KR20190010720A - 분해가능한 클로스트리듐 독소 - Google Patents

분해가능한 클로스트리듐 독소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메라, 상기 독소 또는 키메라를 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자들, 상기 독소 또는 키메라를 포함하는 조성물, 및 상기 독소 또는 키메라를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

분해가능한 클로스트리듐 독소{DEGRADABLE CLOSTRIDIAL TOXINS}
본 출원은 그의 전체 기술내용이 본 명세서에 구체적인 참고로 포함되는, 2010년 5월 20일자 제출된 미국 특허가출원 제61/346,578호를 우선권으로 주장한다.
뉴런 전달을 억제하는 예를 들어, 보툴리눔 신경독(BoNTs), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 테타누스 신경독(TeNT)과 같은 클로스트리듐 독소의 능력은 매우 다양한 치료학적 및 미용적 분야에서 이용되고 있다. [참조: 예를 들어, William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN(Slack, Inc., 2004)]. 약제학적 조성물로서 상업적으로 이용할 수 있는 클로스트리듐 독소에는 예를 들어, 보톡스(BOTOX®)(Allergan, Inc., Irvine, CA), 디스포트(DYSPORT®)/렐록신(RELOXIN®)(Beaufour Ipsen, Porton Down, England), 뉴로녹스(NEURONOX®)(Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, South Korea), BTX-A(Lanzhou Institute Biological Products, China) 및 제오민(XEOMIN®)(Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Germany)과 같은 BoNT/A 제제; 및 예를 들어, 미오블럭(MYOBLOC™)/뉴로블럭(NEUROBLOC™)(Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA)과 같은 BoNT/B 제제가 포함된다. 예를 들어, 보톡스(BOTOX®)는 현재 다음의 적응증에 대해서 하나 또는 그 이상의 국가에서 승인되었다: 이완불능, 성인 경련, 치열, 배부통, 안검 경련, 이갈이, 경부 근긴장이상, 본태성 진전, 미간 주름 또는 과운동성 안면 주름, 두통, 반측 안면 연축, 방광의 활동항진, 다한증, 연소기 뇌성마비, 다발성 경화증, 간헐성 근경련, 비순 주름(nasal labial lines), 연축성 발성장애, 사시 및 VII 신경장애.
클로스트리듐 독소 치료는 시냅스 간극 내로 신경전달물질을 분비시키기 위해서 사용된 세포외유출 과정을 붕괴시킴으로써 신경전달물질 방출을 억제한다. 약제학적 산업에서는 클로스트리듐 독소 치료법의 용도를 그의 현재의 근육-이완제 분야를 넘어서 예를 들어, 다양한 종류의 만성 통증과 같은 감각신경계 질환, 신경원성 염증 및 비뇨생식기 장애뿐만 아니라 예를 들어, 췌장염과 같은 그 밖의 다른 장애를 치료하도록 확대시키고자 하는 큰 욕구가 있다. 클로스트리듐 독소-기본 치료법을 확대시키기 위해서 현재 이용되고 있는 한가지 접근방법은 변형된 독소가 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 대해 변화된 세포 표적화능을 갖도록 클로스트리듐 독소를 변형시키는 것을 포함한다. 이러한 재-표적화 능력은 클로스트리듐 독소의 천연적으로-존재하는 표적화 영역을 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체에 대한 선택적 결합 활성을 나타내는 표적화 영역으로 대체시킴으로써 달성된다. 표적화 영역에 대한 이러한 변형은 비-클로스트리듐 독소 표적 세포(재-표적화) 상에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체(독소 수용체)에 선택적으로 결합할 수 있는 표적화된 소포성 세포외유출 변조 단백질(Targeted Vesicular Exocytosis Modulating Protein; TVEMP)로 불리는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제공한다. 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 표적화 활성을 갖는 클로스트리듐 독소 키메릭은 비-클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 수용체에 결합할 수 있고, 세포질 내로 전위할 수 있으며, 비-클로스트리듐 독소 표적 세포의 SNARE 컴플렉스에 대한 그의 단백분해효과를 발휘할 수 있다.
클로스트리듐 독소 및 클로스트리듐 독소 키메릭 치료법은 다수의 적응증에 대해서 성공적으로 사용된다. 일반적으로, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 투여는 잘 허용된다. 그러나, 일부의 적용분야에서의 투여는 유익한 효과를 달성하는데 필요한 더 많은 용량으로 인하여 난관에 처할 수 있다. 더 많은 용량은 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 간질액, 및 예를 들어, 심혈관계 및 림프계와 같은 신체의 순환기계를 통해서 이동하여 치료를 위해서 표적화되지 않은 영역에까지 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 원치 않는 분산이 일어나도록 할 수 있다. 이러한 분산은 예를 들어, 독소 치료에 대해서 표적화되지 않은 뉴론에서의 신경전달물질 방출의 억제 또는 치료에 대해서 표적화되지 않은 근육의 마비와 같은 원치 않는 부작용을 초래할 수 있다. 예를 들어, 사경에 대해서 목 근육 내로 치료학적 유효량의 BoNT/A 치료제를 투여한 환자는 독소의 구인두 내로의 분산으로 인하여 연하곤란을 발생시킬 수 있다. 따라서, 치료의 부위에서는 효과적이지만 독소 치료에 대해 표적화되지 않은 영역에서는 무시할 수 있는 효과 내지는 최소의 효과를 갖는 개선된 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메라에 대한 필요성이 남아있다.
더 많은 용량을 필요로 하는 치료법에서 클로스트리듐 독소 및 클로스트리듐 독소 키메라의 증가하고 있는 임상적, 치료학적 및 미용적 용도는 약제학적 산업이 적용의 표적 부위에서는 효과적이지만 원치 않는 위치에 대한 독소의 분산과 연관되어 일어날 수 있는 부작용을 감소 또는 방지한 변형된 클로스트리듐 독소 및 클로스트리듐 독소 키메라를 개발하도록 요구하고 있다. 본 발명은 비-표적화 영역 내로의 독소 분산과 연관된 원치 않는 부작용을 감소시키거나 방지한 신규의 변형된 클로스트리듐 독소 및 클로스트리듐 독소 키메라를 제공한다. 이들 및 관련된 이점은 예를 들어, 신경근육 장애, 신경병성 장애, 안질환, 통증, 근육 손상, 두통, 심혈관 질환, 신경정신병적 장애, 내분비 장애, 암, 귀 장애 및 과운동성 안면 주름뿐만 아니라 포유동물에 대한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭 투여가 유익한 효과를 제공할 수 있는 그 밖의 다른 장애의 치료와 같은 다양한 임상적, 치료학적 및 미용적 적용분야에 유용하다.
본 발명은 간질액, 및 예를 들어, 심혈관계 및 림프계와 같은 순환기계에 존재하는 프로테아제의 존재를 이용하여 원치 않는 위치 또는 위치들로부터 빠르게 불활성화될 수 있는 변형된 클로스트리듐 독소 및 변형된 클로스트리듐 독소 키메라를 기술한다.
이것은, 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소 및 변형된 클로스트리듐 독소 키메라가 간질액 및/또는 순환기계에 존재하는 프로테아제에 대한 프로테아제 분해 부위를 포함하기 때문이다. 이러한 프로테아제 분해 부위의 존재는 변형된 클로스트리듐 독소 또는 변형된 클로스트리듐 독소 키메라가, 이러한 변형된 독소를 불활성이 되도록 하는 그의 동족성(cognate) 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 민감하도록 만든다. 예를 들어, 세포외 매트릭스 프로테아제에 대한 분해 부위를 포함하도록 변형된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 간질액 내로 확산된 상황에서, 이 변형된 독소 또는 변형된 클로스트리듐 독소 키메릭은 동족성 세포외 매트릭스 프로테아제에 의해서 효과적으로 분해될 수 있다. 또 다른 예로서, 혈액 프로테아제에 대한 분해 부위를 포함하도록 변형된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 심혈관계 내로 확산된 상황에서, 이 변형된 독소 또는 변형된 클로스트리듐 독소 키메릭은 동족성 혈액 프로테아제에 의해서 효과적으로 분해될 수 있다. 또 다른 예로서, 림프성 프로테아제에 대한 분해 부위를 포함하도록 변형된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 림프계 내로 확산된 상황에서, 이 변형된 독소 또는 변형된 클로스트리듐 독소 키메릭은 동족성 림프성 프로테아제에 의해서 효과적으로 분해될 수 있다.
따라서, 간질액 및/또는 순환기계에 존재하는 프로테아제에 대한 분해 부위(들)를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 이용하는 것은 원치 않는 위치에서 이러한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 감소시키거나 제거함으로써, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 원치 않는 위치로의 확산과 연관된 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 방지할 것이다.
도 1은 중추 및 말초 뉴론에서 신경전달물질 방출 및 클로스트리듐 독소 중독의 현재의 패러다임의 개략도를 나타낸다. 도 1a는 중추 및 말초 뉴론의 신경전달물질 방출 기전에 대한 개략도를 나타낸다. 방출 과정은 1) 신경전달물질 분자를 함유하는 소포의 소포-결합된 SNARE 단백질이 원형질막에 위치하는 막-결합된 SNARE 단백질과 회합하는 소포 도킹(vesicle docking); 및 2) 소포가 원형질막과 융합하고, 신경전달물질 분자가 세포외유출이 되는 신경전달물질 방출의 2 단계를 포함하는 것으로 설명될 수 있다. 도 1b는 중추 및 말초 뉴론에서 테타누스 및 보툴리눔 독소 활성에 대한 중독 기전의 개략도를 나타낸다. 이 중독과정은 1) 클로스트리듐 독소가 클로스트리듐 수용체 시스템에 결합하고, 중독과정을 개시시키는 수용체 결합; 2) 독소 결합 후에 독소/수용체 시스템 컴플렉스를 함유하는 소포가 세포 내로 세포내이입이 되는 컴플렉스 내재화; 3) 예를 들어, 소포의 내부 pH의 변화, 클로스트리듐 독소 중쇄의 HN 영역을 포함하는 채널 공극(channel pore)의 형성, 중쇄로부터 클로스트리듐 독소 경쇄의 분리, 및 활성 경쇄의 방출을 포함하는 다수의 현상이 일어나는 것으로 생각되는 경쇄 전위, 및 4) 클로스트리듐 독소의 활성화된 경쇄가 예를 들어, SNAP-25, VAMP 또는 신택신(Syntaxin)과 같은 그의 표적 SNARE 기질을 단백분해적으로 분해시킴으로써 소포 도킹 및 신경전달물질 방출을 방지하는 효소적 표적 변형의 4 단계를 포함하는 것으로 설명될 수 있다.
도 2는 천연적으로-존재하는 클로스트리듐 독소의 영역 조직화(domain organization)를 나타낸다. 단일-쇄 형태는 효소 영역, 전위 영역 및 결합 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 조직화를 도시한다. 전위 영역과 효소 영역 사이에 위치한 디-쇄 루프 부분은 이중 SS 괄호로 도시된다. 이 부분은 예를 들어, 내인성 클로스트리듐 독소 프로테아제 또는 환경에서 생산된 천연적으로-존재하는 프로테아제와 같은 천연적으로-존재하는 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 의해서 독소의 단일-쇄 형태를 디-쇄 형태로 전환시키는 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 단일-쇄 형태 위에는 클로스트리듐 독소 결합 영역의 HCC 부분이 도시된다. 이 부분은 아미노에서 카복실로의 선형 조직화로 α-폴드(fold), β4/β5 헤어핀 턴(hairpin turn), β-폴드, β8/β9 헤어핀 턴 및 γ-폴드를 포함하는 β-트레포일(trefoil) 영역을 포함한다.
도 3은 독소의 아미노 말단에 위치한 결합 영역을 갖는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메라를 나타낸다. 도 3a는 결합 요소, 전위 요소, 외인성 프로테아제 분해 부위(P)를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 및 치료학적 요소를 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 조직화가 있는 독소 또는 키메라의 단일-쇄 폴리펩타이드 형태를 도시한다. P 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 의해서, 독소 또는 키메라의 단일-쇄 형태는 디-쇄 형태로 전환된다. 도 3b는 결합 요소, 치료학적 요소, 외인성 프로테아제 분해 부위(P)를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 및 전위 요소를 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 조직화를 갖는 독소 또는 키메라의 단일 폴리펩타이드 형태를 도시한다. P 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 의해서 독소 또는 키메라의 단일-쇄 형태는 디-쇄 형태로 전환된다.
도 4는 독소의 아미노 말단에 위치한 결합 영역을 갖는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메라를 나타낸다. 도 4a는 치료학적 요소, 외인성 프로테아제 분해 부위(P)를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 결합 요소, 및 전위 요소를 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 조직화를 갖는 독소 또는 키메라의 단일 폴리펩타이드 형태를 도시한다. P 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 의해서 독소 또는 키메라의 단일-쇄 형태는 디-쇄 형태로 전환된다. 도 4b는 전위 요소, 외인성 프로테아제 분해 부위(P)를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 결합 요소, 및 치료학적 요소를 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 조직화를 갖는 독소 또는 키메라의 단일 폴리펩타이드 형태를 도시한다. P 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 의해서 독소 또는 키메라의 단일-쇄 형태는 디-쇄 형태로 전환된다. 도 4c는 치료학적 요소, 결합 요소, 외인성 프로테아제 분해 부위(P)를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 및 전위 요소를 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 조직화를 갖는 독소 또는 키메라의 단일 폴리펩타이드 형태를 도시한다. P 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 의해서 독소 또는 키메라의 단일-쇄 형태는 디-쇄 형태로 전환된다. 도 4d는 전위 요소, 결합 요소, 외인성 프로테아제 분해 부위(P)를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 및 치료학적 요소를 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 조직화를 갖는 독소 또는 키메라의 단일 폴리펩타이드 형태를 도시한다. P 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 의해서 독소 또는 키메라의 단일-쇄 형태는 디-쇄 형태로 전환된다.
도 5는 독소의 아미노 말단에 위치한 결합 영역을 갖는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메라를 나타낸다. 도 5a는 치료학적 요소, 외인성 프로테아제 분해 부위(P)를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 전위 요소, 및 결합 요소를 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 조직화를 갖는 독소 또는 키메라의 단일 폴리펩타이드 형태를 도시한다. P 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 의해서 독소의 단일-쇄 형태는 디-쇄 형태로 전환된다. 도 5b는 전위 요소, 외인성 프로테아제 분해 부위(P)를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 치료학적 요소, 및 결합 요소를 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 조직화를 갖는 독소 또는 키메라의 단일 폴리펩타이드 형태를 도시한다. P 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 의해서 독소 또는 키메라의 단일-쇄 형태는 디-쇄 형태로 전환된다.
따라서, 본 명세서의 측면들은 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역(subdomain)에 위치하는 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소를 제공한다. 이러한 기술된 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 및 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함할 수 있다. 불활성화 분해 부위의 비-제한적 예로는 트롬빈 분해 부위, 플라즈민 분해 부위, 응고인자 VIIa 분해 부위, 응고인자 IXa 분해 부위, 응고인자 Xa 분해 부위, 응고인자 XIa 분해 부위, 응고인자 XIIa 분해 부위, 혈장 칼리크레인 분해 부위, 프로테아제-활성화된 G 단백질-커플링된 수용체-1(PAR1) 분해 부위, PAR2 분해 부위, PAR3 분해 부위, PAR4 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9) 분해 부위, 푸린(Furin) 분해 부위, 유로키나제-타입 플라즈미노겐 활성화제(uPA) 분해 부위, 조직-타입 플라즈미노겐 활성화제(tPA) 분해 부위, 트립타제-ε 분해 부위, 마우스 비만세포 프로테아제-7(mMCP-7) 분해 부위, 엔도텔린-전환효소-1(ECE-1) 분해 부위, 켈 혈액형(Kell blood group) 분해 부위, DPPIV 분해 부위, 트롬보스폰딘 타입 1 모티프-13(ADAMTS13) 분해 부위를 갖는 ADAM 메탈로펩티다제, 및 카텝신 L 분해 부위가 포함된다. 불활성화 분해 부위의 첨가는 추가의 불활성화 분해 부위가 없는 동일하거나 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 비해 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시킨다.
본 명세서의 다른 측면들은 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 및 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역에 위치하는 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제공한다. 이러한 기술된 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 및 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함할 수 있다. 불활성화 분해 부위의 비-제한적 예로는 트롬빈 분해 부위, 플라즈민 분해 부위, 응고인자 VIIa 분해 부위, 응고인자 IXa 분해 부위, 응고인자 Xa 분해 부위, 응고인자 XIa 분해 부위, 응고인자 XIIa 분해 부위, 혈장 칼리크레인 분해 부위, 프로테아제-활성화된 G 단백질-커플링된 수용체-1(PAR1) 분해 부위, PAR2 분해 부위, PAR3 분해 부위, PAR4 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9) 분해 부위, 푸린 분해 부위, 유로키나제-타입 플라즈미노겐 활성화제(uPA) 분해 부위, 조직-타입 플라즈미노겐 활성화제(tPA) 분해 부위, 트립타제-ε 분해 부위, 마우스 비만세포 프로테아제-7(mMCP-7) 분해 부위, 엔도텔린-전환효소-1(ECE-1) 분해 부위, 켈 혈액형 분해 부위, DPPIV 분해 부위, 트롬보스폰딘 타입 1 모티프-13(ADAMTS13) 분해 부위를 갖는 ADAM 메탈로펩티다제, 및 카텝신 L 분해 부위가 포함된다. 불활성화 분해 부위의 첨가는 추가의 불활성화 분해 부위가 없는 동일하거나 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 비해 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시킨다.
본 명세서의 다른 측면들은 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화한 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 이러한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화한 폴리뉴클레오타이드 분자는 발현 벡터를 더 포함할 수 있다.
본 명세서의 다른 측면들은 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소 이외에도 약제학적 담체, 약제학적 성분, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
본 명세서의 다른 측면들은 세포 내에서 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소를 코드화한 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현(여기에서, 폴리뉴클레오타이드 분자로부터의 발현은 코드화된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생산한다)시키는 단계를 포함하여, 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생산하는 방법을 제공한다. 다른 측면들에서, 상기 방법은 세포 내로 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화한 폴리뉴클레오타이드 분자를 도입시키고, 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 분자로부터의 발현은 코드화된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생산한다.
클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 바라티(Clostridium baratii) 및 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum)에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소는 인간 및 그 밖의 다른 포유동물의 치료학적 및 미용적 치료에 가장 광범하게 사용된다. 시. 보툴리눔(C. botulinum)의 균주는 인간(BoNT/A, /B, /E 및 /F), 동물(BoNT/C1 및 /D)에서의 보툴리즘 발생을 조사함으로써 확인되었거나, 토양(BoNT/G)으로부터 분리된 7 개의 항원적으로-상이한 타입의 보툴리눔 독소(BoNTs)를 생산한다. BoNT는 서로 약 35% 아미노산 동일성을 가지며, 동일한 기능성 영역 조직화 및 전반적인 구조적 구성을 공유한다. 클로스트리듐 독소의 각각의 타입에는 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산에 있어서 약간 상이한 서브타입(subtype)이 있을 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 인식된다. 예를 들어, 현재는 5 개의 BoNT/A 서브타입인 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5가 있으며, 특정한 서브타입들은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 서브타입과 비교하였을 때 약 84% 내지 93% 아미노산 동일성을 나타낸다. 또 다른 예로서는, 현재 5 개의 BoNT/B 서브타입인 BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/Bnp, 및 BoNT/Bbv가 있으며, 특정한 서브타입들은 SEQ ID NO: 6의 BoNT/B 서브타입과 비교하였을 때 약 93% 내지 96% 아미노산 동일성을 나타낸다. 또 다른 예로서, 현재 3 개의 BoNT/E 서브타입 BoNT/E1 , BoNT/E2, 및 BoNT/E3가 있으며, 특정한 서브타입들은 SEQ ID NO: 15의 BoNT/E 서브타입과 비교하였을 때 약 95% 내지 99% 아미노산 동일성을 나타낸다. 7 개의 BoNT 혈청형 모두는 유사한 구조적 및 약물학적 특성을 갖지만, 각각은 또한 이질적인 세균학적 특징을 나타낸다. 그에 반해서, 테타누스 독소(TeNT)는 클로스트리듐 테타니(C. tetani)의 균일한 그룹에 의해서 생산된다. 2 개의 다른 클로스트리듐 종인 클로스트리듐 바라티(C. baratii) 및 클로스트리듐 부티리쿰(C. butyricum)은 각각 BoNT/F 및 BoNT/E와 유사한 BaNT 및 BuNT를 생산한다.
클로스트리듐 독소는 각각 약 150 kDa의 단일 쇄 폴리펩타이드로서 해독되고, 이어서 천연적으로-존재하는 프로테아제에 의해 디설파이드 루프 내에서 단백분해적 절단에 의해 분해된다(도 1). 이 분해는 디설파이드 브릿지를 형성한 2 개의 시스테인 잔기 사이에서 발생된 불연속적인 디-쇄 루프 부분 내에서 일어난다. 이러한 해독후 과정은 단일 디설파이드 결합 및 2 개의 쇄 사이의 비-공유적 상호작용에 의해서 함께 결합된 약 50 kDa 경쇄(LC) 및 약 100 kDa 중쇄(HC)를 포함하는 디-쇄 분자를 제공한다. 단일 쇄 분자를 디-쇄로 전환시키기 위해서 사용된 천연적으로-존재하는 프로테아제는 현재 알려지지 않았다. 예를 들어, BoNT/A와 같은 일부의 혈청형에서, 천연적으로-존재하는 프로테아제는 박테리아 혈청형에 의해서 내인성으로 생산되며, 분해는 독소가 환경 내로 방출되기 전에 세포 내에서 일어난다. 그러나, 예를 들어, BoNT/E와 같은 다른 혈청형에서는 박테리아 균주가 독소의 단일 쇄 형태를 디-쇄 형태로 전환시킬 수 있는 내인성 프로테아제를 생산하지 않는 것으로 보인다. 이들 상황에서는, 독소는 단일-쇄 독소로서 세포로부터 방출되고, 이어서 환경에 존재하는 천연적으로-존재하는 프로테아제에 의해서 디-쇄 형태로 전환된다.
각각의 성숙 디-쇄 분자는 3 개의 기능적으로 상이한 영역을 포함한다: 1) 신경전달물질 방출 기구의 코어 성분을 특이적으로 표적으로 하는 아연-의존적 엔도펩티다제 활성을 함유하는 메탈로프로테아제 부분을 포함하는 LC 내에 위치하는 효소 영역; 2) 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질 내로 LC의 방출을 용이하게 하는 HC의 아미노-말단 절반(HN) 내에 함유된 전위 영역; 및 3) 표적 세포의 표면에 위치한 수용체 컴플렉스에 대한 독소의 결합 활성 및 결합 특이성을 결정하는 HC의 카복실-말단 절반(HC) 내에서 발견되는 결합 영역 [D. B. Lacy and R. C. Stevens, Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, J. Mol. Biol. 291: 1091-1104(1999)]. HC 영역은 α-나선에 의해서 분리된 것으로, HCN 및 Hcc 서브영역으로 지정된 대략 동일한 크기의 2 개이 상이한 구조적 특징을 포함한다. 표 1은 예시적인 클로스트리듐 독소에서 발견된 각각의 영역 및 서브영역에 대한 대략적인 경계 부분을 제공한다.
표1. 클로스트리듐 독소 기준 서열 및 부분
독소 SEQ ID NO: LC 디-쇄 루프 HN HC
HCN α-링커 HCC
Figure pat00001
이들 3 개의 기능적 영역의 결합, 전위 및 효소 활성은 모두 독성에 필수적이다. 이 과정의 모든 상세한 사항은 아직 정확하게 알려지지 않았지만, 클로스트리듐 독소가 뉴론 내로 들어가서 신경전달물질 방출을 억제하는 전반적인 세포 중독 기전은 혈청형 또는 서브타입과는 무관하게 유사하다. 비록 본 출원인들이 다음의 설명으로 제한하기를 원치는 않지만, 중독 기전은 적어도 4 개의 단계를 포함하는 것으로 설명될 수 있다: 1) 수용체 결합, 2) 컴플렉스 내재화, 3) 경쇄 전위, 및 4) 효소 표적 변형(도 3). 이 과정은 클로스트리듐 독소의 HC 영역이 표적 세포의 원형질막 표면상에 위치하는 독소-특이적 수용체 시스템에 결합하면 개시된다. 수용체 컴플렉스의 결합 특이성은 부분적으로, 명백하게 각각의 클로스트리듐 독소 수용체 컴플렉스를 포함하는 것으로 보이는 단백질 수용체 및 갱글리오사이드의 특이적 조합에 의해서 달성되는 것으로 생각된다. 일단 결합되면, 독소/수용체 컴플렉스는 세포내이입에 의해서 내재화되고, 내재화된 소포는 특이적 세포내 경로들로 구분된다. 전위 단계는 소포 구획의 산성화에 의해서 유발되는 것으로 보인다. 이 과정은 소수성을 증가시키고, 독소의 디-쇄 형태 형성을 촉진시키는 2 개의 중요한 pH-의존성 구조적 재배열을 개시시키는 것으로 보인다. 일단 활성화되면, 독소의 경쇄 엔도펩티다제가 세포내 소포로부터 사이토졸 내로 방출되고, 여기에서 이것은 신경전달물질 방출 기구의 3 개의 공지된 코어 성분 중의 하나를 특이적으로 표적으로 하는 것으로 보인다. 이들 코어 단백질인 소포-결합된 막단백질(VAMP)/시냅토브레빈, 25 kDa의 시냅토좀-결합된 단백질(SNAP-25) 및 신택신(Syntaxin)은 신경 말단에서의 시냅스 소포 도킹 및 융합에 필수적이며, 가용성 N-에틸말레이미드-민감성 인자-부착 단백질-수용체(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein-receptor; SNARE) 패밀리의 구성원들을 구성한다. BoNT/A 및 BoNT/E는 카복실-말단 부분에서 SNAP-25를 분해하여 각각 9 개 또는 26 개의 아미노산 분절을 방출하며, BoNT/C1은 또한 SNAP-25를 카복실-말단에 근접해서 분해시킨다. 보툴리눔 혈청형 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 테타누스 독소는 VAMP의 보존된 중앙 부분에 작용하여 VAMP의 아미노-말단 부분을 사이토졸 내로 방출시킨다. BoNT/C1은 사이토졸 막 표면에 근접한 단일 부위에서 신택신을 분해한다. 시냅스 SNAREs의 선택적 단백분해는 생체내에서 클로스트리듐 독소에 의해서 야기된 신경전달물질 방출의 차단을 설명한다. 클로스트리듐 독소의 SNARE 단백질 표적은 다양한 비-뉴론성 타입에서의 세포외유출에 공통적이며; 뉴론에서와 같이 이들 세포에서 경쇄 펩티다제 활성은 세포외유출을 억제한다. [참조: 예를 들어, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446(2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558.(2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437,(2003)].
BoNT/A, BoNT/B 및 TeNT의 Hc 영역의 삼차원 결정 구조는 클로스트리듐 신경독의 3 개의 기능적 영역이 모든 클로스트리듐 독소에 의해서 공유되는 구조적으로 상이한 영역임을 시사한다. 경쇄의 HEXXH 공통 모티프(consensus motif)는 채널에 의해서 접근하기 쉬운 단백질 표면상의 깊은 클레프트(cleft)에 위치하는 촉매적 부위의 사면체 아연 결합 포켓을 형성한다. HN 및 HC 영역의 구조는 주로, 단일 α-나선에 의해서 연결된 β-시트 토폴로지(topologies)로 구성된다. 원통-형상의 HN 영역은 일부의 바이러스 단백질에서 발견되는 감긴 코일(coiled-coil) 모티프와 닮은 긴 양친매성 α-나선들을 포함한다. HN 영역은 또한, 활성 부위의 촉매적-결합 포켓에 대한 아연 원자의 접근을 차단하는 경쇄의 음으로 하전된 큰 클레프트 주위를 감싸는 '전위 벨트(translocation belt)'로 불리는 긴 비구조적(unstructured) 루프를 형성한다. HC 영역은 기능을 나타내는 대략 동등한 크기의 2 개의 상이한 구조적 특징을 포함한다. HCN 영역으로 지정된 첫 번째 것은 HC 영역의 아미노 절반에 위치한다. HCN 영역은 β-배럴(barrel), 젤리-롤 폴드를 형성한다. HCC 영역은 HC 영역을 포함하는 두 번째 영역이다. 이 카복실-말단 영역은 예를 들어, 혈청 아밀로이드 P, 시알리다제, 크리아(cryia), 살충성 3-엔도톡신 및 렉틴과 같은 다수의 당-결합성 단백질에서 발견되는 탄수화물 결합 부분을 닮은 3 개의 상이한 탄수화물 결합 부분을 형성하는 변형된 β-트레포일 영역을 포함한다. 생화학적 연구는 HCC 영역의 β-트레포일 영역 구조가 세포 표면상의 클로스트리듐 독소 수용체의 특이적 탄수화물 함유 성분에 대한 결합을 매개하는 것으로 보임을 시사하였다. [참조: 예를 들어, Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site, 482(1-2) FEBS Lett. 119-124(2000)]. HC 영역은 HN 영역으로부터 기울어져서 표면 루프를 노출시키고, 이들이 결합을 위해서 접근할 수 있도록 만든다. 경쇄와 HC 영역 사이에서 접촉은 일어나지 않는다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로 클로스트리듐 독소를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소"는 클로스트리듐 독소가 세포를 중독시키고, 클로스트리듐 독소의 저 또는 고 친화성 수용체 컴플렉스에 대한 결합, 독소/수용체 컴플렉스의 내재화, 클로스트리듐 독소 경쇄의 세포질 내로의 전위 및 클로스트리듐 독소 기질의 효소적 변형을 포함하는 전반적인 세포 기전을 실행할 수 있는 클로스트리듐 독소 균주에 의해서 생산되는 모든 신경독을 나타낸다. 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 및 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함한다. 예시적인 클로스트리듐 독소에는 클로스트리듐 보툴리눔, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 바라티 및 클로스트리듐 부티리쿰에 의해서 생산된 것들이 포함된다.
클로스트리듐 독소에는 제한이 없이, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 이소형태 및 클로스트리듐 독소 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체; 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체 및 그의 활성 클로스트리듐 독소 단편과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 변이체"는 천연적으로 존재하든지 비-천연적으로 존재하는지, 기술된 기준 서열(표 1)의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대해서 동일성 퍼센트로 설명될 수 있는 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 비-제한적인 예로서, SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 변이체는 SEQ ID NO: 1의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 6의 BoNT/B 변이체는 SEQ ID NO: 6의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; SEQ ID NO: 11의 BoNT/C1 변이체는 SEQ ID NO: 11의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 13의 BoNT/D 변이체는 SEQ ID NO: 13의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; SEQ ID NO: 15의 BoNT/E 변이체는 SEQ ID NO: 15의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 18의 BoNT/F 변이체는 SEQ ID NO: 18의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 변이체는 SEQ ID NO: 21의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 22의 TeNT 변이체 c는 SEQ ID NO: 22의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; SEQ ID NO: 23의 BaNT 변이체는 SEQ ID NO: 23의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 24의 BuNT 변이체는 SEQ ID NO: 24의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체"는 제한이 없이, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 클로스트리듐 독소 이소형태, 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 이소형태 및 클로스트리듐 독소 서브타입을 포함하는, 어떤 인간 조작의 도움도 없이 생산된 모든 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 클로스트리듐 독소 이소형태의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 이소형태, BoNT/B 이소형태, BoNT/C1 이소형태, BoNT/D 이소형태, BoNT/E 이소형태, BoNT/F 이소형태, BoNT/G 이소형태, TeNT 이소형태, BaNT 이소형태 및 BuNT 이소형태가 포함된다. 클로스트리듐 독소 서브타입의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5; BoNT/B 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, 2가 BoNT/B 2가 및 비단백분해성 BoNT/B; BoNT/C1 서브타입 BoNT/C1-1 및 BoNT/C1-2; BoNT/E 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2, 및 BoNT/E3; BoNT/F 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, 및 BoNT/F3; 및 BuNT 서브타입 BuNT-1, 및 BuNT-2가 포함된다. 클로스트리듐 독소 서브타입의 그 밖의 다른 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 서브타입 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 5; BoNT/B 서브타입 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10; BoNT/C1 서브타입 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12; BoNT/E 서브타입 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 17; BoNT/F 서브타입 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 20; 및 BuNT 서브타입 SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 및 화학적 합성에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소를 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 클로스트리듐 독소 변이체"는 기준 클로스트리듐 독소 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피(topography), 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소에 대체될 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개 또는 그 이상의 아미노산을 치환시킬 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 또한, 보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기로로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 적어도 5, 10, 15, 20, 또는 25 개의 인접한 아미노산들을 치환시킬 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 변이체, 보존적 BoNT/B 변이체, 보존적 BoNT/C1 변이체, 보존적 BoNT/D 변이체, 보존적 BoNT/E 변이체, 보존적 BoNT/F 변이체, 보존적 BoNT/G 변이체, 보존적 TeNT 변이체, 보존적 BaNT 변이체 및 보존적 BuNT 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체"는 1) 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 클로스트리듐 독소 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소에 대체될 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산, 2 개 또는 그 이상의 아미노산, 3 개 또는 그 이상의 아미노산, 4 개 또는 그 이상의 아미노산, 5 개 또는 그 이상의 아미노산, 및 10 개 또는 그 이상의 아미노산을 결실시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소에 하나 또는 그 이상의 아미노산, 2 개 또는 그 이상의 아미노산, 3 개 또는 그 이상의 아미노산, 4 개 또는 그 이상의 아미노산, 5 개 또는 그 이상의 아미노산, 및 10 개 또는 그 이상의 아미노산을 첨가할 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개 또는 그 이상의 아미노산을 치환시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 치환체는 또한, 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 적어도 5, 10, 15, 20, 또는 25 개의 인접한 아미노산들을 치환시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 BoNT/A 변이체, 비-보존적 BoNT/B 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 변이체, 비-보존적 BoNT/D 변이체, 비-보존적 BoNT/E 변이체, 비-보존적 BoNT/F 변이체, 비-보존적 BoNT/G 변이체, 비-보존적 TeNT 변이체, 비-보존적 BaNT 변이체 및 비-보존적 BuNT 변이체가 포함된다.
또한, 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것이라도 이들 활성 단편이 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 이 구체예의 측면들은 예를 들어, 적어도 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 또는 적어도 1200 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 단편을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들은 예를 들어, 최대 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 또는 최대 1200 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 단편을 포함할 수 있다.
또한, 경쇄를 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것이라도 이들 경쇄 단편이 신경전달물질 방출 기구의 코어 성분을 특이적으로 표적으로 할 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 클로스트리듐 독소의 경쇄는 길이가 대략 420-460 아미노산이며, 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 경쇄의 전체 길이가 클로스트리듐 독소 효소 영역의 효소적 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 경쇄의 처음 8 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 또 다른 비-제한적 예로서, TeNT 경쇄의 처음 8 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 마찬가지로, 경쇄의 카복실-말단은 활성에 필수적이지 않다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 경쇄의 마지막 32 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 또 다른 비-제한적 예로서, TeNT 경쇄의 마지막 31 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 따라서, 이 구체예의 측면들에는 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 425, 또는 450 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 경쇄가 포함된다. 이 구체예의 다른 측면들에는 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 425, 또는 450 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 경쇄가 포함된다.
또한, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 HN 부분 중의 어떤 것이라도 이들 활성 단편이 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질 내로 LC의 방출을 용이하게 할 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 클로스트리듐 독소의 중쇄로부터의 HN 부분은 길이가 대략 410-430 아미노산이며, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 중쇄로부터의 HN 부분의 전체 길이가 클로스트리듐 독소 전위 영역의 전위 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 따라서, 이 구체예의 측면들은 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 HN 부분을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들은 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 HN 부분을 포함할 수 있다.
또한, 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 HC 부분 중의 어떤 것이라도 이들 활성 단편이 표적 세포의 표면에 위치한 수용체 컴플렉스에 대한 독소의 결합 활성 및 결합 특이성을 결정할 수 있고, 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 용이하게 할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 클로스트리듐 독소의 중쇄로부터의 HC 부분은 길이가 약 400-440 아미노산이며, 결합 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 중쇄로부터의 HC 부분의 전체 길이가 클로스트리듐 독소 결합 영역의 결합 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 따라서, 이 구체예의 측면들은 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 결합 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 HC 부분을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들은 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 결합 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 HC 부분을 포함할 수 있다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법(segment approach methods)과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
포괄적 방법은 분자의 처음부터 끝까지 서열을 정렬하고, 개개의 잔기쌍의 점수를 합하고, 갭(gap) 벌점을 부과함으로써 최상의 정렬을 결정한다. 비-제한적 방법으로는 예를 들어, CLUSTAL W [참조: 예를 들어, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)]; 및 반복적인 개선방법[참조: 예를 들어, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838(1996)]이 포함된다.
국소적 방법은 입력 서열 모두에 의해서 공유된 하나 또는 그 이상의 보존적 모티프를 확인함으로써 서열을 정렬한다. 비-제한적 방법에는 예를 들어, 매치-박스(Match-box) [참조: 예를 들어, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509(1992); 깁스(Gibbs) 샘플링 [참조: 예를 들어, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214(1993)]; Align-M[참조: 예를 들어, Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics,: 1428-1435(2004)]이 포함된다.
하이브리드 방법은 포괄적 및 국소적 정렬방법 둘 다의 기능적 측면들을 조합한 것이다. 비-제한적 방법에는 예를 들어, 분절-대-분절 비교 [참조: 예를 들어, Burkhard Morgenstern et al., Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based On Segment-To-Segment Comparison, 93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103(1996)]; T-Coffee [참조: 예를 들어, Cedric Notredame et al., T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment, 302(1) J. Mol. Biol. 205-217(2000)]; MUSCLE [참조: 예를 들어, Robert C. Edgar, MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797(2004)]; 및 DIALIGN-T[참조: 예를 들어, Amarendran R Subramanian et al., DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment, 6(1) BMC Bioinformatics 66(2005)]가 포함된다.
본 발명은 예를 들어, 클로스트리듐 독소 변이체, 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 및 프로테아제 분해 부위 변이체와 같은 하나의 아미노산이 또 다른 것으로 치환된 다양한 폴리펩타이드 변이체를 기술한다. 치환은 예를 들어, 치환된 아미노산의 물리적 특성(표 2) 또는 원래의 아미노산이 치환을 어떻게 견뎌낼지(표 3)와 같은 다양한 인자들에 의해서 평가될 수 있다. 폴리펩타이드 내의 또 다른 아미노산에 대해서 치환될 수 있는 아미노산의 선택은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 공지되어 있다.
표 2. 아미노산 특성
특성 아미노산
지방족 G, A, I, L, M, P, V
방향족 F, H, W, Y
C-베타 분지 I, V, T
소수성 C, F, I, L, M, V, W
소형 극성 D, N, P
소형 비-극성 A, C, G, S, T
대형 극성 E, H, K, Q, R, W, Y
대형 비-극성 F, I, L, M, V
하전됨 D, E, H, K, R
비하전됨 C, S, T
음성 D, E
양성 H, K, R
산성 D, E
염기성 K, R
아미드 N, Q
표3. 아미노산 치환
아미노산 바람직한 치환 중립 치환 바람직하지 않은 치환
Figure pat00002
Figure pat00003
따라서, 구체예에서 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 및 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소는 예를 들어, 클로스트리듐 독소 이소형태 또는 클로스트리듐 독소 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체 또는 활성 클로스트리듐 독소 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역 또는 그의 활성 단편, 클로스트리듐 독소 전위 영역 또는 그의 활성 단편, 클로스트리듐 독소 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 또는 BuNT를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 방향족 아미노산은 또 다른 방향족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 스태킹(stacking) 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 이 구체예의 또한 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/A를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/A는 BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, 및 BoNT/A 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 예를 들어, BoNT/A 이소형태 또는 BoNT/A 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/A 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 예를 들어, BoNT/A 이소형태 또는 BoNT/A 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 변이체, 비-보존적 BoNT/A 변이체 또는 활성 BoNT/A 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 변이체, 비-보존적 BoNT/A 변이체, 활성 BoNT/A 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 BoNT/A 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/A 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/A 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 BoNT/A 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 BoNT/A 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 BoNT/A 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A는 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면들에서, BoNT/A는 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A는 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/B를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/B는 BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, 및 BoNT/B 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 예를 들어, BoNT/B 이소형태 또는 BoNT/B 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/B 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 예를 들어, BoNT/B 이소형태 또는 BoNT/B 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 예를 들어, 보존적 BoNT/B 변이체, 비-보존적 BoNT/B 변이체, 활성 BoNT/B 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 예를 들어, 보존적 BoNT/B 변이체, 비-보존적 BoNT/B 변이체, 활성 BoNT/B 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 BoNT/B 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/B 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/B 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 BoNT/B 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 BoNT/B 전위 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 BoNT/B 결합 영역, 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B는 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B는 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B는 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/C1을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/C1은 BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, 및 BoNT/C1 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 또는 BoNT/C1 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 또는 BoNT/C1 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 변이체, 활성 BoNT/C1 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 변이체, 활성 BoNT/C1 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 BoNT/C1 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/C1 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/C1 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 BoNT/C1 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 BoNT/C1 전위 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 BoNT/C1 결합 영역, 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1은 예를 들어, SEQ ID NO: 3에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/D를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/D는 BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, 및 BoNT/D 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 예를 들어, BoNT/D 이소형태 또는 BoNT/D 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/D 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 예를 들어, BoNT/D 이소형태 또는 BoNT/D 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 예를 들어, 보존적 BoNT/D 변이체, 비-보존적 BoNT/D 변이체, 활성 BoNT/D 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 예를 들어, 보존적 BoNT/D 변이체, 비-보존적 BoNT/D 변이체, 활성 BoNT/D 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 BoNT/D 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/D 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/D 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 BoNT/D 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 BoNT/D 전위 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 BoNT/D 결합 영역, 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D는 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D는 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D는 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/E를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/E는 BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, 및 BoNT/E 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 예를 들어, BoNT/E 이소형태 또는 BoNT/E 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/E 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 예를 들어, BoNT/E 이소형태 또는 BoNT/E 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 예를 들어, 보존적 BoNT/E 변이체, 비-보존적 BoNT/E 변이체, 활성 BoNT/E 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 예를 들어, 보존적 BoNT/E 변이체, 비-보존적 BoNT/E 변이체, 활성 BoNT/E 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 BoNT/E 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/E 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/E 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 BoNT/E 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 BoNT/E 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 BoNT/E 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E는 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E는 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E는 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/F를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, BoNT/F는 BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, 및 BoNT/F 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 예를 들어, BoNT/F 이소형태 또는 BoNT/F 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/F 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 예를 들어, BoNT/F 이소형태 또는 BoNT/F 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 예를 들어, 보존적 BoNT/F 변이체, 비-보존적 BoNT/F 변이체, 활성 BoNT/F 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 예를 들어, 보존적 BoNT/F 변이체, 비-보존적 BoNT/F 변이체, 활성 BoNT/F 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 BoNT/F 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/F 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/F 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 BoNT/F 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 BoNT/F 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 BoNT/F 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F는 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F는 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F는 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/G를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/G는 BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, 및 BoNT/G 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 SEQ ID NO: 21을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 예를 들어, BoNT/G 이소형태 또는 BoNT/G 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/G 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 이소형태 또는 BoNT/G 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 변이체를 포함한다. 또한, 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 예를 들어, 보존적 BoNT/G 변이체, 비-보존적 BoNT/G 변이체 또는 활성 BoNT/G 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 예를 들어, 보존적 BoNT/G 변이체, 비-보존적 BoNT/G 변이체, 활성 BoNT/G 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 BoNT/G 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/G 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/G 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G는 예를 들어, SEQ ID NO: 21에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G는 예를 들어, SEQ ID NO: 21에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G는 예를 들어, SEQ ID NO: 21에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 TeNT를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, TeNT는 TeNT 효소 영역, TeNT 전위 영역, 및 TeNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 SEQ ID NO: 22를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 예를 들어, TeNT 이소형태 또는 TeNT 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 TeNT 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 예를 들어, TeNT 이소형태 또는 TeNT 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 예를 들어, 보존적 TeNT 변이체, 비-보존적 TeNT 변이체, 활성 TeNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 TeNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 예를 들어, 보존적 TeNT 변이체, 비-보존적 TeNT 변이체, 활성 TeNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 TeNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, TeNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, TeNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 SEQ ID NO: 22의 TeNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 22의 TeNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 22의 TeNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 22에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 22에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 22에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BaNT를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BaNT는 BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, 및 BaNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 SEQ ID NO: 23을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 예를 들어, BaNT 이소형태 또는 BaNT 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BaNT 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 예를 들어, BaNT 이소형태 또는 BaNT 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 예를 들어, 보존적 BaNT 변이체, 비-보존적 BaNT 변이체 또는 활성 BaNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BaNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 예를 들어, 보존적 BaNT 변이체, 비-보존적 BaNT 변이체, 활성 BaNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 BaNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BaNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BaNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 SEQ ID NO: 23의 BaNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 23의 BaNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 23의 BaNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 23에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 23에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 23에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BuNT를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BuNT는 BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, 및 BuNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 예를 들어, BuNT 이소형태 또는 BuNT 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BuNT 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 예를 들어, BuNT 이소형태 또는 BuNT 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 천연적으로 존재하는 BuNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 예를 들어, 보존적 BuNT 변이체, 비-보존적 BuNT 변이체, 활성 BuNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BuNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 예를 들어, 보존적 BuNT 변이체, 비-보존적 BuNT 변이체, 활성 BuNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 BuNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BuNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BuNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 BuNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 BuNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 BuNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 키메릭" 또는 "클로스트리듐 독소 키메라"는 표 1의 기준 클로스트리듐 독소와 상이한 적어도 하나의 특성을 갖는 독소를 형성하도록 적어도 하나의 클로스트리듐 독소로부터의 부분 및 적어도 하나의 다른 단백질로부터의 부분을 포함하는 분자를 나타낸다. 클로스트리듐 독소 키메라의 비-제한적 예로는 비-클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 비-클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 클로스트리듐 독소 키메라의 그 밖의 다른 비-제한적 예로는 상이한 클로스트리듐 독소로부터의 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 상이한 클로스트리듐 독소로부터의 전위 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 상이한 클로스트리듐 독소로부터의 결합 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다.
클로스트리듐 독소 키메릭의 한가지 클래스는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 효소 영역 또는 그의 일부분, 전위 영역 또는 그의 일부분, 및/또는 결합 영역 또는 그의 일부분이 변형되거나 상이한 클로스트리듐 독소의 효소 영역 또는 그의 일부분, 전위 영역 또는 그의 일부분, 및/또는 결합 영역 또는 그의 일부분으로 치환된 변형된 클로스트리듐 독소를 포함한다. 비-제한적 예로서, BoNT/A의 결합 영역은 BoNT/B의 결합 영역으로 대체되어 BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, 및 BoNT/B 결합 영역을 갖는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생산할 수 있다. 이러한 클로스트리듐 독소 키메라는 예를 들어, 그 전문이 참고로 포함된 문헌 [J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,132,259호]에 기술되어 있다. 또 다른 비-제한적 예로서, BoNT/A로부터의 류신 모티프를 생물학적 지속성을 증가시키기 위해서 BoNT/E의 경쇄 내로 삽입시킬 수 있다. 이러한 클로스트리듐 독소 키메라는 예를 들어, 문헌 [Lance E. Steward et al., Leucine-based Motif and Clostridial Toxins, 미국 특허공개 제2003/0027752호(Feb. 6, 2003); Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, 미국 특허공개 제2003/0219462호(Nov. 27, 2003); 및 Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, 미국 특허공개 제2004/0220386호; 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
클로스트리듐 독소 키메릭의 또 다른 클래스는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 결합 영역이 변형되거나 비-클로스트리듐 독소의 결합 영역으로 대체된 클로스트리듐 독소를 포함한다. 이러한 클로스트리듐 독소 키메라는, 변형된 독소가 예를 들어, 1) 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 강화된 세포 결합 활성으로 불리는 것으로서, 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소에 의해서 사용되는 것과 동일한, 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포의 표면상에 존재하는 수용체를 사용할 수 있거나; 2) 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화된 세포 결합 활성으로 불리는 것으로서, 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포의 표면상에 존재하는 상이한 수용체를 사용할 수 있거나; 3) 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화된 세포 결합 활성, 재-표적화 독소 또는 TVEMP로 불리는 것으로서 비-클로스트리듐 독소 표적 세포의 표면상에 존재하는 상이한 수용체를 사용할 수 있기 때문에 변화된 세포 결합 활성을 갖는다.
클로스트리듐 독소 키메릭은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포, 예를 들어, 운동 뉴론을 중독시킬 수 있는 강화된 세포 결합 활성을 갖는 클로스트리듐 독소일 수 있다. 한가지 방법으로 이 강화된 결합 활성은 독소의 천연적으로 존재하는 수용체에 대한 독소의 세포 결합 활성을 증진시키기 위해서 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 내인성 결합 영역을 변형시킴으로써 달성된다. 표적화 영역에 대한 이러한 변형은 예를 들어, 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 내인성 클로스트리듐 독소 수용체에 대한 결합 친화성을 증가시킨 강화된 세포 결합 활성; 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 내인성 클로스트리듐 독소 수용체의 서브그룹에 대한 결합 특이성을 증가시킨 강화된 세포 결합 활성; 또는 결합 친화성 및 결합 특이성 둘 다를 증가시킨 강화된 세포 결합 활성을 제공한다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 수용체에 대한 강화된 세포 결합 활성을 갖는 변형된 클로스트리듐 독소의 비-제한적 예는 예를 들어, 문헌 [Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems, 미국 특허공개 제2008/0096248호; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Enhanced Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, 국제특허공개 제2008/105901호; 이들은 각각 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
클로스트리듐 독소 키메릭은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포, 예를 들어, 운동 뉴론을 중독시킬 수 있는 변화된 세포 결합 활성을 갖는 클로스트리듐 독소일 수 있다. 한가지 방법으로 이 변화된 능력은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 내인성 결합 영역을 클로스트리듐 독소 표적 세포의 표면상에 존재하는 상이한 수용체에 우선적으로 결합하는 또 다른 분자의 결합 영역으로 대체시킴으로써 달성된다. 결합 영역에 대한 이러한 변형은 클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체에 우선적으로 결합할 수 있는 변형된 독소를 제공한다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 이 강화된 결합 활성은, 더 많은 독소가 표적 세포에 송달될 것이기 때문에, 개체에게 변형된 클로스트리듐 독소의 더 적은 유효용량이 투여되도록 할 수 있다. 따라서, 강화된 결합 활성을 갖는 변형된 클로스트리듐 독소는 치료를 위해서 표적화되지 않은 영역에 대한 독소의 바람직하지 않은 분산을 감소시킬 것이며, 이에 의해서 원치 않는 위치에 클로스트리듐 독소가 확산되는 것과 연관된 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 방지할 것이다. 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화된 세포 결합능을 갖는 변형된 클로스트리듐 독소의 비-제한적 예는 예를 들어, 문헌 [Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허 제7,514,088호; Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허공개 제2008/0161543호; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허공개 제2008/0241881호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허공개 제2009/0048431호; Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, 국제특허공개 제WO 2007/106115호; 이들은 각각 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
클로스트리듐 독소 키메릭은 클로스트리듐 독소 표적 세포 이외의 세포, 예를 들어, 운동 뉴론 이외의 세포를 중독시킬 수 있는 변화된 세포 결합 활성을 갖는 클로스트리듐 독소일 수 있다. TVEMP라 불리는 이들 분자는 비-클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 표적 수용체를 사용함으로써 이 중독을 달성한다. 이러한 재-표적화된 능력은 클로스트리듐 독소의 천연적으로 존재하는 결합 영역을 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체에 대한 우선적 결합 활성을 나타내는 결합 영역으로 대체시킴으로써 달성된다. 결합 영역에 대한 이러한 변형은 비-클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체에 우선적으로 결합할 수 있는 변형된 독소를 제공한다. 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화되 표적화 활성을 갖는 클로스트리듐 독소 키메릭은 표적 세포에 결합하고, 세포질 내로 전위하여 비-클로스트리듐 독소 표적 세포의 SNARE 컴플렉스에 대한 그의 단백분해적 효과를 발휘할 수 있다. 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화된 표적화 활성을 갖는 클로스트리듐 독소 키메라의 비-제한적 예는 예를 들어, 문헌 [Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, 미국 특허 제5,989,545호; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, 미국 특허 제6,461,617호; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, 미국 특허 제6,632,440호; Lance E. Steward et al., Methods and Compositions for the Treatment of Pancreatitis, 미국 특허 제6,843,998호; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,132,259호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제7,244,437호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제7,413,742호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제7,415,338호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허 제7,514,088호; Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, 미국 특허공개 제2006/0216283호; Keith A. Foster, Fusion Proteins, 미국 특허공개 제2008/0064092호; Keith A. Foster, Fusion Proteins, 미국 특허공개 제2009/0035822호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허공개 제2009/0048431호; Keith A. Foster, Non-Cytotoxic Protein Conjugates, 미국 특허공개 제2009/0162341호; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, 국제특허공개 제WO 2005/023309호; 및 Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells, 국제특허공개 제WO 2008/008805호; 이들은 각각 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로 클로스트리듐 독소 효소 영역을 제공하다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 효소 영역"은 중독과정의 효소적 표적 변형화 단계를 실행할 수 있는 모든 클로스트리듐 독소 폴리펩타이드를 나타낸다. 따라서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 특이적으로 클로스트리듐 독소 기질을 표적으로 하고, 예를 들어, SNAP-25 기질, VAMP 기질, 및 신택신 기질과 같은 SNARE 단백질과 같은 클로스트리듐 독소 기질의 단백분해적 분해를 포함한다. 클로스트리듐 독소 효소 영역의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 효소 영역, BoNT/B 효소 영역, BoNT/C1 효소 영역, BoNT/D 효소 영역, BoNT/E 효소 영역, BoNT/F 효소 영역, BoNT/G 효소 영역, TeNT 효소 영역, BaNT 효소 영역, 및 BuNT 효소 영역을 포함한다.
클로스트리듐 독소 효소 영역은 제한이 없이, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태 및 크로마토그래피 효소 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체; 및 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 그의 활성 클로스트리듐 독소 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기술된 기준 서열(표 1)의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 명백하게 나타내지 않는 한, 기술된 구체예를 실시하는데 유용한 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체는 중독과정의 효소적 표적 변형화 단계를 실행하는 변이체이다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; BoNT/B 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/C1 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; BoNT/D 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/E 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; BoNT/F 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/G 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-438과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; TeNT 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BaNT 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; BuNT 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 1/2-411과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이다.
클로스트리듐 독소의 각 혈청형 내에 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산이 다소 상이한 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 있을 수 있다는 것을 본 기술분야에서 숙련된 전문가들이 인정한다. 예를 들어, 현재 5 개의 BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5과 있으며, 특정한 효소 영역 서브타입은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 효소 영역과 비교할 때 약 80% 내지 95% 아미노산 동일성을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 제한되지 않지만, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태, 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 효소 영역 서브타입을 포함한, 천연적으로 존재하는 과정에 의해서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역에 대체될 수 있다.
천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 비-제한적 예는 예를 들어, BoNT/A 효소 영역 이소형태, BoNT/B 효소 영역 이소형태, BoNT/C1 효소 영역 이소형태, BoNT/D 효소 영역 이소형태, BoNT/E 효소 영역 이소형태, BoNT/F 효소 영역 이소형태, BoNT/G 효소 영역 이소형태, TeNT 효소 영역 이소형태, BaNT 효소 영역 이소형태, 및 BuNT 효소 영역 이소형태와 같은 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태이다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 또 다른 비-제한적 예는 예를 들어, 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 또는 BoNT/A5로부터의 효소 영역; 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/Bbv, 또는 BoNT/Bnp로부터의 효소 영역; 서브타입 BoNT/C1-1 또는 BoNT/C1-2로부터의 효소 영역; 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2 및 BoNT/E3으로부터의 효소 영역; 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, 또는 BoNT/F3으로부터의 효소 영역; 및 서브타입 BuNT-1 또는 BuNT-2로부터의 효소 영역과 같은 클로스트리듐 독소 효소 영역 서브타입이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 효소 영역 및 화학적 합성에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 클로스트리듐 독소 효소 영역 키메릭 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소 효소 영역 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역에 대체될 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 보존적 BaNT 효소 영역 변이체 및 보존적 BuNT 효소 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 1) 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역에 대체될 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 영역 변이체 및 비-보존적 BuNT 효소 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "활성 클로스트리듐 독소 효소 영역 단편"은 이들 효소 영역 단편이 신경전달물질 방출 기구의 코어 성분을 특이적으로 표적으로 할 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는, 효소 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것을 나타낸다. 클로스트리듐 독소의 효소 영역은 길이가 대략 420-460 아미노산이며, 효소 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 효소 영역의 전체 길이가 효소 영역의 효소적 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 효소 영역의 처음 8 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 또 다른 비-제한적 예로서, TeNT 효소 영역의 처음 8 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 마찬가지로, 효소 영역의 카복실-말단은 활성에 필수적이지 않다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 효소 영역의 마지막 32 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 또 다른 비-제한적 예로서, TeNT 효소 영역의 마지막 31 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 따라서, 이 구체예의 측면들에는 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 425, 또는 450 아미노산의 길이를 갖는 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 효소 영역이 포함된다. 이 구체예의 다른 측면들에는 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 425, 또는 450 아미노산의 길이를 갖는 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 효소 영역이 포함된다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체와 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
따라서, 한가지 구체예에서, 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 예를 들어, 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태 또는 클로스트리듐 독소 효소 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 활성 클로스트리듐 독소 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방?족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/A 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/A 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/A 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/A 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 1의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-429를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/A 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/A 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/A 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-429를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/B 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/B 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/B 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/B 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 6의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/B 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/B 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/B 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/C1 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/C1 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 11의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/D 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/D 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/D 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/D 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 13의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/D 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/D 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/D 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/E 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/E 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/E 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/E 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 15의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/E 효소 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/E 효소 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/E 효소 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/F 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/F 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/F 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/F 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 18의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-428을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/F 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/F 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/F 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-428을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/G 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 SEQ ID NO: 21의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/G 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/G 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/G 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-4435를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/G 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/G 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/G 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-4435를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 TeNT 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, TeNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 22의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태로부터의 효소 영역 또는 TeNT 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 효소 영역 또는 TeNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 효소 영역 또는 TeNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-438을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 활성 TeNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 활성 TeNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 활성 TeNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-438을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BaNT 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BaNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 23의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BaNT 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 효소 영역 또는 BaNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 효소 영역 또는 BaNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-420을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 활성 BaNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 활성 BaNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 활성 BaNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-420을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BuNT 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BuNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 24의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BuNT 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 효소 영역 또는 BuNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 효소 영역 또는 BuNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 24의 천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 활성 BuNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 활성 BuNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 활성 BuNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
"전위 영역"은 전위 활성을 갖는 클로스트리듐 신경독 중쇄의 일부분을 포함한다. "전위(translocation)"는 소포막을 통한 폴리펩타이드의 운반을 촉진시킴으로써 폴리펩타이드의 일부 또는 전부가 세포질에 노출되도록 하는 능력을 의미한다. 다양한 보툴리눔 신경독에서 전위는 엔조좀(endosome) 내에서 pH의 감소에 의해서 야기된 중쇄의 알로스테릭 배좌 변화(allosteric conformational change)를 수반하는 것으로 생각된다. 이 배좌 변화는 중쇄의 N 말단 절반을 포함하고 이에 의해서 매개되며, 소포막에서 막의 형성을 야기하는 것으로 보이며; 이 변화는 단백분해적 경쇄가 엔도좀 소포로부터 세포질 내로 이동하는 것을 허용한다. [참조: 예를 들어, Lacy, et al., Nature Struct. Biol. 5:898-902(October 1998)].
보툴리눔 신경독 중쇄의 전위-매개성 부분의 아미노산 서열은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며; 추가로 전위 활성을 부여하는데 필수적인 것으로 알려진 이 부분 내의 아미노산 잔기도 또한 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어, 다양한 클로스트리듐 테타누스(Clostridium tetanus) 또는 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum) 신경독 서브타입 중의 어떤 것의 중쇄의 천연적으로 존재하는 N-말단 펩타이드 절반을 전위 영역으로 이용하거나, 다양한 중쇄의 N-말단 절반의 일차 서열을 정렬하고, 서열들 사이의 보존된 아미노산, 극성, 입체 및 소수성 특징을 기초로 하여 공통 일차 전위 서열을 선택함으로써 유사한 전위 영역을 디자인하는 것은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가의 능력으로 충분할 것이다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 전위 영역"은 클로스트리듐 독소 경쇄 전위를 매개하는 중독과정의 전위 단계를 실행할 수 있는 모든 클로스트리듐 독소 폴리펩타이드를 나타낸다. 따라서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 클로스트리듐 독소 경쇄가 막을 가로질러서 이동하는 것을 촉진하며, 세포내 소포의 막을 통한 클로스트리듐 독소 경쇄의 세포의 세포질 내로의 이동을 포함한다. 클로스트리듐 독소 전위 영역의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 전위 영역, BoNT/B 전위 영역, BoNT/C1 전위 영역, BoNT/D 전위 영역, BoNT/E 전위 영역, BoNT/F 전위 영역, BoNT/G 전위 영역, TeNT 전위 영역, BaNT 전위 영역, 및 BuNT 전위 영역이 포함된다.
클로스트리듐 독소 전위 영역에는 제한이 없이, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 전위 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체; 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 그의 활성 클로스트리듐 독소 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기술된 기준 서열(표 1)의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 명백히 나타내지 않는 한, 기술된 구체예를 실시하는데 유용한 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체는 클로스트리듐 독소 경쇄 전위를 매개하는 중독과정의 전위 단계를 실행하는 변이체이다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/B 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/C1 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/D 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/E 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/F 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/G 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; TeNT 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BaNT 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BuNT 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 427-847과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있다.
클로스트리듐 독소의 각 혈청형 내에 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산이 다소 상이한 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 있을 수 있다는 것을 본 기술분야에서 숙련된 전문가들이 인정한다. 예를 들어, 현재 5 개의 BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5과 있으며, 특정한 전위 영역 서브타입은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 전위 영역 서브타입과 비교할 때 약 85-87% 아미노산 동일성을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 제한되지 않지만, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태, 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 전위 영역 서브타입을 포함한, 천연적으로 존재하는 과정에 의해서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역에 대체될 수 있다.
천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 비-제한적 예는 예를 들어, BoNT/A 전위 영역 이소형태, BoNT/B 전위 영역 이소형태, BoNT/C1 전위 영역 이소형태, BoNT/D 전위 영역 이소형태, BoNT/E 전위 영역 이소형태, BoNT/F 전위 영역 이소형태, BoNT/G 전위 영역 이소형태, TeNT 전위 영역 이소형태, BaNT 전위 영역 이소형태, 및 BuNT 전위 영역 이소형태와 같은 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태이다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 또 다른 비-제한적 예는 예를 들어, 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5로부터의 전위 영역; 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, 2 가 BoNT/B, 및 비단백분해성 BoNT/B로부터의 전위 영역; 서브타입 BoNT/C1-1 및 BoNT/C1-2로부터의 전위 영역; 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2 및 BoNT/E3으로부터의 전위 영역; 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, 및 BoNT/F3으로부터의 전위 영역; 및 서브타입 BuNT-1 및 BuNT-2로부터의 전위 영역과 같은 클로스트리듐 독소 전위 영역 서브타입이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 전위 영역 및 화학적 합성에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소 전위 영역 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역에 대체될 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 보존적 BaNT 전위 영역 변이체 및 보존적 BuNT 전위 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 1) 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역에 대체될 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 영역 변이체 및 비-보존적 BuNT 전위 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "활성 클로스트리듐 독소 전위 영역 단편"은 이들 활성 단편이 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질 내로의 LC의 방출을 촉진시킬 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는, 전위 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것을 나타낸다. 클로스트리듐 독소의 중쇄로부터의 전위 영역은 길이가 대략 410-430 아미노산이며, 전위 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 중쇄로부터의 전위 영역의 전체 길이가 전위 영역의 전위 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 따라서, 이 구체예의 측면들에는 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역이 포함된다. 이 구체예의 다른 측면들에는 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역이 포함된다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체와 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
따라서, 한가지 구체예에서, 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 예를 들어, 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태 또는 클로스트리듐 독소 전위 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 활성 클로스트리듐 독소 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방?족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/A 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/A 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/A 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/A 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 1의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체의 아미노산 455-873을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/A 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/A 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/A 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체의 아미노산 455-873을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/B 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/B 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/B 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/B 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 6의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체의 아미노산 447-860을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/B 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/B 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/B 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체의 아미노산 447-860을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/C1 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/C1 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 11의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체의 아미노산 454-868을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체의 아미노산 454-868을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/D 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/D 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/D 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/D 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 13의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체의 아미노산 451-864를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/D 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/D 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/D 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체의 아미노산 451-864를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/E 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/E 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/E 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/E 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 15의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/E 전위 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/E 전위 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/E 전위 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/F 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/F 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/F 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/F 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 18의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체의 아미노산 446-865를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/F 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/F 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/F 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체의 아미노산 446-865를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/G 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 SEQ ID NO: 21의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/G 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/G 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/G 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체의 아미노산 451-865를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/G 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/G 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/G 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체의 아미노산 451-865를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 TeNT 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, TeNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 22의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태로부터의 전위 영역 또는 TeNT 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 전위 영역 또는 TeNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 전위 영역 또는 TeNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체의 아미노산 468-881을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 활성 TeNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 활성 TeNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 활성 TeNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체의 아미노산 468-881을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BaNT 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BaNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 23의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BaNT 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 전위 영역 또는 BaNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 전위 영역 또는 BaNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체의 아미노산 436-857을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 활성 BaNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 활성 BaNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 활성 BaNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체의 아미노산 436-857을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BuNT 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BuNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 24의 아미노산 427-847을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BuNT 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 전위 영역 또는 BuNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 전위 영역 또는 BuNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 24의 천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 활성 BuNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 활성 BuNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 활성 BuNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로 결합 영역을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "결합 영역"은 "리간드" 또는 "표적화 부위"와 동의어이며, 생리적 조건 하에서 세포의 표면상에 존재하는 또 다른 분자와 우선적으로 상호작용할 수 있는 모든 분자를 나타낸다. 세포 표면 분자는 폴리펩타이드, 폴리사카라이드, 지질을 포함할 수 있거나, 이들 중의 하나 이상의 구조적 특징을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "우선적으로 상호작용"한다는 것은 분자가 생리적 조건 하에서, 또는 실질적으로 생리적 조건을 모방한 시험관내 조건에서, 다른 비-표적 수용체에 비해서 통계학적으로 유의적으로 더 큰 정도까지 그의 표적 수용체에 결합할 수 있음을 나타낸다. 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 결합 영역에 관하여, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 다른 수용체에 비해 그의 동족성 수용체에 대해서 차별적인 결합을 한다. 본 명세서에 기술된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 관하여, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 다른 수용체에 비해 그의 동족성 수용체에 대해서 차별적인 결합을 한다.
따라서, 한가지 구체예에서, 표적 세포에 선택적으로 결합하는 결합 영역은 비-표적 수용체에 비해 표적 수용체에 대해, 예를 들어, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10 배, 적어도 50 배, 적어도 100 배, 적어도 1000, 적어도 10,000, 또는 적어도 100,000 배만큼 더 큰 해리 평형 상수(dissociation equilibrium constant; KD)를 갖는다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 클로스트리듐 독소 결합 영역을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 결합 영역"은 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소가 표적 세포를 중독시키는 전반적인 내재화 기전을 개시하는 중독과정의 결합 단계를 실행할 수 있는 모든 클로스트리듐 독소 폴리펩타이드를 나타낸다. 클로스트리듐 독소 결합 영역의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 결합 영역, BoNT/B 결합 영역, BoNT/C1 결합 영역, BoNT/D 결합 영역, BoNT/E 결합 영역, BoNT/F 결합 영역, BoNT/G 결합 영역, TeNT 결합 영역, BaNT 결합 영역, 및 BuNT 결합 영역이 포함된다. 클로스트리듐 독소 결합 영역의 그 밖의 다른 비-제한적 예로는 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296, SEQ ID NO: 2의 아미노산 861-1291, SEQ ID NO: 3의 아미노산 869-1291, SEQ ID NO: 4의 아미노산 865-1291, SEQ ID NO: 5의 아미노산 848-1252, SEQ ID NO: 6의 아미노산 866-1274, SEQ ID NO: 7의 아미노산 866-1297, SEQ ID NO: 8의 아미노산 882-1315, SEQ ID NO: 9의 아미노산 858-1268, 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 848-1251이 포함된다.
클로스트리듐 독소 결합 영역에는 제한이 없이, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체; 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 그의 활성 클로스트리듐 독소 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기술된 기준 서열(표 1)의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 명백히 나타내지 않는 한, 기술된 구체예를 실시하는데 유용한 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 클로스트리듐 독소 경쇄 전위를 매개하는 중독과정의 전위 단계를 실행하는 변이체이다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/B 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/C1 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/D 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/E 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/F 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/G 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; TeNT 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BaNT 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BuNT 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 848-1251과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있다.
클로스트리듐 독소의 각 혈청형 내에 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산이 다소 상이한 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 있을 수 있다는 것을 본 기술분야에서 숙련된 전문가들이 인정한다. 예를 들어, 현재 5 개의 BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5과 있으며, 특정한 결합 영역 서브타입은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 결합 영역 서브타입과 비교할 때 약 83-97% 아미노산 동일성을 나타낸다. 또 다른 예로서, 현재 5 개의 BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5과 있으며, 특정한 결합 영역 서브타입은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 결합 영역 서브타입과 비교할 때 약 83-97% 아미노산 동일성을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 제한되지 않지만, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태, 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입을 포함한, 천연적으로 존재하는 과정에 의해서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다.
천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예는 예를 들어, BoNT/A 결합 영역 이소형태, BoNT/B 결합 영역 이소형태, BoNT/C1 결합 영역 이소형태, BoNT/D 결합 영역 이소형태, BoNT/E 결합 영역 이소형태, BoNT/F 결합 영역 이소형태, BoNT/G 결합 영역 이소형태, TeNT 결합 영역 이소형태, BaNT 결합 영역 이소형태, 및 BuNT 결합 영역 이소형태와 같은 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태이다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 또 다른 비-제한적 예는 예를 들어, 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5로부터의 결합 영역; 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, 2 가 BoNT/B, 및 비단백분해성 BoNT/B로부터의 결합 영역; 서브타입 BoNT/C1-1 및 BoNT/C1-2로부터의 결합 영역; 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2 및 BoNT/E3으로부터의 결합 영역; 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, 및 BoNT/F3으로부터의 결합 영역; 및 서브타입 BuNT-1 및 BuNT-2로부터의 결합 영역과 같은 클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 결합 영역 및 화학적 합성에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 클로스트리듐 독소 결합 영역 키메릭 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소 결합 영역 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 보존적 BaNT 결합 영역 변이체 및 보존적 BuNT 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 1) 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 결합 영역 변이체 및 비-보존적 BuNT 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "활성 클로스트리듐 독소 결합 영역 단편"은 이들 활성 단편이 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질 내로의 LC의 방출을 촉진시킬 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는, 결합 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것을 나타낸다. 클로스트리듐 독소의 중쇄로부터의 결합 영역은 길이가 대략 400-440 아미노산이며, 결합 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 중쇄로부터의 결합 영역의 전체 길이가 결합 영역의 전위 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 따라서, 이 구체예의 측면들에는 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 결합 영역이 포함된다. 이 구체예의 다른 측면들에는 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 결합 영역이 포함된다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체와 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
따라서, 한가지 구체예에서, 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 또는 클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 활성 클로스트리듐 독소 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방?족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/A 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/A 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/A 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/A 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 1의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체의 아미노산 874-1296을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/A 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/A 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/A 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체의 아미노산 874-1296을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/B 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/B 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/B 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/B 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 6의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체의 아미노산 861-1291을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/B 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/B 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/B 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체의 아미노산 861-1291을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/C1 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/C1 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 11의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체의 아미노산 869-1291을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체의 아미노산 869-1291을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/D 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/D 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/D 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/D 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 13의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체의 아미노산 865-1291을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/D 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/D 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/D 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체의 아미노산 865-1291을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/E 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/E 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/E 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/E 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 15의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체의 아미노산 848-1252를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/E 결합 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/E 결합 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/E 결합 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체의 아미노산 848-1252를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/F 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/F 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/F 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/F 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 18의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체의 아미노산 866-1274를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/F 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/F 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/F 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체의 아미노산 866-1274를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/G 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 SEQ ID NO: 21의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/G 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/G 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/G 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체의 아미노산 866-1297을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/G 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/G 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/G 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체의 아미노산 866-1297을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 TeNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, TeNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 22의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태로부터의 결합 영역 또는 TeNT 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 결합 영역 또는 TeNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 결합 영역 또는 TeNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체의 아미노산 882-1315를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 활성 TeNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 활성 TeNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 활성 TeNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체의 아미노산 882-1315를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BaNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BaNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 23의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BaNT 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 결합 영역 또는 BaNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 결합 영역 또는 BaNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체의 아미노산 858-1268을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 활성 BaNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 활성 BaNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 활성 BaNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체의 아미노산 858-1268을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BuNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BuNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 24의 아미노산 848-1251을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BuNT 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 결합 영역 또는 BuNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 결합 영역 또는 BuNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 24의 천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체의 아미노산 848-1251을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 활성 BuNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 활성 BuNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 활성 BuNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체의 아미노산 848-1251을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-클로스트리듐 독소 결합 영역"은 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소가 표적 세포를 중독시키는 전반적인 내재화 기전을 개시하는 중독과정의 결합 단계를 실행할 수 있는 모든 폴리펩타이드를 나타낸다. 결합 영역의 예는 예를 들어, 문헌 [Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, 미국 특허 제5,989,545호; Clifford C. hone et al., Recombinant Toxin Fragments, 미국 특허 제6,461,617호; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, 미국 특허 제6,632,440호; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, 미국 특허 제6,843,998호; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,132,259호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허공개 제2002/0037833호; Keith A. Foster et al., Inhibition of Selection from Non-neural Cells, 미국 특허공개 제2003/0180289호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허공개 제2006/0211619호; Keith A. Foster et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, 미국 특허공개 제2008/0187960호; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허출원 제11/776,075호; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, 미국 특허출원 제11/792,210호; 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
비-클로스트리듐 독소 결합 영역에는 제한이 없이, 예를 들어, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 및 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체; 및 예를 들어, 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 키메라, 그의 활성 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기준 서열의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 명백히 나타내지 않는 한, 기술된 구체예를 실시하는데 유용한 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 중독과정의 결합 단계를 실행하는 변이체이다.
각각의 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 내에 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산이 다소 상이한 천연적으로 존재하는 변이체가 있을 수 있다는 것을 본 기술분야에서 숙련된 전문가들이 인정한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 제한되지 않지만, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 및 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태를 포함한, 천연적으로 존재하는 과정에 의해서 생산된 모든 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태이다. 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태의 비-제한적 예로는 예를 들어, 오피오이드(opiod) 결합 영역 이소형태, 타키키닌(tachykinin) 결합 영역 이소형태, 멜라노코르틴(melanocortin) 결합 영역 이소형태, 갈라닌(galanin) 결합 영역 이소형태, 그라닌(granin) 결합 영역 이소형태, 뉴로펩타이드(Neuropeptide) Y 관련된 펩타이드 결합 영역 이소형태, 신경호르몬 결합 영역 이소형태, 신경조절성 사이토킨 결합 영역 이소형태, 키닌 펩타이드 결합 영역 이소형태, 성장인자 결합 영역 이소형태, 및 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역 이소형태가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 화학적 합성에 의해서 생산된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 키메릭 변이체, 및 활성 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 서열로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 오피오이드 결합 영역 변이체, 보존적 타키키닌 결합 영역 변이체, 보존적 멜라노코르틴 결합 영역 변이체, 보존적 갈라닌 결합 영역 변이체, 보존적 그라닌 결합 영역 변이체, 보존적 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역 변이체, 보존적 신경호르몬 결합 영역 변이체, 보존적 신경조절성 사이토킨 결합 영역 변이체, 보존적 키닌 펩타이드 결합 영역 변이체, 보존적 성장인자 결합 영역 변이체, 및 보존적 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 1) 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역이 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 서열로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 오피오이드 결합 영역 변이체, 비-보존적 타키키닌 결합 영역 변이체, 비-보존적 멜라노코르틴 결합 영역 변이체, 비-보존적 갈라닌 결합 영역 변이체, 비-보존적 그라닌 결합 영역 변이체, 비-보존적 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역 변이체, 비-보존적 신경호르몬 결합 영역 변이체, 비-보존적 신경조절성 사이토킨 결합 영역 변이체, 비-보존적 키닌 펩타이드 결합 영역 변이체, 비-보존적 성장인자 결합 영역 변이체, 및 비-보존적 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "활성 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 단편"은 이들 결합 영역 단편이 동족성 수용체와 우선적으로 상호작용할 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는, 결합 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것을 나타낸다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체와 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
따라서, 한가지 구체예에서, 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태와 같은 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 활성 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방?족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 엔케팔린, 엔도모르핀, 엔도르핀, 다이노르핀, 노시셉틴 또는 헤모르핀과 같은 오피오이드 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 물질 P, 뉴로펩타이드 K(NPK), 뉴로펩타이드 감마(NP 감마), 뉴로키닌 A(NKA; 물질 K, 뉴로키닌 알파, 뉴로메딘 L), 뉴로키닌 B(NKB), 헤모키닌 또는 엔도키닌과 같은 타키키닌 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소는 예를 들어, 멜라노사이트 자극 호르몬, 아드레노코르티코트로핀, 또는 리포트로핀과 같은 멜라노코르틴 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 갈라닌 또는 갈라닌 메시지-연관된 펩타이드와 같은 갈라닌 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 크로모그라닌(Chromogranin) A, 크로모그라닌 B 또는 크로모그라닌 C와 같은 그라닌 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 뉴로펩타이드 Y, 펩타이드 YY, 췌장 펩타이드 또는 췌장 이코사펩타이드와 같은 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 부갑상선 호르몬, 타이로트로핀-방출 호르몬 또는 소마토스타틴과 같은 신경호르몬 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 섬모 향신경성 인자, 글리코포린-A, 백혈병 억제인자, 콜린성 분화인자, 인터류킨, 오노스타틴 M, 카디오트로핀-1, 카디오트로핀-유사 사이토킨, 또는 뉴로류킨과 같은 신경조절성 사이토킨 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 브래디키닌, 칼리딘, 데스Arg9 브래디키닌 또는 데스Arg10 브래디키닌과 같은 키닌 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 섬유아세포 성장인자 결합 영역, 신경 성장인자 결합 영역, 인슐린 성장인자 결합 영역, 표피 성장인자 결합 영역, 혈관 내피 성장인자 결합 영역, 뇌 유도된 향신경성 인자 결합 영역, 성장 유도된 향신경성 인자 결합 영역, 예를 들어, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4/5와 같은 뉴로트로핀 결합 영역, 두부 활성화제(head activator) 펩타이드 결합 영역, 뉴르투린(neurturin) 결합 영역, 퍼세프린(persephrin) 결합 영역, 아르테민(artemin) 결합 영역, 예를 들어, TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 또는 TGFβ4와 같은 변형 성장인자 β 결합 영역, 예를 들어, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8 또는 BMP10과 같은 골형성 단백질 결합 영역, 예를 들어, GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF10, GDF11 또는 GDF15와 같은 성장 분화인자 결합 영역, 또는 예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E 또는 인히빈 A와 같은 액티빈 결합 영역과 같은 성장인자 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 세크레틴, GLP-1 및 GLP-2와 같은 글루카곤-유사 펩타이드, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩타이드 결합 영역, 성장 호르몬-방출 호르몬 결합 영역, VIP1 또는 VIP2와 같은 혈관활성 장 펩타이드 결합 영역, 위 억제성 폴리펩타이드 결합 영역, 가스트린, 가스트린-방출 펩타이드 또는 콜레시스토키닌과 같은 칼시토닌-관련된 펩타이드내 장 펩타이드 결합 영역, 또는 PARP1 펩타이드, PARP2 펩타이드, PARP3 펩타이드 또는 PARP4 펩타이드와 같은 PAR 펩타이드 결합 영역과 같은 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 엔케팔린 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 엔케팔린 펩타이드는 Leu-엔케팔린, Met-엔케팔린, Met-엔케팔린 MRGL 또는 Met-엔케팔린 MRF를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔케팔린 펩타이드는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 엔케팔린은 예를 들어, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔케팔린은 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔케팔린은 예를 들어, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 소 부신수질(bovine adrenomedullary)-22(BAM22) 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, BAM22 펩타이드는 BAM22 펩타이드(1-12), BAM22 펩타이드(6-22), BAM22 펩타이드(8-22) 또는 BAM22 펩타이드(1-22)를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BAM22 펩타이드는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BAM22 펩타이드는 예를 들어, SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BAM22 펩타이드는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BAM22 펩타이드는 예를 들어, SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 엔도모르핀 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 엔도모르핀 펩타이드는 엔도모르핀-1 또는 엔도모르핀-2를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도모르핀 펩타이드는 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도모르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도모르핀은 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도모르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 엔도르핀 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 엔도르핀 펩타이드는 엔도르핀-α, 네오엔도르핀-α, 에도르핀-β, 네오엔도르핀-β 또는 엔도르핀-γ를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀 펩타이드는 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 다이노르핀 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 다이노르핀 펩타이드는 다이노르핀 A, 다이노르핀 B(류모르핀) 또는 리모르핀을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 다이노르핀 펩타이드는 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 또는 SEQ ID NO: 74를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 다이노르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 노시셉틴 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 노시셉틴 펩타이드는 노시셉틴 RK, 노시셉틴, 뉴로펩타이드 1, 뉴로펩타이드 2, 또는 뉴로펩타이드 3을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 노시셉틴 펩타이드는 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 노시셉틴은 예를 들어, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 노시셉틴은 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 노시셉틴은 예를 들어, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 헤모르핀 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 헤모르핀 펩타이드는 LVVH7, VVH7, VH7, H7, LVVH6, LVVH5, VVH5, LVVH4 및 LVVH3을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 헤모르핀 펩타이드는 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 헤모르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 헤모르핀은 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 헤모르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 갈라닌 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 갈라닌 펩타이드 결합 영역은 갈라닌 또는 갈라닌 메시지-연관된 펩타이드(GMAP)를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 갈라닌 펩타이드 결합 영역은 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 갈라닌 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 갈라닌 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 갈라닌 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 타키키닌 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 물질 P, 뉴로펩타이드 K(NPK), 뉴로펩타이드 감마(NP 감마), 뉴로키닌 A(NKA; 물질 K, 뉴로키닌 알파, 뉴로메딘 L), 뉴로키닌 B(NKB), 헤모키닌 또는 엔도키닌을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 뉴로펩타이드 Y(NPY), 펩타이드 YY(PYY), 췌장 펩타이드(PP) 또는 췌장 이코사펩타이드(PIP)를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 키메릭은 클로스트리듐 독소 키메릭이 중독과정을 수행할 수 있다는 단서하에, 어떤 위치에서라도 비-클로스트리듐 결합 영역을 포함할 수 있는 것으로 생각된다. 비-제한적 예로는 변형된 클로스트리듐 독소의 아미노 말단에 비-클로스트리듐 결합 영역이 위치하고; 변형된 클로스트리듐 독소의 클로스트리듐 독소 효소 영역과 전위 영역 사이에 비-클로스트리듐 결합 영역이 위치하고; 변형된 클로스트리듐 독소의 카복실 말단에 비-클로스트리듐 결합 영역이 위치하는 것이 포함된다. 그 밖의 다른 비-제한적 예로는 변형된 클로스트리듐 독소의 클로스트리듐 독소 효소 영역과 클로스트리듐 독소 전위 영역 사이에 비-클로스트리듐 결합 영역이 위치하는 것이 포함된다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 효소 영역은 천연의 출발 메티오닌을 함유한다. 따라서, 효소 영역이 아미노-말단 위치에 있지 않은 영역 조직화에서는 출발 메티오닌을 포함하는 아미노산 서열이 아미노-말단 영역의 전방에 위치하여야 한다. 마찬가지로, 비-클로스트리듐 결합 영역이 아미노-말단 위치에 있는 경우에, 출발 메티오닌 및 프로테아제 분해 부위를 포함하는 아미노산 서열은 비-클로스트리듐 결합 영역이 유리 아미노 말단을 필요로 하는 상황에서 작동가능하게-연결될 수 있다. [참조: 예를 들어, Shengwen Li et al., Degradable Clostridial Toxins, 미국 특허출원 제11/572,512호(2007년 1월 23일); 이것은 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다]. 또한, 출발 메티오닌을 포함하는 또 다른 폴리펩타이드의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 폴리펩타이드를 첨가하는 경우에 원래의 메티오닌 잔기가 결실될 수 있다는 것은 본 기술분야에서 공지되어 있다.
따라서, 구체예에서 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 결합 영역, 전위 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 3a). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 결합 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 결합 영역, 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 및 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 3b). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 결합 영역, 클로스트리듐 독소 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 비-클로스트리듐 결합 영역, 및 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4a). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 비-클로스트리듐 결합 영역, 및 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 전위 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 비-클로스트리듐 결합 영역, 및 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4b). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 효소 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 및 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4c). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 전위 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4d). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 전위 영역, 및 비-클로스트리듐 결합 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 5a). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 및 비-클로스트리듐 결합 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 전위 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 효소 영역 및 비-클로스트리듐 결합 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 5b). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "불활성화 분해 부위"는 예를 들어, 심혈관계 또는 림프계와 같은 순환기계 또는 간질액 내에 존재하는 프로테아제에 의한 절단가능한 결합에서의 선택적 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 이러한 불활성화 분해 부위는 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 융합 단백질로서 작동가능하게-연결된다. 의미상, 불활성화 분해 부위는 간질액 또는 순환기계에 존재하는 적어도 하나의 프로테아제에 의한 선택적 분해에 민감하다. 불활성화 분해 부위의 비-제한적 예로는 트롬빈 분해 부위, 플라즈민 분해 부위, 응고인자 VIIa 분해 부위, 응고인자 IXa 분해 부위, 응고인자 Xa 분해 부위, 응고인자 XIa 분해 부위, 응고인자 XIIa 분해 부위, 혈장 칼리크레인 분해 부위, 프로테아제-활성화된 G 단백질-커플링된 수용체-1(PAR1) 분해 부위, PAR2 분해 부위, PAR3 분해 부위, PAR4 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9) 분해 부위, 푸린 분해 부위, 유로키나제-타입 플라즈미노겐 활성화제(uPA) 분해 부위, 조직-타입 플라즈미노겐 활성화제(tPA) 분해 부위, 트립타제-ε 분해 부위, 마우스 비만세포 프로테아제-7(mMCP-7) 분해 부위, 엔도텔린-전환효소-1(ECE-1) 분해 부위, 켈 혈액형 분해 부위, DPPIV 분해 부위, 트롬보스폰딘 타입 1 모티프-13(ADAMTS13) 분해 부위를 갖는 ADAM 메탈로펩티다제, 및 카텝신 L 분해 부위가 포함된다(표 4).
표 4. 불활성화 분해 부위
프로테아제 분해 부위 기준 서열 SEQ ID NO:






