ES2813650T3

ES2813650T3 - Toxinas clostridiales degradables

Info

Publication number: ES2813650T3
Application number: ES16181227T
Authority: ES
Inventors: Lance E Steward; Sanjiv Ghanshani; Ester Fernandez-Salas; Marcella A Gilmore; Joseph Francis; Kei Roger Aoki
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2010-05-20
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2021-03-24
Anticipated expiration: 2031-05-19
Also published as: TW201142026A; IL223100B; US8512992B2; EP3106170B1; US20130330807A1; NZ604322A; AU2011255525B2; KR20210132753A; US9284545B2; EP2650003A1; US20140220627A1; UA108646C2; KR20190010720A; EP2571509B1; EP2571509A1; SG185663A1; JP2015193669A; NZ703378A; RU2561465C2; AR081407A1

Abstract

Una neutotoxina botulínica, en donde la neutoxina botulínica comprende una variante de SEQ ID NO: 1, en donde dicha variantes se caracteriza por un sitio de escisión de trombina doble en SEQ ID NO: 1, concretamente un primer sitio de escisión de trombina, en donde los aminoácidos VPRGS se han insertado después del aminoácido L en la posición 881 de SEQ ID NO: 1, y el sitio de escisión consiste por tanto en SEQ ID NO: 114, y un segundo sitio de escisión de trombina en donde los aminoácidos VPRG se han insertado después de L en la posición 891 en SEQ ID NO: 1, en donde la variante tiene actividad de neurotoxina botulínica.

Description

DESCRIPCIÓN

Toxinas clostridiales degradables

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE.UU. número de serie 61/346.578, presentada el 20 de mayo de 2010.

La capacidad de las toxinas clostridiales, tales como, p. ej., neurotoxinas botulínicas (BoNTs), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, y neurotoxina tetánica (TeNT), para inhibir la transmisión neuronal, se ha explotado en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase, p. ej. William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004). Las toxinas clostridiales disponibles en el comercio como composiciones farmacéuticas incluyen preparaciones de BoNT/A, tales como, p. ej., BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, Ca ), DYSPORT®/RELOXIN®, (Beaufour Ipsen, Porton Down, Inglaterra), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur) BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products, China) y XEOMIN® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Alemania); y preparaciones de BoNT/B, tales como, p. ej., MYOBLOC™/NEUROBLOC™ (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, Ca ). Como ejemplo, BOTOX® está actualmente aprobado en uno o más países para las siguientes indicaciones: acalasia, espasticidad en adultos, fisura anal, dolor de espalda, blefaroespasmo, bruxismo, distonía cervical, temblor hereditario, arrugas del entrecejo o líneas faciales hipercinéticas, dolor de cabeza, espasmo hemifacial, hiperactividad de la vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, arrugas nasolabiales, disfonía espasmódica, estrabismo y trastorno del nervio VII.

Un tratamiento de la toxina clostridial inhibe la liberación de neurotransmisores alterando el proceso exocitótico usado para secretar el neurotransmisor en la hendidura sináptica. La industria farmacéutica tiene un gran deseo de expandir el uso de terapias con toxinas clostridiales más allá de sus aplicaciones miorrelajantes actuales para tratar dolencias basadas en nervios sensoriales, tales como, p. ej., diferentes tipos de dolor crónico, inflamación neurogénica y trastornos urogenitales, así como otros trastornos, tales como, p. ej., la pancreatitis. Un procedimiento que se está usando actualmente para expandir las terapias basadas en toxinas clostridiales implica modificar una toxina clostridial de modo que la toxina modificada tiene una capacidad alterada de dirigirse a la célula para una célula que no es diana de toxina clostridial. La capacidad redirigida se logra sustituyendo un dominio de direccionamiento natural de una toxina clostridial por un dominio de direccionamiento que muestra una actividad de unión preferencial por un receptor que no es de toxina clostridial presente en una célula que no es diana de toxina clostridial. Dichas modificaciones en un dominio de direccionamiento dan como resultado una toxina clostridial quimérica llamada Proteína moduladora de exocitosis vesicular dirigida (TVEMP) que es capaz de unirse selectivamente a un receptor que no es de toxina clostridial (receptor diana) presente en una célula que no es diana de toxina clostridial (redirigida). Una toxina clostridial quimérica con una actividad de dirigirse a una célula que no es diana de toxina clostridial, se puede unir a un receptor presente en la célula que no es diana de toxina clostridial, traslocarse al citoplasma y ejercer su efecto proteolítico en el complejo SNARE de la célula que no es diana de toxina clostridial.

Las terapias con toxinas clostridiales y toxinas clostridiales quiméricas se usan satisfactoriamente para muchas indicaciones. En general, la administración de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica es bien tolerada. Sin embargo, la administración en algunas aplicaciones puede ser un desafío debido a las mayores dosis necesarias para lograr el efecto beneficioso. Dosis mayores pueden aumentar la probabilidad de que la toxina o toxina clostridial quimérica se mueva a través de los fluidos intersticiales y los sistemas circulatorios, tales como, p. ej., el sistema cardiovascular y el sistema linfático, del cuerpo, produciendo la dispersión indeseable de la toxina o toxina clostridial quimérica a zonas a las que no está dirigido el tratamiento. Dicha dispersión puede conducir a efectos secundarios indeseables, tales como, p. ej., inhibición de la liberación de neurotransmisores en neuronas que no son el objetivo del tratamiento con toxinas o parálisis de un músculo que no es objetivo del tratamiento. Por ejemplo, un paciente al que se la administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un tratamiento con BoNT/A en los músculos del cuello para la tortícolis puede desarrollar disfagia debido a la dispersión de la toxina en la orofaringe. Por lo tanto, sigue siendo necesario mejorar las toxinas clostridiales o toxinas clostridiales quiméricas que sean eficaces en el sitio de tratamiento, pero tengan efectos de despreciables a mínimos en zonas que no son el objetivo del tratamiento con toxina.

El crecimiento del uso clínico, terapéutico y cosmético de las toxinas clostridiales y toxinas clostridiales quiméricas en tratamientos que requieren dosis mayores necesita que la industria farmacéutica desarrolle toxinas clostridiales o toxinas clostridiales quiméricas modificadas que sean eficaces en el sitio diana de aplicación, pero reduzcan o prevengan los posibles efectos secundarios asociados con la dispersión de las toxinas a un sitio no deseado. La presente memoria descriptiva proporciona nuevas toxinas clostridiales modificadas y toxinas clostridiales quiméricas que reducen o previenen los efectos secundarios indeseados asociados con la dispersión de toxinas en zonas no seleccionadas. Estas y otras ventajas son útiles para las diferentes aplicaciones clínicas, terapéuticas y cosméticas tales como, p. ej., el tratamiento de trastornos neuromusculares, trastornos neuropáticos, trastornos oculares, dolor, lesiones musculares, dolor de cabeza, enfermedades cardiovasculares, trastornos neuropsiquiátricos, trastornos endocrinos, cánceres, trastornos óticos y líneas faciales hipercinéticas, así como otros trastornos donde la administración de una toxina clostridial o una toxina clostridial quimérica a un mamífero, puede producir un efecto beneficioso.

El documento WO 02/44199 divulga neurotoxinas botulínicas que se han modificado mediante la inserción de un sitio de escisión de inactivación en el dominio de unión o dominio de translocación, mediante lo cual los constructos resultantes no comprenden los sitios de escisión de trombina dobles específicos.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra un esquema del paradigma actual de la liberación de neurotransmisores e intoxicación por toxina clostridial en una neurona central y periférica. La figura 1A muestra un esquema del mecanismo de liberación de neurotransmisores de una neurona central y periférica. El proceso de liberación se puede describir como que comprende dos etapas: 1) amarre de la vesícula, donde la proteína SNARE unida a vesícula de una vesícula que contiene moléculas neurotransmisoras se asocia con las proteínas SNARE unidas a membrana situadas en la membrana plasmática; y 2) la liberación de neurotransmisor, donde la vesícula se fusiona con la membrana plasmática y las moléculas neurotransmisoras son exocitosadas. La figura 1B muestra un esquema del mecanismo de intoxicación para la actividad de toxina tetánica y botulínica en una neurona central y periférica. Este proceso de intoxicación se puede describir como que comprende cuatro etapas: 1) unión al receptor, donde la toxina clostridial se une a un sistema receptor clostridial e inicia el proceso de intoxicación; 2) internalización del complejo, donde después de la unión de la toxina, se produce la endocitosis de una vesícula que contiene el sistema de toxina/receptor en la célula; 3) traslocación de la cadena ligera, donde se cree que ocurren múltiples procesos, que incluyen, p. ej., cambios en el pH interno de las vesículas, formación de un poro canal que comprende el dominio NH de la cadena pesada de la toxina clostridial, separación de la cadena ligera de la toxina clostridial de la cadena pesada, y liberación de la cadena ligera activa, y 4) modificación de la diana enzimática, donde la cadena ligera activada de la toxina clostridial escinde de forma proteolítica su sustrato diana SNARE, tal como p. ej., SNAP-25,VAMP o sintaxina, previniendo de esta forma el amarre de la vesícula y la liberación de neurotransmisor.

La FIG. 2 muestra la organización del dominio de las toxinas clostridiales naturales. La forma monocatenaria representa la organización lineal de amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático, un dominio de traslocación y un dominio de unión. La región de bucle bicatenario situada entre los dominios de traslocación y enzimático se representa mediante los corchetes de doble SS. Esta región comprende un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario endógeno que tras la escisión proteolítica con una proteasa natural, tal como, p. ej., una proteína de toxina clostridial endógena o una proteasa natural producida en el entorno, convierte la forma monocatenaria de la toxina en forma bicatenaria. Encima de la forma monocatenaria, se representa la región Hcc del dominio de unión de la toxina clostridial. Esta región comprende el dominio de p-trébol que comprende en una organización lineal de amino a carboxilo, un pliegue a, una vuelta de horquilla p4/p5, un pliegue p, una vuelta de horquilla p8/p9 y un pliegue y.

La FIG. 3 muestra toxinas clostridiales o toxinas clostridiales quiméricas con un dominio de unión situado en el extremo amino de la toxina. La figura 3A representa una forma de polipéptido monocatenaria de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de unión, un elemento de traslocación, una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P) y un elemento terapéutico. Tras la escisión proteolítica con una proteasa P, la forma monocatenaria de la toxina o quimera se convierte en la forma bicatenaria. La figura 3B representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de unión, un elemento terapéutico, una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P) y un elemento de traslocación. Tras la escisión proteolítica con una proteasa P, la forma monocatenaria de la toxina o quimera se convierte en la forma bicatenaria.

La FIG. 4 muestra toxinas clostridiales o toxinas clostridiales quiméricas con un dominio de unión situado en el extremo amino de la toxina. La figura 4A representa una forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento terapéutico, una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P), un elemento de unión y un elemento de traslocación. Tras la escisión proteolítica con una proteasa P, la forma monocatenaria de la toxina o quimera se convierte en la forma bicatenaria. La figura 4B representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de traslocación, una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P), un elemento de unión y un elemento terapéutico. Tras la escisión proteolítica con una proteasa P, la forma monocatenaria de la toxina o quimera se convierte en la forma bicatenaria. La figura 4C representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento terapéutico, un elemento de unión, una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P), y un elemento de traslocación. Tras la escisión proteolítica con una proteasa P, la forma monocatenaria de la toxina o quimera se convierte en la forma bicatenaria. La figura 4D representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de traslocación, un elemento de unión, una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P), y un elemento terapéutico. Tras la escisión proteolítica con una proteasa P, la forma monocatenaria de la toxina o quimera se convierte en la forma bicatenaria.

La FIG. 5 muestra toxinas clostridiales o toxinas clostridiales quiméricas con un dominio de unión situado en el extremo amino de la toxina. La figura 5A representa una forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento terapéutico, una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P), un elemento de traslocación y un elemento de unión. Tras la escisión proteolítica con una proteasa P, la forma monocatenaria de la toxina o quimera se convierte en la forma bicatenaria. La figura 5B representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de traslocación, una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P), un elemento terapéutico y un elemento de unión. Tras la escisión proteolítica con una proteasa P, la forma monocatenaria de la toxina o quimera se convierte en la forma bicatenaria.

Descripción detallada

La presente memoria descriptiva describe toxinas clostridiales modificadas y toxinas clostridiales quiméricas modificadas que se pueden inactivar rápidamente de un sitio o sitios no deseados explotando la presencia de proteasas presentes en los fluidos intersticiales y sistemas circulatorios, tales como, p. ej., el sistema cardiovascular y el sistema linfático. Esto se debe que las toxinas clostridiales modificadas y toxinas clostridiales quiméricas modificadas descritas en la presente memoria descriptiva comprenden un sitio de escisión de proteasa para una proteasa presente en un fluido intersticial y/o un sistema circulatorio como se describe en las reivindicaciones. La presencia de dicho sitio de escisión de proteasa hace que la toxina clostridial modificada o toxina clostridial quimérica modificada sea susceptible a la escisión proteolítica por su proteasa cognada, lo que convierte en inactivas a dichas toxinas modificadas. Por ejemplo, en situaciones donde una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica modificada para comprender un sitio de escisión para una proteasa de la matriz extracelular se ha difundido al fluido intersticial, esta toxina modificada o toxina clostridial quimérica modificada puede ser escindida eficazmente por la proteasa de la matriz extracelular cognada. Como otro ejemplo, en situaciones donde una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica modificada para comprender un sitio de escisión para una proteasa de la sangre, se ha difundido en el sistema cardiovascular, esta toxina modificada o toxina clostridial quimérica modificada puede ser escindida eficazmente por la proteasa cognada de la sangre. Como otro ejemplo más, en situaciones donde una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica modificada para comprender un sitio de escisión para una proteasa linfática se ha difundido en el sistema linfático, esta toxina modificada o toxina clostridial quimérica modificada puede ser escindida eficazmente por la proteasa linfática cognada. Por lo tanto, el uso de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio o sitios de escisión para proteasas presentes en el fluido intersticial y/o sistema circulatorio, disminuirá o eliminará dicha toxina clostridial o toxina clostridial quimérica de un sitio no deseado, reduciendo o previniendo así los efectos secundarios indeseables asociados con la difusión de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica a un sitio no deseado.

Por lo tanto, se proporciona una neutotoxina botulínica, en donde la neutoxina botulínica comprende una variante de SEQ ID NO: 1, en donde dicha variantes se caracteriza por un sitio de escisión de trombina doble en SEQ ID NO: 1, concretamente un primer sitio de escisión de trombina, en donde los aminoácidos VPRGS se han insertado después del aminoácido L en la posición 881 de SEQ ID NO: 1, y el sitio de escisión consiste por tanto en SEQ ID NO: 114, y un segundo sitio de escisión de trombina en donde los aminoácidos VPRG se han insertado después de L en la posición 891 en SEQ ID NO: 1, en donde la variante tiene actividad de neurotoxina botulínica. Dichas toxinas descritas comprenden un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de traslocación de toxina clostridial, un dominio de unión a toxina clostridial, una región de bucle bicatenario que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno, y un sitio de escisión de inactivación situado dentro de una región de sitios de escisión de inactivación. La adición del sitio de escisión de inactivación aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional.

La presente invención proporciona moléculas de polinucleótidos que codifican una toxina clostridial o una toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva y definida adicionalmente en las reivindicaciones. Una molécula de polinucleótido que codifica dicha toxina clostridial o toxina clostridial quimérica puede comprender además un vector de expresión.

Otros aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan una composición que comprende una toxina clostridial o una toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. Una composición que comprende dicha toxina clostridial o toxina clostridial quimérica puede ser una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede comprender, además de una toxina clostridial modificada descrita en la presente memoria descriptiva un vehículo farmacéutico, un componente farmacéutico o ambos.

La invención también proporciona un método para producir una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva y definida adicionalmente en las reivindicaciones, comprendiendo el método la etapa de expresar en una célula una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva, en donde la expresión de la molécula de polinucleótido produce la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica codificada. En otros aspectos, el método comprende las etapas de introducir en una célula una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva, y expresar la molécula de polinucleótido, en donde la expresión de la molécula de polinucleótido produce la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica codificada.

Las toxinas clostridiales producidas por Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium baratii y Clostridium butyricum son las más ampliamente usadas en tratamientos terapéuticos y cosméticos en seres humanos y otros mamíferos. Las cepas de C. botulinum producen siete tipos antigénicamente distintos de toxinas botulínicas (BoNT), que se han identificado investigando los brotes de botulismo en el hombre (BoNT/A, /B, /E y /F), animales (BoNT/C1 y /D) o aislados del suelo (BoNT/G). Las BoNT tienen una identidad de aminoácidos de aproximadamente 35% entre sí y comparten la misma organización de dominios funcionales y arquitectura estructural general. Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada tipo de toxina clostridial puede haber subtipos que difieren algo en su secuencia de aminoácidos, y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, actualmente hay 5 subtipos de BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos específicos que muestran una identidad de aminoácidos de aproximadamente 84% a 93% cuando se comparan con el subtipo BoNT/A de SEQ ID NO: 1. Como otro ejemplo, hay actualmente 5 subtipos de BoNT/B, BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/Bnp y BoNT/Bbv, con subtipos específicos que muestran una identidad de aminoácidos de 93% a 96% cuando se comparan con el subtipo BoNT/B de ID NO: 6. Como otro ejemplo más, hay actualmente tres subtipos de BoNT/E, BoNT/E1, BoNT/E2 y BoNT/E3, con subtipos específicos que muestran una identidad de aminoácidos de 95% a 99% cuando se comparan con el subtipo BoNT/E de SEQ ID NO: 15. Aunque los 7 BoNT serotipos tienen estructura y propiedades farmacológicas similares, cada uno presenta también características bacteriológicas heterogéneas. En cambio, la toxina tetánica (TeNT) es producida por un grupo uniforme de C. tetani. Otros dos tipos de especies de clostridios, C. baratii y C. butyricum, producen toxinas, BaNT y BuNT, que son similares a BoNT/F y BoNT/E, respectivamente.

Cada una de las toxinas es traducida como un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que posteriormente es escindido por escisión proteolítica dentro de un bucle disulfuro por una proteasa natural (FIG. 1). Esta escisión se produce dentro de la región discreta de bucle bicatenario creado entre dos restos de cisteína que forman un puente disulfuro. Este procesamiento postraduccional produce una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente (HC) 100 kDa mantenidas entre sí por el enlace disulfuro sencillo e interacciones no covalentes entre las dos cadenas. La proteasa natural usada para convertir la molécula monocatenaria en bicatenaria actualmente no se conoce. En algunos serotipos, tales como, p. ej., BoNT/A, la proteasa natural es producida de forma endógena por el serotipo bacteriano y la escisión se produce dentro de la célula antes de que la toxina sea liberada al entorno. Sin embargo, en otros serotipos, tales como, p. ej., BoNT/E, parece que la cepa bacteriana no produce una proteasa endógena capaz de convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. en estas situaciones, la toxina es liberada de la célula como una toxina monocatenaria que posteriormente se convierte en la forma bicatenaria mediante una proteasa natural encontrada en el entorno.

Cada molécula bicatenaria madura comprende tres dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio enzimático situado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene actividad de endopeptidasa dependiente de cinc que se dirige específicamente a componentes nucleares del aparato de liberación de neurotransmisores; 2) un dominio de traslocación contenido dentro de la mitad amino terminal de la HC (Hn) que facilita la liberación de la LC de las vesículas intracelulares en el citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión encontrado dentro de la mitad carboxilo terminal de la HC (Hc) que determina la actividad de unión y especificidad de unión de la toxina al complejo receptor situado en la superficie de la célula diana. D. B. Lacy y R. C. Stevens, "Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins", J. Mol. Biol. 291: 1091-1104 (1999). El dominio Hc comprende dos características estructurales distintas de tamaño aproximadamente igual, separadas por una hélice a, designadas subdominios Hcn y Hcc. La tabla 1 da regiones límite aproximadas para cada dominio y subdominio encontrado en las toxinas clostridiales de ejemplo.

La unión, traslocación y actividad enzimática de estos tres dominios funcionales son todos necesarios para la toxicidad. Aunque no se conocen todavía con precisión todos los detalles de este proceso, el mecanismo de intoxicación celular completo por el cual las toxinas clostridiales entran en una neurona e inhiben la liberación de neurotransmisores es similar, independientemente del serotipo y subtipo. Aunque los autores de la invención no desean estar limitados por la siguiente descripción, el mecanismo de intoxicación se puede describir como que comprende al menos cuatro etapas: 1) unión al receptor, 2) internalización del complejo, 3) traslocación de la cadena ligera, y 4) modificación de la diana enzimática (FIG. 3). El proceso es iniciado cuando el dominio Hc de una toxina clostridial se une a un sistema de receptor específico de toxina situado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. La especificidad de unión de un complejo receptor se cree que se logra, en parte por combinaciones específicas de gangliósidos y receptores de proteína que parece que comprenden claramente cada complejo receptor de toxina clostridial. Una vez unidos, los complejos de toxina/receptor son internalizados por endocitosis y las vesículas internalizadas son clasificadas a rutas intracelulares específicas. Parece que la etapa de traslocación es producida por la acidificación del compartimento de vesícula. Parece que este proceso inicia dos reorganizaciones estructurales dependientes del pH importantes que aumentan la hidrofobicidad y promueven la formación de la forma bicatenaria de la toxina. Una vez activada la endopeptidasa la cadena ligera de la toxina es liberada de la vesícula intracelular al citosol donde parece que se dirige específicamente a uno de tres componentes nucleares conocidos del aparato de liberación de neurotransmisores. Estas proteínas nucleares, proteínas de membrana asociadas a vesícula (VAMP)/sinaptobrevina, proteína asociada a sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25) y sintaxina, son necesarias para el amarre a la vesícula sináptica y fusión en el terminal nervioso y constituyen miembros de la familia de proteínas receptores de fijación de factor sensible a N-etilmaleimida soluble (SNARE). BoNT/A y BoNT/E escinden SNAP-25 en la región carboxilo terminal liberando un segmento de 9 o 26 aminoácidos, respectivamente, y BoNT/C1 también escinde SNAP-25 cerca del extremo carboxilo. Los serotipos botulínicos BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G, y la toxina tetánica, actúan en la parte central conservada de VAMP, y liberan la parte amino terminal de VAMP al citosol. BoNT/C1 escinde la sintaxina en un solo sitio cerca de la superficie de la membrana citosólica. La proteolisis selectiva de los SNARE sinápticos explica el bloqueo de la liberación de neurotransmisores producido por las toxinas clostridiales in vivo. Las dianas de la proteína SNARE de toxinas clostridiales son comunes para la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la actividad de peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis, p. ej., Yann Humeau et al., "How Botulinum y Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release", 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., "Botulinum y Tetanus Neurotoxins: Structure, Function y Therapeutic Utility", 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., "The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons", 11(9) Trends Microbio). 431-437, (2003).

Las estructuras cristalinas tridimensionales de BoNT/A, BoNT/B y el dominio Hc de TeNT indican que los tres dominios funcionales de las neurotoxinas clostridiales son dominios estructuralmente diferentes que son compartidos por todas las toxinas clostridiales. El motivo consenso HEXXH de la cadena ligera forma el bolsillo de unión de cinc tetraédrico del sitio catalítico situado en la hendidura profunda de la superficie de proteína que es accesible por un canal. La estructura de los dominios Hn y Hc consiste principalmente en topologías de láminas p que están unidas a una sola hélice a. El dominio Hn de forma cilíndrica comprende dos hélices a anfipáticas largas que parecen el motivo bobina enrollada encontrado en algunas proteínas víricas. El domino Hn también forma un bucle largo no estructurado llamado la "cinta de traslocación", que envuelve alrededor de una hendidura grande con carga negativa de la cadena ligera que bloquea el acceso del átomo de cinc al bolsillo de unión catalítica del sitio activo. El dominio Hc comprende dos características estructurales distintas de tamaño aproximadamente igual que indican función. La primera, designada el dominio Hcn, está situada en la mitad amino del dominio Hc. El dominio Hcn forma un plegado de barril p de tipo rollo de gelatina. El dominio Hcc es el segundo dominio que comprende el dominio Hc. El dominio carboxilo terminal comprende un dominio de p-trébol modificado que forma tres regiones de unión de hidrato de carbono distintas que se parecen al resto de unión de hidratos de carbono encontrado en muchas proteínas que se unen a azúcares, tales como, p. ej., amiloide P del suero, sialidasa, crylA, endotoxina d insecticida y lecitinas. Estudios bioquímicos indican que la estructura del dominio de trébol p del dominio Hcc parece que media la unión a componentes que contienen hidratos de carbono específicos del receptor de toxina clostridial en la superficie celular, véase, p. ej., Krzysztof Ginalski et al., "Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site", 482(1-2) FEBS Lett. 119-124 (2000). El dominio Hc se inclina alejándose del dominio Hn exponiendo los bucles de la superficie y haciéndolos accesibles para la unión. No se producen contacto entre la cadena ligera y el dominio Hc.

Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, una toxina clostridial. Las reivindicaciones se refieren a la toxina clostridial BoNT/A. Como se usa en la presente memoria, la expresión "toxina clostridial" se refiere a cualquier neurotoxina producida por una cepa de toxina clostridial que ejecuta el mecanismo celular completo por el cual una toxina clostridial intoxica una célula, y abarca la unión de una toxina clostridial a un complejo receptor de afinidad baja o alta, la internalización del complejo de toxina/receptor, la traslocación de la cadena ligera de la toxina clostridial al citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de toxina clostridial. Una toxina clostridial comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de traslocación de toxina clostridial y un dominio de unión de toxina clostridial. Las toxinas clostridiales de ejemplo incluyen las producidas por un Clostridium botulinum, un Clostridium tetani, un Clostridium baratii y un Clostridium butyricum.

Una toxina clostridial incluye, sin limitación, variantes naturales de la toxina clostridial, tales como, p. ej., isoformas de la toxina clostridial y subtipos de la toxina clostridial; variantes no naturales de la toxina clostridial, tales como, p. ej., variantes conservadoras de la toxina clostridial, variantes no conservadoras de la toxina clostridial y fragmentos de toxina clostridial activos de los mismos o cualquier combinación de los mismos. Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante de toxina clostridial", sea natural o no, se refiere a una toxina clostridial que tiene al menos un cambio de aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia descritas (tabla 1) y se puede describir en porcentaje de identidad respecto a la correspondiente región de esa secuencia de referencia. Como ejemplos no limitantes, una variante de BoNT/A de SEQ ID NO: 1 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 1; una variante de BoNT/B de SEQ ID NO: 6 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 6; una variante de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 11; una variante de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 13; una variante de BoNT/E de SEQ ID NO: 15 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 15; una variante de BoNT/F de SEQ ID NO: 18 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 18; una variante de BoNT/G de SEQ ID NO: 21 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 21; una variante de TeNT c de SEQ ID NO: 22 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 22; una variante de BaNT de SEQ ID NO: 23 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 23; y una variante de BuNT de SEQ ID NO: 24 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparada con la o las correspondientes posiciones de la SEQ ID NO: 24.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante natural de toxina clostridial" se refiere a cualquier toxina clostridial producida sin la ayuda de cualquier manipulación humana, incluyendo sin limitación, isoformas de la toxina clostridial producidas a partir de transcritos empalmados de forma alternativa, isoformas de la toxina clostridial producidas por mutación espontánea y subtipos de toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de una isoforma de toxina clostridial incluyen, p. ej., isoformas BoNT/A, isoformas BoNT/B, isoformas BoNT/C1, isoformas BoNT/D, isoformas BoNT/E, isoformas BoNT/F, isoformas BoNT/G, isoformas TeNT, isoformas BaNT e isoformas BuNT. Los ejemplos no limitantes de un subtipo de toxina clostridial incluyen, p. ej., subtipos de BoNT/A BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5; subtipos de BoNT/B BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B bivalente y BoNT/B no proteolítico; subtipos de BoNT/C1 BoNT/C1-1 y BoNT/C1-2; subtipos de BoNT/E BoNT/E1, BoNT/E2, y BoNT/E3; subtipos de BoNT/F BoNT/F1, BoNT/F2 y BoNT/F3; y subtipos de BuNT BuNT-1 y BuNT-2. Otros ejemplos no limitantes de un subtipo de toxina clostridial incluyen, p. ej., subtipos de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5; subtipos de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10; subtipos de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12; subtipos de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17; subtipos de BoNT/F SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19,y SEQ ID NO: 20; y subtipos de BuNT de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no natural de toxina clostridial" se refiere a cualquier toxina clostridial producida con ayuda de manipulación humana, incluyendo sin limitación, toxinas clostridiales producidas por modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y toxinas clostridiales producidas por síntesis química. Los ejemplos no limitantes de variantes no naturales de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de toxina clostridial, variantes no conservadoras de toxina clostridial y fragmentos activos de toxina clostridial.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante conservadora de toxina clostridial" se refiere a una toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de la toxina clostridial de referencia (tabla 1). Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de enlace de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica o similar o cualquier combinación de los mismos. Una variante conservadora de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante de toxina clostridial, y puede sustituir a la toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Una variante conservadora de toxina clostridial puede sustituir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 o 500 o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora de toxina clostridial. Una variante conservadora de toxina clostridial también puede sustituir al menos 5, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos contiguos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora de la toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de una variante conservadora de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de BoNT/A, variantes conservadoras de BoNT/B, variantes conservadoras de BoNT/C1, variantes conservadoras de BoNT/D, variantes conservadoras de BoNT/E, variantes conservadoras de BoNT/F, variantes conservadoras de BoNT/G, variantes conservadoras de TeNT, variantes conservadoras de BaNT y variantes conservadoras de BuNT.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no conservadora de toxina clostridial" se refiere a una toxina clostridial en la que 1) se elimina al menos un aminoácido de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial; 2) se añade al menos un aminoácido a la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar con el aminoácido original de la secuencia de la toxina clostridial de referencia (tabla 1). Una variante no conservadora de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial, y puede sustituir a la toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente invención. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede eliminar uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede añadir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos a la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede sustituir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 o 500 o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no conservadora de toxina clostridial también puede sustituir al menos 5, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos contiguos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de la toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de una variante no conservadora de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de BoNT/A, variantes no conservadoras de BoNT/B, variantes no conservadoras de BoNT/C1, variantes no conservadoras de BoNT/D, variantes no conservadoras de BoNT/E, variantes no conservadoras de BoNT/F, variantes no conservadoras de BoNT/G, variantes no conservadoras de TeNT, variantes no conservadoras de BaNT y variantes no conservadoras de BuNT.

También está contemplado que cualquiera de una variedad de fragmentos de toxina clostridial BoNT/A puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva, con la condición de que estos fragmentos activos puedan ejecutar el mecanismo celular completo por el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Por lo tanto, aspectos de esta realización pueden incluir fragmentos de toxina clostridial que tienen una longitud de, p. ej., al menos 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o al menos 1200 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir fragmentos de toxina clostridial que tienen una longitud de, p. ej., como máximo 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o como máximo 1200 aminoácidos.

