BR112012029666A2 - toxinas clostridiais degradáveis - Google Patents

Abstract

TOXINAS CLOSTRIDIAIS DEGRADÁVEIS. A invenção refere-se a toxinas clostridiais ou quimeras de toxinas clostridiais compreendendo um sítio de clivagem de inativação, moléculas de polinucleotídeo codificando tais toxinas ou quimeras, composições compreendendo tais toxinas ou quimeras, e métodos de produção de tais toxinas ou quimeras.

Description

Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para "TOXINAS CLOSTRIDIAIS DEGRADÁVEIS". Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente US Provisório Série Número 61/346.578, depositado em 20 de maio de 2010, 5 cujo teor completo encontra-se aqui incorporada a título de referência espe- cÍfica.

A capacidade das toxinas clostridiana, tais como, por exemplo, neurotoxinas de Botulinum (BONTs), BONT/A, BONT/B, B?NT/C1, BONT/D, BONT/E, BONT/F e BONT/G, e neurotoxina de Tetanus (TeNT), de inibir a i'

- 10 transmissão neuronal vem sendo explorado em uma ampla variedade de , aplicações terapêuticas e cosméticas, vide, por exemplo, William J.

Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (S- lack, Inc., 2004). Toxinas clostridiana comercialmente disponíveis como composições farmacêuticas incluem preparações de BONT/A, tais como, por 15 exemplo, BOTOX" (Allergan, Inc., lrvine, CA), DYSPORT"/RELOXIN", (Be- auquatro lpsen, Porton Down, lnglaterra), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc.,

Ochang-myeon, Coreia do Sul) BTX-A (Lanzhou lnstitute Biological Pro- ducts, China) e XEOM|N® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Ale-

manha); e preparações de BONT/B, tais como, por exemplo, 20 MYOBLOC'"/NEUROBLOC'" (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA). Como um exemplo, o BOTOX® já foi aprovado em um ou mais países para as seguintes indicações: acalasia, espasticidade do adulto, fissura anal, dor nas costas, blefarospasmo, bruxismo, distonia cervical, tremor essencial, linhas glabelares ou Iinhas faciais hipercinéticas, dor de cabeça, espasmo 25 hemifacial, hiperatividade da bexiga, hiper-hidrose, paralisia cerebral juvenil, esclerose múltipla, distúrbios mioclônicos, linhas naso-labiais, disfonia es- pasmódica, estrabismo e doenças do Vll nervo.

O tratamento com uma toxina cIostridiana inibe a liberação de neurotransmissores rompendo o processo exocitótico usado para secretar o 30 neurotransmissor na fenda sináptica.

Um grande desejo da indústria farma- cêutica é expandir o uso das terapias com toxinas clostridiana além das su- as atuais aplicações como mio-relaxantes para tratar doenças que afetam os nervos sensoriais, tais como, por exemplo, vários tipos de dor crônica, inflamação neurogênica e distúrbios urogenitais, assim como outros distúr- bios, tais como, por exemplo, pancreatite. Uma abordagem que vem sendo explorada atualmente para expandir as terapias à base de toxinas clostridia- 5 na envolve modificar uma toxina clostridiana de modo que a toxina modifi- cada tenha uma capacidade de vetorização a células alterada para uma cé- lula alvo de uma toxina não clostridiana. Esta capacidde revetorizada é obti- da com a substituição de um domínio de vetorização de ocorrência natural de uma toxina clostridiana por um domínio de vetorização apresentando

Y

L 10 uma atividade de ligação preferencial para um receptor de toxina não clos- tridiana presente em uma célula alvo de uma toxina não clostridiana. Tais modificações em domínio de vetorização resultam em uma quimera de toxi- na clostridiana chamada de Proteína de Modulação de Exocitose Vesicular Vetorizada (TVEMP) que é capaz de se Iigar seletivamente a um receptor de 15 toxina não clostridiana (receptor alvo) presente em uma célula alvo de toxina não cIostridiana (revetorizada). Uma quimera de toxina clostridiana com uma . atividade de vetorização para uma célula alvo de toxina não clostridiana po- de se ligar a um receptor presente na célula alvo de toxina não clostridiana, se translocar para o citoplasma, e exercer seu efeito proteolítica no comple- 20 xo SNARE da célula alvo de toxina não clostridiana. Terapias com toxina cIostridiana e com quimera de toxina clos- tridiana são usadas com sucesso para muitas indicações. Geralmente, a administração de uma toxina clostridiana ou de uma quimera de toxina clos- tridiana é bem tolerada. No entanto, esta administração em algumas aplica- 25 ções pode representar um desafio por causa das doses mais altas necessá- rias para obter um efeito benéfico. Doses mais altas podem aumentar a pro- babilidade de a toxina ou a quimera de toxina clostridiana se deslocar atra- vés dos fluidos intersticiais e dos sistemas circulatórios, tais como, por e- xemplo, o sistema cardiovascular e o sistema linfático, do corpo, resultando 30 na dispersão indesejável da toxina ou da quimera de toxina clostridiana para áreas não são alvo do tratamento. Tal dispersão pode levar a efeitos colate- rais indesejáveis, tais como, por exemplo, inibição da liberação de neuro-

transmissores nos neurônios que não são alvo de tratamento com toxina ou paralisia de um músculo que não é alvo de tratamento.

Por exemplo, um paciente que recebe uma quantidade terapeuticamente eficaz de um trata- mento com BONT/A nos músculos do pescoço para torcicoio pode desenvo1- 5 ver disfagia por causa da dispersão da toxina para a orofaringe.

Portanto, continuam sendo necessárias toxinas clostridiana e/ou quimeras de toxina clostridiana que sejam eficazes no sÍtio de tratamento, mas que tenham efei- tos desprezíveis a mínimos nas áreas que não são alvo de tratamento com toxina.

O crescente uso clínico, terapêutico, e cosmético de toxinas clostridiana e quimeras de toxina clostridiana em terapias que requerem do- ses mais altas requer que a indústria farmacêutica desenvolva toxinas clos- tridiana modificadas e quimeras de toxina clostridiana que sejam eficazes no sÍtio alvo de aplicação, mas que reduzam ou previnam os possÍveis efeitos colaterais associados à dispersão das toxinas para uma localização indese- jada.

A presente invenção fornece novas toxinas clostridiana modificadas e quimeras de toxina clostridiana que reduzem ou previnem os efeitos colate- rais indesejados associados à dispersão de toxinas para áreas que não são alvo de tratamento.

Estas vantagens e vantagens relacionadas são úteis para várias aplicações clínicas, terapêuticas e cosméticas, tais como, por exemplo, o tratamento de distúrbios neuromusculares, distúrbios neuropáti- cos, distúrbios oculares, dor, lesões musculares, dor de cabeça, doenças cardiovasculares, distúrbios neuropsiquiátricos, distúrbios endócrinos, cân- ceres, distúrbios óticos e linhas faciais hipercinéticas, assim como outros distúrbios nos quais a administração de uma toxina clostridiana ou de uma quimera de toxina clostridiana a um mamífero pode produzir um efeito bené- fico.

Breve Descrição dos Desenhos FIG. 1 mostra um diagrama do paradigma comum de liberação de neurotransmissores e intoxicação com toxinas clostridiana em um neurô- nio central e periférico.

A FIG. 1A mostra um diagrama do mecanismo de liberação de neurotransmissores de um neurônio central e periférico.

O pro-

W u cesso de liberação pode ser descrito como compreendendo duas etapas: 1) atracagem de vesícula, onde a proteína SNARE ligada à vesícula de uma vesícula contendo moléculas de neurotransmissor se associa às proteínas SNARE ligadas à membrana localizadas na membrana plasmática; e 2) libe- 5 ração de neurotransmissores, onde a vesícula se funde à membrana plas- mática e as moléculas de neurotransmissor são exocitosadas.

A FlG. 1 B mostra um diagrama do mecanismo de intoxicação para a atividade de toxi- na tetânica e botulínica um neurônio central e periférico.

Este processo de intoxicação pode ser descrito como compreendendo quatro etapas: 1) liga-

" 10 ção a receptor, onde uma toxina clostridiana se liga a um sistema receptor cIostridiana e inicia o processo de intoxicação; 2) internalização de comple- xo, onde depois de se ligar a uma toxina, uma vesícula contendo o comple- xo toxina/sistema de receptor é endocitosada na célula; 3) translocação de cadeia leve, onde se acredita que ocorrem múltiplos eventos, incluindo, por 15 exemplo, alterações no pH interna da vesícula, formação de um poro de ca- nal compreendendo o domínio HN da cadeia pesada da toxina cbstridiana, separação da cadeia leve da toxina cIostridiana da cadeia pesada, e libera- ção da cadeia leve ativa, e 4) modificação do alvo enzimático, onde a cadeia leve ativada da toxina clostridiana cliva proteoliticamente seu substrato 20 SNARE alvo, tal como, por exemplo, SNAP-25, VAMP ou Sintaxina, dessa forma prevenindo a atracagem de vesículas e liberação de neurotransmisso- res.

A FIG. 2 mostra a organização de domínios de toxinas clostridi- ana de ocorrência natural.

A forma de cadeia simples representa a organi- 25 zação linear de amino para carboxil compreendendo um domínio enzimáti- co, um domínio de translocação, e um domínio de ligação.

A região de alça de cadeia dupla Iocalizada entre os domínios de translocação e enzimático está representada pelo braço SS duplo.

Esta região compreende um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla endógena que, com a cliva- 30 gem proteolítica de uma protease de ocorrência natural, tal como, por e- xemplo, uma protease de toxina clostridiana endógena ou uma protease de ocorrência natural produzida no ambiente, converte a forma de cadeia sim-

ples da toxina na forma de cadeia dupla. Acima da forma de cadeia simples, está representada a região Hcc do"domínio de ligação de toxina clostridiana.

Esta região compreende o domínio trifólio B que compreende em uma orga- nização Iinear de amino para carboxil uma prega ot, uma curva fechada 5 B4/B5, uma prega B, uma curva fechada B8/B9, e uma prega y. A FlG. 3 mostra toxinas cIostridiana ou quimeras de toxina clos- tridiana com um domínio de ligação localizado no terminal amino da toxina. A FlG. 3A representa a forma poIipeptídica de cadeia simples de uma toxina ou quimera com uma organização linear de amino para carboxil compreen- - 10 dendo um elemento de ligação, um elemento de translocação, uma região de alça de cadeia dupla compreendendo um sÍtio de clivagem da protease exógena (P), e um elemento terapêutico. Com a clivagem proteolítica com uma protease P, a forma de cadeia simples da toxina ou da quimera é con- vertida na forma de cadeia dupla. A FIG. 3B representa a forma polipeptídi- 15 ca simples de uma toxina ou quimera com uma organização linear de amino para carboxil compreendendo um elemento de ligação, um elemento tera- pêutico, uma região de alça de cadeia dupla compreendendo um sÍtio de clivagem da protease exógena (P), e um elemento de translocação. Com a cIivagem proteolítica com uma protease P, a forma de cadeia simples da 20 toxina ou da quimera é convertida na forma de cadeia dupla. A FlG. 4 mostra toxinas clostridiana ou quimeras de toxina clos- tridiana com um domínio de ligação localizado no terminal amino da toxina. A FlG. 4A representa a forma polipeptídica simples de uma toxina ou quime- ra com uma organização linear de amino para carboxil compreendendo um 25 elemento terapêutico, uma região de alça de cadeia dupla compreendendo um sÍtio de clivagem da protease exógena (P), um elemento de ligação, e um elemento de translocação. Com a clivagem proteolítica com uma protea- se P, a forma de cadeia simples da toxina ou da quimera é convertida na forma de cadeia dupla. A FIG. 4B representa a forma poIipeptídica simples 30 de uma toxina ou quimera com uma organização Iinear de amino para car- boxil compreendendo um elemento de translocação, uma região de alça de cadeia dupla compreendendo um sÍtio de clivagem da protease exógena

(P), um elemento de ligação, e um elemento terapêutico.

Com a cIivagem proteolítica com uma protease P, a forma de cadeia simples da toxina ou da quimera é convertida na forma de cadeia dupla.

A FlG. 4C representa a for- ma polipeptídica simples de uma toxina ou quimera com uma organização 5 linear de amino para carboxil compreendendo um elemento terapêutíco, um elemento de ligação, uma região de alça de cadeia dupla compreendendo um sítio de cIivagem da protease exógena (P), e um elemento de transloca- ção.

Com a cIivagem proteolítica com uma protease P, a forma de cadeia simples da toxina ou da quimera é convertida na forma de cadeia dupla.

A

- 10 FlG. 4D representa a forma poIipeptídica simples de uma toxina ou quimera com uma organização linear de amino para carboxil compreendendo um elemento de translocação, um elemento de ligação, uma região de alça de cadeia dupla compreendendo um sÍtio de clivagem da protease exógena (P), e um elemento. terapêutico.

Com a clivagem proteolítica com uma pro- 15 tease P, a forma de cadeia simples da toxina ou da quimera é convertida na forma de cadeia dupla.

A FIG. 5 mostra toxinas clostridiana ou quimeras de toxina clos- tridiana com um domínio de ligação localizado no terminal amino da toxina.

A FlG. 5A representa a forma polipeptídica simples de uma toxina ou quime- 20 ra com uma organização linear de amino para carboxil compreendendo um elemento terapêutico, uma região de alça de cadeia dupla compreendendo um sÍtio de clivagem da protease exógena (P), um elemento de transloca- çâo, e um elemento de ligação- Com a clivagem proteolítica com uma prote- ase P, a forma de cadeia simples da toxina é convertida na forma de cadeia 25 dupla.

A FlG. 5B representa a forma polipeptídica simples de uma toxina ou quimera com uma organização linear de amino para carboxil compreenden- do um elemento de translocação, uma região de alça de cadeia dupla com- preendendo um sÍtio de cIivagem da protease exógena (P), um elemento terapêutico, e um elemento de ligação.

Com a clivagem proteolítica com 30 uma protease P, a forma de cadeia simples da toxina ou da quimera é con- vertida na forma de cadeia dupla.

Descrição Detalhada

A presente invenção divulga toxinas clostridiana e modificadas quimeras modificadas de toxina clostridiana que podem ser rapidamente inativadas a partir de uma localização ou localizações indesejadas exploran- do-se a presença de proteases presentes nos fluidos intersticiais e sistemas 5 circulatórios, tais como, por exemplo, o sistema cardiovascular e o sistema linfático.

Isto porque as toxinas clostridiana modificadas e as quimeras de toxina clostridiana modificadas descritas no presente relatório compreendem um sÍtio de clivagem da protease para uma protease presente em um fluido intersticial e/ou em um sistema circulatório.

A presença de um tal sÍtio de clivagem da protease deixa a toxina cIostridiana modificada ou a quimera de toxina clostridiana modificada susceptível à clivagem proteolítica por sua protease cognato, que deixa tais toxinas modificadas inativas.

Por exemplo, em situações nas quais uma toxina clostridiana ou uma quimera de toxina clostridiana modificada para compreender um sÍtio de clivagem para uma protease matricial extracelular se espalhou no fluido intersticial, esta toxina modificada ou quimera de toxina clostridiana modificada pode ser efetiva- mente clivada pela protease matricial extracelular cognata.

Como um outro exemplo, em situações nas quais uma toxina cIostridiana ou uma quimera de toxina clostridiana modificada para compreender um sÍtio de clivagem para uma protease sanguínea se espalhou no sistema cardiovascular, esta toxina modificada ou quimera de toxina clostridiana modificada pode ser efe- tivamente clivada pela protease sanguínea cognata.

Ainda como um outro exemplo, em situações nas quais uma toxina clostridiana ou uma quimera de toxina clostridiana modificada para compreender um sÍtio de clivagem para uma protease Iinfática se espalhou no sistema linfático, esta toxina modificada ou quimera de toxina clostridiana modificada pode ser efetiva- mente cIivada pela protease linfática cognata.

Por conseguinte a utilização de uma toxina clostridiana ou de uma quimera de toxina clostridiana com- preendendo um ou mais sÍtios de clivagem para as proteases presentes no fluido intersticial e/ou no sistema circulatório vai diminuir ou remover tal toxi- na clostridiana ou quimera de toxina clostridiana de uma localização indese- jada, dessa forma reduzindo ou prevenindo os efeitos colaterais indesejados associados ao espalhamento de uma toxina clostridiana ou de uma quimera de toxina clostridiana para uma localização indesejada.

Assim sendo, os aspectos da presente invenção oferecem uma toxina clostridiana compreendendo um sÍtiO de clivagem de inativação Iocali- 5 zado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de trans- Iocação ou no subdomínio de ligação Hcn.

Tais toxinas divulgadas podem compreender um domínio enzimático de toxina cIostridiana, um domínio de translocação de toxina clostridiana, um domínio de ligação de toxina clostri- lO diana, uma região de alça de cadeia dupla compreendendo um sÍtio de cli- vagem da protease exógena, e um sítio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação.

Exemplos não limitativos de sÍtios de clivagem de inativação incluem sÍtios de clivagem da trombina, sÍtios de clivagem da plasmina, sítios de clivagem do fator de coa- gulação Vlla, sÍtios de clivagem do fator de coagulação lXa, sÍtios de cliva- gem do fator de coagulação Xa, sÍtios de clivagem do fator de coagulação Xla, sÍtios de clivagem do fator de coagulação Xlla, sÍtios de clivagem da calicreína plasmática, sítios de clivagem do receptor-l acoplado à proteína G ativada pela protease (PARI), sítios de clivagem de PAR2, sÍtios de cliva- gem de PAR3, sÍtios de clivagem de PAR4, sÍtios de clivagem da metalopro- teinase matricial-2 (MMP-2), sÍtios de clivagem da metaloproteinase matrici- al-9 (MMP-9), sÍtios de clivagem da furina, sÍtios de cIivagem do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA), sÍtios de clivagem do ativador de plasminogênio tipo tecido (tPA), sÍtios de clivagem da triptase-e, sítios de clivagem da protease-7 de mastócito de camundongo (mMCP-7), sÍtios de clivagem da enzima-l conversora de endotelina (ECE-I), sÍtios de clivagem do grupo sanguíneo de Kell, sÍtios de cIivagem de DPPlV, sÍtios de clivagem da metalopeptidase ADAM com motivo-13 tipo 1 da trombospondina (ADAMTS13), e sÍtios de clivagem da catepsina L.

A adição do sÍtio de cli- vagem de inativação aumenta a margem de segurança da toxina cIostridiana ou da quimera de toxina cIostridiana em relação à mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou em relação a uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de ina- tivação adicional.

Outros aspectos da presente invenção oferecem uma quimera de toxina cIostridiana compreendendo um domínio enzimático de toxina 5 cIostridiana, um domínio de translocação de toxina clostridiana, um domínio de ligação de toxina não cIostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de cIivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação ou no subdomínio de ligação de Hcn.

Tais toxinas divulgadas podem compreender um domínio enzimático de toxina clostridiana, um do- mínio de translocação de toxina clostridiana, um domínio de ligação de toxi- na não cIostridiana, uma região de alça de cadeia dupla compreendendo um sÍtio de clivagem da protease exógena, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de cIivagem de inativação.

E- xemplos não limitativos de sÍtios de clivagem de inativação incluem sÍtios de cIivagem da trombina, sÍtios de clivagem da plasmina, sÍtios de clivagem do fator de coagulação Vlla, sÍtios de clivagem do fator de coagulação IXa, sí- tios de clivagem do fator de coagulação Xa, sÍtios de clivagem do fator de coagulação XIa, sÍtios de cIivagem do fator de coagulação Xlla, sÍtios de clivagem da calicreína pIasmática, sÍtios de clivagem do receptor-l acoplado à proteína G ativada pela protease (PARI), sÍtios de cIivagem de PAR2, SÍ- tios de clivagem de PAR3, SÍtios de clivagem de PAR4, sÍtios de cIivagem da metaloproteinase matricial-2 (MMP-2), sÍtios de clivagem da metaloproteina- se matricial-9 (MMP-9), sÍtios de clivagem da furina, sÍtios de clivagem do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA), sÍtios de clivagem do ati- vador de plasminogênio tipo tecido (tPA), sítios de clivagem da triptase-e, sÍtios de clivagem da protease-7 de mastócito de camundongo (mMCP-7), sÍtios de clivagem da enzima-l conversora de endotelina (ECE-I), sÍtios de cIivagem do grupo sanguíneo de Kell, sÍtios de clivagem de DPPIV, sÍtios de clivagem da metalopeptidase ADAM com motivo-13 tipo 1 da trombospondi- na (ADAMTS13), e sÍtios de clivagem da catepsina L.

A adição do sÍtio de clivagem de inativação aumenta a margem de segurança da toxina cIostridi-

ana ou quimera de toxina cIostridiana em relação à mesma toxina clostridia- na ou quimera de toxina cIostridiana ou em relação a uma toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional. 5 Outros aspectos da presente invenção oferecem moléculas de polinucleotÍdeo codificando uma toxina clostridiana ou uma quimera de toxi- na clostridiana descrita no presente relatório. Uma molécula de polinucleotí- deo codificando tal toxina clostridiana ou uma quimera de toxina clostridiana pode compreender ainda um vetor de expressão.

- 10 Outros aspectos da presente invenção oferecem uma composi- ção compreendendo uma toxina clostridiana ou uma quimera de toxina clos- tridiana descrita no presente relatório. Uma composição compreendendo tal toxina clostridiana ou tal quimera de toxina clostridiana pode ser uma com- posição farmacêutica. Tal composição farmacêutica pode compreender, a- 15 lém de uma toxina cIostridiana modificada descrita no presente relatório, um carreador farmacêutica, um componente farmacêutico, ou ambos. Outros aspectos da presente invenção oferecem um método de produção de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana des- crita no presente relatório, o método compreendendo a etapa de expressar 20 em uma célula uma molécula de polinucleotídeo codificando uma toxina cIostridiana ou uma quimera de toxina clostridiana descrita no presente rela- tório, onde a expressão da molécula de polinucleotÍdeo produz a toxina clos- tridiana ou a quimera de toxina clostridiana codificadas. Em outros aspectos, o método compreende as etapas de introduzir em uma célula uma molécula , 25 de polinucleotÍdeo codificando uma toxina clostridiana ou uma quimera de toxina clostridiana descrita no presente relatório, e expressar a molécula de poHnucleotídeo, onde a expressão da molécula de polinucleotídeo produz a toxina clostridiana ou a quimera de toxina clostridiana codificadas. Toxinas de Clostridia produzidas pela Clostridium botulinum, 30 Clostridium tetani, Clostridium baratii e Clostridium butyricum são as mais amplamente usadas em tratamentos terapêuticos e cosméticos de seres humanos e outros mamíferos. As cepas de C. botulinum produzem sete ti-

pos antigenicamente distintos de toxinas de Botulinum (BONTS), que foram identificados por investigação de surtos de botulismo no homem (BONT/A, IB, IE e IF), animais (BONT/CI e ID), ou isolado de terra (BoNT/G). As BONTS possuem aproximadamente 35% de identidade de aminoácidos entre 5 si e compartilham a mesma organização de domínios funcionais e arquitetu- ra estrutural geral.

Os especialistas na técnica reconhecem que em cada tipo de toxina clostridiana pode haver subtipos que diferem um pouco em termos de sua sequência aminoacídica, e também em termos dos ácidos nucleicos que codificam essas proteínas.

Por exemplo, existem atualmente

- 10 cinco subtipos de BONT/A, BONT/AI, BoNT/A2, BONT/A3, BONT/A4, e BONT/A5, com subtipos específicos apresentando cerca de 84% a 93°/o de identidade de aminoácidos quando comparados com o subtipo de BONT/A de SEQ ID N°: 1. Como um outro exemplo, existem atualmente cinco subti- pos de BoNT/B, BoNT/BI, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/Bnp, e BoNT/Bbv, 15 com subtipos específicos apresentando cerca de 93% a 96% de identidade de aminoácidos quando comparados com o subtipo de BONT/B de SEQ ID N°: 6. Ainda como um outro exemplo, existem atualmente três subtipos de BONT/E, BONT/EI, BONT/E2, e BONT/E3, com subtipos específicos apre- sentando cerca de 95% a 99% de identidade de aminoácidos quando com- 20 parados com o subtipo de BONT/E de SEQ ID N": 15. Embora todos os sete sorotipos de BONT tenham estrutura e propriedades farmacológicas simila- res, cada um deles também apresenta características bacteriológicas hete- rogêneas.

Em contraste, a toxina tetânica (TeNT) é produzida por um grupo uniforme de C. tetani.

Outras duas espécies de Clostridia, C. baratii e C. 25 butyricum, produzem toxinas, BaNT e BuNT, que são similares à BoNT/F e BONT/E, respectivamente.

Todas as toxinas clostridiana são translad"adas como um poli- peptídio de cadeia simples de aproximadamente 150 kDa que é subsequen- temente clivado por cisão proteolítica em uma alça dissulfeto por uma prote- 30 ase de ocorrência natural (FlG. 1). Esta cIivagem ocorre na região de alça de cadeia dupla distinta criada entre dois resíduos cisteína que formam uma ponte dissulfeto.

Este processamento pós-translacional produz uma molécu-

la de cadeia dupla compreendendo uma cadeia leve (LC) de aproximada- mente 50 kDa e uma cadeia pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa mantidas unidas pela ligação simples dissulfeto e interações não covalentes entre as duas cadeias.

A protease de ocorrência natural usada pàra conver- 5 ter a molécula de cadeia simples na molécula de cadeia dupla ainda não é conhecida.

Em alguns sorotipos, tais como, por exemplo, BONT/A, a protea- se de ocorrência natural é produzida endogenamente pelo sorotipo bacteri- ano e a clivagem ocorre na célula antes de a toxina ser liberada no ambien- te.

Entretanto, em outros sorotipos, tais como, por exemplo, BONT/E, a cepa bacteriana parece não produzir uma protease endógena capaz de converter a forma de cadeia simples da toxina na forma de cadeia dupla.

Nessas situ- ações, a toxina é liberada da célula como uma toxina de cadeia simples que é subsequentemente convertida na forma de cadeia dupla por uma protease de ocorrência natural encontrada no ambiente.

Toda molécula de cadeia simples madura compreende três do- mínios funcionalmente distintos: 1) um domínio enzimático Iocalizado na LC que inclui uma região de metaloprotease contendo uma atividade de endo- peptidase zinco-dependente que tem especificamente como alvo componen- tes de núcleo do aparelho de liberação de neurotransmissores; 2) um do- mínio de translocação contido na metade amino-terminal da HC (Hn) que facilita a liberação da LC das vesículas intracelulares no citoplasma da célu- la alvo; e 3) um domínio de Iigação encontrado na metade carboxil-terminal da HC (HJ que determina a atividade de ligação e a especificidadede Iiga- ção da toxina ao complexo de receptores localizado na superfície da célula alvo.

D. B.

Lacy & R.

C.

Stevens, Sequence Homo/ogy and Structural Analy- sis of the C/ostridia/ Neurotoxins, J.

Mol.

Biol. 291 : 1091-1104 (1999). O domínio H, compreende dois aspectos estruturais distintos de tamanho a- proximadamente igual, separados por uma hélice ot, designados subdomí- nios Hcn e Hcc.

A Tabela 1 fornece regiões limítrofes aproximadas para ca- da domínio e subdomínio encontrado em toxinas clostridiana exemplificati- vas.

Table 1. Sequências e regiõ% de da de mxina dè Clostridial

'°"'" I '::" i '" |;,:: I " I &N H¢ ligante a.

Hc¢

BONT/A 1 M1/P2-L429 C430-C454 14554873 Í874-N1(J80 E1081-Q1091 S1092-L1296

BoNTIB 6 M1/P2-M436 C437-C446 14474860 L861-S1067 Q1068-Q1078 S1079-E1291

BoNT/CI 11 M1/P2.F436 C437-C453 R454-l868 N869-D1OM G1082=L1092 Q1093-E1291 BONT/D 13 M1/T2-V436 C437-C450 1451-1864 N865-S1069 N1069-Q1079 11080-E1276

BoNT/E 15 M1/P2-F411 C412-C426 1427-1847 K848-D1055 E1056-E1066 P1Õ67-K1252

BONT/F 18 M1/P2-F428 C429-C445 1446-1865 K866-D1075 K1076-E1086 P1087-E1274

BONT/G 21 M1IP2-M435 C436-C450 14514865 $866-N1075 A1076-Q1086 S1087-E1297 TeNT 22 M1/P2-L438 C439-C467 I468-L881 K882-N1097 P1098-Y1108 L1109-D1315

BaNT 23 M1/P2-L420 C42bC435 1436-1857 1858-01064 K106&E1075 P1076-E1268 BuNT 24 M1/P2-F411 C412-C426 1427-1847 K848-D1055 E1056-E1066 P1067-K1251

A ligação, translocação, e a atividade enzimática desses três domínios funcionais são todas necessárias para toxicidade.

Apesar de todos os detalhes deste processo ainda não serem conhecidos com exatidão, o mecanismo geral de intoxicação celular por meio do qual as toxinas clostri- 5 diana penetram um neurônio e inibem a 'liberação de neurotransmissores é semelhante, independentemente do sorotipo ou subtipo.

Embora as reque- rentes não pretendam ficar Iimitadas à descrição que se segue, o mecanis- mo de intoxicação pode ser descrito como compreendendo pelo menos qua- tro etapas: 1) ligação do receptor, 2) internalização do complexo, 3) translo- lO cação da cadeia leve, e 4) modificação enzimática do alvo (FlG. 3). O pro- cesso tem início quando o domínio H, de uma toxina clostridiana se liga a um sistema de receptores específico para toxinas Iocalizado na superfície da membrana plasmática de um célula alvo.

Acredita-se que a especificida- de de ligação de um complexo de receptores é atingida, em parte, por com- binações específicas de gangliosídeos e receptores de proteínas que pare- cem compreender distintamente cada complexo toxina clostridiana / recep- tor.

Uma vez ligados, os complexos toxina/receptor são internalizados por endocitose e as vesículas internalizadas são classificadas para rotas intrace- lulares específicas.

A etapa de translocação parece ser desencadeada pela acidificação do compartimento da vesícula.

Este processo parece dar início a dois rearranjos estruturais pH-dependentes importantes que aumentam a hidrofobicidade e promovem a formação da forma de cadeia dupla da toxi-

na.

Uma vez atividade, a endopeptidase de cadeia leve da toxina é liberada da vesícula intracelular para o citosol onde ela parece ter especificamente como alvo um de três componentes de núcleo conhecidos do aparelho de liberação de neurotransmissores.

Essas proteínas de núcleo, proteína 5 membranosa associada à vesícula (WMP)/sinaptobrevina, proteína associ- ada de 25 kDa a sinaptossoma (SNAP-25) e Sintaxina, são necessárias pa- ra atracagem e fusão da vesícula sináptica ao terminal nervoso e constituem membros da família de receptores proteicos de fixação do fator sensível à N-etilmaleimida solúvel (SNARE). A BONT/A e a BONT/E clivam a SNAP-25 na região carboxil-terminal, liberando um segmento de nove ou vinte e seis aminoácidos, respectivamente, e a BoNTICI também cIiva a SNAP-25 perto do terminal carboxil.

Os sorotipos botulínicos BONT/B, BONT/D, BONT/F e BONT/G, e a toxina tetânica, agem na porção central conservada da VAMP, e liberação a porção amino-terminal da VAMP no citosol.

A BONT/CI cliva a sintaxina em um sÍtio simples perto da superfície da membrana citosólica.

A proteólise seletiva das SNAREs sinápticas é responsável pelo bloqueio da liberação de neurotransmissores causada por toxinas clostridiana in vivo.

Os alvos da proteína SNARE de toxinas clostridiana são comuns para a exoci- tose em uma variedade de tipos não neuronais; nessas células, como nos neurônios, a atividade da peptidase de cadeia leve inibe a exocitose, vide, por exemplo, Yann Humeau et al., How Botu/inum and Tetanus Neurotoxins B/ock Neurotransmitter Re/ease, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botu/inum and Tetanus Neurotoxins Structure, Function and Therapeutic Uti/ity, 27(11) Trends Biochem.

Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Joumey of Tetanus and Botu/inum Neurotoxins in Neurons, 11 (9) Trends Microbiol. 431-437, (2003). As estruturas cristalina tridimensionais da BoNT/A, da BoNT/B e do domínio H, da TeNT indicam que os três domínios funcionais das neuro- toxinas clostridiana são estruturalmente distintos que são compartilhadas por todas as toxinas clostridiana.

O motivo de consenso HEXXH da cadeia leve forma a bolsa de ligação a zinco tetraédrico do sÍtio catalítico localizado em uma fenda profunda na superfície da proteína que é accessível por um

Ü canal.

A estrutura dos domínios Hn e H, consiste em topologias de lâminas B que são ligadas por uma hélice cl simples.

O domínio Hn de formato cilín- drico compreende duas hélices cl anfipáticas compridas que se assemelha ao motivo em forma de espiral encontrado em algumas proteínas virais.

O 5 domínio Hn uma alça desestruturada comprida chamada de 'correia de translocação', que fica em volta de uma grande fenda negativamente carre- gada da cadeia leve que bloqueia o acesso do átomo de zinco à bolsa de ligação catalítica do sÍtio ativo.

O domínio H, compreende dois aspectos es- truturais distintos de tamanho aproximadamente igual que indicam função.

O 10 primeiro, designado domínio Hcn, fica localizado na metade amino do domí- nio Hç.

O domínio Hcn forma um barril |3 com topologia rocambole.

O domí- nio Hcc é o segundo domínio que compreende o domínio Hç.

Este domínio carboxil-terminal compreende um domínio trifólio j3 modificado que forma três regiões de ligação de carboidratos distintas que se assemelham à por- 15 ção de ligação de carboidratos em uma proteínas fixadoras de açúcar, tais como, por exemplo, soro amiloide P, sialidase, cryia, 3-endotoxina inseticida e lectinas.

Estudos bioquímicos indicam a estrutura de domínio trifólio j3 do domínio Hçç parece mediar a ligação ao carboidrato específico contendo componentes do receptor de toxina clostridiana receptor na superfície celu- 20 lar, vide, por exemplo, Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Fa- mily Provides Residue Level lnformation About the Putative Ganglioside Bin- ding Site, 482(1-2) FEBS Lett. 119-124 (2000)- O domínio H, se inclina para longe do domínio Hn expondo as alças superficiais e deixando-as accessí- 25 veis para ligação.

Não ocorre qualquer contanto entre a cadeia leve e o do- mínio Hç.

Os aspectos da presente invenção oferecem, em parte, uma to- xina clostridiana.

Conforme usado neste relatório, o termo "clostridiana toxin" refere-se a qualquer neurotoxina produzida por uma cepa de toxina clostridi- 30 ana que pode executar o mescanismo celular completo por meio do qual uma toxina clostridiana intoxica uma célula e abrange a Iigação de uma toxi- na clostridiana a um complexo de receptores de baixa ou alta afinidade, a a internalização do complexo toxina/receptor, a translocação da cadeia leve da toxina clostridiana para o citoplasma e a modificação enzimática de um substrato de toxina cIostridiana.

Uma toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de toxina clostridiana, um domínio de translocação de 5 toxina clostridiana, e um domínio de ligação de toxina clostridiana.

Toxinas clostridiana exemplificativas incluem aquelas produzidas por uma CIostridi- um botulinum, uma Clostridium tetani, uma Clostridium baratii e uma Clostri- dium butyricum.

Uma toxina clostridiana inclui, sem limitação, variantes de ocor- IO rência natural de toxina clostridiana, tais como, por exemplo, isoformas de toxina clostridiaha e subtipos de toxina clostridiana; variantes de ocorrência não natural de toxina clostridiana, tais como, por exemplo, variantes conser- vativas de toxina clostridiana, variantes não conservativas de toxina clostri- diana, e fragmentos ativos de toxina clostridiana das mesmas, ou qualquer 15 combinação dos mesmos.

Conforme usado neste relatório, o termo "variante de toxina clostridiana", seja de ocorrência natural ou de ocorrência não natu- ral, refere-se a uma toxina clostridiana que tem pelo menos uma alteração de aminoácido em relação à região correspondente das sequências de refe- rência apresentadas (Tabela 1) e pode ser descrita em percentagem de i- 20 dentidade em relação à região correspondente daquela sequência de refe- rência.

Como exemplos não limitativos, uma variante de BONT/A de SEQ ID N°: 1 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exem- plo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação às po- sições correspondentes de SEQ ID N°: 1; uma variante de BONT/B de SEQ 25 ID N°: 6 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por e- xemplo, uma substitui¢ão, deleção ou adição de aminoácido, em relação às posições correspondentes dè SEQ ID N°: 6; uma variante de BONT/CI de SEQ ID N°: 11 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em rela- 30 ção às posições correspondentes de SEQ ID N°: 11: uma variante de BONT/D de SEQ ID N°: 13 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido,

em relação às posições correspondentes de SEQ ID N°: 13; uma variante de BONT/E de SEQ ID N°: 15 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação às posições correspondentes de SEQ ID N°: 15; uma variante de 5 BONT/F de SEQ ID N°: 18 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição,' deleção ou adição de aminoácido, em relação às posições correspondentes de SEQ ID N°: 18; uma variante de BONT/G de SEQ ID N°: 21 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação às posições correspondentes de SEQ ID N°: 21; uma TeNT vari- ante c de SEQ ID N°: 22 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação às posições correspondentes de SEQ ID N°: 22; uma variante de BaNT de SEQ ID N°: 23 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação às posições correspondentes de SEQ ID N°: 23; e uma variante de BuNT de SEQ ID N°: 24 terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação às posições correspondentes de SEQ ID N°: 24. Conforme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência natural de toxina clostridiana" refere-se a qualquer toxina clostridiana produ- zida sem o auxílio de qualquer manipulaçãao humana, incluindo, sem limita- ção, isoformas de toxina clostridiana produzidas a partir de transcritos alter- nativamente emendados, isoformas de toxina clostridiana produzidas por mutação espontânea e subtipos de toxina cIostridiana.

Exemplos não limita- tivos de uma toxina clostridiana isoform incluem, por exemplo, isoformas de BONT/A, isoformas de BONT/B, isoformas de BONT/CI, isoformas de BONT/D, isoformas de BONT/E, isoformas de BONT/F, isoformas de BoNT/G, isoformas de TeNT, isoformas de BaNT e isoformas de BuNT.

E- xemplos não limitativos de um subtipo de toxina clostridiana incluem, por exemplo, subtipos de BONT/A BONT/AI, BoNT/A2, BONT/A3, BONT/A4, e BONT/A5; subtipos de BONT/B BONT/BI, BONT/B2, BONT/B3, BONT/B biva-

lente e BoNT/B não proteolítica; subtipos de BONT/CI BONT/CI-I e BoNT/C1-2; subtipos de BoNT/E BoNT/EI, BoNT/E2, e BoNT/E3; subtipos de BONT/F BONT/FI, BONT/F2, e BONT/F3; e BuNT subtipos BuNT-1, e BuNT-2. Other exemplos não limitativos de um subtipo de toxina clostridiana 5 incluem, por exemplo, subtipos de BONT/A SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, e SEQ ID N°: 5; subtipos de BONT/B SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, e SEQ ID N°: 10; subtipos de BoNT/CI SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12; subtipos de BoNT/E SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e SEQ ID N°: 17; subtiposde BONT/F SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, e SEQ ID N°: 20; e BuNT subtipos SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25. Conforme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência não natural de toxina clostridiana" refere-se a qualquer toxina clostridiana produzida com o auxílio de manipulação humana, incluindo, sem limitação, toxinas clostridiana produzido por engenharia genética usando mutagênese aleatória ou desenho racional e toxinas clostridiana produzidas por sÍntese química.

Exemplos não limitativos de variantes de ocorrência não natural de toxina cIostridiana incluem, por exemplo, variantes conservativas de toxina clostridiana, variantes não conservativas de toxina clostridiana, e fragmentos ativos de toxina clostridiana.

Conforme usado neste relatório, o termo "variante conservativa de toxina clostridiana" refere-se a uma toxina clostridiana que tem pelo me- nos um aminoácido substituído por um outro aminoácido ou um análogo de aminoácido que tem pelo menos uma propriedade similar àquela do amino- ácido original da sequência de referência da toxina clostridiana (Tabela 1). Exemplos de propriedades incluem, sem limitação, tamanho similar, topo- grafia, carga, hidrofobocidade, hidrofilicidade, lipofilicidade, capacidade de ligação covalente, capacidade de ligação hidrogênio, uma propriedade físi- co-química, entre outras, ou qualquer combinação das mesmas.

Uma vari- ante conservativa de toxina clostridiana pode funcionar substancialmente da mesma maneira que a toxina clostridiana de referência na qual a variante conservativa de toxina clostridiana se baseia, e pode substituir a toxina clos-

tridiana de referência em qualquer aspecto da presente invenção.

Uma vari- ante conservativa de toxina clostridiana pode substituir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, ou 500 ou mais aminoácidos da toxina clostridiana de referência na qual a variante conservativa de toxina clostridi- 5 ana se baseia.

Uma variante conservativa de toxina clostridiana também pode substituir pelo menos 5, 10, 15, 20, ou 25 aminoácidos adjacentes da toxina cIostridiana de referência na qual a variante conservativa de toxina clostridiana se baseia.

Exemplos não limitativos de uma variante conservati- va de toxina clostridiana incluem, por exemplo, variantes conservativas de BONT/A, variantes conservativas de BONT/B, variantes conservativas de BoNT/CI, variantes conservativas de BONT/D, variantes conservativas de BONT/E, variantes conservativas de BONT/F, variantes conservativas de BONT/G, variantes conservativas de TeNT, variantes conservativas de BaNT e variantes conservativas de BuNT.

Conforme usado neste relatório, o termo "variante não conseNa- tiva de toxina clostridiana" refere-se a uma toxina clostridiana na qual 1) pelo menos um aminoácido é deletado from the toxina clostridiana de referência na qual a variante não conseNativa de toxina clostridiana se baseia; 2) pelo menos one amino acid added a a toxina clostridiana de referência na qual a toxina clostridiana não conservativa se baseia; ou 3) pelo çnenos um amino- ácido é substituído por um outro aminoácido ou por um análogo de aminoá- cido que não compartilha qualquer propriedade similar àquela do aminoáci- do original da sequência de referência da toxina clostridiana (Tabela 1). Uma variante não conseNativa de toxina cIostridiana pode funcionar subs- tancialmente da mesma maneira que a toxina clostridiana de referência na qual a variante não conservativa de toxina clostridiana se baseia, e pode substituir a toxina cIostridiana de referência em qualquer aspecto da presen- te invenção.

Uma variante não conservativa de toxina clostridiana pode dele- tar um ou mais aminoácidos, dois ou mais aminoácidos, três ou mais ami- noácidos, quatro ou mais aminoácidos, cinco ou mais aminoácidos, e dez ou mais aminoácidos da toxina clostridiana de referência na qual a variante não conservativa de toxina clostridiana se baseia.

Uma variante não conservati-

va de toxina clostridiana pode adicionar um ou mais aminoácidos, dois ou mais aminoácidos, três ou mais aminoácidos, quatro ou mais aminoácidos, cinco ou mais aminoácidos, e dez ou mais aminoácidos à toxina clostridiana de referência na qual a variante não conservativa de toxina clostridiana se 5 baseia.

Uma variante não conservativa de toxina clostridiana pode substituir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, ou 500 ou mais ami- noácidos da toxina clostridiana de referência na qual a variante não conser- vativa de toxina cIostridiana se baseia.

Uma variante não conservativa de toxina clostridiana também pode substituir pelo menos 5, 10, 15, 20, ou 25 aminoácidos adjacentes da toxina clostridiana de referência na qual a vari- ante não conservativa de toxina clostridiana se baseia.

Exemplos não limita- tivos de uma variante não conservativa de toxina clostridiana incluem, por exemplo, variantes não conservativas de BONT/A, variantes não conservati- vas de BONT/B, variantes não conservativas de BONT/CI, variantes não conservativas de BONT/D, variantes não conservativas de BONT/E, variantes não conservativas de BONT/F, variantes não conservativas de BoNT/G, vari- antes não conservativas de TeNT, variantes não conservativas de BaNT e variantes não conservativas de BuNT.

Vislumbrou-se também que qualquer um de uma variedade de fragmentos de toxina clostridiana pode ser útil nos aspectos da presente invenção com a condição de que esses fragmentos ativos podem executar o

. mecanismo celular completo por meio do qual uma toxina clostridiana cliva proteoliticamente um substrato.

Assim sendo, aspectos desta modalidade podem incluir fragmentos de toxina cIostridiana tendo um comprimento de, por exemplo, pelo menos 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, ou pelo menos 1200 aminoácidos.

Outros aspectos desta modalidade podem incluir frag- mentos de toxina clostridiana tendo um comprimento de, por exemplo, no máximo 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, ou no máximo 1200 aminoácidos.

Vislumbrou-se também que qualquer um de uma variedade de fragmentos de toxina cIostridiana compreendendo a cadeia leve pode ser útil nos aspectos da presente invenção com a condição de que esses fragmen- tos de cadeia leve podem ter especificamente como alvo os componentes

-

de núcleo do aparelho de liberação de neurotransmissores e portanto parti- cipar na execução do mecanismo celular completo por meio do qual uma toxina clostridiana cliva proteoliticamente um substrato.

As cadeias leves das toxinas clostridiana têm aproximadamente 420-460 aminoácidos de 5 comprimento e compreendem um domínio enzimático de toxina clostridiana (Tabela 1). As pesquisas mostraram que o comprimento inteiro de uma ca- deia leve de toxina clostridiana não é necessário para a atividade enzimática do domínio enzimático da toxina clostridiana.

Como um exemplo não limita- tivo, os oito primeiros aminoácidos da cadeia leve de uma BONT/A não são

- 10 necessários para a atividade enzimática.

Como um outro exemplo não limi- tativo, os oito primeiros aminoácidos da cadeia leve de TeNT não são ne- cessários para a atividade enzimática.

Da mesma forma, o terminal carboxil da cadeia Ieve não é necessária para atividade.

Como um exemplo não limi- tativo, os 32 últimos aminoácidos da cadeia leve de BONT/A não são neces- 15 sários para a atividade enzimática.

Como um outro exemplo não limitativo, os 31 últimos aminoácidos da cadeia leve de TeNT não são necessários para a atividade enzimática.

Assim sendo, os aspectos desta modalidade incluem uma cadeia leve de toxina clostridiana compreendendo um domínio enzimático de toxina cIostridiana tendo um comprimento de, por exemplo, 20 pelo menos 350, 375, 400, 425, ou 450 aminoácidos.

Outros aspectos desta modalidade incluem uma cadeia Ieve de toxina clostridiana compreendendo um domínio enzimático de toxina clostridiana tendo um comprimento de, por exemplo, no máximo 350, 375, 400, 425, ou 450 aminoácidos.

Vislumbrou-se também que qualquer uma de uma variedade de 25 regiões Hn de toxina clostridiana compreendendo um domínio de transloca- ção de toxina clostridiana pode ser útil nos aspectos da presente invenção com a condição de que esses fragmentos ativos possam facilitar a liberação da LC de vesículas intracelulares no citoplasma da célula alvo e portanto participar na execução do mecanismo celular completo por meio do qual 30 uma toxina clostridiana cliva proteoliticamente um substrato.

As regiões Hn das cadeias pesadas de toxina clostridiana têm aproximadamente 410-430 aminoácidos de comprimento e compreendem um domínio de translocação de toxina clostridiana (Tabela 1). As pesquisas mostraram que o comprimen- to inteiro de uma região Hn de uma cadeia pesada de uma toxina clostridia- na não é necessário para a atividade de translocação do domínio de trans- Iocação de toxina clostridiana.

Assim sendo, aspectos desta modalidade 5 podem incluir regiões Hn de toxina clostridiana compreendendo um domínio de translocação de toxina clostridiana tendo um comprimento de, por exem- plo, pelo menos 350, 375, 400, ou 425 aminoácidos.

Outros aspectos desta modalidade podem incluir regiões Hn de toxina clostridiana compreendendo um domínio de translocação de toxina clostridiana tendo um comprimento de, por exemplo, no máximo 350, 375, 400, ou 425 aminoácidos.

Vislumbrou-se também que qualquer uma de uma variedade de regiões H, de toxina clostridiana compreendendo um domínio de ligação de toxina clostridiana pode ser útil nos aspectos da presente invenção com a condição de que esses fragmentos ativos possam determina a atividade de ligação e a especificidade de ligação da toxina ao complexo de receptores Iocalizado na superfície da célular alvo e facilitar o mecanismo celular com- pIeto por meio do qual uma toxina clostridiana cliva proteoliticamente um substrato.

As regiões H, das cadeias pesadas de toxina clostridiana têm a- proximadamente 400-440 aminoácidos de comprimento e compreendem um domínio de ligação (Tabela 1). As pesquisas mostraram que o comprimento inteiro de uma região H, de uma cadeia pesada de uma toxina clostridiana não é necessário para a atividade de ligação do domínio de ligação de toxi- na clostridiana.

Assim sendo, aspectos desta modalidade podem incluir re- giões H, de toxina clostridiana compreendendo um domínio de ligação tendo um comprimento de, por exemplo, pelo menos 350, 375, 400, ou 425 ami- noácidos.

Outros aspectos desta modalidade podem incluir regiões H, de toxina clostridiana compreendendo um domínio de ligação tendo um com- primento de, por exemplo, no máximo 350, 375, 400, ou 425 aminoácidos.

Qualquer um de uma variedade de métodos de alinhamento de sequências pode ser usado para determinar a percentagem de identidade, incluindo, sem limitação, métodos globais, métodos locais e métodos híbri- dos, tais como, por exemplo, métodos de abordagem de segmentos.

Os pro-

tocolos para determinação da percentagem de identidade são procedimen- tos rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados neste relatório. . Métodos globais alinham sequência do início para o final da mo- 5 lécula e determinam o melhor alinhamento somando escores de pares de resíduos individuais e impondo "gap penalties". Métodos não limitativos in- cluem, por exemplo, CLUSTAL W, vide, por exemplo, Julie D.

Thompson et al., CLUSTAL W: lmproving the Sensitivity of Progressive Mu/tjp/e Sequence A/ignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Pena/ties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); e refinamento iterativo, vide, por exemplo, Osamu Gotoh, Significant lmprovement in Accuracy of Mu/tip/e Protein Sequence A/ignments by ltera- tive Re/inement as Assessed by Reference a Structural A/ignments, 264(4) J.

Mol.

Biol. 823-838 (1996). Métodos locais alinham sequências identificando um ou mais motivos conservads compartilhados por todas as sequências de entrada. - Métodos não limitativos incluem, por exemplo, Match-box, vide, por exem- plo, Eric Depiereux & Ernest Feytmans, Match-8ox: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); amostragem de Gibbs, vide, por exemplo, C.

E.

Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, vide, por exemplo, Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multi- pIe Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics,: 1428- 1435 (2004). Métodos híbridos combinaam aspectos funcionais dos métodos globais e locais de alinhamento.

Métodos não limitativos incluem, por exem- plo, comparação de segmento com segmento, vide, por exemplo, Burkhard Morgenstern et al., Mu/t(p/e DNA and Protein Sequence A/ignment Based On Segment-To-Segment Comparison, 93(22) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A. 12098-12103 (1996); T-Coffee, vide, por exemplo, Cedric Notredame et al., T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment, 302(1) J.

Mol.

Biol. 205-217 (2000); MUSCLE, vide, por exemplo, Robert C. Edgar, MUSCLE: Mu/tjp/e Sequence A/ignment With High Score Accuracy and High Throughput, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004); e DIALIGN-T, vide, por exemplo, Amarendran R Subramanian et al., DIALIGN-T: An lmproved 5 A/gorithm for Segment-Based Mu/t(p/e Sequence A/ignment, 6(1) BMC Bioin- formatics 66 (2005).

A presente invenção descreve diversas variantes de polipeptídio onde um aminoácido é substituído por outro aminoácido, tal como, por e- xemplo, variantes de toxina cIostridiana, variantes de domínio enzimático de toxina clostridiana, variantes de domínio de translocação de toxina clostridi- ana, variantes de domínio de ligação de toxina clostridiana, variantes de domínio de ligação de toxina não clostridiana, e variantes de sÍtio de cliva- gem da protease. Uma substituição pode ser avaliadas por diversos fatores, tais como, por exemplo, as propriedades físicas do aminoácido sendo subs- tituído (Tabela 2) ou como o aminoácido original toleraria uma substituição (Tabela 3). As seleções de qual aminoácido pode substituir um outro amino- ácido em um polipeptídio são de conhecimento do especialista na técnica.

! Tabela 2. Propriedades dos aminoácidos +u mh hàwuma : Propriedade I Aminoácidos

J ! alifático I G, A, l, L, M, P,V ) amático, W, Y --.—-.—.— . com ramificacão em C-betíj I, V, T i, hidOfoW, C, F,l, L, M,V, \N i polar pequeno I D, N, P j ) não pofar pequeno, A, C, G,S, T ! polargrande ., ) —·— E, H, K, Q, R, W, Y i não poIar gmride ' '""e, I, L, M, V | carregado D, E, H, K, R i ; não carregado. I C, S, T ¶ ) negatNo, I D, E posÍtiVo I H, K, R lí- i _ ácklo, ) D, E r ! básico I K, R ! { amídã I N, Q jTabda 3. Substituições de amincácidos Amlnoãcido I SubstiMção preMda j substituições nwú"as Substituição depda

S C, E, I. K, M, L, P. Q. R.V i A I G, S,T ) C I F, S, Y, W A, H, l. M, L, T, V D, E, G, K, N, P, Q, R D I E, N G, H, K, P, Q, R, S. T A, C, I, L, : E I D, K Cl !

Ê A, H, N, P, R, S,T C, F, G,|, L, M,V,W,Y F I M, L, W. Y ! C, I, V A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T ,.,—— : G I A, S ' D. K, N, P, Q. R C, E, F, H, I, L, M, T, V, W, Y C, D, E, K, Q, RÍÀTW —— .,--.. L . H I N, Y i A, F, G, I, L, M, P,V A, C,T, F,Y D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S,W !' mj——"'"" ; . Z K I Q A, D, G, H, M, N, P, s,í' C, F, l, L,V,W, Y A, C, W, Y D, E, G, H, K, N,P,Q, R,S, T i L I F,l, M,V i i M I F, í, L, V I A. C. R, Q, K, T, W, Y D, E, G, H, N, P, S N D, H, S i E. G, K Q, R, T A, C, F, I, L, M, P, V, W, Y P A, D, E, G, K, Q, R, S, T C, F, H, I, L, M, N,V, W, Y Q E, K R ! A, D, G, H, M, N, P, S, T C, F, [, L,V,W, Y R K, Q ' A, D, E, G, H, M, N, P,S, T C, F, I, L,V, W, Y S A, N,T l C, D, E, G, H, K, P, Q, R, T F, I, L, M, V, W, Y i A, C, D. E, H, I, K, M, N. P, T S F, G, L.W.Y l Q, R, V q .L V I, L, M i A, C, F, T, Y D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, W A C, D, E, G, I, K, N, P, Q, R, S, W F, Y H, L, M T, V Y F, H, W C, I, L. M.V A, D,E, G. K, N, P. Q, R, S,T Matthew J. Betts & Robert, B. Russell, Amino Acid Properties and Consequences of Substitutions, págs. 289-316, ln Bioinformatics for Geneticists, (eds Michael R.

Barnes, lan C. Gray, Wiley, 2003). Assim sendo, em uma modalidade, uma toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de toxina clostridiana, um domínio de translocação de toxina clostridiana, e um domínio de ligação de toxina clos- tridiana. Em um aspecto desta modalidade, uma toxina clostridiana compre- ende uma variante de ocorrência natural de toxina clostridiana, tal como, por exemplo, uma toxina clostridiana isoform ou um subtipo de toxina clostridia- na. Em um outro aspecto desta modalidade, uma toxina clostridiana com- preende uma variante de ocorrência não natural de toxina clostridiana, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de toxina clostridiana, uma variante não conservativa de toxina clostridiana ou um fragmento ativo de toxina cIostridiana, ou qualquer combinação dos mesmos. Em um outro as- pecto desta modalidade, uma toxina clostridiana compreende um domínio " enzimático de toxina clostridiana ou um fragmento ativo do mesmo, um do-

mínio de translocação de toxina clostridiana ou um fragmento ativo do mes- mo, um domínio de ligação de toxina clostridiana ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana can compreendem uma BoNT/A, uma 5 BONT/B, uma BONT/CI, uma BONT/D, uma BONT/E, uma BONT/F, uma BoNT/G, uma TeNT, uma BaNT, ou uma BuNT.

Em uma outra modalidade, um aminoácido hidrófobo em uma posição particular na cadeia polipeptídica da toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido hidrófobo.

Exemplos de aminoácidos hidrófobos incluem, por exemplo, C, F, I, L, M, V e W.

Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido alifático em uma posição particular na cadeia polipeptídica da toxina cIostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido alifático.

Exemplos de aminoácidos alifáticos incluem, por e- xemplo, A, I, L, P, e V.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido aromático em uma posição particular na cadeia polipeptídica da toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido aromático.

Exemplos de aminoácidos aromáticos incluem, por exemplo, F, H, W e Y.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de empilha- mento em uma posição particular na cadeia polipeptídica da toxina cIostridi- ana pode ser substituído por um outro aminoácido de empilhamento.

Exem- pIos de aminoácidos de empilhamento incluem, por exemplo, F, H, W e Y.

Em um outro aspecto desta modalidade, a polar amino acid em uma posição particular na cadeia polipeptídica da toxina cIostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido polar.

Exemplos de aminoácidos polares incluem, por exemplo, D, E, K, N, Q, e R.

Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido menos polar ou indiferente em uma posição particular na cadeia poIipeptídica da toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido menos polar ou indiferente.

Exemplos de aminoácidos menos polares ou indiferentes incluem, por exemplo, A, H, G, P, S, T, e Y.

Em ain- da um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga positiva em uma posição particular na cadeia polipeptídica da toxina clostridiana po- de ser substituído por um outro aminoácido de carga positiva.

Exemplos de

-

aminoácidos de carga positiva incluem, por exemplo, K, R, e H.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga negativa em uma posição particular na cadeia polipeptídica da toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de carga negativa.

Exemplos de 5 aminoácidos de carga negativa incluem, por exemplo, D e E.

Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido pequeno em uma posição parti- cular na cadeia polipeptídica da toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido pequeno.

Exemplos de aminoácidos pequenos inclu- em, por exemplo, A, D, G, N, P, S, e T.

Em ainda um outro aspecto desta 10 modalidade, um aminoácido ramificado em C-beta em uma posição particu- lar na cadeia polipeptídica da toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido ramificado em C-beta.

Exemplos de aminoácidos ramifica- dos em C-beta incluem, por exemplo, 1, T e V.

Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende 15 . a BONT/A.

Em um aspecto desta modalidade, uma BONT/A compreende um domínio enzimático de BONT/A, um domínio de translocação de BONT/A, e um domínio de ligação BONT/A.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/A compreende a SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em um outro aspecto desta modalidade, 20 uma BONT/A compreende uma variante de ocorrência natural de BONT/A, tal como, por exemplo, uma isoforma de BONT/A ou um subtipo de BONT/A.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BoNT/A compreende uma va- riante de ocorrência natural de BONT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ r

ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N": 5, tal como, por exemplo, uma iso- 25 forma de BONT/A ou um subtipo de BoNT/A.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/A compreende uma variante de ocorrência não natural de BONT/A, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BONT/A, uma variante não conservativa de BONT/A ou um fragmento ati- vo de BoNT/A, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro 30 aspecto desta modalidade, uma BONT/A compreende uma variante de ocor- rência não natural de BoNT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5, tal como, por exemplo, uma variante con-

servativa de BONT/A, uma variante não conservativa de BONT/A, um frag- mento ativo de BONT/A, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/A compreende um domínio enzimático de BONT/A ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de 5 translocação de BONT/A ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação BONT/A ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/A compreendendo um domínio enzimático de BONT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BONT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5, ou um frag- mento ativo do mesmo, um domínio de ligação BONT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5, ou um frag- mento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/A compreen- de um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, peio menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 70°6, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Ó°/o, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N": 5. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em rela- ção à SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N": 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/A compre- ende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos -1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou subs-

tituições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 1, 5 SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende uma BONT/B.

Em um aspecto desta modalidade, uma BoNT/B compreende um domínio enzimático de BoNT/B, um domínio de translocação de BONT/B, e um domínio de ligação de BoNT/B.

Em um outro aspecto desta modalida- lO de, uma BONT/B compreende a SEQ ID N": 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/B compreende uma variante de ocorrência natural de BoNT/B, tal como, por exemplo, uma isoforma de BONT/B ou um subtipo de BONT/B.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/B compreende uma va- riante de ocorrência natural de BONT/B de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ - ID N°: 8, SEQ ID N": 9, ou SEQ ID N°: 10, tal como, por exemplo, uma iso- forma de BONT/B ou um subtipo de BONT/B.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/B compreende uma variante de ocorrência não natural de BONT/B, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BONT/B, uma variante não conservativa de BONT/B, um fragmento ativo de BoNT/B, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um' outro as- pecto desta modalidade, uma BONT/B compreende uma variante de ocor- rência não natural de BONT/B de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, tal como, por exemplo, uma variante con- servativa de BONT/B, uma variante não conservativa de BONT/B, um frag- mento ativo de BONT/B, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/B compreende um domínio enzimático de BoNT/B ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BoNT/B ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BoNT/B ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combina- ção dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/B compreende um domínio enzimático de BONT/B de SEQ ID N°: 6,

SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, ou um frag- mento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BONT/B de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BONT/B de SEQ ID 5 N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/B compreen- de um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo

- 10 menos 9Ô°/o, ou pelo menos 95% com a SEQ ID j\j°; 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 102; ou no máximo 70%, no máximo . 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo , 95% com a SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/B 15 compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300,- 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em reiação à SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 dele- 20 ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em rela- ção à SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/B compre- ende um polipeptÍdio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou subs- 25 tituições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 6, SEQIDN°:7,SEQID N°:8,SEQID N°:9,ou SEQID N°: 10. 30 Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende uma BoNT/CI.

Em um aspecto desta modalidade, uma BONT/CI compre- ende um domínio enzimático de BONT/CI, um domínio de translocação de

BONT/CI, e um domínio de ligação de BoNT/CI. Em um outro aspecto des- ta modalidade, uma BoNT/CI compreende a SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°:

12. Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/CI compreende uma variante de ocorrência natural de BONT/CI, tal como, por exemplo, 5 uma isoforma de BONT/CI ou um subtipo de BONT/CI. Em um outro aspec- to desta modalidade, uma BONT/CI compreende uma variante de ocorrên- cia natural de BONT/CI de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12, tal como, por exemplo, uma isoforma de BoNT/CI ou um subtipo de BoNT/CI. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/CI compreende uma vari- " 10 ante de ocorrência não natural de BONT/CI, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BONT/CI, uma variante não conservativa de . BONT/CI, um fragmento ativo de BoNT/CI, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/CI compreende uma variante de ocorrência não natural de BONT/CI de SEQ ID 15 N°: 11 ou SEQ ÍD N°: 12, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BONT/CI, uma variante não conservativa de BONT/CI, um fragmento ativo de BoNT/CI, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um ou- tro aspecto desta modalidade, uma BONT/CI compreende um domínio en- zimático de BONT/CI ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de 20 translocação de BoNT/CI ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BoNT/CI, um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combina- ção dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/CI compreende um domínio enzimático de BONT/CI de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de 25 translocação de BONT/CI de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12, ou um frag- mento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BoNT/CI de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12, ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combi- nação dos mesmos. Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/CI compre- 30 ende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exem- pIo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°:

12; ou no máximo 7Õ°/o, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°:

12. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/CI compreen- de um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 5 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/CI compreende um polipep- tídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de a- minoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 3; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 11 ouSEQIDN°:12. Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende uma BONT/D. Em um aspecto desta modalidade, uma BoNT/D compreende um domínio enzimático de BONT/D, um domínio de translocação de BoNT/D, e um domínio de ligação de BONT/D. Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/D compreende a SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/D compreende uma variante de ocorrência natural de BONT/D, tal como, por exemplo, uma iso- forma de BONT/D ou um subtipo de BONT/D. Em um outro aspecto desta modalidade, uma BoNT/D compreende uma variante de ocorrência natural de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14, tal como, por exemplo, uma isoforma de BONT/D ou um subtipo de BONT/D. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/D compreende uma variante de ocorrência não natural de BONT/D, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BONT/D, uma variante não conservativa de BONT/D, um fragmento ativo de BONT/D, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro as- pecto desta modalidade, uma BONT/D compreende uma variante de ocor-

rência não natural de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BONT/D, uma variante não con- servativa de BONT/D, um fragmento ativo de BONT/D, ou qualquer combina- ção dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma 5 BONT/D compreende um domínio enzimático de BoNT/D ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BoNT/D ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BONT/D ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro as- pecto desta modalidade, uma BONT/D compreende um domínio enzimático

- 10 de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14, ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos. 15 Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/D compreen- de um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Ô°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no 20 máximo 90%, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 25 14; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacen- tes em relação à SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em ainda outros aspec- tos desta modalidade, uma BoNT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 30 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos ad- jacentes em relação à SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adi-

ções, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°:13ouSEQIDN°:14. Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende uma BoNT/E.

