CN103228286A - 可降解梭菌毒素 - Google Patents

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Abstract

本发明公开包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体、编码所述毒素或嵌合体的多核苷酸分子、包含所述毒素或嵌合体的组合物和产生所述毒素或嵌合体的方法。

Description

可降解梭菌毒素
本申请要求2010年5月20日提交的美国临时专利申请号61/346,578的权益，所述专利申请的整个公开内容以此特别引用的方式并入本文。
诸如肉毒杆菌神经毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(Tetanus neurotoxin，TeNT)等梭菌毒素抑制神经元传递的能力正在广泛多种治疗及美容应用中得到利用，参见例如William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin(Slack公司,2004)。可以药用组合物形式商购获得的梭菌毒素包括BoNT/A制剂，诸如
Figure BDA00002756375800011
(Allergan公司,Irvine,CA)、
Figure BDA00002756375800012
(Beaufour Ipsen,Porton Down,England)、
Figure BDA00002756375800013
(Medy-Tox公司,Ochang-myeon,South Korea)、BTX-A(中国兰州生物制品研究所(Lanzhou Institute Biological Products,China))和
Figure BDA00002756375800014
(Merz Pharmaceuticals股份有限公司,Frankfurt,Germany)；以及BoNT/B制剂，诸如MYOBLOCTM/NEUROBLOCTM(Elan Pharmaceuticals,San Francisco,CA)。举例来说，
Figure BDA00002756375800015
当前在一个或多个国家被批准用于以下适应症：弛缓不能(achalasia)、成人痉挛(adult spasticity)、肛裂(anal fissure)、背痛、眼睑痉挛(blepharospasm)、夜间磨牙(bruxism)、颈肌张力障碍(cervical dystonia)、原发性震颤、眉间皱纹或运动过度性面部皱纹、头痛、半面痉挛、膀胱机能亢进、多汗、青少年脑性麻痹、多发性硬化症、肌阵挛病症、鼻唇皱纹、痉挛性发声困难(spasmodic dysphonia)、斜视以及VII型神经病症。
梭菌毒素治疗剂通过破坏用于将神经递质分泌至突触间隙中的胞外分泌过程来抑制神经递质释放。制药工业对使梭菌毒素疗法的用途扩展超出其当前肌肉弛缓应用以治疗感觉神经型疾病(诸如各种慢性疼痛、神经性炎症和泌尿生殖病症)以及其它病症(诸如胰腺炎)存在极大需要。一种当前正用于扩展基于梭菌毒素的疗法的方法涉及修饰梭菌毒素以使经过修饰的毒素对非梭菌毒素靶细胞的细胞靶向能力改变。此再靶向能力是通过将梭菌毒素的天然存在的靶向结构域置换为对非梭菌毒素靶细胞中存在的非梭菌毒素受体显示优先结合活性的靶向结构域来达成的。对靶向结构域的所述修饰产生称为靶向囊泡胞外分泌调节蛋白(TVEMP)的梭菌毒素嵌合体，其能够选择性结合非梭菌毒素靶细胞(再靶向)上存在的非梭菌毒素受体(靶受体)。对非梭菌毒素靶细胞具有靶向活性的梭菌毒素嵌合体可结合非梭菌毒素靶细胞上存在的受体，移位至细胞质中，且对非梭菌毒素靶细胞的SNARE复合物施加其蛋白水解作用。
梭菌毒素和梭菌毒素嵌合体疗法成功用于许多适应症。通常，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的施用良好耐受。然而，在一些应用中施用可能由于为达成有益效果需要较大剂量而具有挑战性。较大剂量可增加毒素或梭菌毒素嵌合体可能通过身体的间质液和循环系统(诸如心血管系统和淋巴系统)移动的可能性，从而导致毒素或梭菌毒素嵌合体不当散布至不为治疗所靶向的区。所述散布可导致不当副作用，诸如抑制不为毒素治疗所靶向的神经元中的神经递质释放或麻痹不为治疗所靶向的肌肉。举例来说，针对斜颈向颈部肌肉中施用治疗有效量的BoNT/A治疗剂的患者可能由于毒素散布至口咽中而发生吞咽困难。因此，对在治疗部位处有效，但在不为毒素治疗所靶向的区中具有可忽略至最低限度作用的改进的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体仍然存在需要。
在需要较大剂量的疗法中，梭菌毒素和梭菌毒素嵌合体的临床、治疗和美容使用日益增长使得制药工业有必要开发在用药的靶部位处有效，但减少或防止与毒素散布至不希望的位置相关的可能副作用的修饰梭菌毒素和梭菌毒素嵌合体。本说明书提供减少或防止与毒素散布至非靶向区中相关的不希望的副作用的新颖修饰梭菌毒素和梭菌毒素嵌合体。这些和相关优势适用于各种临床、治疗和美容应用，诸如治疗神经肌肉病症、神经病症、眼部病症、疼痛、肌肉损伤、头痛、心血管疾病、神经精神病症、内分泌病症、癌症、耳部病症和运动过度性面部皱纹、以及向哺乳动物施用梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可以产生有益效果的其它病症。
附图简述
图1示出中枢和周边神经元中神经递质释放和梭菌毒素中毒的当前范式的示意图。图1A示出中枢和周边神经元的神经递质释放机制的示意图。释放过程可描述成包括两个步骤：1)囊泡对接，其中含有神经递质分子的囊泡的囊泡结合SNARE蛋白与位于质膜处的膜结合SNARE蛋白缔合；和2)神经递质释放，其中囊泡与质膜融合且神经递质分子分泌至胞外。图1B示出中枢和周边神经元中破伤风和肉毒杆菌毒素活性的中毒机制的示意图。此中毒过程可描述成包括四个步骤：1)受体结合，其中梭菌毒素结合梭菌受体系统且起始中毒过程；2)复合物内化，其中在毒素结合之后，含有毒素/受体系统复合物的囊泡被胞吞至细胞中；3)轻链移位，其中认为发生多个事件，包括例如囊泡的内部pH改变，形成包含梭菌毒素重链的HN结构域的通道孔，梭菌毒素轻链与重链分离，和释放活性轻链，以及4)酶促靶标修饰，其中梭菌毒素的活化轻链对其靶SNARE底物进行蛋白水解裂解，诸如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白(Syntaxin)，由此阻止囊泡对接和神经递质释放。
图2示出天然存在的梭菌毒素的结构域组构。单链形式描绘包含酶促结构域、移位结构域和结合结构域的氨基至羧基线性组构。位于移位结构域与酶促结构域之间的双链环区由双SS方括号描绘。此区包含内源性双链环蛋白酶裂解位点，其在被天然存在的蛋白酶(诸如内源性梭菌毒素蛋白酶)或在环境中产生的天然存在的蛋白酶蛋白水解裂解后使毒素的单链形式转化成双链形式。在单链形式上方，描绘梭菌毒素结合结构域的HCC区。此区包含β三叶形结构域，其以氨基至羧基线性组构包含α折叠、β4/β5发夹转角、β折叠、β8/β9发夹转角和γ折叠。
图3示出结合结构域位于毒素的氨基端上的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。图3A描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单链多肽形式，所述线性组构包含结合元件、移位元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、和治疗元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图3B描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含结合元件、治疗元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区和移位元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。
图4示出结合结构域位于毒素的氨基端上的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。图4A描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含治疗元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、结合元件和移位元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图4B描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含移位元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、结合元件和治疗元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图4C描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含治疗元件、结合元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区和移位元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。图4D描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含移位元件、结合元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区和治疗元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。
图5示出结合结构域位于毒素的氨基端上的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。图5A描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含治疗元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、移位元件和结合元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素的单链形式转化成双链形式。图5B描绘具有氨基至羧基线性组构的毒素或嵌合体的单一多肽形式，所述线性组构包含移位元件、包含外源性蛋白酶裂解位点(P)的双链环区、治疗元件和结合元件。在被P蛋白酶蛋白水解裂解后，毒素或嵌合体的单链形式转化成双链形式。
详细描述
本说明书公开可通过利用存在于间质液和循环系统(诸如心血管系统和淋巴系统)中的蛋白酶的存在而自不希望的位置快速失活的修饰梭菌毒素和修饰梭菌毒素嵌合体。这是因为本说明书中公开的修饰梭菌毒素和修饰梭菌毒素嵌合体包含存在于间质液和/或循环系统中的蛋白酶的蛋白酶裂解位点。所述蛋白酶裂解位点的存在使修饰梭菌毒素或修饰梭菌毒素嵌合体易受其同源蛋白酶进行蛋白水解裂解，这会使所述修饰毒素失活。举例来说，在经过修饰以包含细胞外基质蛋白酶的裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体已扩散至间质液中的情形下，此修饰毒素或修饰梭菌毒素嵌合体可由同源细胞外基质蛋白酶有效裂解。作为另一实例，在经过修饰以包含血液蛋白酶的裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体已扩散至心血管系统中的情形下，此修饰毒素或修饰梭菌毒素嵌合体可由同源血液蛋白酶有效裂解。作为另一实例，在经过修饰以包含淋巴蛋白酶的裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体已扩散至淋巴系统中的情形下，此修饰毒素或修饰梭菌毒素嵌合体可由同源淋巴蛋白酶有效裂解。因此，利用包含存在于间质液和/或循环系统中的蛋白酶的裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体将自不希望的位置减少或移除所述梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，由此减少或防止与梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体扩散至不希望的位置相关的不当副作用。
因此，本说明书的多个方面提供一种包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点的梭菌毒素，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域或HCN结合亚结构域中。所述公开的毒素可包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、梭菌毒素结合结构域、包含外源性蛋白酶裂解位点的双链环区、和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点。失活裂解位点的非限制性实例包括凝血酶(Thrombin)裂解位点、纤溶酶(Plasmin)裂解位点、凝血因子VIIa裂解位点、凝血因子IXa裂解位点、凝血因子Xa裂解位点、凝血因子XIa裂解位点、凝血因子XIIa裂解位点、血浆激肽释放酶(plasma kallikrein)裂解位点、蛋白酶活化G蛋白偶联受体-1(PAR1)裂解位点、PAR2裂解位点、PAR3裂解位点、PAR4裂解位点、基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase)-2(MMP-2)裂解位点、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)裂解位点、弗林蛋白酶(Furin)裂解位点、尿激酶型纤溶酶原活化因子(urokinase-typePlasminogen activator，uPA)裂解位点、组织型纤溶酶原活化因子(tissue-type Plasminogen activator，tPA)裂解位点、类胰蛋白酶(Tryptase)-ε裂解位点、小鼠肥大细胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位点、內皮素(endothelin)转化酶-1(ECE-1)裂解位点、凯尔血型(Kell bloodgroup)裂解位点、DPPIV裂解位点、具有血小板反应蛋白(thrombospondin)1型基序的ADAM金属肽酶-13(ADAMTS13)裂解位点、和组织蛋白酶L(Cathepsin L)裂解位点。相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，添加失活裂解位点会增加梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限。
本说明书的其它方面提供一种包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点的梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域或HCN结合亚结构域中。所述公开的毒素可包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、包含外源性蛋白酶裂解位点的双链环区、和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点。失活裂解位点的非限制性实例包括凝血酶裂解位点、纤溶酶裂解位点、凝血因子VIIa裂解位点、凝血因子IXa裂解位点、凝血因子Xa裂解位点、凝血因子XIa裂解位点、凝血因子XIIa裂解位点、血浆激肽释放酶裂解位点、蛋白酶活化G蛋白偶联受体-1(PAR1)裂解位点、PAR2裂解位点、PAR3裂解位点、PAR4裂解位点、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)裂解位点、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)裂解位点、弗林蛋白酶裂解位点、尿激酶型纤溶酶原活化因子(uPA)裂解位点、组织型纤溶酶原活化因子(tPA)裂解位点、类胰蛋白酶-ε裂解位点、小鼠肥大细胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位点、內皮素转化酶-1(ECE-1)裂解位点、凯尔血型裂解位点、DPPIV裂解位点、具有血小板反应蛋白1型基序的ADAM金属肽酶-13(ADAMTS13)裂解位点、和组织蛋白酶L裂解位点。相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，添加失活裂解位点会增加梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限。
本说明书的其它方面提供编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子。编码所述梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子可更包含表达载体。
本说明书的其它方面提供一种包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的组合物。包含所述梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的组合物可为药用组合物。除本说明书中公开的修饰梭菌毒素之外，所述药用组合物还可以包含药用载剂、药用组分或两者。
本说明书的其它方面提供一种产生本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的方法，所述方法包括在细胞中表达编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子的步骤，其中所述多核苷酸分子的表达产生所编码的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。在其它方面，方法包括将编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子引入细胞中，和表达所述多核苷酸分子的步骤，其中所述多核苷酸分子的表达产生所编码的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。
由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)产生的梭菌毒素在人和其它哺乳动物的治疗性和美容性治疗中使用最广泛。肉毒梭菌菌株产生七种抗原类型不同的肉毒杆菌毒素(BoNT)，其已通过研究肉毒杆菌毒素中毒暴发而在人(BoNT/A、/B、/E和/F)、动物(BoNT/C1和/D)中鉴定出来，或自土壤分离(BoNT/G)。BoNT彼此具有约35%的氨基酸一致性且共享相同的功能性结构域组构和总体结构构造。本领域技术人员应认识到在梭菌毒素的各类型内，可存在亚型，所述亚型在它们的氨基酸序列方面以及在编码这些蛋白质的核酸方面多少有些不同。举例来说，目前存在五种BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，其中当与BoNT/A亚型SEQ ID NO:1相比较时，特定亚型显示约84%至93%的氨基酸一致性。作为另一实例，目前存在五种BoNT/B亚型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/Bnp和BoNT/Bbv，其中当与BoNT/B亚型SEQ ID NO:6相比较时，特定亚型显示约93%至96%的氨基酸一致性。作为另一实例，目前存在三种BoNT/E亚型BoNT/E1、BoNT/E2和BoNT/E3，其中当与BoNT/E亚型SEQ ID NO:15相比较时，特定亚型显示约95%至99%的氨基酸一致性。尽管所有七种BoNT血清型皆具有类似的结构和药理学性质，但各自也显示异质细菌学特征。相反，破伤风毒素(TeNT)由一组统一的破伤风梭菌产生。两个其它梭菌物种巴氏梭菌和丁酸梭菌产生分别类似于BoNT/F和BoNT/E的毒素BaNT和BuNT。
梭菌毒素各自翻译成约150kDa的单链多肽，其随后在二硫环内通过由天然存在的蛋白酶进行蛋白水解剪切而裂解(图1)。此裂解发生在于形成二硫桥键的两个半胱氨酸残基之间产生的离散双链环区内。此翻译后加工产生双链分子，所述双链分子包含通过单一二硫键和两条链之间的非共价相互作用保持在一起的约50kDa轻链(LC)和约100kDa重链(HC)。用于将单链分子转化成双链的天然存在的蛋白酶当前未知。在诸如BoNT/A等一些血清型中，天然存在的蛋白酶由细菌血清型内源性产生且裂解在毒素释放至环境中之前在细胞内发生。然而，在诸如BoNT/E等其它血清型中，细菌菌株似乎不产生能够将毒素的单链形式转化成双链形式的内源性蛋白酶。在这些情形下，毒素以单链毒素形式自细胞释放，其随后由存在于环境中的天然存在的蛋白酶转化成双链形式。
各成熟双链分子包含三个功能上不同的结构域：1)位于LC中的包括含有锌依赖性肽链内切酶活性的金属蛋白酶区的酶促结构域，其特异性靶向神经递质释放机构的核心组分；2)含于HC的氨基端半部(HN)内的促进LC自细胞内囊泡释放至靶细胞的细胞质中的移位结构域；和3)存在于HC的羧基端半部(HC)内的决定毒素对位于靶细胞的表面上的受体复合物的结合活性和结合特异性的结合结构域。D.B.Lacy和R.C.Stevens,Sequence Homology and Structural Analysis of theClostridial Neurotoxins,J.Mol.Biol.291:1091-1104(1999)。HC结构域包含大小大致相等的由α螺旋分开的两个不同结构特征，称为HCN和HCC亚结构域。表1给出存在于示例性梭菌毒素中的各结构域和亚结构域的大致边界区。
