MX2012013381A

MX2012013381A - Toxinas de clostridium degradables.

Info

Publication number: MX2012013381A
Application number: MX2012013381A
Authority: MX
Inventors: Kei Roger Aoki; Ester Fernandez-Salas; Lance E Steward; Joseph Francis; Sanjiv Ghanshani; Marcella A Gilmore
Original assignee: Allergan Inc
Priority date: 2010-05-20
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2013-02-21
Also published as: EP3106170B1; US20160201046A1; US8697413B2; US20140227740A1; DK2650003T3; US20130196414A1; ES2596128T3; US10501731B2; US20180119126A1; HK1180592A1; WO2011146704A1; EP2571509A1; DK3106170T3; US20130288334A1; MX369263B; JP6467000B2; JP2013529213A; US9284545B2; SG10201506567UA; IL223100A0

Abstract

La presente invención describe toxinas de clostridium o quimeras de toxinas de Clostridium que comprenden un sitio de inactivación de escisión, moléculas de polinucleótidos que codifican las toxinas o quimeras, composiciones que comprenden las toxinas o quimeras, y métodos para producir las toxinas o quimeras.

Description

TOXINAS DE CLOSTRIDIUM DEGRADARLES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La capacidad de las toxinas de Clostridium, tales como, por ejemplo, neurotoxinas botulinicas (BoNT, por sus siglas en inglés), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, y neurotoxina del tétanos (TeNT, por sus siglas en inglés), para inhibir la transmisión neuronal está siendo aprovechada en una gran variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase por ejemplo, William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004) . Las toxinas de Clostridium comercialmente disponibles como composiciones farmacéuticas incluyen, preparaciones de BoNT/A, tales como, por ejemplo, BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA) , DYSPORTO/RELOXIN®, (Beaufour Ipsen, Portón Down, Inglaterra), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur) BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products, China) y XEO IN® (Merz Pharmaceuticals , GmbH., Frankfurt, Alemania); y preparaciones de BoNT/B, tales como, por ejemplo, MYOBLOC™/NEUROBLOC™ (Elan Pharmaceuticals , San Francisco, CA) . A modo de ejemplo, BOTOX® está actualmente aprobado en uno o más países para las siguientes indicaciones: acalasia, espasticidad en adultos, fisura anal, lumbalgia, blefaroespasmo, bruxismo, distonia cervical, temblor esencial, líneas en el entrecejo o líneas faciales REF: 237351 hiperquinéticas , cefalea, espasmo hemifacial, hiperactividad de la vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, lineas labiales y nasales, disfonia espasmódica, estrabismo y trastorno del nervio facial.

Un tratamiento con toxinas de Clostridium inhibe la liberación de neurotransmisores mediante la interrupción del proceso exocitótico usado para secretar los neurotransmisores en la hendidura sináptica. Existe una gran necesidad en la industria farmacéutica de expandir el uso de las terapias con toxinas de Clostridium más allá de sus aplicaciones miorrelaj antes actuales para tratar dolencias basadas en los nervios sensoriales tales como, por ejemplo, diversos tipos de dolor crónico, inflamación neurogénica y trastornos urogenitales, asi como otros trastornos, tales como, por ejemplo, pancreatitis. Actualmente se está explotando un enfoque para expandir las terapias basadas en toxina de Clostridium que implica la modificación de una toxina de Clostridium de forma tal que la toxina modificada tenga una capacidad de direccionamiento celular alterada para una célula diana de toxina que no es de Clostridium. Esta capacidad redirigida se logra mediante el remplazo de un dominio diana de origen natural de una toxina de Clostridium con un dominio diana que muestra una actividad de unión preferencial por un receptor de toxina que no es de Clostridium presente en una célula diana de toxina que no es de Clostridium. Las modificaciones a un dominio diana dan como resultado una quimera de toxina de Clostridium denominada proteina moduladora de exocitosis vesicular diana (TVEMP, por sus siglas en inglés) que es capaz de unirse selectivamente a un receptor de toxina que no es Clostridium (receptor diana) presente en una célula diana de toxina que no es de Clostridium (redirigida) . Una quimera de toxina de Clostridium con actividad de direccionamiento a una célula diana de toxina que no es de Clostridium se puede unir a un receptor presente en la célula diana de toxina que no es de Clostridium, trasladarse hacia el citoplasma y ejercer su efecto proteolitico en el complejo SNARE de la célula diana de toxina que no es de Clostridium.

Las terapias con toxinas de Clostridium y quimeras de toxinas de Clostridium se utilizan satisfactoriamente para muchas indicaciones. En general, la administración de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium se tolera bien. Sin embargo, la administración en algunas aplicaciones puede suponer un desafio debido a las mayores dosis requeridas para alcanzar un efecto beneficioso. Las dosis mayores pueden aumentar la probabilidad de que las toxinas o quimeras de toxinas de Clostridium se desplacen a través de los líquidos intersticiales y los sistemas circulatorios, tales como, por ejemplo, el sistema cardiovascular y el sistema linfático, del cuerpo, lo que da como resultado la dispersión no deseada de la toxina o quimera de toxina de Clostridium en las áreas no seleccionadas para el tratamiento. La dispersión puede conllevar efectos secundarios no deseados, tales como, por ejemplo, inhibición de la liberación de los neurotransmisores en las neuronas no seleccionadas para el tratamiento con toxinas o parálisis de un músculo no seleccionado para el tratamiento. Por ejemplo, un paciente al que se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un tratamiento con BoNT/A en los músculos del cuello para la torticolis puede desarrollar disfagia debido a la dispersión de la toxina hacia la orofaringe. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de toxinas de Clostridium y/o quimeras de toxinas de Clostridium mejoradas que sean eficaces en el sitio de tratamiento, pero que presenten efectos insignificantes a mínimos en las áreas no seleccionadas para el tratamiento con toxinas.

El creciente uso clínico, terapéutico y cosmético de las toxinas de Clostridium y quimeras de toxinas de Clostridium en las terapias que requieren dosis más grandes necesita que la industria farmacéutica desarrolle toxinas de Clostridium modificadas y quimeras de toxinas de Clostridium que sean eficaces en el sitio diana de aplicación, pero que reduzcan o prevengan los posibles efectos secundarios asociados a la dispersión de las toxinas hacia una ubicación no deseada. La presente descripción proporciona toxinas de Clostridium modificadas y quimeras de toxinas de Clostridium que reducen o previenen los efectos secundarios no deseados asociados a la dispersión de las toxinas hacia las áreas no seleccionadas. Estas ventajas y ventajas relacionadas son útiles para varias aplicaciones clínicas, terapéuticas y cosméticas, tales como, por ejemplo, el tratamiento de trastornos neuromusculares, trastornos neuropáticos , trastornos oculares, dolor, lesiones musculares, cefalea, trastornos cardiovasculares, trastornos neuropsiquiátricos , trastornos endocrinos, cánceres, trastornos del oído y líneas faciales hiperquinéticas, así como otros trastornos donde la administración de una toxina de Clostridium o quimera de toxinas de Clostridium a un mamífero puede producir un efecto beneficioso .

Las FIGS. 1A-1B muestran un esquema del paradigma actual sobre la liberación de neurotransmisores y la intoxicación por toxinas de Clostridium en una neurona central y periférica. La FIG. 1A es un esquema del mecanismo de liberación de neurotransmisores de una neurona central y periférica. El proceso de liberación se puede describir como que comprende dos pasos: 1) acoplamiento de vesícula, donde la proteína SNARE unida a la vesícula de una vesícula que contiene moléculas de neurotransmisores se asocia con las proteínas SNARE unidas a la membrana ubicadas en la membrana plasmática y 2) liberación de neurotransmisores, donde la vesícula se fusiona con la membrana plasmática y las moléculas de neurotransmisores se exocitan. La FIG. IB muestra un esquema del mecanismo de intoxicación para la actividad de toxina del tétanos y botulínica en una neurona central y periférica. Este proceso de intoxicación se puede describir como que comprende cuatro pasos: 1) unión al receptor, donde una toxina de Clostridium se une a un sistema receptor de Clostridium e inicia el proceso de intoxicación; 2) internalización del complejo, donde luego de la unión de la toxina, una vesícula que contiene el complejo de sistema de toxina/receptor se endocita en la célula; 3) traslocación de cadena ligera, donde se cree que ocurren múltiples eventos, incluyendo, por ejemplo, cambios en el pH interno de la vesícula, formación de un poro del canal que comprende el dominio HN de la cadena pesada de la toxina de Clostridium, separación de la cadena ligera de la toxina de Clostridium de la cadena pesada y liberación de la cadena ligera activa y 4) modificación de la diana enzimática, donde la cadena ligera activa de la toxina de Clostridium escinde proteolíticamente su sustrato SNARE diana, tales como, por ejemplo, SNAP-25, VAMP o Sintaxina, previniendo así el acoplamiento de la vesícula y la liberación de neurotransmisores.

La FIG. 2 muestra la organización de dominio de las toxinas de Clostridium de origen natural. La forma de cadena simple ilustra la organización lineal amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático, un dominio de traslocación y un dominio de unión. La región de bucle de cadena doble ubicada entre los dominios de traslocación y enzimáticos se representa mediante el corchete SS doble. Esta región comprende un sitio de escisión de proteasa de bucle de cadena doble endógeno que tras la escisión proteolitica con una proteasa de origen natural, tal como, por ejemplo, una proteasa de toxina de Clostridium endógena o una proteasa de origen natural producida en el ambiente, convierte la forma de cadena simple de la toxina en la forma de cadena doble. Arriba de la forma de cadena simple, se representa la región Hcc del dominio de unión a la toxina de Clostridium. Esta región comprende el dominio trefoil ß que comprende en una organización amino a carboxilo un pliegue a, una vuelta de la horquilla ß4/ß5, un pliegue ß, una vuelta de la horquilla ß8 / ß9 y un pliegue ?.

Las FIGS. 3A-3B muestran toxinas de Clostridium o quimeras de toxinas de Clostridium con un dominio de unión ubicado en el amino-terminal de la toxina. La FIG. 3A representa la forma de polipéptido de cadena simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de unión, un elemento de traslocación, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P) y un elemento terapéutico. Luego de la escisión proteolitica con una proteasa P, la forma de cadena simple de la toxina o quimera se convierte en la forma de cadena doble. La FIG. 3B representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de unión, un elemento terapéutico, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P) y un elemento de traslocación . Luego de la escisión proteolitica con una proteasa P, la forma de cadena simple de la toxina o quimera se convierte en la forma de cadena doble.

Las FIGS . 4A-4D muestra toxinas de Clostridium o quimeras de toxinas de Clostridium con un dominio de unión ubicado en el amino-terminal de la toxina. La FIG. 4A representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento terapéutico, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P), un elemento de unión y un elemento de traslocación. Luego de la escisión proteolitica con una proteasa P, la forma de cadena simple de la toxina o quimera se convierte en la forma de cadena doble. La FIG. 4B representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de traslocacion, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P), un elemento de unión y un elemento terapéutico. Luego de la escisión proteolitica con una proteasa P, la forma de cadena simple de la toxina o quimera se convierte en la forma de cadena doble. La FIG. 4C representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento terapéutico, un elemento de unión, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P) y un elemento de traslocacion. Luego de la escisión proteolitica con una proteasa P, la forma de cadena simple de la toxina o quimera se convierte en la forma de cadena doble. La FIG. 4D representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de traslocacion, un elemento de unión, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P) y elemento terapéutico. Luego de la escisión proteolitica con una proteasa P, la forma de cadena simple de la toxina o quimera se convierte en la forma de cadena doble.

Las FIGS. 5A-5B muestran toxinas de Clostridium o quimeras de toxinas de Clostridium con un dominio de unión ubicado en el amino-terminal de la toxina. La FIG. 5A representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento terapéutico, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P) , un elemento de traslocación y un elemento de unión. Luego de la escisión proteolitica con una proteasa P, la forma de cadena simple de la toxina se convierte en la forma de cadena doble. La FIG. 5B representa la forma de polipéptido simple de una toxina o quimera con una organización lineal de amino a carboxilo que comprende un elemento de traslocación, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de proteasa exógeno (P), un elemento terapéutico y un elemento de unión. Luego de la escisión proteolitica con una proteasa P, la forma de cadena simple de la toxina o quimera se convierte en la forma de cadena doble.

La presente invención describe toxinas de Clostridium modificadas y quimeras de toxinas de Clostridium que se pueden inactivar fácilmente desde una o unas ubicaciones no deseadas explotando la presencia de proteasas presentes en los líquidos intersticiales y los sistemas circulatorios, tales como, por ejemplo, el sistema cardiovascular y el sistema linfático. Esto se debe a que las toxinas de Clostridium modificadas y las quimeras de toxinas de Clostridium modificadas descritas en la presente descripción comprenden un sitio de escisión de proteasa para una proteasa presente en un liquido intersticial y/o un sistema circulatorio. La presente del sitio de escisión de proteasa deja la toxina de Clostridium modificada o quimera de toxina de Clostridium modificada susceptible a la escisión proteolitica mediante su proteasa análoqa, que inactivan las toxinas modificadas. Por ejemplo, en las situaciones en las que una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium modificada para comprender un sitio de escisión para una proteasa de matriz extracelular se ha esparcido en el liquido intersticial, esta toxina modificada o quimera de toxina de Clostridium modificada se puede escindir eficazmente mediante la proteasa de matriz extracelular análoga. Como ejemplo adicional, en las situaciones en las que una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium modificada para comprender un sitio de escisión para una proteasa de la sangre se ha esparcido en el sistema cardiovascular, esta toxina modificada o quimera de toxina de Clostridium modificada se puede escindir eficazmente mediante la proteasa de la sangre análoga. Como otro ejemplo adicional, en las situaciones en las que una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium modificada para comprender un sitio de escisión para una proteasa linfática se ha esparcido en el sistema linfático, esta toxina modificada o quimera de toxina de Clostridium modificada se puede escindir eficazmente mediante la proteasa linfática análoga. Por lo tanto, utilizar una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende uno o más sitios de escisión para las proteasas presentes en el liquido intersticial y/o sistema circulatorio disminuirá o suprimirá la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de una ubicación no deseada, reduciendo o previniendo asi los efectos secundarios no deseados asociados con el esparcimiento de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium hacia una ubicación no deseada.

Por lo tanto, los aspectos de la presente descripción proporcionan una toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación o en el subdominio de unión a HCN. Las toxinas descritas pueden comprender un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina de Clostridium, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógeno y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación. Los ejemplos no taxativos de sitios de escisión de inactivación incluyen sitios de escisión de trombina, sitios de escisión de plasrnina, sitios de escisión del factor de coagulación Vlla, sitios de escisión del factor de coagulación IXa, sitios de escisión del factor de coagulación Xa, sitios de escisión del factor de coagulación Xla, sitios de escisión del factor de coagulación Xlla, sitios de escisión de calicreina plasmática, sitios de escisión del receptor activada por proteasa acoplado a proteínas G 1 (PARI, por sus siglas en inglés), sitios de escisión de PAR 2, sitios de escisión de PAR 3, sitios de escisión de PAR 4, sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 2 (M P-2), sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9) , sitios de escisión de furina, sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo urocinasa (uPA, por sus siglas en inglés) , sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo tejido (tPA, por sus siglas en inglés), sitios de escisión de triptasa-e, sitios de escisión de proteasa de mastocitos de ratón (mMCP-7), sitios de escisión de enzima convertidora de endotelina 1 (ECE-1), sitios de escisión del grupo sanguíneo Kell, sitios de escisión de DPPIV, sitios de escisión de metalopeptidasa ADAM con trombospondina tipo 1, motivo 13 (ADA TS13) y sitios de escisión de Catepsina L. La adición del sitio de escisión de inactivación aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o una similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional.

Otros aspectos de la presente descripción proporcionan una quimera de toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación o en el subdominio de unión a HCN. Las toxinas descritas pueden comprender un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, una región de bucle de cadena doble que comprende un sitio de escisión de la proteasa exógeno y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación. Los ejemplos no taxativos de sitios de escisión de inactivación incluyen sitios de escisión de trombina, sitios de escisión de plasmina, sitios de escisión del factor de coagulación Vlla, sitios de escisión del factor de coagulación IXa, sitios de escisión del factor de coagulación Xa, sitios de escisión del factor de coagulación Xla, sitios de escisión del factor de coagulación Xlla, sitios de escisión de calicreina plasmática, sitios de escisión del receptor activada por proteasa acoplado a proteínas G 1 (PARI), sitios de escisión de PAR 2, sitios de escisión de PAR 3, sitios de escisión de PAR 4, sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2), sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 9 ( MP-9) , sitios de escisión de furina, sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo urocinasa (uPA) , sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo tejido (tPA) , sitios de escisión de triptasa-e, sitios de escisión de proteasa de mastocitos de ratón (mMCP-7), sitios de escisión de enzima convertidora de endotelina 1 (ECE-1), sitios de escisión del grupo sanguíneo Kell, sitios de escisión de DPPIV, sitios de escisión de metalopeptidasa ADAM con trombospondina tipo 1, motivo 13 (ADAMTS13) y sitios de escisión de Catepsina L. La adición del sitio de escisión de inactivación aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o una similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional.

Otros aspectos de la presente descripción proporcionan moléculas de polinucleótido que codifican una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. Una molécula de polinucleótido que codifica la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium puede comprender adicionalmente un vector de expresión.

Otros aspectos de la presente descripción proporcionan una composición que comprende una toxina de Clostridium o una quimera de la toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. Una composición que comprende la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium puede ser una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender, además de una toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción, un portador farmacéutico, un componente farmacéutico o ambos.

Otros aspectos de la presente descripción proporcionan un método para producir una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción, el método comprende el paso de expresar en una célula una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción, donde la expresión de la molécula de polinucleótido produce la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium codificada. En otros aspectos, el método comprende los pasos de introducir en una célula una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción y expresar la molécula de polinucleótido, donde la expresión de la molécula de polinucleótido produce la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium codificada.

Las toxinas de Clostridium producidas por Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium baratii y Clostridium butyricum son las más usadas en los tratamientos terapéuticos y cosméticos de humanos y otros mamíferos. Las cepas de C. botulinum producen siete tipos distintos desde el punto de vista de los antigenos de toxinas botulínicas (BoNT) que han sido identificados mediante la investigación de los brotes de botulismo en sujetos masculinos (BoNT/A, /B, /E y /F) , animales (BoNT/Cl y /D) , o aislados del suelo (BoNT/G) . Las BoNT poseen aproximadamente 35 % de identidad de aminoácidos entre sí y comparten la misma organización de dominio funcional y arquitectura de estructura global. Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada tipo de toxina de Clostridium puede haber subtipos que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, actualmente hay cinco subtipos de BoNT/A, BoNT/Al, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos específicos que muestran alrededor de 84 % a 93 % de identidad de aminoácidos en comparación con el subtipo BoNT/A de la SEQ ID NO: 1. Como ejemplo adicional, actualmente hay cinco subtipos de BoNT/B, BoNT/Bl, BONT/B2, BoNT/B3 , BoNT/Bnp y BoNT/Bbv, con subtipos específicos que muestran alrededor de 93 % a 96 % de identidad de aminoácidos en comparación con el subtipo BoNT/B de la SEQ ID NO: 6. Como otro ejemplo adicional, actualmente hay tres subtipos de BoNT/E, BoNT/El, BoNT/E2 y BoNT/E3 , con subtipos específicos que muestran alrededor de 95 % a 99 % de identidad de aminoácidos en comparación con el subtipo BoNT/E de la SEQ ID NO: 15. Mientras que los siete serotipos de BoNT tienen estructuras y propiedades farmacológicas similares, cada uno también muestra características bacteriológicas heterogéneas. Por el contrario, la toxina del tétanos (TeNT, por sus siglas en inglés) se produce por un grupo uniforme de C. tetani. Otras dos especies de Clostridium, C. baratii y C. butyricum, producen toxinas, BaNT y BuNT, que son similares a BoNT/F y BoNT/E, respectivamente.

Cada una de las toxinas de Clostridium se traducen como un polipéptido de cadena simple de aproximadamente 150 kDa que se escinde posteriormente mediante corte proteolítico dentro de un bucle disulfuro mediante una proteasa de origen natural (FIGS. 1A-1B) . Esta escisión ocurre dentro de la región específica de bucle de cadena doble creada entre dos residuos de cisteína que forman un puente disulfuro. Este procesamiento post traduccional proporciona una molécula de cadena doble que comprende una cadena ligera (LC, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 100 kDa unidas por un solo enlace de disulfuro e interacciones no covalentes entre las dos cadenas. La proteasa de origen natural utilizada para convertir la molécula de cadena simple en la cadena doble actualmente no se conoce. En algunos serotipos, tales como, por ejemplo, BoNT/A, la proteasa de origen natural se produce de forma endógena mediante el serotipo bacteriano y la escisión ocurre dentro de la célula antes de que se libere la toxina en el ambiente. Sin embargo, en otros serotipos, tales como, por ejemplo, BoNT/E, la cepa bacteriana parece que no produce una proteasa endógena que puede convertir la forma de cadena simple de la toxina en la forma de cadena doble. En estas situaciones, la toxina se libera desde la célula como una toxina de cadena simple que se convierte posteriormente en la forma de cadena doble mediante una proteasa de origen natural que se encuentra en el ambiente.

Cada molécula madura de cadena doble comprende tres dominios funcionalmente diferentes: 1) un dominio enzimático ubicado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad de endopeptidasa dependiente de zinc que se dirige específicamente a los componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores ; 2) un dominio de traslocación contenido dentro de la mitad del amino-terminal de la HC (HN) que facilita la liberación de la LC desde vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana y 3) un dominio de unión encontrado dentro de la mitad del extremo carboxil de la HC (Hc) que determina la actividad de unión y la especificidad de unión a la toxina al complejo de receptor ubicado en la superficie de la célula diana. D. B. Lacy y R. C. Stevens, Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, J. Mol. Biol. 291: 1091-1104 (1999) . El dominio Hc comprende dos características estructurales distintas de tamaño aproximadamente igual, separado por una hélice a, designó los subdominios HCN y HCc-La Tabla 1 proporciona regiones límite aproximadas para cada dominio y subdominio encontrado en los ejemplos de toxinas de Clostridium.

Tanto la unión, como la traslocación y la actividad enzimática de estos tres dominios funcionales son necesarios para la toxicidad. Mientras que todos los detalles de este proceso no se conocen aún con exactitud, el mecanismo de intoxicación celular global por el cual las toxinas Clostridium ingresan en una neurona e inhiben la liberación de neurotransmisores es similar, sin importar el serotipo o el subtipo. Pese a que los solicitantes no desean verse limitados por la siguiente descripción, el mecanismo de intoxicación se puede describir como que comprende al menos cuatro pasos: 1) unión al receptor, 2) internalización de complejo, 3) traslocación de cadena ligera y 4) modificación de diana enzimática (FIGS. 3A-3B) . El proceso se inicia cuando el dominio Hc de una toxina de Clostridium se une a un sistema de receptor especifico para las toxinas ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se cree que se logra la especificidad de unión de un complejo receptor, en parte, mediante combinaciones especificas de gangliósidos y receptores de proteina que parecen comprender claramente cada complejo de receptor de toxina de Clostridium. Una vez unidos, los complejos de toxina/receptor se internalizan mediante endocitosis y las vesículas internalizadas se clasifican en vías intracelulares específicas. La etapa de traslocación parece estar desencadenada por la acidificación del compartimiento de vesícula. Este proceso parece iniciar dos rearreglos estructurales importantes dependientes del pH que aumentan la hidrofobicidad y promueven la formación de la forma de cadena doble de la toxina. Una vez activada, la endopeptidasa de cadena ligera de la toxina se libera de la vesícula intracelular al citosil donde parece que se dirige específicamente a uno de los tres componentes centrales conocidos del aparato de liberación de neurotransmisores . Estas proteínas centrales, proteínas de membrana asociadas con la vesícula (VA P, por sus siglas en inglés) /sinaptobrevina, proteína asociada de forma sinaptosomal de 25 kDa (SNAP-25) y Sintaxina son necesarias para el acoplamiento y fusión sináptica de vesícula en el extremo del nervio y constituyen miembros de la familia del receptor de proteína de unión al factor sensible a N-etilmaleimida soluble (SNARE, por sus siglas en inglés) . BoNT/A y BoNT/E escinden la SNAP-25 en la región carboxilo, liberando un segmento de nueve o veintiséis aminoácidos, respectivamente y BoNT/Cl también escinde la SNAP25 cerca del carboxi-terminal . Los serotipos botulinicos BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G y la toxina del tétanos actúan en la porción central conservada de VAMP y liberan la porción amino de VAMP en el citosol. La BoNT/Cl escinde la sintaxina en un único sitio cerca de la superficie de membrana citosólica. La proteólisis selectiva de SNARE sinápticos explica el bloqueo de la liberación de neurotransmisores causado por las toxinas de Clostridium in vivo. Las dianas de la proteina SNARE de las toxinas de Clostridium son comunes para la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la actividad de peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis, véase, por ejemplo, Yann Humeau et ál., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Reléase, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et ál., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et ál., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).

Las estructuras cristales tridimensionales de BoNT/A, BoNT/B y el dominio Hc de TeNT indican que los tres dominios 2 funcionales de las neurotoxinas de Clostridium son dominios estructuralmente distintos compartidos por todas las toxinas de Clostridium. El motivo HEXXH de consenso de la cadena ligera forma el sitio de unión tetraédrico de zinc del sitio catalítico ubicado en una hendidura profunda sobre la superficie de la proteina que se puede acceder mediante un canal. La estructura de los dominios HN y Hc consisten principalmente en topologías de hojas que se unen mediante una única hélice a. El dominio HN de forma cilindrica comprende dos hélices o¡ anfipáticas largas que se asemejan al motivo de superhélice que se encuentra en algunas proteínas virales. El dominio HN también forma un bucle largo sin estructura denominado "cinta de traslocación" , que se envuelve alrededor de una hendidura grande con carga negativa de la cadena ligera que bloquea el acceso del átomo de zinc al sitio de unión catalítico del sitio activo. El dominio Hc comprende dos características estructurales distintas de tamaño aproximadamente igual que indican la función. El primero, designado dominio HCN/ está ubicado en la mitad amino del dominio Hc. El dominio HCN forma un pliegue barril ß, tipo remolino. El dominio HCc es el segundo dominio que comprende el dominio Hc. Este dominio del carboxi-terminal comprende un dominio trefoil ß que forma tres regiones de unión al carbohidrato distintas que se asemejan al resto de unión al carbohidrato que se encuentra en muchas proteínas de unión a azúcares, tales como, por ejemplo, P amiloide en suero, sialidasa, cryia, d-endotoxina insecticida y lectinas. Los estudios bioquímicos indican que la estructura del dominio de trefoil ß del dominio Hcc parece mediar la unión con los componentes específicos que contienen carbohidratos del receptor de la toxina de Clostridium sobre la superficie celular, ver, por ejemplo, Krzysztof Ginalski et ál., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site, 482(1-2) FEBS Lett . 119-124 (2000). El dominio Hc se aleja del dominio HN que expone los bucles de la superficie y los hace accesibles para la unión. No ocurren contactos entre la cadena ligera y el dominio Hc.

Los aspectos de la presente descripción proporcionan, parcialmente, una toxina de Clostridium. Tal como se usa en la presente, el término "toxina de Clostridium" se refiere a cualquier neurotoxina producida por una cepa de toxina de Clostridium que puede ejecutar el mecanismo celular total por el cual una toxina de Clostridium intoxica una célula y abarca la unión de una toxina de Clostridium con un complejo receptor de alta o baja afinidad, la internalización del complejo de toxina/receptor, la traslocación de la cadena ligera de la toxina de Clostridium en el citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de la toxina de Clostridium. Una toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium y un dominio de unión a la toxina de Clostridium. Los ejemplos de toxinas de Clostridium incluyen las producidas por una Clostridium botulinum, una Clostridium tetani, una Clostridium baratii y una Clostridium butyricum .

Una toxina de Clostridium incluye, de modo no taxativo, variantes de la toxina de Clostridium de origen natural, tales como, por ejemplo, isoformas de la toxina de Clostridium y subtipos de la toxina de Clostridium; variantes de la toxina de Clostridium de origen no natural, tales como, por ejemplo, variantes de la toxina de Clostridium conservadoras, variantes de la toxina de Clostridium no conservadoras y fragmentos activos de la toxina de Clostridium de estos o cualquier combinación de estos. Tal como se usa en la presente, el término "variante de la toxina de Clostridium", ya sea de origen natural o no, se refiere a una toxina de Clostridium que tiene al menos un cambio de aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia descritas (Tabla 1) y se puede describir como porcentaje en la identidad de la región correspondiente de la secuencia de referencia. Como ejemplos no taxativos, una variante de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 1; una variante de BoNT/B de la SEQ ID NO: 6 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 6; una variante de BoNT/Cl de la SEQ ID NO: 11 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 11; una variante de BoNT/D de la SEQ ID NO: 13 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 13; una variante de BoNT/E de la SEQ ID NO: 15 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 15; una variante de BoNT/F de la SEQ ID NO: 18 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 18; una variante de BoNT/G de la SEQ ID NO: 21 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 21; una variante de TeNT de la SEQ ID NO: 22 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 22; una variante de BaNT de la SEQ ID NO: 23 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 23; una variante de BuNT de la SEQ ID NO: 24 tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, en comparación con la o las posiciones correspondientes de la SEQ ID NO: 2 .

Tal como se usa en la presente, el término "variante de la toxina de Clostridium de origen natural" se refiere cualquier toxina de Clostridium producida sin la ayuda de ninguna manipulación humana, incluyendo, de modo no taxativo, isoformas de la toxina de Clostridium producidas a partir de transcripciones alternativamente empalmadas, isoformas de la toxina de Clostridium producidas por mutación espontánea y subtipos de la toxina de Clostridium. Los ejemplos no taxativos de una isoforma de la toxina de Clostridium incluyen, por ejemplo, isoformas de BoNT/A, isoformas de BoNT/B, isoformas de BoNT/Cl, isoformas de BoNT/D, isoformas de BoNT/E, isoformas de BoNT/F, isoformas de BoNT/G, isoformas de TeNT, isoformas de BaNT e isoformas de BuNT . Los ejemplos no taxativos de un subtipo de la toxina de Clostridium incluyen, por ejemplo, subtipos de BoNT/A BoNT/Al, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5 ; subtipos de BoNT/B BoNT/Bl, BoNT/B2 , BoNT/B3 , BoNT/B bivalente y BoNT/B no proteolitico; subtipos de BoNT/Cl BoNT/Cl-1 y BoNT/Cl-2; subtipos de BoNT/E BoNT/El, BoNT/E2 y BoNT/E3; subtipos de BoNT/F BoNT/Fl, BoNT/F2 y BoNT/F3; y subtipos de BuNT, BuNT-1 y BuNT-2. Otros ejemplos no taxativos de un subtipo de la toxina de Clostridium incluyen, por ejemplo, subtipos de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; subtipos de BoNT/B de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10; subtipos de BoNT/Cl de la SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12; subtipos de BoNT/E de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 17; subtipos de BoNT/F de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20; y los subtipos de BuNT de la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25.

Tal como se usa en la presente, el término "variante de la toxina de Clostridium de origen no natural" se refiere a cualquier toxina de Clostridium producida con la ayuda de manipulación humana, incluyendo, de modo no taxativo, toxinas de Clostridium producidas mediante modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y toxinas de Clostridium producidas mediante síntesis química. Los ejemplos no taxativos de variantes de la toxina de Clostridium de origen no natural incluyen, por ejemplo, variantes de la toxina de Clostridium conservadoras, variantes de la toxina de Clostridium no conservadoras y fragmentos activos de la toxina de Clostridium.

Tal como se usa en la presente, el término "variante de la toxina de Clostridium conservadora" se refiere a una toxina de Clostridium que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de la toxina de Clostridium de referencia (Tabla 1) . Los ejemplos de propiedades incluyen, de modo no taxativo, similar tamaño, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de unión a hidrógeno, una propiedad fisicoquímica o similares o cualquier combinación de estos. Una variante de la toxina de Clostridium conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la variante de la toxina de Clostridium conservadora, y puede sustituir a la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Una variante de la toxina de Clostridium conservadora puede sustituir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 o 500 o más aminoácidos de la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la variante de la toxina de Clostridium conservadora. Una variante de la toxina de Clostridium conservadora también puede sustituir al menos 5, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos contiguos de la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la variante de la toxina de Clostridium conservadora. Los ejemplos no taxativos de una variante de la toxina de Clostridium conservadora incluyen, por ejemplo, variantes de BoNT/A conservadoras, variantes de BoNT/B conservadoras, variantes de BoNT/Cl conservadoras, variantes de BoNT/D conservadoras, variantes de BoNT/E conservadoras, variantes de BoNT/F conservadoras, variantes de BoNT/G conservadoras, variantes de TeNT conservadoras, variantes de BaNT conservadoras y variantes de BuNT conservadoras .

Tal como se usa en la presente, el término "variante de la toxina de Clostridium no conservadora" se refiere a una toxina de Clostridium donde 1) se suprime al menos un aminoácido de la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la variante de la toxina de Clostridium no conservador; 2) se agrega al menos un aminoácido a la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la toxina de Clostridium no conservadora; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de la toxina de Clostridium de referencia (Tabla 1) . Una variante de la toxina de Clostridium no conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la variante de la toxina de Clostridium no conservadora, y puede sustituir a la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Una variante de la toxina de Clostridium no conservadora puede suprimir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos de la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la variante de la toxina de Clostridium no conservadora. Una variante de la toxina de Clostridium no conservadora puede agregar uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos a la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la variante de la toxina de Clostridium no conservadora. Una variante de la toxina de Clostridium no conservadora puede sustituir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 o 500 o más aminoácidos de la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la variante de la toxina de Clostridium no conservadora. Una variante de la toxina de Clostridium no conservadora también puede sustituir al menos 5, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos contiguos de la toxina de Clostridium de referencia en la cual se basa la variante de la toxina de Clostridium no conservadora. Los ejemplos no taxativos de una variante de la toxina de Clostridium no conservadora incluyen, por ejemplo, variantes de BoNT/A no conservadoras, variantes de BoNT/B no conservadoras, variantes de BoNT/Cl no conservadoras, variantes de BoNT/D no conservadoras, variantes de BoNT/E no conservadoras, variantes de BoNT/F no conservadoras, variantes de BoNT/G no conservadoras, variantes de TeNT no conservadoras, variantes de BaNT no conservadoras y variantes de BuNT no conservadoras.

También se prevé que cualquiera de varios fragmentos de la toxina de Clostridium puede ser útil en los aspectos de la presente descripción con la condición de que estos fragmentos activos puedan ejecutar el mecanismo celular total mediante el cual una toxina de Clostridium escinde proteoliticamente un sustrato. Por lo tanto, los aspectos de la presente modalidad pueden incluir fragmentos de la toxina de Clostridium con una longitud de, por ejemplo, al menos 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o al menos 1200 aminoácidos. Otros aspectos de la presente modalidad pueden incluir fragmentos de la toxina de Clostridium con una longitud de, por ejemplo, como máximo 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o como máximo 1200 aminoácidos.

También se prevé que cualquiera de varios fragmentos de la toxina de Clostridium que comprenden la cadena ligera pueden ser útiles en los aspectos de la presente descripción, con la condición de que estos fragmentos de la cadena ligera puedan dirigirse específicamente a los componentes principales del aparato de liberación de neurotransmisores y participar así en la ejecución del mecanismo celular total mediante el cual una toxina de Clostridium escinde proteolíticamente un sustrato. Las cadenas ligeras de las toxinas de Clostridium tienen aproximadamente 420-460 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio enzimático de la toxina de Clostridium (Tabla 1) . Las investigaciones han demostrado que la longitud total de una cadena ligera de la toxina de Clostridium no es necesaria para la actividad enzimática del dominio enzimático de la toxina de Clostridium. Como ejemplo no taxativo, los primeros ocho aminoácidos de una cadena ligera de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no taxativo, los primeros ocho aminoácidos de la cadena ligera de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Asimismo, el carboxi-terminal de la cadena ligera no es necesario para la actividad. Como ejemplo no taxativo, los últimos 32 aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no taxativo, ios últimos 31 aminoácidos de la cadena ligera de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática . Por lo tanto, los aspectos de la presente modalidad incluyen una cadena ligera de la toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium con una longitud de, por ejemplo, al menos 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos. Otros aspectos de la presente modalidad incluyen una cadena ligera de la toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium con una longitud de, por ejemplo, como máximo 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos.

También se prevé que cualquiera de varias regiones HN de la toxina de Clostridium que comprenden un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium pueden ser útiles en aspectos de la presente descripción, con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de la LC desde vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana y participar así en la ejecución del mecanismo celular total mediante el cual una toxina de Clostridium escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones HN de las cadenas pesadas de las toxinas de Clostridium tienen aproximadamente 410-430 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium (Tabla 1) . Las investigaciones han demostrado que la longitud completa de una región HN de la cadena pesada de una toxina de Clostridium no es necesaria para la actividad de traslocación del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium. Por lo tanto, los aspectos de la presente modalidad pueden incluir regiones HN de la toxina de Clostridium que comprenden un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium con una longitud de, por ejemplo, al menos 350, 375, 400, o 425 aminoácidos. Otros aspectos de la presente modalidad pueden incluir regiones HN de la toxina de Clostridium que comprenden un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium con una longitud de, por ejemplo, como máximo 350, 375, 400 o 425 aminoácidos.

También se prevé que cualquiera de varias regiones Hc de la toxina de Clostridium que comprenden un dominio de unión a la toxina de Clostridium pueden ser útiles en los aspectos de la presente descripción, con la condición de que estos fragmentos activos puedan determinar la actividad de unión y la especificidad de unión a la toxina al complejo receptor ubicado en la superficie de la célula diana y facilitar el mecanismo celular total mediante el cual una toxina de Clostridium escinde proteoliticamente un sustrato. Las regiones Hc de las cadenas pesadas de las toxinas de Clostridium tienen aproximadamente 400-440 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de unión (Tabla 1) . Las investigaciones han demostrado que la longitud completa de una región Hc de una cadena pesada de una toxina de Clostridium no es necesaria para la actividad de unión del dominio de unión a la toxina de Clostridium. Por lo tanto, los aspectos de la presente modalidad pueden incluir regiones Hc de la toxina de Clostridium que comprenden un dominio de unión con una longitud de, por ejemplo, al menos 350, 375, 400 o 425 aminoácidos. Otros aspectos de la presente modalidad pueden incluir regiones Hc de la toxina de Clostridium que comprenden un dominio de unión con una longitud de, por ejemplo, como máximo 350, 375, 400 o 425 aminoácidos .

Cualquiera de varios métodos de alineación de secuencia se pueden usar para determinar el porcentaje de identidad incluyendo, de modo no taxativo, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, por ejemplo, métodos de enfoque de segmento. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procesos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente .

Los métodos globales alinean secuencias desde el comienzo hasta el final de la molécula y determinan la mejor alineación mediante la adición de puntuaciones de pares de residuo individuales e imponiendo penalizaciones de brecha. Los métodos no taxativos incluyen, por ejemplo, CLUSTAL W, véase, por ejemplo, Julie D. Thompson et ál., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Múltiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994) ; and iterative refinement, véase, por ejemplo, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Múltiple Protein Sequence Alignments by Itera ti e Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments , 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996).

Los métodos locales alinean secuencias mediante la identificación de uno o más motivos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Los métodos no taxativos incluyen, por ejemplo, Match-box, véase, por ejemplo, Eric Depiereux y Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); Gibbs sampling, véase, por ejemplo, C. E. Lawrence et ál., Detecting Subtle Sequence Signáis: A Gibbs Sampling Strategy for Múltiple Alignment , 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, véase, por ejemplo, Ivo Van Walle et ál., Align-M - A New Algorithm for Múltiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics, : 1428-1435 (2004) .

Los métodos híbridos combinan aspectos funcionales de métodos de alineación tanto globales como locales. Los métodos no taxativos incluyen, por ejemplo, comparación entre segmentos, véase, por ejemplo, Burkhard Morgenstern et ál., Múltiple DNA and Protein Sequence Alignment Based On Segment-To-Segment Comparison, 93(22) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 12098-12103 (1996); T-Coffee, véase, por ejemplo, Cedric Notredame et ál., T-Coffee: A Novel Algorithm for Múltiple Sequence Alignment, 302(1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000); MUSCLE, véase, por ejemplo, Robert C. Edgar, MUSCLE: Múltiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004); and DIALIGN-T, véase, por ejemplo, Amarendran R Subramanian et ál., DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Múltiple Sequence Alignment, 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005) .