트롬빈
Figure pat00004
Figure pat00005



응고인자 VIIa(FVIIA)
Figure pat00006
Figure pat00007

응고인자 IXa(FIXa)
Figure pat00008
Figure pat00009






응고인자 Xa(FXa)
Figure pat00010
Figure pat00011




응고인자 XIa(FXIa)
Figure pat00012
Figure pat00013


응고인자 XIIa(FXIIa)
Figure pat00014
Figure pat00015









칼리크레인 1
Figure pat00016
Figure pat00017



단백질 C
Figure pat00018
Figure pat00019











플라즈미노겐
Figure pat00020

Figure pat00021
Figure pat00022

Figure pat00023












매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)
Figure pat00024
Figure pat00025


매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9)
Figure pat00026

Figure pat00027
Figure pat00028

Figure pat00029










푸린
Figure pat00030

Figure pat00031
Figure pat00032

Figure pat00033







u-플라즈미노겐 활성화제(u-PA)
Figure pat00034
Figure pat00035

t-플라즈미노겐 활성화제(t-PA)
Figure pat00036
Figure pat00037




트립타제-ε(프로세민)
Figure pat00038
Figure pat00039

마우스 비만세포 프로테아제-7(mMCP-7)
Figure pat00040
Figure pat00041







엔도텔린-전환효소-1(ECE-1)
Figure pat00042

Figure pat00043
Figure pat00044

Figure pat00045
켈 혈액형 단백질(KBGP)
Figure pat00046
Figure pat00047









카텝신 L
Figure pat00048
Figure pat00049



PAR1
Figure pat00050
Figure pat00051
PAR2
Figure pat00052
Figure pat00053
PAR3
Figure pat00054
Figure pat00055
PAR4
Figure pat00056