这三个功能性结构域的结合、移位和酶促活性皆为毒性所必需。尽管此过程的所有细节尚未准确了解，但梭菌毒素进入神经元和抑制神经递质释放所凭借的总体细胞中毒机制类似，而与血清型或亚型无关。尽管申请人不希望受限于以下描述，但中毒机制可描述成包括至少四个步骤：1)受体结合，2)复合物内化，3)轻链移位，和4)酶促靶标修饰(图3)。所述过程在梭菌毒素的HC结构域结合位于靶细胞的质膜表面上的毒素特异性受体系统时起始。认为受体复合物的结合特异性部分通过神经节苷脂(ganglioside)与似乎明显包含各梭菌毒素受体复合物的蛋白质受体的特定组合来达成。一旦结合，毒素/受体复合物即通过胞吞作用内化且内化的囊泡被拣选至特定细胞内途径。移位步骤似乎通过囊泡区室的酸化来触发。此过程似乎起始增加疏水性和促进形成毒素的双链形式的两种重要pH依赖性结构重排。一旦活化，毒素的轻链肽链内切酶即自细胞内囊泡释放至胞液中，在胞液中其似乎特异性靶向神经递质释放机构的三个已知核心组分之一。这些核心蛋白质，即囊泡相关膜蛋白质(VAMP)/小突触泡蛋白(synaptobrevin)、25kDa的突触体相关蛋白(SNAP-25)和突触融合蛋白为突触囊泡在神经终端对接和融合及构成可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性因子附着蛋白受体(SNARE)家族的成员所必需。BoNT/A和BoNT/E在羧基端区中裂解SNAP-25，从而分别释放含九或二十六个氨基酸的链段，且BoNT/C1也在羧基末端附近裂解SNAP-25。肉毒杆菌血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G及破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分，且使VAMP的氨基端部分释放至胞液中。BoNT/C1在接近胞液膜表面的单一位点处裂解突触融合蛋白。突触SNARE的选择性蛋白水解是由梭菌毒素在体内引起神经递质释放受阻断的原因。梭菌毒素的SNARE蛋白质靶标为多种非神经元类型中的胞外分泌所共有；与在神经元中一样，在这些细胞中，轻链肽酶活性抑制胞外分泌，参见例如Yann Humeau等,How Botulinum and TetanusNeurotoxins Block Neurotransmitter Release,82(5)Biochimie.427-446(2000)；Kathryn Turton等,Botulinum and Tetanus Neurotoxins:Structure,Function and Therapeutic Utility,27(11)Trends Biochem.Sci.552-558.(2002)；Giovanna Lalli等,The Journey of Tetanus andBotulinum Neurotoxins in Neurons,11(9)Trends Microbiol.431-437,(2003)。
BoNT/A、BoNT/B以及TeNT的HC结构域的三维晶体结构指示梭菌神经毒素的三个功能性结构域是由所有梭菌毒素共享的结构上不同的结构域。轻链的HEXXH共有基序形成催化位点的位于蛋白质表面上的深裂缝中的四面体锌结合袋，其可通过一通道到达。HN和HC结构域的结构主要由通过单一α螺旋连接的β折叠片拓扑结构组成。圆柱形HN结构域包含类似于见于一些病毒蛋白质中的卷曲螺旋基序的两个两亲性长α螺旋。HN结构域也形成称为‘移位带(translocation belt)’的无结构长环，其环绕轻链的带负电荷大裂缝，阻断锌原子到达活性位点的催化结合袋。HC结构域包含大小大致相等的两个指示功能的不同结构特征。称为HCN结构域的第一结构特征位于HC结构域的氨基半部中。HCN结构域形成β桶，即果酱卷折叠(jelly-roll fold)。HCC结构域是构成HC结构域的第二结构域。此羧基端结构域包含修饰β三叶形结构域，其形成类似于见于许多糖结合蛋白(诸如血清淀粉状蛋白P(serum amyloid P)、唾液酸酶(sialidase)、杀虫结晶蛋白(cryia)、杀昆虫性δ-内毒素和凝集素(lectin))中的碳水化合物结合部分的三个不同碳水化合物结合区。生物化学研究指示HCC结构域的β三叶形结构域结构似乎介导与细胞表面上的梭菌毒素受体的特定含碳水化合物组分的结合，参见例如Krzysztof Ginalski等,Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain ofthe Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level InformationAbout the Putative Ganglioside Binding Site,482(1-2)FEBS Lett.119-124(2000)。HC结构域倾斜远离HN结构域，从而暴露表面环且使其可接近以达成结合。在轻链与HC结构域之间不发生接触。
本说明书的多个方面部分地提供梭菌毒素。如本文所用，术语“梭菌毒素”是指由梭菌毒素菌株产生的可执行梭菌毒素使细胞中毒所凭借的总体细胞机制的任何神经毒素且所述总体细胞机制涵盖梭菌毒素结合低或高亲和力受体复合物、毒素/受体复合物内化、梭菌毒素轻链移位至细胞质中及酶促修饰梭菌毒素底物。梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域和梭菌毒素结合结构域。示例性梭菌毒素包括由肉毒梭菌、破伤风梭菌、巴氏梭菌和丁酸梭菌产生的那些梭菌毒素。
梭菌毒素包括但不限于天然存在的梭菌毒素变异体，诸如梭菌毒素同工型和梭菌毒素亚型；非天然存在的梭菌毒素变异体，诸如保守梭菌毒素变异体、非保守梭菌毒素变异体及其活性梭菌毒素片段或其任何组合。如本文所用，术语“梭菌毒素变异体”无论是天然存在或是非天然存在的，皆指与所公开的参考序列(表1)的相应区相比具有至少一个氨基酸变化且可用与那个参考序列的相应区的一致性百分比描述的梭菌毒素。作为非限制性实例，相较于SEQ ID NO:1的相应位置，SEQ ID NO:1的BoNT/A变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:6的相应位置，SEQ ID NO:6的BoNT/B变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:11的相应位置，SEQ IDNO:11的BoNT/C1变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:13的相应位置，SEQ ID NO:13的BoNT/D变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:15的相应位置，SEQ ID NO:15的BoNT/E变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:18的相应位置，SEQ ID NO:18的BoNT/F变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:21的相应位置，SEQ ID NO:21的BoNT/G变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:22的相应位置，SEQ ID NO:22的TeNT变异体c将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:23的相应位置，SEQ ID NO:23的BaNT变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；且相较于SEQID NO:24的相应位置，SEQ ID NO:24的BuNT变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加。
如本文所用，术语“天然存在的梭菌毒素变异体”是指不借助于任何人操作所产生的任何梭菌毒素，包括但不限于自交替拼接转录物产生的梭菌毒素同工型、通过自发突变产生的梭菌毒素同工型、和梭菌毒素亚型。梭菌毒素同工型的非限制性实例包括例如BoNT/A同工型、BoNT/B同工型、BoNT/C1同工型、BoNT/D同工型、BoNT/E同工型、BoNT/F同工型、BoNT/G同工型、TeNT同工型、BaNT同工型和BuNT同工型。梭菌毒素亚型的非限制性实例包括例如BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5；BoNT/B亚型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、二价BoNT/B和非蛋白水解BoNT/B；BoNT/C1亚型BoNT/C1-1和BoNT/C1-2；BoNT/E亚型BoNT/E1、BoNT/E2和BoNT/E3；BoNT/F亚型BoNT/F1、BoNT/F2和BoNT/F3；及BuNT亚型BuNT-1和BuNT-2。梭菌毒素亚型的其它非限制性实例包括例如BoNT/A亚型SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；BoNT/B亚型SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；BoNT/C1亚型SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；BoNT/E亚型SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；BoNT/F亚型SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；以及BuNT亚型SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。
如本文所用，术语“非天然存在的梭菌毒素变异体”是指借助于人操作产生的任何梭菌毒素，包括但不限于通过使用随机诱变或合理设计进行遗传工程改造所产生的梭菌毒素和通过化学合成所产生的梭菌毒素。非天然存在的梭菌毒素变异体的非限制性实例包括例如保守梭菌毒素变异体、非保守梭菌毒素变异体和活性梭菌毒素片段。
如本文所用，术语“保守梭菌毒素变异体”是指至少一个氨基酸取代为至少一种性质类似于来自参考梭菌毒素序列(表1)的原始氨基酸的性质的另一氨基酸或氨基酸类似物的梭菌毒素。性质的实例包括但不限于类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键结能力、氢键结能力、物理化学性质等或其任何组合。保守梭菌毒素变异体可以与保守梭菌毒素变异体所基于的参考梭菌毒素大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素。保守梭菌毒素变异体可取代所述保守梭菌毒素变异体所基于的参考梭菌毒素的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400或500个或更多个氨基酸。保守梭菌毒素变异体也可取代所述保守梭菌毒素变异体所基于的参考梭菌毒素的至少5、10、15、20或25个连续氨基酸。保守梭菌毒素变异体的非限制性实例包括例如保守BoNT/A变异体、保守BoNT/B变异体、保守BoNT/C1变异体、保守BoNT/D变异体、保守BoNT/E变异体、保守BoNT/F变异体、保守BoNT/G变异体、保守TeNT变异体、保守BaNT变异体和保守BuNT变异体。
如本文所用，术语“非保守梭菌毒素变异体”是指以下梭菌毒素：其中1)自非保守梭菌毒素变异体所基于的参考梭菌毒素缺失至少一个氨基酸；2)向非保守梭菌毒素所基于的参考梭菌毒素中添加至少一个氨基酸；或3)至少一个氨基酸取代为不共享类似于参考梭菌毒素序列(表1)的原始氨基酸的性质的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守梭菌毒素变异体可以与非保守梭菌毒素变异体所基于的参考梭菌毒素大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素。非保守梭菌毒素变异体可自所述非保守梭菌毒素变异体所基于的参考梭菌毒素缺失一个或多个氨基酸、两个或更多个氨基酸、三个或更多个氨基酸、四个或更多个氨基酸、五个或更多个氨基酸、以及十个或更多个氨基酸。非保守梭菌毒素变异体可向所述非保守梭菌毒素变异体所基于的参考梭菌毒素中添加一个或多个氨基酸、两个或更多个氨基酸、三个或更多个氨基酸、四个或更多个氨基酸、五个或更多个氨基酸、以及十个或更多个氨基酸。非保守梭菌毒素变异体可取代所述非保守梭菌毒素变异体所基于的参考梭菌毒素的1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400或500个或更多个氨基酸。非保守梭菌毒素变异体也可取代所述非保守梭菌毒素变异体所基于的参考梭菌毒素的至少5、10、15、20或25个连续氨基酸。非保守梭菌毒素变异体的非限制性实例包括例如非保守BoNT/A变异体、非保守BoNT/B变异体、非保守BoNT/C1变异体、非保守BoNT/D变异体、非保守BoNT/E变异体、非保守BoNT/F变异体、非保守BoNT/G变异体、非保守TeNT变异体、非保守BaNT变异体和非保守BuNT变异体。
也设想多种梭菌毒素片段中的任一者可适用于本说明书的多个方面，附带条件为这些活性片段可执行梭菌毒素蛋白水解裂解底物所凭借的总体细胞机制。因此，此实施方案的多个方面可包括长度为例如至少600、700、800、900、1000、1100个或至少1200个氨基酸的梭菌毒素片段。此实施方案的其它方面可包括长度为例如至多600、700、800、900、1000、1100个或至多1200个氨基酸的梭菌毒素片段。
也设想多种包含轻链的梭菌毒素片段中的任一者可适用于本说明书的多个方面，附带条件为这些轻链片段可特异性靶向神经递质释放机构的核心组分且因此参与执行梭菌毒素蛋白水解裂解底物所凭借的总体细胞机制。梭菌毒素的轻链长约420-460个氨基酸且包含梭菌毒素酶促结构域(表1)。研究已显示梭菌毒素酶促结构域的酶促活性并不必需梭菌毒素轻链的整个长度。作为一个非限制性实例，BoNT/A轻链的前八个氨基酸不为酶促活性所需。作为另一非限制性实例，TeNT轻链的前八个氨基酸不为酶促活性所需。同样，轻链的羧基末端不为活性所必需。作为一个非限制性实例，BoNT/A轻链的最后32个氨基酸不为酶促活性所需。作为另一非限制性实例，TeNT轻链的最后31个氨基酸不为酶促活性所需。因此，此实施方案的多个方面包括包含长度为例如至少350、375、400、425或450个氨基酸的梭菌毒素酶促结构域的梭菌毒素轻链。此实施方案的其它方面包括包含长度为例如至多350、375、400、425或450个氨基酸的梭菌毒素酶促结构域的梭菌毒素轻链。
也设想多种包含梭菌毒素移位结构域的梭菌毒素HN区中的任一者可适用于本说明书的多个方面，附带条件为这些活性片段可促进LC自细胞内囊泡释放至靶细胞的细胞质中且因此参与执行梭菌毒素蛋白水解裂解底物所凭借的总体细胞机制。梭菌毒素的重链的HN区长约410-430个氨基酸且包含梭菌毒素移位结构域(表1)。研究已显示梭菌毒素移位结构域的移位活性并不必需梭菌毒素重链的HN区的整个长度。因此，此实施方案的多个方面可包括包含长度为例如至少350、375、400或425个氨基酸的梭菌毒素移位结构域的梭菌毒素HN区。此实施方案的其它方面可包括包含长度为例如至多350、375、400或425个氨基酸的梭菌毒素移位结构域的梭菌毒素HN区。
也设想多种包含梭菌毒素结合结构域的梭菌毒素HC区中的任一者可适用于本说明书的多个方面，附带条件为这些活性片段可决定毒素对位于靶细胞的表面上的受体复合物的结合活性和结合特异性且促进梭菌毒素蛋白水解裂解底物所凭借的总体细胞机制。梭菌毒素的重链的HC区长约400-440个氨基酸且包含结合结构域(表1)。研究已显示梭菌毒素结合结构域的结合活性并不必需梭菌毒素重链的HC区的整个长度。因此，此实施方案的多个方面可包括包含长度为例如至少350、375、400或425个氨基酸的结合结构域的梭菌毒素HC区。此实施方案的其它方面可包括包含长度为例如至多350、375、400或425个氨基酸的结合结构域的梭菌毒素HC区。
多种序列比对方法中的任一者可用于确定一致性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，诸如链段逼近法。确定一致性百分比的方案是在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
全局方法自分子的开始至结束来比对序列且通过加和个别残基对的计分并通过施加间隙罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence AlignmentThrough Sequence Weighting，Position-Specific Gap Penalties and WeightMatrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research4673-4680(1994)；和迭代细化，参见例如Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy ofMultiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement asAssessed by Reference to Structural Alignments,264(4) J.Mol.Biol.823-838(1996)。
局部方法通过鉴定一个或多个由所有输入序列所共享的保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如匹配盒法(Match-box)，参见例如Eric Depiereux和Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501-509(1992)；吉布斯取样法(Gibbs sampling)，参见例如C.E.Lawrence等,Detecting Subtle Sequence Signals:A GibbsSampling Strategy for Multiple Alignment，262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van Walle等,Align-M-A New Algorithmfor Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics,:1428-1435(2004)。
混合方法组合全局比对方法与局部比对方法两者的功能方面。非限制性方法包括例如链段间比较，参见例如Burkhard Morgenstern等,Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based OnSegment-To-Segment Comparison,93(22)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.12098-12103(1996)；T-Coffee，参见例如Cédric Notredame等,T-Coffee:A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment,302(1)J.Mol.Biol.205-217(2000)；MUSCLE，参见例如Robert C.Edgar，MUSCLE：Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and HighThroughput,32(5)Nucleic Acids Res.1792-1797(2004)；和DIALIGN-T，参见例如Amarendran R Subramanian等,DIALIGN-T：AnImproved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment,6(1)BMC Bioinformatics66(2005)。
本说明书描述一个氨基酸取代成另一氨基酸的各种多肽变异体，诸如梭菌毒素变异体、梭菌毒素酶促结构域变异体、梭菌毒素移位结构域变异体、梭菌毒素结合结构域变异体、非梭菌毒素结合结构域变异体和蛋白酶裂解位点变异体。可通过多种因素评估取代，诸如所取代的氨基酸的物理性质(表2)或原始氨基酸将耐受取代的程度(表3)。选择多肽中哪个氨基酸可经取代成另一氨基酸为本领域普通技术人员所已知。
Figure BDA00002756375800181
Figure BDA00002756375800182
Figure BDA00002756375800191
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域和梭菌毒素结合结构域。在此实施方案的一个方面，梭菌毒素包含天然存在的梭菌毒素变异体，诸如梭菌毒素同工型或梭菌毒素亚型。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素包含非天然存在的梭菌毒素变异体，诸如保守梭菌毒素变异体、非保守梭菌毒素变异体或活性梭菌毒素片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域或其活性片段、梭菌毒素移位结构域或其活性片段、梭菌毒素结合结构域或其活性片段或其任何组合。在此实施方案的其它方面，梭菌毒素可包含BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT或BuNT。