La presente invención describe varias variantes de polipéptidos donde un aminoácido se sustituye por otro, tales como, por ejemplo, variantes de la toxina de Clostridium, variantes del dominio enzimático de la toxina de Clostridium, variantes del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, variantes del dominio de unión a la toxina de Clostridium, variantes del dominio de unión a la toxina que-no es de Clostridium y variantes del sitio de escisión de la proteasa. Se puede evaluar una sustitución mediante varios factores, tales como, por ejemplo, las propiedades físicas del aminoácido que se está sustituyendo (Tabla 2) o cómo podría tolerar una sustitución el aminoácido original (Tabla 3) . La elección de qué aminoácido se puede sustituir por otro aminoácido en un polipéptido es conocida por un experto en la técnica.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium y un dominio de unión a la toxina de Clostridium. En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium comprende una variante de la toxina de Clostridium de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de la toxina de Clostridium o un subtipo de la toxina de Clostridium. En otro aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium comprende una variante de la toxina de Clostridium de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de la toxina de Clostridium conservadora, una variante de la toxina de Clostridium no conservadora, un fragmento activo de la toxina de Clostridium o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium o un fragmento activo de este, un dominio de unión a la toxina de Clostridium o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En otros aspectos de la presente modalidad, una toxina de Clostridium puede comprender una BoNT/A, una BoNT/B, una BoNT/Cl, una BoNT/D, una BoNT/E, una BoNT/F, una BoNT/G, una TeNT, una BaNT o una BuNT.

En otra modalidad, un aminoácido hidrofóbico en una posición particular en la cadena polipeptidica de la toxina de Clostridium se puede sustituir con otro aminoácido hidrofóbico. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos incluyen, por ejemplo, C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena polipeptidica de la toxina de Clostridium se puede sustituir con otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, por ejemplo, A, I, L, P y V. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena polipeptidica de la toxina de Clostridium se puede sustituir con otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido acumulado en una posición particular en la cadena polipeptidica de la toxina de Clostridium se puede sustituir con otro aminoácido acumulado. Los ejemplos de aminoácidos acumulados incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena polipeptidica de la toxina de Clostridium se puede sustituir con otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, por ejemplo, D, E, K, N, Q y R. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena polipeptidica de la toxina de Clostridium se puede sustituir con otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, por ejemplo, A, H, G, P, S, T e Y. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir con otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, por ejemplo, K, R y H. En aun otro aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena polipeptidica de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, por ejemplo, D y E. En otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena polipeptidica de la toxina de Clostridium se puede sustituir con otro aminoácido pequeño. Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, por ejemplo, A, D, G, N, P, S y T. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido ramificado C-beta en una posición particular en la cadena polipeptidica de la toxina de Clostridium se. puede sustituir con otro aminoácido ramificado C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados C-beta incluyen, por ejemplo, I, T y V.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una BoNT/A. En un aspecto de la presente modalidad, una BoNT/A comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/A y un dominio de unión de BoNT/A. En otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/A comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/A comprende una variante de BoNT/A de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/A o un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/A comprende una variante de BoNT/A de origen natural de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/A o un subtipo de BoNT/A. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/A comprende una variante de BoNT/A de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/A conservadora, una variante de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo de BoNT/A o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/A comprende una variante de BoNT/A de origen no natural de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/A conservadora, una variante de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo de BoNT/A o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/A comprende un dominio enzimático de BONT/A o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BONT/A o un fragmento activo de este, un dominio de unión a BONT/A o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/A comprende un dominio enzimático de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, o un fragmento activo de este, un dominio de unión a BoNT/A de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de este.

En otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una BoNT/B. En un aspecto de la presente modalidad, una BoNT/B comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de traslocación de BoNT/B y un dominio de unión de BoNT/B. En otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/B comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/B comprende una variante de BoNT/B de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/B o un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/B comprende una variante de BoNT/B de origen natural de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/B o un subtipo de BoNT/B. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/B comprende una variante de BoNT/B de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/B conservadora, una variante de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo de BoNT/B o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/B comprende una variante de BoNT/B de origen no natural de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/B conservadora, una variante de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo de BoNT/B o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/B comprende un dominio enzimático de BONT/B o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BONT/B o un fragmento activo de este, un dominio de unión a BONT/B o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/B comprende un dominio enzimático de BoNT/B de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BoNT/B de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BoNT/B de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 102; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, '200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una BoNT/Cl. En un aspecto de la presente modalidad, una BoNT/Cl comprende un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio de traslocación de BoNT/Cl y un dominio de unión de BoNT/Cl. En otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/C1 comprende la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/Cl comprende una variante de BoNT/Cl de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/Cl o un subtipo de BoNT/Cl. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/Cl comprende una variante de BoNT/Cl de origen natural de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/Cl o un subtipo de BoNT/Cl. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/C1 comprende una variante de BoNT/Cl de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/Cl conservadora, una variante de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo de BoNT/Cl o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/Cl comprende una variante de BoNT/Cl de origen no natural de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/Cl conservadora, una variante de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo de BoNT/Cl o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una B0NT/C1 comprende un dominio enzimático de B0NT/C1 o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de B0NT/C1 o un fragmento activo de este, un dominio de unión a B0NT/C1, un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/Cl comprende un dominio enzimático de BoNT/Cl de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BoNT/Cl de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BoNT/Cl de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; como máximo 1, 1,2, 3,4, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 3; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una BoNT/D. En un aspecto de la presente modalidad, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de traslocación de BoNT/D y un dominio de unión de BoNT/D. En otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/D comprende la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/D comprende una variante de BoNT/D de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/D o un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/D comprende una variante de BoNT/D de origen natural de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/D o un subtipo de BoNT/D. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/D comprende una variante de BoNT/D de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/D conservadora, una variante de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo de BoNT/D o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/D comprende una variante de BoNT/D de origen no natural de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/D conservadora, una variante de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo de BoNT/D o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/D comprende un dominio enzimático de BONT/D o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BONT/D o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BONT/D o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BoNT/D de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BoNT/D de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de este.

En otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una BoNT/E. En un aspecto de la presente modalidad, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/E y un dominio de unión de BoNT/E. En otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/E comprende la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/E comprende una variante de BoNT/E de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/E o un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/E comprende una variante de BoNT/E de origen natural de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/E o un subtipo de BoNT/E. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/E comprende una variante de BoNT/E de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/E conservadora, una variante de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo de BoNT/E o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/E comprende una variante de BoNT/E de origen no natural de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/E conservadora, una variante de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo de BoNT/E o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/E comprende un dominio enzimático de BONT/E o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BONT/E o un fragmento activo de este, un dominio de unión a BONT/E o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, o la SEQ ID NO: 17, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BoNT/E de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BoNT/E de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una BoNT/F. En un aspecto de la presente modalidad, una BoNT/F comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/F y un dominio de unión de BoNT/F. En otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/F comprende la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/F comprende una variante de BoNT/F de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/F o un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/F comprende una variante de BoNT/F de origen natural de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/F o un subtipo de BoNT/F. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/F comprende una variante de BoNT/F de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/F conservadora, una variante de BpNT/F no conservadora, un fragmento activo de BoNT/F o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/F comprende una variante de BoNT/F de origen no natural de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/F conservadora, una variante de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo de BoNT/F o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/F comprende un dominio enzimático de BONT/F o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BONT/F o un fragmento activo de este, un dominio de unión a BONT/F o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/F comprende un dominio enzimático de BoNT/F de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BoNT/F de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BoNT/F de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una BoNT/G. En un aspecto de la presente modalidad, una BoNT/G comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de traslocación de BoNT/G y un dominio de unión de BoNT/G. En otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/G comprende la SEQ ID NO: 21. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/G comprende una variante de BoNT/G de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/G o un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/G comprende una variante de BoNT/G de origen natural de la SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, una isoforma de BoNT/G o un subtipo de BoNT/G de la SEQ ID NO: 21. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/G comprende una variante de BoNT/G de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/G conservadora, una variante de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo de BoNT/G o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/D comprende una variante de BoNT/G de origen no natural de la SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, una variante de BoNT/G conservadora, una variante de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo de BoNT/G o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BONT/G comprende un dominio enzimático de BONT/G o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BONT/G o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BONT/G o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BoNT/G comprende un dominio enzimático de BoNT/G de la SEQ ID NO: 21, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BoNT/G de la SEQ ID NO: 21, o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BoNT/G de la SEQ ID NO: 21, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de este.

En otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 21; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a la SEQ ID NO: 21; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 21; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 21.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una TeNT. En un aspecto de la presente modalidad, una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT, un dominio de traslocación de TeNT y un dominio de unión de TeNT. En un aspecto de la presente modalidad, una TeNT comprende la SEQ ID NO: 22. En otro aspecto de la presente modalidad, una TeNT comprende una variante de TeNT de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de TeNT o un subtipo de TeNT. En otro aspecto de la presente modalidad, una TeNT comprende una variante de TeNT de origen natural de la SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, una isoforma de TeNT o un subtipo de TeNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una TeNT comprende una variante de TeNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de TeNT conservadora, una variante de TeNT no conservadora, un fragmento activo de TeNT o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una TeNT comprende una variante de TeNT de origen no natural de la SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, una variante de TeNT conservadora, una variante de TeNT no conservadora, un fragmento activo de TeNT o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de TeNT o un fragmento activo de este, un dominio de unión de TeNT o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT de la SEQ ID NO: 22, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de TeNT de la SEQ ID NO: 22, o un fragmento activo de este, un dominio de unión de TeNT de la SEQ ID NO: 22, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, una TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 22; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a la SEQ ID NO: 22; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a la SEQ ID NO: 22; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 22.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una BaNT . En un aspecto de la presente modalidad, una BaNT comprende un dominio enzimático de BaNT, un dominio de traslocación de BaNT y un dominio de unión de BaNT. En otro aspecto de la presente modalidad, una BaNT comprende la SEQ ID NO: 23. En otro aspecto de la presente modalidad, una BaNT comprende una variante de BaNT de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de BaNT o un subtipo de BaNT. En otro aspecto de la presente modalidad, una BaNT comprende una variante de BaNT de origen natural de la SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, una isoforma de BaNT o un subtipo de BaNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BaNT comprende una variante de BaNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de BaNT conservadora, una variante de BaNT no conservadora, un fragmento activo de BaNT o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BaNT comprende una variante de BaNT de origen no natural de la SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, una variante de BaNT conservadora, una variante de BaNT no conservadora, un fragmento activo de BaNT o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BaNT comprende un dominio enzimático de BaNT o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BaNT o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BaNT o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BaNT comprende un dominio enzimático de BaNT de la SEQ ID NO: 23, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BaNT de la SEQ ID NO: 23, o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BaNT de la SEQ ID NO: 23, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de este.

En otros aspectos de la presente modalidad, una BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 23; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a la SEQ ID NO: 23; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a la SEQ ID NO: 23; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 23.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium comprende una BuNT. En un aspecto de la presente modalidad, una BuNT comprende un dominio enzimático de BuNT, un dominio de traslocación de BuNT y un dominio de unión de BuNT. En otro aspecto de la presente modalidad, una BuNT comprende la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En otro aspecto de la presente modalidad, una BuNT comprende una variante de BuNT de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de BuNT o un subtipo de BuNT. En otro aspecto de la presente modalidad, una BuNT comprende una variante de BuNT de origen natural de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, tal como, por ejemplo, una isoforma de BuNT o un subtipo de BuNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BuNT comprende una variante de BuNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante de BuNT conservadora, una variante de BuNT no conservadora, un fragmento activo de BuNT o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BuNT comprende una variante de BuNT de origen no natural de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, tal como, por ejemplo, una variante de BuNT conservadora, una variante de BuNT no conservadora, un fragmento activo de BuNT o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BuNT comprende un dominio enzimático de BuNT o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BuNT o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BuNT o un fragmento activo de este o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una BuNT comprende un dominio enzimático de BuNT de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, o un fragmento activo de este, un dominio de traslocación de BuNT de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, o un fragmento activo de este, un dominio de unión de BuNT de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, o un fragmento activo de este, o cualquier combinación de este.

En otros aspectos de la presente modalidad, una BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

Tal como se usa en la presente, el término "quimeras de la toxina de Clostridium" se refiere a una molécula que comprende al menos una porción de una toxina de Clostridium y una porción de al menos otra proteina para formar una toxina con al menos una propiedad distinta de las toxinas de Clostridium de referencia de la Tabla 1. Los ejemplos no taxativos de quimeras de la toxina de Clostridium incluyen una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de la toxina que no es de Clostridium, una toxina de Clostridium que comprende un dominio de traslocación de la toxina que no es de Clostridium, una toxina de Clostridium que comprende un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium o cualquier combinación de estos. Otros ejemplos no taxativos de quimeras de la toxina de Clostridium incluyen una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de una toxina de Clostridium distinta, una toxina de Clostridium que comprende un dominio de traslocación de una toxina de Clostridium distinta, una toxina de Clostridium que comprende un dominio de unión a una toxina de Clostridium distinta o cualquier combinación de estos. 7 Una clase de quimeras de la toxina de Clostridium comprende una toxina de Clostridium modificada donde el dominio enzimático o una porción de este, el dominio de traslocación o una porción de este y/o el dominio de unión o una porción de este de una toxina de Clostridium de origen natural se modifica o reemplaza con un dominio enzimático o una porción de este, el dominio de traslocación o una porción de este y/o el dominio de unión o una porción de este de una toxina de Clostridium distinta. Como ejemplo no taxativo, el dominio de unión de BoNT/A se puede reemplazar con el dominio de unión de BoNT/B que produce una quimera de la toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/A y un dominio de unión de BoNT/B. Las quimeras de la toxina de Clostridium se describen en, por ejemplo, J. Oliver Dolly et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, patente estadounidense 7,132,259, que se incorpora en su totalidad mediante esta referencia. Como otro ejemplo no taxativo, el motivo de leucina de BoNT/A se puede insertar en la cadena ligera de una BoNT/E para aumentar la persistencia biológica. Las quimeras de la toxina de Clostridium se describen en, por ejemplo, Lance E. Steward et ál., Leucine-based Motif and Clostridial Toxins, publicación de patente estadounidense 2003/0027752 (6 de febrero de 2003); Lance E. Steward et ál., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, publicación de patente estadounidense 2003/0219462 (27 de noviembre de 2003); y Lance E. Steward et ál., Clostridial Neurotoxin Compositions and odified Clostridial Neurotoxins, publicación de patente estadounidense 2004/0220386 (4 de noviembre de 2004), cada una de las cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Otra clase de quimera de toxina de Clostridium comprende una toxina de Clostridium donde el dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural se modifica o reemplaza con un dominio de unión a una toxina que no es de Clostridium. Las quimeras de la toxina de Clostridium poseen una actividad de unión celular modificada ya que la toxina modificada puede, por ejemplo 1) utilizar el mismo receptor presente sobre la superficie de una célula diana de la toxina de Clostridium de origen natural que el utilizado por la toxina de Clostridium de origen natural, denominada una actividad de unión celular mejorada para una célula diana de la toxina de Clostridium de origen natural; 2) utilizar un receptor distinto presente sobre la superficie de una célula diana de la toxina de Clostridium de origen natural, denominada actividad de unión celular modificada para una célula diana de la toxina de Clostridium de origen natural; o 3) utilizar un receptor distinto presente sobre la superficie de la célula diana de la toxina que no es de Clostridium, denominada actividad de unión celular modificada para una célula diana de la toxina de Clostridium de origen no natural, una toxina redirigida o una TVEMP.

Una quimera de toxina de Clostridium puede ser una toxina de Clostridium con una actividad de unión celular mejorada que pueda intoxicar una célula diana de toxina de Clostridium de origen natural, por ejemplo, una neurona motora. De una manera esta actividad de unión mejorada se logra modificando el dominio de unión endógeno de una toxina de Clostridium de origen natural para mejorar una actividad de unión celular de la toxina para su receptor de origen natural. Las modificaciones a un dominio diana dan como resultado, por ejemplo, una actividad de unión celular mejorada que aumenta la afinidad de unión con un receptor endógeno de la toxina de Clostridium presente en una célula diana de la toxina de Clostridium de origen natural; una actividad de unión celular mejorada que aumenta la especificidad de unión con un subgrupo de receptores endógenos de la toxina de Clostridium presentes en una célula diana de la toxina de Clostridium de origen natural; o una actividad de unión celular mejorada que aumenta tanto la afinidad de unión como la especificidad de unión. Los ejemplos no taxativos de toxinas de Clostridium modificadas con actividad de unión celular mejorada para un receptor de la toxina de Clostridium de origen natural se describen en, por ejemplo, Lance E. Steward et ál., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems, publicación de patente estadounidense 2008/0096248; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Enhanced Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente internacional 2008/105901; cada una de las cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia .

Una quimera de toxina de Clostridium puede ser una toxina de Clostridium con una actividad de unión celular modificada que puede intoxicar una célula diana de toxina de Clostridium de origen natural, por ejemplo, una neurona motora. Una forma de lograr esta capacidad modificada es reemplazar el dominio de unión endógeno de una toxina de Clostridium de origen natural con un dominio de unión de otra molécula que preferentemente se une con un receptor distinto presente sobre la superficie de una célula diana de la toxina de Clostridium. Las modificaciones a un dominio de unión dan como resultado una toxina modificada que es capaz de unirse preferentemente a un receptor de toxina que no es Clostridium presente en una célula diana de toxina de Clostridium. Esta actividad de unión mejorada para una célula diana de la toxina de Clostridium de origen natural permite administrar dosis eficaces más bajas de una toxina de Clostridium modificada a un individuo ya que se administrará más toxina a la célula diana. Por lo tanto, las toxinas de Clostridium modificadas con una actividad de unión mejorada reducirán la dispersión de la toxina hacia las áreas no seleccionadas para el tratamiento, reduciendo o previniendo asi los efectos secundarios no deseados asociados a la difusión de una toxina de Clostridium hacia una ubicación no deseada. Los ejemplos no taxativos de toxinas de Clostridium modificadas con una capacidad de unión celular modificada para una célula diana de la toxina de Clostridium se describen en, por ejemplo, Lance E. Steward et ál., Multívalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, patente estadounidense 7,514,088; Lance E. Steward et ál., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente estadounidense 2008/0161543; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente estadounidense 2008/0241881; Lance E. Steward et ál., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, publicación de patente estadounidense 2009/0048431; Lance E. Steward et ál., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente internacional WO 2007/106115; cada una de las cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Una quimera de toxina de Clostridium puede ser una toxina de Clostridium con una actividad de unión celular modificada que puede intoxicar una célula que no es una célula diana de toxina de Clostridium, por ejemplo, una célula distinta de una neurona motora. Estas moléculas denominadas TVEMP logran esta intoxicación utilizando un receptor diana presente en la célula diana de la toxina que no es de Clostridium. Esta capacidad redirigida se logra mediante el remplazo de un dominio de unión de origen natural de una toxina de Clostridium con un dominio de unión que muestra una actividad de unión preferencial para un receptor de toxina que no es de Clostridium presente en una célula diana de toxina que no es de Clostridium. Las modificaciones a un dominio de unión dan como resultado una toxina modificada que es capaz de unirse preferentemente a un receptor de toxina que no es Clostridium presente en una célula diana de toxina que no es de Clostridium. Una quimera de toxina de Clostridium con actividad de direccionamiento modificada para una célula diana de toxina que no es de Clostridium se puede unir a un receptor diana, traslocar hacia el citoplasma y ejercer su efecto proteolitico en el complejo SNARE de la célula diana de toxina que no es de Clostridium. Los ejemplos no taxativos de quimeras de la toxina de Clostridium con una actividad de direccionamiento modificada para una célula diana de la toxina que no es de Clostridium se describen en, por ejemplo, Keith A. Foster et ál., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, patente estadounidense 5, 989, 545; Clifford C. Shone et ál., Recombinant Toxin Fragmente, patente estadounidense 6,461,617; Conrad P. Quinn et ál., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion , patente estadounidense 6,632,440; Lance E. Steward et ál . , Methods and Compositions for the Treatment of Pancreatitis, patente estadounidense 6,843,998; J. Oliver Dolly et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins , patente estadounidense 7,132,259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, patente estadounidense 7,244,437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, patente estadounidense 7,413,742; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, patente estadounidense 7,415,338; Lance E. Steward et ál., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, patente estadounidense 7,514,088; Keith A. Foster et ál., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, publicación de patente estadounidense 2006/0216283; Keith A. Foster, Fusión Proteins , publicación de patente estadounidense 2008/0064092; Keith A. Foster, Fusión Proteins, publicación de patente estadounidense 2009/0035822; Lance E. Steward et ál., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, publicación de patente estadounidense 2009/0048431; Keith A. Foster, Non-Cytotoxic Protein Conjugates , publicación de patente estadounidense 2009/0162341; Keith A. Foster et ál., Re-targeted Toxin Conjugates , publicación de patente internacional O 2005/023309; y Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells, solicitud de patente internacional WO 2008/008805; cada una de las cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Los aspectos de la presente descripción proporcionan, parcialmente, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium. Tal como se usa en la presente, el término "dominio enzimático de la toxina de Clostridium" se refiere a cualquier polipéptido de toxina de Clostridium que puede ejecutar el paso de modificación de la diana enzimática del proceso de intoxicación. Por lo tanto, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium se dirige específicamente a un sustrato de toxina de Clostridium y abarca la escisión proteolítica de un sustrato de toxina de Clostridium, tal como, por ejemplo, proteínas SNARE como un sustrato SNAP-25, un sustrato VAMP y un sustrato de sintaxina. Los ejemplos no taxativos de un dominio enzimático de la toxina de Clostridium incluyen, por ejemplo, un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio 7 enzimático de BoNT/Cl, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de TeNT, un' dominio enzimático de BaNT y un dominio enzimático de BuNT.

Un dominio enzimático de la toxina de Clostridium incluye, de modo no taxativo, variantes de dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen natural, tales como, por ejempjo, isoformas del dominio enzimático de la toxina de Clostridium y subtipos del dominio enzimático de la toxina de Clostridium y variantes del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen no natural, tales como, por ejemplo, variantes del dominio enzimático de la toxina de Clostridium conservadoras, variantes del dominio enzimático de la toxina de Clostridium no conservadoras, quimeras del dominio enzimático de la toxina de Clostridium, fragmentos activos del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de estos, o cualquier combinación de estos.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium", ya sea de origen natural o no natural, se refiere a. un dominio enzimático de la toxina de Clostridium que tiene al menos un cambio de aminoácidos desde la región correspondiente de las secuencias de referencia descritas (Tabla 1) y se puede describir como porcentaje de identidad con la región correspondiente de esa secuencia de referencia. Salvo que se indique expresamente, las variantes del dominio de la toxina de Clostridium útiles para la puesta en práctica de las modalidades descritas son variantes que ejecutan el paso de modificación de la diana enzimática del proceso de intoxicación. Como ejemplos no taxativos, una variante del dominio enzimático de BoNT/A tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1; una variante del dominio enzimático de BoNT/B tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6; una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11; una variante del dominio enzimático de BoNT/D tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13; una variante del dominio enzimático de BoNT/E tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15; una variante del dominio enzimático de BoNT/F tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18; una variante del dominio enzimático de BoNT/G tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 21; una variante del dominio enzimático de TeNT tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22; una variante del dominio enzimático de BaNT tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23; una variante del dominio enzimático de BuNT tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24.

Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada serotipo de toxina de Clostridium puede haber variantes del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen natural que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, actualmente hay cinco subtipos de BoNT/A, BoNT/Al, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos de dominio enzimático específicos que muestran alrededor de 80 % a 95 % de identidad de aminoácidos en comparación con el dominio enzimático de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1. Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen natural" se refiere a cualquier dominio enzimático de la toxina de Clostridium producido mediante un proceso de origen natural, incluyendo de modo no taxativo, isoformas del dominio enzimático de la toxina de Clostridium producidas a partir de transcripciones alternativamente empalmadas, isoformas del dominio enzimático de la toxina de Clostridium producidas mediante mutación espontánea y subtipos del dominio enzimático de la toxina de Clostridium. Una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen natural puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio enzimático de la toxina de Clostridium en el cual se basa la variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen natural, y puede sustituir al dominio enzimático de la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción.

Un ejemplo no taxativo de una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen natural es una isoforma del dominio enzimático de la toxina de Clostridium tal como, por ejemplo, una isoforma del dominio enzimático de BoNT/A, una isoforma del dominio enzimático de BoNT/B, una isoforma del dominio enzimático de BoNT/Cl, una isoforma del dominio enzimático de BoNT/D, una isoforma del dominio enzimático de BoNT/E, una isoforma del dominio enzimático de BoNT/F, una isoforma del dominio enzimático de BoNT/G, una isoforma de dominio enzimático de TeNT, una isoforma de dominio enzimático de BaNT y una isoforma del dominio enzimático de BuNT . Otro ejemplo no taxativo de una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen natural es un subtipo del dominio enzimático de la toxina de Clostridium tal como, por ejemplo, un dominio enzimático del subtipo BoNT/Al, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 o BoNT/A5; un dominio enzimático del subtipo BoNT/Bl, BoNT/B2, BoNT/Bbv o BoNT/Bnp; un dominio enzimático del subtipo BoNT/Cl-1 y BoNT/Cl-2; un dominio enzimático del subtipo BoNT/El, BoNT/E2 y BoNT/E3 ; y un dominio enzimático del subtipo BoNT/Fl , BoNT/F2 o BoNT/F3 y un dominio enzimático del subtipo BuNT-1 o BuNT-2.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen no natural" se refiere a cualquier dominio enzimático de la toxina de Clostridium producido con la ayuda de manipulación humana, incluyendo, de modo no taxativo, dominios enzimáticos de la toxina de Clostridium producidos mediante modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño . racional y dominios enzimáticos de la toxina de Clostridium producidos mediante síntesis química. Los ejemplos no taxativos de las variantes del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen no natural incluyen, por ejemplo, variantes del dominio enzimático de la toxina de Clostridium conservadoras, variantes del dominio enzimático de la toxina de Clostridium no conservadoras, variantes quiméricas del dominio enzimático de la toxina de Clostridium y fragmentos activos del dominio enzimático de la toxina de Clostridium.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium conservadora" se refiere a un dominio enzimático de la toxina de Clostridium que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de referencia (Tabla 1) . Los ejemplos de propiedades incluyen, de modo no taxativo, similar tamaño, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de unión a hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares o cualquier combinación de estos. Una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio enzimático de la toxina de Clostridium en el cual se basa la variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium conservadora, y puede sustituir al dominio enzimático de la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Los ejemplos no taxativos de una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium conservado:ra incluyen, por ejemplo, variantes del dominio enzimático de BoNT/A conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/B conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/Cl conservadoras, variantes del dominio enzimático de BoNT/D conservadoras, variantes del dominio enzimático de BoNT/D conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/E conservadoras, variantes del dominio enzimático de BoNT/F conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/G conservadoras , variantes del dominio enzimático de TeNT conservadoras , variantes del dominio enzimático de BaNT conservadoras y variantes del dominio enzimático de BuNT conservadoras.

Tal como se usa en la presente , el término "variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium no conservadora" se refiere a un dominio enzimático de la toxina de Clostridium donde 1) se suprime al menos un aminoácido del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium no conservadora; 2) se agrega al menos un aminoácido al dominio enzimático de la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa el dominio enzimático de la toxina de Clostridium no conservadora; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de referencia (Tabla 1) . Una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium no conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio enzimático de la toxina de Clostridium en el cual se basa la variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium no conservadora, y puede sustituir al dominio enzimático de la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Los ejemplos no taxativos de una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium no conservadora incluyen, por ejemplo, variantes del dominio enzimático de BoNT/A no conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/B no conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/Cl no conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/D no conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/E no conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/F no conservadoras , variantes del dominio enzimático de BoNT/G no conservadoras , variantes del dominio enzimático de TeNT no conservadoras, variantes del dominio enzimático de BaNT no conservadoras y variantes del dominio enzimático de BuNT no conservadoras.

Tal como se usa en la presente, el término "fragmento activo del dominio enzimático de la toxina de Clostridium" se refiere a cualquiera de varios fragmentos de la toxina de Clostridium que comprenden el dominio enzimático, puede ser útil en aspectos de la presente descripción con la condición de que estos fragmentos del dominio enzimático puedan dirigirse específicamente a los componentes principales del aparato de liberación de neurotransmisores y por lo tanto participar en la ejecución del mecanismo celular total mediante el cual una toxina de Clostridium escinde proteolíticamente un sustrato. Los dominios enzimáticos de las toxinas de Clostridium tienen aproximadamente 420-460 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio enzimático (Tabla 1) . Las investigaciones han demostrado que la longitud total de un dominio enzimático de la toxina de Clostridium no es necesaria para la actividad enzimática del dominio enzimático. Como ejemplo no taxativo, los primeros ocho aminoácidos del dominio enzimático de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no taxativo, los primeros ocho aminoácidos del dominio enzimático de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Asimismo, el carboxi-terminal del dominio enzimático no es necesario para la actividad. Como ejemplo no taxativo, los últimos 32 aminoácidos del dominio enzimático de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no taxativo, los últimos 31 aminoácidos del dominio enzimático de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Por lo tanto, los aspectos de la presente modalidad incluyen dominios enzimáticos de la toxina de Clostridium que comprenden un dominio enzimático con una longitud de, por ejemplo, al menos 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos. Otros aspectos de la presente modalidad incluyen dominios enzimáticos de la toxina de Clostridium que comprenden un dominio enzimático con una longitud de, por ejemplo, como máximo 350, 375, 400, 425 o 450 aminoácidos.

Cualquiera de una variedad de métodos de alineación de secuencia se pueden usar para determinar el porcentaje de identidad de variantes del dominio enzimático a la toxina de Clostridium de origen natural y variantes del dominio enzimático de toxina de Clostridium de origen no natural incluyendo, de modo no taxativo, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, por ejemplo, métodos de enfoque de segmento. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procesos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente .

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma del dominio enzimático de la toxina de Clostridium o un subtipo del dominio enzimático de la toxina de Clostridium. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático a la toxina de Clostridium comprende una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium conservadora, una variante del dominio enzimático de la toxina de Clostridium no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático a la toxina de Clostridium, o cualquier combinación de estos.

En otra modalidad, un aminoácido hidrofóbico en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio enzimático de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido hidrofóbico. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos incluyen, por ejemplo, C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio enzimático de la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, por ejemplo, A, I, L, P y V. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio enzimático de la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, por ejemplo, F, H, e Y. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido acumulado en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio enzimático de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido acumulado. Los ejemplos de aminoácidos acumulados incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio enzimático de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, por ejemplo, D, E, K, N, Q y R. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio enzimático de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, por ejemplo, A, H, G, P, S, T e Y. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena polipeptídica del dominio enzimático de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, por ejemplo, K, R y H. En otro aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio enzimático de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, por ejemplo, D y E. En otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio enzimático de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido pequeño. Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, por ejemplo, A, D, G, N, P, S y T. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido ramificado C-beta en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio enzimático de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido ramificado C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados C-beta incluyen, por ejemplo, I, T y v.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BoNT/A. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio enzimático de BoNT/A comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio enzimático de BoNT/A comprende los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/A de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/A o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/A de origen natural de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/A o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende aminoácidos 1/2-429 de una variante del dominio de BoNT/A de origen natural de la SEQ ID NO: 1, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de la isoforma BoNT/A o un dominio enzimático del subtipo BoNT/A. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/A de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/A conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/A, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de BoNT/A de origen no natural de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/A conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/A, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende aminoácidos 1/2-429 de una variante del dominio enzimático de BoNT/A de origen no natural de la SEQ ID NO: 1, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/A conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/A, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-429 de la SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BoNT/B. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio enzimático de BoNT/B comprende los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende una variante del dominio de unión de BoNT/B de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/B o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/B de origen natural de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/B o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/A comprende aminoácidos 1/2-436 de una variante del dominio enzimático de BoNT/B de origen natural de la SEQ ID NO: 6, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/B o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/B. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/B de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/B conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/B, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de BoNT/B de origen no natural de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/B conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/B, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende aminoácidos 1/2-436 de una variante del dominio enzimático de BoNT/B de origen no natural de la SEQ ID NO: 6, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/B conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/B, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 6.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BoNT/Cl. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/Cl o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/Cl. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl de origen natural de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/Cl o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/Cl. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende aminoácidos 1/2-436 de una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl de origen natural de la SEQ ID NO: 11, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/Cl o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/Cl. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/Cl, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl de origen no natural de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/Cl, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende aminoácidos 1/2-436 de una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl de origen no natural de la SEQ ID NO: 11, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/Cl, o cualquier combinación de estos .

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 1,2, 3,4, 4, 5, 6, 7, 7,8, 9, 10, 20, 10,20, 30,40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 11.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BoNT/D. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/D de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/D o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/D de origen natural de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/D o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende aminoácidos 1/2-436 de una variante del dominio enzimático de BoNT/D de origen natural de la SEQ ID NO: 13, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/D o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/D. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/D de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/D conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/D, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de BoNT/D de origen no natural de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/D conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/D, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende aminoácidos 1/2-436 de una variante del dominio enzimático de BoNT/D de origen no natural de la SEQ ID NO: 13, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/D conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/D, o cualquier combinación de estos .

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, io, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-436 de la SEQ ID NO: 13.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BoNT/E. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/E de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/E o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/E de origen natural de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/E o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende aminoácidos 1/2-411 de una variante del dominio enzimático de BoNT/E de origen natural de la SEQ ID NO: 15, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/E o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/E. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/E de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/E conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/E, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de BoNT/E de origen no natural de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/E conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/E, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende aminoácidos 1/2-411 de una variante del dominio enzimático de BoNT/E de origen no natural de la SEQ ID NO: 15, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/E conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/E, o cualquier combinación de estos .

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 2-411 de la SEQ ID NO: 15.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BoNT/F. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/F de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/F o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/F de origen natural de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/F o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende aminoácidos 1/2-428 de una variante del dominio enzimático de BoNT/F de origen natural de la SEQ ID NO: 18, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/F o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/F. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/F de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/F conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/F, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de BoNT/F de origen no natural de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/F conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/F, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende aminoácidos 1/2-428 de una variante del dominio enzimático de BoNT/F de origen no natural de la SEQ ID NO: 18, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/F conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/F, o cualquier combinación de estos .

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-428 de la SEQ ID NO: 18.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BoNT/G. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 21. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/G de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/G o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/G de origen natural de la SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/G o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende aminoácidos 1/2-4435 de una variante del dominio enzimático de BoNT/G de origen natural de la SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BoNT/G o un dominio enzimático de un subtipo de BoNT/G. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende una variante del dominio enzimático de BoNT/G de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/G conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/G, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de BoNT/G de origen no natural de la SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/G conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/G, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende aminoácidos 1/2-4435 de una variante del dominio enzimático de BoNT/G de origen no natural de la SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BoNT/G conservadora, una variante del dominio enzimático de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BoNT/G, o cualquier combinación de estos .

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 21. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3P 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-4435 de la SEQ ID NO: 21.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de TeNT. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 22. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende una variante del dominio enzimático de TeNT de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de TeNT o un dominio enzimático de un subtipo de TeNT. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende una variante del dominio enzimático de TeNT de origen natural de la SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de TeNT o un dominio enzimático de un subtipo de TeNT. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende aminoácidos 1/2438 de una variante del dominio enzimático de TeNT de origen natural de la SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de TeNT o un dominio enzimático de un subtipo de TeNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende una variante del dominio enzimático de TeNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de TeNT conservadora, una variante del dominio enzimático de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de TeNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de TeNT de origen no natural de la SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de TeNT conservadora, una variante del dominio enzimático de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de TeNT, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende aminoácidos 1/2-438 de una variante del dominio enzimático de TeNT de origen no natural de la SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de TeNT conservadora, una variante del dominio enzimático de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de TeNT, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 22. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-438 de la SEQ ID NO: 22.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BaNT. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 23. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende una variante del dominio enzimático de BaNT de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BaNT o un dominio enzimático de un subtipo de BaNT. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende una variante del dominio enzimático de BaNT de origen natural de la SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BaNT o un dominio enzimático de un subtipo de BaNT. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende aminoácidos 1/2420 de una variante del dominio enzimático de BaNT de origen natural de la SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BaNT o un dominio enzimático de un subtipo de BaNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende una variante del dominio enzimático de BaNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BaNT conservadora, una variante del dominio enzimático de BaNT no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BaNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto.de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de BaNT de origen no natural de la SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BaNT conservadora, una variante del dominio enzimático de BaNT no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BaNT, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende aminoácidos 1/2-420 de una variante del dominio enzimático de BaNT de origen no natural de la SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BaNT conservadora, una variante del dominio enzimático de BaNT no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BaNT, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 23. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-420 de la SEQ ID NO: 23.

En otra modalidad, un dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BuNT. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende los dominios enzimáticos de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende una variante del dominio enzimático de BuNT de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BuNT o un dominio enzimático de un subtipo de BuNT. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende una variante del dominio enzimático de BuNT de origen natural de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BuNT o un dominio enzimático de un subtipo de BuNT. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende aminoácidos 1/2-411 de una variante del dominio enzimático de BuNT de origen natural de la SEQ ID NO: 24, tal como, por ejemplo, un dominio enzimático de una isoforma de BuNT o un dominio enzimático de un subtipo de BuNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende una variante del dominio enzimático de BuNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BuNT conservadora, una variante del dominio enzimático de BuNT no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BuNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende el dominio enzimático de una variante del dominio enzimático de BuNT de origen no natural de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BuNT conservadora, una variante del dominio enzimático de BuNT no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BuNT, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende aminoácidos 1/2-411 de una variante del dominio enzimático de BuNT de origen no natural de la SEQ ID NO: 24, tal como, por ejemplo, una variante del dominio enzimático de BuNT conservadora, una variante del dominio enzimático de BuNT no conservadora, un fragmento activo del dominio enzimático de BuNT, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio enzimático de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 ¾, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio enzimático de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio enzimático de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2411 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 1/2-411 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

El "dominio de traslocación" comprende una porción de una cadena pesada de neurotoxina de Clostridium que presenta actividad de traslocación. "Traslocación" se refiere a la capacidad de facilitar el transporte de un polipéptido mediante una membrana vesicular, exponiendo asi algún o todos los polipéptidos al citoplasma. Se cree que la traslocación de varias neurotoxinas botulinicas implica un cambio conformacional alostérico de la cadena pesada provocado por una disminución en el pH dentro del endosoma. Este cambio conformacional parece implicar y ser mediado por la mitad del N-terminal de la cadena pesada y dar como resultado la formación de poros en la membrana vesicular; este cambio permite el movimiento de la cadena ligera proteolitica dentro de la vesícula endosomal hacia el citoplasma. Véase, por ejemplo, Lacy, et ál., Nature Struct. Biol. 5:898-902 (octubre de 1998) .

La secuencia de aminoácidos de la porción que interviene en la traslocación de la cadena pesada de la neurotoxina botulínica es conocida por los expertos en la técnica; de manera adicional, también se conocen los residuos de aminoácidos dentro de esta porción que se sabe que son esenciales para conferir la actividad de traslocación . Por lo tanto, dentro de las aptitudes del experto en la técnica se encuentra, por ejemplo, el empleo de la mitad de péptido del N-terminalde origen natural de la cadena pesada de cualquiera de los varios subtipos de neurotoxina Clostridium tetanus o Clostridium botulinum como dominio de traslocación, o el diseño de un dominio de traslocación análogo alineando las secuencias principales de las mitades del N-terminalde las varias cadenas pesadas y seleccionando una secuencia de traslocación principal de consenso en función de las características de estéricas, de aminoácidos, de polaridad y de hidrofobicidad conservadas entre las secuencias.