También está contemplado que cualquiera de una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprenden la cadena ligera, pueden ser útiles en aspectos de la presente memoria descriptiva, con la condición de que estos fragmentos de cadena ligera puedan dirigirse específicamente a los componentes nucleares de la liberación de neurotransmisores y así participar en la ejecución del mecanismo celular completo por el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las cadenas ligeras de toxinas clostridiales tienen aproximadamente 420-460 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio enzimático de toxina clostridial (tabla 1). La investigación ha mostrado que no es necesaria la longitud entera de la cadena ligera de la toxina clostridial para la actividad enzimática del dominio enzimático de la toxina clostridial. Como un ejemplo no limitante, los primeros ocho aminoácidos de una cadena ligera de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitante, los primeros ocho aminoácidos de una cadena ligera de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Igualmente, el extremo carboxilo de la cadena ligera no es necesario para la actividad. Como un ejemplo no limitante, los últimos 32 aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitante, los últimos 31 aminoácidos de la cadena ligera de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Por lo tanto, aspectos de esta realización incluyen una cadena ligera de toxina clostridial que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial que tiene una longitud de, p. ej., al menos 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización incluyen una cadena ligera de toxina clostridial que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial que tiene una longitud de, p. ej., como máximo 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos.

También está contemplado que cualquiera de una variedad de regiones Hn de toxina clostridial que comprenden un dominio de traslocación de toxina clostridial puede ser útiles en aspectos de la presente memoria descriptiva, con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de la LC de las vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana y así participar en la ejecución del mecanismo celular completo por el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones Hn de las cadenas pesadas de toxinas clostridiales tienen aproximadamente 410-430 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de traslocación de toxina clostridial (tabla 1). La investigación ha mostrado que no es necesaria la longitud completa de la región Hn de una cadena pesada de toxina clostridial para la actividad de traslocación del dominio de traslocación de toxina clostridial. Por lo tanto, aspectos de esta realización pueden incluir regiones Hn de toxina clostridial que comprenden un dominio de traslocación de toxina clostridial que tiene una longitud de, p. ej., al menos 350, 375, 400 o 425 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir regiones Hn de toxina clostridial que comprenden el dominio de traslocación de toxina clostridial que tiene una longitud de, p. ej., como máximo 350, 375, 400 o 425 aminoácidos.

También está contemplado que cualquiera de una variedad de regiones He de toxina clostridial que comprenden un dominio de unión de toxina clostridial puede ser útiles en aspectos de la presente memoria descriptiva con la condición de que estos fragmentos activos puedan determinar la actividad de unión y especificidad de unión de la toxina al complejo receptor situado en la superficie de la célula diana y facilitar el mecanismo celular completo por el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones He de las cadenas pesadas de toxinas clostridiales tienen aproximadamente 400-440 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de unión (tabla 1). La investigación ha mostrado que no es necesaria la longitud entera de la región He de una cadena pesada de toxina clostridial para la actividad de unión del dominio de unión de la toxina clostridial. Por lo tanto, aspectos de esta realización pueden incluir regiones He de toxina clostridial que comprenden un dominio de unión que tiene una longitud de, p. ej., al menos 350, 375, 400 o 425 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir regiones He de toxina clostridial que comprenden un dominio de unión que tiene una longitud de, p. ej., como máximo 350, 375, 400 o 425 aminoácidos.

Se puede usar cualquiera de una variedad de métodos de alineamiento de secuencias para determinar el porcentaje de identidad, incluyendo, sin limitar, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, p. ej., métodos de aproximación de segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Los métodos globales alinean secuencias desde el principio al final de la molécula y determinan el mejor alineamiento sumando puntuaciones de parejas de restos individuales e imponiendo penalizaciones por huecos. Los métodos no limitantes incluyen, p. ej., c Lu s Ta L W, véase, p. ej., Julie D. Thompson et al., "eLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice", 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); y refinamiento iterativo, véase, p. ej., Osamu Gotoh, "Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments", 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996).

Los métodos locales alinean secuencias identificando uno o más motivos conservados compartidos por todas las secuencias introducidas. Los métodos no limitantes incluyen, p. ej., Match-box, véase, p. ej., Eric Depiereux y Ernest Feytmans, "Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences", 8(5) CABIOS 501-509 (1992); muestreo de Gibbs, véase, p. ej., C. E. Lawrence et al., "Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment", 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, véase, p. ej., Ivo Van Walle et al., "Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences", 20(9) Bioinformatics,:1428-1435 (2004).

Los métodos híbridos combinan aspectos funcionales de los métodos tanto globales como locales. Los métodos no limitantes incluyen, p. ej., comparación de segmento a segmento, véase, p. ej., Burkhard Morgenstern et al., "Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based On Segment-To-Segment Comparison", 93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103 (1996); T-Coffee, véase, p. ej., Cédric Notredame et al., "T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment", 302(1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000); MUSCLE, véase, p. ej., Robert C. Edgar, "MUSc Le : Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput", 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004); y DIALIGN-T, véase, p. ej., Amarendran R Subramanian et al., "DIALiGn -T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment", 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005).

La presente memoria descriptiva describe diferentes variantes de polipéptidos donde un aminoácido se sustituye por otro, tal como, p. ej., variantes de toxina clostridial, variantes del dominio enzimático de toxina clostridial, variantes del dominio de traslocación de toxina clostridial, variantes del dominio de unión de toxina clostridial, variantes del dominio de unión que no son de toxina clostridial, y variantes del sitio de escisión de proteasa. Una sustitución se puede evaluar por una variedad de factores, tales como, p. ej., las propiedades físicas del aminoácido que se sustituye (tabla 2) o cómo toleraría el aminoácido original una sustitución (tabla 3). Las selecciones de qué aminoácido se puede sustituir por otro aminoácido en un polipéptido son conocidas para el experto en la técnica.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de traslocación de toxina clostridial y un dominio de unión de toxina clostridial. En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende una variante de toxina clostridial natural, tal como, p. ej., una isoterma de toxina clostridial o un subtipo de toxina clostridial. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende una variante no natural de toxina clostridial, tal como, p. ej., una variante conservadora de toxina clostridial, una variante no conservadora de toxina clostridial o un fragmento activo de toxina clostridial o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende un dominio enzimático de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. La toxina clostridial de la invención comprende BoNT/A.

En otra realización, un aminoácido hidrófobo en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido hidrófobo. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos incluyen, p. ej., C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, p. ej., A, I, L, P y V. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido de apilamiento en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido de apilamiento. Los ejemplos de aminoácidos de apilamiento incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En un aspecto más de esta realización, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, p. ej., D, E, K, N, Q, y R. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, p. ej., A, H, G, P, S, T e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, p. ej., K, R, y H. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, p. ej., D y E. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido pequeño. Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, p. ej., A, D, G, N, P, S y T. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido ramificado en el C-beta en una posición particular en la cadena de polipéptido de la toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido ramificado en el C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados en el C-beta incluyen, p. ej., I, T y V.

La toxina clostridial comprende una BoNT/A. En un aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/A y un dominio de unión de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende una variante natural de BoNT/A, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/A o un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende una variante natural de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/A o un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A comprende una variante no natural de BoNT/A, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/A, una variante no conservadora de BoNT/A o un fragmento activo de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A comprende una variante no natural de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/A, una variante no conservadora de BoNT/A, un fragmento activo de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A comprende un dominio enzimático de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/A o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A que comprende un dominio enzimático de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la Se Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.

En una realización de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/B. En un aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de traslocación de BoNT/B y un dominio de unión de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende la SEQ ID NO: 6, Se Q ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o s Eq ID NO: 10. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende una variante natural de BoNT/B, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/B o un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende una variante natural de BoNT/B de Se Q ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, Se Q ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/B o un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B comprende una variante no natural de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/B, una variante no conservadora de BoNT/B, un fragmento activo de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B comprende una variante no natural de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/B, una variante no conservadora de BoNT/B, un fragmento activo de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B comprende un dominio enzimático de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/B o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B comprende un dominio enzimático de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la Se Q ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 102; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

En un aspecto de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio de traslocación de BoNT/C1 y un dominio de unión de BonT/C1. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante natural de BoNT/C1, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 o un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante natural de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID No : 12, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 o un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante no natural de BoNT/C1 variante, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/C1, una variante no conservadora de BoNT/C1, un fragmento activo de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante no natural de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o Se Q ID NO: 12, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/C1, una variante no conservadora BoNT/C1, un fragmento activo de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/C1, fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o Se Q ID NO: 12 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 3; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.

En un aspecto de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/D. En un aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de traslocación de BoNT/D y un dominio de unión de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende la SEQ ID NO: 13 o s Eq ID NO: 14. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende una variante natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D o un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende una variante natural de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D o un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende una variante no natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/D, una variante no conservadora de BoNT/D, un fragmento activo de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende una variante no natural de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/D, una variante no conservadora de BoNT/D, un fragmento activo de BoNt /D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/D o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o s Eq ID NO: 14 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEX ID NO: 14 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14.

En otro aspecto de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/E. En un aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/E y un dominio de unión de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende una variante natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E o un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende una variante natural de BoNT/E de Se Q ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E o un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende una variante no natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/E, una variante no conservadora de BoNT/E, un fragmento activo de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende una variante no natural de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/E, una variante no conservadora de BoNT/E, un fragmento activo de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/E o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ iD NO: 16 o SEQ ID NO: 17 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la Se Q ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17.

En otro aspecto de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/F. En un aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/F y un dominio de unión de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende la SEQ ID NO: 18, Se Q ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende una variante natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F o un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende una variante natural de BoNT/F de Se Q ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F o un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende una variante no natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/F, una variante no conservadora de BoNT/F, un fragmento activo de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende una variante no natural de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/F, una variante no conservadora de BoNT/F, un fragmento activo de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende un dominio enzimático de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/F o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende un dominio enzimático BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID n O: 19 o SEQ ID NO: 20 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la Se Q ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.

En otro aspecto de referencia, una toxina clostridial comprende una BoNT/G. En un aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de traslocación de BoNT/G y un dominio de unión de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende la SEQ ID NO: 21. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende una variante natural de BoNT/G, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/G o un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende una variante natural de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/G o un subtipo de BoNT/G de SEQ ID NO: 21. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/G comprende una variante no natural de BoNT/G, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/G, una variante no conservadora de BoNT/G o un fragmento activo de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende una variante no natural de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/G, una variante no conservadora de BoNT/G, un fragmento activo de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/G comprende un dominio enzimático de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/G o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/G comprende un dominio enzimático de BoNT/G de SEQ ID NO: 21 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BoNT/G de SEQ ID NO: 21 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/G de SEQ ID NO: 21 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 21; como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 21; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 21.

En otro aspecto de referencia, una toxina clostridial comprende una TeNT. En un aspecto de esta realización, una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT, un dominio de traslocación de TeNT y un dominio de unión de TeNT. En un aspecto de esta realización, una TeNT comprende la SEQ ID NO: 22. En otro aspecto de esta realización, una TeNT comprende una variante natural de TeNT, tal como, p. ej., una isoforma de TeNT o un subtipo de TeNT. En otro aspecto de esta realización, una TeNT comprende una variante natural de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., una isoforma de TeNT o un subtipo de TeNT. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende una variante no natural de TeNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de TeNT, una variante no conservadora de TeNT, un fragmento activo de TeNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende una variante no natural de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., una variante conservadora de TeNT, una variante no conservadora de TeNT, un fragmento activo de TeNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de TeNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de TeNT o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT de SEQ ID NO: 22 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de TeNT de SEQ ID NO: 22 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de TeNT de SEQ ID NO: 22 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 22; como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 22; como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 22.

En otro aspecto de referencia, una toxina clostridial comprende una BaNT. En un aspecto de esta realización, una BaNT comprende un dominio enzimático de BaNT, un dominio de traslocación de BaNT y un dominio de unión de BaNT. En otro aspecto de esta realización, una BaNT comprende la SEQ ID NO: 23. En otro aspecto de esta realización, una BaNT comprende una variante natural de BaNT, tal como, p. ej., una isoforma de BaNT o un subtipo de BaNT. En otro aspecto de esta realización, una BaNT comprende una variante natural de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., una isoforma de BaNT o un subtipo de BaNT. En otro aspecto más de esta realización, una BaNT comprende una variante no natural de BaNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de BaNT, una variante no conservadora de BaNT o un fragmento activo de BaNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BaNT comprende una variante no natural de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., una variante conservadora de BaNT, una variante no conservadora de BaNT, un fragmento activo de BaNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BaNT comprende un dominio enzimático de BaNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BaNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BaNT o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BaNT comprende un dominio enzimático de BaNT de SEQ ID NO: 23 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BaNT de SEQ ID NO: 23 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BaNT de SEQ ID NO: 23 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, una BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 23; como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, una BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 23; como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 23.

En otro aspecto de referencia, una toxina clostridial comprende una BuNT. En un aspecto de esta realización, una BuNT comprende un dominio enzimático de BuNT, un dominio de traslocación de BuNT, y un dominio de unión de BuNT. En otro aspecto de esta realización, una BuNT comprende la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otro aspecto de esta realización, una BuNT comprende una variante natural de BuNT, tal como, p. ej., una isoforma de BuNT o un subtipo de BuNT. En otro aspecto de esta realización, una BuNT comprende una variante natural de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, tal como, p. ej., una isoforma de BuNT o un subtipo de BuNT. En otro aspecto más de esta realización, una BuNT comprende una variante no natural de BuNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de BuNT, una variante no conservadora de BuNT, un fragmento activo de BuNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BuNT comprende una variante no natural de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, tal como, p. ej., una variante conservadora de BuNT, una variante no conservadora de BuNT, un fragmento activo de BuNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BuNT comprende un dominio enzimático de BuNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BuNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BuNT, un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BuNT comprende un dominio enzimático de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25 o un fragmento activo del mismo, un dominio de traslocación de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25 o un fragmento activo del mismo o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, una BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, una BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, una BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "toxina clostridial quimérica" o "quimeras de toxina clostridial" se refiere a una molécula que comprende al menos una parte de una toxina clostridial y una parte de al menos otra proteína para formar una toxina con al menos una propiedad diferente de las toxinas clostridiales de referencia de la tabla 1. Los ejemplos no limitantes de quimeras de toxinas clostridiales incluyen una toxina clostridial que comprende un dominio enzimático que no es de toxina clostridial, una toxina clostridial que comprende un dominio de traslocación que no es de toxina clostridial, una toxina clostridial que comprende un dominio de unión que no es de toxina clostridial, o cualquier combinación de los mismos. Otro ejemplo no limitante de una quimera de toxina clostridial incluye una toxina clostridial que comprende un dominio enzimático de una toxina clostridial diferente, una toxina clostridial que comprende un dominio de traslocación de una toxina clostridial diferente, una toxina clostridial que comprende un dominio de unión de una toxina clostridial diferente o cualquier combinación de los mismos.

Una clase de toxina clostridial quimérica comprende una toxina clostridial modificada donde el dominio enzimático o parte del mismo, dominio de traslocación o parte del mismo, y/o dominio de unión o parte del mismo de una toxina clostridial natural se modifica o se sustituye por un dominio enzimático o parte del mismo, dominio de traslocación o parte del mismo y/o dominio de unión o parte del mismo de una toxina clostridial diferente. Como ejemplo no limitante, el dominio de unión de BoNT/A se puede sustituir por el dominio de unión of BoNT/B produciendo toxina clostridial quimérica que comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/A, y un dominio de unión de BoNT/B. Dichas quimeras de toxinas clostridiales se describen, p. ej., en J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, patente de EE.UU. 7,132,259, que se incorpora por referencia en su totalidad. Como otro ejemplo no limitante, se puede insertar el motivo de leucina de BoNT/A en la cadena ligera de una BoNT/E con el fin de aumentar la persistencia biológica. Dichas quimeras de toxinas clostridiales se describen, p. ej., en Lance E. Steward et al., Leucine-based M otif and Clostridial Toxins, publicación de patente de EE.UU. 2003/0027752 (6 de Feb., 2003); Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, publicación de patente de EE.UU. 2003/0219462 (27 de nov., 2003); y Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, publicación de patente de EE.UU. 2004/0220386 (4 de nov., 2004).

Otra clase de toxina clostridial quimérica comprende una toxina clostridial donde el dominio de unión de una toxina clostridial natural se modifica o sustituye por un dominio de unión de una toxina no clostridial. Dichas quimeras de toxina clostridial tienen una actividad de unión celular alterada porque la toxina modificada puede p. ej., 1) usar el mismo receptor presente en la superficie de una célula diana de toxina clostridial natural que el usado por la toxina clostridial natural, referido como una actividad de unión celular potenciada para una célula diana de toxina clostridial natural; 2) usar un receptor diferente presente en la superficie de una célula diana de toxina clostridial natural, referido como una actividad de unión celular alterada para una célula diana de toxina clostridial natural; o 3) usar un receptor diferente presente en la superficie de la célula que no es diana de toxina clostridial, referido como una actividad de unión celular alterada para una célula diana de toxina clostridial no natural, una toxina redirigida o una TVEMP.

Una toxina clostridial quimérica puede ser toxina clostridial con una actividad de unión celular potenciada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural, p. ej., una neurona motora. Una forma de lograr esta actividad de unión potenciada es modificando el dominio de unión endógeno de una toxina clostridial natural con el fin de potenciar una actividad de unión celular de la toxina por su receptor natural. Dichas modificaciones en un dominio de direccionamiento producen, p. ej., una actividad de unión celular potenciada que aumenta la afinidad de unión por un receptor de toxina clostridial endógeno presente en una célula diana de toxina clostridial natural; una actividad de unión celular potenciada que aumenta la especificidad de unión por un subgrupo de receptores de toxina clostridial endógenos presentes en una célula diana de toxina clostridial natural; o una actividad de unión celular potenciada que aumenta tanto la afinidad de unión como la especificidad de unión. Los ejemplos no limitantes de toxinas clostridiales modificadas y actividad de unión celular potenciada para un receptor de toxina clostridial natural se describen, p. ej., en Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems, publicación de patente de EE.UU. 2008/0096248; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Enhanced Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente internacional 2008/105901.

Una toxina clostridial quimérica puede ser una toxina clostridial con una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural, p. ej., una neurona motora. Una forma de lograr esta capacidad alterada es sustituyendo el dominio de unión endógeno de una toxina clostridial natural por un dominio de unión de otra molécula que se une con preferencia a un receptor diferente presente en la superficie de una célula diana de toxina clostridial natural. Dicha modificación de un dominio de unión produce una toxina modificada que puede unirse con preferencia a un receptor que no es de toxina clostridial presente en una célula diana de toxina clostridial. Esta actividad de unión potenciada para una célula diana de toxina clostridial natural permite administrar dosis eficaces menores de una toxina clostridial modificada a un individuo porque se suministrará más toxina a la célula diana. Por lo tanto, las toxinas clostridiales modificadas con una actividad de unión potenciada reducirán la dispersión indeseada de la toxina a zonas a las que no está dirigido el tratamiento, reduciendo o previniendo de esta forma los efectos secundarios indeseables asociados con la difusión de una toxina clostridial a un sitio no deseado. Los ejemplos no limitantes de toxinas clostridiales modificadas con una capacidad de unión alterada por una célula diana de toxina clostridial se describen, p. ej., en Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods o f Their Use, patente de EE.u U. 7,514,088; Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente de EE.UU. 2008/0161543; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente de EE.UU. 2008/0241881; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods o f Their Use, publicación de patente de EE.UU. 2009/0048431; Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente internacional WO 2007/106115.

Una toxina clostridial quimérica puede ser una toxina clostridial con una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar una célula distinta de una célula diana de toxina clostridial, p. ej., una célula distinta de una neurona motora. Llamadas TVEMP, estas moléculas logran esta intoxicación usando un receptor diana presente en una célula que no diana es de toxina clostridial. Esta capacidad redirigida se logra sustituyendo un dominio de unión natural de una toxina clostridial por un dominio de unión que muestre una actividad de unión preferente por un receptor que no es de toxina clostridial presente en una célula que no es diana de toxina clostridial. Dichas modificaciones de un dominio de unión producen una toxina modificada que es capaz de unirse con preferencia a un receptor que no es de toxina clostridial presente en una célula que no es diana de toxina clostridial. Una toxina clostridial quimérica con una actividad de direccionamiento alterada por una célula que no es diana de toxina clostridial puede unirse a un receptor diana, traslocarse al citoplasma, y ejercer su efecto proteolítico en el complejo SNARE de la célula que no es diana de toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de quimeras de toxina clostridial con una actividad de direccionamiento alterada por una célula que no es diana de toxina clostridial se describen, p. ej., en Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, patente de EE.UU. 5,989,545; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, patente de EE.UU. 6,461,617; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment o f Mucus Hypersecretion, patente de EE.UU. 6,632,440; Lance E. Steward et al., Methods and Compositions for the Treatment o f Pancreatitis, patente de EE.UU. 6,843,998; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, patente de EE.UU. 7,132,259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, patente de EE.UU. 7,244,437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, patente de EE.UU. 7,413,742; Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, patente de EE.UU. 7,415,338; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods o f Their Use, patente de EE.UU. 7,514,088; Keith A. Foster et al., Inhibition o f Secretion from Non-neural Cells, publicación de patente de EE.UU. 2006/0216283; Keith A. Foster, Fusion Proteins, publicación de patente de EE.UU.

2008/0064092; Keith A. Foster, Fusion Proteins, publicación de patente de EE.UU. 2009/0035822; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods o f Their Use, publicación de patente de EE.UU.

2009/0048431; Keith A. Foster, Non-Cytotoxic Protein Conjugates, publicación de patente de EE.UU. 2009/0162341; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, publicación de patente internacional WO 2005/023309; y Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells, solicitud de patente internacional WO 2008/008805.

Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, un dominio enzimático de toxina clostridial. Como se usa en la presente memoria la expresión "dominio enzimático de toxina clostridial" se refiere a cualquier polipéptido de toxina clostridial que ejecuta la etapa de modificación enzimática de la diana del proceso de intoxicación. Por lo tanto, un dominio enzimático de toxina clostridial se dirige específicamente a un sustrato de toxina clostridial y abarca la escisión proteolítica de un sustrato de toxina clostridial, tal como. p. ej., proteínas SNARE como un sustrato SNAP-25, un sustrato VAMP y un sustrato sintaxina. Los ejemplos no limitantes de un dominio enzimático de toxina clostridial incluyen, p. ej., un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un dominio enzimático de BaNT y un dominio enzimático de BuNT.

Un dominio enzimático de toxina clostridial incluye, sin limitación, variantes de dominio enzimático de toxina clostridial, tales como, p. ej., isoformas de dominio enzimático de toxina clostridial y subtipos de dominio enzimático de toxina clostridial; y variantes no naturales de dominio enzimático de toxina clostridial, tales como, p. ej., variantes conservadoras de dominio enzimático de toxina clostridial, variantes no conservadoras de dominio enzimático de toxina clostridial, fragmentos activos de dominio enzimático de toxina clostridial de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante de dominio enzimático de toxina clostridial", sea natural o no natural, se refiere a un dominio enzimático de toxina clostridial que tiene al menos un cambio de aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia descritas (tabla 1) y se puede describir en porcentaje de identidad respecto a la región correspondiente de esa secuencia de referencia. Salvo que se indique de forma expresa, las variantes de dominio enzimático de toxina clostridial útiles para la práctica de las realizaciones descritas son variantes que ejecutan la etapa de modificación enzimática de la diana del proceso de intoxicación. Como ejemplos no limitantes, una variante de dominio enzimático de BoNT/A tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID NO: 1; una variante de dominio enzimático de BoNT/B tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 6; una variante de dominio enzimático de BoNT/C1 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 11; una variante de dominio enzimático de BoNT/D tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 13; una variante de dominio enzimático de BoNT/E tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID NO: 15; una variante de dominio enzimático de BoNT/F tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-428 de SEQ ID NO: 18; una variante de dominio enzimático de BoNT/G tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID NO: 21; una variante de dominio enzimático de TeNT tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID NO: 22; una variante de dominio enzimático de BaNT tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-420 de SEQ ID NO: 23; y una variante de dominio enzimático de BuNT tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID NO: 24.

Los expertos en la técnica reconocerán que dentro de cada serotipo de toxina clostridial puede haber variantes del dominio enzimático de toxina clostridial naturales que difieren algo en la secuencia de aminoácidos, y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, actualmente hay cinco subtipos de BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos de dominio enzimático específicos que muestran una identidad de aminoácidos de aproximadamente 80% a 95% comparado con el dominio enzimático de BoNT/A de SEQ ID NO: 1. Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante natural de dominio enzimático de toxina clostridial" se refiere a cualquier dominio enzimático de toxina clostridial producido por un proceso natural que incluye, sin limitación, isoformas de dominio enzimático de toxina clostridial producidas por transcritos de empalme alternativo. Las isoformas del dominio enzimático de toxina clostridial producidas por mutación espontánea y los subtipos de dominio enzimático de toxina clostridial. Una variante natural de dominio enzimático de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante natural de dominio enzimático de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva.

Un ejemplos no limitante de una variante natural de dominio enzimático de toxina clostridial es una isoforma de dominio enzimático de toxina clostridial tal como, p. ej., una isoforma de dominio enzimático de BoNT/A, una isoforma de dominio enzimático de BoNT/B, una isoforma de dominio enzimático de BoNT/C1, una isoforma de dominio enzimático de BoNT/D, una isoforma de dominio enzimático de BoNT/E, una isoforma de dominio enzimático de BoNT/F, una isoterma de dominio enzimático de BoNT/G, una isoterma de dominio enzimático de TeNT, una isoterma de dominio enzimático de BaNT y una isoterma de dominio enzimático de BuNT. Otro ejemplo no limitante de una variante de dominio enzimático de toxina clostridial natural es un subtipo de dominio enzimático de toxina clostridial tal como, p. ej., un dominio enzimático del subtipo BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 o BoNT/A5; un dominio enzimático del subtipo BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/Bbv o BoNT/Bnp; un dominio enzimático del subtipo BoNT/C1-1 o BoNT/C1-2; un dominio enzimático del subtipo BoNT/E1, BoNT/E2 y BoNT/E3; un dominio enzimático del subtipo BoNT/F1, BoNT/F2 o BoNT/F3; y un dominio enzimático del subtipo BuNT-1 o BuNT-2.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no natural de dominio enzimático de toxina clostridial " se refiere a cualquier dominio enzimático de toxina clostridial producido con ayuda de la manipulación humana, incluyendo, sin limitación, dominios enzimáticos de toxina clostridial producidos por manipulación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y dominios enzimáticos de toxina clostridial producidos por síntesis química. Los ejemplos no limitantes de variantes no naturales de dominio enzimático de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de dominio enzimático de toxina clostridial, variantes no conservadoras de dominio enzimático de toxina clostridial, variantes quiméricas de dominio enzimático de toxina clostridial y fragmentos activos de dominio enzimático de toxina clostridial.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial" se refiere a un dominio enzimático de toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio enzimático de toxina clostridial de referencia (tabla 1). Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de enlace de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica o similar o cualquier combinación de los mismos. Una variante conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/A, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/B, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/C1, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/D, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/E, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/F, variantes conservadoras de dominio enzimático de BoNT/G, variantes conservadoras de dominio enzimático de TeNT, variantes conservadoras de dominio enzimático de BaNT y variantes conservadoras de dominio enzimático de BuNT.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial" se refiere a un dominio enzimático de toxina clostridial en el que 1) se elimina al menos un aminoácido del dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial; 2) se añade al menos un aminoácido al dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar con el aminoácido original del dominio enzimático de toxina clostridial de referencia (tabla 1). Una variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial pude funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio enzimático de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/A, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/B, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/C1, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/D, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/E, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/F, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BoNT/G y variantes no conservadoras de dominio enzimático de TeNT, variantes no conservadoras de dominio enzimático de BaNT y variantes no conservadoras de dominio enzimático de BuNT.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "fragmento activo de dominio enzimático de toxina clostridial" se refiere a cualquiera de una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva con la condición de que estos fragmentos de dominio enzimático puedan dirigirse específicamente a los componentes nucleares del aparato de liberación de neurotransmisores y por lo tanto participar en la ejecución del mecanismo celular completo por el cual la toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Los dominios enzimáticos de toxinas clostridiales tienen aproximadamente 420-460 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio enzimático (tabla 1). La investigación ha mostrado que no es necesaria la longitud entera del dominio enzimático de la toxina clostridial para la actividad enzimática del dominio enzimático. Como un ejemplo no limitante, los primeros ocho aminoácidos del dominio enzimático de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitante, los primeros ocho aminoácidos del dominio enzimático de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Igualmente, el extremo carboxilo del dominio enzimático no es necesario para la actividad. Como un ejemplo no limitante, los últimos 32 aminoácidos del dominio enzimático de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitante, los últimos 31 aminoácidos del dominio enzimático de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Por lo tanto, aspectos de esta realización incluyen dominios enzimáticos de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, p. ej., al menos 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización incluyen dominios enzimáticos de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, p. ej., como máximo 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos.

Se puede usar cualquiera de una variedad de métodos de alineamiento de secuencias para determinar el porcentaje de identidad de variantes naturales de dominio enzimático de toxina clostridial y variantes no naturales de dominio enzimático de toxina clostridial, incluyendo, sin limitación, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como p. ej., métodos de aproximación de segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial modificada descrita en la presente memoria descriptiva comprende un dominio enzimático de toxina clostridial. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende una variante natural de dominio enzimático de toxina clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de dominio enzimático de toxina clostridial o un subtipo de dominio enzimático de toxina clostridial. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende una variante no natural de dominio enzimático de toxina clostridial, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial, una variante no conservadora de dominio enzimático de toxina clostridial, un fragmento activo de dominio enzimático de toxina clostridial o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, un aminoácido hidrófobo en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido hidrófobo. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos incluyen, p. ej., C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, p. ej., A, I, L, P y V. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido de apilamiento en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido de apilamiento. Los ejemplos de aminoácidos de apilamiento incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, p. ej., D, E, K, N, Q y R. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácido menos polar o indiferentes incluyen, p. ej., A, H, G, P, S, T e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, p. ej., K, R y H. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, p. ej., D y E. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido pequeño. Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, p. ej., A, D, G, N, P, S y T. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido ramificado en el C-beta en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio enzimático de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido ramificado en el C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados en el C-beta incluyen, p. ej., I, T y V.

El dominio enzimático de toxina clostridial de la invención comprende un dominio enzimático de BoNT/A de SEQ ID NO: 1 como se define adicionalmente en las reivindicaciones. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende una variante natural de dominio enzimático BoNT/A, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/A o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una isoforma de dominio enzimático de BoNT/A o un subtipo de dominio enzimático de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende los aminoácidos 1/2-429 de una variante natural de dominio enzimático de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., una isoforma de dominio enzimático de BoNT/A o un subtipo de dominio enzimático de BoNT/A. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/A, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/A, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/A, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende el dominio enzimático de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/A, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/A, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende los aminoácidos 1/2-429 de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/A, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/A, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID NO: 1; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID NO: 1.

En un aspecto de referencia, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende un dominio enzimático de BoNT/B. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende los dominios enzimáticos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende una variante dominio enzimático natural de BoNT/B, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/B o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende una variante de dominio enzimático natural de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, tal como, p. ej., una isoforma de dominio enzimático de BoNT/B o un subtipo de dominio enzimático de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende los aminoácidos 1/2-436 de una variante de dominio enzimático natural de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., una isoforma de dominio enzimático de BoNT/B o un subtipo de dominio enzimático de BoNT/B. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/B, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/B, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende el dominio enzimático de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/B, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/B, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende los aminoácidos 1/2-436 de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/B, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/B, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 6; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 6.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 6.