在另一实施方案中，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的疏水性氨基酸可取代成另一疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的脂肪族氨基酸可取代成另一脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的芳香族氨基酸可取代成另一芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的堆叠氨基酸可取代成另一堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的极性氨基酸可取代成另一极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的极性较小的或中性氨基酸可取代成另一极性较小的或中性氨基酸。极性较小的或中性氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的带正电荷氨基酸可取代成另一带正电荷氨基酸。带正电荷氨基酸的实例包括例如K、R和H。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的带负电荷氨基酸可取代成另一带负电荷氨基酸。带负电荷氨基酸的实例包括例如D和E。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的小氨基酸可取代成另一小氨基酸。小氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素的多肽链中的一个特定位置上的C-β支链氨基酸可取代成另一C-β支链氨基酸。C-β支链氨基酸的实例包括例如I、T和V。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含BoNT/A。在此实施方案的一个方面，BoNT/A包含BoNT/A酶促结构域、BoNT/A移位结构域和BoNT/A结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。在此实施方案的另一方面，BoNT/A包含天然存在的BoNT/A变异体，诸如BoNT/A同工型或BoNT/A亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/A包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5的天然存在的BoNT/A变异体，诸如BoNT/A同工型或BoNT/A亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/A包含非天然存在的BoNT/A变异体，诸如保守BoNT/A变异体、非保守BoNT/A变异体或活性BoNT/A片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/A包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的非天然存在的BoNT/A变异体，诸如保守BoNT/A变异体、非保守BoNT/A变异体、活性BoNT/A片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/A包含BoNT/A酶促结构域或其活性片段、BoNT/A移位结构域或其活性片段、BoNT/A结合结构域或其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/A包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的BoNT/A酶促结构域或其活性片段、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5的BoNT/A移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的BoNT/A结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，BoNT/A包含与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A包含相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A包含相对于SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含BoNT/B。在此实施方案的一个方面，BoNT/B包含BoNT/B酶促结构域、BoNT/B移位结构域和BoNT/B结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B包含SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在此实施方案的另一方面，BoNT/B包含天然存在的BoNT/B变异体，诸如BoNT/B同工型或BoNT/B亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/B包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10的天然存在的BoNT/B变异体，诸如BoNT/B同工型或BoNT/B亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/B包含非天然存在的BoNT/B变异体，诸如保守BoNT/B变异体、非保守BoNT/B变异体、活性BoNT/B片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/B包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的非天然存在的BoNT/B变异体，诸如保守BoNT/B变异体、非保守BoNT/B变异体、活性BoNT/B片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/B包含BoNT/B酶促结构域或其活性片段、BoNT/B移位结构域或其活性片段、BoNT/B结合结构域或其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/B包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的BoNT/B酶促结构域或其活性片段、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的BoNT/B移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的BoNT/B结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，BoNT/B包含与SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B包含相对于SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B包含相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQID NO:10具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含BoNT/C1。在此实施方案的一个方面，BoNT/C1包含BoNT/C1酶促结构域、BoNT/C1移位结构域和BoNT/C1结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1包含天然存在的BoNT/C1变异体，诸如BoNT/C1同工型或BoNT/C1亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的天然存在的BoNT/C1变异体，诸如BoNT/C1同工型或BoNT/C1亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1包含非天然存在的BoNT/C1变异体，诸如保守BoNT/C1变异体、非保守BoNT/C1变异体、活性BoNT/C1片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的非天然存在的BoNT/C1变异体，诸如保守BoNT/C1变异体、非保守BoNT/C1变异体、活性BoNT/C1片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1包含BoNT/C1酶促结构域或其活性片段、BoNT/C1移位结构域或其活性片段、BoNT/C1结合结构域、其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12的BoNT/C1酶促结构域或其活性片段、SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的BoNT/C1移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的BoNT/C1结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，BoNT/C1包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1包含相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1包含相对于SEQ ID NO:3具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含BoNT/D。在此实施方案的一个方面，BoNT/D包含BoNT/D酶促结构域、BoNT/D移位结构域和BoNT/D结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D包含SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14。在此实施方案的另一方面，BoNT/D包含天然存在的BoNT/D变异体，诸如BoNT/D同工型或BoNT/D亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/D包含SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:14的天然存在的BoNT/D变异体，诸如BoNT/D同工型或BoNT/D亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/D包含非天然存在的BoNT/D变异体，诸如保守BoNT/D变异体、非保守BoNT/D变异体、活性BoNT/D片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/D包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的非天然存在的BoNT/D变异体，诸如保守BoNT/D变异体、非保守BoNT/D变异体、活性BoNT/D片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/D包含BoNT/D酶促结构域或其活性片段、BoNT/D移位结构域或其活性片段、BoNT/D结合结构域或其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/D包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的BoNT/D酶促结构域或其活性片段、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的BoNT/D移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的BoNT/D结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，BoNT/D包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:14具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D包含相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D包含相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含BoNT/E。在此实施方案的一个方面，BoNT/E包含BoNT/E酶促结构域、BoNT/E移位结构域和BoNT/E结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E包含SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17。在此实施方案的另一方面，BoNT/E包含天然存在的BoNT/E变异体，诸如BoNT/E同工型或BoNT/E亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/E包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的天然存在的BoNT/E变异体，诸如BoNT/E同工型或BoNT/E亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/E包含非天然存在的BoNT/E变异体，诸如保守BoNT/E变异体、非保守BoNT/E变异体、活性BoNT/E片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/E包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的非天然存在的BoNT/E变异体，诸如保守BoNT/E变异体、非保守BoNT/E变异体、活性BoNT/E片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/E包含BoNT/E酶促结构域或其活性片段、BoNT/E移位结构域或其活性片段、BoNT/E结合结构域或其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/E包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的BoNT/E酶促结构域或其活性片段、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的BoNT/E移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的BoNT/E结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，BoNT/E包含与SEQ ID NO:15、SEQID NO:16或SEQ ID NO:17具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E包含相对于SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:17具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQID NO:17具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E包含相对于SEQID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:15、SEQID NO:16或SEQ ID NO:17具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含BoNT/F。在此实施方案的一个方面，BoNT/F包含BoNT/F酶促结构域、BoNT/F移位结构域和BoNT/F结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F包含SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20。在此实施方案的另一方面，BoNT/F包含天然存在的BoNT/F变异体，诸如BoNT/F同工型或BoNT/F亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/F包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的天然存在的BoNT/F变异体，诸如BoNT/F同工型或BoNT/F亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/F包含非天然存在的BoNT/F变异体，诸如保守BoNT/F变异体、非保守BoNT/F变异体、活性BoNT/F片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/F包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的非天然存在的BoNT/F变异体，诸如保守BoNT/F变异体、非保守BoNT/F变异体、活性BoNT/F片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/F包含BoNT/F酶促结构域或其活性片段、BoNT/F移位结构域或其活性片段、BoNT/F结合结构域或其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/F包含SEQID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的BoNT/F酶促结构域或其活性片段、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的BoNT/F移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的BoNT/F结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，BoNT/F包含与SEQ ID NO:18、SEQID NO:19或SEQ ID NO:20具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F包含相对于SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQID NO:20具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F包含相对于SEQID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:18、SEQID NO:19或SEQ ID NO:20具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含BoNT/G。在此实施方案的一个方面，BoNT/G包含BoNT/G酶促结构域、BoNT/G移位结构域和BoNT/G结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G包含SEQ IDNO:21。在此实施方案的另一方面，BoNT/G包含天然存在的BoNT/G变异体，诸如BoNT/G同工型或BoNT/G亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/G包含SEQ ID NO:21的天然存在的BoNT/G变异体，诸如SEQ ID NO:21的BoNT/G同工型或BoNT/G亚型。在此实施方案的另一方面，BoNT/G包含非天然存在的BoNT/G变异体，诸如保守BoNT/G变异体、非保守BoNT/G变异体或活性BoNT/G片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/D包含SEQ ID NO:21的非天然存在的BoNT/G变异体，诸如保守BoNT/G变异体、非保守BoNT/G变异体、活性BoNT/G片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/G包含BoNT/G酶促结构域或其活性片段、BoNT/G移位结构域或其活性片段、BoNT/G结合结构域或其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/G包含SEQ ID NO:21的BoNT/G酶促结构域或其活性片段、SEQ ID NO:21的BoNT/G移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:21的BoNT/G结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，BoNT/G包含与SEQ ID NO:21具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:21具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G包含相对于SEQ ID NO:21具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:21具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G包含相对于SEQ ID NO:21具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:21具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含TeNT。在此实施方案的一个方面，TeNT包含TeNT酶促结构域、TeNT移位结构域和TeNT结合结构域。在此实施方案的一个方面，TeNT包含SEQ ID NO:22。在此实施方案的另一方面，TeNT包含天然存在的TeNT变异体，诸如TeNT同工型或TeNT亚型。在此实施方案的另一方面，TeNT包含SEQ ID NO:22的天然存在的TeNT变异体，诸如TeNT同工型或TeNT亚型。在此实施方案的另一方面，TeNT包含非天然存在的TeNT变异体，诸如保守TeNT变异体、非保守TeNT变异体、活性TeNT片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，TeNT包含SEQ ID NO:22的非天然存在的TeNT变异体，诸如保守TeNT变异体、非保守TeNT变异体、活性TeNT片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，TeNT包含TeNT酶促结构域或其活性片段、TeNT移位结构域或其活性片段、TeNT结合结构域或其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，TeNT包含SEQ ID NO:22的TeNT酶促结构域或其活性片段、SEQ ID NO:22的TeNT移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:22的TeNT结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，TeNT包含与SEQ ID NO:22具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:22具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT包含相对于SEQ ID NO:22具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:22具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT包含相对于SEQ ID NO:22具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:22具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含BaNT。在此实施方案的一个方面，BaNT包含BaNT酶促结构域、BaNT移位结构域和BaNT结合结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT包含SEQ ID NO:23。在此实施方案的另一方面，BaNT包含天然存在的BaNT变异体，诸如BaNT同工型或BaNT亚型。在此实施方案的另一方面，BaNT包含SEQ ID NO:23的天然存在的BaNT变异体，诸如BaNT同工型或BaNT亚型。