Los aspectos de la presente descripción proporcionan, parcialmente, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium. Tal como se usa en la presente, el término "dominio de traslocación de la toxina de Clostridium" se refiere a cualquier polipéptido de toxina de Clostridium que puede ejecutar el paso de traslocación del proceso de intoxicación que media la traslocación de la cadena ligera de la toxina de Clostridium. Por lo tanto, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium facilita el movimiento de una cadena ligera de la toxina de Clostridium a través de una membrana y abarca el movimiento de una cadena ligera de la toxina de Clostridium a través de la membrana de Una vesícula intracelular dentro del citoplasma de una célula. Los ejemplos no taxativos de un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium incluye, por ejemplo, un dominio de traslocación de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/B, un dominio de traslocación de BoNT/Cl, un dominio de traslocación de BoNT/D, un dominio de traslocación de BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/G, un dominio de traslocación de TeNT, un dominio de traslocación de BaNT y un dominio de traslocación de BuNT.

Un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium incluye, de modo no taxativo, variantes del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de origen natural, tal como, por ejemplo, isoformas del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium y subtipos del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium; variantes del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de origen no natural, tales como, por ejemplo, variantes del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium conservadoras, variantes del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium no conservadoras, fragmentos activos del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de estos, o cualquier combinación de estos.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium", ya sea de origen natural o no natural, se refiere a un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium que tiene al menos un cambio de aminoácidos desde la región correspondiente de las secuencias de referencia descritas (Tabla 1) y se puede describir como porcentaje de identidad con la región correspondiente de esa secuencia de referencia. A menos que se indique expresamente, las variantes de dominio de traslocación de la toxina de Clostridium útiles para poner en práctica las modalidades descritas son variantes que ejecutan el paso de traslocación del proceso de intoxicación que media la traslocación de la cadena ligera de la toxina de Clostridium. Como ejemplos no taxativos, una variante del dominio de traslocación de BoNT/A tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1; una variante del dominio de traslocación de BoNT/B tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6; una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11; una variante del dominio de traslocación de BoNT/D tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, 1 una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13; una variante del dominio de traslocación de BoNT/E tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15; una variante del dominio de traslocación de BoNT/F tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 446-865 de la SEQ ID NO: 18; una variante del dominio de traslocación de BoNT/G tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 451-865 de la SEQ ID NO: 21; una variante del dominio de traslocación de TeNT tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 468-881 de la SEQ ID NO: 22; una variante del dominio de traslocación de BaNT tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 436-857 de la SEQ ID NO: 23; una variante del dominio de traslocación de BuNT tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 24.

Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada serotipo de toxina de Clostridium puede haber variantes del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium de oriqen natural que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, actualmente hay cinco subtipos de BoNT/A, BoNT/Al, BoNT/A2 , BoNT/A3 , BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos específicos del dominio de traslocacion que muestran alrededor de 85-87 % de identidad de aminoácidos en comparación con el subtipo del dominio de traslocacion de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1. Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium de origen natural" significa cualquier dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium producido por un proceso de origen natural incluyendo, de modo no taxativo, isoformas del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium producidas a partir de transcripciones alternativamente empalmadas, isoformas del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium producidas por mutación espontánea y subtipos del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium. Una variante del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium de origen natural puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de origen natural, y puede sustituir el dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción.

Un ejemplo no taxativo de una variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de origen natural es una isoforma del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium tal como, por ejemplo, una isoforma del dominio de traslocación de BoNT/A, una isoforma del dominio de traslocación de BoNT/B, una isoforma del dominio de traslocación de BoNT/Cl, una isoforma del dominio de traslocación de BoNT/D, una isoforma del dominio de traslocación de BoNT/E, una isoforma del dominio de traslocación de BoNT/F, una isoforma del dominio de traslocación de BoNT/G, una isoforma de dominio de traslocación de TeNT, una isoforma de dominio de traslocación de BaNT y una isoforma del dominio de traslocación de BuNT .

Otro ejemplo no taxativo de una variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de origen natural es un subtipo del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación del subtipo BoNT/Al , BoNT/A2 , BoNT/A3 , BoNT/A4 y BoNT/A5; un dominio de traslocación del subtipo BoNT/Bl, BoNT/B2, BoNT/B bivalente y BoNT/B no proteolitico; un dominio de traslocación del subtipo BoNT/Cl-1 y BoNT/Cl-2; un dominio de traslocacion del subtipo BoNT/El, BoNT/E2 y BoNT/E3; un dominio de traslocacion del subtipo BoNT/Fl, BoNT/F2 , BoNT/F3 y BoNT/F4 y un dominio de traslocacion del subtipo BuNT-1 y BuNT-2.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de traslocacion de . la toxina de Clostridium de origen no natural" significa cualquier dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium producido con la ayuda de la manipulación humana, incluyendo, de modo no taxativo, dominios de traslocacion de la toxina de Clostridium producidos mediante modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y dominios de traslocacion de la toxina de Clostridium producidos mediante síntesis química. Los ejemplos no taxativos de las variantes del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium de origen no natural incluyen, por ejemplo, variantes del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium conservadoras, variantes del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium no conservadoras y fragmentos activos del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium conservadora" significa un dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de referencia (Tabla 1). Los ejemplos de propiedades incluyen, de modo no taxativo, similar tamaño, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de unión a hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares o cualquier combinación de estos. Una variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium conservadora, y puede sustituir al dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Los ejemplos no taxativos de una variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium conservadora incluyen, por ejemplo, variantes del dominio de traslocación de BoNT/A conservadora, variantes del dominio de traslocación de BoNT/B conservadoras, variantes del dominio enzimático de BoNT/Cl conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BoNT/D de origen no natural, variantes del dominio de traslocación de BoNT/E conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BoNT/F conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BoNT/G conservadoras, variantes del dominio de traslocación de TeNT conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BaNT conservadoras y variantes del dominio de traslocación de BuNT conservadoras.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium no conservadora" se refiere a un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium donde 1) se suprime al menos un aminoácido del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium no conservadora; 2) se agrega al menos un aminoácido al dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa el dominio de traslocación de la toxina de Clostridium no conservadora; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de referencia (Tabla 1) . Una variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium no conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium no conservadora y puede sustituir al dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Los ejemplos no taxativos de una variante del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium no conservadora incluyen, por ejemplo, variantes del dominio de traslocación de BoNT/A no conservadora, variantes del dominio de traslocación de BoNT/B no conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BoNT/Cl no conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BoNT/D no conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BoNT/E no conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BoNT/F no conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BoNT/G no conservadoras, variantes del dominio de traslocación de TeNT no conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BaNT no conservadoras y variantes del dominio de traslocación de BuNT no conservadoras.

Tal como se usa en la presente, el término "fragmento activo del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium" se refiere a cualquiera de varios fragmentos de la toxina de Clostridium que comprenden el dominio de traslocación pueden ser útiles en aspectos de la presente descripción con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de la LC desde vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana y por lo tanto participar en la ejecución del mecanismo celular total mediante el cual una toxina de Clostridium escinde proteoliticamente un sustrato. Los dominios de traslocación de las cadenas pesadas de las toxinas de Clostridium tienen aproximadamente 410-430 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de traslocación (Tabla 1). Las investigaciones han demostrado que la longitud completa de un dominio de traslocación de la cadena pesada de una toxina de Clostridium no es necesaria para la actividad de traslocación del dominio de traslocación. Por lo tanto, los aspectos de la presente modalidad incluyen un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium que tiene una longitud de, por ejemplo, al menos 350, 375, 400 o 425 aminoácidos. Otros aspectos de la presente modalidad incluyen un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium que tiene una longitud de, por ejemplo, como máximo 350, 375, 400 o 425 aminoácidos.

Cualquiera de una variedad de métodos de alineación de secuencia- se pueden usar para determinar el porcentaj,e de identidad de variantes del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de origen natural y variantes del dominio de traslocación de toxina de Clostridium de origen no natural incluyendo, de modo no taxativo, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, por ejemplo, métodos de enfoque de segmento. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procesos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción comprende un dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium comprende una variante del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium o un subtipo del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium comprende una variante del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium conservadora, una variante del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium, o cualquier combinación de estos.

En otra modalidad, un aminoácido hidrofóbico en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido hidrofóbico. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos incluyen, por ejemplo, C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena polipeptídica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, por ejemplo, A, I, L, P y V. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido acumulado en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido acumulado. Los ejemplos de aminoácidos acumulados incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, por ejemplo, D, E, K, N, Q y R. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, por ejemplo, A, H, G, P, S, T e Y. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena polipeptídica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, por ejemplo, K, R y H. En otro aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, por ejemplo, D y E. En otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido pequeño., Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, por ejemplo, A, D, G, N, P, S y T. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido ramificado C-beta en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido ramificado C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados C-beta incluyen, por ejemplo, I, T y V.

En otra modalidad, un dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de BoNT/A. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende los dominios de traslocación de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/A de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/A o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/A de origen natural de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/A o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende aminoácidos 455-873 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/A de origen natural de la SEQ ID NO: 1, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/A o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/A. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/A de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/A conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/A, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende el dominio de traslocación de una variante del dominio de traslocación de BoNT/A de origen no natural de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/A conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/A, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende aminoácidos 455-873 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/A de origen no natural de la SEQ ID NO: 1, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/A conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/A, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 5. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 455-873 de SEQ ID NO: 1.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 455-873 de la SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 455-873 de SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de BoNT/B. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende los dominios de traslocación de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/B de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/B o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/B de origen natural de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/B o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende aminoácidos 447-860 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/B de origen natural de la SEQ ID NO: 6, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/B o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/B. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/B de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/B conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/B, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende el dominio de traslocación de una variante del dominio de traslocación de BoNT/B de origen no natural de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/B conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/B, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende aminoácidos 447-860 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/B de origen no natural de la SEQ ID NO: 6, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/B conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/B, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 , al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6, En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 447-860 de la SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 447-860 de SEQ ID NO: 6.

En otra modalidad, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de BoNT/Cl. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende los dominios de traslocación de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/Cl o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/Cl. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl de origen natural de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/Cl o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/Cl. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende aminoácidos 454-868 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl de origen natural de la SEQ ID NO: 11, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/Cl o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/Cl. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/Cl, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende el dominio de traslocación de una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl de origen no natural de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl conservadora, Una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/Cl, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende aminoácidos 454-868 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl de origen no natural de la SEQ ID NO: 11, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/Cl, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 454-868 de la SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 454-868 de SEQ ID NO: 11.

En otra modalidad, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de BoNT/D. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende los dominios de traslocación de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/D de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/D o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/D de origen natural de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/D o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende aminoácidos 451-864 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/D de origen natural de la SEQ ID NO: 13, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/D o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/D. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/D de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/D conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/D, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende el dominio de traslocación de una variante del dominio de traslocación de BoNT/D de origen no natural de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/D conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BoNT/D, o cualquier combinación de estos. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/D comprende aminoácidos 451-864 de una variante del dominio de traslocacion de BoNT/D de origen natural de la SEQ ID NO: 13, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/D conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BoNT/D, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio de traslocacion de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio de traslocacion de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 451864 de la SEQ ID NO: 13.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 451-864 de la SEQ ID NO: 13.

En otra modalidad, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de BoNT/E. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende los dominios de traslocación de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/E de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocacion de una isoforma de BoNT/E o un dominio de traslocacion de un subtipo de BoNT/ E. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/E comprende una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E de origen natural de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocacion de una isoforma de BoNT/E o un dominio de traslocacion de un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/E comprende aminoácidos 427-847 de una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E de origen natural de la SEQ ID NO: 15, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocacion de una isoforma de BoNT/E o un dominio de traslocacion de un subtipo de BoNT/E. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/E comprende una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BoNT/E, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/E comprende el dominio de traslocacion de una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E de origen no natural de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BoNT/E, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/E comprende aminoácidos 427-847 de una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E de origen no natural de la SEQ ID NO: 15, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BoNT/E, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con el dominio de traslocacion de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con el dominio de traslocacion de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al 1 4 menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 427-847 de SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 427-847 de la SEQ ID NO: 15.

En otra modalidad, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de BoNT/F. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende los dominios de traslocación de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende los aminoácidos 446-865 de la SEQ ID NO: 18. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/F de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/F o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/ F. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/F de origen natural de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/F o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende aminoácidos 446-865 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/F de origen natural de la SEQ ID NO: 18, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/F o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/F. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/F de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/F conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/F, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende el dominio de traslocacion de una variante del dominio de traslocacion de BoNT/F de origen no natural de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/F conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BoNT/F, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/F comprende aminoácidos 446-865 de una variante del dominio de traslocacion de BoNT/F de origen no natural de la SEQ ID NO: 18, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/F conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BoNT/F, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de traslocacion de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de traslocacion de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 446-865 de SEQ ID NO: 18; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 446-865 de SEQ ID NO: 18.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 446-865 de SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 446-865 de SEQ ID NO: 18. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocacion de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocacion de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 446-865 de SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 446-865 de SEQ ID NO: 18.

En otra modalidad, un dominio de traslocacion de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocacion de BoNT/G. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocacion de BoNT/G comprende los dominios de traslocacion de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de traslocación de BoNT/G comprende los aminoácidos 451-865 de SEQ ID NO: 21. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/G de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/G o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocación de BoNT/G comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/G de origen natural de SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/G o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocación de BoNT/G comprende aminoácidos 451-865 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/G de origen natural de SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BoNT/G o un dominio de traslocación de un subtipo de BoNT/G. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende una variante del dominio de traslocación de BoNT/G de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/G conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/G, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende el dominio de traslocación de una variante del dominio de traslocación de BoNT/G de origen no natural de SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/G conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/G, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocación de BoNT/G comprende aminoácidos 451-865 de una variante del dominio de traslocación de BoNT/G de origen no natural de SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BoNT/G conservadora, una variante del dominio de traslocación de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BoNT/G, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 451-865 de SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 451-865 de SEQ ID NO: 21.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 451-865 de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 451-865 de SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 451-865 de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 451-865 de SEQ ID NO: 21.

En otra modalidad, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de TeNT. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocación de TeNT comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de traslocación de TeNT comprende los aminoácidos 468-881 de SEQ ID NO: 22. En otro aspecto de la presente 7 modalidad, un dominio de traslocación de TeNT comprende una variante del dominio de traslocación de TeNT de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de TeNT o un dominio de traslocación de un subtipo de TeNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocación de TeNT comprende una variante del dominio de traslocación de TeNT de origen natural de SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de TeNT o un dominio de traslocación de un subtipo de TeNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocación de TeNT comprende aminoácidos 468-881 de una variante del dominio de traslocación de TeNT de origen natural de SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de TeNT o un dominio de traslocación de un subtipo de TeNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de TeNT comprende una variante del dominio de traslocación de TeNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de TeNT conservadora, una variante del dominio de traslocación de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de TeNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de TeNT comprende el dominio de traslocación de una variante del dominio de traslocación de TeNT de origen no natural de SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de TeNT conservadora, una variante del dominio de traslocacion de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de TeNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocacion de TeNT comprende aminoácidos 468-881 de una variante del dominio de traslocacion de TeNT de origen no natural de SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de TeNT conservadora, una variante del dominio de traslocacion de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de TeNT, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de traslocacion de SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de traslocacion de SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 468-881 de SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como 17 máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 468-881 de SEQ ID NO: 22.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 468-881 de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 468-881 de SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocación de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 468-881 de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 468-881 de SEQ ID NO: 22.

En otra modalidad, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de BaNT. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocación de BaNT comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de traslocación de BaNT comprende los aminoácidos 436-857 de SEQ ID NO: 23. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BaNT comprende una variante del dominio de traslocación de BaNT de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BaNT o un dominio de traslocación de un subtipo de BaNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocacion de BaNT comprende una variante del dominio de traslocacion de BaNT de origen natural de SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocacion de una isoforma de BaNT o un dominio de traslocacion de un subtipo de BaNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocacion de BaNT comprende aminoácidos 436-857 de una variante del dominio de traslocacion de BaNT de origen natural de SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocacion de una isoforma de BaNT o un dominio de traslocacion de un subtipo de BaNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BaNT comprende una variante del dominio de traslocacion de BaNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BaNT conservadora, una variante del dominio de traslocacion de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BaNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BaNT comprende el dominio de traslocacion de una variante del dominio de traslocacion de BaNT de origen no natural de SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BaNT conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BaNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BaNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocacion de BaNT comprende aminoácidos 436-857 de una variante del dominio de traslocacion de BaNT de origen no natural de SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BaNT conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BaNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BaNT, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de traslocacion de SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de traslocacion de SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 436-857 de SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 436-857 de SEQ ID NO: 23.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 1 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 436-857 de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 436-857 de SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 436-857 de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 436-857 de SEQ ID NO: 23.

En otra modalidad, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de BuNT. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocación de BuNT comprende los dominios de traslocación de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de traslocación de BuNT comprende los aminoácidos 427-847 de SEQ ID NO: 24. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BuNT comprende una variante del dominio de traslocación de BuNT de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BuNT o un dominio de traslocación de un subtipo de BuNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocación de BuNT comprende una variante del dominio de traslocación de BuNT de origen natural de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocación de una isoforma de BuNT o un dominio de traslocación de un subtipo de BuNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocacion de BuNT comprende aminoácidos 427-847 de una variante del dominio de traslocacion de BuNT de origen natural de SEQ ID NO: 24, tal como, por ejemplo, un dominio de traslocacion de una isoforma de BuNT o un dominio de traslocacion de un subtipo de BuNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BuNT comprende una variante del dominio de traslocacion de BuNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BuNT conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BuNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BuNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de traslocacion de BuNT comprende el dominio de traslocacion de una variante del dominio de traslocacion de BuNT de origen no natural de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocacion de BuNT conservadora, una variante del dominio de traslocacion de BuNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocacion de BuNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de traslocacion de BuNT comprende aminoácidos 427-847 de una variante del dominio de traslocacion de BuNT de origen no natural de SEQ ID NO: 24, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de traslocación de BuNT conservadora, una variante del dominio de traslocación de BuNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de traslocación de BuNT, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 427-847 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 427-847 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 427-847 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 427-847 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de traslocación de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de traslocación de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 427-847 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 427-847 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

Los aspectos de la presente descripción proporcionan, en parte, un dominio de unión. Tal como se usa en la presente, el término "dominio de unión" es sinónimo de "ligando" o "resto dirigido" y se refiere a cualquier molécula que pueda interactuar preferentemente con otra molécula presente en la superficie de una célula en condiciones fisiológicas. La molécula de superficie celular puede comprender un polipéptido, un polisacárido, un lipido, o puede tener características estructurales de más de uno de estos. Tal como se usa en la presente, el término "interactúa preferentemente" se refiere a una molécula capaz de unirse a su receptor diana en condiciones fisiológicas o condiciones in vitro que se aproximan sustancialmente a condiciones fisiológicas, en un grado estadísticamente mayor con relación a otros receptores no diana. Con referencia al dominio de unión a la toxina de Clostridium descrito en la presente descripción, existe una unión discriminatoria del dominio de unión a la toxina de Clostridium con su receptor análogo con relación a otros receptores. Con referencia al dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium descrito en la presente descripción, existe una unión discriminatoria del dominio de unión a la toxina de Clostridium con su receptor análogo con relación a otros receptores.

Por lo tanto, en una modalidad, un dominio de unión que se une selectivamente a un receptor diana tiene una constante de disociación de equilibrio (KD) mayor que la de un receptor diana con respecto a un receptor no diana, en, por ejemplo, al menos una vez, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000, al menos 10,000, o al menos 100,000 veces.

Los aspectos de la presente descripción proporcionan, en parte, un dominio de unión a las toxinas de Clostridium. Tal como se usa en la presente, el término "dominio de unión a la toxinas de Clostridium" se refiere a cualquier polipéptido de toxinas de Clostridium que puede ejecutar el paso de unión del proceso de intoxicación que inicia el mecanismo general de internalización mediante el cual la toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción intoxica una célula diana. Ejemplos no taxativos de un dominio de unión a la toxina de Clostridium incluyen, por ejemplo, un dominio de unión a BoNT/A, un dominio de unión a BoNT/B, un dominio de unión a BoNT/Cl, un dominio de unión a BoNT/D, un dominio de unión a BoNT/E, un dominio de unión a BoNT/F, un dominio de unión a BoNT/G, un dominio de unión a TeNT, un dominio de unión a BaNT y un dominio de unión a BuNT. Otros ejemplos no taxativos del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium incluyen, por ejemplo, aminoácidos 874-1296 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 869-1291 de SEQ ID NO: 3, aminoácidos 865-1291 de SEQ ID NO: 4, aminoácidos 848-1252 de SEQ ID NO: 5, aminoácidos 866-1274 de SEQ ID NO: 6, aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 7, aminoácidos 882-1315 de SEQ ID NO: 8, aminoácidos 858-1268 de SEQ ID NO: 9, aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 10.

Un dominio de unión a la toxina de Clostridium incluye, de modo no taxativo, variantes de dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de origen natural, tal como, por ejemplo, isoformas del dominio de unión a la toxina de Clostridium y subtipos del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium; variantes del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen no natural, tales como, por ejemplo, variantes del dominio de unión a la toxina de Clostridium conservadoras, variantes del dominio de unión a la toxina de Clostridium no conservadoras, fragmentos activos del dominio de unión a la toxina de Clostridium de estos o cualquier combinación de estos.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium", ya sea de origen natural o no natural, se refiere a un dominio de unión a la toxina de Clostridium que tiene al menos un cambio de aminoácidos desde la región correspondiente de las secuencias de referencia descritas (Tabla 1) y se puede describir como porcentaje de identidad con la región correspondiente de esa secuencia de referencia. A menos que se indique expresamente, las variantes de dominio de unión a la toxina de Clostridium útiles para poner en práctica las modalidades descritas son variantes que ejecutan el paso de traslocacion del proceso de intoxicación que media la traslocacion de la cadena ligera de la toxina de Clostridium. Como ejemplos no taxativos, una variante del dominio de unión de BoNT/A tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 874-1296 de SEQ ID NO: 1; una variante del dominio de unión de BoNT/B tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6; una variante del dominio de unión de BoNT/Cl tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 869-1291 de SEQ ID NO: 11; una variante del dominio de unión de BoNT/D tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 865-1291 de SEQ ID NO: 13; una variante del dominio de unión de BoNT/E tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 848-1252 de SEQ ID NO: 15; una variante del dominio de unión de BoNT/F tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 866-1274 de SEQ ID NO: 18; una variante del dominio de unión de BoNT/G tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 21; una variante del dominio de unión de TeNT tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 882-1315 de SEQ ID NO: 22; una variante del dominio de unión de BaNT tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 858-1268 de SEQ ID NO: 23; una variante del dominio de unión de BuNT tendrá al menos una diferencia de aminoácidos, tal como por ejemplo, una sustitución, supresión o adición de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 24.

Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada serotipo de toxina de Clostridium puede haber variantes del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, actualmente hay cinco subtipos de' BoNT/A, BoNT/Al, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5, con subtipos específicos de dominio de unión que muestran alrededor de 83% a 97% de identidad de aminoácidos en comparación con el subtipo del dominio de unión a BoNT/A de SEQ ID NO: 1. Como otro ejemplo, actualmente hay cinco subtipos de BoNT/A, BoNT/Al , BoNT/A2 , BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5 , con subtipos específicos de dominio de unión que muestran alrededor de 83% a 97% de identidad de aminoácidos en comparación con el subtipo del dominio de unión a BoNT/A de SEQ ID NO: 1. Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural" se refiere cualquier dominio de unión a la toxina de Clostridium producido por un proceso de origen natural incluyendo, de modo no taxativo, isoformas del dominio de unión a la toxina de Clostridium producidas a partir de transcripciones alternativamente empalmadas, isoformas del dominio de unión a la toxina de Clostridium producidas por mutación espontánea y subtipos del dominio de unión a la toxina de Clostridium. Una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural, y puede sustituir al dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción.

Un ejemplo no taxativo de una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural es una isoforma del dominio de unión a la toxina de Clostridium tal como, por ejemplo, una isoforma del dominio de unión de BoNT/A, una isoforma del dominio de unión de BoNT/B, una isoforma del dominio de unión de BoNT/Cl, una isoforma del dominio de unión de BoNT/D, una isoforma del dominio de unión de BoNT/E, una isoforma del dominio de unión de BoNT/F, una isoforma del dominio de unión de BoNT/G, una isoforma de dominio de unión de TeNT, una isoforma de dominio de unión de BaNT y una isoforma del dominio de unión de BuNT. Otro ejemplo no taxativo de una variante de dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural es un subtipo del dominio de traslocación de la toxina de Clostridium tal como, por ejemplo, un dominio de unión del subtipo BoNT/Al, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5; un dominio de unión del subtipo BoNT/Bl , BoNT/B2 , BoNT/B bivalente y BoNT/B no proteolítico; un dominio de unión del subtipo BoNT/Cl-1 y BoNT/Cl-2; un dominio de unión del subtipo BoNT/El, BoNT/E2 and BoNT/E3; y a un dominio de unión del subtipo BoNT/Fl, BoNT/F2 , y BoNT/F3 y un dominio de unión del subtipo de BuNT-1 y BuNT-2.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen no natural" se refiere a cualquier dominio de unión a la toxina de Clostridium producido con la ayuda de la manipulación humana, incluyendo, de modo no taxativo, dominios de traslocación de la toxina de Clostridium producidos mediante modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y dominios de unión a la toxina de Clostridium producidos mediante síntesis química. Los ejemplos no taxativos de las variantes del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen no natural incluyen, por ejemplo, variantes del dominio de unión a la toxina de Clostridium conservadoras, variantes del dominio de unión a la toxina de Clostridium no conservadoras, variantes quiméricas del dominio de unión a la toxina de Clostridium y fragmentos activos del dominio de unión a la toxina de Clostridium.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium conservadora" se refiere a un dominio de unión a la toxina de Clostridium que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia (Tabla 1) . Los ejemplos de propiedades incluyen, de modo no taxativo, similar tamaño, topografía, carga, hidro.fobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de unión a hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares o cualquier combinación de estos. Una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium conservadora, y puede sustituir al dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Los ejemplos no taxativos de una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium conservadora incluyen, por ejemplo, variantes del dominio de traslocación de BoNT/A conservadora, variantes del dominio de unión de BoNT/B conservadoras, variantes del dominio enzimático de BoNT/Cl conservadoras, variantes del dominio de unión de BoNT/D conservadoras, variantes del dominio de unión de BoNT/E conservadoras, variantes del dominio de traslocación de BoNT/F conservadoras, variantes del dominio de unión de 1 BoNT/G conservadoras, variantes del dominio de unión de TeNT conservadoras, variantes del dominio de unión de BaNT conservadoras y variantes del dominio de unión de BuNT conservadoras .

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium no conservadora" se refiere a un dominio de unión a la toxina de Clostridium donde 1) se suprime al menos un aminoácido del dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium no conservadora; 2) se agrega al menos un aminoácido al dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa el dominio de unión a la toxina de Clostridium no conservadora; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia (Tabla 1) . Una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium no conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium no conservadora, y puede sustituir al dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Los ejemplos no taxativos de una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium no conservadora incluyen, por ejemplo, variantes del dominio de unión de BoNT/A no conservadora, variantes del dominio de unión de BoNT/B no conservadoras, variantes del dominio de unión de BoNT/Cl no conservadoras, variantes del dominio de unión de BoNT/D no conservadoras, variantes del dominio de unión de BoNT/E no conservadoras, variantes del dominio de unión de BoNT/F no conservadoras, variantes del dominio de unión de BoNT/G no conservadoras, variantes del dominio de unión de TeNT no conservadoras, variantes del dominio de unión de BaNT no conservadoras y variantes del dominio de unión de BuNT no conservadoras.

Tal como se usa en la presente, el término "fragmento activo del dominio de unión a la toxina de Clostridium " se refiere a cualquiera de una variedad de fragmentos activos de la toxina de Clostridium que comprenden el dominio de unión que pueden ser útiles en aspectos de la presente descripción con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de la LC desde vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana y por lo tanto participar en la ejecución del mecanismo celular global mediante el cual una toxina de Clostridium escinde proteolíticamente un sustrato. Los dominios de unión de las cadenas pesadas de las toxinas de Clostridium tienen aproximadamente 400-440 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de unión (Tabla 1). Las investigaciones han demostrado que la longitud completa de un dominio de unión de la cadena pesada de una toxina de Clostridium no es necesaria para la actividad de traslocación del dominio de unión. Por lo tanto, los aspectos de la presente modalidad incluyen un dominio de unión a la toxinas de Clostridium que tiene una longitud de, por ejemplo, al menos 350, 375, 400 o 425 aminoácidos. Otros aspectos de la presente modalidad incluyen un dominio de unión a la toxinas de Clostridium que tiene una longitud de, por ejemplo, como máximo 350, 375, 400 o 425 aminoácidos .

Cualquiera de una variedad de métodos de alineación de secuencia se pueden usar para determinar el porcentaje de identidad de variantes de dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural, variantes de dominio de unión de toxina de Clostridium de origen no natural e incluyendo, de modo no taxativo, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, por ejemplo, métodos de enfoque de segmento. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procesos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción comprende un dominio de unión a las toxinas de Clostridium. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma del dominio de unión a la toxina de Clostridium o un subtipo del dominio de unión a la toxina de Clostridium. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium conservadora, una variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión a la toxina de Clostridium, o cualquier combinación de estos.

En otra modalidad, un aminoácido hidrofóbico en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido hidrofóbico. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos incluyen, por ejemplo, C, F, I, L, M, V y . En otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, por ejemplo, A, I, L, P y V. En aun otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En aun otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido acumulado en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido acumulado. Los ejemplos de aminoácidos acumulados incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En un aspecto adicional de esta modalidad, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, por ejemplo, D, E, K, N, Q y R. En un aspecto adicional de esta modalidad, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, por ejemplo, A, H, G, P, S, T e Y. En un aspecto adicional de esta modalidad, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se .puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, por ejemplo, K, R y H. En otro aspecto adicional de esta modalidad, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, por ejemplo, D y E. En otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa., Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, por ejemplo, A, D, G, N, P, S y T. En aun otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido ramificado C-beta en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido ramificado C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados C-beta incluyen, por ejemplo, I, T y v .

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de BoNT/A. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/A comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/A comprende los aminoácidos 874-1296 de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/A comprende una variante del dominio de unión de BoNT/A de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/A o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/A comprende una variante del dominio de unión de BoNT/A de origen natural de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/A o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/A comprende aminoácidos 874-1296 de una variante del dominio de unión de BoNT/A de origen natural de SEQ ID NO: 1, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/A o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/A. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/A comprende una variante del dominio de unión de BoNT/A de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/A conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/A, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/A comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de BoNT/A de origen no natural de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/A conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/A, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/A comprende aminoácidos 874-1296 de una variante del dominio de unión de BoNT/A de origen no natural de SEQ ID NO: 1, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/A conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/A no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/A, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 874-1296 de SEQ ID NO: 1; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 874-1296 de SEQ ID NO: 1.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 874-1296 de SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 874-1296 de SEQ ID NO: 1. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos 64 contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 874-1296 de SEQ ID NO: 1; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 874-1296 de SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de BoNT/B. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/B comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/B comprende los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende una variante del dominio de unión de BoNT/B de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/B o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/B comprende una variante del dominio de unión de BoNT/B de origen natural de SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/B o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/B comprende aminoácidos 861-1291 de una variante del dominio de unión de BoNT/B de origen natural de SEQ ID NO: 6, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/B o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/B. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende una variante del dominio de unión de BoNT/B de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/B conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/B, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de BoNT/B de origen no natural de SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/B conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/B, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/B comprende aminoácidos 861-1291 de una variante del dominio de unión de BoNT/B de origen no natural de SEQ ID NO: 6, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/B conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/B no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/B, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 861-1291 de SEQ ID NO: 6.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de BoNT/Cl. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/Cl comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/Cl comprende los aminoácidos 869-1291 de SEQ ID NO: 11. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/Cl comprende una variante del dominio de unión de BoNT/Cl de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/Cl o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/Cl. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/Cl comprende una variante del dominio de unión de BoNT/Cl de origen natural de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/Cl o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/Cl. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/Cl comprende aminoácidos 869-1291 de una variante del dominio de unión de BoNT/Cl de origen natural de SEQ ID NO: 11, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/Cl o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/Cl. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/Cl comprende una variante del dominio de unión de BoNT/Cl de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/Cl conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/Cl, o cualguier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/Cl comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de BoNT/Cl de origen no natural de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/Cl conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/Cl, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/Cl comprende aminoácidos 869-1291 de una variante del dominio de unión de BoNT/Cl de origen no natural de SEQ ID NO: 11, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/Cl conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/Cl no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/Cl, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 869-1291 de SEQ ID NO: 11; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 869-1291 de SEQ ID NO: 11.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 869-1291 de SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 869-1291 de SEQ ID NO: 11. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/Cl comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 869-1291 de SEQ ID NO: 11; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 869-1291 de SEQ ID NO: 11.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de BoNT/D. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/D comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/D comprende los aminoácidos 865-1291 de SEQ ID NO: 13. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/D comprende una variante del dominio de unión de BoNT/D de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/D o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/D comprende una variante del dominio de unión de BoNT/D de origen natural de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/D o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/D comprende aminoácidos 865-1291 de una variante del dominio de unión de BoNT/D de origen natural de SEQ ID NO: .13, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/D o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/D. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/D comprende una variante del dominio de unión de BoNT/D de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/D conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/D, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/D comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de BoNT/D de origen no natural de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/D conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/D, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/D comprende aminoácidos 865-1291 de una variante del dominio de unión de BoNT/D de origen no natural de SEQ ID NO: 13, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/D conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/D no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/D, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 865-1291 de SEQ ID NO: 13; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 865-1291 de SEQ ID NO: 13.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 865-1291 de SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 865-1291 de SEQ ID NO: 13. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 865-1291 de SEQ ID NO: 13; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 865-1291 de SEQ ID NO: 13.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de BoNT/E. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/E comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/E comprende los aminoácidos 848-1252 de SEQ ID NO: 15. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/E comprende una variante del dominio de unión de BoNT/E de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/E o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/E comprende una variante del dominio de unión de BoNT/E de origen natural de SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/E o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/E comprende aminoácidos 848-1252 de una variante del dominio de unión de BoNT/E de origen natural de SEQ ID NO: 15, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/E o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/E. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/E comprende una variante del dominio de unión de BoNT/E de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/E conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/E, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/E comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de BoNT/E de origen no natural de SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/E conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/E, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/E comprende aminoácidos 848-1252 de una variante del dominio de unión de BoNT/E de origen no natural de SEQ ID NO: 15, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/E conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/E no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/E, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 848-1252 de SEQ ID NO: 15; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 8481252 de SEQ ID NO: 15.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 848-1252 de SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 848-1252 de SEQ ID NO: 15. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 848-1252 de SEQ ID NO: 15; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 848-1252 de SEQ ID NO: 15.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de BoNT/F. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/F comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/F comprende los aminoácidos 866-1274 de SEQ ID NO: 18. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/F comprende una variante del dominio de unión de BoNT/F de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/F o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/F comprende una variante del dominio de unión de BoNT/F de origen natural de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/F o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/F comprende aminoácidos 866-1274 de una variante del dominio de unión de BoNT/F de origen natural de SEQ ID NO: 18, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/F o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/F. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/F comprende una variante del dominio de unión de BoNT/F de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/F conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/F, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/F comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de BoNT/F de origen no natural de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/F conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/F, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/F comprende aminoácidos 866-1274 de una variante del dominio de unión de BoNT/F de origen no natural de SEQ ID NO: 18, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/F conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/F no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/F, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 866-1274 de SEQ ID NO: 18; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 8661274 de SEQ ID NO: 18.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos,, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos,, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos,, con relación a los aminoácidos 866-1274 de SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, , con relación a los aminoácidos 866-1274 de SEQ ID NO: 18. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos,, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, , con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos,, con relación a los aminoácidos 866-1274 de SEQ ID NO: 18; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos,, con relación a los aminoácidos 866-1274 de SEQ ID NO: 18.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de BoNT/G. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/G comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/G comprende los aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 21. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/G comprende una variante del dominio de unión de BoNT/G de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/G o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/G comprende una variante del dominio de unión de BoNT/G de origen natural de SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/G o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/G comprende aminoácidos 866-1297 de una variante del dominio de unión de BoNT/G de origen natural de SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BoNT/G o un dominio de unión de un subtipo de BoNT/G. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/G comprende una variante del dominio de unión de BoNT/G de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/G conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/G, o cualguier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/G comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de BoNT/G de origen no natural de SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/G conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/G, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BoNT/G comprende aminoácidos 866-1297 de una variante del dominio de unión de BoNT/G de origen no natural de SEQ ID NO: 21, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BoNT/G conservadora, una variante del dominio de unión de BoNT/G no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BoNT/G, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 21; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 21.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, , con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, , con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos,, con relación a los aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, , con relación a los aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 21. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos,, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos,, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 21. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 21; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 866-1297 de SEQ ID NO: 21.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de TeNT . En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de TeNT comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de TeNT comprende los aminoácidos 882-1315 de SEQ ID NO: 22. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de TeNT comprende una variante del dominio de unión de TeNT de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de TeNT o un dominio de unión de un subtipo de TeNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de TeNT comprende una variante del dominio de unión de TeNT de origen natural de SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de TeNT o un dominio de unión de un subtipo de TeNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de TeNT comprende aminoácidos 882-1315 de una variante del dominio de unión de TeNT de origen natural de SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de TeNT o un dominio de unión de un subtipo de TeNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de TeNT comprende una variante del dominio de unión de TeNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de TeNT conservadora, una variante del dominio de unión de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de TeNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de TeNT comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de TeNT de origen no natural de SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de TeNT conservadora, una variante del dominio de unión de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de TeNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de TeNT comprende aminoácidos 882-1315 de una variante del dominio de unión de TeNT de origen no natural de SEQ ID NO: 22, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de TeNT conservadora, una variante del dominio de unión de TeNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de TeNT, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 882-1315 de SEQ ID NO: 22; o como máximo 70%, como' máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 882-1315 de SEQ ID NO: 22.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 8821315 de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 882-1315 de SEQ ID NO: 22. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o 3 sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 22. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de TeNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 882-1315 de SEQ ID NO: 22; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 882-1315 de SEQ ID NO: 22.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de BaNT . En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BaNT comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de BaNT comprende los aminoácidos 858-1268 de SEQ ID NO: 23. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BaNT comprende una variante del dominio de unión de BaNT de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BaNT o un dominio de unión de un subtipo de BaNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BaNT comprende una variante del dominio de unión de BaNT de origen natural de SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BaNT o un dominio de unión de un subtipo de BaNT . En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BaNT comprende aminoácidos 858-1268 de una variante del dominio de unión de BaNT de origen natural de SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BaNT o un dominio de unión de un subtipo de BaNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BaNT comprende una variante del dominio de unión de BaNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BaNT conservadora, una variante del dominio de unión de BaNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BaNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BaNT comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de BaNT de origen no natural de SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BaNT conservadora, una variante del dominio de unión de BaNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BaNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BaNT comprende aminoácidos 858-1268 de una variante del dominio de unión de BaNT de origen no natural de SEQ ID NO: 23, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BaNT conservadora, una variante del dominio de unión de BaNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BaNT, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 858-1268 de SEQ ID NO: 23; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 858-1268 de SEQ ID NO: 23.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 858-1268 de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 858-1268 de SEQ ID NO: 23. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 23. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de BaNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 858-1268 de SEQ ID NO: 23; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 858-1268 de SEQ ID NO: 23.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión de BuNT. En un aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BuNT comprende los dominios de unión de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En otros aspectos de la presente modalidad, el dominio de unión de BuNT comprende los aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 24. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BuNT comprende un una variante del dominio de unión de BuNT de origen natural, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BuNT o un dominio de unión de un subtipo de BuNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BuNT comprende una variante del dominio de unión de BuNT de origen natural de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BuNT o un dominio de unión de un subtipo de BuNT. En otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BuNT comprende aminoácidos 848-1251 de una variante del dominio de unión de BuNT de origen natural de SEQ ID NO: 24, tal como, por ejemplo, un dominio de unión de una isoforma de BuNT o un dominio de unión de un subtipo de BuNT. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BuNT comprende una variante del dominio de unión de BuNT de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BuNT conservadora, una variante del dominio de unión de BuNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BuNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión de BuNT comprende el dominio de unión de una variante del dominio de unión de BuNT de origen no natural de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BuNT conservadora, una variante del dominio de unión de BuNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BuNT, o cualquier combinación de estos. En aun otro aspecto de la presente modalidad, el dominio de unión de BuNT comprende aminoácidos 848-1251 de una variante del dominio de unión de BuNT de origen no natural de SEQ ID NO: 24, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión de BuNT conservadora, una variante del dominio de unión de BuNT no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión de BuNT, o cualquier combinación de estos.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con el dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene una identidad de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con los aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con los aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por. ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a los aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación al dominio de unión de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25. En otros aspectos adicionales de la presente modalidad, un dominio de unión de BuNT comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, o 100 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a los aminoácidos 848-1251 de SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

Los aspectos de la presente descripción proporcionan, en parte, un dominio de unión a las toxinas que no son de Clostridium. Tal como se usa en la presente, el término "dominio de unión a la toxinas que no son de Clostridium" se refiere a cualquier polipéptido que puede ejecutar el paso de unión del proceso de intoxicación que inicia el mecanismo general de internalización mediante el cual la toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción intoxica una célula diana. Ejemplos de dominios de unión se describen en por ejemplo, Keith A. Foster et ál., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, Patente estadounidense 5,989,545; Clifford C. Shone et ál., Recombinant Toxin Fragments, Patente estadounidense 6,461,617; Conrad P. Quinn et ál., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, Patente estadounidense 6,632,440; Lance E. Steward et ál., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis , Patente estadounidense 6,843,998; J. Oliver Dolly et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, Patente estadounidense 7,132,259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Patente estadounidense Publication 2002/0037833; Keith A. Foster et ál., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, Publicación de patente estadounidense 2003/0180289; Lance E. Steward et ál., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Publicación de patente estadounidense 2006/0211619; Keith A. Foster et ál., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, Publicación de patente estadounidense 2008/0187960; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non- 3 Clostridial Toxin Target Cells, Solicitud de patente estadounidense N° 11/776,075; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates , Solicitud de patente estadounidense N° 11/792,210; cada una de las cuales se incorpora a la presente mediante esta referencia.