Em um aspecto desta modalidade, uma BONT/E compreende 5 um domínio enzimático de BoNT/E, um domínio de translocação de BONT/E, e um domínio de Iigação de BONT/E.

Em um outro aspecto desta modalida- de, uma BONT/E compreende a SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/E compreende uma variante de ocorrência natural de BONT/E, tal como, por exemplo, uma

- 10 isoforma de BONT/E ou um subtipo de BONT/E.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/E compreende uma variante de ocorrência natural de BoNT/E de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N": 17, tal como, por exemplo, uma isoforma de BONT/E ou um subtipo de BONT/E.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/E compreende uma varian- 15 te de ocorrência não natural de BONT/E, tal como, por exemplo, uma varian- te conservativa de BONT/E, uma variante não conservativa de BONT/E, um fragmento ativo de BONT/E, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ain- da um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/E compreende uma va- riante de ocorrência não natural de BONT/E de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 20 16, ou SEQ ID N°: 17, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BONT/E, uma variante não conservativa de BoNT/E, um fragmento ativo de BONT/E, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BoNT/E compreende um domínio enzimático de BONT/E ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de 25 BONT/E ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BONT/E ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/E com- preende um domínio enzimático de BONT/E de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de 30 translocação de BONT/E de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de Iigação de BONT/E de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17, ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/E compreen- de um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo 5 menos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Ó°/o, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em ainda outros aspectos desta modali- dade, uma BONT/E compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/E compreende um poIipeptídio tendo, por e- xemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacen- tes em relação à SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16,-ou SEQ ID N°: 17; no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- çãoàSEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N": 17. Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende uma BONT/F.

Em um aspecto desta modalidade, uma BoNT/F compreende um domínio enzimático de BONT/F, um domínio de translocação de BoNT/F, e um domínio de ligação de BONT/F.

Em um outro aspecto desta modalida- de, uma BONT/F compreende a SEQ ID N°: 18, SEQ ID N": 19, ou SEQ ID N°: 20. Em um outro aspecto desta modalidade, uma BoNT/F compreende uma variante de ocorrência natural de BONT/F, tal como, por exemplo, uma isoforma de BoNT/F ou um subtipo de BONT/F.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/F compreende uma variante de ocorrência natural de BONT/F de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, tal como,

por exemplo, uma isoforma de BoNT/F ou um subtipo de BoNT/F.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/F compreende uma variante de ocorrência não natural de BONT/F, tal como, por exemplo, uma variante conseNativa de BONT/F, uma variante não conservativa de BONT/F, um 5 fragmento ativo de BONT/F, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ain- da um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/F compreende uma vari- ante de ocorrência não natural de BoNT/F de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou Seq ID N°: 20, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BONT/F, uma variante não conservativa de BONT/F, um fragmento ativo de

" 10 BONT/F, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BoNT/F compreende um domínio enzimático de BONT/F ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BONT/F ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BONT/F ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos 15 mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BoNT/F com- preende um domínio enzimático de BoNT/F de SEQ ID N": 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BONT/F de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BONT/F de 20 SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BoNT/F compreen- de um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo 25 menos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85°6, no máximo 90%, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos desta modali- dade, uma BONT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo 30 menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N": 20; no máximo 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/F compreende um polipeptídio tendo, por e- 5 xemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacen- tes em relação à SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela-

- 10 çãOàSEQID N°: 18,SEQID N°: 19,ou SEQID N°:20. Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende . uma BoNT/G.

Em um aspecto desta modalidade, uma BONT/G compreende um domínio enzimático de BONT/G, um domínio de translocação de BONT/G, e um domínio de ligação de BONT/G.

Em um outro aspecto desta 15 modalidade, uma BONT/G compreende a SEQ ID N°: 21. Em um outro as- pecto desta modalidade, uma BONT/G compreende uma variante de ocor- rência natural de BONT/G, tal como, por exemplo, uma isoforma de BONT/G ou um subtipo de BoNT/G.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/G compreende uma variante de ocorrência natural de BONT/G de 20 SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, uma isoforma de BONT/G ou um sub- tipo de BoNT/G de SEQ ID N°: 21. Em ainda um outro aspecto desta moda- lidade, uma BONT/G compreende uma variante de ocorrência não natural de BONT/G, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BoNT/G, uma variante não conservativa de BONT/G ou um fragmento ativo de BONT/G, ou 25 qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta mo- dalidade, uma BONT/D compreende uma variante de ocorrência não natural de BONT/G de SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, uma variante conser- vativa de BONT/G, uma variante não conservativa de BONT/G, um fragmento ativo de BONT/G, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro 30 aspecto desta modalidade, uma BoNT/G compreende um domínio enzimáti- co de BoNT/G ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de transloca- ção de BONT/G ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de

BoNT/G ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/G com- preende um domínio enzimático de BONT/G de SEQ ID N°: 21 ou um frag- mento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BONT/G de SEQ ID 5 N°: 21 ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BONT/G de SEQ ID N°: 21 ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combina- ção dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/G compreen- de um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 21; ou no máximo 7Õ°/o, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta moda- lidade, uma BoNT/G compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 "deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 21; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de a- minoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/G compreende um polipeptídio ten- do, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rekção à SEQ ID N°: 21; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 21. Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende uma TeNT.

Em um aspecto desta modalidade, uma TeNT compreende um domínio enzimático de TeNT, um domínio de translocação de TeNT, e um domínio de ligação de TeNT.

Em um aspecto desta modalidade, uma TeNT compreende a SEQ ID N°: 22. Em um outro aspecto desta modalidade, uma TeNT compreende uma variante de ocorrência natural de TeNT, tal como, por exemplo, uma isoforma de TeNT ou um subtipo de TeNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma TeNT compreende uma variante de ocor- rência natural de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma iso- forma de TeNT ou um subtipo de TeNT.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma TeNT compreende uma variante de ocorrência não natural 5 de TeNT, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de TeNT, uma variante não conservativa de TeNT, um fragmento ativo de TeNT, ou qual- quer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalida- de, uma TeNT compreende uma variante de ocorrência não natural de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma variante conservativa

- 10 de TeNT, uma variante não conservativa de TeNT, um fragmento ativo de TeNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma TeNT compreende um domínio enzimático de TeNT ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de TeNT ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de Iigação de TeNT ou um

, 15 fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda " ' um outro aspecto desta modalidade, uma TeNT compreende um domínio enzimático de TeNT de SEQ ID N°: 22 ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de TeNT de SEQ ID N°: 22 ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de TeNT de SEQ ID N°: 22 ou um 20 fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, uma TeNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 22; ou no máximo 70%, no 25 máximo 75%, no máximo 8Ó°/o, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 22. Em ainda outros aspectos desta moda- lidade, uma TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em 30 relação à SEQ ID N°: 22; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de a- minoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 22. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos ad- jacentes em relação à SEQ ID N°: 22; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 5 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 22. Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende uma BaNT.

Em um aspecto desta modalidade, uma BaNT compreende um domínio enzimático de BaNT, um domínio de translocação de BaNT, e um

" 10 domínio de ligação de BaNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BaNT compreende a SEQ ID N°: 23. Em um outro aspecto desta modalida- de, uma BaNT compreende uma variante de ocorrência natural de BaNT, tal como, por exemplo, uma isoforma de BaNT ou um subtipo de BaNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BaNT compreende uma variante de

, 15 ocorrência natural de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma isoforma de BaNT ou um subtipo de BaNT.

Em ainda um outro aspecto des- _ ta modalidade, uma BaNT compreende uma variante de ocorrência não na- tural de BaNT, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BaNT, uma variante não conservativa de BaNT ou um fragmento ativo de BaNT, ou 20 qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta mo- dalidade, uma BaNT compreende uma variante de ocorrência não natural de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BaNT, uma variante não conservativa de BaNT, um fragmento ativo de BaNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto 25 desta modalidade, uma BaNT compreende um domínio enzimático de BaNT ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BaNT ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BaNT ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BaNT compreende um domínio 30 enzimático de BaNT de SEQ ID N°: 23 ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BaNT de SEQ ID N°: 23 ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BaNT de SEQ ID N°: 23 ou um fragmento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BaNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- 5 nos 90%, ou pelo menos 95°/o com a SEQ ID N°: 23; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta moda- lidade, uma BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500

- 10 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 23; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de a- . minoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BaNT compreende um polipeptídio tendo,

. 15 por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, "400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos ad- jacentes em relação à SEQ ID N°: 23; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 23. 20 Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana compreende uma BuNT.

Em um aspecto desta modalidade, uma BuNT compreende um domínio enzimático de BuNT, um domínio de translocação de BuNT, e um domínio de Iigação de BuNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BuNT compreende a SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em um outro aspec- 25 to desta modalidade, uma BuNT compreende uma variante de ocorrência natural de BuNT, tal como, por exemplo, uma isoforma de BuNT ou de um subtipo de BuNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma BuNT com- preende uma variante de ocorrência natural de BuNT de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, tal como, por exemplo, uma isoforma de BuNT ou de um 30 subtipo de BuNT.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BuNT compreende uma variante de ocorrência não hatural de BuNT, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de BuNT, uma variante não conservati-

va de BuNT, um fragmento ativo de BuNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BuNT com- preende uma variante de ocorrência não natural de BuNT de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de 5 BuNT, uma variante não conservativa de BuNT, um fragmento ativo de BuNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BuNT compreende um domínio enzimático de BuNT ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de translocação de BuNT ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de BuNT, um frag-

" 10 mento ativo do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BuNT compreende um domínio enzi- mático de BuNT de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, ou um fragmento ativo " do mesmo, um domínio de translocação de BuNT de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, ou um fragmento ativo do mesmo, um domínio de ligação de

. 15 BuNT de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, ou um fragmento ativo do mes- mo, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BuNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo me- 20 nos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85°6, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BuNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25: no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacen- tes em relação à SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspec- 30 tos desta modalidade, uma BuNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos ad-

jacentes em relação à SEQ ID N": 24 ou SEQ ID N": 25; no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, ou 500 deleções, adi- ções, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°:24ouSEQIDN°:25. 5 Conforme usado neste relatório, o termo "quimera de toxina clostridiana" ou "quimeras de toxina clostridiana" refere-se a uma molécula compreendendo pelo menos uma porção de uma toxina clostridiana e uma porção de pelo menos uma outra proteína para formar uma toxina com peio menos uma propriedade diferente das toxinas clostridiana de referência da

- 10 Tabela 1. Exemplos não limitativos quimeras de toxina clostridiana incluem uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzimático de toxina não clostridiana, uma toxina clostridiana compreendendo um domínio de

- translocação de toxina não clostridiana, uma toxina clostridiana compreen- dendo um domínio de ligação de toxina não clostridiana, ou qualquer combi- " . 15 nação dos mesmos.

Outros exemplos não limitativos de quimeras toxina . "" clostridiana incluem uma toxina clostridiana compreendendo" um domínio enzimático de uma toxina clostridiana diferente, uma toxina cIostridiana compreendendo um domínio de translocação de uma toxina clostridiana di- ferente, uma toxina clostridiana compreendendo um domínio de ligação de 20 uma toxina clostridiana diferente, ou qualquer combinação dos mesmos.

Uma classe de quimera de toxina cIostridiana compreende uma toxina clostridiana modificada na qual o domínio enzimático ou uma porção do mesmo, o domínio de translocação ou uma porção do mesmo, e/ou o domínio de Iigação ou uma porção do mesmo, de uma toxina clostridiana de 25 ocorrência natural ou é modificada ou é substituída por um domínio enzimá- tico ou uma porção do mesmo, um domínio de translocação ou uma porção do mesmo, e/ou um domínio de ligação uma porção do mesmo, de uma to- xina clostridiana diferente.

Como exemplo não limitativo, o domínio de liga- ção de BoNT/A pode ser substituído pelo domínio de ligação de BONT/B 30 produzindo uma quimera de toxina clostridiana compreendendo um domínio enzimático de BoNT/A, um domínio de translocação de BoNT/A, e um domí- nio de Iigação de BoNT/B.

Tais quimeras de toxina clostridiana estão descri-

tas, por exemplo, em J.

Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neuro- toxins, Patente US 7.132.259, que está aqui incorporada em sua integridade a título de referência.

Como um outro exemplo não limitativo, o motivo leuci- na de BONT/A pode ser inserido na cadeia leve de uma BONT/E a fim de 5 aumentar a persistência biológica.

Tais quimeras de toxina clostridiana estão descritas, por exemplo, em Lance E.

Steward et al., Leucine-based Motif and C/ostridia/ Toxins, Publicação de Patente US 2003/0027752 (6 de feve- reiro de 2003); Lance E.

Steward et al., C/ostridia/ Neurotoxin Compositions and Modified C/ostridia/ Neurotoxins, Publicação de Patente US

- 10 2003/0219462 (27 de novembro de 2003); e Lance E.

Steward et al., C/os- tridia/ Neurotoxin Compositions and Modi/ied Clostridial Neurotoxins, Publi- cação de Patente US 2004/0220386 (4 de novembro de 2004), todas elas aqui incorporadas em sua integridade a título de referência.

Uma outra classe de quimera de toxina clostridiana compreende

. 15 uma toxina cIostridiana na qual o domínio de ligação de uma toxina clostridi- ana de ocorrência natural ou é modificado ou é substituído por um domínio de ligação de uma toxina não cIostridiana.

Tais quimeras de toxina clostridi- ana possuem uma atividade de ligação de célula alterada porque a toxina modificada pode, por exemplo, 1) usar o mesmo receptor presente na super- 20 fície de uma célula alvo de toxina cIostridiana de ocorrência natural que a- quele usado pela toxina clostridiana de ocorrência natural, denominada ati- vidade de ligação de célula intensificada para uma célula alvo de toxina clos- tridiana de ocorrência natural; 2) usar um receptor diferente presente na su- perfície de uma célula alvo de toxina clostridiana de ocorrência natural, de- 25 nominada atividade de ligação de célula alterada para uma célula alvo de toxina clostridiana de ocorrência natural; ou 3) usar um receptor diferente presente na superfície da célula alvo de toxina não clostridiana, denominada atividade de ligação de célula alterada para uma célula alvo de toxina clos- tridiana de ocorrência não natural, uma toxina revetorizada ou uma TVEMP. 30 Uma quimera de toxina cIostridiana pode ser uma toxina clostri- diana com uma atividade de Iigação de célula intensificada capaz de intoxi- car uma célula alvo de toxina clostridiana de ocorrência natural, por exem-

plo, um neurônio motor.

Uma maneira de obter esta atividade de ligação in- ' tensificada é através da modificação do domínio de ligação endógeno de uma toxina clostridiana de ocorrência natural a fim de intensificar a atividde de ligação de célula da toxina para seu receptor de ocorrência natural.

Tais 5 modificações em um domínio de vetorização resultam, por exemplo, em uma atividade de ligação de célula intensificada que aumenta a afinidade de ligação para um receptor endógeno de toxina clostridiana presente em uma célula alvo de toxina clostridiana de ocorrência natural; uma atividade de ligação de célula intensificada que aumenta a especificidade para um sub-

- 10 grupo de receptores endógenos de toxina clostridiana presentes em uma célula alvo de toxina clostridiana de ocorrência natural; ou uma atividade de ligação de célula intensificada que aumenta tanto a afinidade de ligação quanto a especificidade de ligação.

Exemplos não limitativos de toxinas clos- tridiana modificadas com uma atividade de Iigação de célula intensificada

. 15 para um receptor de toxina clostridiana de ocorrência natural estão descri- tos, por exemplo, em Lance E.

Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous CIostridium Toxin Receptor Systems, Publicação de Patente US 2008/0096248; Lance E.

Ste- ward, Modified CIostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities 20 and Enhanced Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, Publica- ção de Patente Internacional 2008/105901; todos eles estando aqui incorpo- rados em sua integridade a título de referência.

Uma quimera de toxina clostridiana pode ser uma toxina clostri- diana com uma atividade de ligação de célula alterada capaz de intoxicar 25 uma célula alvo de toxina clostridiana de ocorrência natural, por exemplo, um neurônio motor.

Uma maneira de obter esta atividade de ligação alterada é através da substituição do domínio de ligação endógeno de uma toxina clostridiana de ocorrência natural por um domínio de ligação de uma outra molécula que se liga preferencialmente a um receptor diferente presente na 30 superfície de uma célula alvo de toxina clostridiana.

Tal modificação em um domínio de ligação resulta em uma toxina modificada que é capaz de se li- gar preferencialmente a um receptor de toxina não clostridiana presente na célula alvo de uma toxina clostridiana. Esta atividade de ligação intensificada uma uma célula alvo de toxina clostridiana de ocorrência natural que doses eficazes mais baixas de uma toxina clostridiana modificada sejam adminis- tradas a um indivíduo porque mais toxina será distribuída para a célula alvo. 5 Portanto, toxinas clostridiana modificadas com uma atividade de ligação in- tensificada vão reduzir a dispersão indesejável da toxina para áreas que não são alvo de tratamento, dessa forma reduzindo ou prevenindo os efeitos colaterais indesejáveis com a difusão de uma toxina clostridiana para uma localização indesejada. Exemplos não limitativos de toxinas clostridiana mo- - 10 dificadas com uma capacidade de ligação de célula alterada para uma célu- la alvo de clostridiana estão descritos, por exemplo, em Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Pa- tente US 7.514.088; Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with

N Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, Publicação . 15 de Patente US 2008/0161543; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, Publicação de Patente US 2008/0241881; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Me- thods of Their Use, Publicação de Patente US 2009/0048431; Lance E. 20 Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, Publicação de Patente lnternacional WO 2007/106115; todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referência. Uma quimera de toxina clostridiana pode ser uma toxina clostri- 25 diana com uma atividade de ligação de célula alterada capaz de intoxicar uma célula que não uma célula alvo de toxina clostridiana, por exemplo, uma célula que não um neurônio motor. Chamadas de TVEMPS, estas mo- léculas realizam esta intoxicação usando um receptor alvo presente na célu- la alvo de toxina não clostridiana. Esta capacidade revetorizada é obtida por 30 substituição de um domínio de ligação de ocorrência natural de uma toxina clostridiana por um domínio de- ligação mostrando uma atividade de ligação preferencial para um receptor de toxina não clostridiana presente em uma célula alvo de toxina não clostridiana. Tais modificações em um domínio de ligação resultam em uma toxina modificada que é capaz de se ligar prefe- rencialmente a um a receptor de toxina não clostridiana presente em uma célula alvo de toxina não clostridiana. Uma' quimera de toxina clostridiana 5 com uma atividade de vetorização alterada para uma célula alvo de toxina não clostridiana pode se ligar a um receptor alvo, translocar-se para o cito- plasma, e exercer seu efeito proteolítico no complexo SNARE da célula alvo de toxina não clostridiana. Exemplos não Iimitativos quimeras de toxina clos- tridiana com uma atividade de vetorização alterada para uma célula alvo de 10 toxina não clostridiana estão descritos, por exemplo, em Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able A Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, Patente US 5.989.545; Clifford C. Shone et al., Recombinant To- xin Fragments, Patente US 6.461.617; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, Patente US . 15 6.632.440; Lance E. Steward et a!., Methods and Compositions for the Tre- atment of Pancreatitis, Patente US 6.843.998; J. Oliver Dolly et al., Activata- ble Recombinant Neurotoxins, Patente US 7.132.259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Patente US

7.244.437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For 20 Treating Pain, Patente US 7.413.742; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Patente US 7.415.338; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Patente US 7.514.088; Keith A. Foster et al., lnhibition of Secretion from Non-neural Cells, Publicação de Patente US 2006/0216283; Keith A. 25 Foster, Fusion Proteins, Publicação de Patente US 2008/0064092; Keith A. Foster, Fusion Proteins, Publicação de Patente US 2009/0035822; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Publicação de Patente US 2009/0048431; Keith A. Foster, Non- Cytotoxic Protein Conjugates, Publicação de Patente US 2009/0162341; 30 Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, Publicação de Patente Internacional WO 2005/023309; e Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Ca-

pabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells, Pedido de Patente Interna- cional WO 2008/008805; todos eles estando aqui incorporados em sua inte- gridade a título de referência.

Os aspectos da presente invenção oferecem, em parte, um do- 5 mínio enzimático de toxina clostridiana.

Conforme usado neste relatório, o termo "domínio enzimático de toxina clostridiana" refere-se a qualquer poli- peptídio de toxina clostridiana que pode executar a etapa de modificação do alvo enzimático do processo de intoxicação.

Assim sendo, um domínio en- zimático de toxina clostridiana indica especificamente um substrato de toxi-

_ 10 na cIostridiana e abrange a clivagem proteolítica de um substrato de toxina clostridiana, tal como, por exemplo, proteínas SNARE como um substrato de SNAP-25, um substrato de VAMP, e um substrato de sintaxina.

Exemplos não limitativos de um domínio enzimático de toxina clostridiana incluem, por exemplo, um domínio enzimático de BoNT/A, um domínio enzimático de

. 15 BoNT/B, um domínio enzimático de BoNT/CI, um domínio enzimático de BoNT/D, um domínio enzimático de"-BoNT/E, um domínio enzimático de BONT/F, um domínio enzimático de BoNT/G, um domínio enzimático de TeNT, um domínio enzimático de BaNT, e um domínio enzimático de BuNT.

Um domínio enzimático de toxina clostridiana inclui, sem limita- 20 ção, variantes de ocorrência natural de domínio enzimático de toxina clostri- diana, tal como, por exemplo, isoformas de domínio enzimático de toxina clostridiana e subtipos de domínio enzimático de toxina clostridiana; e vari- antes de ocorrência não natural de domínio enzimático de toxina clostridia- na, tal como, por exemplo, variantes conservativas de domínio enzimático 25 de toxina clostridiana, variantes não conservativas de domínio enzimático de toxina clostridiana, fragmentos ativos de domínio enzimático de toxina clos- tridiana das mesmas, ou qualquer combinação dos mesmos.

Conforme usado neste relatório, o termo "variante de domínio enzimático de toxina clostridiana", seja de ocorrência natural ou de ocorrên- 30 cia não natural, refere-se a um domínio enzimático de toxina clostridiana que tem pelo menos-uma alteração de aminoácido em relação à região cor- respondente das sequências de referência apresentadas (Tabela 1) e pode ser descrito em percentagem de identidade em relação à região correspon- dente daquela sequência de referência. A menos que expressamente indi- cado, variantes de domínio enzimático de toxina clostridiana úteis para a prática das modalidades descritas são variantes que executam a etapa de 5 modificação do alvo enzimático do processo de intoxicação. Como exemplos não limitativos, uma variante de domínio enzimático de BONT/A terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substi- tuição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 1/2- 429 de SEQ ID N°: 1; uma variante de domínio enzimático de BONT/B terá " 10 pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 6: uma variante de domínio enzimático de BONT/CI terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos amino-

W 15 ácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 11; uma variante de domínio enzimático de BONT/D terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por e- xemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 13; uma variante de domínio enzi- mático de BONT/E terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal co- 20 mo, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 15; uma variante de domí- nio enzimático de BoNT/F terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 1/2-428 de SEQ ID N°: 18; uma variante de 25 domínio enzimático de BoNT/G terá pelo menos uma diferença em aminoá- cidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de ami- noácido, em relação aos aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID N°: 21; uma vari- ante de domínio enzimático de TeNT terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição 30 de aminoácido, em relação aos aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID N°: 22; uma variante de domínio enzimático de BaNT terá pelo menos uma diferen- ça em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 1/2-420 de SEQ ID N°: 23; e uma variante de domínio enzimático de BuNT terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, dele- ção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 1/2-411 de SEQ 5 ID N°: 24. Os especialistas na técnica reconhecem que dentro de cada so- rotipo de toxina clostridiana pode haver variantes de ocorrência natural de domínio enzimático de toxina clostridiana que diferem um pouco em termos de sua sequência aminoacídica, e também em termos dos ácidos nucleicos 10 que codificam essas proteínas.

Por exemplo, existem atualmente cinco sub- tipos de BONT/A, BONT/AI, BONT/A2, BONT/A3, BONT/A4, e BONT/A5, com subtipos de domínio específico enzimático apresentando cerca de 80% a " 95% de identidade de aminoácidos quando comparados com the BONT/A domínio enzimático de SEQ ID N°: 1. Conforme usado neste relatório, o

. 15 termo "variante de ocorrência natural de domínio enzimático de toxina clos- tridiana" refere-se a qualquer domínio enzimático toxina clostridiana produ- zido por um processo de ocorrência natural, incluindo, sem limitação, iso- formas de domínio enzimático de toxina clostridiana produzidas a partir de transcritos alternativamente emendados, isoformas de domínio enzimático 20 de toxina clostridiana produzidas por mutação espontânea e subtipos de domínio enzimático de toxina clostridiana.

A variante de ocorrência natural de domínio enzimático de toxina clostridiana pode funcionar substancial- mente da mesma maneira que o domínio enzimático de referência de toxina clostridiana na qual a variante de ocorrência natural de domínio enzimático 25 de toxina clostridiana se baseia, e pode substituir o domínio enzimático de referência de toxina clostridiana em qualquer aspecto da presente invenção.

Exemplos não limitativos de uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de toxina clostridiana é uma isoforma de domínio en- zimático de toxina clostridiana tal como, por exemplo, uma isoforma de do- 30 mínio enzimático de BONT/A, uma isoforma de domínio enzimático de BONT/B, uma isoforma de domínio enzimático de BONT/CI, uma isoforma de domínio enzimático de BoNT/D, uma isoforma de domínio enzimático de

BONT/E, uma isoforma de domínio enzimático de BONT/F, uma isoforma de domínio enzimático de BONT/G, uma isoforma de domínio enzimático de TeNT, uma isoforma de domínio enzimático de BaNT, e uma isoforma de domínio enzimático de BuNT. Um outro exemplo não limitativo de uma vari- 5 ante de ocorrência natural de domínio enzimático de toxina clostridiana é um subtipo de domínio enzimático de toxina clostridiana tal como, por exemplo, um domínio enzimático do subtipo BONT/AI, BONT/A2, BONT/A3, BONT/A4, ou BONT/A5; um domínio enzimático do subtipo BONT/BI, BONT/B2, BoNT/Bbv, ou BoNT/Bnp; um domínio enzimático do subtipo BONT/C1-1 ou " 10 BONT/CI -2; um domínio enzimático do subtipo BONT/EI, BONT/E2 e BONT/E3; um domínio enzimático do subtipo BONT/FI, BoNT/F2, ou BONT/F3; e um domínio enzimático do subtipo BuNT-1 ou BuNT-2.

K Conforme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência não natural domínio enzimático de toxina clostridiana" refere-se a qualquer . 15 domínio enzimático de toxina cIostridiana produzido com o auxilio de mani- pulação humana, incluindo, sem limitação, domínios enzimáticos de" toxina clostridiana produzido por engenharia genética usando mutagênese aleató- ria ou desenho racional e domínios enzimáticos de toxina clostridiana produ- zido por sÍniese química. Exemplos não Iimitativos de variantes de ocorrên- 20 cia não natural de domínio enzimático de toxina clostridiana incluem, por exemplo, variantes conservativas de domínio enzimático de toxina clostridi- ana, variantes não conservativas de domínio enzimático de toxina clostridia- na, variantes de quimera de domínio enzimático de toxina cIostridiana, e fragmentos ativos de domínio enzimático de toxina clostridiana. 25 Conforme usado neste relatório, o termo "variante conservativa de domínio enzimático de toxina clostridiana" refere-se a um domínio enzi- mático de toxina clostridiana que tem pelo menos um aminoácido substituí- do por um outro aminoácido ou um análogo de aminoácido que tem pelo menos uma proprieàade similar àquela do aminoácido original da sequência 30 do domínio enzimático de referência de toxina cIostridiana (Tabela 1). E- xemplos de propriedades incluem, sem limitação, tamanho similar, topogra- fia, carga, hidrofobocidade, hidrofilicidade, lipofilicidade, capacidade de liga-

ção covalente, capacidade de ligação hidrogênio, uma propriedade físico- química, entre outras, ou qualquer combinação dos mesmos.

Uma variante conservativa de domínio enzimático de toxina clostridiana pode funcionar substancialmente da mesma maneira que o domínio enzimático de referên- 5 cia de toxina clostridiana no qual a variante conservativa de domínio enzimá- tico de toxina clostridiana se baseia, e pode substituir o domínio enzimático de referência de toxina clostridiana em qualquer aspecto da presente inven- ção.

Exemplos não limitativos de uma variante conservativa de domínio en- zimático de toxina clostridiana incluem, por exemplo, variantes conservativas 10 de domínio enzimático de BONT/A, variantes conservativas de domínio en- zimático de BONT/B, variantes conservativas de domínio enzimático de BONT/CI, variantes conservativas de domínio enzimático de BONT/D, vari- antes conservativas de domínio enzimático de BONT/E, variantes conserva- tivas de domínio enzimático de BoNT/F, variantes conservativas de domínio

. 15 enzimático de BONT/G, variantes conservativas de domínio enzimático de " TeNT, variantes conservativas de domínio enzimático de BaNT, e variantes conservativas de domínio enzimático de BuNT.

Conforme usado neste relatório, o termo "variante não conserva- tiva de domínio enzimático de toxina clostridiana" refere-se a um domínio 20 enzimático de toxina clostridiana no qual 1) pelo menos um aminoácido é deletado do domínio enzimático de referência de toxina clostridiana no qual a variante não conservativa de domínio enzimático de toxina clostridiana se baseia; 2) pelo menos um aminoácido é adicionado ao domínio enzimático de referência de toxina clostridiana no qual o domínio enzimático não con- 25 servativo de toxina clostridiana se baseia; ou 3) pelo menos um aminoácido é substituído por um outro aminoácido ou por um análogo de aminoácido que não compartilha qualquer propriedade similar àquela do aminoácido ori- ginal da sequência de referência de domínio enzimático de toxina clostridia- na (Tabela 1). Uma variante não conservativa de domínio enzimático de to- 30 xina clostridiana pode funcionar substancialmente da mesma maneira que o domínio enzimático de referência de toxina clostridiana no qual a variante não conservativa de domínio enzimático de toxina clostridiana se baseia, e pode substituir o domínio enzimático de referência de toxina clostridiana em qualquer aspecto da presente invenção.

Exemplos não limitativos de uma variante não conservativa de domínio enzimático de toxina clostridiana in- cluem, por exemplo, variantes não conservativas de domínio enzimático de 5 BONT/A, variantes não conservativas de domínio enzimático de BONT/B, variantes não conservativas de domínio enzimático de BoNT/CI, variantes não conservativas de domínio enzimático de BONT/D, variantes não conser- vativas de domínio enzimático de BONT/E, variantes não conservativas de domínio enzimático de BoNT/F, variantes não conservativas de domínio en- lO zimático de BONT/G, e variantes não conservativas de domínio enzimático de TeNT, variantes não conservativas de domínio enzimático de BaNT, e variantes não conservativas de domínio enzimático de BuNT.

Conforme usado neste relatório, o termo "fragmento ativo de domínio enzimático de toxina clostridiana" refere-se a qualquer um de uma variedade de fragmentos de toxina cIostridiana compreendendo o domínio enzimático que pode ser útil nos aspectos da presente invenção com a con- _ dição de que esses fragmentos de domínio enzimático podem ter especifi- camente como alvo os componentes de núcleo do aparelho de liberação de neurotransmissores e portanto participar na execução do mecanismo celular completo por meio do qual uma toxina clostridiana cliva proteoliticamente um substrato.

Os domínios enzimáticos of toxinas clostridiana têm aproxi- madamente 420-460 aminoácidos de comprimento e compreendem um do- mínio enzimático (Tabela 1). As pesquisas mostraram que o comprimento inteiro de um domínio enzimático de toxina clostridiana não é necessário para a atividade enzimática do domínio enzimático.

Como um exemplo não limitativo, os oito primeiros aminoácidos do domínio enzimático de BONT/A não são necessários para a atividade enzimática.

Como um outro exemplo não Iimitativo, os oito primeiros aminoácidos do domínio enzimático de TeNT não são necessários para a atividade enzimática.

Da mesma forma, o termi- nal carboxil do domínio enzimático não é necessário para atividade.

Como um exemplo não limitativo, os 32 últimos aminoácidos do domínio enzimáti- co de BoNT/A não são necessários para a atividade enzimática.

Como um outro exemplo não limitativo, os 31 últimos aminoácidos do domínio enzimá- tico de TeNT não são necessários para a atividade enzimática. Assim sen- do, os aspectos desta modalidade incluem domínios enzimáticos de toxina clostridiana compreendendo um domínio enzimático tendo um comprimento 5 de, por exemplo, pelo menos 350, 375, 400, 425, ou 450 aminoácidos. Ou- tros aspectos desta modalidade incluem domínios enzimáticos de toxina clostridiana compreendendo um domínio enzimático tendo um comprimento de, por exemplo, no máximo 350, 375, 400, 425, ou 450 aminoácidos. Qualquer um de uma diversidade de métodos pode ser usado " 10 para determinada a percentagem dè identidade de variantes de ocorrência natural de domínio enzimático de toxina clostridiana e variantes de ocorrên- cia não natural de domínio enzimático de toxina clostridiana, incluindo, sem

W limitação, métodos globais, métodos locais e métodos híbridos, tais como, por exemplo, métodos de abordagem de segmentos. Os protocolos para . 15 determinação da percentagem de identidade são procedimentos rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados neste relatório. " Assim sendo, em uma modalidade, uma toxina clostridiana mo- dificada descrita no presente relatório compreende um domínio enzimático de toxina clostridiana. Em um aspecto desta modalidade, um domínio enzi- 20 mático de toxina clostridiana compreende uma variante de ocorrência natu- ral de domínio enzimático de toxina cIostridiana, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de toxina clostridiana ou um subtipo de do- mínio enzimático de toxina cIostridiana. Em um outro aspecto desta modali- dade, um domínio enzimático de toxina clostridiana compreende uma vari- 25 ante de ocorrência não natural de domínio enzimático de toxina clostridiana, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de toxina clostridiana, uma variante não conservativa de domínio enzimático de toxina clostridiana, um fragmento ativo de domínio enzimático de toxina clos- tridiana, ou qualquer combinação dos mesmos. 30 Em uma outra modalidade, um aminoácido hidrófobo em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio enzimático de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido hidrófobo. Exem-

plos de aminoácidos hidrófobos incluem, por exemplo, C, F, I, L, M, V e W.

Em um outro 'aspecto desta modalidade, um aminoácido alifático em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio enzimático de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido alifático.

Exem- 5 plos de aminoácidos alifáticos incluem, por exemplo, A, I, L, P, e V.

Em ain- da um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido aromático em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio enzimático de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido aromático.

Exem- plos de aminoácidos aromáticos incluem, por exemplo, F, H, W e Y.

Em ain- _ 10 da um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de empilhamento em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio enzimático de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de empi- " lhamento.

Exemplos de aminoácidos de empilhamento incluem, por exem- plo, F, H, W e Y.

Em um outro aspecto desta modalidade, a polar amino acid

- 15 em uma posição particular na cadeia poIipeptídica do domínio enzimático de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido poiar.

E- xemplos de aminoácidos polares incluem, por exemplo, D, E, K, N, Q, e R.

Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido menos polar ou indiferente em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio 20 enzimático de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoá- cido menos polar ou indiferente.

Exemplos de aminoácidos menos poIares ou indiferentes incluem, por exemplo, A, H, G, P, S, T, e Y.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga positiva em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio enzimático de toxina 25 clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de carga positiva.

Exemplos de aminoácidos de carga positiva incluem, por exemplo, K, R, e H.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga negativa em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio en- zimático de toxina cIostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido 30 de carga negativa.

Exemplos de aminoácidos de carga negativa incluem, por exemplo, D e E.

Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido pequeno em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio en-

zimático de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido pequeno. Exemplos de aminoácidos pequenos incluem, por exemplo, A, D, G, N, P, S, e T. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoá- cido ramificado em C-beta em uma posição particular na cadeia polipeptídi- 5 ca do domínio enzimático de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido ramificado em C-beta. Exemplos dè aminoácidos ramifica- dos em C-beta incluem, por exemplo, I, T e V.

. Em uma outra modalidade, um domínio enzimático de toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de BONT/A. Em um aspec- lO to desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/A compreende os domínios enzimáticos de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/A compreende os aminoácidos 1/2-429 of SEQ ID N°: -

1. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/A compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzi- "" ' mático de BONT/A, tal como, por exemplo, um domínio enzimático de uma isoforma de BONT/A ou um domínio enzimático de um subtipo de BONT/A. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/A compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BONT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de BONT/A ou um subtipo de domínio enzimático de BoNT/A. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/A compreende os aminoácidos 1/2-429 de uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BoNT/A de SEQ ID N°: 1, tal como, por exemplo, uma isofor- ma de domínio enzimático de BONT/A ou um subtipo de domínio enzimático de BONT/A. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio en- zimático de BONT/A compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BONT/A, tal como, por exemplo, uma variante con- servativa de domínio enzimático de BONT/A, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BONT/A, um fragmento ativo de domínio enzimáti- co de BoNT/A, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro

¶

aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/A compreende o domínio enzimático de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BONT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5, tal como, por exemplo, uma variante conservativa 5 de domínio enzimático de BONT/A, uma variante não conseNativa de domí- nio enzimático de BONT/A, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/A, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/A compreende os ami- noácidos 1/2-429 de uma variante de ocorrência não natural de domínio en-

_ 10 zimático de BoNT/A de SEQ ID N°: 1, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de BONT/A, uma variante não conserva- tiva de domínio enzimático de BoNT/A, um fragmento ativo de domínio en-

- zimático de BONT/A, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático " 15 de BoNT/A compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- . dos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%,' pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio en- zimático de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no 20 máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio enzimáti- co de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/A compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, 25 pelo menos 85%, pelo menos 9Ô°/o, ou pelo menos 95% com os aminoáci- dos 1/2-429 de SEQ ID N°: 1; ou no máximo 7Õ°/o, no máximo 75%, no má- ximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID N°: 1. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático 30 de BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID 5 N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por e- xemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em rela- ção aos aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID N°: 1; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, .

- 10 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID N°: 1. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um dominio en- . zimático de BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, . 15 e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzi- mático de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N": 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- ção ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, 20 SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em ainda outros aspectos desta modalida- de, um domínio enzimático de BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- ção aos aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID N°: 1; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 25 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-429 de SEQ ID N\ 1. Em uma outra modalidade, um domínio enzimático de toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de BONT/B. Em um aspec- 30 to desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/B compreende os domínios enzimáticos de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/B compreende os aminoácidos 1/2-436 of SEQ ID N°:

6. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/B compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzi- mático de BONT/B, tal como, por exemplo, um domínio enzimático de uma 5 isoforma de BONT/B ou um domínio enzimático de um subtipo de BONT/B. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/B compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BONT/B de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático - 10 de BONT/B ou um subtipo de domínio enzimático de BONT/B. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/B compreende os aminoácidos 1/2-436 de uma variante de ocorrência natural de domínio " enzimático de BONT/B de SEQ ID N°: 6, tal como, por exemplo, uma isofor- ma de domínio enzimático de BONT/B ou um subtipo de domínio enzimático . 15 de BONT/B. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio en- zimático de BoNT/B compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BoNT/B, tal como, por exemplo, uma variante con- servativa de domínio enzimático de BONT/B, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BONT/B, um fragmento ativo de domínio enzimáti- 20 co de BONT/B, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/B compreende o domínio enzimático de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BoNT/B de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, tal como, por exemplo, uma variante conservati- 25 va de domínio enzimático de BONT/B, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BONT/B, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/B, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro as- pecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/B compreende os aminoácidos 1/2-436 de uma variante de ocorrência não natural de domínio 30 enzimático de BONT/B de SEQ ID N°: 6, tal como, por exemplo, uma varian- te conservativa de domínio enzimático de BONT/B, uma variante não con- servativa de domínio enzimático de BoNT/B, um fraginento ativo de domínio enzimático de BONT/B, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/B compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8Ó°/o, 5 pelo menos 85°6, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio en- zimático de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; ou no máximo 70°/o, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com o domínio enzimáti- co de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID 10 N°: 10. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/B compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 7Ô°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 9O°/,, ou pelo menos 95% com os aminoáci- dos 1/2-436 de SEQ ID N°: 6; ou no máximo 7Ó°/o, no máximo 75%, no má- . - 15 ximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 6. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/B compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- 20 tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N": 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N": 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, or 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID 25 N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/B compreende um polipeptídio tendo, por e- xemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em rela- ção aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 6; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 30 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 6. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio en-

zimático de BONT/B compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzi- mático de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ 5 ID N°: 10; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- ção ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em ainda outros aspectos desta modalida- de, um domínio enzimático de BONT/B compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 ' deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- ção aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 6; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 6. Em uma outra modalidade, um domlnio enzimático de toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de BONT/CI.

Em um as- pecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compreende os domínios enzimáticos de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compreen- de os aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 11. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BONT/CI, tal como, por e- xemplo, um domínio enzimático de uma isoforma de BoNT/CI ou um domí- nio enzimático de um subtipo de BONT/CI.

Em um outro aspecto desta mo- dalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BONT/CI de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de BONT/CI ou um subtipo de domínio enzimático de BONT/CI.

Em um ou- tro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compre- ende os aminoácidos 1/2-436 de uma variante de ocorrência natural de do- mínio enzimático de BONT/CI de SEQ ID N°: 11, tal como, por exemplo,

m uma isoforma de domínio enzimático de BONT/CI ou um subtipo de domínio enzimático de BoNT/CI. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/CI compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BONT/CI, tal como, por exemplo, uma 5 variante conservativa de domínio enzimático de BONT/CI, uma variante não conseNativa de domínio enzimático de BONT/CI, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/CI, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compreende o domínio enzimático de uma variante de ocorrência - 10 não natural de domínio enzimático de BONT/CI de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio en- zimático de BONT/CI, uma variante não conservativa de domínio enzimático >·

L

P L ' de BONT/CI, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/CI, ou < ·,. qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta mo- , 15 dalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compreende os aminoácidos 1/2-436 de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BoNT/CI de SEQ ID N°: 11, tal como, por exemplo, uma variante con- servativa de domínio enzimático de BONT/CI, uma variante não conservati- va de domínio enzimático de BONT/CI, um fragmento ativo de domínio en- . 20 zimático de BONT/CI, ou qualquer combinação dos mesmos. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/CI compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoá- cidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com o domínio en- 25 zimático de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; ou no máximo 70%, no máxi- mo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio enzimático de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- 30 dos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8O°/,, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoáci- dos 1/2-436 de SEQ ID N°: 11; ou no máximo 7Õ°/o, no máximo 75°6, no má-

ximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 11. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 5 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deíeções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoá- cidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 11 - 10 ou SEQ ID N°: 12. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, t," " e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- tf" cidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 11; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em reiação aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 11. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- 20 ições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N": 11 ouSEQIDN°: 12;ou nomáximo1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,20,30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adja- centes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°:

12. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de 25 BONT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,"20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 11; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em 30 relação aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 11. Em uma outra modalidade, um domínio enzimático de toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de BONT/D. Em um aspec-

" to desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/D compreende os domínios enzimáticos de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em outros as- pectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/D compreende os aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 13. Em um outro aspecto desta mo- 5 dalidade, um domínio enzimático de BONT/D compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BONT/D, tal como, por exem- plo, um domínio enzimático de uma isoforma de BONT/D ou um domínio en- zimático de um subtipo de BONT/D.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/D compreende uma variante de ocorrência

- 10 natural de domínio enzimático de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de BONT/D " ou um subtipo de domínio enzimático de BONT/D.

Em um outro aspecto des- l" ta modalidade, um domínio enzimático de BONT/D compreende os aminoá- ) y'" cidos 1/2-436 de uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático ij

" 15 de BONT/D de SEQ ID N°: 13, tal como, por exemplo, uma isoforma de do-

mínio enzimático de BONT/D ou um subtipo de domínio enzimático de BONT/D.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzi- mático de BoNT/D compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BONT/D, tal como, por exemplo, uma variante con- 20 servativa de domínio enzimático de BONT/D, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BONT/D, um fragmento ativo de domínio enzimáti- co de BONT/D, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/D compreende o domínio enzimático de uma variante de ocorrência não natural de domínio 25 enzimático de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de BoNT/D, uma variante não conseNativa de domínio enzimático de BoNT/D, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/D, ou qualquer combinação dos mes- mos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático 30 de BONT/D compreende os aminoácidos 1/2-436 de uma variante de ocor- rência não natural de domínio enzimático de BONT/D de SEQ ID N°: 13, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de

BoNT/D, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BONT/D, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/D, ou qualquer combi- nação dos mesmos. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático 5 de BONT/D compreende um poIipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 7O°/j, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio en- zimático de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; ou no máximo 70%, no máxi- mo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo " 10 95% com o domínio enzimático de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/D

T compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por l" . \ exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos '\ i° 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 1/2-436 de 15 SEQ ID N°: 13; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 1/2- 436deSEQIDN°:13. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 20 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoá- cidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 13 25 ou SEQ ID N°: 14. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- cidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 13; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 30 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 13. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N": 14; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 5 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de

- 10 aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-436 de SEQ ID N°: 13; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação i ' aos aminoácidos 1/2-436 de.SEQ ID N°: 13. l. t, Em uma outra modalidade, um domínio enzimático de toxina

- 15 clostridiana compreende um domínio enzimático de BONT/E.

Em um aspec- to desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/E compreende os domínios enzimáticos de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em outros aspectos desta modalidade, a BONT/E domínio enzimático compreende os aminoácidos 1/2- 20 411 de SEQ ID N°: 15. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/E compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BONT/E, tal como, por exemplo, um domínio enzimá- tico de uma isoforma de BONT/E ou um domínio enzimático de um subtipo de BONT/E.

Em um outro aspecto desta modaiidade, um domínio enzimático 25 de BONT/E compreende uma variante de ocorrência natural de domínio en- zimático de BONT/E de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de BONT/E ou um subtipo de domínio enzimático de BONT/E.

Em um outro aspecto desta mo- dalidade, um domínio enzimático de BONT/E compreende os aminoácidos 30 1/2-411 de uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BoNT/E de SEQ ID N°: 15, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de BoNT/E ou um subtipo de domínio enzimático de BONT/E.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/E compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BONT/E, tal como, por exemplo, uma variante conseNativa de domínio enzimático de BONT/E, uma variante não conseNativa de domínio 5 enzimático de BONT/E, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/E, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/E compreende o domí- nio enzimático de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzi- mático de BONT/E de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17, tal " 10 como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de BONT/E, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BONT/E,

W um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/E, ou qualquer combi- í" , nação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um do- )'l· mínio enzimático de BoNT/E compreende os aminoácidos 1/2-411 de uma , 15 variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BONT/E de SEQ ID N°: 15, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domí- nio enzimático de BONT/E, uma variante não conservativa de domínio enzi- mático de BoNT/E, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/E, ou qualquer combinação dos mesmos. 20 Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/E compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Ó°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio en- zimático de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; ou no máximo 25 7Õ°/o, no máximo 75%, no máximo 8Ó°/o, no máximo 85%, no máximo 9O°/,, ou no máximo 95% com o domínio enzimático de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/E compreende um polipeptídio tendo uma i- dentidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Ó°/o, pelo menos 30 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 15; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 15. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/E compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,.8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- 5 tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em ainda outros aspectos 10 desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/E compreende um poli- peptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deieções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não {" -

F

P adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 15; ou no i, - máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, u, , 15 e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- cidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 15. Em ainda outros aspectos desta ·modalida- de, um domínio enzimático de BONT/E compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- 20 ção ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N": 16, ou SEQ ID N°: 17; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de 25 BONT/E compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 15; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em 30 relação aos aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 15. Em uma outra modalidade, um domínio enzimático de toxina ( clostridiana compreende um domínio enzimático de BONT/F. Em um aspecto l f b t t 69/316 .

desta modalidade, um dominio enzimático de BoNT/F compreende os domí- nios enzimáticos de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/F com- preende os aminoácidos 1/2-428 de SEQ ID N°: 18. Em um outro aspecto 5 desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/F compreende uma va- riante de ocorrência natural de domínio enzimático de BONT/F, tal como, por exemplo, um domínio enzimático de uma isoforma de BONT/F ou um domí- nio enzimático de um subtipo de BONT/F. Em um outro aspecto desta moda- lidade, um domínio enzimático de BONT/F compreende uma variante de o- "' 10 corrência natural de domínio enzimático de BoNT/F de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, ta! como, por exemplo, uma isoforma de domí- . nio enzimático de BONT/F ou um subtipo de domínio enzimático de BONT/F. . F " P ' . 7 '\ ,_ //" . Em um outro aspecto desta modahdade, um dorrnnio enzimatico de BONT/F - compreende os aminoácidos 1/2-428 de uma variante de ocorrência natural 15 de domínio enzimático de BONT/F de SEQ ID N°: 18, tal como, por exemplo, 1) " . uma isoforma de domínio enzimático de BoNT/F"ou um subtipo de' domínio enzimático de BoNT/F. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/F compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BONT/F, tal como, por exemplo, uma vari- 20 ante conservativa de domínio enzimático de BONT/F, uma variante nào con- servativa de domínio enzimático de BONT/F, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/F, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/F com- preende o domínio enzimático de uma variante de ocorrência não natural de 25 domínio enzimático de BONT/F de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio en- zimático de BONT/F, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BoNT/F, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/F, ou qual- quer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalida- 30 de, um domínio enzimático de BONT/F compreende os aminoácidos 1/2-428 " de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BONT/F de SEQ ID N°: 18, tal como, por exemplo, uma variante conservati-

&

va de domínio enzimático de BoNT/F, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BoNT/F, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/F, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático 5 de BONT/F compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Ó°/o, pelo menos 85%, pelo menos 9O°/o, ou pelo menos 95% com o domínio en- zimático de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%,

- 10 ou no máximo 95% com o domínio enzimático de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N": 20. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/F compreende um polipeptídio tendo uma i- l" . \ dentidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos lj 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85°6, pelo menos 90%, ou pelo menos

- 15 95°/o com os aminoácidos 1/2-428 de SEQ ID N°: 18; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 1/2-428 de SEQ ID N°: 18. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 20 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de 25 SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/F compreende um poli- peptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-428 de SEQ ID N°: 18; ou no 30 máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- cidos 1/2-428 de SEQ ID N°: 18. Em ainda outros aspectos desta modalida-

^

V

W de, um domínio enzimático de BONT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- ção ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 5 20; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, - 10 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-428 de u SEQ ID N°: 18; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou + " 100 .deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-428 de SEQ ID N°: 18. ^. , 15 Em uma outra modalidade, um domínio enzimático de toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de BONT/G. Em um aspec- to desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/G compreende os domínios enzimáticos de SEQ ID N°: 21. Em outros aspectos desta modali- dade, um domí'nio enzimático de BONT/G compreende os aminoácidos 1/2- 20 4435 de SEQ ID N°: 21. Em um outro aspecto desta modalidade, um domí- nio enzimático de BoNT/G compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BONT/G, tal como, por exemplo, um domínio en- zimático de uma isoforma de BONT/G ou um domínio enzimático de um sub- tipo de BONT/G. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzi- 25 mático de BONT/G compreende uma variante de ocorrência natural de do- mínio enzimático de BONT/G de SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, uma isoforma de domlnio enzimático de BONT/G ou um subtipo de domínio en- zimático de BONT/G. Em um outro aspecto desta modalidade, um domlnio enzimático de BONT/G compreende os aminoácidos 1/2-4435 de uma vari- 30 ante de ocorrência natural de domínio enzimático de BoNT/G de SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de BONT/G ou um subtipo de domínio enzimático de BoNT/G. Em ainda um outro as-

^ W"

pecto desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/G compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BoNT/G, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de BONT/G, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BONT/G, 5 um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/G, ou qualquer combi- nação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um do- mínio enzimático de BONT/G compreende o domínio enzimático de uma va- riante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BONT/G de SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio en-

" 10 zimático de BONT/G, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BONT/G, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/G, ou qual- quer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalida- " . -de, um domínio enzimático de BONT/G compreende os aminoácidos 1/2-

é " 4435 de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de

_ 15 BONT/G de SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, uma variante conservati- va de domínio enzimático de BONT/G, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BONT/G, um fragmento ativo de domínio enzimático de BONT/G, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático 20 de BoNT/G compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80°6, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio en- zimático de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 70%, no máximo 75°/o, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com o domínio 25 enzimático de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/G compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 9Ó°/o, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 1/2-4435 de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 70°/o, 30 no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 1/2-4435 de SEQ ID N°: 21. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático

[ L 73/316

G W de BONT/G compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 5 ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacen- tes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/G compreen- de um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoá- - 10 cidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-4435 de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em rela- . - ção aos aminoácidos 1/2-4435 de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BONT/G compreende um poli- -, . 15 peptldio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adja- centes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático 20 de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BoNT/G compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pe- lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adi- ções, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos amino- ácidos 1/2-4435 de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-4435 de SEQ ID N°: 21. Em uma outra modalidade, um domínio enzimático de toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de TeNT. Em um aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende os domí- 30 nios enzimáticos de SEQ ID N°: 22. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende os aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID N°: 22. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzi-

mático de TeNT compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de TeNT, tal como, por exemplo, um domínio enzimático de uma isoforma de TeNT ou um domínio enzimático de um subtipo de TeNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT com- 5 preende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimá- tico de TeNT ou um subtipo de domínio enzimático de TeNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende os aminoácidos 1/2-438 de uma variante de ocorrência naturai de domínio en-

- 10 zimático de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de TeNT ou um subtipo de domínio enzimático de TeNT.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimáti- . " co de TeNT compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de TeNT, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de - , 15 domínio enzimático de TeNT, uma variante não conservativa de domínio enzimático de TeNT, um fragmento ativo '"de domínio enzimático de TeNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende o domínio enzi- mático de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de 20 TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de TeNT, uma variante não conservativa de domínio enzimático de TeNT, um fragmento ativo de domínio enzimático de TeNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende os aminoácidos 25 1/2-438 de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma variante conservati- va de domínio enzimático de TeNT, uma variante não conservativa de domí- nio enzimático de TeNT, um fragmento ativo de domínio enzimático de TeNT, ou qualquer combinação dos mesmos. 30 Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio enzimáti- co de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Ô°/o, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com o domínio enzi- mático de SEQ ID N°: 22. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um 5 domínio enzimático de TeNT compreende um polipeptídio tendo uma identi- dade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Ô°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID N°: 22: ou no máximo 70%, no má- ximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máxi- lO mo 95% com os aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID N°: 22. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 22. Em ainda outros as- pectos desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adi- ções, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID N°: 22. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende um polipeptÍdio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 22. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em 5 relação aos aminoácidos 1/2-438 de SEQ ID N°: 22. Em uma outra modalidade, um domínio enzimático de toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de BaNT.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende os domí- nios enzimáticos de SEQ ID N°: 23. Em outros aspectos desta modalidade,

- 10 um domínio enzimático de BaNT compreende os aminoácidos 1/2-420 de SEQ ID N°: 23. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzi- mático de BaNT compreende uma variante de ocorrência natural de domínio . enzimático de BaNT, tal como, por exemplo, um domínio enzimático de uma isoforma de BaNT ou um domínio enzimático de um subtipo de BaNT.

Em -- - 15 um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT com- preende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BaNT ' de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimá- tico de BaNT ou um subtipo de domínio enzimático de BaNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende os 20 aminoácidos 1/2-420 de uma variante de ocorrência natural de domínio en- zimático de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de BaNT ou um subtipo de domínio enzimático de - BaNT.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimáti- co de BaNT compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio 25 enzimático de BaNT, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de BaNT, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BaNT, um fragmento ativo de domínio enzimático de BaNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende o domínio enzi- 30 mático de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de BaNT, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BaNT, um fragmento ativo de domínio enzimático de BaNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende os aminoácidos 1/2-420 de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático 5 de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma variante conserva- tiva de domínio enzimático de BaNT, uma variante não conservativa de do- mínio enzimático de BaNT, um fragmento ativo de domínio enzimático de BaNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio enzimáti- co de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 70%,-no máximo 75°/o, no máximo 80%, no máximo 85°/o, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio enzi- mático de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende"um polipeptídio tendo uma identi- dade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 1/2-420 de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 70%, no má- ximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máxi- mo 95°6 com os aminoácidos 1/2-420 de SEQ ID N°: 23. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros as- pectos desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-420 de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adi- ções, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-420 de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende um polipeptídio 5 tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID

" 10 N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, - 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- . . ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-420 de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou +

. 15 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-420 de SEQ ID N°: 23. Em uma outra modalidade, um domínio enzimático de toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de BuNT.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende os domí- 20 nios enzimáticos de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende os amino- ácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 24. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BuNT, tal como, por exemplo, um domínio 25 enzimático de uma isoforma de BuNT ou um domínio enzimático from de um subtipo de BuNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio en- zimático de BuNT compreende uma variante de ocorrência natural de domí- nio enzimático de BuNT de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de BuNT ou de um subtipo 30 de domínio enzimático de BuNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende os aminoácidos 1/2-411 de uma variante de ocorrência natural de domínio enzimático de BuNT de SEQ

ID N°: 24, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio enzimático de BuNT ou de um subtipo de domínio enzimático de BuNT.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BuNT, tal 5 como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio enzimático de BuNT, uma variante não conservativa de domínio enzimático de BuNT, um fragmento ativo de domínio enzimático de BuNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um dominio enzimático de BuNT compreende o domínio enzimático de uma variante de 10 ocorrência não natural de domínio enzimático de BuNT de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domí- nio enzimático de BuNT, uma variante não conservativa de domínio enzimá- tico de BuNT, um fragmento atiyo de domínio enzimático de BuNT, ou qual-

O— quer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalida- 15 de, um domínio enzimático de BuNT compreende os aminoácidos 1/2-411 de uma variante de ocorrência não natural de domínio enzimático de BuNT .-.-- " de SEQ ID N°: 24, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de do- mínio enzimático de BuNT, uma variante não conservativa de domínio enzi- . mático de BuNT, um fragmento ativo de domínio enzimático de BuNT, ou 20 qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende um poIipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95°/o com o domínio enzimáti- 25 co de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N": 25; ou no máximo 7Õ°/o, no máximo 75°/o, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio enzimático de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por 30 exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8O°/,, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 70%, no máximo 75°/o, no máximo 8Ô°/o, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com os aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 5 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 24 ou 10 SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, . e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- cidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1, 2, 3, 4, -- . 15 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-411 de . SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modali- dade, um domínio enzimático de BuNT compreende um poIipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 20 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- ção ao domínio enzimático de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio enzi- mático de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N": 25. Em ainda outros aspectos desta 25 modalidade, um domínio enzimático de BuNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, 30 e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1/2-411 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N": 25. O "domínio de translocação" compreende uma porção da cadeia pesada de uma neurotoxina clostridiana tendo atividade de translocação.

Por "translocação" entende-se a capacidade de facilitar o transporte de um polipeptídio através de uma membrana vesicular, expondo assim parte ou todo o polipeptídio ao citoplasma.

Nas várias neurotoxinas botulínicas acre- 5 dita-se que a translocação envolve uma alteração conformacional alostérica da cadeia pesada causada por uma redução no pH no endossoma.

Essa alteração conformacional parece envolver e ser mediada pela metade N- terminal da cadeia pesada e resultar na formação de poros na membrana vesicular; essa alteração permite o movimento da cadeia leve proteolítica de

- 10 dentro da vesícula endossômica para dentro do citoplasma.

Vide, por exem- plo, Lacy, et al., Nature Struct.

Biol. 5:898-902 (Outubro 1998). A sequência aminoacídica da porção mediadora da translocação . " da cadeia pesada da-neurotoxina botulínica é conhecida pelos especialistas + na técnica; adicionalmente, os resíduos aminoacídicos nesta porção que

. 15 são conhecidos como essenciais para conferir a atividade de translocação também são conhecidos.

O especialista na técnica sabe portanto como·-em- pregar a metade peptícia N-terminal de ocorrência natural da cadeia pesada de- qualquer um dos vários subtipos de neurotoxina clostridiana tetanus ou ' Clostridium botulinum subtipos como um domínio de translocação, ou para 20 desenhar um domínio de translocação análogo alinhando as sequências primárias das metades N-terminais das várias cadeias pesadas e seleciona- do uma sequência de translocação primária de consenso baseada nos ami- noácidos conservados, na poIaridade, e nas características estéricas e de hidrofobicidade entre as sequências. 25 Os aspectos da presente invenção oferecem, em parte, um do- mínio de translocação de toxina clostridiana.

Conforme usado neste reiató- rio, o termo "domínio de translocação de toxina clostridiana" refere-se a qualquer polipeptídio de toxina clostridiana que pode executar a etapa de translocação do processo de intoxicação que medeia a translocação da ca- 30 deia Ieve da toxina clostridiana.

Assim sendo, um domínio de translocação de toxina clostridiana facilita o movimento de uma cadeia leve de toxina clostridiana através de uma membrana e abrange o movimento de uma ca-

deia leve de toxina clostridiana pela membrana de uma vesícula intracelular até o interior do citoplasma de uma célula. Exemplos não limitativos de um domínio de translocação de toxina clostridiana incluem, por exemplo, um domínio de translocação de BONT/A, um domínio de translocação de 5 BONT/B, um domínio de translocação de BONT/CI, um domínio de translo- cação de BONT/D, um domínio de translocação de BoNT/E, um domínio de translocação de BONT/F, um domínio de translocação de BoNT/G, um do- mínio de translocação de TeNT, um domínio de translocação de BaNT, e um domínio de translocação de BuNT. _ 10 Um domínio de translocação de toxina clostridiana inclui, sem Iimitação, variantes de ocorrência natural de domínio de translocação de toxina clostridiana, tal como, por exemplo, isoformas de domínio de translo- . r cação de toxina clostridiana e subtipos de domínio de translocação de toxina H , clostridiana; variantes de ocorrência não natural de domínio de translocação

I . 15 de toxina clostridiana, tal como, por exemplo, variantes conseNativas de ' do'mínio de translocação de toxina clostridiana, variantes não conservativas de domínio de translocação de toxina clostridiana, fragmentos ativos de do- mínio de translocação de toxina clostridiana das mesmas, ou qualquer com- binação dos mesmos. 20 Conforme usado neste relatório, o termo "variante de domínio de translocação de toxina clostridiana", seja de ocorrência natural ou de ocor- rência não natural, refere-se a um domínio de translocação de toxina clostri- diana que tem pelo menos uma alteração de aminoácido em relação à regi- ão correspondente das sequências de referência apresentadas (Tabela 1) e 25 pode ser descrito em percentagem de identidade em relação à região cor- respondente daquela sequência de referência. A menos que expressamente indicado, variantes de domínio de translocação de toxina clostridiana úteis para a prática das modalidades descritas são variantes que executam a eta- pa de translocação do processo de intoxicação que medeia a translocação 30 da cadeia leve da toxina clostridiana. Como exemplos não limitativos, uma variante de domínio de translocação de BONT/A terá pelo menos uma dife- rença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 455-873 de SEQ ID N°: 1; uma variante de domínio de translocação de BONT/B terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 447-860 de 5 SEQ ID N°: 6; uma variante de domínio de translocação de BoNT/CI terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 454-868 de SEQ ID N°: 11; uma variante de domínio de translocação de BoNT/D terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por e-

- 10 xemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 451-864 de SEQ ID N°: 13; uma variante de domínio de translocação de BONT/E terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, - . tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 15; uma variante de « . 15 domínio de translocação de BONT/F terá pelo menos uma diferença em a- minoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 446-865 de SEQ ID N°: 18; uma variante de domínio de translocação de BONT/G terá pelo menos uma dife- rença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou 20 adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 451-865 de SEQ ID N°: 21; uma variante de domínio de translocação de TeNT terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, dele- ção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 468-881 de SEQ ID N°: 22; uma variante de domínio de translocação de BaNT terá pelo me- 25 nos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substitui- ção, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 436- 857 de SEQ ID N°: 23; e uma variante de domínio de translocação de BuNT terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos amino- 30 ácidos 427-847 de SEQ ID N°: 24. Os especialistas na técnica reconhecem que dentro de cada so- rotipo de toxina clostridiana pode haver variantes de ocorrência natural de domínio de translocação de toxina clostridiana que diferem um pouco em termos de sua sequência aminoacídica, e também em termos dos ácidos nucleicos que codificam essas proteínas.