在此实施方案的另一方面，BaNT包含非天然存在的BaNT变异体，诸如保守BaNT变异体、非保守BaNT变异体或活性BaNT片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BaNT包含SEQID NO:23的非天然存在的BaNT变异体，诸如保守BaNT变异体、非保守BaNT变异体、活性BaNT片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BaNT包含BaNT酶促结构域或其活性片段、BaNT移位结构域或其活性片段、BaNT结合结构域或其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BaNT包含SEQ ID NO:23的BaNT酶促结构域或其活性片段、SEQ ID NO:23的BaNT移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:23的BaNT结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，BaNT包含与SEQ ID NO:23具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:23具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT包含相对于SEQ ID NO:23具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:23具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT包含相对于SEQ ID NO:23具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:23具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素包含BuNT。在此实施方案的一个方面，BuNT包含BuNT酶促结构域、BuNT移位结构域和BuNT结合结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。在此实施方案的另一方面，BuNT包含天然存在的BuNT变异体，诸如BuNT同工型或BuNT亚型。在此实施方案的另一方面，BuNT包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的天然存在的BuNT变异体，诸如BuNT同工型或BuNT亚型。在此实施方案的另一方面，BuNT包含非天然存在的BuNT变异体，诸如保守BuNT变异体、非保守BuNT变异体、活性BuNT片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BuNT包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的非天然存在的BuNT变异体，诸如保守BuNT变异体、非保守BuNT变异体、活性BuNT片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BuNT包含BuNT酶促结构域或其活性片段、BuNT移位结构域或其活性片段、BuNT结合结构域、其活性片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BuNT包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的BuNT酶促结构域或其活性片段、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的BuNT移位结构域或其活性片段、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的BuNT结合结构域或其活性片段或其任何组合。
在此实施方案的其它方面，BuNT包含与SEQ ID NO:24或SEQID NO:25具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
如本文所用，术语“梭菌毒素嵌合体”是指包含来自一种梭菌毒素的至少一部分和来自至少一种其它蛋白质的一部分以形成至少一种性质不同于表1的参考梭菌毒素的毒素的分子。梭菌毒素嵌合体的非限制性实例包括包含非梭菌毒素酶促结构域的梭菌毒素、包含非梭菌毒素移位结构域的梭菌毒素、包含非梭菌毒素结合结构域的梭菌毒素或其任何组合。梭菌毒素嵌合体的其它非限制性实例包括包含来自不同梭菌毒素的酶促结构域的梭菌毒素、包含来自不同梭菌毒素的移位结构域的梭菌毒素、包含来自不同梭菌毒素的结合结构域的梭菌毒素或其任何组合。
一个类别的梭菌毒素嵌合体包含修饰梭菌毒素，其中天然存在的梭菌毒素的酶促结构域或其部分、移位结构域或其部分、和/或结合结构域或其部分修饰或置换为不同梭菌毒素的酶促结构域或其部分、移位结构域或其部分、和/或结合结构域或其部分。作为非限制性实例，BoNT/A的结合结构域可置换为BoNT/B的结合结构域，从而产生包含BoNT/A酶促结构域、BoNT/A移位结构域和BoNT/B结合结构域的梭菌毒素嵌合体。所述梭菌毒素嵌合体描述于例如J.OliverDolly等,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利7,132,259中，所述专利全文以引用的方式并入本文。作为另一非限制性实例，可将来自BoNT/A的亮氨酸基序插入BoNT/E的轻链中以增加生物持久性。所述梭菌毒素嵌合体描述于例如Lance E.Steward等,Leucine-based Motif and Clostridial Toxins,美国专利公布2003/0027752(2003年2月6日)；Lance E.Steward等,ClostridialNeurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins,美国专利公布2003/0219462(2003年11月27日)；和Lance E.Steward等,Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified ClostridialNeurotoxins,美国专利公布2004/0220386(2004年11月4日)中，所述专利各自全文以引用的方式并入本文。
另一类别的梭菌毒素嵌合体包含梭菌毒素，其中天然存在的梭菌毒素的结合结构域修饰或置换为非梭菌毒素的结合结构域。所述梭菌毒素嵌合体具有改变的细胞结合活性，因为修饰毒素可例如1)使用与天然存在的梭菌毒素所使用的受体相同的存在于天然存在的梭菌毒素靶细胞的表面上的受体，称为对天然存在的梭菌毒素靶细胞的细胞结合活性增强；2)使用存在于天然存在的梭菌毒素靶细胞的表面上的不同受体，称为对天然存在的梭菌毒素靶细胞的细胞结合活性改变；或3)使用存在于非梭菌毒素靶细胞的表面上的不同受体，称为对非天然存在的梭菌毒素靶细胞的细胞结合活性改变，即再靶向毒素或TVEMP。
梭菌毒素嵌合体可为细胞结合活性增强的能够使天然存在的梭菌毒素靶细胞，例如运动神经元中毒的梭菌毒素。一种达成此结合活性增强的方式是通过修饰天然存在的梭菌毒素的内源性结合结构域以增强毒素对其天然存在的受体的细胞结合活性来达成。对靶向结构域的所述修饰导致例如增加对存在于天然存在的梭菌毒素靶细胞上的内源性梭菌毒素受体的结合亲和力的细胞结合活性增强；增加对存在于天然存在的梭菌毒素靶细胞上的内源性梭菌毒素受体亚组的结合特异性的细胞结合活性增强；或增加结合亲和力与结合特异性两者的细胞结合活性增强。对天然存在的梭菌毒素受体的细胞结合活性增强的修饰梭菌毒素的非限制性实例描述于例如Lance E.Steward等,Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities ForEndogenous Clostridial Toxin Receptor Systems,美国专利公布2008/0096248；Lance E.Steward,Modified Clostridial Toxins withEnhanced Translocation Capabilities and Enhanced Targeting Activity forClostridial Toxin Target Cells,国际专利公布2008/105901中；所述专利各自据此全文以引用的方式并入本文。
梭菌毒素嵌合体可为细胞结合活性改变的能够使天然存在的梭菌毒素靶细胞，例如运动神经元中毒的梭菌毒素。一种达成此能力改变的方式是通过用优先结合存在于梭菌毒素靶细胞的表面上的不同受体的另一分子的结合结构域置换天然存在的梭菌毒素的内源性结合结构域来达成。对结合结构域的所述修饰产生能够优先结合存在于梭菌毒素靶细胞上的非梭菌毒素受体的修饰毒素。对天然存在的梭菌毒素靶细胞的此增强的结合活性允许向个体施用较低有效剂量的修饰梭菌毒素，因为更多毒素将递送至靶细胞。因此，结合活性增强的修饰梭菌毒素将减少毒素不当散布至不为治疗所靶向的区，由此减少或防止与梭菌毒素扩散至不希望的位置相关的不当副作用。对梭菌毒素靶细胞的细胞结合能力改变的修饰梭菌毒素的非限制性实例描述于例如Lance E.Steward等,Multivalent Clostridial Toxin Derivativesand Methods of Their Use,美国专利7,514,088；Lance E.Steward等,Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities ForClostridial Toxin Target Cells,美国专利公布2008/0161543；Lance E.Steward,Modified Clostridial Toxins with Enhanced TranslocationCapabilities and Altered Targeting Activity for Clostridiall Toxin TargetCells,美国专利公布2008/0241881；Lance E.Steward等,MultivalentClostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use,美国专利公布2009/0048431；Lance E.Steward等,Modified Clostridial Toxins withAltered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells,国际专利公布WO2007/106115中；所述专利各自据此全文以引用的方式并入本文。
梭菌毒素嵌合体可为细胞结合活性改变的能够使除梭菌毒素靶细胞以外的细胞，例如除运动神经元以外的细胞中毒的梭菌毒素。称为TVEMP的这些分子通过使用存在于非梭菌毒素靶细胞上的靶受体来达成这种中毒作用。此再靶向能力是通过用对存在于非梭菌毒素靶细胞中的非梭菌毒素受体显示优先结合活性的结合结构域置换梭菌毒素的天然存在的结合结构域来达成。对结合结构域的所述修饰产生能够优先结合存在于非梭菌毒素靶细胞上的非梭菌毒素受体的修饰毒素。对非梭菌毒素靶细胞的靶向活性改变的梭菌毒素嵌合体可结合靶受体，移位至细胞质中，且对非梭菌毒素靶细胞的SNARE复合物施加其蛋白水解作用。对非梭菌毒素靶细胞的靶向活性改变的梭菌毒素嵌合体的非限制性实例描述于例如Keith A.Foster等,ClostridialToxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions,美国专利5,989,545；Clifford C.Shone等,Recombinant ToxinFragments,美国专利6,461,617；Conrad P. Quinn等,Methods andCompounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion,美国专利6,632,440；Lance E.Steward等,Methods and Compositions for theTreatment of Pancreatitis,美国专利6,843,998；J.Oliver Dolly等,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利7,132,259；StephanDonovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain,美国专利7,244,437；Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives andMethods For Treating Pain,美国专利7,413,742；Stephan Donovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain,美国专利7,415,338；Lance E.Steward等,Multivalent Clostridial ToxinDerivatives and Methods of Their Use,美国专利7,514,088；Keith A.Foster等,Inhibition of Secretion from Non-neural Cells,美国专利公布2006/0216283；Keith A.Foster,Fusion Proteins,美国专利公布2008/0064092；Keith A.Foster，Fusion Proteins,美国专利公布2009/0035822；Lance E.Steward等,Multivalent Clostridial ToxinDerivatives and Methods of Their Use,美国专利公布2009/0048431；Keith A.Foster,Non-Cytotoxic Protein Conjugates,美国专利公布2009/0162341；Keith A.Foster等,Re-targeted Toxin Conjugates,国际专利公布WO2005/023309；和Lance E.Steward,Modified ClostridialToxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered TargetingCapabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells,国际专利申请WO2008/008805中；所述专利各自据此全文以引用的方式并入本文。
本说明书的多个方面部分地提供梭菌毒素酶促结构域。如本文所用，术语“梭菌毒素酶促结构域”是指可执行中毒过程的酶促靶标修饰步骤的任何梭菌毒素多肽。因此，梭菌毒素酶促结构域特异性靶向梭菌毒素底物且涵盖梭菌毒素底物的蛋白水解裂解，诸如SNARE蛋白质，如SNAP-25底物、VAMP底物和突触融合蛋白底物。梭菌毒素酶促结构域的非限制性实例包括例如BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域和BuNT酶促结构域。
梭菌毒素酶促结构域包括但不限于天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体，诸如梭菌毒素酶促结构域同工型和梭菌毒素酶促结构域亚型；以及非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体，诸如保守梭菌毒素酶促结构域变异体、非保守梭菌毒素酶促结构域变异体、其活性梭菌毒素酶促结构域片段或其任何组合。
如本文所用，术语“梭菌毒素酶促结构域变异体”无论是天然存在或非天然存在的皆指与公开的参考序列(表1)的相应区相比具有至少一个氨基酸变化且可用与那个参考序列的相应区的一致性百分比描述的梭菌毒素酶促结构域。除非明确指示，否则适用于实施公开的实施方案的梭菌毒素酶促结构域变异体为执行中毒过程的酶促靶标修饰步骤的变异体。作为非限制性实例，相较于SEQ ID NO:1的氨基酸1/2-429，BoNT/A酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:6的氨基酸1/2-436，BoNT/B酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:11的氨基酸1/2-436，BoNT/C1酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:13的氨基酸1/2-436，BoNT/D酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:15的氨基酸1/2-411，BoNT/E酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:18的氨基酸1/2-428，BoNT/F酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:21的氨基酸1/2-438，BoNT/G酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:22的氨基酸1/2-438，TeNT酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQID NO:23的氨基酸1/2-420，BaNT酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；且相较于SEQ ID NO:24的氨基酸1/2-411，BuNT酶促结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加。
本领域技术人员应认识到在梭菌毒素的各血清型内，可存在天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体，所述天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体在它们的氨基酸序列方面以及在编码这些蛋白质的核酸方面多少有些不同。举例来说，目前存在五种BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，其中当与SEQID NO:1的BoNT/A酶促结构域比较时，特定酶促结构域亚型显示约80%至95%氨基酸一致性。如本文所用，术语“天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体”是指通过天然存在的过程产生的任何梭菌毒素酶促结构域，包括但不限于自交替拼接转录物产生的梭菌毒素酶促结构域同工型、通过自发突变产生的梭菌毒素酶促结构域同工型、和梭菌毒素酶促结构域亚型。天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体可以与天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素酶促结构域。
天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体的非限制性实例为梭菌毒素酶促结构域同工型，诸如BoNT/A酶促结构域同工型、BoNT/B酶促结构域同工型、BoNT/C1酶促结构域同工型、BoNT/D酶促结构域同工型、BoNT/E酶促结构域同工型、BoNT/F酶促结构域同工型、BoNT/G酶促结构域同工型、TeNT酶促结构域同工型、BaNT酶促结构域同工型和BuNT酶促结构域同工型。天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体的另一非限制性实例为梭菌毒素酶促结构域亚型，诸如来自亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4或BoNT/A5的酶促结构域；来自亚型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/Bbv或BoNT/Bnp的酶促结构域；来自亚型BoNT/C1-1或BoNT/C1-2的酶促结构域；来自亚型BoNT/E1、BoNT/E2和BoNT/E3的酶促结构域；来自亚型BoNT/F1、BoNT/F2或BoNT/F3的酶促结构域；和来自亚型BuNT-1或BuNT-2的酶促结构域。
如本文所用，术语“非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体”是指借助于人操作所产生的任何梭菌毒素酶促结构域，包括但不限于通过使用随机诱变或合理设计进行遗传工程改造所产生的梭菌毒素酶促结构域和通过化学合成所产生的梭菌毒素酶促结构域。非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体的非限制性实例包括例如保守梭菌毒素酶促结构域变异体、非保守梭菌毒素酶促结构域变异体、梭菌毒素酶促结构域嵌合变异体和活性梭菌毒素酶促结构域片段。
如本文所用，术语“保守梭菌毒素酶促结构域变异体”是指至少一个氨基酸取代为至少一种性质类似于来自参考梭菌毒素酶促结构域序列(表1)的原始氨基酸的性质的另一氨基酸或氨基酸类似物的梭菌毒素酶促结构域。性质的实例包括但不限于类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键结能力、氢键结能力、物理化学性质等或其任何组合。保守梭菌毒素酶促结构域变异体可以与保守梭菌毒素酶促结构域变异体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素酶促结构域。保守梭菌毒素酶促结构域变异体的非限制性实例包括例如保守BoNT/A酶促结构域变异体、保守BoNT/B酶促结构域变异体、保守BoNT/C1酶促结构域变异体、保守BoNT/D酶促结构域变异体、保守BoNT/E酶促结构域变异体、保守BoNT/F酶促结构域变异体、保守BoNT/G酶促结构域变异体、保守TeNT酶促结构域变异体、保守BaNT酶促结构域变异体和保守BuNT酶促结构域变异体。
如本文所用，术语“非保守梭菌毒素酶促结构域变异体”是指以下梭菌毒素酶促结构域：其中1)自非保守梭菌毒素酶促结构域变异体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域缺失至少一个氨基酸；2)向非保守梭菌毒素酶促结构域所基于的参考梭菌毒素酶促结构域中添加至少一个氨基酸；或3)至少一个氨基酸取代为不共享类似于来自参考梭菌毒素酶促结构域序列(表1)的原始氨基酸的性质的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守梭菌毒素酶促结构域变异体可以与非保守梭菌毒素酶促结构域变异体所基于的参考梭菌毒素酶促结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素酶促结构域。非保守梭菌毒素酶促结构域变异体的非限制性实例包括例如非保守BoNT/A酶促结构域变异体、非保守BoNT/B酶促结构域变异体、非保守BoNT/C1酶促结构域变异体、非保守BoNT/D酶促结构域变异体、非保守BoNT/E酶促结构域变异体、非保守BoNT/F酶促结构域变异体、非保守BoNT/G酶促结构域变异体和非保守TeNT酶促结构域变异体、非保守BaNT酶促结构域变异体和非保守BuNT酶促结构域变异体。