Figure pat00057
Figure pat00058

Figure pat00059
ADAMTS13
Figure pat00060
Figure pat00061
별표(*)는 지시된 프로테아제에 의해서 분해되는 P1-P1' 분해 부위의 펩타이드 결합을 나타낸다.
불활성화 분해 부위가 간질액 또는 순환기계 프로테아제에 의해서 분해될 수 있다는 단서하에, 모든 길이의 불활성화 분해 부위가 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위는 길이가 예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 아미노산일 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위는 길이가 예를 들어, 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 아미노산일 수 있다.본 명세서의 측면들에서 유용한 불활성화 분해 부위에는 제한이 없이 천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위; 천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체; 및 예를 들어, 보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체 및 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체(peptidomimetic)와 같은 비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체가 포함된다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "불활성화 분해 부위 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기술된 기준 서열의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 갖고, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체"는 인간 조작의 도움이 없이 생산된 모든 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 불활성화 분해 부위의 비-제한적 예로는 트롬빈 분해 부위 변이체, 플라즈민 분해 부위 변이체, 응고인자 V 분해 부위 변이체, 응고인자 VII 분해 부위 변이체, 응고인자 VIII 분해 부위 변이체, 응고인자 IXa 분해 부위 변이체, 응고인자 Xa 분해 부위 변이체, 응고인자 XIa 분해 부위 변이체, 응고인자 XIIa 분해 부위 변이체, 혈장 칼리크레인 분해 부위 변이체, MMP-2 분해 부위 변이체, MMP-9 분해 부위 변이체, 푸린 분해 부위 변이체, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 트립타제-ε 분해 부위 변이체, mMCP-7 분해 부위 변이체, ECE-1 분해 부위 변이체, KBGP 분해 부위 변이체, 카텝신 L 분해 부위 변이체, PAR1 분해 부위 변이체, PAR2 분해 부위 변이체, PAR3 분해 부위 변이체, PAR4 분해 부위 변이체, 및 ADAM-TS13 분해 부위 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 불활성화 분해 부위 변이체 및 화학적 합성에 의해서 생산된 불활성화 분해 부위 변이체를 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 및 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 불활성화 분해 부위 변이체"는 기준 불활성화 분해 부위 서열로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 불활성화 분해 부위 변이체는 보존적 불활성화 분해 부위 변이체가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 불활성화 분해 부위에 대체될 수 있다. 보존적 불활성화 분해 부위 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 트롬빈 분해 부위 변이체, 보존적 플라즈민 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 V 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 VII 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 VIII 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 IXa 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 Xa 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 XIa 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 XIIa 분해 부위 변이체, 보존적 혈장 칼리크레인 분해 부위 변이체, 보존적 MMP-2 분해 부위 변이체, 보존적 MMP-9 분해 부위 변이체, 보존적 푸린 분해 부위 변이체, 보존적 u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 보존적 t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 보존적 트립타제-ε 분해 부위 변이체, 보존적 mMCP-7 분해 부위 변이체, 보존적 ECE-1 분해 부위 변이체, 보존적 KBGP 분해 부위 변이체, 보존적 카텝신 L 분해 부위 변이체, 보존적 PAR1 분해 부위 변이체, 보존적 PAR2 분해 부위 변이체, 보존적 PAR3 분해 부위 변이체, 보존적 PAR4 분해 부위 변이체, 및 보존적 ADAM-TS13 분해 부위 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체"는 1) 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 불활성화 분해 부위가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 불활성화 분해 부위 서열(표 4)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체는 비-보존적 불활성화 분해 부위가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 불활성화 분해 부위에 대체될 수 있다. 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 트롬빈 분해 부위 변이체, 비-보존적 플라즈민 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 V 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 VII 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 VIII 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 IXa 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 Xa 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 XIa 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 XIIa 분해 부위 변이체, 비-보존적 혈장 칼리크레인 분해 부위 변이체, 비-보존적 MMP-2 분해 부위 변이체, 비-보존적 MMP-9 분해 부위 변이체, 비-보존적 푸린 분해 부위 변이체, 비-보존적 u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 비-보존적 t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 비-보존적 트립타제-ε 분해 부위 변이체, 비-보존적 mMCP-7 분해 부위 변이체, 비-보존적 ECE-1 분해 부위 변이체, 비-보존적 KBGP 분해 부위 변이체, 비-보존적 카텝신 L 분해 부위 변이체, 비-보존적 PAR1 분해 부위 변이체, 비-보존적 PAR2 분해 부위 변이체, 비-보존적 PAR3 분해 부위 변이체, 비-보존적 PAR4 분해 부위 변이체, 및 비-보존적 ADAM-TS13 분해 부위 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "불활성화 분해 부위 펩타이드유사체"는 첫 번째 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 비-천연 올리고머에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 특성의 예로는 이에 한정되지 않고 펩타이드 일차 구조 요소의 토포그래피, 펩타이드 일차 구조 요소의 작용성, 펩타이드 이차 구조 요소의 토폴로지(topology), 펩타이드 이차 구조 요소의 작용성 등, 또는 이들의 조합이 포함된다. 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체는 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 불활성화 분해 부위에 대해 대체될 수 있다. 펩타이드유사체 방법의 예로는 예를 들어, 문헌 [Amy S. Ripka & Daniel H. Rich, Peptidomimetic design, 2(4) Curr. Opin. Chem. Biol. 441-452(1998); 및 M. Angels Estiarte & Daniel H. Rich, Peptidomimetics for Drug Design, 803-861(Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery Vol. 1 Principle and Practice, Donald J. Abraham ed., Wiley-Interscience, 6th ed 2003)]을 참고로 한다. 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 트롬빈 분해 부위 펩타이드유사체, 플라즈민 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 V 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 VII 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 VIII 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 IXa 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 Xa 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 XIa 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 XIIa 분해 부위 펩타이드유사체, 혈장 칼리크레인 분해 부위 펩타이드유사체, MMP-2 분해 부위 펩타이드유사체, MMP-9 분해 부위 펩타이드유사체, 푸린 분해 부위 펩타이드유사체, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 펩타이드유사체, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 펩타이드유사체, 트립타제-ε 분해 부위 펩타이드유사체, mMCP-7 분해 부위 펩타이드유사체, ECE-1 분해 부위 펩타이드유사체, KBGP 분해 부위 펩타이드유사체, 카텝신 L 분해 부위 펩타이드유사체, PAR1 분해 부위 펩타이드유사체, PAR2 분해 부위 펩타이드유사체, PAR3 분해 부위 펩타이드유사체, PAR4 분해 부위 펩타이드유사체, 및 ADAM-TS13 분해 부위 펩타이드유사체가 포함된다.
따라서, 구체예에서 클로스트리듐 독소는 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 클로스트리듐 독소 결합 영역, 및 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소는 예를 들어, 불활성화 분해 부위 이소형태와 같은 천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소는 예를 들어, 보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체 또는 활성 불활성화 분해 부위 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소 키메릭은 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 및 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 불활성화 분해 부위 이소형태와 같은 천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체 또는 활성 불활성화 분해 부위 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방?족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 트롬빈 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "트롬빈 분해 부위"는 트롬빈 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 트롬빈에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 트롬빈에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 트롬빈 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 113)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 S, T, 또는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 선택적으로 F, S, T, 또는 N 또는 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 선택적으로 S, T, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 트롬빈에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 114-123). 추가의 트롬빈 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 트롬빈 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 트롬빈 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 113을 포함하며, 여기에서 X1은 S, T, 또는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 F, S, T, 또는 N 또는 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 S, T, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 트롬빈 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 113을 포함하며, 여기에서 X1은 S, Q, K, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 N, Q, G, P, A, V, L, 또는 I이며; X4는 S, T, H, G, A, L, 또는 I이고; X5는 S, T, Q, K, R, F, Y, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 S, T, Q, K, R, G, P, A, V, L, 또는 I이고; X7은 S, T, Q, K, R, G, P, A, V, L 또는 I이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 트롬빈 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 113을 포함하며, 여기에서 X1은 Q, G, P, A, V, L, I 또는 M이고; X2는 S, T, D, E, G, A, V 또는 I이며; X3은 G, P, A, V, 또는 L이며; X4는 S, G, A, 또는 L이고; X5는 Q, K, F, A, V, 또는 L이며; X6은 S, Q, K, R, G, P, V, 또는 L이고; X7은 S, T, K, G, V, L 또는 I이다. 이 구체예의 다른 측면에서, 트롬빈 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, 또는 SEQ ID NO: 123을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 플라즈민 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "플라즈민 분해 부위"는 플라즈민 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 플라즈민에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 플라즈민에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 플라즈민은 트립신의 경우와 유사한 특이성으로 Lys｜ 및 Arg｜ 결합의 분해를 촉진시킨다. 그러나, 플라즈민은 트립신보다 훨씬 덜 효율적인 효소이며, 단백질 내의 이들 결합 중의 단지 일부만을 분해시킨다. 트립신은 주로 아미노산 리신 또는 아르기닌의 카복실 측면에서 펩타이드 쇄를 분해시키는데, 이들 중의 어떤 것의 다음에 프롤린이 있는 경우는 예외로 한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 VIIa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 VIIa 분해 부위" 또는 "FVIIa 분해 부위"는 FVIIa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FVIIa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FVIIa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FVIIa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 124)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 Q, S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 Q, S, T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 FVIIa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 125-133). 추가의 FVIIa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, J. H. Morrissey, Coagulation Factor VIIa, In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1659-1662(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 VIIa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 VIIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 124를 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 Q, S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 Q, S, T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 VIIa 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, 또는 SEQ ID NO: 133을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 IXa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 IXa 분해 부위" 또는 "FIXa 분해 부위"는 FIXa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FIXa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FIXa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FIXa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 134)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 FIXa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 135-138). 추가의 FIXa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, A. T. Thompson, Molecular Biology of Factor IX. In Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, pp. 128-129(R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); S. Kawabata and S. Iwanaga, Russellysin. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 683-684(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); A. E. Schmidt and S. P. Bajaj, Coagulatio factor IXa. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1655-1659(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 IXa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 IXa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 134를 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 IXa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 134를 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 IXa 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, 또는 SEQ ID NO: 138을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 Xa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 Xa 분해 부위" 또는 "FXa 분해 부위"는 FXa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FXa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FXa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FXa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 139)이며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되며; X2는 선택적으로 G, A, S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 FXa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 140-155). 추가의 FXa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, D. L. Greenberg and E. W. Davie, Blood Coagulation Factors: Their Complementary DNAs, Genes, and Expression. In Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, pp. 34-35(R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 Xa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 Xa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 139를 포함하며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되며; X2는 G, A, S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이며; X3은 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 Xa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 139를 포함하며, 여기에서 X1은 E, F, P, A, L, 또는 I이며; X2는 S, Q, D, E, F, G 또는 A이며; X3은 F, G, 또는 P이며; X4는 S, T, L, 또는 I이고; X5는 S, F, A 또는 V이며; X6은 S, T, E, N, H, G, A, 또는 M이고; X7은 S, N, D, Q, K, R, 또는 G이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 Xa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 139를 포함하며, 여기에서 X1은 I 또는 A이며; X2는 E 또는 F이며; X3은 F, G, 또는 P이며; X4는 S, T, 또는 I이고; X5는 S, F, 또는 V이며; X6은 E 또는 G이고; X7은 S 또는 G이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 Xa 분해 부위는 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, 또는 SEQ ID NO: 155를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 XIa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 XIa 분해 부위" 또는 "FXIa 분해 부위"는 FXIa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FXIa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FXIa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FXIa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 156)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 H, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 선택적으로 H, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 FXIa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 157-166). 추가의 FXIa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, P. N. Walsh, Coagulation Factor XIa. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1651-1655(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F, Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 XIa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 XIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 156을 포함하며, 여기에서 X1은 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 H, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 H, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 XIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 156을 포함하며, 여기에서 X1은 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, 또는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산이고; X2는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 XIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 156을 포함하며, 여기에서 X1은 D 또는 K이며; X2는 F 또는 L이며; X3은 T 또는 P이며; X4는 A 또는 V이고; X5는 E 또는 V이며; X6은 T 또는 G이고; X7은 G 또는 V이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 XIa 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, 또는 SEQ ID NO: 166을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 XIIa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 XIIa 분해 부위" 또는 "FXIIa 분해 부위"는 FXIIa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FXIIa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FXIIa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FXIIa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 167)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 FXIIa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 168-172). 추가의 FXIIa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. D. Ratnoff, Coagulation Factor XIIa. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1642-1644(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F, Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 XIIa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 XIIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 167을 포함하며, 여기에서 X1은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 XIIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 167을 포함하며, 여기에서 X1은 S, T, P 또는 I이며; X2는 Q, K, S 또는 M이며; X3은 K, T, G 또는 P이며; X4는 L, I 또는 V이고; X5는 T 또는 V이며; X6은 G 또는 L이고; X7은 G이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 XIIa 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, 또는 SEQ ID NO: 172를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 칼리크레인 1 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "칼리크레인 1 분해 부위"는 칼리크레인 1 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 칼리크레인 1에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 칼리크레인 1에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 칼리크레인 1 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *(R/K/S)X5X6X7(SEQ ID NO: 173)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 어떤 아미노산이라도 되고; X4는 선택적으로 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, I, L, M 및 V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X5는 어떤 아미노산이라도 되며; X6은 어떤 아미노산이라도 되고; X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 칼리크레인 1에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 174-198). 추가의 칼리크레인 1 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, R. W. Colman, Contact Activation Pathway: Inflammation, Fibrinolytic, Anticoagulant, Antiadhesive, and Antiangiogenic Activities. In Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, pp. 103-104(R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W. Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); J. Chao, Human Kallikrein 1, Tissue Kallikrein. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1577-1580(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F, Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); H. X. Li, et al., Substrate Specificity of Human Kallikreins 1 ad 6 Determined by Phage Display, Protein Sci. 17: 664-672(2008); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 칼리크레인 1 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 칼리크레인 1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 173을 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 어떤 아미노산이라도 되고; X4는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, I, L, M 및 V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X5는 어떤 아미노산이라도 되며; X6은 어떤 아미노산이라도 되고; X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 칼리크레인 1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 173을 포함하며, 여기에서 X1은 D, S, T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 S, T, A, P, 또는 V이며; X3은 S, F 또는 L이고; X4는 R 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X5는 R, S, T, 또는 A이며; X6은 R, S, 또는 G이고; X7은 R, G, 또는 A이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 칼리크레인 1 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, 또는 SEQ ID NO: 198을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 단백질 C 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "단백질 C 분해 부위"는 단백질 C 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 단백질 C에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 단백질 C에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 단백질 C 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 199)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X7은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 단백질 C에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 200-209). 추가의 단백질 C 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, L. Shen and B. Dahiback, Protein C. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1673-1677(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F, Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 단백질 C 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 단백질 C 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 199를 포함하며, 여기에서 X1은 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3 및 X4는 독립적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X7은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 단백질 C 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 199를 포함하며, 여기에서 X1은 K, R, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D, E, Q, N, 또는 K이며; X3은 P, L, T, Q, K 또는 R이고; X4는 G, I, S, N, 또는 K이고; X5는 Q, N, K, F, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 F, S, N, Q, K, 또는 H이고; X7은 L, I, T, K, D, E, Q 또는 N이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 단백질 C 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, 또는 SEQ ID NO: 209를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 플라즈미노겐 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "플라즈미노겐 분해 부위"는 플라즈미노겐 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 플라즈미노겐에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 플라즈미노겐에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 플라즈미노겐 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 210)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 선택적으로 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 어떤 아미노산이라도 되며; X7은 선택적으로 H, F, Y, R, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 플라즈미노겐에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 211-240). 추가의 플라즈미노겐 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 플라즈미노겐 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 플라즈미노겐 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 211을 포함하며, 여기에서 X1은 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 어떤 아미노산이라도 되며; X7은 H, F, Y, R, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 플라즈미노겐 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 211을 포함하며, 여기에서 X1은 K, R, S, T, A, G, L, 또는 P이고; X2는 D, E, Q, N, K, R, S, T, A, G, I, 또는 L이며; X3은 N, Q, S, F, Y, A, 또는 L이고; X4는 K, R, S, A, G, L, 또는 V이고; X5는 K, R, N, S, F, Y, A, I, L, P, 또는 V이며; X6은 K, R, N, S, F, Y, A, G, L, P, 또는 V이고; X7은 R, S, T, F, Y, A, G, I, L, 또는 P이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 플라즈미노겐 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, 또는 SEQ ID NO: 240을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위" 또는 "MMP-2 분해 부위"는 MMP-2 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 MMP-2에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. MMP-2에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, MMP-2 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1(P/A/V/L/I)X2X3 *(V/L/I/F/Q)X4X5X6(SEQ ID NO: 241)이며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, 및 X6은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 MMP-2에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 242-273). 추가의 MMP-2 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 241을 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, 및 X6은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 241을 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 H, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 241을 포함하며, 여기에서 X1은 G, P, A, V, L, I, S, T, E, 또는 Q이고; X2는 G, A, L, S, N, Q, W, 또는 K이며; X3은 G, P, A, S, Q, D, E, 또는 H이고; X4는 G, A, V, L, I, F, S, T, Q, 또는 K이고; X5는 G, A, V, S, T, Q, 또는 K이며; X6은 G, P, A, V, L, I, S, T, D, E, K, N, 또는 Q이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 241을 포함하며, 여기에서 X1은 G, A, 또는 L, 또는 Q이고; X2는 G, A, 또는 S이며; X3은 G, A, S, 또는 N이고; X4는 A, V, L, I, 또는 K이고; X5는 G, A, 또는 S이며; X6은 G, P, A, V, L, 또는 D이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, 또는 SEQ ID NO: 273을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위" 또는 "MMP-9 분해 부위"는 MMP-9 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 MMP-9에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. MMP-9에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, MMP-9 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *X5X6X7X8(SEQ ID NO: 274)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 F, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 F, Y, S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 어떤 아미노산이라도 되며; X5는 선택적으로 S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X6은 어떤 아미노산이라도 되며; X7은 어떤 아미노산이라도 되고; X8은 선택적으로 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 MMP-9에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 275-319). 추가의 MMP-9 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, S. L. Kridel, et al., Substrate Hydrolysis by Matrix Metalloproteinase-9, J. Biol. Chem. 276: 20572-20578(2001); E. Y. Zhen, et al., Characterization of Metalloprotease Cleavage Products of Human Articular Cattilage, Arthritis Rheum. 58: 2420-2431(2008); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 274를 포함하며, 여기에서 X1은 F, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 F, Y, S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 어떤 아미노산이라도 되며; X5는 S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X6은 어떤 아미노산이라도 되며; X7은 어떤 아미노산이라도 되고; X8은 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 274를 포함하며, 여기에서 X1은 G, V, L, I, F, S, Q, K, 또는 R이고; X2는 P, A, V, L, I, 또는 S이며; X3은 G, P, A, V, L, S, Q, E, K, 또는 R이고; X4는 G, P, A, V, L, F, S, N, E, 또는 K이고; X5는 A, V, L, I, M, F, S, Q, 또는 K이며; X6은 P, A, V, L, I, S, T, Q, E, K, 또는 R이고; X7은 G, A, V, L, S, 또는 T이며; X8은 G, P, A, V, L, F, T, D, E, K, 또는 R이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 274를 포함하며, 여기에서 X1은 G 또는 L이고; X2는 P, A, 또는 V이며; X3은 P, A, R, K, 또는 S이고; X4는 G이고; X5는 A, V, L, 또는 I이며; X6은 T, Q, K, 또는 R이고; X7은 G, A, 또는 S이며; X8은 G, P, A, V, 또는 E이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 318, 또는 SEQ ID NO: 319를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 푸린 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "푸린 분해 부위"는 푸린 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 푸린에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 푸린에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 푸린 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은(R/I/A)X1(R/K/A/P)R*X2 *X3X4X5(SEQ ID NO: 320)이며, 여기에서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 푸린에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 321-346). 추가의 푸린 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, A. Basak, et al., Implication of the Proprotein Convertases Furin, PC5 And PC7 in the Cleavage of Surface Glycoproteins of Hong Kong, Ebola and Respiratory Syncytial Viruses: A Comparative Analysis with Fluorogenic Peptides, Biochem. J. 353: 537-545(2001); O. Bader, et al., Processing of Predicted Substrates of Fungal Kex2 Proteinases from Candida albicans, C. glabrata, Saccharomyces serevisiae and Pichia pastoris, BMC Microbiol. 8: 116(2008); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 푸린 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 푸린 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 320을 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 푸린 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 320을 포함하며, 여기에서 X1은 F, S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 G, P, M, F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산이며; X3은 G, P, A, V, L, I, F, W, S, T, N, Q, D, H, K, 또는 R이고; X4는 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X5는 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 푸린 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 320을 포함하며, 여기에서 X1은 K, R, S, 또는 T이고; X2는 D, E, S, A, 또는 G이며; X3은 A, V, L, 또는 I이고; X4는 S, G, D, E 또는 R이고; X5는 G, P, A, S, T, Q, D, 또는 E이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 푸린 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345, 또는 SEQ ID NO: 346을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위" 또는 "u-PA"는 u-PA 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 u-PA에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. u-플라즈미노겐 활성화제에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, u-PA 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4 *X5X6X7(SEQ ID NO: 347)이며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되며; X2는 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 어떤 아미노산이라도 되며; X5는 선택적으로 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 u-PA에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 347-368). 추가의 u-PA 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, V. Ellis, u-Plasminogen Activator. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1677-1683(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 347을 포함하며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되며; X2는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 어떤 아미노산이라도 되며; X5는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 347을 포함하며, 여기에서 X1은 P, A, L, S, T, C, N, 또는 R이며; X2는 G, P, L, Y, S, 또는 T이고; X3은 G, A, S, 또는 N이고; X4는 G, A, V, I, Y, S, 또는 R이고; X5는 P, V, L, F, 또는 R이며; X6은 G, A, V, Y, S, 또는 T이고; X7은 G, V, L, F, Y, N, 또는 H이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 347을 포함하며, 여기에서 X1은 P, A, L, S, T, C, N, 또는 R이며; X2는 G, Y, 또는 S이고; X3은 G, 또는 S이고; X4는 G, A, V, I, Y, S, 또는 R이고; X5는 V, 또는 R이며; X6은 T, 또는 Y이고; X7은 G, V, L, F, Y, N, 또는 H이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 367, 또는 SEQ ID NO: 368을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위" 또는 "t-PA"는 t-PA 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 t-PA에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. t-PA에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, t-PA 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4 *X5X6X7(SEQ ID NO: 369)이며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 어떠한 아미노산이라도 된다. 표 4는 t-PA에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 370-373). 추가의 t-PA 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, H. R. Lijnen and D. Collen, t-Plasminogen Activator. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1684-1689(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 369를 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 어떠한 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 369를 포함하며, 여기에서 X1은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 369를 포함하며, 여기에서 X1은 A, P, C, 또는 N이고; X2는 A, L, P, 또는 Q이며; X3은 G, L, S, 또는 F이고; X4는 I, V, M, 또는 Y이고; X5는 A, V, 또는 K이며; X6은 G, V, 또는 P이고; X7은 G, L, 또는 D이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 372, 또는 SEQ ID NO: 373을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 트립타제-ε 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "트립타제-ε 분해 부위" 또는 "프로세민 분해 부위"는 트립타제-ε 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 트립타제-ε에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 트립타제-ε에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 트립타제-ε 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 *(R/K)X1X2X3X4(D/E)(SEQ ID NO: 374)이며, 여기에서 X1, X2, X3 및 X4는 독립적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 트립타제-ε에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 375-386). 추가의 트립타제-ε 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다 [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 트립타제-ε 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 트립타제-ε 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 374를 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3 및 X4는 독립적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 트립타제-ε 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 374를 포함하며, 여기에서 X1은 I 또는 V이고; X2는 I 또는 V이며; X3은 G 또는 S이고; X4는 G 또는 S이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 트립타제-ε 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385, 또는 SEQ ID NO: 386을 포함한다.
본 명세서의 측면들들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위" 또는 "mMCP-7 분해 부위"는 mMCP-7 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 mMCP-7에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. mMCP-7에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, mMCP-7 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(K/R)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 387)이며, 여기에서 X1은 어떠한 아미노산이라도 되며; X2는 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4, X5, X6, X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 mMMCP-7에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 388-391). 추가의 mMMCP-7 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 387을 포함하며, 여기에서 X1은 어떠한 아미노산이라도 되며; X2는 N 또는 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4, X5, X6, X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 측면들에서, 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 387을 포함하며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되고; X2는 G, S, 또는 Q이며; X3은 A, P, 또는 S이고; X4, X5, X6, X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 390, 또는 SEQ ID NO: 391을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "엔도텔린-전환효소-1 분해 부위" 또는 "ECE-1 분해 부위"는 ECE-1 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 ECE-1에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. ECE-1에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, ECE-1 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *(F/L/I/V/Y)5X6X7(SEQ ID NO: 392)이며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 ECE-1에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 393-412). 추가의 ECE-1 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, K. Ahn and G. D. Johnson, Endothelin-Converting Enzyme-1. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 429-434(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 392을 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 392을 포함하며, 여기에서 X1은 G, P, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산이고; X2는 F, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y과 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 F, W, S, C, N, E, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 G, P, V, L, F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산이고; X7은 P, A, V, L, M, F, Y, S, N, D, 또는 K이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 392를 포함하며, 여기에서 X1은 G, P, Y, C, D, K, R 또는 H이고; X2는 P, L, I, F, S, C, Q, D, R, 또는 H이며; X3은 V, L, I, S, Q, K, 또는 R이고; X4는 G, P, L, F, Y, W, 또는 R이고; X5는 V, I, M, F, N, R, 또는 H이며; X6은 P, L, F, T, E, 또는 H이고; X7은 P, V, L, F, S, N, D, 또는 K이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 392를 포함하며, 여기에서 X1은 G, D, 또는 H이고; X2는 I, 또는 F이며; X3은 V, I, S, Q, 또는 K이고; X4는 P, F, 또는 W이고; X5는 I, N, R, 또는 H이며; X6은 L, T, 또는 H이고; X7은 P, S, 또는 D이다. 이 구체예의 다른 측면들에서 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411, 또는 SEQ ID NO: 412를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 켈 혈액형 단백질 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "켈 혈액형 단백질 분해 부위" 또는 "KBGP 분해 부위"는 KBGP 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 KBGP에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. KBGP에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, KBGP 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *X5X6X7X8(SEQ ID NO: 413)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산이고; X2는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 선택적으로 F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산이고; X5는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산이고; X7은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산이며; X8은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 KBGP에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 414-415). 추가의 KBGP 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 켈 혈액형 단백질 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 켈 혈액형 단백질 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 413을 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산이고; X2는 T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산이고; X5는 T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산이고; X7은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 I, V, 또는 T와 같은 C-베타 분지된 아미노산이며; X8은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 켈 혈액형 단백질 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 413을 포함하며, 여기에서 X1은 D이고; X2는 I, V, 또는 T이며; X3은 I, V, 또는 T이고; X4는 W이고; X5는 I, V, 또는 T이며; X6은 N이고; X7은 T이며; X8은 P이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 켈 혈액형 단백질 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 414, 또는 SEQ ID NO: 415를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 카텝신 L 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "카텝신 L 분해 부위"는 카텝신 L 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 카텝신 L에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 카텝신 L에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 카텝신 L 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *X5X6X7X8(SEQ ID NO: 416)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 W, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 선택적으로 L, V, F, 또는 Y이고; X4, X5, X6, X7 및 X8은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 카텝신 L에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 417-443). 추가의 카텝신 L 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, J. C. Kelly, et al., Profiling of Calpain Activity with a Series of FRET-Based Substrates, Biochim. Biophys. Acta 1794: 1505-1509(2009); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 카텝신 L 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 카텝신 L 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하며, 여기에서 X1은 W, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 L, V, F, 또는 Y이고; X4, X5, X6, X7 및 X8은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 카텝신 L 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하며, 여기에서 X1은 G, P, A, L, Q, E, 또는 K이고; X2는 F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 L, V, F, 또는 Y이고; X4는 G, A, F, T, Q, E, K, 또는 R이고; X5는 G, A, S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산이며; X6은 P, A, L, I, S, Q, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산이고; X7은 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X8은 P, L, S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 카텝신 L 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하며, 여기에서 X1은 G, A, Q, E, 또는 K이고; X2는 G, P, L, 또는 F이며; X3은 L, V, F, 또는 Y이고; X4는 G, A, F, T, Q, E, K, 또는 R이고; X5는 A, S, Q, E, K, 또는 R이며; X6은 P, A, L, I, S, 또는 E이고; X7은 P, L, 또는 R이며; X8은 P, L, S, 또는 K이다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 카텝신 L 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 442, 또는 SEQ ID NO: 443을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 PAR1 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "PAR1 분해 부위"는 PAR1 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 PAR1에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. PAR1에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, PAR1 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4(K/R)X5(SEQ ID NO: 444)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이며; X3은 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이고; X4는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 F, W 또는 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이다. 표 4는 PAR1에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 445-452). 추가의 PAR1 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다.
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 PAR1 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, PAR1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 444를 포함하며, 여기에서 X1은 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이며; X3은 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이고; X4는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 F, W 또는 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, PAR1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 444를 포함하며, 여기에서 X1은 S, T 또는 G이고; X2는 F 또는 Y이며; X3은 L, P, 또는 F이고; X4는 A, G, I, 또는 L이고; X5는 F 또는 N이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, PAR1 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451, 또는 SEQ ID NO: 452를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 PAR2 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "PAR2 분해 부위"는 PAR2 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 PAR2에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. PAR2에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, PAR2 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4(K/R)X5(SEQ ID NO: 453)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이며; X3은 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이고; X4는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이다. 표 4는 PAR2에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 454-455). 추가의 PAR2 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다.
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 PAR2 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, PAR2 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 453을 포함하며, 여기에서 X1은 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이며; X3은 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이고; X4는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, PAR2 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 453을 포함하며, 여기에서 X1은 S이고; X2는 I 또는 L이며; X3은 I, 또는 L이고; X4는 A, 또는 G이고; X5는 L 또는 V이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, PAR2 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 454, 또는 SEQ ID NO: 455를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 PAR3 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "PAR3 분해 부위"는 PAR3 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 PAR3에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. PAR3에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, PAR3 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 456)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이며; X3은 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산이고; X4는 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X5는 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산, 또는 D, N 또는 P와 같은 소형 극성 아미노산이며; X6은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 D, N 또는 P와 같은 소형 극성 아미노산이다. 표 4는 PAR3에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 457-459). 추가의 PAR3 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다.
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 PAR3 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, PAR3 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 456을 포함하며, 여기에서 X1은 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이며; X3은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산이고; X4는 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X5는 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산, 또는 D, N 또는 P와 같은 소형 극성 아미노산이며; X6은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 D, N 또는 P와 같은 소형 극성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, PAR3 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 456을 포함하며, 여기에서 X1은 S 또는 T이고; X2는 F이며; X3은 N 또는 R이고; X4는 A 또는 G이고; X5는 A, G 또는 N이며; X6은 P 또는 E이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, PAR3 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 458, 또는 SEQ ID NO: 459를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 PAR4 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "PAR4 분해 부위"는 PAR4 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 PAR4에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. PAR4에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, PAR4 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4(K/R/Q/F)X5(SEQ ID NO: 460)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이며; X3은 선택적으로 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 선택적으로 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W, 또는 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 PAR4에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 461-478). 추가의 PAR4 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다.
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 PAR4 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, PAR4 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 460을 포함하며, 여기에서 X1은 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이며; X3은 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W, 또는 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, PAR4 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 460을 포함하며, 여기에서 X1은 A, G, S 또는 T이고; X2는 F 또는 Y이며; X3은 A 또는 P이고; X4는 A 또는 G이고; X5는 A, V, P, F, W, Y 또는 K이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, PAR4 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, 또는 SEQ ID NO: 478을 포함한다.
