TWI516594B - 可降解之梭狀芽孢桿菌毒素 - Google Patents

可降解之梭狀芽孢桿菌毒素 Download PDF

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Description

可降解之梭狀芽孢桿菌毒素
本申請案主張2010年5月20日申請之美國臨時專利申請案第61/346,578號之權利，其整個揭示內容以此特定引用之方式併入本文中。
梭狀芽孢桿菌毒素(諸如肉毒桿菌(Botulinum)神經毒素(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F及BoNT/G，及破傷風(Tetanus)神經毒素(TeNT))抑制神經元傳輸之能力正在諸多治療性及美容性應用中加以利用，參見例如William J. Lipham,COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN(Slack,Inc.,2004)。可以醫藥組合物形式購得之梭狀芽孢桿菌毒素包括BoNT/A製劑，諸如(Allergan,Inc.,Irvine,CA)、/(Beaufour Ipsen,Porton Down,England)、(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,South Korea)、BTX-A(Lanzhou Institute Biological Products,China)及XEOMIN(Merz Pharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)；及BoNT/B製劑，諸如MYOBLOCTM/NEUROBLOCTM(Elan Pharmaceuticals,San Francisco,CA)。舉例而言，當前在一或多個國家經核准用於以下適應症：弛緩不能(achalasia)、成人痙攣、裂肛、背痛、瞼痙攣、睡中磨牙、頸肌張力障礙(cervical dystonia)、特發性震顫、眉間紋(glabellar line)或過動性面部細紋、頭痛、半面痙攣、膀胱機能亢進、多汗症、青少年腦性麻痺(juvenile cerebral palsy)、多發性硬化症、肌痙攣病症、鼻唇線(nasal labial line)、痙攣性發音障礙(spasmodic dysphonia)、斜視及VII神經病症。
梭狀芽孢桿菌毒素治療藉由破壞用於分泌神經傳遞質至突觸間隙中之胞吐過程來抑制神經傳遞質釋放。除梭狀芽孢桿菌毒素當前之肌鬆弛應用以外，醫藥行業亦極需推廣梭狀芽孢桿菌毒素療法之使用來治療基於感覺神經之病痛(諸如各種類型之慢性疼痛、神經性發炎及泌尿生殖病症)以及其他病症(諸如胰臟炎)。當前正被用來推廣基於梭狀芽孢桿菌毒素之療法之一種方法涉及修飾梭狀芽孢桿菌毒素以使經修飾之毒素對非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之細胞靶向能力改變。此重靶向能力係藉由用對非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞中存在之非梭狀芽孢桿菌毒素受體顯示優先結合活性的靶向域置換梭狀芽孢桿菌毒素之天然存在之靶向域來達成。針對靶向域之此等修飾產生稱為靶向囊泡胞吐調節蛋白(TVEMP)之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其能夠選擇性結合非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞上存在之非梭狀芽孢桿菌毒素受體(目標受體)(重靶向)。對非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞具有靶向活性之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可與非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞上存在之受體結合，易位至細胞質中，且對非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之SNARE複合物發揮其蛋白水解作用。
梭狀芽孢桿菌毒素及梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物療法成功用於許多適應症。一般而言，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之投藥耐受性良好。然而，在一些應用中，投藥會由於需要較大劑量來達成有益效應而具有挑戰性。較大劑量會增加毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可能移動穿過身體之間質液及循環系統(諸如心血管系統及淋巴系統)之可能性，從而導致毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物不合需要地分散至不為治療所靶向的區域。此分散會導致不合需要之副作用，諸如不為毒素治療所靶向之神經元中之神經傳遞質釋放的抑制或不為治療所靶向之肌肉的麻痺。舉例而言，經投與治療有效量之BoNT/A治療劑至頸肌肉中以治療斜頸(torticollis)之患者可能由於毒素分散至口咽(oropharynx)中而出現咽下困難(dysphagia)。因此，仍然需要在治療部位有效但在不為毒素治療所靶向之區域中之效應可忽略至最小的改良之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體。
梭狀芽孢桿菌毒素及梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體在需要較大劑量之療法中漸增之臨床、治療性及美容性使用使醫藥行業必需開發在用藥之目標部位有效但降低或防止與毒素分散至非所要位置相關之可能副作用的經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素及梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體。本說明書提供降低或防止與毒素分散至非靶向區域中相關之非所要副作用的新穎經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素及梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體。此等及相關優點適用於各種臨床、治療性及美容性應用，諸如治療神經肌肉病症、神經病症、眼病症、疼痛、肌肉損傷、頭痛、心血管疾病、神經精神病症、內分泌病症、癌症、耳病症及過動性面部細紋，以及向哺乳動物投與梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可產生有益效應之其他病症。
本說明書揭示可藉由利用間質液及循環系統(諸如心血管系統及淋巴系統)中存在之蛋白酶之存在自非所要位置快速不活化的經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素及經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體。此係因為本說明書中揭示之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素及經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體包含間質液及/或循環系統中存在之蛋白酶的蛋白酶裂解位點。存在該種蛋白酶裂解位點使得經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素或經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物易經其同源蛋白酶蛋白水解裂解，由此使得此等經修飾之毒素不活化。舉例而言，在經修飾成包含細胞外基質蛋白酶之裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物已擴散至間質液中的情形中，此經修飾之毒素或經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可由同源細胞外基質蛋白酶有效裂解。作為另一實例，在經修飾成包含血液蛋白酶之裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物已擴散至心血管系統中的情形中，此經修飾之毒素或經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可由同源血液蛋白酶有效裂解。作為另一實例，在經修飾成包含淋巴蛋白酶之裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物已擴散至淋巴系統中的情形中，此經修飾之毒素或經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可由同源淋巴蛋白酶有效裂解。因此，利用包含間質液及/或循環系統中存在之蛋白酶之裂解位點的梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物將自非所要位置減少或移除此梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，藉此降低或防止與梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物擴散至非所要位置相關之不合需要副作用。
因此，本說明書之態樣提供包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素，其中該不活化裂解位點區位於易位域或HCN結合子域中。所揭示之此等毒素可包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、梭狀芽孢桿菌毒素結合域、包含外源性蛋白酶裂解位點之二鏈環區、及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點。不活化裂解位點之非限制性實例包括凝血酶(Thrombin)裂解位點、纖維蛋白溶酶(Plasmin)裂解位點、凝血因子VIIa裂解位點、凝血因子IXa裂解位點、凝血因子Xa裂解位點、凝血因子XIa裂解位點、凝血因子XIIa裂解位點、血漿激肽釋放素(kallikrein)裂解位點、蛋白酶活化之G蛋白偶聯受體-1(PAR1)裂解位點、PAR 2裂解位點、PAR3裂解位點、PAR4裂解位點、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)裂解位點、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)裂解位點、弗林蛋白酶(Furin)裂解位點、尿激酶(urokinase)型纖維蛋白溶酶原活化因子(Plasminogen activator)(uPA)裂解位點、組織型纖維蛋白溶酶原活化因子(tPA)裂解位點、類胰蛋白酶(Tryptase)-ε裂解位點、小鼠肥大細胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位點、內皮素(endothelin)轉化酶-1(ECE-1)裂解位點、凱爾血型(Kell blood group)裂解位點、DPPIV裂解位點、具有1型血小板反應蛋白(thrombospondin)基元-13之ADAM金屬肽酶(metallopeptidase)(ADAMTS13)裂解位點、及組織蛋白酶(Cathepsin)L裂解位點。相對於相同或類似但無另外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，添加不活化裂解位點會增加梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度。
本說明書之其他態樣提供包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點區位於易位域或HCN結合子域中。所揭示之此等毒素可包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、包含外源性蛋白酶裂解位點之二鏈環區、及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點。不活化裂解位點之非限制性實例包括凝血酶裂解位點、纖維蛋白溶酶裂解位點、凝血因子VIIa裂解位點、凝血因子IXa裂解位點、凝血因子Xa裂解位點、凝血因子XIa裂解位點、凝血因子XIIa裂解位點、血漿激肽釋放素裂解位點、蛋白酶活化之G蛋白偶聯受體-1(PAR1)裂解位點、PAR 2裂解位點、PAR3裂解位點、PAR4裂解位點、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)裂解位點、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)裂解位點、弗林蛋白酶裂解位點、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)裂解位點、組織型纖維蛋白溶酶原活化因子(tPA)裂解位點、類胰蛋白酶-ε裂解位點、小鼠肥大細胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位點、內皮素轉化酶-1(ECE-1)裂解位點、凱爾血型裂解位點、DPPIV裂解位點、具有1型血小板反應蛋白基元-13之ADAM金屬肽酶(ADAMTS13)裂解位點、及組織蛋白酶L裂解位點。相對於相同或類似但無另外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，添加不活化裂解位點會增加梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度。
本說明書之其他態樣提供編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子。編碼該種梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子可進一步包含表現載體。
本說明書之其他態樣提供包含本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之組合物。包含該種梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之組合物可為醫藥組合物。該種醫藥組合物除包含本說明書中揭示之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素外亦可包含醫藥載劑、醫藥組分或兩者。
本說明書之其他態樣提供產生本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物的方法，該方法包含在細胞中表現編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子的步驟，其中自該聚核苷酸分子表現會產生經編碼之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。在其他態樣中，該方法包含將編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子引入細胞中及表現該聚核苷酸分子的步驟，其中自該聚核苷酸分子表現會產生經編碼之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。
由肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)、破傷風梭狀芽孢桿菌(Clostridium tetani)、巴氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium baratii)及酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)產生之梭狀芽孢桿菌毒素最廣泛用於人類及其他哺乳動物之治療性及美容性治療中。肉毒梭狀芽孢桿菌菌株會產生7種抗原性不同類型之肉毒桿菌毒素(BoNT)，其已藉由研究人類(BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E及BoNT/F)、動物(BoNT/C1及BoNT/D)中之肉毒症(botulism)發作而鑑別或自土壤分離(BoNT/G)。BoNT彼此具有約35%胺基酸一致性且共有相同功能域組織及總體結構架構。熟習此項技術者認識到在各類型之梭狀芽孢桿菌毒素內，可存在胺基酸序列以及編碼此等蛋白質之核酸略有不同之亞型。舉例而言，目前存在5種BoNT/A亞型，即BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4及BoNT/A5，其中當相較於SEQ ID NO: 1之BoNT/A亞型時，特定亞型顯示約84%至93%胺基酸一致性。作為另一實例，目前存在5種BoNT/B亞型，即BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/Bnp及BoNT/Bbv，其中當相較於SEQ ID NO: 6之BoNT/B亞型時，特定亞型顯示約93%%至96%胺基酸一致性。作為另一實例，目前存在3個BoNT/E亞型，即BoNT/E1、BoNT/E2及BoNT/E3，其中當相較於SEQ ID NO: 15之BoNT/E亞型時，特定亞型顯示約95%至99%胺基酸一致性。儘管所有7個BoNT血清型皆具有類似結構及藥理學性質，但各者亦顯示不同細菌學特徵。相對比而言，破傷風毒素(TeNT)由一組相同破傷風梭狀芽孢桿菌產生。另外兩種梭狀芽孢桿菌巴氏梭狀芽孢桿菌及酪酸梭狀芽孢桿菌產生分別類似於BoNT/F及BoNT/E之毒素BaNT及BuNT。
梭狀芽孢桿菌毒素各轉譯成約150 kDa之單鏈多肽，其隨後由天然存在之蛋白酶在二硫環內發生蛋白水解斷鏈而裂解(圖1)。此裂解發生在形成二硫橋鍵之2個半胱胺酸殘基之間所產生的離散二鏈環區內。此轉譯後加工產生包含約50 kDa輕鏈(LC)及約100 kDa重鏈(HC)之二鏈分子，該輕鏈與該重鏈由兩條鏈之間的單一雙硫鍵及非共價相互作用固持在一起。用於將單鏈分子轉化成二鏈之天然存在之蛋白酶當前未知。在一些血清型(諸如BoNT/A)中，由細菌血清型內源性產生天然存在之蛋白酶且在細胞內發生裂解，隨後將毒素釋放至環境中。然而，在其他血清型(諸如BoNT/E)中，細菌菌株似乎不產生能夠將單鏈形式之毒素轉化成二鏈形式之內源性蛋白酶。在此等情形中，毒素以單鏈毒素形式自細胞釋放，該單鏈毒素隨後由可見於環境中之天然存在之蛋白酶轉化成二鏈形式。
各成熟二鏈分子皆包含3個功能不同域：1)位於LC中之酶域，其包括含有鋅依賴性肽鏈內切酶活性並特異性靶向神經傳遞質釋放器之核心組分的金屬蛋白酶區；2)含於HC之胺基端半部(HN)內之易位域，其促進LC自細胞內囊泡釋放至目標細胞之細胞質中；及3)可見於HC之羧基端半部(HC)內之結合域，其決定毒素與位於目標細胞表面之受體複合物的結合活性及結合特異性。D. B. Lacy及R. C. Stevens,Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins,J. Mol. Biol. 291: 1091-1104(1999)。HC域包含兩個尺寸大致相等，由α螺旋分隔，稱為HCN及HCC子域之不同結構特徵。表1給出可見於例示性梭狀芽孢桿菌毒素中之各域及子域的近似邊界區。
此三個功能域之結合、易位及酶活性皆為毒性所必需。儘管此過程之所有詳情尚未準確瞭解，但梭狀芽孢桿菌毒素藉以進入神經元且抑制神經傳遞質釋放之總體細胞中毒機制為類似的，無論血清型或亞型如何。儘管申請人不希望受以下描述限制，但中毒機制可描述為包含至少四步：1)受體結合，2)複合物內化，3)輕鏈易位，及4)酶目標修飾(圖3)。當梭狀芽孢桿菌毒素之HC域與位於目標細胞之質膜表面上之毒素特異性受體系統結合時，該過程起始。認為受體複合物之結合特異性部分地由神經結醣脂與似乎明顯構成各梭狀芽孢桿菌毒素受體複合物之蛋白質受體的特定組合達成。一經結合，毒素/受體複合物即藉由內飲作用內化且經內化之囊泡經揀選用於特定細胞內途徑。易位步驟似乎藉由囊泡室的酸化而觸發。此過程似乎會起始增加疏水性且促進毒素之二鏈形式形成之兩個重要的pH值依賴性結構重排。一經活化，毒素之輕鏈肽鏈內切酶即自細胞內囊泡釋放至細胞溶質中，在該細胞溶質中，該輕鏈肽鏈內切酶似乎特異性靶向神經傳遞質釋放器之三種已知核心組分之一。此等核心蛋白、囊泡相關之膜蛋白(VAMP)/突觸泡蛋白(synaptobrevin)、25 kDa之突觸體相關蛋白(SNAP-25)及突觸蛋白(Syntaxin)為神經末端之突觸囊泡對接及融合所必需且構成可溶性N-乙基順丁烯二醯亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)家族之成員。BoNT/A及BoNT/E裂解羧基端區域中之SNAP-25，從而分別釋放9個或26個胺基酸之區段，且BoNT/Cl亦裂解羧基端附近之SNAP-25。肉毒桿菌血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F及BoNT/G以及破傷風毒素作用於VAMP之保守中心部分，且將VAMP之胺基端部分釋放至細胞溶質中。BoNT/Cl在接近胞內膜表面之單一位點處裂解突觸蛋白。突觸SNARE之選擇性蛋白水解為梭狀芽孢桿菌毒素在活體內引起神經傳遞質釋放阻斷的原因。梭狀芽孢桿菌毒素之SNARE蛋白目標為多種非神經元類型中之胞吐所共有；在此等細胞中，如在神經元中，輕鏈肽酶活性會抑制胞吐，參見例如Yann Humeau等人，How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release,82(5) Biochimie. 427-446(2000)；Kathryn Turton等人，Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure,Function and Therapeutic Utility,27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558.(2002)；Giovanna Lalli等人，The Journey of Tetanusand Botulinum Neurotoxins in Neurons,11(9)Trends Microbiol. 431-437,(2003)。BoNT/A、BoNT/B、以及TeNT之HC域之三維晶體結構指示梭狀芽孢桿菌神經毒素之三個功能域為由所有梭狀芽孢桿菌毒素所共有之結構不同的域。輕鏈之HEXXH共同基元形成位於通道可到達之蛋白質表面上之深間隙中的催化位點之四面體鋅結合袋。HN及HC域之結構主要由經單一α螺旋連接之β片拓撲結構組成。圓柱形HN域包含類似於可見於一些病毒蛋白質中之捲曲螺旋基元的兩個較長兩性α螺旋。HN域亦形成稱為『易位帶』之較長未結構化環，其圍繞在輕鏈之阻斷鋅原子到達活性位點之催化結合袋的較大帶負電荷間隙周圍。HC域包含尺寸大致相等之指示功能的兩個不同結構特徵。第一個特徵稱為HCN域，位於HC域之胺基半部中。HCN域形成β桶果凍捲摺疊。HCC域為構成HC域之第二域。此羧基端域包含經修飾之β-車軸草域，其形成類似於可見於許多糖結合蛋白(諸如血清澱粉樣蛋白P、唾液酸酶、殺蟲晶體蛋白(cryia)、殺昆蟲-內毒素及凝集素)中之碳水化合物結合部分的3個不同碳水化合物結合區。生物化學研究指示HCC域之β-車軸草域結構似乎介導與細胞表面上之梭狀芽孢桿菌毒素受體之含有特定碳水化合物的組分結合，參見例如Krzysztof Ginalski等人，Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site,482(1-2) FEBS Lett. 119-124(2000)。HC域遠離HN域傾斜，從而暴露表面環且使其可易於結合。輕鏈與HC域之間不發生接觸。
本說明書之態樣部分地提供梭狀芽孢桿菌毒素。如本文所用，術語「梭狀芽孢桿菌毒素」係指由可執行梭狀芽孢桿菌毒素藉以使細胞中毒且涵蓋以下之總體細胞機制之梭狀芽孢桿菌毒素菌株產生的任何神經毒素：梭狀芽孢桿菌毒素與低或高親和力受體複合物結合、毒素/受體複合物之內化、梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈易位至細胞質中及梭狀芽孢桿菌毒素受質之酶修飾。梭狀芽孢桿菌毒素包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域及梭狀芽孢桿菌毒素結合域。例示性梭狀芽孢桿菌毒素包括由肉毒梭狀芽孢桿菌、破傷風梭狀芽孢桿菌、巴氏梭狀芽孢桿菌及酪酸梭狀芽孢桿菌產生之彼等梭狀芽孢桿菌毒素。
梭狀芽孢桿菌毒素包括但不限於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素同功異型物及梭狀芽孢桿菌毒素亞型；非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素變異體，諸如保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體及其活性梭狀芽孢桿菌毒素片段或其任何組合。如本文所用，術語「梭狀芽孢桿菌毒素變異體」，無論天然存在或非天然存在，皆係指相較於揭示之參考序列之相應區域(表1)，具有至少一個胺基酸變化且可用與彼參考序列之相應區域之一致性百分比來描述的梭狀芽孢桿菌毒素。作為非限制性實例，相較於SEQ ID NO: 1之相應位置，SEQ ID NO: 1之BoNT/A變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 6之相應位置，SEQ ID NO: 6之BoNT/B變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 11之相應位置，SEQ ID NO: 11之BoNT/C1變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 13之相應位置，SEQ ID NO: 13之BoNT/D變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 15之相應位置，SEQ ID NO: 15之BoNT/E變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 18之相應位置，SEQ ID NO: 18之BoNT/F變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 21之相應位置，SEQ ID NO: 21之BoNT/G變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 22之相應位置，SEQ ID NO: 22之TeNT變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 23之相應位置，SEQ ID NO: 23之BaNT變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；及相較於SEQ ID NO: 24之相應位置，SEQ ID NO: 24之BuNT變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加。
如本文所用，術語「天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素變異體」係指不藉助於任何人類操作所產生之任何梭狀芽孢桿菌毒素，包括但不限於自經替代性拼接之轉錄物產生之梭狀芽孢桿菌毒素同功異型物、藉由自發突變產生之梭狀芽孢桿菌毒素同功異型物、及梭狀芽孢桿菌毒素亞型。梭狀芽孢桿菌毒素同功異型物之非限制性實例包括例如BoNT/A同功異型物、BoNT/B同功異型物、BoNT/C1同功異型物、BoNT/D同功異型物、BoNT/E同功異型物、BoNT/F同功異型物、BoNT/G同功異型物、TeNT同功異型物、BaNT同功異型物及BuNT同功異型物。梭狀芽孢桿菌毒素亞型之非限制性實例包括例如BoNT/A亞型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4及BoNT/A5；BoNT/B亞型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、二價BoNT/B及非蛋白水解性BoNT/B；BoNT/C1亞型BoNT/C1-1及 BoNT/C1-2；BoNT/E亞型BoNT/E1、BoNT/E2及BoNT/E3；BoNT/F亞型BoNT/F1、BoNT/F2及BoNT/F3；及BuNT亞型BuNT-1及BuNT-2。梭狀芽孢桿菌毒素亞型之其他非限制性實例包括例如BoNT/A亞型SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5；BoNT/B亞型SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10；BoNT/C1亞型SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12；BoNT/E亞型SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 17；BoNT/F亞型SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20；及BuNT亞型SEQ ID NO: 24及SEQ ID NO: 25。
如本文所用，術語「非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素變異體」係指藉助於人類操作所產生之任何梭狀芽孢桿菌毒素，包括但不限於藉由使用隨機突變誘發或合理設計進行遺傳工程改造產生之梭狀芽孢桿菌毒素及藉由化學合成產生之梭狀芽孢桿菌毒素。非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素變異體之非限制性實例包括例如保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體、及活性梭狀芽孢桿菌毒素片段。
如本文所用，術語「保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體」係指至少一個胺基酸經具有至少一種與參考梭狀芽孢桿菌毒素序列(表1)之原始胺基酸類似之性質的另一胺基酸或胺基酸類似物取代的梭狀芽孢桿菌毒素。性質之實例包括但不限於類似尺寸、構形、電荷、疏水性、親水性、親脂性、共價鍵結能力、氫鍵結能力、物理化學性質或其類似性質、或其任何組合。保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體可以與該保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素。保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體可取代該保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素之1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400或500個或500個以上胺基酸。保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體亦可取代該保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素之至少5、10、15、20或25個鄰接胺基酸。保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體之非限制性實例包括例如保守BoNT/A變異體、保守BoNT/B變異體、保守BoNT/C1變異體、保守BoNT/D變異體、保守BoNT/E變異體、保守BoNT/F變異體、保守BoNT/G變異體、保守TeNT變異體、保守BaNT變異體及保守BuNT變異體。
如本文所用，術語「非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體」係指以下梭狀芽孢桿菌毒素：其中1)至少一個胺基酸自該非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素缺失；2)至少一個胺基酸添加至該非保守梭狀芽孢桿菌毒素所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素中；或3)至少一個胺基酸經不共有與參考梭狀芽孢桿菌毒素序列(表1)之原始胺基酸類似的任何性質之另一胺基酸或胺基酸類似物取代。非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體可以與該非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素。非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體可自該非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素缺失一或多個胺基酸、2個或2個以上胺基酸、3個或3個以上胺基酸、4個或4個以上胺基酸、5個或5個以上胺基酸及10個或10個以上胺基酸。非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體可添加一或多個胺基酸、2個或2個以上胺基酸、3個或3個以上胺基酸、4個或4個以上胺基酸、5個或5個以上胺基酸及10個或10個以上胺基酸至該非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素中。非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體可取代該非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素之1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400或500個或500個以上胺基酸。非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體亦可取代該非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素之至少5、10、15、20或25個鄰接胺基酸。非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體之非限制性實例包括例如非保守BoNT/A變異體、非保守BoNT/B變異體、非保守BoNT/C1變異體、非保守BoNT/D變異體、非保守BoNT/E變異體、非保守BoNT/F變異體、非保守BoNT/G變異體、非保守TeNT變異體、非保守BaNT變異體及非保守BuNT變異體。
亦設想多種梭狀芽孢桿菌毒素片段之任一者可適用於本說明書之態樣中，其限制條件為此等活性片段可執行梭狀芽孢桿菌毒素藉以使受質蛋白水解裂解的總體細胞機制。因此，此實施例之態樣可包括長度為例如至少600、700、800、900、1000、1100或至少1200個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素片段。此實施例之其他態樣可包括長度為例如至多600、700、800、900、1000、1100或至多1200個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素片段。
亦設想多種包含輕鏈之梭狀芽孢桿菌毒素片段之任一者可適用於本說明書之態樣中，其限制條件為此等輕鏈片段可特異性靶向神經傳遞質釋放器之核心組分且因此參與執行梭狀芽孢桿菌毒素藉以使受質蛋白水解裂解的總體細胞機制。梭狀芽孢桿菌毒素之輕鏈之長度為約420-460個胺基酸且其包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域(表1)。研究已顯示完整長度之梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈並不為梭狀芽孢桿菌毒素酶域之酶活性所必需。作為一非限制性實例，BoNT/A輕鏈之前8個胺基酸不為酶活性所需。作為另一非限制性實例，TeNT輕鏈之前8個胺基酸不為酶活性所需。同樣，輕鏈之羧基端不為活性所必需。作為一非限制性實例，BoNT/A輕鏈之最後32個胺基酸不為酶活性所需。作為另一非限制性實例，TeNT輕鏈之最後31個胺基酸不為酶活性所需。因此，此實施例之態樣包括包含長度為例如至少350、375、400、425或450個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素酶域的梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈。此實施例之其他態樣包括包含長度為例如至多350、375、400、425或450個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素酶域的梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈。
亦設想多種包含梭狀芽孢桿菌毒素易位域之梭狀芽孢桿菌毒素HN區之任一者可適用於本說明書之態樣中，其限制條件為此等活性片段可促進LC自細胞內囊泡釋放至目標細胞之細胞質中且因此參與執行梭狀芽孢桿菌毒素藉以使受質蛋白水解裂解的總體細胞機制。梭狀芽孢桿菌毒素之重鏈之HN區的長度為約410-430個胺基酸且其包含梭狀芽孢桿菌毒素易位域(表1)。研究已顯示梭狀芽孢桿菌毒素重鏈之完整長度之HN區並不為梭狀芽孢桿菌毒素易位域之易位活性所必需。因此，此實施例之態樣可包括包含長度為例如至少350、375、400或425個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素易位域的梭狀芽孢桿菌毒素HN區。此實施例之其他態樣可包括包含長度為例如至多350、375、400或425個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素易位域的梭狀芽孢桿菌毒素HN區。
亦設想多種包含梭狀芽孢桿菌毒素結合域之梭狀芽孢桿菌毒素HC區之任一者可適用於本說明書之態樣中，其限制條件為此等活性片段可決定毒素與位於目標細胞表面之受體複合物的結合活性及結合特異性且促進梭狀芽孢桿菌毒素藉以使受質蛋白水解裂解的總體細胞機制。梭狀芽孢桿菌毒素之重鏈之HC區的長度為約400-440個胺基酸且其包含結合域(表1)。研究已顯示梭狀芽孢桿菌毒素重鏈之完整長度之HC區並不為梭狀芽孢桿菌毒素結合域之結合活性所必需。因此，此實施例之態樣可包括包含長度為例如至少350、375、400或425個胺基酸之結合域的梭狀芽孢桿菌毒素HC區。此實施例之其他態樣可包括包含長度為例如至多350、375、400或425個胺基酸之結合域的梭狀芽孢桿菌毒素HC區。
多種序列比對方法之任一者可用於確定一致性百分比，該等方法包括但不限於整體法、局部法及混合法，諸如區段接近法(segment approach method)。確定一致性百分比之方案為在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
整體法自分子之開始至結尾比對序列且藉由累加個別殘基對之計分及藉由施加空隙罰分來確定最佳比對。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，參見例如Julie D. Thompson等人，CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice,22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；及迭代改進，參見例如Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments,264(4) J. Mol. Biol. 823-838(1996)。局部法藉由鑑別由所有輸入序列所共有之一或多個保守基元來比對序列。非限制性方法包括例如Match-box，參見例如Eric Depiereux及Ernest Feytmans,Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5) CABIOS 501-509(1992)；吉布斯抽樣(Gibbs sampling)，參見例如C. E. Lawrence等人，Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131) Science 208-214(1993)；Align-M，參見例如Ivo Van Walle等人，Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9) Bioinformatics,:1428-1435(2004)。
混合法組合整體比對法與局部比對法兩者之功能態樣。非限制性方法包括例如區段對區段比較，參見例如Burkhard Morgenstern等人，Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based 0n Segment-To-Segment Comparison,93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103(1996)；T-Coffee，參見例如Cdric Notredame等人，T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment,302(1) J. Mol. Biol. 205-217(2000)；MUSCLE，參見例如Robert C. Edgar,MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput,32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797(2004)；及DIALIGN-T，參見例如Amarendran R Subramanian等人，DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment,6(1) BMC Bioinformatics 66(2005)。
本說明書描述一個胺基酸經取代成另一胺基酸之各種多肽變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素變異體、梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體、梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體、梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、及蛋白酶裂解位點變異體。取代可由多種因素評估，該等因素諸如經取代之胺基酸之物理性質(表2)或原始胺基酸對取代之容許程度(表3)。在多肽中哪個胺基酸可經取代成另一胺基酸之選擇為一般技術者所知。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域及梭狀芽孢桿菌毒素結合域。在此實施例之一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素包含天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素同功異型物或梭狀芽孢桿菌毒素亞型。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素包含非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素變異體，諸如保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素變異體或活性梭狀芽孢桿菌毒素片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域或其活性片段、梭狀芽孢桿菌毒素易位域或其活性片段、梭狀芽孢桿菌毒素結合域或其活性片段、或其任何組合。在此實施例之其他態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素可包含BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT或BuNT。
在另一實施例中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之疏水性胺基酸可經另一疏水性胺基酸取代。疏水性胺基酸之實例包括例如C、F、I、L、M、V及W。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之脂族胺基酸可經另一脂族胺基酸取代。脂族胺基酸之實例包括例如A、I、L、P及V。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之芳族胺基酸可經另一芳族胺基酸取代。芳族胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之堆疊胺基酸可經另一堆疊胺基酸取代。堆疊胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之極性胺基酸可經另一極性胺基酸取代。極性胺基酸之實例包括例如D、E、K、N、Q及R。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之極性較小或中性胺基酸可經另一極性較小或中性胺基酸取代。極性較小或中性胺基酸之實例包括例如A、H、G、P、S、T及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之帶正電荷胺基酸可經另一帶正電荷胺基酸取代。帶正電荷胺基酸之實例包括例如K、R及H。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之帶負電荷胺基酸可經另一帶負電荷胺基酸取代。帶負電荷胺基酸之實例包括例如D及E。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之較小胺基酸可經另一較小胺基酸取代。較小胺基酸之實例包括例如A、D、G、N、P、S及T。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素之多肽鏈中一特定位置處之C-β分支鏈胺基酸可經另一C-β分支鏈胺基酸取代。C-β分支鏈胺基酸之實例包括例如I、T及V。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含BoNT/A。在此實施例之一態樣中，BoNT/A包含BoNT/A酶域、BoNT/A易位域及BoNT/A結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A包含天然存在之BoNT/A變異體，諸如BoNT/A同功異型物或BoNT/A亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之天然存在之BoNT/A變異體，諸如BoNT/A同功異型物或BoNT/A亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A包含非天然存在之BoNT/A變異體，諸如保守BoNT/A變異體、非保守BoNT/A變異體或活性BoNT/A片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之非天然存在之BoNT/A變異體，諸如保守BoNT/A變異體、非保守BoNT/A變異體、活性BoNT/A片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A包含BoNT/A酶域或其活性片段、BoNT/A易位域或其活性片段、BoNT/A結合域或其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO:5之BoNT/A酶域或其活性片段；SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之BoNT/A易位域或其活性片段；SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之BoNT/A結合域或其活性片段；或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/A包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A包含相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A包含相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含BoNT/B。在此實施例之一態樣中，BoNT/B包含BoNT/B酶域、BoNT/B易位域及BoNT/B結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B包含天然存在之BoNT/B變異體，諸如BoNT/B同功異型物或BoNT/B亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之天然存在之BoNT/B變異體，諸如BoNT/B同功異型物或BoNT/B亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B包含非天然存在之BoNT/B變異體，諸如保守BoNT/B變異體、非保守BoNT/B變異體、活性BoNT/B片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之非天然存在之BoNT/B變異體，諸如保守BoNT/B變異體、非保守BoNT/B變異體、活性BoNT/B片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B包含BoNT/B酶域或其活性片段、BoNT/B易位域或其活性片段、BoNT/B結合域或其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之BoNT/B酶域或其活性片段；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之BoNT/B易位域或其活性片段；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之BoNT/B結合域或其活性片段；或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/B包含與SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 102之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B包含相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B包含相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含BoNT/C1。在此實施例之一態樣中，BoNT/C1包含BoNT/C1酶域、BoNT/C1易位域及BoNT/C1結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1包含天然存在之BoNT/C1變異體，諸如BoNT/C1同功異型物或BoNT/C1亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之天然存在之BoNT/C1變異體，諸如BoNT/C1同功異型物或BoNT/C1亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1包含非天然存在之BoNT/C1變異體，諸如保守BoNT/C1變異體、非保守BoNT/C1變異體、活性BoNT/C1片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之非天然存在之BoNT/C1變異體，諸如保守BoNT/C1變異體、非保守BoNT/C1變異體、活性BoNT/C1片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1包含BoNT/C1酶域或其活性片段、BoNT/C1易位域或其活性片段、BoNT/C1結合域、其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之BoNT/C1酶域或其活性片段、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之BoNT/C1易位域或其活性片段、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之BoNT/C1結合域或其活性片段、或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1包含與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之多肽；或與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1包含相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1包含相對於SEQ ID NO: 3，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含BoNT/D。在此實施例之一態樣中，BoNT/D包含BoNT/D酶域、BoNT/D易位域及BoNT/D結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D包含天然存在之BoNT/D變異體，諸如BoNT/D同功異型物或BoNT/D亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之天然存在之BoNT/D變異體，諸如BoNT/D同功異型物或BoNT/D亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D包含非天然存在之BoNT/D變異體，諸如保守BoNT/D變異體、非保守BoNT/D變異體、活性BoNT/D片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之非天然存在之BoNT/D變異體，諸如保守BoNT/D變異體、非保守BoNT/D變異體、活性BoNT/D片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D包含BoNT/D酶域或其活性片段、BoNT/D易位域或其活性片段、BoNT/D結合域或其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之BoNT/D酶域或其活性片段、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之BoNT/D易位域或其活性片段、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之BoNT/D結合域或其活性片段、或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/D包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之多肽；或與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D包含相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D包含相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含BoNT/E。在此實施例之一態樣中，BoNT/E包含BoNT/E酶域、BoNT/E易位域及BoNT/E結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E包含天然存在之BoNT/E變異體，諸如BoNT/E同功異型物或BoNT/E亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之天然存在之BoNT/E變異體，諸如BoNT/E同功異型物或BoNT/E亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E包含非天然存在之BoNT/E變異體，諸如保守BoNT/E變異體、非保守BoNT/E變異體、活性BoNT/E片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之非天然存在之BoNT/E變異體，諸如保守BoNT/E變異體、非保守BoNT/E變異體、活性BoNT/E片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E包含BoNT/E酶域或其活性片段、BoNT/E易位域或其活性片段、BoNT/E結合域或其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之BoNT/E酶域或其活性片段；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之BoNT/E易位域或其活性片段；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之BoNT/E結合域或其活性片段；或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/E包含與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之多肽；或與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E包含相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E包含相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含BoNT/F。在此實施例之一態樣中，BoNT/F包含BoNT/F酶域、BoNT/F易位域及BoNT/F結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F包含天然存在之BoNT/F變異體，諸如BoNT/F同功異型物或BoNT/F亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之天然存在之BoNT/F變異體，諸如BoNT/F同功異型物或BoNT/F亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F包含非天然存在之BoNT/F變異體，諸如保守BoNT/F變異體、非保守BoNT/F變異體、活性BoNT/F片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之非天然存在之BoNT/F變異體，諸如保守BoNT/F變異體、非保守BoNT/F變異體、活性BoNT/F片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F包含BoNT/F酶域或其活性片段、BoNT/F易位域或其活性片段、BoNT/F結合域或其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之BoNT/F酶域或其活性片段；SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之BoNT/F易位域或其活性片段；SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之BoNT/F結合域或其活性片段；或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/F包含與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之多肽；或與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F包含相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F包含相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含BoNT/G。在此實施例之一態樣中，BoNT/G包含BoNT/G酶域、BoNT/G易位域及BoNT/G結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G包含SEQ ID NO: 21。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G包含天然存在之BoNT/G變異體，諸如BoNT/G同功異型物或BoNT/G亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G包含SEQ ID NO: 21之天然存在之BoNT/G變異體，諸如SEQ ID NO: 21之BoNT/G同功異型物或BoNT/G亞型。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G包含非天然存在之BoNT/G變異體，諸如保守BoNT/G變異體、非保守BoNT/G變異體或活性BoNT/G片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D包含SEQ ID NO: 21之非天然存在之BoNT/G變異體，諸如保守BoNT/G變異體、非保守BoNT/G變異體、活性BoNT/G片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G包含BoNT/G酶域或其活性片段、BoNT/G易位域或其活性片段、BoNT/G結合域或其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G包含SEQ ID NO: 21之BoNT/G酶域或其活性片段、SEQ ID NO: 21之BoNT/G易位域或其活性片段、SEQ ID NO: 21之BoNT/G結合域或其活性片段、或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/G包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之多肽；或與SEQ ID NO: 21之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G包含相對於SEQ ID NO: 21，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 21，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G包含相對於SEQ ID NO: 21，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 21，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含TeNT。在此實施例之一態樣中，TeNT包含TeNT酶域、TeNT易位域及TeNT結合域。在此實施例之一態樣中，TeNT包含SEQ ID NO: 22。在此實施例之另一態樣中，TeNT包含天然存在之TeNT變異體，諸如TeNT同功異型物或TeNT亞型。在此實施例之另一態樣中，TeNT包含SEQ ID NO: 22之天然存在之TeNT變異體，諸如TeNT同功異型物或TeNT亞型。在此實施例之另一態樣中，TeNT包含非天然存在之TeNT變異體，諸如保守TeNT變異體、非保守TeNT變異體、活性TeNT片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，TeNT包含SEQ ID NO: 22之非天然存在之TeNT變異體，諸如保守TeNT變異體、非保守TeNT變異體、活性TeNT片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，TeNT包含TeNT酶域或其活性片段、TeNT易位域或其活性片段、TeNT結合域或其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，TeNT包含SEQ ID NO: 22之TeNT酶域或其活性片段、SEQ ID NO: 22之TeNT易位域或其活性片段、SEQ ID NO: 22之TeNT結合域或其活性片段、或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，TeNT包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之多肽；或與SEQ ID NO: 22之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT包含相對於SEQ ID NO: 22，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 22，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT包含相對於SEQ ID NO: 22，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 22，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含BaNT。在此實施例之一態樣中，BaNT包含BaNT酶域、BaNT易位域及BaNT結合域。在此實施例之另一態樣中，BaNT包含SEQ ID NO: 23。在此實施例之另一態樣中，BaNT包含天然存在之BaNT變異體，諸如BaNT同功異型物或BaNT亞型。在此實施例之另一態樣中，BaNT包含SEQ ID NO: 23之天然存在之BaNT變異體，諸如BaNT同功異型物或BaNT亞型。在此實施例之另一態樣中，BaNT包含非天然存在之BaNT變異體，諸如保守BaNT變異體、非保守BaNT變異體或活性BaNT片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BaNT包含SEQ ID NO: 23之非天然存在之BaNT變異體，諸如保守BaNT變異體、非保守BaNT變異體、活性BaNT片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BaNT包含BaNT酶域或其活性片段、BaNT易位域或其活性片段、BaNT結合域或其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BaNT包含SEQ ID NO: 23之BaNT酶域或其活性片段、SEQ ID NO: 23之BaNT易位域或其活性片段、SEQ ID NO: 23之BaNT結合域或其活性片段、或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，BaNT包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之多肽；或與SEQ ID NO: 23之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT包含相對於SEQ ID NO: 23，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 23，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT包含相對於SEQ ID NO: 23，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 23，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含BuNT。在此實施例之一態樣中，BuNT包含BuNT酶域、BuNT易位域及BuNT結合域。在此實施例之另一態樣中，BuNT包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25。在此實施例之另一態樣中，BuNT包含天然存在之BuNT變異體，諸如BuNT同功異型物或BuNT亞型。在此實施例之另一態樣中，BuNT包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之天然存在之BuNT變異體，諸如BuNT同功異型物或BuNT亞型。在此實施例之另一態樣中，BuNT包含非天然存在之BuNT變異體，諸如保守BuNT變異體、非保守BuNT變異體、活性BuNT片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BuNT包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之非天然存在之BuNT變異體，諸如保守BuNT變異體、非保守BuNT變異體、活性BuNT片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BuNT包含BuNT酶域或其活性片段、BuNT易位域或其活性片段、BuNT結合域、其活性片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BuNT包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之BuNT酶域或其活性片段、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之BuNT易位域或其活性片段、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之BuNT結合域或其活性片段、或其任何組合。
在此實施例之其他態樣中，BuNT包含與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之多肽；或與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
如本文所用，術語「梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物」或「梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體」係指包含一種梭狀芽孢桿菌毒素之至少一部分及至少一種其他蛋白質之一部分以形成具有至少一種不同於表1之參考梭狀芽孢桿菌毒素之性質的毒素之分子。梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體之非限制性實例包括包含非梭狀芽孢桿菌毒素酶域之梭狀芽孢桿菌毒素、包含非梭狀芽孢桿菌毒素易位域之梭狀芽孢桿菌毒素、包含非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之梭狀芽孢桿菌毒素、或其任何組合。梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體之其他非限制性實例包括包含不同梭狀芽孢桿菌毒素之酶域的梭狀芽孢桿菌毒素、包含不同梭狀芽孢桿菌毒素之易位域的梭狀芽孢桿菌毒素、包含不同梭狀芽孢桿菌毒素之結合域的梭狀芽孢桿菌毒素、或其任何組合。