Por exemplo, existem atualmente cinco subtipos de BONT/A, BoNT/AI, BONT/A2, BONT/A3, BONT/A4, e 5 BONT/A5, with specific translocation domain subtipos apresentando cerca de 85-87% de identidade de aminoácidos quando comparados com the BoNT/Um domínio de translocação subtipo de SEQ ID N°: 1. Conforme usa- do neste relatório, o termo "variante de ocorrência natural de domínio de translocação de toxina clostridiana" refere-se a qualquer domínio de translo-

" 10 cação de toxina clostridiana produzido por um processo de ocorrência natu- ral, incluindo, sem limitação, isoformas de domínio de translocação de toxina . clostridiana produzidas a partir de transcritos alternativamente emendados, 4 isoformas de domínio de translocação de toxina clostridiana produzidopro-

&., duzidos por mutação espontânea e subtipos de domínio de translocação de

,. 15 toxina clostridiana.

Uma variante de ocorrência natural de domínio de trans- locação de toxina clostridiana pode funcionar substancialmente da mesma maneira que o domínio de translocação de referência de toxina clostridiana no qual the variante de ocorrência natural de domínio de translocação de toxina clostridiana se baseia, e pode substituir o domínio de translocação de 20 referência de toxina clostridiana em qualquer aspecto da presente invenção.

Um exemplo não limitativo de uma variante de ocorrência natu- ral de domínio de translocação de toxina clostridiana é uma isoforma de domínio de translocação de toxina clostridiana tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de translocação de BONT/A, uma isoforma de domínio 25 de translocação de BoNT/B, uma isoforma de domínio de translocação de BoNT/CI, uma isoforma de domínio de translocação de BoNT/D, uma iso- forma de domínio de translocação de BONT/E, uma isoforma de domínio de translocação de BONT/F, uma isoforma de domínio de translocação de BONT/G, uma isoforma de domínio de translocação de TeNT, uma isoforma 30 de domínio de translocação de BaNT, e uma isoforma de domínio de trans- locação de BuNT.

Um outro exemplo não limitativo de uma variante de ocor- rência natural de domínio de translocação de toxina clostridiana é um subti-

k '

85/316 po de domínio de translocaçáo de toxina clostridiana tal como, por exemplo, um domínio de translocação do subtipo BONT/AI, BONT/A2, BONT/A3, BONT/A4, e BONT/A5; um domínio de translocação do subtipo BONT/BI, BONT/B2, BONT/B bivalente e BONT/B não proteolítica; um domínio de 5 translocação do subtipo BONT/CI-I e BoNT/C1-2; um domínio de transloca- ção do subtipo BoNT/EI, BoNT/E2 e BoNT/E3; um domínio de translocação do subtipo BoNT/FI, BoNT/F2, BoNT/F3; e um domínio de translocação do subtipo BuNT-1 e BuNT-2. Conforme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de toxina clostridiana" refere-se a qualquer toxina clostridiana translocation domain produzido com o auxílio de manipulação humana, incluindo, sem limitação, clostridiana domínios de translocação de toxina produzido por engenharia genética usando mutagê- nese aleatória ou desenho racional e clostridiana domínios de translocação de toxina produzidos por sÍntese química.

Exemplos não limitativos de vari- antes de ocorrência não natural de domínio de translocação de toxina clos- tridiana incluem, por exemplo, variantes conservativas de domínio de trans- locação de toxina clostridiana, variantes não conservativas de domínio de translocação de toxina clostridiana, e fragmentos ativos de domínio de trans- locação de toxina clostridiana.

Conforme usado neste relatório, o termo "variante conservativa de domínio de translocação de toxina clostridiana" refere-se a um domínio de translocação de toxina clostridiana que tem pelo menos um aminoácido substituído por um outro aminoácido ou um análogo de aminoácido que tem pelo menos uma propriedade similar àquela do aminoácido original da se- quência do domínio de translocação de referência de toxina clostridiana (Tabela 1). Exemplos de propriedades incluem, sem limitação, tamanho si- milar, topografia, carga, hidrofobocidade, hidrofilicidade, lipofilicidade, capa- cidade de ligação covalente, capacidade de ligação hidrogênio, uma propri- edade físico-química, entre outras, ou qualquer combinação dos mesmos.

Uma variante conservativa de domínio de translocação de toxina clostridiana pode funcionar substancialmente da mesma maneira que o domínio de translocação de referência de toxina clostridiana no qual a variante conser- vativa de domínio de translocação de toxina clostridiana se baseia, e pode substituir o domínio de translocação de referência de toxina cIostridiana em qualquer aspecto da presente invenção.

Exemplos não limitativos de uma 5 variante conservativa de domínio de translocação de toxina clostridiana in- cluem, por exemplo, variantes conservativas de domínio de translocação de BoNT/A, variantes conservativas de domínio de translocação de BONT/B, variantes conservativas de domínio de translocação de BoNT/CI, variantes conservativas de domínio de translocação de BoNT/D, variantes conseNati- 10 vas de domínio de translocação de BoNT/E, variantes conservativas de do- mínio de translocação de BoNT/F, variantes conseNativas de domínio de translocação de BONT/G, variantes conservativas de domínio de transloca- «

ção de TeNT, variantes conservativas de domínio de translocação de BaNT, e variantes conservativas de domínio de translocação de BuNT. 15 Conforme usado neste relatório, o termo "variante não conserva- tiva de domínio de translocação de toxina clostridiana" refere-se a um domí- nio de translocação de toxina clostridiana in which 1) pelo menos um amino- ácido é deletado do domínio de translocação de referência de toxina clostri- diana no qual a variante não conservativa de domínio de translocação de 20 toxina clostridiana se baseia; 2) pelo menos um aminoácido é adicionado ao domínio de translocação de referência de toxina clostridiana no qual o do- mínio de translocação não conservativo de toxina clostridiana se baseia; ou 3) pelo menos um aminoácido é substituído por um outro aminoácido ou por um análogo de aminoácido que compartilha qualquer propriedade similar 25 àquela da sequência do domínio de translocação de referência de toxina clostridiana (Tabela 1). Uma variante não conservativa de domínio de trans- locação de toxina clostridiana pode funcionar substancialmente da mesma maneira que o domínio de translocação de referência de toxina clostridiana no qual a variante não conservativa de domínio de translocação de toxina 30 cIostridiana se baseia, e pode substituir o domínio de translocação de refe- rência de toxina clostridiana em qualquer aspecto da presente invenção.

Exemplos não limitativòs de uma variante não conservativa de domínio de

%',"qF',* :..?Z ? m":»-m3' 3

87/316 translocação de toxina clostridiana incluem, por exemplo, variantes não con- servativas de domínio de translocação de BONT/A, variantes não conservati- vas de domínio de translocação de BONT/B, variantes não conservativas de domínio de translocação de BONT/CI, variantes não conservativas de domí-

5 nio de translocação de BoNT/D, variantes não conservativas de domínio de translocação de BONT/E, variantes não conservativas de domínio de trans- . locação de BONT/F, variantes não conservativas de domínio de translocação de BONT/G, e variantes não conservativas de domínio de translocação de TeNT, variantes não conservativas de domínio de translocação de BaNT, e

" 10 variantes não conservativas de domínio de translocação de BuNT.

Conforme usado neste relatório, o termo "fragmento ativo de rr domínio de translocação de toxina clostridiana" refere-se a qualquer um de m * uma variedade de fragmentos de toxina clostridiana compreendendo o do- mínio de translocação que pode ser útil nos aspectos da presente invenção " . 15 com a condição de que esses fragmentos ativos possam facilitar a liberação da LC das vesículas intracelulares no citoplasma da célula alvo e portanto participar na execução do mecanismo celular completo por meio do qual uma toxina clostridiana cliva proteoliticamente um substrato.

Os domínios de translocação das cadeias pesadas de toxina clostridiana têm aproximada-

20 mente 410-430 aminoácidos de comprimento e compreendem um domínio de translocação (Tabela 1). As pesquisas mostraram que o comprimento inteiro de um domínio de translocação de uma cadeia pesada de uma toxina clostridiana não é necessário para a atividade de translocação do domínio de translocação.

Assim sendo, os aspectos desta modalidade incluem um 25 domínio de translocação de toxina clostridiana tendo um comprimento de, por exemplo, pelo menos 350, 375, 400, ou 425 aminoácidos.

Outros aspec- tos desta modalidade incluem um domínio de translocação de toxina clostri- diana tendo um comprimento de, por exemplo, no máximo 350, 375, 400, ou 425 aminoácidos. 30 Qualquer um de uma diversidade de métodos pode ser usado para determinada a percentagem de identidade de variantes de ocorrência natural de domínio de translocação de toxina clostridiana e variantes de o-

corrência não natural de domínio de translocação de toxina clostridiana, in- cluindo, sem Iimitação, métodos globais, métodos locais e métodos híbridos, tais como, por exemplo, métodos de abordagem de segmentos.

Os protoco- los para determinação da percentagem de identidade são procedimentos 5 rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados neste relatório.

Assim sendo, em uma modalidade, uma toxina clostridiana mo- dificada descrita no presente relatório compreende um domínio de translo- · cação de toxina clostridiana.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio

- 10 de translocação de toxina clostridiana compreende a variante de ocorrência natural de domínio de translocação de toxina clostridiana, tal como, por e- xemplo, uma isoforma de domínio de translocação de toxina clostridiana ou « " um subtipo de domínio de translocação de toxina clostridiana.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de toxina clostridia- - . 15 na compreende a variante de ocorrência não natural de domínio de translo- cação de toxina clostridiana, tal como, ,por exemplo, uma variante conseNa- tiva de domínio de translocação de toxina clostridiana, uma variante não conservativa de domínio de translocação de toxina clostridiana, um fragmen- to ativo de domínio de translocação de toxina cIostridiana, ou qualquer com- 20 binação dos mesmos.

Em uma outra modalidade, um aminoácido hidrófobo em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de translocação de toxina cIostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido hidrófobo.

Exemplos de aminoácidos hidrófobos incluem, por exemplo, C, F, I, L, M, V 25 e W.

Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido alifático em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de translocação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido alifático- Exemplos de aminoácidos alifáticos incluem, por exemplo, A, l, L, P, e V.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido aromático 30 em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de transloca- ção de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido a- romático.

Exemplos de aminoácidos aromáticos incluem, por exemplo, F, H,

W e Y.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de empilhamento em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de translocação de toxina clostridiana pode ser substituldo por um outro a- minoácido de empilhamento.

Exemplos de aminoácidos de empilhamento 5 inciuem, por exemplo, F, H, W e Y.

Em um outro aspecto desta modalidade, a polar aminoácido em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de translocação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido polar.

Exemplos de aminoácidos polares incluem, por e- xemplo, D, E, K, N, Q, e R.

Em um outro aspecto desta modalidade, um a-

- 10 minoácido menos polar ou indiferente em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de translocação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido menos polar ou indiferente.

Exemplos

- de aminoácidos menos poIares ou indiferentes incluem, por exemplo, A, H, G, P, S, T, e Y.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoá- 15 cido de carga positiva em uma posição particular na cadeia polipeptídica do - domínio de translocação de tox'ina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de carga positiva.

Exemplos de aminoácidos de carga po- sitiva incluem, por exemplo, K, R, e H.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga negativa em uma posição particular 20 na cadeia polipeptídica do domínio de translocação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de carga negativa.

Exemplos de aminoácidos de carga negativa incluem, por exemplo, D e E.

Em um ou- tro aspecto desta modalidade, um aminoácido pequeno em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de translocação de toxina clos- 25 tridiana pode ser substituído por um outro aminoácido pequeno.

Exemplos de aminoácidos pequenos incluem, por exemplo, A, D, G, N, P, S, e T.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido ramificado em C- beta em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de trans- locação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido 30 ramificado em C-beta.

Exemplos de aminoácidos ramificados em C-beta incluem, por exemplo, I, T e V.

Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi-

na clostridiana compreende um domínio de translocação de BONT/A.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/A com- preende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em outros aspectos desta modali- 5 dade, um domínio de translocação de BONT/A compreende os aminoácidos 455-873 de SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto desta modalidade, um do- mínio de translocação de BONTIA compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BONT/A, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de uma isoforma de BONT/A ou um domínio de

" 10 translocação de um subtipo de BoNT/A.

Em um outro aspecto desta modali- dade, um domínio de translocação de BONT/A compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BONT/A de SEQ ID N°: 1, - . SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BONT/A ou um domí-

. 15 nio de translocação de subtipo de BONT/A.

Em um outro aspecto desta mo- dalidade, um domínio de translocação de BONT/A compreende os aminoáci- dos 455-873 de uma variante de ocorrência natural de domínio de translo- cação de BONT/A de SEQ ID N°: 1, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BoNT/A ou um domínio de translocação de 20 subtipo de BONT/A.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um do- mínio de translocação de BoNT/A compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/A, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/A, uma va- riante não conservativa de domínio de translocação de BONT/A, um frag- 25 mento ativo de domínio de translocação de BONT/A, ou qualquer combina- ção dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domí- nio de translocação de BONT/A compreende o domínio de translocação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou 30 SEQ ID N°: 5, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/A, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BoNT/A, um fragmento ativo de domínio de translocação de

BoNT/A, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/A compreende os aminoácidos 455-873 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/A de SEQ ID N°: 1, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/A, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/A, um fragmento ati- vo de domínio de translocação de BONT/A, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo-

lO cação de BONT/A compreende um polipeptídio tendo uma identidade de a- minoácidos de, por exemplo, pelo menos 7O°/j, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo

8O°/j, no máximo 85%, no máximo 9Ô°/o, ou no máximo 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domí- nio de translocação de BONT/A compreende um polipeptídio tendo uma i- dentidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos

75%, pelo menos 80%, pelo menos 85°/o, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 455-873 de SEQ ID N°: 1; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 455-873 de SEQ ID N°: l- Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo-

cação de BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50,

ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacen- tes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5.

Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adi- ções, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 455-873 de SEQ ID N°: 1; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoá- cidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 455-873 de SEQ ID N°:

1. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domí- nio de translocação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 455-873 de SEQ ID N°: 1; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de a- minoácidos adjacentes em relação aos 'aminoácidos 455-873 de SEQ ID N°:

1. Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi- na cIostridiana compreende um domínio de translocação de BONT/B. Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/B com- preende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em outros aspectos desta moda- lidade, um domínio de translocação de BONT/B compreende os aminoácidos 447-860 de SEQ ID N°: 6. Em um outro aspecto desta modalidade, um do- mínio de translocação de BoNT/B compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BONT/B, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de uma isoforma de BONT/B ou um domínio de translocação de um subtipo de BONT/B.

Em um outro aspecto desta modali- dade, um domínio de translocação de BONT/B compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BoNT/B de SEQ ID N°: 6,

5 SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BONT/B ou um domí- nio de translocação de subtipo de BONT/B.

Em um outro aspecto desta mo- dalidade, um domínio de translocação de BONT/B compreende os aminoáci- dos 447-860 de uma variante de ocorrência natural de domínio de translo-

lO cação de BONT/B de SEQ ID N°: 6, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BONT/B ou um domínio de translocação de subtipo de BONT/B.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um do-

. mínio de translocação de BONT/B compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/B, tal como, por exemplo,

. 15 uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/B, uma va- riante não conservativa de domínio de translocação de BoNT/B, um frag- .--' "" mento ativo de domínio de translocação de BoNT/B, ou qualquer combina- ção dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domí- nio de translocação de BoNT/B compreende o domínio de translocação de

20 uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/B de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domí- nio de translocação de BONT/B, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/B, um fragmento ativo de domínio de translocação

25 de BONT/B, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro as- pecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/B compre- ende os aminoácidos 447-860 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/B de SEQ ID N°: 6, tal como, por exem- plo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BoNT/B, uma

30 variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/B, um frag- mento ativo de domínio de translocação de BONT/B, ou qualquer combina-

ção dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BONT/B compreende um polipeptídio tendo uma identidade de a- minoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Ô°/o, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85°/o, pelo menos 90°/o, ou pelo menos 95% com o

5 domínio de translocação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máxi- mo 80%, no máximo 85°/o, no máximo 9O°/o, ou no máximo 95% com o do- mínio de translocação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em ainda outros aspectos desta modalidade,

10 um domínio de translocação de BONT/B compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80°/o, pelo menos 85°6, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 447-860 de SEQ ID N°: 6; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 90°/o,

- 15 ou no máximo 95% com os aminoácidos 447-860 de SEQ ID N°: 6. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- " cação de BONT/B compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio

20 de translocação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adja- centes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em ainda outros aspectos

25 desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/B compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 447-860 de SEQ ID N°: 6: ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adi-

30 ções, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 447-860 de SEQ ID N°: 6. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/B compreende um poli-

peptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adja- centes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/B compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, - 10 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 447-860 de d SEQ ID N°: 6; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou . " 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 447-860 de SEQ ID N°: 6. e "' . 15 Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi- na clostridiana compreende um domínio de translocação de BONT/CI ." Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/CI compreende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°:

12. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de 20 BONT/CI compreende os aminoácidos 454-868 de SEQ ID N°: 11. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/CI compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BoNT/CI, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de uma isoforma de BONT/CI ou um domínio de translocação de um subtipo de 25 BONT/CI. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translo- cação de BONT/CI compreende uma variante de ocorrência natural de do- mínio de translocação de BONT/CI de SEQ ID N": 11 ou SEQ ID N°: 12, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BONT/CI ou um domínio de translocação de subtipo de BoNT/CI. Em um outro as- 30 pecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/CI compre- ende os aminoácidos 454-868 de uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BONT/CI de SEQ ID N°: 11, tal como, por e-

xemplo, um domínio de translocação de isoforma de BONT/CI ou um domí- nio de translocação de subtipo de BONT/CI.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/CI compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de

5 BONT/CI, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/CI, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BoNT/CI, um fragmento ativo de domínio de translocação de BoNT/CI, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro as- pecto desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/CI compre-

lO ende o domínio de translocação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/CI de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: . 12, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translo-

. cação de BONT/CI, uma variante não conservativa de domínio de transloca- ção de BONT/CI, um fragmento ativo de domínio de translocação de * . 15 BONT/CI, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspec- .- - " "to desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/CI icompreende os aminoácidos 454-868 de uma variante de ocorrência não natural de do- mínio de translocação de BONT/CI de SEQ ID N°: 11, tal como, por exem-

- plo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/CI, 20 uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/CI, um fragmento ativo de domínio de translocação de BONT/CI, ou qualquer com-

binação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BONT/CI compreende um polipeptídio tendo uma identidade de

25 aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95°/o com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95°/o com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 11 ou

30 SEQ ID N°: 12. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/CI compreende um polipeptídio tendo uma identida- de de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%,

pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 9O°/,, ou pelo menos 95°/, com os aminoácidos 454-868 de SEQ ID N°: 11; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 454-868 de SEQ ID N°: 11.

5 Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BONT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; ou no máximo 1, 2, 3, - 10 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de transloca- ção de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12. Em ainda outros aspectos desta

P modalidade, um domínio de translocação de BoNT/CI compreende um poli- àp peptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 15 .40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não " adjacentes em relação aos aminoácidos 454-868 de SEQ :ID" N°: 11; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- cidos 454-868 de SEQ ID N°: 11. Em ainda outros aspectos desta modali- 20 dade, um domínio de translocação de BONT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adi- 25 ções, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12. Em ainda outros as- pectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/CI com- preende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de a- 30 minoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 454-868 de SEQ ID N°: 11; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,-20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 454-868 de SEQ ID N°: 11. Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi- na clostridiana compreende um domínio de translocação de BONT/D.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/D com- 5 preende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/D compreende os aminoácidos 451-864 de SEQ ID N°: 13. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/D compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação '

" 10 de BoNT/D, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de uma isoforma de BONT/D ou um domínio de translocação de um subtipo de BONT/D.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de transloca- . ção de BONT/D compreende uma variante de ocorrência natural de domínio,

'Kn, de translocação de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N": 14, tal como,

. 15 por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BoNT/D ou um domínio de translocação de subtipo de BONT/D.

Em um "outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/D compreende os ami- noácidos 451-864 de uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BoNT/D de SEQ ID N°: 13, tal como, por exemplo, um do- 20 mínio de translocação de isoforma de BoNT/D ou um domínio de transloca- ção de subtipo de BONT/D.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/D compreende uma variante de ocor- rência não natural de domínio de translocação de BoNT/D, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/D, 25 uma variante não conservativa de domínio de translocação de BoNT/D, um fragmento ativo de domínio de translocação de BONT/D, ou qualquer combi- nação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um do- mínio de translocação de BoNT/D compreende o domlnio de translocação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de 30 BoNT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/D, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/D, um fragmento ati-

.j 99/316 {

S vo de domínio de translocação de BoNT/D, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/D compreende os aminoácidos 451 -864 de uma va- riante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/D de 5 SEQ ID N°: 13, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domí- nio de translocação de BONT/D, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/D, um fragmento ativo de domínio de translocação de BoNT/D, ou qualquer combinação dos mesmos. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- lO cação de BONT/D compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 8Ó°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9O°/o, 15 ou no máximo 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em ainda outros aspectos desta rrrodalidade, um domínio de translocação de BONT/D compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8O°/j, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com 20 os aminoácidos 451-864 de SEQ ID N°: 13; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 451-864 de SEQ ID N°: 13. Em outros aspectos desta modalidade, um dominio de translo- cação de BONT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no má- 25 ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de transloca- 30 ção de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/D compreende um poli- peptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30,

V &

-

¶b'

40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 451 -864 de SEQ ID N°: 13; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- 5 cidos 451-864 de SEQ ID N°: 13. Em ainda outros aspectos desta modali- dade, um domínio de translocação de BONT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; ou 10 no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adi- ções, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em ainda outros as- " . pectos desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/D compre- ende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, m

- 15 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoá- cidos adjacentes em relação aos aminoácid:os 451-864 de SEQ ID N°: 13; ' ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos ami- " noácidos 451-864 de SEQ ID N°: 13. 20 Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi- na clostridiana compreende um dominio de translocação de BONT/E.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/E com-

, preende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de trans- 25 locação de BONT/E compreende os aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 15. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/E compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BoNT/E, tal como, por exemplo, um domínio de transloca- ção de uma isoforma de BONT/E ou um domínio de translocação de um sub- 30 tipo de BONT/E.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/E compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BoNT/E de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou

SEQ ID N°: 17, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de iso- forma de BoNT/E ou um domínio de translocação de subtipo de BONT/E.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/E compreende os aminoácidos 427-847 de uma variante de ocorrên- 5 cia natural de domínio de translocação de BONT/E de SEQ ID N°: 15, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BONT/E ou um domínio de translocação de subtipo de BONT/E.

Em ainda um outro as- pecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/E compre- ende uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de

- 10 BONT/E, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/E, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/E, um fragmento ativo de domínio de translocação de "- BONT/E, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto . desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/E compreende o m

15 domínio de translocação de uma variante de ocorrência não natural de do- míhio de translocação de BoNT/E de-SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domí- nio de translocação de BONT/E, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/E, um fragmento ativo de domínio de translocação 20 de BONT/E, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro as- pecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/E compre- ende os aminoácidos 427-847 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BoNT/E de SEQ ID N": 15, tal como, por exem- plo, uma variante conservativa de domínio de translocação de 'BONT/E, uma

25 variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/E, um frag- mento ativo de domínio de translocação de BONT/E, ou qualquer combina- ção dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BONT/E compreende um polipeptídio tendo uma identidade de a- 30 minoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N": 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°:

17; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Ó°/o, ou no máximo 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/E compreende um 5 polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90°/o, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 15; ou no máximo 70%, no máximo 75°/o, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95°/o com os aminoácidos 427-847 de SEQ " 10 ID N°: 15. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BONT/E compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no má- . " ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio - 15 de translocação de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio

Y de translocação de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de 20 BONT/E compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 15; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacen- 25 tes em relação aos aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 15. Em ainda ou- tros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/E compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID 30 N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de ami- noácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N":

15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em ainda outros aspectos desta mo- dalidade, um domínio de translocação de BONT/E compreende um polipep- tídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes 5 em relação aos aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 15; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 427-847 de SEQIDN°:15. Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi- lO na clostridiana compreende um domínio de translocação de BoNT/F.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/F compre- ende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou "" SEQ ID N°: 20. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de trans- locação de BONT/F compreende os aminoácidos 446-865 de SEQ ID N°: 18. 15 Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/F compreende uma mariante de ocorrência natural de domínio de translocação de BONT/F, tal como, por exemplo, um domínio de transloca- ção de uma isoforma de BONT/F ou um domínio de translocação de um sub- tipo de BoNT/F.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de 20 translocação de BoNT/F compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BONT/F de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de iso- forma de BONT/F ou um domínio de translocação de subtipo de BONT/F.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de 25 BoNT/F compreende os aminoácidos 446-865 de uma variante de ocorrên- cia natural de domínio de translocação de BoNT/F de SEQ ID N°: 18, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BONT/F ou um domínio de translocação de subtipo de BONT/F.

Em ainda um outro as- pecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/F compre- 30 ende uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/F, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/F, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/F, um fragmento ativo de domínio de translocação de BoNT/F, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/F compreende o domínio de translocação de uma variante de ocorrência não natural de do- 5 mínio de translocação de BONT/F de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/F, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/F, um fragmento ativo de domínio de translocação de BONT/F, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto

\ - 10 desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/F compreende os aminoácidos 446-865 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/F de SEQ ID N°: 18, tal como, por exemplo, uma . variante conservativa de domínio de translocação de BONT/F, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/F, um fragmento ati-

. 15 vo de domínio de translocação de BoNT/F, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BoNT/F compreende um polipeptídio tendo uma identidade de a- minoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- 20 nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; ou no máximo 70%, no máximo 75°/o, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos 25 desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/F compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85°/o, pelo me- nos 90%, ou pelo menos 95°/o com os aminoácidos 446-865 de SEQ ID N": 18: ou no máximo 7Õ°/o, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, 30 no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 446-865 de SEQ ID N°: 18. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo-

cação de BONT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; ou no 5 máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 446-865 de SEQ ID N°: 18; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacen- tes em relação aos aminoácidos 446-865 de SEQ ID N°: 18. Em ainda ou- tros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de ami- noácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos desta mo- dalidade, um domínio de translocação de BoNT/F compreende um polipep- tídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 446-865 de SEQ ID N°: 18; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 446-865 de SEQIDN°:18. Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi- na clostridiana compreende um domínio de translocação de BONT/G.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/G compreende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 21. Em outros as- pectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/G compre- ende os aminoácidos 451-865 de SEQ ID N°: 21. Em um outro aspecto des- ta modalidade, um domínio de translocação de BONT/G compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BONT/G, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de uma isoforma de BONT/G ou um domínio de translocação de um subtipo de BONT/G.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/G compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BoNT/G de SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, um domínio de trans- locação de isoforma de BONT/G ou um domínio de translocação de subtipo de BONT/G.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de trans- locação de BoNT/G compreende os aminoácidos 451-865 de uma variante de ocorrência natura! de domínio de translocação de BoNT/G de SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de

- BONT/G ou um domínio de translocação de subtipo de BONT/G.

Em ainda .- um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/G compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BONT/G, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/G, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BONT/G, um fragmento ativo de domínio de translocação de BONT/G, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/G compreende o domínio de translocação de uma variante de ocor- rência não natural de domínio de translocação de BONT/G de SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translo- cação de BoNT/G, uma variante não conservativa de domínio de transloca- ção de BoNT/G, um fragmento ativo de domínio de translocação de BoNT/G, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/G compreende os aminoácidos 451-865 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BoNT/G de SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BONT/G, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BoNTIG, um fragmento ativo de domínio de translocação de BoNT/G, ou qualquer combinação dos mesmos. 5 Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BONT/G compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 7Õ°/o, no máximo 10 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/G com- . · preende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por e- xemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos

F - 15 85%, pelo menos 9Ó°/o, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 451 -865 de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no.-- máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 451-865 de SEQ ID N°: 21. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- 20 cação de BoNT/G compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos 25 não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/G compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 451- 30 865 de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adja- centes em relação aos aminoácidos 451-865 de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BONT/G compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao dominio de transiocação de SEQ ID 5 N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- . ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BoNT/G compreende um poli- peptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 10 40, 50, ou 100 deleções, adições, elou substituições de aminoácidos adja- centes em relação aos aminoácidos 451-865 de SEQ ID N°: 21; ou no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, - - e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 451-865 de SEQ ID N°: 21.

- 15 Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi- na clostridiana compreende um domínio de translocação de TeNT. Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de TeNT compre- ende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 22. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de TeNT compreende os 20 aminoácidos 468-881 de SEQ ID N°: 22. Em um outro aspecto desta moda- lidade, um domínio de translocação de TeNT compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de transiocação de TeNT, tal como, por e- xemplo, um domínio de translocação de uma isoforma de TeNT ou um do- mínio de translocação de um subtipo de TeNT. Em um outro aspecto desta 25 modalidade, um domínio de translocação de TeNT compreende uma varian- te de ocorrência natural de domínio de translocação de TeNT de SEQ ID N": 22, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de TeNT ou um domínio de translocação de subtipo de TeNT. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de TeNT compre- 30 ende os aminoácidos 468-881 de uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de TeNT ou um domínio de trans-

locação de subtipo de TeNT.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de TeNT compreende uma variante de ocor- rência não natural de domínio de translocação de TeNT, tal como, por e- xemplo, uma variante conseNativa de domínio de translocação de TeNT, 5 uma variante não conservativa de domínio de translocação de TeNT, um fragmento ativo de domínio de translocaçâo de TeNT, ou qualquer combina- ção dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domí- nio de translocação de TeNT compreende o domínio de translocação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de TeNT, uma variante não conservativa de domínio de translocação de TeNT, um fragmento ativo de domínio de trans- locação de TeNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de TeNT compre- ende os aminoácidos 468-881 de uma variante de ocorrência não natural de · . domínio de translocação de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, porexemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de TeNT, uma vari- ante não conservativa de domínio de translocação de TeNT, um fragmento ativo de domínio de translocação de TeNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um dominio de translo- cação de TeNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de ami- noácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com o domí- nio de translocação de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 7Õ°/o, no máximo 75°/,, no máximo 80%, no máximo 85°/o, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 22. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de TeNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 468-881 de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%,

no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com os aminoácidos 468-881 de SEQ ID N°: 22. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 5 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 22. 10 Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- . ições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 468-881 de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, W"'

- 15 ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacen- - tes em relação aos aminoácidos 468-881 de SEQ ID N°: 22. Em ainda ou- tros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de 20 aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 22. ln further other aspects of this embodiment, um domínio de translocação de TeNT compreende um poli- 25 peptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adja- centes em relação aos aminoácidos 468-881 de SEQ ID N°: 22; ou no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 30 468-881 de SEQ ID N°: 22. Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi- na clostridiana compreende um domínio de translocação de BaNT.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BaNT compre- ende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 23. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BaNT compreende os aminoácidos 436-857 de SEQ ID N°: 23. Em um outro aspecto desta moda- 5 lidade, um domínio de translocação de BaNT compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BaNT, tal como, por e- xemplo, um domínio de translocação de uma isoforma de BaNT ou um do- mínio de translocação de um subtipo de BaNT. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de transiocação de BaNT compreende uma varian- lO te de ocorrência natural de domínio de translocação de BaNT de SEQ ID N°: 23, ta! como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BaNT ou um domínio de translocação de subtipo de BaNT. Em um outro m, .

aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BaNT compre- ende os aminoácidos 436-857 de uma variante de ocorrência natural de ^ - 15 domínio de translocação de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de isoforma de BaNT ou um domínio de trans- locação de subtipo de BaNT. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BaNT compreende uma variante de ocor- rência não natural de domínio de translocação de BaNT, tal como, por e- 20 xemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BaNT, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BaNT, um fragmento ativo de domínio de translocação de BaNT, ou qualquer combina- ção dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domí- nio de translocação de BaNT compreende o domínio de translocação de 25 uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BaNT, uma variante não conservativa de domínio de transiocação de BaNT, um fragmento ativo de domínio de trans- locação de BaNT, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um ou- 30 tro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BaNT com- preende os aminoácidos 436-857 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por e-

xemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BaNT, uma variante não conservativa de dominio de translocação de BaNT, um fragmento ativo de domínio de translocação de BaNT, ou qualquer combina- ção dos mesmos. 5 Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BaNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de ami- noácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domí- nio de translocação de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BaNT compreende um .polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8O°/,, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 436-857 de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com os aminoácidos 436-857 de SEQ ID N°: 23. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjaçentes em relação ao domínio de t'ranslocação de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 436-857 de SEQ ID N": 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacen- tes em relação aos aminoácidos 436-857 de SEQ ID N°: 23. Em ainda ou-

tros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID 5 N°: 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BaNT compreende um polipep- tídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 10 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 436-857 de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- K "

. ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 436-857 de v7· SEQIDN°:23. 15 Em uma outra modalidade, um domínio de translocação de toxi- na clostridiana compreende um domínio de translocação de BuNT.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BuNT compre- ende os domínios de translocação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BuNT 20 compreende os aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 24. Em um outro as- pecto desta modalidade, um domínio de translocação de BuNT compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BuNT, tal como, por exemplo, um domínio de translocação de uma isoforma de BuNT ou um domínio de translocação from de um subtipo de BuNT.

Em um outro 25 aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BuNT compre- ende uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BuNT de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, tai como, por exemplo, um do- mínio de translocação de isoforma de BuNT ou de um domínio de transloca- ção de subtipo de BuNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domí- 30 nio de translocação de BuNT compreende os aminoácidos 427-847 de uma variante de ocorrência natural de domínio de translocação de BuNT de SEQ ID N°: 24, tal como, por exemplo, um domínio de .translocação de isoforma de BuNT ou de um domínio de translocação de subtipo de BuNT.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BuNT compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de translo- cação de BuNT, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domí- 5 nio de translocação de BuNT, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BuNT, um fragmento ativo de domínio de translocação de BuNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de translocação de BuNT compreende o domínio de translocação de uma variante de ocorrência não natural de do- lO mínio de translocação de BuNT de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N": 25, tal co- mo, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BuNT, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BuNT, '" um fragmento ativo de domínio de translocação de BuNT, ou qualquer com - " binação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um a'-

- 15 domínio de translocação de BuNT compreende os aminoácidos 427-847 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de translocação de . BuNT de SEQ ID N°: 24, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de translocação de BuNT, uma variante não conservativa de domínio de translocação de BuNT, um fragmento ativo de domínio de trans- 20 locação de BuNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- cação de BuNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de ami- noácidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o doml- 25 nio de translocação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9O°/,, ou no máximo 95% com o domínio de translocação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BuNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade 30 de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95°/o com os aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo

70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 427-847 de SEQ ID N": 24 ou SEQ ID N°: 25. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de translo- 5 cação de BuNT compreende um poIipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições 10 de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modali- dade, um domínio de translocação de BuNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes

. 15 em relação aos aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1,-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, .10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BuNT compre- 20 ende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoá- cidos adjacentes em relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em 25 relação ao domínio de translocação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de translocação de BuNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 427-847 de 30 SEQ ID N": 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 427-847 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ

ID N°: 25. Os aspectos da presente invenção oferecem, em parte, um do- mínio de ligação.

Conforme usado neste relatório, o termo "domínio de liga- ção" é sinônimo de "ligando" ou "porção de vetorização" e refere-se a qual- 5 quer molécula que pode interagir preferencialmente com uma outra molécu- la presente na superfície de uma célula em condições fisiológicas.

A molé- cula da superfície celular pode compreender um polipeptídio, um polissaca- rídeo, um lipídio, ou pode ter características estruturais de mais de um des- tes.

Conforme usado neste relatório, o termo "interage preferencialmente" refere-se à molécula que é capaz de ligar seu receptor alvo em condições fisiológicas, ou em condições in vitro substancialmente próximas das condi- ções fisiológicas, em um grau estatisticamente significativamente maior em relação a outro receptor não alvo.

Com respeito-a um domínio de ligação de toxina clostridiana descrita no presente relatório, ocorre uma ligação diferen- cial do domínio de ligação de toxina clostridiana ao seu receptor cognato em relação a outros receptores.

Com- respeito a um domínio de ligação de toxi- na não clostridiana descrita no presente relatório, ocorre uma ligação dife- rencial do domínio de ligação de toxina não clostridiana ao seu receptor cognato em relação a outros receptores.

Assim sendo, em uma modalidade, um domínio de ligação que liga seletivamente um receptor alvo tem uma uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) que é maior para o receptor do que para o receptor não alvo, por exemplo, pelo menos uma vez, pelo menos duas, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000, pelo menos 1O,OOO,or pelo menos 100,000 vezes.

Os aspectos da presente invenção oferecem, em parte, um do- mínio de ligação de toxina clostridiana.

Conforme usado neste relatório, o termo "domínio de ligação de toxina clostridiana" refere-se a qualquer poli- peptídio de toxina clostridiana que pode executar a etapa de ligação do pro- cesso de intoxicação que dá início o mecanismo de internalização completo por meio do qual a toxina clostridiana modificada descrita no presente rela-

tório intoxica uma célula alvo. Exemplos não limitativos de um domínio de ligação de toxina clostridiana incluem, por exemplo, um domínio de ligação BONT/A, um domínio de ligação de BONT/B, um domínio de ligação de BONT/CI, um domínio de ligação de BONT/D, um domínio de ligação de 5 BONT/E, um domínio de ligação de BONT/F, um domínio de ligação de BONT/G, um domínio de ligação de TeNT, um domínio de ligação de BaNT, e um domínio de ligação de BuNT. Outros exemplos não limitativos de um domínio de ligação de toxina clostridiana incluem, por exemplo, amino acids 874-1296 de SEQ ID N°: 1, amino acids 861-1291 de SEQ ID N°: 2, amino 10 acids 869-1291 de SEQ ID N°: 3, amino acids 865-1291 de SEQ ID N°: 4, amino acids 848-1252 de SEQ ID N°: 5, amino acids 866-1274 de SEQ ID N°: 6, amino acids 866-1297 de SEQ ID N°: 7, amino acids 882-1315 de SEQ ID N°: 8, amino acids 858-1268 de SEQ ID N°: 9, e amino acids 848- 1251deSEQIDN°:1O.

. 15 Um domínio de ligação de toxina clostridiana inclui, sem Iimita- ção, variantes de ocorrência-natural de domínio de ligação de toxina cIostri- diana, tal como, por exemplo, isoformas de domínio de ligação de toxina clostridiana e subtipos de domínio de ligação de toxina clostridiana; varian- tes de ocorrência não natural de domínio de Iigação de toxina clostridiana, 20 tal como, por exemplo, variantes conservativas de domínio de ligação de toxina clostridiana, variantes não conservativas de domínio de ligação de toxina clostridiana, fragmentos ativos de domínio de ligação de toxina clos- tridiana das mesmas, ou qualquer combinação dos mesmos. Conforme usado neste relatório, o termo "variante de domínio de 25 ligação de toxina clostridiana", seja de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, refere-se a um domínio de ligação de toxina clostridiana que tem pelo menos uma alteração de aminoácido em relação à região corres- pondente das sequências de referência apresentadas (Tabela 1) e pode ser descrito em percentagem de identidade em relação à região correspondente 30 daquela sequência de referência. A menos que expressamente indicado, variantes de domínio de Iigação de toxina clostridiana úteis para a prática - das modalidades descritas são variantes que executam a etapa de translo-

cação do processo de intoxicação que medeia a translocação da cadeia leve da toxina clostridiana.

Como exemplos não Iimitativos, uma variante de do- mínio de ligação de BONT/A terá pelo menos uma diferença em aminoáci- dos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de amino- 5 ácido, em relação aos aminoácidos 874-1296 de SEQ ID N°: 1; uma variante de domínio de ligação de BONT/B terá pelo menos uma diferença em ami- noácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 861 -1291 de SEQ ID N°: 6; uma variante de domínio de ligação de BONT/CI terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adi- ção de aminoácido, em relação aos aminoácidos 869-1291 de SEQ ID N°: 11; uma variante de domínio de Iigação de BONT/D terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, dele- ção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 865- 1291 de SEQ ID N°: 13; uma variante de domínio de ligação de BONT/E terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substi- tuição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 848- · 1252 de SEQ ID N°: 15; uma variante de domínio de ligação de BONT/F terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 866- 1274 de SEQ ID N°: 18; uma variante de domínio de ligação de BONT/G terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por e- xemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em relação aos aminoácidos 866-1297 de SEQ ID N°: 21; uma variante de domínio de ligação de TeNT terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em rela- ção aos aminoácidos 882-1315 de SEQ ID N°: 22; uma variante de domínio de ligação de BaNT terá pelo menos uma diferença em aminoácidos, tal como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de aminoácido, em q relação aos aminoácidos 858-1268 of SEQ ID N°: 23: e uma variante de domínio de Iigação de BuNT terá pelo menos uma diferença em aminoáci- dos, tai como, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de amino-

ácido, em relação aos aminoácidos 848-1251 de SEQ ID N°: 24. Os especialistas na técnica reconhecem que dentro de cada so- rotipo de toxina clostridiana pode haver variantes de ocorrência natural de domínio de ligação de toxina clostridiana que diferem um pouco em termos 5 de sua sequência aminoacídica, e também em termos dos ácidos nucleicos que codificam essas proteínas.

Por exemplo, existem atualmente cinco sub- tipos de BONT/A, BONT/AI, BoNT/A2, BONT/A3, BONT/A4, e BONT/A5, com subtipos específicos do domínio de ligação apresentando cerca de 83-97% de identidade de aminoácidos quando comparados com o subtipo de domí- lO nio de ligação de BONT/A de SEQ ID N°: 1. Como um outro exemplo, exis- tem atualmente cinco subtipos de BONT/A, BONT/AI, BONT/A2, BoNT/A3, BONT/A4, e BONT/A5, com subtipos específicos do domínio de ligação apreT sentando cerca de 83-97% de identidade de aminoácidos quando compara- dos com o subtipo de domínio de Iigação de BONT/A de SEQ ID N°: 1. Con- 15 forme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência natural de do- . mínio de ligação-de toxina clostridiana" refere-se a qualquer domínio de liga- ção de toxina clostridiana produzido por processo de ocorrência natural, in- cluindo, sem limitação, isoformas de domínio de ligação de toxina clostridia- na produzidas a partir de transcritos alternativamente emendados, isoformas 20 de domínio de ligação de toxina clostridiana produzidas por mutação espon- tânea e subtipos de domínio de ligação de toxina clostridiana.

Uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de toxina clostridiana pode fun- cionar substancialmente da mesma maneira que o domínio de ligação de referência de toxina clostridiana no qual a variante de ocorrência natural de 25 domínio de ligação de toxina clostridiana se baseia, e pode substituir o do- mínio de ligação de referência de toxina clostridiana em qualquer aspecto da presente invenção.

Um exemplo não limitativo de uma variante de ocorrência natu- ral de domínio de ligação de toxina clostridiana é uma isoforma de domínio 30 de ligação de toxina clostridiana tal como, por exemplo, uma isoforma de .domínio de ligação de BONT/A, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/B, uma isoforma de domínio de ligação de BoNT/CI, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/D, uma isoforma de domínio de ligação de BoNT/E, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/F, uma isoforma de domínio de ligação de BoNT/G, uma isoforma de domínio de ligação de TeNT, uma isoforma de domínio de ligação de BaNT, e uma isoforma de 5 domínio de ligação de BuNT.

Um outro exemplo não limitativo de uma vari- ante de ocorrência natural de domínio de Iigação de toxina clostridiana é um subtipo de domínio de ligação de toxina clostridiana tal como, por exemplo, um subtipo de domínio de ligação do subtipo BONT/AI, BONT/A2, BONT/A3, BONT/A4, e BONT/A5; um domínio de ligação do subtipo BONT/BI, BONT/B2, BONT/B bivalente e BONT/B não proteolítica; um domínio de liga- ção do subtipo BONT/CI -1 e BONT/C1-2; um domínio de ligação do subtipo BONT/EI, BONT/E2 e BONT/E3; e um domínio de ligação do subtipo BONT/FI, BONT/F2, e BONT/F3: e um domínio de ligação do subtipo BuNT-1 e BuNT-2. Conforme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de toxina clostridiana" refere-se a qual- . quer domínio de ligação de toxina clostridiana produzido com o auxílio de manipulação humana, incluindo, sem limitação, domínios de ligação de toxi- na clostridiana produzidos por engenharia genética usando mutagênese a- leatória ou desenho racional e domínios de ligação de toxina clostridiana produzidos por sÍntese química.

Exemplos não limitativos de variantes de ocorrência não natural de domínio de Iigação de toxina clostridiana incluem, por exemplo, variantes conservativas de domínio de ligação de toxina cIos- tridiana, variantes não conservativas de domínio de Iigação de toxina clostri- diana, variantes quiméricas de domínio de ligação de toxina clostridiana e fragmentos ativos de domínio de ligação de toxina clostridiana.

Conforme usado neste relatório, o termo "variante conservativa de domínio de ligação de toxina clostridiana" refere-se a um domínio de li- gação de toxina clostridiana que tem pelo menos um aminoácido substituído por um outro aminoácido ou um análogo de aminoácido que tem pelo me- . . nos uma propriedade similar àquela do aminoácido original da sequência do domínio de ligação de referência de toxina clostridiana (Tabela 1). Exemplos de propriedades incluem, sem limitação, tamanho similar, topografia, carga, hidrofobocidade, hidrofilicidade, lipofilicidade, capacidade de ligação cova- Iente, capacidade de ligação hidrogênio, uma propriedade físico-química, entre outras, ou qualquer combinação dos mesmos.

Uma variante conserva- 5 tiva de domínio de ligação de toxina clostridiana pode funcionar substanci- almente da mesma maneira que o domínio de ligação de referência de toxi- na clostridiana no qual a variante conseNativa de domínio de ligação de to- xina clostridiana se baseia, e pode substituir o domínio de ligação de refe- rência de toxina clostridiana em qualquer aspecto da presente invenção. 10 Exemplos não limitativos de uma variante conservativa de domínio de liga- ção de toxina clostridiana incluem, por exemplo, variantes conservativas de domínio de ligação de BONT/A, variantes conservativas de domínio de liga- ção de BONT/B, variantes conservativas de domínio de ligação de BONT/CI, variantes conservativas de domínio de ligação de BONT/D, variantes conser-

- 15 vativas de domínio de ligação de BoNT/E, variantes conservativas de domí- nio de- ligação de BoNT/F, variantes conservativas de domínio de ligação de BONT/G, variantes conservativas de domínio de ligação de TeNT, variantes conservativas de domínio de Iigação de BaNT, e variantes conservativas de domínio de ligação de BuNT. 20 Conforme usado neste relatório, o termo "variante não conseNa- tiva de domínio de ligação de toxina clostridiana" refere-se a um domínio de ligação de toxina clostridiana no qual 1) pelo menos um aminoácido é dele- tado do domínio de ligação de referência de toxina clostridiana no qual a variante não conservativa de domínio de ligação de toxina clostridiana se 25 baseia; 2) pelo menos um aminoácido é adicionado ao domínio de ligação de referência de toxina clostridiana no qual o domínio de ligação não con- servativo de toxina clostridiana se baseia; ou 3) pelo menos um aminoácido é substituído por um outro aminoácido ou por um análogo de aminoácido que não compartilha qualquer propriedade similar àquela do aminoácido ori- 30 ginal da sequência do domínio de ligação de referência de toxina clostridia- na (Tabela 1). Uma variante não conservativa de domínio de ligação de toxi- na clostridiana pode funcionar substancialmente da mesma maneira que o domínio de ligação de referência de toxina clostridiana no qual a variante não conservativa de domínio de ligação de toxina clostridiana se baseia, e pode substituir o domínio de ligação de referência de toxina clostridiana em qualquer aspecto da presente invenção.

Exemplos não limitativos de uma 5 variante não conservativa de domínio de ligação de toxina c'lostridiana inclu- em, por exemplo, variantes não conservativas de domínio de ligação de BoNT/A, variantes não conservativas de domínio de ligação de BONT/B, va- riantes não conservativas de domínio de ligação de BONT/CI, variantes não conservativas de domínio de ligação de BONT/D: variantes não conservati- lO vas de domínio de ligação de BONT/E, variantes não conseNativas de do- mínio de ligação de BONT/F, variantes não conservativas de domínio de li- gação de BONT/G, e variantes não conservativas de domínio de ligação de TeNT, variantes não conservativas de domínio de ligação de BaNT, e vari- antes não conservativas de domínio de ligação de BuNT.

Conforme usado neste relatório, o termo "fragmento ativo de domínio de ligação de toxina clostridiana" refere-se a qualquer um de-.vários fragmentos de toxina clostridiana compreendendo o domínio de ligação que pode ser útil nos aspectos da presente invenção com a condição de que es- ses fragmentos ativos possam facilitatar a liberação da LC das vesículas intracelulares para o interior do citoplasma da célula alvo e dessa forma par- ticipar da execução do mecanismo celular geral por meio do qual uma toxina clostridiana cliva proteoliticamente um substrato.

Os domínios de ligação das cadeias pesadas de toxina clostridiana têm aproximadamente 400-440 aminoácidos de comprimento e compreendem um domínio de ligação (Ta- bela 1). As pesquisas mostraram que o comprimento inteiro de um domínio de ligação de uma cadeia pesada de uma toxina clostridiana não é necessá- rio para a atividade de translocação do domínio de ligação.

Assim sendo, os aspectos desta modalidade incluem um domínio de ligação de toxina clostri- diana tendo um comprimento de, por exemplo, pelo menos 350, 375, 400, ou 425 aminoácidos.

Outros aspectos desta modalidade incluem um domí- nio de ligação de toxina clostridiana tendo um comprimento de, por exemplo, no máximo 350, 375, 400, ou 425 aminoácidos.

123/31.6

Qualquer um de uma diversidade de métodos pode ser usado para determinada a percentagem de identidade de variantes de ocorrência natural de domínio de ligação de toxina clostridiana e variantes de ocorrên- cia não natural de domínio de ligação de toxina clostridiana, incluindo, sem 5 limitação, métodos globais, métodos locais, e métodos híbridos, tal como, por exemplo, métodos de abordagem de segmentos.

Os protocolos para determinação da percentagem de identidade são procedimentos rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados neste relatório.

Assim sendo, em uma modalidade, uma toxina clostridiana mo- lO dificada descrita no presente relatório compreende um domínio de ligação \

de toxina clostridiana.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende uma variante de ocorrência natu- ral de domínio de ligação de toxina clostridiana, tal como, por exemplo, uma . isoforma de domínio de ligação de toxina clostridiana ou subtipo de um do-

- 15 mínio de ligação de toxina clostridiana.

Em um outro aspecto desta modali- - - dade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende-.uma varian- te de ocorrência não natural de domínio de ligação de toxina clostridiana, tal como, por exemplo, uma variante conseNativa de domínio .de ligação de toxina clostridiana, uma variante não conservativa de domínio de ligação de 20 toxina clostridiana, um fragmento ativo de domínio de ligação de toxina clos- tridiana, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em uma outra modalidade, um aminoácido hidrófobo em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de ligação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido hidrófobo.

Exem- 25 plos de aminoácidos hidrófobos incluem, por exemplo, C, F, I, L, M, V e W.

Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido alifático em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de ligação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido alifático.

Exem- plos de aminoácidos alifáticos incluem, por exemplo, A, I, L, P, e V.

Em ain- 30 da um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido aromático em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de ligação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido aromático.

Exem-

plos de aminoácidos aromáticos incluem, por exemplo, F, H, W e Y.

Em ain- da um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de empilhamento em uma posição particular na cadeia polipeptldica do domínio de Iigação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de empi- 5 lhamento.

Exemplos de aminoácidos de empilhamento incluem, por exem- plo, F, H, W e Y.

Em um outro aspecto desta modalidade, a polar amino acid em uma posição particular na cadeia polipeptídica do dominio de ligação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido polar.

E- xemplos de aminoácidos polares incluem, por exemplo, D, E, K, N, Q, e R. 10 Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido menos polar ou indiferente em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de ligação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido menos polar ou indiferente.

Exemplos de aminoácidos menos polares ou indiferentes incluem, por exemplo, A, H, G, P, S, T, e Y.

Em ainda um outro

- 15 aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga positiva em uma posi- ção particular na cadeia poIipeptídica do domínio de ligação"de toxina clos- tridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de carga positiva.

E- xemplos de aminoácidos de carga positiva incluem, por exemplo, K, R, e H.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga ne- 20 gativa em uma posição particuiar na cadeia polipeptídica do domínio de liga- ção de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de carga negativa.

Exemplos de amin,oácidos de carga negativa incluem, por exemplo, D e E.

Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido pequeno em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de 25 ligação de toxina clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido pequeno.

Exemplos de aminoácidos pequenos incluem, por exemplo, A, D, G, N, P, S, e T.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoá- cido ramificado em C-beta em uma posição particular na cadeia polipeptídi- ca do domínio de ligação de toxina clostridiana pode ser substituído por um 30 outro aminoácido ramificado em C-beta.

Exemplos de aminoácidos ramifica- dos em C-beta incluem, por exemplo, I, T e V.- Em uma outra modalidade, um domínio de ligação-de toxina clostridiana compreende um domínio de ligação BoNT/A.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação BONT/A compreende os domínios de ligação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N": 4, ou SEQ ID N°: 5. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação 5 BONT/A compreende os aminoácidos 874-1296 de SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de Iigação BONT/A compreen- de uma variante de"ocorrência natural de domínio de ligação de BoNT/A, tal como, por exemplo, um domínio de ligação de uma isoforma de BoNT/A ou um domínio de ligação de um subtipo de BoNT/A.

Em um outro aspecto des- lO ta modalidade, um domínio de ligação BONT/A compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BONT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5, tal como, por exem- pIo, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/A ou um subtipo de do- mínio de ligação de BONT/A.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação BoNT/A compreende os aminoácidos 874-1296 de uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de' BONT/A de SEQ ID N°: 1, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/A ou um subtipo de domínio de ligação de BONT/A.

Em ainda um ou- tro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação BONT/A compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/A, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BoNT/A, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/A, um fragmento ativo de domínio de ligação de BONT/A, ou qualquer combi- nação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um do- mínio de ligação BONT/A compreende o domínio de ligação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/A de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5, tal como, por 4 exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BONT/A, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BoNT/A, um fragmento ativo de domínio de ligação de BONT/A, ou qualquer combinação dos mes- mos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação BONT/A compreende os aminoácidos 874-1296 de uma variante de ocorrên-

cia não natural de domínio de ligação de BONT/A de SEQ ID N°: 1, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BONT/A, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BoNT/A, um frag- mento ativo de domínio de ligação de BONT/A, ou qualquer combinação dos 5 mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação BONT/A compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio de liga- lO ÇãO de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação BONT/A compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 874-1296 de SEQ ID N°: 1; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com os amino- ácidos 874-1296 de SEQ ID N°: 1. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de Iigação BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N": 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 nondele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação BoNT/A compreende um polipeptídio tendo, por exem- plo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 874-1296 de SEQ ID N°: 1; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de ami- noácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 874-1296 de SEQ ID N°: 1. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação 5 BONT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, ou SEQ ID N°: 5. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação BoNT/A compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo me- nos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 874-1296 de SEQ ID N°: 1; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deieções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adja- centes em relação aos aminoácidos 874-1296 de SEQ ID N°: 1. Em uma outra modalidade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende um domínio de ligação de BoNT/B.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/B compreende os domí- nios de ligação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de Iigação de BONT/B compreende os aminoácidos 861-1291 de SEQ ID N°: 6. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/B compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BoNT/B, tal como, por exemplo, um domínio de ligação de uma isoforma de BONT/B ou um domínio de ligação de um subtipo de BoNT/B.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/B compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BoNT/B de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BoNT/B ou um subtipo de domínio de ligação de BoNT/B. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/B compreende os aminoácidos 861-1291 de uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BONT/B de SEQ ID N°: 6, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio 5 de ligação de BONT/B ou um subtipo de domínio de Iigação de BONT/B. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/B compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/B, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BONT/B, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/B, um fragmento ativo de domínio de ligação de BONT/B, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/B compreende o domí- nio de ligação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de li- gação de BoNT/B de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de Iigação de BONT/B, uma variante não conservativa de dominio de ligação de BONT/B, um fragmento ativo de domínio de ligação de BONT/B, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/B compreende os ami- noácidos 861-1291 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/B de SEQ ID N°: 6, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de Iigação de BONT/B, uma variante não conserva- tiva de domínio de ligação de BONT/B, um fragmento ativo de domínio de ligação de BONT/B, ou qualquer combinação dos mesmos. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de iigação

P de BONT/B compreende um polipeptldio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 9O°/,, ou pelo menos 95% com o domínio de Iigação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio de liga- ção de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID a 129/316

N°: 10. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/B compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75°/o, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoáci- 5 dos 861 -1291 de SEQ ID N°: 6; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 861 -1291 de SEQ ID N°: 6. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/B compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 10 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N": 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em rela-

- 15 ção ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 1O:-Em ainda outros aspectos desta modalida- de, um domínio de ligação de BONT/B compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em 20 relação aos aminoácidos 861-1291 de SEQ ID N°: 6; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 861-1291 de SEQ ID N°: 6. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/B compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo 25 menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em 30 relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10. Em ainda outros aspectos desta modalida- de, um domínio de ligação de BoNT/B compreende um polipeptídio tendo,

por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- ção aos aminoácidos 861-1291 de SEQ ID N°: 6; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições 5 de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 861 -1291 de SEQ ID N°: 6. Em uma outra modalidade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende um domínio de ligação de BONT/CI.

Em um aspec- to desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/CI compreende os 10 domínios de ligação de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12. Em outros aspec- tos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/CI compreende os aminoácidos 869-1291 de SEQ ID N°: 11. Em um outro aspecto desta mo- dalidade, um domínio de ligação de BoNT/CI compreende uma variante de oçorrência natural de domínio de ligação de BoNT/CI, tal como, por exem-

- 15 pIo, um domínio de ligação de uma isoforma de BONT/CI ou um domínio de ligação de um subtipo de BONT/CI.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/CI compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BONT/CI de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N": 12, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/CI 20 ou um subtipo de domínio de ligação de BoNT/CI.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/CI compreende os ami- noácidos 869-1291 de uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BONT/CI de SEQ ID N°: 11, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/CI ou um subtipo de domínio de ligação de 25 BONT/CI.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/CI compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BoNT/CI, tal como, por exemplo, uma variante con- servativa de domínio de ligação de BoNT/CI, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/CI, um fragmento ativo de domínio de liga- 30 ção de BONT/CI, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/CI compreende o domínio de ligação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/CI de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BoNT/CI, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/CI, um fragmento ativo de domínio de ligação de BoNT/CI, ou qualquer combina- 5 ção dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domí- nio de ligação de BoNT/CI compreende os aminoácidos 869-1291 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/CI de SEQ ID N°: 11, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domí- nio de ligação de BoNT/CI, uma variante não conservativa de domínio de 10 ligação de BONT/CI, um fragmento ativo de domlnio de ligação de BONT/CI, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/CI compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoá- cidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, 15 pelo menos 85°/o, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio de ' ligação de SEQ ID N°:.1"1 -ou SEQ ID N": 12; ou no máximo 7Ó°/o, no máximo /

75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95°6 com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12. Em a- inda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/CI 20 compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 869-1291 de SEQ ID N°: 11; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com os aminoácidos 25 869-1291 deSEQID N°: 11. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação 30 de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoá- cidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- 5 cidos 869-1291 de SEQ ID N°: 11; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 869-1291 de SEQ ID N°: 11. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 11 ouSEQID N°: 12;ou nomáximo 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,20,30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adja- centes em relação ao domínio de Iigação de SEQ ID N°: 11. ou SEQ ID N°:

12. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/CI compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, .- - 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 869-1291 de SEQ ID N°: 11; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 869-1291 de SEQ ID N°: 11. Em uma outra modalidade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende um domínio de ligação de BoNT/D. Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/D compreende os domínios de Iigação of SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/D compreende os aminoácidos 865-1291 de SEQ ID N°: 13. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/D com- preende uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BONT/D, tal como, por exemplo, um domínio de ligação de uma isoforma de BONT/D ou um domínio de ligação de um subtipo de BoNT/D. Em um .outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/D compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/D ou um subtipo de domínio de ligação de BoNT/D.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de 5 BoNT/D compreende os aminoácidos 865-1291 de uma variante de ocor- rência natural de domínio de ligação de BONT/D de SEQ ID N°: 13, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/D ou um subtipo de domínio de ligação de BONT/D.

Em ainda um outro aspecto desta moda- lidade, um domínio de ligação de BONT/D compreende uma variante de 0- corrência não natural de domínio de ligação de BONT/D, tai como, por e- xemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BONT/D, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/D, um fragmento ativo de domínio de ligação de BONT/D, ou qualquer combinação dos mes- mos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/D compreende o domínio de ligação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/D de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID ·'- . - N°: 14, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de li- gação de BONT/D, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/D, um fragmento ativo de domínio de ligação de BoNT/D, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modaíidade, um domínio de Iigação de BONT/D compreende os aminoácidos 865-1291 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/D de SEQ ID N°: 13, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de do- mínio de ligação de BoNT/D, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/D, um fragmento ativo de domínio de ligação de BONT/D, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/D compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75°/o, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo

95% com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em a- inda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/D compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 5 85%, pelo menos 9Ô°/o, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 865-1291 de SEQ ID N°: 13; ou no máximo 70°/o, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 865-1291 deSEQID N°: 13. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de Iigação 10 de BONT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoá-

. 15 cidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio -' de ligação de BoNT/D compreende um polipeptldio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- 20 cidos 865-1291 de SEQ ID N°: 13; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 865-1291 de SEQ ID N°: 13. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 25 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 13ou SEQ ID N°: 14;ou nomáximo1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,20,30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adja- centes em relação ao domínio de Iigação de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 30 14. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/D compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu-

ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 865-1291 de SEQ ID N°: 13; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 865-1291 de SEQ ID N°: 13. 5 Em uma outra modalidade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende um domínio de ligação de BONT/E.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/E compreende os domí- nios de ligação de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/E com- lO preende os aminoácidos 848-1252 de SEQ ID N": 15. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/E compreende uma va- riante de ocorrência natural de domínio de ligação de BONT/E, tal como, por exemplo, um domínio de ligação de uma isoforma de BONT/E ou um domí- nio de ligação de um subtipo de BONT/E.

