднем	57 дней в среднем
Длительность эффекта	20 дней в среднем	>6 месяцев в среднем*

*примерно 40 дней для 2/6 субъектов, >26 недель для 4/6 субъектов

ПРИМЕР 5

Сравнение 200 пг rBoNT/E и 40 Ед Dysport ®

Фигуры 10 и 11 показывают, что 200 пг rBoNT-E дает такую же амплитуду действия, как и 40 Ед Dysport®. Сравнение ФД свойств представлено в таблице ниже.

Таблица 4 показывает сравнительные данные для rBoNT/E и Dysport®.

ФД параметр	rBoNT-E - 200 пг	Dysport 40 Ед
Время наступления	D1 - D2	D1 - D4
Максимальный эффект	~ 70% ингибирование в среднем	~ 70% ингибирование в среднем
Время до максимального эффекта	9 дней в среднем	29 дней в среднем
Длительность эффекта	35 дней в среднем	>6 месяцев в среднем

В заключение, BoNT/E демонстрирует:

- хороший общий профиль безопасности для однократных внутримышечных доз rBoNT-E вплоть до 3,6 нг у здоровых добровольцев (нормальные мышцы);

- отсутствие локальной диффузии в соседние мышцы (AH и ADQ);

- быстрое наступление действия независимо от исследованной дозы;

- дозозависимую амплитуду эффекта с максимальным эффектом, достигаемым от 0,9 нг;

- достижение максимального эффекта в течение приблизительно одной недели; и

- аналогичный ФД профиль для двух наивысших тестированных доз, связанный с длительность эффекта приблизительно 50 дней.

Наоборот, ингибирование CMAP все еще наблюдалось в конце 26-недельного (6 месяцев) периода регистрации для Dysport®.

Что касается амплитуды максимального эффекта:

- 20 Ед Dysport сравнивают с 0,04 нг rBoNT-E; и

- 40-70 Ед Dysport сравнивают с 0,2 нг rBoNT-E

ПРИМЕР 6

Лечение морщин верхней части лица

Представлен субъект с выраженными глабеллярными морщинами (3 степень выраженности согласно Шкале морщин лица (FWS), где 0=отсутствие и 3=выраженные). Дозу, по меньшей мере, 0,1 нг (на место инъекции) rBoNT/E вводят внутримышечно в пять мест (последовательно, так что каждая мышца инъецируется практически в одно и то же время): одна инъекция в мышцу гордецов, и две в каждую мышцу, сморщивающую бровь.

Степень выраженности глабеллярных морщин у субъекта оценивают через 7 дней (после введения) с помощью FWS, и определяют 0 степень (таким образом, показано, что rBoNT/E быстро начинает действовать для лечения морщин в верхней части лица).

Степень выраженности глабеллярных морщин у субъекта оценивают через 35 дней (после введения) с помощью FWS и устанавливают 2 степень (среднюю).

Степень выраженности глабеллярных морщин у субъекта оценивают через 56 дней (после введения) с помощью FWS и устанавливают 3 степень (выраженную) (таким образом, показано, что rBoNT/E имеет короткую продолжительность эффекта для лечения морщин в верхней части лица).

Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в настоящий документ в качестве ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и систем по настоящему изобретению будут очевидны специалистам в данной области техники без отклонения от объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в области биохимии и биотехнологии или родственных областях, входят в объем следующей формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ipsen Biopharm Limited

<120> ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ И КОСМЕТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ НЕЙРОТОКСИНА