En un aspecto de referencia, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende un dominio enzimático de BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende los dominios enzimáticos de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/C1, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/C1 o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/C1 o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 1/2-436 de una variante natural de dominio enzimático de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/C1 o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/C1, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/C1, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/C1, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende el dominio enzimático de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/C1, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/C1, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 1/2-436 de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/C1, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/C1, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 11.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11.

En un aspecto de referencia, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende un dominio enzimático de BoNT/D. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende los dominios enzimáticos de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 13. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/D, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/D o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/D o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende los aminoácidos 1/2-436 de una variante natural de dominio enzimático de BoNT/D de SEQ ID NO: 13, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/D o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/D. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/D, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/D, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende el dominio enzimático de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o s Eq ID NO: 14, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/D, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/D, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende los aminoácidos 1/2-436 de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/D de SEQ ID NO: 13, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/D, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/D, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 13; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con los aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID NO: 13.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13.

En otro aspecto de referencia, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende un dominio enzimático de BoNT/E. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende los dominios enzimáticos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende los aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID NO: 15. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/E, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/E o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/E o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende los aminoácidos 1/2-411 de una variante natural de dominio enzimático de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/E o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/E. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/E, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/E, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende el dominio enzimático de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/E, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/E, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende los aminoácidos 1/2-411 de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/E, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/E, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o s Eq ID NO: 17; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15.

En otro aspecto de referencia, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende un dominio enzimático de BoNT/F. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende los dominios enzimáticos de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/F, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/F o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/F o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende los aminoácidos 1/2-428 de una variante natural de dominio enzimático de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/F o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/F. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/F, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/F, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende el dominio enzimático de un variante no natural de dominio enzimático de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/F, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/F, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende los aminoácidos 1/2-428 de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/F, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/F, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 1/2-428 de SEQ ID NO: 18; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o s Eq ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18.

En otro aspecto de referencia, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende un dominio enzimático de BoNT/G. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende los dominios enzimáticos de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/G, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/G o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende una variante natural de dominio enzimático de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/G o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende los aminoácidos 1/2-4435 de una variante natural de dominio enzimático de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BoNT/G o un dominio enzimático de subtipo de BoNT/G. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/G, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/G, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/G, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende el dominio enzimático de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/G, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/G, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende los aminoácidos 1/2-4435 de una variante no natural de dominio enzimático de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BoNT/G, una variante no conservadora de dominio enzimático de BoNT/G, un fragmento activo de dominio enzimático de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21.

En otro aspecto de referencia, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende un dominio enzimático de TeNT. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende los dominios enzimáticos de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende una variante natural de dominio enzimático de TeNT, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoforma de TeNT o un dominio enzimático de un subtipo de TeNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende una variante natural de dominio enzimático de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de TeNT o un dominio enzimático de subtipo de TeNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende los aminoácidos 1/2-438 de una variante natural de dominio enzimático de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de TeNT o un dominio enzimático de subtipo de TeNT. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende una variante no natural de dominio enzimático TeNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de TeNT, una variante no conservadora de dominio enzimático de TeNT, un fragmento activo de dominio enzimático de TeNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende el dominio enzimático de una variante no natural de dominio enzimático de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de TeNT, una variante no conservadora de dominio enzimático de TeNT, un fragmento activo de TeNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende los aminoácidos 1/2-438 de una variante no natural de dominio enzimático de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de TeNT, una variante no conservadora de dominio enzimático de TeNT, un fragmento activo de dominio enzimático de TeNT o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22.

En otro aspecto de referencia, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende un dominio enzimático de BaNT. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende los dominios enzimáticos de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende una variante natural de dominio enzimático de BaNT, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoforma de BaNT o un dominio enzimático de un subtipo de BaNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende una variante natural de dominio enzimático de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BaNT o un dominio enzimático de subtipo de BaNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende los aminoácidos 1/2-420 de una variante natural de dominio enzimático de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BaNT o un dominio enzimático de subtipo de BaNT. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende una variante no natural de dominio enzimático de BaNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BaNT, una variante no conservadora de dominio enzimático de BaNT, un fragmento activo de dominio enzimático de BaNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende el dominio enzimático de una variante no natural de dominio enzimático de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BaNT, una variante no conservadora de dominio enzimático de BaNT, un fragmento activo de dominio enzimático de BaNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende los aminoácidos 1/2-420 de una variante no natural de dominio enzimático de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BaNT, una variante no conservadora de dominio enzimático de BaNT, un fragmento activo de dominio enzimático de BaNT o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23.

En otro aspecto de referencia, un dominio enzimático de toxina clostridial comprende un dominio enzimático de BuNT. En un aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende los dominios enzimáticos de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende una variante natural de dominio enzimático de BuNT, tal como, p. ej., un dominio enzimático de una isoterma de BuNT o un dominio enzimático de un subtipo de BuNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende una variante natural de dominio enzimático de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BuNT o un dominio enzimático de subtipo de BuNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende los aminoácidos 1/2-411 de una variante natural de dominio enzimático de BuNT de SEQ ID NO: 24, tal como, p. ej., un dominio enzimático de isoforma de BuNT o un dominio enzimático de subtipo de BuNT. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende una variante no natural de dominio enzimático de BuNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BuNT, una variante no conservadora de dominio enzimático de BuNT, un fragmento activo de dominio enzimático de BuNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende el dominio enzimático de una variante no natural de dominio enzimático de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BuNT, una variante no conservadora de dominio enzimático de BuNT, un fragmento activo de dominio enzimático de BuNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende los aminoácidos 1/2-411 de una variante no natural de dominio enzimático de BuNT de SEQ ID NO: 24, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio enzimático de BuNT, una variante no conservadora de dominio enzimático de BuNT, un fragmento activo de dominio enzimático de BuNT o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.

En otros aspectos de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio enzimático de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID No : 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.

El "dominio de traslocación" comprende una parte de una cadena pesada de neurotoxina clostridial que tiene una actividad de traslocación. Por "traslocación" se entiende la capacidad de facilitar el transporte de un polipéptido a través de una membrana vesicular, exponiendo de esta forma algo o todo el polipéptido al citoplasma. En las diferentes neurotoxinas botulínicas se cree que la traslocación implica un cambio conformacional alostérico de la cadena pesada causado por una disminución del pH dentro del endosoma. Parece que este cambio conformacional implica y es mediado por la mitad N-terminal de la cadena pesada y da como resultado la formación de poros en la membrana vesicular; este cambio permite el movimiento de la cadena ligera proteolítica dentro de la vesícula endosómica al citoplasma. Véase, p. ej., Lacy, et al., Nature Struct. Biol. 5:898-902 (Octubre 1998).

La secuencia de aminoácidos de la parte que media la traslocación de la cadena pesada de la neurona botulínica es conocida para los expertos en la técnica; además, también se conocen los restos de aminoácidos dentro de esta parte que se sabe que son esenciales para conferir actividad de traslocación. Por lo tanto, el experto en la técnica tendría capacidad, por ejemplo, para usar la mitad del péptido N-terminal de la cadena pesada natural de cualquiera de los diferentes subtipos de neurotoxinas de Clostridium tetanus o Clostridium botulinum, como un dominio de traslocación, o para diseñar un dominio de traslocación análogo alineando las secuencias primarias de las mitades N-terminales de las diferentes cadenas pesadas y seleccionando una secuencia de traslocación principal de consenso basada en características de aminoácidos conservados, polaridad, estéricas e hidrofobicidad.

Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, un dominio de traslocación de toxina clostridial. Como se usa en la presente memoria, la expresión "dominio de traslocación de toxina clostridial" se refiere a cualquier polipéptido de toxina clostridial que puede ejecutar la etapa de traslocación del proceso de intoxicación que media la traslocación de la cadena ligera de la toxina clostridial. Por lo tanto, un dominio de traslocación de toxina clostridial facilita el movimiento de una cadena ligera de toxina clostridial a través de una membrana y abarca el movimiento de una cadena ligera de toxina clostridial a través de la membrana de una vesícula intracelular al citoplasma de una célula. Los ejemplos no limitantes de un dominio de traslocación de toxina clostridial incluyen, p. ej., un dominio de traslocación de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/B, un dominio de traslocación de BoNT/C1, un dominio de traslocación de BoNT/D, un dominio de traslocación de BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/G, un dominio de traslocación de TeNT, un dominio de traslocación de BaNT y un dominio de traslocación de BuNT.

Un dominio de traslocación de toxina clostridial incluye, sin limitación, variantes naturales de dominio de traslocación de toxina clostridial, tales como, p. ej., isoformas de dominio de traslocación de toxina clostridial y subtipos de dominio de traslocación de toxina clostridial; variantes no naturales de dominio de traslocación de toxina clostridial, tales como, p. ej., variantes conservadoras de dominio de traslocación de toxina clostridial, variantes no conservadoras de dominio de traslocación de toxina clostridial, fragmentos activos de dominio de traslocación de toxina clostridial de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante de dominio de traslocación de toxina clostridial," sea natural o no natural, se refiere a un dominio de traslocación de toxina clostridial que tiene al menos un cambio de aminoácido de la correspondiente región de las secuencias de referencia descritas (tabla 1) y se puede describir en porcentaje de identidad respecto a la correspondiente región de esa secuencia de referencia. Salvo que se indique expresamente lo contrario, las variantes de dominio de traslocación de toxina clostridial útiles para la práctica de las realizaciones descritas son variantes que ejecutan la etapa de traslocación del proceso de intoxicación que media la traslocación de la cadena ligera de toxina clostridial. Como ejemplos no limitantes, una variante dominio de traslocación de BoNT/A tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej.. una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1, en aspectos de referencia una variante de dominio de traslocación de BoNT/B tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6; una variante de dominio de traslocación de BoNT/C1 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11; una variante de dominio de traslocación de BoNT/D tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13; una variante de dominio de traslocación de BoNT/E tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15; una variante de dominio de traslocación de BoNT/F tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 446-865 de la SEQ ID NO: 18; una variante de dominio de traslocación de BoNT/G tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 451-865 de la SEQ ID NO: 21; una variante de dominio de traslocación de TeNT tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 468-881 de la SEQ ID NO: 22; una variante de dominio de traslocación de BaNT tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 436-857 de la SEQ ID NO: 23; y una variante de dominio de traslocación de BuNT tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 24.

El experto en la técnica reconoce que dentro de cada serotipo de toxina clostridial puede haber variantes de dominio de traslocación de toxina clostridial naturales que difieren algo en su secuencia de aminoácidos, y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, actualmente hay cinco subtipos de BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos específicos de dominio de traslocación que muestran una identidad de aminoácidos de aproximadamente 85-87% comparado con el subtipo de dominio de traslocación de BoNT/A de SEQ ID NO: 1. Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante natural de dominio de traslocación de toxina clostridial" se refiere a cualquier dominio de traslocación de toxina clostridial producido por un procedimiento natural, incluyendo, sin limitación, isoformas de dominio de traslocación de toxina clostridial producidas por transcritos empalmados de forma alternativa, isoformas de dominio de traslocación de toxina clostridial producidas por mutación espontánea y subtipos de dominio de traslocación de toxina clostridial. Una variante natural de dominio de traslocación de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio de traslocación de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante natural de dominio de traslocación de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio de traslocación de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva.

Un ejemplo no limitante de una variante natural de dominio de traslocación de toxina clostridial es una isoforma de dominio de traslocación de toxina clostridial tal como, p. ej., una isoforma de dominio de traslocación de BoNT/A, una isoterma de dominio de traslocación de BoNT/B, una isoterma de dominio de traslocación de BoNT/C1, una isoterma de dominio de traslocación de BoNT/D, una isoterma de dominio de traslocación de BoNT/E, una isoterma de dominio de traslocación de BoNT/F, una isoforma de dominio de traslocación de BoNT/G, una isoforma de TeNT dominio de traslocación, una isoforma de dominio de traslocación de BaNT y una isoforma de dominio de traslocación de BuNT. Otro ejemplo no limitante de una variante natural de dominio de traslocación de toxina clostridial es un subtipo de dominio de traslocación de toxina clostridial tal como, p. ej., un dominio de traslocación de subtipo BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5; un dominio de traslocación de subtipo BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B bivalente y BoNT/B no proteolítica; un dominio de traslocación de subtipo BoNT/C1-1 y BoNT/C1-2; un dominio de traslocación de subtipo BoNt /E1, BoNT/E2 y BoNT/E3; un dominio de traslocación de subtipo BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3; y un dominio de traslocación de subtipo BuNT-1 y BuNT-2.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no natural de dominio de traslocación de toxina clostridial" se refiere a cualquier dominio de traslocación de toxina clostridial producido con ayuda de la manipulación humana, incluyendo, sin limitación, dominios de traslocación de toxina clostridial producidos por modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y dominios de traslocación de toxina clostridial producidos por síntesis química. Los ejemplos no limitantes de variantes no natural de dominio de traslocación de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de dominio de traslocación de toxina clostridial, variantes no conservadoras de dominio de traslocación de toxina clostridial, y fragmentos activos de dominio de traslocación de toxina clostridial.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial" se refiere a un dominio de traslocación de toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de referencia de dominio de traslocación de toxina clostridial (tabla 1). Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de formar enlace covalente, capacidad de formar enlace de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares, o cualquier combinación de las mismas. Una variante conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio de traslocación de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio de traslocación de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/A, variantes conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/B, variantes conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/C1, variantes conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/D, variantes conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/E, variantes conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/F, variantes conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/G, variantes conservadoras de dominio de traslocación de TeNT, variantes conservadoras de dominio de traslocación de BaNT y variantes conservadoras de dominio de traslocación de BuNT.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial" se refiere a un dominio de traslocación de toxina clostridial en el que 1) se elimina al menos un aminoácido del dominio de traslocación de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial; 2) se añade al menos un aminoácido al dominio de traslocación de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de referencia de dominio de traslocación de toxina clostridial (tabla 1). Una variante no conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio de traslocación de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio de traslocación de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante no conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/A, variantes no conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/B, variantes no conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/C1, variantes no conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/D, variantes no conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/E, variantes no conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/F, variantes no conservadoras de dominio de traslocación de BoNT/G, y variantes no conservadoras de dominio de traslocación de TeNT, variantes no conservadoras de dominio de traslocación de BaNT y variantes no conservadoras de dominio de traslocación de BuNT.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "fragmento activo de dominio de traslocación de toxina clostridial" se refiere a cualquiera de una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprenden el dominio de traslocación que pueden ser útiles en aspectos de la presente memoria descriptiva con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de la LC de las vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana y así participar en la ejecución del mecanismo celular completo por el que una toxina clostridial escinde de forma proteolítica un sustrato. Los dominios de traslocación de las cadenas pesadas de las toxinas clostridiales tienen aproximadamente 410-430 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de traslocación (tabla 1). La investigación ha mostrado que no es necesaria la longitud entera de un dominio de traslocación de una cadena pesada de toxina clostridial para la actividad de traslocación del dominio de traslocación. Por lo tanto, aspectos de esta invención incluyen un dominio de traslocación de toxina clostridial que tiene una longitud de, p. ej., al menos 350, 375, 400 o 425 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización incluyen un dominio de traslocación de toxina clostridial que tiene una longitud de, p. ej., como máximo 350, 375, 400 o 425 aminoácidos.

Se puede usar cualquiera de una variedad de métodos de alineamiento para determinar el porcentaje de identidad de variantes naturales de dominio de traslocación de toxina clostridial y variantes no naturales de dominio de traslocación de toxina clostridial, incluyendo, sin limitación, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tal como, p. ej., métodos de aproximación de segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial modificada descrita en la presente memoria descriptiva comprende un dominio de traslocación de toxina clostridial. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un variante natural de dominio de traslocación de toxina clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de dominio de traslocación de toxina clostridial o un subtipo de dominio de traslocación de toxina clostridial. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende una variante no natural de dominio de traslocación de toxina clostridial, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial, una variante no conservadora de dominio de traslocación de toxina clostridial, un fragmento activo de dominio de traslocación de toxina clostridial o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, un aminoácido hidrófobo en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido hidrófobo. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos incluyen, p. ej., C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, p. ej., A, I, L, P y V. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido de apilamiento en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido de apilamiento. Los ejemplos de aminoácido de apilamientos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, p. ej., D, E, K, N, Q y R. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, p. ej., A, H, G, P, S, T e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, p. ej., K, R y H. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, p. ej., D y E. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido pequeño. Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, p. ej., A, D, G, N, P, S y T. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido ramificado en el C-beta en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de traslocación de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido ramificado en el C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados en el C-beta incluyen, p. ej., I, T y V.

En otra realización, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de BoNT/A. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/A, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/A o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, Se Q ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/A o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende los aminoácidos 455-873 de una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/A o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/A. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende una variante no natural BoNT/A dominio de traslocación, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/A, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/A, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/A, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/A, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende los aminoácidos 455-873 de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/A, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/A, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1.

En un aspecto de referencia, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de BoNT/B. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/B, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/B o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/B o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende los aminoácidos 447-860 de una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/B o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/B. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/B, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/B, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/B, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/B, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende los aminoácidos 447-860 de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/B, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/B, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 447-860 de SEQ ID NO: 6.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 6, SEQ ID n O: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto de referencia, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNt /C 1 comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/C1, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/C1 o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/C1 o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 454-868 de una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/C1 o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/C1, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/C1, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/C1, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/C1, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/C1, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 454-868 de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/C1, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/C1, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 454 868 de la SEQ ID NO: 11. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11.

En otro aspecto de referencia, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de BoNT/D. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende los aminoácidos 451-864 de SEQ ID NO: 13. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/D, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/D o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/D o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende los aminoácidos 451-864 de una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/D de SEQ ID NO: 13, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/D o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/D. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/D, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/D, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/D, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/D, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende los aminoácidos 451-864 de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/D de SEQ ID NO: 13, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/D, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/D, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 451 864 de la SEQ ID NO: 13. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13.

En otro aspecto de referencia, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de BoNT/E. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/E, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/E o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/E o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende los aminoácidos 427-847 de una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/E o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/E. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/E, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/E, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNt /E comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/E, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/E, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende los aminoácidos 427-847 de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/E, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/E, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15.

En otro aspecto de referencia, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de BoNT/F. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende los aminoácidos 446-865 de SEQ ID NO: 18. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/F, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoterma de BoNT/F o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/F o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende los aminoácidos 446-865 de una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/F o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/F. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/F, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/F, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNt /F comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/F, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/F, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende los aminoácidos 446-865 de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/F, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/F, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 446-865 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 446-865 de la SEQ ID NO: 18.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 446-865 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 446-865 de la SEQ ID NO: 18. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 446-865 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 446-865 de la SEQ ID NO: 18.

En otro aspecto de referencia, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de BoNT/G. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende los aminoácidos 451-865 de la s Eq ID NO: 21. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/G, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/G o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/G o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende los aminoácidos 451-865 de una variante natural de dominio de traslocación de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BoNT/G o un dominio de traslocación de subtipo de BoNT/G. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/G, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/G, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/G, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/G, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/G, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende los aminoácidos 451-865 de una variante no natural de dominio de traslocación de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BoNT/G, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BoNT/G, un fragmento activo de dominio de traslocación de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 451-865 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 451-865 de la SEQ ID NO: 21.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 451-865 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 451-865 de la SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 451-865 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 451-865 de la SEQ ID NO: 21.

En otro aspecto de referencia, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de TeNT. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende los aminoácidos 468-881 de SEQ ID NO: 22. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende una variante natural de dominio de traslocación de TeNT, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoforma de TeNT o un dominio de traslocación de un subtipo de TeNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende una variante natural de dominio de traslocación de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de TeNT o un dominio de traslocación de subtipo de TeNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende los aminoácidos 468-881 de una variante natural de dominio de traslocación de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de TeNT o un dominio de traslocación de subtipo de TeNT. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende una variante no natural de dominio de traslocación de TeNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de TeNT, una variante no conservadora de dominio de traslocación de TeNT, un fragmento activo de dominio de traslocación de TeNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de TeNT, una variante no conservadora de dominio de traslocación de TeNT, un fragmento activo de dominio de traslocación de TeNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende los aminoácidos 468-881 de una variante no natural de dominio de traslocación de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de TeNT, una variante no conservadora de dominio de traslocación de TeNT, un fragmento activo de dominio de traslocación de TeNT o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 468-881 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 468-881 de la SEQ ID NO: 22.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 468-881 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 468-881 de la SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 468-881 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 468-881 de la SEQ ID NO: 22.

En otro aspecto de referencia, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de BaNT. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende los dominios de traslocación de SEQ Id NO: 23. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende los aminoácidos 436-857 de la SEQ ID NO: 23. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende una variante natural de dominio de traslocación de BaNT, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoforma de BaNT o un dominio de traslocación de un subtipo de BaNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende una variante natural de dominio de traslocación de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BaNT o un dominio de traslocación de subtipo de BaNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende los aminoácidos 436-857 de una variante natural de dominio de traslocación de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BaNT o un dominio de traslocación de subtipo de BaNT. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende una variante no natural de dominio de traslocación de BaNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BaNT, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BaNT, un fragmento activo de dominio de traslocación de BaNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BaNT, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BaNT, un fragmento activo de dominio de traslocación de BaNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende los aminoácidos 436-857 de una variante no natural de dominio de traslocación de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BaNT, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BaNT, un fragmento activo de dominio de traslocación de BaNT o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 436-857 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 436-857 de la SEQ ID NO: 23.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 436-857 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 436-857 de la SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 436-857 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 436-857 de la SEQ ID NO: 23.

En otro aspecto de referencia, un dominio de traslocación de toxina clostridial comprende un dominio de traslocación de BuNT. En un aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 24. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende una variante natural de dominio de traslocación de BuNT, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de una isoforma de BuNT o un dominio de traslocación de un subtipo de BuNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende una variante natural de dominio de traslocación de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BuNT o un dominio de traslocación de subtipo de BuNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende los aminoácidos 427-847 de una variante natural de dominio de traslocación de BuNT de SEQ ID NO: 24, tal como, p. ej., un dominio de traslocación de isoforma de BuNT o un dominio de traslocación de subtipo de BuNT. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende una variante no natural de dominio de traslocación de BuNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BuNT, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BuNT, un fragmento activo de dominio de traslocación de BuNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende el dominio de traslocación de una variante no natural de dominio de traslocación de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BuNT, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BuNT, un fragmento activo de dominio de traslocación de BuNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende los aminoácidos 427-847 de una variante no natural de dominio de traslocación de BuNT de SEQ ID NO: 24, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de traslocación de BuNT, una variante no conservadora de dominio de traslocación de BuNT, un fragmento activo de dominio de traslocación de BuNT o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 427 847 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID No : 25.

Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, un dominio de unión. Como se usa en la presente memoria, la expresión "dominio de unión" es sinónimo de "ligando" o "resto director" y se refiere a cualquier molécula que interaccione con preferencia con otra molécula presente en la superficie de una célula en condiciones fisiológicas.

La molécula de superficie celular puede comprender un polipéptido, un polisacárido, un lípido, o puede tener características estructurales de más de uno de estos. Como se usa en la presente memoria, la expresión "interacciona con preferencia" se refiere a la molécula que es capaz de unirse a su receptor diana en condiciones fisiológicas, o en condiciones in vitro que se aproximan sustancialmente a las condiciones fisiológicas, en un grado estadísticamente significativamente mayor respecto a otro receptor no diana. En relación a un dominio de unión de toxina clostridial descrita en la presente memoria descriptiva, hay una unión discriminatoria del dominio de unión de toxina clostridial con su receptor cognado con respecto a otros receptores. En relación con un dominio de unión que no es de toxina clostridial descrito en la presente memoria descriptiva, hay una unión discriminatoria del dominio de unión que no es de toxina clostridial con su receptor cognado, con respecto a otros receptores.

Por lo tanto, en una realización, un dominio de unión que se une selectivamente a un receptor diana tiene una constante de equilibrio de disociación (Kd) que es mayor para el receptor diana con respecto a un receptor no diana en p. ej., al menos una vez, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000, al menos 10,000, o al menos 100,000 veces.

Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, un dominio de unión de toxina clostridial. Como se usa en la presente memoria, la expresión "dominio de unión de toxina clostridial" se refiere a cualquier polipéptido de toxina que puede ejecutar la etapa de unión del proceso de intoxicación que inicial el mecanismo de internalización completo, por el cual la toxina clostridial modificada descrita en la presente memoria descriptiva intoxica una célula diana. Los ejemplos no limitantes de un dominio de unión de toxina clostridial incluyen, p. ej., un dominio de unión de BoNT/A, un dominio de unión de BoNT/B, un dominio de unión de BoNT/C1, un dominio de unión de BoNT/D, un dominio de unión de BoNT/E, un dominio de unión de BoNT/F, un dominio de unión de BoNT/G, un dominio de unión de TeNT, un dominio de unión de BaNT, y un dominio de unión de BuNT. Otros ejemplos no limitantes de un dominio de unión de toxina clostridial incluyen, p. ej., los aminoácidos 874-1296 de la SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 861 1291 de la SEQ ID NO: 2, los aminoácidos 869-1291 de la SEQ ID NO: 3, los aminoácidos 865-1291 de la SEQ ID NO: 4, los aminoácidos 848-1252 de la SEQ ID NO: 5, los aminoácidos 866-1274 de la SEQ ID NO: 6, los aminoácidos

866-1297 de la SEQ ID NO: 7, los aminoácidos 882-1315 de la SEQ ID NO: 8, los aminoácidos 858-1268 de la SEQ

ID NO: 9, y los aminoácidos 848-1251 de la SEQ ID NO: 10.

Un dominio de unión de toxina clostridial incluye, sin limitación, variantes naturales de dominio de unión de toxina clostridial, tal como, p. ej., isoformas de dominio de unión de toxina clostridial y subtipos de dominio de unión de toxina clostridial; variantes no naturales de dominio de unión de toxina clostridial, tales como, p. ej., variantes conservadoras de dominio de unión de toxina clostridial, variantes no conservadoras de dominio de unión de toxina clostridial, fragmentos activos de dominio de unión de toxina clostridial de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante de dominio de unión de toxina clostridial," sea natural o no natural, se refiere a un dominio de unión de toxina clostridial que tiene al menos un cambio de aminoácido de la correspondiente región de las secuencias de referencia descritas (tabla 1) y se puede describir en porcentaje de identidad respecto a la correspondiente región de esa secuencia de referencia. Salvo que se indique expresamente, las variantes de dominio de unión de toxina clostridial útiles para la práctica de las realizaciones descritas son variantes que ejecutan la etapa de traslocación del proceso de intoxicación que media la traslocación de cadena ligera de toxina clostridial. Como ejemplos no limitantes, una variante de dominio de unión de BoNT/A tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 874-1296 de la SEQ ID NO: 1; una variante de dominio de unión de BoNT/B tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 861-1291 de la SEQ Id NO: 6; una variante de dominio de unión de BoNT/C1 tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 869-1291 de la SEQ ID NO: 11; una variante de dominio de unión de BoNT/D tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 865-1291 de la SEQ ID NO: 13; una variante de dominio de unión de BoNT/E tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 848-1252 de la SEQ ID NO: 15; una variante de dominio de unión de BoNT/F tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 866-1274 de SEQ ID NO: 18; una variante de dominio de unión de BoNT/G tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 866-1297 de la SEQ Id NO: 21; una variante de dominio de unión de TeNT tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 882-1315 de la SEQ Id NO: 22; una variante de dominio de unión de BaNT tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 858-1268 de la SEQ ID NO: 23; y una variante de dominio de unión de BuNT tendrá una diferencia de al menos un aminoácido, tal como, p. ej., una sustitución, eliminación o adición de aminoácido, comparado con los aminoácidos 848-1251 de la SEQ ID NO: 24.

Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada serotipo de toxina clostridial puede haber variantes naturales de dominio de unión de toxina clostridial que difieren algo en su secuencia de aminoácidos, y también en los ácidos nucleicos que codifican esas proteínas. Por ejemplo, actualmente hay cinco subtipos de BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos específicos de dominio de unión que muestran una identidad de aminoácidos de aproximadamente 83-97% comparado con el subtipo de dominio de unión de BoNT/A de SEQ ID NO: 1. Como otro ejemplo, hay actualmente cinco subtipos de BoNt /A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos específicos de dominio de unión que muestran una identidad de aminoácidos de aproximadamente 83-97% comparado con el subtipo de dominio de unión de BoNT/A de SEQ ID NO: 1. Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante natural de dominio de unión de toxina clostridial" se refiere a cualquier dominio de unión de toxina clostridial producido por un procedimiento natural, incluyendo, sin limitación, isoformas de dominio de unión de toxina clostridial producidas a partir de transcritos empalmados de forma alternativa, isoformas de dominio de unión de toxina clostridial producidas por mutación espontánea y subtipos de dominio de unión de toxina clostridial. Una variante natural de dominio de unión de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio de unión de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante natural de dominio de unión de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio de unión de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva.