Em um outro aspecto desta moda- lidade, um domínio de ligação de BONT/E compreende uma variante de o- cotUncia natural de domínio de ligação de BONT/E de SEQ ID N°: 15,:-SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17, tal como, por exempjo, uma isoforma de domí- nio de ligação de BONT/E ou um subtipo de domínio de ligação de BONT/E.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/E compreende os aminoácidos 848-1252 de uma variante de ocorrência natu- ral de domínio de ligação de BoNT/E de SEQ ID N°: 15, tal como, por exem- plo, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/E ou um subtipo de do- mínio de ligação de BoNT/E.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/E compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BoNT/E, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BONT/E, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/E, um fragmento ativo de do- mínio de ligação de BoNT/E, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em a- inda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/E compreende o domínio de ligação de uma variante de ocorrência não natu- ral de domínio de ligação de BONT/E de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domí-

nio de ligação de BoNT/E, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/E, um fragmento ativo de domínio de ligação de BoNT/E, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/E compreende os aminoácidos 5 848-1252 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/E de SEQ ID N°: 15, tal como, por exemplo, uma variante conser- vativa de domínio de ligação de BONT/E, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BoNT/E, um fragmento ativo de domínio de ligação de BoNT/E, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/E compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 90°/o, · --ou no máximo 95% com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 15, .SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um do- mínio de ligação de BONT/E compreende um polipeptídio tendo uma identi- dade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 848-1252 de SEQ ID N°: 15; ou no máximo 70°6, no máximo 75%, no máximo 8Ó°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 848-1252 de SEQ ID N°: 15. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/E compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N": 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitui- ções de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ÍD N": 17. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/E compreende um poli-

peptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 848-1252 de SEQ ID N°: 15; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, 5 e/ou substituições de. aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- cidos 848-1252 de SEQ ID N°: 15. Em ainda outros aspectos desta modali- dade, um domínio de ligação de BoNT/E compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- lO ção ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17: ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17. Em . ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/E

- 15 compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, -. '- 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou -substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 848-1252 de SEQ ID N°: 15; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação 20 aos aminoácidos 848-1252 de SEQ ID N°: 15. Em uma outra modalidade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende um domínio de ligação de BONT/F.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/F compreende os. domí- nios de ligação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em 25 outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/F com- preende os aminoácidos 866-1274 de SEQ ID N°: 18. Em um outro aspecto desta modalidade, um domlnio de ligação de BONT/F compreende uma va- riante de ocorrência natural de domínio de ligação de BONT/F, tal como, por exemplo, um domínio de ligação de uma isoforma de BoNT/F ou um domí- 30 nio de ligação de um subtipo de BONT/F.

Em um outro aspecto desta moda- lidade, um domínio de ligação de BONT/F compreende uma variante de o- corrência natural de domínio de ligação de BoNT/F de SEQ ID N°: 18, SEQ

ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, tal como, por exemplo, uma isoforma de domí- nio de ligação de BONT/F ou um subtipo de domínio de ligação de BONT/F.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/F compreende os aminoácidos 866-1274 de uma variante de ocorrência natu- 5 ral de domínio de ligação de BONT/F de SEQ ID N°: 18, tal como, por exem- plo, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/F ou um subtipo de do- mínio de ligação de BONT/F.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/F compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/F, tal como, por exemplo, uma 10 variante conservativa de domínio de ligação de BoNT/F, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BONT/F, um fragmento ativo de do- mínio de ligação de BONT/F, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ain- da um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/F compreende o domínio de ligação de uma variante de ocorrência não natu-

- 15 ral de domínio de ligação de BONT/F de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20, tal como, por exemplo, 'uma variante conservativa de domí- nio de ligação de BONT/F, uma variante não conservativa de domínio de li- gação de BoNT/F, um fragmento ativo de domínio de ligação de BoNT/F, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta mo- 20 dalidade, um domínio de ligação de BONT/F compreende os aminoácidos 866-1274 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/F de SEQ ID N°: 18, tal como, por exemplo, uma variante conser- vativa de domínio de ligação de BONT/F, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BoNT/F, um fragmento ativo de domínio de ligação de 25 BoNT/F, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/F compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio de 30 ligação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N": 20; ou no máximo 7Õ°/o, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85°/o, no máximo 9O°/,, ou no máximo 95% com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°:

19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um do- mínio de ligação de BoNT/F compreende um polipeptídio tendo uma identi- dade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% 5 com os aminoácidos 866-1274 de SEQ ID N°: 18; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com os aminoácidos 866-1274 de SEQ ID N°: 18. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 non-contiguous aminiácido dele- ções, adições, e/ou substitutions em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos des- ta modalidade, um domínio de ligação de BoNT/E-compreende um polipep- tídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adja- centes em relação aos aminoácidos 866-1274 de SEQ ID N°: 18; ou no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoá- cidos 866-1274 de SEQ ID N°: 18. Em ainda outros aspectos desta modali- dade, um domínio de ligação de BONT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em rela- ção ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/F compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 866-1274 de SEQ ID N°: 18; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 866-1274 de SEQ ID N°: 18. 5 Em uma outra modalidade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende um domínio de ligação de BoNT/G.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende os domí- nios de Iigação de SEQ ID N°: 21. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende os aminoácidos 866-1297 10 de SEQ ID N°: 21. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende uma variante de ocorrência natural de do- mínio de ligação de BONT/G, tal como, por exemplo, um domínio de ligação

.- de uma isoforma de BoNT/G ou um domínio de ligação de um subtipo de BONT/G.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de

- 15 BONT/G compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de li- gação de BONT/G de SEQ ID N°: 21, tal como,-"por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BONT/G ou um subtipo de domínio de ligação de BONT/G.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende os aminoácidos 866-1297 de uma variante de ocor- 20 rência natural de domínio de ligação de BoNT/G de SEQ ID N°: 21, tal co- mo, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BoNT/G ou um subtipo de domínio de ligação de BONT/G.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/G, tal como, por 25 exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BONT/G, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BoNT/G, um fragmento ativo de domínio de ligação de BONT/G, ou qualquer combinação dos mes- mos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende o domínio de ligação de uma variante de ocorrên- 30 cia não natural de domínio de ligação de BONT/G de SEQ ID N°: 21, tal co- mo, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BoNT/G, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BoNT/G,

um fragmento ativo de domínio de Iigação de BoNT/G, ou qualquer combi- nação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um do- mínio de ligação de BONT/G compreende os aminoácidos 866-1297 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BONT/G de 5 SEQ ID N°: 21, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domí- nio de ligação de BoNT/G, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BoNT/G, um fragmento ativo de domínio de ligação de BoNT/G, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação 10 de BoNT/G compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoáci- dos de, por exemplo, pelo menos 70°6, pelo menos 75%, pelo menos 8O°/j, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Ó°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio " 15 de ligação de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90°6, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 866-1297 de SEQ ID N": 21; ou no máximo 70%, 20 no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 866-1297 de SEQ ID N°: 21. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- 25 tituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de Iigação de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacen- tes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende 30 um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 866-1297 de SEQ ID N°: 21;

t4 b 142/316 k \r .? y Ó\ ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos 4 aminoácidos 866-1297 de SEQ ID N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende um polipeptídio 5 tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou

L 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID 10 N°: 21. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BONT/G compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou subs- . tituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 866-1297 , -\ de SEQ ID N°: 21; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ¶P 15 ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 866-1297. de-SEQ ID N°: 21. m' Em uma outra modalidade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende um domínio de ligação de TeNT. Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende os domí- 20 nios de ligação de SEQ ID N°: 22. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende os aminoácidos 882-1315 de SEQ ID N°: 22. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de li- gação de TeNT compreende uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de TeNT, tal como, por exemplo, um domínio de ligação de uma 25 isoforma de TeNT ou um domínio de ligação de um subtipo de TeNT. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de TeNT com- preende uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de liga- ção de TeNT ou um subtipo de domínio de ligação de TeNT. Em um outro 30 aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende os aminoácidos 882-1315 de uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de TeNT de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma isoforma de

- a 143/316

W \ e, domínio de ligação de TeNT ou um subtipo de domínio de ligação de TeNT. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de " TeNT compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de TeNT, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de do- 5 mínio de ligação de TeNT, uma variante não conservativa de domínio de ligação de TeNT, um fragmento ativo de domínio de ligação de TeNT, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta mo- dalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende o domínio de ligação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de TeNT 10 de SEQ ID N°: 22, tal como, por exemplo, uma variante conseNativa de do- mínio de ligação de TeNT, uma variante não conservativa de domínio de . ligação de TeNT, um fragmento ativo de domínio de ligação de TeNT, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda -um outro aspecto desta mo- dalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende os aminoácidos 882- . <' 15 1315 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de TeNT of SEQ ID N": 22, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de TeNT, uma variante não conservativa de domínio de ligação de TeNT, um fragmento ativo de domínio de ligação de TeNT, ou qualquer combinação dos mesmos. 20 Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com o domínio de liga- ção de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 25 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 22. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 30 95% com os aminoácidos 882-1315 de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 882-1315 de SEQ ID N°: 22.

G H 144/316 + ~ .

O Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, " 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de 5 SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 22. Em ainda outros as- pectos desta modalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 10 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 882-1315 de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos

G aminoácidos 882-1315 de SEQ ID N°: 22. Em ainda outros aspectos desta <" 15 modalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo. menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições 20 de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 22. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de TeNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 882-1315 de 25 SEQ ID N°: 22; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 882-1315 de SEQ ID N°: 22. Em uma outra modalidade, um domínio de ligação de toxina clostridiana compreende um domínio de ligação de BaNT. Em um aspecto 30 desta modalidade, um domínio de Iigação de BaNT compreende os domí- nios de ligação de SEQ ID N°: 23. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de Iigação de BaNT compreende os aminoácidos 858-1268 de

' SEQ ID N": 23. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de li- . gação de BaNT compreende uma variante de ocorrência natural de domínio " de ligação de BaNT, tal como, por exemplo, um domínio de ligação de uma isoforma de BaNT ou um domínio de ligação de um subtipo de BaNT. Em 5 um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BaNT com- preende uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de liga- ção de BaNT ou um subtipo de domínio de ligação de BaNT. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BaNT compreende os 10 aminoácidos 858-1268 de uma variante de ocorrência natural de domínio de ligação de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BaNT ou um subtipo de domínio de ligação de BaNT. . » Em ainda um outro aspecto desta .modalidade, um domínio de ligação de A ^ · r . ¥ b,, BaNT compreende uma variante de ocorrencia não natural de dorrnnio de -· .'jt: 15 ligação de BaNT, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de do- .- mínio de ligação de. BaNT, uma variante não conservativa de domínio de - ligação de BaNT, um fragmento ativo de domínio de ligação de BaNT, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta mo- dalidade, um domínio de ligação de BaNT compreende o domínio de ligação 20 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BaNT de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de do- mínio de ligação de BaNT, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BaNT, um fragmento ativo de domínio de ligação de BaNT, ou qualquer combinação dos mesmos. Em ainda um outro aspecto desta mo- 25 dalidade, um domínio de ligação de BaNT compreende os aminoácidos 858- 1268 de uma variante de um domínio de ligação de BaNT de ocorrência não natural de SEQ ID N°: 23, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BaNT, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BaNT, um fragmento ativo de domínio de ligação de BaNT, ou 30 qualquer combinação dos mesmos.

. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BaNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos e + : de, por exemplo, pelo menos 70°6, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo > menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com o domínio de liga- " ção de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com o domínio 5 de ligação de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BaNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 858-1268 de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 70%, 10 no máximo 75%, no máximo 8Ó°/o, no máximo 85°/o, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 858-1268 de SEQ ID N°: 23. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, " 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- l -bj 15 ições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de

T SEQ ID N°: 23;- ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou .- 100 deleções, adições, elou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros as- pectos desta modalidade, um domínio de ligação de BaNT compreende um . 20 polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 858-1268 de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos 25 aminoácidos 858-1268 de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de Iigação de BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N": 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 30 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 23. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de Iigação de BaNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, " 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu-

, ições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 858-1268 de SEQ ID N°: 23; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 5 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 858-1268 de SEQ ID N°: 23. Em uma outra modalidade, um domínio de Iigação de toxina cIostridiana compreende um domínio de ligação de BuNT.

Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BuNT compreende os domí- lO nios de ligação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BuNT compreende os aminoá- cidos 848-1251 de SEQ ID N°: 24. Em um outro aspecto desta modalidade,

á um domínio de ligação de-BuNT compreende uma variante de um domínio © de ligação de BuNT de ocorrência natural, tal como, por exemplo, um domí- '. 15 nio de ligação de uma isoforma de BuNT ou um domínio de ligação de um .j subtipo de.

BuNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de .-.- "" ligação de BuNT compreende uma variante de um domínio de ligação de BuNT de ocorrência natural de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BuNT ou de um subti- 20 po de domínio de ligação de BuNT.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BuNT compreende os aminoácidos 848-1251 de uma variante de um domínio de ligação de BuNT de ocorrência natural de SEQ ID N°: 24, tal como, por exemplo, uma isoforma de domínio de ligação de BuNT ou de um subtipo de domínio de ligação de BuNT.

Em ainda um 25 outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de BuNT compre- ende uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BuNT, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de Iiga- ção de BuNT, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BuNT, um fragmento ativo de domínio de ligação de BuNT, ou qualquer 30 combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, . um domínio de ligação de BuNT compreende o domínio de ligação de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BuNT de SEQ

148/316 -

- ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25, tal como, por exemplo, uma variante conseNa- - tiva de domínio de ligação de BuNT, uma variante não conservativa de do- mínio de ligação de BuNT, um fragmento ativo de domínio de ligação de BuNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em ainda um outro aspecto 5 desta modalidade, um domínio de ligação de BuNT compreende os aminoá- cidos 848-1251 de uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de BuNT de SEQ ID N°: 24, tal como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de BuNT, uma variante não conservativa de domínio de ligação de BuNT, um fragmento ativo de domínio de ligação 10 de BuNT, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de ·BuNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo-menos 70°6, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo 1 menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com o domínio de Iiga-

m .-P 15 ÇãO de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Ó°/o, ou no máximo 95% com o domínio de ligação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em a- inda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BuNT compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por 20 exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 848-1251 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 848-1251 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. 25 Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de Iigação de BuNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 30 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de liga-

ção de BuNT compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, no máximo - 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou

- substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 848-1251 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 5 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substituições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 848-1251 de SEQ

/ ID N": 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de BuNT compreende um polipeptídio tendo, por e- xemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 dele- lO ções, adições, e/ou substituições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, e/ou substitu- ições de aminoácidos adjacentes em relação ao domínio de ligação de SEQ m ID N°: 24 ou SEQ ID N": 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade,

, 15 um domínio de ligação de BuNT compreende um polipeptídio tendo, por e- - xemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou - -- 100 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 848-1251 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25; ou no má- ximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, ou 100 deleções, adições, 20 e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 848- 1251 deSEQ ID N°:24ou SEQ ID N°:25. Os aspectos da presente invenção fornecem, em parte, um do- mínio de ligação de toxina não clostridiana.

Conforme usado neste relatório, o termo "domínio de ligação de toxina não clostridiana" refere-se a qualquer 25 poIipeptídio que pode executar a etapa de Iigação do processo de intoxica- ção que dá início o mecanismo de internalização completo por meio do qual a toxina clostridiana modificada divulgada na presente invenção intoxica uma célula alvo.

Exemplos de domínios de ligação estão descritos, por e- xemplo, em Keith A.

Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Mo- 30 dify Peripheral Sensory Afferent Functions, Patente US 5.989.545; Clifford C.

Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, Patente US 6.461.617; Con- rad P.

Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus

Hypersecretion, Patente US 6.632.440; Lance E. Steward et al., Methods

F And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, Patente US - 6.843.998; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Pa- tente US 7.132.259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Me- 5 thods For Treating Pain, Publicação de Patente US 2002/0037833; Keith A. Foster et al., lnhibition of Secretion from Non-neural Cells, Publicação de Patente US 2003/0180289; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Publicação de Patente US . 2006/021 1619; Keith A. Foster et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, 10 Publicação de Patente US 2008/0187960; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Tar- geting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, Pedido de Patente US " N° 11/776.075; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, Pedido " de Patente US N° 11/792,210; todos eles estando aqui incorporados em sua

B t 15 integridade a titulo de referência. Um domínio de ligação de toxina não clostridiana. inclui, sem li- mitação, variantes de ocorrência natural de domínio de ligação de toxina não clostridiana, tais como, por exemplo, isoformas de domínio de ligação de toxina não clostridiana e subtipos de domínio de ligação de toxina não 20 clostridiana; e variantes de ocorrência não natural de domínio de ligação de toxina não clostridiana, tais como, por exemplo, variantes conservativas de domínio de ligação de toxina não clostridiana, variantes não conservativas de domínio de Iigação de toxina não clostridiana, quimeras de domínio de ligação de toxina não clostridiana, fragmentos ativos de domínio de ligação 25 de toxina não clostridiana fragments das mesmas, ou qualquer combinação das mesmas. Conforme usado neste relatório, o termo "variante de domínio de ligação de toxina não clostridiana", seja de ocorrência natural ou de ocor- rência não natural, refere-se a um domínio de ligação de toxina não clostri- 30 diana que tem pelo menos uma alteração de aminoácido em relação à regi- ão correspondente de uma sequência de referência e pode ser descrito em percentagem de identidade em relação à região correspondente daquela sequência de referência.

A menos que expressamente indicado, variantes - de domínio de ligação de toxina não cIostridiana úteis para a prática das

- modalidades descritas são variantes que executam a etapa de ligação do processo de intoxicação. 5 Os especialistas na técnica reconhecem que dentro de cada domínio de Iigação de toxina não clostridiana pode haver variantes de ocor- rência natural que diferem um pouco em termos de sua sequência aminoa- cÍdica, e também em termos dos ácidos nucleicos que codificam essas pro- teínas.

Conforme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência na- lO tural de domínio de ligação de toxina não clostridiana" refere-se a qualquer domínio de ligação de toxina não clostridiana produzido por um processo de ocorrência natural, incluindo, sem limitação, isoformas de domínio de liga- l ção de.toxina não clostridiana produzidas a partir de transcritos alternativa- . mente emendados e isoformas de domínio de ligação de toxina não clostri-

I 15 diana produzidas por mutação espontânea.

Uma variante de ocorrência na- tural de domínio de Iigação de toxina não clostridiana pode"funcionar subs- tancialmente da mesma maneira que o domínio de ligação de toxina não clostridiana de referência no qual a variante de ocorrência natural de domí- nio de ligação de toxina não clostridiana se baseia, e pode substituir o do- 20 mínio de ligação de toxina não clostridiana de referência em qualquer aspec- to da presente invenção- Um exemplo não limitativo de uma variante de o- corrência natural de domínio de ligação de toxina não clostridiana é uma isoforma de domínio de ligação de toxina não clostridiana.

Exemplos não limitativos de uma isoforma de domínio de ligação de toxina não clostridiana 25 incluem, por exemplo, isoformas de domínio de ligação de opioide, isofor- mas de domínio de ligação de taquiquinina, isoformas de domínio de ligação de melanocortina, isoformas de domínio de ligação de galanina, isoformas de domínio de ligação de granina, isoformas de domínio de ligação de pep- tídio relacionado ao neuropeptídio Y, isoformas de domínio de ligação de 30 neuro-hormônio, isoformas de domínio de ligação de citocina neurorregula- dora, isoformas de domínio de ligação do peptídio quinina, isoformas de domínio de ligação do fator de crescimento, e isoformas de domínio de liga-

ção do hormônio semelhante ao glucagon. - Conforme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência " não natural de domínio de ligação de toxina não clostridiana" refere-se a qualquer domínio de ligação de toxina não clostridiana produzido com o au- 5 xÍlio de manipulação humana, incluindo, sem limitação, domínios de Iigação de toxina não clostridiana produzidos por engenharia genética usando mu- tagênese aleatória ou desenho racional e domínios de ligação de toxina não clostridiana produzidos por sÍntese química. Exemplos não limitativos de variante de ocorrência não natural de domínios de ligação de toxina não 10 clostridiana incluem, por exemplo, variantes conservativas de domínio de ligação de toxina não clostridiana, variantes não conservativas de domínio :- de ligação de toxina não clostridiana, variantes quiméricas de domínio de ligação de toxina não clostridiana e fragmentos ativos de domínio de Iigação "-i de toxina não clostridiana.

' 15 Conforme usado neste relatório, o termo "variante conservativa de domínio de ligação de toxina não clostridiana" refere-se a um domínio de ligação de toxina não clostridiana que tem pelo menos um aminoácido subs- tituído por um outro aminoácido ou um aminoácido análogo que tem pelo menos uma propriedade similar àquela do aminoácido original de uma se- 20 quência de referência de domínio de ligação de toxina não clostridiána. E- xemplos de propriedades incluem, sem limitação, tamanho similar, topogra- fia, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade, lipofilicidade, capacidade de liga- ção covalente, capacidade de ligação de hidrogênio, uma propriedade físico- química, entre outras, ou qualquer combinação das mesmas. Uma variante 25 conservativa de domínio de ligação de toxina não clostridiana pode funcio- nar substancialmente da mesma maneira que o domínio de ligação de toxi- na não clostridiana de referência no qual a variante conservativa de domínio de ligação de toxina não clostridiana se baseia, e pode substituir o domínio de ligação de toxina não clostridiana de referência em qualquer aspecto da 30 presente invenção. Exemplos não limitativos de uma variante conservativa de domínio de Iigação de toxina não clostridiana incluem, por exemplo, vari- antes conservativas de domínio de ligação de opiode, variantes conservati-

vas de domínio de Iigação de traquiquinina, variantes conservativas de do- . mínio de ligação de melanocortina, variantes conseNativas de domínio de " ligação de galanina, variantes conservativas de domínio de ligação de grani- na, variantes conservativas de domínio de ligação de peptídio relacionado 5 ao neuropeptídio Y, variantes conseNativas de domínio de ligação de neuro- hormônio, variantes conservativas de domínio de ligação de citocina neuror- reguladora, variantes conservativas de domínio de ligação de quinina, vari- antes conservativas de domínio de ligação do fator de crescimento, e varian- tes conservativas de domínio de ligação do hormônio semelhante ao gluca- lO ' gon.

Conforme usado neste relatório, o termo "variante não conseNa- " tiva de domínio de ligação.de toxina não clostridiana" refere-se a um domí- nio de ligação de toxina não clostridiana no qual 1) pelo menos .um aminoá- - , cido é deletado do domínio de ligação de toxina não clostridiana de referên- 15 cia no qual a variante não conservativa de domínio de ligação de toxina não . clostridiana se baseia; 2) pelo menos um aminoácido é adicionado ao domí- nio de ligação de toxina não clostridiana de referência no qual o domínio de ligação não conservativo de toxina não clostridiana se baseia; ou 3) pelo menos um aminoácido é substituído por um outro aminoácido ou um amino- 20 ácido análogo que não compartilha qualquer propriedade similar àquela do aminoácido original de uma sequência de referência de domínio de ligação de toxina não cIostridiana. Uma variante não conservativa de domínio de ligação de toxina não clostridiana pode funcionar substancialmente da mesma maneira que o domínio de ligação de toxina não clostridiana de refe- 25 rência no qual a variante não conservativa de domínio de ligação de toxina não clostridiana se baseia, e pode substituir o domínio de ligação de toxina não cIostridiana de referência em qualquer aspecto da presente invenção. Exemplos não limitativos de uma variante não conservativa de domínio de ligação de toxina não clostridiana incluem, por exemplo, variantes não con- 30 servativas de domínio de ligação de opioide, variantes não conservativas de domínio de ligação de traquiquinina, variantes não conservativas de domínio de ligação de melanocortina, variantes não conservativas de domínio de Ii-

gação de galanina, variantes não conseNativas de domínio de ligação de - granina, variantes não conservativas de domínio de ligação do peptídio rela- cionado ao neuropeptídio Y, variantes não conservativas de domínio de liga- ção de neuro-hormônio, variantes não conservativas de domínio de ligação 5 da citocina neurorreguladora, variantes não conservativas de domínio de ligação do peptídio quinia, variantes não conservativas de domínio de liga- ção do fator de crescimento, e variantes não conservativas de domínio de ligação do hormônio semelhante ao glucagon. Conforme usado neste relatório, o termo "fragmento ativo de 10 domínio de Iigação de toxina não clostridiana" refere-se a qualquer um de uma variedade de fragmentos de toxina clostridiana compreendendo o do- mínio de ligação que pode ser útil nos aspectos da presente invenção com a condição de que esses fragmentos de domínio de Iigação- podem interagir

Ç preferencialmente com o receptor cognato, e portanto participar na execu-

W 15 ção do mecanismo celular completo por meio do qual a Clostridial toxin cliva proteoliticamente um substrato. Qualquer um de uma variedade de métodos de alinhamento de sequências pode ser usado para determinar a percentagem de identidade de variantes de ocorrência natural de domínio de ligação de toxina clostridi- 20 ana e de variantes de ocorrência não natural de domínio de ligação de toxi- na clostridiana, incluindo, sem limitação, métodos globais, métodos locais e métodos híbridos, tais como, por exemplo, métodos de abordagem de seg- mentos. Os protocolos para determinação da percentagem de identidade são procedimentos rotineiros de conhecimento do especiaiista na técnica e 25 ensinados neste relatório. Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana modifica- da divulgada na presente invenção compreende um domínio de ligação de toxina não clostridiana. Em um aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de toxina não clostridiana compreende uma variante de ocorrência 30 natural de domínio de ligação de toxina não clostridiana, tais como, por e- xemplo, uma isoforma de domínio de ligação de toxina não clostridiana. Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de toxina não clostridiana compreende uma variante de ocorrência não natural de domínio de ligação de toxina não clostridiana, tais como, por exemplo, uma variante conservativa de domínio de ligação de toxina não clostridiana, uma variante não conservativa de domínio de ligação de toxina não clostridiana, um frag- 5 mento ativo de domínio de ligação de toxina não clostridiana, "ou qualquer combinação das mesmas. Em uma outra modalidade, um aminoácido hidrófobo em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de ligação de toxina não clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido hidrófobo. 10 Exemplos de aminoácidos hidrófobos incluem, por exemplo, C, F, I, L, M, V e W. Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido alifático em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de ligação de to- xina não clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido alifático. - -' Exemplos de aminoácidos alifáticos incluem, por exemplo, A, I, L, P, e V.

, 15 Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido aromático em uma posição p'articular na cadeia',po1ipeptídica do domínio de ligação de toxina não clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido aromá- tico. Exemplos de aminoácidos aromáticos incluem, por exemplo, F, H, W e Y. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um"aminoácido de empi- 20 lhamento em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de ligação de toxina não clostridiana pode ser substituido por um outro aminoá- cido de empilhamento. Exemplos de aminoácidos de empilhamento incluem, por exemplo, F, H, W e Y. Em um outro aspecto desta modalidade, um ami- noácido polar em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio 25 de ligação de toxina não clostridiana pode ser substituído por um outro ami- noácido polar. Exemplos de aminoácidos poIares incluem, por exemplo, D, E, K, N, Q, e R. Em um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido menos polar ou indiferente em uma posição particular na cadeia polipeptídi- ca do domínio de ligação de toxina não clostridiana pode ser substituído por 30 um outro aminoácido menos polar ou indiferente. Exemplos de aminoácidos menos polares ou indifer.entes incluem, por exemplo, A, H, G, P, S, T, e Y. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga po-

sitiva em uma posição particular na cadeia polipeptídica do domínio de liga- ção de toxina não clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de carga positiva.

Exemplos de aminoácidos de carga positiva incluem, por exemplo, K, R, e H.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um ami- 5 noácido de carga negativa em uma posição particular na cadeia polipeptídi- ca do domínio de iigação de toxina não clostridiana pode ser substituído por um outro aminoácido de carga negativa.

Exemplos de aminoácidos de carga negativa incluem, por exemplo, D e E.

Em um outro aspecto desta modali- dade, um aminoácido pequeno em uma posição particular na cadeia poli- lO peptídica do domínio de ligação de toxina não clostridiana pode ser substitu- Ído por um outro aminoácido pequeno.

Exemplos de aminoácidos pequenos incluem, por exemplo, A, D, G, N, P, S, e T.

Em ainda um outro aspecto des- ta modalidade, um aminoácido com ramificação em C-beta em uma posição - - particular na cadeia polipeptídica do domínio de ligação de toxina não CIOS- 15 tridiana pode ser substituído por um outro aminoácido com ramificação em - C-beta.

Exemplos de aminoácidos'"com ramificação em C-beta"incluem, por " exemplo, I, T e V.

Em uma outra modalidade, um domínio de ligação de toxina não clostridiana compreende um domínio de ligação de opioide, tais como, por 20 exemplo, uma encefalina, uma endomorfina, uma endorfina, uma dinorfina, uma nociceptina ou uma hemorfina.

Em ainda um outro aspecto desta mo- dalidade, um domínio de ligação de toxina não clostridiana compreende a um domínio de ligação de taquiquinina, tais como, por exemplo, uma subs- tância P, um neuropeptídio K (NPK), um neuropeptidio gama (NP gama), 25 uma neuroquinina A (NKA; Substance K, neuroquinina alfa, neuromedina L), uma neuroquinina B (NKB), uma hemoquinina ou uma endoquinina.

Em ain- da um outro aspecto desta modalidade, uma toxina não clostridiana com- preende um domínio de ligação de melanocortina, tais como, por exemplo, um hormônio estimulante de melanócitos, adrenocorticotropina, ou uma lipo- 30 tropina.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de liga- ção de toxina não clostridiana compreende um domínio de ligação galanina, tais como, por exemplo, uma galanina ou um peptídio associado a mensa-

gens da galanina.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de toxina não clostridiana compreende um domínio de ligação de

- granina, tal como, por exemplo, uma cromogranina A, uma cromogranina B, ou uma cromogranina C.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domí- 5 nio de ligação de toxina não clostridiana compreende um domínio de ligação de peptídio relacionado ao neuropeptídio Y, tal como, por exemplo, um neu- ropeptídio Y, um peptídio YY, um peptídio pancreático ou um icosapeptídio pancreático.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de toxina não clostridiana compreende um domínio de ligação de 10 neuro-hormônio, tal como, por exemplo, um hormônio liberador de cortico- tropina, um hormônio da paratireoide, um hormônio liberador de tirotropina, ou uma somatostatina.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de toxina não clostridiana compreende um domínio de ligação de citocina neurorreguladora, tal como, por exemplo, um fator neuro- 15 trófico ciliar, uma glicoforina-A, um fator inibitório de leucemia, um fator de - diferenciação colinérgico, uma interleucina, uma onostatina M, uma cardio- trofina-l, uma citocina semelhante à cardiotrofina, ou uma neuroleucina.

Em um outro aspecto desta modalidade, um dominio de ligação de toxina não clostridiana compreende um domínio de ligação do peptídio quinina, tal co- 20 mo, por exemplo, uma bradiquinina , uma calidina, a desArg9 bradiquinina , ou uma desArgl O bradiquinina.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de toxina não clostridiana compreende um domínio de ligação de fator de crescimento, tal como, por exemplo, um domínio de liga- ção do fator de crescimento de fibroblastos, um domínio de ligação do fator 25 de crescimento nervoso, um domínio de ligação do fator de crescimento de insulina, um domínio de ligação do fator de crescimento epidérmico, um do- mínio de ligação do fator de crescimento endotelial vascular, um domínio de ligação do fator neurotrófico derivado do cérebro, um domínio de ligação do fator neurotrófico derivado do crescimento, um domínio de ligação de neuro- 30 trofina, tal como, por exemplo, uma neurotrofina-3, uma neurotrofina-4/5, um domínio de ligação do peptídio ativador do cérebro, um domínio de ligação da neurturina, um domínio de ligação da persefrina, um domínio de ligação

P da artemina, um domínio de ligação do fator de transformação do cresci- - mento, tal como, por exemplo, um TGF[31, um TGF|32, um TGF|33, ou um

- TGF[34, um domínio de ligação da proteína morfogênica dos ossos, tal co- mo, por exemplo, um BMP2, um BMP3, um BMP4, um BMP5, um BMP6, 5 um BMP7, um BMP8 ou um BMPIO, um domínio de ligação do fator de dife- renciação do crescimento, tal como, por exemplo, um GDFI, um GDF2, um GDF3, um GDF5, um GDF6, um GDF7, um GDF8, um GDFIO, um GDFI 1 ou um GDF15, ou um domínio de ligação da activina, tal como, por exemplo, uma activina A, uma activina B, uma activina C, uma activina E ou uma ini- lO bina A.

Em um outro aspecto desta modalidade, um domínio de ligação de toxina não clostridiana compreende um domínio de iigação do hormônio semelhante ao glucagon, tal como, por exemplo, uma secretina, um peptídio semelhante ao glucagon, como um GLP-l e um GLP-2, um domínio de liga- ção do peptídio ativador da adenilato ciclase pituitária, um domínio de liga-

. 15 ção do hormônio liberador do hormônio do crescimento, um domínio de liga- ção do peptídio intestinal vasoativo como um VlPl ou um VIP2, um "domínio de ligação do polipeptídio inibitório gástrico, um domínio de ligação do pep- tídio peptidesvisceral relacionado à calcitonina como uma gastrina, um pep- tídio liberador de gastrina ou uma colecistoquinina, ou um domínio de liga- 20 ção do peptídio PAR como um peptídio PARI, um peptídio PAR2, um peptí- dio PAR3 ou um peptídio PAR4. Em uma outra modalidade, um peptídio opioide compreende um peptídio encefalina.

Nos aspectos desta modalidade, um peptídio encefalina compreende uma Leu-encefalina, uma Met-encefalina, uma Met-encefalina 25 MRGL ou uma Met-encefalina MRF.

Em outros aspectos desta modalidade, um peptídio encefalina compreende a SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 27, SEQ lDN°:28ouSEQIDN°:29. Em outros aspectos desta modalidade, uma encefalina compre- ende um poiipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exem- 30 plo, pelo menos 7Ó°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 29: ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com a SEQ ID N": 26, SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 29. Em ainda · outros aspectos desta modalidade, uma encefalina compreende um polipep- tídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, ou 3 deleções, adições, e/ou adi- 5 ções de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 29; ou no máximo 1, 2, ou 3 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 29. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma encefalina compreende um poIipeptídio 10 tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, ou 3 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 29; ou no máximo 1, 2, ou 3 deleções, adi- ções, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 26,

V SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 28 ou SEQ ID N°: 29. 15 Em uma outra modalidade, um peptídio opioide compreende um - peptídio adrenomedular-22 (BAM22) bovino. Nos aspectos desta-modalida- de, um peptídio BAM22 compreende um peptídio BAM22 (1-12), um peptídio BAM22 (6-22), um peptídio BAM22 (8-22) ou um peptídio BAM22 (1-22). Em outros aspectos desta modalidade, um peptídio BAM22 compreende os a- 20 minoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoá- cidos 1-22 de SEQ ID N°: 30; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 31; os aminoáci- dos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1- 22 de SEQ ID N°: 32; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os amino- 25 ácidos 8-22 ou os aminoácidos 1 -22 de SEQ ID N°: 33; os aminoácidos 1- 12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 34 ou os aminoácidos 1- 12, os aminoácidos 6-22, os aminoáci- dos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 35. Em outros aspectos desta modalidade, um peptídio BAM22 30 compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID - N°: 30: os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou

· os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 31; os aminoácidos 1- 12, os aminoáci- dos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 32: 5 os aminoácidos 1 -12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os a- minoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 33: os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6- 22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 34 ou os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os amino- ácidos 1-22 de SEQ ID N°: 35; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no má- lO ximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os amino- ácidos 1-22 de SEQ ID N°: 30; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 31; os aminoá- cidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1- 15 22 de SEQ ID N°: 32; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os amino- ácidos 8-22 -ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 33; os aminoácidos 1- .- 12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 34 ou os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoáci- dos 8-22 ou os aminoácidos 1 -22 de SEQ ID N°: 35. 20 Em ainda outros aspectos desta modalidade, um peptídio BAM22 compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1-12, aos aminoácidos 6-22, aos aminoácidos 8-22 ou aos aminoácidos 1 -22 de SEQ ID N°: 30; os aminoácidos 1-12, aos ami- 25 noácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 31; os aminoácidos 1- 12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 32; os aminoácidos 1 -12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 33; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6- 22, os aminoácidos 8-22 ou os amino- 30 ácidos 1-22 de SEQ ID N°: 34 ou os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6- 22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1 -22 de SEQ ID N°: 35; ou no máximo 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação aos aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os ami- . noácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 30; os aminoácidos 1 - -12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 31; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 5 8-22 ou os aminoácidos 1 -22 de SEQ ID N°: 32; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 33; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 34 ou os aminoácidos 1-12, os aminoá- cidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 35. 10 Em ainda outros aspectos desta modalidade, um peptídio BAM22 compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em rela- ção aos aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os

W aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 30; os aminoácidos 1- 12, os aminoácidos 15 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 31; os aminoácidos 1 -12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os amino- ácidos 1-22 de SEQ ID N°: 32; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6- 22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 33; os aminoá- cidos 1 -12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 20 1-22 de SEQ ID N°: 34 ou os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8- 22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N": 35: ou no máximo 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação aos aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8- 22 ou os aminoácidos 1 -22 de SEQ ID N°: 30; os aminoácidos 1-12, os a- 25 minoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 71; os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 32; os aminoácidos 1-12, os aminoáci- dos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 33; os aminoácidos 1 -12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os a- 30 minoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 34 ou os aminoácidos 1-12, os aminoácidos 6-22, os aminoácidos 8-22 ou os aminoácidos 1-22 de SEQ ID N°: 35. Em uma outra modalidade, um peptídio opioide compreende um

& 162/316 , W ' peptídio endomorfina. Nos aspectos desta modalidade, um peptídio endo- - morfina compreende uma endomorfina-l ou uma endomorfina-2. Em outros - aspectos desta modalidade, um peptídio endomorfina compreende as SEQ lDN°:36ouSEQIDN°:37. 5 Em outros aspectos desta modalidade, uma endomorfina com- preende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por e- xemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 36 ou SEQ ID N°: 37; ou no máximo 70%, no máximo 75°/o, no máximo 80%, no máximo 10 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 36 ou SEQ ID N°: 37. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma endomorfina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, ou 3 de- Ieções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à +.

SEQ ID N°: 36 ou SEQ ID N°: 37;" ou no máximo 1, 2, ou 3 deleções, adi- 15 ções, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N": - 36-'ou SEQ ID N°: 37. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma- en- domorfina compreende um poIipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, ou 3 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em rela- ção à SEQ ID N°: 36 ou SEQ ID N°: 37; ou no máximo 1, 2, ou 3 deleções, 20 adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 36ouSEQIDN°:37. Em uma outra modalidade, um peptídio opioide compreende um peptídio endorfina. Nos aspectos desta modalidade, um peptídio endorfina compreende uma endorfina-ot, uma neoendorfina-ot, uma endorfina-j3, a ne- 25 oendorfina-j3 ou uma endorfina-y. Em outros aspectos desta modalidade, um peptídio endorfina compreende as SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 42, ou SEQ ID N°: 43. Em outros aspectos desta modalidade, uma endorfina compre- ende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exem- 30 plo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 42, ou SEQ ID N°: 43; ou no má-

ximo 70%, no máximo 75%, no máximo 8Ô°/o, no máximo 85%, no máximo - 9Õ°/o, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 42, ou SEQ ID N°: 43. Em ainda outros as- pectos desta modalidade, uma endorfina compreende um polipeptídio tendo, 5 por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 42, ou SEQ ID N°: 43; ou no má- ximo 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 40, 10 SEQ ID N°: 41, SEQ ID N": 42, ou SEQ ID N°: 43. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma endorfina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 39, SEQ & ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 42, ou SEQ ID N°: 43; ou no máximo

W 15 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes -: -em relação à SEQ ID N°: 38, SEQ ID N°: 39, SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQIDN°:42,ouSEQIDN°:43. Em uma outra modalidade, um peptídio opioide compreende um peptídio dinorfina. Nos aspectos desta modalidade, um peptídio dinorfina 20 compreende uma dinorfina A, uma dinorfina B (leumorfina) ou uma rimorfi- na. Em outros aspectos desta modalidade, um peptídio dinorfina compreen- de as SEQ ID N°: 44, SEQ ID N°: 45, SEQ ID N°: 46, SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: 48, SEQ ID N°: 49, SEQ ID N°: 50, SEQ ID N°: 51, SEQ ID N°: 52, SEQ ID N": 53, SEQ ID N°: 54, SEQ ID N°: 55, SEQ ID N°: 56, SEQ ID N°: 25 57, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 59, SEQ ID N°: 60, SEQ ID N°: 61, SEQ ID N°: 62, SEQ ID N°: 63, SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 65, SEQ ID N°: 66, SEQ ID N°: 67, SEQ ID N°: 68, SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 73, ou SEQ ID N°: 74. Em outros aspectos desta modalidade, uma dinorfina compre- 30 ende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exem- plo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9O°/j, ou pelo menos 95°/o com a SEQ ID N°: 44, SEQ ID N°: 45,

SEQ ID N°: 46, SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: 53, ou SEQ ID N°: 69; ou no má- . ximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo

- 90%, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 44, SEQ ID N°: 45, SEQ ID N°: 46, SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: 53, ou SEQ ID N°: 69. Em ainda outros as- 5 pectos desta modalidade, uma dinorfina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 44, SEQ ID N°: 45, SEQ ID N°: 46, SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: 53, ou SEQ ID N°: 69; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou 10 adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 44, SEQ ID N°: 45, SEQ ID N°: 46, SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: 53, ou SEQ ID N": 69. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma dinorfina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou lO- deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à 15 SEQ ID N°: 44, SEQ ID N°: 45, SEQ ID N°: 46, SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: . 53, ou SEQ ID N°: 69; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9., -ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 44, SEQ ID N°: 45, SEQ ID N°: 46, SEQ ID N°: 47, SEQ ID N°: 53, ou SEQ ID N°: 69. 20 Em uma oútra modalidade, um peptídio opioide compreende um peptídio nociceptina.

Nos aspectos desta modalidade, um peptídio nocicep- tina compreende uma nociceptina RK, uma nociceptina, um neuropeptídio 1, um neuropeptídio 2, ou um neuropeptídio 3. Em outros aspectos desta mo- dalidade, um peptídio nociceptina compreende as SEQ ID N": 75, SEQ ID 25 N°: 76, SEQ ID N°: 77, SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 83, ou SEQ ID N°: 84. Em outros aspectos desta modalidade, uma nociceptina com- preende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por e- xemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8Õ°/o, pelo menos 30 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 75, SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 77, SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 83, ou SEQ ID N°: 84; ou no máximo

70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%,

J ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 75, SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 77, - SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 83, ou SEQ ID N°: 84. Em ainda outros aspectos desta mo- 5 dalidade, uma nociceptina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 75, SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 77, SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N": 83, ou SEQ ID N°: 84; ou no máximo 1, 2, 3, 10 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 75, SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 77, SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N": 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 83, ou SEQ ID N°: 84. Em ainda outros aspectos desta mo- dalidade, uma nociceptina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, 15 pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de . aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 75, .SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 77, SEQ ID N": 78, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 83, ou SEQ ID N°: 84; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacen- 20 tes em relação à SEQ ID N°: 75, SEQ ID N°: 76, SEQ ID N°: 77, SEQ ID N°: 78, SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 83, ou SEQ ID N°: 84. [G221J Em uma outra modalidade, um peptídio opioide compreende um peptídio hemorfina. Nos aspectos desta modalida- de, um peptídio hemorfina compreende uma LWH7, uma VVH7, uma VH7, 25 uma H7, uma LWH6, uma LWH5, uma WH5, uma LWH4, e uma LWH3. Em outros aspectos desta modalidade, um peptídio hemorfina compreende as SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 89, SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 92, ou SEQ ID N°: 93. Em outros aspectos desta modalidade, uma hemorfina compre- 30 ende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exem- plo, pelo menos 70%, pelo menos 75°6,. pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 86,

SEQ ID N°: 87, SEQ ID N": 88, SEQ ID N°: 89, SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 92, ou SEQ ID N°: 93; ou no máximo 70%, no máximo 75%, ·) no máximo 80°/o, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 5 89, SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 92, ou SEQ ID N°: 93. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma nociceptina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, ou 3 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 89, SEQ ID N°: 10 90, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 92, ou SEQ ID N°: 93; ou no máximo 1, 2, ou 3 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em rela- ção à SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 88, SEQ . .ID N°: 89, SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 92, ou SEQ ID N°: 93. . Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma nociceptina compreende 15 um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, ou 3 deleções, adi- . ções, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 89, SEQ ID N°: / 90, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 92, ou SEQ ID N°: 93; ou no máximo 1, 2, ou 3 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à 20 SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 89, SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 91, SEQ ID N°: 92, ou SEQ ID N°: 93. Em ainda uma outra modalidade, um domínio de ligação de to- xina não clostridiana compreende um domínio de ligação do peptídio galani- na. Nos aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio ga- 25 Ianina compreende uma galanina ou um peptídio associado a mensagens da galanina(GMAP). Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio galanina compreende as SEQ ID N°: 94 ou SEQ ID N°:

95. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação 30 de galanina compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoá- cidos de, por exemplo, pelo menos 7Õ°/o, pelo menos 75%, pelo menos 8Ó°/o, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°:

94 ou SEQ ID N°: 95; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, - no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 94 · ou SEQ ID N°: 95. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de galanina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pe- 5 lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 94 ou SEQ ID N°: 95; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 94 ou SEQ ID N°:

95. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação de 10 galanina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 94 ou SEQ ID N°: 95; ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos . adjacentes em relação à SEQ ID N°: 94 ou SEQ ID N°: 95. 15 Em ainda uma outra modalidade, um domínio de ligação de to- - xina não clostridiana compreende um domínio "de ligação do peptídio taqui- quinina. Nos aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio taquiquinina compreende uma substância P, um neuropeptídio K (NPK), um neuropeptídio gama (NP gama), uma neuroquinina A (NKA; substância K, 20 neuroquinina alfa, neuromedina L), uma neuroquinina B (NKB), uma hemo- quinina ou uma endoquinina. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio taquiquinina compreende as SEQ ID N°: 96, SEQ ID N°: 97, SEQ ID N°: 98, SEQ ID N°: 99, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101, SEQ ID N°: 102, SEQ ID N°: 103, SEQ ID N°: 104, SEQ ID N°: 105, 25 SEQID N°: 106,ou SEQID N°: 107. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio taquiquinina compreende um polipeptídio tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7Ô°/o, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95°6 com a 30 SEQ ID N°: 96, SEQ ID N°: 97, SEQ ID N°: 98, SEQ ID N°: 99, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101, SEQ ID N°: 102, SEQ ID N°: 103, SEQ ID N°: 104, SEQ ID N°: 105, SEQ ID N°: 106, ou SEQ ID N°: 107; ou no máximo 70%,

no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 9Õ°/o, ou no máximo 95% com a SEQ ID N°: 96, SEQ ID N": 97, SEQ ID N°: 98, SEQ ID - N°: 99, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101, SEQ ID N°: 102, SEQ ID N°: 103, SEQ ID N°: 104, SEQ ID N°: 105, SEQ ID N°: 106, ou SEQ ID N°: 107. Em 5 ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio taquiquinina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacen- tes em relação à SEQ ID N°: 96, SEQ ID N°: 97, SEQ ID N°: 98, SEQ ID N°: 99, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101, SEQ ID N°: 102, SEQ ID N°: 103, SEQ 10 ID N°: 104, SEQ ID N°: 105, SEQ ID N°: 106, ou SEQ ID N°: 107; ou no má- ximo 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à SEQ ID N°: 96, SEQ ID N°: 97, SEQ ID N°: 98, SEQ ID N°: 99, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101, SEQ ID N°: 102, SEQ ID

W N°: 103, SEQ ID N°: 104, SEQ ID N°: 105, SEQ ID N°: 106, ou SEQ ID N°:

W 15 107. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio taquiquinina compreende um polipeptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos ad- jacentes em relação à SEQ ID N°: 96, SEQ ID N°: 97, SEQ ID N°: 98, SEQ ID N°: 99, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101, SEQ ID N°: 102, SEQ ID N°: 20 103, SEQ ID N°: 104, SEQ ID N°: 105, SEQ ID N°: 106, ou SEQ ID N°: 107; ou no máximo 1, 2, 3, 4, ou 5 deleções, adições, e/ou adições de aminoáci- dos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 96, SEQ ID N°: 97, SEQ ID N°: 98, SEQ ID N°: 99, SEQ ID N°: 100, SEQ ID N°: 101, SEQ ID N°: 102, SEQ ID N°: 103, SEQ ID N°: 104, SEQ ID N°: 105, SEQ ID N°: 106, ou SEQ ID N°: 25 107. Em ainda uma outra modalidade, um domínio de ligação de to- xina não clostridiana compreende um domínio de ligação do peptídio rela- cionado ao neuropeptídio Y. Nos aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio relacionado ao neuropeptídio Y compreende um neu- 30 ropeptídio Y (NPY), a Peptide YY (PYY), um peptídio pancreático (PP) ou um icosapeptídio pancreático (PIP). Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio relacionado ao neuropeptídio Y compre-

ende as SEQ ID N°: 108, SEQ ID N°: 109, SEQ ID N°: 110, SEQ ID N°: 111, - ouSEQIDN°:112. Em outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio relacionado ao neuropeptídio Y compreende um polipeptídio 5 tendo uma identidade de aminoácidos de, por exemplo, pelo menos 7O°/,, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 9Õ°/o, ou pelo menos 95% com a SEQ ID N°: 108, SEQ ID N°: 109, SEQ ID N°: 110, SEQ ID N°: 111, ou SEQ ID N°: 112; ou no máximo 70%, no máximo 75%, no máximo 80%, no máximo 85%, no máximo 90%, ou no máximo 95% com 10 a SEQ ID N°: 108, SEQ ID N°: 109, SEQ ID N°: 110, SEQ ID N°: 111, ou SEQ ID N°: 112. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio relacionado ao neuropeptídio Y compreende um poIi- peptídio tendo, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 dele- ,a ções, adições, e/ou adições de aminoácidos não adjacentes em relação à

. 15 SEQID N°: 108, SEQ ID N°: 109, SEQ ID N°: 110, SEQ ID N°: 111, ou SEQ ID N°: 112; ou no máximo 1, 2, 3,-4,-5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos náo adjacentes em relação à SEQ ID N°: 108, SEQ ID N°: 109, SEQ ID N°: 110, SEQ ID N°: 111, ou SEQ ID N°: 112. Em ainda outros aspectos desta modalidade, um domínio de ligação do peptídio 20 relacionado ao neuropeptídio Y compreende um polipeptídio tendo, por e- xemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de aminoácidos adjacentes em relação à SEQ ID N°: 108, SEQ ID N°: 109, SEQ ID N°: 110, SEQ ID N°: 111, ou SEQ ID N°: 112; ou no máxi- mo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 deleções, adições, e/ou adições de amino- 25 ácidos adjacentes em relação à SEQ ID N": 108, SEQ ID N°: 109, SEQ ID N°:11O,SEQIDN°:111,ouSEQIDN°:112. Vislumbrou-se que uma quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção pode compreender um domínio de ligação não clostri- diano em toda e qualquer localização com a condição de que a quimera de 30 toxina clostridiana possa efetuar o processo de intoxicação.

Exemplos não limitátivos incluem locazar um domínio de ligação não clostridiano no termi- nal amino de uma toxina clostridiana modificada; locazar um domínio de li-

gação não clostridiano entre um domínio enzimático de toxina clostridiana e um domínio de translocação de uma toxina clostridiana modificada; e Ioca-

- zar um domínio de ligação não clostridiano no terminal carboxil de uma toxi- na clostridiana modificada.

Outros exemplos não Iimitativos incluem, locazar 5 um domínio de ligação não clostridiano entre um domínio enzimático de to- xina clostridiana e um domínio de translocação de toxina clostridiana de uma toxina clostridiana modificada.

O domínio enzimático de toxinas cIostri- dianas de ocorrência natural contém uma metionina inicial nativa.

Portanto, em organizações de domínio nas quais o domínio enzimático não está na 10 localização amino-terminal uma sequência aminoacídica compreendendo a metionina inicial deve ser colocada na frente do domínio amino-terminal.

Da mesma forma, onde um domínio de ligação não clostridiano está na posição amino-terminal, uma sequência aminoacídica compreendendo uma metioni- 6 .. na inicial e um sÍtio de clivagem da protease pode ser operacionalmente li-

m 15 gada em situações nas quais um domínio de ligação não clostridiano requer um terminal amino livre, vide,..'por exemplo, Sh'engwen Li et al., Degradable Clostridial Toxins, Pedido de Patente US 11/572.512 (23 de janeiro de 2007), que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência.

Além disso, sabe-se na técnica que quando se adiciona um polipeptídio que 20 está operacionalmente ligado ao terminal amino de um outro polipeptídio compreendendo a metionina inicial que o resíduo metionina original pode ser deletado.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana modifica- da pode compreender uma ordem linear de polipeptídio simples amino para 25 carboxil compreendendo um domínio de ligação não clostridiano, um domí- nio de translocação, um sÍtio de clivagem da protease exógena e um domí- nio enzimático (FlG. 3A). Em um aspecto desta modalidade, uma toxina clostridiana modificada pode compreender uma ordem linear de polipeptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio de ligação não 30 clostridiano, um domínio de translocação de toxina clostridiana, um sítio de clivagem da protease exógena e um domínio enzimático de toxina clostridia- na.

Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana modificada

P pode compreender uma ordem linear de polipeptídio simples amino para . carboxil compreendendo um domínio de ligação não clostridiano, um domí- nio enzimático, um sÍtio de clivagem da protease exógena, e um domínio de 5 translocação (FlG. 3B). Em um aspecto desta modalidade, uma toxina clos- tridiana modificada pode compreender uma ordem linear de polipeptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio de ligação não clostridiano, um domínio enzimático de toxina clostridiana, um sÍtio de cliva- gem da protease exógena, um domínio de translocação de toxina clostridia- lO na. Em ainda uma outra modalidade, uma toxina clostridiana modifi- cada pode compreender uma ordem linear de polipeptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio enzimático, um sÍtio de clivagem 0 da protease exógena, um domínio de ligação não clostridiano, e um domínio , 15 de translocação (FIG. 4A). Em um aspecto desta modalidade, uma toxina clostridiana modificada :pode compreender uma ordem linear de polipeptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio enzimático de to- xina clostridiana, um sÍtio de clivagem da protease exógena, um domínio de ligação não clostridiano, e um domínio de translocação de toxina clostridia- 20 na. Em ainda uma outra modalidade, uma toxina clostridiana modifi- cada pode compreender uma ordem linear de polipeptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio de translocação, um sÍtio de cli- vagem da protease exógena, um domínio de ligação não clostridiano, e um 25 domínio enzimático (FlG. 4B). Em um aspecto desta modalidade, uma toxi- na clostridiana modificada pode compreender uma ordem linear de polipep- tídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio de transloca- ção de toxina clostridiana, um domínio de ligação não clostridiano, um sÍtio de clivagem da protease exógena e um domínio enzimático de toxina clos- 30 tridiana. - Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana modificada pode compreender uma ordem linear de polipeptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio enzimático, um domínio de ligação não clostridiano, um sÍtio de clivagem da protease exógena, e um domínio de

. translocação (FlG. 4C). Em um aspecto desta modalidade, uma toxina clos- tridiana modificada pode compreender uma ordem linear de polipeptídio 5 simples amino para carboxil compreendendo um domínio enzimático de to- xina clostridiana, um domínio de ligação não clostridiano, um sÍtio de cliva- gem da protease exógena, um domínio de translocação de toxina clostridia- na.

Em ainda uma outra modalidade, uma toxina clostridiana modifi- lO cada pode compreender uma ordem linear de polipeptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio de translocação, um domínio de ligação não clostridiano, um sÍtio de clivagem da protease exógena e um domínio enzimático (FlG. 4D). Em -um aspecto desta modalidade, uma toxi- . " na clostridiana modificada pode compreender uma ordem linear de polipep- 15 tídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio de transloca- . ção de toxina clostridiana, um domínio de ligação não clostridiano, um sÍtio de clivagem da protease exógena e um domínio enzimático de toxina clos- tridiana.

Em ainda uma outra modalidade, uma toxina clostridiana modifi- 20 cada pode compreender uma .ordem linear de polipeptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio enzimático, um sÍtio de clivagem da protease exógena, um domínio de translocação, e um domínio de ligação não clostridiano (FlG. 5A). Em um aspecto desta modalidade, uma toxina clostridiana modificada pode compreender uma ordem linear de polipeptídio 25 simples amino para carboxil compreendendo um domínio enzimático de to- xina clostridiana, um sÍtio de clivagem da protease exógena, um domínio de translocação de toxina clostridiana, e um domínio de ligação não clostridia- no.

Em ainda uma outra modalidade, uma toxina clostridiana modifi- 30 cada pode compreender uma ordem Iinear de polipeptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio de translocação, um sÍtio de cIi- vagem da protease exógena, um domínio enzimático e um domínio de liga-

ção não clostridiano, (FlG. 5B). Em um aspecto desta modalidade, uma to- xina clostridiana modificada pode compreender uma ordem linear de poli- peptídio simples amino para carboxil compreendendo um domínio de trans- locação de toxina clostridiana, um domínio de ligação não clostridiano, um 5 sÍtio de clivagem da protease exógena e um domínio enzimático de toxina clostridiana. Os aspectos da presente invenção fornecem, em parte, um sÍtio de clivagem de inativação. Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de .clivagem de inativação" refere-se a cÍssil junto com elementos de reconhe- lO cimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteóli- se seletiva na ligação císsil por uma protease presente em fluidos interstici- ais ou em sistemas circulatórios, tais como, por exemplo, o sistema cardio- vascular ou o sistema linfático. Tal sÍtio de clivagem de inativação é opera- p" cionalmente ligado como uma proteína de fusão a uma toxina clostridiana ou

W 15 a uma quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção. Por definição, unsítio de clivagem de inativação é suscetível à clivagem seletiva ." "" por pelo menos uma protease presente em fluidos intersticiais ou em siste- mas circulatórios. Exemplos não limitativos de sÍtios de clivagem de inativa- ção incluem sÍtios de clivagem da trombina, sÍtios de clivagem da plasmina, 20 sÍtios de clivagem do fator de coagulação Vlla, sÍtios de clivagem do fator de coagulação IXa, sÍtios de clivagem do fator de coagulação Xa, sÍtios de cli- vagem do fator de coagulação Xla, sítios de clivagem do fator de coagula- ção XIla, sÍtios de clivagem da calicreína plasmática, sÍtios de clivagem do receptor-l acoplado à proteína G ativada pela protease (PARI), sÍtios de 25 clivagem de PAR2, sÍtios de clivagem de PAR3, sÍtios de clivagem de PAR4, sÍtios de cIivagem da metaloproteinase matricial-2 (MMP-2), sÍtios de cliva- gem da metaloproteinase matricial-9 (MMP-9), sÍtios de clivagem da furina, sÍtios de clivagem do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA), sÍtios de clivagem do ativador de plasminogênio tipo tecido (tPA), sÍtios de cliva- 30 gem da triptase-e, sÍtios de clivagem da protease-7 de mastócito de camun- dongo (mMCP-7), sÍtios de clivagem da enzima-l conversora de end.otelina (ECE-I), sÍtios de clivagem do grupo sanguíneo de Kell, sÍtios de clivagem de DPPlV, sÍtios de clivagem da metalopeptidase ADAM com motivo-13 tipo 1 da trombospondina (ADAMTS13), e sitios de clivagem da catepsina L (Ta- bela 4). % jTABELA 4 SÍÜqs de clivagem de imtiwção | i i SÍtio de divagem da protease Sequências de rderência SEQJDN" LVPR*GS

Ê

E , LVPK"GS FIPR"TF ::: ) 116 VLPR*SF 117 tranbina I IVPR"SF ii8 IVPR*GY 119 VVPR*GV 1'20 VLPR"LI 121 VMPR*SL 122 MFPR*SL 123 % KLTR*AETV DFTR'VVGG LSPÀ'TFHP :à: | 127 LIQR*NLSP 128 fatm decoagulação Vlia (FV1lA) | MATR*KMHD )j) LG1R"SFRN PQGR¶VGG NLTR"NGG QVVR"IVGG PQGR"IVGG 135 _ lXa (FlXa) fator cie coagulaçao I PQLR*MKNN NÚTR*IVGG 136 QVVR"IVGG ;;;_J I' IDGR* IEG'R" 1DGR*SVGG

T 142 IDGFUTVGG 143 IDGR*MGG 144 1EGR"SVGG 145 IEGR"TVGG 146 fator de coagulaçao - \T"a (EXa) {: PQGR*1VGG 1EGR*IVGG 147 148 IEGR"TSED 149 IEGRIVEG 150 IDGR"1VEG 151 FNPR"TFGS 152 FDER*TFGL 153 IDERWGG 154 FNEK*TFGL 155 i I AFWK¶DAS 157 4 KLTR"AETV 1'58 ; l KLTR*AET1 159 I I DFTR*VVGG 160 * Íator de coagulação Xla (FXla) I EFSR*VVGG 161 KLTR"AETV 162 i | DFTR'VVGG 163 . , 1KPR"IVGG 164 ! I DLHR"HIF\N j I

KQLRUNNG PQGR¶VGG ;;;_J 168 ! I IKPR"IVGG 1"69 Pator de coagulação Xjla (FXlla) I SMTR"VVGG 170 TSTR*IVGG .