一類梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素，其中天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素之酶域或其一部分、易位域或其一部分、及/或結合域或其一部分經不同梭狀芽孢桿菌毒素之酶域或其一部分、易位域或其一部分、及/或結合域或其一部分修飾或置換。作為非限制性實例，BoNT/A之結合域可經BoNT/B之結合域置換，從而產生包含BoNT/A酶域、BoNT/A易位域及BoNT/B結合域之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。此等梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體描述於例如J. Oliver Dolly等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利7,132,259中，該專利以全文引用的方式併入本文中。作為另一非限制性實例，BoNT/A之白胺酸基元可插入BoNT/E之輕鏈中以增加生物持久性。此等梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體描述於例如Lance E. Steward等人，Leucine-based Motif and Clostridial Toxins，美國專利公開案2003/0027752(2003年2月6日)；Lance E. Steward等人，Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins，美國專利公開案2003/0219462(2003年11月27日)；及Lance E. Steward等人，Clostridial Neurotoxin Compositionsand Modified Clostridial Neurotoxins，美國專利公開案2004/0220386(2004年11月4日)中，各專利皆以全文引用的方式併入本文中。
另一類梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含梭狀芽孢桿菌毒素，其中天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素之結合域經非梭狀芽孢桿菌毒素之結合域修飾或置換。此等梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體具有改變之細胞結合活性，因為經修飾之毒素可例如1)使用與天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素所用受體相同之存在於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞表面上的受體，稱為對天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之細胞結合活性增強；2)使用存在於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞表面上之不同受體，稱為對天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之細胞結合活性改變；或3)使用存在於非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞表面上之不同受體，稱為對非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之細胞結合活性改變，即重靶向毒素或TVEMP。
梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可為細胞結合活性增強且能夠使天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞(例如運動神經元)中毒的梭狀芽孢桿菌毒素。獲得此增強之結合活性之一種方式係藉由修飾天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素之內源性結合域以增強毒素對其天然存在之受體的細胞結合活性來達成。針對靶向域之此等修飾產生例如會增加對存在於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞上之內源性梭狀芽孢桿菌毒素受體的結合親和力之增強之細胞結合活性；會增加對存在於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞上之一部分內源性梭狀芽孢桿菌毒素受體的結合特異性之增強之細胞結合活性；或會增加結合親和力與結合特異性兩者之增強之細胞結合活性。對天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素受體之細胞結合活性增強之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素的非限制性實例描述於例如Lance E. Steward等人，Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems，美國專利公開案2008/0096248；Lance E. Steward,Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Enhanced Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells,國際專利公開案2008/105901中，各專利皆據此以全文引用的方式併入本文中。
梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可為細胞結合活性改變且能夠使天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞(例如運動神經元)中毒的梭狀芽孢桿菌毒素。獲得此改變之能力之一種方式係藉由用優先與存在於梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞表面上之不同受體結合之另一分子的結合域置換天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素之內源性結合域來達成。針對結合域之該種修飾會產生能夠優先與存在於梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞上之非梭狀芽孢桿菌毒素受體結合之經修飾的毒素。對天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之此增強的結合活性使欲向個體投與之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素的有效劑量降低，此係由於更多毒素將傳遞至目標細胞中之故。因此，結合活性增強之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素將減少毒素不合需要地分散至不為治療所靶向之區域，藉此降低或防止與梭狀芽孢桿菌毒素擴散至非所要位置相關之不合需要的副作用。對梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之細胞結合能力改變之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素的非限制性實例描述於例如Lance E. Steward等人，Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use，美國專利7,514,088；Lance E. Steward等人，Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells，美國專利公開案2008/0161543；Lance E. Steward,Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells，美國專利公開案2008/0241881；Lance E. Steward等人，Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use，美國專利公開案2009/0048431；Lance E. Steward等人，Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells,國際專利公開案WO 2007/106115中，各專利據此以全文引用的方式併入本文中。
梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可為細胞結合活性改變且能夠使除梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞以外之細胞(例如除運動神經元以外之細胞)中毒的梭狀芽孢桿菌毒素。此等分子稱為TVEMP，其藉由使用存在於非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞上之目標受體達成此中毒。此重靶向能力係藉由用對存在於非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞中之非梭狀芽孢桿菌毒素受體顯示優先結合活性的結合域置換梭狀芽孢桿菌毒素之天然存在之結合域來達成。針對結合域之此等修飾會產生能夠優先與存在於非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞上之非梭狀芽孢桿菌毒素受體結合之經修飾的毒素。對非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之靶向活性改變之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可與目標受體結合，易位至細胞質中，且對非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之SNARE複合物發揮其蛋白水解作用。對非梭狀芽孢桿菌毒素目標細胞之靶向活性改變之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體的非限制性實例描述於例如Keith A. Foster等人，Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions，美國專利5,989,545；Clifford C. Shone等人，Recombinant Toxin Fragments，美國專利6,461,617；Conrad P. Quinn等人，Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion，美國專利6,632,440；Lance E. Steward等人，Methods and Compositions for the Treatment of Pancreatitis，美國專利6,843,998；J. Oliver Dolly等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利7,132,259；Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain，美國專利7,244,437；Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain，美國專利7,413,742；Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain，美國專利7,415,338；Lance E. Steward等人，Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use，美國專利7,514,088；Keith A. Foster等人，Inhibition of Secretion from Non-neural Cells，美國專利公開案2006/0216283；Keith A. Foster,Fusion Proteins，美國專利公開案2008/0064092；Keith A. Foster,Fusion Proteins，美國專利公開案2009/0035822；Lance E. Steward等人，Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use，美國專利公開案2009/0048431；Keith A. Foster,Non-Cytotoxic Protein Conjugates，美國專利公開案2009/0162341；Keith A. Foster等人，Re-targeted Toxin Conjugates,國際專利公開案WO 2005/023309；及Lance E. Steward,Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells,國際專利申請案WO 2008/008805中，各專利皆據此以全文引用的方式併入本文中。
本說明書之態樣部分地提供梭狀芽孢桿菌毒素酶域。如本文所用，術語「梭狀芽孢桿菌毒素酶域」係指可執行中毒過程之酶目標修飾步驟之任何梭狀芽孢桿菌毒素多肽。因此，梭狀芽孢桿菌毒素酶域特異性靶向梭狀芽孢桿菌毒素受質且涵蓋蛋白水解裂解梭狀芽孢桿菌毒素受質，諸如SNARE蛋白，如SNAP-25受質、VAMP受質及突觸蛋白受質。梭狀芽孢桿菌毒素酶域之非限制性實例包括例如BoNT/A酶域、BoNT/B酶域、BoNT/C1酶域、BoNT/D酶域、BoNT/E酶域、BoNT/F酶域、BoNT/G酶域、TeNT酶域、BaNT酶域及BuNT酶域。
梭狀芽孢桿菌毒素酶域包括但不限於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素酶域同功異型物及梭狀芽孢桿菌毒素酶域亞型；及非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體，諸如保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體、其活性梭狀芽孢桿菌毒素酶域片段或其任何組合。
如本文所用，術語「梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體」，無論天然存在或非天然存在，皆係指相較於揭示之參考序列之相應區域(表1)，具有至少一個胺基酸變化且可用與彼參考序列之相應區域之一致性百分比來描述的梭狀芽孢桿菌毒素酶域。除非明確指示，否則適用於實施揭示之實施例之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體為執行中毒過程之酶目標修飾步驟之變異體。作為非限制性實例，相較於SEQ ID NO: 1之胺基酸1/2-429，BoNT/A酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 6之胺基酸1/2-436，BoNT/B酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 11之胺基酸1/2-436，BoNT/C1酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 13之胺基酸1/2-436，BoNT/D酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 15之胺基酸1/2-411，BoNT/E酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 18之胺基酸1/2-428，BoNT/F酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 21之胺基酸1/2-438，BoNT/G酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 22之胺基酸1/2-438，TeNT酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 23之胺基酸1/2-420，BaNT酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；及相較於SEQ ID NO: 24之胺基酸1/2-411，BuNT酶域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加。
熟習此項技術者認識到在各血清型之梭狀芽孢桿菌毒素內，可存在胺基酸序列以及編碼此等蛋白質之核酸略有不同之天然存在的梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體。舉例而言，目前存在5種BoNT/A亞型，即BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4及BoNT/A5，其中當相較於SEQ ID NO: 1之BoNT/A酶域時，特定酶域亞型顯示約80%至95%胺基酸一致性。如本文所用，術語「天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體」係指藉由天然存在之過程所產生之任何梭狀芽孢桿菌毒素酶域，包括但不限於自經替代性拼接之轉錄物產生之梭狀芽孢桿菌毒素酶域同功異型物、藉由自發突變產生之梭狀芽孢桿菌毒素酶域同功異型物、及梭狀芽孢桿菌毒素酶域亞型。天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體可以與該天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域。
天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體之一非限制性實例為梭狀芽孢桿菌毒素酶域同功異型物，諸如BoNT/A酶域同功異型物、BoNT/B酶域同功異型物、BoNT/C1酶域同功異型物、BoNT/D酶域同功異型物、BoNT/E酶域同功異型物、BoNT/F酶域同功異型物、BoNT/G酶域同功異型物、TeNT酶域同功異型物、BaNT酶域同功異型物、及BuNT酶域同功異型物。天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體之另一非限制性實例為梭狀芽孢桿菌毒素酶域亞型，諸如來自亞型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4或BoNT/A5之酶域；來自亞型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/Bbv或BoNT/Bnp之酶域；來自亞型BoNT/C1-1或BoNT/C1-2之酶域；來自亞型BoNT/E1、BoNT/E2及BoNT/E3之酶域；來自亞型BoNT/F1、BoNT/F2或BoNT/F3之酶域；及來自亞型BuNT-1或BuNT-2之酶域。
如本文所用，術語「非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體」係指藉助於人類操作所產生之任何梭狀芽孢桿菌毒素酶域，包括但不限於藉由使用隨機突變誘發或合理設計進行遺傳工程改造產生之梭狀芽孢桿菌毒素酶域及藉由化學合成產生之梭狀芽孢桿菌毒素酶域。非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體之非限制性實例包括例如保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體、梭狀芽孢桿菌毒素酶域嵌合變異體、及活性梭狀芽孢桿菌毒素酶域片段。
如本文所用，術語「保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體」係指至少一個胺基酸經具有至少一種與參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域序列(表1)之原始胺基酸類似之性質的另一胺基酸或胺基酸類似物取代的梭狀芽孢桿菌毒素酶域。性質之實例包括但不限於類似尺寸、構形、電荷、疏水性、親水性、親脂性、共價鍵結能力、氫鍵結能力、物理化學性質或其類似性質、或其任何組合。保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體可以與該保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域。保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體之非限制性實例包括例如保守BoNT/A酶域變異體、保守BoNT/B酶域變異體、保守BoNT/Cl酶域變異體、保守BoNT/D酶域變異體、保守BoNT/E酶域變異體、保守BoNT/F酶域變異體、保守BoNT/G酶域變異體、保守TeNT酶域變異體、保守BaNT酶域變異體、及保守BuNT酶域變異體。
如本文所用，術語「非保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體」係指以下梭狀芽孢桿菌毒素酶域：其中1)至少一個胺基酸自該非保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域缺失；2)至少一個胺基酸添加至該非保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域中；或3)至少一個胺基酸經不共有與參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域序列(表1)之原始胺基酸類似的任何性質之另一胺基酸或胺基酸類似物取代。非保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體可以與該非保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素酶域。非保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體之非限制性實例包括例如非保守BoNT/A酶域變異體、非保守BoNT/B酶域變異體、非保守BoNT/C1酶域變異體、非保守BoNT/D酶域變異體、非保守BoNT/E酶域變異體、非保守BoNT/F酶域變異體、非保守BoNT/G酶域變異體、及非保守TeNT酶域變異體、非保守BaNT酶域變異體、及非保守BuNT酶域變異體。
如本文所用，術語「活性梭狀芽孢桿菌毒素酶域片段」係指可適用於本說明書之態樣中之包含酶域的多種梭狀芽孢桿菌毒素片段之任一者，其限制條件為此等酶域片段可特異性靶向神經傳遞質釋放器之核心組分且因此參與執行梭狀芽孢桿菌毒素藉以使受質蛋白水解裂解的總體細胞機制。梭狀芽孢桿菌毒素之酶域之長度為約420-460個胺基酸且其包含酶域(表1)。研究已顯示完整長度之梭狀芽孢桿菌毒素酶域並不為酶域之酶活性所必需。作為一非限制性實例，BoNT/A酶域之前8個胺基酸不為酶活性所需。作為另一非限制性實例，TeNT酶域之前8個胺基酸不為酶活性所需。同樣，酶域之羧基端不為活性所必需。作為一非限制性實例，BoNT/A酶域之最後32個胺基酸不為酶活性所需。作為另一非限制性實例，TeNT酶域之最後31個胺基酸不為酶活性所需。因此，此實施例之態樣包括包含長度為例如至少350、375、400、425或450個胺基酸之酶域的梭狀芽孢桿菌毒素酶域。此實施例之其他態樣包括包含長度為例如至多350、375、400、425或450個胺基酸之酶域的梭狀芽孢桿菌毒素酶域。
多種序列比對方法之任一者可用於確定天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體及非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體之一致性百分比，該等方法包括但不限於整體法、局部法及混合法，諸如區段接近法。確定一致性百分比之方案為在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
因此，在一實施例中，本說明書中揭示之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域。在此實施例之一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素酶域同功異型物或梭狀芽孢桿菌毒素酶域亞型。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體，諸如保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素酶域變異體、活性梭狀芽孢桿菌毒素酶域片段或其任何組合。
在另一實施例中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之疏水性胺基酸可經另一疏水性胺基酸取代。疏水性胺基酸之實例包括例如C、F、I、L、M、V及W。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之脂族胺基酸可經另一脂族胺基酸取代。脂族胺基酸之實例包括例如A、I、L、P及V。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之芳族胺基酸可經另一芳族胺基酸取代。芳族胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之堆疊胺基酸可經另一堆疊胺基酸取代。堆疊胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之極性胺基酸可經另一極性胺基酸取代。極性胺基酸之實例包括例如D、E、K、N、Q及R。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之極性較小或中性胺基酸可經另一極性較小或中性胺基酸取代。極性較小或中性胺基酸之實例包括例如A、H、G、P、S、T及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之帶正電荷胺基酸可經另一帶正電荷胺基酸取代。帶正電荷胺基酸之實例包括例如K、R及H。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之帶負電荷胺基酸可經另一帶負電荷胺基酸取代。帶負電荷胺基酸之實例包括例如D及E。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之較小胺基酸可經另一較小胺基酸取代。較小胺基酸之實例包括例如A、D、G、N、P、S及T。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素酶域之多肽鏈中一特定位置處之C-β分支鏈胺基酸可經另一C-β分支鏈胺基酸取代。C-β分支鏈胺基酸之實例包括例如I、T及V。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BoNT/A酶域。在此實施例之一態樣中，BoNT/A酶域包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之酶域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A酶域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1/2-429。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A酶域包含天然存在之BoNT/A酶域變異體，諸如BoNT/A同功異型物之酶域或BoNT/A亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A酶域包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之天然存在之BoNT/A酶域變異體，諸如BoNT/A同功異型物酶域或BoNT/A亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A酶域包含SEQ ID NO: 1之天然存在之BoNT/A酶域變異體，諸如BoNT/A同功異型物酶域或BoNT/A亞型酶域的胺基酸1/2-429。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A酶域包含非天然存在之BoNT/A酶域變異體，諸如保守BoNT/A酶域變異體、非保守BoNT/A酶域變異體、活性BoNT/A酶域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A酶域包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之非天然存在之BoNT/A酶域變異體，諸如保守BoNT/A酶域變異體、非保守BoNT/A酶域變異體、活性BoNT/A酶域片段、或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A酶域包含SEQ ID NO: 1之非天然存在之BoNT/A酶域變異體，諸如保守BoNT/A酶域變異體、非保守BoNT/A酶域變異體、活性BoNT/A酶域片段、或其任何組合的胺基酸1/2-429。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/A酶域包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A酶域包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸1/2-429之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 1之胺基酸1/2-429之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/A酶域包含相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A酶域包含相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸1/2-429，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸1/2-429，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A酶域包含相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A酶域包含相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸1/2-429，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸1/2-429，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BoNT/B酶域。在此實施例之一態樣中，BoNT/B酶域包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之酶域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B酶域包含SEQ ID NO: 6之胺基酸1/2-436。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B酶域包含天然存在之BoNT/B酶域變異體，諸如BoNT/B同功異型物之酶域或BoNT/B亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B酶域包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之天然存在之BoNT/B酶域變異體，諸如BoNT/B同功異型物酶域或BoNT/B亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B酶域包含SEQ ID NO: 6之天然存在之BoNT/B酶域變異體，諸如BoNT/B同功異型物酶域或BoNT/B亞型酶域的胺基酸1/2-436。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B酶域包含非天然存在之BoNT/B酶域變異體，諸如保守BoNT/B酶域變異體、非保守BoNT/B酶域變異體、活性BoNT/B酶域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B酶域包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之非天然存在之BoNT/B酶域變異體，諸如保守BoNT/B酶域變異體、非保守BoNT/B酶域變異體、活性BoNT/B酶域片段、或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B酶域包含SEQ ID NO: 6之非天然存在之BoNT/B酶域變異體，諸如保守BoNT/B酶域變異體、非保守BoNT/B酶域變異體、活性BoNT/B酶域片段、或其任何組合的胺基酸1/2-436。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/B酶域包含與SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B酶域包含與SEQ ID NO: 6之胺基酸1/2-436之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 6之胺基酸1/2-436之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/B酶域包含相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B酶域包含相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸1/2-436，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸1/2-436，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B酶域包含相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B酶域包含相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸1/2-436，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸1/2-436，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BoNT/C1酶域。在此實施例之一態樣中，BoNT/C1酶域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之酶域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1酶域包含SEQ ID NO: 11之胺基酸1/2-436。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1酶域包含天然存在之BoNT/C1酶域變異體，諸如BoNT/C1同功異型物之酶域或BoNT/C1亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1酶域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之天然存在之BoNT/C1酶域變異體，諸如BoNT/C1同功異型物酶域或BoNT/C1亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1酶域包含SEQ ID NO: 11之天然存在之BoNT/C1酶域變異體，諸如BoNT/C1同功異型物酶域或BoNT/C1亞型酶域的胺基酸1/2-436。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1酶域包含非天然存在之BoNT/C1酶域變異體，諸如保守BoNT/C1酶域變異體、非保守BoNT/C1酶域變異體、活性BoNT/C1酶域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1酶域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之非天然存在之BoNT/C1酶域變異體，諸如保守BoNT/C1酶域變異體、非保守BoNT/C1酶域變異體、活性BoNT/C1酶域片段、或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1酶域包含SEQ ID NO: 11之非天然存在之BoNT/C1酶域變異體，諸如保守BoNT/C1酶域變異體、非保守BoNT/C1酶域變異體、活性BoNT/C1酶域片段、或其任何組合的胺基酸1/2-436。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1酶域包含與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1酶域包含與SEQ ID NO: 11之胺基酸1/2-436之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 11之胺基酸1/2-436之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1酶域包含相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1酶域包含相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸1/2-436，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸1/2-436，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1酶域包含相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1酶域包含相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸1/2-436，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸1/2-436，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BoNT/D酶域。在此實施例之一態樣中，BoNT/D酶域包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之酶域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D酶域包含SEQ ID NO: 13之胺基酸1/2-436。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D酶域包含天然存在之BoNT/D酶域變異體，諸如BoNT/D同功異型物之酶域或BoNT/D亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D酶域包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之天然存在之BoNT/D酶域變異體，諸如BoNT/D同功異型物酶域或BoNT/D亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D酶域包含SEQ ID NO: 13之天然存在之BoNT/D酶域變異體，諸如BoNT/D同功異型物酶域或BoNT/D亞型酶域的胺基酸1/2-436。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D酶域包含非天然存在之BoNT/D酶域變異體，諸如保守BoNT/D酶域變異體、非保守BoNT/D酶域變異體、活性BoNT/D酶域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D酶域包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之非天然存在之BoNT/D酶域變異體，諸如保守BoNT/D酶域變異體、非保守BoNT/D酶域變異體、活性BoNT/D酶域片段、或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D酶域包含SEQ ID NO: 13之非天然存在之BoNT/D酶域變異體，諸如保守BoNT/D酶域變異體、非保守BoNT/D酶域變異體、活性BoNT/D酶域片段、或其任何組合的胺基酸1/2-436。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/D酶域包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D酶域包含與SEQ ID NO: 13之胺基酸1/2-436之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 13之胺基酸1/2-436之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/D酶域包含相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D酶域包含相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸1/2-436，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸1/2-436，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D酶域包含相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D酶域包含相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸1/2-436，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸1/2-436，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BoNT/E酶域。在此實施例之一態樣中，BoNT/E酶域包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之酶域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E酶域包含SEQ ID NO: 15之胺基酸1/2-411。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E酶域包含天然存在之BoNT/E酶域變異體，諸如BoNT/E同功異型物之酶域或BoNT/E亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E酶域包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之天然存在之BoNT/E酶域變異體，諸如BoNT/E同功異型物酶域或BoNT/E亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E酶域包含SEQ ID NO: 15之天然存在之BoNT/E酶域變異體，諸如BoNT/E同功異型物酶域或BoNT/E亞型酶域的胺基酸1/2-411。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E酶域包含非天然存在之BoNT/E酶域變異體，諸如保守BoNT/E酶域變異體、非保守BoNT/E酶域變異體、活性BoNT/E酶域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E酶域包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之非天然存在之BoNT/E酶域變異體，諸如保守BoNT/E酶域變異體、非保守BoNT/E酶域變異體、活性BoNT/E酶域片段、或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E酶域包含SEQ ID NO: 15之非天然存在之BoNT/E酶域變異體，諸如保守BoNT/E酶域變異體、非保守BoNT/E酶域變異體、活性BoNT/E酶域片段、或其任何組合的胺基酸1/2-411。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/E酶域包含與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E酶域包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸1/2-411之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 15之胺基酸1/2-411之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/E酶域包含相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E酶域包含相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸1/2-411，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸1/2-411，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E酶域包含相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E酶域包含相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸1/2-411，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸1/2-411，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BoNT/F酶域。在此實施例之一態樣中，BoNT/F酶域包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之酶域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F酶域包含SEQ ID NO: 18之胺基酸1/2-428。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F酶域包含天然存在之BoNT/F酶域變異體，諸如BoNT/F同功異型物之酶域或BoNT/F亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F酶域包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之天然存在之BoNT/F酶域變異體，諸如BoNT/F同功異型物酶域或BoNT/F亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F酶域包含SEQ ID NO: 18之天然存在之BoNT/F酶域變異體，諸如BoNT/F同功異型物酶域或BoNT/F亞型酶域的胺基酸1/2-428。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F酶域包含非天然存在之BoNT/F酶域變異體，諸如保守BoNT/F酶域變異體、非保守BoNT/F酶域變異體、活性BoNT/F酶域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F酶域包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之非天然存在之BoNT/F酶域變異體，諸如保守BoNT/F酶域變異體、非保守BoNT/F酶域變異體、活性BoNT/F酶域片段、或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F酶域包含SEQ ID NO: 18之非天然存在之BoNT/F酶域變異體，諸如保守BoNT/F酶域變異體、非保守BoNT/F酶域變異體、活性BoNT/F酶域片段、或其任何組合的胺基酸1/2-428。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/F酶域包含與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F酶域包含與SEQ ID NO: 18之胺基酸1/2-428之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 18之胺基酸1/2-428之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/F酶域包含相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F酶域包含相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸1/2-428，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸1/2-428，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F酶域包含相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F酶域包含相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸1/2-428，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸1/2-428，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BoNT/G酶域。在此實施例之一態樣中，BoNT/G酶域包含SEQ ID NO: 21之酶域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G酶域包含SEQ ID NO: 21之胺基酸1/2-4435。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G酶域包含天然存在之BoNT/G酶域變異體，諸如BoNT/G同功異型物之酶域或BoNT/G亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G酶域包含SEQ ID NO: 21之天然存在之BoNT/G酶域變異體，諸如BoNT/G同功異型物酶域或BoNT/G亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G酶域包含SEQ ID NO: 21之天然存在之BoNT/G酶域變異體，諸如BoNT/G同功異型物酶域或BoNT/G亞型酶域的胺基酸1/2-4435。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G酶域包含非天然存在之BoNT/G酶域變異體，諸如保守BoNT/G酶域變異體、非保守BoNT/G酶域變異體、活性BoNT/G酶域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G酶域包含SEQ ID NO: 21之非天然存在之BoNT/G酶域變異體，諸如保守BoNT/G酶域變異體、非保守BoNT/G酶域變異體、活性BoNT/G酶域片段、或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G酶域包含SEQ ID NO: 21之非天然存在之BoNT/G酶域變異體，諸如保守BoNT/G酶域變異體、非保守BoNT/G酶域變異體、活性BoNT/G酶域片段、或其任何組合的胺基酸1/2-4435。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/G酶域包含與SEQ ID NO: 21之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 21之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G酶域包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸1/2-4435之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 21之胺基酸1/2-4435之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/G酶域包含相對於SEQ ID NO: 21之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G酶域包含相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸1/2-4435，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸1/2-4435，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G酶域包含相對於SEQ ID NO: 21之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G酶域包含相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸1/2-4435，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸1/2-4435，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含TeNT酶域。在此實施例之一態樣中，TeNT酶域包含SEQ ID NO: 22之酶域。在此實施例之其他態樣中，TeNT酶域包含SEQ ID NO: 22之胺基酸1/2-438。在此實施例之另一態樣中，TeNT酶域包含天然存在之TeNT酶域變異體，諸如TeNT同功異型物之酶域或TeNT亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，TeNT酶域包含SEQ ID NO: 22之天然存在之TeNT酶域變異體，諸如TeNT同功異型物酶域或TeNT亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，TeNT酶域包含SEQ ID NO: 22之天然存在之TeNT酶域變異體，諸如TeNT同功異型物酶域或TeNT亞型酶域的胺基酸1/2-438。在此實施例之另一態樣中，TeNT酶域包含非天然存在之TeNT酶域變異體，諸如保守TeNT酶域變異體、非保守TeNT酶域變異體、活性TeNT酶域片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，TeNT酶域包含SEQ ID NO: 22之非天然存在之TeNT酶域變異體，諸如保守TeNT酶域變異體、非保守TeNT酶域變異體、活性TeNT酶域片段或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，TeNT酶域包含SEQ ID NO: 22之非天然存在之TeNT酶域變異體，諸如保守TeNT酶域變異體、非保守TeNT酶域變異體、活性TeNT酶域片段或其任何組合的胺基酸1/2-438。
在此實施例之其他態樣中，TeNT酶域包含與SEQ ID NO: 22之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 22之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT酶域包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸1/2-438之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 22之胺基酸1/2-438之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，TeNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 22之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸1/2-438，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸1/2-438，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 22之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸1/2-438，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸1/2-438，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BaNT酶域。在此實施例之一態樣中，BaNT酶域包含SEQ ID NO: 23之酶域。在此實施例之其他態樣中，BaNT酶域包含SEQ ID NO: 23之胺基酸1/2-420。在此實施例之另一態樣中，BaNT酶域包含天然存在之BaNT酶域變異體，諸如BaNT同功異型物之酶域或BaNT亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，BaNT酶域包含SEQ ID NO: 23之天然存在之BaNT酶域變異體，諸如BaNT同功異型物酶域或BaNT亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，BaNT酶域包含SEQ ID NO: 23之天然存在之BaNT酶域變異體，諸如BaNT同功異型物酶域或BaNT亞型酶域的胺基酸1/2-420。在此實施例之另一態樣中，BaNT酶域包含非天然存在之BaNT酶域變異體，諸如保守BaNT酶域變異體、非保守BaNT酶域變異體、活性BaNT酶域片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BaNT酶域包含SEQ ID NO: 23之非天然存在之BaNT酶域變異體，諸如保守BaNT酶域變異體、非保守BaNT酶域變異體、活性BaNT酶域片段或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，BaNT酶域包含SEQ ID NO: 23之非天然存在之BaNT酶域變異體，諸如保守BaNT酶域變異體、非保守BaNT酶域變異體、活性BaNT酶域片段或其任何組合的胺基酸1/2-420。
在此實施例之其他態樣中，BaNT酶域包含與SEQ ID NO: 23之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 23之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT酶域包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸1/2-420之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 23之胺基酸1/2-420之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BaNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 23之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸1/2-420，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸1/2-420，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 23之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸1/2-420，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸1/2-420，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BuNT酶域。在此實施例之一態樣中，BuNT酶域包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之酶域。在此實施例之其他態樣中，BuNT酶域包含SEQ ID NO: 24之胺基酸1/2-411。在此實施例之另一態樣中，BuNT酶域包含天然存在之BuNT酶域變異體，諸如BuNT同功異型物之酶域或BuNT亞型之酶域。在此實施例之另一態樣中，BuNT酶域包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之天然存在之BuNT酶域變異體，諸如BuNT同功異型物酶域或BuNT亞型酶域。在此實施例之另一態樣中，BuNT酶域包含SEQ ID NO: 24之天然存在之BuNT酶域變異體，諸如BuNT同功異型物酶域或BuNT亞型酶域的胺基酸1/2-411。在此實施例之另一態樣中，BuNT酶域包含非天然存在之BuNT酶域變異體，諸如保守BuNT酶域變異體、非保守BuNT酶域變異體、活性BuNT酶域片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BuNT酶域包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之非天然存在之BuNT酶域變異體，諸如保守BuNT酶域變異體、非保守BuNT酶域變異體、活性BuNT酶域片段、或其任何組合的酶域。在此實施例之另一態樣中，BuNT酶域包含SEQ ID NO: 24之非天然存在之BuNT酶域變異體，諸如保守BuNT酶域變異體、非保守BuNT酶域變異體、活性BuNT酶域片段、或其任何組合的胺基酸1/2-411。
在此實施例之其他態樣中，BuNT酶域包含與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之酶域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之酶域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT酶域包含與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸1/2-411之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸1/2-411之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BuNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸1/2-411，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸1/2-411，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之酶域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之酶域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT酶域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸1/2-411，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸1/2-411，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
「易位域」包含一部分具有易位活性之梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈。「易位」意謂促進多肽穿過囊泡膜轉運，藉此使該多肽之一部分或全部暴露於細胞質的能力。在各種肉毒桿菌神經毒素中，認為易位涉及由核內體(endosome)內之pH值下降所引起的重鏈之異位構形變化。此構形變化似乎涉及重鏈之N端半部並由重鏈之N端半部介導，且似乎導致在囊泡膜中形成孔；此變化允許蛋白水解輕鏈自核內體囊泡內移動至細胞質中。參見例如Lacy，等人，Nature Struct. Biol. 5:898-902(1998年10月)。
肉毒桿菌神經毒素重鏈之易位介導部分之胺基酸序列為熟習此項技術者所知；另外，亦已知此部分內已知成為賦予易位活性所必要之彼等胺基酸殘基。因此，一般技術者完全能夠例如採用各種破傷風梭狀芽孢桿菌(Clostridium tetanus)或肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之任一者之重鏈的天然存在之N端肽半部作為易位域，或藉由比對各種重鏈之N端半部之一級序列且基於序列之間之保守胺基酸、極性、立體性及疏水性特徵，選擇共同一級易位序列，來設計類似易位域。
本說明書之態樣部分地提供梭狀芽孢桿菌毒素易位域。如本文所用，術語「梭狀芽孢桿菌毒素易位域」係指可執行中毒過程中介導梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈易位之易位步驟的任何梭狀芽孢桿菌毒素多肽。因此，梭狀芽孢桿菌毒素易位域促進梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈跨膜移動且涵蓋梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈穿過細胞內囊泡之膜，移動至細胞之細胞質中。梭狀芽孢桿菌毒素易位域之非限制性實例包括例如BoNT/A易位域、BoNT/B易位域、BoNT/C1易位域、BoNT/D易位域、BoNT/E易位域、BoNT/F易位域、BoNT/G易位域、TeNT易位域、BaNT易位域及BuNT易位域。
梭狀芽孢桿菌毒素易位域包括但不限於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素易位域同功異型物及梭狀芽孢桿菌毒素易位域亞型；非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體，諸如保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體、其活性梭狀芽孢桿菌毒素易位域片段或其任何組合。
如本文所用，術語「梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體」，無論天然存在或非天然存在，皆係指相較於揭示之參考序列之相應區域(表1)，具有至少一個胺基酸變化且可用與彼參考序列之相應區域之一致性百分比來描述的梭狀芽孢桿菌毒素易位域。除非明確指示，否則適用於實施所揭示之實施例之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體為執行中毒過程之介導梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈易位之易位步驟的變異體。作為非限制性實例，相較於SEQ ID NO: 1之胺基酸455-873，BoNT/A易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 6之胺基酸447-860，BoNT/B易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 11之胺基酸454-868，BoNT/C1易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 13之胺基酸451-864，BoNT/D易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 15之胺基酸427-847，BoNT/E易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 18之胺基酸446-865，BoNT/F易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 21之胺基酸451-865，BoNT/G易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 22之胺基酸468-881，TeNT易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 23之胺基酸436-857，BaNT易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；及相較於SEQ ID NO: 24之胺基酸427-847，BuNT易位域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加。
熟習此項技術者認識到在各血清型之梭狀芽孢桿菌毒素內，可存在胺基酸序列以及編碼此等蛋白質之核酸略有不同之天然存在的梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體。舉例而言，目前存在5種BoNT/A亞型，即BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4及BoNT/A5，其中當相較於SEQ ID NO: 1之BoNT/A易位域亞型時，特定易位域亞型顯示約85-87%胺基酸一致性。如本文所用，術語「天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體」係指藉由天然存在之過程所產生之任何梭狀芽孢桿菌毒素易位域，包括但不限於自經替代性拼接之轉錄物產生之梭狀芽孢桿菌毒素易位域同功異型物、藉由自發突變產生之梭狀芽孢桿菌毒素易位域同功異型物、及梭狀芽孢桿菌毒素易位域亞型。天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體可以與該天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域。
天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體之一非限制性實例為梭狀芽孢桿菌毒素易位域同功異型物，諸如BoNT/A易位域同功異型物、BoNT/B易位域同功異型物、BoNT/C1易位域同功異型物、BoNT/D易位域同功異型物、BoNT/E易位域同功異型物、BoNT/F易位域同功異型物、BoNT/G易位域同功異型物、TeNT易位域同功異型物、BaNT易位域同功異型物及BuNT易位域同功異型物。天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體之另一非限制性實例為梭狀芽孢桿菌毒素易位域亞型，諸如來自亞型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4及BoNT/A5之易位域；來自亞型BoNT/B1、BoNT/B2、二價BoNT/B及非蛋白水解性BoNT/B之易位域；來自亞型BoNT/C1-1及BoNT/C1-2之易位域；來自亞型BoNT/E1、BoNT/E2及BoNT/E3之易位域；來自亞型BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3之易位域；及來自亞型BuNT-1及BuNT-2之易位域。
如本文所用，術語「非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體」係指藉助於人類操作所產生之任何梭狀芽孢桿菌毒素易位域，包括但不限於藉由使用隨機突變誘發或合理設計進行遺傳工程改造產生之梭狀芽孢桿菌毒素易位域及藉由化學合成產生之梭狀芽孢桿菌毒素易位域。非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體之非限制性實例包括例如保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體、及活性梭狀芽孢桿菌毒素易位域片段。