Un ejemplo no limitante de una variante natural de dominio de unión de toxina clostridial es una isoforma de dominio de unión de toxina clostridial tal como, p. ej., una isoforma de dominio de unión de BoNT/A, una isoforma de dominio de unión de BoNT/B, una isoforma de dominio de unión de BoNT/C1, una isoforma de dominio de unión de BoNT/D, una isoforma de dominio de unión de BoNT/E, una isoforma de dominio de unión de BoNT/F, una isoforma de dominio de unión de BoNT/G, una isoforma de dominio de unión de TeNT, una isoforma de dominio de unión de BaNT, y una isoforma de dominio de unión de BuNT. Otro ejemplo no limitante de una variante natural de dominio de unión de toxina clostridial es un subtipo de dominio de unión de toxina clostridial tal como, p. ej., un dominio de unión del subtipo BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5; un dominio de unión del subtipo BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B bivalente y BoNT/B no proteolítico; un dominio de unión del subtipo BoNT/C1-1 y BoNT/C1-2; un dominio de unión del subtipo BoNT/E1, BonT/E2 y BoNT/E3; y un dominio de unión del subtipo BoNT/F1, BoNT/F2, y BoNT/F3; y un dominio de unión del subtipo BuNT-1 y BuNT-2.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no natural de dominio de unión de toxina clostridial" se refiere a cualquier dominio de unión de toxina clostridial producido con ayuda de la manipulación humana, incluyendo, sin limitación, dominios de unión de toxina clostridial producidos por modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y dominios de unión de toxina clostridial producidos por síntesis química. Los ejemplos no limitantes de variantes no naturales de dominio de unión de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de dominio de unión de toxina clostridial, variantes no conservadoras de dominio de unión de toxina clostridial, variantes quiméricas de dominio de unión de toxina clostridial y fragmentos activos de dominio de unión de toxina clostridial.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante conservadora de dominio de unión de toxina clostridial" se refiere a un dominio de unión de toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de referencia de dominio de unión de toxina clostridial (tabla 1). Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de formar enlace covalente, capacidad de formar enlace de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares, o cualquier combinación de los mismos. Una variante conservadora de dominio de unión de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio de unión de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante conservadora de dominio de unión de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio de unión de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante conservadora de dominio de unión de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de dominio de unión de BoNT/A, variantes conservadoras de dominio de unión de BoNT/B, variantes conservadoras de dominio de unión de BoNT/C1, variantes conservadoras de dominio de unión de BoNT/D, variantes conservadoras de dominio de unión de BoNT/E, variantes conservadoras de dominio de unión de BoNT/F, variantes conservadoras de dominio de unión de BoNT/G, variantes conservadoras de dominio de unión de TeNT, variantes conservadoras de dominio de unión de BaNT y variantes conservadoras de dominio de unión de BuNT.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no conservadora de dominio de unión de toxina clostridial" se refiere a un dominio de unión de toxina clostridial en el que 1) se elimina al menos un aminoácido del dominio de unión de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio de unión de toxina clostridial; 2) se añade al menos un aminoácido al dominio de unión de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio de unión de toxina clostridial; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de referencia de dominio de unión de toxina clostridial (tabla 1). Una variante no conservadora de dominio de unión de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio de unión de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio de unión de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio de unión de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante no conservadora de dominio de unión de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de dominio de unión de BoNT/A, variantes no conservadoras de dominio de unión de BoNT/B, variantes no conservadoras de dominio de unión de BoNT/C1, variantes no conservadoras de dominio de unión de BoNT/D, variantes no conservadoras de dominio de unión de BoNT/E, variantes no conservadoras de dominio de unión de BoNT/F, variantes no conservadoras de dominio de unión de BoNT/G y variantes no conservadoras de dominio de unión de TeNT, variantes no conservadoras de dominio de unión de BaNT, y variantes no conservadoras de dominio de unión de BuNT.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "fragmento activo de dominio de unión de toxina clostridial" se refiere a cualquiera de una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprenden dominio de unión que pueden ser útiles en aspectos de la presente memoria descriptiva con la condición de que esos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de la lC de las vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana, y así participar en la ejecución del mecanismo celular general por el que la toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Los dominios de unión de las cadenas pesadas de las toxinas clostridiales tienen aproximadamente 400-440 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de unión (tabla 1). La investigación ha mostrado que no es necesaria la longitud entera de un dominio de unión de una cadena pesada de toxina clostridial para la actividad de traslocación del dominio de unión. Por lo tanto, aspectos de esta realización incluyen un dominio de unión de toxina clostridial que tienen una longitud de, p. ej., al menos 350, 375, 400 o 425 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización incluyen un dominio de unión de toxina clostridial que tienen una longitud de, p. ej., como máximo 350, 375, 400 o 425 aminoácidos.

Se puede usar cualquiera de una variedad de métodos de alineamiento para determinar el porcentaje de identidad de variantes naturales de dominio de unión de toxina clostridial y variantes no naturales de dominio de unión de toxina clostridial, incluyendo, sin limitación, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tal como, p. ej., métodos de aproximación de segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial modificada descrita en la presente memoria descriptiva comprende un dominio de unión de toxina clostridial. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende una variante natural de dominio de unión de toxina clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de dominio de unión de toxina clostridial o un subtipo de dominio de unión de toxina clostridial. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende una variante no natural de dominio de unión de toxina clostridial, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de toxina clostridial, una variante no conservadora de dominio de unión de toxina clostridial, un fragmento activo de dominio de unión de toxina clostridial o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, un aminoácido hidrófobo en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido hidrófobo. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos incluyen, p. ej., C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, p. ej., A, I, L, P y V. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido de apilamiento en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido de apilamiento. Los ejemplos de aminoácido de apilamientos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, p. ej., D, E, K, N, Q y R. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, p. ej., A, H, G, P, S, T e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, p. ej., K, R y H. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, p. ej., D y E. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido pequeño. Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, p. ej., A, D, G, N, P, S y T. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido ramificado en el C-beta en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido ramificado en el C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados en el C-beta incluyen, p. ej., I, T y V.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de BoNT/A. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende los aminoácidos 874-1296 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNt /A comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/A, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoterma de BoNT/A o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoterma de BoNT/A o un dominio de unión de subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende los aminoácidos 874-1296 de una variante natural de dominio de unión de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/A o un dominio de unión de subtipo de BoNT/A. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende una variante no natural de dominio de unión de BoNT/A, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/A, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/A, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/A, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/A, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende los aminoácidos 874-1296 de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/A, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/A, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/A o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 874-1296 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 874-1296 de la SEQ ID NO: 1.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 874-1296 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 874-1296 de la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID No : 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 874-1296 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 874-1296 de la SEQ ID NO: 1.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de BoNT/B. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende los aminoácidos 861-1291 de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNt /B comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/B, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoforma de BoNT/B o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/B o un dominio de unión de subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende los aminoácidos 861-1291 de una variante natural de dominio de unión de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/B o un dominio de unión de subtipo de BoNT/B. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende una variante no natural de dominio de unión de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/B, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/B, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/B, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/B, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende los aminoácidos 861-1291 de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/B de SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/B, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/B, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/B o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 861-1291 de la SEQ ID NO: 6.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 861-1291 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 861 1291 de la SEQ ID NO: 6.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 869-1291 de la SEQ ID NO: 11. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/C1, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoforma de BoNT/C1 o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/C1 o un dominio de unión de subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 869-1291 de una variante natural de dominio de unión de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/C1 o un dominio de unión de subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende una variante no natural de dominio de unión de BoNT/C1, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/C1, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/C1, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/C1, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/C1, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 869-1291 de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 11, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/C1, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/C1, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/C1 o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 869-1291 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 869-1291 de la SEQ ID NO: 11.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 869 1291 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 869-1291 de la SEQ ID NO: 11. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 869-1291 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 869-1291 de la SEQ ID NO: 11.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de BoNT/D. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende los dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende los aminoácidos 865-1291 de la SEQ ID NO: 13. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/D, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoforma de BoNT/D o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/D o un dominio de unión de subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende los aminoácidos 865-1291 de una variante natural de dominio de unión de BoNT/D de SEQ ID NO: 13, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/D o un dominio de unión de subtipo de BoNT/D. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende una variante no natural de dominio de unión de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/D, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/D, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/D de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/D, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/D, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende los aminoácidos 865-1291 de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/D de SEQ ID NO: 13, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/D, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/D, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/D o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 865-1291 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 865-1291 de la SEQ ID NO: 13.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 865 1291 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 865-1291 de la SEQ ID NO: 13. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 865-1291 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 865-1291 de la SEQ ID NO: 13.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de BoNT/E. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende los dominio de unión de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende los aminoácidos 848-1252 de la SEQ ID NO: 15. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/E, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoforma de BoNT/E o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/E o un dominio de unión de subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende los aminoácidos 848-1252 de una variante natural de dominio de unión de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/E o un dominio de unión de subtipo de BoNT/E. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende una variante no natural de dominio de unión de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/E, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/E, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/E, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/E, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende los aminoácidos 848-1252 de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/E de SEQ ID NO: 15, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/E, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/E, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/E o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 848 1252 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 848-1252 de la SEQ ID NO: 15.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 848-1252 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 848 1252 de la SEQ ID NO: 15. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o s Eq ID NO: 17; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 848-1252 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 848-1252 de la SEQ ID NO: 15.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de BoNT/F. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende los dominio de unión de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende los aminoácidos 866-1274 de la SEQ ID NO: 18. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/F, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoterma de BoNT/F o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/F o un dominio de unión de subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende los aminoácidos 866-1274 de una variante natural de dominio de unión de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/F o un dominio de unión de subtipo de BoNT/F. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende una variante no natural de dominio de unión de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/F, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/F, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/F, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/F, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende los aminoácidos 866-1274 de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/F de SEQ ID NO: 18, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/F, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/F, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/F o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 866 1274 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 866-1274 de la SEQ ID NO: 18.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 866-1274 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 866 1274 de la SEQ ID NO: 18. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o s Eq ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 866-1274 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 866-1274 de la SEQ ID NO: 18.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de BoNT/G. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende los aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 21. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/G, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoforma de BoNT/G o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende una variante natural de dominio de unión de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/G o un dominio de unión de subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende los aminoácidos 866-1297 de una variante natural de dominio de unión de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BoNT/G o un dominio de unión de subtipo de BoNT/G. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende una variante no natural de dominio de unión de BoNT/G, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/G, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/G, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/G, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/G, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende los aminoácidos 866-1297 de una variante no natural de dominio de unión de BoNT/G de SEQ ID NO: 21, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BoNT/G, una variante no conservadora de dominio de unión de BoNT/G, un fragmento activo de dominio de unión de BoNT/G o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNt /G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 866-1297 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 866 1297 de la SEQ ID NO: 21.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 866-1297 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 866-1297 de la SEQ ID NO: 21. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 866-1297 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 866 1297 de la SEQ ID NO: 21.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de TeNT. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende los aminoácidos 882-1315 de la SEQ ID NO: 22. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende una variante natural de dominio de unión de TeNT, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoforma de TeNT o un dominio de unión de un subtipo de TeNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende una variante natural de dominio de unión de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de TeNT o un dominio de unión de subtipo de TeNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende los aminoácidos 882-1315 de una variante natural de dominio de unión de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de TeNT o un dominio de unión de subtipo de TeNT. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende una variante no natural de dominio de unión de TeNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de TeNT, una variante no conservadora de dominio de unión de TeNT, un fragmento activo de dominio de unión de TeNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de TeNT de SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de TeNT, una variante no conservadora de dominio de unión de TeNT, un fragmento activo de dominio de unión de TeNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende los aminoácidos 882-1315 de una variante no natural de dominio de unión de TeNT de la SEQ ID NO: 22, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de TeNT, una variante no conservadora de dominio de unión de TeNT, un fragmento activo de dominio de unión de TeNT o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 882-1315 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 882 1315 de la SEQ ID NO: 22.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 882-1315 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 882-1315 de la SEQ ID NO: 22. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 882-1315 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 882-1315 de la SEQ ID NO: 22.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de BaNT. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende los aminoácidos 858-1268 de la SEQ ID NO: 23. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende una variante natural de dominio de unión de BaNT, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoforma de BaNT o un dominio de unión de un subtipo de BaNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende una variante natural de dominio de unión de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BaNT o un dominio de unión de subtipo de BaNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende los aminoácidos 858-1268 de una variante natural de dominio de unión de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BaNT o un dominio de unión de subtipo de BaNT. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende una variante no natural de dominio de unión de BaNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BaNT, una variante no conservadora de dominio de unión de BaNT, un fragmento activo de dominio de unión de BaNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BaNT, una variante no conservadora de dominio de unión de BaNT, un fragmento activo de dominio de unión de BaNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende los aminoácidos 858-1268 de una variante no natural de dominio de unión de BaNT de SEQ ID NO: 23, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BaNT, una variante no conservadora de dominio de unión de BaNT, un fragmento activo de dominio de unión de BaNT o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 858-1268 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 858 1268 de la SEQ ID NO: 23.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 858-1268 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 858-1268 de la SEQ ID NO: 23. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 858-1268 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 858-1268 de la SEQ ID NO: 23.

En otra realización, un dominio de unión de toxina clostridial comprende un dominio de unión de BuNT. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende los aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 24. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende una variante natural de dominio de unión de BuNT, tal como, p. ej., un dominio de unión de una isoforma de BuNT o un dominio de unión de un subtipo de BuNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende una variante natural de dominio de unión de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BuNT o un dominio de unión de subtipo de BuNT. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende los aminoácidos 848-1251 de una variante natural de dominio de unión de BuNT de SEQ ID NO: 24, tal como, p. ej., un dominio de unión de isoforma de BuNT o un dominio de unión de subtipo de BuNT. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende una variante no natural de dominio de unión de BuNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BuNT, una variante no conservadora de dominio de unión de BuNT, un fragmento activo de dominio de unión de BuNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende el dominio de unión de una variante no natural de dominio de unión de BuNT de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BuNT, una variante no conservadora de dominio de unión de BuNT, un fragmento activo de dominio de unión de BuNT o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende los aminoácidos 848-1251 de una variante no natural de dominio de unión de BuNT de SEQ ID NO: 24, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión de BuNT, una variante no conservadora de dominio de unión de BuNT, un fragmento activo de dominio de unión de BuNT o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 848-1251 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 848-1251 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 848-1251 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 848-1251 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En otros aspectos adicionales de esta realización, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 848-1251 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25; o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 848 1251 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.

Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, un dominio de unión que no es de toxina clostridial. Como se usa en la presente memoria, la expresión "dominio de unión que no es de toxina clostridial" se refiere a cualquier polipéptido que puede ejecutar la etapa de unión del proceso de intoxicación que inicia el mecanismo de internalización completo de modo que la toxina clostridial modificada descrita en la presente memoria descriptiva intoxica una célula diana. Los ejemplos de dominios de unión se describen, p. ej., en Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, patente de EE.UU. 5,989,545; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, patente de EE.UU. 6,461,617; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment o f Mucus Hypersecretion, patente de EE.UU. 6,632,440; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment O f Pancreatitis, patente de EE.UU. 6,843,998; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, patente de EE.UU. 7,132,259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, publicación de patente de EE.UU. 2002/0037833; Keith A. Foster et al., Inhibition o f Secretion from Non-neural Cells, publicación de patente de EE.UU. 2003/0180289; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods o f Their Use, publicación de patente de EE.UU. 2006/0211619; Keith A. Foster et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, publicación de patente de EE.UU. 2008/0187960; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, solicitud de patente de EE.UU. n° 11/776,075; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, solicitud de patente de EE.UU. n° 11/792,210, cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad.

Un dominio de unión que no es de toxina clostridial incluye, sin limitación, variantes naturales de dominio de unión que no es de toxina clostridial, tal como, p. ej., isotermas de dominio de unión que no es de toxina clostridial y subtipos de dominio de unión que no es de toxina clostridial; y variantes no naturales de dominio de unión que no es de toxina clostridial, tal como, p. ej., variantes conservadoras de dominio de unión que no es de toxina clostridial, variantes no conservadoras de dominio de unión que no es de toxina clostridial, quimeras de dominio de unión de que no es de toxina clostridial, fragmentos activos de dominio de unión que no es de toxina clostridial de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante de dominio de unión que no es de toxina clostridial," sea natural o no natural, se refiere a un dominio de unión que no es de toxina clostridial que tiene al menos un cambio de aminoácido de la correspondiente región de las secuencias de referencia y se puede describir en porcentaje de identidad respecto a la correspondiente región de esa secuencia de referencia. Salvo que se indique expresamente, las variantes de dominio de unión que no es de toxina clostridial útiles para la práctica de las realizaciones descritas son variantes que ejecutan la etapa de unión del proceso de intoxicación.

Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada dominio de unión que no es de toxina clostridial puede haber variantes naturales que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante natural de dominio de unión que no es de toxina clostridial" se refiere a cualquier dominio de unión que no es de toxina clostridial producido por un proceso natural que incluye, sin limitación, isoformas de dominio de unión que no es de toxina clostridial producidas por transcritos de empalme alternativo e isoformas de dominio de unión que no es de toxina clostridial producidas por mutación espontánea. Una variante natural de dominio de unión que no es de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio de unión que no es de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante natural de dominio de unión que no es de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio de unión que no es de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Un ejemplo no limitante de una variante natural de dominio de unión que no es de toxina clostridial es una isoforma de dominio de unión que no es de toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de una isoforma de dominio de unión que no es de toxina clostridial incluyen, p. ej., isoformas de dominio de unión de opiáceo, isoformas de dominio de unión de taquiquinina, isoformas de dominio de unión de melanocortina, isoformas de dominio de unión de galanina, isoformas de dominio de unión de granina, isoformas de dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y, isoformas de dominio de unión de neurohormona, isoformas de dominio de unión de citoquina neurorreguladora, isoformas de dominio de unión de quinina, isoformas de dominio de unión de factor de crecimiento, e isoformas de dominio de unión de hormona similar a glucagón.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no natural de dominio de unión que no es de toxina clostridial" se refiere a cualquier dominio de unión que no es de toxina clostridial producido con ayuda de la manipulación humana, incluyendo, sin limitación, dominios de unión que no son de toxina clostridial producidos por modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y dominios de unión que no son de toxina clostridial producidos por síntesis química. Los ejemplos no limitantes de variantes no naturales de dominio de unión que no es de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de dominio de unión que no es de toxina clostridial, variantes no conservadoras de dominio de unión que no es de toxina clostridial, variantes quiméricas de dominio de unión que no es de toxina clostridial y fragmentos activos de dominio de unión que no es de toxina clostridial.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial" se refiere a un dominio de unión que no es de toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de referencia de dominio de unión que no es de toxina clostridial. Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de formar enlace covalente, capacidad de formar enlace de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares, o cualquier combinación de los mismos. Una variante conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio de unión que no es de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio de unión que no es de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de dominio de unión de opiáceo, variantes conservadoras de dominio de unión de taquiquinina, variantes conservadoras de dominio de unión de melanocortina, variantes conservadoras de dominio de unión de galanina, variantes conservadoras de dominio de unión de granina, variantes conservadoras de dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y, variantes conservadoras de dominio de unión de neurohormona, variantes conservadoras de dominio de unión de citoquina neurorreguladora, variantes conservadoras de dominio de unión de quinina, variantes conservadoras de dominio de unión de factor de crecimiento y variantes de dominio de unión de hormona similar a glucagón.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial" se refiere a un dominio de unión que no es de toxina clostridial en el que 1) se elimina al menos un aminoácido del dominio de unión que no es de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial; 2) se añade al menos un aminoácido al dominio de unión que no es de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de referencia de dominio de unión que no es de toxina clostridial. Una variante no conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el dominio de unión que no es de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial, y puede sustituir al dominio de unión que no es de toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante no conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de dominio de unión de opiáceo, variantes no conservadoras de dominio de unión de taquiquinina, variantes no conservadoras de dominio de unión de melanocortina, variantes no conservadoras de dominio de unión de galanina, variantes no conservadoras de dominio de unión de granina, variantes no conservadoras de dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y, variantes no conservadoras de dominio de unión de neurohormona, variantes no conservadoras de dominio de unión de citoquina neurorreguladora, variantes no conservadoras de dominio de unión de quinina, variantes no conservadoras de dominio de unión de factor de crecimiento y variantes no de dominio de unión de hormona similar a glucagón.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "fragmento activo de dominio de unión que no es de toxina clostridial" se refiere a cualquiera de una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprenden el dominio de unión que pueden ser útiles en aspectos de la presente memoria descriptiva con la condición de que esos fragmentos de dominios de unión puedan interaccionar de forma preferente con el receptor cognado, y por lo tanto participar en la ejecución del mecanismo celular completo por el que una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial modificada descrita en la presente memoria descriptiva comprende un dominio de unión que no es de toxina clostridial. En un aspecto de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende una variante natural de dominio de unión que no es de toxina clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de dominio de unión que no es de toxina clostridial. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende una variante no natural de dominio de unión que no es de toxina clostridial, tal como, p. ej., una variante conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial, una variante no conservadora de dominio de unión que no es de toxina clostridial, un fragmento activo de dominio de unión que no es de toxina clostridial o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, un aminoácido hidrófobo en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido hidrófobo. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos incluyen, p. ej., C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, p. ej., A, I, L, P y V. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido de apilamiento en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido de apilamiento. Los ejemplos de aminoácido de apilamientos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, p. ej., D, E, K, N, Q y R. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, p. ej., A, H, G, P, S, T e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, p. ej., K, R y H. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, p. ej., D y E. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido pequeño. Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, p. ej., A, D, G, N, P, S y T. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido ramificado en el C-beta en una posición particular en la cadena de polipéptido del dominio de unión que no es de toxina clostridial se puede sustituir por otro aminoácido ramificado en el C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados en el C-beta incluyen, p. ej., I, T y V.

En otra realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de opiáceo, tal como, p. ej., una encefalina, una endomorfina, una endorfina, una dinorfina, una nociceptina o una hemorfina. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de taquiquinina, tal como, p. ej., una sustancia P, un neuropéptido K (NPK), un neuropéptido gamma (NP gamma), una neuroquinina A (NKA); sustancia K, neuroquinina alfa, neuromedina L), una neuroquinina B (NKB), una hemoquinina o una endoquinina. En otro aspecto más de esta realización, una toxina no clostridial comprende un dominio de unión de melanocortina, tal como, p. ej., una hormona estimuladora de melanocitos, adrenocorticotropina o una lipotropina. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de galanina, tal como, p. ej., una galanina o un péptido asociado a mensaje de galanina. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de granina, tal como, p. ej., una cromogranina A, una cromogranina B o una cromogranina C. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y, tal como, p. ej., un neuropéptido Y, un péptido YY, péptido pancreático o un eicosapéptido pancreático. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de neurohormona, tal como, p. ej., una hormona liberadora de corticotropina, una hormona paratiroidea, una hormona liberadora de tirotropina o una somatostatina. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de citoquina neurorreguladora, tal como, p. ej., un factor neurotrófico ciliar, una glicoforina-A, un factor inhibidor de leucemia, un factor de diferenciación colinérgico, una interleuquina, una onostatina M, una cardiotrofina-1, una citoquina similar a cardiotrofina o una neuroleuquina. En otro aspecto más de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de péptido quinina, tal como, p. ej., una bradiquinina, una calidina, una desArg9 bradiquinina o una desArg10 bradiquinina. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de factor de crecimiento, tal como, p. ej., un dominio de unión de factor de crecimiento de fibroblasto, un dominio de unión de factor de crecimiento de nervios, un dominio de unión de factor de crecimiento insulínico, un dominio de unión de factor de crecimiento epidérmico, un dominio de unión de factor de crecimiento endotelial vascular, un dominio de unión de factor neurotrófico derivado del cerebro, un dominio de unión de factor neurotrófico derivado de crecimiento, un dominio de unión de neurotrofina, tal como, p. ej., una neurotrofina-3, una neurotrofina-4/5, un dominio de unión de péptido activador de cabeza, un dominio de unión de neurturina, un dominio de unión de persefrina, un dominio de unión de artemina, un dominio de unión de factor de crecimiento transformante p, tal como, p. ej., un TGFp1, un TGFp2, un TGFp3 o un TGFp4, un dominio de unión de proteína morfogénica ósea, tal como, p. ej., una BMP2, una BMP3, una BMP4, una BMP5, una BMP6, una BMP7, una BMP8 o una BMP10, un dominio de unión de factor de diferenciación de crecimiento, tal como, p. ej., un GDF1, un GDF2, un GDF3, un GDF5, un GDF6, un GDF7, un GDF8, un GDF10, un GDF11 o un GDF15 o un dominio de unión de activina, tal como, p. ej., una activina A, una activina B, una activina C, una activina E o una inhibina A. En otro aspecto de esta realización, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de hormona similar al glucagón, tal como, p. ej., una secretina, un péptido similar al glucagón, como un GLP-1 y un GLP-2, un dominio de unión de péptido activador de adenilato ciclasa de pituitaria, un dominio de unión de hormona liberadora de hormona de crecimiento, un dominio de unión de péptido intestinal vasoactivo como un VIP1 o un VIP2, un dominio de unión de polipéptido inhibidor gástrico, un dominio de unión de péptido intestinal visceral relacionado con calcitonina, como una gastrina, un péptido liberador de gastrina o una colecistoquinina, o un dominio de unión de péptido PAR como un péptido PAR1, un péptido PAR2, un péptido PAR3 o un péptido PAR4.

En otra realización, un péptido opiáceo comprende un péptido encefalina. En aspectos de esta realización un péptido encefalina comprende una Leu-encefalina, una Met-encefalina, una Met-encefalina MRGL o una Met-encefalina MRF. En otros aspectos de esta realización, un péptido encefalina comprende la SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

En otros aspectos de esta realización, una encefalina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID n O: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29. En otros aspectos más de esta realización, una encefalina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29; o como máximo 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o s Eq ID NO: 29. En otros aspectos más de esta realización, una encefalina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SeQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29; o como máximo 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

En otra realización, un péptido opiáceo comprende un péptido corticomedular-22 bovino (BAM22). En aspectos de esta realización, un péptido BAM22 comprende un péptido Ba M22 (1-12), un péptido BAM22 (6-22), un péptido BAM22 (8-22) o un péptido BAM22 (1-22). En otros aspectos de esta realización, un péptido BAM22 comprende los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 30; los aminoácidos 1 12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 31; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 32; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 33; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8 22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 34 o los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 35.

En otros aspectos de esta realización, un péptido BAM22 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% respecto a los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 30; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 31; los aminoácidos 1 12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 32; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 33; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 34 o los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 35; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 30; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8 22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 31; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 32; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1 22 de la SEQ ID NO: 33; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 34 o los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 35.

En otros aspectos más de esta realización, un péptido BAM22 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1 12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 30; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 31; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 32; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8 22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 33; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 34 o los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 35; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 30; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 31; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 32; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 33; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 34 o los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 35.

En otros aspectos más de esta realización, un péptido BAM22 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 30; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 31; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 32; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 33; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 34 o los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 35; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 30; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 71; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 32; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 33; los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 34 o los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o los aminoácidos 1-22 de la SEQ ID NO: 35.

En otra realización, un péptido opiáceo comprende un péptido endomorfina. En aspectos de esta realización, un péptido endomorfina comprende una endomorfina-1 o una endomorfina-2. En otros aspectos de esta realización, un péptido endomorfina comprende la SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.

En otros aspectos de esta realización, una endomorfina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% respecto a la SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37. En otros aspectos más de esta realización, una endomorfina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la s Eq ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37; o como máximo 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37. En otros aspectos más de esta realización, una endomorfina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37; o como máximo 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.

En otra realización, un péptido opiáceo comprende un péptido endorfina. En aspectos de esta realización, un péptido endorfina comprende una endorfina-a, una neoendorfina-a, una endorfina-p, una neoendorfina-p o una endorfina-y. En otros aspectos de esta realización, un péptido endorfina comprende la SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43.

En otros aspectos de esta realización, una endorfina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43. En otros aspectos más de esta realización, una endorfina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, s Eq ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43; o como máximo 1,2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, s Eq ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43. En otros aspectos más de esta realización, una endorfina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43.

En otra realización, un péptido opiáceo comprende un péptido dinorfina. En aspectos de esta realización, un péptido dinorfina péptido comprende una dinorfina A, una dinorfina B (leumorfina) o una rimorfina. En otros aspectos de esta realización, un péptido dinorfina comprende la SEQ ID NO: 44, SEQ ID n O: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ iD NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 o SEQ ID NO: 74.

En otros aspectos de esta realización, una dinorfina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 69; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 69. En otros aspectos más de esta realización, una dinorfina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 69; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, Se Q ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 69. En otros aspectos más de esta realización, una dinorfina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 69; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 69.

En otra realización, un péptido opiáceo comprende un péptido nociceptina. En aspectos de esta realización, un péptido nociceptina comprende una nociceptina RK, una nociceptina, un neuropéptido 1, un neuropéptido 2 o un neuropéptido 3. En otros aspectos de esta realización, un péptido nociceptina comprende la SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84.

En otros aspectos de esta realización, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84. En otros aspectos más de esta realización, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO:

81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84. En otros aspectos más de esta realización, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO:

81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:

77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO:

84.

En otra realización, un péptido opiáceo comprende un péptido hemorfina. En aspectos de esta realización, un péptido hemorfina comprende un LVVH7, un VVH7, un VH7, un H7, un LVVH6, un LVVH5, un VVH5, un LVVH4, y un LVVH3.

En otros aspectos de esta realización, un péptido hemorfina comprende la SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 93.

En otros aspectos de esta realización, una hemorfina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 93; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 93. En otros aspectos más de esta realización, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 93; o como máximo 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 93. En otros aspectos más de esta realización, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 93; o como máximo 1,2 o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 93.

En otra realización más, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de péptido galanina. En aspectos de esta realización, un dominio de unión de péptido galanina comprende un galanina o un péptido asociado a mensaje de galanina (GMAP). En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de péptido galanina comprende la SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 95.

En otros aspectos de esta realización, dominio de unión de galanina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 95; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 95. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de galanina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 95; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 95. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de galanina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 95; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 94 o SEQ ID NO: 95.

En otra realización más, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de péptido taquiquinina. En aspectos de esta realización, un dominio de unión de péptido taquiquinina comprende una sustancia P, un neuropéptido K (NPK), un neuropéptido gamma (NP gamma), una neuroquinina A (NKA); sustancia K, neuroquinina alfa, neuromedina L), una neuroquinina B (NKB), una hemoquinina o una endoquinina. En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de péptido taquiquinina comprende la SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 107.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de péptido taquiquinina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO:

107; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de péptido taquiquinina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 107; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de péptido taquiquinina comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ iD NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 107; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 107.

En otra realización más, un dominio de unión que no es de toxina clostridial comprende un dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y. En aspectos de esta realización, un dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y comprende un neuropéptido Y (NPY), un péptido YY (PYY), péptido pancreático (PP) o un eicosapéptido pancreático (PIP). En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y comprende la SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112.

En otros aspectos de esta realización, un dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, p. ej., al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90% o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112. En otros aspectos más de esta realización, un dominio de unión de péptido relacionado con neuropéptido Y comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con respecto a la SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112.

Está contemplado que una toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva puede comprender un dominio de unión que no es de toxina clostridial en todas y cada una de las posiciones con la condición de que la toxina clostridial quimérica puede realizar el proceso de intoxicación. Los ejemplos no limitantes incluyen, situar un dominio de unión no clostridial en el extremo amino de una toxina clostridial modificada; situar un dominio de unión no clostridial entre un dominio enzimático de toxina clostridial y un dominio de traslocación de una toxina clostridial modificada; y situar un dominio de unión no clostridial en el extremo carboxilo de una toxina clostridial modificada. Otros ejemplos no limitantes incluyen, situar un dominio de unión no clostridial entre un dominio enzimático de toxina clostridial y un dominio de traslocación de toxina clostridial de una toxina clostridial modificada. El dominio enzimático de las toxinas clostridiales naturales contiene la metionina de inicio nativa. Por lo tanto, en organizaciones de dominios donde el dominio enzimático no está en la posición amino terminal, se debería poner una secuencia de aminoácidos que comprende la metionina de inicio en frente del dominio amino terminal. Igualmente, donde un dominio de unión no clostridial está en la posición amino terminal, una secuencia de aminoácidos que comprende una metionina de inicio y un sitio de escisión de proteasa se pueden unir operativamente en situaciones en las que un dominio de unión no clostridial requiere un extremo amino libre, véase, p. ej., Shengwen Li et al., Degradable Clostridial Toxins, solicitud de patente de Ee .UU. 11/572.512 (23 de enero, 2007). Además, se sabe en la técnica que cuando se añade un polipéptido que está operativamente unido al extremo amino de otro polipéptido que comprende la metionina de inicio, se puede suprimir el resto de metionina original.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo, que comprende un dominio de unión no clostridial, un dominio de traslocación, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático (figura 3A). En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo, que comprende un dominio de unión no clostridial, un dominio de traslocación de toxina clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático de toxina clostridial.