БОТУЛИНА СЕРОТИПА E

<130> P60164WO

<150> GB1815844.4

<151> 2018-09-28

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3759

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 1

atgccaaaaa ttaatagttt taattataat gatcctgtta atgatagaac aattttatat

60

attaaaccag gcggttgtca agaattttat aaatcattta atattatgaa aaatatttgg

120

ataattccag agagaaatgt aattggtaca accccccaag attttcatcc gcctacttca

180

ttaaaaaatg gagatagtag ttattatgac cctaattatt tacaaagtga tgaagaaaag

240

gatagatttt taaaaatagt cacaaaaata tttaatagaa taaataataa tctttcagga

300

gggattttat tagaagaact gtcaaaagct aatccatatt tagggaatga taatactcca

360

gataatcaat tccatattgg tgatgcatca gcagttgaga ttaaattctc aaatggtagc

420

caagacatac tattacctaa tgttattata atgggagcag agcctgattt atttgaaact

480

aacagttcca atatttctct aagaaataat tatatgccaa gcaatcacgg ttttggatca

540

atagctatag taacattctc acctgaatat tcttttagat ttaatgataa tagtatgaat

600

gaatttattc aagatcctgc tcttacatta atgcatgaat taatacattc attacatgga

660

ctatatgggg ctaaagggat tactacaaag tatactataa cacaaaaaca aaatccccta

720

ataacaaata taagaggtac aaatattgaa gaattcttaa cttttggagg tactgattta

780

aacattatta ctagtgctca gtccaatgat atctatacta atcttctagc tgattataaa

840

aaaatagcgt ctaaacttag caaagtacaa gtatctaatc cactacttaa tccttataaa

900

gatgtttttg aagcaaagta tggattagat aaagatgcta gcggaattta ttcggtaaat

960

ataaacaaat ttaatgatat ttttaaaaaa ttatacagct ttacggaatt tgatttagca

1020

actaaatttc aagttaaatg taggcaaact tatattggac agtataaata cttcaaactt

1080

tcaaacttgt taaatgattc tatttataat atatcagaag gctataatat aaataattta

1140

aaggtaaatt ttagaggaca gaatgcaaat ttaaatccta gaattattac accaattaca

1200

ggtagaggac tagtaaaaaa aatcattaga ttttgtaaaa atattgtttc tgtaaaaggc

1260

ataaggaaat caatatgtat cgaaataaat aatggtgagt tattttttgt ggcttccgag

1320

aatagttata atgatgataa tataaatact cctaaagaaa ttgacgatac agtaacttca

1380

aataataatt atgaaaatga tttagatcag gttattttaa attttaatag tgaatcagca

1440

cctggacttt cagatgaaaa attaaattta actatccaaa atgatgctta tataccaaaa

1500

tatgattcta atggaacaag tgatatagaa caacatgatg ttaatgaact taatgtattt

1560

ttctatttag atgcacagaa agtgcccgaa ggtgaaaata atgtcaatct cacctcttca

1620

attgatacag cattattaga acaacctaaa atatatacat ttttttcatc agaatttatt

1680

aataatgtca ataaacctgt gcaagcagca ttatttgtaa gctggataca acaagtgtta

1740

gtagatttta ctactgaagc taaccaaaaa agtactgttg ataaaattgc agatatttct

1800

atagttgttc catatatagg tcttgcttta aatataggaa atgaagcaca aaaaggaaat

1860

tttaaagatg cacttgaatt attaggagca ggtattttat tagaatttga acccgagctt

1920

ttaattccta caattttagt attcacgata aaatcttttt taggttcatc tgataataaa

1980

aataaagtta ttaaagcaat aaataatgca ttgaaagaaa gagatgaaaa atggaaagaa

2040

gtatatagtt ttatagtatc gaattggatg actaaaatta atacacaatt taataaaaga

2100

aaagaacaaa tgtatcaagc tttacaaaat caagtaaatg caattaaaac aataatagaa

2160

tctaagtata atagttatac tttagaggaa aaaaatgagc ttacaaataa atatgatatt

2220

aagcaaatag aaaatgaact taatcaaaag gtttctatag caatgaataa tatagacagg

2280

ttcttaactg aaagttctat atcctattta atgaaattaa taaatgaagt aaaaattaat

2340

aaattaagag aatatgatga gaatgtcaaa acgtatttat tgaattatat tatacaacat

2400

ggatcaatct tgggagagag tcagcaagaa ctaaattcta tggtaactga taccctaaat

2460

aatagtattc cttttaagct ttcttcttat acagatgata aaattttaat ttcatatttt

2520

aataaattct ttaagagaat taaaagtagt tcagttttaa atatgagata taaaaatgat

2580

aaatacgtag atacttcagg atatgattca aatataaata ttaatggaga tgtatataaa

2640

tatccaacta ataaaaatca atttggaata tataatgata aacttagtga agttaatata

2700

tctcaaaatg attacattat atatgataat aaatataaaa attttagtat tagtttttgg

2760

gtaagaattc ctaactatga taataagata gtaaatgtta ataatgaata cactataata

2820

aattgtatga gagataataa ttcaggatgg aaagtatctc ttaatcataa tgaaataatt

2880

tggacattgc aagataatgc aggaattaat caaaaattag catttaacta tggtaacgca

2940

aatggtattt ctgattatat aaataagtgg atttttgtaa ctataactaa tgatagatta

3000

ggagattcta aactttatat taatggaaat ttaatagatc aaaaatcaat tttaaattta

3060

ggtaatattc atgttagtga caatatatta tttaaaatag ttaattgtag ttatacaaga

3120

tatattggta ttagatattt taatattttt gataaagaat tagatgaaac agaaattcaa

3180

actttatata gcaatgaacc taatacaaat attttgaagg atttttgggg aaattatttg

3240

ctttatgaca aagaatacta tttattaaat gtgttaaaac caaataactt tattgatagg

3300

agaaaagatt ctactttaag cattaataat ataagaagca ctattctttt agctaataga

3360

ttatatagtg gaataaaagt taaaatacaa agagttaata atagtagtac taacgataat

3420

cttgttagaa agaatgatca ggtatatatt aattttgtag ccagcaaaac tcacttattt

3480

ccattatatg ctgatacagc taccacaaat aaagagaaaa caataaaaat atcatcatct

3540

ggcaatagat ttaatcaagt agtagttatg aattcagtag gaaataattg tacaatgaat

3600

tttaaaaata ataatggaaa taatattggg ttgttaggtt tcaaggcaga tactgtagtt

3660

gctagtactt ggtattatac acatatgaga gatcatacaa acagcaatgg atgtttttgg

3720

aactttattt ctgaagaaca tggatggcaa gaaaaataa

3759

<210> 2

<211> 1251

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 2

Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg Thr

1 5 10 15

Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser Phe

20 25 30

Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile Gly

35 40 45

Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly Asp

50 55 60

Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys Asp

65 70 75 80

Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn Asn

85 90 95

Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro Tyr

100 105 110

Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp Ala

115 120 125

Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu Leu

130 135 140

Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His Gly

165 170 175

Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe Arg

180 185 190

Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu Thr

195 200 205

Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Lys

210 215 220

Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu Ile

225 230 235 240

Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr Thr

260 265 270

Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys Val

275 280 285

Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu Ala

290 295 300

Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn Ile

305 310 315 320

Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu Phe

325 330 335

Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile Gly

340 345 350

Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile Tyr

355 360 365

Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe Arg

370 375 380

Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr Gly

385 390 395 400

Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val Ser

405 410 415

Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly Glu

420 425 430

Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile Asn

435 440 445

Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr Glu

450 455 460

Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala Pro

465 470 475 480

Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala Tyr

485 490 495

Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His Asp

500 505 510

Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val Pro

515 520 525

Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala Leu

530 535 540

Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile Asn

545 550 555 560

Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile Gln

565 570 575

Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr Val

580 585 590

