ES2596128T3 - Toxinas clostridiales degradables - Google Patents
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Abstract
Una toxina clostridial BoNT/A que comprende al menos un sitio de escisión de inactivación situado dentro de una región de sitios de escisión de inactivación, en donde la región de sitios de escisión de inactivación está situada en el dominio 871 - 895 de la SEQ ID NO: 1, en donde el al menos un sitio de escisión de inactivación comprende un sitio doble de trombina-trombina.
Description
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técnica reconocen que dentro de cada tipo de toxina clostridial puede haber subtipos que difieren algo en su secuencia de aminoácidos, y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, actualmente hay 5 subtipos de BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos específicos que muestran una identidad de aminoácidos de aproximadamente 84% a 93% cuando se comparan con el subtipo BoNT/A de SEQ ID NO: 1. Como otro ejemplo, hay actualmente 5 subtipos de BoNT/B, BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/Bnp y BoNT/Bbv, con subtipos específicos que muestran una identidad de aminoácidos de 93% a 96% cuando se comparan con el subtipo BoNT/B de ID NO: 6. Como otro ejemplo más, hay actualmente tres subtipos de BoNT/E, BoNT/E1, BoNT/E2 y BoNT/E3, con subtipos específicos que muestran una identidad de aminoácidos de 95% a 99% cuando se comparan con el subtipo BoNT/E de SEQ ID NO: 15. Aunque los 7 BoNT serotipos tienen estructura y propiedades farmacológicas similares, cada uno presenta también características bacteriológicas heterogéneas. En cambio, la toxina tetánica (TeNT) es producida por un grupo uniforme de C. tetani. Otros dos tipos de especies de clostridios, C. baratii y C. butyricum, producen toxinas, BaNT y BuNT, que son similares a BoNT/F y BoNT/E, respectivamente.
Cada una de las toxinas es traducida como un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que posteriormente es escindido por escisión proteolítica dentro de un bucle disulfuro por una proteasa natural (FIG. 1). Esta escisión se produce dentro de la región discreta de bucle bicatenario creado entre dos restos de cisteína que forman un puente disulfuro. Este procesamiento postraduccional produce una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente (HC) 100 kDa mantenidas entre sí por el enlace disulfuro sencillo e interacciones no covalentes entre las dos cadenas. La proteasa natural usada para convertir la molécula monocatenaria en bicatenaria actualmente no se conoce. En algunos serotipos, tales como, p. ej., BoNT/A, la proteasa natural es producida de forma endógena por el serotipo bacteriano y la escisión se produce dentro de la célula antes de que la toxina sea liberada al entorno. Sin embargo, en otros serotipos, tales como, p. ej., BoNT/E, parece que la cepa bacteriana no produce una proteasa endógena capaz de convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. en estas situaciones, la toxina es liberada de la célula como una toxina monocatenaria que posteriormente se convierte en la forma bicatenaria mediante una proteasa natural encontrada en el entorno.
Cada molécula bicatenaria madura comprende tres dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio enzimático situado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene actividad de endopeptidasa dependiente de cinc que se dirige específicamente a componentes nucleares del aparato de liberación de neurotransmisores; 2) un dominio de traslocación contenido dentro de la mitad amino terminal de la HC (HN) que facilita la liberación de la LC de las vesículas intracelulares en el citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión encontrado dentro de la mitad carboxilo terminal de la HC (HC) que determina la actividad de unión y especificidad de unión de la toxina al complejo receptor situado en la superficie de la célula diana. D. B. Lacy y R. C. Stevens, "Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins", J. Mol. Biol. 291: 1091-1104 (1999). El dominio HC comprende dos características estructurales distintas de tamaño aproximadamente igual, separadas por una hélice α, designadas subdominios HCN y HCC. La tabla 1 da regiones límite aproximadas para cada dominio y subdominio encontrado en las toxinas clostridiales de ejemplo.
- Tabla 1. Regiones y secuencias de referencia de toxinas clostridiales
- Toxina
- SEQ ID NO: LC Bucle bicatenario HN HC
- HCN
- Conector α Hcc
- BoNT/A
- 1 M1/P2-L429 C430-C454 I455-I873 I874-N1080 E1081-Q1091 S1092-L1296
- BoNT/B
- 6 M1/P2-M436 C437-C446 I447-I860 L861-S1067 Q1068-Q1078 S1079-E1291
- BoNT/C1
- 11 M1/P2-F436 C437-C453 R454-1868 N869-D1081 G1082-L1092 Q1093-E1291
- BoNT/D
- 13 M1/T2-V436 C437-C450 1451-1864 N865-S1069 N1069-Q1079 I1080-E1276
- BoNT/E
- 15 M1/P2-F411 C412-C426 I427-I847 K848-D1055 E1056-E1066 P1067-K1252
- BoNT/F
- 18 M1/P2-F428 C429-C445 I446-I865 K866-D1075 K1076-E1086 P1087-E1274
- BoNT/G
- 21 M1/P2-M435 C436-C450 1451-1865 S866-N1075 A1076-Q1086 S1087-E1297
- TeNT
- 22 M1/P2-L438 C439-C467 I468-L881 K882-N1097 P1098-Y1108 L1109-D1315
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482(1-2) FEBS Lett. 119-124 (2000). El dominio HC se inclina alejándose del dominio HN exponiendo los bucles de la superficie y haciéndolos accesibles para la unión. No se producen contacto entre la cadena ligera y el dominio HC.
Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, una toxina clostridial. Las reivindicaciones se refieren a la toxina clostridial BoNT/A. Como se usa en la presente memoria, la expresión "toxina clostridial" se refiere a cualquier neurotoxina producida por una cepa de toxina clostridial que ejecuta el mecanismo celular completo por el cual una toxina clostridial intoxica una célula, y abarca la unión de una toxina clostridial a un complejo receptor de afinidad baja o alta, la internalización del complejo de toxina/receptor, la traslocación de la cadena ligera de la toxina clostridial al citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de toxina clostridial. Una toxina clostridial comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de traslocación de toxina clostridial y un dominio de unión de toxina clostridial. Las toxinas clostridiales de ejemplo incluyen las producidas por un Clostridium botulinum, un Clostridium tetani, un Clostridium baratii y un Clostridium butyricum.
Una toxina clostridial incluye, sin limitación, variantes naturales de la toxina clostridial, tales como, p. ej., isoformas de la toxina clostridial y subtipos de la toxina clostridial; variantes no naturales de la toxina clostridial, tales como, p. ej., variantes conservadoras de la toxina clostridial, variantes no conservadoras de la toxina clostridial y fragmentos de toxina clostridial activos de los mismos o cualquier combinación de los mismos. Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante de toxina clostridial", sea natural o no, se refiere a una toxina clostridial que tiene al menos un cambio de aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia descritas (tabla 1) y se puede describir en porcentaje de identidad respecto a la correspondiente región de esa secuencia de referencia. Como ejemplos no limitantes, una variante de BoNT/A de SEQ ID NO: 1 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 1; una variante de BoNT/B de SEQ ID NO: 6 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 6; una variante de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 11; una variante de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 13; una variante de BoNT/E de SEQ ID NO: 15 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 15; una variante de BoNT/F de SEQ ID NO: 18 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 18; una variante de BoNT/G de SEQ ID NO: 21 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 21; una variante de TeNT c de SEQ ID NO: 22 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 22; una variante de BaNT de SEQ ID NO: 23 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 23; y una variante de BuNT de SEQ ID NO: 24 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 24.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante natural de toxina clostridial" se refiere a cualquier toxina clostridial producida sin la ayuda de cualquier manipulación humana, incluyendo sin limitación, isoformas de la toxina clostridial producidas a partir de transcritos empalmados de forma alternativa, isoformas de la toxina clostridial producidas por mutación espontánea y subtipos de toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de una isoforma de toxina clostridial incluyen, p. ej., isoformas BoNT/A, isoformas BoNT/B, isoformas BoNT/C1, isoformas BoNT/D, isoformas BoNT/E, isoformas BoNT/F, isoformas BoNT/G, isoformas TeNT, isoformas BaNT y isoformas BuNT. Los ejemplos no limitantes de un subtipo de toxina clostridial incluyen, p. ej., subtipos de BoNT/A BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5; subtipos de BoNT/B BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B bivalente y BoNT/B no proteolítico; subtipos de BoNT/C1 BoNT/C1-1 y BoNT/C1-2; subtipos de BoNT/E BoNT/E1, BoNT/E2, y BoNT/E3; subtipos de BoNT/F BoNT/F1, BoNT/F2 y BoNT/F3; y subtipos de BuNT BuNT-1 y BuNT-2. Otros ejemplos no limitantes de un subtipo de toxina clostridial incluyen, p. ej., subtipos de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5; subtipos de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10; subtipos de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12; subtipos de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17; subtipos de BoNT/F SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19,y SEQ ID NO: 20; y subtipos de BuNT de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no natural de toxina clostridial" se refiere a cualquier toxina clostridial producida con ayuda de manipulación humana, incluyendo sin limitación, toxinas clostridiales producidas por modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y toxinas clostridiales producidas por síntesis química. Los ejemplos no limitantes de variantes no naturales de toxina clostridial incluyen,
p. ej., variantes conservadoras de toxina clostridial, variantes no conservadoras de toxina clostridial y fragmentos activos de toxina clostridial.