如本文所用，術語「保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體」係指具有至少一個胺基酸經具有至少一種與參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域序列(表1)之原始胺基酸類似之性質的另一胺基酸或胺基酸類似物取代的梭狀芽孢桿菌毒素易位域。性質之實例包括但不限於類似尺寸、構形、電荷、疏水性、親水性、親脂性、共價鍵結能力、氫鍵結能力、物理化學性質或其類似性質、或其任何組合。保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體可以與該保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域。保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體之非限制性實例包括例如保守BoNT/A易位域變異體、保守BoNT/B易位域變異體、保守BoNT/C1易位域變異體、保守BoNT/D易位域變異體、保守BoNT/E易位域變異體、保守BoNT/F易位域變異體、保守BoNT/G易位域變異體、保守TeNT易位域變異體、保守BaNT易位域變異體及保守BuNT易位域變異體。
如本文所用，術語「非保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體」係指以下梭狀芽孢桿菌毒素易位域：其中1)至少一個胺基酸自該非保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域缺失；2)至少一個胺基酸添加至該非保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域中；或3)至少一個胺基酸經不共有與參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域序列(表1)之原始胺基酸之性質類似的任何性質之另一胺基酸或胺基酸類似物取代。非保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體可以與該非保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素易位域。非保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體之非限制性實例包括例如非保守BoNT/A易位域變異體、非保守BoNT/B易位域變異體、非保守BoNT/C1易位域變異體、非保守BoNT/D易位域變異體、非保守BoNT/E易位域變異體、非保守BoNT/F易位域變異體、非保守BoNT/G易位域變異體、及非保守TeNT易位域變異體、非保守BaNT易位域變異體及非保守BuNT易位域變異體。
如本文所用，術語「活性梭狀芽孢桿菌毒素易位域片段」係指可適用於本說明書之態樣中之包含易位域的多種梭狀芽孢桿菌毒素片段之任一者，其限制條件為此等活性片段可促進LC自細胞內囊泡釋放至目標細胞之細胞質中且因此參與執行梭狀芽孢桿菌毒素藉以使受質蛋白水解裂解的總體細胞機制。梭狀芽孢桿菌毒素之重鏈之易位域的長度為約410-430個胺基酸且其包含易位域(表1)。研究已顯示梭狀芽孢桿菌毒素重鏈之完整長度之易位域並不為易位域之易位活性所必需。因此，此實施例之態樣包括長度為例如至少350、375、400或425個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素易位域。此實施例之其他態樣包括長度為例如至多350、375、400或425個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素易位域。
多種序列比對方法之任一者可用於確定天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體及非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體之一致性百分比，該等方法包括但不限於整體法、局部法及混合法，諸如區段接近法。確定一致性百分比之方案為在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
因此，在一實施例中，本說明書中揭示之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素包含梭狀芽孢桿菌毒素易位域。在此實施例之一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素易位域同功異型物或梭狀芽孢桿菌毒素易位域亞型。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體，諸如保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素易位域變異體、活性梭狀芽孢桿菌毒素易位域片段或其任何組合。
在另一實施例中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之疏水性胺基酸可經另一疏水性胺基酸取代。疏水性胺基酸之實例包括例如C、F、I、L、M、V及W。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之脂族胺基酸可經另一脂族胺基酸取代。脂族胺基酸之實例包括例如A、I、L、P及V。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之芳族胺基酸可經另一芳族胺基酸取代。芳族胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之堆疊胺基酸可經另一堆疊胺基酸取代。堆疊胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之極性胺基酸可經另一極性胺基酸取代。極性胺基酸之實例包括例如D、E、K、N、Q及R。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之極性較小或中性胺基酸可經另一極性較小或中性胺基酸取代。極性較小或中性胺基酸之實例包括例如A、H、G、P、S、T及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之帶正電荷胺基酸可經另一帶正電荷胺基酸取代。帶正電荷胺基酸之實例包括例如K、R及H。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之帶負電荷胺基酸可經另一帶負電荷胺基酸取代。帶負電荷胺基酸之實例包括例如D及E。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之較小胺基酸可經另一較小胺基酸取代。較小胺基酸之實例包括例如A、D、G、N、P、S及T。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素易位域之多肽鏈中一特定位置處之C-β分支鏈胺基酸可經另一C-β分支鏈胺基酸取代。C-β分支鏈胺基酸之實例包括例如I、T及V。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BoNT/A易位域。在此實施例之一態樣中，BoNT/A易位域包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之易位域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A易位域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸455-873。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A易位域包含天然存在之BoNT/A易位域變異體，諸如BoNT/A同功異型物之易位域或BoNT/A亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A易位域包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之天然存在之BoNT/A易位域變異體，諸如BoNT/A同功異型物易位域或BoNT/A亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A易位域包含SEQ ID NO: 1之天然存在之BoNT/A易位域變異體，諸如BoNT/A同功異型物易位域或BoNT/A亞型易位域的胺基酸455-873。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A易位域包含非天然存在之BoNT/A易位域變異體，諸如保守BoNT/A易位域變異體、非保守BoNT/A易位域變異體、活性BoNT/A易位域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A易位域包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之非天然存在之BoNT/A易位域變異體，諸如保守BoNT/A易位域變異體、非保守BoNT/A易位域變異體、活性BoNT/A易位域片段、或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A易位域包含SEQ ID NO: 1之非天然存在之BoNT/A易位域變異體，諸如保守BoNT/A易位域變異體、非保守BoNT/A易位域變異體、活性BoNT/A易位域片段、或其任何組合的胺基酸455-873。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/A易位域包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A易位域包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸455-873之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 1之胺基酸455-873之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/A易位域包含相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A易位域包含相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸455-873，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸455-873，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A易位域包含相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A易位域包含相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸455-873，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸455-873，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BoNT/B易位域。在此實施例之一態樣中，BoNT/B易位域包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之易位域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B易位域包含SEQ ID NO: 6之胺基酸447-860。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B易位域包含天然存在之BoNT/B易位域變異體，諸如BoNT/B同功異型物之易位域或BoNT/B亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B易位域包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之天然存在之BoNT/B易位域變異體，諸如BoNT/B同功異型物易位域或BoNT/B亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B易位域包含SEQ ID NO: 6之天然存在之BoNT/B易位域變異體，諸如BoNT/B同功異型物易位域或BoNT/B亞型易位域的胺基酸447-860。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B易位域包含非天然存在之BoNT/B易位域變異體，諸如保守BoNT/B易位域變異體、非保守BoNT/B易位域變異體、活性BoNT/B易位域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B易位域包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之非天然存在之BoNT/B易位域變異體，諸如保守BoNT/B易位域變異體、非保守BoNT/B易位域變異體、活性BoNT/B易位域片段、或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B易位域包含SEQ ID NO: 6之非天然存在之BoNT/B易位域變異體，諸如保守BoNT/B易位域變異體、非保守BoNT/B易位域變異體、活性BoNT/B易位域片段、或其任何組合的胺基酸447-860。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/B易位域包含與SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B易位域包含與SEQ ID NO: 6之胺基酸447-860之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 6之胺基酸447-860之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/B易位域包含相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B易位域包含相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸447-860，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸447-860，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B易位域包含相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B易位域包含相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸447-860，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸447-860，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BoNT/Cl易位域。在此實施例之一態樣中，BoNT/C1易位域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之易位域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/Cl易位域包含SEQ ID NO: 11之胺基酸454-868。在此實施例之另一態樣中，BoNT/Cl易位域包含天然存在之BoNT/C1易位域變異體，諸如BoNT/C1同功異型物之易位域或BoNT/C1亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1易位域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之天然存在之BoNT/C1易位域變異體，諸如BoNT/C1同功異型物易位域或BoNT/C1亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1易位域包含SEQ ID NO: 11之天然存在之BoNT/C1易位域變異體，諸如BoNT/C1同功異型物易位域或BoNT/C1亞型易位域的胺基酸454-868。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1易位域包含非天然存在之BoNT/C1易位域變異體，諸如保守BoNT/C1易位域變異體、非保守BoNT/C1易位域變異體、活性BoNT/C1易位域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1易位域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之非天然存在之BoNT/C1易位域變異體，諸如保守BoNT/C1易位域變異體、非保守BoNT/C1易位域變異體、活性BoNT/C1易位域片段、或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1易位域包含SEQ ID NO: 11之非天然存在之BoNT/C1易位域變異體，諸如保守BoNT/C1易位域變異體、非保守BoNT/C1易位域變異體、活性BoNT/C1易位域片段、或其任何組合的胺基酸454-868。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1易位域包含與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1易位域包含與SEQ ID NO: 11之胺基酸454-868之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 11之胺基酸454-868之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1易位域包含相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1易位域包含相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸454-868，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸454-868，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1易位域包含相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1易位域包含相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸454-868，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸454-868，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BoNT/D易位域。在此實施例之一態樣中，BoNT/D易位域包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之易位域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D易位域包含SEQ ID NO: 13之胺基酸451-864。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D易位域包含天然存在之BoNT/D易位域變異體，諸如BoNT/D同功異型物之易位域或BoNT/D亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D易位域包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之天然存在之BoNT/D易位域變異體，諸如BoNT/D同功異型物易位域或BoNT/D亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D易位域包含SEQ ID NO: 13之天然存在之BoNT/D易位域變異體，諸如BoNT/D同功異型物易位域或BoNT/D亞型易位域的胺基酸451-864。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D易位域包含非天然存在之BoNT/D易位域變異體，諸如保守BoNT/D易位域變異體、非保守BoNT/D易位域變異體、活性BoNT/D易位域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D易位域包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之非天然存在之BoNT/D易位域變異體，諸如保守BoNT/D易位域變異體、非保守BoNT/D易位域變異體、活性BoNT/D易位域片段、或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D易位域包含SEQ ID NO: 13之非天然存在之BoNT/D易位域變異體，諸如保守BoNT/D易位域變異體、非保守BoNT/D易位域變異體、活性BoNT/D易位域片段、或其任何組合的胺基酸451-864。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/D易位域包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D易位域包含與SEQ ID NO: 13之胺基酸451-864之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 13之胺基酸451-864之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/D易位域包含相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D易位域包含相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸451-864，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸451-864，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D易位域包含相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D易位域包含相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸451-864，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸451-864，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BoNT/E易位域。在此實施例之一態樣中，BoNT/E易位域包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之易位域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E易位域包含SEQ ID NO: 15之胺基酸427-847。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E易位域包含天然存在之BoNT/E易位域變異體，諸如BoNT/E同功異型物之易位域或BoNT/E亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E易位域包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之天然存在之BoNT/E易位域變異體，諸如BoNT/E同功異型物易位域或BoNT/E亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E易位域包含SEQ ID NO: 15之天然存在之BoNT/E易位域變異體，諸如BoNT/E同功異型物易位域或BoNT/E亞型易位域的胺基酸427-847。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E易位域包含非天然存在之BoNT/E易位域變異體，諸如保守BoNT/E易位域變異體、非保守BoNT/E易位域變異體、活性BoNT/E易位域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E易位域包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之非天然存在之BoNT/E易位域變異體，諸如保守BoNT/E易位域變異體、非保守BoNT/E易位域變異體、活性BoNT/E易位域片段、或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E易位域包含SEQ ID NO: 15之非天然存在之BoNT/E易位域變異體，諸如保守BoNT/E易位域變異體、非保守BoNT/E易位域變異體、活性BoNT/E易位域片段、或其任何組合的胺基酸427-847。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/E易位域包含與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E易位域包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸427-847之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 15之胺基酸427-847之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/E易位域包含相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E易位域包含相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸427-847，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸427-847，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E易位域包含相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E易位域包含相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸427-847，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸427-847，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BoNT/F易位域。在此實施例之一態樣中，BoNT/F易位域包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之易位域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F易位域包含SEQ ID NO: 18之胺基酸446-865。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F易位域包含天然存在之BoNT/F易位域變異體，諸如BoNT/F同功異型物之易位域或BoNT/F亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F易位域包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之天然存在之BoNT/F易位域變異體，諸如BoNT/F同功異型物易位域或BoNT/F亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F易位域包含SEQ ID NO: 18之天然存在之BoNT/F易位域變異體，諸如BoNT/F同功異型物易位域或BoNT/F亞型易位域的胺基酸446-865。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F易位域包含非天然存在之BoNT/F易位域變異體，諸如保守BoNT/F易位域變異體、非保守BoNT/F易位域變異體、活性BoNT/F易位域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F易位域包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之非天然存在之BoNT/F易位域變異體，諸如保守BoNT/F易位域變異體、非保守BoNT/F易位域變異體、活性BoNT/F易位域片段、或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F易位域包含SEQ ID NO: 18之非天然存在之BoNT/F易位域變異體，諸如保守BoNT/F易位域變異體、非保守BoNT/F易位域變異體、活性BoNT/F易位域片段、或其任何組合的胺基酸446-865。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/F易位域包含與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F易位域包含與SEQ ID NO: 18之胺基酸446-865之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 18之胺基酸446-865之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/F易位域包含相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F易位域包含相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸446-865，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸446-865，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F易位域包含相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F易位域包含相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸446-865，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸446-865，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BoNT/G易位域。在此實施例之一態樣中，BoNT/G易位域包含SEQ ID NO: 21之易位域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G易位域包含SEQ ID NO: 21之胺基酸451-865。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G易位域包含天然存在之BoNT/G易位域變異體，諸如BoNT/G同功異型物之易位域或BoNT/G亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G易位域包含SEQ ID NO: 21之天然存在之BoNT/G易位域變異體，諸如BoNT/G同功異型物易位域或BoNT/G亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G易位域包含SEQ ID NO: 21之天然存在之BoNT/G易位域變異體，諸如BoNT/G同功異型物易位域或BoNT/G亞型易位域的胺基酸451-865。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G易位域包含非天然存在之BoNT/G易位域變異體，諸如保守BoNT/G易位域變異體、非保守BoNT/G易位域變異體、活性BoNT/G易位域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G易位域包含SEQ ID NO: 21之非天然存在之BoNT/G易位域變異體，諸如保守BoNT/G易位域變異體、非保守BoNT/G易位域變異體、活性BoNT/G易位域片段、或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G易位域包含SEQ ID NO: 21之非天然存在之BoNT/G易位域變異體，諸如保守BoNT/G易位域變異體、非保守BoNT/G易位域變異體、活性BoNT/G易位域片段、或其任何組合的胺基酸451-865。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/G易位域包含與SEQ ID NO: 21之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 21之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G易位域包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸451-865之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 21之胺基酸451-865之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/G易位域包含相對於SEQ ID NO: 21之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G易位域包含相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸451-865，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸451-865，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G易位域包含相對於SEQ ID NO: 21之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G易位域包含相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸451-865，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸451-865，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含TeNT易位域。在此實施例之一態樣中，TeNT易位域包含SEQ ID NO: 22之易位域。在此實施例之其他態樣中，TeNT易位域包含SEQ ID NO: 22之胺基酸468-881。在此實施例之另一態樣中，TeNT易位域包含天然存在之TeNT易位域變異體，諸如TeNT同功異型物之易位域或TeNT亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，TeNT易位域包含SEQ ID NO: 22之天然存在之TeNT易位域變異體，諸如TeNT同功異型物易位域或TeNT亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，TeNT易位域包含SEQ ID NO: 22之天然存在之TeNT易位域變異體，諸如TeNT同功異型物易位域或TeNT亞型易位域的胺基酸468-881。在此實施例之另一態樣中，TeNT易位域包含非天然存在之TeNT易位域變異體，諸如保守TeNT易位域變異體、非保守TeNT易位域變異體、活性TeNT易位域片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，TeNT易位域包含SEQ ID NO: 22之非天然存在之TeNT易位域變異體，諸如保守TeNT易位域變異體、非保守TeNT易位域變異體、活性TeNT易位域片段或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，TeNT易位域包含SEQ ID NO: 22之非天然存在之TeNT易位域變異體，諸如保守TeNT易位域變異體、非保守TeNT易位域變異體、活性TeNT易位域片段或其任何組合的胺基酸468-881。
在此實施例之其他態樣中，TeNT易位域包含與SEQ ID NO: 22之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 22之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT易位域包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸468-881之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 22之胺基酸468-881之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，TeNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 22之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸468-881，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸468-881，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 22之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸468-881，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸468-881，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BaNT易位域。在此實施例之一態樣中，BaNT易位域包含SEQ ID NO: 23之易位域。在此實施例之其他態樣中，BaNT易位域包含SEQ ID NO: 23之胺基酸436-857。在此實施例之另一態樣中，BaNT易位域包含天然存在之BaNT易位域變異體，諸如BaNT同功異型物之易位域或BaNT亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，BaNT易位域包含SEQ ID NO: 23之天然存在之BaNT易位域變異體，諸如BaNT同功異型物易位域或BaNT亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，BaNT易位域包含SEQ ID NO: 23之天然存在之BaNT易位域變異體，諸如BaNT同功異型物易位域或BaNT亞型易位域的胺基酸436-857。在此實施例之另一態樣中，BaNT易位域包含非天然存在之BaNT易位域變異體，諸如保守BaNT易位域變異體、非保守BaNT易位域變異體、活性BaNT易位域片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BaNT易位域包含SEQ ID NO: 23之非天然存在之BaNT易位域變異體，諸如保守BaNT易位域變異體、非保守BaNT易位域變異體、活性BaNT易位域片段或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，BaNT易位域包含SEQ ID NO: 23之非天然存在之BaNT易位域變異體，諸如保守BaNT易位域變異體、非保守BaNT易位域變異體、活性BaNT易位域片段或其任何組合的胺基酸436-857。
在此實施例之其他態樣中，BaNT易位域包含與SEQ ID NO: 23之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 23之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT易位域包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸436-857之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 23之胺基酸436-857之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BaNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 23之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸436-857，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸436-857，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 23之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸436-857，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸436-857，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BuNT易位域。在此實施例之一態樣中，BuNT易位域包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之易位域。在此實施例之其他態樣中，BuNT易位域包含SEQ ID NO: 24之胺基酸427-847。在此實施例之另一態樣中，BuNT易位域包含天然存在之BuNT易位域變異體，諸如BuNT同功異型物之易位域或BuNT亞型之易位域。在此實施例之另一態樣中，BuNT易位域包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之天然存在之BuNT易位域變異體，諸如BuNT同功異型物易位域或BuNT亞型易位域。在此實施例之另一態樣中，BuNT易位域包含SEQ ID NO: 24之天然存在之BuNT易位域變異體，諸如BuNT同功異型物易位域或BuNT亞型易位域的胺基酸427-847。在此實施例之另一態樣中，BuNT易位域包含非天然存在之BuNT易位域變異體，諸如保守BuNT易位域變異體、非保守BuNT易位域變異體、活性BuNT易位域片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BuNT易位域包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之非天然存在之BuNT易位域變異體，諸如保守BuNT易位域變異體、非保守BuNT易位域變異體、活性BuNT易位域片段、或其任何組合的易位域。在此實施例之另一態樣中，BuNT易位域包含SEQ ID NO: 24之非天然存在之BuNT易位域變異體，諸如保守BuNT易位域變異體、非保守BuNT易位域變異體、活性BuNT易位域片段、或其任何組合的胺基酸427-847。
在此實施例之其他態樣中，BuNT易位域包含與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之易位域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之易位域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT易位域包含與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸427-847之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸427-847之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BuNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸427-847，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸427-847，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之易位域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之易位域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT易位域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸427-847，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸427-847，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
本說明書之態樣部分地提供結合域。如本文所用，術語「結合域」與「配位體」或「靶向部分」同義且係指在生理條件下可優先與存在於細胞表面上之另一分子相互作用的任何分子。細胞表面分子可包含多肽、多醣、脂質，或可具有此等物質中一者以上的結構特徵。如本文所用，術語「優先相互作用」係指分子能夠在生理條件或實質上近似生理條件之活體外條件下，以相對於其他非目標受體統計學上顯著較大的程度結合其目標受體。關於本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素結合域，梭狀芽孢桿菌毒素結合域與其同源受體之結合相對於其與其他受體之結合有差別。關於本說明書中揭示之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域與其同源受體之結合相對於其與其他受體之結合有差別。
因此，在一實施例中，選擇性結合目標受體之結合域對目標受體之解離平衡常數(KD)相對於其對非目標受體之解離平衡常數大例如至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍、至少10,000倍或至少100,000倍。
本說明書之態樣部分地提供梭狀芽孢桿菌毒素結合域。如本文所用，術語「梭狀芽孢桿菌毒素結合域」係指可執行中毒過程之結合步驟之任何梭狀芽孢桿菌毒素多肽，該結合步驟起始本說明書中揭示之經修飾梭狀芽孢桿菌毒素藉以使目標細胞中毒的總體內化機制。梭狀芽孢桿菌毒素結合域之非限制性實例包括例如BoNT/A結合域、BoNT/B結合域、BoNT/C1結合域、BoNT/D結合域、BoNT/E結合域、BoNT/F結合域、BoNT/G結合域、TeNT結合域、BaNT結合域及BuNT結合域。梭狀芽孢桿菌毒素結合域之其他非限制性實例包括例如SEQ ID NO: 1之胺基酸874-1296、SEQ ID NO: 2之胺基酸861-1291、SEQ ID NO: 3之胺基酸869-1291、SEQ ID NO: 4之胺基酸865-1291、SEQ ID NO: 5之胺基酸848-1252、SEQ ID NO: 6之胺基酸866-1274、SEQ ID NO: 7之胺基酸866-1297、SEQ ID NO: 8之胺基酸882-1315、SEQ ID NO: 9之胺基酸858-1268、及SEQ ID NO: 10之胺基酸848-1251。
梭狀芽孢桿菌毒素結合域包括但不限於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物及梭狀芽孢桿菌毒素結合域亞型；非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體，諸如保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、其活性梭狀芽孢桿菌毒素結合域片段，或其任何組合。
如本文所用，術語「梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」，無論天然存在或非天然存在，皆係指相較於揭示之參考序列之相應區域(表1)，具有至少一個胺基酸變化且可用與彼參考序列之相應區域之一致性百分比來描述的梭狀芽孢桿菌毒素結合域。除非明確指示，否則適用於實施揭示之實施例之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體為執行中毒過程之介導梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈易位之易位步驟的變異體。作為非限制性實例，相較於SEQ ID NO: 1之胺基酸874-1296，BoNT/A結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 6之胺基酸861-1291，BoNT/B結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 11之胺基酸869-1291，Bo NT/Cl結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 13之胺基酸865-1291，BoNT/D結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 15之胺基酸848-1252，BoNT/E結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO:18之胺基酸866-1274，BoNT/F結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 21之胺基酸866-1297，BoNT/G結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 22之胺基酸882-1315，TeNT結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；相較於SEQ ID NO: 23之胺基酸858-1268，BaNT結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加；及相較於SEQ ID NO: 24之胺基酸848-1251，BuNT結合域變異體將具有至少一個胺基酸差異，諸如胺基酸取代、缺失或添加。
熟習此項技術者認識到在各血清型之梭狀芽孢桿菌毒素內，可存在胺基酸序列以及編碼此等蛋白質之核酸略有不同之天然存在的梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體。舉例而言，目前存在5種BoNT/A亞型，即BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4及BoNT/A5，其中當相較於SEQ ID NO: 1之BoNT/A結合域亞型時，特定結合域亞型顯示約83-97%胺基酸一致性。作為另一實例，目前存在5種BoNT/A亞型，即BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4及BoNT/A5，其中當相較於SEQ ID NO: 1之另一BoNT/A結合域亞型時，特定結合域亞型顯示約83-97%胺基酸一致性。如本文所用，術語「天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」係指藉由天然存在之過程所產生之任何梭狀芽孢桿菌毒素結合域，包括但不限於自經替代性拼接之轉錄物產生之梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物、藉由自發突變產生之梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物、及梭狀芽孢桿菌毒素結合域亞型。天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體可以與該天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域。
天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之一非限制性實例為梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物，諸如BoNT/A結合域同功異型物、BoNT/B結合域同功異型物、BoNT/Cl結合域同功異型物、BoNT/D結合域同功異型物、BoNT/E結合域同功異型物、BoNT/F結合域同功異型物、BoNT/G結合域同功異型物、TeNT結合域同功異型物、BaNT結合域同功異型物及BuNT結合域同功異型物。天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之另一非限制性實例為梭狀芽孢桿菌毒素結合域亞型，諸如來自亞型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4及BoNT/A5之結合域；來自亞型BoNT/B1、BoNT/B2、二價BoNT/B及非蛋白水解性BoNT/B之結合域；來自亞型BoNT/C1-1及BoNT/C1-2之結合域；來自亞型BoNT/E1、BoNT/E2及BoNT/E3之結合域；及來自亞型BoNT/F1、BoNT/F2及BoNT/F3之結合域；及來自亞型BuNT1及BuNT-2之結合域。
如本文所用，術語「非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」係指藉助於人類操作所產生之任何梭狀芽孢桿菌毒素結合域，包括但不限於藉由使用隨機突變誘發或合理設計進行遺傳工程改造產生之梭狀芽孢桿菌毒素結合域及藉由化學合成產生之梭狀芽孢桿菌毒素結合域。非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之非限制性實例包括例如保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、梭狀芽孢桿菌毒素結合域嵌合變異體及活性梭狀芽孢桿菌毒素結合域片段。
如本文所用，術語「保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」係指至少一個胺基酸經具有至少一種與參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域序列(表1)之原始胺基酸類似之性質的另一胺基酸或胺基酸類似物取代的梭狀芽孢桿菌毒素結合域。性質之實例包括但不限於類似尺寸、構形、電荷、疏水性、、親水性、親脂性、共價鍵結能力、氫鍵結能力、物理化學性質或其類似性質、或其任何組合。保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體可以與該保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域。保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之非限制性實例包括例如保守BoNT/A結合域變異體、保守BoNT/B結合域變異體、保守BoNT/C1結合域變異體、保守BoNT/D結合域變異體、保守BoNT/E結合域變異體、保守BoNT/F結合域變異體、保守BoNT/G結合域變異體、保守TeNT結合域變異體、保守BaNT結合域變異體及保守BuNT結合域變異體。
如本文所用，術語「非保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」係指以下梭狀芽孢桿菌毒素結合域：其中1)至少一個胺基酸自該非保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域缺失；2)至少一個胺基酸添加至該非保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域中；或3)至少一個胺基酸經不共有與參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域序列(表1)之原始胺基酸之性質類似的任何性質之另一胺基酸或胺基酸類似物取代。非保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體可以與該非保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體所基於之參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考梭狀芽孢桿菌毒素結合域。非保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之非限制性實例包括例如非保守BoNT/A結合域變異體、非保守BoNT/B結合域變異體、非保守BoNT/C1結合域變異體、非保守BoNT/D結合域變異體、非保守BoNT/E結合域變異體、非保守BoNT/F結合域變異體、非保守BoNT/G結合域變異體、及非保守TeNT結合域變異體、非保守BaNT結合域變異體及非保守BuNT結合域變異體。
如本文所用，術語「活性梭狀芽孢桿菌毒素結合域片段」係指可適用於本說明書之態樣中之包含結合域的多種梭狀芽孢桿菌毒素片段之任一者，其限制條件為此等活性片段可促進LC自細胞內囊泡釋放至目標細胞之細胞質中且因此參與執行梭狀芽孢桿菌毒素藉以使受質蛋白水解裂解的總體細胞機制。梭狀芽孢桿菌毒素之重鏈之結合域的長度為約400-440個胺基酸且其包含結合域(表1)。研究已顯示梭狀芽孢桿菌毒素重鏈之完整長度之結合域並不為結合域之易位活性所必需。因此，此實施例之態樣包括長度為例如至少350、375、400或425個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素結合域。此實施例之其他態樣包括長度為例如至多350、375、400或425個胺基酸之梭狀芽孢桿菌毒素結合域。
多種序列比對方法之任一者可用於確定天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體及非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之一致性百分比，該等方法包括但不限於整體法、局部法及混合法，諸如區段接近法。確定一致性百分比之方案為在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
因此，在一實施例中，本說明書中揭示之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素包含梭狀芽孢桿菌毒素結合域。在此實施例之一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物或梭狀芽孢桿菌毒素結合域亞型。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體，諸如保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、非保守梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、活性梭狀芽孢桿菌毒素結合域片段或其任何組合。
在另一實施例中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之疏水性胺基酸可經另一疏水性胺基酸取代。疏水性胺基酸之實例包括例如C、F、I、L、M、V及W。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之脂族胺基酸可經另一脂族胺基酸取代。脂族胺基酸之實例包括例如A、I、L、P及V。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之芳族胺基酸可經另一芳族胺基酸取代。芳族胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之堆疊胺基酸可經另一堆疊胺基酸取代。堆疊胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之極性胺基酸可經另一極性胺基酸取代。極性胺基酸之實例包括例如D、E、K、N、Q及R。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之極性較小或中性胺基酸可經另一極性較小或中性胺基酸取代。極性較小或中性胺基酸之實例包括例如A、H、G、P、S、T及Y。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之帶正電荷胺基酸可經另一帶正電荷胺基酸取代。帶正電荷胺基酸之實例包括例如K、R及H。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之帶負電荷胺基酸可經另一帶負電荷胺基酸取代。帶負電荷胺基酸之實例包括例如D及E。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之較小胺基酸可經另一較小胺基酸取代。較小胺基酸之實例包括例如A、D、G、N、P、S及T。在此實施例之另一態樣中，在梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之C-β分支鏈胺基酸可經另一C-β分支鏈胺基酸取代。C-β分支鏈胺基酸之實例包括例如I、T及V。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含BoNT/A結合域。在此實施例之一態樣中，BoNT/A結合域包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之結合域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A結合域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸874-1296。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A結合域包含天然存在之BoNT/A結合域變異體，諸如BoNT/A同功異型物之結合域或BoNT/A亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A結合域包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之天然存在之BoNT/A結合域變異體，諸如BoNT/A同功異型物結合域或BoNT/A亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A結合域包含SEQ ID NO: 1之天然存在之BoNT/A結合域變異體，諸如BoNT/A同功異型物結合域或BoNT/A亞型結合域的胺基酸874-1296。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A結合域包含非天然存在之BoNT/A結合域變異體，諸如保守BoNT/A結合域變異體、非保守BoNT/A結合域變異體、活性BoNT/A結合域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A結合域包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之非天然存在之BoNT/A結合域變異體，諸如保守BoNT/A結合域變異體、非保守BoNT/A結合域變異體、活性BoNT/A結合域片段、或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/A結合域包含SEQ ID NO: 1之非天然存在之BoNT/A結合域變異體，諸如保守BoNT/A結合域變異體、非保守BoNT/A結合域變異體、活性BoNT/A結合域片段、或其任何組合的胺基酸874-1296。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/A結合域包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A結合域包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸874-1296之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 1之胺基酸874-1296之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/A結合域包含相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A結合域包含相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸874-1296，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸874-1296，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A結合域包含相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/A結合域包含相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸874-1296，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 1之胺基酸874-1296，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含BoNT/B結合域。在此實施例之一態樣中，BoNT/B結合域包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之結合域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B結合域包含SEQ ID NO: 6之胺基酸861-1291。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B結合域包含天然存在之BoNT/B結合域變異體，諸如BoNT/B同功異型物之結合域或BoNT/B亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B結合域包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之天然存在之BoNT/B結合域變異體，諸如BoNT/B同功異型物結合域或BoNT/B亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B結合域包含SEQ ID NO: 6之天然存在之BoNT/B結合域變異體，諸如BoNT/B同功異型物結合域或BoNT/B亞型結合域的胺基酸861-1291。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B結合域包含非天然存在之BoNT/B結合域變異體，諸如保守BoNT/B結合域變異體、非保守BoNT/B結合域變異體、活性BoNT/B結合域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B結合域包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之非天然存在之BoNT/B結合域變異體，諸如保守BoNT/B結合域變異體、非保守BoNT/B結合域變異體、活性BoNT/B結合域片段、或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/B結合域包含SEQ ID NO: 6之非天然存在之BoNT/B結合域變異體，諸如保守BoNT/B結合域變異體、非保守BoNT/B結合域變異體、活性BoNT/B結合域片段、或其任何組合的胺基酸861-1291。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/B結合域包含與SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B結合域包含與SEQ ID NO: 6之胺基酸861-1291之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 6之胺基酸861-1291之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/B結合域包含相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ IDNO: 9或SEQ ID NO: 10之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B結合域包含相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸861-1291，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸861-1291，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B結合域包含相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/B結合域包含相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸861-1291，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 6之胺基酸861-1291，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含BoNT/C1結合域。在此實施例之一態樣中，BoNT/C1結合域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之結合域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1結合域包含SEQ ID NO: 11之胺基酸869-1291。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1結合域包含天然存在之BoNT/C1結合域變異體，諸如BoNT/C1同功異型物之結合域或BoNT/C1亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1結合域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之天然存在之BoNT/C1結合域變異體，諸如BoNT/C1同功異型物結合域或BoNT/C1亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1結合域包含SEQ ID NO: 11之天然存在之BoNT/C1結合域變異體，諸如BoNT/C1同功異型物結合域或BoNT/C1亞型結合域的胺基酸869-1291。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1結合域包含非天然存在之BoNT/C1結合域變異體，諸如保守BoNT/C1結合域變異體、非保守BoNT/C1結合域變異體、活性BoNT/C1結合域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1結合域包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之非天然存在之BoNT/C1結合域變異體，諸如保守BoNT/C1結合域變異體、非保守BoNT/C1結合域變異體、活性BoNT/C1結合域片段、或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/C1結合域包含SEQ IDNO: 11之非天然存在之BoNT/C1結合域變異體，諸如保守BoNT/C1結合域變異體、非保守BoNT/C1結合域變異體、活性BoNT/C1結合域片段、或其任何組合的胺基酸869-1291。