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu Ala

595 600 605

Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala Leu

610 615 620

Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu Leu

625 630 635 640

Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser Ser

645 650 655

Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys Glu

660 665 670

Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn Trp

675 680 685

Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met Tyr

690 695 700

Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu Ser

705 710 715 720

Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn Lys

725 730 735

Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser Ile

740 745 750

Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser Tyr

755 760 765

Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu Tyr

770 775 780

Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His Gly

785 790 795 800

Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr Asp

805 810 815

Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp Asp

820 825 830

Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys Ser

835 840 845

Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr

850 855 860

Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr

865 870 875 880

Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu

885 890 895

Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys

900 905 910

Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys

915 920 925

Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp

930 935 940

Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp

945 950 955 960

Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr

965 970 975

Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val

980 985 990

Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly

995 1000 1005

Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His

1010 1015 1020

Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr

1025 1030 1035

Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu Leu

1040 1045 1050

Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr

1055 1060 1065

Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys

1070 1075 1080

Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile Asp

1085 1090 1095

Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser Thr

1100 1105 1110

Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys Ile

1115 1120 1125

Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg Lys

1130 1135 1140

Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His Leu

1145 1150 1155

Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys Thr

1160 1165 1170

Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val Val

1175 1180 1185

Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn

1190 1195 1200

Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val

1205 1210 1215

Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr Asn

1220 1225 1230

Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp

1235 1240 1245

Gln Glu Lys

1250

<210> 3

<211> 1251

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 3

Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg

1 5 10 15

Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser

20 25 30

Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile

35 40 45

Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys

65 70 75 80

Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn

85 90 95

Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro

100 105 110

Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp

115 120 125

Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu

130 135 140

Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr

145 150 155 160

Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His

165 170 175

Arg Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe

180 185 190

Arg Phe Asn Asp Asn Cys Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu

195 200 205

Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala

210 215 220

Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu

225 230 235 240

Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr

260 265 270

Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys

275 280 285

Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu

290 295 300

Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn

305 310 315 320

Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu

325 330 335

Phe Asp Leu Arg Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile

340 345 350

Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile

355 360 365

Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe

370 375 380

Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr

385 390 395 400

Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val

405 410 415

Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly

420 425 430

Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile

435 440 445

Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr

450 455 460

Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala

465 470 475 480

Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala

485 490 495

Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His

500 505 510

Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val

515 520 525

Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala

530 535 540

Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile

545 550 555 560

Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile

565 570 575

Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr

580 585 590

Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu

595 600 605

Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala

610 615 620

Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu

625 630 635 640

Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser

645 650 655

Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys

660 665 670

Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn

675 680 685

Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met

690 695 700

Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu

705 710 715 720

Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn

725 730 735

Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser

740 745 750

Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser

755 760 765

Tyr Leu Met Lys Ile Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu

770 775 780

Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His

785 790 795 800

Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr

805 810 815

Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp

820 825 830

Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys

835 840 845

Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp

850 855 860

Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys

865 870 875 880

Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser

885 890 895

Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr

900 905 910

Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn

915 920 925

Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg

930 935 940

Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile

945 950 955 960

Trp Thr Phe Glu Asp Asn Arg Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn

965 970 975

Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe

980 985 990

Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile

1010 1015 1020

His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr

1025 1030 1035

Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu

1040 1045 1050

Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn

1055 1060 1065

Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp

1070 1075 1080

Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile

1085 1090 1095

Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser

1100 1105 1110

Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys

1115 1120 1125

Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg

1130 1135 1140

Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

1145 1150 1155

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys

1160 1165 1170

Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val

1175 1180 1185

Val Met Asn Ser Val Gly Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn

1190 1195 1200

Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val

1205 1210 1215

Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr Asn

1220 1225 1230

Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp

1235 1240 1245

Gln Glu Lys

1250

<210> 4

<211> 421

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 4

Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg Thr

1 5 10 15

Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser Phe

20 25 30

Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile Gly

35 40 45

Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly Asp

50 55 60

Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys Asp

65 70 75 80

Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn Asn

85 90 95

Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro Tyr

100 105 110

Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp Ala

115 120 125

Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu Leu

130 135 140

Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His Gly

165 170 175

Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe Arg

180 185 190

Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu Thr

195 200 205

Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Lys

210 215 220

Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu Ile

225 230 235 240

Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly

245 250 255

Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr Thr

260 265 270

Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys Val

275 280 285

Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu Ala

290 295 300

Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn Ile

305 310 315 320

Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu Phe

325 330 335

Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile Gly

340 345 350

Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile Tyr

355 360 365

Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe Arg

370 375 380

Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr Gly

385 390 395 400

Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val Ser

405 410 415

Val Lys Gly Ile Arg

420

<210> 5

<211> 830

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 5

Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly Glu Leu Phe Phe Val Ala

1 5 10 15

Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile

20 25 30

Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr Glu Asn Asp Leu Asp Gln

35 40 45

Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala Pro Gly Leu Ser Asp Glu

50 55 60

Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp

65 70 75 80

Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His Asp Val Asn Glu Leu Asn

85 90 95

Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Asn Asn

100 105 110

Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala Leu Leu Glu Gln Pro Lys

115 120 125

Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile Asn Asn Val Asn Lys Pro

130 135 140

Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile Gln Gln Val Leu Val Asp

145 150 155 160

Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp

165 170 175

Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu Ala Leu Asn Ile Gly Asn

180 185 190

Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala Leu Glu Leu Leu Gly Ala

195 200 205

Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu Leu Ile Pro Thr Ile Leu

210 215 220

Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser Ser Asp Asn Lys Asn Lys

225 230 235 240

Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys Glu Arg Asp Glu Lys Trp

245 250 255

Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn Trp Met Thr Lys Ile Asn

260 265 270

Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn

275 280 285

Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr

290 295 300

Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn Lys Tyr Asp Ile Lys Gln

305 310 315 320

Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser Ile Ala Met Asn Asn Ile

325 330 335

Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile

340 345 350

Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Asp Glu Asn Val Lys

355 360 365

Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His Gly Ser Ile Leu Gly Glu

370 375 380

Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr Asp Thr Leu Asn Asn Ser

385 390 395 400

Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp Asp Lys Ile Leu Ile Ser

405 410 415

Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys Ser Ser Ser Val Leu Asn

420 425 430

Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asp Ser

435 440 445

Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys Tyr Pro Thr Asn Lys Asn

450 455 460

Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser Glu Val Asn Ile Ser Gln

465 470 475 480

Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr Lys Asn Phe Ser Ile Ser

485 490 495

Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn Lys Ile Val Asn Val Asn

500 505 510

Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg Asp Asn Asn Ser Gly Trp

515 520 525

Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Asn

530 535 540

Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn Tyr Gly Asn Ala Asn Gly

545 550 555 560

Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asp

565 570 575

Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Asp Gln

580 585 590

Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu

595 600 605

Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr

610 615 620

Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu

625 630 635 640

Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn

645 650 655

Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro

660 665 670

Asn Asn Phe Ile Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn

675 680 685

Ile Arg Ser Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys

690 695 700

Val Lys Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val

705 710 715 720

Arg Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

725 730 735

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys Thr

740 745 750

Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val Val Met

755 760 765

Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn Asn Asn Gly

770 775 780

Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr Val Val Ala Ser

785 790 795 800

Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr Asn Ser Asn Gly Cys

805 810 815

Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp Gln Glu Lys

820 825 830

<---

Claims

1. Способ лечения расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E (BoNT/E), где способ включает введение BoNT/E субъекту-человеку, и где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и

снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения,

где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки,

где рекомбинантный BoNT/E вводят в дозе от 0,04 до 4 нг.

2. Способ лечения расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E (BoNT/E), где способ включает введение BoNT/E субъекту-человеку, и где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и

где ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается по существу линейно после указанного максимального ингибирования секреции нейромедиатора,

где указанное по существу линейное снижение происходит в течение 10-56 дней, 10-42 дней и/или 10-21 дней после введения,

3. Способ лечения расстройства, поддающегося лечению ботулиническим нейротоксином серотипа E (BoNT/E), где способ включает введение BoNT/E субъекту-человеку, и где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и

где % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени снижается в среднем на 1-8% в день после указанного максимального ингибирования секреции нейромедиатора,

где указанное снижение % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени происходит в течение 10-24 дней, 6-42 дней, 10-42 дней, 10-49 дней и/или 10-56 дней после введения,

4. Косметический способ для подавления морщин в верхней части лица, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку, где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и

снижает до >25% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени на 14 день после введения, где BoNT/E представляет собой рекомбинантный BoNT/E, который не содержит комплексообразующие белки,

5. Косметический способ для подавления морщин в верхней части лица, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку, где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и

6. Косметический способ для подавления морщин в верхней части лица, включающий введение BoNT/E субъекту-человеку, где введение BoNT/E дает максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и

7. Способ по любому из пп. 1-3 или косметический способ по любому из пп. 4-6, где общая введенная доза BoNT/E составляет менее чем 0,2 нг.

8. Способ по любому из пп. 1-3 или 7 или косметический способ по любому из пп. 4-6 или 7, где общая введенная доза BoNT/E составляет 0,01 – 0,04 нг.

9. Способ по любому из пп. 1-3 или 7, 8 или косметический способ по любому из пп. 4-6 или 7, 8, где BoNT/E вводится и дает:

снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение от >21 до <100 дней после введения.

10. Способ по п. 9, где BoNT/E вводится и дает:

снижает до 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение от >40 до <80 дней после введения.

11. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-10 или косметический способ по любому из пп. 4-10, где BoNT/E вводится и дает, по меньшей мере, 40% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤10 дней после введения.

12. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-11 или косметический способ по любому из пп. 4-11, где BoNT/E вводится и дает 15% или меньше ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение <80 дней после введения.

13. Способ или косметический способ по п. 12, где BoNT/E вводится и дает 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение <60 дней после введения.

14. Способ или косметический способ по п. 13, где BoNT/E вводится и дает 15% или менее ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение <30 дней после введения.

15. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-14 или косметический способ по любому из пп. 4-14, где BoNT/E вводится и дает более чем 15% ингибирование секреции нейромедиатора в течение 5-100 дней.