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Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante conservadora de toxina clostridial" se refiere a una toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de la toxina clostridial de referencia (tabla 1). Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de enlace de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica o similar o cualquier combinación de los mismos. Una variante conservadora de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante de toxina clostridial, y puede sustituir a la toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Una variante conservadora de toxina clostridial puede sustituir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 o 500 o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora de toxina clostridial. Una variante conservadora de toxina clostridial también puede sustituir al menos 5, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos contiguos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora de la toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de una variante conservadora de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de BoNT/A, variantes conservadoras de BoNT/B, variantes conservadoras de BoNT/C1, variantes conservadoras de BoNT/D, variantes conservadoras de BoNT/E, variantes conservadoras de BoNT/F, variantes conservadoras de BoNT/G, variantes conservadoras de TeNT, variantes conservadoras de BaNT y variantes conservadoras de BuNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no conservadora de toxina clostridial" se refiere a una toxina clostridial en la que 1) se elimina al menos un aminoácido de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial; 2) se añade al menos un aminoácido a la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar con el aminoácido original de la secuencia de la toxina clostridial de referencia (tabla 1). Una variante no conservadora de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial, y puede sustituir a la toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente invención. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede eliminar uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede añadir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos a la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede sustituir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 o 500 o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no conservadora de toxina clostridial también puede sustituir al menos 5, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos contiguos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de la toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de una variante no conservadora de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de BoNT/A, variantes no conservadoras de BoNT/B, variantes no conservadoras de BoNT/C1, variantes no conservadoras de BoNT/D, variantes no conservadoras de BoNT/E, variantes no conservadoras de BoNT/F, variantes no conservadoras de BoNT/G, variantes no conservadoras de TeNT, variantes no conservadoras de BaNT y variantes no conservadoras de BuNT.
También está contemplado que cualquiera de una variedad de fragmentos de toxina clostridial BoNT/A puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva, con la condición de que estos fragmentos activos puedan ejecutar el mecanismo celular completo por el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Por lo tanto, aspectos de esta realización pueden incluir fragmentos de toxina clostridial que tienen una longitud de, p. ej., al menos 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o al menos 1200 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir fragmentos de toxina clostridial que tienen una longitud de, p. ej., como máximo 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o como máximo 1200 aminoácidos.
También está contemplado que cualquiera de una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprenden la cadena ligera, pueden ser útiles en aspectos de la presente memoria descriptiva, con la condición de que estos fragmentos de cadena ligera puedan dirigirse específicamente a los componentes nucleares de la liberación de neurotransmisores y así participar en la ejecución del mecanismo celular completo por el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las cadenas ligeras de toxinas clostridiales tienen aproximadamente 420-460 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio enzimático de toxina clostridial (tabla 1). La investigación ha mostrado que no es necesaria la longitud entera de la cadena ligera de la toxina clostridial para la actividad enzimática del dominio enzimático de la toxina clostridial. Como un ejemplo no limitante, los primeros ocho aminoácidos de una cadena ligera de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Igualmente, el extremo carboxilo de la cadena ligera no es necesario para la actividad. Como un ejemplo no limitante, los últimos 32 aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Por lo tanto, aspectos de esta realización incluyen una cadena ligera de toxina clostridial que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial que tiene una longitud de, p. ej., al menos 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización incluyen una cadena ligera de toxina clostridial que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial que tiene una longitud de, p. ej., como máximo 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos.
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- TABLA 2. Propiedades de los aminoácidos
- Propiedad
- Aminoácidos
- Alifático
- G, A, I, L, M, P, V
- Aromático
- F, H, W, Y
- Ramificado en C-beta
- I, V, T
- Hidrófobo
- C, F, I, L, M, V, W
- Polar pequeño
- D, N, P
- No polar pequeño
- A, C, G, S, T
- Polar grande
- E, H, K, Q, R, W, Y
- No polar grande
- F, I, L, M, V
- Cargado
- D, E, H, K, R
- No cargado
- C, S, T
- Negativo
- D, E
- Positivo
- H, K, R
- Ácido
- D, E
- Básico
- K, R
- Amida
- N, Q
- TABLA 3. Sustituciones de aminoácidos
- Aminoácido
- Sustitución favorecida Sustituciones neutras Sustitución desfavorecida
- A
- G, S, T C, E, I, K, M, L, P, Q, R, V D, F, H, N, Y, W
- C
- F, S, Y, W A, H, I, M, L, T, V D, E, G, K, N, P, Q, R
- D
- E, N G, H, K, P, Q, R, S, T A, C, I, L,
- E
- D, K, Q A, H, N, P, R, S, T C, F, G, I, L, M, V, W, Y
- F
- M, L, W, Y C, I, V A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T
- G
- A, S D, K, N, P, Q, R C, E, F, H, I, L, M, T, V, W, Y
- H
- N, Y C, D, E, K, Q, R, S, T, W A, F, G, I, L, M, P, V
- I
- V, L, M A, C, T, F, Y D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, W
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Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un
dominio de traslocación de toxina clostridial y un dominio de unión de toxina clostridial. En un aspecto de esta
realización, una toxina clostridial comprende una variante de toxina clostridial natural, tal como, p. ej., una isoforma
5 de toxina clostridial o un subtipo de toxina clostridial. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial
comprende una variante no natural de toxina clostridial, tal como, p. ej., una variante conservadora de toxina
clostridial, una variante no conservadora de toxina clostridial o un fragmento activo de toxina clostridial o cualquier
combinación de los mismos. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende un dominio
enzimático de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de toxina clostridial o un 10 fragmento activo del mismo, un dominio de unión de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo o cualquier
combinación de los mismos. La toxina clostridial de la invención comprende BoNT/A.
En otra realización, un aminoácido hidrófobo en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina
clostridial se puede sustituir por otro aminoácido hidrófobo. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos incluyen, p. ej.,
C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido alifático en una posición particular en la 15 cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de
aminoácidos alifáticos incluyen, p. ej., A, I, L, P y V. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido
aromático en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro
aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más
de esta realización, un aminoácido de apilamiento en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina 20 clostridial se puede sustituir por otro aminoácido de apilamiento. Los ejemplos de aminoácidos de apilamiento
incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En un aspecto más de esta realización, un aminoácido polar en una posición particular
en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de
aminoácidos polares incluyen, p. ej., D, E, K, N, Q, y R. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido
menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede 25 sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes
incluyen, p. ej., A, H, G, P, S, T e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga positiva en
una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con
carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, p. ej., K, R, y H. En otro aspecto más de
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SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 102; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.
En una realización de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio de traslocación de BoNT/C1 y un dominio de unión de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante natural de BoNT/C1, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 o un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante natural de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 o un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante no natural de BoNT/C1 variante, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/C1, una variante no conservadora de BoNT/C1, un fragmento activo de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante no natural de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/C1, una variante no conservadora BoNT/C1, un fragmento activo de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/C1, fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 3; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.
En una realización de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/D. En un aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de traslocación de BoNT/D y un dominio de unión de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende una variante natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D o un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende una variante natural de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D o un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende una variante no natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/D, una variante no conservadora de BoNT/D, un fragmento activo de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende una variante no natural de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/D, una variante no conservadora de BoNT/D, un fragmento activo de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/D o un fragmento
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activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/D o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEX ID NO: 14 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14.
En una realización de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/E. En un aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/E y un dominio de unión de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende una variante natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E o un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende una variante natural de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E o un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende una variante no natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/E, una variante no conservadora de BoNT/E, un fragmento activo de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende una variante no natural de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/E, una variante no conservadora de BoNT/E, un fragmento activo de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/E o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17.