En otra realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo, que comprende un dominio de unión no clostridial, un dominio enzimático, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio de traslocación (figura 3B). En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo, que comprende un dominio de unión no clostridial, un dominio enzimático de toxina clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio de traslocación de toxina clostridial.

En otra realización más, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de unión no clostridial, y un dominio de traslocación (figura 4A). En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de unión no clostridial, y un dominio de traslocación de toxina clostridial.

En otra realización más, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de unión no clostridial, y un dominio enzimático (figura 4B). En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación de toxina clostridial, un dominio de unión no clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático de toxina clostridial.

En otra realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático, un dominio de unión no clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno, y un dominio de traslocación (figura 4C). En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de unión no clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de traslocación de toxina clostridial.

En otra realización más, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación, un dominio de unión no clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático (figura 4D). En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación de toxina clostridial, un dominio de unión no clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático de toxina clostridial.

En otra realización más, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de traslocación, y un dominio de unión no clostridial (figura 5A). En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de traslocación de toxina clostridial, y un dominio de unión no clostridial.

En otra realización más, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio enzimático y un dominio de unión no clostridial, (figura 5B). En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender un orden lineal de un solo polipéptido de amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación de toxina clostridial, un dominio de unión no clostridial, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático de toxina clostridial.

Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de inactivación" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis selectiva en el enlace escindible por una proteasa presente en fluidos intersticiales o sistemas circulatorios, tal como, p. ej. el sistema cardiovascular o el sistema linfático. Dicho sitio de escisión de inactivación está operativamente unido como una proteína de fusión a una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. Por definición, un sitio de escisión de inactivación es susceptible de escisión selectiva por al menos una proteasa presente en fluidos intersticiales o sistemas circulatorios. Los ejemplos no limitantes de sitios de escisión de inactivación incluyen sitios de escisión de trombina, sitios de escisión de plasmina, sitios de escisión de factor de coagulación VIIa, sitios de escisión de factor de coagulación IXa, sitios de escisión de factor de coagulación Xa, sitios de escisión de factor de coagulación XIa, sitios de escisión de factor de coagulación Xlla, sitios de escisión de calicreína plasmática, sitios de escisión de receptor 1 acoplado a proteína G activada por proteasa (PAR1), sitios de escisión de PAR 2, sitios de escisión de PAR3, sitios de escisión de PAR4, sitios de escisión de metaloproteasa de matriz-2 (MMP-2), sitios de escisión de metaloproteasa de matriz-9 (MMP-9), sitios de escisión de furina, sitios de escisión de activador de plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), sitios de escisión de activador de plasminógeno tipo tisular (tPA), sitios de escisión de triptasa-E, sitios de escisión de proteasa-7 de mastocitos de ratón (mMCP-7), sitios de escisión de enzima-1 convertidora de endotelina (ECE-1), sitios de escisión de grupo sanguíneo Kell, sitios de escisión de DPPIV, sitios de escisión de metalopeptidasa ADAM con trombospondina tipo 1, motivo 13 (ADAMTS13), y sitios de escisión de catepsina L (tabla 4). El sitio de escisión de inactivación de la invención comprende un sitio doble de trombina-trombina.

Está contemplado que un sitio de escisión de inactivación de cualquier y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva con la condición de que el sitio de escisión de inactivación sea capaz de ser escindido por una proteasa de fluido intersticial o de sistema circulatorio. Por lo tanto, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de inactivación pude ser de, p. ej., al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 aminoácidos de longitud.

En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de inactivación puede ser de, p. ej., como máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 aminoácidos de longitud.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante natural de sitio de escisión de inactivación" se refiere a cualquier sitio de escisión de inactivación producido sin la ayuda de ninguna manipulación humana. Los ejemplos no limitantes de sitios de escisión de inactivación incluyen variantes de sitios de escisión de trombina, variantes de sitios de escisión de plasmina, variantes de sitios de escisión de factor de coagulación V, variantes de sitios de escisión de factor de coagulación VII, variantes de sitios de escisión de factor de coagulación VIII, variantes de sitios de escisión de factor de coagulación IXa, variantes de sitios de escisión de factor de coagulación Xa, variantes de sitios de escisión de factor de coagulación Xla, variantes de sitios de escisión de factor de coagulación XlIa, variantes de sitios de escisión de calicreína plasmática, variantes de sitios de escisión de MMP-2, variantes de sitios de escisión de MMP-9, variantes de sitios de escisión de furina, variantes de sitios de escisión de activador de plasminógeno-u, variantes de sitios de escisión de activador de plasminógeno-t, variantes de sitios de escisión de triptasa-g, variantes de sitios de escisión de mMCP-7, variantes de sitios de escisión de ECE-1, variantes de sitios de escisión de KBGP, variantes de sitios de escisión de catepsina-L, variantes de sitios de escisión de PAR1, variantes de sitios de escisión de PAR2, variantes de sitios de escisión de PAR3, variantes de sitios de escisión de PAR4 y variantes de sitios de escisión de ADAM-TS13.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no natural de sitio de escisión de inactivación" se refiere a cualquier sitio de escisión de inactivación producido con ayuda de manipulación humana, incluyendo sin limitación, variantes de sitios de escisión de inactivación producidas por modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y variantes de sitios de escisión de inactivación producidas por síntesis química. Los ejemplos no limitantes de variantes no naturales de sitios de escisión de inactivación incluyen, p. ej., variantes conservadoras de sitios de escisión de inactivación, variantes no conservadoras de sitios de escisión de inactivación y peptidomiméticos de sitios de escisión de inactivación.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante conservadora de sitio de escisión de inactivación" se refiere a un sitio de escisión de inactivación que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de referencia del sitio de escisión de inactivación. Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de formar enlace covalente, capacidad de formar enlace de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares, o cualquier combinación de los mismos. Una variante conservadora de sitio de escisión de inactivación puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el sitio de escisión de inactivación de referencia en el que se basa la variante conservadora de sitio de escisión de inactivación, y puede sustituir al sitio de escisión de inactivación de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante conservadora de sitio de escisión de inactivación incluyen, p. ej., variantes conservadoras de sitios de escisión de trombina, variantes conservadoras de sitios de escisión de plasmina, variantes conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación V, variantes conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación VII, variantes conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación VIII, variantes conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación IXa, variantes conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación Xa, variantes conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación Xla, variantes conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación XlIa, variantes conservadoras de sitios de escisión de calicreína plasmática, variantes conservadoras de sitios de escisión de MMP-2, variantes conservadoras de sitios de escisión de MMP-9, variantes conservadoras de sitios de escisión de furina, variantes conservadoras de sitios de escisión de activador de plasminógeno-u, variantes conservadoras de sitios de escisión de activador de plasminógeno-t, variantes conservadoras de sitios de escisión de triptasa-g, variantes conservadoras de sitios de escisión de mMCP-7, variantes conservadoras de sitios de escisión de ECE-1, variantes conservadoras de sitios de escisión de KBGP, variantes conservadoras de sitios de escisión de catepsina-L, variantes conservadoras de sitios de escisión de PAR1, variantes conservadoras de sitios de escisión de PAR2, variantes conservadoras de sitios de escisión de PAR3, variantes conservadoras de sitios de escisión de PAR4 y variantes conservadoras de sitios de escisión de ADAM-TS13.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "variante no conservadora de sitio de escisión de inactivación" se refiere a un sitio de escisión de inactivación en el que 1) se elimina al menos un aminoácido del sitio de escisión de inactivación de referencia en el que se basa la variante no conservadora de sitio de escisión de inactivación; 2) se añade al menos un aminoácido al sitio de escisión de inactivación de referencia en el que se basa la variante no conservadora de sitio de escisión de inactivación; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de referencia de sitio de escisión de inactivación (tabla 4). Una variante no conservadora de sitio de escisión de inactivación puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el sitio de escisión de inactivación de referencia en el que se basa la variante no conservadora de sitio de escisión de inactivación, y puede sustituir al sitio de escisión de inactivación de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de una variante no conservadora de sitio de escisión de inactivación incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de sitios de escisión de trombina, variantes no conservadoras de sitios de escisión de plasmina, variantes no conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación V, variantes no conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación VII, variantes no conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación VIII, variantes no conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación IXa, variantes no conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación Xa, variantes no conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación Xla, variantes no conservadoras de sitios de escisión de factor de coagulación XlIa, variantes no conservadoras de sitios de escisión de calicreína plasmática, variantes no conservadoras de sitios de escisión de MMP-2, variantes no conservadoras de sitios de escisión de MMP-9, variantes no conservadoras de sitios de escisión de furina, variantes no conservadoras de sitios de escisión de activador de plasminógeno-u, variantes no conservadoras de sitios de escisión de activador de plasminógeno-t, variantes no conservadoras de sitios de escisión de triptasa-g, variantes no conservadoras de sitios de escisión de mMCP-7, variantes no conservadoras de sitios de escisión de ECE-1, variantes no conservadoras de sitios de escisión de KBGP, variantes no conservadoras de sitios de escisión de catepsina-L, variantes no conservadoras de sitios de escisión de PAR1, variantes no conservadoras de sitios de escisión de PAR2, variantes no conservadoras de sitios de escisión de PAR3, variantes no conservadoras de sitios de escisión de PAR4 y variantes no conservadoras de sitios de escisión de ADAM-TS13.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "peptidomimético de sitio de escisión de inactivación" se refiere a un sitio de escisión de inactivación que tiene al menos un aminoácido sustituido por un oligómero no natural que tiene al menos una propiedad similar con la del primer aminoácido. Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, topografía de un elemento de estructura primaria peptídica, funcionalidad de un elemento de estructura primaria peptídica, topología de un elemento de estructura secundaria peptídica, funcionalidad de un elemento de estructura secundaria peptídica, o similares, o cualquier combinación de los mismos. Un peptidomimético de sitio de escisión de inactivación puede funcionar sustancialmente de la misma forma que el sitio de escisión de inactivación de referencia en el que se basa el peptidomimético de sitio de escisión de inactivación, y puede sustituir al sitio de escisión de inactivación de referencia en cualquier aspecto de la presente memoria descriptiva. Para ejemplos de métodos de peptidomiméticos véase, p. ej., Amy S. Ripka y Daniel H. Rich, "Peptidomimetic design", 2(4) CURR. OPIN. CHEM. BiOl .441-452 (1998); y M. Angels Estiarte y Daniel H. Rich, "Peptidomimetics for Drug Design", 803-861 (BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY Vol. 1 PRINCIPLE AND PRACTICE, Donald J. Abraham ed., Wiley-Interscience, 6a ed 2003). Los ejemplos no limitantes de un peptidomimético de sitio de escisión de inactivación incluyen, p. ej., peptidomiméticos de sitios de escisión de trombina, peptidomiméticos de sitios de escisión de plasmina, peptidomiméticos de sitios de escisión de factor de coagulación V, peptidomiméticos de sitios de escisión de factor de coagulación VII, peptidomiméticos de sitios de escisión de factor de coagulación VIII, peptidomiméticos de sitios de escisión de factor de coagulación IXa, peptidomiméticos de sitios de escisión de factor de coagulación Xa, peptidomiméticos de sitios de escisión de factor de coagulación Xla, peptidomiméticos de sitios de escisión de factor de coagulación XlIa, peptidomiméticos de sitios de escisión de calicreína plasmática, peptidomiméticos de sitios de escisión de MMP-2, peptidomiméticos de sitios de escisión de MMP-9, peptidomiméticos de sitios de escisión de furina, peptidomiméticos de sitios de escisión de activador de plasminógeno-u, peptidomiméticos de sitios de escisión de activador de plasminógeno-t, peptidomiméticos de sitios de escisión de triptasa-g, peptidomiméticos de sitios de escisión de mMCP-7, peptidomiméticos de sitios de escisión de ECE-1, peptidomiméticos de sitios de escisión de KBGP, peptidomiméticos de sitios de escisión de catepsina-L, peptidomiméticos de sitios de escisión de PAR1, peptidomiméticos de sitios de escisión de PAR2, peptidomiméticos de sitios de escisión de PAR3, peptidomiméticos de sitios de escisión de PAR4 y peptidomiméticos de sitios de escisión de ADAM-TS13.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial comprende un sitio de escisión de inactivación. En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de traslocación de toxina clostridial, un dominio de unión de toxina clostridial, y un sitio de escisión de inactivación. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende una variante natural de sitio de escisión de inactivación, tal como, p. ej., una isoforma de sitio de escisión de inactivación. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende una variante no natural de sitio de escisión de inactivación, tal como, p. ej., una variante conservadora de sitio de escisión de inactivación, una variante no conservadora de sitio de escisión de inactivación o un fragmento activo de sitio de escisión de inactivación o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, una toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de inactivación. En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial quimérica comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de traslocación de toxina clostridial, un dominio de unión que no es de toxina clostridial, y un sitio de escisión de inactivación. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial quimérica comprende una variante natural de sitio de escisión de inactivación, tal como, p. ej., una isoforma de sitio de escisión de inactivación. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial quimérica comprende una variante no natural de sitio de escisión de inactivación, tal como, p. ej., una variante conservadora de sitio de escisión de inactivación, una variante no conservadora de sitio de escisión de inactivación o un fragmento activo de sitio de escisión de inactivación o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, un aminoácido hidrófobo en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido hidrófobo. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos incluyen, p. ej., C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido alifático en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, p. ej., A, I, L, P, y V. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido aromático en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido de apilamiento en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido de apilamiento. Los ejemplos de aminoácido de apilamientos incluyen, p. ej., F, H, W e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido polar en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, p. ej., D, E, K, N, Q y R. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácido menos polar o indiferentes incluyen, p. ej., A, H, G, P, S, T e Y. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva . Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, p. ej., K, R y H. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, p. ej., D y E. En otro aspecto de esta realización, un aminoácido pequeño en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido pequeño. Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, p. ej., A, D, G, N, P, S y T. En otro aspecto más de esta realización, un aminoácido ramificado en el C-beta en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido ramificado en el C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados en el C-beta incluyen, p. ej., I, T y V.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de trombina como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de trombina" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimientos adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el sitio escindible por la trombina en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la trombina. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por la trombina puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para el sitio de escisión de la trombina es X-iX2X3(R/K)*X4X5XaX7 (SEQ ID NO: 113), donde X1 es preferiblemente S, T, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W, e Y, un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es preferiblemente F, S, T, un aminoácido amídico como N o Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es preferiblemente S, T, un aminoácido positivo como H, K, y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X5, X6, y X7, son independientemente cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para la trombina (SEQ ID NO: 114-123). Se conocen en la técnica sitios de escisión de trombina adicionales o se pueden definir mediante métodos rutinarios. Véase, p. ej., O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en una realización de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de trombina, como se define en las reivindicaciones. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de trombina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 113, donde X1 es S, T, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es F, S, T, un aminoácido amídico como N o Q,, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es S, T, un aminoácido positivo como H, K, y R,, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X5, X6 y X7, son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de trombina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 113, donde X1 es S, Q, K,, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es N, Q, G, P, A, V, L o I; X4 es S, T, H, G, A, L o I; X5 es S, T, Q, K, R, F, Y,, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; Xe es S, T, Q, K, R, G, P, A, V, L o I; y X7 es S, T, Q, K, R, G, P, A, V, L o I. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de trombina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 113, donde X1 es Q, G, P, A, V, L, I o M; X2 es S, T, D, E, G, A, V o I; X3 es G, P, A, V o L; X4 es S, G, A o L; X5 es Q, K, F, A, V o L; Xa es S, Q, K, R, G, P, V o L; y X7 es S, T, K, G, V, L o I. Uno de los sitios de escisión de trombina comprende la SEQ ID NO: 114.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de plasmina como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de plasmina" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimientos adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por la plasmina en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la plasmina. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por la plasmina puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. La plasmina cataliza la escisión de enlaces de Lys| y Arg|, con una especificidad similar a la de la tripsina. Sin embargo, la plasmina es una enzima mucho menos eficaz que la tripsina, y escinde solo algunos de estos enlaces en proteínas. La tripsina escinde cadenas de péptidos principalmente en el lado del carboxilo de los aminoácidos lisina o arginina, excepto cuando a cualquiera de ellos le sigue la prolina.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de factor de coagulación VIIa como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de factor de coagulación VIIa" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimientos adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por el factor de coagulación VIIa en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa del factor de coagulación VIIa. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por el factor de coagulación VIIa puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de FVIIa es X-|X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 124), donde X1 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es Q, S, T, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente Q, S, T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4, X5, X6, y X7, son independientemente cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para el FVIIa (SEQ ID NO: 125-133). Se conocen bien en la técnica sitios de escisión de FVIIa adicionales o se puede definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., J. H. Morrissey, "Coagulation Factor VIIa". En HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, pág.1659-1662 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de factor de coagulación VIIa. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación VIIa comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 124, donde X1 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es Q, S, T, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es Q, S, T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X4, X5, X6, y X7, son independientemente cualquier aminoácido. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación VIIa comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132 o SEQ ID NO: 133

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de factor de coagulación IXa como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de factor de coagulación IXa" o "sitio de escisión de FIXa" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimientos adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por el FIXa en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa del FIXa. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por el FIXa puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de FIXa es X-iX2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 134), donde X1 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente S, T, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X4, X5, X6 y X7, son independientemente cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para FIXa (SEQ ID NO: 135-138). Sitios de escisión de FIXa adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., A. T. Thompson, "Molecular Biology of Factor IX". En HEMOSTASIS AND THROMBOSIS, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE, pág. 128-129 (R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); S. Kawabata y S. Iwanaga, "Russellysin". En HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, pág.683-684 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); A. E. Schmidt y S. P. Bajaj, "Coagulation factor IXa". En HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, pág. 1655-1659 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685 694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de factor de coagulación IXa. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación IXa comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 134, donde X1 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es S, T, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; y X4, X5, X6y X7, son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación IXa comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 134, donde X1 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es S, T, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4, X5, X6 y X7, son independientemente un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación IXa comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 138.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de factor de coagulación Xa como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de factor de coagulación Xa" o "sitio de escisión de FXa" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por FXa en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de FXa. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por FXa puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de FXa es X-iX2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 139), donde X1 es cualquier aminoácido, X2 es preferiblemente G, A, S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N o un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, X3 es preferiblemente un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es preferiblemente un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5, X6 y X7, son independientemente cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para FXa (SEQ ID NO: 140-155). Los sitios de escisión FXa adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., D. L. Greenberg y E. W. Davie, "Blood Coagulation Factors: Their Complementary DNAs, Genes, and Expression". En HEMOSTASIS AND THROMBOSIS, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE, pág. 34-35 (R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de factor de coagulación Xa. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación Xa comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 139, donde X1 es cualquier aminoácido, X2 es G, A, S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N, o un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, X3 es un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5, X6 y X7, son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación Xa comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 139, donde X1 es E, F, P, A, L o I; X2 es S, Q, D, E, F, G o A; X3 es F, G o P; X4 es S, T, L o I; X5 es S, F, A o V; X6 es S, T, E, N, H, G, A o M; y X7 es S, N, D, Q, K, R o G. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación Xa comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 139, donde X1 es I o A; X2 es E o F; X3 es F, G o P; X4 es S, T o I; X5 es S, F o V; X6 es E o G; y X7 es S o G. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación Xa comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154 o SEQ ID NO: 155.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de factor de coagulación XIa como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de factor de coagulación XIa" o "sitio de escisión de FXIa" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por FXIa en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de FXIa. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por FXIa puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de FXIa es X-iX2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 156), donde X1 es preferiblemente un aminoácido ácido como D o E, un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es preferiblemente un aminoácido ácido como D o E, un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente H, un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es preferiblemente H, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es preferiblemente un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es preferiblemente un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para FXIa (SEQ ID NO: 157-166). Los sitios de escisión adicionales de FXIa son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., P. N. Walsh, "Coagulation Factor Xla". En Handbook o f Proteolytic Enzymes, pág.1651-1655 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010),

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de factor de coagulación XIa. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación XIa comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 156, donde X1 es un aminoácido ácido como D o E, un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D o E, un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es H, un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es H, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5 es un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación XIa comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 156, donde es un aminoácido ácido como D o E, o un aminoácido básico como K y R; X2 es un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5 es un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación Xla comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 156, donde X1 es D o K; X2 es F o L; X3 es T o P; X4 es A o V; X5 es E o V; X6 es T o G; y X7 es G o V. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación XIa comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 o SEQ ID NO: 166.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de factor de coagulación Xlla como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de factor de coagulación Xlla" o "sitio de escisión de FXIIa" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por FXIIa en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de FXIIa. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por FXIIa puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de FXIIa es X-iX2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 167), donde X1 es preferiblemente un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5 es preferiblemente un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para FXIIa (SEQ ID NO: 168-172). Los sitios de escisión de FXIIa adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., O. D. Ratnoff, "Coagulation Factor XIIa". En Handbook o f Proteolytic Enzymes, pág.1642-1644 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de factor de coagulación XIIa. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación Xlla comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 167, donde X1 es un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5 es un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación XIIa comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 167, donde X1 es S, T, P o I; X2 es Q, K, S o M; X3 es K, T, G o P; X4 es L, I o V; X5 es T o V; X6 es G o L; y X7 es G. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de factor de coagulación XIIa comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171 o SEQ ID NO: 172.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de calicreína 1 como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de calicreína 1" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por calicreína 1 en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la calicreína 1. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por la calicreína 1 puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de calicreína 1 es X-|X2X3X4*(R/K/S)X5X6X7 (SEQ ID NO: 173), donde X1 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es cualquier aminoácido; X4 es preferiblemente un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no polar grande como F, I, L, M y V o un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y; X5 es cualquier aminoácido; X6 es cualquier aminoácido; y X7 es cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para la calicreína 1 (SEQ ID NO: 174-198). Los sitios de escisión de calicreína 1 adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., R. W. Colman, “Contact Activation Pathway: Inflammation, Fibrinolytic, Anticoagulant, Antiadhesive, and Antiangiogenic Activities”. En HEMOSTASIS AND THROMBOSIS, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE, pág. 103-104 (R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); J. Chao, "Human Kallikrein 1, Tissue Kallikrein". En Handbook o f Proteolytic Enzymes, pág.1577-1580 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); H. X. Li, et al., “Substrate Specificity of Human Kallikreins 1 and 6 Determined by Phage Display”, Protein Sci. 17: 664-672 (2008); O. Schilling and C. M. Overall, “Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites”, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de calicreína 1. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de calicreína 1 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 173, donde X1 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es cualquier aminoácido; X4 es un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no polar grande como F, I, L, M y V, o un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y; X5 es cualquier aminoácido; X6 es cualquier aminoácido; y X7 es cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de calicreína 1 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 173, donde X1 es D, S, T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es S, T, A, P o V; X3 es S, F o L; X4 es R o un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y; X5 es R, S, T o A; X6 es R, S o G; y X7 es R, G o A. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de calicreína 1 comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197 o SEQ ID NO: 198.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de proteína C como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de proteína C" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por la proteína C en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la proteína C. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por la proteína C puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de proteína C es X-|X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 199), donde X1 es preferiblemente un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es preferiblemente un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5 es preferiblemente un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es preferiblemente un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y; X7 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para la proteína C (SEQ ID NO: 200-209). Los sitios de escisión de proteína C adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., L. Shen y B. Dahiback, "Protein C". En Handbook o f Proteolytic Enzymes, pág.1673-1677 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de proteína C. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteína C comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 199, donde X1 es un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 y X4 son independientemente un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X5 es un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T o un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y; X7 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteína C comprende la secuencia SEQ ID NO: 199, donde X1 es K, R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es D, E, Q, N o K; X3 es P, L, T, Q, K o R; X4 es G, I, S, N o K; X5 es Q, N, K, F, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es F, S, N, Q, K o H; X7 es L, I, T, K, D, E, Q o N. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de proteína C comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 o SEQ ID NO: 209.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de plasminógeno como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de plasminógeno" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por plasminógeno en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa del plasminógeno. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por el plasminógeno puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de plasminógeno es X-iX2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 210), donde X1 es preferiblemente un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es preferiblemente un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es preferiblemente un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5 es preferiblemente un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es cualquier aminoácido; X7 es preferiblemente H, F, Y, R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para el plasminógeno (SEQ ID NO: 211-240). Los sitios de escisión de plasminógeno adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de plasminógeno. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de plasminógeno comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 211, donde X1 es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X5 es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es cualquier aminoácido; X7 es H, F, Y, R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de plasminógeno comprende la secuencia SEQ ID NO: 211, donde X1 es K, R, S, T, A, G, L o P; X2 es D, E, Q, N, K, R, S, T, A, G, I o L; X3 es N, Q, S, F, Y, A o L; X4 es K, R, S, A, G, L o V; X5 es K, R, N, S, F, Y, A, I, L, P o V; Xa es K, R, N, S, F, Y, A, G, L, P o V; X7 es R, S, T, F, Y, A, G, I, L o P. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de plasminógeno comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 o SEQ ID NO: 240.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 2 como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 2" o "sitio de escisión de MMP-2" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por MMP-2 en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la MMP-2. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por MMP-2 puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de MMP-2 es X1(P/A/V/L/I)X2X3*(V/L/I/F/Q)X4X5Xa (SEQ ID NO: 241), donde X1, X2, X3, X4, X5 y Xa son cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para MMP-2 (SEQ ID NO: 242-273). Los sitios de escisión de MMP-2 adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 2. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 2 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 241, donde X1, X2, X3, X4, X5 y X6son cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 2 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 241, donde X1 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es H, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido básico como K y R, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X5 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X6 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido básico como K y R, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 2 comprende la secuencia SEQ ID NO: 241, donde X1 es G, P, A, V, L, I, S, T, E o Q; X2 es G, A, L, S, N, Q, W o K; X3 es G, P, A, S, Q, D, E o H; X4 es G, A, V, L, I, F, S, T, Q o K; X5 es G, A, V, S, T, Q o K; X6 es G, P, A, V, L, I, S, T, D, E, K, N o Q. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 2 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 241, donde X1 es G, A o L o Q; X2 es G, A o S; X3 es G, A, S o N; X4 es A, V, L, I o K; X5 es G, A o S; X6 es G, P, A, V, L o D. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 2 comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272 o SEQ ID NO: 273.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 9 como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 9" o "sitio de escisión de MMP-2" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por MMP-9 en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de MMP-9. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por Mm P-9 puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de MMP-9 es X1X2X3X4*X5X6X7Xb (SEQ ID NO: 274), donde X1 es preferiblemente F, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es preferiblemente F, Y, S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es cualquier aminoácido; X5 es preferiblemente S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es cualquier aminoácido; X7 es cualquier aminoácido; X8 es preferiblemente F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para MMP-9 (SEQ ID NO: 275-319). Los sitios de escisión de MMP-9 adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., S. L. Kridel, et al., “Substrate Hydrolysis by Matrix Metalloproteinase-9”, J. Biol. Chem. 276: 20572-20578 (2001); E. Y. Zhen, et al., “Characterization of Metalloprotease Cleavage Products of Human Articular Cartilage”, Arthritis Rheum. 58: 2420-2431 (2008); O. Schilling y C. M. Overall, “Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites”, Nat. Biotechnol.

26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res.

38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 9. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 9 comprende la secuencia consenso de s Eq ID NO: 274, donde X1 es F, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es F, Y, S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es cualquier aminoácido; X5 es S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X6 es cualquier aminoácido; X7 es cualquier aminoácido; Xa es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 9 comprende la secuencia consenso de s Eq ID NO: 274, donde X1 es G, V, L, I, F, S, Q, K o R; X2 es P, A, V, L, I o S; X3 es G, P, A, V, L, S, Q, E, K o R; X4 es G, P, A, V, L, F, S, N, E o K; X5 es A, V, L, I, M, F, S, Q o K; X6 es P, A, V, L, I, S, T, Q, E, K o R; X7 es G, A, V, L, S o T; X8 es G, P, A, V, L, F, T, D, E, K o R. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 9 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 274, donde X1 es G o L; X2 es P, A o V; X3 es P, A, R, K o S; X4 es G; X5 es A, V, L o I; X6 es T, Q, K o R; X7 es G, A o S; X8 es G, P, A, V o E. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de metaloproteasa de matriz 9 comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 318 o SEQ ID NO: 319.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de furina como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de furina " se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por furina en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la furina. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por la furina puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de furina es (R/I/A)X-i(R/K/A/P)R*X2*X3X4X5 (SEQ ID NO: 320), donde X1, X2, X3, X4 y X5 son cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para la furina (SEQ ID NO: 321-346). Los sitios de escisión de furina adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., A. Basak, et al., “ Implication of the Proprotein Convertases Furin, PC5 And PC7 in the Cleavage of Surface Glycoproteins of Hong Kong, Ebola y Respiratory Syncytial Viruses: A Comparative Analysis with Fluorogenic Peptides”, Biochem. J. 353: 537-545 (2001); O. Bader, et al., “Processing of Predicted Substrates of Fungal Kex2 Proteinases from Candida albicans, C. glabrata, Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris”, BMC Microbiol. 8: 116 (2008); O. Schilling y C. M. Overall, “Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites”, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de furina. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de furina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 320, donde X1, X2, X3, X4 y X5 son cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de furina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 320, donde X1 es F, S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es G, P, M, F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R o un aminoácido no cargado como C, S, y T; X3 es G, P, A, V, L, I, F, W, S, T, N, Q, D, H, K o R; X4 es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X5 es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de furina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 320, donde X1 es K, R, S o T; X2 es D, E, S, A o G; X3 es A, V, L o I; y X4 es S, G, D, E o R; y X5 es G, P, A, S, T, Q, D o E. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de furina comprende, p. ej., SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345 o SEQ ID NO: 346.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-u como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de activador de plasminógeno-u" o "sitio de escisión de u-PA " se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por u-PA en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa del u-PA. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por el activador de plasminógeno-u puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de u-PA es X1X2X3(R/K)*X4*X5X6X7 (SEQ ID NO: 347), donde X1 es cualquier aminoácido; X2 es preferiblemente un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es cualquier aminoácido; X5 es preferiblemente un aminoácido básico como K y R, un aminoácido aromático como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es preferiblemente un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para el u-PA (SEQ ID NO: 347-368). Los sitios de escisión de u-PA adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., V. Ellis, “u-Plasminogen Activator”. En Handbook of Proteolytic Enzymes, pág. 1677-1683 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling y C. M. Overall, “Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites”, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de activador de plasminógeno-u. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-u comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 347, donde X1 es cualquier aminoácido; X2 es un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es cualquier aminoácido; X5 es un aminoácido básico como K y R, un aminoácido aromático como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X6 es un aminoácido no cargado como C, S, y T, un aminoácido aromático como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-u comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 347, donde X1 es P, A, L, S, T, C, N o R; X2 es G, P, L, Y, S o T; X3 es G, A, S o N; y X4 es G, A, V, I, Y, S o R; X5 es P, V, L, F o R; X6 es G, A, V, Y, S o T; y X7 es G, V, L, F, Y, N o H. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-u comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 347, donde X1 es P, A, L, S, T, C, N o R; X2 es G, Y o S; X3 es G o S; y X4 es G, A, V, I, Y, S o R; X5 es V o R; X6 es T o Y; y X7 es G, V, L, F, Y, N o H. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-u comprende, p. ej., SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349, NO: 350, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355 o SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 367 o SEQ ID NO: 368.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-t como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de activador de plasminógeno-t" o "sitio de escisión de t-PA" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por t-PA en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa del t-PA. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por el t-PA puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de t-PA es X1X2Xa(R/K)*X4*X5X6Xy (SEQ ID NO: 369), donde X1, X2, X3, X4, X5, Xa y X7 son cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para t-PA (SEQ ID NO: 370-373). Los sitios de escisión de t-PA adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., H. R. Lijnen y D. Collen, “t-Plasminogen Activator”. En Handbook of Proteolytic Enzymes, pág. 1684-1689 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling y C. M. Overall, “Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites”, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de activador de plasminógeno-t. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-t comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 369, donde X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-t comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 369, donde X1 es un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5 es un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-t comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 369, donde X1 es A, P, C o N; X2 es A, L, P o Q; X3 es G, L, S o F; X4 es I, V, M o Y; X5 es A, V o K; X6 es G, V o P; y X7 es G, L o D. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de activador de plasminógeno-t comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 372 o SEQ ID NO: 373.