16. Способ или косметический способ по п. 15, где BoNT/E вводится и дает более чем 15% ингибирование секреции нейромедиатора в течение 5-60 дней.

17. Способ или косметический способ по п. 16, где BoNT/E вводится и дает более чем 15% ингибирование секреции нейромедиатора в течение 5-40 дней.

18. Способ или косметический способ по п. 17, где BoNT/E вводится и дает более чем 15% ингибирование секреции нейромедиатора в течение 5-30 дней.

19. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-18 или косметический способ по любому из пп. 4-18, где BoNT/E вводится и дает 40-60% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения.

20. Способ или косметический способ по п. 19, где BoNT/E вводится и дает 40-60% ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤11 дней после введения.

21. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-20 или косметический способ по любому из пп. 4-20, где BoNT/E вводится и дает:

а. максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤13 дней после введения; и

b. последующее снижение % ингибирования секреции нейромедиатора на 1-10% в день.

22. Способ или косметический способ по п. 21, где BoNT/E вводится и дает:

а. максимальное ингибирование секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени в течение ≤10 дней после введения; и

b. последующее снижение % ингибирования секреции нейромедиатора на 1-3% в день от дня 10-24, от дня 6-42, от дня 10-42 и/или от дня 10-56 после введения.

23. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-22 или косметический способ по любому из пп. 4-22, где % ингибирования секреции нейромедиатора из клетки-мишени или ткани-мишени измеряют с применением электрофизиологии.

24. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-23 или косметический способ по любому из пп. 4-23, где BoNT/E:

а. кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 1; или

b. содержит полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

25. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-24 или косметический способ по любому из пп. 4-24, где BoNT/E содержит полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности к SEQ ID NO: 2, при условии, что полипептидная последовательность включает одну или несколько из следующих аминокислот, где нумерация положений аминокислот начинается от N-концевого метионинового аминокислотного остатка и заканчивается на C-концевом аминокислотном остатке BoNT/E белка:

26. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-25, где расстройством является одно или несколько из: состояния, связанного с косоглазием, блефароспазма, косоглазия, дистонии, кривошеи, косметологического применения, где полезно временное поражение клеток/мышц через подавление или инактивацию SNARE, нервно-мышечного расстройства или состояния подвижности глаз, писчего спазма, блефароспазма, бруксизма, болезни Вильсона, тремора, тиков, сегментарного миоклонуса, спазмов, спастичности из-за хронического рассеянного склероза, спастичности, приводящей к нарушению контроля над мочевым пузырем, анимуса, спазма спины, ушиба или разрыва мышц, головных болей напряжения, синдрома подъемника таза, расщелины позвоночника, поздней дискинезии, болезни Паркинсона, заикания, гемифациального спазма, расстройства век, церебрального паралича, очаговой спастичности, спазматического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей, тиков, тремора, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, дисфагии, слезотечения, гипергидроза, чрезмерного слюноотделения, чрезмерной секреции желудочно-кишечного тракта, мышечной боли, головной боли, межбровных складок, морщин кожи, рака, расстройств матки, мочеполовых расстройств, урогенитально-неврологических расстройств, хронического нейрогенного воспаления и расстройства гладкой мускулатуры.

27. Способ по п. 26, где

а. дистонию выбирают из спазматической дистонии, оромандибулярной дистонии, очаговой дистонии, поздней дистонии, дистонии мышц гортани, дистонии конечностей, шейной дистонии;

b. кривошея представляет собой спастическую кривошею;

с. нервно-мышечное расстройство или состояние подвижности глаз выбирают из сопутствующего косоглазия, вертикального косоглазия, паралича наружной прямой мышцы, нистагма и дистироидной миопатии;

d. мышечная боль представляет собой боль при мышечных спазмах; и/или

е. головная боль представляет собой головную боль напряжения.

28. Способ по любому из пп. 1-3 или 7-27, где расстройством является спастичность верхних конечностей.

29. Способ по п. 28, где расстройством является спастичность верхних конечностей у субъекта в возрасте более 18 лет.

30. Косметический способ по любому из пп. 4-25, где необязательно морщинами в верхней части лица являются одни или несколько, выбранных из глабеллярных морщин, морщин в углах глаз, лобных морщин или их комбинации.

31. Косметический способ по любому из пп. 4-25 или 30, где косметический способ предназначен для лечения глабеллярных морщин.