불활성화 분해 부위의 위치는 여러 기준에 의해 좌우되는 중요한 측면이다. 첫째, 불활성화 분해 부위의 배치는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 그의 표적 세포를 중독시킬 수 있는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않아야 한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 중독과 관련하여 용어 "실질적으로 영향을 미치지 않는" 것은 전반적인 중독 기전을 실행할 수 있음으로써, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 표적 세포에 세포내이입하고, 표적 기질을 단백분해적으로 분해하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 저친화도 또는 고친화도 수용체 컴플렉스로 결합하는 것, 독소/수용체 컴플렉스의 내재화, 경쇄의 세포질로의 전위, 및 표적 기질의 효소적 변형을 포함하는, 본 명세서의 상세한 설명에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 의미한다.
이 구체예의 한 측면에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 변형이 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 같은 정도로 표적 세포를 중독시킬 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 변형이 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 같은 정도, 예를 들면 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 표적 세포를 중독시킬 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 변형없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 같은 정도, 예를 들면 최대 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 표적 세포를 중독시킬 수 있다.
둘째, 불활성화 분해 부위의 배치는 상기 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 표면 노출 부분에 있어야 하며, 단백질 내부로 묻히지 않거나, 또는 2차 구조 요소들에 의해 가려지지 않아야 한다. 불활성화 분해 부위의 적당한 표면 노출은 상기 부위가 이것의 해당 프로테아제에 적당하게 접속하는 것을 용이하게 함으로써 단백분해적 분해를 가능하게 한다. 해당 프로테아제에 의한 상기 불활성화 분해 부위의 단백분해적 분해는 세포를 중독시킬 수 있는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 능력을 실질적으로 불활성화시킨다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 중독과 관련하여, 용어 "실질적으로 불활성화시키는" 것은 불활성화 분해 부위에서 분해한 후 전반적인 중독 기전을 실행시킬 수 있는 감소된 능력을 가짐으로써, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 표적 세포에 세포내이입하고, 표적 기질을 단백분해적 분해하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 저친화도 또는 고친화도 수용체 컴플렉스로 결합하는 것, 독소/수용체 컴플렉스의 내재화, 경쇄의 세포질로의 전위, 및 표적 기질의 효소적 변형을 포함하는 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 의미한다.
이 구체예의 한 측면에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 불활성화 분해 부위에서 단백분해적으로 분해하면, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 대조적으로, 독소가 표적세포를 중독시키는 능력이 완전히 무능해지지만, 단백분해적 비분해 상태(즉, 중독 분해 부위가 온전하거나, 또는 분해되지 않은 상태)에서는 그렇지 않다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 불활성화 분해 부위에서의 단백분해적 분해는 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 대조적으로 표적 세포를 중독시킬 수 있는 능력을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 감소시키지만, 단백분해적 비분해 상태에서는 그렇지 않다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 불활성화 분해 부위에서의 단백분해적 분해는 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 대조적으로 표적 세포를 중독시킬 수 있는 능력을 예를 들면, 최대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 감소시키지만, 단백분해적 비분해 상태에서는 그렇지 않다.
본 명세서의 한 측면에서, 불활성화 분해 부위는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "불활성화 분해 부위 부분"은 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형될 수 있는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 아미노산 서열을 의미하며, 상기 변형은 단백질의 표적 세포 중독능력을 실질적으로 방해하지 않을 것이므로; 및 동족 프로테아제에 노출시에 불활성화 분해 부위가 분해되어, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 실질적으로 불활성화시킬 것이다. 불활성화 분해 부위의 위치는 이 위치가 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 표적 세포 중독능력에 실질적으로 악영향을 미치지 않을 조건에서, 불활성화 분해 부위 부분내에 어디에나 있을 수 있으며; 동족 프로테아제에 노출시에 불활성화 분해 부위의 분해는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 실질적으로 불활성화시킬 것이다. 표 5는 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 함께 사용하기에 적당한 예시적인 불활성화 분해 부위를 개시한다.
따라서, 이 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역으로부터 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 462-496; SEQ ID NO: 3의 아미노산 458-492; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 464-487; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 463-496; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 458-491; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 434-467; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 453-486; SEQ ID NO: 21의 아미노산 458-491; SEQ ID NO: 22의 아미노산 475-508; SEQ ID NO: 23의 아미노산 443-476; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 434-467을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 618-634; SEQ ID NO: 3의 아미노산 614-630; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 605-621; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 613-629; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 609-625; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 587-603; SEQ ID NO: 18의 아미노산 604-620; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 605-621; SEQ ID NO: 21의 아미노산 610-626; SEQ ID NO: 22의 아미노산 627-643; SEQ ID NO: 23의 아미노산 596-612; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 587-603을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
표5. 클로스트리듐 독소의 불활성화 분해 부위 부분들
독소 SEQ
ID NO:		 불활성화 분해 부위 부분들
1 2 3 4 5 6 7 8
BoNT/A 1 L462-
L496		 T618-
I634		 G638-
D651		 L665-
N687		 N752-
N765		 N826-
D835		 T844-
L863		 K871-
A895
BoNT/B 2 L464-
P487		 A605-
V621		 G625-
N638		 L652-
N674		 N739-
D752		 N813-
A824		 Y831-
I850		 S858-
G882
BoNT/C1 3 L463-
S496		 I613-
I629		 G633-
N646		 L660-
E682		 K747-
Q760		 H821-
D830		 S839-
K858		 N866-
N890
BoNT/D 4 L458-
S491		 I609-
I625		 G629-
N642		 L656-
E678		 K743-
Q756		 H817-
D826		 S835-
K854		 N862-
N886
BoNT/E 5 L434-
D467		 A587-
V603		 G607-
N620		 L634-
N659		 N724-
D739		 H800-
Q809		 T818-
I837		 K845-
D869
BoNT/F 6 L453-
N486		 A605-
V621		 G625-
N638		 L652-
N677		 N742-
N757		 H818-
N827		 T836-
I855		 K863-
G887
BoNT/G 7 L458-
S491		 S610-
I626		 G630-
N643		 M657-
N679		 N744-
D757		 N818-
N827		 H836-
I855		 S863-
G887
TeNT 8 L475-
S508		 S627-
V643		 G647-
N660		 L674-
Q696		 K761-
E774		 N835-
K844		 V854-
V871		 V879-
N903
BaNT 9 L443-N476 A596-
V612		 G616-
N629		 L643-
S668		 N733-
N748		 N809-
P819		 T828-
I847		 K855-
G879
BuNT 10 L434-
D467		 A587-
V603		 G607-
N620		 L634-
S659		 N724-
D739		 H800-
Q809		 T818-I837 K845-
D869
이 구체예의 또 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 638-651; SEQ ID NO: 3의 아미노산 634-647; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 625-638; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 633-646; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 629-642; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 607-620; SEQ ID NO: 18의 아미노산 624-637; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 625-638; SEQ ID NO: 21의 아미노산 630-643; SEQ ID NO: 22의 아미노산 647-660; SEQ ID NO: 23의 아미노산 616-629; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 607-620을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 665-687; SEQ ID NO: 3의 아미노산 661-683; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 652-674; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 660-682; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 656-678; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 634-659; SEQ ID NO: 18의 아미노산 651-676; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 652-677; SEQ ID NO: 21의 아미노산 657-679; SEQ ID NO: 22의 아미노산 674-696; SEQ ID NO: 23의 아미노산 643-668; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 634-659를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 752-765; SEQ ID NO: 3의 아미노산 748-761; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 739-752; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 747-760; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 743-756; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 724-739; SEQ ID NO: 18의 아미노산 741-756; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 742-757; SEQ ID NO: 21의 아미노산 744-757; SEQ ID NO: 22의 아미노산 761-774; SEQ ID NO: 23의 아미노산 733-748; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 724-739를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 826-835; SEQ ID NO: 3의 아미노산 824-831; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 813-824; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 821-830; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 817-826; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 800-809; SEQ ID NO: 18의 아미노산 817-826; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 818-827; SEQ ID NO: 21의 아미노산 818-827; SEQ ID NO: 22의 아미노산 835-844; SEQ ID NO: 23의 아미노산 809-819; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 800-809를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 844-863; SEQ ID NO: 3의 아미노산 840-859; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 831-850; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 839-858; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 835-854; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 818-837; SEQ ID NO: 18의 아미노산 835-854; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 836-855; SEQ ID NO: 21의 아미노산 836-855; SEQ ID NO: 22의 아미노산 854-871; SEQ ID NO: 23의 아미노산 828-847; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 818-837을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 871-895; SEQ ID NO: 3의 아미노산 867-891; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 858-882; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 866-890; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 862-886; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 845-869; SEQ ID NO: 18의 아미노산 862-886; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 863-887; SEQ ID NO: 21의 아미노산 863-887; SEQ ID NO: 22의 아미노산 879-903; SEQ ID NO: 23의 아미노산 855-879; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 845-869를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/A 또는 BoNT/A 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/A 또는 BoNT/A 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 462-496, 618-634, 638-651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863 또는 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분; 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822-831, 840-859 또는 867-891을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/A는 SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 534, 또는 SEQ ID NO: 536에 의해 코드화된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/A는 SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 535 또는 SEQ ID NO: 537을 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/B 또는 BoNT/B 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/B 또는 BoNT/B 키메릭은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 464-487, 605-621, 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850 또는 858-882를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/C1 또는 BoNT/C1 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/C1 또는 BoNT/C1 키메릭은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 463-496, 613-629, 633-646, 660-682, 747-760, 821-830, 839-858 또는 866-890을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/D 또는 BoNT/D 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/D 또는 BoNT/D 키메릭은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 458-491, 609-625, 629-642, 656-678, 743-756, 817-826, 835-854 또는 862-886을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/E 또는 BoNT/E 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/E 또는 BoNT/E 키메릭은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 또는 845-869를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/F 또는 BoNT/F 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/F 또는 BoNT/F 키메릭은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 453-486, 604-620, 624-637, 651-676, 741-756, 817-826, 835-854 또는 862-886을 포함하는; 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 453-486, 605-621, 625-638, 652-677, 742-757, 818-827, 836-855 또는 863-887을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/G 또는 BoNT/G 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/G 또는 BoNT/G 키메릭은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 458-491, 610-626, 630-643, 657-679, 744-757, 818-827, 836-855 또는 863-887을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 TeNT 또는 TeNT 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 TeNT 또는 TeNT 키메릭은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 475-508, 627-643, 647-660, 674-696, 761-774, 835-844, 854-871 또는 879-903을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BaNT 또는 BaNT 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BaNT 또는 BaNT 키메릭은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847 또는 855-879를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BuNT 또는 BuNT 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BuNT 또는 BuNT 키메릭은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 또는 845-869를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
본 명세서의 한 측면에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대한 안전역보다 큰 안전역을 가진다. 즉, 불활성화 분해 부위를 첨가하면, 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역이 증가된다.
따라서, 한 구체예에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 큰 안전역을 가진다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 예를 들면, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 또는 적어도 300%보다 큰 안전역을 가진다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 예를 들면, 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90%, 최대 100%, 최대 110%, 최대 120%, 최대 130%, 최대 140%, 최대 150%, 최대 160%, 최대 170%, 최대 180%, 최대 190%, 최대 200%, 최대 210%, 최대 220%, 최대 230%, 최대 240%, 최대 250%, 최대 260%, 최대 270%, 최대 280%, 최대 290%, 또는 최대 300%보다 큰 안전역을 가진다. 본 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 예를 들면, 약 10% ~ 약 300%, 약 20% ~ 약 300%, 약 30% ~ 약 300%, 약 40% ~ 약 300%, 약 50% ~ 약 300%, 약 60% ~ 약 300%, 약 70% ~ 약 300%, 약 80% ~ 약 300%, 약 90% ~ 약 300% 또는 약 100% ~ 약 300% 이상인 안전역을 가진다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 예를 들어 적어도 1-배, 적어도 1-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배 또는 적어도 10-배 이상인 안전역을 가진다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 예를 들어 적어도 1-배, 최대 1-배, 최대 3-배, 최대 4-배, 최대 5-배, 최대 6-배, 최대 7-배, 최대 8-배, 최대 9-배 또는 최대 10-배 이상인 안전역을 가진다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 약 1-배 ~ 약 10-배, 약 1-배 ~ 약 9-배, 약 1-배 ~ 약 8-배, 약 1-배 ~ 약 7-배, 약 1-배 ~ 약 6-배, 약 1-배 ~ 약 5-배, 약 2-배 ~ 약 10-배, 약 2-배 ~ 약 9-배, 약 2-배 ~ 약 8-배, 약 2-배 ~ 약 7-배, 약 2-배 ~ 약 6-배 또는 약 2-배 ~ 약 5-배 이상인 안전역을 가진다.
다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시키는 불활성화 분해 부위 첨가를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 또는 적어도 300%까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을, 예를 들어 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90%, 최대 100%, 최대 110%, 최대 120%, 최대 130%, 최대 140%, 최대 150%, 최대 160%, 최대 170%, 최대 180%, 최대 190%, 최대 200%, 최대 210%, 최대 220%, 최대 230%, 최대 240%, 최대 250%, 최대 260%, 최대 270%, 최대 280%, 최대 290%, 또는 최대 300% 까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어 약 10% ~ 약 300%, 약 20% ~ 약 300%, 약 30% ~ 약 300%, 약 40% ~ 약 300%, 약 50% ~ 약 300%, 약 60% ~ 약 300%, 약 70% ~ 약 300%, 약 80% ~ 약 300%, 약 90% ~ 약 300% 또는 약 100% ~ 약 300%까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어, 적어도 1-배, 적어도 1-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배 또는 적어도 10-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어, 최대 1-배, 최대 3-배, 최대 4-배, 최대 5-배, 최대 6-배, 최대 7-배, 최대 8-배, 최대 9-배 또는 최대 10-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어, 약 1-배 ~ 약 10-배, 약 1-배 ~ 약 9-배, 약 1-배 ~ 약 8-배, 약 1-배 ~ 약 7-배, 약 1-배 ~ 약 6-배, 약 1-배 ~ 약 5-배, 약 2-배 ~ 약 10-배, 약 2-배 ~ 약 9-배, 약 2-배 ~ 약 8-배, 약 2-배 ~ 약 7-배, 약 2-배 ~ 약 6-배 또는 약 2-배 ~ 약 5-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다.
다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 부분은 단일 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 부분은 복수의 불활성화 분해 부위들을 포함하도록 변형될 수 있다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 분해 부위 부분은 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 분해 부위 부분은 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 분해 부위 부분은 예를 들어, 2-10개의 불활성화 분해 부위들, 2-8개의 불활성화 분해 부위들, 2-6개의 불활성화 분해 부위들, 2-4개의 불활성화 분해 부위들, 2-3개의 불활성화 분해 부위들, 3-9개의 불활성화 분해 부위들, 3-7개의 불활성화 분해 부위들, 3-5개의 불활성화 분해 부위들 또는 3-4개의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 트롬빈 분해 부위와 같은 한 종류의 불활성화 분해 부위만을 포함하도록 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 부분은 트롬빈 분해 부위, 인자 Xa 분해 부위, MMP-2 분해 부위 및 MMP-9 분해 부위와 같은 복수의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들을 포함하도록 변형될 수 있다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 최대 2, 3, 4 또는 5개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 2-5개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들, 2-4개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들, 2-3개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들, 3-5개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들 또는 3-4개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다.
불활성화 분해 부위를 포함하도록 불활성화 분해 부위 부분들을 변형시키는 것은 불활성화 분해 부위 부분내에서 아미노산들 중 적어도 하나를 변경시킴으로써 수행될 수 있다. 아미노산 변경법의 비-제한적인 예로는 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 또는 다른 아미노산에 의한 원 아미노산의 치환이 포함된다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 불활성화 분해 부위 부분내에서 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산들을 변경시킴으로써 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 불활성화 분해 부위 부분내에서 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산들을 변경시킴으로써 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-5개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-4개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-3개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-2개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-5개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-4개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-3개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 3-5개의 아미노산들, 또는 불활성화 분해 부위 부분내에서 4-5개의 아미노산들을 변경시킴으로써 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다.
이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 불활성화 분해 부위 부분내에서 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산들을 결실, 첨가, 치환 또는 이들을 조합함으로써, 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 불활성화 분해 부위 부분내에서 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산들을 결실, 첨가, 치환 또는 이들을 조합함으로써, 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-5개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-4개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-3개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-2개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-5개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-4개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-3개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 3-5개의 아미노산들 또는 불활성화 분해 부위 부분내에서 4-5개의 아미노산들을 결실, 첨가, 치환 또는 이들을 조합함으로써, 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다.
불활성화 분해 부위를 포함하도록 불활성화 분해 부위 부분을 변형시키는 것은 당 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 돌연변이생성 과정들을 사용하여 얻어질 수 있다. 돌연변이생성 과정들뿐만 아니라 특성화 제제들, 조건들 및 프로토콜들의 비-제한적인 예들은 BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; 및 Stratagene, La Jolla, CA를 포함하는 상업용 판매사로부터 쉽게 입수 가능하며, 이에 제한되지는 않는다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주내의 과정들, 및 본 명세서의 과정들이다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 디설파이드 루프 부분내에서 단백분해적 절단에 의해 분해되는 단일쇄 폴리펩티드들로서 해독된다. 이 해독후 프로세싱은 단일 디설파이드 결합 및 비공유 상호작용을 사용하여 함께 유지되는 디-쇄 분자를 생성한다. 디설파이드 루프 부분내 단백분해적 절단은 디-쇄 루프 부분내에서 자연발생하는 내인성 프로테아제 분해 부위들을 사용함으로써, 또는 외인성 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 디-쇄 루프 부분을 조작함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서의 측면들은 디-쇄 루프 부분을 부분적으로 개시한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "디-쇄 루프 부분"은 단일-쇄 형태의 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 그의 디-쇄 형태로 전환하기 위해 사용되는 프로테아제 분해 부위를 함유하고 시스테인 아미노산에 의해 측면에 배치된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 아미노산 서열을 의미한다(표 6). 디-쇄 루프 부분의 비-제한적인 예로는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 430-454를 포함하는 BoNT/A의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 2의 아미노산 437-446을 포함하는 BoNT/B의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 3의 아미노산 437-453을 포함하는 BoNT/C1의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 4의 아미노산 437-450을 포함하는 BoNT/D의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 5의 아미노산 412-426을 포함하는 BoNT/E의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 6의 아미노산 429-445를 포함하는 BoNT/F의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 7의 아미노산 436-450를 포함하는 BoNT/G의 디-쇄 루프 부분; 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 439-467을 포함하는 TeNT의 디-쇄 루프 부분이 포함된다(표 6).
표 6. 디-쇄 루프 부분
독소 자연-발생 프로테아제 분해 부위를 함유하는 디-쇄 루프 부분
BoNT/A CVRGIITSKTKSLDKGYNK*---ALNDLC
BoNT/B CKSVK*--------------APGIC
BoNT/C1 CHKAIDGRSLYNK*------TLDC
BoNT/D CLRLTKNSR*---------DDSTC
BoNT/E CKNIVSVKGIR*-------KSIC
BoNT/F CKSVIPRKGTK*------APPRLC
BoNT/G CKPVMYKNTGK*-------SEQC
TeNT CKKIIPPTNIRENLYNRTA*SLTDLGGELC
BaNT CKS-IVSKKGTK*------NSLC
BuNT CKN-IVSVKGIR*------KSIC
표시된 아미노산 서열은 다음과 같다: BoNT/A, SEQ ID NO: 1의 잔기 430-454; BoNT/B, SEQ ID NO: 2의 잔기 437-446; BoNT/C1, SEQ ID NO: 3의 잔기 437-453; BoNT/D, SEQ ID NO: 4의 잔기 437-450; BoNT/E, SEQ ID NO: 5의 잔기 412-426; BoNT/F, SEQ ID NO: 6의 잔기 429-445; BoNT/G, SEQ ID NO: 7의 잔기 436-450; TeNT, SEQ ID NO: 8의 잔기 439-467; BaNT, SEQ ID NO: 9의 잔기 421-435; 및 BuNT, SEQ ID NO: 10의 잔기 412-426. 별표(*)는 클로스트리듐 독소 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 결합을 가리킨다.
따라서, 한 구체예에서, 디-쇄 루프 부분은 클로스트리듐 독소 디-쇄 루프 부분을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 디-쇄 루프 부분은 예를 들어, BoNT/A 디-쇄 루프 부분, BoNT/B 디-쇄 루프 부분, BoNT/C1 디-쇄 루프 부분, BoNT/D 디-쇄 루프 부분, BoNT/E 디-쇄 루프 부분, BoNT/F 디-쇄 루프 부분, BoNT/G 디-쇄 루프 부분, TeNT 디-쇄 루프 부분, BaNT 디-쇄 루프 부분 또는 BuNT 디-쇄 루프 부분을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 430-454를 포함하는 BoNT/A 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 2의 아미노산 437-446을 포함하는 BoNT/B 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 3의 아미노산 437-453을 포함하는 BoNT/C1 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 4의 아미노산 437-450을 포함하는 BoNT/D 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 5의 아미노산 412-426을 포함하는 BoNT/E 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 6의 아미노산 429-445를 포함하는 BoNT/F 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 7의 아미노산 436-450을 포함하는 BoNT/G 디-쇄 루프 부분; 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 439-467을 포함하는 TeNT 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 9의 아미노산 421-435를 포함하는 BaNT 디-쇄 루프 부분; 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 412-426을 포함하는 BuNT 디-쇄 루프 부분을 포함한다.본 명세서의 측면들은 부분적으로, 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 개시하고 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위"는 "자연발생 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위"와 동의어이며, 자연발생 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 디-쇄 루프 부분내에서 발견되는 자연발생 프로테아제 분해 부위를 의미하며, 예를 들어 클로스트리듐 독소 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위 이소형태 및 클로스트리듐 독소 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위 서브타입과 같은 자연발생 클로스트리듐 독소 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위 변이체들을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 내인성 프로테아제 분해 부위의 비-제한적인 예로는, 예를 들어 BoNT/A 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/B 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/C1 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/D 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/E 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/F 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/G 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위 및 TeNT 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위가 포함된다.
프로테아제의 정체는 현재 알려져 있지 않지만, 많은 클로스트리듐 독소들에 대한 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위는 측정되어 왔다. BoNT들에서, K448-A449에서의 분해는 BoNT/A의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; K441-A442에서의 분해는 BoNT/B의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; K449-T450에서의 분해는 BoNT/C1의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; R445-D446에서의 분해는 BoNT/D의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; R422-K423에서의 분해는 BoNT/E의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; K439-A440에서의 분해는 BoNT/F의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; 및 K446-S447에서의 분해는 BoNT/G의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환한다. A457-S458에서 TeNT의 단일 폴리펩티드 형태를 단백분해적 분해하면 디-쇄 형태가 형성된다. K431-N432에서 BaNT의 단일 폴리펩티드 형태를 단백분해적 분해하면 디-쇄 형태가 형성된다. R422-K423에서 BuNT의 단일 폴리펩티드 형태를 단백분해적 분해하면 디-쇄 형태가 형성된다. 상기 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위는 융합 단백질로서 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 조작가능하게-결합된다. 그러나, 디-쇄 루프내 추가의 분해 부위들이 분해되어, 손실된 작은 펩티드 단편을 발생시키는 것이 밝혀졌다는 것을 주목해야 한다. 비-제한적인 예로서, BoNT/A 단일-쇄 폴리펩티드가 궁극적으로 분해되어, 디-쇄 루프내 10개의 아미노산 단편들이 손실된다.
따라서, 한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 포함하는 디-쇄 루프 부분을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, BoNT/A 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/B 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/C1 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/D 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/E 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/F 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/G 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, TeNT 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BaNT 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, 또는 BuNT 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 430-454를 포함하는 BoNT/A의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 2의 아미노산 437-446을 포함하는 BoNT/B의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 3의 아미노산 437-453을 포함하는 BoNT/C1의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 4의 아미노산 437-450을 포함하는 BoNT/D의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 5의 아미노산 412-426을 포함하는 BoNT/E의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 6의 아미노산 429-445를 포함하는 BoNT/F의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 7의 아미노산 436-450을 포함하는 BoNT/G의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 8의 아미노산 439-467을 포함하는 TeNT의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 9의 아미노산 421-435를 포함하는 BaNT의 디-쇄 루프 부분; 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 412-426을 포함하는 BuNT의 디-쇄 루프 부분을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 외인성 프로테아제 분해 부위를 부분적으로 개시하고 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "외인성 프로테아제 분해 부위"는 "조작된 프로테아제 분해 부위", "비-자연발생 프로테아제 분해 부위" 또는 "비-천연 프로테아제 분해 부위"와 동의어이며, 자연발생 클로스트리듐 독소로부터 디-쇄 루프 부분내에 정상적으로 존재하지 않는 프로테아제 분해 부위를 의미한다. 디-쇄 루프 부분내 상기 조작된 또는 외인성 프로테아제 분해 부위들은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 단일-쇄 폴리펩티드 형태를 그의 디-쇄 형태로 전환시키는데 사용된다. 모든 및 일부 외인성 프로테아제 분해 부위들은 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 단일-쇄 폴리펩티드 형태를 그의 활성 디-쇄 형태로 전환시키기 위해 사용될 수 있으며, 본 명세서의 측면들을 실시하기 위해 사용될 수 있다고 생각된다. 외인성 프로테아제 분해 부위들의 비-제한적인 예로는, 예를 들어 식물 파파인 분해 부위, 곤충 파파인 분해 부위, 크러스타시안 파파인 분해 부위, 엔테로키나제 분해 부위, 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제 분해 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 분해 부위, 담배식각바이러스(TEV) 프로테아제 분해 부위, 담배 베인 모틀링 바이러스(TVMV) 분해 부위, 서브틸리신 분해 부위 또는 하이드록실아민 분해 부위 또는 카스파제 3 분해 부위가 포함된다. 디-쇄 루프내에 위치한 조작된 프로테아제 분해 부위들은 예를 들면, Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,419,676호, Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,422,877호, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허공개 제2008/0032930호, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허공개 제2009/0018081호, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허공개 제2009/0005313호, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허공개 제2009/0004224호에 기술되어 있으며; 이들은 각각 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다.
외인성 프로테아제 분해 부위가 각각의 프로테아제에 의해 분해될 수 있다는 조건하에, 본 명세서의 측면들에서 특정 및 모든 길이의 외인성 프로테아제 분해 부위가 사용될 수 있다고 생각된다. 따라서, 이 구체예의 측면들에서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 적어도 60개의 아미노산; 또는 최대 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 적어도 60개의 아미노산들의 길이를 가질 수 있다.
한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 외인성 프로테아제 분해 부위를 포함하는 디-쇄 루프 부분을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 식물 파파인 분해 부위, 곤충 파파인 분해 부위, 크러스타시안 파파인 분해 부위, 비-인간 엔테로키나제 분해 부위, 담배식각바이러스(TEV) 프로테아제 분해 부위, 담배 베인 모틀링 바이러스(TVMV) 분해 부위, 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제 분해 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 분해 부위, 서브틸리신 분해 부위, 하이드록실아민 분해 부위, SUMO/ULP-1 프로테아제 분해 부위 및 비-인간 카스파제 3 분해 부위가 포함된다
이 구체예의 한 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 비-인간 엔테로키나제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 소 엔테로키나제 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 480을 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 담배식각 바이러스 프로테아제 분해를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 EX1X2YX3Q*G(SEQ ID NO: 481) 또는 EX1X2YX3Q*S(SEQ ID NO: 482)(여기에서, X1, X2 및 X3은 아미노산임)를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491 또는 SEQ ID NO: 492를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 담배 베인 모틀링 바이러스 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 X1X2VRFQ*G(SEQ ID NO: 493) 또는 X1X2VRFQ*S(SEQ ID NO: 494)(여기에서, X1 및 X2는 독립적으로 아미노산임)를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497 또는 SEQ ID NO: 498을 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 X1X2LFQ*GP(SEQ ID NO: 499)(여기에서, X1은 D 또는 E와 같은 산성 아미노산인 아미노산이며; 및 X2는 우선적으로 S, T, 및 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산임)를 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 504 또는 SEQ ID NO: 505를 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 PRESCISSION®에 의해 분해된 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 서브틸리신 분해 부위를 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 X1X2X3X4H*Y(SEQ ID NO: 506) 또는 X1X2X3X4YH*(SEQ ID NO: 507)(여기에서, X1, X2, X3 및 X4는 독립적으로 아미노산임)을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 509 또는 SEQ ID NO: 510을 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, GENENASE®에 의해 분해되는 서브틸리신 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 하이드록실아민 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 다이펩타이드 N*G를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 511 또는 SEQ ID NO: 512를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SUMO/ULP-1 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 GG*X1X2X3(SEQ ID NO: 513)(여기에서, X1, X2 및 X3은 독립적으로 아미노산임)을 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 514를 포함한다.
이 구체예의 한 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 카스파제 3 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 비-인간 카스파제 3 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 DX1X2D*X3(SEQ ID NO: 515)(여기에서, X1은 특정 아미노산이며, D 및 E와 같은 산성 아미노산이 바람직하며, X2는 특정 아미노산이고, X3은 아미노산이며, A, C, G, S 및 T와 같은 작은 비-극성 아미노산이 바람직함)을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520 또는 SEQ ID NO: 521을 포함한다.
디-쇄 루프 부분은 자연발생 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위가 외인성 프로테아제 분해 부위에 의해 치환되도록 변형될 수 있다. 이 변형에서, 자연발생 디-쇄 루프 외인성 프로테아제 분해 부위는 동작불가능하게 되어서, 그의 프로테아제에 의해 분해될 수 없다. 외인성 프로테아제 분해 부위만 그의 해당 외인성 프로테아제에 의해 분해될 수 있다. 이 타입의 변형에서, 외인성 프로테아제 부위는 융합 단백질로서 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 동작가능하게 결합되며, 그 부위는 그의 각 외인성 프로테아제에 의해 분해될 수 있다. 외인성 프로테아제 분해 부위에 의해 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 치환하는 것은 내인성 부위의 분해 부위 위치에 접근하는 위치에서 외인성 부위가 조작되는 부위들을 치환하는 것이 될 수 있다. 외인성 프로테아제 분해 부위에 의해 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 치환하는 것은 외인성 부위가 내인성 부위의 분해 부위 위치(location)와 다른 위치(position)에서 조작되는 외인성 부위를 첨가하는 것이 될 수 있으며, 내인성 부위는 동작가능하도록 조작된다. 프로테아제 분해 부위의 위치 및 종류는 특정 결합 영역들이 유리 아미노-말단 또는 카복실-말단 아미노산을 필요로 하기 때문에 중요할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드 결합 영역이 2개의 다른 영역들(예를 들면 도 4 참조) 사이에 위치하는 경우, 프로테아제 분해 부위의 선택기준은 그의 부위를 분해하는 프로테아제가 플러시 컷을 남기는지의 여부, 그의 수용체에 대하여 결합 영역을 선택적으로 결합하기 위해 필요한 결합 영역의 유리 아미노-말단 또는 카복실-말단을 노출시키는 것이다.
천연적으로 존재하는 프로테아제 분해 부위는 천연적으로 존재하는 디-쇄 루프 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 결합을 플랭킹하는 2개의 아미노산들 중 적어도 하나를 변경시킴으로써 동작불능하게 할 수 있다. 디-쇄 루프 부분의 2개의 시스테인 잔기들이 온전한 상태로 남아있고, 그 부분이 여전히 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있다는 가정하게, 보다 광범위한 변경들이 이루어질 수 있다. 아미노산 변경의 비-제한적인 예로는 아미노산을 결실하거나, 또는 원래의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것이 포함된다. 따라서, 한 구체예에서, 자연발생 프로테아제 분해 부위는 자연발생 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 결합을 플랭킹하는 2개의 아미노산들 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 개의 아미노산들을 변경시킴으로써 동작가능하게 된다. 다른 구체예에서, 자연발생 프로테아제 분해 부위는 자연발생 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 결합을 플랭킹하는 2개의 아미노산들 중 적어도 하나를 포함하는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개의 아미노산들을 변경시킴으로써 동작불능하게 된다.
본 명세서에 개시된 변형된 클로스트리듐 독소는 가요성 스페이서(flexible spacer)를 포함하는 가변 부분을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 가요성 스페이서를 포함하는 가변 부분은 폴리펩타이드의 특성, 속성 또는 성질을 최적화하기 위해 폴리펩타이드 부분의 길이를 조정하기 위해 사용될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 1개 이상의 가요성 스페이서들을 나란히 포함하는 폴리펩타이드 부분은 프로테아제 분해 부위를 보다 잘 노출시키기 위해 사용될 수 있으며, 그럼으로써 프로테아제에 의해 이 부위를 제거하는 것이 용이해진다. 다른 비-제한적인 예로서, 1개 이상의 가요성 스페이서들을 나란히 포함하는 폴리펩타이드 부분은 펩타이드 결합 영역에 보다 잘 존재하도록 사용될 수 있으며, 그럼으로써 결합 영역이 그의 수용체에 결합하는 것이 용이해진다.
펩타이드를 포함하는 가요성 스페이서는 길이가 적어도 하나의 아미노산이며, A, C, G, S 및 T와 같은 작은 비-극성 아미노산과 같은, 소형 측쇄 R기들을 갖는 비하전된 아미노산들을 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산들; 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산들의 길이를 가질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 1-3개의 아미노산들 사이에, 2-4개의 아미노산들 사이에, 3-5개의 아미노산들 사이에, 4-6개의 아미노산들 사이에, 또는 5-7개의 아미노산들 사이에 있을 수 있다. 가요성 스페이서의 비-제한적인 예로는 예를 들어, GGG, GGGG(SEQ ID NO: 522) 및 GGGGS(SEQ ID NO: 523)와 같은 G-스페이서, 또는 AAA, AAAA(SEQ ID NO: 524) 및 AAAAT(SEQ ID NO: 525)와 같은 A-스페이서가 포함된다. 상기 가변 부분은 융합 단백질로서, 변형된 클로스트리듐 독소에 인-프레임 동작가능하게 결합된다.
따라서, 한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 가요성 스페이서를 포함하는 가변 부분을 추가로 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 복수의 가요성 스페이서들을 나란히 포함하는 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 이 구체예의 측면들들에서, 가변 부분은 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 G-스페이서들; 또는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 G-스페이서들을 나란히 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 가변 부분은 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 A-스페이서들; 또는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 A-스페이서들을 나란히 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 같은 가요성 스페이서들의 1개 이상의 복제본들, 다른 가변-스페이서 부분들의 1개 이상의 복제본들 또는 이들의 조합들을 포함하는 가변 부분을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 전반적인 중독 과정을 수행할 수 있다는 조건하에, 모든 위치에서 가요성 스페이서를 포함할 수 있다고 생각된다. 이 구체예의 측면들에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 효소 영역과 전위 영역, 효소 영역과 결합 영역, 효소 영역과 외인성 프로테아제 분해 부위 사이에 위치한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 결합 영역과 전위 영역, 결합 영역과 효소 영역, 결합 영역과 외인성 프로테아제 분해 부위 사이에 위치한다. 이 구체예의 또 다른 측면들에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 전위 영역과 효소 영역, 전위 영역과 결합 영역, 전위 영역과 외인성 프로테아제 분해 부위 사이에 위치한다.
임의 성분의 비-제한적인 예로서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 에피토프-결합 부분을 추가로 포함할 수 있다. 에피토프-결합 부분은 예를 들어, 단백질 정제 및 단백질 시각화를 포함하는 광범위한 과정들에 사용될 수 있다. 상기 에피토프-결합 부분은 변형된 클로스트리듐 독소에 융합 단백질로서 인-프레임 동작가능하게-결합된다. 에피토프-결합 부분의 비-제한적인 예로는 예를 들어, FLAG, ExpressTM, 인간 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA), 인간 p62c-Myc 단백질(c-MYC), 수포성 구내염 바이러스 글리코단백질(VSV-G), 단순 헤르페스 바이러스(HSV)의 글리코단백질-D 전구체, V5, AU1 및 AU5; 예를 들어, 폴리히스티딘(HIS), 스트렙타비딘 결합 펩타이드(strep), 및 바이오틴 또는 바이오틴화 서열과 같은 친화도-결합; 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제의 글루타티온 결합 영역, 칼모듈린 결합 단백질의 칼모듈린 결합 영역 및 말토스 결합 단백질의 말토스 결합 영역과 같은 펩타이드-결합 부분들이 포함된다. 적당한 결합 펩타이드를 선택, 제조 및 사용하기 위한 특정 프로토콜들의 비-제한적인 예들은 예를 들어, Epitope Tagging, pp. 17.90-17.93(Sambrook and Russell, eds., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Vol. 3, 3rd ed. 2001); ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL(Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998); 및 USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL NO.I(Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998)에 기술되어 있다. 게다가, 결합 펩타이드 뿐만 아니라 잘-특성화된 제제들, 조건들 및 프로토콜들의 비-제한적인 예는 BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; 및 Stratagene, La Jolla, CA를 포함하는(제한되지 않음) 상업적 판매사에서 쉽게 입수할 수 있다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 이들의 교시내용에 있는 정규과정들이다.
따라서, 한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 에피토프-결합 부분을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 복수의 에피토프-결합 부분들을 추가로 포함할 수 있다. 이 구체예의 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 에피토프-결합 부분들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 에피토프-결합 부분들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 같은 에피토프-결합 부분의 1개 이상의 복제본들, 다른 에피토프-결합 부분들의 1개 이상의 복제본들 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
에피토프-결합 부분의 위치는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 아미노 말단, 내부 또는 카복실 말단을 포함하는 다양한 위치에 있을 수 있으며, 여기에 제한되지는 않는다. 따라서, 한 구체예에서, 에피토프-결합 부분은 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 아미노-말단에 위치한다. 다른 구체예에서, 에피토프-결합 부분은 변형된 클로스트리듐 독소의 카복실-말단에 위치되어 있다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로 폴리뉴클레오타이드 분자들을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 분자"는 "핵산 분자"와 동의어이며, 예를 들어, 라이보뉴클레오타이드 및 데옥시라이보뉴클레오타이드들과 같은 폴리머 형태의 뉴클레오타이드들을 의미한다. 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화할 수 있는 특정의 폴리뉴클레오타이드 분자들 및 모든 폴리뉴클레오타이드 분자들이 사용될 수 있으며, 이들은 자연발생 및 비-자연발생 DNA 분자들 및 자연발생 및 비-자연발생 RNA 분자들을 포함하며, 여기에 제한되지 않는다. 자연발생 및 비-자연발생 DNA 분자들의 비-제한적인 예로는 단일가닥 DNA 분자들, 이중가닥 DNA 분자들, 게놈 DNA 분자들, cDNA 분자들, 벡터 구조물들, 예를 들면 플라스미드 구조물, 파그미드 구조물, 박테리오파지 구조물, 레트로바이러스 구조물 및 인조 염색체 구조물들이 포함된다. 자연발생 및 비-자연발생 RNA 분자들의 비-제한적인 예로는 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA 및 mRNA가 포함된다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조하기 위해 제조될 필요가 있는, 잘 정립된 분자생물학 기술들은 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭, 제한효소 반응, 아가로스 겔 전기영동, 핵산 연결법, 박테리아 형질전환, 핵산 정제법, 핵산 시퀀싱 및 재조합-기반 기술들을 포함하며(이에 제한되지는 않음), 이들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 이의 교시내용 안에 있는 정규 과정들이다. 변형된 클로스트리듐 독소를 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조하는데 필요한 특정 프로토콜들의 비-제한적인 예들은 예를 들어, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004)에 기술되어 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조하기 위해 사용가능한 상업용으로 사용가능한 제품들의 다양성은 널리 사용가능하다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 이의 교시내용 안에 있는 정규 과정들이다.
따라서, 한 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화한다.
본 명세서의 또 다른 측면은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제조하는 방법을 부분제공하며, 상기 방법은 세포내에서 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 단계를 포함한다. 본 명세서의 또 다른 측면은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 세포내에서 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 구조물을 도입하는 단계, 및 세포내에서 발현 구조물을 발현시키는 단계들을 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법들은 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 부분 포함한다. 본 명세서에 개시된 특정의 및 모든 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메라들은 본 명세서에 개시된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다고 생각된다. 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 특정의 및 모든 폴리뉴클레오타이드 분자들은 본 명세서에 개시된 방법들을 사용하여 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제조하는데 사용할 수 있다고 생각된다.
본 명세서에 개시된 방법들은 발현 구조물을 부분 포함한다. 발현 구조물은 세포 또는 세포-유리 추출물내에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하기에 유용한 발현 벡터에 동작가능하게-결합된 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 매우 다양한 발현 벡터들은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하기 위해 사용될 수 있으며, 바이러스 발현 벡터; 원핵 발현 벡터; 진핵 발현 벡터, 예를 들면 효모발현 벡터, 곤충발현 벡터, 및 포유류발현 벡터; 및 세포-유리 추출물 발현 벡터를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들의 측면들을 실시하기 위해 사용가능한 발현벡터들은 구조적, 조직-특이적, 세포-특이적 또는 유도성 프로모터 요소, 증가 요소 또는 둘 모두의 조절하에 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 발현하는 것들을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 상기 발현 벡터들로부터 발현 구조물을 제조하고 그 발현 구조물을 사용하기 위한 잘-정립된 제제들 및 조건들에 따른 발현 벡터들의 비-제한적인 예들은 BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; 및 Stratagene, La Jolla, CA를 포함하는 상업용 판매사로부터 쉽게 입수할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 적당한 발현 벡터를 선택, 제조 및 사용하는 것은 본 발명의 교시내용으로부터 및 당 분야에 기술을 가진 자의 범주내에 있는 정규 과정들이다.
따라서, 이 구체예의 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 발현 벡터에 동작가능하게 결합된다. 이 구체예의 측면들에서, 발현벡터는 예를 들어, 바이러스 발현 벡터, 원핵 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 또는 포유류 발현 벡터이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 세포-유리 추출물 발현 벡터에 동작가능하게 결합된다.
본 명세서에 개시된 방법들은 부분적으로 세포를 포함한다. 특정의 세포 및 모든 세포들이 사용될 수 있다고 생각된다. 따라서, 이 구체예의 측면들은 예를 들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 클로스트리디아 퍼프린겐스(Clostridia perfringens), 클로스트리디아 디피실(Clostridia difficile), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter cressentus), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 메틸로박테리움 엑스토퀴엔스(Methylobacterium extorquens), 네이세리아 메닌기룰스(Neisseria meningirulls), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 휴도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로부터 유도된 것들과 같은 호기성, 미호기성, 호탄산가스성, 조건혐기성, 혐기성, 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 세포들; 및 예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica)로부터 유도된 것들과 같은 효모 균주들을 포함하는 진핵 세포들; 예를 들어, 스포돕테라 프루기퍼(Spodoptera frugiperda)다, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 및 만두카 섹타(Manduca sexta)로부터 유도된 것들과 같은, 곤충으로부터 유도된 곤충 세포 및 세포주들; 및 마우스, 쥐, 햄스터, 돼지, 소, 말, 영장류 및 인간으로부터 유도된 것들과 같은 포유류 세포들로부터 유도된 포유류 세포 및 세포주들을 포함한다. 세포주들은 미생물 및 세포 배양물들의 American Type Culture Collection, European Collection of Cell Cultures 및 German Collection으로부터 얻어질 수 있다. 적당한 세포주를 선택, 제조 및 사용하기 위한 특정 프로토콜들의 비-제한적인 예는 예를 들어, INSECT CELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus F.A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE(Cambridge University press, 1997); CELL AND TISSUE CULTUREL: LABORATORY PROCEDURES(Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss, 4th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH(John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH(John M. Davis, Oxford Press 2nd ed. 2002): 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004)에 기술되어 있다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 교시내용에 있는 정규 과정들이다.
본 명세서에 개시된 방법들은 세포에 폴리뉴클레오타이드 분자를 이입시키는 단계를 포함한다. 세포에 이입된 폴리뉴클레오타이드 분자는 세포에 의해 일시적으로 또는 안정적으로 유지될 수 있다. 스탠리-유지된 폴리뉴클레오타이드 분자들은 염색체외적이고, 자발적으로 복제하거나, 또는 세포의 염색체 물질로 통합되고, 비자발적으로 복제한다. 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포에 이입시키는 특정 및 모든 방법들이 사용될 수 있다고 생각된다. 세포에 폴리뉴클레오타이드 분자를 이입시키기 위해 사용가능한 방법들은 예를 들어, 염화칼슘-매개, 인산칼슘-매개, 다이에틸-아미노에틸(DEAE) 덱스트란-매개, 지질-매개, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개, 폴리라이신-매개 및 폴리브렌-매개와 같은 화학물-매개 트랜스펙션 또는 형질전환; 예를 들어, 생분해성 입자전달, 마이크로주입, 원형질 융합 및 전기천공과 같은 물리적-매개 트랜스펙션 또는 형질전환; 및 예를 들어, 레트로바이러스-매개 트랜스펙션과 같은 바이러스-매개 트랜스펙션을 포함하며(예를 들어, Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62(Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001 참조), 이에 제한되지 않는다. 당 분야에 기술을 가진 자는 세포에 발현 구조물을 이입시키기 위한 특정 방법을 선택하는 것은 세포가 발현 구조물을 일시적으로 함유할 것인지의 여부 또는 세포가 발현 구조물을 안정적으로 함유할 것인지의 여부에 부분적으로 의존할 것임을 이해한다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 지식을 가진 자의 범주 및 이의 교시내용에서 정규 과정들이다.
이 구체예의 한 측면에서, 화학물-매개 방법, 일명 트랜스펙션은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 세포 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포에 이입시키기 위해 사용된다. 트랜스펙션의 화학물-매개 방법에서, 화학물 제제는 세포에 흡수되는 것을 용이하게 하는 핵산과 컴플렉스를 형성한다. 상기 화학물 제제들은 인산칼슘-매개(예를 들어, Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004) 참조); 다이에틸-아미노에틸(DEAE) 덱스트란-매개, 지질-매개, 양이온성 폴리머-매개, 예를 들면 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 및 폴리라이신-매개 및 폴리브렌-매개(예를 들어, Chun Zhang et al, Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144-150(2004) 참조)를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 상기 화학물-매개 전달 시스템은 표준 방법들에 의해 제조될 수 있으며, 상업용으로 시판가능하다(예를 들면, CellPhect Transfection Kit(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); Mammalian Transfection Kit, Calcium phosphate and DEAE Dextran, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); LIPOFECTAMINETM Transfection Reagent(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); ExGen 500 Transfection kit(Fermentas, Inc., Hanover, MD) 및 SuperFect and Effectene Transfection Kits(Qiagen, Inc., Valencia, CA 참조).