En una realización de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/F. En un aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/F y un dominio de unión de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende una variante natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F o un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende una variante natural de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F o un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende una variante no natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/F, una variante no conservadora de BoNT/F, un fragmento activo de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende una variante no natural de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/F, una variante no conservadora de BoNT/F, un fragmento activo de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta
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En otros aspectos de esta realización, una BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, una BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, una BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "toxina clostridial quimérica" o "quimeras de toxina clostridial" se refiere a una molécula que comprende al menos una parte de una toxina clostridial y una parte de al menos otra proteína para formar una toxina con al menos una propiedad diferente de las toxinas clostridiales de referencia de la tabla 1. Los ejemplos no limitantes de quimeras de toxinas clostridiales incluyen una toxina clostridial que comprende un dominio enzimático que no es de toxina clostridial, una toxina clostridial que comprende un dominio de traslocación que no es de toxina clostridial, una toxina clostridial que comprende un dominio de unión que no es de toxina clostridial, o cualquier combinación de los mismos. Otro ejemplo no limitante de una quimera de toxina clostridial incluye una toxina clostridial que comprende un dominio enzimático de una toxina clostridial diferente, una toxina clostridial que comprende un dominio de traslocación de una toxina clostridial diferente, una toxina clostridial que comprende un dominio de unión de una toxina clostridial diferente o cualquier combinación de los mismos.
Una clase de toxina clostridial quimérica comprende una toxina clostridial modificada donde el dominio enzimático o parte del mismo, dominio de traslocación o parte del mismo, y/o dominio de unión o parte del mismo de una toxina clostridial natural se modifica o se sustituye por un dominio enzimático o parte del mismo, dominio de traslocación o parte del mismo y/o dominio de unión o parte del mismo de una toxina clostridial diferente. Como ejemplo no limitante, el dominio de unión de BoNT/A se puede sustituir por el dominio de unión of BoNT/B produciendo toxina clostridial quimérica que comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/A, y un dominio de unión de BoNT/B. Dichas quimeras de toxinas clostridiales se describen, p. ej., en J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, patente de EE.UU. 7,132,259, que se incorpora por referencia en su totalidad. Como otro ejemplo no limitante, se puede insertar el motivo de leucina de BoNT/A en la cadena ligera de una BoNT/E con el fin de aumentar la persistencia biológica. Dichas quimeras de toxinas clostridiales se describen, p. ej., en Lance E. Steward et al., Leucine-based Motif and Clostridial Toxins, publicación de patente de EE.UU. 2003/0027752 (6 de Feb., 2003); Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, publicación de patente de EE.UU. 2003/0219462 (27 de nov., 2003); y Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, publicación de patente de EE.UU. 2004/0220386 (4 de nov., 2004), cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad.
Otra clase de toxina clostridial quimérica comprende una toxina clostridial donde el dominio de unión de una toxina clostridial natural se modifica o sustituye por un dominio de unión de una toxina no clostridial. Dichas quimeras de toxina clostridial tienen una actividad de unión celular alterada porque la toxina modificada puede p. ej., 1) usar el mismo receptor presente en la superficie de una célula diana de toxina clostridial natural que el usado por la toxina clostridial natural, referido como una actividad de unión celular potenciada para una célula diana de toxina clostridial natural; 2) usar un receptor diferente presente en la superficie de una célula diana de toxina clostridial natural, referido como una actividad de unión celular alterada para una célula diana de toxina clostridial natural; o 3) usar un receptor diferente presente en la superficie de la célula que no es diana de toxina clostridial, referido como una actividad de unión celular alterada para una célula diana de toxina clostridial no natural, una toxina redirigida o una TVEMP.
Una toxina clostridial quimérica puede ser toxina clostridial con una actividad de unión celular potenciada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural, p. ej., una neurona motora. Una forma de lograr esta actividad de unión potenciada es modificando el dominio de unión endógeno de una toxina clostridial natural con el fin de potenciar una actividad de unión celular de la toxina por su receptor natural. Dichas modificaciones en un dominio de direccionamiento producen, p. ej., una actividad de unión celular potenciada que aumenta la afinidad de unión por un receptor de toxina clostridial endógeno presente en una célula diana de toxina clostridial natural; una actividad de unión celular potenciada que aumenta la especificidad de unión por un subgrupo de receptores de toxina clostridial endógenos presentes en una célula diana de toxina clostridial natural; o una actividad de unión celular potenciada que aumenta tanto la afinidad de unión como la especificidad de unión. Los ejemplos no limitantes de toxinas clostridiales modificadas y actividad de unión celular potenciada para un receptor de toxina clostridial natural se describen, p. ej., en Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems, publicación de patente de EE.UU. 2008/0096248; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Enhanced Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente internacional 2008/105901.
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Una toxina clostridial quimérica puede ser una toxina clostridial con una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural, p. ej., una neurona motora. Una forma de lograr esta capacidad alterada es sustituyendo el dominio de unión endógeno de una toxina clostridial natural por un dominio de unión de otra molécula que se une con preferencia a un receptor diferente presente en la superficie de una célula diana de toxina clostridial natural. Dicha modificación de un dominio de unión produce una toxina modificada que puede unirse con preferencia a un receptor que no es de toxina clostridial presente en una célula diana de toxina clostridial. Esta actividad de unión potenciada para una célula diana de toxina clostridial natural permite administrar dosis eficaces menores de una toxina clostridial modificada a un individuo porque se suministrará más toxina a la célula diana. Por lo tanto, las toxinas clostridiales modificadas con una actividad de unión potenciada reducirán la dispersión indeseada de la toxina a zonas a las que no está dirigido el tratamiento, reduciendo o previniendo de esta forma los efectos secundarios indeseables asociados con la difusión de una toxina clostridial a un sitio no deseado. Los ejemplos no limitantes de toxinas clostridiales modificadas con una capacidad de unión alterada por una célula diana de toxina clostridial se describen, p. ej., en Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, patente de EE.UU. 7,514,088; Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente de EE.UU. 2008/0161543; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente de EE.UU. 2008/0241881; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, publicación de patente de EE.UU. 2009/0048431; Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente internacional WO 2007/106115.
Una toxina clostridial quimérica puede ser una toxina clostridial con una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar una célula distinta de una célula diana de toxina clostridial, p. ej., una célula distinta de una neurona motora. Llamadas TVEMP, estas moléculas logran esta intoxicación usando un receptor diana presente en una célula que no diana es de toxina clostridial. Esta capacidad redirigida se logra sustituyendo un dominio de unión natural de una toxina clostridial por un dominio de unión que muestre una actividad de unión preferente por un receptor que no es de toxina clostridial presente en una célula que no es diana de toxina clostridial. Dichas modificaciones de un dominio de unión producen una toxina modificada que es capaz de unirse con preferencia a un receptor que no es de toxina clostridial presente en una célula que no es diana de toxina clostridial. Una toxina clostridial quimérica con una actividad de direccionamiento alterada por una célula que no es diana de toxina clostridial puede unirse a un receptor diana, traslocarse al citoplasma, y ejercer su efecto proteolítico en el complejo SNARE de la célula que no es diana de toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de quimeras de toxina clostridial con una actividad de direccionamiento alterada por una célula que no es diana de toxina clostridial se describen, p. ej., en Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, patente de EE.UU. 5,989,545; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, patente de EE.UU. 6,461,617; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, patente de EE.UU. 6,632,440; Lance E. Steward et al., Methods and Compositions for the Treatment of Pancreatitis, patente de EE.UU. 6,843,998; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, patente de EE.UU. 7,132,259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, patente de EE.UU. 7,244,437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, patente de EE.UU. 7,413,742; Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, patente de EE.UU. 7,415,338; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, patente de EE.UU. 7,514,088; Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, publicación de patente de EE.UU. 2006/0216283; Keith A. Foster, Fusion Proteins, publicación de patente de EE.UU. 2008/0064092; Keith A. Foster, Fusion Proteins, publicación de patente de EE.UU. 2009/0035822; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, publicación de patente de EE.UU. 2009/0048431; Keith A. Foster, Non-Cytotoxic Protein Conjugates, publicación de patente de EE.UU. 2009/0162341; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, publicación de patente internacional WO 2005/023309; y Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells,
solicitud de patente internacional WO 2008/008805.
Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, un dominio enzimático de toxina clostridial. Como se usa en la presente memoria la expresión "dominio enzimático de toxina clostridial" se refiere a cualquier polipéptido de toxina clostridial que ejecuta la etapa de modificación enzimática de la diana del proceso de intoxicación. Por lo tanto, un dominio enzimático de toxina clostridial se dirige específicamente a un sustrato de toxina clostridial y abarca la escisión proteolítica de un sustrato de toxina clostridial, tal como. p. ej., proteínas SNARE como un sustrato SNAP-25, un sustrato VAMP y un sustrato sintaxina. Los ejemplos no limitantes de un dominio enzimático de toxina clostridial incluyen, p. ej., un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT y un dominio enzimático de BuNT.
Un dominio enzimático de toxina clostridial incluye, sin limitación, variantes de dominio enzimático de toxina clostridial, tales como, p. ej., isoformas de dominio enzimático de toxina clostridial y subtipos de dominio enzimático de toxina clostridial; y variantes no naturales de dominio enzimático de toxina clostridial, tales como, p. ej., variantes conservadoras de dominio enzimático de toxina clostridial, variantes no conservadoras de dominio enzimático de
18
5
15
25
35
45
55
Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial" se refiere a un dominio enzimático de toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio enzimático de toxina clostridial de referencia (tabla 1). Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de enlace de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica o similar o cualquier combinación de los mismos. Una variante conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/A, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/B, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/C1, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/D, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/E, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/F, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/G, variantes conservadoras de dominio enzimático de TeNT, variantes conservadoras de dominio enzimático de BaNT y variantes conservadoras de dominio enzimático de BuNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial" se refiere a un dominio enzimático de toxina clostridial en el que 1) se elimina al menos un aminoácido del dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial; 2) se añade al menos un aminoácido al dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar con el aminoácido original del dominio enzimático de toxina clostridial de referencia (tabla 1). Una variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial pude funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/A, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/B, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/C1, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/D, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/E, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/F, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/G y variantes no conservadoras de dominio enzimático de TeNT, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BaNT y variantes no conservadoras de dominio enzimático de BuNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "fragmento activo de dominio enzimático de toxina clostridial" se refiere a cualquiera de una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva con la condición de que estos fragmentos de dominio enzimático puedan dirigirse específicamente a los componentes nucleares del aparato de liberación de neurotransmisores y por lo tanto participar en la ejecución del mecanismo celular completo por el cual la toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Los dominios enzimáticos de toxinas clostridiales tienen aproximadamente 420-460 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio enzimático (tabla 1). La investigación ha mostrado que no es necesaria la longitud entera del dominio enzimático de la toxina clostridial para la actividad enzimática del dominio enzimático. Como un ejemplo no limitante, los primeros ocho aminoácidos del dominio enzimático de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitante, los primeros ocho aminoácidos del dominio enzimático de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Igualmente, el extremo carboxilo del dominio enzimático no es necesario para la actividad. Como un ejemplo no limitante, los últimos 32 aminoácidos del dominio enzimático de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitante, los últimos 31 aminoácidos del dominio enzimático de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Por lo tanto, aspectos de esta realización incluyen dominios enzimáticos de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, p. ej., al menos 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización incluyen dominios enzimáticos de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, p. ej., como máximo 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos.
Se puede usar cualquiera de una variedad de métodos de alineamiento de secuencias para determinar el porcentaje de identidad de variantes naturales de dominio enzimático de toxina clostridial y variantes no naturales de dominio enzimático de toxina clostridial, incluyendo, sin limitación, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como p. ej., métodos de aproximación de segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.
Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial modificada descrita en la presente memoria descriptiva comprende un dominio enzimático de toxina clostridial. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende una variante natural de dominio enzimático de toxina clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de dominio enzimático de toxina clostridial o un subtipo de dominio enzimático de toxina clostridial. En otro
20
(ADAMTS13), y sitios de escisión de catepsina L (tabla 4). El sitio de escisión de inactivación de la invención comprende un sitio doble de trombina-trombina.
- TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación
- Sitio de escisión de proteasa
- Secuencias de referencia SEQ ID NO:
- Trombina
- LVPR*GS 114
- LVPK*GS
- 115
- FIPR*TF
- 116
- VLPR*SF
- 117
- imagen50
-
imagen51
- IVPR*SF
- 118
- IVPR*GY
- 119
- VVPR*GV
- 120
- VLPR*LI
- 121
- VMPR*SL
- 122
- MFPR*SL
- 123
- Factor de coagulación VIIa (FVIIA)
- KLTR*AETV 125
- DFTR*VVGG
- 126
- LSPR*TFHP
- 127
- LIQR*NLSP
- 128
- MATR*KMHD
- 129
- LGIR*SFRN
- 130
- PQGR*IVGG
- 131
- NLTR*IVGG
- 132
- QVVR*IVGG
- 133
- Factor de coagulación IXa (FIXa)
- PQGR*IVGG 135
- PQLR*MKNN
- 136
- NLTR*IVGG
- 137
- QVVR*IVGG
- 138
- Factor de coagulación Xa (FXa)
- IDGR* 140
- IEGR*
- 141
- IDGR*SVGG
- 142
- IDGR*TVGG
- 143
- IDGR*IVGG
- 144
- IEGR*SVGG
- 145
- IEGR*TVGG
- 146
- IEGR*IVGG
- 147
- PQGR*IVGG
- 148
- IEGR*TSED
- 149
- IEGR*IVEG
- 150
- IDGR*IVEG
- 151
- FNPR*TFGS
- 152
- FDER*TFGL
- 153
60
- TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación
- Sitio de escisión de proteasa
- Secuencias de referencia SEQ ID NO:
- IDER*IVGG
- 154
- FNEK*TFGL
- 155
- Factor de coagulación XIa (FXIa)
- AFWK*TDAS 157
- KLTR*AETV
- 158
- KLTR*AETI
- 159
- DFTR*VVGG
- 160
- EFSR*VVGG
- 161
- KLTR*AETV
- 162
- DFTR*VVGG
- 163
- IKPR*IVGG
- 164
- DLHR*HIFW
- 165
- KQLR*VVNG
- 166
- Factor de coagulación XIIa (FXIIa)
- PQGR*IVGG 168
- IKPR*IVGG
- 169
- SMTR*VVGG
- 170
- TSTR*IVGG
- 171
- PMKR*LTLG
- 172
- Calicreína 1
- SMTR*VVGG 174
- SPFR*SSDI
- 175
- SLMK*RPPG
- 176
- YDWR*TPYL
- 177
- SPFR*SVQV
- 178
- SPFR*TPYL
- 179
- TFHK*AEYR
- 180
- PRFK*IIGG
- 181
- ISLM*KRPP
- 182
- LEAR*SAYH
- 183
- EAKR*SYHS
- 184
- PNRW*STGA
- 185
- EAFY*SQFG
- 186
- NAAR*STGA
- 187
- SSEW*SMPY
- 188
- GTLF*RSGN
- 189
- ARLY*SRGA
- 190
- EASR*SATL
- 191
- EASY*RRKQ
- 192
- TTFY*RRGA
- 193
- AAWY*RTSR
- 194
- SFHY*RMVG
- 195
61 62 63 64 65 66 67
- TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación
- Sitio de escisión de proteasa
- Secuencias de referencia SEQ ID NO:
- ASSY*RTSR
- 196
- TRFY*SRGR
- 197
- IKFF*SAQT
- 198
- Proteína C
- KKTR*NLKK 200
- LDRR*GLQR
- 201
- MATR*KMHD
- 202
- RLKK*SQFL
- 203
- PQLR*MKNN
- 204
- VDQR*GNQI
- 205
- IEPR*SPSQ
- 206
- KKTR*SPKT
- 207
- LDQR*GVQR
- 208
- PDPR*SKNN
- 209
- Plasminógeno
- GEAR*GSVI 211
- GHAR*LVHV
- 212
- AEFR*HDSG
- 213
- HHQK*LVFF
- 214
- GSNK*GALL
- 215
- RAQR*SAGA
- 216
- AFWK*TDAS
- 217
- MSMR*VRRH
- 218
- RGVR*RTAS
- 219
- imagen52
- RAAR*SQCT 220
- PQSR*SVPP
- 221
- PYLK*VFNP
- 222
- LSFR*ARAY
- 223
- PQLR*RGWR
- 224
- EDNR*DSSM
- 225
- LSFR*ARAY
- 226
- FRAR*AYGF
- 227
- YGFR*GPGP
- 228
- ITFR*MNVA
- 229
- THEK*GRQS
- 230
- PRLK*ARAG
- 231
- PKAK*SHAP
- 232
- PSHK*EGPQ
- 233
- LFEK*KVYL
- 234
- ADGK*KPSS
- 235
- TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación
- Sitio de escisión de proteasa
- Secuencias de referencia SEQ ID NO:
- PRFK*IIGG
- 236
- PQFR*IKGG
- 237
- PRCR*HRPH
- 238
- KGYR*SQRG
- 239
- DVAQ*FVLT
- 240
- Metaloproteasa de matriz-2 (MMP-2)
- QPVS*VKVG 242
- RGVG*IKST
- 243
- FVDC*LIEQ
- 244
- VPAG*NWVL
- 245
- YHAD*IYDK
- 246
- RACR*LAKA
- 247
- QGAY*QEAF
- 248
- DVLS*LLEK
- 249
- TLDD*LIMA
- 250
- HISS*LIKL
- 251
- DPNN*LLND
- 252
- PVQP*QQSP
- 253
- KPKT*ITGP
- 254
- VVHP*LVLL
- 255
- HPLV*LLSV
- 256
- AVAL*LIGP
- 257
- QPLQ*LLDA
- 258
- YIQG*INLV
- 259
- LPQE*IKAN
- 260
- NISD*LTAA
- 261
- KPRA*LTAL
- 262
- APSW*LLTA
- 263
- AVRW*LLTA
- 264
- AVSW*LLTA
- 265
- SLRR*LTAA
- 266
- SLSR*LTAL
- 267
- RYSS*LTAA
- 268
- SLAY*YTAL
- 269
- SLRY*YTAA
- 270
- SPAY*YTAL
- 271
- MHKA*LTAA
- 272
- LRLA*ITAL
- 273
- imagen53
- IPEN*FFGV 275
- MDIA*IHHP
- 276
- TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación
- Sitio de escisión de proteasa Metaloproteasa de matriz-9 (MMP-9)
- Secuencias de referencia SEQ ID NO:
- SPSR*LFDQ
- 277
- SEMR*LEKD
- 278
- FSVN*LDVK
- 279
- RLFD*QFFG
- 280
- imagen54
- FFGE*HLLE 281
- GLSE*MRLE
- 282
- SPEE*LKVK
- 283
- DVIE*VHGK
- 284
- EVHG*KHEE
- 285
- DEHG*FISR
- 286
- GEHL*LESD
- 287
- FHRK*YRIP
- 288
- GPRK*QVSG
- 289
- LSPF*YLRP
- 290
- PPSF*LRAP
- 291
- NPLE*NSGF
- 292
- VPYG*LGSP
- 293
- PPLK*LMHS
- 294
- GPEG*LRVG
- 295
- FMKG*LSKA
- 296
- VVTG*VTAV
- 297
- AIIG*LMVG
- 298
- SDLG*LTGI
- 299
- VPYG*LGSP
- 300
- GAAG*VKGD
- 301
- GPTG*KQGD
- 302
- GPSG*DQGA
- 303
- GPSG*FPFP
- 304
- GAPG*FPGP
- 305
- GAPG*NRGF
- 306
- GLRG*ERGE
- 307
- GPPG*SQGN
- 308
- GPAG*QQGA
- 309
- GPPG*KDGT
- 310
- GQPG*SPGS
- 311
- GSPG*YQGP
- 312
- GPVS*AVLT
- 313
- GPLG*MLSQ
- 314
- GPLG*MWAQ
- 315
- TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación
- Sitio de escisión de proteasa
- Secuencias de referencia SEQ ID NO:
- GPQG*IFGQ
- 316
- LPRS*AKEL
- 317
- NSFG*LRFG
- 318
- RAIH*INAE
- 319
- Furina
- RPRR*AKRF 321
- RKKR*GLYA
- 322
- RERR*RKKR
- 323
- RKKR*GLYA
- 324
- RKKR*TTSA
- 325
- RHKR*ETLK
- 326
- RLKR*DVVT
- 327
- RMKR*EDLN
- 328
- RAKR*FASL
- 329
- RKKR*FVSS
- 330
- RTKR*FLSY
- 331
- RRAR*SVDG
- 332
- VFRR*DAHK
- 333
- VFRR*EAHK
- 334
- RVAR*DITM
- 335
- RISR*SLPQ
- 336
- RSRR*AATS
- 337
- RAKR*SPKH
- 338
- FWHR*GVTK
- 339
- AKRR*TKRD
- 340
- AKRR*AKRD
- 341
- imagen55
- AKQR*AKRD 342
- RDVR*GFAS
- 343
- RKRR*SVNP
- 344
- RQKR*FVLS
- 345
- RSKR*SLSC
- 346
- Activador de plasminógeno-u (u-PA)
- GSGK*SATL 348
- QRGR*SATL
- 349
- RGSV*ILTV
- 350
- PSSR*RRVN
- 351
- CPGR*VVGG
- 352
- PGAR*GRAF
- 353
- SSSR*GPTH
- 354
- VSNK*YFSN
- 355
- NSGR*AVTY
- 356
- TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación
- Sitio de escisión de proteasa
- Secuencias de referencia SEQ ID NO:
- TYSR*SRYL
- 357
- NSGR*AVTY
- 358
- PSGR*GRTL
- 359
- AGSR*AVYY
- 360
- TYGR*SRTN
- 361
- NSSR*GVYL
- 362
- PSSR*SVYN
- 363
- ASGR*GRTY
- 364
- TSSR*AVYL
- 365
- NSGR*SRTL
- 366
- VSGR*IRTG
- 367
- SSGR*IRTV
- 368
- Activador de plasminógeno-t (t-PA)
- NALR*YAPD 370
- CPGR*VVGG
- 371
- PQFR*IKGG
- 372
- ALSR*MAVL
- 373
- Triptasa-ε (Prosemina)
- *RVVGGE 375
- *RIVGGE
- 376
- *RIIGGE
- 377
- *RVVGGD
- 378
- *RIVGGD
- 379
- *RIIGGD
- 380
- *KVVGGE
- 381
- *KIVGGE
- 382
- *KIIGGE
- 383
- *KVVGGD
- 384
- *KIVGGD
- 385
- *KIIGGD
- 386
- Proteasa-7 de mastocitos de ratón (mMCP-7)
- LSSR*QSPG 388
- LQAR*GASL
- 389
- LGPK*AITM
- 390
- LGPR*SAVY
- 391
- Enzima-1 convertidora de endotelina (ECE-1)
- HQKL*VFFA 393
- HHQK*LVFF
- 394
- KLVF*FAED
- 395
- DRVY*IHPF
- 396
- YIHP*FHLV
- 397
- YGLG*SPRS
- 398
- TPEH*VVPY
- 399
- TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación
- Sitio de escisión de proteasa
- Secuencias de referencia SEQ ID NO:
- DIIW*VNTP
- 400
- DIIW*INTP
- 401
- CHLD*IIWV
- 402
- HLDI*IWVN
- 403
- CVYF*CHLD
- 404
- imagen56
- SCSS*LMDK 405
- ECVY*FCHL
- 406
- RSKR*CSCS
- 407
- RSKR*ALEN
- 408
- GFSP*FRSS
- 409
- PRRP*YILP
- 410
- KPQQ*FFGL
- 411
- PQQF*FGLM
- 412
- Proteína de grupo sanguíneo Kell (KBGP)
- DIIW*VNTP 414
- DIIW*INTP
- 415
- Catepsina L
- MFLE*AIPM 417
- KVFQ*EPLF
- 418
- ATLT*FDHS
- 419
- PLFY*EAPR
- 420
- TGLR*DPFN
- 421
- KILH*LPTS
- 422
- AHLK*NSQE
- 423
- APLT*AEIQ
- 424
- EALF*AERK
- 425
- EPLA*AERK
- 426
- GTFT*SDYS
- 427
- KYLD*SRRA
- 428
- QDFV*QWLM
- 429
- KQLA*TKAA
- 430
- STFE*ERSY
- 431
- LRLE*WPYQ
- 432
- RGFF*YTPK
- 433
- GFFY*TPKA
- 434
- HFFK*NIVT
- 435
- RGLS*LSRF
- 436
- QWLG*APVP
- 437
- NMLK*RGLP
- 438
- LSLA*HTHQ
- 439
- TPFA*ATSS
- 440
- TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación
- Sitio de escisión de proteasa
- Secuencias de referencia SEQ ID NO:
- KLLA*VSGP
- 441
- QLFR*RAVL
- 442
- PRFK*IIGG
- 443
- PAR1
- *SFLLRN 445
- *SFFLRN
- 446
- *SFFLKN
- 447
- *TFLLRN
- 448
- *GFPGKF
- 449
- *GYPAKF
- 450
- *GYPLKF
- 451
- *GYPIKF
- 452
- PAR2
- *SLIGKV 454
- *SLIGRL
- 455
- PAR3
- *TFRGAP 457
- *SFNGGP
- 458
- *SFNGNE
- 459
- PAR4
- *GYPGQV 461
- *AYPGKF
- 462
- *TYPGKF
- 463
- *GYPGKY
- 464
- *GYPGKW
- 465
- *GYPGKK
- 466
- *GYPGKF
- 467
- *GYPGRF
- 468
- imagen57
- *GYPGFK 469
- *GYPAKF
- 470
- *GFPGKF
- 471
- *GFPGKP
- 472
- *SYPGKF
- 473
- *SYPAKF
- 474
- *SYPGRF
- 475
- *SYAGKF
- 476
- *SFPGQP
- 477
- *SFPGQA
- 478
- ADAMTS13
- NLVY*MVTG 479
- Un asterisco (*) indica el enlace peptídico del sitio de escisión P1-P1' que va a ser escindido por la proteasa indicada.