Aspectos de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de triptasa-g como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de triptasa-g" o "sitio de escisión de prosemina" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por triptasa-E en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la triptasa-E. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por triptasa-E puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de triptasa-g es *(R/K)X1X2X3X4(D/E) (SEQ ID NO: 374), donde X1, X2, X3 y X4, son independientemente un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para triptasa-g (SEQ ID NO: 375-386). Los sitios de escisión de triptasa-g adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de triptasa-g. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de triptasa-g comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 374, donde X1, X2, X3 y X4, son independientemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de triptasa-g comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 374, donde X1 es I o V; X2 es I o V; X3 es G o S; X4 es G o S. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de triptasa-g comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 o SEQ ID NO: 386.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de proteasa-7 de mastocitos de ratón como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de proteasa-7 de mastocitos de ratón" o "sitio de escisión de mMCP-7" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por mMCP-7 en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la mMCP-7. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por mMCP-7 puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de mMCP-7 es X iX2X3(K/R)*X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 387), donde Xi es cualquier aminoácido; X2 es preferiblemente un aminoácido amídico como N o Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X4, X5, X6, X7 son cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para mMMCP-7 (SEQ ID NO: 388-391). Los sitios de escisión de mMMCP-7 adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de proteasa-7 de mastocitos de ratón. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteasa-7 de mastocitos de ratón comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 387, donde X1 es cualquier aminoácido; X2 es un aminoácido amídico como N o Q, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; y X4, X5, X6, X7 son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteasa-7 de mastocitos de ratón comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 387, donde X1 es cualquier aminoácido; X2 es G, S o Q; X3 es A, P o S; y X4, X5, X6, X7 son cualquier aminoácido. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de proteasa-7 de mastocitos de ratón comprende, p. ej., SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 390 o SEQ ID NO: 391.

Aspectos de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de enzima-1 convertidora de endotelina como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de enzima-1 convertidora de endotelina" o "sitio de escisión de ECE-1" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por ECE-1 en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la ECE-1. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por ECE-1 puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de ECE-1 es X1X2X3X4*(F/L/I/V/Y)5X6X7 (SEQ ID NO: 392), donde X1, X2, X3, X4, X5, Xa y X7 son cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para ECE-1 (SEQ ID NO: 393-412). Los sitios de escisión de ECE-1 adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., K. Ahn y G. D. Johnson, "Endothelin-Converting Enzyme-1". En Handbook of Proteolytic Enzymes, pág. 429-434 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling y C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de enzima-1 convertidora de endotelina. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de enzima-1 convertidora de endotelina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 392, donde X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de enzima-1 convertidora de endotelina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 392, donde X1 es G, P, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R o un aminoácido no cargado como C, S, y T; X2 es F, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X5 es F, W, S, C, N, E, un aminoácido positivo como H, K, y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es G, P, V, L, F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R o un aminoácido no cargado como C, S, y T; y X7 es P, A, V, L, M, F, Y, S, N, D o K. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de enzima-1 convertidora de endotelina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 392, donde X1 es G, P, Y, C, D, K, R o H; X2 es P, L, I, F, S, C, Q, D, R o H; X3 es V, L, I, S, Q, K o R; X4 es G, P, L, F, Y, W o R; X5 es V, I, M, F, N, R o H; X6 es P, L, F, T, E o H; y X7 es P, V, L, F, S, N, D o K. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de enzima-1 convertidora de endotelina comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 392, donde X1 es G, D o H; X2 es I o F; X3 es V, I, S, Q o K; X4 es P, F o W; X5 es I, N, R o H; X6 es L, T o H; y X7 es P, S o D. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de enzima-1 convertidora de endotelina comprende, p. ej., SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411 o SEQ ID NO: 412.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de proteína de grupo sanguíneo Kell como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de proteína de grupo sanguíneo Kell" o "sitio de escisión de KBGP" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por KBGP en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la KBGP. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por KBGP puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de KBGP es X-|X2X3X4*X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 413), donde X1 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E; X2 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es preferiblemente un aminoácido aromático como F, W, e Y; X5 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es preferiblemente un aminoácido amídico como N y Q; X7 es un aminoácido no cargado como C, S, y T; X8 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para KBGP (SEQ ID NO: 414-415). Los sitios de escisión de KBGP adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., "A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database", Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de proteína de grupo sanguíneo Kell. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteína de grupo sanguíneo Kell comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 413, donde X1 es un aminoácido ácido como D y E; X2 es T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido aromático como F, W, e Y; X5 es T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X6 es un aminoácido amídico como N y Q; X7 es un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido ramificado en el C-beta como I, V o T; X8es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteína de grupo sanguíneo Kell comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 413, donde X1 es D; X2 es I, V o T; X3 es I, V o T; X4 es W; X5 es I, V o T; X6 es N; X7 es T; X8 es P. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de proteína de grupo sanguíneo Kell comprende, p. ej., SEQ ID NO: 414 o SEQ ID NO: 415.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de catepsina L como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de catepsina L" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por catepsina L en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de la catepsina L. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por catepsina L puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de catepsina L es X-|X2X3X4*X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 416), donde X1 es preferiblemente W, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es preferiblemente L, V, F o Y; y X4, X5, X6, X7 y X8 son cualquier aminoácido. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para catepsina L (SEQ ID NO: 417-443). Los sitios de escisión de catepsina L adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios. Véase, p. ej., J. C. Kelly, et al., "Profiling of Calpain Activity with a Series of FRET-Based Substrates", Biochim. Biophys. Acta 1794: 1505-1509 (2009); O. Schilling y C. M. Overall, "Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites", Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., "A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database", Base de datos pendiente de publicación (2010).

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de catepsina L. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de catepsina L comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 416, donde X1 es W, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido no cargado como C, S, y T, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es L, V, F o Y; y X4, X5, X6, X7 y Xa son cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de catepsina L comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 416, donde X1 es G, P, A, L, Q, E o K; X2 es un aminoácido aromático como F, W, e Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X3 es L, V, F o Y; X4 es G, A, F, T, Q, E, K o R; X5 es G, A, S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido positivo como H, K, y R; X6 es P, A, L, I, S, Q, un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido positivo como H, K, y R; X7 es un aminoácido positivo como H, K, y R, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X8 es P, L, S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido básico como K, y R. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de catepsina L comprende la secuencia consenso de s Eq ID NO: 416, donde X1 es G, A, Q, E o K; X2 es G, P, L o F; X3 es L, V, F o Y; X4 es G, A, F, T, Q, E, K o R; X5 es A, S, Q, E, K o R; Xa es P, A, L, I, S o E; X7 P, L o R; y X8 es P, L, S o K. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de catepsina L comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 442 o SEQ ID NO: 443.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de PAR1 como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de PAR1" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por PAR1 en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de PAR1. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por PAR1 puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de PAR1 es X-iX2X3X4(K/R)X5 (SEQ ID NO: 444), donde X1 es preferiblemente un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X2 es preferiblemente un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X3 es preferiblemente un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X4 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X5 es preferiblemente un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido aromático hidrófobo como F, W o Y. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para PAR1 (SEQ ID NO: 445 452). Los sitios de escisión de PAR1 adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios.

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de PAR1. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de PAR1 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 444, donde X1 es un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X2 es un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X3 es un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X4 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X5 es un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido aromático hidrófobo como F, W o Y. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de PAR1 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 444, donde X1 es S, T o G; X2 es F o Y; X3 es L, P o F; X4 es A, G, I o L; y X5 es F o N. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de PAR1 comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451 o SEQ ID NO: 452.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de PAR2 como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de PAR2" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por PAR2 en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de PAR2. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por PAR2 puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de PAR2 es X-iX2X3X4(K/R)X5 (SEQ ID NO: 453), donde X1 es preferiblemente un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X2 es preferiblemente un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V; X3 es preferiblemente un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V; X4 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X5 es preferiblemente un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para PAR2 (SEQ ID NO: 454-455). Los sitios de escisión de PAR2 adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios.

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de PAR2. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de PAR2 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 453, donde X1 es un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X2 es un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V; X3 es un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V; X4 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X5 es un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de PAR2 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 453, donde X1 es S; X2 es I o L; X3 es I o L; X4 es A o G; X5 es L o V. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de PAR2 comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 454 o SEQ ID NO: 455.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de PAR3 como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de PAR3" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por PAR3 en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de PAR3. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por PAR3 puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de PAR3 es X1X2X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 456), donde X1 es preferiblemente un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X2 es preferiblemente un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V; X3 es preferiblemente un aminoácido amídico como N y Q o un aminoácido básico como K y R; X4 es preferiblemente un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X5 es preferiblemente un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T, o un aminoácido pequeño polar como D, N o P; y X6 es preferiblemente un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido pequeño polar como D, N o P. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para PAR3 (SEQ ID NO: 457-459). Los sitios de escisión de PAR3 adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios.

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de PAR3. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de PAR3 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 456, donde X1 es un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X2 es un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V; X3 es un aminoácido amídico como N y Q, o un aminoácido básico como K y R; X4 es un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X5 es un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T, o un aminoácido pequeño polar como D, N o P; y X6 es un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido pequeño polar como D, N o P. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de PAR3 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 456, donde X1 es S o T; X2 es F; X3 es N o R; X4 es A o G; X5 es A, G o N y X6 es P o E. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de PAR3 comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 458 o SEQ ID NO: 459.

Aspectos de referencia de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de PAR4 como un sitio de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de PAR4" se refiere a un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteolisis detectable en el enlace escindible por PAR4 en condiciones adecuadas para la actividad de proteasa de PAR4. Está contemplado que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por PAR4 puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva. Aunque se conocen excepciones, una secuencia consenso generalizada para un sitio de escisión de PAR4 es X-iX2X3X4(K/R/Q/F)X5 (SEQ ID NO: 460), donde X1 es preferiblemente un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X2 es preferiblemente un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X3 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es preferiblemente un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X5 es preferiblemente un aminoácido básico como K y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W o Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M. La tabla 4 cita sitios de escisión de referencia de ejemplo para PAR4 (SEQ ID NO: 461-478). Los sitios de escisión de PAR4 adicionales son bien conocidos en la técnica o se pueden definir por métodos rutinarios.

Por lo tanto, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende un sitio de escisión de PAR4. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de PAR4 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 460, donde X1 es un aminoácido no polar pequeño como A, C G, S, y T; X2 es un aminoácido no polar grande como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X3 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido alifático hidrófobo como, G, P, A, V, L, I, y M; y X5 es un aminoácido básico como K y R, un aminoácido aromático hidrófobo como F, W o Y, o un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de PAR4 comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 460, donde X1 es A, G, S o T; X2 es F o Y; X3 es A o P; X4 es A o G; y X5 es A, V, P, F, W, Y o K. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de PAR4 comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477 o SEQ ID NO: 478.

La situación de un sitio de escisión de inactivación es un aspecto crítico que está regido por varios criterios y se define en la reivindicación 1. Primero, la ubicación del sitio de escisión de inactivación no debe afectar sustancialmente a la capacidad de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica para intoxicar a su célula diana. Como se usa en la presente memoria, la expresión "no afectar sustancialmente" en relación con la intoxicación, se refiere a una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva que todavía puede ejecutar el mecanismo de intoxicación completo de modo que una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica entra en una célula diana y escinde proteolíticamente un sustrato diana y abarca la unión de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica a un complejo de receptor de baja o alta afinidad, la internalización del complejo de toxina/receptor, la traslocación de la cadena ligera al citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato diana.

En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación puede intoxicar una célula diana en la misma extensión que la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin la modificación del sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación puede intoxicar una célula diana en una extensión de, p. ej., al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% que la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin modificación del sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación puede intoxicar una célula diana en una extensión de, p. ej., como máximo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% la extensión de la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin la modificación del sitio de escisión de inactivación.

Segundo, la ubicación de un sitio de escisión de inactivación debe estar en una región expuesta de la superficie de la toxina o toxina clostridial quimérica y no enterrada internamente dentro de la proteína o enmascarada por elementos de estructura secundaria. La exposición adecuada en la superficie del sitio de escisión de inactivación facilita el acceso adecuado al sitio de su correspondiente proteasa, permitiendo así la escisión proteolítica. La escisión proteolítica del sitio de escisión de inactivación por su correspondiente proteasa inactiva sustancialmente la capacidad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica para intoxicar a la célula. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inactiva sustancialmente", en relación con la intoxicación, se refiere a una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva que, después de escisión en un sitio de escisión de inactivación, tiene una capacidad reducida para ejecutar el mecanismo de intoxicación en general, de modo que una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica entra en una célula diana y escinde proteolíticamente un sustrato diana, y abarca la unión de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica a un complejo de receptor de baja o alta afinidad, la internalización del complejo de toxina/receptor, la traslocación de la cadena ligera al citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato diana.

En un aspecto de esta realización, la escisión proteolítica de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva en un sitio de escisión de inactivación, produce la incapacidad completa de la toxina para intoxicar una célula diana comparada con la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero en un estado sin escisión proteolítica (es decir, el sitio de escisión de intoxicación está intacto o no escindido). En otros aspectos de esta realización, la escisión proteolítica de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva en un sitio de escisión de inactivación produce una capacidad, p. ej., al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% menor para intoxicar una célula diana comparada con la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero en un estado sin escisión proteolítica. En otros aspectos de esta realización, la escisión proteolítica de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva en un sitio de escisión de inactivación produce una capacidad, p. ej., como máximo un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% menor para intoxicar una célula diana comparada con la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, peso en un estado sin escisión proteolítica.

El sitio de escisión de inactivación está situado dentro de una región de sitios de escisión de inactivación. Como se usa en la presente memoria, la expresión "región de sitios de escisión de inactivación" se refiere a una secuencia de aminoácidos de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que se puede modificar para que contenga un sitio de escisión de inactivación porque dicha modificación no alterará sustancialmente la capacidad de la proteína para intoxicar una célula diana; y tras la exposición a su proteasa cognada, el sitio de escisión de inactivación será escindido e inactivará sustancialmente la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica. La situación de un sitio de escisión de inactivación puede ser en cualquier parte dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, con la condición de que dicha situación no afecte sustancialmente a la capacidad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica para intoxicar una célula diana; y tras la exposición a su proteasa cognada, la escisión del sitio de escisión de inactivación inactivará sustancialmente la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica. La tabla 5 cita regiones de sitios de escisión de inactivación adecuadas para usar con una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva.

La toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva comprende un sitio de escisión de inactivación situado dentro de la región de sitios de escisión de inactivación. La toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva comprende un sitio de escisión de inactivación situado dentro de la región de sitios de escisión de inactivación del subdominio Hcn. La toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva comprende un sitio de escisión de inactivación.

En otros aspectos más de esta realización, la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva comprende un sitio de escisión de inactivación situado dentro de una región de sitios de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 618-634 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; los aminoácidos 614-630 de la SEQ ID NO: 3; los aminoácidos 605-621 de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10; los aminoácidos 613-629 de la SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; los aminoácidos 609-625 de la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; los aminoácidos 587-603 de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 17; los aminoácidos 604-620 de la SEQ ID NO: 18; los aminoácidos 605-621 de la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20; los aminoácidos 610-626 de la SEQ ID NO: 21; los aminoácidos 627-643 de la SEQ ID NO: 22; los aminoácidos 596-612 de la SEQ ID NO: 23; o los aminoácidos 587-603 de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25

En un aspecto de la presente memoria descriptiva, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad mayor que el margen de seguridad para la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otras palabras, la adición de un sitio de escisión de inactivación aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, p. ej., al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, 110%, al menos 120%, al menos 130%, al menos 140%, al menos 150%, al menos 160%, al menos 170%, al menos 180%, al menos 190%, al menos 200%, 210%, al menos 220%, al menos 230%, al menos 240%, al menos 250%, al menos 260%, al menos 270%, al menos 280%, al menos 290% o al menos 300%, con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, p. ej., como máximo 10%, como máximo 20%, como máximo 30%, como máximo 40%, como máximo 50%, como máximo 60%, como máximo 70%, como máximo 80%, como máximo 90%, como máximo 100%, 110%, como máximo 120%, como máximo 130%, como máximo 140%, como máximo 150%, como máximo 160%, como máximo 170%, como máximo 180%, como máximo 190%, como máximo 200%, 210%, como máximo 220%, como máximo 230%, como máximo 240%, como máximo 250%, como máximo 260%, como máximo 270%, como máximo 280%, como máximo 290% o como máximo 300%, con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos más de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor en, p. ej., aproximadamente 10% a aproximadamente 300%, aproximadamente 20% a aproximadamente 300% aproximadamente 30% a aproximadamente 300%, aproximadamente 40% a aproximadamente 300% aproximadamente 50% a aproximadamente 300%, aproximadamente 60% a aproximadamente 300% aproximadamente 70% a aproximadamente 300%, aproximadamente 80% a aproximadamente 300% aproximadamente 90% a aproximadamente 300% o aproximadamente 100% a aproximadamente 300%, con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación.

En otros aspectos de la realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, p. ej., al menos 1 vez, al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces, con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos más de la realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, p. ej., al menos 1 vez, como máximo 1 vez, como máximo 3 veces, como máximo 4 veces, como máximo 5 veces, como máximo 6 veces, como máximo 7 veces, como máximo 8 veces, como máximo 9 veces o como máximo 10 veces, con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos más de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor en, p. ej., aproximadamente 1 vez a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 6 veces o aproximadamente 2 veces a aproximadamente 5 veces.

En otra realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional.

En aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional, en, p. ej., al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos

60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, 110%, al menos 120%, al menos 130%, al menos 140%, al menos 150%, al menos 160%, al menos 170%, al menos 180%, al menos 190%, al menos 200%, 210%, al menos 220%, al menos 230%, al menos 240%, al menos 250%, al menos 260%, al menos 270%, al menos 280%, al menos 290% o al menos 300%. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin sitio de escisión de inactivación adicional, en, p. ej., como máximo 10%, como máximo 20%, como máximo 30%, como máximo 40%, como máximo 50%, como máximo 60%, como máximo 70%, como máximo 80%, como máximo 90%, como máximo 100%, 110%, como máximo 120%, como máximo 130%, como máximo 140%, como máximo 150%, como máximo 160%, como máximo 170%, como máximo 180%, como máximo 190%, como máximo 200%, 210%, como máximo 220%, como máximo 230%, como máximo 240%, como máximo 250%, como máximo 260%, como máximo 270%, como máximo 280%, como máximo 290% o como máximo 300%. En otros aspectos más de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional, en, p. ej., aproximadamente 10% a aproximadamente 300%, aproximadamente 20% a aproximadamente 300%, aproximadamente 30% a aproximadamente 300%, aproximadamente 40% a aproximadamente 300%, aproximadamente 50% a aproximadamente 300%, aproximadamente 60% a aproximadamente 300%, aproximadamente 70% a aproximadamente 300%, aproximadamente 80% a aproximadamente 300%, aproximadamente 90% a aproximadamente 300% o aproximadamente 100% a aproximadamente 300%.

En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional, en, p. ej., al menos 1 vez, al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces. En aspectos más de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en, p. ej., como máximo 1 vez, como máximo 3 veces, como máximo 4 veces, como máximo 5 veces, como máximo 6 veces, como máximo 7 veces, como máximo 8 veces, como máximo 9 veces o como máximo

10 veces. En otros aspectos más de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica con respecto a la misma toxina clostridial o toxina clostridial quimérica o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional, en, p. ej., aproximadamente 1 vez a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 1 vez a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 6 veces o aproximadamente 2 veces a aproximadamente 5 veces.

En otra realización, una región de sitios de escisión de inactivación se puede modificar para que incluya un solo sitio de escisión de inactivación. En otra realización más, una región de sitios de escisión de inactivación se puede modificar para que incluya una pluralidad de sitios de escisión del sitio de escisión de inactivación. En aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de sitio de escisión de inactivación puede comprender, p. ej., al menos 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de sitio de escisión de inactivación puede comprender, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios de escisión de inactivación. En otros aspectos más de esta realización, una región de sitios de escisión de sitio de escisión de inactivación puede comprender, p. ej., 2-10 sitios de escisión de inactivación, 2-8 sitios de escisión de inactivación, 2-6 sitios de escisión de inactivación, 2-4 sitios de escisión de inactivación, 2-3 sitios de escisión de inactivación, 3-9 sitios de escisión de inactivación, 3-7 sitios de escisión de inactivación, 3-5 sitios de escisión de inactivación o 3-4 sitios de escisión de inactivación.

En otra realización, una región de sitios de escisión de inactivación se puede modificar para que incluya un solo tipo de sitio de escisión de inactivación, tal como, p. ej., un sitio de escisión de trombina. En otra realización más, una región de sitios de escisión de inactivación se puede modificar para que incluya una pluralidad de tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación, tal como, p. ej., un sitio de escisión de trombina, un sitio de escisión de factor Xa, sitio de escisión de MMP-2, y un sitio de escisión de MMP-9. En aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de inactivación puede comprender, p. ej., al menos 2, 3, 4 o 5 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de inactivación puede comprender, p. ej., como máximo 2, 3, 4 o 5 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de inactivación puede comprender, p. ej., 2-5 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación, 2-4 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación, 2-3 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación, 3-5 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación o 3-4 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación.

La modificación de una región de sitios de escisión de inactivación para que incluya un sitio de escisión de inactivación se puede llevar a cabo alterando al menos uno de los aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación. Los ejemplos no limitantes de una alteración de aminoácido incluyen una eliminación de un aminoácido, una adición de un aminoácido o una sustitución de un aminoácido original por un aminoácido diferente. En aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de inactivación se modifica para que incluya un sitio de escisión de inactivación alterando, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de inactivación se modifica para que incluya un sitio de escisión de inactivación alterando, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación. En más aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de inactivación se modifica para que incluya un sitio de escisión de inactivación alterando, p. ej., 1-5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 1-4 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 1-3 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 1-2 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 2-5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 2-4 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 2-3 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 3-5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación o 4-5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación.

En aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de inactivación se modifica para que incluya un sitio de escisión de inactivación eliminando, añadiendo o sustituyendo, o cualquier combinación de los mismos, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta realización, una región de sitios de escisión de inactivación se modifica para que incluya un sitio de escisión de inactivación eliminando, añadiendo o sustituyendo, o cualquier combinación de los mismos, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación. En aspectos todavía de esta realización, una región de sitios de escisión de inactivación se modifica para que incluya un sitio de escisión de inactivación eliminando, añadiendo o sustituyendo, o cualquier combinación de los mismos, p. ej., 1-5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 1-4 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 1-3 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 1-2 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 2-5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 2-4 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 2-3 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación, 3-5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación o 4-5 aminoácidos dentro de la región de sitios de escisión de inactivación.

La modificación de una región de sitios de escisión de inactivación para que incluya un sitio de escisión de inactivación se puede lograr usando procedimientos de mutagénesis convencionales conocidos para el experto en la técnica. Los ejemplos no limitantes de procedimientos de mutagénesis, así como reactivos, condiciones y protocolos bien caracterizados se pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos protocolos son procedimientos rutinarios dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria descriptiva.

Como se ha mencionado antes, las toxinas clostridiales y toxinas clostridiales quiméricas descritas en la presente memoria descriptiva se traducen como polipéptidos de una cadena que posteriormente son escindidos por escisión proteolítica en una región de bucle de disulfuro. Este procesamiento postraduccional da una molécula bicatenaria mantenida unida por un solo enlace disulfuro e interacciones no covalentes. La escisión proteolítica dentro de una región de bucle de disulfuro se puede lograr usando sitios de escisión de proteasas endógenos que son naturales dentro de la región de bucle bicatenario, o mediante modificación genética de la región de bucle bicatenario para que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno.

Aspectos de la presente memoria descriptiva describen, en parte, una región de bucle bicatenario. Como se usa en la presente memoria, la expresión "región de bucle bicatenario" se refiere a una secuencia de aminoácidos de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica flanqueada por aminoácidos cisteína y que contiene un sitio de escisión de proteasa usado para convertir la forma monocatenaria de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica en su forma bicatenaria (tabla 6). Los ejemplos no limitantes de una región de bucle bicatenario incluyen una región de bucle bicatenario de BoNT/A que comprende los aminoácidos 430-454 de la SEQ ID NO: 1; una región de bucle bicatenario de BoNT/B que comprende los aminoácidos 437-446 de la SEQ ID NO: 2; una región de bucle bicatenario de BoNT/C1 que comprende los aminoácidos 437-453 de la SEQ ID NO: 3; una región de bucle bicatenario de BoNT/D que comprende los aminoácidos 437-450 de la SEQ ID NO: 4; una región de bucle bicatenario de BoNT/E que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 5; una región de bucle bicatenario de BoNT/F que comprende los aminoácidos 429-445 de la SEQ ID NO: 6; una región de bucle bicatenario de BoNT/G que comprende los aminoácidos 436-450 de la SEQ ID NO: 7; and una región de bucle bicatenario de TeNT que comprende los aminoácidos 439-467 de la SEQ ID NO: 8 (tabla 6).

Por lo tanto, en una realización, una región de bucle bicatenario comprende una región de bucle bicatenario de toxina clostridial. En aspectos de esta realización, una región de bucle bicatenario comprende, p. ej., una región de bucle bicatenario de BoNT/A, una región de bucle bicatenario de BoNT/B, una región de bucle bicatenario de BoNT/C1, una región de bucle bicatenario de BoNT/D, una región de bucle bicatenario de BoNT/E, una región de bucle bicatenario de BoNT/F, una región de bucle bicatenario de BoNT/G, una región de bucle bicatenario de TeNT, una región de bucle bicatenario de BaNT o una región de bucle bicatenario de BuNT. En otros aspectos de esta realización, una región de bucle bicatenario comprende, p. ej., una región de bucle bicatenario de BoNT/A que comprende los aminoácidos 430 454 de la SEQ ID NO: 1; una región de bucle bicatenario de BoNT/B que comprende los aminoácidos 437-446 de la SEQ ID NO: 2; una región de bucle bicatenario de BoNT/C1 que comprende los aminoácidos 437-453 de la SEQ ID NO: 3; una región de bucle bicatenario de BoNT/D que comprende los aminoácidos 437-450 de la SEQ ID NO: 4; una región de bucle bicatenario de BoNT/E que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 5; una región de bucle bicatenario de BoNT/F que comprende los aminoácidos 429-445 de la SEQ ID NO: 6; una región de bucle bicatenario de BoNT/G que comprende los aminoácidos 436-450 de la SEQ ID NO: 7; o una región de bucle bicatenario de TeNT que comprende los aminoácidos 439-467 de la SEQ ID NO: 8. una región de bucle bicatenario de BaNT que comprende los aminoácidos 421-435 de la SEQ ID NO: 9; o una región de bucle bicatenario de BuNT que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 10.

Aspectos de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de proteasa endógeno del bucle bicatenario. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de proteasa endógeno del bucle bicatenario" es sinónima de "sitio de escisión de proteasa natural del bucle bicatenario" y se refiere a un sitio de escisión de proteasa natural que se encuentra dentro de la región de bucle bicatenario de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica natural e incluye, sin limitación, variantes del sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de toxina clostridial natural, tales como, p. ej., isoformas del sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de toxina clostridial y subtipos del sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de toxina clostridial. Los ejemplos no limitantes de un sitio de escisión de proteasa endógeno, incluyen, p. ej., un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/A, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/B, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/C1, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/D, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/E, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/F, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/G y un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de TeNT.

Aunque la identidad de la proteasa actualmente no se conoce, se ha determinado el sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario para muchas toxinas clostridiales. En las BoNT, la escisión en K448-A449 convierte la forma de polipéptido sencilla de BoNT/A en la forma bicatenaria; la escisión en K441-A442 convierte la forma de polipéptido sencilla de BoNT/B en la forma bicatenaria; la escisión en K449-T450 convierte la forma de polipéptido sencilla de BoNT/C1 en la forma bicatenaria; la escisión en R445-D446 convierte la forma de polipéptido sencilla de BoNT/D en la forma bicatenaria; la escisión en R422-K423 convierte la forma de polipéptido sencilla de BoNT/E en la forma bicatenaria; la escisión en K439-A440 convierte la forma de polipéptido sencilla de BoNT/F en la forma bicatenaria; y la escisión en K446-S447 convierte la forma de polipéptido sencilla de BoNT/G en la forma bicatenaria. La escisión proteolítica de la forma de polipéptido sencilla de TeNT en A457-S458 da la forma bicatenaria. La escisión proteolítica de la forma de polipéptido sencilla de BaNT en K431-N432 da la forma bicatenaria. La escisión proteolítica de la forma de polipéptido sencilla de BuNT en R422-K423 da la forma bicatenaria. Dicho sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario está operativamente unido a una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica como una proteína de fusión. Sin embargo, debe indicarse que parece que sitios de escisión adicionales dentro del bucle bicatenario parece que también son escindidos dando como resultado la generación de un fragmento de péptido pequeño que se pierde. Como un ejemplo no limitante, la escisión del polipéptido monocatenario de BoNT/A produce la pérdida de un fragmento de diez aminoácidos dentro del bucle bicatenario.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva comprende una región de bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión de proteasa endógeno del bucle bicatenario. En aspectos de esta realización, un sitio de escisión de proteasa endógeno del bucle bicatenario dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/A, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/B, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/C1, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/D, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/E, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/F, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BoNT/G, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de TeNT, un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BaNT o un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario de BuNT. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de proteasa endógeno del bucle bicatenario dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., una región de bucle bicatenario de BoNT/A que comprende los aminoácidos 430-454 de la SEQ ID NO: 1; una región de bucle bicatenario de BoNT/B que comprende los aminoácidos 437-446 de la SEQ ID NO: 2; una región de bucle bicatenario de BoNT/C1 que comprende los aminoácidos 437-453 de la SEQ ID NO: 3; una región de bucle bicatenario de BoNT/D que comprende los aminoácidos 437-450 de la SEQ ID NO: 4; una región de bucle bicatenario de BoNT/E que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 5; una región de bucle bicatenario de BoNT/F que comprende los aminoácidos 429-445 de la SEQ ID NO: 6; una región de bucle bicatenario de BoNT/G que comprende los aminoácidos 436-450 de la SEQ ID NO: 7; o una región de bucle bicatenario de TeNT que comprende los aminoácidos 439-467 de la SEQ ID NO: 8. una región de bucle bicatenario de BaNT que comprende los aminoácidos 421-435 de la SEQ ID NO: 9; o una región de bucle bicatenario de BuNT que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 10.