如本文所用，术语“活性梭菌毒素酶促结构域片段”是指可适用于本说明书的多个方面的多种包含酶促结构域的梭菌毒素片段中的任一者，附带条件为这些酶促结构域片段可特异性靶向神经递质释放机构的核心组分且因此参与执行梭菌毒素蛋白水解裂解底物所凭借的总体细胞机制。梭菌毒素的酶促结构域长约420-460个氨基酸且包含酶促结构域(表1)。研究已显示酶促结构域的酶促活性并不必需梭菌毒素酶促结构域的整个长度。作为一个非限制性实例，BoNT/A酶促结构域的前八个氨基酸不为酶促活性所需。作为另一非限制性实例，TeNT酶促结构域的前八个氨基酸不为酶促活性所需。同样，酶促结构域的羧基末端不为活性所必需。作为一个非限制性实例，BoNT/A酶促结构域的最后32个氨基酸不为酶促活性所需。作为另一非限制性实例，TeNT酶促结构域的最后31个氨基酸不为酶促活性所需。因此，此实施方案的多个方面包括包含长度为例如至少350、375、400、425或450个氨基酸的酶促结构域的梭菌毒素酶促结构域。此实施方案的其它方面包括包含长度为例如至多350、375、400、425或450个氨基酸的酶促结构域的梭菌毒素酶促结构域。
多种序列比对方法中的任一者可用于确定天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体和非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体的一致性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，诸如链段逼近方法。确定一致性百分比的方案是在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的修饰梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域。在此实施方案的一个方面，梭菌毒素酶促结构域包含天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体，诸如梭菌毒素酶促结构域同工型或梭菌毒素酶促结构域亚型。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素酶促结构域包含非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变异体，诸如保守梭菌毒素酶促结构域变异体、非保守梭菌毒素酶促结构域变异体、活性梭菌毒素酶促结构域片段或其任何组合。
在另一实施方案中，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的疏水性氨基酸可取代为另一疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的脂肪族氨基酸可取代为另一脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的芳香族氨基酸可取代为另一芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的堆叠氨基酸可取代为另一堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性氨基酸可取代为另一极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性较小的或中性氨基酸可取代为另一极性较小的或中性氨基酸。极性较小的或中性氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的带正电荷氨基酸可取代为另一带正电荷氨基酸。带正电荷氨基酸的实例包括例如K、R和H。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的带负电荷氨基酸可取代为另一带负电荷氨基酸。带负电荷氨基酸的实例包括例如D和E。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的小氨基酸可取代为另一小氨基酸。小氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的C-β支链氨基酸可取代为另一C-β支链氨基酸。C-β支链氨基酸的实例包括例如I、T和V。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/A酶促结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQID NO:1的氨基酸1/2-429。在此实施方案的另一方面，BoNT/A酶促结构域包含天然存在的BoNT/A酶促结构域变异体，诸如来自BoNT/A同工型的酶促结构域或来自BoNT/A亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的天然存在的BoNT/A酶促结构域变异体，诸如BoNT/A同工型酶促结构域或BoNT/A亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO:1的天然存在的BoNT/A酶促结构域变异体(诸如BoNT/A同工型酶促结构域或BoNT/A亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-429。在此实施方案的另一方面，BoNT/A酶促结构域包含非天然存在的BoNT/A酶促结构域变异体，诸如保守BoNT/A酶促结构域变异体、非保守BoNT/A酶促结构域变异体、活性BoNT/A酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的非天然存在的BoNT/A酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/A酶促结构域变异体、非保守BoNT/A酶促结构域变异体、活性BoNT/A酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO:1的非天然存在的BoNT/A酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/A酶促结构域变异体、非保守BoNT/A酶促结构域变异体、活性BoNT/A酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-429。
在此实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1/2-429具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:1的氨基酸1/2-429具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含相对于SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含相对于SEQID NO:1的氨基酸1/2-429具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1的氨基酸1/2-429具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸1/2-429具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1的氨基酸1/2-429具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/B酶促结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/B酶促结构域包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸1/2-436。在此实施方案的另一方面，BoNT/B酶促结构域包含天然存在的BoNT/B酶促结构域变异体，诸如来自BoNT/B同工型的酶促结构域或来自BoNT/B亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B酶促结构域包含SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的天然存在的BoNT/B酶促结构域变异体，诸如BoNT/B同工型酶促结构域或BoNT/B亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B酶促结构域包含SEQ ID NO:6的天然存在的BoNT/B酶促结构域变异体(诸如BoNT/B同工型酶促结构域或BoNT/B亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-436。在此实施方案的另一方面，BoNT/B酶促结构域包含非天然存在的BoNT/B酶促结构域变异体，诸如保守BoNT/B酶促结构域变异体、非保守BoNT/B酶促结构域变异体、活性BoNT/B酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/B酶促结构域包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的非天然存在的BoNT/B酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/B酶促结构域变异体、非保守BoNT/B酶促结构域变异体、活性BoNT/B酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B酶促结构域包含SEQ ID NO:6的非天然存在的BoNT/B酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/B酶促结构域变异体、非保守BoNT/B酶促结构域变异体、活性BoNT/B酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-436。
在此实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包含与SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸1/2-436具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:6的氨基酸1/2-436具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包含相对于SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQID NO:10的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包含相对于SEQID NO:6的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:6的氨基酸1/2-436具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/C1酶促结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/C1酶促结构域包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸1/2-436。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1酶促结构域包含天然存在的BoNT/C1酶促结构域变异体，诸如来自BoNT/C1同工型的酶促结构域或来自BoNT/C1亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1酶促结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的天然存在的BoNT/C1酶促结构域变异体，诸如BoNT/C1同工型酶促结构域或BoNT/C1亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1酶促结构域包含SEQ ID NO:11的天然存在的BoNT/C1酶促结构域变异体(诸如BoNT/C1同工型酶促结构域或BoNT/C1亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-436。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1酶促结构域包含非天然存在的BoNT/C1酶促结构域变异体，诸如保守BoNT/C1酶促结构域变异体、非保守BoNT/C1酶促结构域变异体、活性BoNT/C1酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1酶促结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的非天然存在的BoNT/C1酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/C1酶促结构域变异体、非保守BoNT/C1酶促结构域变异体、活性BoNT/C1酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1酶促结构域包含SEQ ID NO:11的非天然存在的BoNT/C1酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/C1酶促结构域变异体、非保守BoNT/C1酶促结构域变异体、活性BoNT/C1酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-436。
在此实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包含与SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包含与SEQ IDNO:11的氨基酸1/2-436具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:11的氨基酸1/2-436具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包含相对于SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:11的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:11的氨基酸1/2-436具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/D酶促结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/D酶促结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸1/2-436。在此实施方案的另一方面，BoNT/D酶促结构域包含天然存在的BoNT/D酶促结构域变异体，诸如来自BoNT/D同工型的酶促结构域或来自BoNT/D亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D酶促结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的天然存在的BoNT/D酶促结构域变异体，诸如BoNT/D同工型酶促结构域或BoNT/D亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D酶促结构域包含SEQ ID NO:13的天然存在的BoNT/D酶促结构域变异体(诸如BoNT/D同工型酶促结构域或BoNT/D亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-436。在此实施方案的另一方面，BoNT/D酶促结构域包含非天然存在的BoNT/D酶促结构域变异体，诸如保守BoNT/D酶促结构域变异体、非保守BoNT/D酶促结构域变异体、活性BoNT/D酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/D酶促结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的非天然存在的BoNT/D酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/D酶促结构域变异体、非保守BoNT/D酶促结构域变异体、活性BoNT/D酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D酶促结构域包含SEQ ID NO:13的非天然存在的BoNT/D酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/D酶促结构域变异体、非保守BoNT/D酶促结构域变异体、活性BoNT/D酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-436。
在此实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包含与SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包含与SEQ ID NO:13的氨基酸1/2-436具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:13的氨基酸1/2-436具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包含相对于SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:13的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:13的氨基酸1/2-436具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/E酶促结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/E酶促结构域包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸1/2-411。在此实施方案的另一方面，BoNT/E酶促结构域包含天然存在的BoNT/E酶促结构域变异体，诸如来自BoNT/E同工型的酶促结构域或来自BoNT/E亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E酶促结构域包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:17的天然存在的BoNT/E酶促结构域变异体，诸如BoNT/E同工型酶促结构域或BoNT/E亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E酶促结构域包含SEQ ID NO:15的天然存在的BoNT/E酶促结构域变异体(诸如BoNT/E同工型酶促结构域或BoNT/E亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-411。在此实施方案的另一方面，BoNT/E酶促结构域包含非天然存在的BoNT/E酶促结构域变异体，诸如保守BoNT/E酶促结构域变异体、非保守BoNT/E酶促结构域变异体、活性BoNT/E酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/E酶促结构域包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的非天然存在的BoNT/E酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/E酶促结构域变异体、非保守BoNT/E酶促结构域变异体、活性BoNT/E酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E酶促结构域包含SEQ ID NO:15的非天然存在的BoNT/E酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/E酶促结构域变异体、非保守BoNT/E酶促结构域变异体、活性BoNT/E酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-411。
在此实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包含与SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包含与SEQ ID NO:15的氨基酸1/2-411具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:15的氨基酸1/2-411具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包含相对于SEQID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:17的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:15的氨基酸1/2-411具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15的氨基酸1/2-411具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:15的氨基酸1/2-411具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQID NO:15的氨基酸1/2-411具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/F酶促结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/F酶促结构域包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸1/2-428。在此实施方案的另一方面，BoNT/F酶促结构域包含天然存在的BoNT/F酶促结构域变异体，诸如来自BoNT/F同工型的酶促结构域或来自BoNT/F亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F酶促结构域包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:20的天然存在的BoNT/F酶促结构域变异体，诸如BoNT/F同工型酶促结构域或BoNT/F亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F酶促结构域包含SEQ ID NO:18的天然存在的BoNT/F酶促结构域变异体(诸如BoNT/F同工型酶促结构域或BoNT/F亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-428。在此实施方案的另一方面，BoNT/F酶促结构域包含非天然存在的BoNT/F酶促结构域变异体，诸如保守BoNT/F酶促结构域变异体、非保守BoNT/F酶促结构域变异体、活性BoNT/F酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/F酶促结构域包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的非天然存在的BoNT/F酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/F酶促结构域变异体、非保守BoNT/F酶促结构域变异体、活性BoNT/F酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F酶促结构域包含SEQ ID NO:18的非天然存在的BoNT/F酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/F酶促结构域变异体、非保守BoNT/F酶促结构域变异体、活性BoNT/F酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-428。