" PMKR*LTLG SMTR*WGG ::: _J 174 I ! I SPFR"SSDI 175 SLMK*RPPG i76 , S I YD\NR"TPYL 177 SPFR"SVQV 178 -" i " I SPFR-TPYL 179 . I TFHK"AEYR 180 PRFK"I1GG

W i81 1SLM"KRPP

M 182 183 " "l LEAR*SAYH EAKR*SYHS 184 PNR\N"STGA | calicreína 1 I EAFY"SQFG 185 186 1 NAAR*STGA | I SSE\N"SMPY GTLF"RSGN ARLY*SRGA ::: | 189 3

E 190 : à EASR"SATL 191 . : EASY*RRKQ 192 l' TTFY"RRGA i93 ! I ^AWY*'}TSR 194 à 3 SFHY*R dvG 195 ASSY"RTSR 196 ! I TRFY"SRGR } 197 g , ' j IKFF*SAQT 198

176/3.16

KKTR'NLKK 200 LDRR*GLQR 201 MATR'KMHD 202 RLKK*SQFL 203 proteina C I PQLR"MKNNl 204 VDQR*GNQI 205 IEPR*SPSQ 206 KKTR"SPKT 207 LDQR"GVQR, 208 PDPR"SKNN 209 GEAR*GSVI 211 GHAR*LVHV 212 AEFR"HDSG 213 HHQK*LVFF 214 ptasmincgênio GSNK"GALL 215 RAQR*SAGA 216 AFWK*TDAS 217 MSMRNRRH 218 RGVR*RTAS 2'19 RAAR*SQCT 220 PQSR*SVPP 221 PYLK*VFNP 222 LSFR*ARAY 223 PQLR*RGWR 224 EDNR*DSSM 225 LSFR*ARAY 226 FRAR*AYGF 227 YGFR*GPGP 228 ITFR*MNVA 229 THEK*GRQS 230 PRLK*ARAG 231 PKAK*SHAP 232 PSHK*EGPQ 233 LFEK*KVYL 234 ADGK*KPSS 235 PRFK*1IGG 236 PQFR*IKGG 237 PRCR*HRPH 238 KGYR*SQRG 239 DVAQ*FVLT 240

QPVS"VKVG 242 RGVG"IKST 243 FVDC*LIEQ 244 VPAG*N'\NVL 245 YHAD*IYDK 246 RACR"LAKA 247 QGAY*QEAF 248 DVLS*LLEK 249 TLDD*LIMA 250 H1SS*LJKL 251 DPNN"LLND 252 PVQP"QQSP 253 KPKT*IT'GP metatoprdeinase matric ial-2 (MMP2) VVHP"LVLL HPLV'LLSV AVAL"LIGP iS I 257 QPLQ"LLDA 258 Y[QG*1NLV 259 LPQE"1KAN 260 N1SD"LTAA 261 KPRA"LTAL 262 APSW"LLTA 263 AVRVV"LLTA 264 AVSW*LLTA 265 SLRR*LTAA 266 $L$R'LTAL 267 .RYSS"LTAA 268 sLA\rYTAL 269 SLRY*YTAA 270 SPATYTAL 271 MHKA"LTAA LRLA¶TAL

IPEN*FFGV ::Lj 275 MDÍA'IHHP 276 $P$R*LFDQ 277 metaloprdáhase matncta-g' (mmp9) SEMRILEKD 278 'FSVN"LDVK 279 RLFD*QFFG 280

FFGE*HLLE 281 GLSE*MRLE 282 SPEE*LKVK 283 DVIE*VHGK 284 EVHG*KHEE 285 DEHG*FISR 286 GEHL*LESD 287 FHRK*YRIP 288 GPRK*QVSG 289 LSPF*YLRP 290 PPSF*LRAP 291 NPLE*NSGF 292 VPYG*LGSP 293 PPLK*LMHS 294 GPEG*LRVG 295 FMKG*LSKA 296 VVTG*VTAV 297 AIIG*LMVG 298 SDLG*LTGI 299 VPYG*LGSP 300 GAAG*VKGD 301 GPTG*KQGD 302 GPSG*DQGA 303 GPSG*FPFP 304 GAPG*FPGP 305 GAPG*NRGF 306 GLRG*ERGE 307 GPPG*SQGN 308 GPAG*QQGA 309 GPPG*KDGT 310 GQPG*SPGS 311 GSPG*YQGP 312 GPVS*AVLT 313 GPLG*MLSQ 314 GPLG*MWAQ 315 GPQG*IFGQ 316 LPRS*AKEL 317 NSFG*LRFG 318 RAIH*INAE 319

! RPRR*AKRF 321 i RKKR'GLYA 322 RERRi'RKKR 323 RKKR"GLYA 324 RKKR"TTSA 325 RHKR*ETLK 326 RLKR*D\NT á27 RMKR"EDLN furina I RAKR"FASL RKKR"FVSS RTKR'FLSY RRAR*SVDG ii! l' 331 332 VFRR'DAHK 333 VFRR"EAHK 334 RVAR"DITM 335 R1SR*SLPQ 336 RSRR'"AATS 337 RAKR*SPKH 338 FVVHR*GVTK 339 AKRR'TKRD i AKRR"AKRD

GSGKFATL =_J ""_ ZT'

W © QRGR*SATL RGSVILTV 350 PS$R"RRVN 351 CPGR'VVGG 352 PGAR"GRAF 353 SSSR"GPTH 354 VSNKNFSN 355 NSGR*AVTY 356 TYSR"SRYL 357 ativadorde u-ptasminogênio (u-PA) NSGR"AV1Y 358 PSGR*GRTL 359 AGSR*AVYY 360 TYGR*SRTN 361 NSSR'"GVYL 362 P$SR*SVYN 3'63 ASGR*GRTY 364 TS$R"AVYL 365 NSG.R*SRTL 366 VSGR*1RTG SSGR*IRTV NALR*YAPD ::: _J 370 ativador de t-pl!asminQga1io (êpa') I CPGR*VVGG 371 PQFR"1KGG 372 ALSR"MAVL 373 e y : "RVVGGE j: 375 ' "RIVGGE 376 "RHGGE' ' 377 "RVVGGD 378 "RIVGGD 379 triptase-E (prosanina) I, "RIIGGD "KVVGGE 380 381 "KIVGGE 382 i "KIIGGE ' 383 *KVVGGD 384 *K1VGGD 385 *KIIGGD 386 protease-7 de mast!&ÍtD de can.undongo (mP4CP-7) I LSSR*QSPG LQAR*GASL LGPK*AITM LGPR"SAVY iir' ;;_J HQKLU/FFA 393 HHQK*LVFF 394 ! K"LVF"FAED 395 DR'N'IHPF 396 YIHP*FHLV 397 enzima-l conve de endderna YGLG*SPRS 398 TPEH¶NPY 399 (ECE-I) DI1W*VNTP 400 D1(\N¶NTP 401 CHLD*IIWV 402 HLDr|'|NvN CVYF"CHLD' ::: _J SCSS*LMDK ECVY*FCHL RSKR*CSCS

ZT 407 RSKR*ALEN 408 GFSP*FRSS 409 PRRP*YILP 410 KPQQ*FFGL 411 PQQF*FGLM 412 proteína do grupo sanguíneo DIFN*VNTP 414 de Kell (KBGP) DIM'INTP 415 K5FLE"AIPM 417 KVFQ*EPLF 418 PTLT"FDHS 419 FLFY"EAPR 42Q TGLR'DPFN 421 KILH"'LPTS 4-22 AHLK"NSQE 423 A.PLT"AE1Q 424 EALF"AERK 425 EPLA*AERK 426 GTFT"SDYS 427 KYLD*SRRA 428 QjF\rQvdLM 429 catepsim L KQLA*TKAA 430 STFE"ERSY 431 LRLE"NPYQ 432 RGFF"YTPK GFFY"TPKA m C4 HFFK"'NIVT 435 RGLS'LSRF 436 QWLG'APVP' 437 IWIALK'RGLP 438 439 . LSLA'HTHQ TPFA"ATSS 440 KLLA"VS.GP 44'1 CLFR"RAVL 442 PRFK'IICG 443

*SFLLRN 445 *SFFLRN 446 *SFFLKN 447 *TFLLRN 448 PARI *GFPGKF 449 *GYPAKF 450 *GYPLKF 451 *GYPIKF 452 *SLIGKV 454 PAR2 *SLIGRL 455 *TFRGAP 457 PAR3 *SFNGGP 458 *SFNGNE 459 *GYPGQV 461 *AYPGKF 462 *TYPGKF 463 *GYPGKY 464 PAR4 *GYPGKW 465 *GYPGKK 466 *GYPGKF 467 *GYPGRF 468 à *GYPGFK i 469 *GYPAKF l 470 *GFPGKF I 471 *GFPGKP I 472 *SYPGKF i 473 *SYPAKF i 474 *SYPGRF I 475 *SYAGKF I 476 - I I *SFPGQP j 477 *SFPGQA 478 ADAMTS13 NLVY*MVTG 479 Í Um asterisco (*) indica a ligação peptídica do sítio de clivagem P,-Pr que é cIiva- jgo _E!e.|.a_ protease indicada.

Vislumbrou-se que um sÍtio de clivagem de inativação de todo e qualquer comprimento pode ser útil nos aspectos da presente invenção com a condição de que o sÍtio de cIivagem de inativação seja capaz de ser cliva- ." do clivado por uma protease de um fluido intersticial ou de um sistema circu- 5 latório. Portanto, nos aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem de " inativação pode ter, por exemplo, pelo. menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ou 20 aminoácidos de comprimento. Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem de inativação pode ter, por exemplo, no máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ou 20 aminoácidos de comprimento- lO Um sÍtio de clivagem de inativação útil nos aspectos da invenção inclui, sem limitação, sÍtio de clivagem de inativação de ocorrência natural; variantes de ocorrência natural de sítio de clivagem de inativação; e varian- tes de ocorrência não natural de sÍtio de clivagem de inativação, tais como, por exemplo, variantes conservativas de sÍtio de clivagem de inativação, va- 15 riantes não conservativas de sÍtio de clivagem de inativação e peptidomimé- ticos de sÍtio de clivagem de inativação. Conforme usado neste relatório, o termo "variante de sÍtio de clivagem de inativação", seja de ocorrência natu- ral ou não natural, refere-se a um sÍtio de clivagem de inativação que tem pelo menos uma alteração de aminoácido em relação à região corresponde 20 das sequências de referência divulgadas e pode ser descrita em percenta- gem de identidade com a região correspondente daquela sequência de refe- rência. Qualquer um de uma variedade de métodos de alinhamento de se- quências pode ser usado para determinar a percentagem de identidade, in-

" cluindo, sem limitação, métodos globais, métodos locais e métodos híbridos, tais como, por exemplo, métodos de abordagem de segmentos. Os protoco- ios para determinação da percentagem de identidade são procedimentos rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados neste 5 relatório. . Conforme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência natural de sÍtio de clivagem de inativação" refere-se a qualquer sÍtio de cli- vagem de inativação produzido sem o auxílio de qualquer manipulação hu- mana. Exemplos não limitativos de sÍtios de clivagem de inativação incluem 10 variantes de sÍtio de clivagem da trombina, variantes de sÍtio de clivagem da plasmina, variantes de sÍtio de clivagem do fator de coagulação V, variantes de sÍtio de cIivagem do fator de coagulação VIl, variantes de sÍtio de cliva- gem do fator de coagulação VIll, variantes de sítio de clivagem do fator de

W coagulação IXa, variantes de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xa,

C 15 variantes de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xla, variantes de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xlla, variantes de sÍtio de clivagem da calicreína plasmática, variantes de sítio de clivagem da MMP-2, variantes de sÍtio de clivagem da MMP-9, variantes de sÍtio de clivagem da furina, varian- tes de sÍtio de clivagem do ativador de u-plasminogênio, variantes de sÍtio . 20 de cIivagem do ativador de t-plasminogênio, variantes de sitio de clivagem da triptase-E, variantes de sÍtio de clivagem da mMCP-7, variantes de sÍtio de cIivagem da ECE-I, variantes de sÍtio de clivagem da KBGP, variantes de sÍtio de clivagem da catepsina L, variantes de sÍtio de clivagem de PARI, variantes de sÍtio de clivagem de PAR2, variantes de sítio de clivagem de 25 PAR3, variantes de sÍtio de clivagem de PAR4, e variantes de sÍtio de cliva- gem de ADAM-TS13. Conforme usado neste relatório, o termo "variante de ocorrência não natural de sÍtio de clivagem de inativação" refere-se a qualquer sÍtio de clivagem de inativação produzido com o auxílio de manipulação humana, 30 incluindo, sem limitação, variantes de sÍtio de clivagem de inativação produ- zidas por engenharia genética usando mutagênese aleatória ou desenho racional e variantes de sÍtio de cIivagem de inativação produzidas por sínte-

se química. Exemplos não limitativos de variante de ocorrência não natural de sítio de clivagem de inativaçãos incluem, por exemplo, variantes conser- vativas de sÍtio de clivagem de inativação, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem de inativação, e sÍtio de clivagem de inativação peptidomi- 5 metics.

W Conforme usado neste relatório, o termo "variante conservativa de sÍtio de clivagem de inativação" refere-se a um sítio de clivagem de inati- vação que tem pelo menos um aminoácido substituído por um outro amino- ácido ou um aminoácido análogo que tem pelo menos uma propriedade si- lO milar àquela do aminoácido original da sequência do sÍtio de clivagem de inativação de referência. Exemplos de propriedades incluem, sem limitação, tamanho similar, topografia, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade, Iipofilici- dade, capacidade de ligação covalente, capacidade de ligação de hidrogê- 'V ^ nio, uma propriedade físico-química, entre outras, ou qualquer combinação # 15 das mesmas. Uma variante conservativa de sÍtio de clivagem de inativação pode funcionar substancialmente da mesma maneira que sítio de clivagem de inativação de referência no qual a variante conseNativa de sÍtio de cliva- gem de inativação se baseia, e pode substituir o sÍtio de clivagem de inati- vação de referência em qualquer aspecto da presente invenção. Exemplos 20 não limitativos de uma variante conservativa de sítio de clivagem de inativa- ção incluem, por exemplo, variantes conservativas de sÍtio de clivagem da trombina, variantes conservativas de sÍtio de clivagem da plasmina, varian- tes conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação V, variantes conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Vll, variantes 25 conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Vlll, variantes conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação lXa, variantes conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xa, variantes conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação XIa, variantes conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xlla, variantes 30 conservativas de sÍtio de clivagem da calicreína plasmática, variantes con- seNativas de sÍtio de clivagem da MMP-2, variantes conservativas de sÍtio - de clivagem da MMP-9, variantes conservativas de sÍtio de clivagem da furi-

" na, variantes conservativas de sítio de clivagem do ativador de u- . plasminogênio, variantes conservativas de sítio de clivagem do ativador de t-

· plasminogênio, variantes conservativas de sÍtio de clivagem da triptase-E, variantes conservativas de sÍtio de clivagem da mMCP-7, variantes conser- 5 vativas de sÍtio de clivagem da ECE-I, variantes conservativas de sÍtio de

" cIivagem da KBGP, variantes conservativas de sÍtio de clivagem da catepsi- na L, variantes conservativas de sÍtio de clivagem de PARI, variantes con- servativas de sÍtio de clivagem de PAR2, variantes conservativas de sÍtio de clivagem de PAR3, variantes conservativas de sítio de clivagem de PAR4, e 10 variantes conservativas de sÍtio de clivagem de ADAM-TS13. Conforme usado neste relatório, o termo "variante não conserva- tiva de sÍtio de clivagem de inativação" refere-se a um sítio de clivagem de inativação no qual 1) pelo menos um aminoácido é deletado do sÍtio de cli- . vagem de inativação de referência no qual a variante não conservativa de m 15 sÍtio de clivagem de inativação se baseia; 2) pelo menos um aminoácido é adicionado ao sÍtio de clivagem de inativação de referência no o sÍtio de cIi- vagem de inativação não conservativo se baseia; ou 3) pelo menos um ami- noácido é substituído por um outro aminoácido ou por um análogo de ami- noácido que não compartilha qualquer propriedade similar àquela do amino-

, 20 ácido originai da sequência do sÍtio de ciivagem de inativação de referência (Tabela 4). Uma variante não conservativa de sÍtio de clivagem de inativa- ção pode funcionar substancialmente da mesma maneira que o sÍtio de cli- vagem de inativação de referência no qual o sítio de clivagem de inativação não conservativo se baseia, e pode substituir o sÍtio de clivagem de inativa- 25 ção de referência em qualquer aspecto da presente invenção.

Exemplos não Iimitativos de uma variante não conservativa de sÍtio de clivagem de inativa- ção incluem, por exemplo, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem da trombina, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem da plasmina, variantes não conservativas de sÍtio de 'clivagem do fator de coagulação V, 30 variantes não conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Vll, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Vlll, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação IXa,

variantes não conseNativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xa, variantes não conservativas de sítio de clivagem do fator de coagulação Xla,

· variantes não conservativas de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xll- a, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem da calicreína plasmática, 5 variantes não conservativas de sÍtio de clivagem da MMP-2, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem da MMP-9, variantes não conseNativas de sÍtio de clivagem da furina, variantes não conseNativas de sÍtio de cliva- gem do ativador de u-plasminogênio, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem do ativador de t-plasminogênio, variantes não conseNativas de 10 sÍtio de clivagem da triptase-e, variantes não conservativas de sÍtio de cliva- gem da mMCP-7, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem dá ECE- l, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem da KBGP, variantes não conservativas de sÍtio de clivagem da catepsina L, variantes não conservati- e . vas de sÍtio de clivagem de PARI, variantes não conservativas de sitio de

, 15 clivagem de PAR2, variantes não conseNativas de sÍtio de clivagem de PAR3, variantes:não conservativas de sÍtio de clivagem de PAR4, e varian- tes não conservativas de sÍtio de clivagem de ADAM-TS13. Conforme usado neste relatório, o termo "peptidomimético de SÍ- tio de clivagem de inativação" refere-se a um sÍtio de clivagem de inativação

, 20 que tem pelo menos um aminoácido substituído por um oligômero não natu- ral que tem pelo menos uma propriedade similar àquela do primeiro aminoá- cido.

Exemplos de propriedades incluem, sem limitação, topografia de um elemento estrutural primário do peptídio, functionalidade de um elemento estrutural primário do peptídio, topologia de um elemento estrutural secun- 25 dário do peptídio, functionalidade de um elemento estrutural secundário do peptídio, entre outras, ou qualquer combinação das mesmas.

Um sÍtio de clivagem de inativação peptidomimetic pode funcionar substancialmente da mesma maneira que o sÍtio de clivagem de inativação de referência no qual o peptidomimético de sÍtio de clivagem de inativação se baseia, e pode 30 substituir o sÍtio de clivagem de inativação de referência em qualquer aspec- to. da presente invenção.

Para exemplos de métodos de peptidomimese vi- de, por exemplo, Amy S.

Ripka & Daniel H.

Rich, Peptidomimetic design,

- 2(4) CURR.

OPIN. CHEM.

BIOL. 441 -452 (1998); e M.

Angels Estiarte & - Daniel H.

Rich, Peptidomimetics for Drug Design, 803-861 (BURGER'S

· MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY Vol. 1 PRINCIPLE AND PRACTICE, Donald J.

Abraham ed., Wiley-lnterscience, 6th ed. 2003). E- 5 xemplos não limitativos de um peptidomimético de sÍtio de clivagem de inati- vação incluem, por exemplo, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem da trom- bina, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem plasmina, peptidomiméticos de sÍtio de cIivagem do fator de coagulação V, peptidomiméticos de sÍtio de cli- vagem do fator de coagulação Vll, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem do 10 fator de coagulação Vlll, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem do fator de coagulação lXa, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem do fator de coagula- ção Xa, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xla, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xlla, peptido- * . miméticos de sÍtio de clivagem da calicreína plasmática, peptidomiméticos 15 da sÍtio de clivagem da MMP-2, peptidomiméticos de sítio de clivagem da - MMP-9, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem da furina, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem da furina, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem do ati- vador de u-plasminogênio, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem do ativa- dor de t-plasminogênió, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem da triptase-E,

.. 20 variantes de sÍtio de clivagem da mMCP-7, peptidomiméticos de sÍtio de cli- vagem da ECE-I, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem da KBGP, pepti- domiméticos de sÍtio de clivagem da catepsina L, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem PARI, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem PAR2, peptido- . miméticos de sÍtio de clivagem PAR3, peptidomiméticos de sÍtio de clivagem 25 PAR4, e peptidomiméticos de sÍtio de clivagem de ADAM-TS13. Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana compre- ende um sÍtio de clivagem de inativação.

Em um aspecto desta modalidade, uma toxina clostridiana compreende um domínio enzimático de toxina clos- tridiana, um domínio de translocação de toxina clostridiana, um domínio de 30 ligação de toxina clostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação.

Em um " outro aspecto desta modalidade, uma toxina clostridiana compreende . uma variante de ocorrência natural de sÍtio de clivagem de inativação, tais como,

por exemplo, um isoforma de sÍtio de clivagem de inativação.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma toxina clostridiana compreende uma varian-

- te de ocorrência não natural de sÍtio de clivagem de inativação, tais como, por exemplo, uma variante conseNativa de sÍtio de clivagem de inativação, 5 uma variante não conservativa de sÍtio de clivagem de inativação ou um fragmento ativo de sÍtio de clivagem de inativação, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em uma outra modalidade, uma quimera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem de inativação.

Em um aspecto desta mo- lO dalidade, uma quimera de toxina clostridiana compreende um domínio en- zimático de toxina clostridiana, um domínio de translocação de toxina clos- tridiana, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, e um sÍtio de cli- vagem de inativação.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma quimera + de toxina clostridiana compreende uma variante de ocorrência natural de 15 sÍtio de clivagem de inativação, tais como, por exemplo, uma isoforma de sÍtio de clivagem de inativação.

Em um outro aspecto desta modalidad-e;"" uma quimera de toxina clostridiana compreende uma variante de ocorrência não natural de sÍtio de clivagem de inativação, tais como, por exemplo, uma variante conservativa de sÍtio de clivagem de inativação, uma variante não

, 20 conservativa de sÍtio de clivagem de inativação ou um fragmento ativo de sÍtio de cIivagem de inativação, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em uma outra modalidade, um aminoácido hidrófobo em uma posição particular no sÍtio de clivagem de inativação pode ser substituido por um outro aminoácido hidrófobo.

Exemplos de aminoácidos hidrófobos inclu- 25 em, por exemplo, C, F, I, L, M, V e W.

Em um outro aspecto desta modali- dade, um aminoácido alifático em uma posição particular no sÍtio de cliva- gem de inativação pode ser substituído por um outro aminoácido alifático.

Exemplos de aminoácidos alifáticos incluem, por exemplo, A, I, L, P, e V.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido aromático 30 em uma posição particular no sÍtio de clivagem de inativação pode ser subs-

. tituído por um outro aminoácido aromático.

Exemplos de aminoácidos aro- máticos incluem, por exemplo, F, H, W e Y.

Em ainda um outro aspecto des-

ta modalidade, um aminoácido de empilhamento em uma posição particular no sÍtio de clivagem de inativação pode ser substituído por um outro amino-

- ácido de empilhamento.

Exemplos de aminoácidos de empilhamento inclu- em, por exemplo, F, H, W e Y.

Em um outro aspecto desta modalidade, um 5 aminoácido polar em uma posição particular no sÍtio de clivagem de inativa- ção pode ser substituído por um outro aminoácido polar.

Exemplos de ami- noácidos polares incluem, por exemplo, D, E, K, N, Q, e R.

Em um outro as- - pecto desta modalidade, um aminoácido menos polar ou indiferente em uma posição particular no sÍtio de clivagem de inativação pode ser substituído por 10 um outro aminoácido menos polar ou indiferente.

Exemplos de aminoácidos menos polares ou indiferentes incluem, por exemplo, A, H, G, P, S, T, e Y.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga po- sitiva em uma posição particular no sÍtio de clivagem de inativação pode ser a substituído por um outro aminoácido de carga positiva.

Exemplos de amino- 15 ácidos de carga positiva incluem, por exemplo, K, R, e H.

Em ainda um ou- . tFo.:.aspecto desta modalidade, um aminoácido de carga negativa e.m':"uma posição particular no sÍtio de clivagem de inativação pode ser substituído por um outro aminoácido de carga negativa.

Exemplos de aminoácidos de carga negativa incluem, por exemplo, D e E.

Em um outro aspecto desta modali-

20 dade, um aminoácido pequeno em uma posição particular no sítio de cliva- gem de inativação pode ser substituído por um outro aminoácido pequeno.

Exemplos de aminoácidos pequenos incluem, por exemplo, A, D, G, N, P, S, " e T.

Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um aminoácido com ra- mificação em C-beta em uma posição particular no sÍtio de clivagem de ina- 25 tivação pode ser substituído por um outro aminoácido com ramificação em C-beta.

Exemplos de aminoácidos com ramificação em C-beta incluem, por exemplo, I, T e V.

Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem de trombina como um sÍtio de clivagem de inativação.

Conforme 30 usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem de trombina" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação

- cÍssil pela trombina em condições adequadas para atividade de protease da . trombina. Vislumbrou-se que qualquer sequência de aminoácido clivada por · uma trombina pode ser útil nos aspectos da presente invenção. Embora se- jam conhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generalizada 5 para um sÍtio de clivagem de trombina é X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID N°: 113), onde Xj é preferencialmente S, T, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido aromático hidró- fobo como F, W, e Y, um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é qualquer aminoácido; X3 é preferencialmente F, S, T, um a- lO minoácido amídico como N ou Q, ou um aminoácido alifático hidrófobo co- mo H, G, P, A, V, L, I, e M; X4 é preferencialmente S, T, um aminoácido po- sitivo como H, K, e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X5, X6, e X7, são independentemente qualquer aminoácido. A " Tabela 4 relaciona sÍtios de clivagem de referência exemplificativos para

Õ 15 trombina (SEQ ID N°: 114-123). SÍtios de clivagem da trombina adicionais . - - são bastante conhecidos na lite"ratura ou podem ser definidos :por métodos rotineiros. Vide, por exemplo, O. Schilling & C. M. Overall, Proteome- Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., , 20 MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de ban- co de dados): D320-D325 (2008): Neil D- Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no pre- 25 lo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referência. Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou uma quimera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem de trombi- na. Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem de trombina 30 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 113, onde Xj é S, T, um a- minoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido aromático hidrófobo como F, W, e Y, um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é qualquer aminoácido; X3 é F, S, . T, um aminoácido amídico como N ou Q, ou um aminoácido alifático hidró-

· fobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; )(4 é S, T, um aminoácido positivo como H, K, e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e 5 M; e X5, X6, e X7, são independentemente qualquer aminoácido.

Em um ou-

. tro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem de trombina compreen- de a sequência consenso SEQ ID N°: 113, onde Xj é S, Q, K, ou um amino- ácido alifático hidrófobo como H, G,'P, A, V, L, I, e M; X2 é um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido bá- lO sico como K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um ami- noácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é N, Q, G, P, A, V, L, ou I; )(4 é S, T, H, G, A, L, ou I; X5 é S, T, Q, K, R, F, Y, ou um aminoá- cido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é S, T, Q, K, R, G, P, " A, V, L, ou I; e X7 é S, T, Q, K, R, G, P, A, V, L, ou I.

Em um outro aspecto " 15 desta modalidade, um sÍtio de clivagem de trombina compreende a sequên- . " cia consenso SEQ ID N°: 113, ondeX1 é Q, G, P,A,V, L,:l,-oú M;X2é S, T, D,E,G,A,V,ou|;X3éG,P,A,V,ouL;X4éS,G,A,ouL;X5éQ,K,F,A, V,ouL;X6éS,Q,K,R,G,P,V,ouL;eX7éS,T,K,G,V,L,ou|.Emou- tros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem de trombina compre-

20 ende, por exemplo, a SEQ ID N°: 114, SEQ ID N°: 115, SEQ ID N°: 116, SEQ ID N°: 117, SEQ ID N°: 118, SEQ ID N°: 119, SEQ ID N°: 120, SEQ ID N°: 121, SEQ ID N°: 122, ou SEQ ID N°: 123. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem de plasmina um sÍtio de clivagem de inativação.

Conforme usa- 25 do neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem de plasmina" refere-se a uma Iigação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação CÍS- sil pela plasmina em condições adequadas para atividade de protease da plasmina.

Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pela 30 plasmina pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

A plasmina cata- lisa a clivagem das ligações Lys| e Arg|, com uma especificidade semelhan- te àquela da tripsina.

No entanto, a plasmina é uma enzima muito menos

- eficiente que a tripsina, e cliva apenas estas ligações nas proteínas. A tripsi- . na cliva cadeias peptídicas principalmente no lado carboxil dos aminoácidos · lisina ou arginina, exceto quando qualquer deles é seguido pela prolina. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio 5 de cIivagem do fator de coagulação Vlla como um sÍtio de clivagem de inati- . " vação. Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem do fator de coagulação Vlla" ou "sÍtio de clivagem de VIla" refere-se a uma ligação císsil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacen- tes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍssil pelo 10 FVlla em condições adequadas para atividade de protease do FVlla. Vis- lumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pela FVMa pode ser útil nos aspectos da presente invenção. Embora sejam conhecidas al- gumas exceções, uma sequência consenso generalizada para a FVMum » sÍtio de clivagem é X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID N°: 124), onde Xj é pre- "

W 15 ferencialmente um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido básico como K e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é Q, S, T, um aminoácido aromá- tico hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é preferencialmente Q, S, T, ou um aminoácido alifá- 20 tico hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; XÁ, X5, X6, e X7, são independen- temente qualquer aminoácido. A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de refe- rência exemplificativos para FVlla (SEQ ID N°: 125-133). SÍtios de clivagem de FVlla adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser de- finidos por métodos rotineiros. Vide, por exemplo, J. H. Morrissey, Coagula- 25 tion Factor Vlla. ln HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, págs.1659- 1662 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, & J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling & C. M. Overall, Proteome-Derived, Database- Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Pep- 30 tidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320- D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil a · D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles es-

. tando aqui incorporados em sua integridade a título de referência.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- 5 mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem do fator de coagulação VIla.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de coagulação Vlla compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 124, onde Xj é um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido básico como K e R, ou um aminoácido alifático 10 hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é Q, S, T, um aminoácido aromá- tico hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é Q, S, T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e )(4, X5, X6, e X7, são independentemente qualquer " - aminoácido.

Em outros aspectos desta modalidade, um sítio de clivagem do .^. " 15 fator de coagulação Vlla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 125, SEQ 4

ID N°: 126, SEQ ID N°: 127, SEQ ID N°: 128, SEQ ID N°: 129, SEQ ID N°: 130,SEQÍD N°: 131,SEQID N°: 132,ouSEQID N°: 133 Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio " de clivagem do fator de coagulação lXa como um sÍtio de clivagem de inati-

_ 20 vação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem do fator de coagulação lXa" ou "sÍtio de clivagem FlXa" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍssil pelo FlXa em condições adequadas para atividade de protease do FlXa.

Vislumbrou-se 25 que qualquer sequência aminoacídica clivada pelo FlXa pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam conhecidas algumas exce- ções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem de FlXa é X,X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID N°: 134), onde X, é preferencialmen- te um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, 30 ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é pre- ferencialmente um aminoácido ác.ido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e" '

r · M; X3 é preferencialmente S, T, um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e

" XÀ, X5, X6, e X7, são independentemente qualquer aminoácido.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplificativos para FlXa (SEQ ID N°: 5 135-138). SÍtios de clivagem de FlXa adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, A.

T.

Thompson, Molecular Biology of Factor lX. ln HEMOSTASIS AND THROMBOSIS, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE, págs. 128-129 (R.

W.

Colman, J.

Hirsh, V.

J.

Marder, A.

W Clowes, J.

N.

George, 10 eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2nd, 2001 ); S.

Kawa- bata & S.

Iwanaga, Russellysin. ln HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, págs. 683-684 (A.

J.

Barrett, N.

D.

Rawlings, & J.

F.

Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); A.

E.

Schmidt & S. p.

Bajaj, Coagulation " . factor IXa. ln HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES, págs. 1655-1659 « " % 15 (A.

J.

Barrett, N.

D.

Rawlings, & J.

F.

Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O.

Schilling & C.

M.

Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Data- " base, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325

, 20 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D.

Ra- wIings, et al., A Large and Accurate Coilection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referência. 25 Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem do fator de coagulação lXa.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de coagulação compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 134, onde Xj é um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como 30 N e Q, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é S, T,

· um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifá- . tico hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X4, X5, X6, e X7, são indepen- dentemente qualquer aminoácido.

Em um outro aspecto desta modalidade, sÍtio de cIivagem do fator de coagulação lXa compreende a sequência con- 5 senso SEQ ID N°: 134, onde Xj é um aminoácido ácido como D e E, um a- minoácido amídico como N e Q, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é um aminoácido ácido como D e E, um aminoá- cido amídico como N e Q, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é S, T, um aminoácido aromático hidrófobo como F, W 10 e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X4, X5, X6, e X7 são independentemente um aminoácido ácido como D e E, um aminciácido amídico como N e Q, ou um aminoácido alifático hidrófobo co- mo H, G, P, A, V, L, 1, e M.

Em outros aspectos desta .modalidade, sítio de "' . clivagem do fator de coagulação lXa compreende, por exemplo, a SEQ ID ( 15 N°: 135, SEQ ID N°: 136, SEQ ID N°: 137, ou SEQ ID N°: 138. 4

Os aspectos da presente-invenção divulgam, em parte, um sítio de clivagem do fator de coagulação Xa como um sÍtio de clivagem de inati- vação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem do fator . de coagulação Xa" ou "sÍtio de clivagem FXa" refere-se a uma ligação cÍssil

, 20 junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na Iigação císsil pelo FXa em condições adequadas para atividade de protease do FXa.

Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pelo FXa pode ser útil nos as- pectos da presente invenção.

Embora sejam conhecidas algumas exceções, 25 uma sequência consenso generalizada para a FXa sÍtio de clivagem é X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID N°: 139), onde Xj é qualquer aminoácido, X2 é preferencialmente G, A, S, um aminoácido ácido como D e E, um aminoá- cido amídico como Q e N, ou um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, X3 é preferencialmente um aminoácido aromático hidrófobo como F, 30 W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; XA é preferencialmente um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido não carregadó como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como

- H, G, P, A, V, L, I, e M; X5, X6, e X7, são independentemente qualquer ami- . noácido.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplificativos

- para FXa (SEQ ID N°: 140-155). Sitios de clivagem de FXa adicionais são bastante conhecidos na Iiteratura ou podem ser definidos por métodos roti- 5 neiros.

Vide, por exemplo, D.

L.

Greenberg & E.

W.

Davie, Blood Coagulati-

. on Factors: Their Complementary DNAS, Genes, and Expression. ln HEMOSTASIS AND THROMBOSIS, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE, págs. 34-35 (R.

W.

Colman, J.

Hirsh, V.

J.

Marder, A.

W Clo- wes, J.

N.

George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2nd, 10 2001); O.

Schilling & C.

M.

Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for |dentiNing Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Data- base, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325 . (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic 15 Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D.

Ra- wlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referência. r'

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui-

_ . 20 mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xa.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de coagulação Xa compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 139, onde Xj é qualquer aminoácido, X2 é G, A, S, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como Q e N, ou um aminoácido aromático hi- 25 drófobo como F, W e Y, X3 é um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; XÁ é um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X5, X6, e X7, são independentemente qualquer aminoácido.

Em um 30 outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de coagula- ção Xa compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 139, onde Xj é E, F, P,A,L,ou|;X2éS,Q,D,E,F,G,ouA;X3éF,G,ouP;X4éS,T,L,ou|:

- X,éS,F,A,ouV;X6éS,T,E,N,H,G,A,ouM:eX,éS,N,D,Q,K,R,ou G. Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de " coagulação Xa compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 139, onde Xj élouA;X2éEouF:X3éF,G,ouP:X4éS,T,ou|;X5éS,F,ouV;X6éE 5 ou G: e X7 é S ou G. Em outros aspectos desta modalidade, um sítio de cli- vagem do fator de coagulação Xa compreende, por exemplo, a sequência aminoacídica SEQ ID N°: 141, SEQ ID N°: 142, SEQ ID N°: 143, SEQ ID N°: 144, SEQ ID N°: 145, SEQ ID N°: 146, SEQ ID N°: 147, SEQ ID N°: 148, SEQ ID N°: 149, SEQ ID N°: 150, SEQ ID N°: 151, SEQ ID N°: 152, SEQ ID 10 N°: 153,SEQID N°: 154,ouSEQID N": 155. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de cIivagem do fator de coagulação Xla como um sítio de clivagem de inati- vação. Conforme usado neste relatório, o termo "um sÍtio de clivagem do

P fator de coagulação Xla" ou "sítio de clivagem de FXla" refere-se a uma li- 15 gação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não ad- jacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍssil pelo FXla em condições adequadas para atividade de protease do FXla. Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pelo FXla pode - ser útil nos aspectos da presente invenção. Embora sejam conhecidas al- , 20 gumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem de FXla é X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID N°: 156), onde Xj é pre- ferencialmente um aminoácido ácido como D ou E, um aminoácido básico como K e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é preferencialmente um aminoácido ácido como D ou E, um aminoá- 25 cido amídico como Q e N, um aminoácido básico como K e R, um aminoáci- do aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é preferencialmente H, um aminoácido não carregado como C, S, e T, um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X4 é 30 preferencialmente H, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X5 é preferenci- almente um aminoácido ácido como D e E, ou um aminoácido alifático hidró-

r - fobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é preferencialmente um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido não carregado como C, S, e T, um - aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X7 é preferencialmente um amino- 5 ácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M. A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referên- cia exemplificativos para FXla (SEQ ID N": 157-166). SÍtios de clivagem de FXla adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser defini- dos por métodos rotineiros. Vide, por exemplo, P. N. Walsh, Coagulation 10 Factor Xla. In Handbook of Proteolytic Enzymes, págs. 1651-1655 (A. J. Bar- rett, N. D. Rawlings, & J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling & C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685- " e 694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, .

15 Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. ... 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS " Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incor- _ 20 porados em sua integridade a título de referência. Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem do fator de colagulação Xla. Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de colagulação Xla compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 25 156, onde Xj é um aminoácido ácido como D ou E, um aminoácido básico como K e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é um aminoácido ácido como D ou E, um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido básico como K e R, um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, 30 I, e M; X3 é H, um aminoácido não carregado como C, S, e T, um aminoáci- do aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; )(4 é H, um aminoácido não carregado como

· C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; - X5 é um aminoácido ácido como D e E, ou um aminoácido alifático hidrófobo

· " como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido não carregado como C, S, e T, um aminoácido aromático hidró- 5 fobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X7 é um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, 1, e M.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de coIagulação Xla compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 156, onde Xj é um aminoá- lO cido ácido como D ou E, ou um aminoácido básico como K e R; X2 é um a- minoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, . l, e M; XÁ é um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; 15 X5 é um aminoácido ácido como D e E, ou um aminoácido alifático hidrófobo "como H, G, P, A, V, L", I, e M; X6 é um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X7 é um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

Em um . outro aspecto desta modalidade, um sítio de clivagem do fator de colagula- 20 ção Xla compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 156, onde Xj é D ou K;X2éFouL;X3éTouP;X4éAouV;X5éEouV;X6éTouG;eX7éG ou V.

Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de colagulação Xla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 157, SEQ ID N°: 158, SEQ ID N°: 159, SEQ ID N°: 160, SEQ ID N°: 161, SEQ ID N°: 162, 25 SEQ ID N°: 163, SEQ ID N°: 164, SEQ ID N°: 165, ou SEQ ID N°: 166. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sítio de clivagem do fator de colagulação Xlla como um sÍtio de clivagem de ina- tivação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem do fator de colaguiação Xlla" ou "sÍtio de clivagem de FXlla" refere-se a uma Iigação 30 cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacen- tes, .ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍssil pelo FXlla em condições adequadas para atividade de protease do FXlla.

Vis-

· lumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pelo FXlla pode - ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam conhecidas al-

" gumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem de FXlla é X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID N°: 167), onde X, é pre- 5 ferencialmente um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um ami- noácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é preferencial- mente um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido básico como K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifáti- co hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é preferencialmente um ami- lO noácido básico como K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; XÁ é pre- ferencialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X5 é preferencialmente um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou . um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é prefe- 15 rencialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M: e X7 é preferencialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplifi- cativos para FXlla (SEQ ID N°: 168-172). Sítios de clivagem de FXlla adi- . cionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por 20 métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, O.

D.

Ratnoff, Coagulation Factor Xlla. ln Handbook of Proteolytic Enzymes, págs. 1642-1644 (A. j.

Barrett, N.

D.

Rawlings, & J.

F.

Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O.

Schil- ling & C.

M.

Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libra- ries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 25 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325 (2008); Neil D.

Ra- wlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Da- 30 tabase, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorpora- . dos em sua integridade a título de referência.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui-

J · mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem do fator de colagulação Xlla.

Em um aspecto desta modalidade, um sítio de clivagem do fator de colagulação Xlla compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 167, onde Xj é um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um ami- 5 noácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é um aminoácido

- ácido como D e E, um aminoácido básico como K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, - . P, A, V, L, I, e M; X3 é um aminoácido básico como K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como 10 H, G, P, A, V, L, I, e M; X4 é um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X5 é um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é um amino- ácido alifático hidrófobo c.omo H, G, P, A, V, L, I, e M; e X7 é um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

Em outro aspecto desta 15 modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de colagulação XIla compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 167, onde é S, T, P, ou I; X2 é Q, K, S, ouM;X3éK,T,G,ouP;X4éL,l,ouV;X5éTouV;X6éGouL;eX7é G.

Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem do fator de r colagulação Xlla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 168, SEQ ID N°:

, 20 169, SEQ ID N°: 170, SEQ ID N°: 171, ou SEQ ID N°: 172. ' Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem da calicreína 1 como um sÍtio de cIivagem de inativação.

Con- forme usado neste relatório, o termo "sítio de.clivagem de calicreína 1" refe- re-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacen- 25 tes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍssil pela calicreína 1 em condições adequadas para atividade de protease da calicreína 1. Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoací- dica clivada pela calicreína 1 pode ser útil nos aspectos da presente inven- ção.

Embora sejam conhecidas algumas exceções, uma sequência consen- 30 so generalizada para um sÍtio de clivagem da calicreína 1 é X1X2X3X4*(R/K/S)X5X6X7 (SEQ ID N°: 173), onde Xj é preferencialmente um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como Q e N, um a-

" minoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidró- fobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X2 é qualquer aminoácido; X3 é qualquer . aminoácido; X4 é preferencialmente um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não polar grande como F, I, L, M e V, ou um aminoácido 5 aromático hidrófobo como F, W e Y; X5 é qualquer aminoácido; X6 é qual- quer aminoácido; e X7 é qualquer aminoácido. A Tabela 4 lista sÍtios de cÍi- vagem de referência exemplificativos para Kallikrein 1 (SEQ ID N°: 174-198). Sítios de clivagem de calicreína 1 adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros. Vide, por exemplo, " 10 R. W. Colman, Contact Activation Pathway: lnflammation, Fibrinolytic, Anti- coagulant, Antiadhesive, and Antiangiogenic Activities. ln HEMOSTASIS AND THROMBOSIS, BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE, págs. 103-104 (R. W. CoIman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N.

W George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001 ); j. 15 Chao, Human Kallikrein 1, Tissue Kallikrein. In Handbook of Proteolytic Enzymes, págs. 1577-1580 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, & J. F. Woes.sner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); H. X. Li, et al., Substrate Specificity of Hu- man Kallikreins 1 and 6 Determined by Phage Display, Protein Sci. 1.7: 664- 672 (2008); O. Schilling & C. M. Overall, Proteome-Derived, Database- _ 20 Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Pep- tidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320- D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil 25 D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles es- tando aqui incorporados em sua integridade a título de referência. Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem de calicreína 30 1. Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da calicreína 1 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 173, onde.X1 é um aminoá- cido ácido como D e E, um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido

" não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como - H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é qualquer aminoácido; X3 é qualquer aminoáci-

- do; )(4 é um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não polar grande como F, I, L, M e V, ou um aminoácido aromático hidrófobo como F, 5 W e Y: X5 é qualquer aminoácido; X6 é qualquer aminoácido; e X7 é qual- quer aminoácido.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de cliva- gem da calicreína 1 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 173, onde Xj é D, S, T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L,|,eM:X2éS,T,A,P,ouV:X3éS,F,ouL;X4éRouumaminoácido 10 aromático hidrófobo como F, W e Y; X5 é R, S, T, ou A; X6 é R, S, ou G; e X7 é R, G, ou A.

Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem da calicreína 1 compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 174, SEQ ID N°: 175, SEQ ID N°: 176, SEQ ID N°: 177, SEQ ID N": 178, SEQ ID N°: 179, SEQ ID N°: 180, SEQ ID N°: 181, SEQ ID N°: 182, SEQ ID N°: 183, SEQ ID 15 N°: 184, SEQ ID N°: 185, SEQ ID N°: 186, SEQ ID N°: 187, SEQ ID N°: 188, z-:-SEQ ID N°: 189, SEQ ID N°: 190, SEQ ID N°: 191, SEQ ID N°: 192, SEQ ID N°: 193, SEQ ID N°: 194, SEQ ID N°: 195, SEQ ID N°: 196, SEQ ID N°: 197, ouSEQIDN°:198. " Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio

, 20 de clivagem da proteína C como um sÍtio de clivagem de inativação.

Con- forme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem da proteína C" refe- re-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacen- tes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍssil por Protein C em condições adequadas para atividade de pro- 25 tease da proteína C.

Vislumbrou-se que qualquer seguência aminoacídica clivada pela proteína C pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam conhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem da proteína C é X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID N°: 199), onde Xj é preferencialmente um 30 aminoácido básico como K e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é preferencialmente um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido básico como K e

X · R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é preferencialmente um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido bá-

" sico como K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um ami- noácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; & é preferencial- 5 mente um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido básico como K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifá- tico hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X5 é preferencialmente um ami- noácido amídico como Q e N, um aminoácido básico como K e R, um ami- noácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hi- lO drófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X6 é preferencialmente um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoáci- do não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y; X7 é preferencialmente um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido básico como K e R, 15 um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático

:-,.. "'. hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

A Tabela 4 lista sÍtios-de clivagem de referência exemplificativos para proteína C (SEQ ID N°: 200-209). SÍtios de clivagem da proteína C adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, L.

Shen 20 & B.

Dahiback, Protein C. ln Handbook of Proteolytic Enzymes, págs. 1673- 1677 (A.

J.

Barrett, N.

D.

Rawlings, & J.

F.

Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O.

Schilling & C.

M.

Overall, Proteome-Derived, Database- Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Pep- 25 tidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320- D325 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227- D233 (2010); Neil D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles es- 30 tando aqui incorporados em sua integridade a título de referência.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem da proteína C.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da proteína C com- preende a sequência consenso SEQ ID N°: 199, onde Xj é um aminoácido d básico como K e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X2 é um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico 5 como Q e N, um aminoácido básico como K e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M: Xjj e XÀ -are independently um ami- noácido amídico como Q e N, um aminoácido básico como K e R, um ami- noácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X5 é um aminoácido amídico como Q e N, um 10 aminoácido básico como K e R, um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido .f aromático hidrófobo como F, W e Y; X7 é um aminoácido ácido como D e E, 15 um aminoácido amídico como Q e N, um aminoácido básico como K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um-- aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

Em um outro aspecto desta modali- dade, um sÍtio de clivagem da proteína C compreende a sequência SEQ ID N°: 199, onde Xj é K, R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, 20 A,V,L,|,eM;X,éD,E,Q,N,ouK;X,éP,L,T,Q,K,ouR:X4éG,|,S,N, ou K; X5 é Q, N, K, F, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V,L,|,eM;X6éF,S,N,Q,K,ouH;X7éL,|,T,K,D,E,Q,ouN.Emoutros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem da proteína C compreen- de, por exemplo, a SEQ ID N°: 200, SEQ ID N°: 201, SEQ ID N°: 202, SEQ 25 ID N°: 203, SEQ ID N°: 204, SEQ ID N°: 205, SEQ ID N°: 206, SEQ ID N°: 207, SEQ ID N°: 208, ou SEQ ID N°: 209. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem do plasminogênio como um sítio de clivagem de inativação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem do piasminogê- 30 nio" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detec- tável na Iigação císsil pelo plasminogênio em condições adequadas para

- atividade de protease do plasminogênio.

Vislumbrou-se que qualquer se- . quência aminoacídica clivada pelo plasminogênio pode ser útil nos aspectos

° da presente invenção.

Embora sejam conhecidas algurtias exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem do plasminogê- 5 nio é X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7 (SEQ ID N°: 210), onde Xj é preferencialmente um aminoácido positivo como H, K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é preferencialmente um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou 10 um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é prefe- rencialmente um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido não car- regado como C, S, e T, um aminoácido aromático like F, W e Y, ou um ami- noácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X4 é preferencial- mente um aminoácido positivo como H, K e R, um aminoácido não carrega- 15 do como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X5 é preferencialmente um aminoácido positivo como H, K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidró- fobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é qualquer aminoácido; X7 é preferen- - cialmente H, F, Y, R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, um a-

, 20 minoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

A Tabela 4 lista SÍtiOS de clivagem de referência exemplificativos para Plasminogen (SEQ ID N°: 21 1-240). SÍtios de cIivagem do plasminogênio adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vi- de, por exemplo, O.

Schilling & C.

M.

Overall, Proteome-Derived, Database- 25 Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Pep- tidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320- D325 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil 30 D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles es- tando aqui incorporados em sua integridade a título de referência.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem do plasmino- " gênio.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do plasmino- gênio compreende a sequência consenso SEQ ID N": 211, onde Xj é um 5 aminoácido positivo como H, K e R, um aminoácido não carregado como C, . S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é um aminoácido amldico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifáti- co hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é um aminoácido amídico co- lO mo N e Q, um aminoácido não carregado como C, S, e T, um aminoácido aromático like F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; XÁ é um aminoácido positivo como H, K e R, um aminoácido

. não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X5 é um aminoácido positivo como H, K e R, um a- 15 minoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidró- fobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é qualquer aminoácido; X7 é H, F, Y, R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

Em um outro aspecto desta modali- dade, um sÍtio de cIivagem do plasminogênio compreende a sequência SEQ

- 20 IDN°:211,ondeX,éK,R,S,T,A,G,L,ouP;X,éD,E,Q,N,K,R,S,T, A,G,|ouL;X3éN,Q,S,F,Y,AouL;X4éK,R,S,A,G,L,ouV;X,éK,R, N,S,F,Y,A,l,L,P,ouV;X6éK,R,N,S,F,Y,A,G,L,PouV;X,éR,S, T, F, Y, A, G, I, L, ou P.

Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem do plasminogênio compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 21 1, 25 SEQ ID N°: 212, SEQ ID N°: 213, SEQ ID N°: 214, SEQ ID N°: 215, SEQ ID N°: 216, SEQ ID N°: 217, SEQ ID N°: 218, SEQ ID N°: 219, SEQ ID N°: 220, SEQ ID N°: 221, SEQ ID N°: 222, SEQ ID N°: 223, SEQ ID N°: 224, SEQ ID N°: 225, SEQ ID N°: 226, SEQ ID N°: 227, SEQ ID N°: 228, SEQ ID N°: 229, SEQ ID N°: 230, SEQ ID N°: 231, SEQ ID N°: 232, SEQ ID N°: 233, SEQ ID 30 N°: 234, SEQ ID N°: 235, SEQ ID N°: 236, SEQ ID N°: 237, SEQ ID N°: 238, SEQ ID N°: 239, ou SEQ ID N°: 240. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio

" de clivagem da metaloproteinase matricial-2 como um sÍtio de clivagem de . inativação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem da

" metaloproteinase matricial-2" ou "sÍtio de clivagem de MMP-2" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou 5 não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na Íigação cÍssil pela MMP-2 em condições adequadas para atividade de protease da MMP-2. Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pela MMP-2 pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam co- nhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generalizada para 10 um sÍtio de clivagem de MMP-2 é X1(P/AN/L/|)X2X3*(V/L/|/F/Q)X4X5X6 (SEQ ID N°: 241 ), onde Xj, X2, X3, )(4, X5, e X6 são qualquer aminoácido.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplificativos para MMP-2 (SEQ ID N°: 242-273). SÍtios de clivagem de MMP-2 adicionais são bastante conhe- cidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por 15 exemplo, O.

Schilling & C.

M.

Overall, Proteome-Derived, Database- Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685- 694 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Data-

, 20 base, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptida- se Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referên- cia. 25 Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem da metalopro- teinase matricial-2. Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de cIivagem da metaloproteinase matricial-2 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 241, onde Xj, X2, X3, X[, X5, e X6 são qualquer aminoácido.

Em um outro 30 aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da metaloproteinase matri- cial-2 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 241, onde Xj é um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um a-

- minoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidró- . fobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é um aminoácido ácido como D e E, . um aminoácido básico como K e R, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático 5 hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é H, um aminoácido ácido como . D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; XÀ é um aminoácido básico como K e R, um aminoácido amídico co- mo N e Q, um aminoácido não carregado como C, S, e T, um aminoácido 10 aromático como F, W, e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X5 é um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido básico como K e R, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como

W À, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é um aminoácido ácido como D e E, um aminoá- 15 cido básico como K e R, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoáci- do não carregado como C, S, e T, -ou um" aminoácido alifático hidrófobo co- mo H, G, P, A, V, L, l, e M. Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da metaloproteinase matricial-2 compreende a sequência SEQ IDN°:241,ondeX,éG,P,A,V,L,I,S,T,E,ouQ;XNG,A,L,S,N,Q,W, 20 ouK;X3éG,P,A,S,Q,D,E,ouH;X4éG,A,V,L,|,F,S,T,Q,ouK;X5é G,A,V,S,T,Q,ouK;X6éG,P,A,V,L,|,S,T,D,E,K,N,ouQ.Emum outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da metaloproteinase matricial-2 compreende a sequência SEQ ID N°: 241, onde Xj é G, A, ou L, ouQ;X2éG,A,ouS;X3éG,A,S,ouN;X4éA,V,L,|,ouK;X5éG,A,ou 25 S; X6 é G, P, A, V, L, ou D. Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem da metaloproteinase matricial-2 compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 242, SEQ ID N°: 243, SEQ ID N°: 244, SEQ ID N": 245, SEQ ID N°: 246, SEQ ID N°: 247, SEQ ID N°: 248, SEQ ID N°: 249, SEQ ID N°: 250, SEQ ID N°: 251, SEQ ID N°: 252, SEQ ID N°: 253, SEQ ID N°: 254, SEQ ID 30 N°: 255, SEQ ID N°: 256, SEQ ID N°: 257, SEQ ID N°: 258, SEQ ID N°: 259, SEQ ID N°: 260, SEQ ID N°: 261, SEQ ID N°: 262, SEQ ID N°: 263, SEQ ID N°: 264, SEQ ID N°: 265, SEQ ID N": 266, SEQ ID N°: 267, SEQ ID N°: 268,

SEQ ID N°: 269, SEQ ID N°: 270, SEQ ID N°: 271, SEQ ID N°: 272, ou SEQ ID N°:273. " Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sítio de clivagem da metaloproteinase matricial-9 como um sÍtio de clivagem de 5 inativação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem da . metaloproteinase matricial-9" ou "sÍtio de clivagem de MMP-2" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na Iigação cÍssil pela MMP-9 em condições adequadas para atividade de protease da 10 MMP-9. Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pela MMP-9 pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam co- nhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem de MMP-9 é X1X2X3X4*X5X6X7X8 (SEQ ID N°: 274), on- . de Xj é preferencialmente F, um aminoácido ácido como D e E, um aminoá- 15 cido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um ami- noácido não carregado como C,:S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é preferencialmente F, Y, S, T, um aminoá- cido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido . positivo como H, K, e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, 20 A, V, L, I, e M; X3 é preferencialmente F, Y, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifá- tico hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X4 é qualquer aminoácido; X5 é preferencialmente S, T, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido 25 amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoáci- do aromático hidrófobo como F, W, e Y, ou um aminoácido alifático hidrófo- bo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é qualquer aminoácido; X7 é qualquer aminoácido; X8 é preferencialmente F, Y, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e 30 R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifáti- co hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplificativos para MMP-9 (SEQ ID N°: 275-319). SÍtios de clivagem da MMP- 9 adicionais são bastante conhecidos na literatura ou . µ podem ser definidos por métodos rotineiros. Vide, por exemplo, S. L. Kridel, et al., Substrate Hydrolysis by Matrix Metalloproteinase-9, J. Biol. Chem. 276: 20572-20578 (2001 ); E. Y. Zhen, et al., Characterization of Metallopro- 5 tease Cleavage Products of Human Articular Cartilage, Arthritis Rheum. 58: 2420-2431 (2008); O. Schilling & C. M. Overall, Proteome-Derived, Databa- se- Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, - Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): 10 D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Data- base, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptida- se Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referên- 15 cia, Portanto, em.-:uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um SÍtiO de clivagem da metalopro- teinase matricial-9. Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem

F da metaloproteinase matricial-9 compreende a sequência consenso SEQ ID 20 N°: 274, onde Xj é F, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido a- mídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é F, Y, S, T, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e 25 R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X3 é F, Y, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não carregado co- mo C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X4 é qualquer aminoácido; X5 é S, T, um aminoácido ácido como D e E, 30 um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido aromático hidrófobo como F, W, e Y, ou um aminoácido - - alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é qualquer aminoácido;

X7 é qualquer aminoácido; X8 é F, Y, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, " um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M. Em um outro aspecto desta modali- 5 dade, um sÍtio de cIivagem da metaloproteinase matricial-9 compreende a % sequência consenso SEQ ID N°: 274, onde Xj é G, V, L, I, F, S, Q, K, ou R; X,éP,A,V,L,|,ouS:X3éG,P,A,V,L,S,Q,E,K,ouR;X4éG,P,A,V, L,F,S,N,E,ouK;X5éA,V,L,|,M,F,S,Q,ouK;X6éP,A,V,L,|,S,T, Q,E,K,ouR;X,éG,A,V,L,S,ouT:X8éG,P,A,V,L,F,T,D,E,K,ouR. 10 Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da metalopro- teinase matricial-9 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 274, on- deX1éGouL;X2éP,A,ouV;X3éP,A,R,K,ouS;X4éG;X5éA,V,L, ou|;X6éT,Q,K,ouR;X7éG,A,ouS;X8éG,P,A,V,ouE.Emoutros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem da metaloproteinase ma- 15 tricial-9 compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 275, SEQ ID N°: 276, SEQ ID N": 277, SEQ ID.N°:- 278, SEQ ID N°: 279, SEQ ID N°: 280, SEQ ID N°: . ...- .. .

281, SEQ ID N°: 282, SEQ ID N°: 283, SEQ ID N°: 284, SEQ ID N°: 285, SEQ ID N°: 286, SEQ ID N°: 287, SEQ ID N°: 288, SEQ ID N°: 289, SEQ ID

P N°: 290, SEQ ID N°: 291, SEQ ID N°: 292, SEQ ID N°: 293, SEQ ID N°: 294, _ 20 SEQ ID N°: 295, SEQ ID N°: 296, SEQ ID N°: 297, SEQ ID N°: 298, SEQ ID N°: 299, SEQ ID N°: 300, SEQ ID N°: 301, SEQ ID N°: 302, SEQ ID N°: 303, SEQ ID N°: 304, SEQ ID N°: 305, SEQ ID N°: 306, SEQ ID N°: 307, SEQ ID N°: 308, SEQ ID N°: 309, SEQ ID N°: 310, SEQ ID N°: 31 1, SEQ ID N°: 312, SEQ ID N°: 313, SEQ ID N°: 314, SEQ ID N°: 315, SEQ ID N°: 316, 25 SEQID N°: 317, SEQ ID N°:318, ou SEQ ID N°: 319. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de cIivagem de furina como um SÍtio de clivagem de inativação. Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem de furina" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não 30 adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍS- sil pela furina em condições adequadas para atividade de protease da furi- na. Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica cIivada pela Furin pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam conhecidas r algumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de ' clivagem de furina é (R/|/A)X1(R/K/NP)R*X2*X3X4X5 (SEQ ID N°: 320), onde Xj, X2, X3, X4, e X5 são qualquer aminoácido.

A Tabela 4 lista sítios de cliva- 5 gem de referência exemplificativos para furina (SEQ ID N°: 321-346). Sítios %

de clivagem da furina adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, A.

Basak, et al., lmplication of the Proprotein Convertases Furin, PC5 And PC7 in the Cleavage of Surface Glycoproteins of Hong Kong, Ebola and Respiratory 10 Syncytial Viruses: A Comparative Analysis with Fluorogenic Peptides, Bio- chem.

J. 353: 537-545 (2001 ); O.

Bader, et al., Processing of Predicted Substrates of Fungal Kex2 Proteinases from Candida albicans, C. glabrata, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, BMC Microbiol. 8: 116 (2008); O.

Schilling & C.

M.

Overall, Proteome-Derived, Database- Searchable Pep- " 15 tide Libraries for ldentifYing Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008);. Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Databa- . se, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D.

Rawlings,

_ 20 et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referência.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sítio de clivagem de furina.

Em 25 um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem de furina compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 320, onde Xj, X2, X3, )(4, e X5 são qualquer aminoácido.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem de furina compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 320, onde Xj é F, S, T, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e 30 Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, ou um aminoácido alifático hidró- fobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é G, P, M, F, Y, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, ou um aminoácido não carregado como C, S, e T; X3 é G, .d P, A, V, L, I, F, W, S, T, N, Q, D, H, K, ou R; XÁ é F, Y, um aminoácido ácido . como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um ami- 5 noácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X5 é F, Y, um a- minoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um ami- noácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M. Em . um outro aspecto desta modalidade, um sítio de clivagem de furina compre- lO ende a sequência consenso SEQ ID N°: 320, onde Xj é K, R, S ou T; X2 é D, E,S,AouG;X3éA,V,L,ou|;eX4éS,G,D,EouR;eX5éG,P,A,S,T, Q, D, ou E. Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem de furina compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 321, SEQ ID N°: 322, SEQ ID N°: 323, SEQ ID N°: 324, SEQ ID N°: 325, SEQ ID N°: 326, SEQ ID N°: 15 327, SEQ ID N°: 328, SEQ ID N°: 329, SEQ ID N°: 330, SEQ ID N": 331, SEQ ID N°: 332, SEQ ID N°: 333, SEQ ID N°: 334, SEQ ID N": 335, SEQ ID · N°: 336, SEQ ID N°: 337, SEQ ID N°: 338, SEQ ID N°: 339, SEQ ID N°: 340, SEQ ID N°: 341, SEQ ID N°: 342, SEQ ID N°: 343, SEQ ID N°: 344, SEQ ID N°: 345, ou SEQ ID N°: 346.

. 20 Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem do ativador de u-plasminogênio como um sÍtio de cIivagem de inativação. Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem do ativador de u-plasminogênio" ou "sÍtio de clivagem de u-PA" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não 25 adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍs- sil pelo u-PA em condições adequadas para atividade de protease do u-PA. Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pelo ativador de u-plasminogênio pode ser útil nos aspectos da presente invenção. Embo- ra sejam conhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generali- 30 zada para a u-PUm sÍtio de clivagem é X1X2X3(R/K)*X4*X5X6X7 (SEQ ID N°: - . 347), onde Xj é qualquer aminoácido; X2 é preferencialmente um aminoáci- do não carregado como C, S, e T, um aminoácido aromático como F, W, e

- Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é . preferencialmente um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido não " carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G,

, P, A, V, L, I, e M; X4 é qualquer aminoácido; X5 é preferencialmente um ami- 5 noácido básico como K e R, um aminoácido aromático como F, W, e Y, ou . um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é prefe- rencialmente um aminoácido não carregado como C, S, e T, um aminoácido aromático como F, W, e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M: e X7 é qualquer aminoácido.

A Tabela 4 lista sítios de cli- lO vagem de referência exemplificativos para u-PA (SEQ ID N°: 347-368). SÍ- tios de clivagem de u-PA adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, V.

Ellis, u- Plasminogen Activator. ln Handbook of Proteolytic Enzymes, págs. 1677- - 1683 (A.

J.

Barrett, N.

D.

Rawlings, & J.

F.

Woessner, eds; Elsevier, London, " 15 2nd, 2004); O.

Schilling & C.

M.

Overall, Proteome-Derived, Database- Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neii D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Pep- tidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320- D325 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, 20 Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles es- tando aqui incorporados em sua integridade a título de referência.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- 25 mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem do ativador de u-plasminogênio.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do ativador de u-plasminogênio compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 347, onde Xj é -qualquer aminoácido; X2 é um aminoácido não carregado como C, S, e T, um aminoácido aromático como F, W, e Y, ou um aminoáci- 30 do alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é um aminoácido a- mídico como N e Q, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X4 é qualquer aminoácido; X5 é um aminoácido básico como K e R, um aminoácido aromá- tico como F, W, e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é um aminoácido não carregado como C, S, e T, um aminoá- cido aromático como F, W, e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como 5 H, G, P, A, V, L, I, e M; e X7 é qualquer aminoácido.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do ativador de u-plasminogênio compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 347, onde X, é P, A, L, S, T, C,N,ouR;X2éG,P,L,Y,S,ouT:X3éG,A,S,ouN:eX4éG,A,V,|, Y,S,ouR;X5éP,V,L,F,ouR;X6éG,A,V,Y,S,ouT;eX,éG,V,L,F,Y, 10 N, ou H.

Em um outro aspecto desta modalidade, a um sÍtio de clivagem do ativador de u-plasminogênio compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 347,ondeX,éP,A,L,S,T,C,N,ouR;X2éG,Y,ouS;X3éGouS;eX4é G,A,V,|,Y,S,ouR;X5éVouR:X6éTouY;eX7éG,V,L,F,Y,N,ouH.

Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de cIivagem do ativador de " 15 u-plasminogênio compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 348, SEQ ID N°: --349, NO: 350, SEQ ID N°: 351, SEQ ID N°: 352, SEQ ID N°: 353,-.SEQ ID N°: 354, SEQ ID N°: 355, ou SEQ ID N°: 356, SEQ ID N°: 357, SEQ ID N°: 358, SEQ ID N°: 359, SEQ ID N°: 360, SEQ ID N°: 361, SEQ ID N°: 362, SEQ ID N°: 363, SEQ ID N°: 364, SEQ ID N°: 365, SEQ ID N°: 366, SEQ ID

, 20 N°: 367, ou SEQ ID N°: 368. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem do ativador de t-plasminogênio como um sítio de clivagem de inativação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem do ativador de t-plasminogênio" ou "sÍtio de clivagem de t-PA" refere-se a uma 25 Iigação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cís- sil pelo t-PA em condições adequadas para atividade de protease do t-PA.

Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pelo t-PA pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam conhecidas al- 30 gumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem de t-PA é X1X2X3(R/K)*X4*X5X6X7 (SEQ ID N°: 369), onde X2, X3, X4, X5, X6, e X7 são qualquer aminoácido.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplificativos para t-PA (SEQ ID N°: 370-373). SÍtios de clivagem de t-PA adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, H.

R.

Lijnen & D.

Collen, t-Plasminogen Activator. ln Handbook of Proteolytic Enzymes, págs. 5 1684-1689 (A.

J.

Barrett, N.

D.

Rawlings, & J.

F.

Woessner, eds; Elsevier, London, 2nd, 2004); O.

Schilling & C.

M.

Overall, Proteome-Derived, Data- base-Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Data- base, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptida- se Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referên- cia. ' Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem do ativador de t-plasminogênio.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem do ativador de t-plasminogênio compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 369, onde Xj, X2, X3, X4, X5, X6, e X7 são qualquer aminoácido.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sítio de clivagem do ativador de t- plasminogênio compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 369, onde Xj é um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X2 é um aminoácido amídico como N e Q, ou um aminoácido alifático hidró- fobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifá- tico hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; )(4 é um aminoácido aromático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X5 é um aminoácido básico como K e R, ou um aminoáci- do alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é um aminoácido alifá- tico hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X7 é um aminoácido ácido co-

" mo D e E, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sítio de clivagem do ativador de t-plasminogênio compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 369, on- deX1éA,P,C,ouN;X2éA,L,P,ouQ;X3éG,L,S,ouF;X4é|,V,M,ou 5 Y; X5 é A, V, ou K; X6 é G, V, ou P; e X7 é G, L, ou D.

Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem do ativador de t-plasminogênio compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 370, SEQ ID N°: 371, SEQ ID N°: 372, ou SEQ ID N°: 373. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio 10 de clivagem da triptase-e como um sÍtio de clivagem de inativação.

Confor- me usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem da triptase-é' ou "sítio de clivagem da prosemina" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elemen- tos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍssil pela triptase-E em condições a- 15 dequadas para atividade de protease da triptase-E.

Vislumbrou-se que qual- quer sequência aminoacídica clivada pela trjptase-E pode;ser útil nos aspec- tos da presente invenção.

Embora sejam conhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem da trjpta- se-E é *(R/K)X1X2X3X4(D/E) (SEQ ID N°: 374), onde Xj, X2, X3, e )(4, são in-

, 20 dependentemente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplificativos para triptase-E (SEQ ID N°: 375-386). SÍtios de clivagem da triptase-E adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, O.

Schilling & C.

M.

Overall, Proteome- 25 Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de ban- co de dados): D320-D325 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): 30 D227-D233 (2010); Neil D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no pre- lo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título r - de referência.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina cIostridiana ou qui-

' mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem da triptase-E.

Em um aspecto desta modalidade, um sítio de clivagem da triptase-E com- 5 preende a sequência consenso SEQ ID N°: 374, onde Xj, X2, X3, e X4, são independentemente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da triptase-E compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 374, onde Xj é I ou V; X2 é I ou V; X3 é G ou S; XÁ é G ou S.

Em outros aspectos desta mo- lO dalidade, um sÍtio de clivagem da triptase-e compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 375, SEQ ID N°: 376, SEQ ID N°: 377, SEQ ID N°: 378, SEQ ID N°: 379, SEQ ID N°: 380, SEQ ID N°: 381, SEQ ID N°: 382, SEQ ID N°: 383, SEQ ID N°: 384, SEQ ID N°: 385, ou SEQ ID N°: 386. . Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio

- 15 de clivagem da protease-7 de mastócito de camundongo como um sÍtio de clivagem de inativação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sítio de clivagem da protease-7 de mastócito de camundongo" ou "sÍtio de clivagem da mMCP-7" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reco- nhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para pro-

_ 20 teólise detectável na ligação cÍssil pela mMCP-7 em condições adequadas para atividade de protease da mMCP-7. Vislumbrou-se que qualquer se- quência aminoacídica clivada pela mMCP-7 pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam conhecidas algumas exceções, uma se- quência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem da mMCP-7 é 25 X1X2X3(KjR)*X4X5X6X7 (SEQ ID N°: 387), onde Xj é qualquer aminoácido; X2 é preferencialmente um aminoácido amídico como N ou Q, ou um aminoáci- do alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é preferencialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e )(4, X5, X6, X7 são qualquer aminoácido.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referên- . 30 cia exemplificativos para mMMCP-7 (SEQ ID N°: 388-391 ). SÍtios de cliva- gem da mMMCP-7 adicionais são bastante conhecidos na literatura ou po- dem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, O.

Schilling &

" C. M.

Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for . ldentifying Protease CIeavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); ' Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325 (2008); Neil D.

Rawlings, 5 et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010); Neil D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate CoIlection of Peptidase CIeavages in the MEROPS Database, . Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referência. 10 Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem da protease-7 de mastócito de camundongo.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da protease-7 de mastócito de camundongo compreende a se- . quência consenso SEQ ID N": 387, onde Xj é qualquer aminoácido; X2 é um " 15 aminoácido amídico como N ou Q, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X3 é um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X4, X5, X6, X7 são independentemente qualquer aminoácido.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da protease-7-de mastócito de camundongo compreende a sequência con-

. 20 senso SEQ ID N°: 387, onde Xj é qualquer aminoácido; X2 é G, S, ou Q; X3 é A, P ou S; e )(4, X5, X6, X7 são qualquer aminoácido.

Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem da protease-7 de mastócito de ca- mundongo compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 388, SEQ ID N°: 389, SEQ ID N°: 390, ou SEQ ID N°: 391. 25 Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem da enzima-l conversora de endotelina como um sÍtio de cliva- gem de inativação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de cliva- gem da enzima-l conversora de endotelina" ou "sÍtio de clivagem da ECE-I" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adja- 30 centes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍssil pela ECE-I em condições adequadas para atividade de pro- tease da ECE-I.

Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica cliva-

- da pela ECE-I pode ser útil nos aspectos da presente invenção. Embora sejam conhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generaliza- ' da para an sÍtio de clivagem da ECE-I é X1X2X3X4*(F/L/|N/Y)5X6X7 (SEQ ID N": 392), onde Xj, X2, X3, X4, X5, X6, e X7 são qualquer aminoácido. A Tabe- 5 la 4 Iista sÍtios de clivagem de referência exemplificativos para ECE-I (SEQ . ID N°: 393-412). Sítios de clivagem da ECE-I adicionais são bastante co- nhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros. Vide, por exemplo, K. Ahn & G. D. Johnson, Endothelin-Converting Enzyme-l. ln Handbook of Proteolytic Enzymes, págs. 429-434 (A- J. Barrett, N. D. Ra- lO wlings, & J. F. Woessner, eds; Eisevier, London, 2nd, 2004); O. Schilling & C. M. Overall, Proteome-Derived, Database- Searchable Peptide Libraries for ldentifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, " 15 et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227-D233 (2010): Neil-D. Rawlings, et al., A Large and

W Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referência.

_ 20 Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem da enzima-l conversora de endotelina. Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da enzima-l conversora de endotelina compreende a sequência consenso SEQ ID N": 392, onde Xj, X2, X3, Xl X5, X6, e X7 são independen- 25 temente qualquer aminoácido. Em um outro aspecto desta modalidade, um SÍtiO de clivagem da enzima-l conversora de endotelina compreende a se- quência consenso SEQ ID N°: 392, onde Xj é G, P, Y, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, ou um aminoácido não carregado como C, S, e T; X2 é F, 30 um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3

- é S, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, - um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido aromático hidrófobo ° como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; )(4 é S, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico 5 como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido aro- . mático hidrófobo como F, W e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X5 é F, W, S, C, N, E, um aminoácido positivo como H, K, e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é G, P, V, L, F, Y, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido 10 amídico como N e Q, um aminoácido positivo como H, K, e R, ou um amino- ácido não carregado como C, S, e T; e X7 é P, A, V, L, M, F, Y, S, N, D, ou K.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da enzima- l conversora de endotelina compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 392,ondeéX,G,P,Y,C,D,K,R,ouH:X2éP,L,|,F,S,C,Q,D,R,ouH; _ 15 X,éV,L,|,S,Q,K,ouR;X4éG,P,L,F,Y,W,ouR;X5éV,|,M,F,N,R, ou H; X6 é P, L, F, T, E, ou H; e X7 é7P, V, L, F, S, N, D, ou K.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sítio de clivagem da enzima-l conversora de endotelina compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 392, onde Xj é " G,D,ouH;X2é|ouF;X3éV,|,S,QouK;X4éP,F,ouW;X5é|,N,R,ou

- 20 H; X6 é L, T, ou H; e X7 é P, S, ou D.

Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem da enzima-l conversora de endotelina compreende, por exemplo,. a SEQ ID N°: 393, SEQ ID N°: 394, SEQ ID N°: 395, SEQ ID N°: 396, SEQ ID N°: 397, SEQ ID N°: 398, SEQ ID N°: 399, SEQ ID N°: 400, SEQ ID N°: 401, SEQ ID N°: 402, SEQ ID N°: 403, SEQ ID N°: 404, SEQ ID 25 N°: 405, SEQ ID N°: 406, SEQ ID N": 407, SEQ ID N°: 408, SEQ ID N°: 409, SEQ ID N°:410, SEQID N°:411, ou SEQ ID N°:412. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem da proteína do grupo sanguíneo de Kell como um sÍtio de cIiva- gem de inativação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de cliva- 30 gem da proteína do grupo sanguíneo de Kell" ou "sítio de clivagem da KBGP" refere-se a uma -ligação cÍssil junto com elementos de reconheci- mento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise

- detectável na ligação cÍssil by KBGP em condições adequadas para ativida- de de protease da KBGP.

Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoací- ' dica clivada pela KBGP pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam conhecidas algumas exceções, uma sequência consenso 5 generalizada para um sítio de clivagem da KBGP é X,X2X3X4*X5X6X7X8 (SEQ ID N°: 413), onde Xj é preferencialmente um aminoácido ácido como D e E; X2 é preferencialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é preferencialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; XÁ é preferencialmente um aminoácido aromá- lO tico como F, W, e Y; X5 é preferencialmente um aminoácido alifático hidró- fobo como H, G, P, A, V, L, l, e M; X6 é preferencialmente um aminoácido amídico como N e Q; X7 é um aminoácido não carregado como C, S, e T; X8 é preferencialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplificativos " 15 para KBGP (SEQ ID N°: 414-415). SÍtios de clivagem da KBGP adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, O.

Schiliing & C.

M.

Overall, Proteome- Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D.

Rawlings, et al.,

, 20 MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de ban- co de dados): D320-D325 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de banco de dados): D227- D233 (2010); Neil D.

Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no pre- 25 lo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integridade a título de referência.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de cIivagem da proteína do grupo sanguíneo de Kell.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de cii- 30 vagem da proteína do grupo sanguíneo de Kell compreende a sequência consenso SEQ ID N-°: 413, onde Xj é um aminoácido ácido como D e E; X2 é T ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é

- um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; )(4 é um a- minoácido aromático como F, W, e Y; X5 é T ou um aminoácido alifático hi- ' drófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X6 é um aminoácido amídico como N e Q; X7 é um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido 5 com ramificação em C-beta como I, V, ou T; X8 é um aminoácido alifático . hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

Em um outro aspecto desta modali- dade, um sÍtio de clivagem da proteína do grupo sanguíneo de Kell compre- ende a sequência consenso SEQ ID N°: 413, onde Xj é D; X2 é I, V, ou T; X3 é|,V,ouT;X4éW;X5é|,V,ouT;X6éN;X7éT;X8éP.Emoutrosaspec- 10 tos desta modalidade, um sítio de clivagem da proteína do grupo sanguíneo de Kell compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 414 ou SEQ ID N°: 415. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem da catepsina L como um sítio d.e cIivagem de inativação.' Con- forme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem da catepsina L" refe- " 15 re-se a uma ligação císsil junto com elementos de reconhecimento adjacen- tes ou não adjacentes, ou .ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍssil pela catepsina L em condições adequadas para atividade de protease da catepsina L.

Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoací- . dica clivada pela catepsina L pode ser útil nos aspectos da presente inven- 20 ção.

Embora sejam conhecidas algumas exceções, uma sequência consen- so generalizada para um sÍtio de clivagem da catepsina L é X1X2X3X4*X5X6X7X8 (SEQ ID N°: 416), onde Xj é preferencialmente W, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um a- minoácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não carregado como C, 25 S, e T, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é qualquer aminoácido; X3 é preferencialmente L, V, F ou Y; e X4, X5, X6, X7, e X8 são qualquer aminoácido.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de refe- rência exemplificativos para catepsina L (SEQ ID N": 417-443). SÍtios de clivagem da catepsina L adicionais são bastante conhecidos na literatura ou 30 podem ser definidos por métodos rotineiros.

Vide, por exemplo, J.

C.

Kelly, et al., Profiling of Calpain Activity with a Series of FRET-Based Substrates, . Biochim.

Biophys.

Acta 1794: 1505-1509 (2009); O.

Schilling & C.

M.

Ove-

rall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identif- ying Protease Cleavage Sites, Nat.

Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. " Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (edição de banco de dados): D320-D325 (2008); Neil D.

Rawlings, et al., 5 MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (edição de ban- - co de dados): D227-D233 (2010); Neil D.

Rawlings, et al., A Large and Accu- rate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Banco de dados no prelo (2010), todos eles estando aqui incorporados em sua integri- dade a título de referência. 10 Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem da catepsina L.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da catepsina L compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 416, onde Xj é W, um ami- noácido ácido como D e E, um aminoácido amídico como N e Q, um amino- " 15 ácido positivo como H, K, e R, um aminoácido não carregado como C, S, e T, ou um aminoácido'.alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X2 é qualquer aminoácido; X3 é L, V, F ou Y; e )(4, X5, X6, X7, e X8 são qualquer aminoácido.

Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem © da catepsina L compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 416, onde Xj

, 20 é G, P, A, L, Q, E, ou K; X2 é um aminoácido aromático como F, W, e Y, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; X3 é L, V, F ou Y; X4 é G, A, F, T, Q, E, K, ou R; X5 é G, A, S, um aminoácido ácido co- mo D e E, um aminoácido amídico como N e Q, ou um aminoácido positivo como H, K, e R; X6 é P, A, L, I, S, Q, um aminoácido ácido como D e E, ou 25 um aminoácido positivo como H, K, e R; X7 é um aminoácido positivo como H, K, e R, ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X8 é P, L, S, T, um aminoácido ácido como D e E, um aminoácido amí- dico como N e Q, ou um aminoácido básico como K, e R.

Em um outro as- pecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da catepsina L compreende a 30 sequência consenso SEQ ID N°: 416, onde X, é G, A, Q, E, ou K; X2 é G, P, L,ouF;X3éL,V,FouY;X4éG,A,F,T,Q,E,K,ouR;X5éA,S,Q,E,K, ouR:X6éP,A,L,|,S,ouE;X7P,L,ouR;eX8éP,L,S,ouK.Emoutros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem da catepsina L compreen- de, por exemplo, a SEQ ID N°: 417, SEQ ID N°: 418, SEQ ID N°: 419, SEQ r ID N°: 420, SEQ ID N°: 421, SEQ ID N°: 422, SEQ ID N°: 423, SEQ ID N": 424, SEQ ID N°: 425, SEQ ID N": 426, SEQ ID N°: 427, SEQ ID N°: 428, 5 SEQ ID N°: 429, SEQ ID N°: 430, SEQ ID N°: 431, SEQ ID N°: 432, SEQ ID N°: 433, SEQ ID N°: 434, SEQ ID N°: 435, SEQ ID N°: 436, SEQ ID N°: 437, . SEQ ID N°: 438, SEQ ID N°: 439, SEQ ID N°: 440, SEQ ID N°: 441, SEQ ID - N°: 442, ou SEQ ID N°: 443. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio ' 10 de clivagem de PARI como um sÍtio de clivagem de inativação.

Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem de PARI" refere-se a uma ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não

A . adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação CÍS- sil pelo PARI em condições adequadas para atividade de protease do m' d " r- 15 PARI.

Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica cIivada pela PARI pode ser útil" nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam co- , nhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem de PARI é X,X2X3X4(K/R)X5 (SEQ ID N°: 444), onde Xj

- é preferencialmente um aminoácido não poIar pequeno como A, C G, S, e T; 20 X2 é preferencialmente um aminoácido não polar grande como F, l, L, M, V, ou um aminoácido aromático como F, H, W, ou Y; X3 é preferencialmente um aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V, ou um aminoácido aro- mático como F, H, W, ou Y; X4 é preferencialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X5 é preferencialmente um amino- 25 ácido amídico como N e Q, ou um aminoácido aromático hidrófobo como F, W, ou Y.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplificativos para PARI (SEQ ID N°: 445-452). SÍtios de clivagem de PARI adicionais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por métodos rotineiros. 30 Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem de PARI.

Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem de PARI compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 444, onde Xj é um aminoácido não polar pequeno como A, C G, S, e T; X2 é um aminoácido não polar grande como . F, I, L, M, V, ou um aminoácido aromático como F, H, W, ou Y; X3 é um a- minoácido não polar grande como F, I, L, M, V, ou um aminoácido aromático 5 como F, H, W, ou Y; X4 é um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X5 é um aminoácido amídico como N e Q, ou um aminoáci- do aromático hidrófobo como F, W, ou Y.

Em um outro aspecto desta moda- lidade, um sÍtio de clivagem de PARI compreende a sequência consenso SEQ|DN°:444,ondeX,éS,T,ouG;X2éFouY;X3éL,P,ouF;X4éA, 10 G, I, ou L; e X5 é F ou N.

Em outros aspectos desta modalidade, um sítio de clivagem de PARI compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 445, SEQ ID N°: 446, SEQ ID N°: 447, SEQ ID N°: 448, SEQ ID N°: 449, SEQ ID N°: 450, SEQ ID N°: 451, ou SEQ ID N°: 452. ^ Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sítio ." 15 de cIivagem de PAR2 como um sÍtio de clivagem de inativação.

Conforme usado neste-reiatório, o termo "sÍtio de cIivagem de PAR2" refere-se a uma .. ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligaçâo CÍS- sil pelo PAR2 em condições adequadas para de atividade de protease do

. 20 PAR2. Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pelo PAR2 pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam co- nhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem de PAR2 é X,X2X3X4(K/R)X5 (SEQ ID N°: 453), onde Xj é preferencialmente um aminoácido não polar pequeno como A, C G, S, e T; 25 X2 é preferencialmente um aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V; X3 é preferencialmente um aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V; X4 é preferencialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X5 é preferencialmente um aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V.

A Tabela 4 lista sÍtios de clivagem de referência exemplificati- 30 vos para PAR2 (SEQ ID N°: 454-455). SÍtios de clivagem de PAR2 adicio- nais são bastante conhecidos na literatura ou podem ser definidos por mé- todos rotineiros.

- Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem de PAR2. Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem de PAR2 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 453, onde Xj é um aminoácido não polar 5 pequeno como A, C G, S, e T; X2 é um aminoácido não poIar grande como F, I, L, M, V; X3 é um aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V; )(4 é um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X5 é um - aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V. Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem de PAR2 compreende a sequência con- lO sensoSEQ|DN°:453,ondeX1éS;X2é|ouL;X3é|ouL;X4éAouG:X5 é L ou V. Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio de clivagem de PAR2 compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 454 ou SEQ ID N°: 455. Os aspectos. da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio H, de clivagem de PAR3 como um sÍtio de clivagem de inativação. Conforme

W " 15 usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem de PAR3" refere-se a uma ligação.ícÍssil junto com elementos de reconhecimento" adjacentes ou não - adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cís- sil pelo PAR3 em condições adequadas para atividade de protease do PAR3. Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pela , 20 PAR3 pode ser útil nos aspectos da presente invenção. Embora sejam co- nhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem de PAR3 é X,X2X3X4X5X6 (SEQ ID N°: 456), onde X, é preferencialmente um aminoácido não polar pequeno como A, C G, S, e T; X2 é preferencialmente um aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V; 25 X3 é preferencialmente um aminoácido amídico como N e Q, ou um aminoá- cido básico como K e R; X4 é preferencialmente um aminoácido não polar pequeno como A, C G, S, e T; X5 é preferencialmente um aminoácido não polar pequeno como A, C G, S, e T, ou um aminoácido polar pequeno como D, N, ou P; e X6 é preferencialmente um aminoácido ácido como D e E, ou 30 um aminoácido polar pequeno como D, N, ou P. A Tabela 4 iista sÍtios de cIivagem de referência exemplificativos para PAR3 (SEQ ID N°: 457-459). SÍtios de clivagem de PAR3 adicionais são bastante conhecidos na literatura

- ou podem ser definidos por métodos rotineiros.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- . mera de toxina cIostridiana compreende um sÍtio de clivagem de PAR3. Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem de PAR3 compreende a 5 sequência consenso SEQ ID N°: 456, onde Xj é um aminoácido não polar " pequeno como A, C G, S, e T; X2 é um aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V; X3 é um aminoácido amídico como N e Q, ou um aminoácido básico como K e R; xj é um aminoácido não polar pequeno como A, C G, S, e T: X5 é um aminoácido não polar pequeno como A, C G, S, e T, ou um 10 aminoácido poIar pequeno como D, N, ou P; e X6 é um aminoácido ácido como D e E, ou um aminoácido polar pequeno como D, N, ou P.

Em um ou- tro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem de PAR3 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 456, onde Xj é S ou T; X2 é F; X3 é N ou R; . 0

XÁ é A ou G; X5 é A,G, ou N e X6 é P ou E.

Em outros aspectos desta moda- .' 15 lidade, um sÍtio de clivagem de PAR3 compreende, por exemplo, a SEQ ID N?.:.4-57, SEQ ID N°: 458, ou SEQ ID N°: 459. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de cl,ivagem de PAR4 como um sÍtio de cIivagem de inativação.

Conforme :.a usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem de PAR4" refere-se a uma

- 20 ligação cÍssil junto com elementos de reconhecimento adjacentes ou não adjacentes, ou ambos, suficientes para proteólise detectável na ligação cÍs- sil pelo PAR4 em condições adequadas para atividade de protease do PAR4. Vislumbrou-se que qualquer sequência aminoacídica clivada pela PAR4 pode ser útil nos aspectos da presente invenção.

Embora sejam co- 25 nhecidas algumas exceções, uma sequência consenso generalizada para um sÍtio de clivagem de PAR4 é X,X2X3X4(K/R/Q/F)X5 (SEQ ID N°: 460), onde Xj é preferencialmente um aminoácido não polar pequeno como A, C G, S, e T; X2 é preferencialmente um aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V, ou um aminoácido aromático como F, H, W, ou Y; X3 é preferen- 30 cialmente um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; )(4 é preferencialmente um aminoácido alifático hidrófobo -como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X5 é preferencialmente um aminoácido básico como K e R, um

- aminoácido aromático hidrófobo como F, W, ou Y, ou um aminoácido alifáti- co hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

A Tabela 4 lista sÍtios de cIivagem " de referência exemplificativos para PAR4 (SEQ ID N°: 461- 478). SÍtios de clivagem de PAR4 adicionais são bastante conhecidos na literatura ou po- 5 dem ser definidos por métodos rotineiros.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreende um sÍtio de clivagem de PAR4. Em - um aspecto desta modalidade, um sítio de clivagem de PAR4 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 460, onde X'j é um aminoácido não polar 10 pequeno como A, C G, S, e T; X2 é um aminoácido não polar grande como F, I, L, M, V, ou um aminoácido aromático como F, H, W, ou Y: X3 é um a- minoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; )(4 é um aminoá- cido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M; e X5 é um aminoácido ± básico como K e R, um aminoácido aromático hidrófobo como F, W, ou Y, ." 15 ou um aminoácido alifático hidrófobo como H, G, P, A, V, L, I, e M.

Em um . . outro aspecto desta modalidade, um sítio de clivagem de PAR4 compreende a sequência consenso SEQ ID N°: 460, onde X, é A, G, S, ou T: X2 é F ou Y:X3éAouP;X4éAouG;eX5éA,V,P,F,W,Y,ouK.Emoutrosaspec- . tos desta modalidade, um sítio de clivagem de PAR4 compreende, por e-

20 xemplo, a SEQ ID N°: 461, SEQ ID N°: 462, SEQ ID N°: 463, SEQ ID N°: 464, SEQ ID N°: 465, SEQ ID N°: 466, SEQ ID N°: 467, SEQ ID N°: 468, SEQ ID N°: 469, SEQ ID N°: 470, SEQ ID N°: 471, SEQ ID N°: 472, SEQ ID N°: 473, SEQ ID N°: 474, SEQ ID N°: 475, SEQ ID N°: 476, SEQ ID N°: 477, ouSEQIDN°:478. 25 A localização de um sÍtio de clivagem de inativação é um aspec- to crítico que é controlado por diversos critérios.

Primeiro, a colocação do sítio de clivagem de inativação não deve afetar de forma significativa a ca- pacidade de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana de intoxicar sua célula alvo.

Conforme usado neste relatório, o termo "não afe- 30 tar de forma significativa", em relação à intoxicação, refere-se a uma toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana divulgada na presente inven- ção que ainda consegue executar o mecanismo de intoxicação completo por

- meio do qual uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana pene- tra uma célula alvo e cliva proteoliticamente um substrato alvo e abrange a ligação de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana a um complexo de receptores de baixa ou de alta afinidade, a internalização do 5 complexo toxina/receptor, a translocação da cadeia leve para o citoplasma e a modificação enzimática de um substrato alvo.

Em um aspecto desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sítio de clivagem de ina- tivação pode intoxicar uma céluia alvo na mesma extensão que a mesma 10 toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridi- ana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem a modificação no sÍtio de clivagem de inativação modification.

Em outros aspectos desta mo- dalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana compre- - + - endendo um sÍtio de clivagem de inativação pode intoxicar uma célula alvo " 15 em, por exemplo, pelo menos 5Õ°/o, 6Õ°/o, 7Õ°/o, 80%, 9Õ°/o ou 95% da exten- . " são da mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou de uma toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem a modificação do sÍtio de clivagem de inativação.

Em outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana com-

, 20 preendendo um sÍtio de clivagem de inativação pode intoxicar uma célula alvo em, por exemplo, no máximo 50%, 60°6, 70°6, 8Õ°/o, 90% ou 95% da extensão da mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem a modificação do sÍtio de clivagem de inativação. 25 Em segundo lugar, a colocação de um sÍtio de clivagem de inati- vação deve ocorrer em uma região de superfície exposta da toxina ou qui- mera de toxina clostridiana e não embutida no interior da proteína nem en- coberta por elementos estruturais secundários.

A exposição apropriada da superfície do sÍtio de clivagem de inativação facilita o acesso apropriado do 30 sÍtio ao sua protease correspondente, permitindo assim a cIivagem proteolí- tica.

A clivagem proteolítica do sÍtio de clivagem de inativação por sua pro- tease correspondente inativa substancialmente a capacidade da toxina clos-

- tridiana ou quimera de toxina clostridiana de intoxicar a célula. Conforme usado neste relatório, o termo "inativa substancialmente", em relação à into- xicação, refere-se a uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridia- na divulgada na presente invenção que, depois da clivagem em um sÍtio de 5 clivagem de inativação, tem uma capacidade reduzida de executar o meca- " nismo de intoxicação completo por meio do qual uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana penetra" uma célula alvo e cliva proteolica- - mente um substrato alvo e abrange a ligação de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana a um complexo de receptores de baixa ou de 10 alta afinidade, a internação do complexo toxina/receptor, a translocação da cadeia leve para o citoplasma e a modificação enzimática de um substrato alvo. Em um aspecto desta modalidade, a clivagem proteolítica de

W . uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na pre- +" 15 sente invenção em um sÍtio de clivagem de inativação resulta na incapaci- dade completa da toxina de intoxicar uma célula alvo em comparação com a mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém em um estado . não clivado proteoliticamente (i.e., o sÍtio de clivagem de intoxicação fica , 20 intacto ou não clivado). Em outros aspectos desta modalidade, a clivagem proteolítica de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana di- vulgada na presente invenção em um sÍtio de clivagem de inativação resulta em, por exemplo, pelo menos 10%, 2Õ°/o, 30%, 4Õ°/o, 50%, 60%, 7Õ°/o, 80%, 90% ou 95% de redução da capacidade de intoxicar uma célula alvo em 25 comparação com a mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostri- diana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém em um estado não clivado proteoliticamente. Em outros aspectos desta modalidade, a clivagem proteolítica de uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção em um sÍtio de 30 clivagem "de inativação resuita em, por exemplo, no máximo 1O°/o, 2Õ°/o, 30%, 4Õ°/o, 50%, 60°/o, 7Ó°/o, 80%, 90% -ou 95% de redução da capacidade de intoxicar uma célula alvo em comparação com a mesma toxina clostridia-

na ou quimera de toxina cIostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana similar, porém em um estado não clivado proteolitica- mente.

Em um aspecto da presente invenção, um sÍtio de clivagem de 5 inativação é localizado no interior de uma região de sítio de clivagem de ina-

- tivação.

Conforme usado neste relatório, o termo "região sÍtio de clivagem de inativação" refere-se a uma sequência aminoacídica de uma toxina clos- . tridiana ou quimera de toxina clostridiana que pode ser modificada de forma a conter um sÍtio de clivagem de inativação porque tal modificação não vai 10 romper significativamente a capacidade da proteína de intoxicar uma célula alvo; e com exposição a sua protease cognato, o sÍtio de clivagem de inati- vação será clivado e inativará significativamente a toxina cIostridiana ou . quimera de toxina clostridiana.

A localização de um sítio de clivagem de ina- tivação pode ser qualquer local no interior de uma região de sÍtio de cliva-

- 15 gem de inativação, com a condição de que tal localização afete significati- vamente a capacidade da toxina clostridiana ou q,uimera de toxina clostridia- ' na de intoxicar uma céjula alvo; e com exposição a sua protease cognata, a clivagem do sítio de clivagem de inativação inativará significativamente a toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana.

A Tabela 5 relaciona 20 regiões de sÍtio de clivagem de inativação exemplificativas adequadas para uso com uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compreende um 25 sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação.

Nos aspectos desta modalidade, uma toxina clos- tridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de cIivagem de inativação do domínio de translocação 30 ou do subdomínio Hcn.

Em outros aspectos desta modalidade, uma toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compre-

· ende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os aminoáci- dos 462-496 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 458-492 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 464-487 de SEQ 5 ID N°: 6, SEQ ID N": 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; OS aminoácidos 463-496 de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 458-491 de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 434-467 de ~ SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 453-486 de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 458- 10 491 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 475-508 de SEQ ID N°: 22; os ami- noácidos 443-476 de SEQ ID N°: 23; ou os aminoácidos 434-467 de SEQ ID N°:24ouSEQIDN°:25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostri- - diana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção -' 15 compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interi- or de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os a" minoácidos 618-634 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 614-630 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 605-621 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°:

_ 20 10; os aminoácidos 613-629 de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; os amino- ácidos 609-625 de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 587- 603 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 604-620 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 605- 621 de SEQ ID N°: 19 ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 610-626 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 25 627-643 de SEQ ID N°: 22; os aminoácidos 596-612 de SEQ ID N°: 23; ou os aminoácidos 587-603 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25.

l Tabela 5. Regiões de sitio decliwgem de jnatmção de toxinas clostridianas m á |SEQÍD Regões de sÍtio de clivagem ! Taxina Nq 1 2 3 4 5 6 7 8 . : BONT/A 1 L462- T618- G638- L665- N752- N826- T844- K871= L496 1634 D651 N687 N765 D835 L863 A895 : BoNT/B 2 L464- P487 A605- V621 '"aií"" ' L652- N638 N674 N739- D752 N813- A824 Y831- 1850 S858- G882 !BoNT/C1| 3 1 L463" 1613-1629 , G633- I L660- j K747- H821- S839- N866- I , S496 , , N646 , E682 l Q760 D830 , K858 I n890 I ,BoNTDj 4 II l458- s491 |16094625 , , I g629- n642 I, l656- e678 I I k743= q756 h817- d826 I, s835- k854 I n862- | n886I I

E

F iBoNT/E| 5 | d467 l434- II a587- v603 I{ g607- n620 I I n659 II l634- d739 n724- i q809 II h800- 1837 t818- II k845- d869 I | |'°"" | ' I 5'4'8'6" I :::: I = I :6:" i :::: i :::" I = I = I

È i / l458- s610- g63q- m657- n744- n818- h836- s863- | jBoNTg 7 s491 1626 n643 n679 d757 n827 1855 g887 i TeNT I 8 I l475- s508 I s627- v643 I g647- n660 I l674- q696 k761- e774 |l n835- k844 I v854- v871 I v879- n903 I ' | I l443- I a596- l g616- I l643- n733- n809= I t828- I k855- ' BaNT , 9 I n476 I v612 I n629 I s668' n748 , p819 I !847 l g879

L l434- a587- g607- l634- n724- h800- t818- k845- BuNT 10 d467 v603 n620 s659 d739 q809 1837 d869

A Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostri- diana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interi- or de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os a- 5 minoácidos 638-651 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N": 2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 634-647 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 625-638 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N": 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10: os aminoácidos 633-646 de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N": 12; os amino- ácidos 629-642 de SEQ ID N": 13 ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 607- . 10 620 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 624-637 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 625- 638 de SEQ ID N°: 19 ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 630-643 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 647-660 de SEQ ID N°: 22; os aminoácidos 616-629 de SEQ ID N°: 23; ou os aminoácidos 607-620 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25.

15 Em outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compre- ende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os aminoáci-

dos 665-687 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 661-683 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 652-674 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; OS aminoácidos 660-682 de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 5 656-678 de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 634-659 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 651-676 - de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 652- 677 de SEQ ID N°: 19 ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 657-679 de SEQ ID N°: 21; os aminoáçidos 674-696 de SEQ ID N°: 22; os aminoácidos 643-668 de SEQ ID N°: 23; ou os amino- lO ácidos 634-659 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compre- ende um sítio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de - uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os aminoáci-

-. 15 dos 752-765 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 748-761 de SEQ I-D N°: 3; os aminoácidos 739-752 de SEQ " ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10: OS aminoácidos 747-760 de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 743-756 de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 724-739 de 20 SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 741-756 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 742- 757 de SEQ ID N°: 19 ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 744-757 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 761-774 de SEQ ID N°: 22; os aminoácidos 733-748 de SEQ ID N°: 23; ou os amino- ácidos 724-739 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. 25 Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostri- diana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica Iocalizado no interi- or de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os a- minoácidos 826-835 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ 30 ID N°: 5; os aminoácidos 824-831 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 813-824 de SEQ ID N°: 6, SEQ.ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 821-830 de SEQ ID N": 11 ou SEQ ID N°: 12; os amino-

- ácidos 817-826 de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 800- 809 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 817-826 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 818-827 de SEQ ID N°: 19 ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 818-827 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 5 835-844 de SEQ ID N°: 22; os aminoácidos 809-819 de SEQ ID N°: 23; ou 4 os aminoácidos 800-809 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostri- ' diana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interi- lO or de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os a- minoácidos 844-863 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 840-859 de SEQ ID N°: 3;; os aminoácidos 831 - 850 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 839-858 de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; os _" 15 aminoácidos 835-854 de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 818-837 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; os aminoáci- dos 835-854 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 836- 855 de SEQ ID N°: 19 ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 836-855 de SEQ ID N": 21; os aminoáci- dos 854-871 de SEQ ID N°: 22; os aminoácidos 828-847 de SEQ ID N°: 23;

_ 20 ou os aminoácidos 818-837 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N": 25. Em outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana divulgada na presente invenção compre- ende um sÍtio de cIivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os aminoáci- 25 dos 871-895 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 867-891 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 858-882 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 866-890 de SEQ ID N°: 11 ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 862-886 de SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 14: os aminoácidos 845-869 de 30 SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 862-886 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 863- 887 de SEQ ID N°: 19 ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 863-887 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 879-903 de SEQ ID N°: 22; os aminoácidos 855-879 de SEQ ID N°: 23: ou os amino- ácidos 845-869 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ ID N°: 25. Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/A ou quime- ra de BONT/A divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de cli- 5 vagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de ~ clivagem de inativação from o domínio de translocação ou o subdomínio Hcn.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BoNT/A ou quimera de BoNT/A divulgada na presente invenção compreende um sítio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de cliva- lO gem de inativação compreendendo os aminoácidos 462-496, 618-634, 638- 651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863, ou 871-895 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N": 2, SEQ ID·N°: 4 ou SEQ ID N°: 5; ou compreendendo os amino- ácidos 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822-831, 840-859, ou 867- 891 de SEQ ID N°: 3. Em ainda outros aspectos desta modalidade, " 15 uma BONT/A compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação localizado na região de sítio de cIivagem de inativação é codificada pela SEQ ID N°: 530, SEQ ID N": 532, SEQ ID N°: 534, ou SEQ ID N°: 536. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma BONT/A compreendendo um sÍtio de cliva- gem de inativação localizado na região de sÍtio de clivagem de inativação 20 compreende as SEQ ID N°: 531, SEQ ID N°: 533, SEQ ID N°:. 535, ou SEQ - ID N°: 537. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BoNT/B ou quimera de BoNT/B divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de 25 sítio de clivagem de inativação from o domínio de translocação ou o subdo- mínio Hcn.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/B ou quimera de BONT/B divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de cliva- gem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sítio de clivagem de inativação compreendendo os aminoácidos 464-487, 605-621, 30 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850, ou 858-882 de SEQ ID N°: 6, SEQID N°:7, SEQID N°:8,SEQID N°:9,ouSEQID N°: 10. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/CI ou

- quimera de BONT/CI divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação from o domínio de translocação ou o subdo- mínio Hcn. Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/CI ou quime- 5 ra de BoNT/CI divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de cli- " vagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os aminoácidos 463-496, 613-629, 633- 646, 660-682, 747-760, 821 -830, 839-858, ou 866-890 de SEQ ID N°: 11ouSEQIDN°:12. 10 Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/D ou quime- ra de BONT/D divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de cIi- . vagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sítio de cIivagem de inativação from o domínio de translocação ou o subdomínio » Hcn. Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/D ou quimera de -" 15 BONT/D divulgada na presente invenção compreende um sítio de clivagem de inativação que fica-localizado no interior de uma região de sÍtio de cliva- '- . ----- ,-.. gem de inativação compreendendo os aminoácidos 458-491, 609-625, 629- 642, 656-678, 743- 756, 817-826, 835-854, ou 862-886 de SEQ ID N°: 13 ou - SEQIDN°:14.

- 20 Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/E ou quime- ra de BONT/E divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de cIi- vagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sítio de clivagem de inativação from o domínio de translocação ou o subdomínio Hcn. Em outros aspectos desta modaiidade, uma BONT/E ou quimera de 25 BONT/E divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sítio de cliva- gem de inativação compreendendo os aminoácidos 434-467, 587-603, 607- 620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837, ou 845-869 de SEQ ID N°: 15, SEQIDN°:16,ouSEQIDN°:17. 30 Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/F ou quime.ra de BoNT/F divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de

- sÍtio de clivagem de inativação from o domínio de translocação ou o subdo- mlnio Hcn.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/F ou quimera de BoNT/F divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de cliva- gem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sítio de C 5 clivagem de inativação compreendendo os aminoácidos 453-486, 604-620, ~

624-637, 651-676, 741 -756, 817-826, 835-854, ou 862-886 de SEQ ID N°: 18; ou compreendendo os aminoácidos 453-486, 605-621, 625-638, 652- 677, 742-757, 818-827, 836-855, ou 863-887 de SEQ ID N°: 19 ou SEQ ID N°: 20. 10 Em um outro aspecto desta modalidade, uma BONT/G ou qui- mera de BONT/G divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação from o domínio de translocação ou o subdomínio Hcn.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BONT/G ou quimera de ." 15 BONT/G divulgada na presente invenção compreende um sítio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de cliva- gem de inativação compreendendo os aminoácidos 458-491, 610-626, 630- 643, 657-679, 744- 757, 818-827, 836-855, ou 863-887 de SEQ ID N°: 21. Em um outro aspecto desta modalidade, uma TeNT ou quimera

, 20 de TeNT divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de cliva- gem de inativação from o domínio de translocação ou o subdomínio Hcn.

Em outros aspectos desta modalidade, uma TeNT ou quimera de TeNT divulga- da na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação 25 que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de cIivagem de inativa- ção compreendendo os aminoácidos 475-508, 627-643, 647-660, 674-696, 761 -774, 835-844, 854-871, ou 879-903 de SEQ ID N°: 22. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BaNT ou quimera de BaNT divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de 30 clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação from o domínio de translocação ou o subdomínio Hcn.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BaNT ou quimera de

· BaNT divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os aminoácidos 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847, ou 855-879 de SEQ ID N°: 23. 5 Em ainda um outro aspecto desta modalidade, uma BuNT ou 4 quimera de BuNT divulgada na presente invenção compreende um sÍtio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação from o domínio de translocação ou o subdomínio Hcn.

Em outros aspectos desta modalidade, uma BuNT ou quimera de 10 BuNT divulgada na presente invenção compreende um sitio de clivagem de inativação que fica localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os aminoácidos 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837, ou 845-869 de SEQ ID N°: 24 ou SEQ - ID N°: 25. -" " 15 Em um aspecto da presente invenção, uma toxina clostridiana

" ou quimera de toxina ciostridiana compreendendo um sÍtio de cIivagem de- inativação tem uma margem de segurança maior que a margem de segu- rança para a mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem

_ 20 o sÍtio de clivagem de inativação.

Em outras palavras, a adição de um sÍtio de clivagem de inativação aumenta a margem de segurança da toxina clos- tridiana ou quimera de toxina clostridiana em relação à mesma toxina clos- tridiana ou quimera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inati- 25 vação adicional.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina cIostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativa- ção tem uma margem de segurança que é maior em relação à mesma toxi- na clostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridiana 30 ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de

- inativação.

Nos aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativa-

" ção tem uma margem de segurança que é maior que, por exemplo, pelo menos 1O°/o, pelo menos 20%, pelo menos 3Õ°/o, pelo menos 40%, pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 8Ô°/o, pelo menos 90%, pelo menos 100%, 110%, pelo menos 120%, pelo menos 13Ô°/o, pelo r 5 menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo K.

menos 180%, pelo menos 190%, pelo menos 200%, 210%, pelo menos 220%, pelo menos 230%, pelo menos 240%, pelo menos 250%, pelo menos 260%, pelo menos 270%, pelo menos 280%, pelo menos 290%, ou pelo menos 300%, em relação à mesma toxina cIostridiana ou quimera de toxina 10 clostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana si- milar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação. Em outros aspectos.des- ta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana

W compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior que, por exemplo, no máximo 1O°/o, no máximo 2O°/,, J 15 no máximo 30°6, no máximo 40°/o, no máximo 5Õ°/o, no máximo 60%, no máxi.mo 70%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 90%, no máximo 1OO°/o, 110%, no máximo 120%, no máximo 130%, no máximo 140%, no máximo 150°6, no máximo 160%, no máximo 170%, no máximo 180%, no máximo 190%, no máximo 200%, 210%, no máximo 220%, no máximo 230%, no máximo _ 20 240%, no máximo 250%, no máximo 260%, no máximo 270%, no máximo 280%, no máximo 290%, ou no máximo 300%, em relação à mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de ina- tivação. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridia- 25 na ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior que, por exem- plo, cerca de 1O°/o a cerca de 300%, cerca de 2Õ°/o a cerca de 300%, cerca de 3Õ°/o a cerca de 300%, cerca de 4Õ°/o a cerca de 300%, cerca de 50% a cerca de 300%, cerca de 6Ó°/o a cerca de 300%, cerca de 7Ó°/o a cerca de 30 300%, cerca de 80% a cerca de 300%, cerca de 9Ó°/o a cerca de 300%, ou cerca de 1OO°/o a cerca de 300%, em relação à mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de to-

- xina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação. Em outros aspectos embodiment, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de ina- tivação tem uma margem de segurança que é maior que, por exemplo, pelo

T 5 menos 1 vez, pelo menos 1 vez, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, " · pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes, em relação à mes- ma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou uma toxina clos- tridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de cliva- lO gem de inativação. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior que, por , exemplo, pelo menos 1 vez, no máximo 1 vez, no máximo 3 vezes, no má- -

Y ximo 4 vezes, no máximo 5 vezes, no máximo 6 vezes, no máximo 7 vezes, ,- 15 no máximo 8 vezes, no máximo 9 vezes, ou no máximo 10 vezes, em rela- ':·:çã"o à mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana.-.ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sítio de clivagem de inativação. Em ainda outros aspectos desta modalida- de, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreenden- 20 do um sÍtio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior que, por exemplo, cerca de 1 vez a cerca de 10 vezes, cerca de 1 vezes a cerca de 9 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 8 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 7 vezes, cerca de 1 vezes a cerca de 6 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 5 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 10 vezes, cerca de 2 vezes a 25 cerca de 9 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 8 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 7 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 6 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 5 vezes. Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreende a adição de um sÍtio de clivagem de inati- 30 vação que aumenta a margem de segurança da toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana em relação à mesma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina

- clostridian,a similar, porém sem o sÍtio de cIivagem de inativação adicional. Nos aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxi- \ na clostridiana compreende a adição de um sÍtio de clivagem de inativação que aumenta a margem de segurança da toxina clostridiana ou quimera de 5 toxina clostridiana em relação à mesma toxina clostridiana ou quimera de . toxina clostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridi- ana similar, porém sem o sítio de clivagem de inativação adicional em, por exemplo, pelo menos 1O°/j, pelo menos 2Ó°/o, pelo menos 3Õ°/o, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 10 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130°6, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190%, pelo menos 200%, 210%, pelo menos 220%, pelo menos 230%, pelo menos 240%, pelo menos 250%, pelo menos 260%, pelo menos 270%, pelo menos 280%, pelo menos _" 15 290%, ou pelo menos 300%. Em outros aspectos desta modalidade, uma -,."- -.."- toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana compre.ende a adição

X de um sítio de clivagem de inativaçã9 que aumenta a margem de segurança da toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana em relação à mesma toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridi- 20 ana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional em, por exemplo, no máximo 1O°/o, no máximo 2O°/,, no máximo 3Õ°/o, no máximo 40%, no máximo 5Õ°/o, no máximo 60%, no máximo 70%, no máximo 8Õ°/o, no máximo 9Õ°/o, no máximo 100%, 110%, no máximo 120%, no máximo 130%, no máximo 140%, no máximo 150%, 25 no máximo 160%, no máximo 170%, no máximo 180%, no máximo 190%, no máximo 200%, 210%, no máximo 220%, no máximo 230%, no máximo 240%, no máximo 250%, no máximo 260%, no máximo 270%, no máximo 280%, no máximo 290%, ou no máximo 300%. Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana 30 compreende a adição de um sítio de clivagem de inativação que aumenta a margem de segurança da toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridia- na em relação à mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana

- ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana simiiar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional em, por exemplo, cerca de 1O°/o a cerca de 300%, cerca de 2Õ°/o a cerca de 300%, cerca de 3Ó°/o a cer- ca de 300%, cerca de 40% a cerca de 300%, cerca de 50% a cerca de 5 300%, cerca de 60% a cerca de 300%, cerca de 70% a cerca de 300%, cer- ca de 80% a cerca de 300%, cerca de 90% a cerca de 300%, ou cerca de 1OO°/o a cerca de 300%. Em outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreende a adição de um sÍtio de cliva- lO gem de inativação que aumenta a margem de segurança da toxina cIostridi- ana ou quimera de toxina clostridiana em relação à mesma toxina clostridia- na ou quimera de toxina cIostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação - adicional em, por exemplo, pelo menos 1 vez, pelo menos 1 vez, pelo me- ," 15 nos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9:·vezes, ou pelo me- nos 10 vezes.

Em ainda outros aspectos desta modalidade; uma toxina clos- tridiana ou quimera de toxina clostridiana compreende a adição de um sÍtio de clivagem de inativação que aumenta a margem de segurança da toxina

_ 20 clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana em relação à mesma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de ina- tivação adicional em, por exemplo, no máximo 1 vez, no máximo 3 vezes, no máximo 4 vezes, no máximo 5 vezes, no máximo 6 vezes, no máximo 7 ve- 25 zes, no máximo 8 vezes, no máximo 9 vezes, ou no máximo 10 vezes.

Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina ciostridiana compreende a adição de um sÍtio de clivagem de inati- vação que aumenta a margem de segurança da toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana em relação à mesma toxina cIostridiana ou qui- 30 mera de toxina clostridiana ou uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional em, por exemplo, cerca de 1 vez a cerca de 10 vezes, cerca de 1 vez a cer-

ca de 9 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 8 vezes, cerca de 1 vezes a cerca de 7 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 6 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 5 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 10 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 9 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 8 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 7 5 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 6 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 5 vezes. Em uma outra modalidade, uma região de sÍtio de clivagem de inativação pode ser modificada de forma a incluir um único sÍtio de clivagem de inativação. Em ainda uma outra modalidade, uma região de sÍtio de cli- lO vagem de inativação pode ser modificada de forma a incluir uma pluralidade de sítios de clivagem de inativação cleavage sites. Nos aspectos desta mo- dalidade, uma região de sítio de clivagem de inativação pode compreender, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 sÍtios de clivagem de

W inativação. Em outros aspectos desta modalidade, uma região de sÍtio de - 15 clivagem de inativação pode compreender, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 sÍtios de clivagem de inativaçãoi Em ainda outros as- pectos desta modalidade, uma região de sÍtio de clivagem de inativação po- de compreender, por exemplo, 2-10 sÍtios de clivagem de inativação, 2-8 sÍtios de clivagem de inativação, 2-6 sítios de clivagem de inativação, 2-4 . 20 sÍtios de clivagem de inativação, 2-3 sÍtios de clivagem de inativação, 3-9 sÍtios de clivagem de inativação, 3-7 sÍtios de clivagem de inativação, 3-5 sÍtios de clivagem de inativação, ou 3-4 sÍtios de clivagem de inativação. Em uma outra modalidade, uma região de sÍtio de clivagem de inativação pode ser modificada de forma a incluir um único tipo de sÍtio de clivagem de 25 inativação, tal como, por exemplo, um sÍtio de cIivagem de trombina. Em ainda uma outra modalidade, uma região de sÍtio de cIivagem de inativação pode ser modificada de forma a incluir uma pluralidade de tipos diferentes de sÍtios de clivagem de inativação, tais como, por exemplo, um sÍtio de cli- vagem de trombina, um sÍtio de clivagem do fator Xa, um sÍtio de clivagem 30 da MMP-2, e um sÍtio de ciivagem da MMP-9. Nos aspectos desta modali- dade, uma região de sÍtio de clivagem de inativação pode compreender, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, ou 5 tipos diferentes de sÍtios de clivagem de inativação.

Em outros aspectos desta modalidade, uma região de sÍtio de clivagem de inativação pode compreender, por exemplo, no máximo 2, 3, 4, ou 5 tipos diferentes de sÍtios de clivagem de inativação.

Em outros aspec- tos desta modalidade, uma região de sÍtio de clivagem de inativação pode 5 compreender, por exemplo, 2-5 tipos diferentes de sÍtios de cIivagem de ina- tivação, 2-4 tipos diferentes de sÍtios de clivagem de inativação, 2-3 tipos diferentes de sÍtios de clivagem de inativação, 3-5 tipos diferentes de sÍtios de clivagem de inativação, ou 3-4 tipos diferentes de sÍtios de clivagem de inativação. 10 A modificação de uma região de sÍtio de clivagem de inativação de forma a incluir um sÍtio de clivagem de inativação pode ser realizada alte- rando-se pelo menos um dos aminoácidos no interior da região de sÍtio de cIivagem de inativação.

Exemplos não limitativos de uma alteração de ami- - noácido incluem uma deleção de aminoácido, uma adição de aminoácido, ." 15 ou uma substituição de um aminoácido original por um aminoácido diferente.

Nos aspectos desta modalidade, uma região d,e:'-s"Ítio de clivagem de inativa- ção é modificado de forma a incluir um sÍtio de clivagem de inativação alte- rando-se, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos no interior da região de sítio de clivagem de inativação.

Em outros aspectos desta mo-

. 20 dalidade, uma região de sÍtio de clivagem de inativação é modificado de forma a incluir um sitio de cIivagem de inativação alterando-se, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos no interior da região de sÍtio de cli- vagem de inativação.

Em ainda outras aspectos desta modalidade, uma re- gião de sÍtio de clivagem de inativação é modificado de forma a incluir um 25 sÍtio de clivagem de inativação alterando-se, por exemplo, 1-5 aminoácidos no interior da região de sÍtio de clivagem de inativação, 1-4 aminoácidos no interior da região de sÍtio de clivagem de inativação, 1-3 aminoácidos no in- terior da região de sÍtio de clivagem de inativação, 1-2 aminoácidos no inte- rior da região de sÍtio de clivagem de inativação, 2-5 aminoácidos no interior 30 da região de sÍtio de clivagem de inativação, 2-4 aminoácidos no interior da região de sÍtio de cIivagem de inativação, 2-3 aminoácidos no interior da re- gião de sÍtio de clivagem de inativação, 3-5 aminoácidos no interior da regi-

· ão de sÍtio de clivagem de inativação, ou 4-5 aminoácidos no interior da re- gião de sÍtio de clivagem de inativação.

Nos aspectos desta modalidade, uma região de sítio de cliva- gem de inativação é modificado de forma a incluir um sÍtio de clivagem de 5 inativação por deleção, adição, substituição, ou qualquer combinação das mesmas, por exemplo, de pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos no iriteri- or da região de sÍtio de cIivagem de inativação.

Em outros aspectos desta modalidade, uma região de sÍtio de clivagem de inativação é modificado de forma a incluir um SÍtiO de clivagem de inativação por deleção, adição, subs- lO tituição, ou qualquer combinação das mesmas, por exemplo, de no máximo 1, 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos no interior da região de sÍtio de cIivagem de ina- tivação.

Em ainda outras aspectos desta modalidade, uma região de sÍtio de clivagem de inativação é modificado de forma a incluir um sÍtio de clivagem - . de inativação por deleção, adição, substituição, ou qualquer combinação ," 15 das mesmas, por exemplo, de 1-5 aminoácidos no interior da região de sÍtio de clivagem de inativação, 1-4 aminoácidos-no interior da região de sÍtio de clivagem de inativação, 1-3 aminoácidos no interior da região de sÍtio de cli- vagem de inativação, 1-2 aminoácidos no interior da região de sÍtiõ de cliva- gem de inativação, 2-5 aminoácidos no-interior da região de sítio de cliva-

_ 20 gem de inativação, 2-4 aminoácidos no interior da região de sÍtio de cliva- gem de inativação, 2-3 aminoácidos no interior da região de sÍtio de cliva- gem de inativação, 3-5 aminoácidos no interior da região de sÍtio de cliva- gem de inativação, ou 4-5 aminoácidos no interior da região de sÍtio de cli- vagem de inativação. 25 A modificação de uma região de sÍtio de clivagem de inativação de forma a incluir um sÍtio de clivagem de inativação pode ser feita usando- se procedimentos tradicionais de mutagenênese conhecidos pelo especialis- ta na técnica.

Exemplos não limitativos de procedimentos de mutagênese, assim como de reagentes, condições e protocolos já bem caracterizados r

30 encontram-se facilmente disponíveis em fornecedores comerciais que inclu- em, sem limitação, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, lnc., Carlsbad, CA; QIAGEN, lnc.,

Valencia, CA: e Stratagene, La JoIla, CA.

Esses protocolos são procedimen- tos rotineros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados nesta invenção- Como mencionado acima, as toxinas clostridianas e quimeras 5 de toxina clostridiana divulgadas na presente invenção são transladadas como poIipeptídios de cadeia simples que são subsequentemente clivados por cisão proteolítica em uma região de alça dissulfeto.

Este processamento pós-translacional produz uma molécula de cadeia dupla mantida unida por uma ligação dissulfeto simples e interações não covalentes.

A cisão proteolí- 10 tica em uma região de alça dissulfeto pode ser obtida usando-se os sítios de clivagem da protease endógena de ocorrência natural na região de alça de cadeia dupla, ou por engenharia da região de alça de cadeia dupla de forma d a compreender um sítio de clivagem da protease exógena. -

Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, uma re- ." 15 gião de alça de cadeia dupla.

Conforme usado neste relatório, o termo "re- giào de alça de cadeia dupla" refere-se a uma sequência aminoacídica de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana flanqueada por aminoácidos cisteína e contendo um sÍtio de clivagem da protease usado - para converter a forma de cadeia simples de uma toxina clostridiana ou

, 20 quimera de toxina clostridiana em sua forma de cadeia dupla (Tabela 6). Exemplos não limitativos de uma região de alça de cadeia dupla incluem uma região de alça de cadeia dupla de BONT/A compreendendo os aminoá- cidos 430-454 de SEQ ID N": 1; uma região de alça de cadeia dupla de BoNT/B compreendendo os aminoácidos 437-446 de SEQ ID N°: 2: uma 25 região de alça de cadeia dupla de BONT/CI compreendendo os aminoáci- dos 437-453 de SEQ ID N°: 3; uma região de alça de cadeia dupla de BoNT/D compreendendo os aminoácidos 437-450 de SEQ ID N°: 4; uma região de alça de cadeia dupla de BONT/E compreendendo os aminoácidos 412-426 de SEQ ID N°: 5; uma região de alça de cadeia dupla de BONT/F 30 compreendendo os aminoácidos 429-445 de SEQ ID N°: 6; uma região de alça de cadeia dupla de BoNT/G compreendendo os aminoácidos 436-450 de SEQ ID N°: 7; e uma região de alça de cadeia dupla de TeNT compreen-

W 251/316 ir- · 'k

"'2 " aminoácidos 437-453 de SEQ ID N°: 3; uma região da alça da cadeia dupla da BoNT/D compreendendo os aminoácidos 437-450 de SEQ ID N°: 4; uma região da alça da cadeia dupla da BoNT/E compreendendo os aminoácidos 412-426 de SEQ ID N°: 5; uma região da alça da cadeia dupla da BONT/F 5 compreendendo os aminoácidos 429-445 de SEQ ID N°: 6; uma região da alça da cadeia dupla da BoNT/G compreendendo os aminoácidos 436-450 de SEQ ID N°: 7; ou uma região da alça da cadeia dupla da TeNT compre- endendo os aminoácidos 439-467 de SEQ ID N°: 8. Uma região da alça da cadeia dupla da BaNT compreendendo os aminoácidos 421-435 de SEQ ID 10 N°: 9; ou uma região da alça da cadeia dupla da BuNT compreendendo os aminoácidos 412-426 de SEQ ID.

N°: 10. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla endógena.

Conforme usa- . do neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia " 15 dupla endógena" é sinônimo de um "sÍtio de cIivagem da protease de alça de cadeia dupla de ocorrên'cia natural" e refere-se a um sÍtio de clivagem da protease de ocorrência natural encontrado na região de alça de cadeia du- pla de uma toxina clostridiana de ocorrência natural ou quimera de toxina clostridiana e inclui, sem limitação, variantes de ocorrência natural de sÍtio

_ 20 de cIivagem da protease de alça de cadeia dupla de toxina clostridiana, tais como, por exemplo, isoformas de sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de toxina clostridiana e subtipos de sÍtio de clivagem da prote- ase de alça de cadeia dupla de toxina clostridiana.

Exemplos não limitativos de um sÍtio de clivagem da protease endógena, incluem, por exemplo, um 25 sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de BoNT/A, um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de BoNT/B, um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de BoNTICI, um sÍtio de cli- vagem da protease de alça de cadeia dupla de BONT/D, um sÍtio de cliva- gem da protease de alça de cadeia dupla de BONT/E, um sÍtio de clivagem 30 da protease de alça de cadeia dupla de BONT/F, um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de BoNT/G e um sÍtio de clivagem da pro- tease de alça de cadeia dupla de TeNT.

r

~N

'W

Embora a identidade da protease ainda seja desconhecida, o sÍ- tio de cIivagem da protease de alça de cadeia dupla para muitas toxinas clostridianas já foi determinado.

Nas BONTS, a clivagem em K448-A449 converte a forma de polipeptídio simples da BONT/A na forma de cadeia du- 5 pla; a clivagem em K441 -A442 converte a forma de poIipeptídio simples da BONT/B na forma de cadeia dupla; a clivagem em K449-T450 converte a forma de polipeptídio simples da BONT/CI na forma de cadeia dupla; a cli- vagem em R445-D446 converte a forma de polipeptídio simples da BONT/D na forma de cadeia dupla; a clivagem em R422-K423 converte a formá de 10 polipeptídio simples da BONT/E na forma de cadeia dupla; a clivagem em K439-A440 converte a forma de poIipeptídio simples da BONT/F na forma de cadeia dupla; e a clivagem em K446-S447 converte a forma de polipeptídio simples da BONT/G na forma de cadeia dupla.

A clivagem proteolítica da e forma de polipeptídio simples da TeNT em A457-S458 resulta na forma de " 15 cadeia dupla.

A clivagem proteolítica da forma de poIipeptídio simples da BaNT em K431-N432-resulta na forma de cadeia dupla.

A clivagem proteolí- tica da forma de polipeptídio simples da BuNT em R422-K423 resulta na forma de cadeia dupla.

Tal sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla é operacionalmente ligado a uma toxina clostridiana ou quimera de 20 toxina clostridiana como uma proteína de fusão.

No entanto, deve-se obser- var também que sítios de clivagem adicionais na alça de cadeia dupla tam- bém parecem ser cIivados resultando na criação de um fragmento peptídico pequeno perdido.

Como um exemplo não limitativo, a clivagem de um poli- peptídio de cadeia simples de BONT/A resulta essencialmente na perda de 25 um fragmento de dez aminoácido na alça de cadeia dupla.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compreende uma região de alça de cadeia dupla incluindo um sÍtio de clivagem da prote- ase de alça de cadeia dupla endógena.

Nos aspectos desta modalidade, um 30 sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla endógena locazido no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de BONT/A, um sÍtio de cIivagem da protease de alça de cadeia dupla de BONT/B, um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de BONT/CI, um sÍtio de cli- vagem da protease de alça de cadeia dupla de BoNT/D, um sÍtio de cliva- gem da protease de alça de cadeia dupla de BoNT/E, um sÍtio de clivagem 5 da protease de alça de cadeia dupla de BONT/F, um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de BONT/G, um sÍtio de clivagem da pro- tease de alça de cadeia dupla de TeNT, um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de BaNT, ou um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de BuNT. Em outros aspectos desta modalidade, um sÍtio 10 de clivagem da protease de alça de cadeia dupla endógena Iocalizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, uma região de alça de cadeia dupla de BONT/A compreendendo os aminoácidos 430-454 de SEQ ID N°: 1; uma região de alça de cadeia dupla de BONT/B

W compreendendo os aminoácidos 437-446 de SEQ ID N°: 2; uma região de -- 15 alça de cadeia dupla de BONT/CI compreendendo os aminoácidos 437-453 de SEQ ID N°: 3;- uma região de alça de cadeia dupla de BONT/D compre- '' endendo os aminoácidos 437-450 de SEQ ID N°: 4; uma região de alça de cadeia dupla de BONT/E compreendendo os aminoácidos 412-426 de SEQ ID N°: 5; uma região de alça de cadeia dupla de BONT/F compreendendo os 20 aminoácidos 429-445 de SEQ ID N°: 6; uma região de alça de cadeia dupla de BONT/G compreendendo os aminoácidos 436- 450 de SEQ ID N°: 7; ou uma região de alça de cadeia dupla de TeNT compreendendo os aminoáci- dos 439-467 de SEQ ID N°: 8. uma região de alça de cadeia dupla de BaNT compreendendo os aminoácidos 421-435 de SEQ ID N°: 9: ou uma região 25 de alça de cadeia dupla de BuNT compreendendo os aminoácidos 412-426 deSEQIDN°:1O. Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, um sÍtio de clivagem da protease exógena. Conforme usado neste relatório, o termo "sÍtio de clivagem da protease exógena" é sinônimo de "sÍtio de clivagem da 30 protease construída geneticamente", "sítio de clivagem da protease de ocor- rência não natural", ou "sítio de clivagem da protease não nativa" e refere-se a um sÍtio de clivagem da protease que normalmente não está presente em r d uma região de alça de cadeia dupla de uma toxina clostridiana de ocorrência natural.