이 구체예의 또 다른 측면에서, 물리적-매개 방법은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포에 이입시키기 위해 사용된다. 물리적 기술들로는 전기천공법, 생분해법 및 마이크로주입법이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다. 생분해법 및 마이크로주입 기술들은 세포에 핵산분자를 이입시키기 위해 세포벽을 천공시키며, 예를 들어, Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods 67-75(1997); 및 John O'Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125(2004)을 참조한다. 전기천공법, 일명 전기침투법은 핵산분자들이 들어오는 막에서 일시적인 구멍들을 생성하기 위해 짧은 고전압의 전기펄스를 사용하고, 모든 세포타입의 안정적이고 일시적인 트랜스펙션을 위해 효과적으로 사용될 수 있으며, 에를 들어, M. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); 및 Oliver Greschet al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004)를 참조한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 바이러스-매개 방법, 일명 형질도입은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포내에 이입시키기 위해 사용된다. 일시적인 형질도입의 바이러스-매개 방법에서, 바이러스 입자가 숙주세포내에서 감염 및 복제하는 방법은 세포내에 폴리뉴클레오타이드 분자를 이입하기 위해 본 메카니즘에 사용하기 위해 조작될 수 있다. 바이러스-매개 방법들은 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순헤르페스 바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스 및 배큘로바이러스를 포함(이에 제한되지는 않음)하는 매우 다양한 바이러스들로부터 개발되었으며, 예를 들어, Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); 및 Maurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al., Adenovirus vectors for gene delivery 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (202); 및 A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003)을 참조한다.
비-봉입형 이중가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스는 약 36kb의 비교적 큰 폴리뉴클레오타이드 분자들을 취급하기 때문에 포유동물 세포 형질도입을 위해 종종 선택되며, 높은 적정에서 제조되고, 다양한 분열 및 비-분열 세포들을 효과적으로 감염시킬 수 있으며, 예를 들어, Wim T. J. M. C. Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) Neurosci. Methods 85-98 (1997); 및 Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug. Rev. 165-176 (2001)을 참조한다. 아데노바이러스-계 시스템을 사용한 형질도입은 핵산분자가 숙주세포 염색체로 통합되기보다 세포 핵내 에피솜에 의해 운반되기 때문에 연장된 단백질 발현을 지지하지 않는다. 아데노바이러스 벡터 시스템 및 상기 벡터들을 사용하는 방법을 위한 특정 프로토콜들은 예를 들어, VIRAPOWERTM Adenoviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and VIRAPOWERTM Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (Jul. 15, 2002); 및 ADEASYTM Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA)과 ADEASYTM Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc.을 참조한다.
폴리뉴클레오타이드 분자 전달은 예를 들어, 온코레트로바이러스 및 렌티바이러스와 같은 단일-가닥 RNA 레트로바이러스를 사용할 수도 있다. 레트로바이러스-매개 형질도입은 종종 100%에 가까운 형질도입 효율을 내며, 세포들을 일시적으로 또는 안정하게 형질도입하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어 Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Felix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); 및 Roland Wolkowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004)를 참조한다. 레트로바이러스 입자들은 지질 외피에 의해 둘러싸인, 단백질 캡시드에 포장된 RNA 게놈으로 구성되어 있다. 레트로바이러스는 역전사효소를 따라 세포질로 그의 RNA를 주입함으로써 숙주 세포를 감염시킨다. 그후, RNA 주형이 직쇄상 이중 가닥 cDNA로 역전사되어, 숙주 세포 게놈으로 삽입함으로써 그 자체를 복제한다. 바이러스 입자들은 모두 (프로바이러스를 통해 모세포로부터 딸세포까지) 수직으로뿐만 아니라, (비리온들을 통해 세포로부터 세포까지) 수평으로 퍼진다. 이 복제 전략은 장기간 지속적인 발현을 가능하게 하는데, 그 이유는 그 핵산분자들이 숙주 세포의 염색체로 안정적으로 삽입되어, 단백질의 장기간 발현을 가능하게 하기 때문이다. 예를 들면, 동물 연구들은 조직의 다양한 조직들에 주입된 렌티바이러스 벡터들이 1년 이상동안 지속적인 단백질 발현을 생성한다는 것을 보여주었으며, 예를 들어, Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996)을 참조한다. 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV)와 같은 온코레트로바이러스-유도된 벡터 시스템이 널리 사용되며, 많은 다른 비-분열 세포들을 감염시킨다. 렌티바이러스들도 또한, 분열 및 비-분열 세포들을 포함하는 많은 다른 세포 타입들을 감염시킬 수 있으며, 복합 외피 단백질들을 가지고 있어서 매우 특이적인 세포 타겟팅이 가능하게 된다.
상기 벡터들을 사용하는 방법들을 위한 레트로바이러스 벡터 및 특정 프로토콜들은 예를 들어, Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters, 미국 특허 제5,464,758호(Nov. 7, 1995)와 Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression, 미국 특허 제5,814,618호(Sep. 29, 1998) David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same, 미국 특허 제5,514,578호(May 7, 1996)와 David S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor, 미국 특허 제6,245,531호(Jun. 12, 2001); Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations, 미국 특허 제5,364,791호(Nov. 15, 1994), Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, 미국 특허 제5,874,534호(Feb. 23, 1999) 및 Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, 미국 특허 제5,935,934호(Aug. 10, 1999)에 개시되어 있다. 그리고, 상기 바이러스 전달 시스템은 표준 방법으로 제조될 수 있으며, 상업용으로 입수가능하며, 예를 들면, BDTM Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems(BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) 및 BDTM Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (mar. 14, 2003), GENESWITCHTM System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and GENESWITCHTM System A Mifepristone-Regulated Expresion System for Mammalian Cells version D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (Nov. 4, 2002); VIRAPOWERTM Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (Dec. 8, 2003); 및 COMPLETE CONTROL® Retroviral Inducible Mammalian Expression System(Stratagene, La Jolla, CA)과 COMPLETE CONTROL® Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005e를 참조한다.
본 명세서에 개시된 방법들은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 부분 발효하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 발현하기 위해, 다양한 발현 시스템들이 사용될 수 있고, 이 시스템은 세포-계 시스템 및 세포-유리 발현 시스템들을 포함하고, 여기에 제한되지 않는다고 생각된다. 세포-계 시스템들은 바이러스 발현 시스템, 원핵 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 배큘로바이러스 발현 시스템, 곤충 발현 시스템, 및 포유류 발현 시스템을 포함하며, 이들에 제한되지는 않는다. 세포-유리 시스템들은 밀 배아 추출물, 토끼 망상적혈구 추출물 및 대장균 (E. coli) 추출물을 포함하며(이에 제한되지는 않음), 일반적으로 본 명세서에 개시된 방법과 동일하다. 발현 시스템을 사용한 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현은 유도성 발현, 비-유도성 발현, 구조적 발현, 바이러스-매개 발현, 안정적-통합형 발현 및 일시적 발현을 포함하여, 여러 다양한 특징들을 포함할 수 있으며, 여기에 제한되지 않는다. 잘-특성화된 벡터, 제제, 조건들 및 세포들을 포함하는 발현 시스템들은 잘-정립되어 있으며, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN; 및 Stratagene, La Jolla, CA를 포함하는(여기에 제한되지 않음) 상업용 판매사들로부터 쉽게 입수가능하다. 적당한 이종발현 시스템들의 선택 및 용도에 대한 비-제한적인 예들은 예를 들어, PROTEIN RXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S.J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); 및 Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001)에 기술되어 있다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 이의 교시내용에 있는 정규과정들이다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하기 위해 다양한 세포-계 발현 과정들이 사용될 수 있다. 그 예로는 바이러스 발현 시스템, 원핵 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 배큘로바이러스 발현 시스템, 곤충 발현 시스템 및 포유류 발현 시스템이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다. 바이러스 발현 시스템은 VIRAPOWERTM Lentiviral(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), Adenoviral Expression Systems(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), ADEASYTM XL Adenoviral Vector System(Stratagene, La Jolla, CA) 및 VIRAPORT® Retroviral Gene Expression System(Stratagene, La Jolla, CA)를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 원핵 발현 시스템들의 비-제한적인 예로는 CHAMPIONTM pET Expression System(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), TRIEXTM Bacterial Expression System(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), QIAEXPRESS® Expression System(QIAGEN, Inc.), 및 AFFINITY® Protein Expression and Purification System(Stratagene, La Jolla, CA)이 포함된다. 효모 발현 시스템은 EASYSELECTTM Pichia Expression Kit(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), YES-ECHOTM Expression Vector Kits(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) 및 SPECTRATM S. pombe Expression System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)을 포함한다. 배큘로바이러스 발현 시스템의 비-제한적인 예로는 BACULODIRECTTM (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), BAC-TO-BAC® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), 그리고 BD BACULOGOLDTM (BD Biosciences-Pharmigen, San Diego, CA)가 포함된다. 곤충 발현 시스템은 Drosophila Expression System(DES®)(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), INSECTSELECTTM System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) 및 INSECTDIRECTTM System(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 포유류 발현 시스템의 비-제한적인 예로는 T-REXTM (Tetracycline-Regulated Expression) System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), FLP-INTM T-REXTM System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), pcDNATM system(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), pSecTag2 system(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), EXCHANGER® System, INTERPLAYTM Mammalian TAP System(Stratagene, La Jolla, CA), COMPLETE CONTROL® Inducible Mammalian Expression System(Stratagene, La Jolla, CA) 및 LACSWITCH® II Inducible Mammalian Expression System(Stratagene, La Jolla, CA)이 포함된다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 다른 방법은 원핵 추출물 및 진핵 추출물과 같은 세포-유리 발현 시스템을 사용하며, 여기에 제한되지는 않는다. 원핵 세포 추출물의 비-제한적인 예로는 RTS 100 대장균(E. coli) HY Kit(Roche Applied Science, Indianapolis, IN), ActivePro In Vitro Translation Kit(Ambion, Inc., Austin, TX), ECOPROTM System(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), 및 EXPRESSWAYTM Plus Expression System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)가 포함된다. 진핵세포 추출물로는 RTS 100 Wheat Germ CECF Kit(Roche Applied Science, Indianapolis, IN), TNT® Coupled Wheat Germ Extract Systems(Promega Corp., Madison, WI), Wheat Germ IVTTM Kit(Ambion, Inc., Austin, TX), Retic Lysate IVTTM Kit(Ambion, Inc., Austin, TX) PROTEINSCRIPT® II System(Ambion, Inc., Austin, TX) 및 TNT® Coupled Reticulocyte Lysate Systems(Promega Corp., Madison, WI)가 포함되며, 여기에 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 단일-쇄 형태의 세포에 의해 생성된다. 완전한 활성을 얻기 위해, 단일-쇄 형태는 그의 디-쇄 형태로 전환되어야 한다. 위에서 언급한 바와 같이, 이 전환방법은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 디-쇄 루프 부분내에 위치한 프로테아제 분해 부위를 분해함으로써 얻어진다. 이러한 전환방법은 특허문헌 Ghanshani, et al., Methods of Intracellular Conversion of single-Chain Proteins into their Di-chain Form, Attorney Docket No. 18469 PROV(BOT)에 기술된 바와 같이, 표준 시험관내 원핵 분해분석법 또는 세포-계 원핵 분해시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 이 문헌은 그 전문이 참고로 통합된다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로는, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 조성물을 개시하고 있다. 추가의 측면에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 조성물이다. 본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 개인에게 투여될 때 부작용, 알레르기반응 또는 다른 부작용 또는 원치않는 반응을 내지 않는 분자성분 또는 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 조성물"은 "약제학적 조성물"과 동의어이며, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메라와 같은 치료적으로 유효한 농도의 유효성분을 의미한다. 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물은 의료용도 및 수의용도로 사용가능하다. 약제학적 조성물은 환자에게 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 보충 유효성분들, 제제, 약물 또는 호르몬과 조합하여 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 종래의 혼합법, 용해법, 과립화, 당제, 분쇄, 유제, 캡슐화, 엔트랩핑, 및 동결건조를 포함하는 다양한 방법들을 사용하여 제조될 수 있으며, 여기에 제한되지 않는다. 약제학적 조성물은 멸균용액, 현탁액, 에멀젼, 동결건조물, 정제, 필, 펠릿, 캡슐, 분말, 시럽, 엘릭시르 또는 투여에 적당한 다른 투여형태를 포함하는 다양한 형태를 취할 수 있으며, 여기에 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 조성물에 유효 성분을 처리하는 것을 용이하게 하는 약제학적으로 허용가능한 담체들을 선택적으로 함유할 수 있다고 생각된다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "약물학적으로 허용가능한 담체"는 "약물학적 담체"와 동의어이며, 투여될 때 실질적으로 장기간 또는 영구적으로 해로운 효과를 갖지 않는 담체를 의미하며, "약물학적으로 허용가능한 부형제, 안정화제, 희석제, 첨가제, 보조제 또는 첨가제"와 같은 용어들을 포함한다. 상기 담체는 일반적으로 유효 화합물과 혼합되거나, 또는 유효 화합물을 희석 또는 둘러싸도록 허용되며, 고형, 반-고형 또는 액체 제제일 수 있다. 유효성분이 가용성일 수 있거나, 또는 원하는 담체 또는 희석제내 현탁액으로서 전달될 수 있음을 이해하고 있다. 예를 들어, 물, 식염수, 글리신, 히알루론산 등과 같은 수성 매질; 예를 들어, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등과 같은 고형 담체; 용매; 분산 매질; 코팅제; 항균제 및 항진균제; 등장성 및 흡수지연제; 또는 다른 불활성 성분을 포함하는 다양한 약제학적으로 허용가능한 담체들이 사용될 수 있으며, 여기에 제한되지는 않는다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 선택은 투여방법에 따라 다를 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체가 유효 성분과 맞지않는 경우를 제외하고는, 약제학적 허용가능한 조성물에 있어서 사용하는 것을 고려한다. 상기 약제학적 담체의 특정 용도의 비-제한적인 예는 PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS(Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(Joel G. Harman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001); 및 HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003)에서 찾아볼 수 있다. 이러한 프로토콜들은 정규 과정들이며, 특정 변형방법들은 당 분야에 지식을 가진 자의 범주 및 이의 교시 내용내에 잘 알려져 있다.
본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 버퍼, 방부제, 긴장성 조절제, 염, 산화방지제, 오스몰농도 조절제, 생리학적 물질, 약물학적 물질, 벌크제, 유화제, 습윤제, 감미제 또는 방향제 등을 포함(이에 제한되지는 않음)하는 다른 약제학적으로 허용가능한 성분들(또는 약제학적 성분들)을 선택적으로 포함(이에 제한되지는 않음)할 수 있음을 추가로 고려한다. 결과적으로 얻은 제제가 약제학적으로 허용가능하다는 조건하에, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물을 제조하기 위해 pH 조정을 위한 다양한 버퍼들이 사용될 수 있다. 상기 버퍼는 아세테이트 버퍼, 사이트레이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, 중성 완충식염수, 인산완충식염수 및 보레이트 버퍼를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 필요에 따라, 조성물의 pH를 조정하기 위해 산 또는 염기가 사용될 수 있음을 이해한다. 약제학적으로 허용가능한 산화방지제로는 소듐 메타바이설파이트, 소듐 티오설페이트, 아세틸시스테인, 부틸화 하이드록시아니솔 및 부틸화 하이드록시톨루엔이 포함되며, 이에 제한되지는 않는다. 사용가능한 방부제로는, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로뷰테인올, 티머로살, 페닐머큐릭 아세테이트, 페닐머큐릭 나이트레이트, 안정화 옥시 클로로 조성물, 예를 들어, PURITE® 및 킬레이트제, 예를 들어 DTPA 또는 DTPA-비스아미드, 칼슘 DTPA 및 CaNaDTPA-비스아미드가 포함되며, 여기에 제한되지는 않는다. 약제학적 조성물에 사용가능한 긴장성 조절제로는 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨 또는 글리세린 및 다른 약제학적으로 허용가능한 긴장성 조절제와 같은 염들을 포함하며, 여기에 제한되지는 않는다. 약제학적 조성물은 염으로 제공될 수 있으며, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산 및 숙신산을 포함하는 많은 다른 산들과 함께 형성될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 염은 대응하는 유리 염기 형태와 다른 프로톤 용매 또는 수성 용매에 보다 잘 용해되도록 하는 경향이 있다. 이러한 및 다른 물질들은 당 분야에 알려져 있으며, 약물학 분야는 명세서에 사용가능한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다고 이해하고 있다.
한 구체예에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물이다. 이 구체예의 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물은 약물학적 담체, 약제학적 성분 또는 약물학적 담체와 약제학적 성분 모두를 추가로 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약물학적 담체, 적어도 하나의 약제학적 성분 또는 적어도 하나의 약물학적 담체 및 적어도 하나의 약제학적 성분을 추가로 포함한다.
본 명세서의 측면들은 하기와 같이 설명될 수도 있다:
1. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 적어도 하나의 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치하며, 적어도 하나의 불활성화 분해 부위는 이중 트롬빈-트롬빈 부위, 인자 Xa 부위, 이중 인자 Xa-트롬빈 부위 및/또는 MMP-9 부위를 포함한다.
2. 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 클로스트리듐 독소 결합 영역, 디-쇄 루프 부분, 외인성 프로테아제 분해 부위 및, 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 적어도 2개의 불활성화 분해 부위들을 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치한다.
3. 측면 2의 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위는 이중 트롬빈-트롬빈 부위 및/또는 이중 인자 Xa-트롬빈 부위를 포함한다.
4. 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역에 위치한다.
5. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 462-496; SEQ ID NO: 3의 아미노산 458-492; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 464-487; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 463-496; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 458-491; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 434-467; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 453-486; SEQ ID NO: 21의 아미노산 458-491; SEQ ID NO: 23의 아미노산 443-476; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 434-467을 포함한다.
6. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 618-634; SEQ ID NO: 3의 아미노산 614-630; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 605-621; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 613-629; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 609-625; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 587-603; SEQ ID NO: 18의 아미노산 604-620; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 605-621; SEQ ID NO: 21의 아미노산 610-626; SEQ ID NO: 23의 아미노산 596-612; SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 587-603을 포함한다.
7. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 638-651; SEQ ID NO: 3의 아미노산 634-647; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 625-638; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 633-646; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 629-642; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 607-620; SEQ ID NO: 18의 아미노산 624-637; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 625-638; SEQ ID NO: 21의 아미노산 630-643; SEQ ID NO: 23의 아미노산 616-629; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 607-620을 포함한다.
8. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 665-687; SEQ ID NO: 3의 아미노산 661-683; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 652-674; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 660-682; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 656-678; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 634-659; SEQ ID NO: 18의 아미노산 651-676; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 652-677; SEQ ID NO: 21의 아미노산 657-679; SEQ ID NO: 23의 아미노산 643-668; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 634-659를 포함한다.
9. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 752-765; SEQ ID NO: 3의 아미노산 748-761; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 739-752; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 747-760; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 743-756; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 724-739; SEQ ID NO: 18의 아미노산 741-756; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 742-757; SEQ ID NO: 21의 아미노산 744-757; SEQ ID NO: 23의 아미노산 733-748; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 724-739를 포함한다.
10. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 826-835; SEQ ID NO: 3의 아미노산 824-831; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 813-824; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 821-830; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 817-826; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 800-809; SEQ ID NO: 18의 아미노산 817-826; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 818-827; SEQ ID NO: 21의 아미노산 818-827; SEQ ID NO: 23의 아미노산 809-819; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 800-809를 포함한다.
11. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 844-863; SEQ ID NO: 3의 아미노산 840-859; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 831-850; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 839-858; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 835-854; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 818-837; SEQ ID NO: 18의 아미노산 835-854; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 836-855; SEQ ID NO: 21의 아미노산 836-855; SEQ ID NO: 23의 아미노산 828-847; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 818-837을 포함한다.
12. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 871-895; SEQ ID NO: 3의 아미노산 867-891; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 858-882; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 866-890; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 862-886; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 845-869; SEQ ID NO: 18의 아미노산 862-886; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 863-887; SEQ ID NO: 21의 아미노산 863-887; SEQ ID NO: 23의 아미노산 855-879; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 845-869를 포함한다.
13. 측면 1-12의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/A 효소 영역, BoNT/B 효소 영역, BoNT/C1 효소 영역, BoNT/D 효소 영역, BoNT/E 효소 영역, BoNT/F 효소 영역, BoNT/G 효소 영역, BaNT 효소 영역, 및/또는 BuNT 효소 영역을 포함한다.
14. 측면 1-13의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위는 트롬빈 분해 부위, 플라즈민 분해 부위, 응고인자 VIIa 분해 부위, 응고인자 IXa 분해 부위, 응고인자 Xa 분해 부위, 응고인자 XIa 분해 부위, 응고인자 XIIa 분해 부위, 혈장 칼리크레인 분해 부위, 프로테아제-활성화된 G 단백질-커플링된 수용체-1 (PAR1) 분해 부위, PAR2 분해 부위, PAR3 분해 부위, PAR4 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 (MMP-2) 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9) 분해 부위, 푸린 분해 부위, 유로키나제-타입 플라즈미노겐 활성화제 (uPA) 분해 부위, 조직-타입 플라즈미노겐 활성화제 (tPA) 분해 부위, 트립타제-ε 분해 부위, 마우스 비만세포 프로테아제-7 (mMCP-7) 분해 부위, 엔도텔린-전환효소-1 (ECE-1) 분해 부위, 켈 혈액형 분해 부위, DPPIV 분해 부위, 트롬보스폰딘 타입 1 모티프-13 (ADAMTS13) 분해 부위를 갖는 ADAM 메탈로펩티다제, 및/또는 카텝신 L 분해 부위를 포함한다.
15. 측면 1-14의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/A 전위 영역, BoNT/B 전위 영역, BoNT/C1 전위 영역, BoNT/D 전위 영역, BoNT/E 전위 영역, BoNT/F 전위 영역, BoNT/G 전위 영역, TeNT 전위 영역, BaNT 전위 영역, 및 BuNT 전위 영역을 포함한다.
16. 측면 1-15의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위는 이중 트롬빈-트롬빈 부위, 인자 Xa 부위, 이중 인자 Xa-트롬빈 부위 및/또는 MMP-9 부위를 포함한다.
17. 측면 1-16의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 오피오이드 (opiod) 결합 영역, 타키키닌 (tachykinin) 결합 영역, 멜라노코르틴 (melanocortin) 결합 영역, 갈라닌 (galanin) 결합 영역, 그라닌 (granin) 결합 영역, 뉴로펩타이드 (Neuropeptide) Y 관련된 펩타이드 결합 영역, 신경호르몬 결합 영역, 신경조절성 사이토킨 결합 영역, 키닌 펩타이드 결합 영역, 성장인자 결합 영역, 및/또는 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역을 포함한다.
18. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/A로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
19. BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, BoNT/A 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
20. BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, BonT/A 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분, 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
21. BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
22. BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
23. 측면 18-22의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 462-496, 618-634, 638-651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863 및/또는 871-895 및/또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822-831, 840-859 및/또는 867-891을 포함한다.
24. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/B로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
25. BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, BoNT/B 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
26. BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, BoNT/B 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
27. BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
28. BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
29. 측면 24-28의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 464-487, 605-621, 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850 및/또는 858-882를 포함한다.
30. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/C1로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
31. BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, BoNT/C1 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
32. BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, BoNT/C1 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
33. BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
34. BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
35. 측면 30-34의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 463-496, 613-629, 633-646, 660-682, 747-760, 821-830, 839-858 및/또는 866-890을 포함한다.
36. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/D로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
37. BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, BoNT/D 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
38. BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, BoNT/D 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
39. BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
40. BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
41. 측면 36-40의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 458-491, 609-625, 629-642, 656-678, 743-756, 817-826, 835-854 및/또는 862-886을 포함한다.
42. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/E로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
43. BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, BoNT/E 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
44. BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, BoNT/E 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
45. BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
46. BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
47. 측면 42-46의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 및/또는 845-869를 포함한다.
48. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/F로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
49. BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, BoNT/F 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
50. BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, BoNT/F 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
51. BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
52. BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
53. 측면 48-52의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 453-486, 604-620, 624-637, 651-676, 741-756, 817-826, 835-854 및/또는 862-886을 포함하며; 및/또는 SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 453-486, 605-621, 625-638, 652-677, 742-757, 818-827, 836-855 및/또는 863-887을 포함한다.
54. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/G로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
55. BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, BoNT/G 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
56. BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, BoNT/G 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
57. BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
58. BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
59. 측면 54-58의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 458-491, 610-626, 630-643, 657-679, 744-757, 818-827, 836-855 및/또는 863-887을 포함한다.
60. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BaNT로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
61. BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, BaNT 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
62. BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, BaNT 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
63. BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
64. BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
65. 측면 60-64의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847 및/또는 855-879를 포함한다.
66. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BuNT로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
67. BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, BuNT 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
68. BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, BuNT 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
69. BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
70. BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
71. 측면 66-70의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 및/또는 845-869를 포함한다.
72. 측면 1-71의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 큰 안전역을 가진다.
73. 측면 72의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 및/또는 적어도 300%보다 큰 안전역을 가지며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90%, 최대 100%, 최대 110%, 최대 120%, 최대 130%, 최대 140%, 최대 150%, 최대 160%, 최대 170%, 최대 180%, 최대 190%, 최대 200%, 최대 210%, 최대 220%, 최대 230%, 최대 240%, 최대 250%, 최대 260%, 최대 270%, 최대 280%, 최대 290%, 및/또는 최대 300%보다 큰 안전역을 가지는 불활성화 분해 부위를 포함하며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 약 10% ~ 약 300%, 약 20% ~ 약 300%, 약 30% ~ 약 300%, 약 40% ~ 약 300%, 약 50% ~ 약 300%, 약 60% ~ 약 300%, 약 70% ~ 약 300%, 약 80% ~ 약 300%, 약 90% ~ 약 300% 및/또는 약 100% ~ 약 300% 이상인 안전역을 가지며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 적어도 1-배, 적어도 1-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배 및/또는 적어도 10-배 이상인 안전역을 가지며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 적어도 1-배, 최대 1-배, 최대 3-배, 최대 4-배, 최대 5-배, 최대 6-배, 최대 7-배, 최대 8-배, 최대 9-배 및/또는 최대 10-배 이상인 안전역을 가지며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 약 1-배 ~ 약 10-배, 약 1-배 ~ 약 9-배, 약 1-배 ~ 약 8-배, 약 1-배 ~ 약 7-배, 약 1-배 ~ 약 6-배, 약 1-배 ~ 약 5-배, 약 2-배 ~ 약 10-배, 약 2-배 ~ 약 9-배, 약 2-배 ~ 약 8-배, 약 2-배 ~ 약 7-배, 약 2-배 ~ 약 6-배 및/또는 약 2-배 ~ 약 5-배 이상인 안전역을 가진다.
74. 측면 1-73의 독소 및/또는 키메릭으로서, 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 불활성화 분해 부위를 첨가하면, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시킨다.
75. 측면 74의 독소 및/또는 키메릭으로서, 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 및/또는 적어도 300%까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 및/또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90%, 최대 100%, 최대 110%, 최대 120%, 최대 130%, 최대 140%, 최대 150%, 최대 160%, 최대 170%, 최대 180%, 최대 190%, 최대 200%, 최대 210%, 최대 220%, 최대 230%, 최대 240%, 최대 250%, 최대 260%, 최대 270%, 최대 280%, 최대 290%, 및/또는 최대 300% 까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 및/또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 약 10% ~ 약 300%, 약 20% ~ 약 300%, 약 30% ~ 약 300%, 약 40% ~ 약 300%, 약 50% ~ 약 300%, 약 60% ~ 약 300%, 약 70% ~ 약 300%, 약 80% ~ 약 300%, 약 90% ~ 약 300% 및/또는 약 100% ~ 약 300%까지 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 적어도 1-배, 적어도 1-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배 및/또는 적어도 10-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 및/또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 최대 1-배, 최대 3-배, 최대 4-배, 최대 5-배, 최대 6-배, 최대 7-배, 최대 8-배, 최대 9-배 및/또는 최대 10-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 및/또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 약 1-배 ~ 약 10-배, 약 1-배 ~ 약 9-배, 약 1-배 ~ 약 8-배, 약 1-배 ~ 약 7-배, 약 1-배 ~ 약 6-배, 약 1-배 ~ 약 5-배, 약 2-배 ~ 약 10-배, 약 2-배 ~ 약 9-배, 약 2-배 ~ 약 8-배, 약 2-배 ~ 약 7-배, 약 2-배 ~ 약 6-배 및/또는 약 2-배 ~ 약 5-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다.
76. 측면 1-75 중 어느 하나에 따른 독소 및/또는 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
77. 폴리뉴클레오타이드 분자로서, 분자는 SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 534 및/또는 SEQ ID NO: 536을 포함한다.
78. 측면 76 및/또는 77에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포내에서 발현하는 단계를 포함하는, 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 제조방법으로서, 폴리뉴클레오타이드 분자로부터의 발현은 코드화된 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생성한다.
79. 하기 단계 a.~b.를 포함하는 변형된 클로스트리듐 독소의 제조 방법으로서:
a. 측면 76 및/또는 77에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포내로 이입하는 단계; 및
b. 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 단계,
폴리뉴클레오타이드 분자로부터의 발현은 코드화된 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생성한다.
80. SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 535 및/또는 SEQ ID NO: 537을 포함하는 클로스트리듐 독소.
81. SEQ ID NO: 531을 포함하는 클로스트리듐 독소.
82. SEQ ID NO: 533을 포함하는 클로스트리듐 독소.
83. SEQ ID NO: 535를 포함하는 클로스트리듐 독소.
84. SEQ ID NO: 537을 포함하는 클로스트리듐 독소.
실시예
하기 비-제한적인 실시예들은 개시한 구체예들을 쉽게 보다 완벽하게 이해할 수 있도록 오직 설명의 목적으로 제공되며, 어떤 방법으로도 본 명세서에 개시된 구체예들 중 어느 것을 한정하기 위한 것은 아니다.
실시예 1
불활성화 분해 부위 부분의 확인
본 실시예는 독소가 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형시키기에 적당한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭내 부분들을 확인하는 방법 및 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 제조방법을 설명한다.
잠재적 불활성화 분해 부위 부분으로서 적당한 단백질 구조내 위치 또는 위치들을 확인하기 위해, BoNT/A의 3차원 구조를 컴퓨터 소프트웨어로 초기분석하여, 프로테아제에 보다 접근가능하게 되는 연장된 부분들 또는 표면노출된 루프들을 확인하였다. 접근가능할 것으로 예상되는 부분들 중, 추가 분석을 위해 8개의 부분들을 선택하였다: SEQ ID NO: 1의 아미노산 462-496, SEQ ID NO: 1의 아미노산 618-634, SEQ ID NO: 1의 아미노산 638-651, SEQ ID NO: 1의 아미노산 665-687, SEQ ID NO: 1의 아미노산 752-765, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 826-835, SEQ ID NO: 1의 아미노산 844-863, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 871-895.
컴퓨터 분석에 의해 확인된 부분이 불활성화 분해 부위 부분으로서 기능할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 멀티-프라이머를 사용하여 트롬빈 분해 부위들을 이들 부분들로 유전자 조작시키고, 트롬빈에 의해 분해될 수 있는 그의 능력에 대하여 분석하였다. 각각 원하는 변형(각 프라이머 125ng)을 함유하는 단일 방향성 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 프라이머 풀을 포함하는 50μL 반응액을 SEQ ID NO: 527을 코드화하는 SEQ ID NO: 526을 포함하는 발현 구조물, 또는 dam 메틸라제에 의해 하이퍼메틸화된, SEQ ID NO: 529를 코드화하는 SEQ ID NO: 528을 포함하는 발현 구조물과 같은 BoNT/A를 코드화하는 발현 구조물을 포함하는 DNA 주형과 다른 비율로 혼합하였다. 이 혼합물에 5μL의 10×PCR 버퍼, 1μL의 데옥시리보뉴클레오타이드(dNTP), 1μL의 2.5units/μL PFUULTRATM High Fidelity DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA), Pfu DNA 리가아제, ATP 및 뉴클레아제-유리 물을 50μL의 최종 부피로 첨가하였다. 서모사이클러(thermocycler) 조건은: 96℃에서 1분, 60℃에서 30초 및 68℃에서 20분의 30주기. 서모사이클링후, 1μL의 Dpnl 제한효소(Stratagene, La Jolla, CA)를 반응에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하여, 주형 DNA를 소화시키고, 야생형 클론의 회수를 감소시켰다. 소화된 반응혼합물을 전기천공법에 의해 전자-경쟁적 대장균(E. coli) BL21(DE3) 아셀라(Acella) 세포(Edge BioSystems, Gaithersburg, MD)로 형질전환시키고, 카나마이신 50㎍/㎖를 함유하는 1.5% 루리아-버타니(Luria-Bertani) 아가 플레이트(pH 7.0) 상에 심고, 및 37℃ 인큐베이터에 넣어 밤새 배양하였다. 발현구조물을 함유하는 세균은 카나마이신내성 콜로니로 확인되었다. 알칼리 용해 플라스미드 미니-제조 과정을 사용하여 후보 구조물들을 분리하고, 통합된 돌연변이의 빈도 및 아이덴티티를 측정하기 위해 서열화에 의해 분석하였다. 표 7은 제조된 트롬빈 분해 부위(BoNT/A-TCS)를 포함하는 각 BoNT/A를 나타내며, 본 트롬빈 주사 분석법으로 시험하였다.
표 7. 트롬빈 스캐닝 분석
부위 변형 발현 트롬빈 민감도 BoNT/A 잠재능
Figure pat00062
Figure pat00063
Figure pat00064
각 BoNT/A-TCS에 대한 가용성 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해, 각 BoNT/A-TCS를 포함하는 발현 구조물을 발현시키고, 고정금속 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, SDS-PAGE 분석법으로 분석하였다. 첫째, 96-웰 플레이트를 사용하여, 50㎍/mL 카나마이신을 함유하는 100㎕의 PA-0.5G 배지에 적당한 발현 구조물을 갖는 BL21(DE3) 세포들의 단일 콜로니로 접종하고, 셰이킹하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 이 스타터 배양액으로부터의 5㎕ 표본액을 사용하여, 50㎍/mL 카나마이신을 함유하는 ZYP-5052 1mL를 접종하고, 셰이킹하면서 37℃에서 3.5시간동안, 그후 22℃에서 16시간동안 배양하였다. 10× FASTBREAKTM 세포 분해 제제(Cell Lysis Reagent)(Promega Corp., Madison, WI)를 포함하는 단백질 추출 제제 110㎕ 표본액, 250U/mL 벤조나제 뉴클라제(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) 및 10× 프로테아제 억제제 칵테일(Protease Inhibitor Cocktail) III(EMD Biosciences-Calbiochem, Gibbstown, NJ)를 96-웰 플레이트내 각 1mL 발현 배양액에 첨가했다. 75㎕의 HISLINKTM 수지(Promega Corp., Madison, WI)를 각 웰에 옮긴후, 그 혼합물을 피펫팅 및 900rpm에서 30분간 셰이킹함으로써 교대로 혼합하였다. 25㎛ 공극 크기를 갖고 막을 물로 미리 적신 여과 플레이트(Promega Corp., Madison, WI)에 상기 분해물을 옮기고, 그 액체를 진공 여과에 의해 제거하였다. 100mM HEPES(pH7.5), 10mM 이미다졸을 포함하는 200㎕ 세척 버퍼에 의해 수지를 3회 세척하였다. 100mM HEPES(pH 7.5), 500mM 이미다졸을 포함하는 200㎕ 용출 버퍼를 첨가하고, 5분간 배양함으로써 단백질을 용출하고, 그 용출액을 진공 여과에 의해 96-웰 플레이트에 수집하였다.
SDS-PAGE를 수행하기 위해, 트롬빈 분해 부위를 포함하는 IMAC 정제된 BoNT/A에 같은 부피의 2× Laemmli 샘플 버퍼를 첨가하고, 그 혼합물을 95℃에서 5분간 배양하였다. 15㎕ 표본액을 로딩하고, 변성, 환원조건하에, NUPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris 프리캐스트 폴리아크릴아마이드 겔(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)을 사용하여 MOPS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법에 의해 분리하였다. 겔을 세척하고, 10% 메테인올 및 7% 아세트산에 고정시켰다. 세척용액을 제거하고, 그 겔을 실온에서 밤새 3시간동안 SYPRO Ruby 단백질 겔 염색용액내에서 배양하였다. 염색된 겔은 10% 메테인올 및 7% 아세트산에서 30분간 탈색시켰다. 탈색된 겔을 Fluoro-S-Max 디지털 이미저(Bio-Rad)에 의해 시각화하였다.
발현 분석 결과가 표 7에 개시되어 있다. 일반적으로, SEQ ID NO: 1의 아미노산 462-496, SEQ ID NO: 1의 아미노산 844-863, 또는 아미노산 871-895를 포함하는 불활성화 부분내 삽입된 트롬빈 분해 부위를 갖는 독소가 웰에 발현되었다. 예를 들어, A489insLVPRGS를 포함하는 독소는 야생형 대조군 구조물의 약 50%에서 발현되었으며, D848insLVPRGS 또는 N880insLVPRGS를 포함하는 독소는 대조군 수준 또는 그 부근에서 발현되었다(표 7). 이러한 결과들은 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한 불활성화 분해 부위 부분들이 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 부분들을 변형시키는 것을 견딘다는 것을 보여준다.
확인된 불활성화 분해 부위 부분들이 프로테아제 분해 부위를 이입한 변형을 견딜 수 있는 정도를 추가로 분석하기 위해, 독소를 변형시켜, 트롬빈 분해 부위들을 그 부분을 통해 포함시켰다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 844-863을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분을 조사하기 위해, T884insLVPRGS 또는 L862insLVPRGS를 포함하는 독소를 제조하였다. 이와 유사하게, SEQ ID NO: 1의 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분을 조사하기 위해, E868insLVPRGS, delE868YIKNI-insLVPRGS, delN872IINTS-insLVPRGS, T876insLVPRGS, L879insVPRGS, delE879NLRYE-insLVPRGS, L881insVPRGS, delL881RYESN-insLVPRGS, Y883insLVPRGS, E884insLVPRGS, S885insLVPRGS, delH887LIDLS-insLVPRGS, L888insLVPRGS, L891insVPRG, 및 delS892RYA-insVPRG를 포함하는 독소를 제조하였다. 변형타입이 어떤 영향을 미쳤는지의 여부를 조사하기 위해 삽입 및 치환 변형 모두를 실시했다. 일반적으로 상기 불활성화 부분내 삽입된 트롬빈 분해 부위를 갖는 모든 독소들을 야생형 대조군 구조물의 수준 또는 부근에서 발현시켰다. 이러한 결과들은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내 불활성화 분해 부위 부분이 불활성화 부위 부분내 어디에서 변형이 일어나든 견딜 수 있음을 보여준다.
끝으로, 2개 이상의 프로테아제 분해 부위들의 존재를 견딜 수 있는 불활성화 분해 부위 부분의 능력을 조사하였다(표 7). 이러한 결과들은 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역내 불활성화 분해 부위 부분들이 불활성화 분해 부위내에 2개 이상의 프로테아제 분해 부위들을 둠으로써 변형을 견딜 수 있음을 보여준다.
트롬빈 분해 부위를 포함하는 BoNT/A가 트롬빈에 의해 분해될 수 있는지의 여부를 측정하기 위해, 시험관내(in vitro) 트롬빈 분해분석을 수행하였다. 각 정제된 BoNT/A-TCS 5㎍을 1U의 트롬빈(Novagen)과 함께 23℃에서 1시간, 3시간, 및 18.5시간동안 배양하였다. 제로-효소 대조군도 또한 각 BoNT/A-TCS에 대하여 평행으로 준비하였다. 각 시간지점에서 샘플을 취하고, DTT를 포함하는 SDS-로딩 버퍼에 의해 퀸칭하고, 상기와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
발현분석 결과는 표 7에 개시되어 있다. 일반적으로, 프로테아제 분해 부위를 포함시키기 위해, SEQ ID NO: 1의 아미노산 467-496, 844-863 또는 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분의 변형시킴으로써, 적당한 프로테아제에 의해 단백분해적 분해되기 쉬운 독소가 얻어졌다.
트롬빈 분해 부위를 포함하는 BoNT/A가 그의 잠재능을 유지하는지의 여부를 측정하기 위해, 세포-계 활성 분석법을 사용하여 BoNT/A 활성 분석법을 수행하였다. 세포-계 활성 분석법을 진행하기 위해, 최소필수배지를 함유하는 혈청-유리 배지 1mL, Earle의 염을 갖는 2mM GLUTAMAXTM I, 1×N2 보충액, 0.1mM 비-필수 아미노산, 10mM HEPES 및 25㎍/mL GT1b를 함유하는 24-웰 조직 배양 플레이트에 약 1.2×106 Neuro-2a 또는 SiMa 세포들을 심었다. 세포들이 분화될 때까지 성장지연 및 신경세포 돌기신장과 같은 표준 및 규칙적인 형태학적 기준에 의해 평가되는 바와 같이, 5% 이산화탄소하에 37℃ 인큐베이터에서 세포들을 배양하였다(대략 3일). 각 웰에서 배지를 흡입하고, 1) 독소를 함유하지 않는 신선한 배지(비처리 세포주) 또는 2) 1nM의 BoNT/A 컴플렉스를 함유하는 신선한 배지(처리 세포주)로 치환하였다. 밤새 배양한후, 배지를 흡입하고, 각 웰을 200㎕의 1×PBS로 세정하여 세포들을 세척하였다. 세포들을 수확하기 위해, 1×PBS를 흡입시키고, 2×SDS 로딩 버퍼 50㎕를 첨가하여, 세포들을 용해(lysis)시키고, 용해물을 깨끗한 시험관으로 옮기고, 샘플을 95℃로 5분간 가열하였다.
분해된 SNAP-25 생성물의 존재에 대하여 검출하기 위해, 각 수확된 샘플로부터 표본액을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 이 분석에서, 수확된 샘플의 12㎕ 표본액을 변성, 환원 조건하에, NUPAGE® Novex 12% Bis-Tris 프리캐스트 폴리아크릴아마이드 겔(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)를 사용하여 MOPS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해, 분리하였다. TRANS-BLOT® SD 반-건조 전기영동 트랜스퍼 세포 장치(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 겔로부터 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) 상으로 상기 분리된 펩타이드들을 옮겼다. 트리스-완충 식염수(TBS)(25mM 2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로페인디올 염산(Tris-HCl)(pH 7.4), 137mM 염화나트륨, 2.7mM 염화칼륨), 0.1% TWEEN-20®(폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트), 2% 소혈청 알부민(BSA), 5% 탈지분유를 함유하는 용액에서 실온에서 2시간동안 배양하여, PVDF 막을 블록킹하였다. TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트), 2% BSA, 및 1) 1차 항체로서 α-SNAP-25 마우스 모노클론항체의 1:5,000 희석액(SMI-81; Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD) 또는 2) 1차 항체로서 S9684 α-SNAP-25 토끼 다클론 항혈청의 1:5,000 희석액(Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 5% 탈지분유에서 4℃에서 밤새 상기 블록킹된 막을 배양하였다. α-SNAP-25 마우스 모노클론 및 토끼 다클론 항체들 모두 분해되지 않은 SNAP-25 기질 및 SNAP-25 분해 생성물 모두를 결실시킬 수 있어서, BoNT/A 흡수량을 평가하기 위한 변수로서 BoNT/A 처리후 분해된 SNAP-25의 비율 및 각 세포주내 전반적인 SNAP-25 발현을 평가하게 된다. 1차 항체 프로브 블롯들을 TBS, TWEEN-20®(폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트)에서 각 시간에 15분간 3회 세척하였다. TBS, 0.1% TWEEN-20®(폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트), 2% BSA 및 1) 2차 항체로서 양고추냉이 과산화효소(Zymed, South San Francisco, CA)에 결합된 염소 다클론 항-마우스 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄(IgG, H+L) 항체의 1:10,000 희석액; 또는 2) 2차 항체로서 양고추냉이 과산화효소(Zymed, South San Francisco, CA)에 결합된 염소 다클론 항-토끼 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄(IgG, H+L) 항체의 1:10,000 희석액을 함유하는 5% 탈지분유에서 실온에서 2시간동안 상기 세척된 막들을 배양하였다. TBS, 0.1% TWEEN-20®(폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트)에서 각 시간에 15분간 3회 2차 항체-프로브 블롯들을 세척하였다. ECL PlusTM 웨스턴 블롯 검출 시스템(GE Healthcard, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 사용하여 표적화 SNAP-25 생성물의 신호검출을 시각화하고, Typhoon 9410 가변모드 이미저 및 이미저 분석 소프트웨어(Variable Mode Imager and Imager Analysis software)(GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)에 의해 막을 이미지화하고, 분해율을 정량화하였다. 픽셀 크기(100~200픽셀) 및 PMT 전압 셋팅(350~600, 정상적으로 400)의 선택은 각 블롯에 따라 다르다.
발현분석결과는 표 7에 개시되어 있다. 일반적으로, SEQ ID NO: 1의 아미노산 467-496, 844-863 또는 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분을 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 변형시키면, 전반적인 중독과정을 수행할 수 있는 잠재 독소가 얻어졌다.
취합하면, 이러한 결과들은 8개의 다른 불활성화 분해 부위 부분들이 확인되더라도, 모두 기능적 트롬빈 분해 부위의 삽입을 지지할 수 있는 것은 아님을 보여준다. 일반적으로, SEQ ID NO: 1의 아미노산 467-496, 844-863 및 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분들을 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 변형시키면, 전반적인 중독 과정을 수행할 수 있고 적당한 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 대하여 민감한 안정적으로 생성된 독소가 얻어졌다.
모든 클로스트리듐 독소의 3차원적 구조는 유사하기 때문에, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 및 BuNT에서 대응 위치들은 불활성화 분해 부위 부분들로서 적당하다. 표 5는 이러한 부분들을 보여준다.
실시예 2
프로테아제 분해 부위 분석
본 실시예는 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제조하는 방법을 설명한다.
트롬빈과 다른 프로테아제 분해 부위가 불활성화 부위로서 사용할 수 있는지를 연구하기 위해, 많은 다른 프로테아제 분해 부위들을 포함하는 독소를 시험하였다.
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제조하기 위해, 실시예 1에 설명된 멀티프라이머 돌연변이생성을 사용하여 프로테아제 분해 부위들을 불활성 분해 부위 부분으로 유전자조작하였다. 표 8은 프로테아제 분해 부위를 함유하도록 변형된 발현 구조물들을 개시하고 있다.
프로테아제 분해 부위를 포함하는 BoNT/A가 그의 동종 프로테아제에 의해 분해될 수 있는지의 여부를 측정하기 위해, 트롬빈 대신에 적당한 프로테아제를 사용한 것을 제외하고는, 상기와 같이 시험관내 프로테아제 분해 분석을 수행하였다. 각 시간 지점에서 샘플들을 취하고, DTT를 포함한 SDS-로딩 버퍼에 의해 퀸칭하고, 실시예 1에 설명한 바와 같이, SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
발현분석결과는 표 7에 개시되어 있다. 일반적으로, SEQ ID NO: 1의 아미노산 467-496, 844-863 또는 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분을 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 변형시키면, 적당한 프로테아제에 의해 단백분해적 분해되기 쉬운 독소가 얻어졌다.
표 8. 프로테아제 분해 부위 분석
프로테아제
분해 부위 		부위 변형 프로테아제
민감도 		BoNT/A 잠재능
Figure pat00065
Figure pat00066
Figure pat00067
Figure pat00068
프로테아제 분해 부위를 포함하는 BoNT/A가 그의 잠재능을 유지하는지의 여부를 측정하기 위해, 상기 세포-계 활성 분석을 수행하였다(표 8). 일반적으로, 약 20 이하의 EC50을 나타내는 프로테아제 분해 부위를 포함하는 독소들은 동물-계 분석법을 사용한 적정 평가에 대한 충분한 잠재능을 유지하였다.
실시예 3
생체내 분석
본 실시예는 동물-계 측정 분석을 사용하여 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 평가하는 방법을 설명한다.
세포-계 활성 분석이 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 동종 프로테아제에 의해 분해될 수 있는지의 여부를 평가하는 좋은 평가법이지만, 특정 후보물들은 동물-계 측정에서 평가되기 위해 선택되었다.
동물-계 측정을 사용한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 활성을 시험하기 위해, 생체내 디짓 어브덕션 스코어(Digit Abduction Score(DAS)) 측정을 초기 수행하였다. CD-1 Fe 마우스를 칭량하고, 각 별개의 DAS 측정을 위해 10마리의 동물들의 서브셋으로 넣었다. 하기 기준: 1) 양호한 건강; 2) 0의 건강한 기준선 DAS 반응; 3) 선택된 서브셋에 대하여 수립된 X ±2g의 중간 중량 범위내에 포함; 및 4) 17.0g 이상의 중량에 기초한 특정 서브셋에 마우스를 포함시켰다.
각 마우스의 오른쪽 뒷다리의 비장근에 30-게이지 바늘을 사용하여 1) 불활성화 분해 부위를 포함하는 10.0nM BoNT/A 5㎕(단일-투여량 DAS 연구); 또는 2) 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/A의 7개의 다른 투여량(0.01nM, 0.04nM, 0.12nM, 0.37nM, 1.11nM, 3.33nM, 및 10.0nM; 전량-투여 DAS 연구) 중 하나 5㎕를 주사하였다. 대조군으로서, 왼쪽 뒷다리의 비장근에는 어떤 독소도 함유하지 않는 용액 5㎕를 주사하였다. 처음 4일간 연속해서 DAS 반응에 대하여 마우스를 관찰하였다. 꼬리에 의해 각 마우스를 들어올리고, 주사한 뒷다리를 정확하게 관찰함으로써, DAS를 읽었다. 다리의 디짓 어브덕션 또는 어브덕션 없음은 근육내에 주사된 시험 독소로 인한 중독 효과를 나타낸다. 주사된 뒷다리의 디짓 어브덕션을 비-주사된 뒷다리와 대조하고, 이에 따라 점수를 매겼다. DAS 데이터는 u/Kg 및/또는 ng/Kg의 측면에서 피크 평균 DAS 점수 및 AUC(곡선아래 면적)에 기초하여 ED50 투여량을 계산하여 DAS 데이터를 분석하였다. 이것은 하기와 같이 수행되었다: 1) 각 투여량에 대한 평균 피크 DAS 점수를 각 연구에서 계산하고; 2) 특정 연구에서 5마리 이상이 죽은 투여량은 계산에서 빼고; 3) 주어진 각 연구에 사용된 최고 투여량은 4.0의 평균 피크가 유도된 최저 투여량이며; 4) 주어진 각 연구에 사용된 최저 투여량은 0의 평균 피크가 유도된 최저 투여량이며; 5) 평균 피크 DAS 대 로그(투여량)의 각 개별적인 연구에 대하여 곡선을 그렸고; 6) 일부 연구에서 여러 그룹의 쥐 10마리의 각 그룹에 대하여 AUC 값을 계산하고; 7) 평균 AUC 대 로그(투여량)의 각 개별적인 연구에 대하여 곡선을 그렸고; 8) 각 시험 독소에 대하여; 여러 동일한 연구세트에 대하여 x, y 복제반응 곡선을 그렸고; 9) 하기 식을 사용한 3-변수 지수식(Sigma Plot v 8.0; SPSS Science, Chicago, Illinois)을 사용하여 비선형 퇴보(비-칭량)에 의해 투여량-반응 데이터를 분석하였다:
y = a/(1 + (x/xo)b)
(여기에서, y는 반응이며, a는 점근선 y최대이며, b는 기울기이며, x는 투여량이며, 및 0은 ED50 투여량이다)
피크 ED50 측정치에 대하여, Y최대는 4로 설정되었다(스케일로 최대 DAS 읽음). 평균(피크 및/또는 AUC) ED50 값을 수행된 각 8회-투여량 연구에 대하여 컴퓨팅하였다.
결과를 여기에 나타낸다(표 9). 일반적으로 약 10 이상의 상대 잠재능을 나타내는 불활성화 분해 부위를 포함하는 독소는 그의 안전역의 적정 평가에 충분한 잠재능을 보유하는 것으로 간주되었다.
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 측정하기 위해, 마우스 치사율 측정을 수행하였다.
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 계산하기 위해, 마우스 치사율 측정으로부터 얻은 LD50 값을 전체-투여 DAS 연구에서 얻은 EC50 값으로 나누었다. 불활성화 분해 부위를 포함하는 독소는 약 15 이상의 안전역 값을 나타낸다면 불활성화 분해 부위에서 충분한 활성을 가지는 것으로 간주되었다.
표 9. 동물계 측정 분석
프로테아제 분해 부위
부위
변형
단일-투여 DAS
전체-투여 DAS 치사율 분석 안전역
EC 50 비교 EC 50 비교 LD 50 LD 50 /DAS ED 50
Figure pat00069
Figure pat00070
Figure pat00071
DAS 분석후, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 ED50을 LD50과 대조함으로써 안전역을 측정하기 위해 마우스 치사율 분석법을 사용하여 평가하였다.