Aspectos de la presente memoria descriptiva describen, en parte, un sitio de escisión de proteasa exógeno. Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de escisión de proteasa exógeno" es sinónimo de "sitio de escisión de proteasa modificado genéticamente", "sitio de escisión de proteasa no natural" o "sitio de escisión de proteasa no nativo" y se refiere a un sitio de escisión de proteasa que normalmente no está presente en una región de bucle bicatenario de una toxina clostridial natural. Dichos sitios de escisión de proteasa exógenos o modificados genéticamente dentro de la región de bucle bicatenario se usan para convertir la forma de polipéptido monocatenaria de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva en la forma bicatenaria. Está contemplado que se pueden usar todos y cada uno de los sitios de escisión de proteasa exógenos para convertir la forma de polipéptido monocatenaria de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica en su forma bicatenaria activa y son útiles para la práctica de aspectos de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de sitios de escisión de proteasa exógenos incluyen, p. ej., un sitio de escisión de papaína vegetal, un sitio de escisión de papaína de insecto, un sitio de escisión de papaína de crustáceos, un sitio de escisión de enteroquinasa, un sitio de escisión de proteasa 3C de rinovirus humano, un sitio de escisión de proteasa 3C de enterovirus humano, un sitio de escisión de proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV), un sitio de escisión del virus del moteado de las venas del tabaco (TVMV), un sitio de escisión de subtilisina, un sitio de escisión de hidroxilamina o un sitio de escisión de caspasa 3. Los sitios de escisión de proteasa modificados genéticamente situados dentro del bucle bicatenario se describen, p. ej., en Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, patente de EE.UU. 7,419,676, Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, patente de EE.UU. 7,422,877, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, publicación de patente de e E.UU. 2009/0069238, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, publicación de patente de EE.UU. 2008/0032930, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, publicación de patente de EE.UU. 2009/0018081, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, publicación de patente de Ee .UU. 2009/0005313, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, publicación de patente de EE.UU. 2009/0004224.

Está contemplado que un sitio de escisión de proteasa exógeno de todas y cada una de las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente memoria descriptiva, con la condición de que el sitio de escisión de proteasa exógeno pueda ser escindido por su respectiva proteasa. Por lo tanto, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno puede tener una longitud de, p. ej., al menos 6 , 7, 8 , 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o al menos 60 aminoácidos; o como máximo 6 , 7, 8 , 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o al menos 60 aminoácidos.

En una realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva comprende una región de bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión de proteasa exógeno. En aspectos de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de papaína vegetal, un sitio de escisión de papaína de insecto, un sitio de escisión de papaína de crustáceos, un sitio de escisión de proteasa enteroquinasa no humana, un sitio de escisión de proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV), un sitio de escisión del virus del moteado de las venas del tabaco, un sitio de escisión de proteasa 3C de rinovirus humano, un sitio de escisión de proteasa 3C de enterovirus humano, un sitio de escisión de subtilisina, un sitio de escisión de hidroxilamina, un sitio de escisión de proteasa SUMO/ULP-1 y un sitio de escisión de caspasa 3 no humana.

En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de enteroquinasa no humana. En otro aspecto de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de proteasa enteroquinasa bovina. En otro aspecto más de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 480.

En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., una escisión de proteasa de virus del grabado del tabaco. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la secuencia consenso EX-iX2YXaQ*G (SEQ ID NO: 481) o EX-iX2YXaQ*S (SEQ ID NO: 482), donde X1, X2 y X3 es cualquier aminoácido. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491 o SEQ ID NO: 492.

En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de proteasa de virus del moteado de las venas del tabaco. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la secuencia consenso X-iX2Vr Fq *G (SEQ ID NO: 493) o X-|X2VRFQ*S (SEQ ID NO: 494), donde X1 y X2 son independientemente cualquier aminoácido. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497 o SEQ ID NO: 498.

En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de proteasa 3C de rinovirus humano. En otro aspecto de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la secuencia consenso X-|X2LFQ*GP (SEQ ID NO: 499), donde X1 es cualquier aminoácido siendo preferido un aminoácido ácido como D o E; y X2 es preferiblemente S, T, y un aminoácido alifático hidrófobo como G, P, A, V, L, I, y M. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 504 o SEQ ID NO: 505. En otro aspecto de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., una proteasa 3C de rinovirus humano escindida por PRESCISSION®.

En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de subtilisina. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la secuencia consenso X-iX2X3X4H*Y (SEQ ID NO: 506) o X - ^ X ^ Y H * (SEQ ID NO: 507), donde X1, X2, X3 y X4 son independientemente cualquier aminoácido. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 508, SEQ ID n O: 509 o SEQ ID NO: 510. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de subtilisina escindido por GENENASE®.

En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de hidroxilamina. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., el dipéptido N*G. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 511 o SEQ ID NO: 512.

En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de proteasa SUMO/ULP-1. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la secuencia consenso GG*X-|X2X3 (SEQ ID NO: 513), donde X1, X2 y X3 son independientemente cualquier aminoácido. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 514.

En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de caspasa 3. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., un sitio de escisión de proteasa caspasa 3 no humana. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la secuencia consenso DX-|X2D*X3 (SEQ ID NO: 515), donde X1 es cualquier aminoácido, siendo preferido un aminoácido ácido como D y E, X2 es cualquier aminoácido y X3 es aminoácido, siendo preferido un aminoácido no polar pequeño como A, C, G, S, y T. En otros aspectos de la realización, un sitio de escisión de proteasa exógeno situado dentro de la región de bucle bicatenario comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520 o SEQ ID NO: 521.

Una región de bucle bicatenario se puede modificar de modo que un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario natural se sustituye por un sitio de escisión de proteasa exógeno. En esta modificación el sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario natural se hace inoperable y por lo tanto, no puede ser escindido por su proteasa. Solo el sitio de escisión de proteasa exógeno puede ser escindido por su correspondiente proteasa exógena. En este tipo de modificación, el sitio de proteasa exógeno está operativamente unido a una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica como una proteína de fusión y el sitio puede ser escindido por su respectiva proteasa exógena. La sustitución de un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario endógeno por un sitio de escisión de proteasa exógeno puede ser una sustitución de los sitios donde el sitio exógeno se modifica genéticamente en la posición acercándose a la posición del sitio de escisión del sitio endógeno. La sustitución de un sitio de escisión de proteasa del bucle bicatenario endógeno por un sitio de escisión de proteasa exógeno puede ser una adición de un sitio exógeno donde el sitio exógeno se modifica genéticamente en una posición diferente de la posición del sitio de escisión del sitio endógeno, modificándose genéticamente el sitio endógeno para ser inoperable. La posición y tipo de sitio de escisión de proteasa pueden ser críticos porque algunos dominios de unión requieren un aminoácido amino terminal o carboxilo terminal libre. Por ejemplo, cuando un dominio de unión de péptido se coloca entre otros dos dominios, p. ej., véase la figura 4, un criterio para la selección de un sitio de escisión de proteasa podría ser si la proteasa que escinde su sitio deja un corte romo, exponiendo el amino terminal o carboxilo terminal libre del dominio de unión necesario para la unión selectiva del dominio de unión a su receptor.

Un sitio de escisión de proteasa natural se puede hacer inoperable alterando al menos uno de los dos aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por la proteasa del bucle bicatenario natural. Se pueden hacer alteraciones más extensas, con la condición de que los dos restos de cisteína de la región de bucle bicatenario permanezcan intactas y la región pueda formar todavía el puente disulfuro. Los ejemplos no limitantes de una alteración de aminoácidos incluyen la eliminación de un aminoácido o sustitución del aminoácido original por un aminoácido diferente. Por lo tanto, en una realización, un sitio de escisión de proteasa natural se hace inoperable alterando al menos 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 15, 20 aminoácidos que incluyen al menos uno de los dos aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una proteasa natural. En otra realización, un sitio de escisión de proteasa natural se hace inoperable alterando como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 15, 20 aminoácidos que incluyen al menos uno de los dos aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una proteasa natural.

Se entiende que una toxina clostridial modificada descrita en la presente memoria descriptiva puede comprender además opcionalmente una región flexible que comprende un espaciador flexible. Una región flexible que comprende espaciadores flexibles se puede usar para ajustar la longitud de una región del polipéptido con el fin de optimizar una característica, atributo o propiedad de un polipéptido. Como un ejemplo no limitante, una región de polipéptido que comprende uno o más espaciadores flexibles en tándem se puede usar para exponer mejor un sitio de escisión de proteasa facilitando así la escisión de ese sitio por una proteasa. Como otro ejemplo no limitante, una región de polipéptido que comprende uno o más espaciadores flexibles en tándem se puede usar para presentar mejor un dominio de unión facilitando así la unión de ese dominio de unión a su receptor.

Un espacio flexible que comprende un péptido es de al menos un aminoácido de longitud y comprende aminoácidos sin carga con grupos R de cadena lateral pequeños, tal como, p. ej., aminoácidos no polares pequeños como A, C, G, S, y T. Por lo tanto, en una realización un espaciador flexible puede tener una longitud de, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 aminoácidos; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 aminoácidos. En otra realización más, un espaciador flexible puede tener, p. ej., entre 1-3 aminoácidos, entre 2-4 aminoácidos, entre 3-5 aminoácidos, entre 4 6 aminoácidos o entre 5-7 aminoácidos. Los ejemplos no limitantes de un espaciador flexible incluyen, p. ej., un espaciador G tal como GGG, GGGG (SEQ ID No : 522), y GGGGS (SEQ ID NO: 523) o un espaciador A tal como a Aa , AAAA (SEQ ID NO: 524) y AAAAT (SEQ ID NO: 525). Dicha región flexible está operativamente unida en el marco con la toxina clostridial modificada como una proteína de fusión.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva puede comprender además una región flexible que comprende un espaciador flexible. En otra realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva puede comprender además una región flexible que comprende una pluralidad de espaciadores flexibles en tándem. En aspectos de esta realización, una región flexible puede comprender en tándem, p. ej., al menos 1, 2, 3, 4 o 5 espaciadores G; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 espaciadores G. En otros aspectos más de esta realización, una región flexible puede comprender en tándem, p. ej., al menos 1,2, 3, 4 o 5 espaciadores A; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 espaciadores A. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica puede comprender una región flexible que comprende una o más copias de los mismos espaciadores flexibles, una o más copias de regiones de espaciadores flexibles diferentes, o cualquier combinación de los mismos.

Está contemplado que una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva puede comprender un espaciador flexible en todas y cada una de las posiciones con la condición de que la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica sea capaz de realizar el proceso de intoxicación completo. En aspectos de esta realización, un espaciador flexible se sitúa entre p. ej., un dominio enzimático y un dominio de traslocación, un dominio enzimático y un dominio de unión, un dominio enzimático y un sitio de escisión de proteasa exógeno. En otros aspectos de esta realización, un espaciador flexibles se sitúa entre, p. ej., un dominio de unión y un dominio de traslocación, un dominio de unión y un dominio enzimático, un dominio de unión y un sitio de escisión de proteasa exógeno. En otros aspectos más de esta realización, un espaciador flexibles se sitúa entre, p. ej., un dominio de traslocación y un dominio enzimático, un dominio de traslocación y un dominio de unión, un dominio de traslocación y un sitio de escisión de proteasa exógeno.

Como otro ejemplo no limitante de un componente opcional, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica puede comprender además una región de unión de epítopo. Una región de unión de epítopo se puede usar en una amplia variedad de procedimientos que implican, p. ej., purificación de proteínas y visualización de proteínas. Dicha región de unión de epítopo está operativamente unida en el marco a una toxina clostridial modificada como una proteína de fusión. Ejemplos no limitantes de una región de unión de epítopo incluyen, p. ej., FLAG, Express™, hemaglutinina humana de virus influenza (HA), proteína p62c-Myc humana (c-MYC), glicoproteína de virus de la estomatotis vesicular (VSV-G), precursor D de glicoproteína del virus del Herpes simplex (HSV), V5, AU1, y AU5; unión por afinidad, tal como, p. ej., polihistidina (HIS), péptido de unión a estreptavidina (strep), y biotina o una secuencia de biotinilación; regiones de unión de péptido, tales como. p. ej., el dominio de unión de glutatión de la glutatión-S-transferasa, el dominio de unión de calmodulina de la proteína de unión de calmodulina, y el dominio de unión de maltosa de la proteína de unión de maltosa. Los ejemplos no limitantes de protocolos específicos para seleccionar, hacer y usar un péptido de unión adecuado se describe, p. ej., en Epitope Tagging, pág. 17.90-17.93 (Sambrook y Russell, eds., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Vol. 3, 3a ed. 2001); ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1998); y USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL No. I (Edward Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998). Además, ejemplos no limitantes de péptidos de unión así como reactivos, condiciones y protocolos bien caracterizados están fácilmente disponibles en los proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; Bd Biosciences Pharmingen, San Diego, c A; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos protocolos son procedimientos rutinarios dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Por lo tanto, en una realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva puede comprender además una región de unión de epítopo. En otra realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva puede comprender además una pluralidad de regiones de unión de epítopos. En aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica puede comprender, p. ej., al menos 1,2, 3, 4 o 5 regiones de unión de epítopos. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica puede comprender, p. ej., como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 regiones de unión de epítopos. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender una o más copias de la misma región de unión de epítopo, una o más copias de diferentes regiones de unión de epítopos, o cualquier combinación de los mismos.

La situación de una región de unión de epítopo puede ser en diferentes posiciones, incluyendo, sin limitación, en el extremo amino, dentro, o en el extremo carboxilo de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica. Por lo tanto, en una realización, una región de unión de epítopo está situada en el extremo amino de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica. En otra realización, una región de unión de epítopo está situada en el extremo carboxilo de una toxina clostridial modificada.

Aspectos de la presente memoria descriptiva proporcionan, en parte, moléculas de polinucleótidos. Como se usa en la presente memoria, la expresión "molécula de polinucleótido" es sinónima de "molécula de ácido nucleico" y se refiere a una forma polimérica de nucleótidos, tal como, p. ej., ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Está contemplado que todas y cada una de las moléculas de polinucleótidos que puedan codificar una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva pueden ser útiles, incluyendo, sin limitación moléculas de ADN naturales y no naturales y moléculas de ARN naturales y no naturales. Los ejemplos no limitantes de moléculas de ADN naturales y no naturales incluyen moléculas de ADN monocatenarias, moléculas de ADN bicatenarias, moléculas de ADN genómicas, moléculas de ADNc, construcciones de vectores, tales como, p. ej., construcciones de plásmidos, construcciones de fagémidos, construcciones de bacteriófagos, construcciones retrovíricas y construcciones de cromosomas artificiales. Los ejemplos no limitantes de moléculas de ARN naturales y no naturales incluyen ARN monocatenario, ARN bicatenario y ARNm.

Las técnicas de biología molecular bien establecidas que pueden ser necesarias para hacer una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva, incluyen, pero no se limitan a procedimientos que implican la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacciones con enzimas de restricción, electroforesis en gel de agarosa, ligado de ácidos nucleicos, transformación bacteriana, purificación de ácido nucleico, técnicas basadas en secuenciación y recombinación de ácidos nucleicos, son procedimientos rutinarios dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria. Los ejemplos no limitantes de protocolos específicos necesarios para hacer una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada se describen, p. ej., en MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, véase antes, (2001); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004). Además, están ampliamente disponibles una variedad de productos disponibles en el comercio para hacer una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. Estos protocolos son procedimientos rutinarios que están dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Por lo tanto, en una realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva.

Otro aspecto de la presente memoria descriptiva proporciona, en parte, un método para producir una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva, comprendiendo dicho método la etapa de expresar una molécula de polinucleótidos que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica en una célula. Otro aspecto de la presente memoria descriptiva proporciona un método para producir una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva, comprendiendo dicho método las etapas de introducir una construcción de expresión que comprende una molécula de polinucleótidos que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica, en una célula y expresar la construcción de expresión en la célula.

Los métodos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica. Está contemplado que todas y cada una de las toxinas clostridiales o toxina clostridial quiméricas descritas en la presente memoria descriptiva se pueden producir usando los métodos descritos en la presente memoria descriptiva. También Está contemplado que todas y cada una de las moléculas de polinucleótido que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descritas en la presente memoria descriptiva pueden ser útiles en la producción de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva usando los métodos descritos en la presente memoria descriptiva.

Los métodos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, una construcción de expresión. Una construcción de expresión comprende una molécula de polinucleótido descrita en la presente memoria descriptiva operativamente unida a un vector de expresión útil para expresar la molécula de polinucleótido en una célula o extracto exento de células. Se puede usar una amplia variedad de vectores de expresión para expresar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva, incluyendo, sin limitación, un vector de expresión vírico; un vector de expresión procariota; vectores de expresión eucariotas, tales como p. ej., un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto y un vector de expresión de mamífero; y un vector de expresión de extracto exento de células. Se entiende además que los vectores de expresión útiles para la práctica de aspectos de estos métodos pueden incluir los que expresan una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica bajo el control de un elemento promotor inducible o constitutivo, específico de tejido, específico de célula, elemento potenciador, o ambos. Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión, junto con reactivos y condiciones para hacerlos bien establecidos y que usan una construcción de expresión de dichos vectores de expresión están fácilmente disponibles de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. La selección, fabricación y uso de un vector de expresión adecuados son procedimientos rutinarios dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Por lo tanto, en aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótidos que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva está operativamente unida a un vector de expresión. En aspectos de esta realización, el vector de expresión es, p. ej., un vector de expresión vírico, un vector de expresión de procariota, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto o un vector de expresión de mamífero. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva está operativamente unida a un vector de expresión de extracto exento de células.

Los métodos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, una célula. Está contemplado que se pueden usar todas y cada una de las células. Por lo tanto, aspectos de esta realización incluyen, sin limitación, células procariotas que incluyen, sin limitación, cepas de células de bacterias aerobias, microaerófilas, capnófilas, facultativas, anaerobias, Gram negativas, tales como las derivadas de, p. ej., Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens y Salmonella typhimurium; y células eucariotas incluyendo, sin limitación, cepas de levaduras, tales como, p. ej., las derivadas de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytica; células de insecto y líneas celulares derivadas de insectos, tales como, p. ej., las derivadas de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y Manduca sexta; y células de mamíferos y líneas celulares derivadas de células de mamíferos, tales como, p. ej., las derivadas de ratón, ratas, hámster, porcinas, bovinas, equinas, primates y humanas. Las líneas celulares se pueden obtener de la American Type Culture Collection, European Collection of Cell Cultures y la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures. Los ejemplos no limitantes de protocolos específicos para seleccionar, hacer y usar una línea celular adecuada se describen en, p. ej., INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997) ; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998) ; R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4a ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3a ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, véase antes, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2a ed. 2002); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, véase antes, (2004). Estos protocolos son procedimientos rutinarios dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Los métodos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, introducir en una célula una molécula de polinucleótido. Una molécula de polinucleótido introducida en una célula puede ser mantenida de forma transitoria o estable por esa célula. Las moléculas de polinucleótido mantenidas de forma estable pueden ser extracromosómicas y replicarse de forma autónoma, o se pueden integrar en el material cromosómico de la célula y replicarse de forma no autónoma. Está previsto que se pueden usar todos y cada uno de los métodos para introducir una molécula de polinucleótido en una célula descritos en la presente memoria descriptiva. Los métodos útiles para introducir una molécula de polinucleótido en una célula incluyen, sin limitación, transfección o transformación mediada por compuestos químicos tal como, p. ej., mediada por cloruro de calcio, mediada por fosfato de calcio, mediada por dietilaminoetil(DEAE)-dextrano, mediada por lípidos, mediada por polietilenimina (PEI), mediada por polilisina y mediada por polibreno; transfección o transformación mediada por métodos físicos, tales como, p. ej., suministro biolístico de partículas, microinyección, fusión de protoplastos y electroporación; y transfección mediada por virus, tal como, p. ej., transfección mediada por retrovirus, véase, p. ej., Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pág. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3a ed. 2001). Un experto en la técnica entiende que la selección de un método específico para introducir una construcción de expresión en una célula dependerá, en parte, de si la célula contendrá de forma transitoria una construcción de expresión o si la célula contendrá establemente una construcción de expresión. Estos protocolos son procedimientos rutinarios dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

En un aspecto de esta realización, se usa un método mediado por compuesto químico, denominado transfección, para introducir en la célula una molécula de polinucleótidos que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. En los métodos de transfección mediados por compuestos químico, el reactivo químico forma un complejo con el ácido nucleico que facilita su absorción en las células. Dichos reactivos químicos incluyen, sin limitación, mediado por fosfato de calcio, véase, p. ej., Martin Jordan y Florian Worm, "Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate", 33(2) Methods 136-143 (2004); mediado por dietilaminoetil(DEAE)-dextrano, mediado por lípidos, mediado por polímero catiónico como mediado por polietilenimina (PEI) y mediado por polilisina y mediado por polibreno, véase, p. ej., Chun Zhang et al., "Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells", 33(2) Methods 144-150 (2004). Dichos sistemas de suministro mediados por compuesto químico se pueden preparar por métodos estándar y están disponibles en el comercio, véase, p. ej., kit de transfección CellPhect (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); Mammalian Transfection Kit, fosfato de calcio y DEAE-Dextrano, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); reactivo de transfección LIPOFECTAMINE™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); kit de transfección ExGen 500 (Fermentas, Inc., Hanover, MD), y kits de transfección SuperFect y Effectene (Qiagen, Inc., Valencia, CA).

En otro aspecto de esta realización, se usa un método físico para introducir en una célula una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. Las técnicas físicas incluyen, sin limitación, electroporación, biolística y microinyección. Las técnicas de biolística y microinyección perforan la pared celular con el fin de introducir la molécula de ácido nucleico en la célula, véase, p. ej., Jeike E. Biewenga et al., "Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique", 71(1) J. Neurosci. Methods 67-75 (1997); y John O'Brien y Sarah C. R. Lummis, "Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells", 33(2) Methods 121-125 (2004). La electroporación, también denominada electropermeabilización, usa pulsos eléctricos breves de alto voltaje para crear poros transitorios en la membrana a través de los cuales entran las moléculas de ácido nucleico y se pueden usar eficazmente para transfecciones estables y transitorias de todos los tipos de células, véase, p. ej., M. Golzio et al., "In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression", 33(2) Methods 126-135 (2004); y Oliver Greschet al., "New non-viral method for gene transfer into primary cells", 33(2) Methods 151-163 (2004).

En otro aspecto de esta realización, se usa un método mediado por virus, denominado transducción, para introducir en una célula una molécula de polinucleótidos que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. En los métodos de transducción transitoria mediados por virus, el proceso por el cual las partículas víricas infectan y se multiplican en una célula hospedante se ha manipulado con el fin de usar este mecanismo para introducir una molécula de polinucleótido en la célula. Se han desarrollado métodos mediados por virus a partir de una amplia variedad de virus incluyendo, sin limitación, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus Herpes simplex, picornavirus, alfavirus y baculovirus, véase, p. ej., Armin Blesch, "Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer", 33(2) Methods 164-172 (2004); y Maurizio Federico, "From lentiviruses to lentivirus vectors", 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, "Non-primate lentiviral vectors", 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al, "Adenovirus vectors for gene delivery", 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, "Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy", 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., "Adenovirus and adeno-associated virus vectors", 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., "Gene delivery using herpes simplex virus vectors", 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., "Targeting HSV amplicon vectors", 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications", 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, "Alphaviral gene transfer in neurobiology", 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost y J. Patrick Condreay, "Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors", 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); y A. Huser y C. Hofmann, "Baculovirus vectors: novel mammalian cell genedelivery vehicles and their applications", 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003).

Se seleccionan con frecuencia adenovirus, que son virus de ADN bicatenario que no tienen envuelta, para la transducción de células de mamífero porque los adenovirus manejan moléculas de polinucleótidos relativamente grandes de aproximadamente 36 kb, se producen con títulos altos y pueden infectar eficazmente una amplia variedad de células tanto que se dividen como que no se dividen, véase, p. ej., Wim T. J. M. C. Hermens et al., "Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS", 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); y Hiroyuki Mizuguchi et al., "Approaches for generating recombinant adenovirus vectors", 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001). La transducción usando sistema basado en adenovirus no soporta la expresión de proteínas prolongada porque la molécula de ácido nucleico la lleva un episoma en el núcleo de la célula, en lugar de ser integrada en el cromosoma de la célula hospedante. Se describen sistemas de vectores adenovíricos y protocolos específicos para cómo usar dichos vectores en, p. ej., VIRAPOWER™ Adenoviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y VIRAPOWER™ Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (15 de julio, 2002); y ADEASY™ Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) y ADEASY™ Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc.

El suministro de moléculas de polinucleótidos también puede usar retrovirus de ARN monocatenarios, tales como, p. ej., oncorretrovirus y lentivirus. La transducción mediada por retrovirus a menudo produce eficacias de transducción cercanas a 100%, puede controlar fácilmente el número de copias províricas variando la multiplicidad de infección (MDI), y se puede usar para transducir células de forma transitoria o estable, véase, p. ej., Tiziana Tonini et al., "Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells", 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, "Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer", 33(2) Methods 164-172 (2004); Félix Recillas-Targa, "Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals", 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); y Roland Wolkowicz et al., "Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells", 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004). Las partículas de retrovirus consisten en un genoma de ARN empaquetado en una cápside de proteínas, rodeado por una envuelta lipídica. El retrovirus infecta una célula hospedante inyectando su ARN en el citoplasma junto con la enzima transcriptasa inversa. Después el molde de ARN se retrotranscribe en un ADNc bicatenario, lineal, que se replica él mismo integrándose en el genoma de la célula huésped. Las partículas víricas se extienden tanto vertical (de célula original a células hija por provirus) como horizontalmente (de célula a célula por viriones). La estrategia de replicación permite la expresión continua prolongada puesto que las moléculas de ácido nucleico de interés están establemente integradas en un cromosoma de la célula hospedante, permitiendo así la expresión prolongada de la proteína. Por ejemplo, estudios en animales han mostrado que vectores lentivirus inyectados en una variedad de tejidos producían expresión de proteína sostenida durante más de 1 año, véase, p. ej., Luigi Naldini et al., "In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector", 272(5259) Science 263-267 (1996). Los sistemas de vectores derivados de oncorretrovirus, tales como, p. ej., virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), se usan ampliamente e infectan muchas células diferentes que no se dividen. Los lentivirus también pueden infectar muchos tipos de células diferentes, incluyendo células que se dividen y que no se dividen y tienen proteínas de envuelta completa, que permiten el direccionamiento celular muy específico.

Se describen vectores retrovíricos y protocolos específicos para cómo usar dichos vectores en, p. ej., Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control o f gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters, patente de EE.UU. n° 5,464,758 (7 de nov., 1995) y Hermann Bujard y Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression, patente de EE.UU. n° 5,814,618 (29 de sep., 1998), David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same, patente de EE.UU. n° 5,514,578 (7 de mayo, 1996) y David S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor, patente de EE.UU. 6,245,531 (12 de jun., 2001); Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptorhaving C. terminal hormone binding domain truncations, patente de EE.UU. n° 5,364,791 (15 de nov., 1994), Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, patente de EE.UU. n° 5,874,534 (23 de feb., 1999) y Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, patente de EE.UU. n° 5,935,934 (10 de agosto, 1999). Además, dichos sistemas de suministro de virus se pueden preparar por métodos convencionales y están disponibles en el comercio, véase, p. ej., sistemas de expresión de genes Tet-Off y Tet-On BD™ (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) y Manual de usuario de sistemas de expresión de genes Tet-Off y Tet-On BD™, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (14 de marzo, 2003), sistema g En ESWITCH™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y sistema GENESWITCH™ Un sistema de expresión regulado por Mifepristona para células de mamíferos, versión D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (4 de nov., 2002); sistema de expresión de lentivirus VIRAPOWER™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y Manual de instrucciones del sistema de expresión de lentivirus VIRAPOWER™ 25-0501 versión E, Invitrogen, Inc., (8 de dic., 2003); y sistema de expresión de mamíferos inducible por retrovirus COMPLETE CONTROL® (Stratagene, La Jolla, CA) y manual de instrucciones del sistema de expresión de mamíferos inducible por retrovirus COMPLETE CONTROL®, 064005e.

Los métodos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, expresar a partir de una molécula de polinucleótido, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. Está contemplado que puede ser útil cualquiera de una variedad de sistemas de expresión para expresar a partir de una molécula de polinucleótido, una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva, incluyendo, sin limitación, sistemas basados en células y sistemas de expresión sin células. Los sistemas basados en células incluyen, sin limitación, sistemas de expresión víricos, sistemas de expresión procariotas, sistemas de expresión de levaduras, sistemas de expresión de baculovirus, sistemas de expresión de insecto y sistemas de expresión de mamífero. Los sistemas sin células incluyen, sin limitación, extractos de germen de trigo, extractos de reticulocitos de conejo y extractos de E. coli y en general son equivalentes al método descrito en la presente memoria, La expresión de una molécula de polinucleótido usando un sistema de expresión puede incluir cualquiera de una variedad de características incluyendo, sin limitación, expresión inducible, expresión no inducible, expresión constitutiva, expresión mediada por virus, expresión establemente integrada y expresión transitoria. Los sistemas de expresión que incluyen vectores, reactivos, condiciones y células bien caracterizados, están bien establecidos y están fácilmente disponibles en proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN; y Stratagene, La Jolla, CA. Los ejemplos no limitantes de selección y uso de sistemas de expresión heterólogos adecuados se describen, p. ej., en PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins y B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez y James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); y Meena Rai y Harish Padh, "Expression Systems for Production of Heterologous Proteins", 80(9) Current Science 1121-1128, (2001). Estos protocolos son procedimientos rutinarios dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Son útiles una variedad de procedimientos de expresión basados en células, para expresar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. Los ejemplos incluyen, sin limitación, sistemas de expresión víricos, sistemas de expresión de procariotas, sistemas de expresión de levaduras, sistemas de expresión de baculovirus, sistemas de expresión de insecto y sistemas de expresión de mamífero. Los sistemas de expresión víricos incluyen, sin limitación, el VIRAPOWER™ Lentiviral (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), los Adenoviral Expression Systems (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el ADEASY™ XL Adenoviral Vector System (Stratagene, La Jolla, CA) y el VIRAPORT® Retroviral Gene Expression System (Stratagene, La Jolla, CA). Los ejemplos no limitantes de sistemas de expresión procariotas incluyen el CHAMPION™ pET Expression System (e Md Biosciences-Novagen, Madison, WI), el TRIEX™ Bacterial Expression System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), el QIAEXPRESS® Expression System (QIAGEN, Inc.), y el AFFINITY®Protein Expression and Purification System (Stratagene, La Jolla, CA). Los sistemas de expresión de levaduras incluyen, sin limitación, el EASYSELECT™ Pichia Expression Kit (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el YES-ECHO™ Expression Vector Kits (Invitrogen, Inc., Carlsbad, c A ) y el SPECTRA™ S. pombe Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Los ejemplos no limitantes de sistemas de expresión de baculovirus incluyen el BACULODIRECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el BAC-TO-BAC® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), y el BD BACULOGOLD™ (BD Biosciences-Pharmigen, San Diego, CA). Los sistemas de expresión de insecto incluyen, sin limitación, el Drosophila Expression System (DES®) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), INSECTSELECT™ System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y INSECTDIRECT™ System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). Los ejemplos no limitantes de sistemas de expresión de mamífero incluyen el T-REX™ (Expresión regulada por tetraciclina) System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el FLP-IN™ T-REX™ System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, c A), el pcDNA™ system (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el pSecTag2 system (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el EXCHANGER® System, INTERPLAY™ Mammalian TAP System (Stratagene, La Jolla, CA), Sistema de expresión de mamífero inducible COMPLETE CONTROL® (Stratagene, La Jolla, CA) y Sistema de expresión de mamífero inducible LACSWITCH® II (Stratagene, La Jolla, CA).