在此实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包含与SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸1/2-428具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:18的氨基酸1/2-428具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包含相对于SEQID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:18的氨基酸1/2-428具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18的氨基酸1/2-428具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:18的氨基酸1/2-428具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQID NO:18的氨基酸1/2-428具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/G酶促结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/G酶促结构域包含SEQ ID NO:21的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸1/2-4435。在此实施方案的另一方面，BoNT/G酶促结构域包含天然存在的BoNT/G酶促结构域变异体，诸如来自BoNT/G同工型的酶促结构域或来自BoNT/G亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G酶促结构域包含SEQ ID NO:21的天然存在的BoNT/G酶促结构域变异体，诸如BoNT/G同工型酶促结构域或BoNT/G亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G酶促结构域包含SEQ ID NO:21的天然存在的BoNT/G酶促结构域变异体(诸如BoNT/G同工型酶促结构域或BoNT/G亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-4435。在此实施方案的另一方面，BoNT/G酶促结构域包含非天然存在的BoNT/G酶促结构域变异体，诸如保守BoNT/G酶促结构域变异体、非保守BoNT/G酶促结构域变异体、活性BoNT/G酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/G酶促结构域包含SEQ ID NO:21的非天然存在的BoNT/G酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/G酶促结构域变异体、非保守BoNT/G酶促结构域变异体、活性BoNT/G酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G酶促结构域包含SEQ ID NO:21的非天然存在的BoNT/G酶促结构域变异体(诸如保守BoNT/G酶促结构域变异体、非保守BoNT/G酶促结构域变异体、活性BoNT/G酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-4435。
在此实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包含与SEQ IDNO:21的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:21的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包含与SEQ ID NO:21的氨基酸1/2-4435具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:21的氨基酸1/2-4435具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包含相对于SEQID NO:21的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:21的氨基酸1/2-4435具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的氨基酸1/2-4435具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:21的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:21的氨基酸1/2-4435具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的氨基酸1/2-4435具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含TeNT酶促结构域。在此实施方案的一个方面，TeNT酶促结构域包含SEQ ID NO:22的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包含SEQID NO:22的氨基酸1/2-438。在此实施方案的另一方面，TeNT酶促结构域包含天然存在的TeNT酶促结构域变异体，诸如来自TeNT同工型的酶促结构域或来自TeNT亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，TeNT酶促结构域包含SEQ ID NO:22的天然存在的TeNT酶促结构域变异体，诸如TeNT同工型酶促结构域或TeNT亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，TeNT酶促结构域包含SEQ ID NO:22的天然存在的TeNT酶促结构域变异体(诸如TeNT同工型酶促结构域或TeNT亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-438。在此实施方案的另一方面，TeNT酶促结构域包含非天然存在的TeNT酶促结构域变异体，诸如保守TeNT酶促结构域变异体、非保守TeNT酶促结构域变异体、活性TeNT酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，TeNT酶促结构域包含SEQ ID NO:22的非天然存在的TeNT酶促结构域变异体(诸如保守TeNT酶促结构域变异体、非保守TeNT酶促结构域变异体、活性TeNT酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，TeNT酶促结构域包含SEQ ID NO:22的非天然存在的TeNT酶促结构域变异体(诸如保守TeNT酶促结构域变异体、非保守TeNT酶促结构域变异体、活性TeNT酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-438。
在此实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包含与SEQ ID NO:22的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:22的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包含与SEQ ID NO:22的氨基酸1/2-438具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:22的氨基酸1/2-438具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包含相对于SEQ IDNO:22的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:22的氨基酸1/2-438具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的氨基酸1/2-438具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:22的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:22的氨基酸1/2-438具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的氨基酸1/2-438具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BaNT酶促结构域。在此实施方案的一个方面，BaNT酶促结构域包含SEQ ID NO:23的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包含SEQID NO:23的氨基酸1/2-420。在此实施方案的另一方面，BaNT酶促结构域包含天然存在的BaNT酶促结构域变异体，诸如来自BaNT同工型的酶促结构域或来自BaNT亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT酶促结构域包含SEQ ID NO:23的天然存在的BaNT酶促结构域变异体，诸如BaNT同工型酶促结构域或BaNT亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT酶促结构域包含SEQ ID NO:23的天然存在的BaNT酶促结构域变异体(诸如BaNT同工型酶促结构域或BaNT亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-420。在此实施方案的另一方面，BaNT酶促结构域包含非天然存在的BaNT酶促结构域变异体，诸如保守BaNT酶促结构域变异体、非保守BaNT酶促结构域变异体、活性BaNT酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BaNT酶促结构域包含SEQ ID NO:23的非天然存在的BaNT酶促结构域变异体(诸如保守BaNT酶促结构域变异体、非保守BaNT酶促结构域变异体、活性BaNT酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT酶促结构域包含SEQ IDNO:23的非天然存在的BaNT酶促结构域变异体(诸如保守BaNT酶促结构域变异体、非保守BaNT酶促结构域变异体、活性BaNT酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-420。
在此实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包含与SEQ ID NO:23的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:23的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包含与SEQ ID NO:23的氨基酸1/2-420具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:23的氨基酸1/2-420具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包含相对于SEQ IDNO:23的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:23的氨基酸1/2-420具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的氨基酸1/2-420具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:23的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:23的氨基酸1/2-420具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的氨基酸1/2-420具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BuNT酶促结构域。在此实施方案的一个方面，BuNT酶促结构域包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的酶促结构域。在此实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸1/2-411。在此实施方案的另一方面，BuNT酶促结构域包含天然存在的BuNT酶促结构域变异体，诸如来自BuNT同工型的酶促结构域或来自BuNT亚型的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT酶促结构域包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的天然存在的BuNT酶促结构域变异体，诸如BuNT同工型酶促结构域或BuNT亚型酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT酶促结构域包含SEQ ID NO:24的天然存在的BuNT酶促结构域变异体(诸如BuNT同工型酶促结构域或BuNT亚型酶促结构域)的氨基酸1/2-411。在此实施方案的另一方面，BuNT酶促结构域包含非天然存在的BuNT酶促结构域变异体，诸如保守BuNT酶促结构域变异体、非保守BuNT酶促结构域变异体、活性BuNT酶促结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BuNT酶促结构域包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的非天然存在的BuNT酶促结构域变异体(诸如保守BuNT酶促结构域变异体、非保守BuNT酶促结构域变异体、活性BuNT酶促结构域片段或其任何组合)的酶促结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT酶促结构域包含SEQ IDNO:24的非天然存在的BuNT酶促结构域变异体(诸如保守BuNT酶促结构域变异体、非保守BuNT酶促结构域变异体、活性BuNT酶促结构域片段或其任何组合)的氨基酸1/2-411。
在此实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的酶促结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的酶促结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸1/2-411具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸1/2-411具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含相对于SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:25的氨基酸1/2-411具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸1/2-411具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸1/2-411具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:25的氨基酸1/2-411具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
“移位结构域”包含梭菌神经毒素重链的具有移位活性的一部分。就“移位”来说，其意指促进多肽转运穿过囊泡膜，由此将多肽的部分或全部暴露于细胞质的能力。在各种肉毒杆菌神经毒素中，认为移位涉及重链的由内体内pH降低引起的变构构象变化。这种构象变化似乎涉及重链的N端半部并由其介导且似乎导致在囊泡膜中形成孔；这种变化允许蛋白水解性轻链由内体囊泡内移动至细胞质中。参见例如Lacy等,Nature Struct.Biol.5:898-902(1998年10月)。
肉毒杆菌神经毒素重链的移位介导部分的氨基酸序列为本领域技术人员所知；另外，这个部分内的已知为赋予移位活性所必需的那些氨基酸残基也是已知的。因此，例如采用各种破伤风梭菌或肉毒梭菌神经毒素亚型中的任一者的重链的天然存在的N端肽半部作为移位结构域，或通过比对各种重链的N端半部的一级序列并基于序列之间的保守氨基酸、极性、空间和疏水性特征选择共有一级移位序列来设计类似移位结构域将完全在本领域一般技术人员的能力范围内。
本说明书的多个方面部分地提供梭菌毒素移位结构域。如本文所用，术语“梭菌毒素移位结构域”是指可执行中毒过程中介导梭菌毒素轻链移位的移位步骤的任何梭菌毒素多肽。因此，梭菌毒素移位结构域促进梭菌毒素轻链跨膜移动且涵盖梭菌毒素轻链穿过细胞内囊泡膜移动至细胞的细胞质中。梭菌毒素移位结构域的非限制性实例包括例如BoNT/A移位结构域、BoNT/B移位结构域、BoNT/C1移位结构域、BoNT/D移位结构域、BoNT/E移位结构域、BoNT/F移位结构域、BoNT/G移位结构域、TeNT移位结构域、BaNT移位结构域和BuNT移位结构域。
梭菌毒素移位结构域包括但不限于天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体，诸如梭菌毒素移位结构域同工型和梭菌毒素移位结构域亚型；非天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体，诸如保守梭菌毒素移位结构域变异体、非保守梭菌毒素移位结构域变异体、其活性梭菌毒素移位结构域片段或其任何组合。
如本文所用，术语“梭菌毒素移位结构域变异体”无论是天然存在或非天然存在的皆指与公开的参考序列(表1)的相应区相比具有至少一个氨基酸变化且可用与那个参考序列的相应区的一致性百分比描述的梭菌毒素移位结构域。除非明确指示，否则适用于实施公开的实施方案的梭菌毒素移位结构域变异体为执行中毒过程中介导梭菌毒素轻链移位的移位步骤的变异体。作为非限制性实例，相较于SEQ IDNO:1的氨基酸455-873，BoNT/A移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:6的氨基酸447-860，BoNT/B移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:11的氨基酸454-868，BoNT/C1移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:13的氨基酸451-864，BoNT/D移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:15的氨基酸427-847，BoNT/E移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:18的氨基酸446-865，BoNT/F移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:21的氨基酸451-865，BoNT/G移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:22的氨基酸468-881，TeNT移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:23的氨基酸436-857，BaNT移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；且相较于SEQ ID NO:24的氨基酸427-847，BuNT移位结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加。
本领域技术人员应认识到在梭菌毒素的各血清型内，可存在天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体，所述天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体在其氨基酸序列方面以及在编码这些蛋白质的核酸方面多少有些不同。举例来说，目前存在五种BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，其中当与SEQID NO:1的BoNT/A移位结构域亚型相比较时，特定移位结构域亚型显示约85-87%氨基酸一致性。如本文所用，术语“天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体”是指通过天然存在的过程产生的任何梭菌毒素移位结构域，包括但不限于自交替拼接转录物产生的梭菌毒素移位结构域同工型、通过自发突变产生的梭菌毒素移位结构域同工型、和梭菌毒素移位结构域亚型。天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体可以与天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体所基于的参考梭菌毒素移位结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素移位结构域。