Está contemplado que un sitio de escisión de inactivación de cualquier y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva con la condición de que el sitio de escisión de inactivación sea capaz de ser escindido por una proteasa de fluido intersticial o de sistema circulatorio. Por lo tanto, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de inactivación pude ser de, p. ej., al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20
68
- Tabla 5. Regiones de sitios de escisión de inactivación de toxinas clostridiales
- Toxina
- SEQ ID NO: Regiones de sitios de escisión de inactivación
- 1
- 2 3 4 5 6 7 8
- BoNT/A
- 1 L462-L496 T618-I634 G638-D651 L665-N687 N752-N765 N826-D835 T844-L863 K871-A895
- BoNT/B
- 2 L464-P487 A605-V621 G625-N638 L652-N674 N739-D752 N813-A824 Y831-1850 S858-G882
- BoNT/C1
- 3 L463-S496 I613-I629 G633-N646 L660-E682 K747-Q760 H821-D830 S839-K858 N866-N890
- BoNT/D
- 4 L458-S491 I609-I625 G629-N642 L656-E678 K743-Q756 H817-D826 S835-K854 N862-N886
- BoNT/E
- 5 L434-D467 A587-V603 G607-N620 L634-N659 N724-D739 H800-Q809 T818-I837 K845-D869
- BoNT/F
- 6 L453-N486 A605-V621 G625-N638 L652-N677 N742-N757 H818-N827 T836-I855 K863-G887
- BoNT/G
- 7 L458-S491 S610-I626 G630-N643 M657-N679 N744-D757 N818-N827 H836-I855 S863-G887
- TeNT
- 8 L475-S508 S627-V643 G647-N660 L674Q696 K761-E774 N835-K844 V854V871 V879N903
- BaNT
- 9 L443-N476 A596-V612 G616-N629 L643-S668 N733-N748 N809-P819 T828-I847 K855-G879
- BuNT
- 10 L434-D467 A587-V603 G607-N620 L634-S659 N724-D739 H800-Q809 T818-I837 K845-D869
La toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva comprende un sitio de escisión de inactivación situado dentro de una región de sitios de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 871-895 de la SEQ ID NO: 1.
5 En un aspecto de la presente memoria descriptiva, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad mayor que el margen de seguridad para la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otras palabras, la adición de un sitio de escisión de inactivación aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin
10 el sitio de escisión de inactivación adicional.
Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un 15 margen de seguridad que es mayor que, p. ej., al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, 110%, al menos 120%, al menos 130%, al menos 140%, al menos 150%, al menos 160%, al menos 170%, al menos 180%, al menos 190%, al menos 200%, 210%, al menos 220%, al menos 230%, al menos 240%, al menos 250%, al menos 260%, al menos 270%, al menos 280%, al menos 290% o al menos 300%, con respecto a la misma toxina clostridial o toxina 20 clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, p. ej., como máximo 10%, como máximo 20%, como máximo 30%, como máximo 40%, como máximo 50%, como máximo 60%, como máximo 70%, como máximo 80%, como máximo 90%, como máximo 100%, 110%, como máximo 120%, como máximo 130%, como máximo 140%, como máximo 150%, como máximo 25 160%, como máximo 170%, como máximo 180%, como máximo 190%, como máximo 200%, 210%, como máximo 220%, como máximo 230%, como máximo 240%, como máximo 250%, como máximo 260%, como máximo 270%, como máximo 280%, como máximo 290% o como máximo 300%, con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos más de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un 30 margen de seguridad que es mayor en, p. ej., aproximadamente 10% a aproximadamente 300%, aproximadamente 20% a aproximadamente 300%, aproximadamente 30% a aproximadamente 300%, aproximadamente 40% a aproximadamente 300%, aproximadamente 50% a aproximadamente 300%, aproximadamente 60% a
86
bien caracterizados se pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos protocolos son procedimientos rutinarios dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria descriptiva.
5 Como se ha mencionado antes, las toxinas clostridiales y toxinas clostridiales quiméricas descritas en la presente memoria descriptiva se traducen como polipéptidos de una cadena que posteriormente son escindidos por escisión proteolítica en una región de bucle de disulfuro. Este procesamiento postraduccional da una molécula bicatenaria mantenida unida por un solo enlace disulfuro e interacciones no covalentes. La escisión proteolítica dentro de una región de bucle de disulfuro se puede lograr usando sitios de escisión de proteasas endógenos que son naturales
10 dentro de la región de bucle bicatenario, o mediante modificación genética de la región de bucle bicatenario para que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno.
Aspectos de la presente memoria descriptiva describen, en parte, una región de bucle bicatenario. Como se usa en la presente memoria, la expresión "región de bucle bicatenario" se refiere a una secuencia de aminoácidos de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica flanqueada por aminoácidos cisteína y que contiene un sitio de 15 escisión de proteasa usado para convertir la forma monocatenaria de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica en su forma bicatenaria (tabla 6). Los ejemplos no limitantes de una región de bucle bicatenario incluyen una región de bucle bicatenario de BoNT/A que comprende los aminoácidos 430-454 de la SEQ ID NO: 1; una región de bucle bicatenario de BoNT/B que comprende los aminoácidos 437-446 de la SEQ ID NO: 2; una región de bucle bicatenario de BoNT/C1 que comprende los aminoácidos 437-453 de la SEQ ID NO: 3; una región de bucle
20 bicatenario de BoNT/D que comprende los aminoácidos 437-450 de la SEQ ID NO: 4; una región de bucle bicatenario de BoNT/E que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 5; una región de bucle bicatenario de BoNT/F que comprende los aminoácidos 429-445 de la SEQ ID NO: 6; una región de bucle bicatenario de BoNT/G que comprende los aminoácidos 436-450 de la SEQ ID NO: 7; and una región de bucle bicatenario de TeNT que comprende los aminoácidos 439-467 de la SEQ ID NO: 8 (tabla 6).
- Tabla 6. Región de bucle bicatenario
- Toxina
- Región de bucle bicatenario que contiene el sitio de escisión de proteasa natural
- BoNT/A
- CVRGIITSKTKSLDKGYNK*----ALNDLC
- BoNT/B
- CKSVK*-------------------APGIC
- BoNT/C1
- CHKAIDGRSLYNK*------------TLDC
- BoNT/D
- CLRLTKNSR*---------------DDSTC
- BoNT/E
- CKNIVSVKGIR*--------------KSIC
- BoNT/F
- CKSVIPRKGTK*------------APPRLC
- BoNT/G
- CKPVMYKNTGK*--------------SEQC
- TeNT
- CKKIIPPTNIRENLYNRTA*SLTDLGGELC
- BaNT
- CKS-IVSKKGTK*------------NSLC
- BuNT
- CKN-IVSVKGIR*--------------KSIC
- La secuencia de aminoácidos presentada es como sigue: BoNT/A, restos 430-454 de la SEQ ID NO: 1; BoNT/B, restos 437-446 de la SEQ ID NO: 2; BoNT/C1, restos 437-453 de la SEQ ID NO: 3; BoNT/D, restos 437-450 de la SEQ ID NO: 4; BoNT/E, restos 412-426 de la SEQ ID NO: 5; BoNT/F, restos 429-445 de la SEQ ID NO: 6; BoNT/G, restos 436-450 de la SEQ ID NO: 7; TeNT, restos 439-467 de la SEQ ID NO: 8; BaNT, restos 421-435 de la SEQ ID NO: 9; t BuNT, restos 412-426 de la SEQ ID NO: 10. Un asterisco (*) indica el enlace peptídico que es escindido por una proteasa de toxina clostridial.