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1結合域包含與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1結合域包含與SEQ ID NO: 11之胺基酸869-1291之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 11之胺基酸869-1291之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1結合域包含相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1結合域包含相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸869-1291，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸869-1291，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1結合域包含相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/C1結合域包含相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸869-1291，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 11之胺基酸869-1291，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含BoNT/D結合域。在此實施例之一態樣中，BoNT/D結合域包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之結合域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D結合域包含SEQ ID NO: 13之胺基酸865-1291。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D結合域包含天然存在之BoNT/D結合域變異體，諸如BoNT/D同功異型物之結合域或BoNT/D亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D結合域包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之天然存在之BoNT/D結合域變異體，諸如BoNT/D同功異型物結合域或BoNT/D亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D結合域包含SEQ ID NO: 13之天然存在之BoNT/D結合域變異體，諸如BoNT/D同功異型物結合域或BoNT/D亞型結合域的胺基酸865-1291。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D結合域包含非天然存在之BoNT/D結合域變異體，諸如保守BoNT/D結合域變異體、非保守BoNT/D結合域變異體、活性BoNT/D結合域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D結合域包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之非天然存在之BoNT/D結合域變異體，諸如保守BoNT/D結合域變異體、非保守BoNT/D結合域變異體、活性BoNT/D結合域片段、或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/D結合域包含SEQ ID NO: 13之非天然存在之BoNT/D結合域變異體，諸如保守BoNT/D結合域變異體、非保守BoNT/D結合域變異體、活性BoNT/D結合域片段、或其任何組合的胺基酸865-1291。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/D結合域包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D結合域包含與SEQ ID NO: 13之胺基酸865-1291之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 13之胺基酸865-1291之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/D結合域包含相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D結合域包含相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸865-1291，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸865-1291，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D結合域包含相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/D結合域包含相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸865-1291，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸865-1291，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含BoNT/E結合域。在此實施例之一態樣中，BoNT/E結合域包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之結合域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E結合域包含SEQ ID NO: 15之胺基酸848-1252。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E結合域包含天然存在之BoNT/E結合域變異體，諸如BoNT/E同功異型物之結合域或BoNT/E亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E結合域包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之天然存在之BoNT/E結合域變異體，諸如BoNT/E同功異型物結合域或BoNT/E亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E結合域包含SEQ ID NO: 15之天然存在之BoNT/E結合域變異體，諸如BoNT/E同功異型物結合域或BoNT/E亞型結合域的胺基酸848-1252。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E結合域包含非天然存在之BoNT/E結合域變異體，諸如保守BoNT/E結合域變異體、非保守BoNT/E結合域變異體、活性BoNT/E結合域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E結合域包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之非天然存在之BoNT/E結合域變異體，諸如保守BoNT/E結合域變異體、非保守BoNT/E結合域變異體、活性BoNT/E結合域片段、或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/E結合域包含SEQ ID NO: 15之非天然存在之BoNT/E結合域變異體，諸如保守BoNT/E結合域變異體、非保守BoNT/E結合域變異體、活性BoNT/E結合域片段、或其任何組合的胺基酸848-1252。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/E結合域包含與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E結合域包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸848-1252之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 15之胺基酸848-1252之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/E結合域包含相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E結合域包含相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸848-1252，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸848-1252，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E結合域包含相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/E結合域包含相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸848-1252，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸848-1252，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含BoNT/F結合域。在此實施例之一態樣中，BoNT/F結合域包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之結合域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F結合域包含SEQ ID NO: 18之胺基酸866-1274。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F結合域包含天然存在之BoNT/F結合域變異體，諸如BoNT/F同功異型物之結合域或BoNT/F亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F結合域包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之天然存在之BoNT/F結合域變異體，諸如BoNT/F同功異型物結合域或BoNT/F亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F結合域包含SEQ ID NO: 18之天然存在之BoNT/F結合域變異體，諸如BoNT/F同功異型物結合域或BoNT/F亞型結合域的胺基酸866-1274。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F結合域包含非天然存在之BoNT/F結合域變異體，諸如保守BoNT/F結合域變異體、非保守BoNT/F結合域變異體、活性BoNT/F結合域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F結合域包含SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之非天然存在之BoNT/F結合域變異體，諸如保守BoNT/F結合域變異體、非保守BoNT/F結合域變異體、活性BoNT/F結合域片段、或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/F結合域包含SEQ ID NO: 18之非天然存在之BoNT/F結合域變異體，諸如保守BoNT/F結合域變異體、非保守BoNT/F結合域變異體、活性BoNT/F結合域片段、或其任何組合的胺基酸866-1274。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/F結合域包含與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F結合域包含與SEQ ID NO: 18之胺基酸866-1274之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 18之胺基酸866-1274之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/F結合域包含相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F結合域包含相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸866-1274，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸866-1274，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F結合域包含相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/F結合域包含相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸866-1274，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸866-1274，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含BoNT/G結合域。在此實施例之一態樣中，BoNT/G結合域包含SEQ ID NO: 21之結合域。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G結合域包含SEQ ID NO: 21之胺基酸866-1297。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G結合域包含天然存在之BoNT/G結合域變異體，諸如BoNT/G同功異型物之結合域或BoNT/G亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G結合域包含SEQ ID NO: 21之天然存在之BoNT/G結合域變異體，諸如BoNT/G同功異型物結合域或BoNT/G亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G結合域包含SEQ ID NO: 21之天然存在之BoNT/G結合域變異體，諸如BoNT/G同功異型物結合域或BoNT/G亞型結合域的胺基酸866-1297。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G結合域包含非天然存在之BoNT/G結合域變異體，諸如保守BoNT/G結合域變異體、非保守BoNT/G結合域變異體、活性BoNT/G結合域片段、或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G結合域包含SEQ ID NO: 21之非天然存在之BoNT/G結合域變異體，諸如保守BoNT/G結合域變異體、非保守BoNT/G結合域變異體、活性BoNT/G結合域片段、或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，BoNT/G結合域包含SEQ ID NO: 21之非天然存在之BoNT/G結合域變異體，諸如保守BoNT/G結合域變異體、非保守BoNT/G結合域變異體、活性BoNT/G結合域片段、或其任何組合的胺基酸866-1297。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/G結合域包含與SEQ ID NO: 21之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 21之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G結合域包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸866-1297之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 21之胺基酸866-1297之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BoNT/G結合域包含相對於SEQ ID NO: 21之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G結合域包含相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸866-1297，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸866-1297，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G結合域包含相對於SEQ ID NO: 21之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BoNT/G結合域包含相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸866-1297，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸866-1297，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含TeNT結合域。在此實施例之一態樣中，TeNT結合域包含SEQ ID NO: 22之結合域。在此實施例之其他態樣中，TeNT結合域包含SEQ ID NO: 22之胺基酸882-1315。在此實施例之另一態樣中，TeNT結合域包含天然存在之TeNT結合域變異體，諸如TeNT同功異型物之結合域或TeNT亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，TeNT結合域包含SEQ ID NO: 22之天然存在之TeNT結合域變異體，諸如TeNT同功異型物結合域或TeNT亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，TeNT結合域包含SEQ ID NO: 22之天然存在之TeNT結合域變異體，諸如TeNT同功異型物結合域或TeNT亞型結合域的胺基酸882-1315。在此實施例之另一態樣中，TeNT結合域包含非天然存在之TeNT結合域變異體，諸如保守TeNT結合域變異體、非保守TeNT結合域變異體、活性TeNT結合域片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，TeNT結合域包含SEQ ID NO: 22之非天然存在之TeNT結合域變異體，諸如保守TeNT結合域變異體、非保守TeNT結合域變異體、活性TeNT結合域片段或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，TeNT結合域包含SEQ ID NO: 22之非天然存在之TeNT結合域變異體，諸如保守TeNT結合域變異體、非保守TeNT結合域變異體、活性TeNT結合域片段或其任何組合的胺基酸882-1315。
在此實施例之其他態樣中，TeNT結合域包含與SEQ ID NO: 22之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 22之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT結合域包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸882-1315之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 22之胺基酸882-1315之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，TeNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 22之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸882-1315，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸882-1315，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 22之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，TeNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸882-1315，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸882-1315，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含BaNT結合域。在此實施例之一態樣中，BaNT結合域包含SEQ ID NO: 23之結合域。在此實施例之其他態樣中，BaNT結合域包含SEQ ID NO: 23之胺基酸858-1268。在此實施例之另一態樣中，BaNT結合域包含天然存在之BaNT結合域變異體，諸如BaNT同功異型物之結合域或BaNT亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，BaNT結合域包含SEQ ID NO: 23之天然存在之BaNT結合域變異體，諸如BaNT同功異型物結合域或BaNT亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，BaNT結合域包含SEQ ID NO: 23之天然存在之BaNT結合域變異體，諸如BaNT同功異型物結合域或BaNT亞型結合域的胺基酸858-1268。在此實施例之另一態樣中，BaNT結合域包含非天然存在之BaNT結合域變異體，諸如保守BaNT結合域變異體、非保守BaNT結合域變異體、活性BaNT結合域片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BaNT結合域包含SEQ ID NO: 23之非天然存在之BaNT結合域變異體，諸如保守BaNT結合域變異體、非保守BaNT結合域變異體、活性BaNT結合域片段或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，BaNT結合域包含SEQ ID NO: 23之非天然存在之BaNT結合域變異體，諸如保守BaNT結合域變異體、非保守BaNT結合域變異體、活性BaNT結合域片段或其任何組合的胺基酸858-1268。
在此實施例之其他態樣中，BaNT結合域包含與SEQ ID NO: 23之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 23之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT結合域包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸858-1268之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 23之胺基酸858-1268之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BaNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 23之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸858-1268，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸858-1268，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 23之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BaNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸858-1268，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸858-1268，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含BuNT結合域。在此實施例之一態樣中，BuNT結合域包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之結合域。在此實施例之其他態樣中，BuNT結合域包含SEQ ID NO: 24之胺基酸848-1251。在此實施例之另一態樣中，BuNT結合域包含天然存在之BuNT結合域變異體，諸如BuNT同功異型物之結合域或BuNT亞型之結合域。在此實施例之另一態樣中，BuNT結合域包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之天然存在之BuNT結合域變異體，諸如BuNT同功異型物結合域或BuNT亞型結合域。在此實施例之另一態樣中，BuNT結合域包含SEQ ID NO: 24之天然存在之BuNT結合域變異體，諸如BuNT同功異型物結合域或BuNT亞型結合域的胺基酸848-1251。在此實施例之另一態樣中，BuNT結合域包含非天然存在之BuNT結合域變異體，諸如保守BuNT結合域變異體、非保守BuNT結合域變異體、活性BuNT結合域片段或其任何組合。在此實施例之另一態樣中，BuNT結合域包含SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之非天然存在之BuNT結合域變異體，諸如保守BuNT結合域變異體、非保守BuNT結合域變異體、活性BuNT結合域片段、或其任何組合的結合域。在此實施例之另一態樣中，BuNT結合域包含SEQ ID NO: 24之非天然存在之BuNT結合域變異體，諸如保守BuNT結合域變異體、非保守BuNT結合域變異體、活性BuNT結合域片段、或其任何組合的胺基酸848-1251。
在此實施例之其他態樣中，BuNT結合域包含與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之結合域之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之結合域之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT結合域包含與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸848-1251之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸848-1251之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BuNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸848-1251，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸848-1251，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之結合域，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之結合域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。在此實施例之其他態樣中，BuNT結合域包含相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸848-1251，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽；或相對於SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸848-1251，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代之多肽。
本說明書之態樣部分地提供非梭狀芽孢桿菌毒素結合域。如本文所用，術語「非梭狀芽孢桿菌毒素結合域」係指可執行中毒過程之結合步驟之任何多肽，該結合步驟起始本說明書中揭示之經修飾梭狀芽孢桿菌毒素藉以使目標細胞中毒的總體內化機制。結合域之實例描述於例如以下中:Keith A. Foster等人，Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions，美國專利5,989,545；Clifford C. Shone等人，Recombinant Toxin Fragments，美國專利6,461,617；Conrad P. Quinn等人，Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion，美國專利6,632,440；Lance E. Steward等人，Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis，美國專利6,843,998；J. Oliver Dolly等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利7,132,259；Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain，美國專利公開案2002/0037833；KeithA.Foster等人，Inhibition of Secretion from Non-neural Cells，美國專利公開案2003/0180289；Lance E. Steward等人，Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use，美國專利公開案2006/0211619；Keith A. Foster等人，Non-Cytotoxic Protein Conjugates，美國專利公開案2008/0187960；Steward,L.E.等人，Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells，美國專利公開案第11/776,075號；Keith A. Foster等人，Re-targeted Toxin Conjugates，美國專利公開案第11/792,210號，各專利皆以全文引用的方式併入本文中。
非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包括但不限於天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體，諸如非梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物及非梭狀芽孢桿菌毒素結合域亞型；及非天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體，諸如保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、非保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域嵌合體、其活性非梭狀芽孢桿菌毒素結合域片段，或其任何組合。
如本文所用，術語「非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」，無論天然存在或非天然存在，皆係指相較於參考序列之相應區域，具有至少1個胺基酸變化且可用與彼參考序列之相應區域之一致性百分比來描述的非梭狀芽孢桿菌毒素結合域。除非明確指示，否則適用於實施揭示之實施例之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體為執行中毒過程之結合步驟之變異體。
熟習此項技術者認識到在各非梭狀芽孢桿菌毒素結合域內，可存在胺基酸序列以及編碼此等蛋白質之核酸略有不同之天然存在的變異體。如本文所用，術語「天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」係指藉由天然存在之過程所產生之任何非梭狀芽孢桿菌毒素結合域，包括但不限於自經替代性拼接之轉錄物產生之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物、及藉由自發突變產生之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物。天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體可以與該天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體所基於之參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域。天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之一非限制性實例為非梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物。非梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物之非限制性實例包括例如類阿片(opiod)結合域同功異型物、速激肽(tachykinin)結合域同功異型物、黑皮素(melanocortin)結合域同功異型物、甘丙胺素(galanin)結合域同功異型物、鳥尿素(granin)結合域同功異型物、神經肽Y相關肽結合域同功異型物、神經激素結合域同功異型物、神經調控細胞激素結合域同功異型物、激肽(kinin)結合域同功異型物、生長因子結合域同功異型物及升糖素(glucagon)樣激素結合域同功異型物。
如本文所用，術語「非天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」係指藉助於人類操作所產生之任何非梭狀芽孢桿菌毒素結合域，包括但不限於藉由使用隨機突變誘發或合理設計進行遺傳工程改造產生之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及藉由化學合成產生之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域。非天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之非限制性實例包括例如保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、非保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域嵌合變異體及活性非梭狀芽孢桿菌毒素結合域片段。
如本文所用，術語「保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」係指至少一個胺基酸經具有至少一種與參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域序列之原始胺基酸類似之性質的另一胺基酸或胺基酸類似物取代的非梭狀芽孢桿菌毒素結合域。性質之實例包括但不限於類似尺寸、構形、電荷、疏水性、、親水性、親脂性、共價鍵結能力、氫鍵結能力、物理化學性質或其類似性質、或其任何組合。保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體可以與該保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體所基於之參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域。保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之非限制性實例包括例如保守類阿片結合域變異體、保守速激肽結合域變異體、保守黑皮素結合域變異體、保守甘丙胺素結合域變異體、保守鳥尿素結合域變異體、保守神經肽Y相關肽結合域變異體、保守神經激素結合域變異體、保守神經調控細胞激素結合域變異體、保守激肽結合域變異體、保守生長因子結合域變異體及保守升糖素樣激素結合域變異體。
如本文所用，術語「非保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體」係指以下非梭狀芽孢桿菌毒素結合域：其中1)至少一個胺基酸自該非保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體所基於之參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域缺失；2)至少一個胺基酸添加至該非保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域所基於之參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域中；或3)至少一個胺基酸經不共有與參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域序列之原始胺基酸之性質類似的任何性質之另一胺基酸或胺基酸類似物取代。非保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體可以與該非保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體所基於之參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考非梭狀芽孢桿菌毒素結合域。非保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之非限制性實例包括例如非保守類阿片結合域變異體、非保守速激肽結合域變異體、非保守黑皮素結合域變異體、非保守甘丙胺素結合域變異體、非保守鳥尿素結合域變異體、非保守神經肽Y相關肽結合域變異體、非保守神經激素結合域變異體、非保守神經調控細胞激素結合域變異體、非保守激肽結合域變異體、非保守生長因子結合域變異體及非保守升糖素樣激素結合域變異體。
如本文所用，術語「活性非梭狀芽孢桿菌毒素結合域片段」係指可適用於本說明書之態樣中之包含結合域的多種梭狀芽孢桿菌毒素片段之任一者，其限制條件為此等結合域片段可優先與同源受體相互作用，且因此參與執行梭狀芽孢桿菌毒素藉以使受質蛋白水解裂解的總體細胞機制。
多種序列比對方法之任一者可用於確定天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體及非天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體之一致性百分比，該等方法包括但不限於整體法、局部法及混合法，諸如區段接近法。確定一致性百分比之方案為在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
因此，在一實施例中，本說明書中揭示之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素包含非梭狀芽孢桿菌毒素結合域。在此實施例之一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體，諸如非梭狀芽孢桿菌毒素結合域同功異型物。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含非天然存在之非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體，諸如保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、非保守非梭狀芽孢桿菌毒素結合域變異體、活性非梭狀芽孢桿菌毒素結合域片段、或其任何組合。
在另一實施例中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之疏水性胺基酸可經另一疏水性胺基酸取代。疏水性胺基酸之實例包括例如C、F、I、L、M、V及W。在此實施例之另一態樣中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之脂族胺基酸可經另一脂族胺基酸取代。脂族胺基酸之實例包括例如A、I、L、P及V。在此實施例之另一態樣中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之芳族胺基酸可經另一芳族胺基酸取代。芳族胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之堆疊胺基酸可經另一堆疊胺基酸取代。堆疊胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之極性胺基酸可經另一極性胺基酸取代。極性胺基酸之實例包括例如D、E、K、N、Q及R。在此實施例之另一態樣中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之極性較小或中性胺基酸可經另一極性較小或中性胺基酸取代。極性較小或中性胺基酸之實例包括例如A、H、G、P、S、T及Y。在此實施例之另一態樣中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之帶正電荷胺基酸可經另一帶正電荷胺基酸取代。帶正電荷胺基酸之實例包括例如K、R及H。在此實施例之另一態樣中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之帶負電荷胺基酸可經另一帶負電荷胺基酸取代。帶負電荷胺基酸之實例包括例如D及E。在此實施例之另一態樣中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之較小胺基酸可經另一較小胺基酸取代。較小胺基酸之實例包括例如A、D、G、N、P、S及T。在此實施例之另一態樣中，在非梭狀芽孢桿菌毒素結合域之多肽鏈中一特定位置處之C-β分支鏈胺基酸可經另一C-β分支鏈胺基酸取代。C-β分支鏈胺基酸之實例包括例如I、T及V。
在另一實施例中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含類阿片結合域，諸如腦啡肽(enkephalin)、內嗎啡肽(endomorphin)、內啡肽(endorphin)、強啡肽(dynorphin)、孤啡肽(nociceptin)或血嗎啡肽(hemorphin)。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含速激肽結合域，諸如物質P(Substance P)、神經肽K(NPK)、神經肽γ(NPγ)、神經激肽A(NKA；物質K，神經激肽α，神經調節肽L(neuromedin L))、神經激肽B(NKB)、血激肽(hemokinin)或內激肽(endokinin)。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素包含黑皮素結合域，諸如促黑素細胞素(melanocyte stimulating hormone)、促皮質素(adrenocorticotropin)或促脂素(lipotropin)。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含甘丙胺素結合域，諸如甘丙胺素或甘丙胺素訊息相關肽。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含鳥尿素結合域，諸如染色顆粒素A(Chromogranin A)、染色顆粒素B或染色顆粒素C。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含神經肽Y相關肽結合域，諸如神經肽Y、肽YY、胰臟肽或胰臟二十肽。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含神經激素結合域，諸如釋皮質促素(corticotropin-releasing hormone)、副甲狀腺素(parathyroid hormone)、促甲狀腺素釋素(thyrotropin-releasing hormone)或生長抑素(somatostatin)。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含神經調控細胞激素結合域，諸如睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、血型醣蛋白-A(glycophorin-A)、白血病抑制因子、膽鹼激導性分化因子(cholinergic differentiation factor)、介白素(interleukin)、制瘤素M(onostatin M)、心營養素-1(cardiotrophin-1)、心營養素樣細胞激素、或神經白介素(neuroleukin)。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含激肽結合域，諸如緩激肽(bradykinin)、胰激肽(kallidin)、desArg9緩激肽或desArg10緩激肽。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含生長因子結合域，諸如纖維母細胞生長因子結合域、神經生長因子結合域、胰島素生長因子結合域、表皮生長因子結合域、血管內皮生長因子結合域、腦源性神經營養因子結合域、生長源性神經營養因子結合域、神經營養素(neurotrophin)結合域(諸如神經營養素-3、神經營養素-4/5)、頭活化肽(head activator peptide)結合域、神經秩蛋白(neurturin)結合域、persephrin神經營養因子結合域、artemin神經營養因子結合域、轉型生長因子β結合域(諸如TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3或TGFβ4)、骨形態發生蛋白質結合域(諸如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8或BMP10)、生長分化因子結合域(諸如GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF10、GDF11或GDF15)、或活化素(activin)結合域(諸如活化素A、活化素B、活化素C、活化素E或抑制素A(inhibin A))。在此實施例之另一態樣中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含升糖素樣激素結合域，諸如胰泌素(secretin)、升糖素樣肽(如GLP-1及GLP-2)、垂體腺苷酸環化酶活化肽結合域、生長激素釋放激素結合域、血管活性腸肽結合域(如VIP1或VIP2)、胃抑制性多肽結合域、抑鈣素(calcitonin)相關肽內臟消化道肽結合域(如胃泌素(gastrin)、胃泌素釋放肽或膽囊收縮素(cholecystokinin))、或PAR肽結合域(如PAR1肽、PAR2肽、PAR3肽或PAR4肽)。
在另一實施例中，類鴉片肽包含腦啡肽。在此實施例之態樣中，腦啡肽包含Leu-腦啡肽、Met-腦啡肽、Met-腦啡肽MRGL或Met-腦啡肽MRF。在此實施例之其他態樣中，腦啡肽包含SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29。
在此實施例之其他態樣中，腦啡肽包含與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之多肽；或與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%之多肽。在此實施例之其他態樣中，腦啡肽包含相對於SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29，具有例如至少1、2或3個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29，具有例如至多1、2或3個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。在此實施例之其他態樣中，腦啡肽包含相對於SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29，具有例如至少1、2或3個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29，具有例如至多1、2或3個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在另一實施例中，類鴉片肽包含牛腎上腺髓質-22(BAM22)肽。在此實施例之態樣中，BAM22肽包含BAM22肽(1-12)、BAM22肽(6-22)、BAM22肽(8-22)或BAM22肽(1-22)。在此實施例之其他態樣中，BAM22肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 31之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 32之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 33之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 34之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；或SEQ ID NO: 35之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22。
在此實施例之其他態樣中，BAM22肽包含與SEQ ID NO: 30之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 31之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 32之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 33之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 34之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；或SEQ ID NO: 35之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22的胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 30之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 31之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 32之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 33之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 34之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；或SEQ ID NO: 35之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22的胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BAM22肽包含相對於SEQ ID NO: 30之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 31之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 32之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 33之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 34之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；或SEQ ID NO: 35之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22，具有例如至少1、2、3、4或5個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 30之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 31之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 32之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 33之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 34之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；或SEQ ID NO: 35之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22，具有例如至多1、2、3、4或5個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在此實施例之其他態樣中，BAM22肽包含相對於SEQ ID NO: 30之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 31之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 32之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 33之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 34之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；或SEQ ID NO: 35之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22，具有例如至少1、2、3、4或5個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 30之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 71之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 32之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 33之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；SEQ ID NO: 34之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22；或SEQ ID NO: 35之胺基酸1-12、胺基酸6-22、胺基酸8-22或胺基酸1-22，具有例如至多1、2、3、4或5個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在另一實施例中，類鴉片肽包含內嗎啡肽。在此實施例之態樣中，內嗎啡肽包含內嗎啡肽-1或內嗎啡肽-2。在此實施例之其他態樣中，內嗎啡肽包含SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 37。
在此實施例之其他態樣中，內嗎啡肽包含與SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 37之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 37之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，內嗎啡肽包含相對於SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 37，具有例如至少1、2或3個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO 36：或SEQ ID NO: 37，具有例如至多1、2或3個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。在此實施例之其他態樣中，內嗎啡肽包含相對於SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 37，具有例如至少1、2或3個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO 36：或SEQ ID NO: 37，具有例如至多1、2或3個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在另一實施例中，類鴉片肽包含內啡肽。在此實施例之態樣中，內啡肽包含內啡肽-α、新內啡肽-α(neoendorphin-α)、內啡肽-β、新內啡肽-β或內啡肽-γ。在此實施例之其他態樣中，內啡肽包含SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43。
在此實施例之其他態樣中，內啡肽包含與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，內啡肽包含相對於SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43，具有例如至少1、2、3、4或5個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43，具有例如至多1、2、3、4或5個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。在此實施例之其他態樣中，內啡肽包含相對於SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43，具有例如至少1、2、3、4或5個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43，具有例如至多1、2、3、4或5個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在另一實施例中，類鴉片肽包含強啡肽。在此實施例之態樣中，強啡肽包含強啡肽A、強啡肽B(白胺酸嗎啡肽(leumorphin))或強啡肽B(rimorphin)。在此實施例之其他態樣中，強啡肽包含SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73或SEQ ID NO: 74。
在此實施例之其他態樣中，強啡肽包含與SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 69之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 69之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽在此實施例之其他態樣中，強啡肽包含相對於SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 69，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 69，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。在此實施例之其他態樣中，強啡肽包含相對於SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 69，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 53或SEQ ID NO: 69，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在另一實施例中，類鴉片肽包含孤啡肽。在此實施例之態樣中，孤啡肽包含孤啡肽RK、孤啡肽、神經肽1、神經肽2或神經肽3。在此實施例之其他態樣中，孤啡肽包含SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84。
在此實施例之其他態樣中，孤啡肽包含與SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，孤啡肽包含相對於SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。在此實施例之其他態樣中，孤啡肽包含相對於SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在另一實施例中，類鴉片肽包含血嗎啡肽。在此實施例之態樣中，血嗎啡肽包含LVVH7、VVH7、VH7、H7、LVVH6、LVVH5、VVH5、LVVH4及LVVH3。在此實施例之其他態樣中，血嗎啡肽包含SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92或SEQ ID NO: 93。
在此實施例之其他態樣中，血嗎啡肽包含與SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQID NO: 92或SEQ ID NO: 93之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92或SEQ ID NO: 93之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，孤啡肽包含相對於SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92或SEQ ID NO: 93，具有例如至少1、2或3個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92或SEQ ID NO: 93，具有例如至多1、2或3個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。在此實施例之其他態樣中，孤啡肽包含相對於SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92或SEQ ID NO: 93，具有例如至少1、2或3個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92或SEQ ID NO: 93，具有例如至多1、2或3個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在另一實施例中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含甘丙胺素肽結合域。在此實施例之態樣中，甘丙胺素肽結合域包含甘丙胺素或甘丙胺素訊息相關肽(GMAP)。在此實施例之其他態樣中，甘丙胺素肽結合域包含SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 95。
在此實施例之其他態樣中，甘丙胺素結合域包含與SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 95之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 95之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，甘丙胺素結合域包含相對於SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 95，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 95，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。在此實施例之其他態樣中，甘丙胺素結合域包含相對於SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 95，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 95，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在另一實施例中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含速激肽結合域。在此實施例之態樣中，速激肽結合域包含物質P、神經肽K(NPK)、神經肽γ(NPγ)、神經激肽A(NKA；物質K，神經激肽α，神經調節肽L)、神經激肽B(NKB)、血激肽或內激肽。在此實施例之其他態樣中，速激肽結合域包含SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106或SEQ ID NO: 107。
在此實施例之其他態樣中，速激肽結合域包含與SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106或SEQ ID NO: 107之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106或SEQ ID NO: 107之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。
在此實施例之其他態樣中，速激肽結合域包含相對於SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106或SEQ ID NO: 107，具有例如至少1、2、3、4或5個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106或SEQ ID NO: 107，具有例如至多1、2、3、4或5個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。在此實施例之其他態樣中，速激肽結合域包含相對於SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106或SEQ ID NO: 107，具有例如至少1、2、3、4或5個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106或SEQ ID NO: 107，具有例如至多1、2、3、4或5個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
在另一實施例中，非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含神經肽Y相關肽結合域。在此實施例之態樣中，神經肽Y相關肽結合域包含神經肽Y(NPY)、肽YY(PYY)、胰臟肽(PP)或胰臟二十肽(PIP)。在此實施例之其他態樣中，神經肽Y相關肽結合域包含SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO:109、SEQID NO: 110、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 112。
在此實施例之其他態樣中，神經肽Y相關肽結合域包含與SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 112之胺基酸一致性為例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的多肽；或與SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 112之胺基酸一致性為例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%的多肽。在此實施例之其他態樣中，神經肽Y相關肽結合域包含相對於SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 112，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: I11或SEQ ID NO: 112，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。在此實施例之其他態樣中，神經肽Y相關肽結合域包含相對於SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 112，具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽；或相對於SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 112，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鄰接胺基酸缺失、添加及/或取代的多肽。
設想本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可在任何及所有位置中包含非梭狀芽孢桿菌結合域，其限制條件為梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可進行中毒過程。非限制性實例包括使非梭狀芽孢桿菌結合域位於經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素之胺基端處；使非梭狀芽孢桿菌結合域位於經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素之梭狀芽孢桿菌毒素酶域與易位域之間；及使非梭狀芽孢桿菌結合域位於經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素之羧基端處。其他非限制性實例包括使非梭狀芽孢桿菌結合域位於經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素之梭狀芽孢桿菌毒素酶域與梭狀芽孢桿菌毒素易位域之間。天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素之酶域含有天然起始甲硫胺酸。因此，在酶域不位於胺基端位置中之域組織中，包含起始甲硫胺酸之胺基酸序列應置於胺基端域之前。同樣，當非梭狀芽孢桿菌結合域位於胺基端位置中時，在非梭狀芽孢桿菌結合域需要游離胺基端之情形下，包含起始甲硫胺酸及蛋白酶裂解位點之胺基酸序列可經可操作地連接，參見例如Shengwen Li等人，Degradable Clostridial Toxins，美國專利申請案11/572,512(2007年1月23日)，其據此以全文引用的方式併入本文中。此外，此項技術中已知當添加與包含起始甲硫胺酸之另一多肽之胺基端可操作地連接的多肽時，原始甲硫胺酸殘基可經缺失。