Otro procedimiento de expresión de una molécula de polinucleótidos que codifica una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva usa un sistema de expresión sin células tal como, sin limitación, extractos de procariotas y extractos de eucariotas. Los ejemplos no limitantes de extractos de células procariotas incluyen el RTS 100 E. coli HY Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), el ActivePro In Vitro Translation Kit (Ambion, Inc., Austin, TX), el Ec Op RO™ System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) y el EXPRESSWAY™ Plus Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). El extracto de células eucariotas incluye, sin limitación, el RTS 100 Wheat Germ CECF Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), el TNT® Coupled Wheat Germ Extract Systems (Promega Corp., Madison, WI), el Wheat Germ IVT™ Kit (Ambion, Inc., Austin, TX), el Retic Lysate IVT™ Kit (Ambion, Inc., Austin, TX), el PROTEINSCRIPT® II System (Ambion, Inc., Austin, TX) y el TNT® Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega Corp., Madison, WI).

La toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva, descrita en la presente memoria descriptiva es producida por la célula en una forma monocatenaria. Con el fin de lograr la actividad completa, la forma monocatenaria debe convertirse en su forma bicatenaria. Como se ha discutido antes, este proceso de conversión se logra por escisión de un sitio de escisión de proteasa situado dentro de la región de bucle bicatenario de la toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. Este proceso de conversión se puede llevar a cabo usando un ensayo de escisión proteolítica in vitro convencional o en un sistema de escisión proteolítica basado en células como se describe en la solicitud de patente de Ghanshani, et al., Methods o f Intracellular Conversión o f Single-Chain Proteins into their Di-chain Form, N° de expediente del apoderado 18469 PROV (BOT).

Aspectos de la presente memoria descriptiva describen, en parte, una composición que comprende una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. En un aspecto adicional, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier entidad molecular o composición que no produce una reacción adversa, alérgica u otra reacción perjudicial o no deseada cuando se administra a un individuo. Como se usa en la presente memoria, la expresión "composición farmacéuticamente aceptable" es sinónima de "composición farmacéutica" y se refiere a una concentración terapéuticamente eficaz de un principio activo, tal como, p. ej., cualquiera de las toxinas clostridiales o toxinas clostridiales quiméricas descritas en la presente memoria descriptiva. Una composición farmacéutica que comprende una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica es útil para aplicaciones médicas y veterinarias. Una composición farmacéutica se puede administrar a un paciente sola o en combinación con otros principios activos, agentes, fármacos y hormonas complementarios. Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar usando cualquiera de una variedad de procedimientos incluyendo, sin limitación, mezcla convencional, disolución, granulación, formación de grageas, levigado, emulsión, encapsulación, atrapamiento y liofilización. La composición farmacéutica puede tener cualquiera de una variedad de formas incluyendo, sin limitación, una solución estéril, suspensión, emulsión, liofilizado, comprimido, píldora, gránulo, cápsula, polvo, jarabe, elixir o cualquier otra forma farmacéutica adecuada para la administración.

Está contemplado también que una composición farmacéutica que comprende una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva puede incluir opcionalmente vehículos farmacéuticamente aceptables que facilitan el procesado de un principio activo en composiciones farmacéuticamente aceptables. Como se usa en la presente memoria, la expresión "vehículo farmacológicamente aceptable" es sinónima de "vehículo farmacológico" y se refiere a cualquier vehículo que no tiene sustancialmente efecto perjudicial permanente o prolongado cuando se administra y abarca expresiones tales como "vehículo, estabilizante, diluyente, aditivo, auxiliar o excipiente farmacológicamente aceptable". Dicho vehículo en general se mezcla con un compuesto activo o se deja diluir o encerrar el compuesto activo, y puede ser un agente sólido, semisólido o líquido. Se entiende que los principios activos pueden ser solubles o se pueden suministrar en forma de una suspensión en el vehículo o diluyente deseado. Se puede usar cualquiera de una variedad de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyendo, sin limitación, medios acuosos tales como, p. ej. agua, solución salina, glicina, ácido hialurónico y similares; vehículos sólidos tales como, p. ej., manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato magnésico y similares; disolventes; medios de dispersión; recubrimientos; agentes antibacterianos y antifúngicos; agentes isotónicos y de retraso de la absorción; o cualquier otro ingrediente activo. La selección de un vehículo farmacéuticamente aceptable puede depender del modo de administración. Excepto en la medida en que cualquier vehículo farmacológicamente aceptable sea incompatible con el principio activo, está contemplado su uso en composiciones farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos no limitantes de usos específicos de dichos vehículos farmacéuticos se pueden encontrar en PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7a ed. 1999); REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20a ed. 2000); GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10a ed. 2001); y HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4a edición 2003). Estos protocolos son procedimientos rutinarios y cualquier modificación está dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Está contemplado además que una composición farmacéutica descrita en la presente memoria descriptiva puede incluir opcionalmente, sin limitación, otros componentes farmacéuticamente aceptables (o componentes farmacéuticos), incluyendo, sin limitación, tampones, conservantes, agentes de ajuste de la tonicidad, sales, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, sustancias fisiológicas, sustancias farmacológicas, agentes de carga, agentes emulsionantes, agentes humectantes, agentes edulcorantes o de sabor, y similares. Se pueden usar diferentes tampones y agentes mencionados para ajustar el pH, para preparar una composición farmacéutica descrita en la presente memoria descriptiva, con la condición de que la preparación resultante sea farmacéuticamente aceptable. Dichos tampones incluyen, sin limitación, tampones de acetato, tampones de citrato, tampones de fosfato, solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y tampones de borato. Se entiende que se pueden usar ácidos o bases para ajustar el pH de una composición según sea necesario. Los antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, metabisulfito sódico, tiosulfato sódico, acetilcisteína, hidroxianisol butilado e hidroxitolueno butilado. Los conservantes útiles incluyen, sin limitación, cloruro de benzalconio, clorobutanol, timerosal, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, una composición de oxi-cloro estabilizada tal como, p. ej., PURITE® y quelantes, tales como, p. ej., DTPA o DTPA-bisamida, DTPA de calcio, y CaNaDTPA-bisamida. Los agentes de ajuste de la tonicidad útiles en una composición farmacéutica incluyen, sin limitación, sales tales como p. ej., cloruro sódico, cloruro potásico, manitol o glicerina y otro agente de ajuste de la tonicidad farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica se puede proporcionar como una sal y se puede formar con muchos ácidos diferentes incluyendo, pero no limitados a clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico y succínico. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre. Se entiende que estas y otras sustancias conocidas en la técnica farmacológica se pueden incluir en una composición farmacéutica útil en la memoria descriptiva.

En una realización, una composición comprende na toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. En un aspecto de esta realización, la composición es una composición farmacéutica que comprende una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva. En aspectos de esta realización, una composición farmacéutica que comprende toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva, comprende además un vehículo farmacológico, un componente farmacéutico o tanto un vehículo farmacológico como un componente farmacéutico. En otros aspectos de esta realización, una composición farmacéutica que comprende una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica descrita en la presente memoria descriptiva comprende además al menos un vehículo farmacológico, al menos un componente farmacéutico o al menos un vehículo farmacológico y al menos un componente farmacéutico.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan con fines ilustrativos solo con el fin de facilitar una comprensión más completa de las realizaciones descritas y no se pretende de ninguna forma que limiten ninguna de las realizaciones descritas en la presente memoria descriptiva.

Ejemplo 1

Identificación de regiones de sitio de escisión de inactivación

Este ejemplo ilustra cómo identificar regiones dentro de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica adecuadas para modificar la toxina para que comprenda un sitio de escisión de inactivación y cómo hacer una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación.

Para identificar una situación o situaciones en la estructura de proteína adecuadas como una potencial región de sitios de escisión de inactivación, se analizó la estructura tridimensional de una BoNT/A mediante un programa de ordenador para identificar bucles expuestos en la superficie o regiones extendidas que serían más accesibles para una proteasa. De las regiones que se predijo que eran accesibles, se seleccionaron ocho para el análisis adicional: los aminoácidos 462-496 de la s Eq ID No : 1, aminoácidos 618-634 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 638-651 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 665-687 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 752-765 de la SEQ ID NO: 1, y aminoácidos 826-835 de la SEQ IN NO: 1, aminoácidos 844-863 de la SEQ ID NO: 1, y aminoácidos 871-895 de la SEQ ID NO: 1.

Para determinar si una región identificada por análisis por ordenador podría funcional como una región de sitios de escisión de inactivación, se modificaron genéticamente sitios de escisión de trombina en esas regiones usando mutagénesis con multicebadores y se ensayó su capacidad para ser escindida por trombina. Se montó una reacción de 50 |jl que comprendía un primer conjunto de cebadores oligonucleótidos unidireccionales que contenía cada uno la modificación deseada (125 ng de cada cebador), mezclados en diferentes proporciones con un molde de ADN que comprendía una construcción de expresión que codifica una BoNT/A, tal como, p. ej., una construcción de expresión que comprende la SEQ ID NO: 526 que codifica la SEQ ID NO: 527 o una construcción de expresión que comprende la SEQ ID NO: 528 que codifica la SEQ ID NO: 529, que se hipermetiló con metalasa Dam. A esta mezcla se añadieron 5 j l de 10x tampón de PCR, 1 j l de desoxirribonucleótidos (dNTP), 1 j l de ADN polimerasa PFUULTRA™ High Fidelity 2.5 unidades/jl (Stratagene, La Jolla, CA), ADN ligasa Pfu, ATP, y agua exenta de nucleasa hasta un volumen final de 50 jl. Las condiciones del termociclador eran: 30 ciclos de 96°C durante 1 minuto, 60°C durante 30 segundos, y 68°C durante 20 minutos. Después de termociclado, se añadió 1 j l de enzima de restricción Dpnl (Stratagene, La Jolla, CA) a la reacción y se incubó durante 1 hora a 37°C para digerir el ADN molde y reducir la recuperación de clones de tipo natural. La mezcla de reacción digerida se transformó en células E. coli BL21(DE3)Acella electrocompetentes (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por electroporación, se cultivaron en placas de agar Luria-Bertani al 1.5% (pH 7.0) que contenía 50 jg/m l de kanamicina, y se pusieron en un incubador a 37°C para el desarrollo durante la noche. La bacterias que contenían construcciones de expresión se identificaron como colonias resistentes a la kanamicina. Las construcciones candidato se aislaron usando una procedimiento de minipreparación de plásmido por lisis alcalina y se analizaron por secuenciación para determinar la frecuencia e identificar las mutaciones incorporadas. La tabla 7 cita cada BoNT/A que comprende un sitio de escisión de trombina (BoNT/A-TCS) hecho y ensayado en este análisis de barrido de trombina.

Para determinar el nivel de expresión de la proteína soluble para cada BoNT/A-TCS, se expresó una construcción de expresión que comprendía cada BoNT/A-TCs, se purificó por cromatografía de afinidad con metal inmovilizado y se analizó por análisis de SDS-PAGE. Primero, usando una placa de 96 pocillos, se inocularon 100 j l de medio PA-0.5G que contenía kanamicina 50 jg/m l con una sola colonia de células BL21(DE3) que albergaban la construcción de expresión adecuada y se cultivaron a 37°C con agitación durante la noche. Se usó una parte alícuota de 5 j l de este cultivo iniciador para inocular 1 ml de ZYP-5052 que contenía kanamicina 50 jg/m l y se cultivó a 37°C con agitación durante 3.5 horas y después a 22°C durante 16 h. Se añadió una parte alícuota de 110 j l de reactivo de extracción de proteínas que comprendía 10X reactivo de lisis celular FASTBREAK™ (Promega Corp., Madison, WI), nucleasa Benzonase 250 U/ml (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), y 10X cóctel inhibidor de proteasas III (EMD Biosciences-Calbiochem, Gibbstown, NJ) a cada cultivo de expresión de 1 ml en una placa de 96 pocillos. Después se transfirieron 75 j l de resina HISLINK™ (Promega Corp., Madison, WI) a cada pocillo y la mezcla se mezcló alternativamente mediante pipeteo y con agitación a 900 rpm durante 30 minutos. Los lisatos se transfirieron a una placa de filtró con un tamaño de poros de 25 jm (Promega Corp., Madison, WI), con membranas previamente mojadas con agua, y el líquido se separó por filtración con vacío. La resina se lavó tres veces con 200 j l de tampón de lavado que comprende HEPES 100 mM (pH 7.5), imidazol 10 mM. La proteína se eluyó añadiendo 200 j l de tampón de elución que comprende HEPES 100 mM (pH 7.5), imidazol 500 mM, incubando durante 5 minutos y el eluido se recogió por filtración con vacío en una placa de 96 pocillos.

Para llevar a cabo en análisis de SDS-PAGE, se añadió un volumen igual de 2 x tampón de muestra de Laemmli a la BoNT/A purificada por IMAC que comprende un sitio de escisión de trombina, y la mezcla se incubó a 95°C durante 5 minutos. Se cargó una parte alícuota de 15 j l y se separó por electroforesis en gel de poliacrilamida-MOPS usando geles de poliacrilamida preformados Bis-Tris al 4-12% NUPAGE®Novex (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en condiciones reductoras, desnaturalizantes. El gel se lavó y fijó en metanol al 10% y ácido acético al 7% durante 30 minutos. Se retiró la solución de lavado y el gel se incubó en solución de gel de tinción de proteínas SYPRO Ruby durante 3 horas a toda la noche a temperatura ambiente. El gel teñido se destiñó en metanol al 10% y ácido acético al 7% durante 30 minutos. El gel desteñido se visualizó con generador de imágenes digitales Fluro-S-Max (Bio-Rad).

Los resultados del análisis de expresión se dan en la tabla 7. En general, las toxinas que albergaban un sitio de escisión de trombina insertado en las regiones de inactivación que comprenden los aminoácidos 462-496 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 844-863 o aminoácidos 871-895 de la SEQ ID NO: 1 se expresaron bien. Por ejemplo, las toxinas que comprenden A489insLVPRGS fueron expresada en aproximadamente un 50% respecto a la construcción de control de tipo natural y las toxinas que comprenden D848insLVPRGS o N880insLVPRGS fueron expresadas en niveles del control o cercanos a este (tabla 7). Estos resultados ponen de manifiesto que las regiones de sitios de escisión de inactivación situadas dentro del dominio de traslocación y/o el subdominio de unión Hcn toleraban la modificación de las regiones para incluir un sitio de escisión de proteasa.

Para explorar más la extensión en la que las regiones de sitios de escisión de inactivación identificadas podrían tolerar modificaciones que introducen un sitio de escisión de proteasa, se modificaron las toxinas para incluir sitios de escisión de trombina a lo largo de la región. Por ejemplo, se hicieron toxinas que comprendían T884insLVPRGS o L862ins LVPRGS para examinar la región de sitios de escisión de inactivación que comprende 844-863 de la SEQ ID NO: 1. Igualmente, se hicieron toxinas que comprendían E868insLVPRGS, deIE868YIKNI-insLVPRGS, delN872IINTS-insLVPRGS, T876insLVPRGS, L879insVPRGS, deIL879NLRYE-insLVPRGS, L881insVPRGS, delL881 RYESNinsLVPRGS, Y883insLVPRGS, E884insLVPRGS, S885insLVPRGS, delH887LIDLS-insLVPRGS, L888insLVPRGS, L891insVPRG y deIS892RYA-insVPRG para examinar la región de sitios de escisión de inactivación región que comprende 871-895 de la SEQ ID NO: 1. Se hicieron modificaciones tanto de inserción como de sustitución para examinar si el tipo de modificación tenían algún efecto. En general, todas las toxinas que albergaban un sitio de escisión de trombina insertado en estas regiones de inactivación fueron expresadas en niveles de o cercanos a los de una construcción de control de tipo natural. Estos resultados ponen de manifiesto que las regiones de sitios de escisión de inactivación dentro del dominio de traslocación y/o el subdominio de unión Hcn pueden tolerar modificaciones situadas en cualquier sitio dentro de una región de sitios de inactivación.

Finalmente, se examinó la capacidad de una región de sitios de inactivación para tolerar la presencia de dos o más sitios de escisión de proteasa (tabla 7). Estos resultados indican que las regiones de sitios de escisión de inactivación dentro del dominio de traslocación y/o el subdominio de unión Hcn pueden tolerar modificaciones que ponen dos o más sitios de escisión de proteasas dentro de una región de sitios de inactivación.

Para determinar si una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de trombina podía ser escindida por trombina, se llevó a cabo un ensayo de escisión con trombina in vitro. Se incubaron 5 |jg de cada BoNT/A-TCS purificada, con 1 U de trombina (Novagen) a 23°C durante 1 hora, 3 horas y 18.5 horas. También se configuró un control de enzima cero en paralelo para cada BoNT/A-TCS. Se tomaron muestras en cada punto de medición y se inactivaron con SDS-tampón de carga que incluía DTT y se analizaron por SDS-PAGE como se ha descrito antes.

Los resultados del análisis de expresión se dan en la tabla 7. En general, la modificación de una región de sitios de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 467-496, 844-863 o 871-895 de la SEQ ID NO: 1 para incluir un sitio de escisión de proteasa daba como resultado una toxina que era susceptible de escisión proteolítica por la proteasa adecuada.

Para determinar si una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de trombina mantenía su potencia, se llevó a cabo un ensayo de actividad de BoNT/A usando un ensayo de actividad basado en células. Para llevar a cabo un ensayo de actividad basado en células, se cultivaron aproximadamente 1.2 x 106 células Neuro-2a o SiMa en placas de cultivo tisular de 24 pocillos que contenían 1 ml de medio exento de suero que contenía medio esencial mínimo, GLUTAMAX™ I 2 mM con sales de Earle, 1 x complemento B27, 1 x complemento N2, aminoácidos no esenciales 0.1 mM, HEPES 10 mM y GT1 b 25 jg/ml. Las células se incubaron en un incubador a 37°C en 5% de dióxido de carbono hasta que las células se diferenciaron, evaluado por criterios morfológicos rutinarios y convencionales, tales como detención del crecimiento y extensión de neurita (aproximadamente 3 días). Se aspiró el medio de cada pocillo y se sustituyó por 1) medio de nueva aportación que no contenía toxina (línea celular no tratada), o 2) medio de nueva aportación que contenía un complejo de BoNT/A 1 nM (línea celular tratada). Después de incubación durante la noche, las células se lavaron aspirando el medio y aclarando cada pocillo con 200 j l de 1 x PBS. Para recoger las células, se aspiró el 1 x PBS, las células se lisaron por adición de 50 j l de 2 x SDS-tampón de carga, el lisato se transfirió a un tubo de ensayo limpio y la muestra se calentó a 95°C durante 5 minutos.

Para detectar la presencia de los productos SNAP-25 escindidos, se analizó una parte alícuota de cada muestra recogida por transferencia Western. En este análisis, se separó una parte alícuota de 12 j l de la muestra recogida por electroforesis en gel de poliacrilamida-MOPS usando geles de poliacrilamida preformados con Bis-Tris al 12% NUPAGE® Novex (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) en condiciones reductoras desnaturalizantes. Los péptidos separados se transfirieron del gel a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) por transferencia Western usando un aparato de transferencia celular electroforética semiseca TRANS-BLOT® SD (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las membranas de PVDF se bloquearon por incubación a temperatura ambiente durante 2 horas en una solución que contenía solución salina tamponada con Tris (TBS) (2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol ácido clorhídrico 25 mM (Tris-HCl)(pH 7.4), cloruro sódico 137 mM, cloruro potásico 2.7 mM), TWEEN-20® al 0.1% (monolaurato de sorbitán polioxietilénico (20)), albúmina de suero bovino al 2% (BSA), 5% leche en polvo desnatada. Las membranas bloqueadas se incubaron a 4 °C durante la noche en TBS, TWEEN-20® al 0.1% (monolaurato de sorbitán polioxietilénico (20)), BSA al 2%, y leche en polvo desnatada al 5% que contenía 1) una dilución 1:5,000 de un anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 como anticuerpo primario (SMI-81; Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD); o 2) una dilución 1:5,000 de anticuerpo policlonal de conejo S9684 a-SNAP-25 como anticuerpo secundario (Sigma, St. Louis, MO). Tanto los anticuerpos monoclonales de ratón a-SNAP-25 como policlonales de conejo pueden detectar tanto el sustrato SNAP-25 no escindido como el producto de escisión de SNAP-25, permitiendo evaluar la expresión general de SNAP-25 en cada línea celular y el porcentaje de SNAP-25 escindido después de tratamiento de BoNT/A como un parámetro para evaluar la cantidad de BoNT/A absorbida. Las transferencias hibridadas con anticuerpo primario se lavaron tres veces durante 15 minutos cada vez en TBS, TWEEN-20® (monolaurato de sorbitán polioxietilénico (20)). Las membranas lavadas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas en TBS, TWe En -20® al 0.1% (monolaurato de sorbitán polioxietilénico (20)), BSA al 2%, y leche en polvo desnatada al 5% que contenía 1) una dilución 1:10,000 de anticuerpo policlonal de cabra anti-inmunoglobulina G de ratón, cadenas pesada y ligera (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano picante (Zymed, South San Francisco, CA) como un anticuerpo secundario; o 2) una dilución 1:10,000 de anticuerpo policlonal de cabra antiinmunoglobulina G de conejo, cadenas pesada y ligera (IgG, H+L) conjugado con peroxidasa de rábano picante (Zymed, South San Francisco, CA) como un anticuerpo secundario. Las transferencias hibridadas con anticuerpo secundario se lavaron tres veces durante 15 minutos cada vez en TBS, TWEEN-20® al 0.1% (monolaurato de sorbitán polioxietilénico (20)). La detección de señales de los productos SNAP-25 marcados se visualizaron usando un sistema de detección de transferencia Western ECL Plus™ (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se adquirieron imágenes de la membrana y el porcentaje de escisión se cuantificó con un Typhoon 9410 Variable Mode Imager y programa Imager Analysis (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La elección del tamaño de píxeles (100 a 200 píxeles) y ajustes de voltaje PMT (350 a 600, normalmente 400) dependían de la transferencia individual.

Los resultados del análisis de expresión se dan en la tabla 7. En general, la modificación de una región de sitios de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 467-496, 844-863 o 871-895 de la SEQ ID NO: 1 para incluir un sitio de escisión de proteasa dio como resultado una toxina potente que era capaz de ejecutar el proceso de intoxicación completo.

Considerados juntos, estos resultados indican que aunque se identificaron ocho regiones de escisión de inactivación diferentes, no todas podían soportar la inserción de un sitio de escisión de trombina funcional. En general, la modificación de regiones de sitios de escisión de inactivación que comprenden los aminoácidos 467-496, 844-863 y 871-895 de SEQ ID NO: 1 para incluir un sitio de escisión de proteasa dieron como resultado una toxina producida de forma estable que podía ejecutar el proceso de intoxicación completo y era sensible a la escisión proteolítica por la proteasa adecuada.

Debido a que la estructura tridimensional de todas las toxinas clostridiales es similar, las correspondientes posiciones en BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT y BuNT también son adecuadas como regiones de sitios de escisión de inactivación. La tabla 5 cita estas regiones.

Ejemplo 2

Análisis del sitio de escisión de proteasa

Este ejemplo ilustra como hacer una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación.

Para explorar si los sitios de escisión de proteasas distintas de trombina podrían ser útiles como un sitio de inactivación, se examinaron toxinas que comprendían muchos sitios de escisión de proteasa diferentes.

Para hacer una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación, se modificaron genéticamente sitios de escisión de proteasa en regiones de sitios de escisión de inactivación usando mutagénesis de multicebadores como se describe en el ejemplo 1. La tabla 8 cita construcciones de expresión modificadas para contener un sitio de escisión de proteasa.

Para determinar si una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de proteasa podía ser escindida por su proteasa cognada, se llevaron a cabo ensayos de escisión de proteasa in vitro esencialmente como se ha descrito antes, pero usando una proteasa adecuada en lugar de trombina. Se tomaron muestras en todos los tiempos de medición y se inactivaron con SDS-tampón de carga que incluía DTT, y se analizaron por SDS-PAGE como se describe en el ejemplo 1.

Los resultados del análisis de expresión se dan en la tabla 7. En general, la modificación de una región de sitios de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 467-496, 844-863 o 871-895 de la SEQ ID NO: 1 para incluir un sitio de escisión de proteasa dio como resultado una toxina que era susceptible de escisión proteolítica por la proteasa adecuada.

Para determinar si una BoNT/A que comprendía un sitio de escisión de proteasa mantenía su potencia, se llevó a cabo el ensayo de actividad basado en células descrito antes (tabla 8). En general, las toxinas que comprendían un sitio de escisión de proteasa que presentaban una CE50 de aproximadamente 20 o menos, se consideró que retenían suficiente potencia para justificar la evaluación usando un ensayo basado en animales.

Ejemplo 3

Análisis in vivo

Este ejemplo ilustra cómo evaluar una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación usando un análisis de ensayo basado en animales.

Aunque el ensayo de actividad basado en células es una buena evaluación de si una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación puede ser escindida por su proteasa cognada, se seleccionaron algunos candidatos para la evaluación en un ensayo basado en animales.

Para ensayar la actividad de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación usando un ensayo basado en animales, se llevó a cabo inicialmente un ensayo in vivo de puntuación de abducción de los dedos (DAS, por sus siglas en inglés Digit Abduction Score). Ratones CD-1 Fe se pesaron y se pusieron en subconjuntos de 10 animales para el ensayo de DAS discreto. Los ratones se incluyeron en un subconjunto particular basándose en los siguientes criterios: 1) buena salud; 2) respuesta 0 de DAS inicial fuerte; 3) inclusión en un intervalo de mediana de peso de of X ± 2 g establecido para el subconjunto seleccionado y 4) peso mayor que 17.0 g.

Se inyectó a cada ratón, usando una aguja de calibre 30 en el músculo gastrocnemio de la extremidad trasera derecha: 1) 5 |jl de BoNT/A 10.0 nM que comprende un sitio de escisión de inactivación (estudio DAS de una sola dosis); o 2) 5 j l de una de las siete dosis diferentes de BoNT/A que comprende un sitio de escisión de inactivación (0.01 nM, 0.04 nM, 0.12 nM, 0.37 nM, 1.11 nM, 3.33 nM y 10.0 nM; estudio DAS de dosis completo). Como control, se inyectaron en el músculo gastrocnemio de la extremidad trasera izquierda 5 j l de una solución que no contenía ninguna toxina. Se observó en los ratones la respuesta de DAS consecutivamente durante los primeros 4 días. Das se leyó levantando cada ratón por la cola y observando con precisión las extremidades traseras inyectadas. La abducción o no abducción de los dedos traseros puso de manifiesto el efecto de parálisis debida a la toxina de ensayo inyectada en el músculo. La abducción de los dedos de la extremidad trasera inyectada se comparó con la de la extremidad trasera no inyectada, y se puntuó en consecuencia. Los datos de DAS se analizaron calculando la dosis de DE50 basada en la puntuación de DAS media máxima y la AUC (área bajo la curva) en términos de u/Kg y/o ng/kg. Esto se llevó a cabo como sigue: 1) se calculó la puntuación media de DAS máximo para cada dosis en cada estudio; 2) cualquier dosis que provocaba más de cinco muertes en cualquier estudio se eliminó de la consideración; 3) la dosis más alta usada en un estudio individual era la dosis más baja que producía un máximo promedio de 4.0; 4) la dosis más baja usada en un estudio individual dado era la dosis más alta que producía un máximo promedio de 0; 5) se construyeron curvas para cada estudio individual de la DAS máxima frente a log(dosis); 6) se calculó un valor de AUC para cada grupo de 10 ratones de los múltiples grupos en algunos estudios; 7) se construyeron curvas para cada estudio individual de la AUC promedio frente a log(dosis); 8) se construyó una curva de respuestas repetidas x, y, para cada conjunto de estudios idénticos múltiples; para cada toxina de ensayo; 9) los datos de dosis-respuesta se analizaron por regresión no lineal (no ponderada) usando una ecuación logística de tres parámetros (Sigma Plot v 8.0; SPSS Science, Chicago, Illinois) usando la siguiente ecuación:

y = a/(1 (x/x0)b)

donde y es la respuesta, a es la ymáx asintótica, b es la pendiente, x es la dosis, y 0 es la dosis DE50. Para determinaciones de DE50 máxima, la Ymáx se fijó en 4 (lectura máxima de DAS en la escala). Se computaron los valores de DE50 medios (máximo y/o AUC) para cada estudios de ocho dosis realizado.

Los resultados indican que (tabla 9), en general, las toxinas que comprenden un sitio de escisión de inactivación que presentaba una potencia relativa de aproximadamente 10 o superior se consideró que retenían suficiente potencia para justificar la evaluación de su margen de seguridad.

Para determinar el margen de seguridad de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación, se llevó a cabo un ensayo de letalidad de ratones.

Para calcular el margen de seguridad de una toxina clostridial o toxina clostridial quimérica que comprende un sitio de escisión de inactivación, el valor de DL50 obtenido del estudio de letalidad de ratones se dividió entre el valor de CE50 obtenido de un estudio de DAS de dosis completa. Una toxina que comprende un sitio de escisión de inactivación se consideró que tenía suficiente actividad en el sitio de escisión de inactivación si presentaba un valor de margen de seguridad de aproximadamente 15 o más.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una neutotoxina botulínica, en donde la neutoxina botulínica comprende una variante de SEQ ID NO: 1, en donde dicha variantes se caracteriza por un sitio de escisión de trombina doble en SEQ ID NO: 1, concretamente un primer sitio de escisión de trombina, en donde los aminoácidos VPRGS se han insertado después del aminoácido L en la posición 881 de SEQ ID NO: 1, y el sitio de escisión consiste por tanto en SEQ ID NO: 114, y un segundo sitio de escisión de trombina en donde los aminoácidos VPRG se han insertado después de L en la posición 891 en SEQ ID NO: 1, en donde la variante tiene actividad de neurotoxina botulínica.

2. Una molécula de polinucleótido, que codifica la toxina botulínica de la reivindicación 1.

3. Método de producción de la neurotoxina botulínica de la reivindicación 1, que comprende las etapas de : a.

introducir en una célula la molécula de polinucleótido de la reivindicación 2; y b. expresar la molécula de polinucleótido, en donde la expresión de la molécula de polinucleótido produce la neurotoxina botulínica codificada.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la célula es una célula de Escherichia coli.