본 명세서의 측면들이 개시된 구체예들을 참고로 설명되었지만, 당 분야의 기술자는 특정 실시예들이 본 측면들의 설명들만을 위한 것이며, 및 어떤 방법으로도 본 명세서를 제한하지 않는다는 것을 당업자라면 쉽게 알 것이다. 본 명세서의 정신으로부터 벗어나지 않으면서 여러 변형들이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Steward, Lance E. Ghanshani, Sanjiv Fernandez-Salas, Ester Gilmore, Marcella A. 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Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 450 455 460 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 465 470 475 480 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 485 490 495 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 500 505 510 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 515 520 525 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 530 535 540 Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu 545 550 555 560 His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu 565 570 575 Leu Asn Pro 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Tyr 900 905 910 Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn 915 920 925 Lys Ile Val Asn Ile Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg 930 935 940 Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile 945 950 955 960 Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Arg Ile Asn Gln Lys Leu Val Phe Lys 965 970 975 Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe 980 985 990 Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn 995 1000 1005 Gly His Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile His 1010 1015 1020 Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr Thr Arg 1025 1030 1035 1040 Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu Leu Asp Glu 1045 1050 1055 Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn Thr Asn Ile Leu 1060 1065 1070 Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp Lys Gly Tyr Tyr Leu 1075 1080 1085 Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile Asp Arg Arg Lys Asp Ser 1090 1095 1100 Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg 1105 1110 1115 1120 Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys Ile Gln Arg Val Asn Asp Ser Ser 1125 1130 1135 Thr Asn Asp Arg Phe Val Arg Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Tyr 1140 1145 1150 Ile Ser Asn Ser Ser Ser Tyr Ser Leu Tyr Ala Asp Thr Asn Thr Thr 1155 1160 1165 Asp Lys Glu Lys Thr Ile Lys Ser Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn 1170 1175 1180 Gln Val Val Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe 1185 1190 1195 1200 Lys Asn Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp 1205 1210 1215 Thr Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr 1220 1225 1230 Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly Trp 1235 1240 1245 Gln Glu Lys 1250 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Tyr Gly Gly Phe Leu 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Tyr Gly Gly Phe Met 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Gly Leu 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Phe 1 5 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg Val Gly Arg Pro Glu Trp Trp Met Asp 1 5 10 15 Tyr Gln Lys Arg Tyr Gly 20 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Necturus maculosus <400> 31 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg Val Gly Arg Pro Glu Trp Trp Leu Asp 1 5 10 15 Tyr Gln Lys Arg Tyr Gly 20 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Bombina orientalis <400> 32 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg Val Gly Arg Pro Glu Trp Trp Gln Asp 1 5 10 15 Tyr Gln Lys Arg Tyr Gly 20 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 33 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg Val Gly Arg Pro Glu Trp Trp Glu Asp 1 5 10 15 Tyr Gln Lys Arg Tyr Gly 20 <210> 34 <211> 22 <212> PRT <213> Neoceratodus forsteri <400> 34 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg Val Gly Arg Pro Glu Trp Lys Leu Asp 1 5 10 15 Asn Gln Lys Arg Tyr Gly 20 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 35 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg Val Gly Arg Pro Asp Trp Trp Gln Glu 1 5 10 15 Ser Lys Arg Tyr Gly 20 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Tyr Pro Trp Phe 1 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Tyr Pro Phe Phe 1 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr 1 5 10 15 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Lys Tyr Pro Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr 1 5 10 15 Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 20 25 30 <210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Tyr Gly Gly Phe Met Ser Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr 1 5 10 15 Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala His Lys Lys Gly Gln 20 25 30 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Lys Tyr Pro 1 5 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr 1 5 10 15 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Ile Arg Pro Lys Leu Lys Trp Asp Asn 1 5 10 15 <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Ile Arg Pro Lys Leu Lys 1 5 10 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gly Gly Phe Leu Arg Arg Ile Arg Pro Lys Leu Lys Trp Asp Asn Gln 1 5 10 15 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gly Gly Phe Leu Arg Arg Ile Arg Pro Lys Leu Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 48 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Ile Arg Pro Lys Leu Arg Trp Asp Asn 1 5 10 15 Gln <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 49 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Ile Arg Pro Arg Leu Arg Trp Asp Asn 1 5 10 15 Gln <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Protopterus annectens <400> 50 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg Ile Arg Pro Lys Ile Arg Trp Asp Asn 1 5 10 15 Gln <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 51 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg Ile Arg Pro Lys Leu Arg Trp Asp Asn 1 5 10 15 Gln <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Anguilla rostrata <400> 52 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg Ile Arg Pro Lys Leu Lys Trp Asp Ser 1 5 10 15 Gln <210> 53 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Val Thr Arg Ser Gln 1 5 10 15 Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Ser Gly Glu Leu Phe Asp Ala 20 25 <210> 54 <211> 28 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 54 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Val Thr Arg Ser Gln 1 5 10 15 Glu Asn Pro Asn Thr Tyr Ser Glu Asp Leu Asp Val 20 25 <210> 55 <211> 28 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Val Thr Arg Ser Gln 1 5 10 15 Glu Ser Pro Asn Thr Tyr Ser Glu Asp Leu Asp Val 20 25 <210> 56 <211> 29 <212> PRT <213> Cavia porcellus <400> 56 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Val Thr Arg Ser Gln 1 5 10 15 Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Ser Glu Glu Phe Phe Asp Val 20 25 <210> 57 <211> 29 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 57 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Val Thr Arg Ser Gln 1 5 10 15 Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Val 20 25 <210> 58 <211> 29 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 58 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Val Thr Arg Ser Gln 1 5 10 15 Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Ser Gly Glu Leu Leu Asp Gly 20 25 <210> 59 <211> 29 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 59 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Val Thr Arg Ser Gln 1 5 10 15 Glu Asp Pro Ser Ala Tyr Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Val 20 25 <210> 60 <211> 29 <212> PRT <213> Bufo marinus <400> 60 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Thr Thr Arg Ser Glu 1 5 10 15 Glu Asp Pro Ser Thr Phe Ser Gly Glu Leu Ser Asn Leu 20 25 <210> 61 <211> 29 <212> PRT <213> Bombina orientalis <400> 61 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Thr Thr Arg Ser Glu 1 5 10 15 Glu Glu Pro Gly Ser Phe Ser Gly Glu Ile Ser Asn Leu 20 25 <210> 62 <211> 29 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 62 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Asn Ala Arg Ser Glu 1 5 10 15 Glu Asp Pro Thr Met Phe Ser Asp Glu Leu Ser Tyr Leu 20 25 <210> 63 <211> 29 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 63 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Asn Ala Arg Ser Glu 1 5 10 15 Glu Asp Pro Thr Met Phe Ser Gly Glu Leu Ser Tyr Leu 20 25 <210> 64 <211> 29 <212> PRT <213> Polypterus senegalus <400> 64 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg His Phe Lys Ile Ser Val Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Glu Pro Ser Ser Tyr Ser Asp Glu Val Leu Glu Leu 20 25 <210> 65 <211> 27 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 65 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg His Phe Lys Ile Ser Val Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Glu Pro Ser Ser Tyr Glu Asp Tyr Ala Leu 20 25 <210> 66 <211> 27 <212> PRT <213> Anguilla rostrata <400> 66 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg His Phe Lys Ile Ser Val Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Glu Pro Gly Ser Tyr Asp Val Ile Gly Leu 20 25 <210> 67 <211> 29 <212> PRT <213> Neoceratodus forsteri <400> 67 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg His Phe Lys Ile Thr Val Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Asp Pro Ser Pro Tyr Leu Asp Glu Phe Ser Asp Leu 20 25 <210> 68 <211> 27 <212> PRT <213> Oncorhynchus masou <400> 68 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg His Tyr Lys Leu Ser Val Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Glu Pro Ser Ser Tyr Asp Asp Phe Gly Leu 20 25 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Val Thr 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Bufo marinus <400> 70 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Thr Thr 1 5 10 <210> 71 <211> 13 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 71 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg Gln Phe Lys Val Asn Ala 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Polypterus senegalus <400> 72 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg His Phe Lys Ile Ser Val 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Neoceratodus forsteri <400> 73 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg His Phe Lys Ile Thr Val 1 5 10 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Oncorhynchus masou <400> 74 Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg His Tyr Lys Leu Ser Val 1 5 10 <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn 1 5 10 15 Gln <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Asn 1 5 10 15 Gln <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Tyr Ala Asn 1 5 10 15 Gln <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Tyr Ala 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Tyr 1 5 10 <210> 81 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys 1 5 10 <210> 82 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Met Pro Arg Val Arg Ser Leu Phe Gln Glu Gln Glu Glu Pro Glu Pro 1 5 10 15 Gly Met Glu Glu Ala Gly Glu Met Glu Gln Lys Gln Leu Gln 20 25 30 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Phe Ser Glu Phe Met Arg Gln Tyr Leu Val Leu Ser Met Gln Ser Ser 1 5 10 15 Gln <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Thr Leu His Gln Asn Gly Asn Val 1 5 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe 1 5 10 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe 1 5 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg 1 5 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Leu Val Val Tyr Pro Trp 1 5 <210> 94 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val 1 5 10 15 Gly Asn His Arg Ser Phe Ser Asp Lys Asn Gly Leu Thr Ser 20 25 30 <210> 95 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Glu Leu Arg Pro Glu Asp Asp Met Lys Pro Gly Ser Phe Asp Arg Ser 1 5 10 15 Ile Pro Glu Asn Asn Ile Met Arg Thr Ile Ile Glu Phe Leu Ser Phe 20 25 30 Leu His Leu Lys Glu Ala Gly Ala Leu Asp Arg Leu Leu Asp Leu Pro 35 40 45 Ala Ala Ala Ser Ser Glu Asp Ile Glu Arg Ser 50 55 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met 1 5 10 <210> 97 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met Gly 1 5 10 <210> 98 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met Gly Lys 1 5 10 <210> 99 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met Gly Lys Arg 1 5 10 <210> 100 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Asp Ala Asp Ser Ser Ile Glu Lys Gln Val Ala Leu Leu Lys Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Gly His Gly Gln Ile Ser His Lys Arg His Lys Thr Asp Ser Phe 20 25 30 Val Gly Leu Met 35 <210> 101 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Gly His Gly Gln Ile Ser His Lys Arg His Lys Thr Asp Ser Phe Val 1 5 10 15 Gly Leu Met <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 His Lys Thr Asp Ser Phe Val Gly Leu Met 1 5 10 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 103 Asp Met His Asp Phe Phe Val Gly Leu Met 1 5 10 <210> 104 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Ser Arg Thr Arg Gln Phe Tyr Gly Leu Met 1 5 10 <210> 105 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Gly Lys Ala Ser Gln Phe Phe Gly Leu Met 1 5 10 <210> 106 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Lys Lys Ala Tyr Gln Leu Glu His Thr Phe Gln Gly Leu Leu 1 5 10 <210> 107 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Val Gly Ala Tyr Gln Leu Glu His Thr Phe Gln Gly Leu Leu 1 5 10 <210> 108 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp 1 5 10 15 Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 109 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 110 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln 1 5 10 15 Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg 20 25 30 Tyr <210> 111 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln 1 5 10 15 Met Ala Gln Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr 20 25 30 Arg Pro Arg Tyr 35 <210> 112 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 His Lys Glu Asp Thr Leu Ala Phe Ser Glu Trp Gly Ser Pro His Ala 1 5 10 15 Ala Val Pro Arg 20 <210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Thrombin cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is S, T, an amidic amino acid like N and Q, a positive amino acid like H, K, and R, an aromatic hydrophobic amino acid like F, W, and Y, an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2, 6, 7, 8 <223> Position 1, 6, 7, and 8, are independently any amino acid <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is F, S, T, an amidic amino acid like N or Q, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is S, T, a positive amino acid like H, K, and R, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <400> 113 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 114 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 114 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 115 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 115 Leu Val Pro Lys Gly Ser 1 5 <210> 116 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 116 Phe Ile Pro Arg Thr Phe 1 5 <210> 117 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 117 Val Leu Pro Arg Ser Phe 1 5 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 118 Ile Val Pro Arg Ser Phe 1 5 <210> 119 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 119 Ile Val Pro Arg Gly Tyr 1 5 <210> 120 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 120 Val Val Pro Arg Gly Val 1 5 <210> 121 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 121 Val Leu Pro Arg Leu Ile 1 5 <210> 122 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 122 Val Met Pro Arg Ser Leu 1 5 <210> 123 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 123 Met Phe Pro Arg Ser Leu 1 5 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Coagulation Factor VIIa cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like N and Q, a basic amino acid like K and R, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is Q, S, T, an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is Q, S, T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <221> VARIANT <222> 5, 6, 7 8 <223> Position 5, 6, 7, and 8 are independently any amino acid <400> 124 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 125 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VIIa cleavage site <400> 125 Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val 1 5 <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VIIa cleavage site <400> 126 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly 1 5 <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VIIa cleavage site <400> 127 Leu Ser Pro Arg Thr Phe His Pro 1 5 <210> 128 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VIIa cleavage site <400> 128 Leu Ile Gln Arg Asn Leu Ser Pro 1 5 <210> 129 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VIIa cleavage site <400> 129 Met Ala Thr Arg Lys Met His Asp 1 5 <210> 130 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VIIa cleavage site <400> 130 Leu Gly Ile Arg Ser Phe Arg Asn 1 5 <210> 131 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VIIa cleavage site <400> 131 Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 132 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VIIa cleavage site <400> 132 Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor VIIa cleavage site <400> 133 Gln Val Val Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 134 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consenus sequence for Coagulation Factor IXa cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like N and Q, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like N and Q, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is, S, T, an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <221> VARIANT <222> 5, 6, 7, 8 <223> Positions 5, 6, 7, and 8 are independently any amino acid <400> 134 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 135 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor IXa cleavage site <400> 135 Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor IXa cleavage site <400> 136 Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn 1 5 <210> 137 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor IXa cleavage site <400> 137 Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 138 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor IXa cleavage site <400> 138 Gln Val Val Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 139 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Coagulation Factor Xa cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 6, 7, 8 <223> Positions 1, 6, 7, and 8 are independantly any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is G, A, S, an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like Q and N, or an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is an amidic amino acid like N and Q, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <400> 139 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 140 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 140 Ile Asp Gly Arg 1 <210> 141 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 141 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 142 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 142 Ile Asp Gly Arg Ser Val Gly Gly 1 5 <210> 143 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 143 Ile Asp Gly Arg Thr Val Gly Gly 1 5 <210> 144 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 144 Ile Asp Gly Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 145 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 145 Ile Glu Gly Arg Ser Val Gly Gly 1 5 <210> 146 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 146 Ile Glu Gly Arg Thr Val Gly Gly 1 5 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 147 Ile Glu Gly Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 148 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 148 Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 149 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 149 Ile Glu Gly Arg Thr Ser Glu Asp 1 5 <210> 150 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 150 Ile Glu Gly Arg Ile Val Glu Gly 1 5 <210> 151 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 151 Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly 1 5 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 152 Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser 1 5 <210> 153 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 153 Phe Asp Glu Arg Thr Phe Gly Leu 1 5 <210> 154 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 154 Ile Asp Glu Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 155 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor Xa cleavage site <400> 155 Phe Asn Glu Lys Thr Phe Gly Leu 1 5 <210> 156 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Coagulation Factor XIa cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is an acidic amino acid like D or E, a basic amino acid like K and R, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is an acidic amino acid like D or E, an amidic amino acid like Q and N, a basic amino acid like K and R, an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is H, an uncharged amino acid like C, S, and T, an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <221> VARIANT <222> 5, 8 <223> Positions 5 and 6 are independantly H, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> (6)...(6) <223> Position 6 is an acidic amino acid like D and E, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Position 7 is an amidic amino acid like Q and N, an uncharged amino acid like C, S, and T, an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <400> 156 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 157 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 157 Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala Ser 1 5 <210> 158 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 158 Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val 1 5 <210> 159 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 159 Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Ile 1 5 <210> 160 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 160 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly 1 5 <210> 161 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 161 Glu Phe Ser Arg Val Val Gly Gly 1 5 <210> 162 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 162 Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val 1 5 <210> 163 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 163 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly 1 5 <210> 164 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 164 Ile Lys Pro Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 165 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 165 Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp 1 5 <210> 166 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIa cleavage site <400> 166 Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly 1 5 <210> 167 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Coagulation Factor XIIa cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 6 <223> Positions 1 and 6 are independantly an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is an acidic amino acid like D and E, a basic amino acid like K and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is a basic amino acid like K and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <221> VARIANT <222> 5, 7, 8 <223> Positions 5, 7 and 8 are independantly an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <400> 167 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 168 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIIa cleavage site <400> 168 Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 169 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIIa cleavage site <400> 169 Ile Lys Pro Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 170 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIIa cleavage site <400> 170 Ser Met Thr Arg Val Val Gly Gly 1 5 <210> 171 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIIa cleavage site <400> 171 Thr Ser Thr Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 172 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coagulation Factor XIIa cleavage site <400> 172 Pro Met Lys Arg Leu Thr Leu Gly 1 5 <210> 173 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Kallikrein 1 cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like Q and N, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2, 3, 6, 7, 8 <223> Positions 2, 3, 6, 7 and 8 are independently any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is a positive amino acid like H, K, and R, a large non-polar amino acid like F, I, L, M and V, or an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is S, K, or R <400> 173 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 174 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 174 Ser Met Thr Arg Val Val Gly Gly 1 5 <210> 175 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 175 Ser Pro Phe Arg Ser Ser Asp Ile 1 5 <210> 176 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 176 Ser Leu Met Lys Arg Pro Pro Gly 1 5 <210> 177 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 177 Tyr Asp Trp Arg Thr Pro Tyr Leu 1 5 <210> 178 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 178 Ser Pro Phe Arg Ser Val Gln Val 1 5 <210> 179 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 179 Ser Pro Phe Arg Thr Pro Tyr Leu 1 5 <210> 180 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 180 Thr Phe His Lys Ala Glu Tyr Arg 1 5 <210> 181 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 181 Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly 1 5 <210> 182 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 182 Ile Ser Leu Met Lys Arg Pro Pro 1 5 <210> 183 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 183 Leu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr His 1 5 <210> 184 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 184 Glu Ala Lys Arg Ser Tyr His Ser 1 5 <210> 185 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 185 Pro Asn Arg Trp Ser Thr Gly Ala 1 5 <210> 186 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 186 Glu Ala Phe Tyr Ser Gln Phe Gly 1 5 <210> 187 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 187 Asn Ala Ala Arg Ser Thr Gly Ala 1 5 <210> 188 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 188 Ser Ser Glu Trp Ser Met Pro Tyr 1 5 <210> 189 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 189 Gly Thr Leu Phe Arg Ser Gly Asn 1 5 <210> 190 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 190 Ala Arg Leu Tyr Ser Arg Gly Ala 1 5 <210> 191 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 191 Glu Ala Ser Arg Ser Ala Thr Leu 1 5 <210> 192 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 192 Glu Ala Ser Tyr Arg Arg Lys Gln 1 5 <210> 193 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 193 Thr Thr Phe Tyr Arg Arg Gly Ala 1 5 <210> 194 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 194 Ala Ala Trp Tyr Arg Thr Ser Arg 1 5 <210> 195 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 195 Ser Phe His Tyr Arg Met Val Gly 1 5 <210> 196 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 196 Ala Ser Ser Tyr Arg Thr Ser Arg 1 5 <210> 197 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 197 Thr Arg Phe Tyr Ser Arg Gly Arg 1 5 <210> 198 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kallikrein 1 cleavage site <400> 198 Ile Lys Phe Phe Ser Ala Gln Thr 1 5 <210> 199 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Protein C cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is a basic amino acid like K and R, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like Q and N, a basic amino acid like K and R, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3, 5 <223> Positions 3 and 5 is an amidic amino acid like Q and N, a basic amino acid like K and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <221> VARIANT <222> 6 <223> Position 6 is an amidic amino acid like Q and N, a basic amino acid like K and R, an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Position 7 is an amidic amino acid like Q and N, a positive amino acid like H, K, and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aromatic hydrophobic amino acid like F, W and Y <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Position 8 is an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like Q and N, a basic amino acid like K and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <400> 199 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 200 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 200 Lys Lys Thr Arg Asn Leu Lys Lys 1 5 <210> 201 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 201 Leu Asp Arg Arg Gly Leu Gln Arg 1 5 <210> 202 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 202 Met Ala Thr Arg Lys Met His Asp 1 5 <210> 203 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 203 Arg Leu Lys Lys Ser Gln Phe Leu 1 5 <210> 204 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 204 Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn 1 5 <210> 205 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 205 Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile 1 5 <210> 206 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 206 Ile Glu Pro Arg Ser Pro Ser Gln 1 5 <210> 207 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 207 Lys Lys Thr Arg Ser Pro Lys Thr 1 5 <210> 208 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 208 Leu Asp Gln Arg Gly Val Gln Arg 1 5 <210> 209 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein C cleavage site <400> 209 Pro Asp Pro Arg Ser Lys Asn Asn 1 5 <210> 210 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Plasminogen cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 5, 6 <223> Positions 1, 5, and 6 are independantly a positive amino acid like H, K and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 3 is an amidic amino acid like N and Q, a positive amino acid like H, K and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is an amidic amino acid like N and Q, an uncharged amino acid like C, S, and T, an aromatic amino acid like F, W and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <221> VARIANT <222> 7 <223> Position 7 is any amino acid <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Position 8 is H, F, Y, R, an uncharged amino acid like C, S, and T, an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <400> 210 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 211 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 211 Gly Glu Ala Arg Gly Ser Val Ile 1 5 <210> 212 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 212 Gly His Ala Arg Leu Val His Val 1 5 <210> 213 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 213 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly 1 5 <210> 214 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 214 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 215 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 215 Gly Ser Asn Lys Gly Ala Leu Leu 1 5 <210> 216 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 216 Arg Ala Gln Arg Ser Ala Gly Ala 1 5 <210> 217 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 217 Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala Ser 1 5 <210> 218 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 218 Met Ser Met Arg Val Arg Arg His 1 5 <210> 219 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 219 Arg Gly Val Arg Arg Thr Ala Ser 1 5 <210> 220 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 220 Arg Ala Ala Arg Ser Gln Cys Thr 1 5 <210> 221 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 221 Pro Gln Ser Arg Ser Val Pro Pro 1 5 <210> 222 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 222 Pro Tyr Leu Lys Val Phe Asn Pro 1 5 <210> 223 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 223 Leu Ser Phe Arg Ala Arg Ala Tyr 1 5 <210> 224 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 224 Pro Gln Leu Arg Arg Gly Trp Arg 1 5 <210> 225 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 225 Glu Asp Asn Arg Asp Ser Ser Met 1 5 <210> 226 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 226 Leu Ser Phe Arg Ala Arg Ala Tyr 1 5 <210> 227 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 227 Phe Arg Ala Arg Ala Tyr Gly Phe 1 5 <210> 228 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 228 Tyr Gly Phe Arg Gly Pro Gly Pro 1 5 <210> 229 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 229 Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala 1 5 <210> 230 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 230 Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser 1 5 <210> 231 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 231 Pro Arg Leu Lys Ala Arg Ala Gly 1 5 <210> 232 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 232 Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro 1 5 <210> 233 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 233 Pro Ser His Lys Glu Gly Pro Gln 1 5 <210> 234 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 234 Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr Leu 1 5 <210> 235 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 235 Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser 1 5 <210> 236 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 236 Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly 1 5 <210> 237 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 237 Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly 1 5 <210> 238 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 238 Pro Arg Cys Arg His Arg Pro His 1 5 <210> 239 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 239 Lys Gly Tyr Arg Ser Gln Arg Gly 1 5 <210> 240 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasminogen cleavage site <400> 240 Asp Val Ala Gln Phe Val Leu Thr 1 5 <210> 241 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for MMP-2 cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 3, 4, 6, 7, 8 <223> Positions 1, 3, 4, 6, 7, 8 are independantly any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is P, A, V, L, or I <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is V, L, I, F, or Q <400> 241 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 242 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 242 Gln Pro Val Ser Val Lys Val Gly 1 5 <210> 243 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 243 Arg Gly Val Gly Ile Lys Ser Thr 1 5 <210> 244 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 244 Phe Val Asp Cys Leu Ile Glu Gln 1 5 <210> 245 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 245 Val Pro Ala Gly Asn Trp Val Leu 1 5 <210> 246 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 246 Tyr His Ala Asp Ile Tyr Asp Lys 1 5 <210> 247 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 247 Arg Ala Cys Arg Leu Ala Lys Ala 1 5 <210> 248 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 248 Gln Gly Ala Tyr Gln Glu Ala Phe 1 5 <210> 249 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 249 Asp Val Leu Ser Leu Leu Glu Lys 1 5 <210> 250 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 250 Thr Leu Asp Asp Leu Ile Met Ala 1 5 <210> 251 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 251 His Ile Ser Ser Leu Ile Lys Leu 1 5 <210> 252 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 252 Asp Pro Asn Asn Leu Leu Asn Asp 1 5 <210> 253 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 253 Pro Val Gln Pro Gln Gln Ser Pro 1 5 <210> 254 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 254 Lys Pro Lys Thr Ile Thr Gly Pro 1 5 <210> 255 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 255 Val Val His Pro Leu Val Leu Leu 1 5 <210> 256 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 256 His Pro Leu Val Leu Leu Ser Val 1 5 <210> 257 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 257 Ala Val Ala Leu Leu Ile Gly Pro 1 5 <210> 258 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 258 Gln Pro Leu Gln Leu Leu Asp Ala 1 5 <210> 259 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 259 Tyr Ile Gln Gly Ile Asn Leu Val 1 5 <210> 260 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 260 Leu Pro Gln Glu Ile Lys Ala Asn 1 5 <210> 261 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 261 Asn Ile Ser Asp Leu Thr Ala Ala 1 5 <210> 262 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 262 Lys Pro Arg Ala Leu Thr Ala Leu 1 5 <210> 263 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 263 Ala Pro Ser Trp Leu Leu Thr Ala 1 5 <210> 264 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 264 Ala Val Arg Trp Leu Leu Thr Ala 1 5 <210> 265 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 265 Ala Val Ser Trp Leu Leu Thr Ala 1 5 <210> 266 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 266 Ser Leu Arg Arg Leu Thr Ala Ala 1 5 <210> 267 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 267 Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ala Leu 1 5 <210> 268 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 268 Arg Tyr Ser Ser Leu Thr Ala Ala 1 5 <210> 269 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 269 Ser Leu Ala Tyr Tyr Thr Ala Leu 1 5 <210> 270 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 270 Ser Leu Arg Tyr Tyr Thr Ala Ala 1 5 <210> 271 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 271 Ser Pro Ala Tyr Tyr Thr Ala Leu 1 5 <210> 272 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 272 Met His Lys Ala Leu Thr Ala Ala 1 5 <210> 273 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 cleavage site <400> 273 Leu Arg Leu Ala Ile Thr Ala Leu 1 5 <210> 274 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for MMP-9 cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is F, an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like N and Q, a positive amino acid like H, K, and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is F, Y, S, T, an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like N and Q, a positive amino acid like H, K, and R, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3, 8 <223> Positions 3 and 8 are independantly F, Y, an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like N and Q, a positive amino acid like H, K, and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Positions 4, 6 and 7 are independantly any amino acid <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is S, T, an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like N and Q, a positive amino acid like H, K, and R, an aromatic hydrophobic amino acid like F, W, and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <400> 274 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 275 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 275 Ile Pro Glu Asn Phe Phe Gly Val 1 5 <210> 276 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 276 Met Asp Ile Ala Ile His His Pro 1 5 <210> 277 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 277 Ser Pro Ser Arg Leu Phe Asp Gln 1 5 <210> 278 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 278 Ser Glu Met Arg Leu Glu Lys Asp 1 5 <210> 279 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 279 Phe Ser Val Asn Leu Asp Val Lys 1 5 <210> 280 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 280 Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly 1 5 <210> 281 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 281 Phe Phe Gly Glu His Leu Leu Glu 1 5 <210> 282 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 282 Gly Leu Ser Glu Met Arg Leu Glu 1 5 <210> 283 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 283 Ser Pro Glu Glu Leu Lys Val Lys 1 5 <210> 284 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 284 Asp Val Ile Glu Val His Gly Lys 1 5 <210> 285 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 285 Glu Val His Gly Lys His Glu Glu 1 5 <210> 286 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 286 Asp Glu His Gly Phe Ile Ser Arg 1 5 <210> 287 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 287 Gly Glu His Leu Leu Glu Ser Asp 1 5 <210> 288 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 288 Phe His Arg Lys Tyr Arg Ile Pro 1 5 <210> 289 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 289 Gly Pro Arg Lys Gln Val Ser Gly 1 5 <210> 290 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 290 Leu Ser Pro Phe Tyr Leu Arg Pro 1 5 <210> 291 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 291 Pro Pro Ser Phe Leu Arg Ala Pro 1 5 <210> 292 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 292 Asn Pro Leu Glu Asn Ser Gly Phe 1 5 <210> 293 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 293 Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro 1 5 <210> 294 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 294 Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser 1 5 <210> 295 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 295 Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly 1 5 <210> 296 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 296 Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala 1 5 <210> 297 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 297 Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val 1 5 <210> 298 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 298 Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly 1 5 <210> 299 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 299 Ser Asp Leu Gly Leu Thr Gly Ile 1 5 <210> 300 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 300 Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro 1 5 <210> 301 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 301 Gly Ala Ala Gly Val Lys Gly Asp 1 5 <210> 302 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 302 Gly Pro Thr Gly Lys Gln Gly Asp 1 5 <210> 303 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 303 Gly Pro Ser Gly Asp Gln Gly Ala 1 5 <210> 304 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 304 Gly Pro Ser Gly Phe Pro Phe Pro 1 5 <210> 305 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 305 Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Pro 1 5 <210> 306 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 306 Gly Ala Pro Gly Asn Arg Gly Phe 1 5 <210> 307 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 307 Gly Leu Arg Gly Glu Arg Gly Glu 1 5 <210> 308 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 308 Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Asn 1 5 <210> 309 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 309 Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala 1 5 <210> 310 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 310 Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Thr 1 5 <210> 311 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 311 Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser 1 5 <210> 312 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 312 Gly Ser Pro Gly Tyr Gln Gly Pro 1 5 <210> 313 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 313 Gly Pro Val Ser Ala Val Leu Thr 1 5 <210> 314 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 314 Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln 1 5 <210> 315 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 315 Gly Pro Leu Gly Met Trp Ala Gln 1 5 <210> 316 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 316 Gly Pro Gln Gly Ile Phe Gly Gln 1 5 <210> 317 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 317 Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu 1 5 <210> 318 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 318 Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe Gly 1 5 <210> 319 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-9 cleavage site <400> 319 Arg Ala Ile His Ile Asn Ala Glu 1 5 <210> 320 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Furin cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is R, I, or A <221> VARIANT <222> 2, 5, 6, 7, 8 <223> Positions 2, 5, 6, 7, and 8 are independantly any amino acid <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is R, K, A, or P <221> VARIANT <222> (0)...