天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体的非限制性实例为梭菌毒素移位结构域同工型，诸如BoNT/A移位结构域同工型、BoNT/B移位结构域同工型、BoNT/C1移位结构域同工型、BoNT/D移位结构域同工型、BoNT/E移位结构域同工型、BoNT/F移位结构域同工型、BoNT/G移位结构域同工型、TeNT移位结构域同工型、BaNT移位结构域同工型和BuNT移位结构域同工型。天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体的另一非限制性实例为梭菌毒素移位结构域亚型，诸如来自亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5的移位结构域；来自亚型BoNT/B1、BoNT/B2、二价BoNT/B和非蛋白水解BoNT/B的移位结构域；来自亚型BoNT/C1-1和BoNT/C1-2的移位结构域；来自亚型BoNT/E1、BoNT/E2和BoNT/E3的移位结构域；来自亚型BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3的移位结构域；以及来自亚型BuNT-1和BuNT-2的移位结构域。
如本文所用，术语“非天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体”是指借助于人操作产生的任何梭菌毒素移位结构域，包括但不限于通过使用随机诱变或合理设计进行遗传工程改造所产生的梭菌毒素移位结构域和通过化学合成所产生的梭菌毒素移位结构域。非天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体的非限制性实例包括例如保守梭菌毒素移位结构域变异体、非保守梭菌毒素移位结构域变异体和活性梭菌毒素移位结构域片段。
如本文所用，术语“保守梭菌毒素移位结构域变异体”是指至少一个氨基酸取代为至少一种性质类似于来自参考梭菌毒素移位结构域序列(表1)的原始氨基酸的性质的另一氨基酸或氨基酸类似物的梭菌毒素移位结构域。性质的实例包括但不限于类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键结能力、氢键结能力、物理化学性质等或其任何组合。保守梭菌毒素移位结构域变异体可以与保守梭菌毒素移位结构域变异体所基于的参考梭菌毒素移位结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素移位结构域。保守梭菌毒素移位结构域变异体的非限制性实例包括例如保守BoNT/A移位结构域变异体、保守BoNT/B移位结构域变异体、保守BoNT/C1移位结构域变异体、保守BoNT/D移位结构域变异体、保守BoNT/E移位结构域变异体、保守BoNT/F移位结构域变异体、保守BoNT/G移位结构域变异体、保守TeNT移位结构域变异体、保守BaNT移位结构域变异体和保守BuNT移位结构域变异体。
如本文所用，术语“非保守梭菌毒素移位结构域变异体”是指以下梭菌毒素移位结构域：其中1)自非保守梭菌毒素移位结构域变异体所基于的参考梭菌毒素移位结构域缺失至少一个氨基酸；2)向非保守梭菌毒素移位结构域所基于的参考梭菌毒素移位结构域中添加至少一个氨基酸；或3)至少一个氨基酸取代为不共享类似于来自参考梭菌毒素移位结构域序列(表1)的原始氨基酸的性质的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守梭菌毒素移位结构域变异体可以与非保守梭菌毒素移位结构域变异体所基于的参考梭菌毒素移位结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素移位结构域。非保守梭菌毒素移位结构域变异体的非限制性实例包括例如非保守BoNT/A移位结构域变异体、非保守BoNT/B移位结构域变异体、非保守BoNT/C1移位结构域变异体、非保守BoNT/D移位结构域变异体、非保守BoNT/E移位结构域变异体、非保守BoNT/F移位结构域变异体、非保守BoNT/G移位结构域变异体和非保守TeNT移位结构域变异体、非保守BaNT移位结构域变异体和非保守BuNT移位结构域变异体。
如本文所用，术语“活性梭菌毒素移位结构域片段”是指可适用于本说明书的多个方面的多种包含移位结构域的梭菌毒素片段中的任一者，附带条件为这些活性片段可促进LC自细胞内囊泡释放至靶细胞的细胞质中且因此参与执行梭菌毒素蛋白水解裂解底物所凭借的总体细胞机制。梭菌毒素的重链的移位结构域长约410-430个氨基酸且包含移位结构域(表1)。研究已显示移位结构域的移位活性并不必需梭菌毒素重链的移位结构域的整个长度。因此，此实施方案的多个方面包括长度为例如至少350、375、400或425个氨基酸的梭菌毒素移位结构域。此实施方案的其它方面包括长度为例如至多350、375、400或425个氨基酸的梭菌毒素移位结构域。
多种序列比对方法中的任一者可用于确定天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体以及非天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体的一致性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，诸如链段逼近方法。确定一致性百分比的方案是在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的修饰梭菌毒素包含梭菌毒素移位结构域。在此实施方案的一个方面，梭菌毒素移位结构域包含天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体，诸如梭菌毒素移位结构域同工型或梭菌毒素移位结构域亚型。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素移位结构域包含非天然存在的梭菌毒素移位结构域变异体，诸如保守梭菌毒素移位结构域变异体、非保守梭菌毒素移位结构域变异体、活性梭菌毒素移位结构域片段或其任何组合。
在另一实施方案中，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的疏水性氨基酸可取代为另一疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的脂肪族氨基酸可取代为另一脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的芳香族氨基酸可取代为另一芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的堆叠氨基酸可取代为另一堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性氨基酸可取代为另一极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性较小的或中性氨基酸可取代为另一极性较小的或中性氨基酸。极性较小的或中性氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的带正电荷氨基酸可取代为另一带正电荷氨基酸。带正电荷氨基酸的实例包括例如K、R和H。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的带负电荷氨基酸可取代为另一带负电荷氨基酸。带负电荷氨基酸的实例包括例如D和E。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的小氨基酸可取代为另一小氨基酸。小氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素移位结构域的多肽链中的一个特定位置上的C-β支链氨基酸可取代为另一C-β支链氨基酸。C-β支链氨基酸的实例包括例如I、T和V。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含BoNT/A移位结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/A移位结构域包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的移位结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/A移位结构域包含SEQID NO:1的氨基酸455-873。在此实施方案的另一方面，BoNT/A移位结构域包含天然存在的BoNT/A移位结构域变异体，诸如来自BoNT/A同工型的移位结构域或来自BoNT/A亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A移位结构域包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的天然存在的BoNT/A移位结构域变异体，诸如BoNT/A同工型移位结构域或BoNT/A亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A移位结构域包含SEQ ID NO:1的天然存在的BoNT/A移位结构域变异体(诸如BoNT/A同工型移位结构域或BoNT/A亚型移位结构域)的氨基酸455-873。在此实施方案的另一方面，BoNT/A移位结构域包含非天然存在的BoNT/A移位结构域变异体，诸如保守BoNT/A移位结构域变异体、非保守BoNT/A移位结构域变异体、活性BoNT/A移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/A移位结构域包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的非天然存在的BoNT/A移位结构域变异体(诸如保守BoNT/A移位结构域变异体、非保守BoNT/A移位结构域变异体、活性BoNT/A移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A移位结构域包含SEQ ID NO:1的非天然存在的BoNT/A移位结构域变异体(诸如保守BoNT/A移位结构域变异体、非保守BoNT/A移位结构域变异体、活性BoNT/A移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸455-873。
在此实施方案的其它方面，BoNT/A移位结构域包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A移位结构域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸455-873具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:1的氨基酸455-873具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/A移位结构域包含相对于SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A移位结构域包含相对于SEQID NO:1的氨基酸455-873具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1的氨基酸455-873具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A移位结构域包含相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的移位结构域，具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A移位结构域包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸455-873具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1的氨基酸455-873具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含BoNT/B移位结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/B移位结构域包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的移位结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/B移位结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸447-860。在此实施方案的另一方面，BoNT/B移位结构域包含天然存在的BoNT/B移位结构域变异体，诸如来自BoNT/B同工型的移位结构域或来自BoNT/B亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B移位结构域包含SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的天然存在的BoNT/B移位结构域变异体，诸如BoNT/B同工型移位结构域或BoNT/B亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B移位结构域包含SEQ ID NO:6的天然存在的BoNT/B移位结构域变异体(诸如BoNT/B同工型移位结构域或BoNT/B亚型移位结构域)的氨基酸447-860。在此实施方案的另一方面，BoNT/B移位结构域包含非天然存在的BoNT/B移位结构域变异体，诸如保守BoNT/B移位结构域变异体、非保守BoNT/B移位结构域变异体、活性BoNT/B移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/B移位结构域包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的非天然存在的BoNT/B移位结构域变异体(诸如保守BoNT/B移位结构域变异体、非保守BoNT/B移位结构域变异体、活性BoNT/B移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B移位结构域包含SEQ ID NO:6的非天然存在的BoNT/B移位结构域变异体(诸如保守BoNT/B移位结构域变异体、非保守BoNT/B移位结构域变异体、活性BoNT/B移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸447-860。
在此实施方案的其它方面，BoNT/B移位结构域包含与SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B移位结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸447-860具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:6的氨基酸447-860具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/B移位结构域包含相对于SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQID NO:10的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B移位结构域包含相对于SEQID NO:6的氨基酸447-860具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6的氨基酸447-860具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B移位结构域包含相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B移位结构域包含相对于SEQ ID NO:6的氨基酸447-860具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6的氨基酸447-860具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含BoNT/C1移位结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/C1移位结构域包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12的移位结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1移位结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸454-868。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1移位结构域包含天然存在的BoNT/C1移位结构域变异体，诸如来自BoNT/C1同工型的移位结构域或来自BoNT/C1亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1移位结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的天然存在的BoNT/C1移位结构域变异体，诸如BoNT/C1同工型移位结构域或BoNT/C1亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1移位结构域包含SEQ ID NO:11的天然存在的BoNT/C1移位结构域变异体(诸如BoNT/C1同工型移位结构域或BoNT/C1亚型移位结构域)的氨基酸454-868。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1移位结构域包含非天然存在的BoNT/C1移位结构域变异体，诸如保守BoNT/C1移位结构域变异体、非保守BoNT/C1移位结构域变异体、活性BoNT/C1移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1移位结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的非天然存在的BoNT/C1移位结构域变异体(诸如保守BoNT/C1移位结构域变异体、非保守BoNT/C1移位结构域变异体、活性BoNT/C1移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1移位结构域包含SEQ ID NO:11的非天然存在的BoNT/C1移位结构域变异体(诸如保守BoNT/C1移位结构域变异体、非保守BoNT/C1移位结构域变异体、活性BoNT/C1移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸454-868。
在此实施方案的其它方面，BoNT/C1移位结构域包含与SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12的移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1移位结构域包含与SEQ IDNO:11的氨基酸454-868具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:11的氨基酸454-868具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/C1移位结构域包含相对于SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1移位结构域包含相对于SEQ ID NO:11的氨基酸454-868具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11的氨基酸454-868具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1移位结构域包含相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1移位结构域包含相对于SEQ ID NO:11的氨基酸454-868具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11的氨基酸454-868具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含BoNT/D移位结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/D移位结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的移位结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/D移位结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸451-864。在此实施方案的另一方面，BoNT/D移位结构域包含天然存在的BoNT/D移位结构域变异体，诸如来自BoNT/D同工型的移位结构域或来自BoNT/D亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D移位结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的天然存在的BoNT/D移位结构域变异体，诸如BoNT/D同工型移位结构域或BoNT/D亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D移位结构域包含SEQ ID NO:13的天然存在的BoNT/D移位结构域变异体(诸如BoNT/D同工型移位结构域或BoNT/D亚型移位结构域)的氨基酸451-864。在此实施方案的另一方面，BoNT/D移位结构域包含非天然存在的BoNT/D移位结构域变异体，诸如保守BoNT/D移位结构域变异体、非保守BoNT/D移位结构域变异体、活性BoNT/D移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/D移位结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的非天然存在的BoNT/D移位结构域变异体(诸如保守BoNT/D移位结构域变异体、非保守BoNT/D移位结构域变异体、活性BoNT/D移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D移位结构域包含SEQ ID NO:13的非天然存在的BoNT/D移位结构域变异体(诸如保守BoNT/D移位结构域变异体、非保守BoNT/D移位结构域变异体、活性BoNT/D移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸451-864。