Un dominio de unión a la toxina que no es Clostridium incluye, de modo no taxativo, variantes de dominio de unión de la toxina que no es de Clostridium de origen natural, tal como, por ejemplo, isoformas del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y subtipos del dominio de unión de la toxina de Clostridium; variantes del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de origen no natural, tales como, por ejemplo, variantes del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium conservadoras, variantes del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium no conservadoras, quimeras del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, fragmentos activos del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de estos o cualquier combinación de estos.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium", ya sea de origen natural o no natural, se refiere a un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium que tiene al menos un cambio de aminoácidos desde la región correspondiente de una secuencia de referencia y se puede describir como porcentaje de identidad con la región correspondiente de esa secuencia de referencia. Salvo que se indique expresamente, las variantes del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, útiles para la puesta en práctica de las modalidades descritas, son variantes que ejecutan el paso de unión del proceso de intoxicación.

Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium puede haber variantes de origen natural que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de origen natural" se refiere a cualquier dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium producido por un proceso de origen natural incluyendo, de modo no taxativo, isoformas del dominio de unión a la toxina de Clostridium producidas a partir de transcripciones alternativamente empalmadas, isoformas del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium producidas por mutación espontánea. Una variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de origen natural puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de unión a la toxina de Clostridium de origen natural, y puede sustituir al dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Un ejemplo no taxativo de una variante del dominio de unión de las toxinas que no es de Clostridium es una isoforma del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium. Ejemplos no taxativos de una isoforma del dominio de unión de una toxina que no es de Clostridium incluye, por ejemplo, isoformas del dominio de unión opioide, isoformas del dominio de unión a taquiquinina, isoformas del dominio de unión a melanocortina , isoformas del dominio de unión a galanina, isoformas del dominio de unión granina, isoformas del dominio de unión al péptido relacionado con el neuropéptido Y, isoformas del dominio de unión a la neurohormona, isoformas del dominio de unión a la citocina neuroreguladora, isoformas del dominio de unión al péptido de quinina, isoformas del dominio de unión al factor de crecimiento e isoformas del dominio de unión a la hormona tipo glucagón.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de origen no natural" se refiere a cualquier dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium producido con la ayuda de la manipulación humana, incluyendo, de modo no taxativo, dominios de unión de la toxina que no es de Clostridium producidos mediante modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y dominios de unión a la toxina que no es de Clostridium producidos mediante síntesis química. Los ejemplos no taxativos de las variantes del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de origen no natural incluyen, por ejemplo, variantes del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium conservadoras, variantes del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium no conservadoras, variantes quiméricas del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y fragmentos activos del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium conservadora" se refiere a un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia. Los ejemplos de propiedades incluyen, de modo no taxativo, similar tamaño, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de unión a hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares o cualquier combinación de estos. Una variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium conservadora, y puede sustituir al dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Ejemplos no taxativos de una isoforma del dominio de unión de una toxina que no es de Clostridium conservadora incluyen, por ejemplo, isoformas del dominio de unión a opioide, isoformas del dominio de unión a taquiquinina, isoformas del dominio de unión a melanocortina, isoformas del dominio de unión a galanina, isoformas del dominio de unión a granina, isoformas del dominio de unión al péptido relacionado con el neuropéptido Y, isoformas del dominio de unión a la neurohormona, isoformas del dominio de unión a la citocina neuroreguladora, isoformas del dominio de unión al péptido de quinina, isoformas del dominio de unión al factor de crecimiento e isoformas del dominio de unión a la hormona tipo glucagón.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium no conservadora" se refiere a un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium donde 1) se suprime al menos un aminoácido del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium no conservadora; 2) se agrega al menos un aminoácido al dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de referencia en el cual se basa el dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium no conservadora; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio de unión a la toxina de Clostridium de referencia. Una variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium no conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de referencia en el cual se basa la variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium no conservadora, y puede sustituir al dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Ejemplos no taxativos de una variante del dominio de unión de una toxina que no es de Clostridium no conservadora incluye, por ejemplo, variantes del dominio de unión a opioide no conservadoras, variantes del dominio de unión a taquiquinina no conservadoras, variantes del dominio de unión a melanocortina no conservadoras, variantes del dominio de unión a galanina no conservadoras, isoformas del dominio de unión a granina no conservadoras, variantes del dominio de unión al péptido relacionado con el neuropéptido Y no conservadoras, variantes del dominio de unión a la neurohormona no conservadoras, variantes del dominio de unión a la citocina neuroreguladora no conservadoras, variantes del dominio de unión al péptido de quinina no conservadoras, variantes del dominio de unión al factor de crecimiento no conservadoras y variantes del dominio de unión a la hormona tipo glucagón no conservadoras.

Tal como se usa en la presente, el término "fragmento activo del dominio de unión a la toxina de Clostridium " se refiere a cualquier variedad de fragmentos de la toxina de Clostridium que comprenden el dominio de unión, puede ser útil en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos del dominio de unión puedan interactuar preferentemente con el receptor análogo, y por lo tanto participar en la ejecución del mecanismo celular global mediante el cual una toxina de Clostridium escinde proteoliticamente un sustrato.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción comprende un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium. En un aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende una variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende una variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium conservadora, una variante del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium no conservadora, un fragmento activo del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, o cualquier combinación de estos.

En otra modalidad, un aminoácido hidrofóbico en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido hidrofóbico. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos incluyen, por ejemplo, C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido alifático en una posición particular en la cadena polipeptídica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, por ejemplo, A, I, L, P y V. En aun otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido aromático en una posición particular en la cadena polipeptídica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En aun otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido acumulado en una posición particular en la cadena polipeptídica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido acumulado. Los ejemplos de aminoácidos acumulados incluyen, por ejemplo, F, H, e Y. En un aspecto adicional de esta modalidad, un aminoácido polar en una posición particular en la cadena polipeptídica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, por ejemplo, D, E, K, N, Q y R. En un aspecto adicional de esta modalidad, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en la cadena polipeptídica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, por ejemplo, A, H, G, P, S, T e Y. En un aspecto adicional de esta modalidad, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, por ejemplo, K, R y H. En otro aspecto adicional de esta modalidad, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, por ejemplo, D y E. En otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido pequeño en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa., Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, por ejemplo, A, D, G, N, P, S y T. En aun otro aspecto de esta modalidad, un aminoácido ramificado C-beta en una posición particular en la cadena polipeptidica del dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium se puede sustituir por otro aminoácido ramificado C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados C-beta incluyen, por ejemplo, I, T y V.

En otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión a opioide, tal como, por ejemplo, una encefalina, una endomorfina, una endorfina, una dinorfina, una nociceptina o una hemorfina. En aun otra modalidad, un dominio de unión a la toxina de Clostridium comprende un dominio de unión a taquiquinina, tal como, por ejemplo, una sustancia P, un neuropéptido K (NPK) , un neoropéptido gamma (NP gamma) , una neuroquinina A (NKA) , sustancia K, neuroquinina alfa, neuromedina L) , una neuroquinina B (NKB) , hemoquinina o una endoquina. En aun otro aspecto de la presente modalidad, una toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión a melanocortina , tal como, por ejemplo, una hormona estimuladora de melanocitos, adrenocorticotropina o una lipotropina. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión a galanina, tal como, por ejemplo, una galanina o un péptido asociado al mensaje de galanina. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión a granina, tal como, por ejemplo, una Cromogranina A, una Cromogranina B, o una Cromogranina C. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión a péptido relacionado con neuropéptido Y, tal como, por ejemplo, un Neuropéptido Y, un Péptido YY, péptido Pancreático o un icosapéptido Pancreático. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión a neurohormona, tal como, por ejemplo, una hormona que libera corticotropina, una hormona paratiroidea, una hormona que libera tirotropina o una somatoestatina . En aun otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión a la citocina neuroreguladora , tal como, por ejemplo, un factor neurotrófico ciliar, una glicoforina A, un factor inhibidor de leucemia, un factor de diferenciación colinérgica, una interleucina, una onoestatina M, una cardiotrofina 1, una citocina tipo cardiotrofina, o, una neuroleucina . En un aspecto adicional de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión al péptido de quinina, tal como, por ejemplo, una bradiquinina, un calidina, una bradiquinina desArg9 o una bradiquinina desArglO. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión al factor de crecimiento, tal como, por ejemplo, un dominio de unión al factor de crecimiento de fibroblastos, un dominio de unión al factor de crecimiento nervioso, un dominio de unión al factor de crecimiento de insulina, un dominio de unión al factor de crecimiento epidérmico, un dominio de unión al factor de crecimiento endotelial vascular, un dominio de unión al factor de crecimiento neurotrófico derivado del cerebro, un dominio de unión al factor neurotrófico derivado del crecimiento, un dominio de unión a neurotrofina, tal como, por ejemplo, una neurotrofina 3, una neurotrofina 4/5, un dominio de unión al péptido activador de la cabeza, un dominio de unión a la neurturina, un dominio de unión a la persefrina, un dominio de unión a artemina, un factor de crecimiento de transformación dominio de unión ß, tal como, por ejemplo, un TGFpi, un TGFP2, un TGF 3 o un TGFP4, un dominio de unión a la proteina morfogénica, tal como, por ejemplo, un BMP2, un BMP3, un BMP4, un BMP5, un B P6, un BMP7, un BMP8 o un BMP10, un dominio de unión del factor de diferenciación de crecimiento, tal como, por ejemplo, un GDF1, un GDF2, un GDF3, un GDF5, un GDF6, un GDF7, un GDF8 , un GDF10, un GDF11 o un GDF15, o un dominio de unión de activina, tal como, por ejemplo, una activina A, una activina B, una activina C, una activina E o una ihhibina A. En otro aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clsotridium comprende un dominio de unión a la hormona tipo glucagón, tal como, por ejemplo, una secretina, un péptido tipo glucagón, similar a GLP-1 y GLP-2, un . dominio de unión al péptido de activación de ciclasa adenilato, un dominio de unión a la hormona liberadora de hormona de crecimiento, dominio de unión al péptido intestinal vasoactivo tipo VIP1 o VIP2, un dominio de unión al polipéptido inhibidor gástrico, un dominio de unión al péptido de intestino péptidoviceral relacionado con calcitonina como una gastrina, un péptido liberador de gastrina o una colecistoquinina, o un dominio de unión al péptido PAR como un péptido PARI, un péptido PAR2, un péptido PAR3 o un péptido PAR4.

En otra modalidad, un péptido opioide comprende un péptido encefaliña. En aspectos de la presente modalidad, un péptido encefalina comprende una Leu-encefaliña, una Met-encefalina, una et-encefaliña MRGL o una Met-encefaliña MRF. En otros aspectos de la presente modalidad, una encefalina comprende la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29.

En otros aspectos de la presente modalidad, una encefalina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una encefalina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29; o como máximo 1, 2 o 3, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una encefalina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29; o como máximo 1, 2 o 3, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29.

En otra modalidad, un péptido opioide comprende un péptido adrenomedular bovino 22 (BAM22, por sus siglas en inglés). En aspectos de la presente modalidad, un BAM22 comprende un péptido BAM22 (1-12), un péptido BA 22 (6-22), un péptido BAM22 (8-22), o un péptido BAM22 (1-22). En otros aspectos de la presente modalidad, un BAM22 comprende aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22, o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 31; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 33; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 35.

En aun otros aspectos de la presente modalidad, un péptido BAM22 comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % con los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 31; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 33; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 35; o como máximo 70 %, como máximo 75 %, como máximo 80 %, como máximo 85 %, como máximo 90 %, o como máximo 95 % con los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 31; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 33; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 35.

En aun otros aspectos de la presente modalidad, un péptido BAM22 comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 31; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 33; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 35; o como máximos 1, 2, 3, 4, o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 31; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 33; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 35.

En aun otros aspectos de la presente modalidad, un péptido BAM22 comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a los aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 31; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 33; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 35; o como máximos 1, 2, 3, 4, o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a los aminoácidos \- \2 , aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 71; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 33; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 1-12, aminoácidos 6-22, aminoácidos 8-22 o aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 35.

En otra modalidad, un péptido opioide comprende un péptido endomorfina. En aspectos de la presente modalidad, un péptido de endomorfina comprende una endomorfina-1 o una endomorfina-2. En otros aspectos de la presente modalidad, una endomorfina comprende la SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37.

En otros aspectos de la presente modalidad, una endomorfina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una endomorfina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37; o como máximo 1, 2 o 3, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una endomorfina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37; o como máximo 1, 2 o 3, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37.

En otra modalidad, un péptido opioide comprende un péptido endorfina. En aspectos de la presente modalidad, un péptido de endorfina comprende una endorfina- , una neoendorfina-a, una endorfina-ß, una neoendorfina-ß o una endorfina-?. En otros aspectos de la presente modalidad, una endorfina comprende la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43.

En otros aspectos de la presente modalidad, una endorfina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una endorfina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una endorfina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43.

En otra modalidad, un péptido opioide comprende un péptido dinorfina. En aspectos de la presente modalidad, un péptido dinorfina comprende una dinorfina A, una dinorfina B (leumorfina) o una rimorfina. En otros aspectos de la presente modalidad, una dinorfina comprende la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 53, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, la SEQ ID NO: 73 o la SEQ ID NO: 74.

En otros aspectos de la presente modalidad, una dinorfina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 69; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 69. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una dinorfina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 69; o como máximo 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 69. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una dinorfina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 69; o como máximo 1, 2,, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 69.

En otra modalidad, un péptido opioide comprende un péptido nociceptina. En aspectos de la presente modalidad, un péptido de nociceptina comprende una nociceptina RK, una nociceptina, un neuropéptido 1, un neuropéptido 2, o un neuropéptido 3. En otros aspectos de la presente modalidad, un péptido de nociceptina comprende la SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 78, la SEQ ID NO: 79, la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 84.

En otros aspectos de la presente modalidad, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 78, la SEQ ID NO: 79, la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 84; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 78, la SEQ ID NO: 79, la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 84. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 78, la SEQ ID NO: 79, la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 84; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 78, la SEQ ID NO: 79, la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 84. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 78, la SEQ ID NO: 79, la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 84; o como máximo 1, 2,, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a SEQ ID NO: 75, la SEQ ID NO: 76, la SEQ ID NO: 77, la SEQ ID NO: 78, la SEQ ID NO: 79, la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 84.

En otra modalidad, un péptido opioide comprende un péptido hemorfina. En aspectos de la presente modalidad, un péptido hemorfina comprende un LVVH7, un VVH7, un VH7, un H7, un LVVH6 , un LVVH5 , un VVH5, un LVVH4 y un LVVH3. En otros aspectos de la presente modalidad, un péptido hemorfina comprende la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86, la SEQ ID NO: 87, la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 89, la SEQ ID NO: 90, la SEQ ID NO: 91, la SEQ ID NO: 92 o la SEQ ID NO: 93.

En otros aspectos de la presente modalidad, una hemorfina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86, la SEQ ID NO: 87, la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 89, la SEQ ID NO: 90, la SEQ ID NO: 91, la SEQ ID NO: 92 o la SEQ ID NO: 93; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86, la SEQ ID NO: 87, la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 89, la SEQ ID NO: 90, la SEQ ID NO: 91, la SEQ ID NO: 92 o la SEQ ID NO: 93. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86, la SEQ ID NO: 87, la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 89, la SEQ ID NO: 90, la SEQ ID NO: 91, la SEQ ID NO: 92 o la SEQ ID NO: 93; o como máximo 1, 2 o 3, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86, la SEQ ID NO: 87, la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 89, la SEQ ID NO: 90, la SEQ ID NO: 91, la SEQ ID NO: 92 o la SEQ ID NO: 93. En aun otros aspectos de la presente modalidad, una nociceptina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, o 3 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86, la SEQ ID NO: 87, la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 89, la SEQ ID NO: 90, la SEQ ID NO: 91, la SEQ ID NO: 92 o la SEQ ID NO: 93; o como máximo 1, 2 o 3, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86, la SEQ ID NO: 87, la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 89, la SEQ ID NO: 90, la SEQ ID NO: 91, la SEQ ID NO: 92 o la SEQ ID NO: 93.

En aun otra modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión al péptido de galanina. En aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de péptido comprende una galanina o un péptido asociado al mensaje de galanina (GMAP, por sus siglas en inglés) . En otros aspectos de la presente modalidad, un 2 5 dominio de unión de péptido galanina comprende la SEQ ID NO: 94 o la SEQ ID NO: 95.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de galanina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 94 o la SEQ ID NO: 95; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 94 o la SEQ ID NO: 95. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de galanina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 94 o la SEQ ID NO: 95; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a SEQ ID NO: 94 o la SEQ ID NO: 95. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión de galanina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 94 o la SEQ ID NO: 95; o como máximo 1, 2,, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a SEQ ID NO: 94 o la SEQ ID NO: 95.

En aun otra modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión al péptido de taquiquinina. En aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido de taquiquinina comprende una sustancia P, un neuropéptido K (NPK) , un neoropéptido gamma (NP gamma) , una neuroquinina A (NKA, sustancia K, neuroquinina alfa, neuromedina L) , una neuroquinina B (NKB) , hemoquinina o una endoquina. En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido de taquiquinina comprende la SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 97, la SEQ ID NO: 98, la SEQ ID NO: 99, la SEQ ID NO: 100, la SEQ ID NO: 101, la SEQ ID NO: 102, la SEQ ID NO: 103, la SEQ ID NO: 104, la SEQ ID NO: 105, la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido de taquiquinina comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 97, la SEQ ID NO: 98, la SEQ ID NO: 99, la SEQ ID NO: 100, la SEQ ID NO: 101, la SEQ ID NO: 102, la SEQ ID NO: 103, la SEQ ID NO: 104, la SEQ ID NO: 105, la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 97, la SEQ ID NO: 98, la SEQ ID NO: 99, la SEQ ID NO: 100, la SEQ ID NO: 101, la SEQ ID NO: 102, la SEQ ID NO: 103, la SEQ ID NO: 104, la SEQ ID NO: 105, la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido de taquiquinina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 97, la SEQ ID NO: 98, la SEQ ID NO: 99, la SEQ ID NO: 100, la SEQ ID NO: 101, la SEQ ID NO: 102, la SEQ ID NO: 103, la SEQ ID NO: 104, la SEQ ID NO: 105, la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 97, la SEQ ID NO: 98, la SEQ ID NO: 99, la SEQ ID NO: 100, la SEQ ID NO: 101, la SEQ ID NO: 102, la SEQ ID NO: 103, la SEQ ID NO: 104, la SEQ ID NO: 105, la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido de taquiquinina comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 97, la SEQ ID NO: 98, la SEQ ID NO: 99, la SEQ ID NO: 100, la SEQ ID NO: 101, la SEQ ID NO: 102, la SEQ ID NO: 103, la SEQ ID NO: 104, la SEQ ID NO: 105, la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 97, la SEQ ID NO: 98, la SEQ ID NO: 99, la SEQ ID NO: 100, la SEQ ID NO: 101, la SEQ ID NO: 102, la SEQ ID NO: 103, la SEQ ID NO: 104, la SEQ ID NO: 105, la SEQ ID NO: 106 o la SEQ ID NO: 107.

En aun otra modalidad, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium comprende un dominio de unión de al péptido relacionado con el neuropéptido Y. En aspecto de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido relacionado con el neuropéptido Y comprende un Neuropéptido Y (NPY), un Péptido YY (PYY), péptido Pancreático (PP) o un icosapéptido Pancreático (PIP) . En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido relacionado con el neuropéptido Y comprende la SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 110, la SEQ ID NO: 111 o la SEQ ID NO: 112.

En otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido relacionado con el neuropéptido Y comprende un polipéptido que tiene una identidad de aminoácido de, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 110, la SEQ ID NO: 111 o la SEQ ID NO: 112; o como máximo 70%, como máximo 75%, como máximo 80%, como máximo 85%, como máximo 90%, o como máximo 95% con la SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 110, la SEQ ID NO: 111 o la SEQ ID NO: 112. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido relacionado con el neuropéptido Y comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o la SEQ ID NO: 112; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos no contiguos, con relación a SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 110, la SEQ ID NO: 111 o la SEQ ID NO: 112. En aun otros aspectos de la presente modalidad, un dominio de unión al péptido relacionado con el neuropéptido Y comprende un polipéptido que tiene, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 110, la SEQ ID NO: 111 o la SEQ ID NO: 112; o como máximo 1, 2,, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos contiguos, con relación a SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109, la SEQ ID NO: 110, la SEQ ID NO: 111 o la SEQ ID NO: 112.

Se prevé que una quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción puede comprender un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium en cualquiera y todas las ubicaciones con la condición de que la quimera de toxina de Clostridium sea capaz de desempeñar el proceso de intoxicación. Ejemplos no taxativos incluyen, ubicar un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium en el amino-terminal de una toxina de Clostridium modificada; ubicar un dominio de unión que no es de Clostridium entre el dominio enzimático de la toxina de Clostridium y un dominio de traslocación de una toxina de Clostridium modificada; y ubicar un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium en el carboxi-terminal de una toxina de Clostridium modificada. Otros ejemplos no taxativos incluyen, ubicar un dominio de unión que no es de Clostridium entre un dominio enzimático de la toxina de Clostridium y un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium de una toxina de Clostridium modificada. El dominio enzimático de toxinas de Clostridium de origen natural contiene la metionina de partida natural. Por lo tanto, en organizaciones de domino donde el dominio enzimático no está en la ubicación de amino-terminal, una secuencia de aminoácidos que comprende la metionina de partida debería colocarse frente al dominio de amino-terminal. Asimismo, en los casos en que un dominio de unión que no es de Clostridium está en la posición de amino-terminal, una secuencia de aminoácidos que comprende una metionina de partida y un sitio de escisión de proteasa puede estar operativamente unido en situaciones donde un dominio de unión que no es de Clostridium requiere un amino-terminal libre, véase, por ejemplo, Shengwen Li et ál., Degradable Clostridial Toxins, solicitud de patente estadounidense 11/572,512 (23 de enero de 2007), que se incorpora en su totalidad mediante esta referencia. Además, se sabe en la técnica que cuando se agrega un polipéptido que está unido operativamente al amino-terminal de otro polipéptido que comprende la metionina de partida, el residuo de metionina original se puede suprimir.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio de unión que no es de Clostridium, un dominio de traslocación, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático (FIG. 3A) . En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático de la toxina de Clostridium.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un dominio enzimático, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio de traslocación (FIG. 3B) . En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio de unión a la toxina de Clostridium, un dominio de unión que no es de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de unión que no es de Clostridium y un dominio de traslocación (FIG. 4A) . En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de unión que no es de Clostridium y un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium.

En aun otra modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de unión que no es de Clostridium y un dominio enzimático (FIG. 4B) . En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático de la toxina de Clostridium.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático, un dominio de unión que no es de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio de traslocación (FIG. 4C) . En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium.

En aun otra modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación, un dominio de unión que no es de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático (FIG. 4D) . En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático de la toxina de Clostridium.

En aun otra modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de traslocación y un dominio de unión que no es de Clostridium (FIG. 5A) . En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium y un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium.

En aun otra modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a carboxilo que comprende un dominio de traslocación, un sitio de escisión de proteasa exógeno, un dominio enzimático y un dominio de unión que no es de Clostridium (FIG. 5B) . En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender un orden lineal de polipéptido único amino a 75 carboxilo que comprende un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de proteasa exógeno y un dominio enzimático de la toxina de Clostridium.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, "sitio de escisión e inactivación" se refiere a un enlace junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para la proteólisis selectiva en el enlace escindible mediante una proteasa presente en los líquidos intersticiales o sistemas circulatorios, tal como, por ejemplo, el sistema cardiovascular o el sistema linfático. El sitio de escisión de inactivación está unido operativamente como una proteína de fusión a la toxina de Clostridium o una quimera de la toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. Por definición, un sitio de escisión de inactivación es capaz de escindirse selectivamente por al menos una proteasa presente en los líquidos intersticiales o sistemas circulatorios. Los ejemplos no taxativos de sitios de escisión de inactivación incluyen sitios de escisión de trombina, sitios de escisión de plasmina, sitios de escisión del factor de coagulación Vlla, sitios de escisión del factor de coagulación IXa, sitios de escisión del factor de coagulación Xa, sitios de escisión del factor de coagulación Xla, sitios de escisión del factor de coagulación Xlla, sitios de escisión de calicreina plasmática, sitios de escisión del receptor activada por proteasa acoplado a proteínas G 1 (PARI), sitios de escisión de PAR2, sitios de escisión de PAR3, sitios de escisión de PAR4 , sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2), sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9) , sitios de escisión de furina, sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo urocinasa (uPA) , sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo tejido (tPA) , sitios de escisión de triptasa-e, sitios de escisión de proteasa de mastocitos de ratón (m CP-7), sitios de escisión de enzima convertidora de endotelina 1 (ECE-1), sitios de escisión del grupo sanguíneo Kell, sitios de escisión de DPPIV, sitios de escisión de metalopeptidasa ADAM con trombospondina tipo 1, motivo 13 (ADAMTS13) y sitios de escisión de Catepsina L (Tabla 4) .

TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación Secuencias de SEQ ID Sitio de escisión de proteasa referencia NO: LVPR*GS 114 LVPK*GS 115 FIPR*TF 116 VLPR*SF 117 Trombina IVPR*SF 118 TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación Secuencias de SEQ ID Sitio de escisión de proteasa referencia NO: IVPR*GY 119 VVPR*GV 120 VLPR*LI 121 V PR*SL 122 MFPR*SL 123 KLTR*AETV 125 DFTR*VVGG 126 LSPR*TFHP 127 LIQR*NLSP 128 Factor de coagulación Vlla (FVIIA) MATR*KMHD 129 LGIR*SFRN 130 PQGR*IVGG 131 NLTR*IVGG 132 QVVR*IVGG 133 PQGR*IVGG 135 PQLR*MKNN 136 Factor de coagulación IXa (FlXa) NLTR*IVGG 137 QVVR*IVGG 138 IDGR* 140 IEGR* 141 IDGR*SVGG 142 IDGR*TVGG 143 IDGR*IVGG 144 IEGR*SVGG 145 IEGR*TVGG 146 Factor de coagulación Xa (FXa) IEGR* IVGG 147 PQGR*IVGG 148 TABLA . Sitios de escisión de inactivación Secuencias de SEQ ID Sitio de escisión de proteasa referencia NO: SPFR*TPYL 179 TFHK*AEYR 180 PRFK*IIGG 181 ISLM*KRPP 182 LEAR*SAYH 183 EAKR*SYHS 184 PNRW*STGA 185 Calicreína 1 EAFY*SQFG 186 NAAR*STGA 187 SSEW*SMPY 188 GTLF*RSGN 189 ARLY*SRGA 190 EASR*SATL 191 EASY*RRKQ 192 TTFY*RRGA 193 AAWY*RTSR ' 194 SFHY*RMVG 195 ASSY*RTSR 196 TRFY*SRGR 197 IKFF*SAQT 198 KKTR*NLKK 200 LDRR*GLQR 201 MATR*KMHD 202 RLKK*SQFL 203 PQLR*MKNN 204 Proteína C VDQR*GNQI 205 IEPR*SPSQ 206 TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación Secuencias de SEQ ID Sitio de escisión de proteasa referencia NO: KKTR*SPKT 207 LDQR*GVQR 208 PDPR*SKNN 209 GEAR*GSVI 211 GHAR*LVHV 212 AEFR*HDSG 213 HHQK*LVFF 214 Plasminógeno GSNK*GALL 215 RAQR*SAGA 216 AFWK*TDAS 217 MSMR*VRRH 218 RGVR*RTAS 219 RAAR*SQCT 220 PQSR*SVPP 221 PYLK*VFNP 222 LSFR*ARAY 223 PQLR*RG R 224 EDNR*DSSM 225 LSFR*ARAY 226 FRAR*AYGF 227 YGFR*GPGP 228 ITFR*MNVA 229 THEK*GRQS 230 PRLK*ARAG 231 PKAK*SHAP 232 PSHK*EGPQ 233 LFEK*KVYL 234 TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación Secuencias de Sitio de escisión de proteasa referencia ADGK*KPSS PRFK*IIGG PQFR*IKGG PRCR*HRPH KGYR*SQRG DVAQ*FVLT QPVS*VKVG RGVG*IKST FVDC*LIEQ VPAG*NWVL YHAD* IYDK RACR*LAKA QGAY*QEAF DVLS*LLEK TLDD*LI A HISS*LIKL DPNN*LLND PVQP*QQSP KPKT*ITGP VVHP*LVLL HPLV*LLSV etaloproteinasa 2 de la matriz (MMP-2) AVAL*LIGP QPLQ*LLDA YIQG*INLV LPQE*IKAN NISD*LTAA KPRA*LTAL TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación Secuencias de Sitio de escisión de proteasa referencia APSW*LLTA AVRW*LLTA AVSW*LLTA SLRR*LTAA SLSR*LTAL RYSS*LTAA SLAY*YTAL SLRY*YTAA SPAY*YTAL MHKA*LTAA LRLA*ITAL IPEN*FFGV MDIA*IHHP SPSR*LFDQ SEMR*LEKD FSVN*LDVK RLFD*QFFG FFGE*HLLE GLSE*MRLE SPEE*LKVK DVIE*VHGK Metaloproteinasa 9 de la matriz (MMP-9) EVHG*KHEE DEHG*FISR GEHL*LESD FHRK*YRI P GPRK*QVSG LSPF*YLRP TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación Sitio de escisión de proteasa TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación Secuencias de SEQ ID Sitio de escisión de proteasa referencia NO: NSFG*LRFG 318 RAIH* INAE 319 RPRR*AKRF 321 RKKR*GLYA 322 RERR*RKKR 323 RKKR*GLYA 324 RKKR*TTSA 325 RHKR*ETLK 326 RLKR*DVVT 327 RMKR*EDLN 328 RAKR*FASL 329 RKKR*FVSS 330 Furina RTKR*FLSY 331 RRAR*SVDG 332 VFRR*DAHK 333 VFRR*EAHK 334 RVAR*DITM 335 RISR*SLPQ 336 RSRR*AATS 337 RAKR*SPKH 338 FWHR*GVTK 339 AKRR*TKRD 340 AKRR*AKRD 341 AKQR*AKRD 342 RDVR*GFAS 343 RKRR*SVNP 344 RQKR*FVLS 345 TABLA . Sitios de escisión de inactivación Secuencias de Sitio de escisión de proteasa referencia RSKR*SLSC GSGK*SATL QRGR*SATL RGSV*ILTV PSSR*RRVN CPGR*VVGG PGAR*GRAF SSSR*GPTH VSNK*YFSN NSGR*AVTY TYSR*SRYL Activador de u-plasminógeno (u-PA) NSGR*AVTY PSGR*GRTL AGSR*AVYY TYGR*SRTN NSSR*GVYL PSSR*SVYN ASGR*GRTY TSSR*AVYL NSGR*SRTL VSGR*IRTG SSGR*IRTV NALR*YAPD CPGR*VVGG Activador de t-plasminógeno (t-PA) PQFR*IKGG ALSR*MAVL *RVVGGE TABLA 4. Sitios de escisión de inactivación Secuencias de SEQ ID Sitio de escisión de proteasa referencia NO: GFFY*TPKA 434 HFFK*NIVT 435 RGLS*LSRF 436 QWLG*APVP 437 NMLK*RGLP 438 LSLA*HTHQ 439 TPFA*ATSS 440 KLLA*VSGP 441 QLFR*RAVL 442 PRFK*IIGG 443 *SFLLRN 445 *SFFLRN 446 *SFFLKN 447 PARI *TFLLRN 448 *GFPGKF 449 *GYPAKF 450 *GYPLKF 451 *GYPIKF 452 PAR2 *SLIGKV 454 *SLIGRL 455 *TFRGAP 457 PAR3 *S NGGP 458 *SFNGNE 459 *GYPGQV 461 *AYPGKF 462 *TYPGKF 463 PAR4 *GYPGKY 464 Se prevé que un sitio de escisión de inactivación de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente descripción con la condición de que el sitio de escisión de inactivación sea capaz de escindirse mediante una proteasa del liquido intersticial o sistema circulatorio. Por lo tanto, en aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de inactivación puede ser, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 aminoácidos de longitud. En otros aspectos de la presente modalidad, en aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de inactivación puede ser, por ejemplo, como máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 aminoácidos de longitud.

Un sitio de escisión de inactivación útil en aspectos de la descripción incluye, de modo no taxativo, sitio de escisión de inactivación de origen natural; variantes del sitio de escisión de inactivación de origen natural; y variantes del sitio de escisión de inactivación de origen no natural, tales como, por ejemplo, variantes del sitio de escisión de inactivación conservadoras, variantes del sitio de escisión de inactivación no conservadoras y peptidomiméticos del sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "variante del sitio de escisión de inactivación", ya sea de origen natural o no, se refiere a un sitio de escisión de inactivación que tiene al menos un cambio de aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia descritas y se puede describir como porcentaje en la identidad de la región correspondiente de la secuencia de referencia. Cualquiera de varios métodos de alineación de secuencia se pueden usar para determinar el porcentaje de identidad incluyendo, de modo no taxativo, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, por ejemplo, métodos de enfoque de segmento. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procesos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del sitio de escisión de inactivación de origen natural" se refiere a cualquier sitio de escisión de inactivación sin el apoyo de manipulación humana. Ejemplos no taxativos de los sitios de escisión incluyen variantes del sitio de escisión de trombina, variantes del sitio de escisión de plasmina, variantes del sitio de escisión del factor de coagulación V, variantes del sitio de escisión del factor de coagulación VII, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación VIII, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación IXa, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación Xa, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación Xla, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación Xlla, variantes del sitio de escisión del factor de calicreina plasmática, variantes del sitio de escisión de MMP-2, variantes del sitio de escisión de MMP-9, variantes del sitio de escisión de furina, variantes del sitio de escisión activador de u-plasminógeno, variantes del sitio de escisión de activador de t-plasminógeno, variantes del sitio de escisión de triptasa-e, variantes del sitio de escisión de MCP-7, variantes del sitio de escisión de ECE-1, variantes del sitio de escisión de KBGP, variantes del sitio de escisión de catepsina L, variantes del sitio de escisión de PARI, variantes del sitio de escisión de PAR2, variantes del sitio de escisión de PAR3, variantes del sitio de escisión de PAR4 y variantes del sitio de escisión de ADAM-TS13.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del sitio de escisión de inactivación de origen no natural" se refiere a cualquier sitio de escisión de inactivación producido con la ayuda de manipulación humana, incluyendo, de modo no taxativo, variantes del sitio de escisión de inactivación producidas mediante modificación genética usando mutagénesis aleatoria o diseño racional y variantes del sitio de escisión de inactivación producidas mediante síntesis química. Ejemplos no taxativos de las variantes del sitio de escisión de inactivación de origen no natural, por ejemplo, variantes del sitio de escisión de inactivación conservadoras, variantes del sitio de escisión de inactivación no conservadoras y peptidomiméticos del sitio de escisión de inactivación.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del sitio de escisión de inactivación conservadora" se refiere a un sitio de escisión de inactivación que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del sitio de escisión de inactivación de referencia. Los ejemplos de propiedades incluyen, de modo no taxativo, similar tamaño, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de unión covalente, capacidad de unión a hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares o cualquier combinación de estos. Una variante del sitio de escisión de inactivación conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el sitio de escisión de inactivación de referencia en el cual se basa la variante del sitio de escisión de inactivación conservadora, y puede sustituir al sitio de escisión de inactivación de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Ejemplos no taxativos de los sitios de escisión de inactivación incluyen, por ejemplo, variantes del sitio de escisión de trombina conservadoras, variantes del sitio de escisión de plasmina conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de coagulación V conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación VII conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación VIII conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación IXa conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación Xa conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación Xla conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación Xlla conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de calicreina plasmática conservadoras, variantes del sitio de escisión de MMP-2 conservadoras, variantes del sitio de escisión de MMP-9 conservadoras, variantes del sitio de escisión de furina conservadoras, variantes del sitio de escisión activador de u-plasminógeno conservadoras, variantes del sitio de escisión de activador de t-plasminógeno conservadoras, variantes del sitio de escisión de triptasa-e conservadoras, variantes del sitio de escisión de MCP-7 conservadoras, variantes del sitio de escisión de ECE-1 conservadoras, variantes del sitio de escisión de KBGP conservadoras, variantes del sitio de escisión de catepsina L conservadoras, variantes del sitio de escisión de PARI conservadoras, variantes del sitio de escisión de PAR2 conservadoras, variantes del sitio de escisión de PAR3, variantes del sitio de escisión de PAR4 conservadoras y variantes del sitio de escisión de ADAM-TS13 conservadoras .

Tal como se usa en la presente, el término "variante del sitio de escisión de inactivación no conservadora" se refiere a un sitio de escisión de inactivación donde 1) se suprime al menos un aminoácido del sitio de escisión de inactivación de referencia en el cual se basa la variante del sitio de escisión de inactivación no conservadora; 2) se agrega al menos un aminoácido al sitio de escisión de inactivación de referencia en el cual se basa el sitio de escisión de inactivación no conservadora; o 3) se sustituye al menos un aminoácido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del sitio de escisión de inactivación de referencia (Tabla 4) . Una variante del sitio de escisión de inactivación no conservadora puede funcionar básicamente de la misma manera que el sitio de escisión de inactivación de referencia en el cual se basa el sitio de escisión de inactivación no conservadora, y puede sustituir al sitio de escisión de inactivación de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Ejemplos no taxativos de los sitios de escisión de inactivación incluyen, por ejemplo, variantes del sitio de escisión de trombina no conservadoras, variantes del sitio de escisión de plasmina conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de coagulación V no conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de coagulación VII no conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de coagulación VIII no conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de coagulación IXa no conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de coagulación Xa no conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación Xla no conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de Coagulación Xlla no conservadoras, variantes del sitio de escisión del factor de calicreina plasmática no conservadoras, variantes del sitio de escisión de MMP-2 no conservadoras, variantes del sitio de escisión de MMP-9 no conservadoras, variantes del sitio de escisión de furina no conservadoras, variantes del sitio de escisión activador de u-plasminógeno no conservadoras, variantes del sitio de escisión de activador de t-plasminógeno no conservadoras, variantes del sitio de escisión de triptasa-e no conservadoras, variantes del sitio de escisión de MCP-7 no conservadoras, variantes del sitio de escisión de ECE-1 no conservadoras, variantes del sitio de escisión de KBGP no conservadoras, variantes del sitio de escisión de catepsina L no conservadoras, variantes del sitio de escisión de PARI no conservadoras , variantes del sitio de escisión de PAR2 no conservadoras , variantes del sitio de escisión de PAR3 no conservadoras , variantes del sitio de escisión de PAR no conservadoras y variantes del sitio de escisión de ADAM-TS13 no conservadoras.