(0) <400> 320 Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 321 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 321 Arg Pro Arg Arg Ala Lys Arg Phe 1 5 <210> 322 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 322 Arg Lys Lys Arg Gly Leu Tyr Ala 1 5 <210> 323 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 323 Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 324 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 324 Arg Lys Lys Arg Gly Leu Tyr Ala 1 5 <210> 325 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 325 Arg Lys Lys Arg Thr Thr Ser Ala 1 5 <210> 326 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 326 Arg His Lys Arg Glu Thr Leu Lys 1 5 <210> 327 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 327 Arg Leu Lys Arg Asp Val Val Thr 1 5 <210> 328 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 328 Arg Met Lys Arg Glu Asp Leu Asn 1 5 <210> 329 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 329 Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu 1 5 <210> 330 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 330 Arg Lys Lys Arg Phe Val Ser Ser 1 5 <210> 331 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 331 Arg Thr Lys Arg Phe Leu Ser Tyr 1 5 <210> 332 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 332 Arg Arg Ala Arg Ser Val Asp Gly 1 5 <210> 333 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 333 Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys 1 5 <210> 334 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 334 Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys 1 5 <210> 335 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 335 Arg Val Ala Arg Asp Ile Thr Met 1 5 <210> 336 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 336 Arg Ile Ser Arg Ser Leu Pro Gln 1 5 <210> 337 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 337 Arg Ser Arg Arg Ala Ala Thr Ser 1 5 <210> 338 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 338 Arg Ala Lys Arg Ser Pro Lys His 1 5 <210> 339 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 339 Phe Trp His Arg Gly Val Thr Lys 1 5 <210> 340 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 340 Ala Lys Arg Arg Thr Lys Arg Asp 1 5 <210> 341 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 341 Ala Lys Arg Arg Ala Lys Arg Asp 1 5 <210> 342 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 342 Ala Lys Gln Arg Ala Lys Arg Asp 1 5 <210> 343 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 343 Arg Asp Val Arg Gly Phe Ala Ser 1 5 <210> 344 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 344 Arg Lys Arg Arg Ser Val Asn Pro 1 5 <210> 345 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 345 Arg Gln Lys Arg Phe Val Leu Ser 1 5 <210> 346 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 346 Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys 1 5 <210> 347 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for u-PA cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 5, 8 <223> Positions 1, 5, and 8 are independantly any amino acid <221> VARIANT <222> 2, 7 <223> Positions 2 and 7 are independantly an uncharged amino acid like C, S, and T, an aromatic amino acid like F, W, and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is an amidic amino acid like N and Q, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <221> VARIANT <222> 6 <223> Position 6 is a basic amino acid like K and R, an aromatic amino acid like F, W, and Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <400> 347 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 348 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 348 Gly Ser Gly Lys Ser Ala Thr Leu 1 5 <210> 349 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 349 Gln Arg Gly Arg Ser Ala Thr Leu 1 5 <210> 350 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 350 Arg Gly Ser Val Ile Leu Thr Val 1 5 <210> 351 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 351 Pro Ser Ser Arg Arg Arg Val Asn 1 5 <210> 352 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 352 Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly 1 5 <210> 353 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 353 Pro Gly Ala Arg Gly Arg Ala Phe 1 5 <210> 354 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 354 Ser Ser Ser Arg Gly Pro Thr His 1 5 <210> 355 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 355 Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn 1 5 <210> 356 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 356 Asn Ser Gly Arg Ala Val Thr Tyr 1 5 <210> 357 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 357 Thr Tyr Ser Arg Ser Arg Tyr Leu 1 5 <210> 358 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 358 Asn Ser Gly Arg Ala Val Thr Tyr 1 5 <210> 359 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 359 Pro Ser Gly Arg Gly Arg Thr Leu 1 5 <210> 360 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 360 Ala Gly Ser Arg Ala Val Tyr Tyr 1 5 <210> 361 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 361 Thr Tyr Gly Arg Ser Arg Thr Asn 1 5 <210> 362 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 362 Asn Ser Ser Arg Gly Val Tyr Leu 1 5 <210> 363 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 363 Pro Ser Ser Arg Ser Val Tyr Asn 1 5 <210> 364 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 364 Ala Ser Gly Arg Gly Arg Thr Tyr 1 5 <210> 365 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 365 Thr Ser Ser Arg Ala Val Tyr Leu 1 5 <210> 366 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 366 Asn Ser Gly Arg Ser Arg Thr Leu 1 5 <210> 367 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 367 Val Ser Gly Arg Ile Arg Thr Gly 1 5 <210> 368 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> u-PA cleavage site <400> 368 Ser Ser Gly Arg Ile Arg Thr Val 1 5 <210> 369 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for t-PA cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 <223> Positions 1, 2, 3, 5, 6, 7, and 8 are independantly any amino acid <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <400> 369 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 370 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> t-PA cleavage site <400> 370 Asn Ala Leu Arg Tyr Ala Pro Asp 1 5 <210> 371 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> t-PA cleavage site <400> 371 Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly 1 5 <210> 372 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> t-PA cleavage site <400> 372 Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly 1 5 <210> 373 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> t-PA cleavage site <400> 373 Ala Leu Ser Arg Met Ala Val Leu 1 5 <210> 374 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Tryptase-epsilon cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is K or R <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5 <223> Positions 2, 3, 4, and 5 are independantly an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 6 <223> Position 6 is D or E <400> 374 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 375 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 375 Arg Val Val Gly Gly Glu 1 5 <210> 376 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 376 Arg Ile Val Gly Gly Glu 1 5 <210> 377 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 377 Arg Ile Ile Gly Gly Glu 1 5 <210> 378 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 378 Arg Val Val Gly Gly Asp 1 5 <210> 379 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 379 Arg Ile Val Gly Gly Asp 1 5 <210> 380 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 380 Arg Ile Ile Gly Gly Asp 1 5 <210> 381 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 381 Lys Val Val Gly Gly Glu 1 5 <210> 382 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 382 Lys Ile Val Gly Gly Glu 1 5 <210> 383 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 383 Lys Ile Ile Gly Gly Glu 1 5 <210> 384 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 384 Lys Val Val Gly Gly Asp 1 5 <210> 385 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 385 Lys Ile Val Gly Gly Asp 1 5 <210> 386 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptase-epsilon cleavage site <400> 386 Lys Ile Ile Gly Gly Asp 1 5 <210> 387 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for mMCP-7 cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 5, 6, 7, 8 <223> Positions 1, 5, 6, 7, and 8 are independently any amino acid <221> VARIANT <222> 2 <223> Potition 2 is an amidic amino acid like N or Q, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is K or R <400> 387 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 388 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mMCP-7 cleavage site <400> 388 Leu Ser Ser Arg Gln Ser Pro Gly 1 5 <210> 389 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mMCP-7 cleavage site <400> 389 Leu Gln Ala Arg Gly Ala Ser Leu 1 5 <210> 390 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mMCP-7 cleavage site <400> 390 Leu Gly Pro Lys Ala Ile Thr Met 1 5 <210> 391 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mMCP-7 cleavage site <400> 391 Leu Gly Pro Arg Ser Ala Val Tyr 1 5 <210> 392 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for ECE-1 cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 <223> Positions 1, 2, 3, 4, 6, 7, and 8 are independantly any amino acid <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is F, L, I, V, or Y <400> 392 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 393 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 393 His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala 1 5 <210> 394 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 394 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 1 5 <210> 395 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 395 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp 1 5 <210> 396 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 396 Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe 1 5 <210> 397 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 397 Tyr Ile His Pro Phe His Leu Val 1 5 <210> 398 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 398 Tyr Gly Leu Gly Ser Pro Arg Ser 1 5 <210> 399 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 399 Thr Pro Glu His Val Val Pro Tyr 1 5 <210> 400 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 400 Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro 1 5 <210> 401 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 401 Asp Ile Ile Trp Ile Asn Thr Pro 1 5 <210> 402 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 402 Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Val 1 5 <210> 403 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 403 His Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn 1 5 <210> 404 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 404 Cys Val Tyr Phe Cys His Leu Asp 1 5 <210> 405 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 405 Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys 1 5 <210> 406 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 406 Glu Cys Val Tyr Phe Cys His Leu 1 5 <210> 407 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 407 Arg Ser Lys Arg Cys Ser Cys Ser 1 5 <210> 408 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 408 Arg Ser Lys Arg Ala Leu Glu Asn 1 5 <210> 409 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 409 Gly Phe Ser Pro Phe Arg Ser Ser 1 5 <210> 410 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 410 Pro Arg Arg Pro Tyr Ile Leu Pro 1 5 <210> 411 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 411 Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu 1 5 <210> 412 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ECE-1 cleavage site <400> 412 Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met 1 5 <210> 413 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for KBGP cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is an acidic amino acid like D and E <221> VARIANT <222> 2, 5 <223> Positions 2 and 5 are independantly T or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 3, 8 <223> Positions 3 and 8 are independantly an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is an aromatic amino acid like F, W <221> VARIANT <222> 6 <223> Position 6 is an amidic amino acid like N and Q <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Position 7 is an uncharged amino acid like C, S, and T, or a C-beta branched amino acid like I, V, or T <400> 413 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 414 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KBGP cleavage site <400> 414 Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro 1 5 <210> 415 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KBGP cleavage site <400> 415 Asp Ile Ile Trp Ile Asn Thr Pro 1 5 <210> 416 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Cathepsin L cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is W, an acidic amino acid like D and E, an amidic amino acid like N and Q, a positive amino acid like H, K, and R, an uncharged amino acid like C, S, and T, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 2, 4, 5, 6, 7, 8 <223> Positions 2, 4, 5, 6, 7, 8 are independantly any amino acid <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is L, V, F or Y <400> 416 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 417 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 417 Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met 1 5 <210> 418 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 418 Lys Val Phe Gln Glu Pro Leu Phe 1 5 <210> 419 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 419 Ala Thr Leu Thr Phe Asp His Ser 1 5 <210> 420 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 420 Pro Leu Phe Tyr Glu Ala Pro Arg 1 5 <210> 421 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 421 Thr Gly Leu Arg Asp Pro Phe Asn 1 5 <210> 422 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 422 Lys Ile Leu His Leu Pro Thr Ser 1 5 <210> 423 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 423 Ala His Leu Lys Asn Ser Gln Glu 1 5 <210> 424 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 424 Ala Pro Leu Thr Ala Glu Ile Gln 1 5 <210> 425 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 425 Glu Ala Leu Phe Ala Glu Arg Lys 1 5 <210> 426 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 426 Glu Pro Leu Ala Ala Glu Arg Lys 1 5 <210> 427 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 427 Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser 1 5 <210> 428 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 428 Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala 1 5 <210> 429 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 429 Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met 1 5 <210> 430 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 430 Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala 1 5 <210> 431 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 431 Ser Thr Phe Glu Glu Arg Ser Tyr 1 5 <210> 432 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 432 Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr Gln 1 5 <210> 433 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 433 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 1 5 <210> 434 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 434 Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala 1 5 <210> 435 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 435 His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr 1 5 <210> 436 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 436 Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe 1 5 <210> 437 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 437 Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro 1 5 <210> 438 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 438 Asn Met Leu Lys Arg Gly Leu Pro 1 5 <210> 439 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 439 Leu Ser Leu Ala His Thr His Gln 1 5 <210> 440 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 440 Thr Pro Phe Ala Ala Thr Ser Ser 1 5 <210> 441 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 441 Lys Leu Leu Ala Val Ser Gly Pro 1 5 <210> 442 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 442 Gln Leu Phe Arg Arg Ala Val Leu 1 5 <210> 443 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L cleavage site <400> 443 Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly 1 5 <210> 444 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for PAR1 cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is a small non-polar amino acid like A, C G, S, and T <221> VARIANT <222> 2, 3 <223> Positions 2 and 3 are independantly a large non-polar amino acid like F, I, L, M, V, or an aromatic amino acid like F, H, W, or Y <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is K or R <221> VARIANT <222> 6 <223> Position 6 is an amidic amino acid like N and Q, or an aromatic hydrophobic amino acid like F, W, or Y <400> 444 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 445 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR1 cleavage site <400> 445 Ser Phe Leu Leu Arg Asn 1 5 <210> 446 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR1 cleavage site <400> 446 Ser Phe Phe Leu Arg Asn 1 5 <210> 447 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR1 cleavage site <400> 447 Ser Phe Phe Leu Lys Asn 1 5 <210> 448 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR1 cleavage site <400> 448 Thr Phe Leu Leu Arg Asn 1 5 <210> 449 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR1 cleavage site <400> 449 Gly Phe Pro Gly Lys Phe 1 5 <210> 450 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR1 cleavage site <400> 450 Gly Tyr Pro Ala Lys Phe 1 5 <210> 451 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR1 cleavage site <400> 451 Gly Tyr Pro Leu Lys Phe 1 5 <210> 452 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR1 cleavage site <400> 452 Gly Tyr Pro Ile Lys Phe 1 5 <210> 453 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for PAR2 cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is a small non-polar amino acid like A, C G, S, and T <221> VARIANT <222> 2, 3, 6 <223> Positions 2, 3, and 6 are independantly a large non-polar amino acid like F, I, L, M, V <221> VARIANT <222> 4 <223> Position 4 is an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is K or R <400> 453 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 454 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR2 cleavage site <400> 454 Ser Leu Ile Gly Lys Val 1 5 <210> 455 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR2 cleavage site <400> 455 Ser Leu Ile Gly Arg Leu 1 5 <210> 456 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for PAR3 cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 4 <223> Positions 1 and 4 are independantly a small non-polar amino acid like A, C G, S, and T <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is a large non-polar amino acid like F, I, L, M, V <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is an amidic amino acid like N and Q, or a basic amino acid like K and R <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is a small non-polar amino acid like A, C G, S, and T, or a small polar amino acid like D, N, or P <221> VARIANT <222> 6 <223> Position 6 is an acidic amino acid like D and E, or a small polar amino acid like D, N, or P <400> 456 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 457 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR3 cleavage site <400> 457 Thr Phe Arg Gly Ala Pro 1 5 <210> 458 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR3 cleavage site <400> 458 Ser Phe Asn Gly Gly Pro 1 5 <210> 459 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR3 cleavage site <400> 459 Ser Phe Asn Gly Asn Glu 1 5 <210> 460 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for PAR4 cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 is a small non-polar amino acid like A, C G, S, and T <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is a large non-polar amino acid like F, I, L, M, V, or an aromatic amino acid like F, H, W, or Y <221> VARIANT <222> 3, 4 <223> Positions 3 and 4 are independantly an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 is K or R <221> VARIANT <222> 6 <223> Position 6 is a basic amino acid like K and R, an aromatic hydrophobic amino acid like F, W, or Y, or an aliphatic hydrophobic amino acid like, G, P, A, V, L, I, and M <400> 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 461 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 461 Gly Tyr Pro Gly Gln Val 1 5 <210> 462 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 462 Ala Tyr Pro Gly Lys Phe 1 5 <210> 463 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 463 Thr Tyr Pro Gly Lys Phe 1 5 <210> 464 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 464 Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr 1 5 <210> 465 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 465 Gly Tyr Pro Gly Lys Trp 1 5 <210> 466 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 466 Gly Tyr Pro Gly Lys Lys 1 5 <210> 467 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 467 Gly Tyr Pro Gly Lys Phe 1 5 <210> 468 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 468 Gly Tyr Pro Gly Arg Phe 1 5 <210> 469 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 469 Gly Tyr Pro Gly Phe Lys 1 5 <210> 470 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 470 Gly Tyr Pro Ala Lys Phe 1 5 <210> 471 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 471 Gly Phe Pro Gly Lys Phe 1 5 <210> 472 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 472 Gly Phe Pro Gly Lys Pro 1 5 <210> 473 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 473 Ser Tyr Pro Gly Lys Phe 1 5 <210> 474 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 474 Ser Tyr Pro Ala Lys Phe 1 5 <210> 475 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 475 Ser Tyr Pro Gly Arg Phe 1 5 <210> 476 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 476 Ser Tyr Ala Gly Lys Phe 1 5 <210> 477 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 477 Ser Phe Pro Gly Gln Pro 1 5 <210> 478 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAR4 cleavage site <400> 478 Ser Phe Pro Gly Gln Ala 1 5 <210> 479 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ADAMTS13 cleavage site <400> 479 Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly 1 5 <210> 480 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bovine enterokinase protease cleavage site <400> 480 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 481 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for TEV protease cleavage site <221> VARIANT <222> 2, 3, 5 <223> Positions 2, 3, and 5 are independantly any amino amino acid <400> 481 Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Gly 1 5 <210> 482 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for TEV protease cleavage site <221> VARIANT <222> 2, 3, 5 <223> Positions 2, 3, and 5 are independantly any amino acid <400> 482 Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser 1 5 <210> 483 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 483 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 484 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 484 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5 <210> 485 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 485 Glu Asn Ile Tyr Thr Gln Gly 1 5 <210> 486 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 486 Glu Asn Ile Tyr Thr Gln Ser 1 5 <210> 487 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 487 Glu Asn Ile Tyr Leu Gln Gly 1 5 <210> 488 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 488 Glu Asn Ile Tyr Leu Gln Ser 1 5 <210> 489 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 489 Glu Asn Val Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 490 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 490 Glu Asn Val Tyr Ser Gln Ser 1 5 <210> 491 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 491 Glu Asn Val Tyr Ser Gln Gly 1 5 <210> 492 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage site <400> 492 Glu Asn Val Tyr Ser Gln Ser 1 5 <210> 493 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for TVMV protease cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 2 <223> Positions 1 and 2 are independantly any amino acid <400> 493 Xaa Xaa Val Arg Phe Gln Gly 1 5 <210> 494 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for TVMV protease cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 2 <223> Positions 1 and 2 are independantly any amino acid <400> 494 Xaa Xaa Val Arg Phe Gln Ser 1 5 <210> 495 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TVMV protease cleavage site <400> 495 Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly 1 5 <210> 496 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TVMV protease cleavage site <400> 496 Glu Thr Val Arg Phe Gln Ser 1 5 <210> 497 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TVMV protease cleavage site <400> 497 Asn Asn Val Arg Phe Gln Gly 1 5 <210> 498 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TVMV protease cleavage site <400> 498 Asn Asn Val Arg Phe Gln Ser 1 5 <210> 499 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for HR3C protease cleavage site <221> VARIANT <222> 1 <223> Position 1 can be amino acid, with D or E preferred <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 is S, T, and an aliphatic hydrophobic amino acid like G, P, A, V, L, I, and M <400> 499 Xaa Xaa Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 500 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HR3C protease cleavage site <400> 500 Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 501 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HR3C protease cleavage site <400> 501 Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 502 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HR3C protease cleavage site <400> 502 Glu Leu Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 503 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HR3C protease cleavage site <400> 503 Asp Ala Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 504 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HR3C protease cleavage site <400> 504 Asp Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 505 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HR3C protease cleavage site <400> 505 Asp Leu Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 506 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Subtilisin protease cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 2, 3, 4 <223> Positions 1, 2, 3, and 4 are independantly any amino acid <400> 506 Xaa Xaa Xaa Xaa His Tyr 1 5 <210> 507 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Subtilisin protease cleavage site <221> VARIANT <222> 1, 2, 3, 4 <223> Positions 1, 2, 3, and 4 are independantly any amino acid <400> 507 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr His 1 5 <210> 508 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtilisin protease cleavage site <400> 508 His Tyr 1 <210> 509 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtilisin protease cleavage site <400> 509 Tyr His 1 <210> 510 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Subtilisin protease cleavage site <400> 510 Pro Gly Ala Ala His Tyr 1 5 <210> 511 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydroxylamine cleavage site <400> 511 Asn Gly Asn Gly Asn Gly 1 5 <210> 512 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydroxylamine cleavage site <400> 512 Asn Gly 1 <210> 513 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for SUMO/ULP-1 protease cleavage site <221> VARIANT <222> 3, 4, 5 <223> Positions 3, 4, and 5 are independantly any amino acid <400> 513 Gly Gly Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 514 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SUMO/ULP-1 protease cleavage site <400> 514 Met Ala Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro 1 5 10 15 Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser 20 25 30 Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu 35 40 45 Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg 50 55 60 Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp 65 70 75 80 Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile 85 90 95 Gly Gly <210> 515 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Caspase 3 protease cleavage site <221> VARIANT <222> 2 <223> Position 2 can be any amino acid with E preferred <221> VARIANT <222> 3 <223> Position 3 is any amino acid <221> VARIANT <222> 5 <223> Position 5 can be any amino acid with G or S preferred <400> 515 Asp Xaa Xaa Asp Xaa 1 5 <210> 516 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 516 Asp Glu Val Asp Gly 1 5 <210> 517 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 517 Asp Glu Val Asp Ser 1 5 <210> 518 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 518 Asp Glu Pro Asp Gly 1 5 <210> 519 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 519 Asp Glu Pro Asp Ser 1 5 <210> 520 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 520 Asp Glu Leu Asp Gly 1 5 <210> 521 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 protease cleavage site <400> 521 Asp Glu Leu Asp Ser 1 5 <210> 522 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible G-spacer <400> 522 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 523 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible G-spacer <400> 523 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 524 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible A-spacer <400> 524 Ala Ala Ala Ala 1 <210> 525 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible A-spacer <400> 525 Ala Ala Ala Ala Val 1 5 <210> 526 <211> 3939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding a BoNT/A with a HIS tag <400> 526 atgccgttcg taaacaaaca gttcaactat aaagacccag tcaacggcgt ggacattgcc 60 tatatcaaaa tcccgaatgc gggtcaaatg cagcccgtga aagcatttaa aatccataac 120 aaaatttggg tgatcccgga gcgcgatacg ttcacgaacc cggaagaagg agatttaaac 180 ccaccgcctg aggctaaaca ggtcccggtg tcttactatg atagcacata cctgagtacc 240 gacaatgaaa aggacaacta cctgaaaggt gttaccaaac tgttcgagcg catttattcg 300 acagatctcg gtcgcatgtt gctgacttct attgtgcgcg gcattccgtt ttggggtggt 360 agcaccatcg atacagaact caaagtgatt gacaccaact gcatcaatgt gattcagcct 420 gatgggagct accggtccga agagcttaac ctcgtaatca ttggcccgag cgcggatatt 480 atccaattcg aatgtaaatc ttttgggcat gaagtcctga atctgacgcg gaatggctat 540 ggatcgacgc agtatattcg tttttctcca gatttcacat ttggatttga agaaagcctc 600 gaagttgata cgaaccctct tttaggcgcg ggaaaattcg cgacggaccc agcggtgacc 660 ttggcacatg aacttattca tgccgggcat cgcttgtatg gaatcgccat taacccgaac 720 cgtgttttca aggtgaatac gaacgcgtat tacgagatgt cgggcttaga agtgtccttt 780 gaagaactgc gcacgtttgg cggtcatgat gcaaaattta ttgatagtct gcaagaaaac 840 gaatttcggc tgtactatta caataaattc aaagacattg catcaacctt aaacaaggcg 900 aaaagcattg tgggtaccac ggctagctta caatatatga aaaacgtttt caaagaaaaa 960 tacctcctta gcgaagacac ttccggcaaa ttctctgtcg ataaactgaa atttgataaa 1020 ctgtataaaa tgctcaccga gatctacaca gaggataact ttgtcaaatt cttcaaggtc 1080 ttgaatcgga aaacctatct gaacttcgat aaagccgtct ttaagatcaa catcgtaccg 1140 aaagttaact acaccatcta tgatggcttt aatctgcgca atacgaatct ggcggcgaac 1200 tttaacggcc agaacaccga aatcaacaac atgaacttta ctaaactgaa aaattttacc 1260 ggcttgtttg aattttataa gctcctgtgt gtccgcggta ttatcaccag caaaaccaaa 1320 tccttggata agggctataa caaggcgctc aatgatttat gcatcaaggt gaacaactgg 1380 gacttgtttt tctctccatc tgaagataat tttactaacg acttgaacaa aggagaggaa 1440 attacttccg ataccaacat cgaagcagcg gaagagaata ttagcctgga tcttattcaa 1500 caatattacc tgacctttaa ttttgataac gagcctgaga acatttccat tgagaatctc 1560 agctctgaca tcatcggcca gctggaactg atgccgaata tcgaacgctt tcctaatgga 1620 aagaaatatg aattggacaa atacaccatg ttccactatc tccgcgcgca ggagtttgag 1680 cacggcaagt ctcgtattgc tctgaccaat tcggtaaacg aagccctttt aaatccttcg 1740 cgtgtgtaca cctttttctc aagcgattat gttaaaaaag tgaacaaggc gaccgaagcg 1800 gcgatgtttt tgggatgggt ggaacaactg gtatatgact ttacggatga aacttctgaa 1860 gtctcgacca ccgacaaaat tgccgatatt accattatca ttccctatat tggccctgca 1920 ctgaacattg gtaacatgct gtataaagat gattttgtgg gcgccctgat cttttcaggc 1980 gctgttatcc tgctggaatt tatcccggaa atcgccattc cagtactcgg tacctttgcg 2040 ctggtgtcct atatcgcaaa caaagttttg actgtccaga cgatcgacaa cgcgctcagt 2100 aaacgtaacg aaaaatggga tgaggtgtat aagtatattg ttaccaactg gctcgctaaa 2160 gtaaacaccc agattgacct gattcgcaag aagatgaaag aagcgctgga aaaccaagca 2220 gaagcgacca aagctattat caactatcaa tataaccagt acacagagga agaaaagaat 2280 aacatcaact tcaacatcga cgacttatct tcaaagctga atgaatctat taacaaagcg 2340 atgattaata ttaacaagtt cttgaaccaa tgtagtgtca gctatctgat gaactcgatg 2400 atcccttacg gtgtgaaacg tctggaagac ttcgatgcaa gccttaaaga tgcccttctg 2460 aagtatattt acgataatcg cggaactctt attggccaag tggatcgctt aaaagataaa 2520 gtcaacaaca cgctgagtac agacatccct tttcagctgt ctaaatatgt ggacaatcag 2580 cgcctgctgt ccacgtttac ggaatacatc aaaaacatca tcaacactag tattctgaac 2640 ttgcgttacg agagtaacca tctgattgat ctgagccgtt acgcatctaa aatcaacatc 2700 ggctcgaagg tgaacttcga tcctatcgac aaaaaccaga ttcaattgtt caacttagaa 2760 tcgtcaaaga ttgaagttat cttaaaaaat gcgattgtat ataattcaat gtacgaaaat 2820 ttctctacga gcttttggat tcgtattccg aaatatttca acagtatctc tttaaacaac 2880 gagtatacta tcatcaattg tatggagaat aacagcgggt ggaaagtgag ccttaactat 2940 ggtgaaatca tctggactct gcaggacact caagaaatta aacaacgcgt ggtgtttaaa 3000 tactcacaga tgattaacat ctcggattat attaatcgct ggatttttgt gacaattact 3060 aacaaccggc tgaacaacag caaaatttac attaacggtc gcctgatcga tcagaaacca 3120 atcagtaatc tcggtaacat tcacgcatcg aataatatca tgttcaaact ggatggttgt 3180 cgcgacacgc accgttacat ttggatcaaa tacttcaatt tattcgacaa agaactcaac 3240 gaaaaggaga ttaaggatct ttatgacaat cagtctaatt cgggtattct gaaagacttt 3300 tggggtgatt accttcagta cgataaaccg tattatatgt taaacttata tgatccgaat 3360 aaatacgttg acgtcaacaa cgttggcatt cgtggctata tgtatctgaa agggccgcgt 3420 ggcagcgtga tgaccactaa catttactta aactcctccc tctatcgcgg tactaaattt 3480 attatcaaga aatatgcctc tggcaacaag gacaatatcg tacgcaataa cgatcgcgtc 3540 tacattaacg tggtggtgaa gaataaagaa tatcgtctgg cgaccaatgc tagtcaggcg 3600 ggcgtggaga aaattctgtc tgcacttgaa atcccggatg tgggtaattt atcccaggtg 3660 gttgtgatga aaagtaaaaa tgaccaaggg atcaccaata aatgcaaaat gaatctgcaa 3720 gataacaacg gcaacgacat tggttttatc ggcttccacc aattcaataa tatcgcgaaa 3780 ctggtggcct caaattggta caaccgtcag attgagcgca gctcccgcac tttaggctgt 3840 agctgggagt tcattccggt agatgacggt tggggagaac gcccattgaa agtcgacaag 3900 cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactga 3939 <210> 527 <211> 1312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/A with a HIS tag <400> 527 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn 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Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln 1265 1270 1275 1280 Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro 1285 1290 1295 Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu 1300 1305 <210> 536 <211> 3916 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding a BoNT/A comprising Fxa (N872) <400> 536 atgccgttcg taaacaaaca gttcaactat aaagacccag tcaacggcgt ggacattgcc 60 tatatcaaaa tcccgaatgc gggtcaaatg cagcccgtga aagcatttaa aatccataac 120 aaaatttggg tgatcccgga gcgcgatacg ttcacgaacc cggaagaagg agatttaaac 180 ccaccgcctg aggctaaaca ggtcccggtg tcttactatg atagcacata cctgagtacc 240 gacaatgaaa aggacaacta cctgaaaggt gttaccaaac tgttcgagcg catttattcg 300 acagatctcg gtcgcatgtt gctgacttct attgtgcgcg gcattccgtt ttggggtggt 360 agcaccatcg atacagaact caaagtgatt gacaccaact gcatcaatgt gattcagcct 420 gatgggagct accggtccga agagcttaac ctcgtaatca ttggcccgag cgcggatatt 480 atccaattcg aatgtaaatc ttttgggcat gaagtcctga atctgacgcg gaatggctat 540 ggatcgacgc agtatattcg tttttctcca gatttcacat ttggatttga agaaagcctc 600 gaagttgata cgaaccctct tttaggcgcg ggaaaattcg cgacggaccc agcggtgacc 660 ttggcacatg aacttattca tgccgggcat cgcttgtatg gaatcgccat taacccgaac 720 cgtgttttca aggtgaatac gaacgcgtat tacgagatgt cgggcttaga agtgtccttt 780 gaagaactgc gcacgtttgg cggtcatgat gcaaaattta ttgatagtct gcaagaaaac 840 gaatttcggc tgtactatta caataaattc aaagacattg catcaacctt aaacaaggcg 900 aaaagcattg tgggtaccac ggctagctta caatatatga aaaacgtttt caaagaaaaa 960 tacctcctta gcgaagacac ttccggcaaa ttctctgtcg ataaactgaa atttgataaa 1020 ctgtataaaa tgctcaccga gatctacaca gaggataact ttgtcaaatt cttcaaggtc 1080 ttgaatcgga aaacctatct gaacttcgat aaagccgtct ttaagatcaa catcgtaccg 1140 aaagttaact acaccatcta tgatggcttt aatctgcgca atacgaatct ggcggcgaac 1200 tttaacggcc agaacaccga aatcaacaac atgaacttta ctaaactgaa aaattttacc 1260 ggcttgtttg aattctataa gctcctgtgt gtccgcggta ttatcaccag caaaggcggt 1320 ggttctggcg gtggtgaaaa cctgtacttc cagggcggtg gctccggtgg tggtgcgctc 1380 aatgatttat gcatcaaggt gaacaactgg gacttgtttt tctctccatc tgaagataat 1440 tttactaacg acttgaacaa aggagaggaa attacttccg ataccaacat cgaagcagcg 1500 gaagagaata ttagtctaga tcttattcaa caatattacc tgacctttaa ttttgataac 1560 gagcctgaga acatttccat tgagaatctc agctctgaca tcatcggcca gctggaactg 1620 atgccgaata tcgaacgctt tcctaatgga aagaaatatg aattggacaa atacaccatg 1680 ttccactatc tccgcgcgca ggagtttgag cacggcaagt ctcgtattgc tctgaccaat 1740 tcggtaaacg aagccctttt aaatccttcg cgtgtgtaca cctttttctc aagcgattat 1800 gttaaaaaag tgaacaaggc gaccgaagcg gcgatgtttt tgggatgggt ggaacaactg 1860 gtatatgact ttacggatga aacttctgaa gtctcgacca ccgacaaaat tgccgatatt 1920 accattatca ttccctatat tggccctgca ctgaacattg gtaacatgct gtataaagat 1980 gattttgtgg gcgccctgat cttttcaggc gctgttatcc tgctggaatt tatcccggaa 2040 atcgccattc cagtactcgg tacctttgcg ctggtgtcct atatcgcaaa caaagttttg 2100 actgtccaga cgatcgacaa cgcgctcagt aaacgtaacg aaaaatggga tgaggtgtat 2160 aagtatattg ttaccaactg gctcgctaaa gtaaacaccc agattgacct gattcgcaag 2220 aagatgaaag aagcgctgga aaaccaagca gaagcgacca aagctattat caactatcaa 2280 tataaccagt acacagagga agaaaagaat aacatcaact tcaacatcga cgacttatct 2340 tcaaagctga atgaatctat taacaaagcg atgattaata ttaacaagtt cttgaaccaa 2400 tgtagtgtca gctatctgat gaactcgatg atcccttacg gtgtgaaacg tctggaagac 2460 ttcgatgcaa gccttaaaga tgcccttctg aagtatattt acgataatcg cggaactctt 2520 attggccaag tggatcgctt aaaagataaa gtcaacaaca cgctgagtac agacatccct 2580 tttcagctgt ctaaatatgt ggacaatcag cgcctgctgt ccacgtttac ggaatacatc 2640 aaaaacattg agggccgtat caacactagt attctgatct aaccatctga ttgatctgag 2700 ccgttacgca tctaaaatca acatcggatc caaggtgaac ttcgatccta tcgacaaaaa 2760 ccagattcaa ttgttcaact tagaatcgtc aaagattgaa gttatcttaa aaaatgcgat 2820 tgtatataat tcaatgtacg aaaatttctc tacgagcttt tggattcgta ttccgaaata 2880 tttcaacagt atctctttaa acaacgagta tactatcatc aattgtatgg agaataacag 2940 cgggtggaaa gtgagcctta actatggtga aatcatctgg actctgcagg acactcaaga 3000 aattaaacaa cgcgtggtgt ttaaatactc acagatgatt aacatctcgg attatattaa 3060 tcgctggatt tttgtgacaa ttactaacaa ccggctgaac aacagcaaaa tttacattaa 3120 cggtcgcctg atcgatcaga aaccaatcag taatctcggt aacattcacg catcgaataa 3180 tatcatgttc aaactggatg gttgtcgcga cacgcaccgt tacatttgga tcaaatactt 3240 caatttattc gacaaagaac tcaacgaaaa ggagattaag gatctttatg acaatcagtc 3300 taattcgggt attctgaaag acttttgggg tgattacctt cagtacgata aaccgtatta 3360 tatgttaaac ttatatgatc cgaataaata cgttgacgtc aacaacgttg gcattcgcgg 3420 ctatatgtat ctgaaagggc cgcgtggcag cgtgatgacc actaacattt acttaaactc 3480 ctccctctat cgcggtacta aatttattat caagaaatat gcctctggca acaaggacaa 3540 tatcgtacgc aataacgatc gcgtctacat taacgtggtg gtgaagaata aagaatatcg 3600 tctggcgacc aatgctagtc aggcgggcgt ggagaaaatt ctgtctgcac ttgaaatccc 3660 ggatgtgggt aatttatccc aggtggttgt gatgaaaagt aaaaatgacc aagggatcac 3720 caataaatgc aaaatgaatc tgcaagataa caacggcaac gacattggtt ttatcggctt 3780 ccaccaattc aataatatcg cgaagcttgt ggcctcaaat tggtacaacc gtcagattga 3840 gcgcagctcc cgcactttag gctgtagctg ggagttcatt ccggtagatg acggttgggg 3900 agaacgccca ttgtaa 3916 <210> 537 <211> 1309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/A comprising Fxa (N872) <400> 537 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Asn Leu 435 440 445 Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Leu Asn Asp Leu Cys 450 455 460 Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn 465 470 475 480 Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn 485 490 495 Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr 500 505 510 Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu 515 520 525 Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile 530 535 540 Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met 545 550 555 560 Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile 565 570 575 Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val 580 585 590 Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr 595 600 605 Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr Asp Phe 610 615 620 Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile 625 630 635 640 Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met 645 650 655 Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val 660 665 670 Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr 675 680 685 Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr 690 695 700 Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr 705 710 715 720 Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp 725 730 735 Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala 740 745 750 Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu 755 760 765 Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn 770 775 780 Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln 785 790 795 800 Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys 805 810 815 Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr 820 825 830 Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys 835 840 845 Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser 850 855 860 Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Ile 865 870 875 880 Lys Asn Ile Glu Gly Arg Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr 885 890 895 Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn 900 905 910 Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln 915 920 925 Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala 930 935 940 Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile 945 950 955 960 Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr 965 970 975 Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn 980 985 990 Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln 995 1000 1005 Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile 1010 1015 1020 Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser 1025 1030 1035 1040 Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn 1045 1050 1055 Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly 1060 1065 1070 Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe 1075 1080 1085 Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln 1090 1095 1100 Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr 1105 1110 1115 1120 Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val 1125 1130 1135 Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro 1140 1145 1150 Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr 1155 1160 1165 Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp 1170 1175 1180 Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys 1185 1190 1195 1200 Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu 1205 1210 1215 Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln 1220 1225 1230 Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys 1235 1240 1245 Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly 1250 1255 1260 Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr 1265 1270 1275 1280 Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu 1285 1290 1295 Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu 1300 1305