因此，在一實施例中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含非梭狀芽孢桿菌結合域、易位域、外源性蛋白酶裂解位點及酶域(圖3A)。在此實施例之一態樣中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含非梭狀芽孢桿菌結合域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、外源性蛋白酶裂解位點及梭狀芽孢桿菌毒素酶域。
在另一實施例中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含非梭狀芽孢桿菌結合域、酶域、外源性蛋白酶裂解位點及易位域(圖3B)。在此實施例之一態樣中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含非梭狀芽孢桿菌結合域、梭狀芽孢桿菌毒素酶域、外源性蛋白酶裂解位點、梭狀芽孢桿菌毒素易位域。
在另一實施例中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含酶域、外源性蛋白酶裂解位點、非梭狀芽孢桿菌結合域及易位域(圖4A)。在此實施例之一態樣中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、外源性蛋白酶裂解位點、非梭狀芽孢桿菌結合域及梭狀芽孢桿菌毒素易位域。
在另一實施例中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含易位域、外源性蛋白酶裂解位點、非梭狀芽孢桿菌結合域及酶域(圖4B)。在此實施例之一態樣中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含梭狀芽孢桿菌毒素易位域、非梭狀芽孢桿菌結合域、外源性蛋白酶裂解位點及梭狀芽孢桿菌毒素酶域。
在另一實施例中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含酶域、非梭狀芽孢桿菌結合域、外源性蛋白酶裂解位點及易位域(圖4C)。在此實施例之一態樣中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、非梭狀芽孢桿菌結合域、外源性蛋白酶裂解位點、梭狀芽孢桿菌毒素易位域。
在另一實施例中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含易位域、非梭狀芽孢桿菌結合域、外源性蛋白酶裂解位點及酶域(圖4D)。在此實施例之一態樣中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含梭狀芽孢桿菌毒素易位域、非梭狀芽孢桿菌結合域、外源性蛋白酶裂解位點及梭狀芽孢桿菌毒素酶域。
在另一實施例中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含酶域、外源性蛋白酶裂解位點、易位域及非梭狀芽孢桿菌結合域(圖5A)。在此實施例之一態樣中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、外源性蛋白酶裂解位點、梭狀芽孢桿菌毒素易位域及非梭狀芽孢桿菌結合域。
在另一實施例中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含易位域、外源性蛋白酶裂解位點、酶域及非梭狀芽孢桿菌結合域(圖5B)。在此實施例之一態樣中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含胺基至羧基單一多肽線性順序，其包含梭狀芽孢桿菌毒素易位域、非梭狀芽孢桿菌結合域、外源性蛋白酶裂解位點及梭狀芽孢桿菌毒素酶域。
本說明書之態樣部分地提供不活化裂解位點。如本文所用，術語「不活化裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在該易裂鍵處經間質液或循環系統(諸如心血管系統或淋巴系統)中存在之蛋白酶發生選擇性蛋白水解。該種不活化裂解位點與本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可操作地連接成融合蛋白。根據定義，不活化裂解位點易經間質液或循環系統中存在之至少一種蛋白酶發生選擇性裂解。不活化裂解位點之非限制性實例包括凝血酶裂解位點、纖維蛋白溶酶裂解位點、凝血因子VIIa裂解位點、凝血因子IXa裂解位點、凝血因子Xa裂解位點、凝血因子XIa裂解位點、凝血因子XIIa裂解位點、血漿激肽釋放素裂解位點、蛋白酶活化之G蛋白偶聯受體-1(PAR1)裂解位點、PAR2裂解位點、PAR3裂解位點、PAR4裂解位點、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)裂解位點、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)裂解位點、弗林蛋白酶裂解位點、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)裂解位點、組織型纖維蛋白溶酶原活化因子(tPA)裂解位點、類胰蛋白酶-ε裂解位點、小鼠肥大細胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位點、內皮素轉化酶-1(ECE-1)裂解位點、凱爾血型裂解位點、DPPIV裂解位點、具有1型血小板反應蛋白基元-13之ADAM金屬肽酶(ADAMTS13)裂解位點、及組織蛋白酶L裂解位點(表4)。
設想任何及所有長度之不活化裂解位點可適用於本說明書之態樣中，其限制條件為該不活化裂解位點能夠經間質液或循環系統蛋白酶裂解。因此，在此實施例之態樣中，不活化裂解位點之長度可為例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個胺基酸。在此實施例之其他態樣中，不活化裂解位點之長度可為例如至多3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個胺基酸。
適用於本說明書之態樣中之不活化裂解位點包括但不限於天然存在之不活化裂解位點；天然存在之不活化裂解位點變異體；及非天然存在之不活化裂解位點變異體，諸如保守不活化裂解位點變異體、非保守不活化裂解位點變異體及不活化裂解位點肽模擬物。如本文所用，術語「不活化裂解位點變異體」，無論天然存在或非天然存在，皆係指相較於揭示之參考序列之相應區域，具有至少一個胺基酸變化且可用與彼參考序列之相應區域的一致性百分比來描述的不活化裂解位點。多種序列比對方法之任一者可用於確定一致性百分比，該等方法包括但不限於整體法、局部法及混合法，諸如區段接近法。確定一致性百分比之方案為在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
如本文所用，術語「天然存在之不活化裂解位點變異體」係指不藉助於任何人類操作所產生之任何不活化裂解位點。不活化裂解位點之非限制性實例包括凝血酶裂解位點變異體、纖維蛋白溶酶裂解位點變異體、凝血因子V裂解位點變異體、凝血因子VII裂解位點變異體、凝血因子VIII裂解位點變異體、凝血因子IXa裂解位點變異體、凝血因子Xa裂解位點變異體、凝血因子XIa裂解位點變異體、凝血因子XIIa裂解位點變異體、血漿激肽釋放素裂解位點變異體、MMP-2裂解位點變異體、MMP-9裂解位點變異體、弗林蛋白酶裂解位點變異體、u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點變異體、t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點變異體、類胰蛋白酶-ε裂解位點變異體、mMCP-7裂解位點變異體、ECE-1裂解位點變異體、KBGP裂解位點變異體、組織蛋白酶L裂解位點變異體、PAR1裂解位點變異體、PAR2裂解位點變異體、PAR3裂解位點變異體、PAR4裂解位點變異體及ADAM-TS13裂解位點變異體。
如本文所用，術語「非天然存在之不活化裂解位點變異體」係指藉助於人類操作所產生之任何不活化裂解位點，包括但不限於藉由使用隨機突變誘發或合理設計進行遺傳工程改造產生之不活化裂解位點變異體及藉由化學合成產生之不活化裂解位點變異體。非天然存在之不活化裂解位點變異體之非限制性實例包括例如保守不活化裂解位點變異體、非保守不活化裂解位點變異體及不活化裂解位點肽模擬物。
如本文所用，術語「保守不活化裂解位點變異體」係指至少一個胺基酸經具有至少一種與參考不活化裂解位點序列之原始胺基酸類似之性質的另一胺基酸或胺基酸類似物取代的不活化裂解位點。性質之實例包括但不限於類似尺寸、構形、電荷、疏水性、親水性、親脂性、共價鍵結能力、氫鍵結能力、物理化學性質或其類似性質、或其任何組合。保守不活化裂解位點變異體可以與該保守不活化裂解位點變異體所基於之參考不活化裂解位點實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考不活化裂解位點。保守不活化裂解位點之非限制性實例包括例如保守凝血酶裂解位點變異體、保守纖維蛋白溶酶裂解位點變異體、保守凝血因子V裂解位點變異體、保守凝血因子VII裂解位點變異體、保守凝血因子VIII裂解位點變異體、保守凝血因子IXa裂解位點變異體、保守凝血因子Xa裂解位點變異體、保守凝血因子XIa裂解位點變異體、保守凝血因子XIIa裂解位點變異體、保守血漿激肽釋放素裂解位點變異體、保守MMP-2裂解位點變異體、保守MMP-9裂解位點變異體、保守弗林蛋白酶裂解位點變異體、保守u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點變異體、保守t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點變異體、保守類胰蛋白酶-ε裂解位點變異體、保守mMCP-7裂解位點變異體、保守ECE-1裂解位點變異體、保守KBGP裂解位點變異體、保守組織蛋白酶L裂解位點變異體、保守PAR1裂解位點變異體、保守PAR2裂解位點變異體、保守PAR3裂解位點變異體、保守PAR4裂解位點變異體及保守ADAM-TS13裂解位點變異體。
如本文所用，術語「非保守不活化裂解位點變異體」係指以下不活化裂解位點：其中1)至少一個胺基酸自該非保守不活化裂解位點變異體所基於之參考不活化裂解位點缺失；2)至少一個胺基酸添加至該非保守不活化裂解位點所基於之參考不活化裂解位點中；或3)至少一個胺基酸經不共有與參考不活化裂解位點序列(表4)之原始胺基酸之性質類似的任何性質之另一胺基酸或胺基酸類似物取代。非保守不活化裂解位點變異體可以與該非保守不活化裂解位點所基於之參考不活化裂解位點實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考不活化裂解位點。非保守不活化裂解位點變異體之非限制性實例包括例如非保守凝血酶裂解位點變異體、非保守纖維蛋白溶酶裂解位點變異體、非保守凝血因子V裂解位點變異體、非保守凝血因子VII裂解位點變異體、非保守凝血因子VIII裂解位點變異體、非保守凝血因子IXa裂解位點變異體、非保守凝血因子Xa裂解位點變異體、非保守凝血因子XIa裂解位點變異體、非保守凝血因子XIIa裂解位點變異體、非保守血漿激肽釋放素裂解位點變異體、非保守MMP-2裂解位點變異體、非保守MMP-9裂解位點變異體、非保守弗林蛋白酶裂解位點變異體、非保守u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點變異體、非保守t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點變異體、非保守類胰蛋白酶-ε裂解位點變異體、非保守mMCP-7裂解位點變異體、非保守ECE-1裂解位點變異體、非保守KBGP裂解位點變異體、非保守組織蛋白酶L裂解位點變異體、非保守PAR1裂解位點變異體、非保守PAR2裂解位點變異體、非保守PAR3裂解位點變異體、非保守PAR4裂解位點變異體及非保守ADAM-TS13裂解位點變異體。
如本文所用，術語「不活化裂解位點肽模擬物」係指具有至少一個胺基酸經具有至少一種與第一胺基酸類似之性質的非天然寡聚物取代的不活化裂解位點。性質之實例包括但不限於肽一級結構元件之構形、肽一級結構元件之功能性、肽二級結構元件之拓撲結構、肽二級結構元件之功能性或其類似性質、或其任何組合。不活化裂解位點肽模擬物可以與該不活化裂解位點肽模擬物所基於之參考不活化裂解位點實質上相同之方式起作用，且在本說明書之任何態樣中可取代參考不活化裂解位點。對於肽模擬物方法之實例，參見例如Amy S. Ripka及Daniel H. Rich,Peptidomimetic design,2(4) CURR. OPIN. CHEM. BIOL. 441-452(1998)；及M. Angels Estiarte及Daniel H. Rich,Peptidomimetics for Drug Design,803-861(BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY第1卷PRINCIPLE AND PRACTICE,Donald J. Abraham編，Wiley-Interscience，第6版2003)。不活化裂解位點肽模擬物之非限制性實例包括例如凝血酶裂解位點肽模擬物、纖維蛋白溶酶裂解位點肽模擬物、凝血因子V裂解位點肽模擬物、凝血因子VII裂解位點肽模擬物、凝血因子VIII裂解位點肽模擬物、凝血因子IXa裂解位點肽模擬物、凝血因子Xa裂解位點肽模擬物、凝血因子XIa裂解位點肽模擬物、凝血因子XIIa裂解位點肽模擬物、血漿激肽釋放素裂解位點肽模擬物、MMP-2裂解位點肽模擬物、MMP-9裂解位點肽模擬物、弗林蛋白酶裂解位點肽模擬物、u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點肽模擬物、t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點肽模擬物、類胰蛋白酶-ε裂解位點肽模擬物、mMCP-7裂解位點肽模擬物、ECE-1裂解位點肽模擬物、KBGP裂解位點肽模擬物、組織蛋白酶L裂解位點肽模擬物、PAR1裂解位點肽模擬物、PAR2裂解位點肽模擬物、PAR3裂解位點肽模擬物、PAR4裂解位點肽模擬物及ADAM-TS13裂解位點肽模擬物。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素包含不活化裂解位點。在此實施例之一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、梭狀芽孢桿菌毒素結合域及不活化裂解位點。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素包含天然存在之不活化裂解位點變異體，諸如不活化裂解位點同功異型物。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素包含非天然存在之不活化裂解位點變異體，諸如保守不活化裂解位點變異體、非保守不活化裂解位點變異體或活性不活化裂解位點片段、或其任何組合。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含不活化裂解位點。在此實施例之一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及不活化裂解位點。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含天然存在之不活化裂解位點變異體，諸如不活化裂解位點同功異型物。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含非天然存在之不活化裂解位點變異體，諸如保守不活化裂解位點變異體、非保守不活化裂解位點變異體或活性不活化裂解位點片段、或其任何組合。
在另一實施例中，在不活化裂解位點中一特定位置處之疏水性胺基酸可經另一疏水性胺基酸取代。疏水性胺基酸之實例包括例如C、F、I、L、M、V及W。在此實施例之另一態樣中，在不活化裂解位點中一特定位置處之脂族胺基酸可經另一脂族胺基酸取代。脂族胺基酸之實例包括例如A、I、L、P及V。在此實施例之另一態樣中，在不活化裂解位點中一特定位置處之芳族胺基酸可經另一芳族胺基酸取代。芳族胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在不活化裂解位點中一特定位置處之堆疊胺基酸可經另一堆疊胺基酸取代。堆疊胺基酸之實例包括例如F、H、W及Y。在此實施例之另一態樣中，在不活化裂解位點中一特定位置處之極性胺基酸可經另一極性胺基酸取代。極性胺基酸之實例包括例如D、E、K、N、Q及R。在此實施例之另一態樣中，在不活化裂解位點中一特定位置處之極性較小或中性胺基酸可經另一極性較小或中性胺基酸取代。極性較小或中性胺基酸之實例包括例如A、H、G、P、S、T及Y。在此實施例之另一態樣中，在不活化裂解位點中一特定位置處之帶正電荷胺基酸可經另一帶正電荷胺基酸取代。帶正電荷胺基酸之實例包括例如K、R及H。在此實施例之另一態樣中，在不活化裂解位點中一特定位置處之帶負電荷胺基酸可經另一帶負電荷胺基酸取代。帶負電荷胺基酸之實例包括例如D及E。在此實施例之另一態樣中，在不活化裂解位點中一特定位置處之較小胺基酸可經另一較小胺基酸取代。較小胺基酸之實例包括例如A、D、G、N、P、S及T。在此實施例之另一態樣中，在不活化裂解位點中一特定位置處之C-β分支鏈胺基酸可經另一C-β分支鏈胺基酸取代。C-β分支鏈胺基酸之實例包括例如I、T及V。
本說明書之態樣部分地揭示凝血酶裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「凝血酶裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於凝血酶蛋白酶活性之條件下經凝血酶在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經凝血酶裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但凝血酶裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 113)，其中X1優先為S、T、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為任何胺基酸；X3優先為F、S、T、醯胺態胺基酸(如N或Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4優先為S、T、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X5、X6及X7獨立地為任何胺基酸。表4列出凝血酶之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 114-123)。其他凝血酶裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如O. Schilling及C. M. OVerall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings，等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings，等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings，等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含凝血酶裂解位點。在此實施例之一態樣中，凝血酶裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 113，其中X1為S、T、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為任何胺基酸；X3為F、S、T、醯胺態胺基酸(如N或Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為S、T、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X5、X6及X7獨立地為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，凝血酶裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 113，其中X1為S、Q、K或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為N、Q、G、P、A、V、L或I；X4為S、T、H、G、A、L或I；X5為S、T、Q、K、R、F、Y、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為S、T、Q、K、R、G、P、A、V、L或I；且X7為S、T、Q、K、R、G、P、A、V、L或I。在此實施例之另一態樣中，凝血酶裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 113，其中X1為Q、G、P、A、V、L、I或M；X2為S、T、D、E、G、A、V或I；X3為G、P、A、V或L；X4為S、G、A或L；X5為Q、K、F、A、V或L；X6為S、Q、K、R、G、P、V或L；且X7為S、T、K、G、V、L或I。在此實施例之其他態樣中，凝血酶裂解位點包含例如SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122或SEQ ID NO: 123。
本說明書之態樣部分地揭示纖維蛋白溶酶裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「纖維蛋白溶酶裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於纖維蛋白溶酶蛋白酶活性之條件下經纖維蛋白溶酶在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經纖維蛋白溶酶裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。纖維蛋白溶酶以與胰蛋白酶類似之特異性催化Lys|及Arg|鍵的裂解。然而，纖維蛋白溶酶為效率比胰蛋白酶低得多之酶，且僅裂解蛋白質中之一些此等鍵。胰蛋白酶主要在胺基酸離胺酸或精胺酸之羧基側處裂解肽鏈，除非當離胺酸或精胺酸之後為脯胺酸時。
本說明書之態樣部分地揭示凝血因子VIIa裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「凝血因子VIIa裂解位點」或「FVIIa裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於FVIIa蛋白酶活性之條件下經FVIIa在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經FVIIa裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但FVIIa裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 124)，其中X1優先為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、鹼性胺基酸(如K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為Q、S、T、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為Q、S、T、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4、X5、X6及X7獨立地為任何胺基酸。表4列出FVIIa之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 125-133)。其他FVIIa裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如J. H. Morrissey,Coagulation Factor VIIa,HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES，第1659-1662頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；Elsevier,London，第2版，2004)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat.Biotechnol. 26:685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含凝血因子VIIa裂解位點。在此實施例之一態樣中，凝血因子VIIa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 124，其中X1為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、鹼性胺基酸(如K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為Q、S、T、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為Q、S、T、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X4、X5、X6及X7獨立地為任何胺基酸。在此實施例之其他態樣中，凝血因子VIIa裂解位點包含例如SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132或SEQ ID NO: 133。
本說明書之態樣部分地揭示凝血因子IXa裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「凝血因子IXa裂解位點」或「FIXa裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於FIXa蛋白酶活性之條件下經FIXa在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經FIXa裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但FIXa裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 134)，其中X1優先為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2優先為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為S、T、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X4、X5、X6及X7獨立地為任何胺基酸。表4列出FIXa之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 135-138)。其他FIXa裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如A. T. Thompson,Molecular Biology of Factor IX,HEMOSTASIS AND THROMBOSIS,BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE，第128-129頁(R. W. Colman,J. Hirsh,V. J. Marder,A. W Clowes,J. N. George編；Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA，第2版，2001)；S. Kawabata及S. Iwanaga,Russellysin,HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES，第683-684頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；Elsevier,London，第2版，2004)；A. E. Schmidt及S. P. Bajaj,Coagulation factor IXa,HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES，第1655-1659頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；Elsevier,London，第2版，2004)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含凝血因子IXa裂解位點。在此實施例之一態樣中，凝血因子IXa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 134，其中X1為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為S、T、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X4、X5、X6及X7獨立地為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，凝血因子IXa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 134，其中X1為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為S、T、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4、X5、X6及X7獨立地為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之其他態樣中，凝血因子IXa裂解位點包含例如SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137或SEQ ID NO: 138。
本說明書之態樣部分地揭示凝血因子Xa裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「凝血因子Xa裂解位點」或「FXa裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於FXa蛋白酶活性之條件下經FXa在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經FXa裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但FXa裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 139)，其中X1為任何胺基酸；X2優先為G、A、S、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、或芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)；X3優先為芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4優先為醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5、X6及X7獨立地為任何胺基酸。表4列出FXa之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 140-155)。其他FXa裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如D. L. Greenberg及E. W. Davie,Blood Coagulation Factors: Their Complementary DNAs,Genes,and Expression,HEMOSTASIS AND THROMBOSIS,BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE，第34-35頁(R. W. Colman,J. Hirsh,V. J. Marder,A. W Clowes,J. N. George編；Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA，第2版，2001)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含凝血因子Xa裂解位點。在此實施例之一態樣中，凝血因子Xa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 139，其中X1為任何胺基酸；X2為G、A、S、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、或芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)；X3為芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5、X6及X7獨立地為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，凝血因子Xa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 139，其中X1為E、F、P、A、L或I；X2為S、Q、D、E、F、G或A；X3為F、G或P；X4為S、T、L或I；X5為S、F、A或V；X6為S、T、E、N、H、G、A或M；且X7為S、N、D、Q、K、R或G。在此實施例之另一態樣中，凝血因子Xa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 139，其中X1為I或A；X2為E或F；X3為F、G或P；X4為S、T或I；X5為S、F或V；X6為E或G；且X7為S或G。在此實施例之其他態樣中，凝血因子Xa裂解位點包含例如胺基酸序列SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154或SEQ ID NO: 155。
本說明書之態樣部分地揭示凝血因子XIa裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「凝血因子XIa裂解位點」或「FXIa裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於FXIa蛋白酶活性之條件下經FXIa在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經FXIa裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但FXIa裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 156)，其中X1優先為酸性胺基酸(如D或E)、鹼性胺基酸(如K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2優先為酸性胺基酸(如D或E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為H、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4優先為H、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5優先為酸性胺基酸(如D及E)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6優先為醯胺態胺基酸(如Q及N)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X7優先為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。表4列出FXIa之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 157-166)。其他FXIa裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如P. N. Walsh,Coagulation Factor XIa,Handbook of Proteolytic Enzymes，第1651-1655頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；Elsevier,London，第2版，2004)；O. Schilling及C. M .Overall,Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人,MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含凝血因子XIa裂解位點。在此實施例之一態樣中，凝血因子XIa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 156，其中X1為酸性胺基酸(如D或E)、鹼性胺基酸(如K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為酸性胺基酸(如D或E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為H、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為H、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5為酸性胺基酸(如D及E)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為醯胺態胺基酸(如Q及N)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X7為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，凝血因子XIa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 156，其中X1為酸性胺基酸(如D或E)、或鹼性胺基酸(如K及R)；X2為芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5為酸性胺基酸(如D及E)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X7為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，凝血因子XIa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 156，其中X1為D或K；X2為F或L；X3為T或P；X4為A或V；X5為E或V；X6為T或G；且X7為G或V。在此實施例之其他態樣中，凝血因子XIa裂解位點包含例如SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165或SEQ ID NO: 166。
本說明書之態樣部分地揭示凝血因子XIIa裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「凝血因子XIIa裂解位點」或「FXIIa裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於FXIIa蛋白酶活性之條件下經FXIIa在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經FXIIa裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但FXIIa裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 167)，其中X1優先為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2優先為酸性胺基酸(如D及E)、鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5優先為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X7優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。表4列出FXIIa之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 168-172)。其他FXIIa裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如O. D. Ratnoff,Coagulation Factor XIIa,Handbook of Proteolytic Enzymes，第1642-1644頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；Elsevier,London，第2版，2004)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide L ibraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含凝血因子XIIa裂解位點。在此實施例之一態樣中，凝血因子XIIa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 167，其中X1為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為酸性胺基酸(如D及E)、鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X7為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之其他態樣中，凝血因子XIIa裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 167，其中X1為S、T、P或I；X2為Q、K、S或M；X3為K、T、G或P；X4為L、I或V；X5為T或V；X6為G或L；且X7為G。在此實施例之其他態樣中，凝血因子XIIa裂解位點包含例如SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171或SEQ ID NO: 172。
本說明書之態樣部分地揭示激肽釋放素1裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「激肽釋放素1裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於激肽釋放素1蛋白酶活性之條件下經激肽釋放素1在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經激肽釋放素1裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但激肽釋放素1裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3X4*(R/K/S)X5X6X7(SEQ ID NO: 173)，其中X1優先為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為任何胺基酸；X3為任何胺基酸；X4優先為帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、大型非極性胺基酸(如F、I、L、M及V)、或芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)；X5為任何胺基酸；X6為任何胺基酸；且X7為任何胺基酸。表4列出激肽釋放素1之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 174-198)。其他激肽釋放素1裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如R. W. Colman,Contact Activation Pathway: Inflammation,Fibrinolytic,Anticoagulant,Antiadhesive, and Antiangiogenic Activities,HEMOSTASIS AND THROMBOSIS,BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE，第103-104頁(R. W. Colman,J. Hirsh,V. J. Marder,A. W Clowes,J. N. George編；Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA，第2版，2001)；J. Chao,Human Kallikrein 1,Tissue Kallikrein,Handbook of Proteolytic Enzymes，第1577-1580頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；E1sevier,London，第2版，2004)；H. X. Li等人，Substrate Specificity of Human Kallikreins 1 and 6 Determined by Phage Display,Protein Sci. 17: 664-672(2008)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含激肽釋放素1裂解位點。在此實施例之一態樣中，激肽釋放素1裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 173，其中X1為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為任何胺基酸；X3為任何胺基酸；X4為帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、大型非極性胺基酸(如F、I、L、M及V)、或芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)；X5為任何胺基酸；X6為任何胺基酸；且X7為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，激肽釋放素1裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 173，其中X1為D、S、T、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為S、T、A、P或V；X3為S、F或L；X4為R或芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)；X5為R、S、T或A；X6為R、S或G；且X7為R、G或A。在此實施例之其他態樣中，激肽釋放素1裂解位點包含例如SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197或SEQ ID NO: 198。
本說明書之態樣部分地揭示蛋白C裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「蛋白C裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於蛋白C蛋白酶活性之條件下經蛋白C在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經蛋白C裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但蛋白C裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 199)，其中X1優先為鹼性胺基酸(如K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2優先為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4優先為醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5優先為醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6優先為醯胺態胺基酸(如Q及N)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)；X7優先為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。表4列出蛋白C之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 200-209)。其他蛋白C裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如L. Shen及B. Dahiback,Protein C,Handbook of Proteolytic Enzymes，第1673-1677頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；Elsevier,London，第2版，2004)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavagesin the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含蛋白C裂解位點。在此實施例之一態樣中，蛋白C裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 199，其中X1為鹼性胺基酸(如K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3及X4獨立地為醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5為醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為醯胺態胺基酸(如Q及N)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)；X7為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如Q及N)、鹼性胺基酸(如K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，蛋白C裂解位點包含序列SEQ ID NO: 199，其中X1為K、R或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為D、E、Q、N或K；X3為P、L、T、Q、K或R；X4為G、I、S、N或K；X5為Q、N、K、F或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為F、S、N、Q、K或H；X7為L、I、T、K、D、E、Q或N。在此實施例之其他態樣中，蛋白C裂解位點包含例如SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208或SEQ ID NO: 209。
本說明書之態樣部分地揭示纖維蛋白溶酶原裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「纖維蛋白溶酶原裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於纖維蛋白溶酶原蛋白酶活性之條件下經纖維蛋白溶酶原在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經纖維蛋白溶酶原裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但纖維蛋白溶酶原裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 210)，其中X1優先為帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2優先為醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4優先為帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5優先為帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為任何胺基酸；X7優先為H、F、Y、R、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。表4列出纖維蛋白溶酶原之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 211-240)。其他纖維蛋白溶酶原裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含纖維蛋白溶酶原裂解位點。在此實施例之一態樣中，纖維蛋白溶酶原裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 211，其中X1為帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5為帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為任何胺基酸；X7為H、F、Y、R、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，纖維蛋白溶酶原裂解位點包含序列SEQ ID NO: 211，其中X1為K、R、S、T、A、G、L或P；X2為D、E、Q、N、K、R、S、T、A、G、I或L；X3為N、Q、S、F、Y、A或L；X4為K、R、S、A、G、L或V；X5為K、R、N、S、F、Y、A、I、L、P或V；X6為K、R、N、S、F、Y、A、G、L、P或V；X7為R、S、T、F、Y、A、G、I、L或P。在此實施例之其他態樣中，纖維蛋白溶酶原裂解位點包含例如SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 220、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 222、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 234、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 238、SEQ ID NO: 239或SEQ ID NO: 240。
本說明書之態樣部分地揭示基質金屬蛋白酶-2裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「基質金屬蛋白酶-2裂解位點」或「MMP-2裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於MMP-2蛋白酶活性之條件下經MMP-2在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經MMP-2裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但MMP-2裂解位點之一般化共同序列為X1(P/A/V/L/I)X2X3*(V/L/I/F/Q)X4X5X6(SEQ ID NO: 241)，其中X1、X2、X3、X4、X5及X6為任何胺基酸。表4列出MMP-2之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO:242-273)。其他MMP-2裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如O. Schilling及C. M. OVerall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS:The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含基質金屬蛋白酶-2裂解位點。在此實施例之一態樣中，基質金屬蛋白酶-2裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 241，其中X1、X2、X3、X4、X5及X6為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，基質金屬蛋白酶-2裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 241，其中X1為酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為酸性胺基酸(如D及E)、鹼性胺基酸(如K及R)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為H、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為鹼性胺基酸(如K及R)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5為酸性胺基酸(如D及E)、鹼性胺基酸(如K及R)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為酸性胺基酸(如D及E)、鹼性胺基酸(如K及R)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，基質金屬蛋白酶-2裂解位點包含序列SEQ ID NO: 241，其中X1為G、P、A、V、L、I、S、T、E或Q；X2為G、A、L、S、N、Q、W或K；X3為G、P、A、S、Q、D、E或H；X4為G、A、V、L、I、F、S、T、Q或K；X5為G、A、V、S、T、Q或K；X6為G、P、A、V、L、I、S、T、D、E、K、N或Q。在此實施例之另一態樣中，基質金屬蛋白酶-2裂解位點包含序列SEQ ID NO: 241，其中X1為G、A或L或Q；X2為G、A或S；X3為G、A、S或N；X4為A、V、L、I或K；X5為G、A或S；X6為G、P、A、V、L或D。在此實施例之其他態樣中，基質金屬蛋白酶-2裂解位點包含例如SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 244、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 246、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 248、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 250、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 252、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 254、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 256、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 258、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 260、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 262、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 264、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 266、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 270、SEQ ID NO: 271、SEQ ID NO: 272或SEQ ID NO: 273。
本說明書之態樣部分地揭示基質金屬蛋白酶-9裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「基質金屬蛋白酶-9裂解位點」或「MMP-2裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於MMP-9蛋白酶活性之條件下經MMP-9在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經MMP-9裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但MMP-9裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3X4*X5X6X7X8(SEQ ID NO: 274)，其中X1優先為F、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2優先為F、Y、S、T、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為F、Y、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為任何胺基酸；X5優先為S、T、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為任何胺基酸；X7為任何胺基酸；X8優先為F、Y、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。表4列出MMP-9之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 275-319)。其他MMP-9裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如S. L. Kridel等人，Substrate Hydrolysis by Matrix Metalloproteinase-9,J. Biol. Chem. 276: 20572-20578(2001)；E. Y. Zhen等人，Characterization of Metalloprotease Cleavage Products of Human Articular Cartilage,Arthritis Rheum. 58: 2420-2431(2008)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含基質金屬蛋白酶-9裂解位點。在此實施例之一態樣中，基質金屬蛋白酶-9裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 274，其中X1為F、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為F、Y、S、T、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為F、Y、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為任何胺基酸；X5為S、T、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為任何胺基酸；X7為任何胺基酸；X8為F、Y、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，基質金屬蛋白酶-9裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 274，其中X1為G、V、L、I、F、S、Q、K或R；X2為P、A、V、L、I或S；X3為G、P、A、V、L、S、Q、E、K或R；X4為G、P、A、V、L、F、S、N、E或K；X5為A、V、L、I、M、F、S、Q或K；X6為P、A、V、L、I、S、T、Q、E、K或R；X7為G、A、V、L、S或T；X8為G、P、A、V、L、F、T、D、E、K或R。在此實施例之另一態樣中，基質金屬蛋白酶-9裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 274，其中X1為G或L；X2為P、A或V；X3為P、A、R、K或S；X4為G；X5為A、V、L或I；X6為T、Q、K或R；X7為G、A或S；X8為G、P、A、V或E。在此實施例之其他態樣中，基質金屬蛋白酶-9裂解位點包含例如SEQ ID NO: 275、SEQ ID NO: 276、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 278、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 280、SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 282、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 284、SEQ ID NO: 285、SEQ ID NO: 286、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 288、SEQ ID NO: 289、SEQ ID NO: 290、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 292、SEQ ID NO: 293、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 296、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 298、SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 302、SEQ ID NO: 303、SEQ ID NO: 304、SEQ ID NO: 305、SEQ ID NO: 306、SEQ ID NO: 307、SEQ ID NO: 308、SEQ ID NO: 309、SEQ ID NO: 310、SEQ ID NO: 311、SEQ ID NO: 312、SEQ ID NO: 313、SEQ ID NO: 314、SEQ ID NO: 315、SEQ ID NO: 316、SEQ ID NO: 317、SEQ ID NO: 318或SEQ ID NO: 319。
本說明書之態樣部分地揭示弗林蛋白酶裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「弗林蛋白酶裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於弗林蛋白酶蛋白酶活性之條件下經弗林蛋白酶在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經弗林蛋白酶裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但弗林蛋白酶裂解位點之一般化共同序列為(R/I/A)X1(R/K/A/P)R*X2*X3X4X5(SEQ ID NO: 320)，其中X1、X2、X3、X4及X5為任何胺基酸。表4列出弗林蛋白酶之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 321-346)。其他弗林蛋白酶裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如A. Basak等人，Implication of the Proprotein Convertases Furin,PC5 And PC7 in the Cleavage of Surface Glycoproteins of Hong Kong,Ebola and Respiratory Syncytial Viruses: A Comparative Analysis with Fluorogenic Peptides,Biochem. J. 353: 537-545(2001)；O. Bader等人，Processing of Predicted Substrates of Fungal Kex2 Proteinases from Candida albicans,C. glabrata,Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris,BMC Microbiol. 8: 116(2008)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含弗林蛋白酶裂解位點。在此實施例之一態樣中，弗林蛋白酶裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 320，其中X1、X2、X3、X4及X5為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，弗林蛋白酶裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 320，其中X1為F、S、T、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為G、P、M、F、Y、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或不帶電荷胺基酸(如C、S及T)；X3為G、P、A、V、L、I、F、W、S、T、N、Q、D、H、K或R；X4為F、Y、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X5為F、Y、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，弗林蛋白酶裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 320，其中X1為K、R、S或T；X2為D、E、S、A或G；X3為A、V、L或I；且X4為S、G、D、E或R；且X5為G、P、A、S、T、Q、D或E。在此實施例之其他態樣中，弗林蛋白酶裂解位點包含例如SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 322、SEQ ID NO: 323、SEQ ID NO: 324、SEQ ID NO: 325、SEQ ID NO: 326、SEQ ID NO: 327、SEQ ID NO: 328、SEQ ID NO: 329、SEQ ID NO: 330、SEQ ID NO: 331、SEQ ID NO: 332、SEQ ID NO: 333、SEQ ID NO: 334、SEQ ID NO: 335、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 337、SEQ ID NO: 338、SEQ ID NO: 339、SEQ ID NO: 340、SEQ ID NO: 341、SEQ ID NO: 342、SEQ ID NO: 343、SEQ ID NO: 344、SEQ ID NO: 345或SEQ ID NO: 346。