Tal como se usa en la presente, el término "variante del sitio de escisión de inactivación no conservadora" se refiere a un sitio de escisión de inactivación que tiene al menos un aminoácido sustituido por un oligómero de origen no natural que tiene al menos una propiedad similar a la del primer aminoácido. Ejemplos de propiedades incluyen, de modo no taxativo, topografía de un elemento estructural principal del péptido, funcionalidad del elemento estructural principal del péptido, topología de un elemento estructural secundario del péptido, funcionalidad de un elemento estructural secundario del péptido o combinaciones de estos. Un peptidomimético del sitio de escisión de inactivación puede funcionar básicamente de la misma manera que el sitio de escisión de inactivación de referencia en el cual se basa el peptidomimético del sitio de escisión de inactivación, y puede sustituir al sitio de escisión de inactivación de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. Para ejemplos de métodos peptidomiméticos , véase por ejemplo, Amy S. Ripka & Daniel H. Rich, Peptidomimetic design, 2(4) CURR. OPIN. CHE . BIOL. 441-452 (1998) ; y M. Angels Estiarte & Daniel H. Rich, Peptidomimetics for Drug Design, 803-861 (BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY Vol. 1 PRINCIPLE AND PRACTICE, Donald J. Abraham ed., Wiley-lnterscience, 6* edición 2003) . Ejemplos no taxativos de un peptidomimético del sitio de escisión de inactivación incluyen por ejemplo, peptidomiméticos del sitio de escisión de trombina, peptidomiméticos del sitio de escisión de plasmina, peptidomiméticos del sitio de escisión del factor de coagulación V, peptidomiméticos del sitio de escisión del factor de coagulación VII, peptidomiméticos del sitio de escisión del factor de Coagulación VIII, peptidomiméticos del sitio de escisión del factor de coagulación IXa, peptidomiméticos del sitio de escisión del factor de coagulación Xa, peptidomiméticos del sitio de escisión del factor de coagulación Xla, peptidomiméticos del sitio de escisión del factor de coagulación Xlla, peptidomiméticos del sitio de escisión del factor de calicreina plasmática, peptidomiméticos del sitio de escisión de MMP-2, peptidomiméticos del sitio de escisión de MP-9, peptidomiméticos del sitio de escisión de furina, peptidomiméticos del sitio de escisión activador de u-plasminógeno, peptidomiméticos del sitio de escisión de activador de t-plasminógeno, peptidomiméticos del sitio de escisión de triptasa-e, peptidomiméticos del sitio de escisión de CP-7, peptidomiméticos del sitio de escisión de ECE-1, peptidomiméticos del sitio de escisión de KBGP, peptidomiméticos del sitio de escisión de catepsina L, peptidomiméticos del sitio de escisión de PARI, peptidomiméticos del sitio de escisión de PAR2, peptidomiméticos del sitio de escisión de PAR3, peptidomiméticos del sitio de escisión de PAR4 y peptidomiméticos del sitio de escisión de ADAM-TS13.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de inactivación. En un aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación. En otro aspecto de esta modalidad, una toxina de Clostridium comprende una variante del sitio de escisión se inactivación de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma del sitio de escisión de inactivación. En otro aspecto de la presente modalidad, una toxina de Clostridium comprende una variante del sitio de escisión de inactivación de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del sitio de escisión de inactivación conservadora, una variante del sitio de escisión de inactivación no conservadora o un fragmento activo del sitio de escisión de inactivación o cualquier combinación de estos.

En otra modalidad, una quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de inactivación. En un aspecto de la presente modalidad, una quimera de toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación. En otro aspecto de esta modalidad, una quimera de toxina de Clostridium comprende una variante del sitio de escisión se inactivación de origen natural, tal como, por ejemplo, una isoforma del sitio de escisión de inactivación. En otro aspecto de la presente modalidad, una quimera de toxina de Clostridium comprende una variante del sitio de escisión de inactivación de origen no natural, tal como, por ejemplo, una variante del sitio de escisión de inactivación conservadora, una variante del sitio de escisión de inactivación no conservadora o un fragmento activo del sitio de escisión de inactivación o cualquier combinación de estos.

En otra modalidad, un aminoácido hidrofóbico en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir con otro aminoácido hidrofóbico. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos incluyen, por ejemplo, C, F, I, L, M, V y W. En otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido alifático en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir con otro aminoácido alifático. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos incluyen, por ejemplo, A, I, L, P y V. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido aromático en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir con otro aminoácido aromático. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido acumulado en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir con otro aminoácido acumulado. Los ejemplos de aminoácidos acumulados incluyen, por ejemplo, F, H, W e Y. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido polar en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir con otro aminoácido polar. Los ejemplos de aminoácidos polares incluyen, por ejemplo, D, E, K, N, Q y R. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido menos polar o indiferente en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir con otro aminoácido menos polar o indiferente. Los ejemplos de aminoácidos menos polares o indiferentes incluyen, por ejemplo, A, H, G, P, S, T e Y. En un aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido con carga positiva en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir con otro aminoácido con carga positiva. Los ejemplos de aminoácidos con carga positiva incluyen, por ejemplo, K, R y H. En otro aspecto adicional de la presente modalidad, un aminoácido con carga negativa en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir por otro aminoácido con carga negativa. Los ejemplos de aminoácidos con carga negativa incluyen, por ejemplo, D y E. En otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido pequeño en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir con otro aminoácido pequeño. Los ejemplos de aminoácidos pequeños incluyen, por ejemplo, A, D, G, N, P, S y T. En aun otro aspecto de la presente modalidad, un aminoácido ramificado C-beta en una posición particular en el sitio de escisión de inactivación se puede sustituir con otro aminoácido ramificado C-beta. Los ejemplos de aminoácidos ramificados C-beta incluyen, por ejemplo, I, T y V.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de trombina como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de trombina" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por trombina en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa de trombina. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por trombina pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de la trombina es XiX2X3 (R/K) *X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 113), donde Xll es preferentemente S, T, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, , e Y, un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es preferentemente F, S, T, un aminoácido amidico como N o Q, un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es preferentemente S, T, un aminoácido positivo como H, K, y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; y X5, X6, y X7, son independientemente cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión para la trombina (SEQ ID NO: 114-123) . En la técnica se conocen sitios de escisión de trombina adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat . Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, base de datos en prensa (2010) , cada una de las cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia .

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de trombina. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de trombina comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 113) , donde Xi, es S, T, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K, y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W, e Y, un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es F, S, T, un aminoácido amidico como N o Q, un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es S, T, un aminoácido positivo como H, K, y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; y X5, X6, y X7 son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de trombina comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 113, donde Xi es S, Q, K o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es u aminoácido base como D, E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es N, Q, G, P, A, V, L o I; X4 es S, T, H, G, A, L o I; X5 es S, T, Q, K, R, F, Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X6 es S, T, Q, K, R, G, P, A, V, L, o I; y X7 es S, T, Q, K, R, G, P, A, V, L, o í. En otro aspecto de esta modalidad, el sitio de escisión de trombina comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 113, donde Xi es Q, G, P, A, V, L, I, o M; X2 es S, T, D, E, G, A, V, o I; X3 es G, P, A, V, o L; X4 es S, G, A, o L; X5 es Q, K, F, A, V, o L; X6 es S, Q, K, R, G, P, V, o L; y X7 es S, T, K, G, V, L, o í. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión de trombina comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 114, la SEQ ID NO: 115, la SEQ ID NO: 116, la SEQ ID NO: 117, la SEQ ID NO: 118, la SEQ ID NO: 119, la SEQ ID NO: 120, la SEQ ID NO: 121, la SEQ ID NO: 122 o la SEQ ID NO: 123.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de plasmina como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de plasmina" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por plasmina en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa de plasmina. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por plasmina pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. La plasmina cataliza la escisión de enlaces Lys y Arg con una especificidad similar a la de la trispina. Sin embargo, la plasmina es una enzima mucho menos eficaz que la tripsina y escinde algunos de los enlaces en proteínas. La tripsina escinde cadenas peptídicas principalmente en el lado carboxilo de los aminoácidos lisina o arginina, salvo cuando a alguno le sigue prolina.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión del factor de coagulación Vlla como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión del factor de coagulación Vlla" o "sitio de escisión de FVIIa" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por FVIIa en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa FVIIa. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por FVIIa pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de FVIIa es X! 2X3 ( /K) *XXsX6Xi (SEQ ID NO: 124), donde Xlf es preferentemente un aminoácido base como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido base como K, y R, o un aminoácido hidrofóbico aromático como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es Q, S, T, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, e Y o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y ; X3 es preferentemente Q, S, T o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; y X4, X5, ?ß, y X7 son independientemente cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión para la FVIIa (SEQ ID NO: 125-133). En la técnica se conocen sitios de escisión de FVIIa adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, J. H. Morrissey, Coagulation Factor Vila. In HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, pp. 1659-1662 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, y J. F. Woessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); O. Schilling y C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat . Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36(ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión del factor de coagulación Vlla. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Vlla comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 124, donde Xi es un aminoácido base como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido base como K, y R, o un aminoácido hidrofóbico aromático como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es Q, S, T, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es Q, S, T o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X4, X5, X6, y X7 son independientemente cualquier aminoácido. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Vlla comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 125, la SEQ ID NO: 126, la SEQ ID NO: 127, la SEQ ID NO: 128, la SEQ ID NO: 129, la SEQ ID NO: 130, la SEQ ID NO: 131, la SEQ ID NO: 132 o la SEQ ID NO: 133.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión del factor de coagulación IXa como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión del factor de coagulación IXa" o "sitio de escisión de FlXa" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por FlXa en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa FlXa. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por FlXa pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de FlXa es XiXsXa (R/K) *?4?5 6?? (SEQ ID NO: 134, donde Xx es preferentemente un aminoácido base como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido hidrofóbico aromático como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es preferentemente un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q o un aminoácido alifático hidrofóbico como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es preferentemente S, T, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; y X4, X5, X6, y X7 son independientemente cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión para la FlXa (SEQ ID NO: 135-138) . En la técnica se conocen sitios de escisión de FlXa adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, po ejemplo, A. T. Thompson, Molecular Biology of Factor IX.

In HEMOSTASIS AND THRO BOSIS, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE, pp. 128-129 (R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); S. Kawabata and S. Iwanaga, Russellysin . In HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, pp.683-684 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); A. E. Schmidt and S. P. Bajaj, Coagulation factor IXa . In HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, pp. 1655-1659 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36(ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión del factor de coagulación IXa. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación IXa comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 134, donde Xi es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es S, T, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; y X4, X5, X6, y X7 son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación IXa comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 134, donde Xi es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es S, T, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, M; y X4, X5, X6, y X7 son independientemente cualquier aminoácido y como D, E, un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación IXa comprende por ejemplo, SEQ ID NO: 135, la SEQ ID NO: 136, la SEQ ID NO: 137 o la SEQ ID NO: 138. 11 Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión del factor de coagulación Xa como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión del factor de coagulación Xa" o "sitio.de escisión de FXa" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por FXa en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa FXa. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por FXa pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de FXa es X1X2X3 (R/K) *?4?5 6?? (SEQ ID NO: 139), donde Xi, es cualquier aminoácido, X2 es preferentemente G, A, S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N, o un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, X3 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; x4 es preferentemente un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S, y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X5, X6, y X7, son independientemente cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión para la FXa (SEQ ID NO: 140-155) . En la técnica se conocen sitios de escisión de FXa adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, D. L. Greenberg and E. . . Davie, Blood Coagulation Factors: Their Complementary DNAs, Genes, and Expression. In HEMOSTASIS AND THROMBOSIS, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE, pp. 34-35 (R. . Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identífying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS : The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión del factor de coagulación Xa. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xa comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 139, donde ?? es cualquier aminoácido, X2 es G, A, S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como Q y N, o un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, X3 es un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S, y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X5, ?e, y 7 son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xa comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 139, donde Xi es E, F, P, A, L, o I; X2 es S, Q, D, E, F, G, o A; X3 es F, G, o P; X4 es S, T, L, o I; X5 es S, F, A, o V; X6 es S, T, E, N, H, G, A, o M; y X7 es S, N, D, Q, K, R, o G. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xa comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 139, donde ?? es I o A; X2 es E o F; X3 es F, G, o P; X4 es S, T, o I; X5 es S, F, o V; X6 es E o G; y X7 es S o G. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xa comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 141, la SEQ ID NO: 142, la SEQ ID NO: 143, la SEQ ID NO: 144, la SEQ ID NO: 145, la SEQ ID NO: 146, la SEQ ID NO: 147, la SEQ ID NO: 148, la SEQ ID NO: 149, la SEQ ID NO: 150, la SEQ ID NO: 151, la SEQ ID NO: 152, la SEQ ID NO: 153, la SEQ ID NO: 154 o la SEQ ID NO: 155.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión del factor de coagulación Xla como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión del factor de coagulación Xla " o "sitio de escisión de FXIa" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por FXIa en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa FXIa. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por FXIa pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de FXIa es X1X2X3 (R/K) *X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 156), donde ?? preferentemente es un aminoácido ácido como D o E, un aminoácido base como K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X2 preferentemente es un aminoácido ácido como D o E, un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido base como K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X3 preferentemente es H, un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático G, P, A, V, L, I y M; X4 preferentemente es H, un aminoácido sin carga C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; ?5 preferentemente es un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X6 es preferentemente un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, e Y; o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X7 preferentemente es un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitios de escisión de referencia para FXIa (SEQ ID NO: 157-166) . En la técnica se conocen sitios de escisión de FXIa adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, P. N. Walsh, Coagulation Factor Xla. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.1651-1655 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol . 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS : The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos) : D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión del factor de coagulación Xla. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xla comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 156, donde Xi es un aminoácido ácido como D o E, un aminoácido base como K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es un aminoácido ácido como D o E, un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido base como K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es H, un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X4 es H, un aminoácido sin carga como C, S y T o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X5 es un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X6 es un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático G, P, A, V, L, I y M; y X7 es un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xla comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 156, donde Xi es un aminoácido ácido como D o E, o un aminoácido base como K y R; X2 es un aminoácido hidrofóbico aromático como F, e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es un aminoácido sin carga como C, S, y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X5 es un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; e es un aminoácido sin carga como C, S, y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M. en otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xla comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 156, donde Xi es D o K; X2 es F o L; X3 es T o P; X4 es A o V; X5 es E o V; X<$ es T o G; y X7 es G o V. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xla comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 157, la SEQ ID NO: 158, la SEQ ID NO: 159, la SEQ ID NO: 160, la SEQ ID NO: 161, la SEQ ID NO: 162, la SEQ ID NO: 163, la SEQ ID NO: 164, la SEQ ID NO: 165 o la SEQ ID NO: 166.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión del factor de coagulación Xlla como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión del factor de coagulación Xlla" o "sitio de escisión de FXIIa" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por FXIIa en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa FXIIa. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por FXIIa pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de FXIIa es XiX2X3 (R/K) *??5 6 ? (SEQ ID NO: 167), donde Xi preferentemente es un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 preferentemente es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X3 preferentemente es un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X4 preferentemente es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X5 preferentemente es un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; y X7 preferentemente es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitios de escisión de referencia para FXIIa (SEQ ID NO: 168-172). En la técnica se conocen sitios de escisión de FXIIa adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, 0. D. Ratnoff, Coagulation Factor Xlla. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.1642-1644 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); 0. Schilling and C. M . Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat . Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36(ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010) , cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión del factor de coagulación Xlla. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xlla comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 167, donde Xi es un aminoácido sin carga como C, S, y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S, y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X3 es un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S, y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; X4 es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y ; X5 es un aminoácido sin carga como C, S, y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; Xe es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M; y X7 es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, y M. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xlla comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 167, donde X1 es S, T, P, o I; X2 es Q, K, S, o M; X3 es K, T, G, o P; X4 es L, I, o V; X5 es T o V; X6 es G o L; y X es G. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión del factor de coagulación Xlla comprende por ejemplo, SEQ ID NO: 168, la SEQ ID NO: 169, la SEQ ID NO: 170, la SEQ ID NO: 171 o la SEQ ID NO: 172.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de calicreina 1 como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de calicreina 1" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por calicreina 1 en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa calicreina 1. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por calicreina 1 pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de calicreina 1 es X1X2X3 4* (R/K/S) X5X6X (SEQ ID NO: 173), donde Xi preferentemente es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es cualquier aminoácido; X4 preferentemente es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido grande no polar como F, I, L, y V, o un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y; X5 es cualquier aminoácido; ?ß es cualquier aminoácido; y X7 es cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión de referencia para calicreina 1 (SEQ ID NO: 174-198) . En la técnica se conocen sitios de escisión de calicreina 1 adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, R. W. Colman, Contact Activation Pathway: Inflammation, Fibrinolytic, Anticoagulant , Antiadhesive, and Antiangiogenic Activities . In HEMOSTASIS AND THROMBOSIS, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE, pp. 103-104 (R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); J. Chao, Human Kallikrein 1, Tissue Kallikrein. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1577-1580 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. oessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); H. X. Li, et ál., Substrate Specificity of Human Kallikreins 1 and 6 Determined by Phage Display, Protein Sci. 17: 664-672 (2008); 0. Schilling and C. M . Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, base de datos en prensa (2010), cada una de las cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de calicreina 1. En un aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de calicreina 1 comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 173) , donde ?? es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es cualquier aminoácido; X4 es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido grande no polar como F, I, L, M y V, o un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y; X5 es cualquier aminoácido; s es cualquier aminoácido; y X7 es cualquier aminoácido. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de calicreina 1 comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 173, donde ?? es D, S, T o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es S, T, A, P o V; X3 es S, F o L; X4 es R o un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y; X5 es R, S, T o A; X6 es R, S o G; y X7 es R, G o A. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión de calicreina 1 comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 174, la SEQ ID NO: 175, la SEQ ID NO: 176, la SEQ ID NO: 177, la SEQ ID NO: 178, la SEQ ID NO: 179, la SEQ ID NO: 180, la SEQ ID NO: 181, la SEQ ID NO: 182, la SEQ ID NO: 183, la SEQ ID NO: 184, la SEQ ID NO: 185, la SEQ ID NO: 186, la SEQ ID NO: 187, la SEQ ID NO: 188, la SEQ ID NO: 189, la SEQ ID NO: 190, la SEQ ID NO: 191, la SEQ ID NO: 192, la SEQ ID NO: 193, la SEQ ID NO: 194, la SEQ ID NO: 195, la SEQ ID NO: 196, la SEQ ID NO: 197 o la SEQ ID NO: 198.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de la proteina C como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de proteina C" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por la proteína C en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa de proteína C. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por la proteína C pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de la proteína C es XiX2X3 (R/K) *?4?5 6 ? ( SEQ ID NO: 199), donde Xi, preferentemente es un aminoácido base como K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X2 preferentemente es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido base como K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 preferentemente es un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X, preferentemente es un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X5 preferentemente es un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido base como K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X6 preferentemente es un aminoácido amídico como Q y N, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y; X7 preferentemente es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. La Tabla 4 enumera los ejemplos de sitios de escisión de referencia para la proteina C (SEQ ID NO: 200-209) . En la técnica se conocen sitios de escisión de proteina C adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, L. Shen and B. Dahiback, Protein C. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1673-1677 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); 0. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36(ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de la proteina C. En un aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de la proteina C comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 199) , donde Xi es un aminoácido base como K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido base como K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 y 4 son independientemente un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X5 es un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido base como K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X6 es un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y; X7 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como Q y N, un aminoácido base como K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de la proteina C comprende la secuencia SEQ ID NO: 199, donde Xi es K, R o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es D, E, Q, N o K; X3 es P, L, T, Q, K o R; X4 es G, I, S, N o K; X5 es Q, N, K, F o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X6 es F, S, N, Q, K o H; X7 es L, I, T, K, D, E, Q o N. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión de la proteina C comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 200, la SEQ ID NO: 201, la SEQ ID NO: 202, la SEQ ID NO: 203, la SEQ ID NO: 204, la SEQ ID NO: 205, la SEQ ID NO: 206, la SEQ ID NO: 207, la SEQ ID NO: 208 o la SEQ ID NO: 209.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de plasminógeno como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de plasminógeno" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por plasminógeno en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa de plasminógeno. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por plasminógeno pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de plasminógeno es XiX2X3 (R/K) *X4X5X5 (SEQ ID NO: 210), donde Xi preferentemente es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 preferentemente es un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 preferentemente es un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X4 preferentemente es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X5 preferentemente es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X6 es cualquier aminoácido; X7 preferentemente es H, F, Y, R, un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitios de escisión de referencia para plasminógeno (SEQ ID NO: 211-240) . En la técnica se conocen sitios de escisión de plasminógeno adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, 0. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Datábase-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320- D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, 32 Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de plasminógeno . En un aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de plasminógeno comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 211, donde Xi es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X4 es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X5 es un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X6 es cualquier aminoácido; X7 preferentemente es H, F, Y, R, un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de plasminógeno comprende la secuencia SEQ ID NO: 211, donde Xi es K, R, S, T, A, G, L o P; X2 es D, E, Q, N, K, R, S, T, A, G, I o L; X3 es N, Q, S, F, Y, A o L; X es K, R, S, A, G, L o V; X5 es K, R, N, S, F, Y, A, I, L, P o V; X6 es K, R, N, S, F, Y, A, G, L, P o V; X7 es R, S, T, F, Y, A, G, I, · L o P. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión de plasminógeno comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 211, la SEQ ID NO: 212, la SEQ ID NO: 213, la SEQ ID NO: 214, la SEQ ID NO: 215, la SEQ ID NO: 216, la SEQ ID NO: 217, la SEQ ID NO: 218, la SEQ ID NO: 219, la SEQ ID NO: 220, la SEQ ID NO: 221, la SEQ ID NO: 222, la SEQ ID NO: 223, la SEQ ID NO: 224, la SEQ ID NO: 225, la SEQ ID NO: 226, la SEQ ID NO: 227, la SEQ ID NO: 228, la SEQ ID NO: 229, la SEQ ID NO: 230, la SEQ ID NO: 231, la SEQ ID NO: 232, la SEQ ID NO: 233, la SEQ ID NO: 234, la SEQ ID NO: 235, la SEQ ID NO: 236, la SEQ ID NO: 237, la SEQ ID NO: 238, la SEQ ID NO: 239 o la SEQ ID NO: 240.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de metaloproteinasa 1 de la matriz como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de la metaloproteinasa 1 de la matriz" o "sitio de escisión de MMP-2" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteolisis en el enlace escindible por MP-2 en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa MMP-2. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por MMP-2 pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de MMP-2 es Xi (P/A/V/L/I) X2X3* (V/L/I/F/Q) X4X5X6 (SEQ ID NO: 241), donde Xx, X2, X3, X , X5 y Xe son cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión para MMP-2 (SEQ ID NO: 242-273) . En la técnica se conocen sitios de escisión de MMP-2 adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál . , MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, base de datos en prensa (2010), cada una de las cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia. or lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de la metaloproteinasa 2 de la matriz. En un aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de la metaloproteinasa 2 de la matriz comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 241, donde Xi, X2, X3, X4, X5 y X6 son cualquier aminoácido. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de la metaloproteinasa 2 de la matriz comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 241, donde i es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido base como K y R, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es H, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X4 es un aminoácido base como K y R, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X5 es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido base como K y R, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; ?? es un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido base como K y R, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de la metaloproteinasa 2 de la matriz comprende la secuencia SEQ ID NO: 241, donde Xx es G, P, A, V, L, I, S, T, E o Q; X2 es G, A, L, S, N, Q, W o K; X3 es G, P, A, S, Q, D, E o H; X4 es G, A, V, L, I, F, S, T, Q, o K; X5 es G, A, V, S, T, Q o K; X6 es G, P, A, V, L, I, S, T, D, E, K, N o Q. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de la metaloproteinasa 2 de la matriz comprende la secuencia SEQ ID NO: 241, donde Xlr es G, A o L, o Q; X2 es G, A o S; X3 es G, A, S o N; X4 es A, V, L, I o K; X5 es G, A o S; X6 es G, P, A, V, L o D. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión de la metaloproteinasa 2 de la matriz comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 242, la SEQ ID NO: 243, la SEQ ID NO: 244, la SEQ ID NO: 245, la SEQ ID NO: 246, la SEQ ID NO: 247, la SEQ ID NO: 248, la SEQ ID NO: 249, la SEQ ID NO: 250, la SEQ ID NO: 251, la SEQ ID NO: 252, la SEQ ID NO: 253, la SEQ ID NO: 254, la SEQ ID NO: 255, la SEQ ID NO: 256, la SEQ ID NO: 257, la SEQ ID NO: 258, la SEQ ID NO: 259, la SEQ ID NO: 260, la SEQ ID NO: 261, la SEQ ID NO: 262, la SEQ ID NO: 263, la SEQ ID NO: 264, la SEQ ID NO: 265, la SEQ ID NO: 266, la SEQ ID NO: 267, la SEQ ID NO: 268, la SEQ ID NO: 269, la SEQ ID NO: 270, la SEQ ID NO: 271, la SEQ ID NO: 272 o la SEQ ID NO: 273.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de metaloproteinasa 9 de la matriz como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de la metaloproteinasa 9 de la matriz" o "sitio de escisión de MMP-2" [sic] se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteolisis en el enlace escindible por MMP-9 en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa MMP-9. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por MMP-9 pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de MMP-9 es X1X2X3X4*X5X6 7X8 (SEQ ID NO: 274), donde Xx preferentemente es F, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 preferentemente es F, Y, S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 preferentemente es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X4 es cualquier aminoácido; X5 preferentemente es S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; ?? es cualquier aminoácido; X7 es cualquier aminoácido; X8 preferentemente es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. La Tabla 4 enumera los ejemplos de sitios de escisión de referencia para MMP-9 (SEQ ID NO: 275-319) . En la técnica se conocen sitios de escisión de MMP-9 adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, S. L. Kridel, et ál., Substrate Hydrolysis by Matrix Metalloproteinase-9, J. Biol. Chem. 276: 20572-20578 (2001 ) ; E. Y. Zhen, et ál., Characterization of Metalloprotease Cleavage Products of Human Articular Cartilage, Arthritis Rheum. 58: 2420-2431 (2008); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36(ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de la metaloproteinasa 9 de la matriz. En un aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de la metaloproteinasa 9 de la matriz comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 274, donde Xi es F, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, .L, I y M; X2 es F, Y, S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X4 es cualquier aminoácido; X5 es S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amídico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X6 es cualquier aminoácido; X7 es cualquier aminoácido; X8 es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de metaloproteinasa 9 de la matriz comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 274, donde Xi es G, V, L, I, F, S, Q, K o R; X2 es P, A, V, L, I o S; X3 es G, P, A, V, L, S, Q, E, K o R; X4 es G, P, A, V, L, F, S, N, E o K; X5 es A, V, L, I, M, F, S, Q o K; X6 es P, A, V, L, I, S, T, Q, E, K o R; X7 es G, A, V, L, S o T; X8 es G, P, A, V, L, F, T, D, E, K o R. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de metaloproteinasa 9 de la matriz comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 274, donde Xx es G o L; X2 es P, A o V; X3 es P, A, R, K o S; X4 es G; X5 es A, V, L o I; X6 es T, Q, K o R; X7 es G, A o S; X8 es G, P, A, V o E. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión de metaloproteinasa 9 de la matriz comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 275, la SEQ ID NO: 276, la SEQ ID NO: 277, la SEQ ID NO: 278, la SEQ ID NO: 279, la SEQ ID NO: 280, la SEQ ID NO: 281, la SEQ ID NO: 282, la SEQ ID NO: 283, la SEQ ID NO: 284, la SEQ ID NO: 285, la SEQ ID NO: 286, la SEQ ID NO: 287, la SEQ ID NO: 288, la SEQ ID NO: 289, la SEQ ID NO: 290, la SEQ ID NO: 291, la SEQ ID NO: 292, la SEQ ID NO: 293, la SEQ ID NO: 294, la SEQ ID NO: 295, la SEQ ID NO: 296, la SEQ ID NO: 297, la SEQ ID NO: 298, la SEQ ID NO: 299, la SEQ ID NO: 300, la SEQ ID NO: 301, la SEQ ID NO: 302, la SEQ ID NO: 303, la SEQ ID NO: 304, la SEQ ID NO: 305, la SEQ ID NO: 306, la SEQ ID NO: 307, la SEQ ID NO: 308, la SEQ ID NO: 309, la SEQ ID NO: 310, la SEQ ID NO: 311, la SEQ ID NO: 312, la SEQ ID NO: 313, la SEQ ID NO: 314, la SEQ ID NO: 315, la SEQ ID NO: 316, la SEQ ID NO: 317, la SEQ ID NO: 318 o la SEQ ID NO: 319.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de furina como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de furina" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por furina en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa de furina. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por furina pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de furina es (R/I/A) Xi (R/K/A/P) R*X2*X3 4 5 (SEQ ID NO: 320), donde Xi X2, X3, X4 y X5 es cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera- ejemplos de sitios de escisión de referencia para la furina (SEQ ID NO : 321-346) . En la técnica se conocen sitios de escisión de furina adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, A. Basak, et ál., Implication of the Proprotein Convertases Furin, PC5 And PCI in the Cleavage of Surface Glycoproteins of Hong Kong, Ebola and Respiratory Syncytial Viruses: A Comparative Analysis with Fluorogenic Peptides, Biochem. J. 353: 537-545 (2001); 0. Bader, et ál., Processing of Predicted Substrates of Fungal Kex2 Proteinases from Candida albicans , C. glabrata , Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris, BMC Microbiol. 8: 116 (2008); 0. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat . Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010) , cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de furina. En un aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de furina comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 320, donde Xi, X2, X3, X4 y X5 son cualquier aminoácido. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de furina comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 320, donde Xi es F, S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es G, P, M, F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, o un 'aminoácido sin carga como C, S y T; X3 es G, P, A, V, L, I, F, W, S, T, N, Q, D, H, K o R; X4 es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X5 es F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido ácido como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión de furina comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 320, donde Xx es K, R, S o T; X2 es D, E, S, A o G; X3 es A, V, L o I; y X4 es S, G, D, E o R; y X5 es G, P, A, S, T, Q, D o E. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión de furina comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 321, la SEQ ID NO: 322, la SEQ ID NO: 323, la SEQ ID NO: 324, la SEQ ID NO: 325, la SEQ ID NO: 326, la SEQ ID NO: 327, la SEQ ID NO: 328, la SEQ ID NO: 329, la SEQ ID NO: 330, la SEQ ID NO: 331, la SEQ ID NO: 332, la SEQ ID NO: 333, la SEQ ID NO: 334, la SEQ ID NO: 335, la SEQ ID NO: 336, la SEQ ID NO: 337, la SEQ ID NO: 338, la SEQ ID NO: 339, la SEQ ID NO: 340, la SEQ ID NO: 341, la SEQ ID NO: 342, la SEQ ID NO: 343, la SEQ ID NO: 344, la SEQ ID NO: 345 o la SEQ ID NO: 346.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión activador de u-plasminógeno como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión activador de u-plasminógeno" o "sitio de escisión u-PA" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por u-PA en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa u-PA. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácidos escindida por el activador de u-plasminógeno pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de u-PA es XiX2X3 (R/ ) *X4*X5X6X7 (SEQ ID NO: 347), donde X= es cualquier aminoácido;, X2 preferentemente es un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 preferentemente es un aminoácido amidico como N y Qr Un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X es cualquier aminoácido; X5 preferentemente es un aminoácido base como K y R, un aminoácido aromático como F, e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X6 preferentemente es un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X7 es cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitios de escisión de referencia para u-PA (SEQ ID NO: 347-368) . En la técnica se conocen sitios de escisión de u-PA adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, V. Ellis, u-Plasminogen Activator. En Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1677-1683 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010) , cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión activador de u-plasminógeno . En un aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión activador de u-plasminógeno comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 347, donde Xi es cualquier aminoácido;, X2 es un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X3 es un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X4 es cualquier aminoácido; X5 es un aminoácido base como K y R, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X6 es un aminoácido sin carga como C, S y T, un aminoácido aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X7 es cualquier aminoácido. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión activador de u-plasminógeno comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 347, donde ?? es P, A, L, S, T-, C, N o R; X2 es G, P, L, Y, S o T; X3 es G, A, S o N; y X4 es G, A, V, I, Y, S o R; X5 es P, V, L, F o R; X6 es G, A, V, Y, S o T; y X7 es G, V, L, F, Y, N o H. En otro aspecto de la presente modalidad, un sitio de escisión activador de u-plasminógeno comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 347, donde ? es P, A, L, S, T, C, N o R; X2 es G, Y o S ; X3 es G o S; y X4 es G, A, V, I, Y, S o R; X5 es V o R; X6 es T o Y; y X7 es G, V, L, F, Y, N o H. En otros aspectos de la presente modalidad, un sitio de escisión activador de u-plasminógeno comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 348, la SEQ ID NO: 349, NO: 350, la SEQ ID NO: 351, la SEQ ID NO: 352, la SEQ ID NO: 353, la SEQ ID NO: 354, la SEQ ID NO: 355 o la SEQ ID NO: 356, la SEQ ID NO: 357, la SEQ ID NO: 358, la SEQ ID NO: 359, la SEQ ID NO: 360, la SEQ ID NO: 361, la SEQ ID NO: 362, la SEQ ID NO: 363, la SEQ ID NO: 364, la SEQ ID NO: 365, la SEQ ID NO: 366, la SEQ ID NO: 367 o la SEQ ID NO: 368.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión activador de t-plasminógeno como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión activador de t-plasminógeno" o "sitio de escisión t-PA" se refiere a un enlace escindióle junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por t-PA en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa t-PA. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por t-PA pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión t-PA es X!X2X3 (R/K) *X4*X5X6X7 (SEQ ID NO: 369), donde Xi, X2, X3, X , Xs# X6 y X7 son cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitios de escisión de referencia para t-PA (SEQ ID NO: 370-373) . En la técnica se conocen sitios de escisión de t-PA adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, H. R. Lijnen and D. Collen, t-Plasminogen Activator . En Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1684-1689 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat . Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, base de datos en prensa (2010) , cada una de las cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia .

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión activador de t-plasminógeno . En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión activador de t-plasminógeno comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 369, donde Xi, X2, X3, 4, X5, e X7 son cualquier aminoácido.

En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión activador de t-plasminógeno comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 369, donde Xi es un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X4 es un aminoácido hidrofóbico aromático como F, e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X5 es un aminoácido básico como K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; e es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X7 es un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión activador de t-plasminógeno comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 369, donde Xi, es A, P, C o N X2 es A, L, P o Q; X3 es G, L, S o F; x4 es I, V, M o Y; X5 es A, V o K; X6 es G, V o P; y X7 es G, L o D. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión activador de t-plasminógeno comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 370, la SEQ ID NO: 371, la SEQ ID NO: 372 o la SEQ ID NO: 373.

Aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de triptasa-e como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de triptasa-e" o "sitio de escisión de prosemina" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por triptasa-e en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa triptasa-e. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por triptasa-e pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de triptasa-e es * (R/K) X1X2X3X4 (D/E) (SEQ ID NO: 374), donde Xi, X2, X3 y X4, son independientemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión de referencia para triptasa-e (SEQ ID NO: 375-386) . En la técnica se conocen sitios de escisión de triptasa-e adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, 0. Schilling and C. M. Overall, Proteo e-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36(ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010) , cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de triptasa-e. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de triptasa-e comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 374, donde Xi, X2, X3 y X4, son independientemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de triptasa-e comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 374, donde Xi es I o V; X2 es I o V; X3 es G o S; X4 es G o S. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de triptasa-e comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 375, la SEQ ID NO: 376, la SEQ ID NO: 377, la SEQ ID NO: 378, la SEQ ID NO: 379, la SEQ ID NO: 380, la SEQ ID NO: 381, la SEQ ID NO: 382, la SEQ ID NO: 383, la SEQ ID NO: 384, la SEQ ID NO: 385 o la SEQ ID NO: 386.

Aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de la proteasa-7 de mastocitos de ratón como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de la proteasa-7 de mastocitos de ratón" o "sitio de escisión de mMCP-7" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por mMCP-7 en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa mMCP-7. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por mMCP-7 pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de mMCP-7 es XiX2X3 (K/R) *X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 387), donde Xx es cualquier aminoácido; X2 es preferentemente un aminoácido amidico como N o Q, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X4, X5, Xe, 7 son cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión para mMMCP-7 (SEQ ID NO: 388-391) . En la técnica se conocen sitios de escisión de mMMCP-7 adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS : The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos) : D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos) : D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010) , cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia .

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende .un sitio de escisión de la proteasa-7 de mastocitos de ratón. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa-7 de mastocitos de ratón comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 387, donde Xi es cualquier aminoácido; X2 es un aminoácido amidico como N o Q, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X4, X5, X6, X7 son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa-7 de mastocitos de ratón comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 387, donde Xi es cualquier aminoácido; X2 es G, S o Q; X3 es A, P o S; y X4, X5, ??, X7 son cualquier aminoácido. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa-7 de mastocitos de ratón comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 388, la SEQ ID NO: 389, la SEQ ID NO: 390 o la SEQ ID NO: 391.

Aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de la enzima-1 convertidora de endotelina como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de la enzima-1 convertidora de endotelina" o "sitio de escisión de ECE-1" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteolisis en el enlace escindible por ECE-1 en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa ECE-1. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por ECE-1 pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de la ECE-1 es XiX2X3Xi* ( F/L/I/V/Y) 5X6X7 (SEQ ID NO: 392) , donde Xl X2, X3, X4, X5, ?e y X7 son cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión para la ECE-1 (SEQ ID NO: 393-412) . En la técnica se conocen sitios de escisión de la ECE-1 adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, K. Ahn and G. D. Johnson, Endothelin-Converting Enzyme-1. En Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 429-434 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, Londres, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat . Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36(ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos) : D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de la enzima-1 convertidora de endotelina. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la enzima-1 convertidora de endotelina comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 392, donde Xlt X2, X3, X4, X5, Xe y son independientemente cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la enzima-1 convertidora de endotelina comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 392, donde Xi es G, P, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, o un aminoácido sin carga como C, S y T; X2 es F, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático G, P, A, V, L, I y M; X4 es S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X5 es F, W, S, C, N, E, un aminoácido positivo como H, K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; ?d es G, P, V, L, F, Y, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, o un aminoácido sin carga como C, S y T; y X7 es P, A, V, L, M, F, Y, S, N, D o K. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la enzima-1 convertidora de endotelina comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 392, donde Xi es G, P, Y, C, D, K, R o H; X2 es P, L, I, F, S, C, Q, D, R o H; X3 es V, L, I, S, Q, K o R; X4 es G, P, L, F, Y, W o R; X5 es V, I, M, F, N, R o H; X6 es P, L, F, T, E o H; y X7 es P, V, L, F, S, N, D o K. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la enzima-1 convertidora de endotelina comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 392, donde Xx es G, D o H; X2 es I o F; X3 es V, I, S, Q o K; x4 es P, F o W; X5 es I, N, R o H; X6 es L, T o H; y X7 es P, S o D. En otros aspectos de esta modalidad, el sitio de escisión de la enzima-1 convertidora de endotelina comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 393, la SEQ ID NO: 394, la SEQ ID NO: 395, la SEQ ID NO: 396, la SEQ ID NO: 397, la SEQ ID NO: 398, la SEQ ID NO: 399, la SEQ ID NO: 400, la SEQ ID NO: 401, la SEQ ID NO: 402, la SEQ ID NO: 403, la SEQ ID NO: 404, la SEQ ID NO: 405, la SEQ ID NO: 406, la SEQ ID NO: 407, la SEQ ID NO: 408, la SEQ ID NO: 409, la SEQ ID NO: 410, la SEQ ID NO: 411 o la SEQ ID NO: 412.

Aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de la proteina del grupo sanguíneo Kell como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de la proteina del grupo sanguíneo Kell" o "sitio de escisión de la KBGP" se refiere a un enlace escindióle junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindióle por KBGP en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa KBGP. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por KBGP pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de la KBGP es X!X2X3X4*X5X6X7X8 ( SEQ ID NO: 413), donde Xi es preferentemente un aminoácido ácido como D y E; X2 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X4 es preferentemente un aminoácido aromático como F, W e Y; X5 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, pr A, V, L, I y ; Xe es preferentemente un aminoácido amidico como N y Q; X7 es preferentemente un aminoácido sin carga como C, S y T; X8 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y . La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión de referencia para la KBGP (SEQ ID NO: 414-415) . En la técnica se conocen sitios de escisión de la KBGP adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, 0. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat . Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D . Rawlings, et ál., MEROPS: The Péptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál . , MEROPS: The Péptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Péptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010) , cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de la proteina del grupo sanguíneo de Kell. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteína del grupo sanguíneo de Kell comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 413, donde Xi es un aminoácido ácido como D y E; X2 es T o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y ; X es un aminoácido aromático como F, W y Y; X5 es T o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; Xe es un aminoácido amidico como N y Q; X7 es un aminoácido sin carga como C, S y T; o un aminoácido ramificado C-beta como I, V o T; X8 es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteina del grupo sanguíneo de Kell comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 413, donde ?? es D; X2 es I, V o T; X3 es I, V o T; X4 es W; X5 es I, V o T; X6 es N; X7 es T; Xa es P. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteína del grupo sanguíneo de Kell comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 414 o la SEQ ID NO: 415.

Aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de catepsina L como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de catepsina L" se refiere a un enlace escindióle junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindióle por catepsina L en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa catepsina L. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por catepsina L pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de conocerse excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de la catepsina L es XiX2X3X4*X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 416, donde ?? es preferentemente W, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es preferentemente L, V, F o Y; y X4, X5, X6, y Xe son cualquier aminoácido. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión para la catepsina L (SEQ ID NO: 417-443). En la técnica se conocen sitios de escisión de la catepsina L adicionales o pueden definirse por métodos de rutina. Véase, por ejemplo, J. C. Kelly, et ál., Profiling of Calpain Activity with a Series of FRET-Based Substrates, Biochim. Biophys. Acta 1794: 1505-1509 (2009); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Librarles for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat . Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 36 (ejemplar de base de datos): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et ál., MEROPS: The Peptidase Datábase, Nucleic Acids Res. 38 (ejemplar de base de datos): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et ál., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Datábase, Base de datos en prensa (2010), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de catepsina L. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de catepsina L comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 416, donde Xi es , un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, un aminoácido positivo como H, K y R, un aminoácido sin carga como C, S y T, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X2 es cualquier aminoácido; X3 es L, V, F o Y; y x4, X5, Xe, X7 y Xs son cualquier aminoácido. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de catepsina L comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 416, donde Xi es G, P, A, L, Q, E o K; X2 es un aminoácido aromático como F, W y Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; X3 es L, V, F o Y; X4 es G, A, F, T, Q, E, K o R; X5 es G, A, S, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido positivo como H, K y R; X6 es P, A, L, I, S, Q, un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido positivo como H, K y R; X7 es un aminoácido positivo como H, K y R, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X8 es P, L, S, T, un aminoácido ácido como D y E, un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido básico como K y R. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de catepsina L comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 416, donde ¾, es G, A, Q, E o K; X2 es G, P, L o F; X3 es L, V, F o Y; X4 es G, A, F, T, Q, E, K o R; X5 es A, S, Q, E, K o R; X6 es P, A, L, I, S o E; X7 P, L o R; y Xs es P, L, S o K. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de catepsina L comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 417, la SEQ ID NO: 418, la SEQ ID NO: 419, la SEQ ID NO: 420, la SEQ ID NO: 421, la SEQ ID NO: 422, la SEQ ID NO: 423, la SEQ ID NO: 424, la SEQ ID NO: 425, la SEQ ID NO: 426, la SEQ ID NO: 427, la SEQ ID NO: 428, la SEQ ID NO: 429, la SEQ ID NO: 430, la SEQ ID NO: 431, la SEQ ID NO: 432, la SEQ ID NO: 433, la SEQ ID NO: 434, la SEQ ID NO: 435, la SEQ ID NO: 436, la SEQ ID NO: 437, la SEQ ID NO: 438, la SEQ ID NO: 439, la SEQ ID NO: 440, la SEQ ID NO: 441, la SEQ ID NO: 442 o la SEQ ID NO: 443.

Aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de PARI como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de PARI" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por PARI en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa PARI. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por PARI pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de PARI es X1X2X3 4 (K/R) X5 (SEQ ID NO: 444, donde Xi es preferentemente un aminoácido pequeño y no polar como A, C G, S y T; X2 es preferentemente un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X3 es preferentemente un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X4 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X5 es preferentemente un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W o Y. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión de referencia para PARI (SEQ ID NO: 445-452). En la técnica se conocen sitios de escisión de la PARI adicionales o pueden definirse por métodos de rutina.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de PARI. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de PARI comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 444, donde Xi es un aminoácido pequeño y no polar como A, C G, S y T; X2 es un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, o Y; X3 es un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X4 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X5 es preferentemente un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W o Y. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de PARI comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 444, donde Xi es S, T o G; X2 es F o Y; X3 es L, P o F; X4 es A, G, I o L; y X5 es F o N. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de PARI comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 445, la SEQ ID NO: 446, la SEQ ID NO: 447, la SEQ ID NO: 448, la SEQ ID NO: 449, la SEQ ID NO: 450, la SEQ ID NO: 451 o la SEQ ID NO: 452.

Aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de PAR2 como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de PAR2" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por PAR2 en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa PAR2. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por PAR2 pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de PAR2 es X1X2X3 (K/R) X5 (SEQ ID NO: 453) , donde Xi es preferentemente un aminoácido pequeño y no polar como A, C G, S y T; X2 es preferentemente un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V; X3 es preferentemente un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V; X4 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X5 es preferentemente un aminoácido grande no polar como F, I, L, M, V. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión de referencia para PAR2 (SEQ ID NO: 454-455) . En la técnica se conocen sitios de escisión de la PAR2 adicionales o pueden definirse por métodos de rutina.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de PAR2. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de PAR2 comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 453, donde Xi es un aminoácido pequeño y no polar como A, C, G, S y T; X2 es un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V; X3 es un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V; X4 es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M; y X5 es un aminoácido grande no polar como F, I, L, M, V. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de PAR2 comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 453, donde Xi es S; X2 es I o L; X3 es I o L; X4 es A o G; X5 es L o V. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de PAR2 comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 454 o la SEQ ID NO: 455.

Aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de PAR3 como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de PAR3" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por PAR3 en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa PAR3. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por PAR3 pueda ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones,' una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de PAR3 es X1X2X3 X5X6 ( SEQ ID NO: 456) , donde Xi es preferentemente un aminoácido pequeño y no polar como A, C G, S y T; X2 es preferentemente un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V; X3 es preferentemente un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido básico como K y R; X4 es preferentemente un aminoácido pequeño y no polar como A, C, G, S y T; X5 es preferentemente un aminoácido pequeño y no polar como A, C, G, S y T, o un aminoácido pequeño y polar como D, N y P; y ?d es preferentemente un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido pequeño y polar como D, N o P. La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión de referencia como PAR3 (SEQ ID NO: 457-459) . En la técnica se conocen sitios de escisión de la PAR3 adicionales o pueden definirse por métodos de rutina .

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de PAR3. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de PAR3 comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 456, donde Xi es un aminoácido pequeño y no polar como A, C G, S y T; X2 es un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V; X3 es un aminoácido amidico como N y Q, o un aminoácido básico como K y R; X4 es un aminoácido pequeño y no polar como A, C, G, S y T; X5 es un aminoácido pequeño y no polar como A, C, G, S y T, o un aminoácido pequeño y polar como D, N o P; y ?ß es un aminoácido ácido como D y E, o un aminoácido pequeño y polar como D, N o P. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de PAR3 comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 456, donde Xi es S o T; X2 es F; X3 es N o R; X4 es A o G; X5 es A, G o N y X6 es P o E. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de PAR3 comprende, por ejemplo, SEQ ID NO: 457, la SEQ ID NO: 458 o la SEQ ID NO: 459.

Aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de PAR4 como un sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de PAR4" se refiere a un enlace escindible junto a elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para detectar proteólisis en el enlace escindible por PAR4 en condiciones adecuadas para actividad de la proteasa PAR4. Se prevé que cualquier secuencia de aminoácido escindida por PAR4 pueda Ser útil en aspectos de la presente descripción. A pesar de haber excepciones, una secuencia de consenso generalizada para un sitio de escisión de PAR4 es X1X2X3 (K/R/Q/F) X5 (SEQ ID NO: 460), donde Xi es preferentemente un aminoácido pequeño y no polar como A, C, G, S y T; X2 es preferentemente un aminoácido grande y no polar como F, I, L, M, V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X3 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I, and M; X4 es preferentemente un aminoácido hidrofóbico aromático como G, P, A, V, L, I y M; y X5 es preferentemente un aminoácido básico como K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M . La Tabla 4 enumera ejemplos de sitio de escisión de referencia para PAR4 (SEQ ID NO: 461-478). En la técnica se conocen sitios de escisión de la PAR4 adicionales o pueden definirse por métodos de rutina.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende un sitio de escisión de PAR4. En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de PAR4 comprende una secuencia de consenso SEQ ID NO: 460, donde Xi es un aminoácido pequeño y no polar como A, C G, S y T; X2 es un aminoácido grande y no polar como F, I, L, , V, o un aminoácido aromático como F, H, W o Y; X3 es un aminoácido hidrofóbico alifático como G, p f A, V, L, I, and ; X4 es un aminoácido hidrofóbico aromático como G, P, A, V, L, I y M; y X5 es un aminoácido básico como K y R, un aminoácido hidrofóbico aromático como F, W e Y, o un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V, L, I y M. En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de PAR4 comprende la secuencia de consenso SEQ ID NO: 460, donde Xi es A, G, S o T; X2 es F o Y; X3 es A o P; X4 es A o G; y X5 es A, V, P, F, W, Y o K. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de PAR4 comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 461, la SEQ ID NO: 462, la SEQ ID NO: 463, la SEQ ID NO: 464, la SEQ ID NO: 465, la SEQ ID NO: 466, la SEQ ID NO: 467, la SEQ ID NO: 468, la SEQ ID NO: 469, la SEQ ID NO: 470, la SEQ ID NO: 471, la SEQ ID NO: 472, la SEQ ID NO: 473, la SEQ ID NO: 474, la SEQ ID NO: 475, la SEQ ID NO: 476, la SEQ ID NO: 477 o la SEQ ID NO: 478.

La ubicación de un sitio de escisión de inactivación es un aspecto critico que se rige por diversos criterios. En primer lugar, la ubicación del sitio de escisión de inactivación no debería afectar sustancialmente la capacidad de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de intoxicar su célula diana. Tal como se usa en la presente, el término "no afectar sustancialmente", con respecto a la intoxicación, se refiere a una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción que puede aún ejecutar el mecanismo de intoxicación global donde una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium ingresa a una célula diana y escinde proteoliticamente un sustrato diana y encierra la unión de una toxina de Clostridium o una quimera de toxina de Clostridium con un complejo receptor de alta o baja afinidad, la internalización del complejo toxina/receptor, la traslocación de la cadena ligera en el citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato diana.

En un aspecto de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación puede intoxicar una célula diana al igual que la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin la modificación del sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación puede intoxicar una célula diana mediante, por ejemplo, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% que la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin la modificación del sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación puede intoxicar una célula diana mediante, por ejemplo, como máximo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% que la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin la modificación del sitio de escisión de inactivación.

En segundo lugar, la ubicación de un sitio de escisión de inactivación debería estar en una región expuesta de la superficie de la toxina o quimera de toxina de Clostridium y no enterrado internamente dentro de la proteína o enmascarado por elementos de estructura secundarios. La exposición de la superficie adecuada del sitio de escisión de inactivación facilita el acceso adecuado del sitio a su correspondiente proteasa, permitiendo así la escisión proteolítica . La escisión proteolítica del sitio de escisión de inactivación mediante su correspondiente proteasa inactiva sustancialmente la capacidad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de intoxicar la célula. Tal como se usa en la presente, el término "inactiva sustancialmente", con respecto a la intoxicación, se refiere a una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción que, luego de la escisión en un sitio de escisión de inactivación, tiene una capacidad reducida de ejecutar el mecanismo de intoxicación global donde una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium ingresa a una célula diana y escinde proteolíticamente un sustrato diana y encierra la unión de una toxina de Clostridium o una quimera de toxina de Clostridium con un complejo receptor de alta o baja afinidad, la internalización del complejo toxina/receptor, la traslocación de la cadena ligera en el citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato diana.

En un aspecto de esta modalidad, la escisión proteolitica de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción en un sitio de escisión de inactivación provoca la completa incapacidad de la toxina de intoxicar una célula diana en comparación con la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero en un estado proteolitico no escindido (es decir, el sitio de escisión de intoxicación está intacto o no escindido) . En otros aspectos de esta modalidad, la escisión proteolitica de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción en un sitio de escisión de inactivación provoca, por ejemplo, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de disminución de la capacidad de intoxicar una célula diana en comparación con la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero en un estado proteolitico no escindido. En otros aspectos de esta modalidad, la escisión proteolitica de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción en un sitio de escisión de inactivación provoca, por ejemplo, como máximo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de disminución de la capacidad de intoxicar una célula diana en comparación con la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero en un estado proteolitico no escindido.

En un aspecto de esta descripción, un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación. Tal como se usa en la presente, el término "región del sitio de escisión de inactivación" se refiere a una secuencia de aminoácido de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que puede modificarse para contener un sitio de escisión de inactivación debido a que la modificación no alterará sustancialmente la capacidad de la proteina de intoxicar una célula diana; y tras la exposición a su proteasa análoga, el sitio de escisión de inactivación se escindirá e inactivará sustancialmente la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium. La ubicación de un sitio de escisión de inactivación puede ser cualquier lugar dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, con la condición de que la ubicación no afecte sustancialmente la capacidad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de intoxicar una célula diana; y tras la exposición a su proteasa análoga, la escisión del sitio de escisión de inactivación inactivará sustancialmente la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium. La Tabla 5 enumera ejemplos de regiones del sitio de escisión de inactivación adecuadas para usar con una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de la región del sitio de escisión de inactivación. En aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocación o del subdominio HCN.

En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 462-496 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 458-492 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 464-487 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 463-496 de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 458-491 de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 434-467 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 453-486 de la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 458-491 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 475-508 de la SEQ ID NO: 22; aminoácidos 443-476 de la SEQ ID NO: 23; o aminoácidos 434-467 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En aun otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 618-634 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 614-630 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 605-621 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 613-629 de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 609-625 de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 587-603 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 604-620 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 605-621 de la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 610-626 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 627-643 de la SEQ ID NO: 22; aminoácidos 596-612 de la SEQ ID NO: 23; o aminoácidos 587-603 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

Tabla 5. Regiones del sitio de escisión de inactivación de toxinas de Clostrídium SEQ Regiones del sitio de escisión de inactivación Toxina ID NO: BoNT/A L462- T618- G638- C665- N752- N826- T844- K871- L496 I634 D651 N687 N765 083S L863 ?895 L464- A605- G625- BoNT/B L652- N739- N813- Y831- S858- P487 V621 N638 N674 D752 A82 1850 G882 BoNT/CI L463- S496 1613-1629 G633- L660- K747- H821- S839- N866- N646 E682 Q760 D830 K8S8 N890 BoNT/D L458- I609-I623 G629- L6S6- K743- H817- S83S- N862- S491 N642 E678 Q756 D826 K854 N886 BoNT/E L434- A587- G607- L634- N724- H800- T8t8- K8 5- D467 V603 N620 N659 D739 Q809 I837 D869 BoNT/F L453- A605- G62S- L652- N742- H818- T836- K863- N486 V621 N038 N877 N757 N827 I855 G887 BoNT/G L458- SG10- GG30- 657- N744- N818- ?836· S863- S491 1626 N543 N679 D7S7 N827 I8S5 G887 L47S- S627- G647- L074- K76I- N835- V834- V879- ToNT SS08 V643 N660 GS96 E774 K844 V871 N903 BaNT L443- A596- G81&- L643- N733- N809- T828- K855- N478 V612 N629 S668 N748 P819 I8 7 G879 L434- A587- G607- L634- N724- BuNT H800- T818- K845- 10 D487 V603 N620 S859 D739 Q809 1837 D869 En aun otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostrídium o quimera de toxina de Clostrídium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 638-651 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 634-647 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 625-638 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 633-646 de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 629-642 de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 607-620 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 624-637 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 625-638 de la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 630-643 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 647-660 de la SEQ ID NO: 22; aminoácidos 616-629 de la SEQ ID NO: 23; o aminoácidos 607-620 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En aspectos adicionales de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 665-687 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 661-683 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 652-674 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 660-682 de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 656-678 de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 634-659 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 651-676 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 652-677 de la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 657-679 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 674-696 de la SEQ ID NO: 22; aminoácidos 643-668 de la SEQ ID NO: 23; o aminoácidos 634-659 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 752-765 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 748-761 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 739-752 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 747-760 de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 743-756 de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 724-739 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 741-756 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 742-757 de la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 744-757 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 761-774 de la SEQ ID NO: 22; aminoácidos 733-748 de la SEQ ID NO: 23; o aminoácidos 724-739 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En aun otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 826-835 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 824-831 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 813-824 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 821-830 de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 817-826 de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 800-809 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 817-826 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 818-827 de la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 818-827 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 835-844 de la SEQ ID NO: 22; aminoácidos 809-819 de la SEQ ID NO: 23; o aminoácidos 800-809 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En aun otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región' del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 844-863 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 840-859 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 831-850 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 839-858 de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 835-854 de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 818-837 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 835-854 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 836-855 de la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 836-855 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 854-871 de la SEQ ID NO: 22; aminoácidos 828-847 de la SEQ ID NO: 23; o aminoácidos 818-837 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En aspectos adicionales de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 871-895 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 867-891 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 858-882 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 866-890 de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 862-886 de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 845-869 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 862-886 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 863-887 de la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 863-887 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 879-903 de la SEQ ID NO: 22; aminoácidos 855-879 de la SEQ ID NO: 23; o aminoácidos 845-869 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En otro aspecto de esta modalidad, una BoNT/A o quimera de BoNT/A descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocación o del subdominio de HCK- En otros aspectos de esta modalidad, una BoNT/A o quimera de BoNT/A descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 462-496, 618-634, 638-651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863 u 871-895 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; o que comprende los aminoácidos 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822-831, 840-859 u 867— 891 de la SEQ ID NO: 3. En aun otros aspectos de esta modalidad, una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de la región del sitio de escisión de inactivación está codificada por la SEQ ID NO: 530, la SEQ ID NO: 532, la SEQ ID NO: 534 o la SEQ ID NO: 536. En aun otros aspectos de esta modalidad, una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de la región del sitio de escisión de inactivación comprende la SEQ ID NO: 531, la SEQ ID NO: 533, la SEQ ID NO: 535 o la SEQ ID NO: 537.

En aun otro aspecto de esta modalidad, una BoNT/B o quimera de BoNT/B descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocación o del subdominio de HCN- En otros aspectos de esta modalidad, una BoNT/B o quimera de BoNT/B descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 464-487, 605-621, 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850 u 858-882 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

En aun otro aspecto de esta modalidad, una BoNT/Cl o quimera de BoNT/Cl descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocación o del subdominio de HCN. En otros aspectos de esta modalidad, una BoNT/Cl o quimera de BoNT/Cl descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 463-496, 613-629, 633-646, 660-682, 747-760, 821-830, 839-858 u 866-890 de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12.

En un aspecto adicional de esta modalidad, una BoNT/D o quimera de BoNT/D descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocación o del subdominio de HCN. En otros aspectos de esta modalidad, una BoNT/D o quimera BoNT/D descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 458-491, 609-625, 629-642, 656-678, 743-756, 817-826, 835-854 u 862-886 de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14.

En otro aspecto de esta modalidad, una BoNT/E o quimera de BoNT/E descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocación o del subdominio de HCN. En otros aspectos de esta modalidad, una BoNT/E o quimera de BoNT/E descrita en la 0 presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 u 845-869 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17.

En aun otro aspecto de esta modalidad, una BoNT/F o quimera de BoNT/F descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocación o del subdominio de HCN. En otros aspectos de esta modalidad, una BoNT/F o quimera de BoNT/F descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 453-486, 604-620, 624-637, 651-676, 741-756, 817-826, 835-854 u 862-886 de la SEQ ID NO: 18; o que comprende los aminoácidos 453-486, 605-621, 625-638, 652-677, 742-757, 818-827, 836-855 u 863-887 de la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 20.

En un aspecto adicional de esta modalidad, una BoNT/G o quimera de BoNT/G descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocación o del subdominio de HCN- En otros aspectos de esta modalidad, una BoNT/G o quimera de BoNT/G descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 458-491, 610-626, 630-643, 657-679, 744-757, 818-827, 836-855 u 863-887 de la SEQ ID NO: 21.

En otro aspecto de esta modalidad, una TeNT o quimera de TeNT descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocacion o del subdominio de HCN. En otros aspectos de esta modalidad, una TeNT o quimera de TeNT descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 475-508, 627-643, 647-660, 674-696, 761-774, 835-844, 854-871 u 879-903 de la SEQ ID NO: 22.

En aun otro aspecto de esta modalidad, una BaNT o quimera de BaNT descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocacion o del subdominio de HCN. En otros aspectos de esta modalidad, una BaNT o quimera de BaNT descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847 u 855-879 de la SEQ ID NO: 23.

En aun otro aspecto de esta modalidad, una BuNT o quimera de BuNT descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación está ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación del dominio de traslocación o del subdominio de HCN. En otros aspectos de esta modalidad, una BuNT o quimera de BuNT descrita en la presente descripción comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 u 845-869 de la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25.

En un aspecto de la presente descripción, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad mayor que el margen de seguridad para la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otras palabras, la adición de un sitio de escisión de inactivación aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad mayor con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, por ejemplo, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, 110%, al menos 120%, al menos 130%, al menos 140%, al menos 150%, al menos 160%, al menos 170%, al menos 180%, al menos 190%, al menos 200%, 210%, al menos 220%, al menos 230%, al menos 240%, al menos 250%, al menos 260%, al menos 270%, al menos 280%, al menos 290% o al menos 300%, con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, por ejemplo, como máximo 10%, como máximo 20%, como máximo 30%., como máximo 40%, como máximo 50%, como máximo 60%, como máximo 70%, como máximo 80%, como máximo 90%, como máximo 100%, 110%, como máximo 120%, como máximo 130%, como máximo 140%, como máximo 150%, como máximo 160%, como máximo 170%, como máximo 180%, como máximo 190%, como máximo 200%, 210%, como máximo 220%, como máximo 230%, como máximo 240%, como máximo 250%, como máximo 260%, como máximo 270%, como máximo 280%, como máximo 290% o como máximo 300%, con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En aun otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, por ejemplo, alrededor de 10% a alrededor de 300%, alrededor de 20% a alrededor de 300%, alrededor de 30% a alrededor de 300%, alrededor de 40% a alrededor de 300%, alrededor de 50% a alrededor de 300%, alrededor de 60% a alrededor de 300%, alrededor de 70% a alrededor de 300%, alrededor de 80% a alrededor de 300%, alrededor de 90% a alrededor de 300%, o alrededor de 100% a alrededor de 300%, con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación .

En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, por ejemplo, al menos 1 vez, al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces, con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En aun otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, por ejemplo, al menos 1 vez, como máximo 1 vez, como máximo 3 veces, como máximo 4 veces, como máximo 5 veces, como máximo 6 veces, como máximo 7 veces, como máximo 8veces, como máximo 9 veces o como máximo 10 veces, con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. En aun otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, por ejemplo, alrededor de 1 vez a alrededor de 10 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 9 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 8 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 7 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 6 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 5 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 9 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 8 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 7 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 6 veces o alrededor de 2 veces a alrededor de 5 veces.

En otra modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional. En aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en, por ejemplo, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, 110%, al menos 120%, al menos 130%, al menos 140%, al menos 150%, al menos 160%, al menos 170%, al menos 180%, al menos 190%, al menos 200%, 210%, al menos 220%, al menos 230%, al menos 240%, al menos 250%, al menos 260%, al menos 270%, al menos 280%, al menos 290% o al menos 300%. En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en, por ejemplo, como máximo 10%, como máximo 20%, como máximo 30%, como máximo 40%, como máximo 50%, como máximo 60%, como máximo 70%, como máximo 80%, como máximo 90%, como máximo 100%, 110%, como máximo 120%, como máximo 130%, como máximo 140%, como máximo 150%, como máximo 160%, como máximo 170%, como máximo 180%, como máximo 190%, como máximo 200%, 210%, como máximo 220%, como máximo 230%, como máximo 240%, como máximo 250%, como máximo 260%, como máximo 270%, como máximo 280%, como máximo 290% o como máximo 300%. En aun otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en, por ejemplo, alrededor de 10% a alrededor de 300%, alrededor de 20% a alrededor de 300%, alrededor de 30% a alrededor de 300%, alrededor de 40% a alrededor de 300%, alrededor de 50% a alrededor de 300%, alrededor de 60% a alrededor de 300%, alrededor de 70% a alrededor de 300%, alrededor de 80% a alrededor de 300%, alrededor de 90% a alrededor de 300% o alrededor de 100% a alrededor de 300%.

En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en, por ejemplo, al menos 1 vez, al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces. En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en, por ejemplo, al menos 1 vez, al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces. En aun otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en, por ejemplo, alrededor de 1 vez a alrededor de 10 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 9 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 8 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 7 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 6 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 5 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 9 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 8 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 7 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 6 veces o alrededor de 2 veces a alrededor de 5 veces.

En otra modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede modificarse para incluir un solo sitio de escisión de inactivación. En aun otra modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede modificarse para incluir varios sitios de escisión de inactivación. En aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede comprender, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede comprender, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios de escisión de inactivación. En aun otros aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede comprender, por ejemplo, 2-10 sitios de escisión de inactivación, 2-8 sitios de escisión de inactivación, 2-6 sitios de escisión de inactivación, 2-4 sitios de escisión de inactivación, 2-3 sitios de escisión de inactivación, 3-9 sitios de escisión de inactivación, 3-7 sitios de escisión de inactivación, 3-5 sitios de escisión de inactivación o 3-4 sitios de escisión de inactivación.

En otra modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede modificarse para incluir únicamente un tipo de sitio de escisión de inactivación, tal como, por ejemplo, un sitio de escisión de trombina. En aun otra modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede modificarse para incluir diversos tipos distintos de sitios de escisión de inactivación, tales como, por ejemplo, un sitio de escisión de trombina, un sitio de escisión de Factor Xa, un sitio de escisión de MMP-2 y un sitio de escisión de MMP-9. En aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede comprender, por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 5 tipos distintos de sitios de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede comprender, por ejemplo, como máximo 2, 3, 4 o 5 tipos distintos de sitios de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación puede comprender, por ejemplo, 2-5 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación, 2-4 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación, 2-3 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación, 3-5 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación o 3-4 tipos diferentes de sitios de escisión de inactivación.

La modificación de una región del sitio de escisión de inactivación puede lograrse alterando al menos uno de los aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación. Los ejemplos no taxativos de una alteración del aminoácido incluyen una supresión de un aminoácido, una adición de un aminoácido o una sustitución de un aminoácido original por un aminoácido diferente. En aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación se modifica para incluir un sitio de escisión de inactivación alterando, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación se modifica para incluir un sitio de escisión de inactivación alterando, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación. En aun otros aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación se modifica para incluir un sitio de escisión de inactivación alterando, por ejemplo, 1-5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 1-4 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 1-3 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 1-2 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 2-5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 2-4 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 2-3 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 3-5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación o 4-5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación.

En aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación se modifica para incluir un sitio de escisión de inactivación eliminando, agregando, sustituyendo o cualquier combinación de estas, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación. En otros aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación se modifica para incluir un sitio de escisión de inactivación eliminando, agregando, sustituyendo o cualquier combinación de estas, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación. En aun otros aspectos de esta modalidad, una región del sitio de escisión de inactivación se modifica para incluir un sitio de escisión de inactivación eliminando, agregando, sustituyendo o cualquier combinación de estas, por ejemplo, 1-5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 1-4 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 1-3 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 1-2 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 2-5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 2-4 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 2-3 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación, 3-5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación o 4-5 aminoácidos dentro de la región del sitio de escisión de inactivación .

La modificación de una región del sitio de escisión de inactivación para incluir un sitio de escisión de inactivación puede lograrse usando procesos de mutagénesis estándar conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos no taxativos de procesos de mutagénesis, asi como también reactivos, condiciones y protocolos bien caracterizados se encuentran comercialmente disponibles de 3 vendedores comerciales que incluyen, de modo no taxativo, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos protocolos son procesos de rutina que se encuentran dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

Tal como se menciona anteriormente, las toxinas de Clostridium y quimeras de toxinas de Clostridium descritas en la presente descripción se traducen como polipéptidos de cadena simple que se escinden posteriormente por escisión proteolitica dentro de una región de bucle de disulfuro. Este proceso postraduccional proporciona una molécula de cadena doble que se mantiene junta por un enlace simple de disulfuro e interacciones no covalentes. La escisión proteolitica dentro de una región de bucle de disulfuro puede lograrse usando los sitios de escisión de la proteasa endógenos de origen natural dentro de la región de bucle de cadena doble o diseñando la región de bucle de cadena doble para comprender un sitio de escisión de la proteasa exógeno.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, una región de bucle de cadena doble. Tal como se usa en la presente, el término "región de bucle de cadena doble" se refiere a una secuencia de aminoácidos de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium flanqueada por aminoácidos de cisteina y que contiene un sitio de escisión de la proteasa usado para convertir la forma de cadena simple de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium en su forma de cadena doble (Tabla 6) . Los ejemplos no taxativos de una región de bucle de cadena doble incluyen una región de bucle de cadena doble de BoNT/A que comprende aminoácidos 430-454 de la SEQ ID NO: 1; una región de bucle de cadena doble de BoNT/B que comprende los aminoácidos 437-446 de la SEQ ID NO: 2; una región de bucle de cadena doble de BoNT/Cl que comprende los aminoácidos 437-453 de la SEQ ID NO: 3; una región de bucle de cadena doble de BoNT/D que comprende los aminoácidos 437-450 de la SEQ ID NO: 4; una región de bucle de cadena doble de BoNT/E que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 5; una región de bucle de cadena doble de BoNT/F que comprende los aminoácidos 429-445 de la SEQ ID NO: 6; una región de bucle de cadena doble de BoNT/G que comprende los aminoácidos 436-450 de la SEQ ID NO: 7; y una región de bucle de cadena doble de TeNT que comprende los aminoácidos 439-467 de la SEQ ID NO: 8 (Tabla 6) Por lo tanto, en una modalidad, una región de bucle de cadena doble comprende una región de bucle de cadena doble de toxina de Clostridium. En aspectos de esta modalidad, una región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, una región de bucle de cadena doble de BoNT/A, una región de bucle de cadena doble de BoNT/B, una región de bucle de cadena doble de BoNT/Cl, una región de bucle de cadena doble de BoNT/D, una región de bucle de cadena doble de BoNT/E, una región de bucle de cadena doble de BoNT/F, una región de bucle de cadena doble de BoNT/G, una región de bucle de cadena doble de TeNT, una región de bucle de cadena doble de BaNT o una región de bucle de cadena doble de BuNT. En otros aspectos de esta modalidad, una región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, una región de bucle de cadena doble de BoNT/A que comprende los aminoácidos 430-454 de la SEQ ID NO: 1; una región de bucle de cadena doble BoNT/B que comprende los aminoácidos 437-446 de la SEQ ID NO: 2; una región de bucle de cadena doble BoNT/Cl que comprende los aminoácidos 437-453 de la SEQ ID NO: 3; una región de bucle de cadena doble BoNT/D que comprende los aminoácidos 437-450 de la SEQ ID NO: 4; una región de bucle de cadena doble BoNT/E que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 5; una región de bucle de cadena doble BoNT/F que comprende los aminoácidos 429-445 de la SEQ ID NO: 6; una región de bucle de cadena doble BoNT/G que comprende los aminoácidos 436-450 de la SEQ ID NO: 7; o una región de bucle de cadena doble TeNT que comprende los aminoácidos 439-467 de la SEQ ID NO: 8; una región de bucle de cadena doble BaNT que comprende los aminoácidos 421-435 de la SEQ ID NO: 9; o una región de bucle de cadena doble BuNT que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 10.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de la proteasa endógena de bucle de cadena doble. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de la proteasa endógena de bucle de cadena doble" es sinónimo de "sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de origen natural" y se refiere a un sitio de escisión de la proteasa de origen natural encontrado dentro de la región de bucle de cadena doble de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de origen natural e incluye, de modo no taxativo, variantes del sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de toxina de Clostridium de origen natural, tales como, por ejemplo, isoformas del sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de toxina de Clostridium y subtipos del sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de toxina de Clostridium. Ejemplos no taxativos de un sitio de escisión de la proteasa endógena incluyen, por ejemplo, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/A, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/Br un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/Cl, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/D, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/E, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/F, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/G y un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de TeNT.

Mientras que la identidad de la proteasa se desconoce actualmente, se determinó el sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble para muchas toxinas de Clostridium. En las BoNT, la escisión en K448-A449 convierte la forma de polipéptido simple de BoNT/A en la forma de cadena doble; la escisión en K441-A442 convierte la forma de polipéptido simple de BoNT/B en la forma de cadena doble; la escisión en K449-T450 convierte la forma de polipéptido simple de BoNT/Cl en la forma de cadena doble; la escisión en R445-D446 convierte la forma de polipéptido simple de BoNT/D en la forma de cadena doble; la escisión en R422-K423 convierte la forma de polipéptido simple de BoNT/E en la forma de cadena doble; la escisión en K439-A440 convierte la forma de polipéptido simple de BoNT/F en la forma de cadena doble; y la escisión en K446-S447 convierte la forma de polipéptido simple de BoNT/G en la forma de cadena doble. La escisión proteolitica de la forma de polipéptido simple de TeNT en A457-S458 resulta en la forma de cadena doble. La escisión proteolitica de la forma de polipéptido simple de BaNT en K431-N432 resulta en la forma de cadena doble. La escisión proteolitica de la forma de polipéptido simple de BuNT en R422-K423 resulta en la forma de cadena doble. El sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble está unido operativamente a una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium como una proteina de fusión. Sin embargo, también cabe destacar que los sitios de escisión adicionales dentro del bucle de cadena doble parecen estar escindidos, provocando la pérdida de la creación de un pequeño fragmento de péptido. Como ejemplo no taxativo, la escisión del polipéptido de cadena simple de BoNT/A finalmente provoca la pérdida de un fragmento de diez aminoácidos dentro del bucle de cadena doble.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende una región de bucle de cadena doble que incluye un sitio de escisión de la proteasa endógena de bucle de cadena doble. En aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa endógena de bucle de cadena doble ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/A, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/B, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/Cl, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/D, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/E, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/F, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BoNT/G, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de TeNT, un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BaNT o un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de BuNT. En otros aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa endógena de bucle de cadena doble ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, una región de bucle de cadena doble de BoNT/A que comprende los aminoácidos 430-454 de la SEQ ID NO: 1; una región de bucle de cadena doble de BoNT/B que comprende los aminoácidos 437-446 de la SEQ ID NO: 2; una región de bucle de cadena doble de BoNT/Cl que comprende los aminoácidos 437-453 de la SEQ ID NO: 3; una región de bucle de cadena doble de BoNT/D que comprende los aminoácidos 437-450 de la SEQ ID NO: 4; una región de bucle de cadena doble de BoNT/E que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 5; una región de bucle de cadena doble de BoNT/F que comprende los aminoácidos 429-445 de la SEQ ID NO: 6; una región de bucle de cadena doble de BoNT/G que comprende los aminoácidos 436-450 de la SEQ ID NO: 7; o una región de bucle de cadena doble de TeNT que comprende los aminoácidos 439-467 de la SEQ ID NO: 8; una región de bucle de cadena doble de BaNT que comprende los aminoácidos 421-435 de la SEQ ID NO: 9; o una región de bucle de cadena doble de BuNT que comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 10.

Los aspectos de la presente invención describen, en parte, un sitio de escisión de la proteasa exógeno. Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión de la proteasa exógeno" es sinónimo de "sitio de escisión de la proteasa diseñada", "sitio de escisión de la proteasa de origen no natural" o "sitio de escisión de la proteasa no nativa" y se refiere a un sitio de escisión de la proteasa que no está normalmente presente en una región de bucle de cadena doble de una toxina de Clostridium de origen natural.

Los sitios de escisión de la proteasa exógeno o diseñada dentro de la región de bucle de cadena doble se usan para convertir la forma de polipéptido de cadena simple de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de la presente descripción en su forma de cadena doble. Se prevé que cualquiera y todos los sitios de escisión de la proteasa exógeno pueda usarse para convertir la forma de polipéptido de cadena simple de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium en su forma de cadena doble activa son útiles para aspectos prácticos de la presente descripción. Ejemplos no taxativos de sitios de escisión de la proteasa exógeno incluyen, por ejemplo, un sitio de escisión de papaina vegetal, un sitio de escisión de papaina de insectos, un sitio de escisión de papaina de crustáceos, un sitio de escisión de enterocinasa, un sitio de escisión de la proteasa de rinovirus humano 3C, un sitio de escisión de la proteasa de enterovirus humano 3C, un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV, por sus siglas en inglés) , un sitio de escisión del virus del moteado de las venas del tabaco (TVMV, por sus siglas en inglés) , un sitio de escisión de subtilisina, un sitio de escisión de hidroxilamina o un sitio de escisión de Caspasa 3. Los sitios de escisión de la proteasa diseñada ubicados dentro del bucle de cadena doble se describen, por ejemplo, en Dolly, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins , patente estadounidense 7,419,676, Dolly, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, patente estadounidense 7,422,877, Steward, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins, publicación de patente estadounidense 2009/0069238, Steward, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins , publicación de patente estadounidense 2008/0032930, Steward, et ál . , Activatable Recombinant Neurotoxins , publicación de patente estadounidense 2009/0018081, Steward, et ál . , Activatable Recombinant Neurotoxins , publicación de patente estadounidense 2009/0005313, Steward, et ál., Activatable Recombinant Neurotoxins , publicación de patente estadounidense 2009/0004224; cada una de las cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Se prevé que un sitio de escisión de la proteasa exógeno de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente descripción con la condición de que el sitio de escisión de la proteasa exógeno pueda escindirse mediante su respectiva proteasa. Por lo tanto, en aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno puede tener una longitud de, por ejemplo, al menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o al menos 60 aminoácidos; o como máximo 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o al menos 60 aminoácidos.

En una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende una región de bucle de cadena doble que incluye un sitio de escisión de la proteasa exógeno. En aspectos de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de papaina vegetal, un sitio de escisión de papaina de insectos, un sitio de escisión de papaina de crustáceos, un sitio de escisión de enterocinasa, un sitio de escisión de la proteasa de rinovirus humano 3C, un sitio de escisión de la proteasa de enterovirus humano 3C, un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco, un sitio de escisión del virus del moteado de las venas del tabaco, un sitio de escisión de subtilisina, un sitio de escisión de hidroxilamina, un sitio de escisión de la proteasa de SUMO/ULP-1 y un sitio de escisión de Caspasa 3 no humana.

En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de enterocinasa no humana. En otro aspecto de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de la proteasa de enterocinasa bovina. En aun otro aspecto de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 480.