Claims (16)

  1. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 적어도 하나의 불활성화 분해 부위를 포함하는 서열번호 1에 의해 보여진 아미노산 서열을 포함하는 보툴리눔 A 독소(BoNT/A)가 변형된 변형된 클로스트리듐 독소에 있어서, 여기서 상기 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역에 위치되고, 여기서 적어도 하나의 불활성화 분해 부위는 이중 트롬빈-트롬빈 부위, 인자 Xa 부위, 이중 인자 Xa-트롬빈 부위, 및/또는 MMP-9 부위를 포함하고, 여기서 상기 변형은 다음의 (a) 내지 (d)의 어느 하나에 의해 적어도 하나의 불활성화 분해 부위를 삽입하는 것인 변형된 클로스트리듐 독소:
    (a) 여기서 아미노산 서열 VPRGS는 서열번호 1에서 L881 후에 삽입되고, 아미노산 서열 VPRG는 서열번호 1에서 L891 후에 삽입되며;
    (b) 여기서 아미노산 서열 EGR은 서열번호 1에서 I873 후에 삽입되며;
    (c) 여기서 아미노산 서열 EGR은 서열번호 1에서 I873 후에 삽입되고, 아미노산 서열 LVPRG는 서열번호 1에서 E884 후에 삽입되며;
    (d) 여기서 아미노산 서열 KNIINTSI는 서열번호 1에서 K871로부터 I878의 부위에서 삭제되고, 아미노산 서열 GPLGLWAQ는 부위로, 서열번호 1의 아미노산 871-895 부분으로 삽입된다.
  2. 제1항에 있어서, 불활성화 분해 부위 부분으로서 불활성화 분해 부위가 서열번호 1의 아미노산 서열 462-496으로 삽입되는 부분을 더 포함하는 것인 클로스트리듐 독소.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/A 효소 영역을 포함하는 것인 클로스트리듐 독소.
  4. 서열번호 531, 서열번호 533, 서열번호 535 및/또는 서열번호 537을 포함하는 클로스트리듐 독소.
  5. 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치된 적어도 하나의 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소에 있어서, 상기 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역에 위치되고, 여기서 적어도 하나의 불활성화 분해 부위는 tPA 분해 부위를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 불활성화 분해 부위는 서열번호 1의 아미노산 871-895 내에 위치되고, 여기서 상기 불활성화 분해 부위에서, 아미노산 SNHLIDL은 서열번호 1에서 S885 내지 L891로부터 부위에서 삭제되고, 아미노산 PQRGRSA는 상기 부위로 삽입되는 것인 클로스트리듐 독소.
  6. 제5항에서, 상기 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/A 효소 영역을 포함하는 것인 클로스트리듐 독소.
  7. 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치된 적어도 하나의 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소에 있어서, 상기 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역에 위치되고, 여기서 적어도 하나의 불활성화 분해 부위는 트롬빈 분해 부위를 포함하고, 여기서 상기 클로스트리듐 독소는 서열번호 1에서 L891 후에 VPRG의 삽입에 의한 변형으로 서열번호 1에서 보여준 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 클로스트리듐 독소.
  8. 제7항에 있어서, 상기 불활성 분열 부위는 불활성화 분해 부위 부분으로서 서열번호 1의 아미노산 서열 462-496으로 삽입되는 것인 클로스트리듐 독소.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 불활성 분해 부위는 불활성 분해 부위 부분으로서 서열번호 1의 아미노산 서열 844-863으로 삽입되는 것인 클로스트리듐 독소.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/A 효소 영역을 포함하는 것인 클로스트리듐 독소.
  11. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 적어도 하나의 불활성화 분해 부위를 포함하는 서열번호 1에 의해 보여진 아미노산 서열을 포함하는 보툴리눔 A 독소(BoNT/A)가 변형된 변형된 클로스트리듐 독소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자에 있어서, 여기서, 상기 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역에 위치되고, 여기서 적어도 하나의 불활성화 분해 부위는 이중 트롬빈-트롬빈 부위, 인자 Xa 부위, 이중 인자 Xa-트롬빈 부위, 및/또는 MMP-9 부위를 포함하고, 여기서 상기 변형은 다음의 (a) 내지 (d)의 어느 하나에 의해 적어도 하나의 불활성화 분해 부위를 삽입하는 것인 변형된 클로스트리듐 독소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자:
    (a) 여기서 아미노산 서열 VPRGS는 서열번호 1에서 L881 후에 삽입되고, 아미노산 서열 VPRG는 서열번호 1에서 L891 후에 삽입되며;
    (b) 여기서 아미노산 서열 EGR은 서열번호 1에서 I873 후에 삽입되며;
    (c) 여기서 아미노산 서열 EGR은 서열번호 1에서 I873 후에 삽입되고, 아미노산 서열 LVPRG는 서열번호 1에서 E884 후에 삽입되며;
    (d) 여기서 아미노산 서열 KNIINTSI는 서열번호 1에서 K871로부터 I878의 부위에서 삭제되고, 아미노산 서열 GPLGLWAQ는 부위로, 서열번호 1의 아미노산 871-895 부분으로 삽입된다.
  12. 제11항에 있어서, 불활성화 분해 부위 부분으로서 불활성화 분해 부위가 서열번호 1의 아미노산 서열 462-496으로 삽입되는 부분을 더 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/A 효소 영역을 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  14. 서열번호 531, 서열번호 533, 서열번호 535 및/또는 서열번호 537을 포함하는 클로스트리듐 독소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  15. 제11항 내지 제12항중 어느 하나의 항에서 정의된 바와 같은 클로스트리듐 독소를 생성하는 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것인 방법:
    a. 제1항 내지 제2항중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포로 도입하는 단계; 및
    b. 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 발현하는 단계, - 상기 폴리뉴클레오타이드로부터 발현은 코드화된 클로스트리듐 독소를 생성함-.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포는 대장균 세포인 방법.
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