本說明書之態樣部分地揭示u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點」或「u-PA裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於u-PA蛋白酶活性之條件下經u-PA在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但u-PA裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4*X5X6X7(SEQ ID NO: 347)，其中X1為任何胺基酸；X2優先為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為任何胺基酸；X5優先為鹼性胺基酸(如K及R)、芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6優先為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X7為任何胺基酸。表4列出u-PA之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 347-368)。其他u-PA裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如V. Ellis,u-Plasminogen Activator,Handbook of Proteolytic Enzymes，第1677-1683頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；Elsevier,London，第2版，2004)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點。在此實施例之一態樣中，u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 347，其中X1為任何胺基酸；X2為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為任何胺基酸；X5為鹼性胺基酸(如K及R)、芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X7為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 347，其中X1為P、A、L、S、T、C、N或R；X2為G、P、L、Y、S或T；X3為G、A、S或N；且X4為G、A、V、I、Y、S或R；X5為P、V、L、F或R；X6為G、A、V、Y、S或T；且X7為G、V、L、F、Y、N或H。在此實施例之另一態樣中，u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 347，其中X1為P、A、L、S、T、C、N或R；X2為G、Y或S；X3為G或S；且X4為G、A、V、I、Y、S或R；X5為V或R；X6為T或Y；且X7為G、V、L、F、Y、N或H。在此實施例之其他態樣中，u-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點包含例如SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 349、NO: 350、SEQ ID NO: 351、SEQ ID NO: 352、SEQ ID NO: 353、SEQ ID NO: 354、SEQ ID NO: 355、orSEQ ID NO: 356、SEQ ID NO: 357、SEQ ID NO: 358、SEQ ID NO: 359、SEQ ID NO: 360、SEQ ID NO: 361、SEQ ID NO: 362、SEQ ID NO: 363、SEQ ID NO: 364、SEQ ID NO: 365、SEQ ID NO: 366、SEQ ID NO: 367或SEQ ID NO: 368。
本說明書之態樣部分地揭示t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點」或「t-PA裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於t-PA蛋白酶活性之條件下經t-PA在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經t-PA裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但t-PA裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(R/K)*X4*X5X6X7(SEQ ID NO: 369)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7為任何胺基酸。表4列出t-PA之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 370-373)。其他t-PA裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如H. R. Lijnen及D. Collen,t-Plasminogen Activator,Handbook of Proteolytic Enzymes，第1684-1689頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；Elsevier,London，第2版，2004)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點。在此實施例之一態樣中，t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 369，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 369，其中X1為醯胺態胺基酸(如N及Q)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為醯胺態胺基酸(如N及Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為醯胺態胺基酸(如N及Q)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5為鹼性胺基酸(如K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X7為酸性胺基酸(如D及E)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 369，其中X1為A、P、C或N；X2為A、L、P或Q；X3為G、L、S或F；X4為I、V、M或Y；X5為A、V或K；X6為G、V或P；且X7為G、L或D。在此實施例之其他態樣中，t-纖維蛋白溶酶原活化因子裂解位點包含例如SEQ ID NO: 370、SEQ ID NO: 371、SEQ ID NO: 372或SEQ ID NO: 373。
本說明書之態樣部分地揭示類胰蛋白酶-ε裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「類胰蛋白酶-ε裂解位點」或「Prosemin裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於類胰蛋白酶-ε蛋白酶活性之條件下經類胰蛋白酶-ε在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經類胰蛋白酶-ε裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但類胰蛋白酶-ε裂解位點之一般化共同序列為*(R/K)X1X2X3X4(D/E)(SEQ ID NO: 374)，其中X1、X2、X3及X4獨立地為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。表4列出類胰蛋白酶-ε之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 375-386)。其他類胰蛋白酶-ε裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含類胰蛋白酶-ε裂解位點。在此實施例之一態樣中，類胰蛋白酶-ε裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 374，其中X1、X2、X3及X4獨立地為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之一態樣中，類胰蛋白酶-ε裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 374，其中X1為I或V；X2為I或V；X3為G或S；X4為G或S。在此實施例之其他態樣中，類胰蛋白酶-ε裂解位點包含例如SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 376、SEQ ID NO: 377、SEQ ID NO: 378、SEQ ID NO: 379、SEQ ID NO: 380、SEQ ID NO: 381、SEQ ID NO: 382、SEQ ID NO: 383、SEQ ID NO: 384、SEQ ID NO: 385或SEQ ID NO: 386。
本說明書之態樣部分地揭示小鼠肥大細胞蛋白酶-7裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「小鼠肥大細胞蛋白酶-7裂解位點」或「mMCP-7裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於mMCP-7蛋白酶活性之條件下經mMCP-7在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經mMCP-7裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但mMCP-7裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3(K/R)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 387)，其中X1為任何胺基酸；X2優先為醯胺態胺基酸(如N或Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X4、X5、X6、X7為任何胺基酸。表4列出mMMCP-7之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 388-391)。其他mMMCP-7裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含小鼠肥大細胞蛋白酶-7裂解位點。在此實施例之一態樣中，小鼠肥大細胞蛋白酶-7裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 387，其中X1為任何胺基酸；X2為醯胺態胺基酸(如N或Q)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X4、X5、X6、X7獨立地為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，小鼠肥大細胞蛋白酶-7裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 387，其中X1為任何胺基酸；X2為G、S或Q；X3為A、P或S；且X4、X5、X6、X7為任何胺基酸。在此實施例之其他態樣中，小鼠肥大細胞蛋白酶-7裂解位點包含例如SEQ ID NO: 388、SEQ ID NO: 389、SEQ ID NO: 390或SEQ ID NO: 391。
本說明書之態樣部分地揭示內皮素轉化酶-1裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「內皮素轉化酶-1裂解位點」或「ECE-1裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於ECE-1蛋白酶活性之條件下經ECE-1在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經ECE-1裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但ECE-1裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3X4*(F/L/I/V/Y)5X6X7(SEQ ID NO: 392)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7為任何胺基酸。表4列出ECE-1之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 393-412)。其他ECE-1裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如K. Ahn及G. D. Johnson,Endothelin-Converting Enzyme-1,Handbook of Proteolytic Enzymes，第429-434頁(A. J. Barrett,N. D. Rawlings及J. F. Woessner編；Elsevier,London，第2版，2004)；O. Schilling 及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含內皮素轉化酶-1裂解位點。在此實施例之一態樣中，內皮素轉化酶-1裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 392，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6及X7獨立地為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，內皮素轉化酶-1裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 392，其中X1為G、P、Y、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或不帶電荷胺基酸(如C、S及T)；X2為F、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為S、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為S、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X5為F、W、S、C、N、E、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為G、P、V、L、F、Y、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或不帶電荷胺基酸(如C、S及T)；且X7為P、A、V、L、M、F、Y、S、N、D或K。在此實施例之另一態樣中，內皮素轉化酶-1裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 392，其中X1為G、P、Y、C、D、K、R或H；X2為P、L、I、F、S、C、Q、D、R或H；X3為V、L、I、S、Q、K或R；X4為G、P、L、F、Y、W或R；X5為V、I、M、F、N、R或H；X6為P、L、F、T、E或H；且X7為P、V、L、F、S、N、D或K。在此實施例之另一態樣中，內皮素轉化酶-1裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 392，其中X1為G、D或H；X2為I或F；X3為V、I、S、Q或K；X4為P、F或W；X5為I、N、R或H；X6為L、T或H；且X7為P、S或D。在此實施例之其他態樣中，內皮素轉化酶-1裂解位點包含例如SEQ ID NO: 393、SEQ ID NO: 394、SEQ ID NO: 395、SEQ ID NO: 396、SEQ ID NO: 397、SEQ ID NO: 398、SEQ ID NO: 399、SEQ ID NO: 400、SEQ ID NO: 401、SEQ ID NO: 402、SEQ ID NO: 403、SEQ ID NO: 404、SEQ ID NO: 405、SEQ ID NO: 406、SEQ ID NO: 407、SEQ ID NO: 408、SEQ ID NO: 409、SEQ ID NO: 410、SEQ ID NO: 411或SEQ ID NO: 412。
本說明書之態樣部分地揭示凱爾血型蛋白裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「凱爾血型蛋白裂解位點」或「KBGP裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於KBGP蛋白酶活性之條件下經KBGP在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經KBGP裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但KBGP裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3X4*X5X6X7X8(SEQ ID NO: 413)，其中X1優先為酸性胺基酸(如D及E)；X2優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4優先為芳族胺基酸(如F、W及Y)；X5優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6優先為醯胺態胺基酸(如N及Q)；X7為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)；X8優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。表4列出KBGP之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 414-415)。其他KBGP裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含凱爾血型蛋白裂解位點。在此實施例之一態樣中，凱爾血型蛋白裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 413，其中X1為酸性胺基酸(如D及E)；X2為T或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為芳族胺基酸(如F、W及Y)；X5為T或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X6為醯胺態胺基酸(如N及Q)；X7為不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或C-β分支鏈胺基酸(如I、V或T)；X8為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，凱爾血型蛋白裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 413，其中X1為為D；X2為I、V或T；X3為I、V或T；X4為W；X5為I、V或T；X6為N；X7為T；X8為P。在此實施例之其他態樣中，凱爾血型蛋白裂解位點包含例如SEQ ID NO: 414或SEQ ID NO: 415。
本說明書之態樣部分地揭示組織蛋白酶L裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「組織蛋白酶L裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於組織蛋白酶L蛋白酶活性之條件下經組織蛋白酶L在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經組織蛋白酶L裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但組織蛋白酶L裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3X4*X5X6X7X8(SEQ ID NO: 416)，其中X1優先為W、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為任何胺基酸；X3優先為L、V、F或Y；且X4、X5、X6、X7及X8為任何胺基酸。表4列出組織蛋白酶L之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 417-443)。其他組織蛋白酶L裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。參見例如J. C. Kelly等人，Profiling of Calpain Activity with a Series of FRET-Based Substrates,Biochim. Biophys. Acta 1794: 1505-1509(2009)；O. Schilling及C. M. Overall,Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database,Nucleic Acids Res. 36(資料庫特刊)：D320-D325(2008)；Neil D. Rawlings等人，MEROPS: The Peptidase Database，Nucleic Acids Res. 38(資料庫特刊)：D227-D233(2010)；Neil D. Rawlings等人，A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database，付梓中之資料庫(2010)，各者皆以全文引用的方式併入本文中。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含組織蛋白酶L裂解位點。在此實施例之一態樣中，組織蛋白酶L裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 416，其中X1為W、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、不帶電荷胺基酸(如C、S及T)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X2為任何胺基酸；X3為L、V、F或Y；且X4、X5、X6、X7及X8為任何胺基酸。在此實施例之另一態樣中，組織蛋白酶L裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 416，其中X1為G、P、A、L、Q、E或K；X2為芳族胺基酸(如F、W及Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X3為L、V、F或Y；X4為G、A、F、T、Q、E、K或R；X5為G、A、S、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、或帶正電荷胺基酸(如H、K及R)；X6為P、A、L、I、S、Q、酸性胺基酸(如D及E)、或帶正電荷胺基酸(如H、K及R)；X7為帶正電荷胺基酸(如H、K及R)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X8為P、L、S、T、酸性胺基酸(如D及E)、醯胺態胺基酸(如N及Q)、或鹼性胺基酸(如K及R)。在此實施例之另一態樣中，組織蛋白酶L裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 416，其中X1為G、A、Q、E或K；X2為G、P、L或F；X3為L、V、F或Y；X4為G、A、F、T、Q、E、K或R；X5為A、S、Q、E、K或R；X6為P、A、L、I、S或E；X7為P、L或R；且X8為P、L、S或K。在此實施例之其他態樣中，組織蛋白酶L裂解位點包含例如SEQ ID NO: 417、SEQ ID NO: 418、SEQ ID NO: 419、SEQ ID NO: 420、SEQ ID NO: 421、SEQ ID NO: 422、SEQ ID NO: 423、SEQ ID NO: 424、SEQ ID NO: 425、SEQ ID NO: 426、SEQ ID NO: 427、SEQ ID NO: 428、SEQ ID NO: 429、SEQ ID NO: 430、SEQ ID NO: 431、SEQ ID NO: 432、SEQ ID NO: 433、SEQ ID NO: 434、SEQ ID NO: 435、SEQ ID NO: 436、SEQ ID NO: 437、SEQ ID NO: 438、SEQ ID NO: 439、SEQ ID NO: 440、SEQ ID NO: 441、SEQ ID NO: 442或SEQ ID NO: 443。
本說明書之態樣部分地揭示PAR1裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「PAR1裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於PAR1蛋白酶活性之條件下經PAR1在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經PAR1裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但PAR1裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3X4(K/R)X5(SEQ ID NO: 444)，其中X1優先為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X2優先為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)或芳族胺基酸(如F、H、W或Y)；X3優先為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)、或芳族胺基酸(如F、H、W或Y)；X4優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X5優先為醯胺態胺基酸(如N及Q)、或芳族疏水性胺基酸(如F、W或Y)。表4列出PAR1之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 445-452)。其他PAR1裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含PAR1裂解位點。在此實施例之一態樣中，PAR1裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 444，其中X1為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X2為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)、或芳族胺基酸(如F、H、W或Y)；X3為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)、或芳族胺基酸(如F、H、W或Y)；X4為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X5為醯胺態胺基酸(如N及Q)、或芳族疏水性胺基酸(如F、W或Y)。在此實施例之另一態樣中，PAR1裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 444，其中X1為S、T或G；X2為F或Y；X3為L、P或F；X4為A、G、I或L；且X5為F或N。在此實施例之其他態樣中，PAR1裂解位點包含例如SEQ ID NO: 445、SEQ ID NO: 446、SEQ ID NO: 447、SEQ ID NO: 448、SEQ ID NO: 449、SEQ ID NO: 450、SEQ ID NO: 451或SEQ ID NO: 452。
本說明書之態樣部分地揭示PAR2裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「PAR2裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於PAR2蛋白酶活性之條件下經PAR2在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經PAR2裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但PAR2裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3X4(K/R)X5(SEQ ID NO: 453)，其中X1優先為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X2優先為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)；X3優先為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)；X4優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X5優先為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)。表4列出PAR2之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 454-455)。其他PAR2裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含PAR2裂解位點。在此實施例之一態樣中，PAR2裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 453，其中X1為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X2為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)；X3為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)；X4為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X5為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)。在此實施例之另一態樣中，PAR2裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 453，其中X1為S；X2為I或L；X3為I或L；X4為A或G；X5為L或V。在此實施例之其他態樣中，PAR2裂解位點包含例如SEQ ID NO: 454或SEQ ID NO: 455。
本說明書之態樣部分地揭示PAR3裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「PAR3裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於PAR3蛋白酶活性之條件下經PAR3在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經PAR3裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但PAR3裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 456)，其中X1優先為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X2優先為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)；X3優先為醯胺態胺基酸(如N及Q)、或鹼性胺基酸(如K及R)；X4優先為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X5優先為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)、小型極性胺基酸(如D、N或P)；且X6優先為酸性胺基酸(如D及E)、或小型極性胺基酸(如D、N或P)。表4列出PAR3之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 457-459)。其他PAR3裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含PAR3裂解位點。在此實施例之一態樣中，PAR3裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 456，其中X1為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X2為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)；X3為醯胺態胺基酸(如N及Q)、或鹼性胺基酸(如K及R)；X4為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X5為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)、或小型極性胺基酸(如D、N或P)；且X6為酸性胺基酸(如D及E)、或小型極性胺基酸(如D、N或P)。在此實施例之另一態樣中，PAR3裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 456，其中X1為S或T；X2為F；X3為N或R；X4為A或G；X5為A、G或N且X6為P或E。在此實施例之其他態樣中，PAR3裂解位點包含例如SEQ ID NO: 457、SEQ ID NO: 458或SEQ ID NO: 459。
本說明書之態樣部分地揭示PAR4裂解位點作為不活化裂解位點。如本文所用，術語「PAR4裂解位點」係指連同鄰近識別元件或非鄰近識別元件或兩者一起之易裂鍵，該等識別元件足以在適於PAR4蛋白酶活性之條件下經PAR4在該易裂鍵處發生可偵測的蛋白水解。設想經PAR4裂解之任何胺基酸序列皆可適用於本說明書之態樣中。儘管已知例外，但PAR4裂解位點之一般化共同序列為X1X2X3X4(K/R/Q/F)X5(SEQ ID NO: 460)，其中X1優先為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X2優先為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)或芳族胺基酸(如F、H、W或Y)；X3優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4優先為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X5優先為鹼性胺基酸(如K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W或Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。表4列出PAR4之例示性參考裂解位點(SEQ ID NO: 461-478)。其他PAR4裂解位點在此項技術中為熟知的或可藉由常規方法確定。
因此，在一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含PAR4裂解位點。在此實施例之一態樣中，PAR4裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 460，其中X1為小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)；X2為大型非極性胺基酸(如F、I、L、M、V)、或芳族胺基酸(如F、H、W或Y)；X3為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；X4為脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)；且X5為鹼性胺基酸(如K及R)、芳族疏水性胺基酸(如F、W或Y)、或脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在此實施例之另一態樣中，PAR4裂解位點包含共同序列SEQ ID NO: 460，其中X1為A、G、S或T；X2為F或Y；X3為A或P；X4為A或G；且X5為A、V、P、F、W、Y或K。在此實施例之其他態樣中，PAR4裂解位點包含例如SEQ ID NO: 461、SEQ ID NO: 462、SEQ ID NO: 463、SEQ ID NO: 464、SEQ ID NO: 465、SEQ ID NO: 466、SEQ ID NO: 467、SEQ ID NO: 468、SEQ ID NO: 469、SEQ ID NO: 470、SEQ ID NO: 471、SEQ ID NO: 472、SEQ ID NO: 473、SEQ ID NO: 474、SEQ ID NO: 475、SEQ ID NO: 476、SEQ ID NO: 477或SEQ ID NO: 478。
不活化裂解位點之位置為受若干準則控管之關鍵態樣。首先，不活化裂解位點之置放不應實質上影響梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物使其目標細胞中毒之能力。如本文所用，關於中毒之術語「不實質上影響」係指本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物仍然可執行梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物藉以進入目標細胞並使目標受質蛋白水解裂解且涵蓋以下各者的總體中毒機制：梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物與低或高親和力受體複合物結合、毒素/受體複合物內化、輕鏈易位至細胞質中及目標受質之酶修飾。
在此實施例之一態樣中，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物使目標細胞中毒的程度可與相同或類似但無該不活化裂解位點修飾之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物相同。在此實施例之其他態樣中，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物使目標細胞中毒的程度可為相同或類似但無該不活化裂解位點修飾之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之例如至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。在此實施例之其他態樣中，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物使目標細胞中毒的程度可為相同或類似但無該不活化裂解位點修飾之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之例如至多50%、60%、70%、80%、90%或95%。其次，不活化裂解位點之置放應在毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之表面暴露區域處且不應包埋在蛋白質內部或經二級結構元件遮蔽。不活化裂解位點之適當表面暴露會促進位點為其相應蛋白酶適當接近，藉此能夠進行蛋白水解裂解。不活化裂解位點經其相應蛋白酶蛋白水解裂解實質上使梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物使細胞中毒之能力不活化。如本文所用，關於中毒之術語「實質上不活化」係指在不活化裂解位點處裂解之後，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物執行梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物藉以進入目標細胞並使目標受質蛋白水解裂解且涵蓋以下各者之總體中毒機制的能力降低：梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物與低或高親和力受體複合物結合、毒素/受體複合物內化、輕鏈易位至細胞質中及目標受質之酶修飾。
在此實施例之一態樣中，相較於相同或類似但處於未蛋白水解裂解狀態(亦即中毒裂解位點完整或未裂解)之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物在不活化裂解位點處蛋白水解裂解使毒素完全不能使目標細胞中毒。在此實施例之其他態樣中，相較於相同或類似但處於未蛋白水解裂解狀態之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物在不活化裂解位點處蛋白水解裂解使其使目標細胞中毒之能力減小例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在此實施例之其他態樣中，相較於相同或類似但處於未蛋白水解裂解狀態之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物在不活化裂解位點處蛋白水解裂解使其使目標細胞中毒之能力減小例如至多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
在本說明書之一態樣中，不活化裂解位點位於不活化裂解位點區內。如本文所用，術語「不活化裂解位點區」係指梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之可經修飾成含有不活化裂解位點的胺基酸序列，因為此修飾將不會實質上破壞蛋白質使目標細胞中毒之能力；且在暴露於其同源蛋白酶時，不活化裂解位點將經裂解且實質上使梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物不活化。不活化裂解位點之位置可在不活化裂解位點區內之任一處，其限制條件為此位置將不會實質上影響梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物使目標細胞中毒之能力；且在暴露於其同源蛋白酶時，不活化裂解位點之裂解將實質上使梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物不活化。表5列出適用於本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之例示性不活化裂解位點區。
因此，在一實施例中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點。在此實施例之態樣中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。
在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸462-496；SEQ ID NO: 3之胺基酸458-492；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸464-487；SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸463-496；SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸458-491；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸434-467；SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸453-486；SEQ ID NO: 21之胺基酸458-491；SEQ ID NO: 22之胺基酸475-508；SEQ ID NO: 23之胺基酸443-476；或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸434-467。
在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸618-634；SEQ ID NO: 3之胺基酸614-630；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸605-621；SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸613-629；SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸609-625；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸587-603；SEQ ID NO: 18之胺基酸604-620；SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸605-621；SEQ ID NO: 21之胺基酸610-626；SEQ ID NO: 22之胺基酸627-643；SEQ ID NO: 23之胺基酸596-612；或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸587-603。
在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸638-651；SEQ ID NO: 3之胺基酸634-647；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸625-638；SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸633-646；SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸629-642；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸607-620；SEQ ID NO: 18之胺基酸624-637；SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸625-638；SEQ ID NO: 21之胺基酸630-643；SEQ ID NO: 22之胺基酸647-660；SEQ ID NO: 23之胺基酸616-629；或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸607-620。
在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸665-687；SEQ ID NO: 3之胺基酸661-683；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO :10之胺基酸652-674；SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸660-682；SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸656-678；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸634-659；SEQ ID NO: 18之胺基酸651-676；SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸652-677；SEQ ID NO: 21之胺基酸657-679；SEQ ID NO: 22之胺基酸674-696；SEQ ID NO: 23之胺基酸643-668；或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸634-659。
在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸752-765；SEQ ID NO: 3之胺基酸748-761；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸739-752:SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸747-760；SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸743-756；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸724-739；SEQ ID NO: 18之胺基酸741-756；SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸742-757；SEQ ID NO: 21之胺基酸744-757；SEQ ID NO: 22之胺基酸761-774；SEQ ID NO: 23之胺基酸733-748；或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸724-739。
在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸826-835；SEQ ID NO: 3之胺基酸824-831；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸813-824；SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸821-830；SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸817-826；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸800-809；SEQ ID NO: 18之胺基酸817-826；SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸818-827；SEQ ID NO: 21之胺基酸818-827；SEQ ID NO: 22之胺基酸835-844；SEQ ID NO: 23之胺基酸809-819；或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸800-809。
在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸844-863；SEQ ID NO: 3之胺基酸840-859；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸831-850；SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸839-858；SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸835-854；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸818-837；SEQ ID NO: 18之胺基酸835-854；SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸836-855；SEQ ID NO: 21之胺基酸836-855；SEQ ID NO: 22之胺基酸854-871；SEQ ID NO: 23之胺基酸828-847；或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸818-837。
在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸871-895；SEQ ID NO: 3之胺基酸867-891；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸858-882；SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸866-890；SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸862-886；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸845-869；SEQ ID NO: 18之胺基酸862-886；SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸863-887；SEQ ID NO: 21之胺基酸863-887；SEQ ID NO: 22之胺基酸879-903；SEQ ID NO: 23之胺基酸855-879；或SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸845-869。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之BoNT/A或BoNT/A嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之BoNT/A或BoNT/A嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸462-496、618-634、638-651、665-687、752-765、826-835、844-863或871-895；或包含SEQ ID NO: 3之胺基酸458-492、614-630、634-647、665-687、748-761、822-831、840-859或867-891。在此實施例之其他態樣中，包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點的BoNT/A係由SEQ ID NO: 530、SEQ ID NO: 532、SEQ ID NO: 534或SEQ ID NO: 536編碼。在此實施例之其他態樣中，包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點的BoNT/A包含SEQ ID NO: 531、SEQ ID NO: 533、SEQ ID NO: 535或SEQ ID NO: 537。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之BoNT/B或BoNT/B嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之BoNT/B或BoNT/B嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸464-487、605-621、625-638、652-674、739-752、813-824、831-850、或858-882。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之BoNT/C1或BoNT/C1嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之BoNT/C1或BoNT/C1嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸463-496、613-629、633-646、660-682、747-760、821-830、839-858、或866-890。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之BoNT/D或BoNT/D嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之BoNT/D或BoNT/D嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14之胺基酸458-491、609-625、629-642、656-678、743-756、817-826、835-854或862-886。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之BoNT/E或BoNT/E嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之BoNT/E或BoNT/E嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17之胺基酸434-467、587-603、607-620、634-659、724-739、800-809、818-837或845-869。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之BoNT/F或BoNT/F嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之BoNT/F或BoNT/F嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 18之胺基酸453-486、604-620、624-637、651-676、741-756、817-826、835-854或862-886；或包含SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸453-486、605-621、625-638、652-677、742-757、818-827、836-855或863-887。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之BoNT/G或BoNT/G嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之BoNT/G或BoNT/G嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 21之胺基酸458-491、610-626、630-643、657-679、744-757、818-827、836-855或863-887。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之TeNT或TeNT嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之TeNT或TeNT嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 22之胺基酸475-508、627-643、647-660、674-696、761-774、835-844、854-871或879-903。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之BaNT或BaNT嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之BaNT或BaNT嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 23之胺基酸443-476、596-612、616-629、643-668、733-748、809-819、828-847或855-879。
在此實施例之另一態樣中，本說明書中揭示之BuNT或BuNT嵌合物包含位於易位域或HCN子域之不活化裂解位點區內的不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，本說明書中揭示之BuNT或BuNT嵌合物包含位於包含以下之不活化裂解位點區內之不活化裂解位點：SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25之胺基酸434-467、587-603、607-620、634-659、724-739、800-809、818-837或845-869。
在本說明書之一態樣中，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大於相同或類似但無該不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物的安全限度。換言之，相對於相同或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，添加不活化裂解位點會增加梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度。
因此，在一實施例中，相對於相同或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物具有較大安全限度。在此實施例之態樣中，相對於相同或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、至少200%、210%、至少220%、至少230%、至少240%、至少250%、至少260%、至少270%、至少280%、至少290%或至少300%。在此實施例之其他態樣中，相對於相同或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大例如至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多100%、110%、至多120%、至多130%、至多140%、至多150%、至多160%、至多170%、至多180%、至多190%、至多200%、210%、至多220%、至多230%、至多240%、至多250%、至多260%、至多270%、至多280%、至多290%或至多300%。在此實施例之其他態樣中，相對於相同或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大例如約10%至約300%、約20%至約300%、約30%至約300%、約40%至約300%、約50%至約300%、約60%至約300%、約70%至約300%、約80%至約300%、約90%至約300%、或約100%至約300%。
在實施例之其他態樣中，相對於相同或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大例如至少1倍、至少1倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在實施例之其他態樣中，相對於相同或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大例如至少1倍、至多1倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍、至多9倍或至多10倍。在此實施例之其他態樣中，包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大例如約1倍至約10倍、約1倍至約9倍、約1倍至約8倍、約1倍至約7倍、約1倍至約6倍、約1倍至約5倍、約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、或約2倍至約5倍。
在另一實施例中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會增加梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度之不活化裂解位點的添加。在此實施例之態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、至少200%、210%、至少220%、至少230%、至少240%、至少250%、至少260%、至少270%、至少280%、至少290%或至少300%之不活化裂解位點的添加。在此實施例之其他態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加例如至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多100%、110%、至多120%、至多130%、至多140%、至多150%、至多160%、至多170%、至多180%、至多190%、至多200%、210%、至多220%、至多230%、至多240%、至多250%、至多260%、至多270%、至多280%、至多290%或至多300%之不活化裂解位點的添加。在此實施例之其他態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加例如約10%至約300%、約20%至約300%、約30%至約300%、約40%至約300%、約50%至約300%、約60%至約300%、約70%至約300%、約80%至約300%、約90%至約300%、或約100%至約300%之不活化裂解位點的添加。
在此實施例之其他態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加例如至少1倍、至少1倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍之不活化裂解位點的添加。在此實施例之其他態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加例如至多1倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍、至多9倍或至多10倍之不活化裂解位點的添加。在此實施例之其他態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加例如約1倍至約10倍、約1倍至約9倍、約1倍至約8倍、約1倍至約7倍、約1倍至約6倍、約1倍至約5倍、約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、或約2倍至約5倍之不活化裂解位點的添加。
在另一實施例中，不活化裂解位點區可經修飾以包括單一不活化裂解位點。在另一實施例中，不活化裂解位點區可經修飾以包括複數個不活化裂解位點。在此實施例之態樣中，不活化裂解位點區可包含例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，不活化裂解位點區可包含例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，不活化裂解位點區可包含例如2-10個不活化裂解位點、2-8個不活化裂解位點、2-6個不活化裂解位點、2-4個不活化裂解位點、2-3個不活化裂解位點、3-9個不活化裂解位點、3-7個不活化裂解位點、3-5個不活化裂解位點、或3-4個不活化裂解位點。
在另一實施例中，不活化裂解位點區可經修飾以包括僅1種類型之不活化裂解位點，諸如凝血酶裂解位點。在另一實施例中，不活化裂解位點區可經修飾以包括複數種不同類型之不活化裂解位點，諸如凝血酶裂解位點、因子Xa裂解位點、MMP-2裂解位點及MMP-9裂解位點。在此實施例之態樣中，不活化裂解位點區可包含例如至少2、3、4或5種不同類型之不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，不活化裂解位點區可包含例如至多2、3、4或5種不同類型之不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，不活化裂解位點區可包含例如2-5種不同類型之不活化裂解位點、2-4種不同類型之不活化裂解位點、2-3種不同類型之不活化裂解位點、3-5種不同類型之不活化裂解位點或3-4種不同類型之不活化裂解位點。
修飾不活化裂解位點區以包括不活化裂解位點可藉由改變不活化裂解位點區內之至少一個胺基酸來達成。胺基酸改變之非限制性實例包括胺基酸缺失、胺基酸添加、或原始胺基酸經不同胺基酸取代。在此實施例之態樣中，藉由改變不活化裂解位點區內之例如至少1、2、3、4或5個胺基酸來修飾不活化裂解位點區以包括不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，藉由改變不活化裂解位點區內之例如至多1、2、3、4或5個胺基酸來修飾不活化裂解位點區以包括不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，藉由改變例如不活化裂解位點區內之1-5個胺基酸、不活化裂解位點區內之1-4個胺基酸、不活化裂解位點區內之1-3個胺基酸、不活化裂解位點區內之1-2個胺基酸、不活化裂解位點區內之2-5個胺基酸、不活化裂解位點區內之2-4個胺基酸、不活化裂解位點區內之2-3個胺基酸、不活化裂解位點區內之3-5個胺基酸或不活化裂解位點區內之4-5個胺基酸來修飾不活化裂解位點區以包括不活化裂解位點。
在此實施例之態樣中，藉由刪除、添加、取代或其任何組合例如不活化裂解位點區內之至少1、2、3、4或5個胺基酸來修飾不活化裂解位點區以包括不活化裂解位點。在此實施例之其他態樣中，藉由刪除、添加、取代或其任何組合例如不活化裂解位點區內之至多1、2、3、4或5個胺基酸來修飾不活化裂解位點區以包括不活化裂解位點。在此實施例之態樣中，藉由刪除、添加、取代或其任何組合例如不活化裂解位點區內之1-5個胺基酸、不活化裂解位點區內之1-4個胺基酸、不活化裂解位點區內之1-3個胺基酸、不活化裂解位點區內之1-2個胺基酸、不活化裂解位點區內之2-5個胺基酸、不活化裂解位點區內之2-4個胺基酸、不活化裂解位點區內之2-3個胺基酸、不活化裂解位點區內之3-5個胺基酸或不活化裂解位點區內之4-5個胺基酸來修飾不活化裂解位點區以包括不活化裂解位點。
修飾不活化裂解位點區以包括不活化裂解位點可使用熟習此項技術者已知之標準突變誘發程序達成。突變誘發程序之非限制性實例以及經充分表徵之試劑、條件及方案可易於購自商業供應商，包括但不限於BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,CA；BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA；Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA；QIAGEN,Inc.,Valencia,CA；及Stratagene,La Jolla,CA。此等方案為在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
如上所提及，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素及梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體轉譯成單鏈多肽，其隨後藉由在二硫環區內發生蛋白水解斷鏈而裂解。此轉譯後加工產生由單一二硫鍵及非共價相互作用固持在一起的二鏈分子。二硫環區內之蛋白水解斷鏈可藉由使用天然存在於二鏈環區內之內源性蛋白酶裂解位點，或藉由工程改造二鏈環區以包含外源性蛋白酶裂解位點來達成。
本說明書之態樣部分地揭示二鏈環區。如本文所用，術語「二鏈環區」係指梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之側接有半胱胺酸胺基酸且含有用於將梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之單鏈形式轉化成其二鏈形式之蛋白酶裂解位點的胺基酸序列(表6)。二鏈環區之非限制性實例包括包含SEQ ID NO: 1之胺基酸430-454的BoNT/A二鏈環區；包含SEQ ID NO: 2之胺基酸437-446的BoNT/B二鏈環區；包含SEQ ID NO: 3之胺基酸437-453的BoNT/C1二鏈環區；包含SEQ ID NO: 4之胺基酸437-450的BoNT/D二鏈環區；包含SEQ ID NO: 5之胺基酸412-426的BoNT/E二鏈環區；包含SEQ ID NO: 6之胺基酸429-445的BoNT/F二鏈環區；包含SEQ ID NO: 7之胺基酸436-450的BoNT/G二鏈環區；及包含SEQ ID NO: 8之胺基酸439-467的TeNT二鏈環區(表6)。