En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, una escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la secuencia de consenso EXiX2YX3Q*G (SEQ ID NO: 481) o EXiX2YX3Q*S (SEQ ID NO: 482), donde Xi , X2 y X3 es cualquier aminoácido. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 483, la SEQ ID NO: 484, la SEQ ID NO: 485, la SEQ ID NO: 486, la SEQ ID NO: 487, la SEQ ID NO: 488, la SEQ ID NO: 489, la SEQ ID NO: 490, la SEQ ID NO: 491 o la SEQ ID NO: 492.

En otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de la proteasa del virus del moteado de las venas del tabaco. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la secuencia de consenso XiX2VRFQ*G (SEQ ID NO: 493) o XiX2VRFQ*S (SEQ ID NO: 494), donde Xi y X2 son independientemente cualquier aminoácido. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 495, la SEQ ID NO: 496, la SEQ ID NO: 497 o la SEQ ID NO: 498.

En aun otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de la proteasa del rinovirus humano 3C. En otro aspecto de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la secuencia de consenso XiX2LFQ*GP (SEQ ID NO: 499), donde Xi es cualquier aminoácido con un aminoácido ácido como D o E preferido; y X2 es preferentemente S, T y un aminoácido hidrofóbico alifático como G, P, A, V,' L, I y . En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 500, la SEQ ID NO: 501, la SEQ ID NO: 502, la SEQ ID NO: 503, la SEQ ID NO: 504 o la SEQ ID NO: 505. En otro aspecto de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, una proteasa del rinovirus humano 3C escindido por PRESCISSION®.

En aun otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de subtilisina. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exogeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la secuencia de consenso XiX2X3X4H*Y (SEQ ID NO: 506) o X1X2X3 4YH* (SEQ ID NO: 507) , donde Xi X2 X3 y 4 son independientemente cualquier aminoácido. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exogeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 508, la SEQ ID NO: 509 o la SEQ ID NO: 510. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exogeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de subtilisina escindido por GENENASE®.

En aun otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exogeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de hidroxilamina . En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exogeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, el dipéptido N*G. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exogeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 511 o la SEQ ID NO: 512.

En aun otro aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exogeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de la proteasa de SUMO/ULP-1. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la secuencia de consenso GG*XiX2X3 (SEQ ID NO: 513), donde ??, X2 y X3 son independientemente cualquier aminoácido. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 514.

En un aspecto de esta modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de Caspasa 3. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, un sitio de escisión de la proteasa de Caspasa 3 no humana. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la secuencia de consenso DX1X2D*X3 (SEQ ID NO: 515), donde Xi es cualquier aminoácido, con un aminoácido ácido como D y E preferido, X2 es cualquier aminoácido y X3 es aminoácido, con un aminoácido pequeño y no polar como A, C, G, S y T preferido. En otros aspectos de la modalidad, un sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble comprende, por ejemplo, la SEQ ID NO: 516, la SEQ ID NO: 517, la SEQ ID NO: 518, la SEQ ID NO: 519, la SEQ ID NO: 520 o la SEQ ID NO: 521.

Una región de bucle de cadena doble puede modificarse de modo que un sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de origen natural se remplace por un sitio de escisión de la proteasa exógeno. En esta modificación, el sitio de escisión de la proteasa de bucle de cadena doble de origen natural se hace inoperable y por lo tanto no puede escindirse por su proteasa. Únicamente el sitio de escisión de la proteasa exógeno puede escindirse por su correspondiente proteasa exógeno. En este tipo de modificación, el sitio de escisión de la proteasa exógeno está unido operativamente a una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium como una proteina de fusión y el sitio puede escindirse por su respectiva proteasa exógeno. El remplazo de un sitio de escisión de la proteasa endógena de bucle de cadena doble con un sitio de escisión de la proteasa exógeno puede ser una sustitución de los sitios donde el sitio exógeno se diseña en la posición que se aproxima a la ubicación del sitio de escisión del sitio endógeno. El remplazo de un sitio de escisión de la proteasa endógena de bucle de cadena doble con un sitio de escisión de la proteasa exógeno puede ser una adición de un sitio exógeno donde el sitio exógeno se diseña en la posición diferente a la ubicación del sitio de escisión del sitio endógeno, el sitio endógeno diseñado para ser inoperable. La ubicación y tipo de sitio de escisión de la proteasa pueden ser críticos debido a que determinados dominios de unión requieren un aminoácido de carboxi-terminal o amino-terminal libre. Por ejemplo, cuando un dominio de unión al péptido se ubica entre otros dos dominios, por ejemplo, véase las FIGS. 4A-4D, un criterio de selección de un sitio de escisión de la proteasa podría ser si la proteasa que escinde su sitio deja un corte al ras, exponiendo el carboxi-terminal o amino-terminal libre del dominio de unión necesario para la unión selectiva del dominio de unión a su receptor.

Un sitio de escisión de la proteasa de origen natural puede hacerse inoperable alterando al menos uno de los dos aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por la proteasa de bucle de cadena doble de origen natural. Pueden realizarse alteraciones más extensas con la condición de que los dos residuos de cisteína de la región de bucle de cadena doble permanezcan intactos y la región pueda aun formar el puente de disulfuro. Los ejemplos no taxativos de una alteración del aminoácido incluyen la supresión de un aminoácido o el remplazo del aminoácido original por un aminoácido diferente. Por lo tanto, en una modalidad, un sitio de escisión de la proteasa de origen natural se hace inoperable alterando al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 aminoácidos que incluyen al menos uno de los dos aminoácidos que flanquean el enlace peptidico escindido por una proteasa de origen natural. En otra modalidad, un sitio de escisión de la proteasa de origen natural se hace inoperable alterando como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 aminoácidos que incluyen al menos uno de los dos aminoácidos que flanquean el enlace peptidico escindido por una proteasa de origen natural.

Se entiende que una toxina de Clostridium modificada descrita en la presente descripción puede comprender adicional y opcionalmente una región flexible que comprende un espaciador flexible. Una región flexible que comprende espaciadores flexibles se puede usar para ajusfar la longitud de una región de polipéptido para optimizar una característica, atributo o propiedad de un polipéptido. A modo de ejemplo no taxativo, una región de polipéptido que comprende uno o más espaciadores flexibles simultáneamente se puede usar para exponer mejor un sitio de escisión de proteasa facilitando así la escisión de ese sitio por una proteasa. Como otro ejemplo no taxativo, una región de polipéptido que comprende uno o más espaciadores flexibles simultáneamente se puede usar para presentar mejor un dominio de unión al péptido, facilitando así la unión del dominio de unión a su receptor.

Un espaciador flexible que comprende un péptido es al menos un aminoácido de longitud y comprende aminoácidos sin carga con grupos R con cadena lateral pequeños, tales como, por ejemplo, aminoácidos pequeños y no polares como A, C, G, S y T. Por lo tanto, en una modalidad un espaciador flexible puede tener una longitud de, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos; o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. En aun otra modalidad, un espaciador flexible puede tener, por ejemplo, entre 1-3 aminoácidos, entre 2-4 aminoácidos, entre 3-5 aminoácidos, entre 4-6 aminoácidos o entre 5-7 aminoácidos. Los ejemplos no taxativos de un espaciador flexible incluyen, por ejemplo, espaciadores G tales como GGG, GGGG (SEQ ID NO: 522) y GGGGS (SEQ ID NO: 523) o un espaciador A tal como AAA, AAAA (SEQ ID NO: 524) y AAAAT (SEQ ID NO: 525). Tal región flexible está unida operativamente dentro del marco con la toxina de Clostridium modificada como una proteina de fusión.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción puede comprender adicionalmente una región flexible que comprende un espaciador flexible. En otra modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción puede comprender adicionalmente una región flexible que comprende varios espaciadores flexibles simultáneamente. En aspectos de esta modalidad, una región flexible puede comprender simultáneamente, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, o 5 espaciadores G; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 espaciadores G. En aspectos de esta modalidad, una región flexible puede comprender simultáneamente, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, o 5 espaciadores A; o como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 espaciadores A. En otro aspecto de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium puede comprender una región flexible que comprende una o más copias de los mismos espaciadores flexibles, una o más copias de diferentes regiones de espaciadores flexibles o cualquier combinación de estos.

Se prevé que una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción pueda comprender un espaciador flexible en cualquiera y todas las ubicaciones con la condición de que la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium sea capaz de desempeñar el proceso total de intoxicación. En aspectos de esta modalidad, un espaciador flexible se ubica entre, por ejemplo, un dominio enzimático y un dominio de traslocación, un dominio enzimático y un dominio de unión, un dominio enzimático y un sitio de escisión de la proteasa exógeno. En otros aspectos de esta modalidad, un espaciador flexible se ubica entre, por ejemplo, un dominio de unión y un dominio de traslocación, un dominio de unión y un dominio enzimático, un dominio de unión y un sitio de escisión de la proteasa exógeno. En aun otros aspectos de esta modalidad, un espaciador flexible se ubica entre, por ejemplo, un dominio de traslocación y un dominio enzimático, un dominio de traslocación y un dominio de unión, un dominio de traslocación y un sito de escisión de proteasa exógeno.

Como otro ejemplo no taxativo de un componente opcional, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium puede comprender adicionalmente una región de unión al epitopo. Una región' de unión al epitopo puede usarse en diversos procesos que implican, por ejemplo, la purificación de proteínas y visualización de proteínas. Tal región de unión al epitopo está unida operativamente dentro del marco a una toxina de Clostridium modificada como una proteína de fusión. Los ejemplos no taxativos de una región de unión al epitopo incluyen, por ejemplo, FLAG, Express™, hemaglutinina del virus de la influenza humana (HA, por sus siglas en inglés) , proteína humana p62cMyc (c-MYC, por sus siglas en inglés), glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G, por sus siglas en inglés), precursor de glicoproteína-D precursor del virus Herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) , V5, AU1 y AU5; unión a la afinidad, tal como, por ejemplo, polihistidina (HIS, por sus siglas en inglés), péptido de unión a la estreptavidina (strep) y biotina o una secuencia de biotinilación; regiones de unión al péptido, tales como, por ejemplo, el dominio de unión a la glutationa de glutationa-S-transferasa, el dominio de unión a la calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina y el dominio de unión a la maltosa de la proteína de unión a la maltosa. Los ejemplos no taxativos de protocolos específicos de selección, modalidad y uso de un péptido de unión adecuado se describen en, por ejemplo, Epitope Tagging, pp. 17.90-17.93 (Sambrook and Russell, eds . , MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Vol. 3, 3era ed. 2001); ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Edward Harlow & David Lañe, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. 1998); and USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL NO. I (Edward Harlow & David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998). Además, los ejemplos no taxativos de péptidos de unión así como también reactivos, condiciones y protocolos bien caracterizados se encuentran comercialmente disponibles de vendedores comerciales que incluyen, de modo no taxativo, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos protocolos son procesos de rutina dentro del alcance de los expertos en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

Por lo tanto, en una modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción puede comprender adicionalmente una región de unión al epitopo. En otra modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción puede comprender adicionalmente varias regiones de unión al epitopo. En aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium puede comprender, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 regiones de unión al epitopo. En otros aspectos de esta modalidad, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium puede comprender, por ejemplo, como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 regiones de unión al epitopo. En otro aspecto de esta modalidad, una toxina de Clostridium modificada puede comprender una o más copias de la misma región de unión al epitopo, una o más copias de diferentes regiones de unión al epitopo o cualquier combinación de estos.

La ubicación de una región de unión al epitopo puede estar en varias posiciones, que incluyen de modo no taxativo, en el amino-terminal , dentro o en el carboxi-terminal de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium. Por lo tanto, en una modalidad, una región de unión al epitopo se ubica en el amino-terminal de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium. En una modalidad, una región de unión al epitopo se ubica en el carboxi-terminal de una toxina de Clostridium modificada.

Aspectos de la presente descripción proporcionan, en parte, moléculas de polinucleótidos . Tal como se usa en la presente, el término "molécula de polinucleótido" es sinónimo de "molécula de ácido nucleico" y se refiere a una forma polimérica de nucleótidos, tal como, por ejemplo, ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos . Se prevé que todas y cada una de las moléculas de polinucleótido que pueden codificar una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción pueden ser útiles, incluidas, de modo no taxativo, moléculas de ADN de origen natural y de origen no natural y moléculas de ARN de origen natural y de origen no natural. Ejemplos no taxativos de moléculas de ADN de origen natural y de origen no natural incluyen moléculas de ADN de hebra simple, moléculas de ADN de hebra doble, moléculas de ADN genómico, moléculas de ADNc, construcciones de vectores, tales como, por ejemplo, construcciones de plásmidos, construcciones de fagémido, construcciones de bacteriófago, construcciones retrovirales y construcciones de cromosoma artificial. Ejemplos no taxativos de moléculas de ARN de origen natural y de origen no natural incluyen ARN de hebra simple, ARN de hebra doble y ARNm.

Las técnicas moleculares establecidas que pueden ser necesarias para realizar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium en la presente descripción que incluyen, de modo no taxativo, los procesos que implican una amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), reacciones de enzimas de restricción, electroforesis en gel de agarosa, ligación de ácido nucleico, transformación bacteriana, purificación de ácido nucleico, secuenciación de ácido nucleico y técnicas basadas en la recombinación, son procesos rutinarios que se encuentran dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente. Los ejemplos no taxativos de protocolos específicos necesarios para realizar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium modificada se describen en por ejemplo, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, anteriormente, (2001); and CÜRRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et ál., eds. John Wiley & Sons, 2004). De manera adicional, se encuentra disponible una variedad de productos comercialmente disponibles útiles para realizar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. Estos protocolos son procesos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

Por lo tanto, en una modalidad, una molécula de polinucleótido codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona, en parte, un método para producir una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción, el método comprende el paso de expresar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium en una célula. Otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para producir una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción, el método comprende los pasos de introducir una construcción de expresión que comprende una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium en una célula y expresar la construcción de expresión en la célula.

Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, parcialmente, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium. Se prevé que todas y cada una de las toxinas de Clostridium o quimeras de toxina de Clostridium descritas en la presente descripción se pueden producir' usando los métodos descritos en la presente descripción. Se prevé que todas y cada una de las moléculas de polinucleotidos que codifican una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción pueden ser útiles en la producción de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium en la presente descripción usando los métodos descritos en la presente descripción.

Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, parcialmente, una construcción de expresión. Una construcción de expresión comprende una molécula de polinucleótido descrita en la presente descripción unida operativamente a un vector de expresión útil para expresar la molécula de polinucleótido en una célula o un extracto libre de células. Una amplia variedad de vectores de expresión se puede usar para expresar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente que incluye, de modo no taxativo, un vector de expresión viral; un vector de expresión procariota; vectores de expresión eucariota, tales como, por ejemplo, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insectos y un vector de expresión de mamíferos; y un vector de expresión de extractos libres de células. Se entiende adicionalmente que los vectores de expresión útiles para poner en práctica aspectos de estos métodos pueden incluir aquellos que expresan una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium bajo el control de un elemento promotor o elemento potenciador inducibles, específico de célula, específicos de tejido o constitutivos o ambos. Ejemplos no taxativos de los vectores de expresión junto con los reactivos y las condiciones establecidos para realizar y usar una construcción de expresión de los vectores de expresión se encuentran comercialmente disponibles de vendedores comerciales que incluyen, de modo no taxativo, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. La selección, modalidad y uso de un vector de expresión apropiado son procesos de rutina que se encuentran dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

Por lo tanto, en aspectos de esta modalidad, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción unida de forma operativa a un vector de expresión. En aspectos de esta modalidad, el vector de expresión es, por ejemplo, un vector de expresión viral, un vector de expresión de procariota, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto o un vector de expresión de mamífero. En otros aspectos de esta modalidad, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción unida de forma operativa a un vector de expresión libre de células.

Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, parcialmente, una célula. Se prevé que se pueden usar todas y cada una de las células. Por lo tanto, los aspectos de esta modalidad incluyen, de modo no taxativo, células procariotas que incluyen, de modo no taxativo, cepas de células de bacterias aeróbicas, microaerofilicas , capnofilicas, facultativas, anaeróbicas, gram-negativas y gram-positivas tales como las que derivan de, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis , Clostridia perfringens , Clostridia difficile, Caulobacter crescentus , Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens , Neisseria meningirulls , Neisseria meningitidis , Pseudomonas fluorescens y Salmonella typhimurium; y células eucariotas que incluyen, de modo no taxativo, cepas de levadura, tales como, por ejemplo, las que derivan de Pichia pastoris, Pichia methanolica , Pichia augusta, Schizosaccharomyces po be, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica ; células y lineas celulares de insecto que derivan de insectos, tales como, por ejemplo, las que derivan de Spodoptera frugiperda , Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y Manduca sexta; y células y lineas celulares de mamífero que derivan de células de mamífero, tales como, por ejemplo, las que derivan de ratón, rata, hámster, porcinos, bovinos, equinos, primates y humanos. Las líneas celulares se pueden obtener de la colección americana de cultivos tipo, la colección europea de cultivos celulares y la colección alemana de microorganismos y cultivos celulares. Los ejemplos no taxativos de protocolos específicos para seleccionar, realizar y usar una línea celular adecuada se describen en por ejemplo, INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et ál. eds., Marcel Dekker, 1993) ; INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. . Vlak et ál. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996) ; Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997) ; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et ál eds., John Wiley and Sons, 1998) ; R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4TA ed. 2000) ; ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed. , Oxford University Press, 3ERA ed. 2000) ; MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001) ; BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John ?. Davis, Oxford Press, 2DA ed. 2002) ; and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, anteriormente, (2004) . Estos protocolos son procesos de rutina que se encuentran dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, parcialmente, introducir en una célula una molécula de polinucleótido. Una molécula de polinucleótido introducida en una célula se puede mantener de forma transitoria o estable mediante esa célula. Las moléculas de polinucleótido que se mantienen de forma estable pueden ser extracromosómicas y replicarse autónomamente o se pueden integrar en el material cromosómico de la célula y replicarse no autónomamente. Se prevé que se pueden usar todos y cada uno de los métodos para introducir una molécula de polinucleótido descrita en la presente descripción en una célula. Métodos útiles para introducir una molécula de polinucleótido en una célula incluyen, de modo no taxativo, transfección o transformación mediada químicamente tal como, por ejemplo, mediada por cloruro de calcio, mediada por fosfato de calcio, mediada por dietil-aminoetil (DEAE) dextrano, mediada por lípido, mediada por polietilenimina (PEI), mediada por polilisina y mediada por polibreno; transfección o transformación mediada físicamente, tal como, por ejemplo, administración de partículas biolísticas, microinyección, fusión de protoplasto y electroporación; y transfección mediada por virus, tal como, por ejemplo, transfección mediada por retrovirus, véase, por ejemplo, Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp . 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds . , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3a ed. 2001). Un experto en la técnica entiende que la selección de un método específico para introducir una construcción de expresión en una célula dependerá, parcialmente, de si la célula contiene de forma transitoria una construcción de expresión o si la célula contendrá de forma estable una construcción de expresión. Estos protocolos son procesos de rutina que se encuentran dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

En un aspecto de esta modalidad, un método mediado químicamente, llamado transfección, se usa para introducir en una célula una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. En métodos de transfección mediados químicamente, el reactivo químico forma un complejo con el ácido nucleico que facilita su absorción en las células. Los reactivos químicos incluyen, de modo no taxativo, mediados por fosfato de calcio, véase, por ejemplo, Martin Jordán & Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004); mediados por dietil-aminoetil (DEAE) dextrano, mediados por lípido, mediados por polímero catiónico como mediado por polietilenimina (PEI) y mediados por polilisina y mediados por polibreno, véase, por ejemplo, Chun Zhang et ál., Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144150 (2004). Los sistemas de administración mediados químicamente se pueden preparar mediante métodos estándar y se encuentran comercialmente disponibles, véase, por ejemplo, kit de transfección CellPhect (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ; kit de transfección en mamíferos, fosfato de calcio y DEAE Dextrano, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) ; reactivo de transfección Lipofectamine™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) ; kit de transfección ExGen 500 (Fermentas, Inc., Hanover, MD) y los kits de transfección SuperFect y Effectene (Qiagen, Inc., Valencia, CA) .

En otro aspecto de esta modalidad, un método mediado físicamente se usa para introducir en una célula una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. Técnicas físicas incluyen, de modo no taxativo, electroporación, biolística y microinyección . Las técnicas de biolística y microinyección perforan la célula para introducir la molécula de ácido nucleico en la célula, véase, por ejemplo, Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods 67-75 (1997); y John O'Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004). La electroporación, también denominada electropermeabilización, usa pulsos breves, de alto voltaje, eléctricos para crear poros transitorios en la membrana a través de la cual las moléculas de ácido nucleico entran y se puede usar eficazmente para transfecciones estables y transitorias de todos los tipos celulares, véase, por ejemplo, M. Golzio et ál., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization , gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); y Oliver Greschet ál., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004).

En otro aspecto de esta modalidad, un método mediado viralmente, llamado transducción, se usa para introducir en una célula una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. En métodos mediados por virus de transducción transitoria, el proceso mediante el cual las partículas virales infectan y se replican en una célula hospedadora se ha manipulado para poder usar este mecanismo para introducir una molécula de polinucleótido en una célula. Los métodos mediados por virus se han desarrollado a partir de una amplia variedad de virus que incluyen, de modo no taxativo, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados , virus del herpes simple, picornavirus , alfavirus y baculovirus, véase, por ejemplo, Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); y Maurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003) ; arim Benihoud et ál, Adenovirus vectors for gene delívery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et ál., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol . 895-913 (2002); Edward A. Burton et ál., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et ál., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); llya Frolov et ál., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications, 93(21) Proc. Nati. Acad. Sci. ü. S. A. 11371-11377 (1996) ; Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); y A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003).

Los adenovirus que son virus de ADN de hebra doble no cubiertos, por lo general se seleccionan para la transducción de células de mamíferos dado que los adenovirus manejan moléculas de polinucleótido relativamente grandes de alrededor de 36 kb, se producen a alta titulación y pueden infectar eficientemente una amplia variedad de células divididas y no divididas, véase, por ejemplo, Wim T. J. M. C. Hermens et ál., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); and Hiroyuki Mizuguchi et ál., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001) . La transducción usando un sistema basado en adenovirus no soporta la expresión prolongada de proteínas dado que un episoma lleva la molécula de ácido nucleico en el núcleo celular y no se integra en el cromosoma de la célula hospedadora. Los sistemas de vectores adenovirales y protocolos específicos para usar los vectores se describen en, por ejemplo, VIRAPOWER™ Adenoviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and VIRAPOWER™ Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 versión A, Invitrogen, Inc., (Jul. 15, 2002); y ADEASY™ Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) y ADEASY™ Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc.

La administración de la molécula de polinucleótido también puede usar retrovirus de ARN de cadena simple, tal como, por ejemplo, oncorretrovirus y lentivirus. La transducción mediada por retrovirus por lo general produce eficacias de transducción cerca del 100%, puede controlar fácilmente el número de copia proviral mediante la variación de la multiplicidad de la infección (MOI, por sus siglas en inglés) y se puede usar ya sea para transducir células de forma transitoria o estable, véase, por ejemplo, Tiziana Tonini et ál., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148· (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Félix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell Unes and transgenic animáis, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); y Roland Wolkowicz et ál., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004). Las partículas retrovirales consisten en un genoma de ARN empaquetado en una cápside proteica rodeada por una envoltura de lípidos. El retrovirus infecta una célula hospedadora inyectando su ARN en el citoplasma junto con la enzima transcriptasa inversa. La plantilla de ARN luego se transcribe de forma inversa en un ADNc de hebra doble, lineal, que se replica integrando el genoma de la célula hospedadora. Las partículas virales se esparcen tanto vertical (de célula principal a célula hija mediante el provirus) como horizontalmente (de célula a célula mediante viriones) . Esta estrategia de replicación permite la expresión constante a largo plazo dado que las moléculas de ácido nucleico de interés integran de forma estable un cromosoma de la célula hospedadora así permitiendo la expresión a largo plazo de la proteína. Por ejemplo, estudios en animales han demostrado que los vectores lentivirales inyectados en una variedad de tejidos produjeron la expresión de proteínas sostenida durante más de un año, véase, por ejemplo, Luigi Naldini et ál., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996). Los sistemas de vectores derivados de Oncorretrovirus , tales como, por ejemplopor ejemplo, virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV) se usan ampliamente e infectan muchas células no divididas diferentes. Los lentivirus también pueden infectar diferentes tipos celulares que incluyen células divididas y no divididas y poseen proteínas de envoltorio complejo las cuales permiten un direccionamiento celular altamente específico.

Los vectores retrovirales y los protocolos específicos para el uso de los vectores se describen en, por ejemplo, Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters, Patente estadounidense No. 5,464,758 (7 de nov. de 1995) y Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression , Patente estadounidense No. 5,814,618 (29 de set. de 1998) David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same, Patente estadounidense No. 5, 514, 578 (7 de mayo de 1996) y David S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor, Patente estadounidense 6,245,531 (12 de junio de 2001); Elisabetta Vegeto et ál., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations , Patente estadounidense No. 5,364,791 (15 de nov. 1994), Elisabetta Vegeto et ál., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, Patente estadounidense No. 5,874,534 (23 de feb. de 1999) y Elisabetta Vegeto et ál., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, Patente estadounidense No. 5,935,934 (10 de agosto de 1999). Además, los sistemas de administración viral se pueden preparar mediante métodos estándar y se encuentran comercialmente disponibles, véase, por ejemplopor ejemplo, BD™ Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) y BD™ Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (14 de marzo de 2003), GENESWITCH™ System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y GENESWITCH™ System A Mifepristone-Regulated Expression System for Mammalian Cells versión D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (4 de nov. de 2002); VIRAPOWER™ Lentiviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and VIRAPOWER™ Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 versión E, Invitrogen, Inc., (8 de dic. de 2003); y COMPLETE CONTROL® Retroviral Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) y COMPLETE CONTROL® Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005e.

Los métodos descritos en la presente descripción incluyen, parcialmente, expresar a partir de una molécula de polinucleótido una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. Se prevé que cualquiera de una variedad de sistemas de expresión puede ser útil para expresar, desde una molécula de polinucleótido, una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción, incluidos, de modo no taxativo, sistemas basados en células y sistemas de expresión libres de células. Los sistemas basados en célula incluyen, de modo no taxativo, sistemas de expresión viral, sistemas de expresión procariota, sistemas de expresión de levadura, sistemas de expresión de baculovirus, sistemas de expresión de insectos y sistemas de expresión de mamíferos. Los sistemas libres de células incluyen, de modo no taxativo, extractos de germen de trigo, extractos de reticulocitos de conejo y extractos de E. coli y por lo general son equivalentes al método descrito en la presente. La expresión de una molécula de polinucleótido usando un sistema de expresión puede incluir cualquiera de una variedad de características que incluyen, de modo no taxativo, expresión inducible, expresión no inducible, expresión constitutiva, expresión mediada por virus, expresión integrada de forma estable y expresión transitoria. Los sistemas de expresión que incluyen vectores, reactivos, condiciones y células bien caracterizados y se encuentran fácilmente disponibles de vendedores comerciales que incluyen, de modo no taxativo, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN; y Stratagene, La Jolla, CA. Ejemplos no taxativos de la selección y el uso de sistemas de expresión heterólogos apropiados se describen en, por ejemplo, PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins and B. David Hames eds . , Oxford University Press, 1999) ; Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999) ; y Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001) . Estos protocolos son procesos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente.

Una variedad de procesos de expresión basados en células son útiles para expresar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. Ejemplos incluyen, de modo no taxativo, sistemas de expresión viral, sistemas de expresión procariota, sistemas de expresión de levadura, sistemas de expresión de baculovirus, sistemas de expresión de insectos y sistemas de expresión de mamíferos. Los sistemas de expresión viral incluyen, de modo no taxativo, el Lentiviral VIRAPOWER™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , los Sistemas de Expresión Adenoviral (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , el Sistema de Vector Adenoviral ADEASY™ XL (Stratagene, La Jolla, CA) y el Sistema de expresión Génica Retroviral VIRAPORT® (Stratagene, La Jolla, CA) . Ejemplos no taxativos de sistemas de expresión procariotas incluyen el Sistema de Expresión CHAMPION™ pET (EMD Biosciences-Novagen, Madison, l) , el Sistema de Expresión Bacteriano TRIEX™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wl) , el Sistema de Expresión QIAEXPRESS® (QIAGEN, Inc.) y el Sistema de Expresión y Purificación de Proteínas AFFINITY® (Stratagene, La Jolla, CA) . Los sistemas de expresión de levadura incluyen, de modo no taxativo, el Kit de Expresión EASYSELECT™ Pichia Pichia (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , los Kits de Vectores de Expresión YES-ECHO™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y el Sistema de Expresión SPECTRA™ S. pombe (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) . Ejemplos no taxativos de sistemas de expresión de baculovirus incluyen BACULODIRECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , BAC-TO-BAC® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y BD BACULOGOLD™ (BD Biosciences-Pharmigen, San Diego, CA) . Ejemplos de sistemas de expresión de insectos incluyen, de modo no taxativo, el Sistema de Expresión Drosophila (DES®) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , Sistema INSECTSELECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y el Sistema INSECTDIRECT™ (EMD Biosciences- 4 Novagen, Madison, Wl) . Ejemplos no taxativos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen el Sistema T-REX™ (Tetracycline-Regulated Expression) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , el Sistema FLP-IN™ T-REX™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , el sistema pcDNA™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , el sistema pSecTag2 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) , el Sistema EXCHANGER®, sistema de TAP de mamífero INTERPLAY™ (Stratagene, La Jolla, CA) , el Sistema de Expresión de Mamíferos Inducible COMPLETE CONTROL® (Stratagene, La Jolla, CA) y sistema de Expresión de Mamíferos Inducible II LACSWITCH® (Stratagene, La Jolla, CA) .

Otro proceso para expresar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción emplea un sistema de expresión libre de células tal como, de modo no taxativo, extractos procariotas y extractos eucariotas. Ejemplos no taxativos de extractos de células procariotas incluyen el Kit RTS 100 JE?, coli HY Kit (Roche Applied Science, Indianapolis , IN) , el Kit de Traducción In Vitro ActivePro (Ambion, Inc., Austin, TX) , el Sistema EcoPro™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) y el Sistema de Expresión Plus EXPRESSWAY™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) . El extracto de célula eucariota incluye, de modo no taxativo, el Kit CECF de germen de trigo RTS 100 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) , los Sistemas de Extractos de Germen de Trigo AcopladoTNT® (Promega Corp., Madison, I), el Kit de Germen de Trigo IVT™ (Ambion, Inc., Austin, TX) , el Kit Retic Lysate IVT™ (Ambion, Inc., Austin, TX) , el Sistema PROTEINSCRIPT® II (Ambion, Inc., Austin, TX) y los Sistemas de Lisado de Reticulocito® Acoplado (Promega Corp., Madison, WI).

La toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción la produce la célula en una forma de cadena simple. Para poder lograr una actividad completa, esta forma de cadena simple debe convertirse en su forma de cadena doble. Tal como se describe anteriormente, este proceso de conversión se logra escindiendo un sitio de escisión de la proteasa ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble de la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. Este proceso de conversión se puede realizar usando un ensayo de escisión proteolítica in vitro estándar o en un sistema de escisión proteolítica basada en células tal como se describe en una solicitud de patente Ghanshani, et ál., Methods of Intracellular Conversión of Single-Chain Proteins into their Di-chain Form, N° de Expediente del Representante 18469 PROV (BOT) , que se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Aspectos de la presente invención describen, parcialmente, una composición que comprende una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. En un aspecto adicional, la composición es una composición farmacéutica aceptable. Tal como se usa en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier composición o entidad molecular que no produce una reacción adversa, alérgica u otra reacción perjudicial o no deseada al administrarse a un individuo. Tal como se usa en la presente, el término "composición farmacéuticamente aceptable" es sinónimo de "composición farmacéutica" y se refiere a una concentración terapéuticamente eficaz de un ingrediente activo, tal como, por ejemplo, cualquiera de las toxinas de Clostridium modificadas en la presente descripción. Una composición farmacéutica que comprende una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium es útil para aplicaciones médicas y veterinarias. Una composición farmacéutica se puede administrar a un paciente sola o en combinación con otros ingrediente, agentes, fármacos y hormonas activos. Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar usando cualquier variedad de procesos que incluyen, de modo no taxativo, mezclado convencional, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, compresión y liofilización . La composición farmacéutica puede tomar cualquiera de una variedad de formas qUe incluyen, de modo no taxativo, una solución, suspensión, emulsión, liofilizado, comprimido, pildora, gránulo, cápsula, polvo, jarabe, elixir o cualquier otra forma de dosificación adecuada para administración.

También se prevé que una composición farmacéutica que comprende una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción puede incluir opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable que facilite el procesamiento de un ingrediente activo en composiciones farmacéuticamente aceptables. Tal como se usa en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" es sinónimo de "portador farmacológico" y se refiere a cualquier portador que no tiene sustancialmente un efecto a largo plazo o perjudicial permanente cuando se administra y comprende términos tales como "vehículo, estabilizador, diluyente, aditivo, auxiliar o excipiente farmacológicamente aceptables". El portador por lo general se mezcla con un compuesto activo o se permite diluir o encierra el compuesto activo y puede ser un agente sólido, semisólido o líquido. Se entiende que los ingredientes activos pueden ser solubles o se pueden administrar como una suspensión en el portador o diluyente deseado. Cualquiera de una variedad de portadores farmacéuticamente aceptables se pueden usar incluidos, de modo no taxativo, medios acuosos tales como, por ejemplo, agua, solución salina, glicina, ácido hialurónico y similares; portadores sólidos tales como, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio y similares; solventes; medios de dispersión; recubrimientos; agentes antibacterianos y antifúngicos; agentes isotónicos y que retardan la absorción; o cualquier otro ingrediente activo. La selección de un portador farmacológicamente aceptable puede depender del modo de administración. Salvo en la medida en que algún portador farmacológicamente aceptable sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticamente aceptables. Ejemplos no taxativos de usos específicos de los portadores farmacéuticos pueden encontrarse en PHARMACEUTICAL DOSAGE FOR S AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (Howard C. Ansel et ál., eds . , Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7a ed. 1999) ; REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20a ed. 2000); GOODMAN & GILMAN ' s THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Joel G. Hardman et ál., eds., McGraw-Hill Professional, 10a ed. 2001); and HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (Raymond C. Rowe et ál., APhA Publications , 4a edición 2003). Estos protocolos son procesos de rutina y cualesquiera modificaciones se encuentran dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente .

Además se prevé que una composición farmacéutica descrita en la presente descripción puede incluir opcionalmente, de modo no taxativo, otros componentes farmacéuticamente aceptables (o componentes farmacéuticos) que incluyen, de modo no taxativo, amortiguadores, conservantes, reguladores de la tonicidad, sales, antioxidantes, agentes reguladores de la osmolalidad, sustancias fisiológicas, sustancias farmacológicas, agentes de carga, agentes emulsionantes, agentes humectantes, agentes endulzantes o aromatizantes y similares. Se pueden usar diversos amortiguadores y se refiere a [sic] para regular el pH para preparar una composición farmacéutica descrita en la presente descripción con la condición de que la preparación resultante sea farmacéuticamente aceptable. Los amortiguadores incluyen, de modo no taxativo, amortiguadores de acetato, amortiguadores de citrato, amortiguadores de fosfato, solución salina tamponada neutral, solución salina tamponada con fosfato y amortiguadores de borato. Se entiende que los ácidos y bases se pueden usar para regular el pH de una composición según sea necesario. Los antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen, de modo no taxativo, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, acetilcisteina, hidroxianisol butilado e hidroxitolueno butilado. Conservantes útiles incluyen, de modo no taxativo, cloruro de benzalconio, clorobutanol, timerosal, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, una composición de oxicloro 44 estabilizada, tal como, por ejemplo, PURITE® y quelantes, tales como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida, DTPA calcio y CaNaDTPA-bisamida . Los reguladores de la tonicidad útiles en una composición farmacéutica incluyen, de modo no taxativo, sales tales como, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, manitol o glicerina y otros reguladores de la tonicidad farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica puede proporcionarse como una sal o puede formarse con varios ácidos diferentes, que incluyen, de modo no taxativo, clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico y succínico. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos u otros solventes protónicos que las formas de base libre correspondientes. Se entiende que estas y otras sustancias conocidas en la técnica de la farmacología se pueden incluir en una composición farmacéutica útil en la descripción.

En una modalidad, una composición comprende una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. En un aspecto de esta modalidad, la composición es una composición farmacéutica que comprende una toxina de Clostridium o una quimera de la toxina de Clostridium descrita en la presente descripción. En aspectos de esta modalidad, una composición farmacéutica que comprende toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción componente adicionalmente un portador farmacológico, un componente farmacológico o tanto un portador farmacológico como un componente farmacológico. En otros aspectos de esta modalidad, una composición farmacéutica comprende una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium descrita en la presente descripción comprende adicionalmente al menos un portador farmacológico, al menos un componente farmacéutico o al menos un portador farmacológico y al menos un componente farmacéutico .