Tais sÍtios de clivagem da protease construída geneticamente ou exógeno no interior da região de alça de cadeia dupla são usados para con- verter a foma de polipeptídio de cadeia simples de uma toxina clostridiana 5 ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção em sua forma de cadeia dupla.

Vislumbrou-se que todo e qualquer sÍtio de clivagem da protease exógena que pode ser usado para converter a forma de poli- peptídio de cadeia simples de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana em sua forma de cadeia dupla ativa é útil para a prática dos as- lO pectos da presente invenção.

Exemplos não limitativos de sÍtios de clivagem da protease exógena incluem, por exemplo, um sÍtio de clivagem de papaína vegetal, um sÍtio de clivagem de papaína de inseto, um sÍtio de clivagem de ' papaína de crustáceo, um sítio de clivagem de enteroquinase, um sÍtio de > clivagem da protease do rinovírus 3C humano, um sÍtio de clivagem da pro- " 15 tease do enterovírus 3C humano, um sÍtio de clivagem da protease do vÍrus Etch do tabaco (TEV), um sÍtio de clivagem do vÍrus mosqueado do tabaco ?:-' " (TVMV), um sÍtio de clivagem da subtilisina, um sÍtio de clivagem da hidroxi- lamina, ou um sÍtio de cIivagem da caspase 3. SÍtios de clivagem da protea- . se construída geneticamente localizados na alça de cadeia dupla estão des-

_ 20 critos, por exemplo, em Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Patente US 7.419.676, Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Patente US 7.422.877, Steward, et al., Activatable Recombinant Neuroto- xins, Publicação de Patente US 2009/0069238, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicação de Patente US 2008/0032930, Ste- 25 ward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicação de Patente US 2009/0018081, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicação de Patente US 2009/0005313, Steward, 'et al., Activatable Re- combinant Neurotoxins, Publicação de Patente US 2009/0004224; todos aqui aqui incorporados em sua integridade a título de referência. 30 Vislumbrou-se que um sÍtio de clivagem da protease exógena de todo e qualquer comprimento pode ser útil nos aspectos da presente inven- ção com a condição de que o sítio de cIivagem da protease exógena possa

^. « ser clivado por sua respectiva protease. Assim sendo, nos aspectos desta modalidade, um sítio de clivagem da protease exógena pode ter um com- primento de, por exemplo, pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, ou pelo menos 60 aminoácidos; ou no máximo 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 5 40, 50, ou pelo menos 60 aminoácidos. Em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de to- xina clostridiana divulgada na presente invenção compreende uma região de alça de cadeia dupla incluindo um sÍtio de clivagem da protease exógena. Nos aspectos desta modalidade, um sítio de clivagem da protease exógena 10 localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, um sÍtio de clivagem de papaína vegetal, um sÍtio de clivagem de papaína de inseto, um sÍtio de clivagem de papaína de crustáceo, um sÍtio de clivagem da proteas.e da enteroquinase não humana, um sÍtio de cliva- W' . gem da protease do vÍrus Etch do tabaco, um sÍtio de clivagem da protease -" 15 do vÍrus mosqueado do tabaco, um sÍtio de clivagem da protease do rinoví- rus 3C--humano, um sÍtio de clivagem da protease do enterovírus 3C huma-._ no, um sÍtio de clivagem da subtilisina, um sÍtio de clivagem da hidroxilami- na, um sitio de clivagem da protease de SUMO/ULP-I, e um sÍtio de cliva- gem da caspase 3 não humana.

_ 20 Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da pro- tease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla com- preende, por exemplo, um sÍtio de clivagem de enteroquinase não humana. Em um outro aspecto da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exó- gena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, 25 por exemplo, um sÍtio de clivagem de enteroquinase bovina. Em ainda um outro aspecto da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 480. Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da 30 protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, um sÍtio de clivagem da protease do vÍrus Etch do tabaco. Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de clivagem da pro-

tease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla com- preende, por exemplo, a sequência consenso EX1X2YX3Q*G (SEQ ID N°: 481) ou EX1X2YX3Q*S (SEQ ID N°: 482), onde Xj, X2 e X3 é qualquer ami- noácido. Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de clivagem da prote- 5 ase exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla com- preende, por exemplo, a SEQ ID N°: 483, SEQ ID N°: 484, SEQ ID N°: 485, SEQ ID N°: 486, SEQ ID N°: 487, SEQ ID N°: 488, SEQ ID N": 489, SEQ ID N°: 490, SEQ ID N°: 491, ou SEQ ID N°: 492. Em um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da 10 protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, um sÍtio de clivagem da protease do vÍrus mos- queado do tabaco. Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia du- * . pla compreende, por exemplo, a sequência consenso X1X2VRFQ*G (SEQ ID -" 15 N°: 493) ou X1X2VRFQ*S (SEQ ID N°: 494), onde Xj e X2 são independen- te.mente qualquer aminoácido. Em outros aspectos da modalidade, tim "sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 495, SEQ ID N°: 496,

E SEQ ID N°: 497, ou SEQ ID N°: 498. 20 Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de cliva- . gem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, um sÍtio de clivagem da protease do rinoví- rus 3C humano. Em um outro aspecto da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia du- 25 pla compreende, por exemplo, a sequência consenso X1X2LFQ*GP (SEQ ID N°: 499), onde Xj é qualquer aminoácido com um aminoácido ácido como D ou E preferred; e X2 é preferencialmente S, T, e um aminoácido alifático hi- drófobo como G, P, A, V, L, I, e M. Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de 30 alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 500, SEQ ID N°: 501, SEQ ID N°: 502, SEQ ID N°: 503, SEQ ID N°: 504, ou SEQ ID N°:

505. Em um outro aspecto da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease

- 4 exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreen- de, por exemplo, uma protease do rinovírus 3C humano clivada por PRESCISSION®. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de cliva- 5 gem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, um sÍtio de clivagem da subtilisina. Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, a sequência consenso X1X2X3X4H*Y (SEQ ID N°: 506) ou 10 X1X2X3X4Y*H (SEQ ID N°: 507), onde Xj, X2, X3, e X4 são independentemen- te qualquer aminoácido. Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de cli- vagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de ca- deia dupla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 508, SEQ ID N°: 509,

W ou SEQ ID N°: 510. Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de cliva- _" 15 gem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia ·: ...".""dupla compreende, por exemplo, um sÍtio de"clivagem da subtilisina clivado por GENENASE®. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de cliva- . gem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia 20 dupla compreende, por exemplo, um sÍtio de clivagem da hidroxilamina. Em

W outros aspectos da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, o dipeptídio N*G. Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de 25 cadeia dupla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 511 ou SEQ ID N°:

512. Em ainda um outro aspecto desta modalidade, um sÍtio de cliva- gem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, um sÍtio de clivagem da protease da 30 SUMO/ULP-I. Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, a sequência consenso GG*X1X2X3 (SEQ ID N°:

<

513), onde Xj, X2, e X3 são independentemente qualquer aminoácido.

Em outros aspectos da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 514. 5 Em um aspecto desta modalidade, um sÍtio de clivagem da pro- tease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla com- preende, por exemplo, um sÍtio de ciivagem da caspase 3. Em outros aspec- tos da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, um 10 sÍtio de clivagem da protease da caspase 3 não humana.

Em outros aspec- tos da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, a se- quência consenso DX1X2D*X3 (SEQ ID N°: 515), onde Xj é qualquer amino- . ácido, com um aminoácido ácido como D e E sendo preferido, X2 é qualquer m" 15 aminoácido e X3 é um aminoácido, com um aminoácido não polar pequeno

, .-,- como A, C, G, S, e T sendo preferido.

Em outros aspectos' da modalidade, um sÍtio de clivagem da protease exógena localizado no interior da região de alça de cadeia dupla compreende, por exemplo, a SEQ ID N°: 516, SEQ ID N°: 517, SEQ ID N°: 518, SEQ ID N°: 519, SEQ ID N°: 520, ou SEQ ID N°:

. 20 521. Uma região de alça de cadeia dupla pode ser modificada de forma que um sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla de o- corrência natural é substituído por um sÍtio de clivagem da protease exóge- na.

Nesta modificação, o sÍtio de clivagem da protease de alça de cadeia 25 dupla de ocorrência natural é deixado inoperável e portanto não pode ser clivado por sua protease.

Apenas o sÍtio de clivagem da protease exógena ' pode ser clivado por sua protease exógena correspondente.

Neste tipo de modificação, o sÍtio de protease exógena é operacionalmente ligado a uma toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana como uma proteína de 30 fusão e o sÍtio pode ser clivado por sua protease exógena respectiva.

A substituição de um sítio de clivagem da protease de alça de cadeia dupla endógena por um sÍtio de clivagem da protease exógena pode ser uma substituição dos sÍtios onde o sÍtio exógeno é construído geneticamente na posição próxima à localização do sítio de clivagem do sÍtio de endógeno. A substituiçãao de um sÍtio de cIivagem da protease de alça de cadeia dupla endógena por um sÍtio de clivagem da protease exógena pode ser uma adi-

W 5 ção de um sÍtio exógeno onde o sÍtio exógeno é construído geneticamente na posição diferente da localização do sÍtio de clivagem do sÍtio endógeno, o sÍtio endógeno sendo construído geneticamente de forma a ser inoperável. A localização e o tipo de sÍtio de clivagem da protease podem ser críticos porque certos domínios de ligação requerem um aminoácido amino-terminal 10 ou carboxil-terminal livre. Por exemplo, um domínio de ligação de peptídio é colocado entre dois outros domínios, vide, por exemplo, a FIG. 4, um critério para escolha de um sÍtio de cIivagem da protease poderia ser se a protease que cliva seu sÍtio deixa um corte liso ("flush cut"), expondo terminal amino m ou terminal carboxyl livre do domínio de ligação necessário para a ligação -" 15 seletiva do domínio de ligação ao seu receptor. Um sÍtio de clivagem da protease de ocorrência natural pode ser deixado inoperável alterando-se pelo menos um dos dos aminoácidos que flanqueiam a ligação peptídica clivada pela.protease de alça de cadeia dupla de ocorrência natural. Alterações mais extensas podem ser feitas, com a _ 20 condição de que os dois resíduos cisteína da região de alça de cadeia dupla permaneçam intactos e a região ainda possa formar a ponte dissulfeto. E- xemplos não limitativos de uma alteração de aminoácido incluem deleção de um aminoácido ou substituição do aminoácido original por um aminoácido diferente. Portanto, em uma modalidade, um sÍtio de clivagem da protease 25 de ocorrência natural é deixado inoperável alterando-se pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 aminoácidos incluindo pelo menos um dos dois aminoácidos que flanqueiam a ligação peptídica clivada por uma protease de ocorrência natural. Em uma outra modalidade, um sítio de clivagem da protease de ocorrência natural é deixado inoperável alterando-se no máximo 30 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 aminoácidos incluindo pelo menos um dos dois aminoácidos que flanqueiam a ligação peptídica clivada por uma prote- ase de ocorrência natural.

Fica entendido que uma toxina clostridiana modificada divulgada na presente invenção pode opcionalmente compreender ainda uma região flexível compreendendo um espaçador flexível.

Uma região flexível compre- endendo espaçadores flexíveis pode ser usada para regular o comprimento 5 de uma região polipeptídica a fim de otimizar uma característica, atributo ou propriedade de um polipeptídio.

Como um exemplo não limitativo, uma regi- ão polipeptídica compreendendo um ou mais espaçadores flexíveis em tan- dem pode ser usada para expor melhor um sítio de clivagem da protease, facilitando assim a clivagem daquele sÍtio por uma protease.

Como um outro 10 exemplo não limitativo, uma região polipeptídica compreendendo um ou mais espaçadores flexíveis em tandem pode ser usada para apresentar me- lhor um domínio de Iigação de peptídio, facilitando assim a ligação daquele domínio de Iigação ao seu receptor. m

Um espaçador flexível compreendendo um peptídio tem pelo " 15 menos um aminoácido de comprimento e compreende aminoácidos não car- regados com grupos R de cadeia lateral pequenos,:tais como, por exemplo, aminoácidos não polares pequenos como A, C, G, S, e T.

Portanto, em uma modalidade um espaçador flexível pode ter um comprimento de, por exem- plo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos; ou no máximo 1,

. 20 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos.

Em ainda uma outra modalidade, um espaçador flexível pode ter, por exemplo, entre 1-3 aminoácidos, entre 2-4 aminoácidos, entre 3-5 aminoácidos, entre 4-6 aminoácidos, ou entre 5- 7 aminoácidos.

Exemplos não limitativos de um espaçador flexível incluem, por exemplo, espaçadores G tais como GGG, GGGG (SEQ ID N°: 522), e 25 GGGGS (SEQ ID N°: 523) ou espaçadores A tais como AAA, AAAA (SEQ ID N°: 524) e AAAAT (SEQ ID N°: 525). Tal região flexível é operacional- mente ligada "in-frame" à toxina cIostridiana modificada como uma proteína de fusão.

Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- 30 mera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção pode compre- ender ainda uma região flexível compre.endendo um espaçador flexível.

Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostri-

diana divulgada na presente invenção pode compreender ainda uma região flexível compreendendo uma pluralidade de espaçadores flexíveis em tan- dem.

Nos aspectos desta modalidade, uma região flexível pode compreen- der em tandem, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 espaçadores G; ou 5 no máximo 1, 2, 3, 4, ou 5 espaçadores G.

Em ainda outros aspectos desta modalidade, uma região flexível pode compreender em tandem, por exem- plo, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 espaçadores A; ou no máximo 1, 2, 3, 4, ou 5 espaçadores A.

Em um outro aspecto desta modalidade, uma toxina clos- tridiana ou quimera de toxina clostridiana pode compreender uma região 10 flexível compreendendo uma ou mais cópias dos mesmos espaçadores fle- xÍveis, uma ou mais cópias de regiões espaçadoras diferenntes, ou qualquer combinação das mesmas.

Vislumbrou-se que uma toxina clostridiana ou quimera de toxina © clostridiana divulgada na presente invenção pode compreender um espaça- -" 15 dor flexível em toda e qualquer localização com a condição de que a toxina clostridiana ou quimera de toxina c|ostridiana:seja capaz de realizar o pro- cesso de intoxicação completo.

Nos aspectos desta modalidade, um espa- çador flexível é posicionado entre, por exemplo, um domínio enzimático e um domínio de translocação, um domínio enzimático e um domínio de liga-

- 20 ção, um domínio enzimático e um sÍtio de clivagem da protease exógena.

Em outros aspectos desta modalidade, um espaçador flexível é posicionado entre, por exemplo, um domínio de ligação e um domínio de translocação, um domínio de ligação e um domínio enzimático, um domínio de ligação e um sÍtio de clivagem da protease exógena.

Em ainda outros aspectos desta 25 modalidade, um espaçador flexível é posicionado entre, por exemplo, um domínio de translocação e um domínio enzimático, um domínio de translo- cação e um domínio de Iigação, um domínio de translocação e um sÍtio de clivagem da protease exógena.

Como um outro exemplo não limitativo de um componente op- 30 cional, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana pode com- preender ainda uma região de ligação de epítopo.

Uma região de ligação de epítopo pode ser usada em uma ampla variedade de procedimentos envol-

vendo, por exemplo, purificação de proteínas e visualização de proteínas. Tal região de ligação de epítopo é operacionalmente ligada "in-frame" a uma toxina clostridiana modificada como uma proteína de fusão. Exemplos não limitativos de uma região de ligação de epítopo incluem, por exemplo, FLAG, 5 Express'", hemaglutinina do vÍrus da influenza humana (HA), proteína p62'" - My' humana (C-MYC), glicoproteína do vÍrus da estomatite vesicular (VSV-G), precursor da glicoproteína-D do vírus do herpes simples (HSV), V5, AUI, e AU5; ligação por atinidad'e, tal como, por exemplo, poli-histidina (HlS), pep- tídio de ligação da estreptavidina (strep), e biotina ou uma sequência de bio- lO tinilação; regiões de ligação de peptídio, tais como, por exemplo, o domínio de ligação de glutationa da glutationa-S-transferase, o dominio de ligação de calmodulina da proteína de ligação de calmodulina, e o domínio de ligação de maltose da proteína de ligação de maltose. Exemplos não limitativos de 0 protocolos específicos para selecionar, fazer e usar um peptídio de ligação ." 15 apropriado estão descritos, por exemplo, em Epitope Tagging, págs. 17.90-

17.93 (Sambrook e Russell, eds.,, . . MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Vol. 3, 3rd ed. 2001 ); ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring - Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998): e USING ANTIBODIES: A - 20 LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL NO. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998). Além disso, e- xemplos não limitativos de peptídios de ligação assim como de reagentes, condições e protocolos já bem caracterizados encontram-se disponíveis em fornecedores comerciais que incluem, sem limitação, BD Biosciences- 25 Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invi- trogen, lnc., Carlsbad, CA; QIAGEN, lnc., Valencia, CA; e Stratagene, La Jolla, CA. Esses protocolos são procedimentos rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados neste relatório. Portanto, em uma modalidade, uma toxina clostridiana ou qui- 30 mera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção pode compre- ender ainda uma"região de ligação de epítopo. Em uma outra modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na pre-

sente invenção pode compreender ainda uma pluralidade de regiões de li- gação de epítopo. Nos aspectos desta modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana pode compreender, por exemplo, pelo me- nos 1, 2, 3, 4, ou 5 regiões de ligação de epítopo. Em outros aspectos desta 5 modalidade, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana pode compreender, por exemplo, no máximo 1, 2, 3, 4, ou 5 regiões de ligação de epítopo. Em um outro aspecto desta modalidade, uma toxina cIostridiana modificada pode compreender uma ou mais cópias da mesma regiões de ligação de epítopo, ou uma ou mais cópias de regiões de Iigação de epítopo 10 diferentes, ou qualquer combinação das mesmas. A localização de uma região de ligação de epítopo pode estar em várias posições, incluindo, sem limitação, no terminal amino,. no interior do terminal carboxil ou no terminal carboxil de uma toxina cIostridiana ou 0 quimera de toxina clostridiana. Portanto, em uma modalidade, uma região ." 15 de ligação de epítopo está localizada no terminal amino de uma toxina clos- tridiana ou quimera de toxina clostridiana. Em uma outra modalidade, uma região de ligação de epítopo está localizada no terminal carboxil de uma to- xina clostridiana modificada.

T Os aspectos da presente invenção fornecem, em parte, molécu- 20 las de polinucleotídeo. Conforme usado neste relatório, o termo "molécula de polinucleotídeo" é sinônimo de "molécula de ácido nucleico" e refere-se a uma forma polimerica de nucleotídeos, tais como, por exemplo, ribonucleo- tídeos e deoxirribonucleotídeos. Vislumbrou-se que toda e qualquer molécu- la de polinucleotídeo que pode codificar uma toxina clostridiana ou quimera 25 de toxina clostridiana divulgada na presente invenção pode ser útil, incluin- do, sem limitação moléculas de DNA de ocorrência natural e de ocorrência não natural e moléculas de RNA de ocorrência natural e de ocorrência não natural. Exemplos não limitativos de moléculas de DNA de ocorrência natu- ral e de ocorrência não natural incluem moléculas de DNA de cordão sim- 30 ples, moléculas de DNA de cordão duplo, moléculas de DNA genônico, mo- léculas de cDNA, construções de vetores, tais como, por exemplo, constru- ções de pIasmídeo, construções de fagemideos, construções de bacteriofa-

264/316 --- gos, construções retrovirais e construções de cromossoma artificial. Exem- plos não limitativos de moléculas de RNA de ocorrência natural e de ocor- rência não natural incluem RNA de cordão simples, RNA de cordão duplo e mRNA. 5 Técnicas bem estabelecidas da biologia molecular que podem ser necessárias para fazer uma molécula de polinucleotídeo codificando uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na pre- sente invenção incluindo, porém sem limitação, procedimentos envolvendo amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR), reações de enzi- lO mas de restrição, eletroforese em gel de agarose, ligação de ácidos nuclei- cos, transformação bacteriana, purificação de ácidos nucleicos, sequencia- mento de ácidos nucleicos, e técnicas baseadas em recombinação são pro- cedimentos rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensina- . dos neste relatório. Exemplos não limitativos de protocolos específicos ne- w" 15 cessários para fazer uma molécula de polinucleotÍdeo codificando uma toxi- , na clostridiana modificada estão descritos, por exemplo, em MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); e CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et al., eds. r John Wiley & Sons, 2004). Adicionalmente, uma variedade de produtos co-

Ü . 20 mercialmente disponíveis úteis para fazer uma molécula de polinucleotÍdeo codificando uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divul- gada na presente invenção encontram-se amplamente disponíveis. Esses protocolos são procedimentos rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados neste relatório. 25 Portanto, em uma modalidade, uma molécula de polinucleotÍdeo codifica uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção. Um outro aspecto da presente invenção fornece, em parte, um método de produção de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clos- 30 tridiana divuigada na presente invenção, tal método compreendendo a etapa de expressar uma molécula de polinucleotÍdeo codificando uma toxina clos- tridiana ou quimera de toxina clostridiana em um célula. Um outro aspecto da presente invenção fornece um método de produção de uma toxina clos- tridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção, tal método compreendendo as etapas de introduzir uma construção de ex- pressão compreendendo uma molécula de polinucleotídeo codificando uma 5 toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana em uma célula e ex- pressar a construção de expressão na célula. Os métodos divulgados na presente invenção incluem, em parte, uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana. Vislumbrou-se que toda e qualquer toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divul- lO gada na presente invenção pode ser produzida usando os métodos divulga- dos na presente invenção. Também vislumbrou-se que toda e qualquer mo- lécula de polinucleotídeo codificando uma toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana divulgada na presente inv-enção pode ser útil na produção

Q de uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na -" 15 presente invenção usando os métodos divulgados na presente invenção. Os métodos di.v.ulgados na presente invenção incluem, em parte, uma construção de expressão. Uma construção de expressão compreende uma molécula de polinucleotÍdeo divulgada na presente invenção operacio- . nalmente ligada a um vetor de expressão útil para expressar a molécula de . 20 polinucleotídeo em uma célula ou extrato livre de células. Uma ampla varie- dade de vetores de expressão podem ser empregados para expressar uma molécula de polinucleotÍdeo codificando uma toxina clostridiana ou quimera de toxina ciostridiana divulgada na presente invenção, incluindo, sem limita- ção, um vetor de expressão viral, um vetor de expressão procariótico, veto- 25 res de expressão eucarióticos, tais como, por exemplo, um vetor de expres- são de levedura, um vetor de expressão de inseto e um vetor de expressão de mamífero; e um vetor de expressão de extrato livre de células. Fica ainda entendido que vetores de expressão úteis para a prática dos aspectos des- ses métodos podem incluir aqueles que expressam uma toxina clostridiana 30 ou quimera de toxina clostridiana sob o controle de um elemento promotor ou elemento intensificador constitutivo especlfico para tecido, específico pa- ra célula ou induzível, ou ambos. Exemplos não Iimitativos de vetores de expressão, junto com reagentes e condições já bem estabelecidos para fa- zer e usar uma construção de expressão a partir de tais vetores de expres- são encontram-se facilmente disponíveis em fornecedores comerciais que incluem, sem limitação, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosci- 5 ences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, lnc., Carlsbad, CA; EMD Bi- osciences-Novagen, Madison, Wl; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; e Stratage- ne, La Jolla, CA.

A seleção, confecção e uso de um vetor de expressão a- propriado são procedimentos rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados neste relatório. 10 Portanto, nos aspectos desta modalidade, uma molécula de po- linucleotÍdeo codificando uma toxina clostridiana ou quimera de toxina CIOS- tridiana divulgada na presente invenção operacionalmente ligado a um vetor de expressão.

Nos aspectos desta modalidade, o vetor de expressão é por 0 exemplo, um vetor de expressão viral, um vetor de expressão procariótico, .." 15 um vetor de expressão de levedura, um vetor de expressão de inseto, ou um vetor de expressão de. mamífero.

Em outros aspectos desta modalidade, uma molécula de polinucleotÍdeo codificando uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção operacional- . mente ligada a um vetor de expressão de extrato livre de células. 20 Os métodos divulgados na presente invenção incluem, em parte, uma célula.

Vislumbrou-se que toda e qualquer célula pode ser usada.

As- sim sendo, os aspectos desta modalidade incluem, sem limitação, células procarióticas, incluindo, sem limitação, células de cepas de bactérias aeróbi- cas, microaerofílicas, capnofílicas, facultativas, anaeróbicaa, gram-negativas 25 e gram-positivas tais como aquelas derivadas de, por exemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, CIostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens e Salmonella typhimurium; e células eucarióticas 30 incluindo, sem limitação, cepas de levedura, tais como, por exemplo, aque- las derivadas de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schi- zosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytica;

.

células de inseto e linhagens de células derivadas de insetos, tais como, por exemplo, aquelas deriVadas de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Dro- sophila melanogaster e Manduca sexta; e células de mamíferos e linhagens de células derivadas de células de mamíferos, tais como, por exemplo, a-

M 5 quelas derivadas de camundongo, rato, hamster, gado porcino, gado bovino, gado equino, primata e seres humanos. As linhagens de células podem ser adquiridas no American Type Culture Collection, European Collection of Cell Cultures e German Collection of Microorganisms and Cell Cultures. Exem- plos não limitativos de protocolos específicos para selecionar, fazer e usar 10 uma linhagem de célula apropriada estão descritos, por exemplo, em INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publi- . shers, 1996): Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES — -" 15 OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997): CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley & Sons, 1998): R. lan Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4th ed. 2000); ANIMAL

K CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Ox- - 20 ford University Press, 3rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001 ); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2nd ed. 2002); e CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004). Esses protocolos são procedimentos rotineiros de conhecimento do especialista na 25 técnica e ensinados neste relatório. Os métodos divulgados na presente invenção incluem, em parte, introduzir em uma célula uma molécula de polinucleotÍdeo. Uma molécula de polinucleotÍdeo introduzida em uma célula pode ser transitoriamente ou estavelmente mantida por aquela célula. As moléculas de poIinucleotÍdeo 30 estavelmente mantidas podem ser extracromossômicas e se replicarem de forma autônoma, ou elas podem ser integrados no material cromossômico da célula e se replicarem de forma não autônoma. Vislumbrou-se que todo e qualquer método para introduzir uma molécula de polinucleotídeo divulgada na presente invenção em uma célula pode ser usado.

Métodos úteis para introduzir uma molécula de poKnucleotídeo em uma célula incluem, sem limi- tação, transfecção ou transformação mediada por químicos tais como, por 5 exemplo, transfecção ou transformação mediada por cloreto de cálcio, me- diada por fosfato de cálcio, mediada por dietil-aminoetil (DEAE) dextrana, mediada por Iipídio, mediada por polietilenoimina (PEl), mediada por polilisi- na e mediada por polibreno; transfecção ou transformação mediada por e- lementos físicos, tais como, por exemplo, distribuição de partículas biolísti- 10 cas, microinjeção, fusão de protoplastos e eletroporação; e transfecção me- diada por vÍrus, tal como, por exemplo, transfecção mediada por retrovírus, . vide, por exemplo, lntroducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cel- - ls, págs. 16.1 -16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Labo- à ratory Manual, Vo!. 3, 3rd ed. 2001 ). O especialista na técnica sabe que a +

.' 15 escolha de um método específico para introduzir uma construção de ex- pressão em .uma célula vai depender, em parte, do fato de a célula conter -. transitoriamente uma construção de expressão ou de a célula conter esta- velmente uma construção de expressão.

Esses protocolos são procedimen- tos rotineiros de conhecimento do especialista na técnica e ensinados neste 20 relatório.

Em um aspecto desta modalidade, um método mediado por químicos, denominado transfecção, é usado para introduzir em uma célula uma molécula de polinucleotÍdeo codificando uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção.

Em métodos 25 de transfecção mediados por químicos o reagente químico forma um com- plexo com o ácido nucleico que facilita sua absorção nas células.

Tais rea- gentes químicos incluem, sem limitação, mediado por fosfato de cálcio, vide, por exemplo, Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cel/s by ca/cium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004); me- 30 diado por dietil-aminoetil (DEAE) dextrana, mediado por lipídio, mediado por polímero catiônico como polietilenoimina (PEl) e mediado por polilisina e mediado por poIibreno, vide, por exemplo, Chun Zhang et al., Polyethyleni-

mine strategies for plasmid delivery a brain-derived cells, 33(2) Methods 144- 150 (2004). Tais sistemas de distribuição mediados por químicos po- dem ser preparados por métodos tradicionais e encontram-se comercial- mente disponíveis, vide, por exemplo, CellPhect Transfection Kit (Amersham 5 Biosciences, Piscataway, Nj); Mammalian Transfection Kit, Calcium phos- phate and DEAE Dextran, (Stratagene, lnc., La Jolla, CA); LIPOFECTAMINE® Transfection Reagent (lnvitrogen, Inc., Carlsbad, CA); ExGen 500 Transfection kit (Fermentas, Inc., Hanover, MD), e SuperFect and Effectene Transfection Kits (Qiagen, lnc., Valencia, CA). 10 Em um outro aspecto desta modalidade, um método mediado por elementos físicos é usado para introduzir em uma célula uma molécula de polinucleotÍdeo codificando uma toxina clostridiana ou quimera de toxina cIostridiana divulgada na presente invenção. Técnicas físicas incluem, sem

Q a limitação, eletroporação, biolística e microinjeção. Biolítica e técnicas de mi- ~

K W 15 croinjeção perfuram a parede celular a fim de introduzir a molécula de ácido nucleico na célula, vide, por exemplo, Jeike E. Biewenga et al., Plasm.id- mediated gene transfer in neurons usando the biolistics technique, 71 (1 ) J. Neurosci. Methods 6.7-75 (1997); e John O'Brien & Sarah C. R. Lummis, Bio- listic and diolistic transfection: using the gene gun a deliver DNA e lipophilic 20 dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004). A eletroporação, também denominada eletropermeabilização, utiliza pulsos elétricos breves de alta tensão para criar poros transitórios na membrana através da qual as moléculas de ácido nucleico entram e pode ser usada efetivamente para transfecções estáveis e transitórias de todos os tipos de células, vide, por 25 exemplo, M. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field- mediated permea- bilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); e Oliver Greschet al., New non-viral method for gene transfer into primary cel- ls, 33(2) Methods 151 -163 (2004). Em um outro aspecto desta modalidade, um método mediado 30 por vÍrus, denominado transdução, é usado para introduzir em uma célula uma molécula de polinucleotÍdeo codificando uma toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção. Nos métodos de transdução transitória mediados por vÍrus, o processo pelo qual as partí- culas virais infectam e se replicam em uma célula hospedeira fora manipu- lado a fim de usar este mecanismo para introduzir uma molécula de polinu- cleotídeo na célula. Métodos mediados por vÍrus foram desenvolvidos a par- 5 tir de uma ampla variedade de vÍrus incluindo, sem limitação, retrovírus, a- denovírus, vÍrus adeno-associados, vÍrus do herpes simples, picornavírus, alfavórus e baculovírus, vide, por exemplo, Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); e Maurizio Federico, From lentiviruses a lentivirus vectors, 10 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al, Adenovirus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440- 447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene

W W therapy, 380(6) Biol. Chem. 61 3-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus ~' © 15 and adeno-associated virus vectors, 21 (12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21 (12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); llya Frolov et al., Alfavirus- based expression vectors: strategies and applications, 93(21 ) Proc. Natl. 20 Acad. Sci. U. S. A. 11371-1 1377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alfaviral gene transfer in neurobiology, 59(1 ) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian ceil gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); e A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene- 25 delivery vehicles amd their applications, 3(1 ) Am. J. Pharmacogenomics 53- 63 (2003). Adenovírus, que são vÍrus de DNA de cordão duplo não envelo- pados, geralmente são os escolhidos para transdução de céiula de mamífe- ro porque os adenovírus manipulam moléculas de polinucleotÍdeo relativa- 30 mente grandes de cerca de 36 kg, são produzidos em alta titulação, e pode infectar com eficiência uma ampla variedade de células em divisão e não em divisão, vide, por exemplo, Wim T. J. M. C. Hermens et al., Transient gene transfer a neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71 (1 ) J.

Neurosci.

Methods 85-98 (1997); e Hiroyuki Mizu- guchi et al., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv.

Drug Deliv.

Rev. 165-176 (2001 ). A transdução usando um sis- 5 tema baseado em adenovírus não aguenta a expressão proteica prolongada porque a molécula de ácido nucleico é carregada por um epissoma no nú- cleo da célula, em vez de ser intragada no cromossoma da célula hospedei- ra.

Sistemas de vetor adenoviral e protocolos específicos sobre como usar tais vetores estão descritos, por exemplo, em VIRAPOWER"" Adenoviral 10 Expression System (Invitrogen, lnc., Carlsbad, CA) e VIRAPOWER'" Ade- noviral Expression System lnstruction Manual 25-0543 version A, lnvitrogen, lnc., (15 de julho de 2002); e ADEASY"" Adenoviral Vector System (Strata- gene, lnc., La Jolla, CA) e ADEASY'" Adenoviral Vector System lnstruction 4

. Manual 064004f, Stratagene, lnc. :" 15 A distribuição de moléculas de polinucleotÍdeo também pode

:·- -- usar retrovírus de RNA de cordão simples, tais como, por exemplo, oncore- trovírus e lentivírus.

A transdução mediada por retrovírus geralmente produz eficiências de transdução perto dos 1OO°/o, pode controlar facilmente o nú- . mero de cópias provirais variando a multiplicidade de infecção (MOl), e pode 20 ser usada para transdução transitória ou estável de células, vide, por exem- plo, Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral- based vectors for the transduction of mammalian celss, 285 Methods Mol.

Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vec- tors for ex vivo e in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Felix 25 Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods MOL Biol. 417-433 (2004); e Roland Wol- kowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol.

Biol. 391-411 (2004). Partículas retrovirais consistem em um genoma de RNA encapsulado em capsídeo proteico, envolvido por um 30 envelope lipídico.

O retrovírus infecta uma célula hospedeira injetando seu RNA no citoplasma junto com a enzima transcriptase reversa.

O gabarito de RNA é então transcrito de forma reversa como um CDNA de cordão duplo

( \ r

272/316

> linear que se replica integrando-se no genoma da célula hospedeira.

As par- tículas virais espalham-se tanto verticalmente (da célula-mãe para as célu- las-filhas via o provírus) como horizontalmente (de célula para célula via VÍ- rions). Esta estratégia de replicação permite uma expressão persistente pro- 5 longada uma vez que as moléculas de ácido nucleico de interesse são esta- - velmente integradas em um cromossoma da célula hospedeira, permitindo assim a expressão prolongada da proteína.

Por exemplo, estudos em ani- mais mostram que vetores lentivirais injetados em uma variedade de tecidos produziram expressão proteica continuada por mais de 1 ano, vide, por e- lO xemplo, Luigi Naldini et al., ln vivo gene de/ivery and stab/e transduction of non-dividing cel/s by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996). Os sistemas de vetor derivado do oncoretrovírus, tais como, por exemplo, vÍrus da leucemia murina de Moloney (MOMLV), são amplamente usados e infectam muitas células não em divisão diferentes.

Os lentivírus também po- " 15 dem infectar muitos tipos de células diferentes, incluindo células em divisão

, -" ," e não em divisão e possuem proteínas de envelope complexas, que permi- tem uma vetorização celular altamente específica.

Vetores retrovirais e protocolos específicos sobre como usar tais . vetores estão descritos, por exemplo, em Manfred Gossen & Hermann Bu- 20 jard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline- res- ponsive promoters, Patente US N° 5.464.758 (7 de novembro de 1995) e Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expres- sion, Patente US N° 5.814.618 (29 de setembro de 1998) David S.

Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and 25 cells transformed with same, Patente US N° 5.514.578 (7 de maio de 1996) e David S.

Hogness, Polynucleotides encoding insect ecdysone receptor, Patente US 6.245.531 (12 de junho de 2001 ); Elisabetta Vegeto et al., Pro- gesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations, Patente US N° 5.364.791 (15 de novembro de 1994), Elisabetta Vegeto et 30 al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, Patente US N° 5.874.534 (23 de fevereiro de 1999) ' e Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, Patente US N° 5.935.934 (10 de agosto de 1999). Além disso, tais sistemas de distribuição viral po- dem ser preparados por métodos tradicionais e encontram-se comercial- mente disponíveis, vide, por exemplo, BD"" Tet-Off and Tet-On Gene Ex- 5 pression Systems (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) e BD"" Tet-Off . and Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosci- ences CIonetech, (14 de março de 2003), GENESWITCH'" System (Invitro- gen, lnc., Carlsbad, CA) e GENESWITCH'" System A Mifepristone- Regulated Expression System for mammalian cells version D, 25-0313, Invi- lO trogen, Inc., (4 de novembro de 2002); VIRAPOWER'" Lentiviral Expression System (Invitrogen, lnc., Carlsbad, CA) e VIRAPOWER"" Lentiviral Expres- sion System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (8 de dezembro de 2003); e COMPLETE CONTROL® Retroviral Inducible Mam- malian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) e COMPLETE " 15 CONTROL® Retroviral lnducible Mammalian Expression System Instruction

...., .. Manual, 064005e.

Os métodos divulgados na presente invenção incluem, em parte, expressar a partir de uma molécula de polinucleotídeo uma toxina clostridia- . na ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção.

Vis-

, 20 lumbrou-se que qualquer um de uma variedade de sistemas de expressão pode ser útil para expressar a partir de uma molécula de polinucleotídeo uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na pre- sente invenção, incluindo, sem limitação, sistemas baseados em células e sistemas de expressão livres de células.

Sistemas baseados em células in- 25 cIuem, sem iimitação, sistemas de expressão virais, sistemas de expressão procarióticos, sistemas de expressão de Ievedura, sistemas de expressão baculovirais, sistemas de expressão de insetos, e sistemas de expressão de mamíferos.

Sistemas livres de células incluem, sem limitação, extratos de germe de trigo, extratos de reticulócitos de coelho, e extratos de E. coli e 30 geralmente são equivalentes ao método divulgado nesta invenção.

A ex- pressão de uma molécula de polinucleotídeo usando um sistema de expres- são pode incluir quaiquer uma de uma variedade de características incluin-

do, sem limitação, expressão induzível, expressão não induzível, expressão constitutiva, expressão mediada por vÍrus, expressão estavelmente integra- da, e expressão transitória. Sistemas de expressão que incluem vetores, reagentes, condições e células já bem caracterizados estão bem estabeleci-

W 5 dos e encontram-se facilmente disponíveis em fornecedores comerciais que incluem, sem limitação, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; lnvitrogen, lnc, Carlsbad, CA; QIAGEN, lnc., Valencia, CA; Roche Applied Science, lndia- napolis, IN; e Stratagene, La Jolla, CA. Exemplos não limitativos da escolha 10 e uso de sistemas de expressão heterológos apropriados estão descritos, por exemplo, em PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins & B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, " 15 1999); e Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121 -1128, (2001 ). Es- - ses protocolos são procedimentos rotineiros de conhecimento do especialis- ta na técnica e ensinados neste relatório. « Vários procedimentos de expressão baseados em células são , 20 úteis para expressar uma molécula de poHnucleotideo codificando uma toxi- na clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente in- venção. Exemplos incluem, sem limitação, sistemas de expressão virais, - sistemas de expressão procarióticos, sistemas de expressão de levedura, sistemas de expressão baculovirais, sistemas de expressão de insetos, e 25 sistemas de expressão de mamíferos. Sistemas de expressão virais inclu- em, sem limitação, o VIRAPOWER'" Lentiviral (Invitrogen, lnc., Carlsbad, CA), os Adenoviral Expression Systems (lnvitrogen, Inc., Carlsbad, CA), o ADEASY"" XL Adenoviral Vector System (Stratagene, La Jolla, CA) e o VIRAPORT® Retroviral Gene Expression System (Stratagene, La Jolla, CA). 30 Exemplos não limitativos de sistemas de expressão procarióticos incluem o CHAMPION"" pET Expression System (EMD Biosciences-Novagen, Madi- son, Wl), o TRIEX"" Bacterial Expression System (EMD Biosciences-

Novagen, Madison, Wl), o QIAEXPRESS® Expression System (QIAGEN, . e Purification System (Stratagene, lnc.), e o AFFINITY® Protein Expression La Jolla, CA). Sistemas de expressão de levedura incluem, sem limitação, o EASYSELECT'" Pichia Expression Kit (Invitrogen, lnc., Carlsbad, CA), os 5 YES-ECHO"" Expression Vector Kits (lnvitrogen, lnc., Carlsbad, CA ) e o .. SPECTRA'" S. pombe Expression System (Invitrogen, lnc., Carlsbad, CA). Exemplos não limitativos de sistemas de expressão baculovirais incluem o BACULODIRECT"" (lnvitrogen, lnc., Carlsbad, CA), o BAC-A-BAC® (lnvi- trogen, lnc., Carlsbad, CA), e o BD BACULOGOLD"" (BD Biosciences- lO Pharmigen, San Diego, CA). Sistemas de expressão de insetos incluem, sem limitação, o Drosophila Expression System (DES®) (lnvitrogen, lnc., Carlsbad, CA), INSECTSELECT'" System (Invitrogen, lnc., Carlsbad, CA) e INSECTDIRECT"" System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wl). E- xemplos não limitativos de sistemas de expressão de mamíferos incluem o " 15 T-REX'" (Tetracycline-Regulated Expression) System (lnvitrogen, Inc., Car- lsbad, CA), o FLP-IN "" T-REX"" System (-Invitrogen, lnc., Carlsbad, CA), o pcDNA'" system (lnvitrogen, lnc., Carlsbad, CA), o pSecTag2 system (Invi- trogen, lnc., Carlsbad, CA), o EXCHANGER® System, INTERPLAY"" . Mammalian TAP System (Stratagene, La Jolla, CA), COMPLETE

- 20 CONTROL® lnducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) e LACSWITCH® ll lnducible Mammalian Expression System (Stratage- ne, La jolla, CA). Um outro procedimento para expressar uma molécula de polinu- cleotídeo codificando uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridi- 25 ana divulgada na presente invenção emprega um sistema de expressão livre de células tal como, sem limitação, extratos procarióticos e extratos eucarió- ticos.

Exemplos não limitativos de extratos de células procarióticas incluem o RTS 100 E. coli HY Kit (Roche Applied Science, lndianapolis, IN), ActivePro ln Vitro Translation Kit (Ambion, lnc., Austin, TX), o ECOPRO"" System 30 (EMD Biosciences- Novagen, Madison, Wl) e o EXPRESSWAY'" Plus Ex- pression System (lnvitrogen, lnc., Carlsbad, CA). Extratos de células eucari- óticas incluem, sem limitação, o RTS 100 Wheat Germ CECF Kit (Roche

. .. .

m Applied Science, lndianapolis, IN), o TNT® Coupled Wheat Germ Extract Systems (Promega Corp., Madison, Wl), o Wheat Germ IVT'" Kit (Ambion, lnc., Austin, TX), o Retic Lysate IVT"" Kit (Ambion, Inc., Austin, TX), o PROTEINSCRIPT® Il System (Ambion, lnc., Austin, TX) e o TNT® Coupled

V 5 Reticulocyte Lysate Systems (Promega Corp., Madison, Wl). A toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção divulgada na presente invenção é produzida pela célu- la na forma de uma cadeia simples. Para atingir plena atividade, esta forma de cadeia simples tem que ser convertida em sua forma de cadeia dupla. 10 Como discutido acima, este processo de conversão é obtido por clivagem de um sÍtio de clivagem da protease localizado no interior da região de alça de cadeia dupla da toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divul- gada na presente invenção. Este processo de conversão pode ser efetuado usando-se um ensaio de clivagem proteolítica in vitro tradicional ou em um " 15 sistema de clivagem proteolítica baseado em células como descrito no pedi- do de patente de Ghanshani, et al., Methods of lntracellular Conversion of " Single-Chain Proteins into their Di-chain Form, Pasta de Procurador N° 18469 PROV (BOT), que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência. 20 Os aspectos da presente invenção divulgam, em parte, uma - composição compreendendo uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção. Em um outro aspecto, a com- posição é uma composição farmaceuticamente aceitável. Conforme usado neste relatório, o termo "farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer 25 entidade molecular ou composição que não produz nenhuma reação adver- sa, alérgica, ou outra reação inconveniente ou indesejada quando adminis- trada a um indivíduo. Conforme usado neste relatório, o termo "composição farmaceuticamente aceitável" é sinônimo de "composição farmacêutica" e refere-se a uma concentração terapeuticamente eficaz de um princípio ativo, 30 tal como, por exemplo, qualquer uma das toxinas cIostridianas ou quimeras de toxina clostridiana divulgadas na presente invenção. Uma composição farmacêutica compreendendo uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana é útil para aplicações médicas e veterinárias.

Uma composição farmacêutica pode ser administrada a um paciente de forma isolada, ou em combinação com outros princípios ativos, agentes, drogas ou hormônios suplementares.

As composições farmacêuticas podem ser produzidas usan- 5 do-se qualquer um de uma variedade de processos, incluindo, sem limita- ção, misturação convencional, dissolução, granulação, confecção de drá- geas, levigação, emuisificação, encapsulação, aprisionamento, e liofilização.

A composição farmacêutica pode adquirir qualquer uma de variedade de formas, sem limitação, uma solução estéril, uma suspensão, uma emulsão, 10 um Iiofilizado, um comprimido, um pÍlula, um glóbulo, uma cápsula, um pó, um xarope, um elixir ou qualquer outra forma de dosagem adequada para administração.

Vislumbrou-se também que uma composição farmacêutica compreendendo uma toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana " 15 divulgada na presente invenção pode incluir opcionalmente carreadores farmaceuticamente aceitáveis que facilitam o processamento de um princí" pio ativo para produzir composições farmaceuticamente aceitáveis.

Confor- " me usado neste relatório, o termo "carreador farmacologicamente aceitável" . é sinônimo de "carreador farmacológico" e refere-se a qualquer carreador 20 que substancialmente não tem qualquer efeito prejudicial prolongado ou permanente quando administrado e abrange termos tais como "veículo, es- tabilizante, diluente, aditivo, auxiliar, ou excipiente farmacologicamente acei- tável". Tal carreador geralmente é misturado com um composto ativo ou é deixado diluir ou envolver o composto ativo e pode ser um agente sólido, 25 semissólido, ou líquido.

Fica entendido que os princípios ativos podem ser solúveis ou podem ser distribuídos como uma suspensão no 'carreador ou diluente desejado.

Qualquer um de uma variedade de carreadores farma- ceuticamente aceitáveis pode ser usado incluindo, sem limitação, meios a- quosos tais como, por exemplo, água, solução salina, glicina, ácido hialurô- 30 nico, entre outros: carreadores sólidos tais como, por exemplo, manitol, lac- tose, amido, estearato. de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glico- se, sacarose, carbonato de magnésio, entre outros; solventes; meios de dis-

persão; revestimentos; agentes antibacterianos e antifúngicos; agentes iso- tônicos e retardadores da absorção; ou qualquer outra princípio inativo.

A escolha de um carreador farmacologicamente aceitável pode depender do modo de administração.

Exceto na medida em que qualquer carreador far- 5 macologicamente aceitável seja incompatível com o princípio ativo, seu uso em composições farmaceuticamente aceitáveis é contemplado.

Exemplos não limitativos de usos específicos de tais carreadores farmacêuticos podem ser encontrados em PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (Howard C.

Ansel et al., eds., Lippincott Williams & 10 Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (Alfonso R.

Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Joel G.

Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, lOth ed. 2001 ); e HANDBOOK OF " 15 PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (Raymond C.

Rowe et al., APhA Publica- tions, 4th edition 2003). Esses"" protocolos são procedimentos rotineiros e todas as modificações são de conhecimento do especialista na técnica e estão ensinadas neste relatório.

Vislumbramos ainda que uma composição farmacêutica divul- 20 gada na presente invenção pode incluir opcionalmente, sem limitação, ou- tros componentes farmaceuticamente aceitáveis (ou componentes farma- cêuticos), incluindo, sem Iimitação, tampões, preservativos, agentes de ajus- te da tonicidade, sais, antioxidantes, agentes de ajuste da osmolalidade, substâncias fisiológicas, substâncias farmacológicas, agentes de volume, 25 agentes emulsificantes, agentes umectantes, agentes adoçantes ou flavori- zantes, entre outros.

Vários tampões e referem-se a e para ajustar o pH po- dem ser usados para preparar uma composição farmacêutica divulgada na presente invenção, contanto que a preparação resultante seja farmaceuti- camente aceitável.

Tais tampões incluem, sem limitação, tampões acetato, 30 tampões citrato, tampões fosfato, solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e tampões borato.

Fica entendido que ácidos . ou bases podem ser usados para ajustar o pH de uma composição, confor-

me necessários.

Antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem limitação, metabissulfito de sódio, tiossulfato de sódio, acetilcisteína, hidro- xianisol butilado e hidroxitolueno butilado.

Preservativos úteis incluem, sem limitação, cloreto de benzalcônio, clorobutanol, timerosal, acetato fenilmer- 5 cúrico, nitrato fenilmercúrico, uma composição de oxicloro estabilizada, tal como, por exemplo, PURITE® e quelantes, tais como, por exemplo, DTPA ou DTPA-bisamida, DTPA cálcica, e CaNaDTPA-bisamida.

Agentes de ajus- te da tonicidade úteis em uma composição farmacêutica incluem, sem limi- tação, sais tais como, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de potássio, manitol ou glicerina e outros agentes de ajuste da tonicidade farmaceutica- mente aceitáveis.

A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com muitos ácidos diferentes, incluindo, porém sem limitação, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, e ácido succínico.

Os sais tendem a ser mais solú- veis em solventes aquosos ou outros solventes protônicos do que as formas de base livre correspondentes.

Fica entendido que estas e outras substân- '

^ cias conhecidas na Iiteratura de farmacologia podem ser incluídas em uma composição farmacêutica útil na invenção.

Em uma modalidade, uma composição compreende uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente inven- ção.

Em um aspecto desta modalidade, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção.

Nos aspectos desta modalida- de, uma composição farmacêutica compreendendo toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compreende ainda um carreador farmacológico, um componente farmacêutico, ou um carreador farmacológico e um componente farmacêutico.

Em outros aspec- tos desta modalidade, uma composição farmacêutica compreendendo uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana divulgada na presente invenção compreende ainda pelo menos carreador farmacológico, pelo me- nos um componente farmacêutico, ou pelo menos carreador farmacológico e pelo menos um componente farmacêutico.

Os aspectos da presente invenção também podem ser descritos da seguinte maneira:

1. Uma toxina cIostridiana compreendendo pelo menos um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de

Ç - 5 ' clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn, onde o pelo menos um sÍtio de clivagem de inativação compreende um sÍtio dual de trombina-trombina, um sÍtio de fator Xa, um sÍtio dual de fator Xa-trombina, e/ou um sÍtio de MMP-9. 10 2. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzimá- tico de toxina clostridiana, um domínio de translocação de toxina clostridia- na, um domínio de ligação de toxina clostridiana, uma região de alça de ca- deia dupla, um sÍtio de clivagem da protease exógena, e pelo menos dois sÍtios de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio " 15 de clivagem de inativação; onde the exogenous protease cleavage site loca- lizado no interior da região de alça de cadeia dupla. ' j

3. Uma toxina clostridiana de acordo com o aspecto 2, onde os sÍtios de clivagem de inativação compreendem um sÍtio dual de trombina- trombina e/ou um sÍtio dual de fator Xa-trombina.

_ 20 4. Uma quimera de toxina clostridiana compreendendo um do- mínio enzimático de toxina clostridiana, um domínio de translocação de toxi- na clostridiana, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, e uma cli- vagem de inativação localizada no interior de uma região de sÍtio de cliva- gem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica 10- 25 calizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

5. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana de ' acordo com os aspectos 1-4, onde a região de sÍtio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 462-496 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 e/ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 458-492 de SEQ ID N°: 3; 30 os aminoácidos 464-487 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N?: 9, e/ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 463-496 de SEQ ID N°: 11 e/ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 458-491 de SEQ ID N°: 13 e/ou SEQ

ID N°: 14; os aminoácidos 434-467 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e/ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 453-486 de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, e/ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 458-491 de SEQ ID N°: 21: os aminoá- cidos 443-476 de SEQ ID N°: 23; e/ou os aminoácidos 434-467 de SEQ ID 5 N°:24e/ouSEQIDN°:25.

6. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana de acordo com os aspectos 1-4, onde a região de sÍtio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 618-634 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 e/ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 614-630 de SEQ ID N°: 3; 10 os aminoácidos 605-621 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N": 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, e/ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 613-629 de SEQ ID N°: 11 e/ou SEQ ID N°: 12: os aminoácidos 609-625 de SEQ ID N°: 13 e/ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 587-603 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e/ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 604-620 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos " 15 605-621 de SEQ ID N°: 19 e/ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 610- 626 de SEQ ID N": 2·1-; os aminoácidos 596-612 de Seq ID N°: 23; e/ou os aminoá- :.- cidos 587-603 de SEQ ID N°: 24 e/ou SEQ ID N°: 25.

7. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana de r acordo com os aspectos 1-4, onde a região de sÍtio de clivagem de inativa- - 20 ção compreende os aminoácidos 638-651 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 e/ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 634-647 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 625-638 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, e/ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 633-646 de SEQ ID N°: 11 e/ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 629-642 de SEQ ID N°: 13 e/ou SEQ 25 ID N°: 14; os aminoácidos 607-620 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e/ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 624-637 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 625-638 de SEQ ID N°: 19 e/ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 630- 643 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 616-629 de SEQ ID N°: 23; e/ou os aminoá- cidos 607-620 de SEQ ID N°: 24 e/ou SEQ ID N°: 25. 30 8. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana de -acordo com os aspectos 1-4, onde a região de sÍtio de cIivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 665-687 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2,

SEQ ID N°: 4 e/ou SEQ ID N°: 5: os aminoácidos 661-683 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 652-674 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, e/ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 660-682 de SEQ ID N°: 11 e/ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 656-678 de SEQ ID N°: 13 e/ou SEQ 5 ID N°: 14; os aminoácidos 634-659 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e/ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 651-676 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 652-677 de SEQ ID N°: 19 e/ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 657- 679 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 643-668 de SEQ ID N°: 23; e/ou os aminoá- cidos 634-659 de SEQ ID N°: 24 e/ou SEQ ID N°: 25. 10 9. A toxina cIostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana de acordo com os aspectos 1-4, onde a região de sítio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 752-765 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 e/ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 748-761 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 739-752 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ " 15 ID N°: 9, e/ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 747-760 de SEQ ID N°: 11 e/ou SEQ:ID N°: 12; os aminoácidos 743-756 de SEQ ID N°: 13 e/ou SEQ---.- ID N°: 14; os aminoácidos 724-739 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e/ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 741-756 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos µ 742-757 de SEQ ID N°: 19 e/ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 744- 757 de 20 SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 733-748 de SEQ ID N°: 23: e/ou os aminoá- cidos 724-739 de SEQ ID N°: 24 e/ou SEQ ID N°: 25.

10. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana de acordo com os aspectos 1-4, onde a região de sÍtio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 826-835 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N": 2, 25 SEQ ID N°: 4 e/ou SEQ ID N": 5; os aminoácidos 824-831 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 813-824 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, e/ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 821-830 de SEQ ID N°: 11 e/ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 817-826 de SEQ ID N°: 13 e/ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 800-809 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e/ou 30 SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 817-826 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos -- 818-827 de SEQ ID N°: 19 e/ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 818- 827 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 809-819 de SEQ ID N": 23; e/ou os aminoá-

cidos 800-809 de SEQ ID N°: 24 e/ou SEQ ID N°: 25.

11. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana de acordo com os aspectos 1-4, onde a região de sÍtio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 844-863 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, 5 SEQ ID N°: 4 e/ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 840-859 de SEQ ID N°: 3; os aminoácidos 831-850 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, e/ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 839-858 de SEQ ID N°: 11 e/ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 835-854 de SEQ ID N°: 13 e/ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 818-837 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e/ou 10 SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 835-854 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 836-855 de SEQ ID N°: 19 e/ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 836- 855 de SEQ ID N": 21; os aminoácidos 828-847 de SEQ ID N°: 23; e/ou os aminoá- cidos 818-837 de SEQ ID N": 24 e/ou SEQ ID N°: 25.

12. A toxina clostridiana e/ou quimera de t?xina clostridiana de " 15 acordo com os aspectos 1-4, onde a região de sítio de clivagem de inativa- çãQ'.:compreende os aminoácidos 871-895 de SEQ ID N": 1, SEQ ID 'N?: 2, SEQ ID N°: 4 e/ou SEQ ID N°: 5; os aminoácidos 867-891 de SEQ ID-N°: 3; os aminoácidos 858-882 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N": 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, e/ou SEQ ID N°: 10; os aminoácidos 866-890 de SEQ ID N°: 11 20 e/ou SEQ ID N°: 12; os aminoácidos 862-886 de SEQ ID N°: 13 e/ou SEQ ID N°: 14; os aminoácidos 845-869 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e/ou SEQ ID N°: 17; os aminoácidos 862-886 de SEQ ID N°: 18; os aminoácidos 863-887 de SEQ ID N°: 19 e/ou SEQ ID N°: 20; os aminoácidos 863- 887 de SEQ ID N°: 21; os aminoácidos 855-879 de SEQ ID N°: 23; e/ou os aminoá- 25 cidos 845-869 de SEQ ID N°: 24 e/ou SEQ ID N°: 25.

13. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana de acordo com os aspectos 1-12, onde o domínio enzimático de toxina cIostri- diana compreende um domínio enzimático de BONT/A, um domínio enzimá- tico de BONT/B, um domínio enzimático de BONT/CI, um domínio enzimáti- 30 co de BONT/D, um domínio enzimático de BONT/E, um domínio enzimático de BONT/F, um domínio enzimático de BONT/G, um domínio enzimático de BaNT, e/ou um domínio enzimático de BuNT.

14. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana de acordo com os aspectos 1-13, onde o sÍtio de clivagem de inativação com- ' preende sÍtios de clivagem da trombina, sÍtios de clivagem da plasmina, sÍ- tios de clivagem do fator de coaguiação Vlla, sítios de clivagem do fator de 5 coagulação lXa, sÍtios de clivagem do fator de coagulação Xa, sÍtios de cli- vagem do fator de coagulação Xla, sÍtios de clivagem do fator de coagula- ção Xlla, sÍtios de clivagem da calicreína plasmática, sÍtios de clivagem do receptor-l acoplado à proteína G ativada pela protease (PARI), sÍtios de clivagem de PAR2, sÍtios de clivagem de PAR3, sÍtios de clivagem de PAR4, sÍtios de clivagem da metaloproteinase matricial-2 (MMP-2), sÍtios de cliva- gem da metaloproteinase matricial-9 (MMP-9), sÍtios de clivagem da furina, sÍtios de cIivagem do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA), sÍtios de clivagem do ativador de plasminogênio tipo tecido (tPA), sÍtios de cliva- gem da triptase-E, sÍtios de clivagem da protease-7 de mastócito de camun- 15" dongo (mMCP-7), sÍtios de clivagem da enzima-l conversora de endotelina '"5·:,-(ECE-1), sÍtios de clivagem do grupo sanguíneo de Kell, sÍtios de-clivagem de DPPlV, sÍtios de clivagem da metalopeptidase ADAM com motivo-13 tipo 1 da trombospondina (ADAMTS13), e/ou sÍtios de clivagem da catepsina L.

15. A toxina cIostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana de acordo com os aspectos 1-14, onde o domínio de translocação de toxina clostridiana compreende um domínio de translocação de BONT/A, um domí- nio de translocação de BONT/B translocation domain, uma BONT/CI, um domínio de translocação de BONT/D, um dominio de translocação de BONT/E, um domínio de translocação de BONT/F, um domínio de transloca- ção de BONT/G, um domínio de translocação de TeNT, um domínio de translocação de BaNT, e/ou um domínio de translocação de BuNT.

16. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana de acordo com os aspectos 1-15, onde o sÍtio de cIivagem de inativação com- preende um sÍtio dual de trombina-trombina, um sÍtio de fator Xa, um sítio dual de fator Xa-trombina, e/ou um sÍtio de MMP-9.

17. A toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana de acordo com os aspectos 1 -16, onde o domínio de ligação de toxina não clostridiana, compreende um domínio de ligação de opioide, a um domínio de ligação de taquiquinina, um domínio de Iigação de melanocortina, um domínio de ligação de galanina, um domínio de ligação de granina, um do- mínio de ligação do peptídio relacionado ao neuropeptídio Y, u"m domínio de 5 ligação de neuro-hormônio, um domínio de ligação de citocina neurorregula- dora, um domínio de ligação do peptídio quinina, um domínio de ligação do fator de crescimento, e/ou um domínio de ligação do hormônio semelhante ao glucagon.

18. Uma BONT/A compreendendo um sitio de clivagem de inati- lO vação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativa- ção, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no do- mínio de translocação e/ou no subdomínio de Iigação de Hcn.

19. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/A, um domínio de translocação de BONT/A, um domínio de " 15 ligação de BONT/A, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interi- .- "· or de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a-. região de sítio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

P

20. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- _ 20 mático de BONT/A, um domínio de translocação de BONT/A, um domínio de ligação de BONT/A, um sÍtio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça 25 de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica locali- zada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de Iigação de Hcn.

21. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/A, um domínio de translocação de BoNT/A, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação loca- 30 lizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no dominio de trans- locação e/ou no subdÒmínio de ligação de Hcn.

22. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/A, um domínio de translocação de BONT/A, um dominio de ligação de toxina não clostridiana, um sÍtio de clivagem da protease exóge- na, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativa- 5 ção localizado no interior de uma região, de sÍtio de clivagem de inativação, onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inati- vação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn. 10 23. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 18-22, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação compreende os aminoáci- dos 462-496, 618-634, 638-651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863, e/ou 871 -895 de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 e/ou SEQ ID N°: 5, e/ou os aminoácidos 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822- " 15 831, 840-859, e/ou 867-891 de SEQ ID N°: 3.

24. Uma BONT/B compreendendo um sÍtio de clivagem de inati- .,.- . vação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativa- ção, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no do- . mínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn. 20 25. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/B, um domínio de translocação de BoNT/B, um domínio de ligação de BoNT/B, e um sÍtio de clivagem de inativação Iocalizado no interi- or de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou 25 no subdomínio de ligação de Hcn.

26. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/B, um domínio de translocação de BoNT/B, um domínio de ligação de BONT/B, um sítio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sítio de clivagem de inativação localizado no 30 interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sítio de clivagem de inativação fica locali-

zada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn. ' 27. Uma toxina cIostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/B, um domínio de translocação de BONT/B, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação loca- 5 lizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de trans- locação e/ou no subdomínio de Iigação de Hcn.

28. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/B, um domínio de translocação de BONT/B, um domínio de ligação de toxina não cIostridiana, um sÍtio de clivagem da protease exóge- na, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativa- ção localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica Iocalizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inati- vação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

29. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 24-28, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação compreende os aminoáci- dos 464-487, 605-621, 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850, e/ou 858-882 de SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, e/ou SEQIDN°:1O.

30. Uma BONT/CI compreendendo um sÍtio de clivagem de ina- tivação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativa- ção, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no do- mínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn-

31. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/CI, um domínio de translocação de BONT/CI, um domínio de ligação de BoNT/CI, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de cIivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

32. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi-

mático de BONT/CI, um domínio de translocação de BONT/CI, um domínio de ligação de BoNT/CI, um sÍtio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de cIivagem de inativação locali- zado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde o 5 sÍtio de clivagem da protease exógena fica Iocalizado no interior da região - de alça de cadeia dupla; onde a região de sítio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn-

33. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- lO mático de BONT/CI, um domínio de translocação de BONT/CI, um domínio de ligação de toxina não cIostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação " localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sítio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn- " 15 34. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/CI, um domínio de translocação de BONT/CI, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, um sÍtio de clivagem da protease exó- gena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inati- . vação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativa- - 20 ção, onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica locaiizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

35. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 30-34, 25 onde a região de sÍtio de clivagem de inativação compreende os aminoáci- dos 463-496, 613-629, 633-646, 660-682, 747-760, 821-830, 839-858, e/ou 866-890deSEQID N°: 11 e/ou SEQ ID N°: 12.