因此，在一實施例中，二鏈環區包含梭狀芽孢桿菌毒素二鏈環區。在此實施例之態樣中，二鏈環區包含例如BoNT/A二鏈環區、BoNT/B二鏈環區、BoNT/C1二鏈環區、BoNT/D二鏈環區、BoNT/E二鏈環區、BoNT/F二鏈環區、BoNT/G二鏈環區、TeNT二鏈環區、BaNT二鏈環區或BuNT二鏈環區。在此實施例之其他態樣中，二鏈環區包含例如包含SEQ ID NO: 1之胺基酸430-454之BoNT/A二鏈環區；包含SEQ ID NO: 2之胺基酸437-446之BoNT/B二鏈環區；包含SEQ ID NO: 3之胺基酸437-453之BoNT/C1二鏈環區；包含SEQ ID NO: 4之胺基酸437-450之BoNT/D二鏈環區；包含SEQ ID NO: 5之胺基酸412-426之BoNT/E二鏈環區；包含SEQ ID NO: 6之胺基酸429-445之BoNT/F二鏈環區；包含SEQ ID NO: 7之胺基酸436-450之BoNT/G二鏈環區；或包含SEQ ID NO: 8之胺基酸439-467之TeNT二鏈環區；包含SEQ ID NO: 9之胺基酸421-435之BaNT二鏈環區；或包含SEQ ID NO: 10之胺基酸412-426之BuNT二鏈環區。
本說明書之態樣部分地揭示內源性二鏈環蛋白酶裂解位點。如本文所用，術語「內源性二鏈環蛋白酶裂解位點」與「天然存在之二鏈環蛋白酶裂解位點」同義且係指可見於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之二鏈環區內的天然存在之蛋白酶裂解位點且包括但不限於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素二鏈環蛋白酶裂解位點變異體，諸如梭狀芽孢桿菌毒素二鏈環蛋白酶裂解位點同功異型物及梭狀芽孢桿菌毒素二鏈環蛋白酶裂解位點亞型。內源性蛋白酶裂解位點之非限制性實例包括例如BoNT/A二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/B二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/C1二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/D二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/E二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/F二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/G二鏈環蛋白酶裂解位點及TeNT二鏈環蛋白酶裂解位點。
儘管當前未知蛋白酶之身分，但已確定許多梭狀芽孢桿菌毒素之二鏈環蛋白酶裂解位點。在BoNT中，在K448-A449處進行裂解會將BoNT/A之單一多肽形式轉化成二鏈形式；在K441-A442處進行裂解會將BoNT/B之單一多肽形式轉化成二鏈形式；在K449-T450處進行裂解會將BoNT/C1之單一多肽形式轉化成二鏈形式；在R445-D446處進行裂解會將BoNT/D之單一多肽形式轉化成二鏈形式；在R422-K423處進行裂解會將BoNT/E之單一多肽形式轉化成二鏈形式；在K439-A440處進行裂解會將BoNT/F之單一多肽形式轉化成二鏈形式；且在K446-S447處進行裂解會將BoNT/G之單一多肽形式轉化成二鏈形式。在A457-S458處對TeNT之單一多肽形式進行蛋白水解裂解會產生二鏈形式。在K431-N432處對BaNT之單一多肽形式進行蛋白水解裂解會產生二鏈形式。在R422-K423處對BuNT之單一多肽形式進行蛋白水解裂解會產生二鏈形式。該種二鏈環蛋白酶裂解位點可操作地與梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物連接成融合蛋白形式。然而，亦應注意二鏈環內其他裂解位點亦似乎經裂解，從而導致產生喪失之小肽片段。作為一非限制性實例，BoNT/A單鏈多肽裂解最終導致二鏈環內10個胺基酸之片段喪失。
因此，在一實施例中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含包括內源性二鏈環蛋白酶裂解位點之二鏈環區。在此實施例之態樣中，位於二鏈環區內之內源性二鏈環蛋白酶裂解位點包含例如BoNT/A二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/B二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/C1二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/D二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/E二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/F二鏈環蛋白酶裂解位點、BoNT/G二鏈環蛋白酶裂解位點、TeNT二鏈環蛋白酶裂解位點、BaNT二鏈環蛋白酶裂解位點、或BuNT二鏈環蛋白酶裂解位點。在此實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之內源性二鏈環蛋白酶裂解位點包含例如BoNT/A之包含SEQ ID NO: 1之胺基酸430-454的二鏈環區；BoNT/B之包含SEQ ID NO: 2之胺基酸437-446的二鏈環區；BoNT/C1之包含SEQ ID NO: 3之胺基酸437-453的二鏈環區；BoNT/D之包含SEQ ID NO: 4之胺基酸437-450的二鏈環區；BoNT/E之包含SEQ ID NO: 5之胺基酸412-426的二鏈環區；BoNT/F之包含SEQ ID NO: 6之胺基酸429-445的二鏈環區；BoNT/G之包含SEQ ID NO: 7之胺基酸436-450的二鏈環區；或TeNT之包含SEQ ID NO: 8之胺基酸439-467的二鏈環區；BaNT之包含SEQ ID NO: 9之胺基酸421-435的二鏈環區；或BuNT之包含SEQ ID NO: 10之胺基酸412-426的二鏈環區。
本說明書之態樣部分地揭示外源性蛋白酶裂解位點。如本文所用，術語「外源性蛋白酶裂解位點」與「經工程改造之蛋白酶裂解位點」、「非天然存在之蛋白酶裂解位點」或「非天然蛋白酶裂解位點」同義且係指通常不存在於天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素之二鏈環區中的蛋白酶裂解位點。二鏈環區內之此等經工程改造或外源性蛋白酶裂解位點用於將本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之單鏈多肽形式轉化成其二鏈形式。設想任何及所有外源性蛋白酶裂解位點可用於將梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之單鏈多肽形式轉化成其適用於實施本說明書之態樣的活性二鏈形式。外源性蛋白酶裂解位點之非限制性實例包括例如植物木瓜蛋白酶(papain)裂解位點、昆蟲木瓜蛋白酶裂解位點、甲殼動物木瓜蛋白酶裂解位點、腸激酶(enterokinase)裂解位點、人類鼻病毒(rhinovirus)3C蛋白酶裂解位點、人類腸病毒3C蛋白酶裂解位點、菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶裂解位點、菸草葉脈斑點病毒(TVMV)裂解位點、枯草桿菌蛋白(subtilisin)裂解位點、羥胺裂解位點或卡斯蛋白酶(Caspase)3裂解位點。位於二鏈環內之經工程改造之蛋白酶裂解位點描述於例如以下中：Dolly等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利7,419,676；Dolly等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利7,422,877；Steward等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利公開案2009/0069238；Steward等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利公開案2008/0032930；Steward等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利公開案2009/0018081；Steward等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利公開案2009/0005313；Steward等人，Activatable Recombinant Neurotoxins，美國專利公開案2009/0004224，各專利據此皆以全文引用的方式併入本文中。
設想任何及所有長度之外源性蛋白酶裂解位點可適用於本說明書之態樣中，其限制條件為該外源性蛋白酶裂解位點可由其各別蛋白酶裂解。因此，在此實施例之態樣中，外源性蛋白酶裂解位點之長度可為例如至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或至少60個胺基酸；或至多6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或至少60個胺基酸。
在一實施例中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含包括外源性蛋白酶裂解位點之二鏈環區。在此實施例之態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如植物木瓜蛋白酶裂解位點、昆蟲木瓜蛋白酶裂解位點、甲殼動物木瓜蛋白酶裂解位點、非人類腸激酶蛋白酶裂解位點、菸草蝕刻病毒蛋白酶裂解位點、菸草葉脈斑點病毒蛋白酶裂解位點、人類鼻病毒3C蛋白酶裂解位點、人類腸病毒3C蛋白酶裂解位點、枯草桿菌蛋白裂解位點、羥胺裂解位點、SUMO/ULP-1蛋白酶裂解位點及非人類卡斯蛋白酶3裂解位點。
在此實施例之一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如非人類腸激酶裂解位點。在實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如牛腸激酶蛋白酶裂解位點。在實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如SEQ ID NO: 480。
在此實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如菸草蝕刻病毒蛋白酶裂解。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如共同序列EX1X2YX3Q*G(SEQ ID NO: 481)或EX1X2YX3Q*S(SEQ ID NO: 482)，其中X1、X2及X3為任何胺基酸。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如SEQ ID NO: 483、SEQ ID NO: 484、SEQ ID NO: 485、SEQ ID NO: 486、SEQ ID NO: 487、SEQ ID NO: 488、SEQ ID NO: 489、SEQ ID NO: 490、SEQ ID NO: 491或SEQ ID NO: 492。
在此實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點位點包含例如菸草葉脈斑點病毒蛋白酶裂解位點。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如共同序列X1X2VRFQ*G(SEQ ID NO: 493)或X1X2VRFQ*S(SEQ ID NO: 494)，其中X1及X2獨立地為任何胺基酸。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如SEQ ID NO: 495、SEQ ID NO: 496、SEQ ID NO: 497或SEQ ID NO: 498。
在此實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如人類鼻病毒3C蛋白酶裂解位點。在實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如共同序列X1X2LFQ*GP(SEQ ID NO: 499)，其中X1為任何胺基酸，其中酸性胺基酸(如D或E)較佳；且X2優先為S、T、及脂族疏水性胺基酸(如G、P、A、V、L、I及M)。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如SEQ ID NO: 500、SEQ ID NO: 501、SEQ ID NO: 502、SEQ ID NO: 503、SEQ ID NO: 504或SEQ ID NO: 505。在實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如由裂解之人類鼻病毒3C蛋白酶。
在此實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如枯草桿菌蛋白裂解位點。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如共同序列X1X2X3X4H*Y(SEQ ID NO: 506)或X1X2X3X4YH*(SEQ ID NO: 507)，其中X1、X2、X3及X4獨立地為任何胺基酸。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如SEQ ID NO: 508、SEQ ID NO: 509或SEQ ID NO: 510。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如由裂解之枯草桿菌蛋白裂解位點。
在此實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如羥胺裂解位點。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如二肽N*G。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如SEQ ID NO: 511或SEQ ID NO: 512。
在此實施例之另一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如SUMO/ULP-1蛋白酶裂解位點。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如共同序列GG*X1X2X3(SEQ ID NO: 513)，其中X1、X2及X3獨立地為任何胺基酸。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如SEQ ID NO: 514。
在此實施例之一態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如卡斯蛋白酶3裂解位點。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如非人類卡斯蛋白酶3蛋白酶裂解位點。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如共同序列DX1X2D*X3(SEQ ID NO: 515)，其中X1為任何胺基酸，其中酸性胺基酸(如D及E)較佳，X2為任何胺基酸且X3為胺基酸，其中小型非極性胺基酸(如A、C、G、S及T)較佳。在實施例之其他態樣中，位於二鏈環區內之外源性蛋白酶裂解位點包含例如SEQ ID NO:516、SEQ ID NO: 517、SEQ ID NO: 518、SEQ ID NO: 519、SEQ ID NO: 520或SEQ ID NO: 521。
二鏈環區可經修飾以使天然存在之二鏈環蛋白酶裂解位點經外源性蛋白酶裂解位點置換。在此修飾中，使天然存在之二鏈環蛋白酶裂解位點不可操作且因此不可由其蛋白酶裂解。僅外源性蛋白酶裂解位點可由其相應外源性蛋白酶裂解。在此類型之修飾中，外源性蛋白酶位點可操作地與梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物連接成融合蛋白形式且位點可由其各別外源性蛋白酶裂解。內源性二鏈環蛋白酶裂解位點經外源性蛋白酶裂解位點之置換可為位點取代，其中外源性位點在接近內源性位點之裂解位點位置的位置處經工程改造。內源性二鏈環蛋白酶裂解位點經外源性蛋白酶裂解位點之置換可為外源性位點之添加，其中外源性位點在不同於內源性位點之裂解位點位置的位置處經工程改造，內源性位點經工程改造以變為不可操作。蛋白酶裂解位點之位置及種類可為關鍵的，因為某些結合域需要游離胺基端或羧基端胺基酸。舉例而言，當肽結合域置放於兩個其他域之間時，例如參見圖4，選擇蛋白酶裂解位點之準則可為使位點裂解之蛋白酶是否會留下暴露結合域之為結合域與其受體選擇性結合所必需之游離胺基端或羧基端的平切口(flush cut)。
可藉由改變側接由天然存在之二鏈環蛋白酶裂解之肽鍵的2個胺基酸之至少一者來使天然存在之蛋白酶裂解位點不可操作。可作更廣泛之改變，其限制條件為二鏈環區之2個半胱胺酸殘基保持完整且該區仍可形成二硫橋鍵。胺基酸改變之非限制性實例包括胺基酸缺失或原始胺基酸經不同胺基酸置換。因此，在一實施例中，藉由改變至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20個胺基酸，包括側接由天然存在之蛋白酶裂解之肽鍵的2個胺基酸之至少一者使天然存在之蛋白酶裂解位點不可操作。在另一實施例中，藉由改變至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20個胺基酸，包括側接由天然存在之蛋白酶裂解之肽鍵的2個胺基酸之至少一者使天然存在之蛋白酶裂解位點不可操作。
應瞭解本說明書中揭示之經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可視情況進一步包含包括可撓性間隔子之可撓性區。包含可撓性間隔子之可撓性區可用於調整多肽區之長度以使多肽之特徵、屬性或性質最佳化。作為一非限制性實例，包含串聯之一或多個可撓性間隔子之多肽區可用於較佳暴露蛋白酶裂解位點，藉此促進彼位點由蛋白酶裂解。作為另一非限制性實例，包含串聯之一或多個可撓性間隔子之多肽區可用於較佳呈現肽結合域，藉此促進彼結合域與其受體結合。
構成肽之可撓性間隔子之長度為至少一個胺基酸且其包含具有較小側鏈R基團之不帶電荷胺基酸，諸如小型非極性胺基酸，如A、C、G、S及T。因此，在一實施例中，可撓性間隔子之長度可為例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸；或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸。在另一實施例中，可撓性間隔子可例如介於1-3個胺基酸之間、介於2-4個胺基酸之間、介於3-5個胺基酸之間、介於4-6個胺基酸之間、或介於5-7個胺基酸之間。可撓性間隔子之非限制性實例包括例如G間隔子，諸如GGG、GGGG(SEQ ID NO: 522)及GGGGS(SEQ ID NO: 523)；或A間隔子，諸如AAA、AAAA(SEQ ID NO: 524)及AAAAT(SEQ ID NO: 525)。該種可撓性區可操作地與經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素同框連接成融合蛋白形式。
因此，在一實施例中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可進一步包含包括可撓性間隔子之可撓性區。在另一實施例中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可進一步包含包括串聯之複數個可撓性間隔子之可撓性區。在此實施例之態樣中，可撓性區可包含串聯之例如至少1、2、3、4或5個G間隔子；或至多1、2、3、4或5個G間隔子。在此實施例之其他態樣中，可撓性區可包含串聯之例如至少1、2、3、4或5個A間隔子；或至多1、2、3、4或5個A間隔子。在此實施例之另一態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可包含包括相同可撓性間隔子之一或多個複本、不同可撓性間隔子區之一或多個複本或其任何組合的可撓性區。
設想本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可在任何及所有位置中包含可撓性間隔子，其限制條件為該梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物能夠進行總體中毒過程。在此實施例之態樣中，可撓性間隔子位於例如酶域與易位域、酶域與結合域、酶域與外源性蛋白酶裂解位點之間。在此實施例之其他態樣中，可撓性間隔子位於例如結合域與易位域、結合域與酶域、結合域與外源性蛋白酶裂解位點之間。在此實施例之其他態樣中，可撓性間隔子位於例如易位域與酶域、易位域與結合域、易位域與外源性蛋白酶裂解位點之間。
作為視情況選用之組分之另一非限制性實例，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可進一步包含抗原決定基結合區。抗原決定基結合區可用於涉及例如蛋白質純化及蛋白質觀測廣泛多種程序中。該種抗原決定基結合區可操作地與經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素同框連接成融合蛋白形式。抗原決定基結合區之非限制性實例包括例如FLAG、ExpressTM、人類流行性感冒病毒血球凝集素(hemagluttinin，HA)、人類p62c-Myc蛋白質(c-MYC)、水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)醣蛋白(VSV-G)、疱疹單純型病毒(Herpes simplex virus，HSV)之醣蛋白-D前驅體、V5、AU1及AU5；親和力結合，諸如聚組胺酸(HIS)、抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)結合肽(strep)、及生物素或生物素化序列；肽結合區，諸如麩胱甘肽-S-轉移酶之麩胱甘肽(glutathione)結合域、鈣調蛋白結合蛋白之鈣調蛋白結合域、及麥芽糖結合蛋白之麥芽糖結合域。選擇、製備及使用適當結合肽之特定方案之非限制性實例描述於例如以下中：Epitope Tagging，第17.90-17.93頁(Sambrook及Russell編，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，第3卷，第3版2001)；ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL(Edward Harlow及David Lane編，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1998)；及USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL第I冊(Edward Harlow及David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998)。此外，結合肽之非限制性實例以及充分表徵之試劑、條件及方案可易於購自商業供應商，包括但不限於BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,CA；BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA；Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA；QIAGEN,Inc.,Valencia,CA；及Stratagene,La Jolla,CA。此等方案為完全在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
因此，在一實施例中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可進一步包含抗原決定基結合區。在另一實施例中，本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可進一步包含複數個抗原決定基結合區。在此實施例之態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可包含例如至少1、2、3、4或5個抗原決定基結合區。在此實施例之其他態樣中，梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物可包含例如至多1、2、3、4或5個抗原決定基結合區。在此實施例之另一態樣中，經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素可包含相同抗原決定基結合區之一或多個複本、不同抗原決定基結合區之一或多個複本或其任何組合。
抗原決定基結合區之位置可在各種位置中，包括但不限於在梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之胺基端處、在梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物內、或在梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之羧基端處。因此，在一實施例中，抗原決定基結合區位於梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之胺基端處。在另一實施例中，抗原決定基結合區位於經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素之羧基端處。
本說明書之態樣部分地提供聚核苷酸分子。如本文所用，術語「聚核苷酸分子」與「核酸分子」同義且係指核苷酸，諸如核糖核苷酸及去氧核糖核苷酸之聚合形式。設想可編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之任何及所有聚核苷酸分子可為適用的，包括但不限於天然存在及非天然存在之DNA分子及天然存在及非天然存在之RNA分子。天然存在及非天然存在之DNA分子之非限制性實例包括單股DNA分子、雙股DNA分子、染色體組DNA分子、cDNA分子、載體構築體，諸如質體構築體、噬菌質體(phagmid)構築體、噬菌體構築體、反轉錄病毒構築體及人工染色體構築體。天然存在及非天然存在之RNA分子之非限制性實例包括單股RNA、雙股RNA及mRNA。
可為製備編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子所必需的已確立之分子生物學技術包括(但不限於)涉及聚合酶鏈反應(PCR)擴增、限制酶反應、瓊脂糖凝膠電泳、核酸連接、細菌轉型、核酸純化、核酸定序之程序且基於重組之技術為完全在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。為製備編碼經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素之聚核苷酸分子所必需的特定方案之非限制性實例描述於例如以下中：MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，同上，(2001)；及CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Frederick M. Ausubel等人編。John Wiley & Sons,2004)。另外，適用於製備編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子的多種市售產品廣泛可用。此等方案為完全在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
因此，在一實施例中，聚核苷酸分子編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。
本說明書之另一態樣部分地提供產生本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之方法，此方法包含在細胞中表現編碼梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子的步驟。本說明書之另一態樣提供產生本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之方法，此方法包含將包含編碼梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子之表現構築體引入細胞且在該細胞中表現該表現構築體的步驟。
本說明書中揭示之方法部分地包括梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。設想本說明書中揭示之任何及所有梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體可使用本說明書中揭示之方法產生。亦設想編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之任何及所有聚核苷酸分子可適用於使用本說明書中揭示之方法產生本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。
本說明書中揭示之方法部分地包括表現構築體。表現構築體包含本說明書中揭示之聚核苷酸分子可操作地與適用於在細胞或無細胞提取物中表現該聚核苷酸分子之表現載體連接。廣泛多種表現載體可用於表現編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子，該等表現載體包括但不限於病毒表現載體；原核表現載體；真核表現載體，諸如酵母表現載體、昆蟲表現載體及哺乳動物表現載體；及無細胞提取物表現載體。應進一步瞭解適用於實施此等方法之態樣之表現載體可包括在組成性、組織特異性、細胞特異性或誘導性啟動子元件、增強子元件或兩者控制下表現梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物的表現載體。表現載體之非限制性實例以及用於自此等表現載體製備及使用表現構築體之已確立的試劑及條件可易於購自商業供應商，包括但不限於BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,CA；BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA；Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA；EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI；QIAGEN,Inc.,Valencia,CA；及Stratagene,La Jolla,CA。適當表現載體之選擇、製備及使用為完全在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
因此，在此實施例之態樣中，編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子可操作地與表現載體連接。在此實施例之態樣中，表現載體為例如病毒表現載體、原核表現載體、酵母表現載體、昆蟲表現載體或哺乳動物表現載體。在此實施例之其他態樣中，編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子可操作地與無細胞提取物表現載體連接。
本說明書中揭示之方法部分地包括細胞。設想可使用任何及所有細胞。因此，此實施例之態樣包括但不限於原核細胞，包括但不限於好氧、微好氣性、嗜二氧化碳、兼性、厭氧、革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌細胞菌株，諸如源於例如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridia perfringens)、難養梭狀芽孢桿菌(Clostridia difficile)、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)、雷特氏乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)、奈瑟菌(Neisseria meningirulls)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)及鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)之彼等菌株；及真核細胞，包括但不限於酵母菌株，諸如源於甲醇酵母(Pichia pastoris)、嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之彼等菌株；源於昆蟲之昆蟲細胞及細胞株，諸如源於草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)及菸草天蛾(Manduca sexta)之彼等細胞及細胞株；及源於哺乳動物細胞之哺乳動物細胞及細胞株，諸如源於小鼠、大鼠、倉鼠、豬科動物、牛科動物、馬科動物、靈長類動物及人類之彼等細胞及細胞株。細胞株可自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)、歐洲細胞培養物保存中心(European Collection of Cell Cultures)及德國微生物及細胞培養物保存中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)獲得。選擇、製備及使用適當細胞株之特定方案之非限制性實例描述於例如以下中：INSECT CELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus F. A. Goosen等人編，Marcel Dekker,1993)；INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J. M. Vlak等人編，Kluwer Academic Publishers,1996)；Maureen A. Harrison及Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE(Cambridge University Press,1997)；CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES(Alan Doyle等人編，John Wiley and Sons,1998)；R. Ian Freshney,CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss，第4版2000)；ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH(John R. W. Masters編，Oxford University Press，第3版2000)；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，同上，(2001)；BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH(John M. Davis,Oxford Press，第2版2002)；及CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，同上，(2004)。此等方案為在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
本說明書中揭示之方法部分地包括將聚核苷酸分子引入細胞中。引入細胞中之聚核苷酸分子可由彼細胞短暫或穩定維持。穩定維持之聚核苷酸分子可在染色體外且自主複製，或其可整合至細胞之染色體物質中且非自主地進行複製。設想可使用將本說明書中揭示之聚核苷酸分子引入細胞中之任何及所有方法。適用於將聚核苷酸分子引入細胞中之方法包括但不限於化學介導之轉染或轉型，諸如氯化鈣介導、磷酸鈣介導、二乙基-胺基乙基(DEAE)葡聚糖介導、脂質介導、聚(伸乙基亞胺)(PEI)介導、聚離胺酸介導及凝聚胺(polybrene)介導之轉染或轉型；物理介導之轉染或轉型，諸如基因槍粒子傳遞、顯微注射、原生質體融合及電穿孔；及病毒介導之轉染，諸如反轉錄病毒介導之轉染，參見例如Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells，第16.1-16.62頁(Sambrook及Russell編，Molecular Cloning A Laboratory Manual，第3卷，第3版2001)。熟習此項技術者瞭解將表現構築體引入細胞中之特定方法之選擇將部分地視該細胞是否將短暫含有表現構築體或該細胞是否將穩定含有表現構築體而定。此等方案為在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
在此實施例之一態樣中，稱為轉染之化學介導之方法用於將編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子引入細胞中。在轉染之化學介導之方法中，化學試劑與核酸形成促進核酸吸收至細胞中之複合物。此等化學試劑包括但不限於磷酸鈣介導，參見例如Martin Jordan及Florian Worm,Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate,33(2)Methods 136-143(2004)；二乙基-胺基乙基(DEAE)葡聚糖介導、脂質介導、陽離子聚合物介導(如聚(伸乙基亞胺)(PEI)介導及聚離胺酸介導及凝聚胺介導)，參見例如Chun Zhang等人，Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells,33(2) Methods 144-150(2004)。此等化學介導之傳遞系統可藉由標準方法製備且可購得，參見例如CellPhect轉染套組(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)；哺乳動物轉染套組、磷酸鈣及DEAE葡聚糖(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)；LIPOFECTAMINETM轉染試劑(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)；ExGen 500轉染套組(Fermentas,Inc.,Hanover,MD)及SuperFect及Effectene轉染套組(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)。
在此實施例之另一態樣中，物理介導之方法用於將編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子引入細胞中。物理技術包括但不限於電穿孔、基因槍及顯微注射。基因槍及顯微注射技術將細胞壁穿孔以將核酸分子引入細胞中，參見例如Jeike E. Biewenga等人，Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique,71(1) J. Neurosci. Methods 67-75(1997)；及John O'Brien及Sarah C. R. Lummis,Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells,33(2) Methods 121-125(2004)。亦稱為電滲透之電穿孔使用短暫高電壓電脈衝來在膜中產生核酸分子穿過其而進入的短暫孔隙且可有效用於所有細胞類型之穩定及短暫轉染，參見例如M. Golzio等人，In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization,gene transfer,and expression,33(2) Methods 126-135(2004)；及Oliver Gresch等人，New non-viral method for gene transfer into primary cells,33(2) Methods 151-163(2004)。
在此實施例之另一態樣中，稱為轉導之病毒介導之方法用於將編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子引入細胞中。在短暫轉導之病毒介導之方法中，病毒粒子藉由其進行感染且在宿主細胞中複製之過程已經操作以使用此機制來將聚核苷酸分子引入細胞中。已自廣泛多種病毒開發病毒介導之方法，該等病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹單純型病毒、小核糖核酸病毒(picornavirus)、α病毒(alphavirus)及桿狀病毒(baculovirus)，參見例如Armin Blesch,Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer,33(2) Methods 164-172(2004)；及Maurizio Federico,From lentiviruses to lentivirus vectors,229 Methods Mol. Biol. 3-15(2003)；E. M. Poeschla,Non-primate lentiviral vectors,5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540(2003)；Karim Benihoud等人，Adenovirus vectors for gene delivery,10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447(1999)；H. Bueler,Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy,380(6)Biol. Chem. 613-622(1999)；Chooi M. Lai等人，Adenovirus and adeno-associated virus vectors,21(12) DNA Cell Biol. 895-913(2002)；Edward A. Burton等人，Gene delivery using herpes simplex virus vectors,21(12) DNA Cell Biol. 915-936(2002)；Paola Grandi等人，Targeting HSV amplicon vectors,33(2) Methods 179-186(2004)；Ilya Frolov等人，Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications,93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377(1996)；Markus U. Ehrengruber,Alphaviral gene transfer in neurobiology,59(1) Brain Res. Bull. 13-22(2002)；Thomas A. Kost及J. Patrick Condreay,Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors,20(4) Trends Biotechnol. 173-180(2002)；及A. Huser及C. Hofmann,Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications,3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63(2003)。
作為非包膜雙股DNA病毒之腺病毒常經選擇用於哺乳動物細胞轉導，因為腺病毒處理約36 kb之相對較大聚核苷酸分子；以高效價產生；且可有效感染廣泛多種分裂細胞與非分裂細胞兩者，參見例如Wim T. J. M. C. Hermens等人，Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS,71(1) J. Neurosci. Methods 85-98(1997)；及Hiroyuki Mizuguchi等人，Approaches for generating recombinant adenovirus vectors,52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176(2001)。使用基於腺病毒之系統進行轉導不支持延長之蛋白質表現，因為核酸分子係由細胞核中之游離基因體攜帶，而非整合至宿主細胞染色體中。腺病毒載體系統及如何使用此等載體之特定方案揭示於例如VIRAPOWERTM腺病毒表現系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)及VIRAPOWERTM腺病毒表現系統使用手冊25-0543版本A,Invitrogen,Inc.(2002年7月15日)；及ADEASYTM腺病毒載體系統(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)及ADEASYTM腺病毒載體系統使用手冊064004f,Stratagene,Inc.中。
聚核苷酸分子傳遞亦可使用單股RNA反轉錄病毒，諸如致癌反轉錄病毒(oncoretrovirus)及豆狀病毒(lentivirus)。反轉錄病毒介導之轉導常產生接近100%之轉導效率，可藉由改變感染倍率(MOI)而容易控制原病毒複本數，且可用於短暫或穩定轉導細胞，參見例如Tiziana Tonini等人，Transient production of retroviral-and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells,285 Methods Mol. Biol. 141-148(2004)；Armin Blesch,Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer,33(2) Methods 164-172(2004)；Flix Recillas-Targa,Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals,267 Methods Mol. Biol. 417-433(2004)；及Roland Wolkowicz等人，Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells,246 Methods Mol. Biol. 391-411(2004)。反轉錄病毒粒子由封裝於由脂質包膜包圍之蛋白質衣殼中的RNA基因組組成。反轉錄病毒藉由將其RNA以及逆轉錄酶一起注入細胞質中來感染宿主細胞。RNA模板接著逆轉錄成藉由整合至宿主細胞基因組中進行自身複製之線性雙股cDNA。病毒粒子縱向(經由原病毒自母細胞至子細胞)以及橫向(經由病毒粒子自細胞至細胞)散佈。此複製策略使能夠長期持續表現，因為相關核酸分子穩定整合至宿主細胞之染色體中，藉此使蛋白質能夠長期表現。舉例而言，動物研究已顯示注入多種組織中之豆狀病毒載體產生持續蛋白質表現維持1年以上，參見例如Luigi Naldini等人，In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector,272(5259) Science 263-267(1996)。源於致癌反轉錄病毒之載體系統(諸如莫洛尼(Moloney)鼠類白血病病毒(MoMLV))經廣泛使用且感染許多不同非分裂細胞。豆狀病毒亦可感染許多不同細胞類型，包括分裂及非分裂細胞，且具有允許達成高度特異性細胞靶向之複合包膜蛋白。
逆轉錄病毒載體及如何使用此等載體之特定方案揭示於例如以下中：Manfred Gossen及Hermann Bujard,Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters，美國專利第5,464,758號(1995年11月7日)及Hermann Bujard及Manfred Gossen,Methods for regulating gene expression，美國專利第5,814,618號(1998年9月29日)；David S. Hogness,Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same，美國專利第5,514,578號(1996年5月7日)及David S. Hogness,Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor，美國專利6,245,531(2001年6月12日)；Elisabetta Vegeto等人，Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations，美國專利第5,364,791號(1994年11月15日)；Elisabetta Vegeto等人，Mutated steroid hormone receptors,methods for their use and molecular switch for gene therapy，美國專利第5,874,534號(1999年2月23日)及Elisabetta Vegeto等人，Mutated steroid hormone receptors,methods for their use and molecular switch for gene therapy，美國專利第5,935,934號(1999年8月10日)。此外，此等病毒傳遞系統可藉由標準方法製備且可購得，參見例如BDTM Tet-Off及Tet-On基因表現系統(BD Biosciences-Clonetech,Palo Alto,CA)及BDTM Tet-Off及Tet-On基因表現系統使用者手冊，PT3001-1,BD Biosciences Clonetech(2003年3月14日)；GENESWITCHTM系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)及GENESWITCHTM系統，一種用於哺乳動物細胞之米非司酮(Mifepristone)調控表現系統版本D,25-0313,Invitrogen,Inc.(2002年11月4日)；VIRAPOWERTM豆狀病毒表現系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)及VIRAPOWERTM豆狀病毒表現系統使用手冊25-0501版本E,Invitrogen,Inc.(2003年12月8日)；及COMPLETE 反轉錄病毒誘導性哺乳動物表現系統(Stratagene,La Jolla,CA)及COMPLETE 反轉錄病毒誘導性哺乳動物表現系統使用手冊,064005e。
本說明書中揭示之方法部分地包括自聚核苷酸分子表現本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。設想多種表現系統之任一者可適用於自聚核苷酸分子表現本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，該等表現系統包括但不限於基於細胞之系統及無細胞表現系統。基於細胞之系統包括但不限於病毒表現系統、原核表現系統、酵母表現系統、桿狀病毒表現系統、昆蟲表現系統及哺乳動物表現系統。無細胞系統包括但不限於麥胚提取物、兔網狀紅血球提取物及大腸桿菌提取物且通常等效於本文揭示之方法。使用表現系統表現聚核苷酸分子可包括多種特徵之任一者，包括但不限於誘導性表現、非誘導性表現、組成性表現、病毒介導之表現、穩定整合之表現及短暫表現。包括經充分表徵之載體、試劑、條件及細胞之表現系統已確立且可易於購自商業供應商，包括但不限於Ambion,Inc. Austin,TX；BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,CA；BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA；Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA；QIAGEN,Inc.,Valencia,CA；Roche Applied Science,Indianapolis,IN；及Stratagene,La Jolla,CA。關於選擇及使用適當異源表現系統之非限制性實例描述於例如以下中：PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH(S. J. Higgins及B. David Hames編，Oxford University Press,1999)；Joseph M. Fernandez及James P. Hoeffler,GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION(Academic Press,1999)；及Meena Rai及Harish Padh,Expression Systems for Production of Heterologous Proteins,80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128,(2001)。此等方案為完全在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示的常規程序。
多種基於細胞之表現程序適用於表現編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物的聚核苷酸分子。實例包括但不限於病毒表現系統、原核表現系統、酵母表現系統、桿狀病毒表現系統、昆蟲表現系統及哺乳動物表現系統。病毒表現系統包括但不限於VIRAPOWERTM豆狀病毒(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、腺病毒表現系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、ADEASYTM XL腺病毒載體系統(Stratagene,La Jolla,CA)及VIRAPORT反轉錄病毒基因表現系統(Stratagene,La Jolla,CA)。原核表現系統之非限制性實例包括CHAMPIONTM pET表現系統(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)、TRIEXTM細菌表現系統(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)、表現系統(QIAGEN,Inc)、及蛋白質表現及純化系統(Stratagene,La Jolla,CA)。酵母表現系統包括但不限於EASYSELECTTM畢赤酵母表現套組(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、YES-ECHOTM表現載體套組(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)及SPECTRATM粟酒裂殖酵母表現系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)。桿狀病毒表現系統之非限制性實例包括BACULODIRECTTM(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、BAC-(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)及BD BACULOGOLDTM(BD Biosciences-Pharmigen,San Diego,CA)。昆蟲表現系統包括但不限於果蠅(Drosophila)表現系統()(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、INSECTSELECTTM系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)及INSECTDIRECTTM系統(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)。哺乳動物表現系統之非限制性實例包括T-REXTM(四環素(Tetracycline)調控之表現)系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、FLP-INTM T-REXTM系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、pcDNATM系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、pSecTag2系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、系統、INTERPLAYTM哺乳動物TAP系統(Stratagene,La Jolla,CA)、COMPLETE 誘導性哺乳動物表現系統(Stratagene,La Jolla,CA)及 II誘導性哺乳動物表現系統(Stratagene,La Jolla,CA)。
表現編碼本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之聚核苷酸分子之另一程序採用無細胞表現系統，諸如但不限於原核提取物及真核提取物。原核細胞提取物之非限制性實例包括RTS 100大腸桿菌HY套組(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)、ActivePro活體外轉譯套組(Ambion,Inc.,Austin,TX)、ECOPROTM系統(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)及EXPRESSWAYTM Plus表現系統(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)。真核細胞提取物包括但不限於RTS 100麥胚CECF套組(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)、偶合麥胚提取物系統(Promega Corp.,Madison,WI)、麥胚IVTTM套組(Ambion,Inc.,Austin,TX)、網狀紅血球溶解產物IVTTM套組(Ambion,Inc.,Austin,TX)、 II系統(Ambion,Inc.,Austin,TX)及偶合網狀紅血球溶解產物系統(Promega Corp.,Madison,WI)。
本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物係由細胞以單鏈形式產生。為了達成完全活性，此單鏈形式必須轉化成其二鏈形式。如上所論述，此轉化過程係藉由裂解位於本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之二鏈環區內的蛋白酶裂解位點而達成。此轉化過程可使用標準活體外蛋白水解裂解檢測或於如專利申請案Ghanshani等人，Methods of Intracellular Conversion of Single-Chain Proteins into their Di-chain Form,代理人案號18469 PROV(BOT)中所述之基於細胞的蛋白水解裂解系統中進行，該專利申請案據此以全文引用的方式併入本文中。
本說明書之態樣部分地揭示包含本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之組合物。在另一態樣中，組合物為醫藥學上可接受之組合物。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係指任何分子實體或組合物在向個體投與時不產生不利、過敏性或其他不適當或非所要之反應。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之組合物」與「醫藥組合物」同義且係指治療有效濃度之活性成分，諸如本說明書中揭示之任何梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體。包含梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之醫藥組合物適用於醫學及獸醫學應用。醫藥組合物可單獨或與其他輔助性活性成分、藥劑、藥物或激素組合向患者投與。可使用多種方法中之任一者製造醫藥組合物，該等方法包括但不限於習知混合、溶解、造粒、製備糖衣藥丸、水磨、乳化、囊封、覆埋及凍乾。醫藥組合物可採用多種形式中之任一者，該等形式包括但不限於無菌溶液、懸浮液、乳液、凍乾物、錠劑、丸劑、小丸、膠囊、散劑、糖漿、酏劑或適於投藥之任何其他劑型。
亦設想包含本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之醫藥組合物可視情況包括有助於將活性成分加工成醫藥學上可接受之組合物之醫藥學上可接受的載劑。如本文所用，術語「藥理學上可接受之載劑」與「藥用載劑」同義且係指在投藥時不具有實質上長期或持久有害效應之任何載劑且涵蓋諸如「藥理學上可接受之媒劑、穩定劑、稀釋劑、添加劑、助劑或賦形劑」之術語。該種載劑通常與活性化合物混合或允許稀釋或包裹活性化合物且可為固體、半固體或液體試劑。應瞭解活性成分可為可溶的或可以於所要載劑或稀釋劑中之懸浮液形式傳遞。可使用多種醫藥學上可接受之載劑中之任一者，包括但不限於水性介質，諸如水、生理食鹽水、甘胺酸、玻尿酸及其類似物；固體載劑，諸如甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂及其類似物；溶劑；分散介質；包衣；抗細菌劑及抗真菌劑；等張劑及吸收延遲劑；或任何其他非活性成分。藥理學上可接受之載劑之選擇可視投藥模式而定。除非任何藥理學上可接受之載劑與活性成分不相容，否則預期其在醫藥學上可接受之組合物中使用。此等醫藥載劑之特定使用之非限制性實例可見於以下中：PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (Howard C. Ansel等人編，Lippincott Williams & Wilkins Publishers，第7版1999)；REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(Alfonso R. Gennaro編，Lippincott,Williams & Wilkins，第20版2000)；GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(Joel G. Hardman等人編，McGraw-Hill Professional，第10版2001)；及HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(Raymond C. Rowe等人，APhA Publications，第4版2003)。此等方案為常規程序且任何修改皆完全在熟習此項技術者之範疇內且來自本文之教示。
進一步設想本說明書中揭示之醫藥組合物可視情況包括但不限於其他醫藥學上可接受之組分(或醫藥組分)，包括但不限於緩衝劑、防腐劑、張力調節劑、鹽、抗氧化劑、滲透壓度調節劑、生理物質、藥用物質、增積劑、乳化劑、濕潤劑、甜味劑或調味劑及其類似物。可使用涉及用於調整pH值之各種緩衝劑來製備本說明書中揭示之醫藥組合物，其限制條件為所得製劑在醫藥學上可接受。此等緩衝劑包括但不限於乙酸鹽緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、中性緩衝生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水及硼酸鹽緩衝劑。應瞭解視需要可使用酸或鹼來調整組合物之pH值。醫藥學上可接受之抗氧化劑包括但不限於偏亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、乙醯半胱胺酸、丁基化羥基大茴香醚及丁基化羥基甲苯。適用防腐劑包括但不限於氯化苯甲烴銨、氯丁醇、硫柳汞、乙酸苯汞、硝酸苯汞、穩定氧氯組合物(諸如)及螯合劑(諸如DTPA或DTPA-雙醯胺、DTPA鈣及CaNaDTPA-雙醯胺)。適用於醫藥組合物中之張力調節劑包括但不限於鹽(諸如氯化鈉、氯化鉀)、甘露糖醇或甘油及其他醫藥學上可接受之張力調節劑。醫藥組合物可以鹽形式提供且可與許多不同酸，包括(但不限於)鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸及丁二酸形成。鹽傾向於比相應游離鹼形式更可溶於水性或其他質子性溶劑中。應瞭解此等物質及藥理學技術中已知之其他物質可包括在適用於本說明書中之醫藥組合物中。
在一實施例中，組合物包含本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。在此實施例之一態樣中，組合物為包含本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之醫藥組合物。在此實施例之態樣中，包含本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之醫藥組合物另外包含藥用載劑、醫藥組分或藥用載劑與醫藥組分兩者。在此實施例之其他態樣中，包含本說明書中揭示之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之醫藥組合物另外包含至少一種藥用載劑、至少一種醫藥組分、或至少一種藥用載劑及至少一種醫藥組分。
本說明書之態樣亦可如下描述：
1.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含至少一個位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中，其中該至少一個不活化裂解位點包含雙重凝血酶-凝血酶位點、因子Xa位點、雙重因子Xa-凝血酶位點、及/或MMP-9位點。
2.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、梭狀芽孢桿菌毒素結合域、二鏈環區、外源性蛋白酶裂解位點、及至少兩個位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點；其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內。
3.　如態樣2之梭狀芽孢桿菌毒素，其中該不活化裂解位點包含雙重凝血酶-凝血酶位點及/或雙重因子Xa-凝血酶位點。
4.一種梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
5.　如態樣1-4之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 5之胺基酸462-496；SEQ ID NO: 3之胺基酸458-492；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 10之胺基酸464-487；SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 12之胺基酸463-496；SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 14之胺基酸458-491；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及/或SEQ ID NO: 17之胺基酸434-467；SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及/或SEQ ID NO: 20之胺基酸453-486；SEQ ID NO: 21之胺基酸458-491；SEQ ID NO: 23之胺基酸443-476；及/或SEQ ID NO: 24及/或SEQ ID NO: 25之胺基酸434-467。
6.如態樣1-4之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 5之胺基酸618-634；SEQ ID NO: 3之胺基酸614-630；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 10之胺基酸605-621；SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 12之胺基酸613-629；SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 14之胺基酸609-625；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及/或SEQ ID NO: 17之胺基酸587-603；SEQ ID NO: 18之胺基酸604-620；SEQ ID NO: 19及/或SEQ ID NO: 20之胺基酸605-621；SEQ ID NO: 21之胺基酸610-626；SEQ ID NO: 23之胺基酸596-612；及/或SEQ ID NO: 24及/或SEQ ID NO: 25之胺基酸587-603。
7.如態樣1-4之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 5之胺基酸638-651；SEQ ID NO: 3之胺基酸634-647；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 10之胺基酸625-638；SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 12之胺基酸633-646；SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 14之胺基酸629-642；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及/或SEQ ID NO: 17之胺基酸607-620；SEQ ID NO: 18之胺基酸624-637；SEQ ID NO: 19及/或SEQ ID NO: 20之胺基酸625-638；SEQ ID NO: 21之胺基酸630-643；SEQ ID NO: 23之胺基酸616-629；及/或SEQ ID NO: 24及/或SEQ ID NO: 25之胺基酸607-620。
8.如態樣1-4之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 5之胺基酸665-687；SEQ ID NO: 3之胺基酸661-683；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 10之胺基酸652-674；SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 12之胺基酸660-682；SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 14之胺基酸656-678；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及/或SEQ ID NO: 17之胺基酸634-659；SEQ ID NO: 18之胺基酸651-676；SEQ ID NO: 19及/或SEQ ID NO: 20之胺基酸652-677；SEQ ID NO: 21之胺基酸657-679；SEQ ID NO: 23之胺基酸643-668；及/或SEQ ID NO: 24及/或SEQ ID NO: 25之胺基酸634-659。