Aspectos de la presente descripción también se pueden describir de la siguiente manera: 1. Una toxina de Clostridium que comprende al menos un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación se ubica en el dominio de traslocación y/o el subdominio de unión a HCN, donde al menos un sitio de escisión de inactivación comprende un sitio dual de trombina-trombina, un sitio de Factor Xa, un sitio dual de Factor Xa-trombina y/o un sitio a MMP-9. 2. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina de Clostridium, una región de bucle de cadena doble, un sitio de escisión de la proteasa exógeno y al menos dos sitios de escisión de inactivación ubicados dentro de una región del sitio de escisión de inactivación; donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble. 3. Una toxina de Clostridium del aspecto 2, donde los sitios de escisión de inactivación comprende un sitio dual de trombina-trombina y/o un sitio dual de Factor Xa-trombina. 4. Una quimera de toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 5. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-4, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 462-496 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 458-492 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 464-487 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 463-496 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 458-491 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 434-467 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 453-486 de la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 458-491 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 443-476 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 434-467 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25. 6. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-4, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 618-634 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 614-630 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 605-621 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 613-629 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 609-625 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 587-603 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 604-620 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 605-621 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 610-626 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 596-612 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 587-603 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25. 7. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-4, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 638-651 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 634-647 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 625-638 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 633-646 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 629-642 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 607-620 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 624-637 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 625-638 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 630-643 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 616-629 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 607-620 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25. 8. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-4, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 665-687 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 661-683 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 652-674 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 660-682 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 656-678 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 634-659 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 651-676 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 652-677 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 657-679 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 643-668 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 634-659 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25. 9. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-4, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 752-765 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 748-761 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 739-752 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 747-760 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 743-756 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 724-739 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 741-756 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 742-757 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 744-757 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 733-748 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 724-739 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25. 10. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-4, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 826-835 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 824-831 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 813-824 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 821-830 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 817-826 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 800-809 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 817-826 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 818-827 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 818-827 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 809-819 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 800-809 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25. 11. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-4, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 844-863 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 840-859 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 831-850 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 839-858 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 835-854 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 818-837 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 835-854 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 836-855 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 836-855 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 828-847 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 818-837 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25. 12. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-4, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 871-895 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 867-891 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 858-882 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 866-890 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 862-886 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 845-869 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 862-886 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 863-887 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 863-887 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 855-879 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 845-869 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25. 13. La toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-12, donde el dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de BaNT y/o un dominio enzimático de BuNT . 14. La toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-13, donde el sitio de escisión de inactivación comprende sitios de escisión de trombina, sitios de escisión de plasmina, sitios de escisión del factor de coagulación Vlla, sitios de escisión del factor de coagulación IXa, sitios de escisión del factor de coagulación Xa, sitios de escisión del factor de coagulación Xla, sitios de escisión del factor de coagulación Xlla, sitios de escisión de calicreina plasmática, sitios de escisión del receptor activada por proteasa acoplado a proteínas G 1 (PARI) , sitios de escisión de PAR 2, sitios de escisión de P AR 3, sitios de escisión de PAR 4, sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2), sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9) , sitios de escisión de furina, sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo urocinasa (uPA) , sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo tejido (tPA) , sitios de escisión de triptasa-e, sitios de escisión de proteasa de mastocitos de ratón (mMCP-7), sitios de escisión de enzima convertidora de endotelina 1 (ECE-1), sitios de escisión del grupo sanguíneo Kell, sitios de escisión de DPPIV, sitios de escisión de metalopeptidasa ADAM con t ombospondina tipo 1, motivo 13 (ADAMTS13) y/o sitios de escisión de Catepsina L. 15. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-14, donde el dominio de traslocación de la toxina de Clostridium comprende un dominio de traslocación de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/B, un dominio de traslocación de BoNT/Cl, un dominio de traslocación de BoNT/D, un dominio de traslocación BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/G, un dominio de traslocación de TeNT, un dominio de traslocación de BaNT y/o un dominio de traslocación de BuNT . 16. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-15, donde el sitio de escisión de inactivación comprende un sitio dual de trombina-trombina, un sitio de Factor Xa, un sitio dual de Factor Xa-trombina y/o un sitio MMP-9. 17. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de los aspectos 1-16, donde el dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, comprende un dominio de unión al opioide, un dominio de unión a la taquiquinina, un dominio de unión a la melanocortina , un dominio de unión a la galanina, un dominio de unión a la granina, un dominio de unión al péptido relacionado al neuropéptido Y, un dominio de unión a la neurohormona, un dominio de unión a la citocina neuroreguladora, un dominio de unión al péptido de quinina, un dominio de unión al factor de crecimiento y/o dominio de unión a la hormona de tipo glucagón. 18. Una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 19. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/A, un dominio de unión a BoNT/A y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 20. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/A, un dominio de unión a BoNT/A, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 21. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/A, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 22. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de traslocación de BoNT/A, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 23. La toxina y/o quimera de los aspectos 18-22, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende los aminoácidos 462-496, 618-634, 638-651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863 y/u 871-895 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; y/o los aminoácidos 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822-831, 840-859 y/u 867-891 de la SEQ ID NO: 3. 24. Una BoNT/B que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 25. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de traslocación de BoNT/B, un dominio de unión a BoNT/B y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 26. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de traslocación de BoNT/B, un dominio de unión a BoNT/B, un sitio de escisión de la proteasa exogeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exogeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de trasl'ocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 27. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de traslocación de BoNT/B, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 28. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de traslocación de BoNT/B, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de la proteasa exogeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio . de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exogeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 29. La toxina y/o quimera de los aspectos 24-28, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende los aminoácidos 464-487, 605-621, 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850 y/u 858-882 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10. 30. Una BoNT/Cl que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 31. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio de traslocación de BoNT/Cl, un dominio de unión a BoNT/Cl y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 32. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio de traslocación de BoNT/Cl, un dominio de unión a BoNT/Cl, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HC . 33. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio de traslocación de BoNT/Cl, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 34. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio de traslocación de BoNT/Cl, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 35. La toxina y/o quimera de los aspectos 30-34, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende los aminoácidos 463-496, 613-629, 633-646, 660-682, 747-760, 821-830, 839-858 y/u 866-890 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12. 36. Una BoNT/D que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 37. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de traslocación de BoNT/D, un dominio de unión a BoNT/D y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 38. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de traslocación de BoNT/D, un dominio de unión a BoNT/D, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 39. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de traslocación de BoNT/D, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 40. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de traslocación de BoNT/D, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 41. La toxina y/o quimera de los aspectos 36-40, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende los aminoácidos 458-491, 609-625, 629-642, 656-678, 743-756, 817-826, 835-854 y/u 862-886 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14. 42. Una BoNT/E que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 43. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/E, un dominio de unión a BoNT/E y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 44. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/E, un dominio de unión a BoNT/E, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 45. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/E, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 46. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de traslocación de BoNT/E, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 47. La toxina y/o quimera de los aspectos 42-46, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende los aminoácidos 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 y/u 845-869 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17. 48. Una BoNT/F que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 49. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/F, un dominio de unión a BoNT/F y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 50. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/F, un dominio de unión a BoNT/F, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 51. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/F, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 52. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de traslocación de BoNT/F, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 53. La toxina y/o quimera de los aspectos 48-52, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende los aminoácidos 453-486, 604-620, 624-637, 651-676, 741-756, 817-826, 835-854 y/u 862-886 de la SEQ ID NO: 18; y/o los aminoácidos 453-486, 605-621, 625-638, 652-677, 742-757, 818-827, 836-855 y/u 863-887 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20. 54. Una BoNT/G que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 55. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de traslocación de BoNT/G, un dominio de unión a BoNT/G y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 56. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de traslocación de BoNT/G, un dominio de unión a BoNT/G, un sitio de escisión de la proteasa exogeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exogeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 57. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de traslocación de BoNT/G, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 58. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de traslocación de BoNT/G, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio ' de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena 4 doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 59. La toxina y/o quimera de los aspectos 54-58, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende los aminoácidos 458-491, 610-626, 630-643, 657-679, 744-757, 818-827, 836-855 y/u 863-887 de la SEQ ID NO: 21. 60. Un BaNT que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 61. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BaNT, un dominio de traslocación de BaNT, un dominio de unión a BaNT y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 62. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BaNT, un dominio de traslocación de BaNT, un dominio de unión a BaNT, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 63. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BaNT, un dominio de traslocación de BaNT, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 64. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BaNT, un dominio de traslocación de BaNT, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 65. La toxina y/o quimera de los aspectos 60-64, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende los aminoácidos 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847 y/u 855-879 de la SEQ ID NO: 23. 66. Un BuNT que comprende un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región de sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 67. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BuNT, un dominio de traslocación de BuNT, un dominio de unión a BuNT y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 68. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BuNT, un dominio de traslocación de BuNT, un dominio de unión a BuNT, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 69. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BuNT, un dominio de traslocación de BuNT, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN. 70. Una toxina de Clostridium que comprende un dominio enzimático de BuNT, un dominio de traslocación de BuNT, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium, un sitio de escisión de la proteasa exógeno, una región de bucle de cadena doble y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble; donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN- 71. La toxina y/o quimera de los aspectos 66-70, donde la región del sitio de escisión de inactivación comprende los aminoácidos 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 y/u 845-869 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25. 72. La toxina y/o quimera de los aspectos 1-71, donde la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad mayor con relación a la misma toxina de 4 Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium y/o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación. 73. La toxina y/o quimera del aspecto 72, donde la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que, por ejemplo, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, 110%, al menos 120%, al menos 130%, al menos 140%, al menos 150%, al menos 160%, al menos 170%, al menos 180%, al menos 190%, al menos 200%, 210%, al menos 220%, al menos 230%, al menos 240%, al menos 250%, al menos 260%, al menos 270%, al menos 280%, al menos 290% y/o al menos 300%, con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium y/o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación, y/o donde la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que como máximo 10%, como máximo 20%, como máximo 30%, como máximo 40%, como máximo 50%, como máximo 60%, como máximo 70%, como máximo 80%, como máximo 90%, como máximo 100%, 110%, como máximo 120%, como máximo 130%, como máximo 140%, como máximo 150%, como máximo 160%, como máximo 170%, como máximo 180%, como máximo 190%, como máximo 200%, 210%, como máximo 220%, como máximo 230%, como máximo 240%, como máximo 250%, como máximo 260%, como máximo 270%, como máximo 280%, como máximo 290% y/o como máximo 300%, con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium y/o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación, y/o donde la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que alrededor de 10% a alrededor de 300%, alrededor de 20% a alrededor de 300%, alrededor de 30% a alrededor de 300%, alrededor de 40% a alrededor de 300%, alrededor de 50% a alrededor de 300%, alrededor de 60% a alrededor de 300%, alrededor de 70% a alrededor de 300%, alrededor de 80% a alrededor de 300%, alrededor de 90% a alrededor de 300%, y/o alrededor de 100% a alrededor de 300%, con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium y/o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación, o donde la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que al menos 1 vez, al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces y/o al menos 10 veces, con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium y/o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación, y/o donde la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que al menos 1 vez, como máximo 1 vez, como máximo 3 veces, como máximo 4 veces, como máximo 5 veces, como máximo 6 veces, como máximo 7 veces, como máximo 8 veces, como máximo 9 veces y/o como máximo 10 veces, con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium y/o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación, y/o donde la toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación tiene un margen de seguridad que es mayor que alrededor de 1 vez a alrededor de 10 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 9 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 8 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 7 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 6 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 5 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 9 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 8 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 7 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 6 veces y/o alrededor de 2 veces a alrededor de 5 veces. 74. La toxina y/o quimera de los aspectos 1-73, donde la adición del sitio de escisión de inactivación aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium y/o una similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional . 75. La toxina y/o quimera del aspecto 74, donde la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium y/o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en, por ejemplo, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, 110%, al menos 120%, al menos 130%, al menos 140%, al menos 150%, al menos 160%, al menos 170%, al menos 180%, al menos 190%, al menos 200%, 210%, al menos 220%, al menos 230%, al menos 240%, al menos 250%, al menos 260%, al menos 270%, al menos 280%, al menos 290% y/o al menos 300%, o donde la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en como máximo 10%, como máximo 20%, como máximo 30%, como máximo 40%, como máximo 50%, como máximo 60%, como máximo 70%, como máximo 80%, como máximo 90%, como máximo 100%, 110%, como máximo 120%, como máximo 130%, como máximo 140%, como máximo 150%, como máximo 160%, como máximo 170%, como máximo 180%, como máximo 190%, como máximo 200%, 210%, como máximo 220%, como máximo 230%, como máximo 240%, como máximo 250%, como máximo 260%, como máximo 270%, como máximo 280%, como máximo 290%, y/o como máximo 300%, o donde la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium o similar, perc > sin el sitio de escisión de inactivación adicional en alrededor de 10% a alrededor de 300%, alrededor de 20% a alrededor de 300%, alrededor de 30% a alrededor de 300%, alrededor de 40% a alrededor de 300%, alrededor de 50% a alrededor de 300%, alrededor de 60% a alrededor de 300%, alrededor de 70% a alrededor de 300%, alrededor de 80% a alrededor de 300%, alrededor de 90% a alrededor de 300%, y/o alrededor de 100% a alrededor de 300%, o donde la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en al menos 1 vez, al menos 1 vez, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, y/o al menos 10 veces, y/o donde la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en, por ejemplo, como máximo 1 vez, como máximo 3 veces, como máximo 4 veces, como máximo 5veces, como .máximo 6 veces, como máximo 7 veces, como máximo 8 veces, como máximo 9 veces y/o como máximo 10 veces, y/o donde la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium comprende la adición de un sitio de escisión de inactivación que aumenta el margen de seguridad de la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium con relación a la misma toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium o similar, pero sin el sitio de escisión de inactivación adicional en alrededor de 1 vez a alrededor de 10 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 9 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 8 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 7 veces, alrededor de 1 vez a alrededor de 6 veces, alrededor de 1-veces a alrededor de 5 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 9 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 8 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 7 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 6 veces, y/o alrededor de 2 veces a alrededor de 5 veces. 76. Una molécula de polinucleótido que codifica una toxina y/o quimera de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1-75. 77. La molécula de polinucleótido, donde la molécula comprende la SEQ ID NO: 530, la SEQ ID NO: 532, la SEQ ID NO: 534 y/o la SEQ ID NO: 536. 78. Un método para producir una toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium que comprende el paso de expresar en una célula una molécula de polinucleótido de acuerdo con el aspecto 76 y/o 77, donde la expresión de la molécula de polinucleótido produce la toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium. 79. Un método para producir una toxina de Clostridium modificada que comprende los pasos de: a. introducir en una célula una molécula de polinucleótido de acuerdo con el aspecto 76 y/o 77; y b. expresar la molécula de polinucleótido, donde la expresión de la molécula de polinucleótido produce la toxina 75 de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium codificadas . 80. Una toxina de Clostridium que comprende la SEQ ID NO: 531, la SEQ ID NO: 533, la SEQ ID NO: 535 y/o la SEQ ID NO: 537. 81. Una toxina de Clostridium que comprende la SEQ ID NO: 531. 82. Una toxina de Clostridium que comprende la SEQ ID NO: 533. 83. Una toxina de Clostridium que comprende la SEQ ID NO: 535. 84. Una toxina de Clostridium que comprende la SEQ ID NO: 537.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no taxativos se proporcionan a fines ilustrativos únicamente para facilitar un entendimiento más completo de las modalidades descritas y de ningún modo pretenden limitar ninguna de las modalidades descritas en la presente descripción.

Ejemplo 1 Identificación de las regiones del sitio de escisión de inactivación Este ejemplo ilustra cómo identificar regiones dentro de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium adecuada para modificar la toxina para comprender un sitio de escisión de inactivación y cómo realizar una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación.

Para identificar una ubicación o ubicaciones en la estructura de la proteina adecuada como una posible región del sitio de escisión de inactivación, la estructura tridimensional de una BoNT/A se analizó inicialmente mediante software informático para identificar bucles expuestos a la superficie o regiones extendidas que serian más accesibles para una proteasa. De las regiones previstas como accesibles, se seleccionaron ocho para mayor análisis: aminoácidos 462-496 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 618-634 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 638-651 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 665-687 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 752-765 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 826-835 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 844-863 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 871-895 de la SEQ ID NO: 1.

Para determinar si una región identificada mediante análisis informático podría funcionar como una región del sitio de escisión de inactivación, los sitios de escisión de trombina se modificaron genéticamente en estas regiones usando mutagénesis de multi-cebadores y ensayados por su capacidad de escindirse con trombina. Se ensambló una reacción de 50 pL que comprende un conjunto de cebadores de cebadores de oligonucleótidos unidireccionales que contiene cada uno la modificación deseada (125 ng de cada cebador) mezclados en diferentes relaciones con un plantilla de ADN que comprende una construcción de expresión que codifica una BoNT/A, tal como, por ejemplo, una construcción de expresión que comprende la SEQ ID NO: 526 que codifica la SEQ ID NO: 527, o una construcción de expresión que comprende la SEQ ID NO: 528 que codifica la SEQ ID NO: 529, que se hipermetiló con dam metilasa. A esta mezcla se agregó 5 µ?> de lOx de amortiguador de PCR, 1 L de desoxirribonucleótidos (dNTPs), lpL de 2.5 unidades/ L de ADN polimerasa de alta fidelidad PFUULTRA™ (Stratagene, La Jolla, CA) , Pfu ADN ligasa, ATP y agua libre de nucleasa hasta un volumen final de 50 pL . Las condiciones termociclador fueron las siguientes: 30 ciclos de 96 °C durante 1 minuto, 60 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 20 minutos. Luego del termociclador, 1 L de la enzima de restricción de Dpnl (Stratagene, La Jolla, CA) se agregó a la reacción y se incubó durante 1 hora a 37 °C para digerir la plantilla de ADN y reducir la recuperación de los clones de tipo salvaje. La mezcla de reacción digerida se transformó en células electrocompetentes E. coli BL21(DE3) Acella (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) mediante electroporación, se colocó en placas de ágar Luria-Bertani al 1.5% (pH 7.0) que contenían 50 pg/mL de kanamicina y se colocó en un incubador a 37°C para el crecimiento durante la noche. Las construcciones de expresión que contienen bacterias se identificaron como colonias resistentes a la kanamicina. Las construcciones candidatas se aislaron usando un proceso, de mini preparación de plásmido de lisis alcalina y se analizaron por secuenciación para determinar la frecuencia e identidad de las mutaciones incorporadas. La Tabla 7 enumera cada BoNT/A que comprende un sitio de escisión de trombina (BoNT/A-TCS) realizado y analizado en este análisis de escaneo de trombina.

Para determinar el nivel de expresión de la proteina soluble para cada BoNT/A-TCS, una construcción de expresión que comprende cada BoNT/A-TCS se expresó y purificó por cromatografía de afinidad de metales inmovilizados y se analizó por análisis SDS-PAGE. En primer lugar, usando una placa de 96 pocilios, se inocularon 100 ih de medio PA-0.5G que contenía 50 pg/mL de Kanamicina con una sola colonia de células BL21(DE3) que alojan la construcción de expresión adecuada y se cultivaron a 37 °C con agitación durante la noche. Una alícuota de 5 pL de este cultivo de partida se usó para inocular 1 mL de ZYP-5052 que contiene 50 pg/mL kanamicina y se cultivó a 37 °C con agitación durante 3.5 horas y luego a 22 °C durante 16 horas. Se agregó una alícuota de 110 pL de Reactivo de Extracción de Proteína que comprende 10X de Reactivo de Lisis Celular FASTBREAK™ (Promega Corp., adison, Wl), 250 U/mL de Benzonasa nucleasa (EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wl) , y 10X de cóctel inhibidor de la proteasa III (EMD Biosciences-Calbiochem, Gibbstown, NJ) a cada 1 mi de cultivo de expresión en una placa de 96 pocilios. 75 pL de resina HISLINK™ (Promega Corp., Madison, Wl) se transfirió luego a cada pocilio y la mezcla se mezcló de forma alternativa por pipeta y por agitación a 900 rpm durante 30 minutos. Los lisados se transfirieron a una placa de filtro con un tamaño de poro de 25 pm (Promega Corp., Madison, Wl) , con membranas previamente humedecidas con agua y el líquido se retiró por filtración al vacío. La resina se lavó tres veces con 200 pL de amortiguador de lavado que comprende 100 mM de HEPES (pH 7.5), 10 mM de imidazol. La proteína se eluyó agregando 200 pL de amortiguador de elución que comprende 100 mM de HEPES (pH 7.5), 500 mM de imidazol, incubando durante 5 minutos y la elución se recogió por filtración al vacío en una placa de 96 pocilios.

Para realizar la SDS-PAGE, un volumen igual a 2 x amortiguador de muestra Laemmli se agregó a BoNT/A purificado con IMAC gue comprende un sitio de escisión de trombina, y la mezcla se incubó a 95 °C durante 5 minutos. Se separó una alícuota de 15 L y separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida OPS usando geles de poliacrilamida precast Bis-Tris 4-12% NUPAGE® Novex (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) en condiciones de desnaturalización y reducción. El gel se lavó y fijó en 10% de metanol y 7% de ácido acético durante 30 minutos. La solución de lavado se retiró y el gel se incubó en solución de tinción de gel de proteína SYPRO Ruby durante 3 horas durante la noche a temperatura ambiente. El gel teñido se destiñó en 10% de metanol y 7% de ácido acético durante 30 minutos. El gel desteñido se visualizó con una cámara digital Fluro-S-Max (Bio-Rad) .

Los resultados del análisis de expresión se brindan en la Tabla 7. En general, las toxinas que alojan un sitio de escisión de trombina insertado en las regiones de inactivación que comprende los aminoácidos 462-496 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 844-863 o los aminoácidos 871-895 de la SEQ ID NO: 1 se expresaron bien. Por ejemplo, las toxinas que comprenden A489insLVPRGS se expresó a alrededor del 50% de Una construcción de control de tipo salvaje y toxinas que comprenden D848insLVPRGS o N880insLVPRGS se expresaron a o aproximadamente a niveles de control (Tabla 7) . Estos resultados revelaron que las regiones del sitio de escisión de inactivación ubicadas dentro del dominio de traslocación y/o el subdominio de unión al HCN toleraron la modificación de regiones para incluir un sitio de escisión de la proteasa.

Paa explotar adicionalmente el alcance a las que las regiones del sitio de escisión de inactivación identificadas podrían tolerar modificaciones que introducen un sitio de escisión de la proteasa, las toxinas se modificaron para incluir sitios de escisión de trombina por toda la región. Por ejemplo, las toxinas que comprenden T884insLVPRGS o L862insLVPRGS se realizaron para examinar la región del sitio de escisión de inactivación que comprende 844-863 de la SEQ ID NO: 1. De manera similar, las toxinas que comprenden E868insLVPRGS, delE868YIKNI-insLVPRGS, delN872IINTS-insLVPRGS, T876insLVPRGS, L879insVPRGS , delL879NLRYE-insLVPRGS, L881insVPRGS, delL881RYESN-insLVPRGS, Y883insLVPRGS, E884insLVPRGS, S885insLVPRGS, delH887LIDLS-insLVPRGS, L888insLVPRGS, L891insVPRGb y delS892RYA-insVPRG se realizaron para examinar la región del sitio de escisión de inactivación que comprende 871-895 de la SEQ ID NO: 1. Ambas modificaciones de inserción y sustitución se realizaron para examinar si el tipo de modificación tenía algún efecto. En general, todas las toxinas que alojan un sitio de escisión de trombina insertada en estas regiones de inactivación se expresaron a o aproximadamente a los niveles de una construcción de control de tipo salvaje. Estos resultados revelaron que las regiones del sitio de escisión de inactivación dentro del dominio de traslocación y/o el subdominio de unión al HCN pueden tolerar modificaciones ubicadas en cualquier parte dentro de una región del sitio de inacti ación .

Por último, se examinó la capacidad de una región del sitio de inactivación para tolerar la presencia de dos o más sitios de escisión de la proteasa (Tabla 7) . Estos resultados indicaron que las regiones del sitio de escisión de inactivación dentro del dominio de traslocación y/o el subdominio de unión al HCN pueden tolerar modificaciones ubicando dos o más sitios de escisión de la proteasa dentro de una región del sitio de inactivación.

Para determinar si una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de trombina podría escindirse por trombina, se llevó a cabo un ensayo de escisión de trombina in vitro. 5 pg de cada BoNT/A-TCS purificada se incubó con 1 U de trombina (Novagen) a 23 °C durante 1 hora, 3 horas y 18.5 horas. También se configuró en paralelo un control de la enzima cero para cada BoNT/A-TCS. Las muestras se tomaron en cada punto de tiempo y se inactivaron con amortiguador de carga SDS que incluye DTT y se analizaron por SDS-PAGE tal como se describe anteriormente.

Los resultados del análisis de expresión se brindan en la Tabla 7. En general, la modificación de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 467-496, 844-863 u 871-895 de la SEQ ID NO: 1 para incluir un sitio de escisión de la proteasa provocó una toxina que era susceptible a la escisión proteolitica mediante la proteasa adecuada.

Para determinar si una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de la trombina mantuvo su potencia, se realizó un ensayo de actividad de BoNT/A usando un ensayo de actividad de células. Para conducir un ensayo de actividad de células, se colocó en placas 1.2 x 106 de células Neuro-2a o Si a en pocilios de placas de cultivo tisular de 24 pocilios que contenían 1 mL de medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo, 2 mM de GLUTAMAX™ I con sales de Earle, 1 x de suplemento B27, 1 x de suplemento N2, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales, 10 mM de HEPES y 25 ug/mL de GTlb. Las células se incubaron en un incubador a 37°C en 5% de dióxido de carbono hasta que las células se diferenciaron, según se evaluó por criterios morfológicos estándar y de rutina, tal como la detención de crecimiento y la extensión de neurita (aproximadamente 3 días) . Se aspiró el medio de cada pocilio y se remplazó por ya sea 1) medio fresco que no contenía toxina (línea celular sin tratar) o 2) medio fresco qUe contenía 1 nM de un complejo BoNT/A (línea celular tratada) . Luego de una incubación durante la noche, las células se lavaron aspirando el medio y enjuagando cada pocilio con 200 pL de 1 x de PBS. Para recoger las células, el 1 x de PBS se aspiró, las células se lisaron agregando 50 yL de 2 x de amortiguador de carga de SDS, el lisado se transfirió a un tubo de ensayo limpio y la muestra se calentó a 95°C durante 5 minutos.

Para detectar la presencia de productos de la SNAP-25 escindida, se analizó una alícuota de cada muestra recolectada mediante transferencia Western. En este análisis, se separó una alícuota de 12 pL de la muestra recolectada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS usando geles de poliacrilamida precast Bis-Tris 12% NUPAGE® Novex (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) en condiciones de desnaturalización y reducción. Los péptidos separados se transfirieron del gel a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) por transferencia Western usando un aparato de transferencia celular electroforético semiseco TRANS-BLOT® SD (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . Las membranas de PVDF se bloquearon mediante incubación a temperatura ambiente durante 2 h en una solución que contenía solución salina amortiguada con tris (TBS, por sus siglas en inglés) (25 mM de ácido clorhídrico 2-amino-2-hidroximetil-l , 3-propanodiol (Tris-HCl) (pH 7.4), 137 mM de cloruro de sodio, 2.7 mM de cloruro de potasio), 0.1% de T EEN-20® (monolaureato de sorbitán polioxietileno (20)), 2% de albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) y 5% de leche en polvo descremada. Las membranas bloqueadas se incubaron a 4 °C durante la noche en TBS, 0.1% de TWEEN-20® (monolaureato de sorbitán polioxietileno (20) ) , 2% de BSA y 5% de leche en polvo descremada que contenia 1) una dilución 1:5,000 de un anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 como el anticuerpo primario (SMI-81; Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD; o 2) una dilución 1:5, 000 de S9684 de antisuero policlonal de conejo a-SNAP-25 como el anticuerpo primario (Sigma, St . Louis, MO) . Ambos anticuerpos policlonales de conejo y monoclonales de ratón a-SNAP-25 pueden detectar tanto el sustrato de la SNAP-25 no escindido como el producto de la escisión de la SNAP-25, lo que permitió la evaluación de la expresión general de la SNAP-25 en cada linea celular y el porcentaje de SNAP-25 escindida luego del tratamiento con BoNT/A como parámetro para evaluar la cantidad de absorción de BoNT/A. Las bandas sondadas con anticuerpo principal se lavaron tres veces durante 15 minutos cada vez en TBS, TWEEN-20® (monolaureato de sorbitán de polioxietileno (20)). Las membranas lavadas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas en TBS 0.1% de TWEEN-20® (monolaureato de sorbitán de polioxietileno (20) ) , 2% de BSA y 5% de leche descremada en polvo que contiene 1) una dilución 1:10,000 de inmunoglobulina G de anti-rátón policlonal de cabra, cadenas pesada y ligera (IgG, H+L) anticuerpo conjugado a peroxidasa de rábano picante (Zymed, South San Francisco, CA) como anticuerpo secundario o 2) una dilución 1:10,000 inmunoglobulina G de anti-ratón policlonal de cabra, cadenas pesada y ligera (IgG, H+L) anticuerpo conjugado a peroxidasa de rábano picante (Zymed, South San Francisco, CA) como anticuerpo secundario. Las bandas sondadas con anticuerpo secundario se lavaron tres veces durante 15 minutos cada vez en TBS y 0.1% de TWEEN-20® (monolaureato de sorbitán de polioxietileno (20) ) . La detección de señal de los productos de la SNAP-25 etiquetados se visualizó usando el sistema de detección de transferencia Western ECL Plus™ (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) , y se tomaron imágenes de la membrana y se cuantificó el porcentaje de escisión con un software de análisis y generador de imágenes de modo variable Typhoon 9410 (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . La elección de tamaño de pixeles (100 a 200 pixeles) y los ajustes de voltaje de PMT (350 a 600, normalmente 400) dependió de la banda individual.

Los resultados del análisis de expresión se brindan en la Tabla 7. En general, la modificación de una región del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 467-496, 844-863 u 871-895 de la SEQ ID NO: 1 para incluir un sitio de escisión de la proteasa provocó una toxina potente que podía ejecutar el proceso global de intoxicación .

Juntos, estos resultados indican que aunque se identificaron ocho regiones de escisión de inactivación diferentes, no todas pudieron soportar la inserción de un sitio de escisión de la trombina funcional. En general, la modificación de las regiones del sitio de escisión de inactivación que comprende los aminoácidos 467-496, 844-863 y 871-895 de la SEQ ID NO: 1 para incluir un sitio de escisión de la proteasa provocó una toxina producida de forma estable que pudo ejecutar el proceso global de intoxicación y era sensible a la escisión proteolítica mediante la proteasa adecuada .

Debido a que la estructura tridimensional de todas las toxinas de Clostridium era similar, las ubicaciones correspondientes en BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT y BuNT son también adecuadas como regiones del sitio de escisión de inactivación. La Tabla 5 enumera estas regiones.

Ejemplo 2 Análisis del sitio de escisión de la proteasa Este ejemplo ilustra cómo realizar una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación.

Para explorar si los sitios de escisión de la proteasa distintos de trombina podrían ser útiles como un sitio de inactivación, se examinaron toxinas que comprenden varios sitios de escisión de la proteasa diferentes.

Para realizar una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación, los sitios de escisión de la proteasa se modificaron genéticamente en regiones del sitio de escisión de inactivación usando mutagénesis de multi-cebadores tal como se describe en el Ejemplo 1. La Tabla 8 enumera las construcciones de expresión modificadas para contener un sitio de escisión de la proteasa.

Para determinar si una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de la proteasa podrían escindirse mediante su proteasa análoga, se realizaron ensayos de escisión de la proteasa in vitro esencialmente tal como se describe anteriormente, pero usando la proteasa adecuada en vez de trombina. Las muestras se tomaron en cada punto de tiempo y se inactivaron con amortiguador de carga SDS que incluye DTT y se analizaron por SDS-PAGE tal como se describe en el Ejemplo 1.

PotyArg 871-895 R8821rtsRRR Sí Pol A g 871-895 S885insRRR 222 PotyArg 871-895 S892insRRR 3.02 863 R861irtsRR PotyArg x 2 844- ND ND 871-895 K871insRKR 844-863 R861¡nsRR Po!yArg x 2 871-895 l873!nsRRRR ND ND 844-863 R861insRR Po!yArg x 2 ND ND 871-895 R882ÍrisRR K871ínsRKR Po!yArg x 2 871-895 S885insRRR 1.92 R882!nsRRR PolyArg x 2 871-895 ND ND S892insRRR Sensibilidad a la proteasa: +, menor de 25% de toxina proteolizada dentro de alrededor de 1 a a!rededor de 4 horas; +?. de 25% a 50% de toar» proteo!izada dentro de alrededor de 1 a alrededor de 4 horas; de 51% a 75% de toaría proteobzada dentro de alrededor de 1 a alrededor de 4 horas; más de 75% de de toxina proteoSzada dentro de a-rededor de 1 a alrededor de 4 horas.

La potencie de BoNT/A m calcula dividiendo el valor ¡TQ de te t0X]na en}re e) ^?, Q del control da estructura, JU ¦— ND es no determinado.

Para determinar si una BoNT/A que comprende un sitio de escisión de la proteasa mantuvo su potencia, se realizó el ensayo de actividad de basado en células usando un ensayo de actividad de células (Tabla 8 ) . En general, se consideró que las toxinas que comprendían un sitio de escisión de la proteasa que exhibía una EC50 de alrededor de 20 o menos retenían suficiente potencia para evaluación garantizada usando un ensayo con animales.

Ejemplo 3 Análisis in vivo Este ejemplo ilustra cómo evaluar una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación usando un análisis de ensayo con animales.

A pesar de que el ensayo de actividad de células es una buena evaluación de si una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación puede escindirse por su proteasa análoga, se seleccionaron determinados candidatos para evaluación en un ensayo con animales.

Para probar la actividad de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación usando un ensayo con animales, se realizó inicialmente un ensayo in vivo de la puntuación de la abducción de los dedos (DAS, por sus siglas en inglés). Los ratones CD-1 Fe se pesaron y colocaron en subconjuntos de 10 animales por cada ensayo DAS especifico. Los ratones se incluyeron en un subconjunto particular en función de los siguientes criterios: 1) buen estado de salud; 2) fuerte respuesta DAS de referencia de 0; 3) inclusión en un intervalo de peso medio de X ± 2 g establecido para el subconjunto seleccionado y 4) peso mayor de 17.0 g.

Cada ratón se inyectó usando una aguja de calibre 30 en el músculo gastrocnemio del miembro posterior derecho con ya sea 1) 5 µ?, de 10'.0 nM BoNT/A que comprende un sitio de escisión de inactivación (estudio de DAS de dosis única); o 2) 5 µL de uno de siete dosis diferentes de BoNT/A que comprende un sitio de escisión de inactivación (0.01 nM, 0.04 nM, 0.12 nM, 0.37 nM, 1.11 nM, 3.33 nM y 10.0 nM; estudio de la DAS de dosis completa) . Como control, el músculo gastrocnemio del miembro posterior izquierdo se inyectó con 5 pL de una solución que no contenia ninguna toxina. Los ratones se observaron por la respuesta a la DAS consecutivamente durante los primeros 4 días. La DAS se leyó al levantar cada ratón por la cola y observar precisamente los miembros posteriores inyectados. La abducción y no abducción de los dedos posteriores revela el efecto de parálisis debido a la toxina de prueba inyectada en el músculo. La abducción de los dedos del muslo posterior inyectado se comparó con el no inyectado y se puntuó en consecuencia. Los datos de la DAS se analizaron calculando la dosis de ED5o en función de la puntuación DAS de pico medio y AUC (área bajo la curva) en términos de u/Kg y/o ng/Kg. Se calculó de la siguiente manera: 1) en cada estudio se calculó la puntuación DAS de pico medio para cada dosis; 2) no se tuvo más en cuenta cualquier dosis que provocó más de cinco muertes en cualquier estudio; 3) la dosis más alta usada en un estudio individual dado fue la dosis más baja que provocó un pico promedio de 4.0; 4) la dosis más baja usada en un estudio individual dado fue la dosis más alta que provocó un pico promedio de 0; 5) se construyeron curvas para cada estudio individual de pico promedio DAS vs . log (dosis); 6) en algunos estudios se calculó un valor AUC para cada grupo de 10 ratones de grupos múltiples; 7) se construyeron curvas para cada estudio individual de AUC promedio vs . log (dosis); 8) se construyó una curva de respuesta a la reproducción x, y para cada conjunto de múltiples estudios idénticos; para cada toxina de prueba; 9) se analizaron los datos de respuesta a la dosis por regresión no lineal (no se ponderaron) usando una ecuación logística de tres parámetros (Sigma Plot v 8.0; SPSS Science, Chicago, Illinois) usando la siguiente ecuación: y= a/(l + (x/x0)b) donde y es la respuesta, a es la asíntota ymáX, b es la pendiente, x es la dosis y 0 es la dosis ED50. Para las determinaciones ED50 pico, Ymáx se estableció en 4 (lectura DAS máxima en escala) . Los valores ED5o (pico y/o AUC) se calcularon para cada estudio de ocho dosis llevado a cabo.

Los resultados indican eso (Tabla 9) . En general, se consideró que las toxinas que comprendían un sitio de escisión de inactivación que exhibía una potencia relativa de alrededor de 10 o mayor retenían suficiente potencia para evaluación garantizada de su margen de error.

Para determinar el margen de seguridad de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación, se realizó un ensayo de letalidad de ratón.

Para calcular el margen de seguridad de una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación, el valor de LD50 obtenido del ensayo de letalidad de ratón se dividió entre el valor EC50 obtenido de un estudio de la DAS de dosis completa.

Se consideró que una toxina que comprende un sitio de escisión de inactivación poseía suficiente actividad en el sitio de escisión de inactivación si exhibía un valor de margen de seguridad de alrededor de 15 o más.

Luego del análisis de la DAS, se evaluó una toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium que comprende un sitio de escisión de inactivación usando un ensayo de letalidad de ratón para determinar el margen de seguridad al comparar la ED50 con la LD50.

Aunque algunos aspectos de la presente descripción se han descrito con referencia a las modalidades descritas, un experto en la técnica apreciará fácilmente que los ejemplos específicos descritos solo son ilustrativos de estos aspectos y de ninguna manera limitan la presente descripción. Se pueden realizar varias modificaciones sin separarse del espíritu de la presente descripción.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una toxina de Clostridium caracterizada porque comprende al menos un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación se ubica en el dominio de traslocación y/o el subdominio de unión a HCN, donde al menos un sitio de escisión de inactivación comprende un sitio dual de trombina-trombina, un sitio de Factor Xa, un sitio dual de Factor Xa-trombina y/o un sitio a MMP-9.

2. Una toxina de Clostridium caracterizada porque comprende un dominio enzimático de toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina de Clostridium, una región de bucle de cadena doble, un sitio de escisión de la proteasa exógeno y al menos dos sitios de escisión de inactivación ubicados dentro de una región del sitio de escisión de inactivación; donde el sitio de escisión de la proteasa exógeno está ubicado dentro de la región de bucle de cadena doble.

3. La toxina de Clostridium de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque los sitios de escisión de inactivación comprenden un sitio dual de trombina-trombina y/o un sitio dual de Factor Xa-trombina.

4. Una quimera de toxina de Clostridium caracterizada porque comprende un dominio enzimático de la toxina de Clostridium, un dominio de traslocación de la toxina de Clostridium, un dominio de unión a la toxina que no es de Clostridium y un sitio de escisión de inactivación ubicado dentro de una región del sitio de escisión de inactivación, donde la región del sitio de escisión de inactivación está ubicada en el dominio de traslocación y/o en el subdominio de unión a HCN-

5. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 462-496 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 458-492 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 464-487 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 463-496 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 458-491 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 434-467 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 453-486 de la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 458-491 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 443-476 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 434-467 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25.

6. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 618-634 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 614-630 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 605-621 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 613-629 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 609-625 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 587-603 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 604-620 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 605-621 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 610-626 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 596-612 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 587-603 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25.

7. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 638-651 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 634-647 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 625-638 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 633-646 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 629-642 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 607-620 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 624-637 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 625-638 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 630-643 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 616-629 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 607-620 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25.

8. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 665-687 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 661-683 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 652-674 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 660-682 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 656-678 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 634-659 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 651-676 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 652-677 de la SEQ ID NO: 19 y/o la, SEQ ID NO: 20; aminoácidos 657-679 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 643-668 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 634-659 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25.

9. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 752-765 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 748-761 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 739-752 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 747-760 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 743-756 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 724-739 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 741-756 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 742-757 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 744-757 de la SEQ ID NO: --21; aminoácidos 733-748 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 724-739 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25.

10. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 826-835 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 824-831 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 813-824 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 821-830 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 817-826 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 800-809 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 817-826 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 818-827 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 818-827 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 809-819 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 800-809 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25.

11. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 844-863 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 840-859 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 831-850 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 839-858 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 835-854 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 818-837 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 835-854 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 836-855 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 836-855 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 828-847 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 818-837 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25.

12. La toxina de Clostridium y/o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la región del sitio de escisión de inactivación comprende aminoácidos 871-895 de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 5; aminoácidos 867-891 de la SEQ ID NO: 3; aminoácidos 858-882 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10; aminoácidos 866-890 de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 12; aminoácidos 862-886 de la SEQ ID NO: 13 y/o la SEQ ID NO: 14; aminoácidos 845-869 de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y/o la SEQ ID NO: 17; aminoácidos 862-886 de la SEQ ID NO: 18; aminoácidos 863-887 de la SEQ ID NO: 19 y/o la SEQ ID NO: 20; aminoácidos 863-887 de la SEQ ID NO: 21; aminoácidos 855-879 de la SEQ ID NO: 23; y/o aminoácidos 845-869 de la SEQ ID NO: 24 y/o la SEQ ID NO: 25.

13. La toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque el dominio enzimático de la toxina de Clostridium comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio enzimático de BoNT/Cl, un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio enzimático de BaNT y/o un dominio enzimático de BuNT .

14. La toxina de Clostridium o quimera de toxina de Clostridium de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque el sitio de escisión de inactivación comprende sitios de escisión de trombina, sitios de escisión de plasmina, sitios de escisión del factor de coagulación Vlla, sitios de escisión del factor de coagulación IXa, sitios de escisión del factor de coagulación Xa, sitios de escisión del factor de coagulación Xla, sitios de escisión del factor de coagulación Xlla, sitios de escisión de calicreina plasmática, sitios de escisión del receptor activado por proteasa acoplado a proteínas G 1 (PARI), sitios de escisión de PAR2, sitios de escisión de PAR3, sitios de escisión de PAR , sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2), sitios de escisión de metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9) , sitios de escisión de furina, sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo urocinasa (uPA) , sitios de escisión del activador de plasminógeno tipo tejido (tPA) , sitios de escisión de triptasa-e, sitios de escisión de proteasa de mastocitos de ratón (mMCP-7), sitios de escisión de enzima convertidora de endotelina 1 (ECE-1), sitios de escisión del grupo sanguíneo Kell, sitios de escisión de DPPIV, sitios de escisión de metalopeptidasa ADAM con trombospondina tipo 1, motivo 13 (ADAMTS13) y/o sitios de escisión de Catepsina L.

15. Una toxina de Clostridium caracterizada porque comprende la SEQ ID NO: 531, la SEQ ID NO: 533, la SEQ ID NO: 535 y/o la SEQ ID NO: 537.