89
Para identificar una situación o situaciones en la estructura de proteína adecuadas como una potencial región de sitios de escisión de inactivación, se analizó la estructura tridimensional de una BoNT/A mediante un programa de ordenador para identificar bucles expuestos en la superficie o regiones extendidas que serían más accesibles para una proteasa. De las regiones que se predijo que eran accesibles, se seleccionaron ocho para el análisis adicional: 5 los aminoácidos 462-496 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 618-634 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 638-651 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 665-687 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 752-765 de la SEQ ID NO: 1, y aminoácidos 826-835 de la SEQ IN NO: 1, aminoácidos 844-863 de la SEQ ID NO: 1, y aminoácidos 871-895 de la SEQ ID NO:
1.
Para determinar si una región identificada por análisis por ordenador podría funcional como una región de sitios de
10 escisión de inactivación, se modificaron genéticamente sitios de escisión de trombina en esas regiones usando mutagénesis con multicebadores y se ensayó su capacidad para ser escindida por trombina. Se montó una reacción de 50 µl que comprendía un primer conjunto de cebadores oligonucleótidos unidireccionales que contenía cada uno la modificación deseada (125 ng de cada cebador), mezclados en diferentes proporciones con un molde de ADN que comprendía una construcción de expresión que codifica una BoNT/A, tal como, p. ej., una construcción de expresión
15 que comprende la SEQ ID NO: 526 que codifica la SEQ ID NO: 527 o una construcción de expresión que comprende la SEQ ID NO: 528 que codifica la SEQ ID NO: 529, que se hipermetiló con metalasa Dam. A esta mezcla se añadieron 5 µl de 10x tampón de PCR, 1 µl de desoxirribonucleótidos (dNTP), 1 µl de ADN polimerasa PFUULTRA™ High Fidelity 2.5 unidades/µl (Stratagene, La Jolla, CA), ADN ligasa Pfu, ATP, y agua exenta de nucleasa hasta un volumen final de 50 µl. Las condiciones del termociclador eran: 30 ciclos de 96°C durante 1
20 minuto, 60°C durante 30 segundos, y 68°C durante 20 minutos. Después de termociclado, se añadió 1 µl de enzima de restricción Dpnl (Stratagene, La Jolla, CA) a la reacción y se incubó durante 1 hora a 37ºC para digerir el ADN molde y reducir la recuperación de clones de tipo natural. La mezcla de reacción digerida se transformó en células E. coli BL21(DE3)Acella electrocompetentes (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, se cultivaron en placas de agar Luria-Bertani al 1.5% (pH 7.0) que contenía 50 µg/ml de kanamicina, y se pusieron en un
25 incubador a 37°C para el desarrollo durante la noche. La bacterias que contenían construcciones de expresión se identificaron como colonias resistentes a la kanamicina. Las construcciones candidato se aislaron usando una procedimiento de minipreparación de plásmido por lisis alcalina y se analizaron por secuenciación para determinar la frecuencia e identificar las mutaciones incorporadas. La tabla 7 cita cada BoNT/A que comprende un sitio de escisión de trombina (BoNT/A-TCS) hecho y ensayado en este análisis de barrido de trombina.
- TABLA 7. Análisis de barrido de trombina
- Región Modificación
- Expresión Sensibilidad trombina a la Potencia de BoNT/A
- 462-496 T482insLVPRGS
- + ND ND
- 462-496 A489insLVPRGS
- ++ ++ ND
- 618-634 E620insLVPRGS
- + ND ND
- 638-651 M646insLVPRGS
- -/+ ND ND
- 665-687 I673insLVPRGS
- + ND ND
- 752-765 E758insLVPRGS
- - ND ND
- 826-835 delR827GT-insLVPRGS
- -/+ ND ND
- 844-863 T844insLVPRGS
- +++ + ND
- 844-863 D848insLVPRGS
- +++ + ND
- 844-863 Q852insLVPRGS
- -/+ ND ND
- 844-863 L862insLVPRGS
- +++ ++ ND
- 871-895
-
E868insLVPRGS
imagen87 imagen88 ND
100 101
- TABLA 7. Análisis de barrido de trombina
- Región
- Modificación Expresión Sensibilidad a la trombina Potencia de BoNT/A
- 871-895
-
delE868YIKNI-insLVPRGS
imagen89 imagen90 ND
- 871-895
- K871insLVPRGS +++ +++ ND
- 871-895
- I873insLVPRGS +++ ++++ ND
- 871-895
-
delN872IINTS-insLVPRGS
imagen91 imagen92 ND
- 871-895
-
T876insLVPRGS
imagen93 imagen94 ND
- 871-895
-
L879insVPRGS
imagen95 imagen96 ND
- 871-895
-
delL879NLRYE-insLVPRGS
imagen97 imagen98 ND
- 871-895
- N880insLVPRGS +++ ++++ 4.05
- 871-895
-
L881 insVPRGS
imagen99 imagen100 ND
- 871-895
-
delL881 RYESN-insLVPRGS
imagen101 imagen102 ND
- 871-895
-
Y883insLVPRGS
imagen103 imagen104 ND
- 871-895
- E884insLVPRGS +++ +++ >50
- 871-895
-
S885insLVPRGS
imagen105 imagen106 ND
- 871-895
-
delH887LIDLS-insLVPRGS
imagen107 imagen108 ND
- 871-895
-
L888insVPRGS
imagen109 imagen110 ND
- 871-895
- D890insLVPRGS ++ ++++ 3.15
- 871-895
-
L891 insVPRG
imagen111 imagen112 ND
- 871-895
-
delS892RYA-insVPRG
imagen113 imagen114 ND
- 467-496
- T482insLVPRGS A489insLVPRGS + ND ND
- 618-634 665-687
- E620insLVPRGS 1673insLVPRGS + ND ND
- 638-651 665-687
- M646insLVPRGS 1673insLVPRGS + ND ND
- 825-832 871-895
- delR827GT-insLVPRGS K871insLVPRGS + +++ ND
- TABLA 8. Análisis de sitios de escisión de proteasa
- Sitio de escisión de proteasa
- Región Modificación Sensibilidad proteasa a Potencia de BoNT/A
- Factor Xa
-
535
E535insG
+
imagen118 2.70
- Factor Xa
-
844-863
L863insIEGR
+
imagen119 >50
- Factor Xa
-
871-895
K871insIEGR
++
imagen120 6.15
- Factor Xa
-
871-895
I873insEGR
+
imagen121 3.97
- Factor Xa
-
871-895
L881 insIEG
ND
imagen122 ND
- Factor Xa
-
871-895
E884insIEGR
+
imagen123 2.95
- Factor Xa
-
871-895
L891insIEGR
++
imagen124 ND
- Factor Xa
-
1272
E1272insG
+
imagen125 ND
- Factor Xa x 2
-
535 1272
E535insG E1272insG
+
imagen126 ND
- Factor Xa x 2
-
871-895
K871insIEGR L891insIEGR
++
imagen127 4.35
- Factor Xa x 2
-
871-895
I873insEGR L891insIEGR
+
imagen128 7.63
- Factor Xa x 2
-
871-895
L881insIEG L891insIEGR
++
imagen129 >50
- Factor Xa tPA
-
871-895
I873insEGR delS885NHLIDL-insPQRGRSA
ND
imagen130 ND
- Factor Xa trombina
-
871-895
I873insEGR E884insLVPRG
+ ++++
imagen131 3.29
- MMP-2
-
871-895
S885insGPLGMLSQ
+
imagen132 6.55
- MMP-2
-
871-895
delK871NIINTSI-insGPLGMLSQ
++
imagen133 5.27
- MMP-2
-
871-895
delS885NHLIDLS-insGPLGMLSQ