9.　如態樣1-4之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 5之胺基酸752-765；SEQ ID NO: 3之胺基酸748-761；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 10之胺基酸739-752；SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 12之胺基酸747-760；SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 14之胺基酸743-756；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及/或SEQ ID NO: 17之胺基酸724-739；SEQ ID NO: 18之胺基酸741-756；SEQ ID NO: 19及/或SEQ ID NO: 20之胺基酸742-757；SEQ ID NO: 21之胺基酸744-757；SEQ ID NO: 23之胺基酸733-748；及/或SEQ ID NO: 24及/或SEQ ID NO: 25之胺基酸724-739。
10.　如態樣1-4之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 5之胺基酸826-835；SEQ ID NO: 3之胺基酸824-831；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 10之胺基酸813-824；SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 12之胺基酸821-830；SE QID NO: 13及/或SEQ ID NO: 14之胺基酸817-826；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及/或SEQ ID NO: 17之胺基酸800-809；SEQ ID NO: 18之胺基酸817-826；SEQ ID NO: 19及/或SEQ ID NO: 20之胺基酸818-827；SEQ ID NO: 21之胺基酸818-827；SEQ ID NO: 23之胺基酸809-819；及/或SEQ ID NO: 24及/或SEQ ID NO: 25之胺基酸800-809。
11.　如態樣1-4之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 5之胺基酸844-863；SEQ ID NO: 3之胺基酸840-859；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 10之胺基酸831-850；SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 12之胺基酸839-858；SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 14之胺基酸835-854；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及/或SEQ ID NO: 17之胺基酸818-837；SEQ ID NO: 18之胺基酸835-854；SEQ ID NO: 19及/或SEQ ID NO: 20之胺基酸836-855；SEQ ID NO: 21之胺基酸836-855；SEQ ID NO: 23之胺基酸828-847；及/或SEQ ID NO: 24及/或SEQ ID NO: 25之胺基酸818-837。
12.　如態樣1-4之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 5之胺基酸871-895；SEQ ID NO: 3之胺基酸867-891；SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 10之胺基酸858-882；SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 12之胺基酸866-890；SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 14之胺基酸862-886；SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及/或SEQ ID NO: 17之胺基酸845-869；SEQ ID NO: 18之胺基酸862-886；SEQ ID NO: 19及/或SEQ ID NO: 20之胺基酸863-887；SEQ ID NO: 21之胺基酸863-887；SEQ ID NO: 23之胺基酸855-879；及/或SEQ ID NO: 24及/或SEQ ID NO: 25之胺基酸845-869。
13.如態樣1-12之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BoNT/A酶域、BoNT/B酶域、BoNT/C1酶域、BoNT/D酶域、BoNT/E酶域、BoNT/F酶域、BoNT/G酶域、BaNT酶域及/或BuNT酶域。
14.如態樣1-13之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點包含凝血酶裂解位點、纖維蛋白溶酶裂解位點、凝血因子VIIa裂解位點、凝血因子IXa裂解位點、凝血因子Xa裂解位點、凝血因子XIa裂解位點、凝血因子XIIa裂解位點、血漿激肽釋放素裂解位點、蛋白酶活化之G蛋白偶聯受體-1(PAR1)裂解位點、PAR2裂解位點、PAR3裂解位點、PAR4裂解位點、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)裂解位點、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)裂解位點、弗林蛋白酶裂解位點、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)裂解位點、組織型纖維蛋白溶酶原活化因子(tPA)裂解位點、類胰蛋白酶-ε裂解位點、小鼠肥大細胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位點、內皮素轉化酶-1(ECE-1)裂解位點、凱爾血型裂解位點、DPPIV裂解位點、具有血小板反應蛋白1型基元-13之ADAM金屬肽酶(ADAMTS13)之裂解位點、及/或組織蛋白酶L裂解位點。
15.　如態樣1-14之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該梭狀芽孢桿菌毒素易位域包含BoNT/A易位域、BoNT/B易位域、BoNT/C1易位域、BoNT/D易位域、BoNT/E易位域、BoNT/F易位域、BoNT/G易位域、TeNT易位域、BaNT易位域及/或BuNT易位域。
16.　如態樣1-15之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點包含雙重凝血酶-凝血酶位點、因子Xa位點、雙重因子Xa-凝血酶位點及/或MMP-9位點。
17.　如態樣1-16之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該非梭狀芽孢桿菌毒素結合域包含類阿片結合域、速激肽結合域、黑皮素結合域、甘丙胺素結合域、鳥尿素結合域、神經肽Y相關肽結合域、神經激素結合域、神經調控細胞激素結合域、激肽結合域、生長因子結合域及/或升糖素樣激素結合域。
18.一種BoNT/A，其包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中。19.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/A酶域、BoNT/A易位域、BoNT/A結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
20.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/A酶域、BoNT/A易位域、BoNT/A結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。21.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/A酶域、BoNT/A易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
22.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/A酶域、BoNT/A易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
23.如態樣18-22之毒素及/或嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 5之胺基酸462-496、618-634、638-651、665-687、752-765、826-835、844-863及/或871-895；及/或SEQ ID NO: 3之胺基酸458-492、614-630、634-647、665-687、748-761、822-831、840-859及/或867-891。
24.一種BoNT/B，其包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中。
25.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/B酶域、BoNT/B易位域、BoNT/B結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。26.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/B酶域、BoNT/B易位域、BoNT/B結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
27.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/B酶域、BoNT/B易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
28.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/B酶域、BoNT/B易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。29.　如態樣24-28之毒素及/或嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 10之胺基酸464-487、605-621、625-638、652-674、739-752、813-824、831-850及/或858-882。
30.　一種BoNT/C1，其包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中。31.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/C1酶域、BoNT/C1易位域、BoNT/C1結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
32.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/C1酶域、BoNT/C1易位域、BoNT/C1結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
33.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/C1酶域、BoNT/C1易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。34.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/C1酶域、BoNT/C1易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
35.如態樣30-34之毒素及/或嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 11及/或SEQ ID NO: 12之胺基酸463-496、613-629、633-646、660-682、747-760、821-830、839-858及/或866-890。36.一種BoNT/D，其包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中。
37.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/D酶域、BoNT/D易位域、BoNT/D結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
38.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/D酶域、BoNT/D易位域、BoNT/D結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
39.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/D酶域、BoNT/D易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
40.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/D酶域、BoNT/D易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
41.　如態樣36-40之毒素及/或嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 13及/或SEQ ID NO: 14之胺基酸458-491、609-625、629-642、656-678、743-756、817-826、835-854及/或862-886。
42.　一種BoNT/E，其包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中。
43.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/E酶域、BoNT/E易位域、BoNT/E結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
44.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/E酶域、BoNT/E易位域、BoNT/E結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
45.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/E酶域、BoNT/E易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。46.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/E酶域、BoNT/E易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
47.如態樣42-46之毒素及/或嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及/或SEQ ID NO: 17之胺基酸434-467、587-603、607-620、634-659、724-739、800-809、818-837及/或845-869。48.一種BoNT/F，其包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中。
49.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/F酶域、BoNT/F易位域、BoNT/F結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
50.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/F酶域、BoNT/F易位域、BoNT/F結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
51.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/F酶域、BoNT/F易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。52.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/F酶域、BoNT/F易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
53.　如態樣48-52之毒素及/或嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 18之胺基酸453-486、604-620、624-637、651-676、741-756、817-826、835-854及/或862-886；及/或SEQ ID NO: 19及/或SEQ ID NO: 20之胺基酸453-486、605-621、625-638、652-677、742-757、818-827、836-855及/或863-887。54.一種BoNT/G，其包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中。
55.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/G酶域、BoNT/G易位域、BoNT/G結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
56.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/G酶域、BoNT/G易位域、BoNT/G結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
57.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/G酶域、BoNT/G易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
58.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BoNT/G酶域、BoNT/G易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。59.如態樣54-58之毒素及/或嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 21之胺基酸458-491、610-626、630-643、657-679、744-757、818-827、836-855及/或863-887。
60.一種BaNT，其包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中。61.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BaNT酶域、BaNT易位域、BaNT結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。62.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BaNT酶域、BaNT易位域、BaNT結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
63.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BaNT酶域、BaNT易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。64.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BaNT酶域、BaNT易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。65.　如態樣60-64之毒素及/或嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 23之胺基酸443-476、596-612、616-629、643-668、733-748、809-819、828-847及/或855-879。66.　一種BuNT，其包含位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中。67.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BuNT酶域、BuNT易位域、BuNT結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。68.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BuNT酶域、BuNT易位域、BuNT結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
69.　一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BuNT酶域、BuNT易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。70.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含BuNT酶域、BuNT易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域、外源性蛋白酶裂解位點、二鏈環區及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內；其中該不活化裂解位點區位於該易位域及/或HCN結合子域中。
71.如態樣66-70之毒素及/或嵌合物，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO: 24及/或SEQ ID NO: 25之胺基酸434-467、587-603、607-620、634-659、724-739、800-809、818-837及/或845-869。72.如態樣1-71之毒素及/或嵌合物，其中相對於相同及/或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含該不活化裂解位點之該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物具有較大安全限度。
73.如態樣72之毒素及/或嵌合物，其中相對於相同及/或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含該不活化裂解位點之該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、至少200%、210%、至少220%、至少230%、至少240%、至少250%、至少260%、至少270%、至少280%、至少290%及/或至少300%，及/或其中相對於相同及/或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含該不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多100%、110%、至多120%、至多130%、至多140%、至多150%、至多160%、至多170%、至多180%、至多190%、至多200%、210%、至多220%、至多230%、至多240%、至多250%、至多260%、至多270%、至多280%、至多290%及/或至多300%，及/或其中相對於相同及/或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含該不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大約10%至約300%、約20%至約300%、約30%至約300%、約40%至約300%、約50%至約300%、約60%至約300%、約70%至約300%、約80%至約300%、約90%至約300%、及/或約100%至約300%，或其中相對於相同及/或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含該不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大至少1倍、至少1倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍及/或至少10倍，及/或其中相對於相同及/或類似但無不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，包含該不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大至少1倍、至多1倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍、至多9倍及/或至多10倍，及/或其中包含不活化裂解位點之該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度大約1倍至約10倍、約1倍至約9倍、約1倍至約8倍、約1倍至約7倍、約1倍至約6倍、約1倍至約5倍、約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、及/或約2倍至約5倍。
74.如態樣1-73之毒素及/或嵌合物，其中相對於相同及/或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，添加該不活化裂解位點會增加該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度。
75.如態樣74之毒素及/或嵌合物，其中該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同及/或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、至少200%、210%、至少220%、至少230%、至少240%、至少250%、至少260%、至少270%、至少280%、至少290%及/或至少300%之不活化裂解位點的添加，或其中該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同及/或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多100%、110%、至多120%、至多130%、至多140%、至多150%、至多160%、至多170%、至多180%、至多190%、至多200%、210%、至多220%、至多230%、至多240%、至多250%、至多260%、至多270%、至多280%、至多290%及/或至多300%之不活化裂解位點的添加，或其中該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同及/或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加約10%至約300%、約20%至約300%、約30%至約300%、約40%至約300%、約50%至約300%、約60%至約300%、約70%至約300%、約80%至約300%、約90%至約300%、及/或約100%至約300%之不活化裂解位點的添加，或其中該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同及/或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加至少1倍、至少1倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍及/或至少10倍之不活化裂解位點的添加，及/或其中該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同及/或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加例如至多1倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍、至多9倍及/或至多10倍之不活化裂解位點的添加，及/或其中該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物包含相對於相同及/或類似但無額外不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，會使該梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度增加約1倍至約10倍、約1倍至約9倍、約1倍至約8倍、約1倍至約7倍、約1倍至約6倍、約1倍至約5倍、約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、及/或約2倍至約5倍之不活化裂解位點的添加。
76.一種聚核苷酸分子，其編碼如態樣1-75中任一者之毒素及/或嵌合物。
77.一種聚核苷酸分子，其中該分子包含SEQ ID NO: 530、SEQ ID NO: 532、SEQ ID NO: 534及/或SEQ ID NO: 536。
78.一種產生梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之方法，其包含在細胞中表現如態樣76及/或77之聚核苷酸分子之步驟，其中自該聚核苷酸分子之表現會產生所編碼之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。79.一種產生經修飾之梭狀芽孢桿菌毒素之方法，其包含以下步驟:a.將如態樣76及/或77之聚核苷酸分子引入細胞中；及b.表現該聚核苷酸分子，其中自該聚核苷酸分子之表現會產生所編碼之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。
80.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含SEQ ID NO: 531、SEQ ID NO: 533、SEQ ID NO: 535及/或SEQ ID NO: 537。
81.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含SEQ ID NO: 531。
82.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含SEQ ID NO: 533。
83.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含SEQ ID NO: 535。
84.一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含SEQ ID NO: 537。
實例
以下非限制性實例僅為達成說明目的而提供以便有助於更完全理解所揭示之實施例且決不意欲限制本說明書中揭示之任何實施例。
實例1鑑別不活化裂解位點區
此實例說明如何鑑別梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物內適於修飾該毒素以包含不活化裂解位點之區域及如何製備包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。為了鑑別蛋白質結構中適合作為潛在不活化裂解位點區之位置，最初藉由電腦軟體分析BoNT/A之三維結構以鑑別蛋白酶將更易到達之表面暴露環或延伸區域。在預測可到達之區域中，選擇以下8個區域進行進一步分析：SEQ ID NO: 1之胺基酸462-496、SEQ ID NO: 1之胺基酸618-634、SEQ ID NO: 1之胺基酸638-651、SEQ ID NO: 1之胺基酸665-687、SEQ ID NO: 1之胺基酸752-765、及SEQ ID NO: 1之胺基酸826-835、SEQ ID NO: 1之胺基酸844-863、及SEQ ID NO: 1之胺基酸871-895。
為了確定藉由電腦分析鑑別之區域是否可充當不活化裂解位點區，使用多引子突變誘發將凝血酶裂解位點遺傳工程改造至此等區域中並檢測其經凝血酶裂解之能力。彙集包含各自含有所要修飾之單向寡核苷酸引子(各引子125 ng)之引子池之50 μL反應物，該等單向寡核苷酸引子以不同比率與包含編碼BoNT/A之表現構築體(諸如包含編碼SEQ ID NO: 527之SEQ ID NO: 526之表現構築體、或包含編碼SEQ ID NO: 529之SEQ ID NO: 528之表現構築體)且經dam甲基化酶過度甲基化的DNA模板混合。向此混合物中添加5 μL 10×PCR緩衝液、1 μL去氧核糖核苷酸(dNTP)、1 μL 2.5單位/微升之PFUULTRATM高保真DNA聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA)、Pfu DNA連接酶、ATP、及無核酸酶之水以達到最終體積50 μL。熱循環儀條件為：96℃，1分鐘；60℃，30秒；及68℃，20分鐘；共30個循環。在熱循環之後，添加1 μL DpnI限制酶(Stratagene,La Jolla,CA)至反應物中且在37℃下培育1小時以消化模板DNA且降低野生型純系之回收率。藉由電穿孔將經消化之反應混合物轉型至電勝任大腸桿菌BL21(DE3)Acella細胞(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)中，塗鋪於含有50 μg/mL康黴素(kanamycin)之1.5%盧里亞-伯坦尼(Luria-Bertani)瓊脂板(pH 7.0)上，並置放於37℃培育箱中生長隔夜。含有表現構築體之細菌鑑別為康黴素抗性菌落。使用鹼裂解質體微型製備程序分離候選構築體且藉由定序加以分析以確定所併入突變之頻率及身分。表7列出所製備且於此凝血酶掃描分析中加以分析之包含凝血酶裂解位點的各BoNT/A(BoNT/A-TCS)。
為了測定各BoNT/A-TCS之可溶性蛋白之表現量，使包含各BoNT/A-TCS之表現構築體表現，藉由固定金屬親和力層析純化且藉由SDS-PAGE分析加以分析。首先，使用96孔板，在100 μL含有50 μg/mL康黴素之PA-0.5G培養基中接種具有適當表現構築體之BL21(DE3)細胞之單一群落且使其在37℃下在震盪下生長隔夜。使用來自此起始培養物之5 μL等分試樣接種1 mL含有50 μg/mL康黴素之ZYP-5052且在37℃下在震盪下生長3.5小時接著在22℃下生長16小時。向96孔板中之各1 mL表現培養物中添加包含10×FASTBREAKTM細胞溶解試劑(Promega Corp.,Madison,WI)、250 U/mL Benzonase核酸酶(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)及10×蛋白酶抑制劑混合物III(EMD Biosciences-Calbiochem,Gibbstown,NJ)之110 μL蛋白質提取試劑等分試樣。接著將75 μL HISLINKTM樹脂(Promega Corp.,Madison,WI)轉移至各孔中且藉由吸移及藉由在900 rpm下震盪30分鐘來交替式混合混合物。將溶解產物轉移至25 μm孔徑之過濾板(Promega Corp.,Madison,WI)中，膜預先用水濕潤且藉由真空過濾移除液體。用200 μL包含100 mM HEPES(pH 7.5)、10 mM咪唑之洗滌緩衝液洗滌樹脂3次。藉由添加200 μL包含100 mM HEPES(pH 7.5)、500 mM咪唑之溶離緩衝液，培育5分鐘來溶離蛋白質，且藉由真空過濾將溶離物收集至96孔板中。
為了進行SDS-PAGE，添加等體積之2×Laemmli樣品緩衝液至經IMAC純化之包含凝血酶裂解位點的BoNT/A中，且在95℃下培育混合物5分鐘。裝載15 μL等分試樣且藉由在變性還原條件下使用 Novex 4-12% Bis-Tris預製聚丙烯醯胺凝膠(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)進行MOPS聚丙烯醯胺凝膠電泳加以分離。洗滌凝膠且於10%甲醇及7%乙酸中固定30分鐘。移除洗滌溶液且在室溫下於SYPRO Ruby蛋白凝膠染色溶液中培育凝膠3小時至隔夜。將經染色之凝膠於10%甲醇及7%乙酸中脫色30分鐘。用Fluro-S-Max數位影像儀(Bio-Rad)觀測經脫色之凝膠。
表現分析之結果列於表7中。一般而言，在包含SEQ ID NO: 1之胺基酸462-496、SEQ ID NO: 1之胺基酸844-863或胺基酸871-895之不活化區中插入有凝血酶裂解位點的毒素表現良好。舉例而言，包含A489insLVPRGS之毒素之表現量為野生型對照構築體表現量的約50%且包含D848insLVPRGS或N880insLVPRGS之毒素之表現量等於或接近對照量(表7)。此等結果揭示位於易位域及/或HCN結合子域內之不活化裂解位點區容許將區域修飾成包括蛋白酶裂解位點。
為了進一步研究所鑑別之不活化裂解位點區對引入蛋白酶裂解位點之修飾的容許程度，修飾毒素在區域內各處包括凝血酶裂解位點。舉例而言，製備包含T884insLVPRGS或L862ins LVPRGS之毒素以檢查包含SEQ ID NO: 1之844-863之不活化裂解位點區。類似地，製備包含E868insLVPRGS、de1E868YIKNI-insLVPRGS、de1N872IINTS-insLVPRGS、T876insLVPRGS、L879insVPRGS、de1L879NLRYE-insLVPRGS、L881insVPRGS、de1L881RYESN-insLVPRGS、Y883insLVPRGS、E884insLVPRGS、S885insLVPRGS、de1H887LIDLS-insLVPRGS、L888insLVPRGS、L891insVPRG及de1S892RYA-insVPRG之毒素以檢查包含SEQ ID NO: 1之871-895之不活化裂解位點區。進行插入與取代兩種修飾以檢查修飾之類型是否有任何影響。一般而言，在此等不活化區中插入有凝血酶裂解位點之所有毒素之表現量皆等於或接近野生型對照構築體之表現量。此等結果揭示位於易位域及/或HCN結合子域內之不活化裂解位點區可容許置於不活化位點區內任一處之修飾。
最後，檢查不活化位點區容許存在兩個或兩個以上蛋白酶裂解位點之能力(表7)。此等結果指示位於易位域及/或HCN結合子域內之不活化裂解位點區可容許在不活化位點區內置放兩個或兩個以上蛋白酶裂解位點之修飾。
為了確定包含凝血酶裂解位點之BoNT/A是否可經凝血酶裂解，進行活體外凝血酶裂解檢測。將5 μg各純化BoNT/A-TCS與1 U之凝血酶(Novagen)一起在23℃下培育1小時、3小時及18.5小時。亦並行建立各BoNT/A-TCS之無酶對照組。在各時間點獲取樣品且用包括DTT之SDS加載緩衝液淬滅，並藉由如上所述之SDS-PAGE分析。表現分析之結果列於表7中。一般而言，將包含SEQ ID NO: 1之胺基酸467-496、844-863或871-895之不活化裂解位點區修飾成包括蛋白酶裂解位點，產生易經適當蛋白酶進行蛋白水解作用裂解的毒素。
為了確定包含凝血酶裂解位點之BoNT/A是否維持其效能，使用基於細胞之活性檢測法進行BoNT/A活性檢測。為了進行基於細胞之活性檢測法，將約1.2×106個Neuro-2a或SiMa細胞接種至24孔組織培養板之各孔中，該等孔含有1 mL含有最低必需培養基、2 mM GLUTAMAXTM I及厄爾氏鹽(Earle's salt)、1×B27補充物、1×N2補充物、0.1 mM非必需胺基酸、10 mM HEPES及25 μg/mL GT1b之無血清培養基。在5%二氧化碳下在37℃培育箱中培育細胞直至細胞分化(約3天)，如藉由標準及常規形態準則，諸如生長遏止及神經突伸長所評估。自各孔吸出培養基且更換為1)不含毒素之新鮮培養基(未經處理之細胞株)或2)含有1 nM BoNT/A複合物之新鮮培養基(經處理之細胞株)。在培育隔夜之後，藉由吸出培養基且用200 μL 1×PBS沖洗各孔來洗滌細胞。為了收集細胞，吸出1×PBS，藉由添加50 μl 2×SDS加載緩衝液來溶解細胞，將溶解產物轉移至清潔試管中且將樣品加熱至95℃，持續5分鐘。
為了偵測經裂解之SNAP-25產物之存在，藉由西方墨點法分析來自各收集樣品之等分試樣。在此分析中，藉由在變性還原條件下，使用 Novex 12% Bis-Tris預製聚丙烯醯胺凝膠(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)進行MOPS聚丙烯醯胺凝膠電泳，來分離所收集樣品之12 μl等分試樣。藉由使用TRANS- SD半乾式電泳轉移細胞裝置(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)進行西方墨點分析，將經分離之肽自凝膠轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA)上。藉由在室溫下，於含有Tris緩衝生理食鹽水(TBS)(25 mM 2-胺基-2-羥甲基-1,3-丙二醇鹽酸(Tris-HCl)(pH 7.4)、137 mM氯化鈉、2.7 mM氯化鉀)、0.1% TWEEN-(聚氧化乙烯(20)脫水山梨糖醇酐單月桂酸酯)、2%牛血清白蛋白(BSA)、5%脫脂乳粉之溶液中培育2小時，來阻斷PVDF膜。將經阻斷之膜在4℃下，於含有1)稀釋5,000倍之α-SNAP-25小鼠單株抗體作為一次抗體(SMI-81；Sternberger Monoclonals Inc.,Lutherville MD)；或2)稀釋5,000倍之S9684 α-SNAP-25兔多株抗血清作為一次抗體(Sigma,St. Louis,MO)的TBS、0.1% TWEEN-(聚氧化乙烯(20)脫水山梨糖醇酐單月桂酸酯)、2% BSA及5%脫脂乳粉中培育隔夜。α-SNAP-25小鼠單株抗體與兔多株抗體兩者均可偵測未裂解之SNAP-25受質與SNAP-25裂解產物兩者，從而可評估各細胞株中之總體SNAP-25表現及BoNT/A處理之後經裂解之SNAP-25的百分比，作為評估BoNT/A吸收量之參數。於TBS、TWEEN-(聚氧化乙烯(20)脫水山梨糖醇酐單月桂酸酯)中洗滌經一次抗體探測之墨點3次，每次15分鐘。將經洗滌之膜在室溫下，於含有1)稀釋10,000倍之結合辣根過氧化酶之山羊多株抗小鼠免疫球蛋白G重鏈及輕鏈(IgG，H+L)抗體(Zymed,South San Francisco,CA)作為二次抗體；或2)稀釋10,000倍之結合辣根過氧化酶之山羊多株抗兔免疫球蛋白G重鏈及輕鏈(IgG，H+L)抗體(Zymed,South San Francisco,CA)作為二次抗體的TBS、0.1% TWEEN-(聚氧化乙烯(20)脫水山梨糖醇酐單月桂酸酯)、2%BSA及5%脫脂乳粉中培育2小時。於TBS、0.1% TWEEN-(聚氧化乙烯(20)脫水山梨糖醇酐單月桂酸酯)中洗滌經二次抗體探測之墨點3次，每次15分鐘。使用ECL PlusTM西方墨點偵測系統(GE Healthcare,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)觀測經標記之SNAP-25產物之信號偵測，且將膜成像，且用Typhoon 9410可變模式影像儀及影像儀分析軟體(GE Healthcare,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)定量裂解百分比。像素大小(100至200像素)之選擇及PMT電壓設定(350至600，通常400)視個別墨點而定。表現分析之結果列於表7中。一般而言，將包含SEQ ID NO: 1之胺基酸467-496、844-863或871-895之不活化裂解位點區修飾成包括蛋白酶裂解位點產生能夠執行總體中毒過程之強力毒素。
總之，此等結果指示儘管鑑別了8個不同不活化裂解區，但並非所有不活化裂解區皆能夠支持插入功能性凝血酶裂解位點。一般而言，將包含SEQ ID NO: 1之胺基酸467-496、844-863及871-895之不活化裂解位點區修飾成包括蛋白酶裂解位點產生能夠執行總體中毒過程且對經適當蛋白酶蛋白水解裂解敏感之穩定產生的毒素。因為所有梭狀芽孢桿菌毒素之三維結構皆類似，故BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT及BuNT中之相應位置亦適合作為不活化裂解位點區。表5列出此等區。
實例2蛋白酶裂解位點分析
此實例說明如何製備包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。為了研究除凝血酶以外之蛋白酶裂解位點是否可適用作不活化位點，檢查包含許多不同蛋白酶裂解位點之毒素。為了製備包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，使用如實例1中所述之多引子突變誘發將蛋白酶裂解位點遺傳工程改造至不活化裂解位點區中。表8列出經修飾成含有蛋白酶裂解位點之表現構築體。
為了確定包含蛋白酶裂解位點之BoNT/A是否可經其同源蛋白酶裂解，基本上如上所述但使用適當蛋白酶替代凝血酶進行活體外蛋白酶裂解檢測。在各時間點獲取樣品且用包括DTT之SDS加載緩衝液淬滅，並藉由如實例1中所述之SDS-PAGE加以分析。
表現分析之結果列於表7中。一般而言，將包含SEQ ID NO: 1之胺基酸467-496、844-863或871-895之不活化裂解位點區修飾成包括蛋白酶裂解位點產生易經適當蛋白酶蛋白水解裂解的毒素。
為了確定包含蛋白酶裂解位點之BoNT/A是否維持其效能，進行上述基於細胞之活性檢測(表8)。一般而言，對於使用基於動物之檢測進行之經批准評估而言，展現約20或20以下之EC50的包含蛋白酶裂解位點之毒素視為保留足夠效能。
實例3活體內分析
此實例說明如何使用基於動物之檢測分析評估包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物。
儘管基於細胞之活性檢測可良好評估包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物是否可經其同源蛋白酶裂解，但選擇某些候選物以便在基於動物之檢測中進行評估。
為了使用基於動物之檢測測試包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之活性，最初進行活體內趾外展計分(Digit Abduction Score，DAS)檢測。將CD-1 Fe小鼠稱重且置於用於各個別DAS檢測之10隻動物之子組中。基於以下準則將小鼠納入特定子組中：1)健康狀況良好；2)強健基線DAS反應為0；3)包括在針對所選子組確立之X±2g之中值重量範圍內及4)重量大於17.0 g。
使用30號針向各小鼠右後肢之腓腸肌中注射以下各物：1)5 μL 10.0 nM包含不活化裂解位點之BoNT/A(單次劑量DAS研究)；或2)5 μL 7種不同劑量之一之包含不活化裂解位點的BoNT/A(0.01 nM、0.04 nM、0.12 nM、0.37 nM、1.11 nM、3.33 nM及10.0 nM；完全給藥DAS研究)。作為對照，左後肢之腓腸肌用5 μL不含有任何毒素之溶液注射。連續觀測小鼠前4天之DAS反應。藉由經尾部提昇各小鼠且精確觀測經注射之後肢來讀取DAS。後趾之外展或無外展揭示歸因於注射於肌肉中之測試毒素的麻痺效應。將經注射後肢之趾外展與未注射後肢之趾外展進行比較並相應加以計分。藉由基於峰平均DAS計分及AUC(曲線下面積)計算ED50劑量來分析DAS數據，以u/Kg及/或ng/Kg計。此如下達成：1)計算各研究中各劑量之平均峰DAS計分；2)任何研究中引發5例以上死亡之任何劑量不予考慮；3)既定個別研究中使用之最高劑量為引發平均峰值4.0的最低劑量；4)既定個別研究中使用之最低劑量為引發平均峰值0的最高劑量；5)構建各個別研究之平均峰值DAS對log(劑量)之曲線；6)計算某些研究中多組之10個小鼠之各組的AUC值；7)構建各個別研究之平均AUC對log(劑量)之曲線；8)構建各組多個相同研究之x、y平行反應曲線；針對各測試毒素；9)藉由使用三參數推理方程式使用以下方程式進行非線性回歸(非加權)(Sigma Plot v 8.0；SPSS Science,Chicago,Illinois)來分析劑量-反應數據：y=a/(1+(x/x0)b)其中y為反應，a為漸近ymax，b為斜率，x為劑量，且0為ED50劑量，對於峰值ED50確定，Ymax設定為4(量表上之最大DAS讀數)。針對所進行各8個劑量研究計算平均(峰值及/或AUC)ED50值。
結果示於表9中。一般而言，對於安全限度之經批准評估而言，展現約10或10以上之相對效能的包含不活化裂解位點之毒素視為保留足夠效能。為了確定包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度，進行小鼠致死率檢測。
為了計算包含不活化裂解位點之梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物之安全限度，自小鼠致死率檢測獲得之LD50值除以自完全給藥DAS研究獲得之EC50值。若包含不活化裂解位點之毒素展現約15或15以上之安全限度值，則其視為在不活化裂解位點處具有足夠活性。
<210>　515
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　卡斯蛋白酶3蛋白酶裂解位點之共同序列
<221>　VARIANT
<222>　2
<223>　位置2可為任何胺基酸，其中E較佳
<221>　VARIANT
<222>　3
<223>　位置3為任何胺基酸
<221>　VARIANT
<222>　5
<223>　位置5可為任何胺基酸，其中G或S較佳
<400>　515
<210>　516
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　卡斯蛋白酶3蛋白酶裂解位點
<400>　516
<210>　517
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　卡斯蛋白酶3蛋白酶裂解位點
<400>　517
<210>　518
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　卡斯蛋白酶3蛋白酶裂解位點
<400>　518
<210>　519
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　卡斯蛋白酶3蛋白酶裂解位點
<400>　519
<210>　520
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　卡斯蛋白酶3蛋白酶裂解位點
<400>　520
<210>　521
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　卡斯蛋白酶3蛋白酶裂解位點
<400>　521
<210>　522
<211>　4
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　可撓性G間隔子
<400>　522
<210>　523
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　可撓性G間隔子
<400>　523
<210>　524
<211>　4
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　可撓性A間隔子
<400>　524
<210>　525
<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　可撓性A間隔子
<400>　525
<210>　526
<211>　3939
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼具有HIS標籤之BoNT/A之DNA
<400>　526
<210>　527
<211>　1312
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　具有HIS標籤之BoNT/A
<400>　527
<210>　528
<211>　3921
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼具有HIS標籤之BoNT/A-TEV之DNA
<400>　528
<210>　529
<211>　1306
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　具有HIS標籤之BoNT/A-TEV
<400>　529
<210>　530
<211>　3945
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼包含凝血酶(N880)及凝血酶(N890)之BoNT/A之DNA
<400>　530
<210>　531
<211>　1314
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　包含凝血酶(N880)及凝血酶(N890)之BoNT/A
<400>　531
<210>　532
<211>　3945
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼包含FXa(N872)及凝血酶(E884)之BoNT/A之DNA
<400>　532
<210>　533
<211>　1314
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　包含FXa(N872)及凝血酶(E884)之BoNT/A
<400>　533
<210>　534
<211>　3921
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼包含MMP-9(I870)之BoNT/A之DNA
<400>　534
<210>　535
<211>　1306
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　包含MMP-9(I870)之BoNT/A
<400>　535
<210>　536
<211>　3916
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　編碼包含Fxa(N872)之BoNT/A之DNA
<400>　536
<210>　537
<211>　1309
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　包含Fxa(N872)之BoNT/A
<400>　537
圖 1展示中樞及周邊神經元中神經傳遞質釋放及梭狀芽孢桿菌毒素中毒之現行範式之示意圖。圖1A展示中樞及周邊神經元之神經傳遞質釋放機制之示意圖。釋放過程可描述為包含兩步：1)囊泡對接，其中含有神經傳遞質分子之囊泡之囊泡結合SNARE蛋白與位於質膜處之膜結合SNARE蛋白締合；及2)神經傳遞質釋放，其中囊泡與質膜融合且胞吐出神經傳遞質分子。圖1B展示中樞及周邊神經元中破傷風毒素及肉毒桿菌毒素活性之中毒機制之示意圖。此中毒過程可描述為包含四步：1)受體結合，其中梭狀芽孢桿菌毒素與梭狀芽孢桿菌受體系統結合且起始中毒過程；2)複合物內化，其中在毒素結合之後，含有毒素/受體系統複合物之囊泡經內飲至細胞中；3)輕鏈易位，其中認為發生多個事件，包括例如囊泡之內部pH值發生變化，形成包含梭狀芽孢桿菌毒素重鏈之HN域之通道孔隙，梭狀芽孢桿菌毒素輕鏈與重鏈分離，及釋放活性輕鏈及4)酶目標修飾，其中梭狀芽孢桿菌毒素之活化輕鏈蛋白水解裂解其目標SNARE受質，諸如SNAP-25、VAMP或突觸蛋白，藉此阻止囊泡對接及神經傳遞質釋放；
圖2展示天然存在之梭狀芽孢桿菌毒素之域組織。單鏈形式描述包含酶域、易位域及結合域之胺基至羧基線性組織。位於易位域與酶域之間之二鏈環區由雙SS方括弧描述。此區包含內源性二鏈環蛋白酶裂解位點，其在經天然存在之蛋白酶，諸如內源性梭狀芽孢桿菌毒素蛋白酶或環境中產生之天然存在之蛋白酶蛋白水解裂解時將毒素之單鏈形式轉化成二鏈形式。在單鏈形式上方，描述梭狀芽孢桿菌毒素結合域之HCC區。此區包含β-車軸草域，其包含α摺疊、β4/β5髮夾狀轉角(hairpin turn)、β摺疊、β8/β9髮夾狀轉角及γ摺疊之胺基至羧基線性組織；
圖3展示結合域位於毒素之胺基端的梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體。圖3A描述具有包含以下各者之胺基至羧基線性組織的毒素或嵌合體之單鏈多肽形式：結合元件、易位元件、包含外源性蛋白酶裂解位點(P)之二鏈環區、及治療元件。在經P蛋白酶蛋白水解裂解時，毒素或嵌合體之單鏈形式轉化成二鏈形式。圖3B描述具有包含以下各者之胺基至羧基線性組織的毒素或嵌合體之單一多肽形式：結合元件、治療元件、包含外源性蛋白酶裂解位點(P)之二鏈環區、及易位元件。在經P蛋白酶蛋白水解裂解時，毒素或嵌合體之單鏈形式轉化成二鏈形式；
圖4展示結合域位於毒素之胺基端的梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體。圖4A描述具有包含以下各者之胺基至羧基線性組織的毒素或嵌合體之單一多肽形式：治療元件、包含外源性蛋白酶裂解位點(P)之二鏈環區、結合元件、及易位元件。在經P蛋白酶蛋白水解裂解時，毒素或嵌合體之單鏈形式轉化成二鏈形式。圖4B描述具有包含以下各者之胺基至羧基線性組織順序的毒素或嵌合體之單一多肽形式：易位元件、包含外源性蛋白酶裂解位點(P)之二鏈環區、結合元件、及治療元件。在經P蛋白酶蛋白水解裂解時，毒素或嵌合體之單鏈形式轉化成二鏈形式。圖4C描述具有包含以下各者之胺基至羧基線性組織的毒素或嵌合體之單一多肽形式：治療元件、結合元件、包含外源性蛋白酶裂解位點(P)之二鏈環區、及易位元件。在經P蛋白酶蛋白水解裂解時，毒素或嵌合體之單鏈形式轉化成二鏈形式。圖4D描述具有包含以下各者之胺基至羧基線性組織的毒素或嵌合體之單一多肽形式：易位元件、結合元件、包含外源性蛋白酶裂解位點(P)之二鏈環區、及治療元件。在經P蛋白酶蛋白水解裂解時，毒素或嵌合體之單鏈形式轉化成二鏈形式；及
圖5展示結合域位於毒素之胺基端的梭狀芽孢桿菌毒素或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合體。圖5A描述具有包含以下各者之胺基至羧基線性組織的毒素或嵌合體之單一多肽形式：治療元件、包含外源性蛋白酶裂解位點(P)之二鏈環區、易位元件、及結合元件。在經P蛋白酶蛋白水解裂解時，毒素之單鏈形式轉化成二鏈形式。圖5B描述具有包含以下各者之胺基至羧基線性組織的毒素或嵌合體之單一多肽形式：易位元件、包含外源性蛋白酶裂解位點(P)之二鏈環區、治療元件、及結合元件。在經P蛋白酶蛋白水解裂解時，毒素或嵌合體之單鏈形式轉化成二鏈形式。

Claims (7)

  1. 一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含至少一個位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中，其中該至少一個不活化裂解位點包含雙重凝血酶-凝血酶位點、因子Xa位點、雙重因子Xa-凝血酶位點、及/或MMP-9位點，其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及/或SEQ ID NO：5之胺基酸462-496；SEQ ID NO：3之胺基酸458-492；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之胺基酸464-487；SEQ ID NO：11及/或SEQ ID NO：12之胺基酸463-496；SEQ ID NO：13及/或SEQ ID NO：14之胺基酸458-491；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及/或SEQ ID NO：17之胺基酸434-467；SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：20之胺基酸453-486；SEQ ID NO：21之胺基酸458-491；SEQ ID NO：23之胺基酸443-476；及/或SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25之胺基酸434-467；或其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及/或SEQ ID NO：5之胺基酸618-634；SEQ ID NO：3之胺基酸614-630；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之胺基酸605-621；SEQ ID NO：11及/或SEQ ID NO：12之胺基酸613-629；SEQ ID NO：13及/或SEQ ID NO：14之胺基酸609-625；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及/或SEQ ID NO：17之胺基酸587-603；SEQ ID NO：18之胺基酸604-620；SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：20之胺基酸605-621；SEQ ID NO：21之胺基酸610-626；SEQ ID NO：23之胺基酸596-612；及/或SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25之胺基酸587-603；或其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及/或SEQ ID NO：5之胺基酸638-651；SEQ ID NO：3之胺基酸634-647；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之胺基酸625-638；SEQ ID NO：11及/或SEQ ID NO：12之胺基酸633-646；SEQ ID NO：13及/或SEQ ID NO：14之胺基酸629-642；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及/或SEQ ID NO：17之胺基酸607-620；SEQ ID NO：18之胺基酸624-637；SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：20之胺基酸625-638；SEQ ID NO：21之胺基酸630-643；SEQ ID NO：23之胺基酸616-629；及/或SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25之胺基酸607-620；或其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及/或SEQ ID NO：5之胺基酸665-687；SEQ ID NO：3之胺基酸661-683；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之胺基酸652-674；SEQ ID NO：11及/或SEQ ID NO：12之胺基酸660-682；SEQ ID NO：13及/或SEQ ID NO：14之胺基酸656-678；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及/或SEQ ID NO：17之胺基酸634-659；SEQ ID NO：18之胺基酸651-676；SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：20之胺基酸652-677；SEQ ID NO：21之胺基酸657-679；SEQ ID NO：23之胺基酸643-668；及/或SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25之胺基酸634-659；或其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及/或SEQ ID NO：5之胺基酸752-765；SEQ ID NO：3之胺基酸748-761；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之胺基酸739-752；SEQ ID NO：11及/或SEQ ID NO：12之胺基酸747-760；SEQ ID NO：13及/或SEQ ID NO：14之胺基酸743-756；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及/或SEQ ID NO：17之胺基酸724-739；SEQ ID NO：18之胺基酸741-756；SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：20之胺基酸742-757；SEQ ID NO：21之胺基酸744-757；SEQ ID NO：23之胺基酸733-748；及/或SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25之胺基酸724-739；或其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及/或SEQ ID NO：5之胺基酸826-835；SEQ ID NO：3之胺基酸824-831；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之胺基酸813-824；SEQ ID NO：11及/或SEQ ID NO：12之胺基酸821-830；SEQ ID NO：13及/或SEQ ID NO：14之胺基酸817-826；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及/或SEQ ID NO：17之胺基酸800-809；SEQ ID NO：18之胺基酸817-826；SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：20之胺基酸818-827；SEQ ID NO：21之胺基酸818-827；SEQ ID NO：23之胺基酸809-819；及/或SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25之胺基酸800-809；或其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及/或SEQ ID NO：5之胺基酸844-863；SEQ ID NO：3之胺基酸840-859；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之胺基酸831-850；SEQ ID NO：11及/或SEQ ID NO：12之胺基酸839-858；SEQ ID NO：13及/或SEQ ID NO：14之胺基酸835-854；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及/或SEQ ID NO：17之胺基酸818-837；SEQ ID NO：18之胺基酸835-854；SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：20之胺基酸836-855；SEQ ID NO：21之胺基酸836-855；SEQ ID NO：23之胺基酸828-847；及/或SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25之胺基酸818-837；或其中該不活化裂解位點區包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及/或SEQ ID NO：5之胺基酸871-895；SEQ ID NO：3之胺基酸867-891；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及/或SEQ ID NO：10之胺基酸858-882；SEQ ID NO：11及/或SEQ ID NO：12之胺基酸866-890；SEQ ID NO：13及/或SEQ ID NO：14之胺基酸862-886；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及/或SEQ ID NO：17之胺基酸845-869；SEQ ID NO：18之胺基酸862-886；SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：20之胺基酸863-887；SEQ ID NO：21之胺基酸863-887；SEQ ID NO：23之胺基酸855-879；及/或SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25之胺基酸845-869。
  2. 一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、梭狀芽孢桿菌毒素結合域、二鏈環區、外源性蛋白酶裂解位點、及至少兩個位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點；其中該外源性蛋白酶裂解位點位於該二鏈環區內，且其中該不活化裂解位點區包含如請求項1所述之胺基酸序列。
  3. 如請求項2之梭狀芽孢桿菌毒素，其中該不活化裂解位點包含雙重凝血酶-凝血酶位點及/或雙重因子Xa-凝血酶位點。
  4. 一種梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其包含梭狀芽孢桿菌毒素酶域、梭狀芽孢桿菌毒素易位域、非梭狀芽孢桿菌毒素結合域及位於不活化裂解位點區內之不活化裂解位點，其中該不活化裂解位點區位於易位域及/或HCN結合子域中，且其中該不活化裂解位點區包含如請求項1所述之胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該梭狀芽孢桿菌毒素酶域包含BoNT/A酶域、BoNT/B酶域、BoNT/C1酶域、BoNT/D酶 域、BoNT/E酶域、BoNT/F酶域、BoNT/G酶域、BaNT酶域、及/或BuNT酶域。
  6. 如請求項1至4中任一項之梭狀芽孢桿菌毒素及/或梭狀芽孢桿菌毒素嵌合物，其中該不活化裂解位點包含凝血酶裂解位點、纖維蛋白溶酶裂解位點、凝血因子VIIa裂解位點、凝血因子IXa裂解位點、凝血因子Xa裂解位點、凝血因子XIa裂解位點、凝血因子XIIa裂解位點、血漿激肽釋放素裂解位點、蛋白酶活化之G蛋白偶聯受體-1(PAR1)裂解位點、PAR 2裂解位點、PAR3裂解位點、PAR4裂解位點、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)裂解位點、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)裂解位點、弗林蛋白酶(Furin)裂解位點、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)裂解位點、組織型纖維蛋白溶酶原活化因子(tPA)裂解位點、類胰蛋白酶-ε裂解位點、小鼠肥大細胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位點、內皮素轉化酶-1(ECE-1)裂解位點、凱爾血型(Kell blood group)裂解位點、DPPIV裂解位點、具有1型血小板反應蛋白(thrombospondin)基元-13之ADAM金屬肽酶(ADAMTS13)裂解位點、及/或組織蛋白酶L裂解位點。
  7. 一種梭狀芽孢桿菌毒素，其包含SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：535及/或SEQ ID NO：537。
TW100117869A 2010-05-20 2011-05-20 可降解之梭狀芽孢桿菌毒素 TWI516594B (zh)

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