36. Uma BONT/D compreendendo um sÍtio de clivagem de inati- vação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativa- 30 ção, onde a região de sítio de clivagem de inativação fica localizada no do- mínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

37. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi-

mático de BONT/D, um domínio de translocação de BONT/D, um domínio de ligação de BONT/D, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no inte- rior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou 5 no subdomínio de ligação de Hcn-

38. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/D, um domínio de translocação de BONT/D, um domínio de ligação de BoNT/D, um sÍtio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no 10 interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de cIivagem de inativação fica locali- zada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

39. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- " 15 mático de BONT/D, um domínio de translocação de BONT/D, um domínio de ligação de toxina não cIostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação loca- lizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica Iocalizada no domínio de trans- locação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn. 20 40. Uma toxina clostridiana .compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/D, um domínio de translocação de BoNT/D, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, um sÍtio de clivagem da protease exóge- na, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativa- ção localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, 25 onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inati- vação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

41. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 36-40, 30 onde a região de sÍtio de clivagem de inativação compreende os aminoáci- dos 458-491, 609-625, 629,-642, 656-678, 743-756, 817-826, 835-854, e/ou 862-886 de SEQ ID N°: 13 e/ou SEQ ID N°: 14,

42. Uma BONT/E compreendendo um sÍtio de clivagem de inati- vação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativa- ção, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica Iocalizada no do- mínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn. 5 43. Uma toxina cIostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/E, um domínio de translocação de BoNT/E, um domínio de ligação de BoNT/E, e um sítio de clivagem de inativação localizado no interi- or de uma região de sítio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de cIivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou 10 no subdomínio de ligação de Hcn.

44. Uma toxina cIostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/E, um domínio de translocação de BONT/E, um domínio de ligação de BONT/E, um sÍtio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no " 15 interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde o sÍtio de -clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica locali- zada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

45. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- _ 20 mático de BONT/E, um domínio de translocação de BONT/E, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação loca- lizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica Iocalizada no domínio de trans- locação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn- 25 46. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/E, um domínio de translocação de BoNT/E, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, um sÍtiO de cIivagem da protease exóge- na, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativa- ção Iocalizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, 30 onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cad.eia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inati- vação fica Iocalizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

47. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 42-46, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação compreende os aminoáci- dos 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837, e/ou 5 845-869 de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, e/ou SEQ ID N°: 17.

48. Uma BONT/F compreendendo um sÍtio de clivagem de inati- vação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativa- ção, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica Iocalizada no do- mínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn- 10 49. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/F, um domínio de translocação de BoNT/F, um domínio de ligação de BONT/F, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interi- or de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou " 15 no subdomínio de ligação de Hcn. 50'. Uma toxina cbstridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/F, um dominio de translocação de BONT/F, um domínio de ligação de BONT/F, um sÍtio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no 20 interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de cIivagem de inativação fica locali- zada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de Iigação de Hcn.

51. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- 25 mático de BoNT/F, um domínio de translocação de BONT/F, um domínio de ligação de toxina não cIostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação loca- lizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de trans- locação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn. 30 52. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BoNT/F, um domínio de translocação de BONT/F, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, um sÍtio de clivagem da protease exóge-

na, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativa- ção localizado no interior de uma região de sÍtio de cIivagem de inativação, onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inati- 5 vação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

53. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 48-52, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação compreende os aminoáci- dos 453-486, 604-620, 624-637, 651-676, 741-756, 817-826, 835-854, e/ou 862-886 de SEQ ID N°: 18; e/ou os aminoácidos 453-486, 605-621, 625- 638, 652-677, 742-757, 818-827, 836- 855, e/ou 863-887 de SEQ ID N°: 19 e/ouSEQIDN°:20.

54. Uma BONT/G compreendendo um sÍtio de clivagem de inati- vação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativa- ção, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no do- mínio de translocação e/o.u-"no subdomínio de ligação de Hcn.

55. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/G, um domínio de translocação de BONT/G, um domínio de ligação de BoNT/G, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no inte- rior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sítio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

56. Uma toxina cIostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/G, um domínio de translocação de BoNT/G, um domínio de ligação de BONT/G, um sÍtio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma regiáo de sÍtio de clivagem de inativação, onde o sÍtio de cIivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica locali- zada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

57. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- -. mático de BONT/G, um domínio de translocação de BONT/G, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação loca- lizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de trans- Iocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn. 5 58. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BONT/G, um domínio de translocação de BoNT/G, um domínio de ligação de toxina não clostridiana, um sÍtio de clivagem da protease exóge- na, uma região de alça de cadeia dupla, e um sítio de clivagem de inativa- 'ção Iocalizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, 10 onde o sÍtio de clivagem da protease exógena fica Iocalizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de ciivagem de inati- vação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

. 59. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 54-58, " 15 onde a região de sÍtio de clivagem de inativação compreende os aminoáci- dos 458-491, 610-62-6,-: 630-643, 657-679, 744-757, 818-827, 836-855, e/ou .

... ..-.- -.. .

863-887 de SEQ ID N°: 21.

60. Uma BaNT compreendendo um sÍtio de clivagem de inativa- ção localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, . 20 onde a região de sítio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

61. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BaNT, um domínio de translocação de BaNT, um domínio de liga- ção de BaNT, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de 25 uma região de sÍtio de cIivagem de inativação, onde a região de sÍtio de cli- vagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

62. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BaNT, um domínio de translocação de BaNT, um domínio de liga- 30 ção de BaNT, um sÍtio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no in- terior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde o sÍtio de cli-

vagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localiza- da no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

63. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- 5 mático de BaNT, um domínio de translocação de BaNT, um domínio de Iiga- ção de toxina não cIostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação localiza- do no interior de uma região de sÍtio de cIivagem de inativação, onde a regi- ão de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translo- cação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn. 10 64. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BaNT, um domínio de translocação de BaNT, um domínio de liga- ção de toxina· não clostridiana, um sÍtio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde ' 15 o sÍtio de clivagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cad.eia"dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inativação · fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

65. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 60-64, 20 onde a região de sÍtio de clivagem de inativação compreende os aminoáci- dos 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847, e/ou 855-879 de SEQ ID N°: 23.

66. Uma BuNT compreendendo um sÍtio de clivagem de inativa- ção localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, 25 onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica Iocalizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

67. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BuNT, um domínio de translocação de BuNT, um domínio de liga- ção de BuNT, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de 30 uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a região de sÍtio de cli- vagem de inativação fica Iocalizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

68. Uma toxina cIostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BuNT, um domínio de translocação de BuNT, um domínio de liga- ção de BuNT, um sÍtio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no in- 5 terior de uma região de SÍtio de clivagem de inativação, onde o sítio de cli- .. vagem da protease exógena fica localizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localiza- da no domínio de translocação e/ou no subdomínio de Iigação de Hcn.

69. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- lO mático de BuNT, um domínio de translocação de BuNT, um domínio de liga- ção de toxina não clostridiana, e um sÍtio de clivagem de inativação localiza- do no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde a regi- ão de sÍtio de clivagem de inativação fica Iocalizada no domínio de translo- cação e/ou no subdomínio de Iigação de Hcn. " 15 70. Uma toxina clostridiana compreendendo um domínio enzi- mático de BuNT, um domínio de translocação de BuNT, um-domínio de liga- -. .- - ção de toxina não cIostridiana, um sítio de clivagem da protease exógena, uma região de alça de cadeia dupla, e um sÍtio de clivagem de inativação p localizado no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativação, onde , 20 o sítio de clivagem da protease exógena fica Iocalizado no interior da região de alça de cadeia dupla; onde a região de sÍtio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn.

71. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 66-70, 25 onde a região de sÍtio de clivagem de inativação compreende os aminoáci- dos 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837, e/ou 845-869 de SEQ ID N°: 24 e/ou SEQ ID N°: 25.

72. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 1 -71, onde a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana compreenden- 30 do um sítio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior em relação à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clos- tridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana similar, porém sem o sÍtio de cIivagem de inativação.

73. A toxina e/ou a quimera de acordo com o aspecto 72, onde a toxina cIostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior 5 que pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70°6, pelo menos 8Ó°/o, pelo menos 90%, pelo menos 100%, 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190%, pelo menos 200%, 210°/o, pelo 10 menos 220%, pelo menos 230°6, pelo menos 240%, pelo menos 250%, pelo menos 260%, pelo menos 270%, pelo menos 280%, pelo menos 290%, e/ou pelo menos 300%, em relação à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação, e/ou onde " 15 a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior que no máximo 1O°/o, no máximo 20%, no máximo 30°6, no máximo 40%, no máximo 50%, no máximo 60%, no máximo 70%, no máximo 80%, no máxi- e mo 90%, no máximo 1OO°/o, 110%, no máximo 120%, no máximo 130%, no . 20 máximo 140%, no máximo 150%, no máximo 160%, no máximo 170°6, no máximo 180%, no máximo 190%, no máximo 200%, 210%, no máximo 220%, no máximo 230°6, no máximo 240%, no máximo 250%, no máximo 260%, no máximo 270%, no máximo 280%, no máximo 290%, e/ou no má- ximo 300%, em relação à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina 25 clostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridia- na similar, porém sem o sÍtio de cIivagem de inativação, e/ou onde a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior que cerca de 1O°/o a cerca de 300%, cerca de 2Õ°/o a cerca de 300%, cerca de 30 3O°/o a cerca de 300%, cerca de 40% a cerca de 300%, cerca de 50% a cer- ca de 300%, cerca de 60% a cerca de 300%, cerca de 70% a cerca de 300%, cerca de 80% a cerca de 300%, cerca de 9Õ°/o a cerca de 300%, e/ou cerca de 1OO°/o a cerca de 300%, em relação à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou qui- mera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inati- . vação, ou onde a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana 5 compreendendo um sÍtio de cIivagem de inativação tem uma margem de . segurança que é maior que pelo menos 1 vez, pelo menos 1 vez, pelo me- nos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, e/ou pelo menos 10 vezes, em relação à mesma toxina cIostridiana e/ou quimera de 10 toxina cIostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação, e/ou onde a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sítio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior que pelo menos 1 vez, no máximo 1 vez, no máximo 3 vezes, no máximo 4 " 15 vezes, no máximo 5 vezes, no máximo 6 vezes, no máximo 7 vezes, no má- ximo 8 vezes, no máximo 9 vezes, e/ou no máximo 10 vezes, em r.elação à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação, e/ou onde a toxina clostridiana e/ou quimera , 20 de toxina clostridiana compreendendo um sítio de clivagem de inativação tem uma margem de segurança que é maior que cerca de 1 vez a cerca de 10 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 9 vezes, cerca de 1 vezes a cerca de 8 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 7 vezes, cerca de 1 vezes a cerca de 6 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 5 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 10 25 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 9 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 8 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 7 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 6 vezes, e/ou cerca de 2 vezes a cerca de 5 vezes.

74. A toxina e/ou a quimera de acordo com os aspectos 1-73, onde a adição do sÍtio de clivagem de inativação aumenta a margem de se- 30 gurança da toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana em rela- ção à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana similar, porém

- sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional.

75. A toxina e/ou a quimera de acordo com o aspecto 74, onde a toxina cIostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana compreende a adição de um sítio de clivagem de inativação que aumenta a margem de segurança 5 da toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana em relação à mesma toxina cIostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional em pelo menos 1O°/o, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 5Õ°/o, pelo menos 10 60%, pelo menos 7Ô°/o, pelo menos 80°6, pelo menos 9O°/o, pelo menos 100%, 110%, pelo menos 120°6, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190%, pelo menos 200%, 210%, pelo menos 220%, pelo menos 230%, pelo menos 240%, pelo menos 250%, pelo menos 260%, pelo menos " 15 270%, pelo menos 280%, pelo menos 290%, e/ou pelo menos 300%, ou zi.--.;· onde a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana compreende a adição de um sÍtio de clivagem de inativação que aumenta a margem de segurança of a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana em relação à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana e/ou 20 a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana similar, porém se,m o sÍtio de clivagem de Ínativação adicional em no máximo 1O°/o, no má- ximo 20%, no máximo 3Õ°/o, no máximo 4Õ°/o, no máximo 5Õ°/o, no máximo 60%, no máximo 7Õ°/o, no máximo 8Õ°/o, no máximo 9Õ°/o, no máximo 1OO°/,, 110%, no máximo 120%, no máximo 130°6, no máximo 140%, no máximo 25 150%, no máximo 160%, no máximo 170%, no máximo 180%, no máximo 190%, no máximo 200%, 210%, no máximo 220%, no máximo 230%, no máximo 240%, no máximo 250%, no máximo 260%, no máximo 270%, no máximo 280%, no máximo 290%, e/ou no máximo 300%, ou onde a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana compreende a adição de um 30 sÍtio dé clivagem de inativação que aumenta a margem de segurança da toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana em relação à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana e/ou a uma toxina cIostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional em cerca de 10% a cerca de 300°6, cerca de 20°6 a cerca de 300%, cerca de 30% a cerca de 300%, cerca de 40% a cerca de 3OÕ°/o, cerca de 50°6 a cerca de 300%, cerca de 60% a cerca de 5 300%, cerca de 7Õ°/o a cerca de 300%, cerca de 80% a cerca de 300%, cer- . ca de 90% a cerca de 300%, e/ou about 100% a cerca de 300%, ou onde a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana compreende a adição de um sítio de clivagem de inativação que aumenta a margem de segurança da toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana em relação à 10 mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional em pelo menos 1 vez, pelo menos 1 vez, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 " 15 vezes, e/ou pelo menos 10 vezes, e/ou onde a toxina clostridiana e/ou qui- mera de toxina clostridiana compreende a adição de um sÍtio de clivagem de inativação que aumenta a margem de segurança da toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana em relação à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina cIostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera

, 20 de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional em, por exemplo, no máximo 1 vez, no máximo 3 vezes, no máxi- mo 4 vezes, no máximo 5 vezes, no máximo 6 vezes, no máximo 7 vezes, no máximo 8 vezes, no máximo 9 vezes, e/ou no máximo 10 vezes, e/ou onde a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana compreende a 25 adição de um sÍtio de clivagem de inativação que aumenta a margem de segurança da toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana em re- lação à mesma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana e/ou a uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana similar, porém sem o sÍtio de clivagem de inativação adicional em cerca de 1 vez a cerca 30 de 10 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 9 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 8 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 7 vezes, cerca de 1 vez a cerca de 6 ve- zes, cerca de 1 vez a cerca de 5 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 10 ve-

zes, cerca de 2 vezes a cerca de 9 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 8 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 7 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 6 vezes, e/ou about 2 vezes a cerca de 5 vezes.

76. Uma molécula de poIinucleotídeo codificando uma toxina 5 e/ou quimera de acordo com qualquer um dos aspectos 1-75.

77. A molécula de polinucleotídeo, onde a molécula compreende as SEQ ID N°: 530, SEQ ID N°: 532, SEQ ID N°: 534, e/ou SEQ ID N°: 536.

78. Um método de produção de uma toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana compreendendo a etapa de expressar em 10 uma célula uma molécula de polinucleotídeo de acordo com o aspecto 76 e/ou 77, onde a expressão da molécula de poIinucleotÍdeo produz a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana codificada.

79. Um método de produção de uma toxina clostridiana modifi- cada compreendendo as etapas de: " 15 a. introduzir em uma célula uma molécula de polinucleotÍdeo de acordo com o aspceto 76 e/ou 77; e . .- .. b. expressar a molécula de pohnucleotídeo, onde a expressão da molécula de polinucleotÍdeo produz a toxina clostridiana e/ou quimera de toxina clostridiana codificada.

- 20 80. Uma toxina cIostridiana compreendendo a SEQ ID N°: 531, SEQ ID N°: 533, SEQ ID N°: 535, e/ou SEQ ID N°: 537.

81. Uma toxina clostridiana compreendendo a SEQ ID N°: 531-

82. Uma toxina clostridiana compreendendo a SEQ ID N": 533.

83. Uma toxina clostridiana compreendendo a SEQ ID N°: 535. 25 84. Uma toxina clostridiana compreendendo a SEQ ID N°: 537.

EXEMPLOS Os exemplos não limitativos a seguir são oferecidos a título ilus- trativo apenas para facilitar uma compreensão mais completa das modalida- des apresentadas e não são de forma alguma destinados a limitar qualquer 30 uma das modalidades divulgadas na presente invenção. Exemplo 1 ldentificação de regiões de sÍtio de clivagem de inativação

Este exemplo ilustra como identificar regiões em uma toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana adequadas para modificar a toxina de forma a compreender um sÍtio de clivagem de inativação e como fazer uma toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreen- 5 dendo um sÍtio de clivagem de inativação. . Para identificar uma localização ou localizações na estrutura proteica adequadas como uma região sÍtio de clivagem de inativação em potencial, a estrutura tridimensional de uma BoNT/A foi inicialmente analisa- da por programa de computador para identificar alças de superfície exposta 10 ou regiões prolongadas que seriam mais accessíveis a uma protease.

Das regiões previstas como accessíveis, oito foram selecionadas para análise adicional: os aminoácidos 462-496 de SEQ ID N°: 1, os aminoácidos 618- - 634 de SEQ ID N°: 1, os aminoácidos 638-651 de SEQ ID N°: 1, os aminoá- cidos 665-687 de SEQ ID N°: 1, os aminoácidos 752-765 de SEQ ID N°: 1, e " 15 aminoácidos 826-835 de SEQ ID N°:: 1, os aminoácidos 844-863 de SEQ ID N": 1, e aminoácidos 871 -895 de SEQ ID N°: 1..: " - Para determinar se uma região identificada por análise compu- tacional poderia funcioriar como uma região de sÍtio de clivagem de inativa- ção, sÍtios de cIivagem de trombina foram geneticamente construídos nes- 20 sas regiões usando-se mutagênese com multi-iniciadores e foram analisa- dos quanto a sua capacidade de serem clivados pela trombina.

Foi montada uma reação de 50 µ1 n compreendendo um lago de iniciadores de iniciado- res oligonucleotÍdicos unidirecionais contendo cada um a modificação dese- jada (125 ng de cada iniciador) misturado em diferentes proporções com 25 gabarito de DNA compreendendo uma construção de expressão codificando uma BONT/A, tal como, por exemplo, uma construção de expressão com- preendendo SEQ ID N°: 526 codificando SEQ ID N°: 527, ou uma constru- ção de expressão compreendendo SEQ ID N°: 528 codificando SEQ ID N": 529, que foi hipermetilada com metilase dam.

A esta mistura foram adicio- 30 nados 5 µ1 de tampão PCR lOx, 1 µ1 de desoxirribonucleotídeos (dNTPs), 1 µ1 de DNA polimerase de alta fidelidade PFUULTRA"" a 2,5 unidades/µl (S- tratagene, La Jolla, CA), DNA ligase Pfu, ATP, e água livre de nuclease para completar um volume final de 50 µ1. As condições do termociclizador foram: 30 ciclos de 96°C por 1 minuto, 60°C por 30 segundos, e 68°C por 20 minu- tos. Subsequente à termociclização, 1 µ1 da enzima de restrição Dpnl (Stra- tagene, La Jolla, CA) foi adicionado à reação e incubado por 1 hora a 37°C 5 para digerir o DNA gabarito e reduzir a recuperação de clones do tipo selva- gem. A mistura reacional digerida foi transformada em células Acella eletro- competentes de E. coli BL21 (DE3) (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) por eletroporação, plaqueada em placas de ágar de Luria-8ertani a 1,5% (pH 7,0) contendo 50 µg/mL de canamicina, e colocada em uma incubadora a 37°C para crescer durante a noite. Bactérias contendo construções de ex- pressão foram identificadas como coIônias resistentes à canamicina. Cons- truções candidatas foram isoladas usando-se um procedimento de minipre- paração de plasmídeo de lise alcalina e analisadas por sequenciamento pa- ra determinar a frequência e a identidade das mutações incorporadas. A Tabela 7 lista cada BONT/A compreendendo um sÍtio de clivagem de trombi- na (BoNT/A-TCS) feito e"testado nesta análise de varredura de trombina.

TABELA 7. Análise de varredura de tmmbina ""'""—=~_==————--=——————-= Região tá Modikcação i ÉxwessãQ i SensihMale l Potência da l I da trombina i BOMT/A 462-496 i t482mslvprgs i + I nd ) nd 462496 l A489insLVPRgS J ++ i ++ l nd 61&634 i E620insLVPRGS i ,. - i nd d ! "' nd "7 638-65i ;, M646insLVPRGS i -, "" ,_ , nd ) nd 6EÍY87 : l$73insLVPRgS I " I ND nd 752-765 | E7wnsLvpReL_ 4 - Á__. !!!L_ L .J'L ..4 82'&s35 : MR827GT-inSLVPRGS _1 -i'" , nd i nd =s' L_Á='"""±.-..- -"-- ""' I "" 4 nd 3 l DS48insLVPRGS _j_ " _ '"t _l 1_ nd 844563 i Q852imLVPRGS I" /+ i 'nd' " nd H mq 63 t l862mlvprgs ' I' +"+ t ++ _ , nd 871-895 l E868insLVPRGS "" ) " ) " i" " nd " ""q 871-Sq5 i ddE868YfKN!-insLVPRgS I I nd 871-895 . K871imLVPRgS i '"" l ""' l nd 871-895 i I873insLVPRGS l +++ ) +++E i nd 871-895 l deNmlNTs-jnsLvpRgs I l ) nd 871-995 I T876insLVPRGS I l nd 87¶-895 I L879ins\/PRGS i I l nd 871-895 ! deAL879NLRYE4wLVPRGS Í _ | _ nd 871-895 l N880insLVPRGS I ., """ i · "~" "! 4 05 -· { 871-895 : ,, l88t1wvprgs.. ) _ _l , i nd r— 871-825 i telL881RYE$N-i=LVPR9S I i nd ' :::::: ) :::'::v:::i '--j —=r± e-+ "! _'íií'""_"" -'

f 87i-895 l S88SnsLVPRGS i "" i L ,.. , ND 871-895 L!!dH887L[DL&ins.LVPRGS _ NO 871-895 L88&hsVPRGS ND í 871-895 I D890ínsLVPRGS i -H- I +44-4- I 3-15 871=895 ! L891insVPRG I __J_^ ND 8'71=895 Í deIS892RYA-insVPRG : I I ND T482MSLVPRGS 467A96 + A4891M.VPRGS ) i ND ND 618-634 i E620iNLvpRgs 665-587 i 1673insLvpRGS I " I ND ND l M646insLVPRGS ' 638-651 â 665=687 , Ê 16731WLVPRGS i " i ND ND 825832 MR827GT4M-VPRGS 871-895 K8711WLVPRGS i " I """ ND T844insLVPRGS 844-863 Q852iNLvpRgs : -4+ I ND ND : Q852hsLVPRGS 844-863 ' L862insLVPRGS I _ i ND ND 82'5-832 deIFUj27GT4nsLVPRGS i 4 871-895 K871hsLVPRGS I l ND ND 825832 i delR827GT4nsLVpRgS 871-895 l K880insLVPRGS i _ ) ND I ND E8%insLVPRG" 871-8% 18731WLVPRGS 1.32 '-·-· · L i deÍE8®YIKNI-insLVPRGS I ' ' 871-8Q5 i ddL881RYESN4nsLVPRGS I | i 0.86 1873insLVpRGS 871-895 , E8841WLVPRGS I ., -. I 1.32 .

E ' L8811WVPRGS I +++ 871-895 I L891insVPRG I I '"" 420 l Estmtura pnn%d I +++ l - Sím Controle 3 Sensibilidade da protease: +, menos de 25% da toxina proteolizada entre cerca de 1 e cerca de 4 horas; ++, de 25% a 50% da toxina proteolizada entre cerca de 1 e cerca de 4 horas; +++, de 51 °/) a 75% da toxina prote- olizada entre cerca de 1 e cerca de 4 horas; ++++, mais de 75°6 da toxina proteolizada entre cerca de 1 e cerca de 4 horas. A potência da BoNT/A é calculada dividindo-se o valor de EC50 da toxina pelo valor de EC50 do controle na estrutura principal. ND significa não determinado. Para determinar o nível de expressão de proteína solúvel para , cada BoNT/A-TCS, uma construção de expressão compreendendo cada BoNT/A-TCS foi expressa, purificada por cromatografia por afinidade de me- tal imobilizado e analisada por análise por SDS-PAGE analysis. Primeiro, usando uma pIaca de 96 compartimentos, 100 µ1 de meio PA-0.5G contendo " canamicina a 50 µg/mL foram inoculados com uma única coIônia de células

BL21 (DE3) ancorando a construção de expressão apropriada e foram culti- vados a 37°C com agitação por uma noite.

Uma alíquota de 5 µ1 desta cultu- ra inicial foi usada para inocular 1 mL de ZYP-5052 contendo canamicina a 50 µg/mL e foi cultivada a 37°C com agitação por 3,5 horas e em seguida a 5 22°C por 16 horas.

Uma alíquota de 110 µ1 de reagente para extração de <"

proteína compreendendo o reagente de lise celular FASTBREAK"" lOX (Promega Corp., Madison, Wl), benzonase nuclease a 250 U/mL(EMD Bios- ciences-Novagen, Madison, WI), e coquetel lll inibidor de protease lOX (EMD Biosciences-Calbiochem, Gibbstown, NJ) foi adicionado a cada 1 ml 10 de cultura de expressão em uma placa de 96 compartimentos. 75 µ1 da resi- na HISLINK'" (Promega Corp., Madison, Wl) foram em seguida transferidos para cada compartimento e a mistura alternadamente misturada por pipeta- gem e por agitação a 900 rpm por 30 minutos.

Os Iisados foram transferidos para uma pIaca-filtro com um tamanho de poro de 25 µm. (Promega Corp., " 15 Madison, Wl), com membranas pré-umedecidas com água, e o líquido foi removido por filtração a vácuo.

A resina foi Iavadaa três vezes com 200 µ1 de tampão de lavagem compreendendo 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de imidazol.

A proteína foi eluída pela adição de 200 µ1 de tampão de elui- ção compreendendo 100 mM de HEPES (pH 7,5), 500 mM de imidazole, 20 incubação por 5 minutos e o eluato foi coletado por filtração a vácuo em uma pIaca de 96 compartimentos.

Para efetuar a SDS-PAGE, um igual volume de tampão de a- mostra Laemmli 2 x foi adicionado à BoNT/A purificada com IMAC compre- endendo um SÍtiO de clivagem de trombina, e a mistura foi incubada a 95°C 25 por 5 minutos.

Uma alíquota de 15 µ1 foi carregada e separada por eletrofo- rese em gel de MOPS poliacrilamida usando géis pré-moldados de poliacri- lamida NUPAGE® Novex 4-12% 81s-Tris (lnvitrogen, lnc, Carlsbad, CA) em condições redutoras desnaturantes.

O gel foi lavado e fixado em metanol a 1O°/o e ácido acético a 7°/0 por 30 minutos.

A solução de lavagem foi removi- 30 da e o gel foi incubado na solução de coloração de gel de proteína Ruby SYPRO por 3 horas a uma noite à temperatura ambiente.

O gel colorido foi descolorido em metanol a 10% e ácido acético a 7°/0 por 30 minutos.

O gel descolorido foi visualizado com um imageador digital Fluro-S-Max (81o-Rad). Os resultados da análise de expressão estão dados na Tabela

7. Em geral, toxinas ancorando um sÍtio de clivagem de trombina inserido nas regiões de inativação compreendendo os aminoácidos 462-496 de SEQ 5 ID N°: 1, os aminoácidos 844-863, ou os aminoácidos 871-895 de SEQ ID N°: 1 foram bem expressos. Por exemplo, as toxinas compreendendo A489insLVPRGS foram expressas a cerca de 50% daquela de uma constru- ção de controle do tipo selvagem e as toxinas compreendendo D848insLVPRGS ou N880insLVPRGS foram expressos nos níveis de con- lO trole, ou perto destes (Tabela 7). Estes resultados revelam que as regiões de sÍtio de clivagem de inativação localizados no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn toleraram a modificação das regiões de forma a incluir um sÍtio de clivagem da protease. Para explorar ainda a extensão em que as regiões de sÍtio de " 15 clivagem de inativação identificadas puderam tolerar modificações que in- troduzem um sÍtio de cIivagem da protease, as toxinas foram modificadas de maneira a incluir sÍtios de clivagem de trombina em toda a região. Por e- xemplo, toxinas compreendendo T884insLVPRgS ou L862ins LVPRGS fo- ram feitas para examinar a região de sÍtio de clivagem de inativação com- 20 preendendo 844-863 de SEQ ID N°: 1. De maneira similar, toxinas compre- endendo E868insLVPRGS, delE868YIKNl-insLVPRgS, delN8721INTS- ins- LVPRGS, T876insLVPRGS, L879insVPRGS, delL879NLRYE-insLVPRgS, L881 insVPRGS, delL881 RYESN-insLVPRGS, Y883insLVPRGS, E884insLVPRGS, S885insLVPRGS, delH887LIDLS- insLVPRGS, 25 L888insLVPRGS, L891 insVPRG, e deIS892RYA-insVpRg foram feitas para examinar a região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo 871- 895 de SEQ ID N°: 1. As modificações por inserção e por substituição foram feitas para examinar se o tipo de modificação tinha algum efeito. Em geral, . todas as toxinas ancorando um sÍtio de clivagem de trombina inserido nes- 30 sas regiões de ativação foram expressas nos níveis, ou perto dos níveis, de uma construção-de controle do tipo selvagem. Estes resultados revelam que - as regiões sÍtio de clivagem de inativação no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação de Hcn podem tolerar modificações feitas em qualquer parte de uma região de sítio de inativação. Por fim, a capacidade de uma região de sÍtio de inativação de tolerar a presença de dois ou mais sÍtios de clivagem da protease foi exami- 5 nada (Tabela 7)- Estes resultados indicam que as regiões de sÍtio de cliva- . gem de inativação no domínio de translocação e/ou no subdomínio de liga- ção de HCN podem tolerar modificações que colocam dois ou mais sítios de clivagem da protease em uma região de sÍtio de inativação. Para determinar se uma BONT/A compreendendo um sÍtio de 10 clivagem de trombina poderia ser clivada pela trombina, foi efetuado um en- saio de clivagem com trombina. 5 ljg de cada BONT/A-TCS purificada foram incubados com 1 U de trombina (Novagen) a 23°C por 1 hora, 3 horas, e 18,5 horas. Um controle de zero-enzima também foi paralelamente montado para cada BoNT/A-TCS. Amostras foram coIetadas em cada ponto no tem- " 15 po e rapidamente resfriadas com tampão de carga de SDS incluindo DTT e analisadas por SDS-PA.GE da maneira descrita acima. Os resultados da análise de expressão estão dados na Tabela

7. Em geral, a modificação de uma região de sítio de cIivagem de inativação compreendendo os aminoácidos 467-496, 844-863, ou 871-895 de SEQ ID 20 N°: 1 de modo a incluir um sÍtio de clivagem da protease resultou em uma toxina que era susceptível à clivagem proteolítica pela protease apropriada. Para determinar se uma BONT/A compreendendo um sítio de clivagem de trombina mantinha sua potência, foi efetuado um ensaio de ati- vidade da BONT/A usando-se um ensaio de atividade baseado em célula. 25 Para conduzir o ensaio de atividade baseado em célula, cerca de 1,2 x 106 células Neuro-2a ou S1Ma foram pIaqueadas nos compartimentos de pIacas de cultura de tecido de 24 compartimentos contendo 1 mL de meio livre de soro contendo meio essencial mínimo, 2 mM de GLUTAMAX"" I com sais de Earle, 1 x suplemento B27, 1 x suplemento N2, 0,1 mM de aminoácidos 30 não essenciais 10 mM de HEPES e 25 µg/mL de GTlb. As células foram incubadas em uma incubadora a 37°C sob dióxido de carbono a 5% até as. células diferenciarem, segundo avaliado por critérios morfológicas tradicio-

'7 nais e rotineiros, tal como a interrupção do crescimento e a extensão de neurite (aproximadamente 3 dias). O meio foi aspirado de cada comparti- mento e substituído por 1) meio fresco não contendo toxina (linhagem celu- lar não tratada) ou 2) meio fresco contendo 1 nM de complexo de BoNT/A 5 (linhagem celular tratada). Depois de incubação por uma noite, as células foram lavadas aspirando-se o meio e enxaguando-se cada compartimento com 200 µ1 de 1 x PBS.

Para coIeta das células, o 1 x PBS foi aspirado, as células foram lisadas por adição de 50 µ1 de 2 x tampão de carga de SDS, o lisado foi transferido para um tubo de ensaio limpo e a amostra foi aquecida 10 até 95°C por 5 minutos.

Para detectar a presença de produtos de SNAP-25 clivados, uma alíquota de cada amostra coletada foi analisada por análise da mancha ocidental.

Nesta análise, uma alíquota de 12 µ1 da amostra coletada foi se- parada por eletroforese em gel de MOPS poliacrilamida usando géis pré- " 15 moldados de poliacrilamida NUPAGE® Novex 12°/o 81s-Tris (Invitrogen lnc., Carlsbad, CA) em. condições redutoras desnaturantes.

Os peptídios separa" dos foram transferidos do gel para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Invitrogen lnc., Carlsbad, CA) por análise da mancha ocidental u- sando um aparelho de células transferência eletroforética semi-seco

. 20 TRANS-BLOT® SD (81o-Rad Laboratories, Hercules, CA). As membranas de PVDF foram bloqueadas por incubação à temperatura ambiente por 2 horas em uma solução contendo solução salina tamponada com Tris (TBS) (25 mM de ácido clorídrico de 2-amino-2-hidroximetil-1,3- propanodiol (Tris- HCI)(pH 7,4), 137 mM de cloreto de sódio, 2,7 mM de cloreto de potássio), 25 0,1 °/) de T\NEEN-20® (polioxietileno (20) sorbitan monolaurato), 2% de al- bumina sérica bovina (BSA), 5°/0 de leite seco desnatado.

As membranas bloqueadas foram incubadas a 4°C por uma noite em TBS, 0,1 °/0 de TWEEN-20® (polioxietileno (20) sorbitan monolaurato), 2% de BSA, e 5% de leite seco desnatado contendo 1) uma diluição 1 :5.000 de um anticorpo 30 monoclonal de camundongo oc-SNAP-25 como o anticorpo primário (SMl-81; Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD): ou 2) uma diluição 1 :5.000 de antissoro policlonal de coelho S9684 o-SNAP-25 como o anticorpo pri-

mário (Sigma, St. Louis, MO). Tanto o anticorpo monoclonal de camundongo quanto o anticorpo policlonal de coelho oc-SNAP-25 podem detectar o subs- trato SNAP-25 não clivado e o produto de clivagem de SNAP-25, possibili- tando a avaliação da expressão total de SNAP-25 em cada linhagem celular 5 e a percentagem de SNAP-25 clivado depois de tratamento com BONT/A como um parâmetro para avaliar a quantidade de absorção de BONT/A. As manchas sondadas com anticorpo primário foram lavadas três vezes por 15 minutos cada vez em TBS, TWEEN-20® (poIioxietileno (20) sorbitan mono- laurato). As membranas lavadas foram incubadas à temperatura ambiente por 2 horas em TBS, 0,1% de T\NEEN-20® (poIioxietileno (20) sorbitan mo- nolaurato), 2°/0 de BSA, e 5°/0 leite seco desnatado contendo 1) uma diluição 1 : 10.000 de imunoglobulina G anti-camundongo policlonal de cabra, anti- corpo de cadeias pesada e leve (lgG, H+L) conjugado à peroxidase de raiz- forte (Zymed, South San Francisco, CA) como um anticorpo secundário; ou 2) uma diluição 1 : 10.000 de imunoglobulina G anti-coelho policlonal de ca- " bra, anticorp.o de cadeias pesada e leve (IgG, H+L) conjugado à peroxidase ,· - \ de raiz-forte (Zymed, South San Francisco, CA) como um anticorpo secun- dário. As manchas sondadas com anticorpo secundário foram lavadas três vezes por 15 minutos cada vez em TBS, 0,1 °/) de TVVEEN-20® (poIioxietile- no (20) sorbitan monolaurato). A detecção de sinal dos produtos de SNAP- 25 marcados foi visualizada usando-se o sistema de detecção da mancha ocidental ECL Plus"" (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e a membrana foi imageada e a percentagem clivada foi quantificada com o software Typhoon 9410 Variable Mode lmager and lmager Analysis (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A escolha do ta- manho de pixel (100 a 200 pixels) e a regulagem da tensão PMT (350 a 600, normally 400) dependiam da mancha individual. Os resultados da análise de expressão estão dados na Tabela

7. Em geral, a modificação de uma região de sÍtio de clivagem de inativação compreendendo os aminoácidos 467-496, 844-863, ou 871-895 de SEQ ID N°: 1 de modo a incluir um sÍtio de clivagem da protease resultou em uma toxina potente que era capaz de executar o processo de intoxicação comple-

to.

Todos juntos, esses resultados indicam que embora oito regiões de cIivagem de inativação diferentes tivessem sido identificadas, nem todas eram capazes de suportar a inserção de um sÍtio de clivagem da trombina 5 funcional.

Em geral, as modificações de regiões de sÍtio de clivagem de ina- . tivação compreendendo os aminoácidos 467-496, 844-863 e 871-895 de SEQ ID N°: 1 de modo a incluir,um sÍtio de clivagem da protease resultaram em uma toxina estavelmente produzida que era capaz de executar o pro- cesso de intoxicação completo e era sensível à clivagem proteolítica pela 10 protease apropriada. ' Como a estrutura tridimensional de todas as toxinas clostridia- nas são similares, as Iocalizações correspondentes nas BoNT/B, BoNT/CI, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, e BuNT também são a- dequadas como regiões de sítio de clivagem de inativação.

A Tabela 5 rela- " 15 ciona essas regiões.

Exemplo. 2 Análise de sÍtios de cIivaçjem da protease Este exemplo ilustra como fazer uma toxina clostridiana ou qui- mera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativa-

, 20 ção.

Para explorar se sÍtios de clivagem da protease que não trombi- na poderiam ser úteis como um sÍtio de inativação, toxinas compreendendo muitos sÍtios de clivagem da protease diferentes foram examinadas.

Para fazer uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostri- 25 diana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação, sÍtios de clivagem da protease foram geneticamente construídos em regiões de sÍtio de cliva- gem de inativação usando-se mutagênese com multi-iniciadores como des- crito no Exemplo 1. A Tabela 8 relaciona as construções de expressão modi- ficadas de modo a conter um sÍtio de cIivagem da protease. 30 Para determinar se uma BONT/A compreendendo um sÍtio de clivagem da protease poderia ser clivada por sua protease cognata, ensaios de clivagem da protease in vitro foram realizados essencialmente da manei-

ra descrita acima, porém usando-se a protease apropriada no lugar da trombina. Amostras foram coletadas em cada ponto no tempo e rapidamen- te resfriadas com tampão de carga de SDS incluindo DTT, e analisadas por SDS-PAGE da maneira descrita no Exemplo 1.

Os resultados da análise de expressão estão dados na Tabela

7. Em geral, a modificação de uma região de sítio de cIivagem de inativação compreendendo os aminoácidos 467-496, 844-863, ou 871-895 de SEQ ID N°: 1 de modo a incluir um sítio de clivagem da protease resultou em uma tjoxina que era susceptível à clivagem proteolítica pela protease apropriada. I TABELA 8. Análise desitios de divagm da pmtease i siüo de divagemj -- - I SeWhilidade | pd&áa I da pmbase ' regao modificaçao da protmse ckí BONT/A i fatorXa 6 "35 "' E53StWG + l ""m'" " ""' fator Xa i 844-863 I L863indEGR I + } >50 ""'{ fator Xa i 871-895 l K871inslEGR I ++ I 6.15 I fàtorXa I 871-895 j f873insEGR i -t- j 3.97 I fàtot Xa [ 871-895 l L881MSIEG I ND ! ND I fator Xa i 871-895 i E884inslEGR i + 2.95 I fatorXa l 871-895 : L891insIEGR I 4-% ND I fàtòr Xa | 1272 i E1272insG I + ND I fator Xax2 )l 535 1272 . E535nsG E1272insG : " nd fabr Xa x2 I 871-895 I K871inslE.GR , # ¶ , ' .) "

E l891mmegr "" 4 35 k

E j873insEGR fàtor Xax2 871-8"5 È L891 inslEGR " 7.63

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S tator Xa - i873insEGR ND ND epa 871-895 delS885NHLIDL-insPQRGRSA ifatàr Xa i 871-895 n' I " Thmmbin i i E884insLVPRG I "++S I 3.29 mmp-2 l 871-8g5 | S885irtsGPLGMLSQ _A_ + I 6.55 mmp-2 i 871-895 I delK871Nl[ms[AmpLgM= ! ++ I 5.27 mmp-2 í 871-895 Í dels~HLlDL&m$gpLgML3Q I ++ I 4.76 i"" nimp=9 I 871-895 i K871insGPLGLWAQ I nd | nd ""[ mmp-9 | 871-895 I ddK871NllNTsHnsgpLgLL4AQ J + I 3.36' mmp-9 871-895 i i873msgplglwaq ] " J à'2.8"""~ mmp-9 871-895 dell874NTSILNL-insGPLGLWAQ 37.7 mmp-9 871-895 deIL881RYESNHL-insGPLGLWAQ nd nd mmp-9 871-895 E884insGPLGLWAQ - nd nd mmp-9 87-1-895 deIS885NHLIDLS-insGPLGLWAQ + 4.38 mmp-9 I 871-895 I S885insGPLGLWAQ i . i 3.38 mmp-9 871-895 L891insGPLGLWAQ 20.61 mmp-9 871-895 delK871N1INTSl-insGPLGLWAQ nd nd

I tranbina i ! MMP"9 fator Xa . 871-895 i · E884irMEGR E884insLVPRG deiK87i NIÍNT$knsGPLGLWAQ -.----- ' _4 i9.62 u-PA ' 871-895 l delN872l!NTS!4nsPGSGKSA + ND JNI9 S885insPGSGKSA +" 3-QQ de|N886HLlDL4NsPGSGKSA ++ 4.90 delN8721INTSj4nsPQRGRSA ++ 3.65 S885insPQRGRSA +"+ 3.3Q t-pA ! 871-895 ; cSeS885NHLIDL-insPQRGRSA ++ 4,80 trmibina | ¶873LVPRGS ÉPA 871-895 l delS8B5NHLIDL=insPQRGRSA ND I ND furina 871-895 ' 187QMRKKR +++ 6.7Q furina 871-895 ! deik871 NIIMSRKKR + 3.50 Turina j 871-895 i_ L881if=« + 7.20 furina 871-895 ! deW883ES-msKKR + 12.1 F, ,.furina I 871-895 I s8g2RKK + 15.2 I furina x2 871-895 l ddK871Nl14nsRKKR ddY883ES=imKKR + I 12.6 ç|elK871N{lÂwRKKR furina x 2 871-8% S892Rl« ++ 6.00 i ii W i 4 delK871NIj4nsRk'KR" furina x 3 871-895 ddY883ES4NKKR ND ND S892RKK Kell 871-8§5 l L891MSAAF + 10.8 Kell 871-895 I dell889DL=insAAF + ' . 4.80 triptase-E 871-895 I rls=E"" ; I 9.45 AR%i+ triptase-€ K871insRIVGGE '+ I 6.48 I- -y's"" & 871-895 1 de|N88gHL|DÚin$RmgE 5.50 e deIN886HLIDL-MsKMGGE "nD=LA= mMMCP-7 : 871-8"5 K871insSLSSRQSP 3.90 mMMCP-7 i 871-895 I delN886HLIDLS4nsLSSRQSP I- 4.8Q ECE-I ! 871-895 i Í870ínsRPPGFSAF + 5.70 >CE-1 L 871-895 Ê

E K871insAFA + 3.85 ÜC&1 : 871-895 Í K871insDNVVNTPEHWPYGLG$ + >50 ECE-I 871-895 | K871insRPKPQQFFgLM ND NÕ , l ECÊ-I ddYEs885NHLIDL$- 871-895 ÍnsPKPQQFFGLM" + I - 9.20 ECE-I 871-895 ! , E8B4irmAFA + 2.95 EÇE-1 871-895 , dUíS885NHLlDLS4nsRPPGFSAF + 3-70 catepsina L 871-895 ; I8701wRGFFYTPK ++*+ 10.3 | catepsina l 871-895 i' K871insLR *+++ 2.25 I catepsina l 871-895 , K871ÍWFR ++*+ 3.05 I catepsina L K871in$LR I tranbina . """'PòlyArg 87i-895 l L891insLVPRGS "·' I 844-863 R861insRR ND I ND

=mjyArg 871-895 R882insRRR sám F'dykg 871-895 S885MRRR 2.22 pdym S892MRRR 3.02 PolyArg x 2 2li%' R861lnsRR

ND ND 871-895 K871insRKR I PolyArg x 2 844-863 R861ÍWRR 871-895 Ê873insRRRR ND ND 844-863 R861insRR FblyNg X2 871-895 R882insRRR ND ND 871-895 K871insRKR PdyAxg x 2 S885ÍWRRR 1.92 R882MSRRR PòlyArg x 2 I 871-89$ ND ND s892tNRRR Sensibilidade da protease: +, menos de 25% da toxina proteolizada entre cerca de 1 e cerca de 4 horas; ++, de 25°/o a 50% da toxina proteolizada entre cerca de 1 e cerca de 4 horas; +++, de 51 °/) a 75% da toxina proteolizada entre cerca de 1 e cerca de 4 horas; ++++, mais de 75°/o da toxina proteolizada entre cerca de 1 e cerca de 4 horas. A potência da BONT/A é calculada dividindo-se o valor de EC50 da toxina pelo valor de EC50 do controle na estrutura principal. ND significa não determinado. Para determinar se uma BONT/A compreendendo um sÍtio de clivagem da protease maintinha sua potência, o ensaio de atividade basea- do em células descrito acima foi realizado (Tabela 8). Em geral, foi conside- 5 rado que as toxinas compreendendo um sÍtio de clivagem da protease que apresentaram um EC50 de cerca de 20 ou menos conservavam potência suficiente para avaliação garantida usando-se um ensaio baseado em ani- mais. Exemplo 3 Análise in vivo Este exemplo ilustra como avaliar uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de cIivagem de ina- tivação usando-se a análise em um ensaio baseado em animais. Embora o ensaio de atividade baseado em células seja uma boa avaliação para determinar se uma toxina clostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sítio de clivagem de inativação pode ser clivada por sua protease cognata, alguns candidatos foram selecionados para avaliação em um ensaio baseado em animais.

Para testar a atividade de uma toxina cIostridiana ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação usan- do um ensaio baseado em animais, um ensaio de escore de abdução digital 5 in vivo ("in vivo Digit Abduction Score") (DAS) foi inicialmente realizado.

Ca- mundongos CD-l Fe foram pesados e distribuídos em subgrupos de 10 a- nimais para cada ensaio de DAS distinto.

Os camundongos foram incluídos em um subgrupo particular com base nos seguintes critérios: 1) boa saúde; 2) resposta robusta de DAS na linha basal de 0; 3) inclussão em uma faixa de peso médio de X +- 2 g estabelecida para cada subgrupo selecionado e 4) peso superior a 17,0 g.

Cada camundongo foi injetado usando-se uma agulha calibre 30 no músculo gastrocnêmio do membro traseiro direito com 1) 5 µ1 de BONT/A 10,0 nM compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação (estudo de DAS em dose única); ou 2) 5 µ1 de uma de sete doses diferentes de BONT/A compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação (0,01 nM, 0,04 nM, 0,12 nM, 0,37 nM, 1,11 nM, 3,33 nM e 10,0 nM; estudo de DAS com dose com- pIeta). Como controle, o músculo gastrocnêmio do membro traseiro esquer- do foi injetado com 5 µ1 de uma solução sem qualquer toxina.

Os camun- dongos foram observados quanto à resposta ao DAS consecutivamente du- rante os 4 primeiros dias.

O DAS foi lido erguendo-se cada camundongo pelo rabo e observado-se com precisão os membros traseiros injetados.

A abdução ou não abdução dos dígitos traseiros revela o efeito de paralisia devido à toxina de teste injetada no músculo.

A abdução digital do membro traseiro injetado foi comparada com aquela do membro traseiro não injetado e classificada de acordo.

Os dados de DAS foram analisados calculando-se a dose de ED50 com base no escore médio de DAS de pico e a AUC (área sob a curva) em termos de u/kg e/ou ng/kg. lsto foi feito da seguinte manei- ra: 1) o escore de DAS de pico médio para cada dose foi calculado em cada estudo; 2) qualquer dose que tenha provocado mais de cinco mortes em qualquer estudo foi eliminada do teste; 3) a dose mais alta usada em um dado estudo individual foi a dose mais baixa que provocou um pico médio de 4,0; 4) a dose mais baixa usada em um dado estudo individual foi a dose mais alta que provocou um pico médio de 0: 5) curvas de DAS de pico mé- dio vs. log (dose) foram construídas para cada estudo individual; 6) um valor de AUC foi calculado para cada grupo de 10 camundongos dos vários gru- 5 pos em alguns estudos; 7) curvas de AUC média vs. log (dose) foram cons- truídas para cada estudo individual; 8) uma curva de resposta repetida x, y foi construída para "cada grupo de múltiplos estudos idênticos; para cada toxina de teste; 9) os dados de dose-resposta foram analisados por regres- são não linear (não ponderada) usando-se uma equação logística de três parâmetros (Sigma PIOt v 8.0; SPSS Science, Chicago, lllinois) usando a seguinte equação: y = a/(1 + (X1X0)b)

onde y é a resposta, a é o ym,, assimptótico, b é a inclinação, x é a dose, e 0 é a dose de ED50. Para determinações de ED50 de pico, o Ymax foi ajustado em 4 (leitura máxima de DAS em escala). Os valores mé- dios (pico e/ou AUC) de ED50 foram computados para cada estudo com oito doses realizado.

Os resultados indicam que (Tabela 9). Em geral, foi considerado que as toxinas compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação que a- presentaram uma potência relativa de cerca de 10 ou mais conservavam potência suficiente para avaliação garantida de sua margem de segurança.

Para determinar a margem de segurança de uma toxina clostri- diana ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sítio de cliva- gem de inativação, foi realizado um ensaio de letalidade em camundongos.

Para calcular a margem de segurança de uma toxina clostridia- na ou quimera de toxina clostridiana compreendendo um sÍtio de clivagem de inativação, o valor de LD50 obtido no ensaio de letalidade em camun- dongos foi dividido pelo valor de EC50 obtido no estudo de DAS de dose completa.

Foi considerado que uma toxina compreendendo um sÍtio de cli- vagem de inativação possuía atividade suficiente no sÍtio de clivagem de inativação se apresentasse um valor da margem de segurança de cerca de 15 ou mais. .

Embora os aspectos da presente invenção tenham sido descrito em relação às modalidades apresentadas, o especialista na técnica vai per- ceber facilmente que os exemplos específicos apresentados são apenas ilustrativos desses aspectos e não limitam de forma alguma a presente in- venção.

Várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da presente invenção.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Toxina clostridial compreendendo pelo menos um sÍtio de ,cli- vagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de cliva- gem de inativação, em que a região de sÍtio de clivagem de inativação ftca . 5 Iocalizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação Hcn, . em que o pelo menos um sítio de clivagem de inativação compreende um . sÍtio dual trombina-trombina, um sÍtio de fator Xa, um sÍtio dual fator Xa- trombina, e/ou um sÍtio MMP-9.

2. Toxina clostridial compreendendo um domínio enzimático de 10 toxina clostridial, um domínio de translocação de toxina clostridial, um domí- nio de ligação de toxina clostridial, uma região de alça dicadeia, um sÍtio de clivagem de protease exógena, e pelo menos dois sÍtios de clivagem de ina- tivação localizados no interior de uma região de sÍtio de clivagem de inativa- ção; em que o sÍtio de clivagem de protease exógena fica localizado no inte- - 15 rior da região de alça dicadeia.

3. Toxina clostridial de acordo com a reivindicação 2, em que os sítios de clivagem de inativação compreendem um sÍtio dual trombina- trombina e/ou um sÍtio dual fator Xa-trombina.

4. Quimera de toxina cIostridial compreendendo um domínio en- 20 zimático de toxina clostridial, um domínio de translocação de toxina clostridi- al, um domínio de ligação de toxina nÊio-clostridial, e um sÍtio de clivagem de inativação localizado no interior de uma região de sÍtio de ciivagem de inati- vação, em que a região de sítio de clivagem de inativação fica localizada no domínio de translocação e/ou no subdomínio de ligação HCN. 25 5. Toxina clostridial e/ou quimera de toxina clostridial de acordo com as reivindicações 1-4, em que a região de sÍtio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 462-496 de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 e/ou SEQ ID N° 5; os aminoácidos 458-492 de SEQ ID N° 3; os aminoácidos 464-487 de SEQ ID N° 6, SEQ ID N" 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID 30 N° 9, e/ou SEQ ID N° 10; os aminoácidos 463-496 de SEQ ID N° 11 e/ou SEQ ID N° 12; os aminoácidos 458-491 de SEQ ID N" 13 e/ou SEQ ID N° 14; os aminoácidos 434-467 de SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16 e/ou SEQ ID

N° 17; os aminoácidos 453-486 de SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, e/ou SEQ ID N° 20; os aminoácios 458-491 de SEQ ID N° 21; os aminoácidos 443-476 de SEQ ID N° 23; e/ou os aminoácidos 434-467 de SEQ ID N° 24 e/ou SEQ ID N° 25.

5 6. Toxina clostridial e/ou quimera de toxina cIostridial de acordo Q - com as reivindicações 1-4, .em que a região de sítio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 618-634 de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 e/ou SEQ ID N° 5; os aminoácidos 614-630 de SEQ ID N° 3; os aminoácidos 605-621 de SEQ ID N°

6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N" 8, SEQ ID 10 N° 9, e/ou SEQ ID N" 10; os aminoácidos 613-629 de SEQ ID N° 11 e/ou SEQ ID N° 12; os aminoácidos 609-625 de SEQ ID N° 13 e/ou SEQ ID N° 14; os aminoácidos 587-603 de SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, e/ou SEQ ID N° 17; os aminoácidos 604-620 de SEQ ID N° 18; os aminoácidos 605-621 de SEQ ID N° 19 e/ou SEQ ID N° 20; os aminoácidos 610-626 de SEQ ID " 15 N° 21; os aminoácidos 596-612 de SEQ ID N° 23; e/ou os aminoácidos 587- 603 de SEQ ID N° 24 e/ou SEQ ID N° 25.

7. Toxina clostridial e/ou quimera de toxina clostridial de acordo com as reivindicações 1-4, em que a região de sÍtio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 638-651 de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, 20 SEQ ID N° 4 e/ou SEQ ID N° 5; os aminoácidos 634-647 de SEQ ID N° 3: os aminoácidos 625-638 de SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, e/ou SEQ ID N° 10: os aminoácidos 633-646 de SEQ ID N° 11 e/ou SEQ ID N° 12; os aminoácidos 629-642 de SEQ ID N" 13 e/ou SEQ ID N° 14; os aminoácidos 607-620 de SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, e/ou SEQ ID 25 N° 17; os aminoácidos 624-637 de SEQ ID N° 18; os aminoácidos 625-638 de SEQ ID N° 19 e/ou SEQ ID N° 20; os aminoácidos 630-643 de SEQ ID N° 21; os aminoácidos 616-629 de SEQ ID N° 23; e/ou os aminoácidos 607- 620 de SEQ ID N° 24 e/ou SEQ ID N° 25.

8. Toxina clostridial e/ou quimera de toxina clostridial de acordo 30 com as reivindicações 1-4, em que a região de sítio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 665-687 de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, . SEQ ID N° 4 e/ou SEQ ID N° 5; os aminoácidos 661-683 de SEQ ID N° 3; os aminoácidos 652-674 de SEQ ID N" 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, e/ou SEQ ID N° 10; os aminoácidos 660-682 de SEQ ID N° 11 e/ou SEQ ID N° 12; os aminoácidos 656-678 de SEQ ID N° 13 e/ou SEQ ID N° - 14; os aminoácidos 634-659 de SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, e/ou SEQ ID 5 N° 17; os aminoácidos 651-676 de SEQ ID N° 18; os aminoácidos 652-677 de SEQ ID N° 19 e/ou SEQ ID N° 20; os aminoácidos 657-679 de SEQ ID N° 21; os aminoácidos 643-668 de SEQ ID N° 23; e/ou os aminoácidos 634- 659 de SEQ ID N° 24 e/ou SEQ ID N° 25.

9. Toxina clostridial e/ou quimera de toxina clostridial de acordo 10 com as reivindicações 1-4, em que a região de sÍtio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 752-765 de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 e/ou SEQ ID N° 5; os aminoácidos 748-761 de SEQ ID N" 3; os aminoácidos 739-752 de SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, e/ou SEQ ID N° 10; os aminoácidos 747-760 de SEQ ID N° 11 e/ou " 15 SEQ ID N° 12; os aminoácidos 743-756 de SEQ ID N° 13 e/ou SEQ ID N° 14; os aminoácidos 724-'739 de SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, e/ou SEQ ID N° 17; os aminoácidos 741-756 de SEQ ID N° 18; os aminoácidos 742-757 de SEQ ID N° 19 e/ou SEQ ID N° 20; os aminoácidos 744-757 de SEQ ID N° 21; os aminoácidos 733-748 de SEQ ID N° 23; e/ou os aminoácidos 724- 20 739 de SEQ ID N° 24 e/ou SEQ ID N° 25.

10. Toxina clostridial e/ou quimera de toxina clostridial de acordo com as reivindicações 1-4, em que a região de sÍtio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 826-835 de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 e/ou SEQ ID N° 5; os aminoácidos 824-831 de SEQ ID N° 3; os 25 aminoácidos 813-824 de SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, e/ou SEQ ID N° 10; os aminoácidos 821-830 de SEQ ID N° 11 e/ou SEQ ID N° 12; os aminoácidos 817-826 de SEQ ID N° 13 e/ou SEQ ID N° 14; os aminoácidos 800-809 de SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, e/ou SEQ ID N° 17; os aminoácidos 817-826 de SEQ ID N° 18; os aminoácidos 818-827 30 de SEQ ID N° 19 e/ou SEQ ID N" 20; os aminoácidos 818-827 de SEQ ID N° 21; os aminoácidos 809-819 de SEQ ID N° 23; e/ou os aminoácidos 800- 809 de SEQ ID N° 24 e/ou SEQ ID N° 25.

11. Toxina clostridial e/ou quimera de toxina clostridial de acordo com as reivindicações 1-4, em que a região de sÍtio de clivagem de inativa- ção compreende os aminoácidos 844-863 de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 e/ou SEQ ID N° 5; os aminoácidos 840-859 de SEQ ID N° 3: os 5 aminoácidos 831-850 de SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, e/ou SEQ ID N° 10; os aminoácidos 839-858 de SEQ ID N° 11 e/ou SEQ ID N° 12: os aminoácidos 835-854 de SEQ ID N° 13 e/ou SEQ ID N° 14; os aminoácidos 818-837 de SEQ ID N° 15, SEQ ID N" 16, e/ou SEQ ID N° 17; os aminoácidos 835-854 de SEQ ID N° 18; os aminoácidos 836-855 10 de SEQ ID N° 19 e/ou SEQ ID N° 20; os aminoácidos 836-855 de SEQ ID N° 21; os aminoácidos 828-847 de SEQ ID N° 23; e/ou os aminoácidos 818- 837 de SEQ ID N° 24 e/ou SEQ ID N° 25.

12. Toxina clostridial e/ou quimera de toxina clostridial de acordo com as reivindicações 1-4, em que a região de sítio de clivagem de inativa- " 15 ção compreende os aminoácidos 871-895 de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 e/ou SEQ ID N° 5; os aminoácidos 867-891 de SEQ ID N° 3; os aminoácidos 858-882 de SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, e/ou SEQ ID N° 10; os aminoácidos 866-890 de SEQ ID N° 11 e/ou SEQ ID N° 12; os aminoácidos 862-886 de SEQ ID N° 13 e/ou SEQ ID N° 20 14; os aminoácidos 845-869 de SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, e/ou SEQ ID N° 17; os aminoácidos 862-886 de -SEQ ID N° 18; os aminoácidos 863-887 de SEQ ID N° 19 e/o"u SEQ ID N° 20; os aminoácidos 863-887 de SEQ ID N° 21; os aminoácidos 855-879 de SEQ ID N" 23; e/ou os aminoácidos 845- 869 de SEQ ID N° 24 e/ou SEQ ID N° 25. 25

13. Toxina clostridia! e/ou quimera de toxina clostridial de acordo com as reivindicações 1-12, em que o domínio enzimático de toxina clostri- dial compreende um domínio enzimático BONT/G, um domínio enzimático BONT/B, um domínio enzimático BONT/CI, um domínio enzimático BONT/D, um domínio enzimático BoNT/E, um domínio enzimático BONT/F, um domí- 30 nio enzimático BoNT/G, um domínio enzimático BaNT, e/ou um domínio en- zimático BuNT.

14. Toxina clostridial e/ou quimera de toxina clostridial de acordo com as reivindicações 1-13, em que o sÍtio de clivagem de inativação com- preende sÍtios de cIivagem da trombina, sítios de cliyagem da plasmina, SÍ- tios de clivagem do fator de coagulaçâo Vlla, sÍtios de clivagem do fator de , coagulação lXa, sÍtios de clivagem do fator de coagulação. Xa, sÍtios de cli- 5 vagem do fator de coagulação Xla, sÍtios de clivagem do fator de coagula- ção XIla, sÍtios de clivagem calicreína plasmática, sÍtios de clivagem do re- ceptor-l acopiado à proteína G ativada pela protease (PARI), sÍtios de cli- vagem de PAR2, sÍtios de clivagem de PAR3, sÍtios de clivagem PAR4, sÍ- tios de clivagem da metaloproteinase matricial-2(MMP-2), sÍtios de clivagem 10 da metaloproteinase matricial-9 (MMP-9), sítios de cIivagem da furina, sÍtios r de clivagem do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA), sítios de clivagem do ativador de plasminogênio tipo tecido (tPA), sÍtios de clivagem da triptase-q sÍtios de cIivagem da protease-7 de célula de camundongo (mMCP-7), sÍtios de clivagem da enzima-l conversora de endotelina (ECE- . - 15 1), sÍtios de clivagem do grupo sanguíneo Kell, sÍtios de clivagem de DPPlV, sÍtios de clivagem da metalopeptidase ADAM com motivo-13 tipo 1 da trom- bospondina (ADAMTS13), e/ou sítios de clivagem da catepsina L.

15. Toxina clostridial compreendendo as SEQ ID N° 531, SEQ ID N° 533, SEQ ID N° 535, e/ou SEQ ID N° 537.

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LSSJ Alça de I cadeia dupla :: t i r o ease de oco ênca natu a De translocação De ligação U) Forma de CD cadeia dupla Enzimático

FlG. 3A.

P l De ligação De translocação N Enzimático

I SS \ l Protease P Enzimático U) U) De translocação De ligação FlG. 3B.

P l De ligação Enzimático De translocação ""'" Lss I Protease P De translocação U) U) Enzimático De ligação

FlG. 4A.

8 -

P U l Enzimático De ligação De translocação

SS I Protease P De ligação De translocação Enzimático FlG. 4B.

P l De translocação De Iigação Enzimático

SS I Protease P De ligação Enzimático De translocação