++
imagen134 4.76
- MMP-9
-
871-895
K871insGPLGLWAQ
ND
imagen135 ND
- MMP-9
-
871-895
delK871NIINTSI-insGPLGLWAQ
+
imagen136 3.36
- MMP-9
-
871-895
I873insGPLGLWAQ
imagen137 imagen138 22.8
- MMP-9
-
871-895
delI874NTSILNL-insGPLGLWAQ
imagen139 imagen140 37.7
- MMP-9
-
871-895
delL881 RYESNHL-insGPLGLWAQ
ND
imagen141 ND
- MMP-9
-
871-895
E884insGPLGLWAQ
ND
imagen142 ND
- MMP-9
-
871-895
delS885NHLIDLS-insGPLGLWAQ
+
imagen143 4.38
- MMP-9
-
871-895
S885insGPLGLWAQ
imagen144 imagen145 3.38
105 106 107
- TABLA 8. Análisis de sitios de escisión de proteasa
- Sitio de escisión de proteasa
- Región Modificación Sensibilidad proteasa a Potencia de BoNT/A
- MMP-9
-
871-895
L891insGPLGLWAQ
imagen146 imagen147 20.61
- MMP-9
-
871-895
delK871NIINTSI-insGPLGLWAQ
ND
imagen148 ND
- Trombina
-
imagen149 E884insLVPRGimagen150 imagen151 imagen152
- MMP-9 Factor Xa
-
871-895
delK871NIINTSI-insGPLGLWAQ E884insIEGR
imagen153 imagen154 19.62
- u-PA
-
871-895
delN872IINTSI-insPGSGKSA
+
imagen155 ND
- u-PA
-
871-895
S885insPGSGKSA
++
imagen156 3.00
- u-PA
-
871-895
delN886HLIDL-insPGSGKSA
++
imagen157 4.90
- t-PA
-
871-895
delN872IINTSI-insPQRGRSA
++
imagen158 3.65
- t-PA
-
871-895
S885insPQRGRSA
+++
imagen159 3.30
- t-PA
-
871-895
delS885NHLIDL-insPQRGRSA
++
imagen160 4.80
- Trombina tPA
-
871-895
I873LVPRGS delS885NHLIDLinsPQRGRSA
ND
imagen161 ND
- Furina
-
871-895
I870insRKKR
+++
imagen162 6.70
- Furina
-
871-895
delK871NII-insRKKR
+
imagen163 3.50
- Furina
-
871-895
L881 insRKK
+
imagen164 7.20
- Furina
-
871-895
delY883ES-insKKR
+
imagen165 12.1
- Furina
-
871-895
S892RKK
+
imagen166 15.2
- Furina x 2
-
871-895
delK871NII-insRKKR delY883ES-insKKR
+
imagen167 12.6
- Furina x 2
-
871-895
delK871NII-insRKKR S892RKK
++
imagen168 6.00
- Furina x 3
-
871-895
delK871NII-insRKKR delY883ES-insKKR S892RKK
ND
imagen169 ND
- Kell
-
871-895
L891 insAAF
+
imagen170 10.8
- Kell
-
871-895
delI889DL-insAAF
+
imagen171 4.80
- Triptasa ε
-
871-895
K871insIVGGE
+
imagen172 9.45
- Triptasa ε
-
871-895
K871 insRIVGGE
+
imagen173 6.48
- TABLA 8. Análisis de sitios de escisión de proteasa
- Sitio de escisión de proteasa
- Región Modificación Sensibilidad proteasa a Potencia de BoNT/A
- Triptasa ε
-
871-895
delN886HLIDL-insRIVGGE
imagen174 imagen175 5.50
- Triptasa ε
-
871-895
delN886HLIDL-insKIVGGE
ND
imagen176 ND
- mMMCP-7
-
871-895
K871insSLSSRQSP
imagen177 imagen178 3.90
- mMMCP-7
-
871-895
delN886HLIDLS-insLSSRQSP
imagen179 imagen180 4.80
- ECE-1
-
871-895
1870insRPPGFSAF
+
imagen181 5.70
- ECE-1
-
871-895
K871 insAFA
+
imagen182 3.85
- ECE-1
-
871-895
K871 insDlIWVNTPEHVVPYGLGS
+
imagen183 >50
- ECE-1
-
871-895
K871insRPKPQQFFGLM
ND
imagen184 ND
- ECE-1
-
871-895
delYES885NHLIDLS-insPKPQQFFGLM
+
imagen185 9.20
- ECE-1
-
871-895
E884insKAFA
+
imagen186 2.95
- ECE-1
-
871-895
delS885NHLIDLS-insRPPGFSAF
+
imagen187 3.70
- Catepsina L
-
871-895
I870insRGFFYTPK
++++
imagen188 10.3
- Catepsina L
-
871-895
K871 insLR
++++
imagen189 2.25
- Catepsina L
-
871-895
K871 insFR
++++
imagen190 3.05
- Catepsina L Trombina
-
871-895
K871 insLR L891insLVPRGS
imagen191 imagen192 12.6
- PoliArg
-
844-863
R861insRR
ND
imagen193 ND
- PoliArg
-
871-895
R882insRRR
imagen194 imagen195 Si
- PoliArg
-
871-895
S885insRRR
imagen196 imagen197 2.22
- PoliArg
-
871-895
S892insRRR
imagen198 imagen199 3.02
- PoliArg x 2
-
844-863 871895
R861 insRR K871 insRKR
ND
imagen200 ND
- PoliArg x 2
-
844-863 871895
R861 insRR I873insRRRR
ND
imagen201 ND
- PoliArg x 2
-
844-863 871895
R861 insRR R882insRRR
ND
imagen202 ND
- PoliArg x 2
-
871-895
K871 insRKR S885insRRR
imagen203 imagen204 1.92
donde y es la respuesta, a es la ymáx asintótica, b es la pendiente, x es la dosis, y 0 es la dosis DE50. Para determinaciones de DE50 máxima, la Ymáx se fijó en 4 (lectura máxima de DAS en la escala). Se computaron los valores de DE50 medios (máximo y/o AUC) para cada estudios de ocho dosis realizado.
Los resultados indican que (tabla 9), en general, las toxinas que comprenden un sitio de escisión de inactivación que 5 presentaba una potencia relativa de aproximadamente 10 o superior se consideró que retenían suficiente potencia para justificar la evaluación de su margen de seguridad.
Para determinar el margen de seguridad de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación, se llevó a cabo un ensayo de letalidad de ratones.
Para calcular el margen de seguridad de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio
10 de escisión de inactivación, el valor de DL50 obtenido del estudio de letalidad de ratones se dividió entre el valor de CE50 obtenido de un estudio de DAS de dosis completa. Una toxina que comprende un sitio de escisión de inactivación se consideró que tenía suficiente actividad en el sitio de escisión de inactivación si presentaba un valor de margen de seguridad de aproximadamente 15 o más.
- TABLA 9. Análisis de ensayo basado en animales
- Sitio de escisión de proteasa
- Región Modificación DAS dosis única DAS de dosis completa Ensayo de letalidad Margen de seguridad
- CE50
- Relativo CE50 Relativo DL50 DL50/DAS DE50
- Trombina
- 871-895 I873insLVPGRS 1.08 30.5 ND ND ND ND
- Trombina
- 871-895 L881 insVPRGS 0.37 7.38 ND ND ND ND
- Trombina
- 871-895 E884insLVPRGS 0.16 25.3 0.15 46.7 1.90 12.5
- Trombina
- 871-895 L891 insVPRG 0.12 23.3 0.19 36.8 2.74 14.8
- Trombina x 2
- 871-895 L881 insVPRGS L891 insVPRG 0.25 11.0 0.15 34.5 4.20 26.9
- Factor Xa
- 871-895 I873insEGR 0.11 46.3 0.10 70.0 2.39 23.0
- Factor Xa Trombina
- 871-895 I873insEGR E884insLVPRG 0.09 37.2 0.26 15.3 6.69 26.9
- MMP-2
- 871-895 delK871NIINTSIinsGPLGMLSQ 0.33 10.0 ND ND ND ND
- MMP-2
- 871-895 delS885NHLIDLSinsGPLGMLSQ 0.10 34.5 ND ND ND ND
- MMP-9
- 871-895 delK871NIINTSIinsGPLGLWAQ 0.11 29.1 0.16 27.7 5.04 23.9
- MMP-9
- 871-895 delS885NHLIDLSinsGPLGLWAQ 0.08 40.8 ND ND ND ND
- u-PA
- 871-895 S885insPGSGKSA 0.03 36.6 ND ND ND ND
- u-PA
- 871-895 delN886HLIDLinsPGSGKSA 0.35 3.52 ND ND ND ND
- t-PA
- 871-895 delN872IINTSI 0.04 30.0 ND ND ND ND
109
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-
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