在此实施方案的其它方面，BoNT/D移位结构域包含与SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14的移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D移位结构域包含与SEQ ID NO:13的氨基酸451-864具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:13的氨基酸451-864具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/D移位结构域包含相对于SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D移位结构域包含相对于SEQ ID NO:13的氨基酸451-864具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13的氨基酸451-864具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D移位结构域包含相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D移位结构域包含相对于SEQ ID NO:13的氨基酸451-864具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13的氨基酸451-864具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含BoNT/E移位结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/E移位结构域包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的移位结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/E移位结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸427-847。在此实施方案的另一方面，BoNT/E移位结构域包含天然存在的BoNT/E移位结构域变异体，诸如来自BoNT/E同工型的移位结构域或来自BoNT/E亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E移位结构域包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:17的天然存在的BoNT/E移位结构域变异体，诸如BoNT/E同工型移位结构域或BoNT/E亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E移位结构域包含SEQ ID NO:15的天然存在的BoNT/E移位结构域变异体(诸如BoNT/E同工型移位结构域或BoNT/E亚型移位结构域)的氨基酸427-847。在此实施方案的另一方面，BoNT/E移位结构域包含非天然存在的BoNT/E移位结构域变异体，诸如保守BoNT/E移位结构域变异体、非保守BoNT/E移位结构域变异体、活性BoNT/E移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/E移位结构域包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的非天然存在的BoNT/E移位结构域变异体(诸如保守BoNT/E移位结构域变异体、非保守BoNT/E移位结构域变异体、活性BoNT/E移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E移位结构域包含SEQ ID NO:15的非天然存在的BoNT/E移位结构域变异体(诸如保守BoNT/E移位结构域变异体、非保守BoNT/E移位结构域变异体、活性BoNT/E移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸427-847。
在此实施方案的其它方面，BoNT/E移位结构域包含与SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E移位结构域包含与SEQ ID NO:15的氨基酸427-847具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:15的氨基酸427-847具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/E移位结构域包含相对于SEQID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:17的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E移位结构域包含相对于SEQ ID NO:15的氨基酸427-847具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15的氨基酸427-847具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E移位结构域包含相对于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E移位结构域包含相对于SEQ ID NO:15的氨基酸427-847具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQID NO:15的氨基酸427-847具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含BoNT/F移位结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/F移位结构域包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的移位结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/F移位结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸446-865。在此实施方案的另一方面，BoNT/F移位结构域包含天然存在的BoNT/F移位结构域变异体，诸如来自BoNT/F同工型的移位结构域或来自BoNT/F亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F移位结构域包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:20的天然存在的BoNT/F移位结构域变异体，诸如BoNT/F同工型移位结构域或BoNT/F亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F移位结构域包含SEQ ID NO:18的天然存在的BoNT/F移位结构域变异体(诸如BoNT/F同工型移位结构域或BoNT/F亚型移位结构域)的氨基酸446-865。在此实施方案的另一方面，BoNT/F移位结构域包含非天然存在的BoNT/F移位结构域变异体，诸如保守BoNT/F移位结构域变异体、非保守BoNT/F移位结构域变异体、活性BoNT/F移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/F移位结构域包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的非天然存在的BoNT/F移位结构域变异体(诸如保守BoNT/F移位结构域变异体、非保守BoNT/F移位结构域变异体、活性BoNT/F移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F移位结构域包含SEQ ID NO:18的非天然存在的BoNT/F移位结构域变异体(诸如保守BoNT/F移位结构域变异体、非保守BoNT/F移位结构域变异体、活性BoNT/F移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸446-865。
在此实施方案的其它方面，BoNT/F移位结构域包含与SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的移位结构域具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F移位结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸446-865具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:18的氨基酸446-865具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/F移位结构域包含相对于SEQID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F移位结构域包含相对于SEQ ID NO:18的氨基酸446-865具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18的氨基酸446-865具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F移位结构域包含相对于SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F移位结构域包含相对于SEQ ID NO:18的氨基酸446-865具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQID NO:18的氨基酸446-865具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含BoNT/G移位结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/G移位结构域包含SEQ ID NO:21的移位结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/G移位结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸451-865。在此实施方案的另一方面，BoNT/G移位结构域包含天然存在的BoNT/G移位结构域变异体，诸如来自BoNT/G同工型的移位结构域或来自BoNT/G亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G移位结构域包含SEQ ID NO:21的天然存在的BoNT/G移位结构域变异体，诸如BoNT/G同工型移位结构域或BoNT/G亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G移位结构域包含SEQ ID NO:21的天然存在的BoNT/G移位结构域变异体(诸如BoNT/G同工型移位结构域或BoNT/G亚型移位结构域)的氨基酸451-865。在此实施方案的另一方面，BoNT/G移位结构域包含非天然存在的BoNT/G移位结构域变异体，诸如保守BoNT/G移位结构域变异体、非保守BoNT/G移位结构域变异体、活性BoNT/G移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/G移位结构域包含SEQ ID NO:21的非天然存在的BoNT/G移位结构域变异体(诸如保守BoNT/G移位结构域变异体、非保守BoNT/G移位结构域变异体、活性BoNT/G移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G移位结构域包含SEQ ID NO:21的非天然存在的BoNT/G移位结构域变异体(诸如保守BoNT/G移位结构域变异体、非保守BoNT/G移位结构域变异体、活性BoNT/G移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸451-865。
在此实施方案的其它方面，BoNT/G移位结构域包含与SEQ IDNO:21的移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:21的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G移位结构域包含与SEQ ID NO:21的氨基酸451-865具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:21的氨基酸451-865具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/G移位结构域包含相对于SEQID NO:21的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G移位结构域包含相对于SEQ ID NO:21的氨基酸451-865具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的氨基酸451-865具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G移位结构域包含相对于SEQ ID NO:21的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G移位结构域包含相对于SEQ ID NO:21的氨基酸451-865具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQID NO:21的氨基酸451-865具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含TeNT移位结构域。在此实施方案的一个方面，TeNT移位结构域包含SEQ ID NO:22的移位结构域。在此实施方案的其它方面，TeNT移位结构域包含SEQID NO:22的氨基酸468-881。在此实施方案的另一方面，TeNT移位结构域包含天然存在的TeNT移位结构域变异体，诸如来自TeNT同工型的移位结构域或来自TeNT亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，TeNT移位结构域包含SEQ ID NO:22的天然存在的TeNT移位结构域变异体，诸如TeNT同工型移位结构域或TeNT亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，TeNT移位结构域包含SEQ ID NO:22的天然存在的TeNT移位结构域变异体(诸如TeNT同工型移位结构域或TeNT亚型移位结构域)的氨基酸468-881。在此实施方案的另一方面，TeNT移位结构域包含非天然存在的TeNT移位结构域变异体，诸如保守TeNT移位结构域变异体、非保守TeNT移位结构域变异体、活性TeNT移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，TeNT移位结构域包含SEQ ID NO:22的非天然存在的TeNT移位结构域变异体(诸如保守TeNT移位结构域变异体、非保守TeNT移位结构域变异体、活性TeNT移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，TeNT移位结构域包含SEQ ID NO:22的非天然存在的TeNT移位结构域变异体(诸如保守TeNT移位结构域变异体、非保守TeNT移位结构域变异体、活性TeNT移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸468-881。
在此实施方案的其它方面，TeNT移位结构域包含与SEQ ID NO:22的移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:22的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT移位结构域包含与SEQ ID NO:22的氨基酸468-881具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:22的氨基酸468-881具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，TeNT移位结构域包含相对于SEQ IDNO:22的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT移位结构域包含相对于SEQ ID NO:22的氨基酸468-881具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的氨基酸468-881具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT移位结构域包含相对于SEQ ID NO:22的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT移位结构域包含相对于SEQ ID NO:22的氨基酸468-881具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ IDNO:22的氨基酸468-881具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含BaNT移位结构域。在此实施方案的一个方面，BaNT移位结构域包含SEQ ID NO:23的移位结构域。在此实施方案的其它方面，BaNT移位结构域包含SEQID NO:23的氨基酸436-857。在此实施方案的另一方面，BaNT移位结构域包含天然存在的BaNT移位结构域变异体，诸如来自BaNT同工型的移位结构域或来自BaNT亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT移位结构域包含SEQ ID NO:23的天然存在的BaNT移位结构域变异体，诸如BaNT同工型移位结构域或BaNT亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT移位结构域包含SEQ ID NO:23的天然存在的BaNT移位结构域变异体(诸如BaNT同工型移位结构域或BaNT亚型移位结构域)的氨基酸436-857。在此实施方案的另一方面，BaNT移位结构域包含非天然存在的BaNT移位结构域变异体，诸如保守BaNT移位结构域变异体、非保守BaNT移位结构域变异体、活性BaNT移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BaNT移位结构域包含SEQ ID NO:23的非天然存在的BaNT移位结构域变异体(诸如保守BaNT移位结构域变异体、非保守BaNT移位结构域变异体、活性BaNT移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT移位结构域包含SEQ IDNO:23的非天然存在的BaNT移位结构域变异体(诸如保守BaNT移位结构域变异体、非保守BaNT移位结构域变异体、活性BaNT移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸436-857。
在此实施方案的其它方面，BaNT移位结构域包含与SEQ ID NO:23的移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:23的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT移位结构域包含与SEQ ID NO:23的氨基酸436-857具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:23的氨基酸436-857具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BaNT移位结构域包含相对于SEQ IDNO:23的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT移位结构域包含相对于SEQ ID NO:23的氨基酸436-857具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的氨基酸436-857具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT移位结构域包含相对于SEQ ID NO:23的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT移位结构域包含相对于SEQ ID NO:23的氨基酸436-857具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ IDNO:23的氨基酸436-857具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素移位结构域包含BuNT移位结构域。在此实施方案的一个方面，BuNT移位结构域包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的移位结构域。在此实施方案的其它方面，BuNT移位结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸427-847。在此实施方案的另一方面，BuNT移位结构域包含天然存在的BuNT移位结构域变异体，诸如来自BuNT同工型的移位结构域或来自BuNT亚型的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT移位结构域包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的天然存在的BuNT移位结构域变异体，诸如BuNT同工型移位结构域或BuNT亚型移位结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT移位结构域包含SEQ ID NO:24的天然存在的BuNT移位结构域变异体(诸如BuNT同工型移位结构域或BuNT亚型移位结构域)的氨基酸427-847。在此实施方案的另一方面，BuNT移位结构域包含非天然存在的BuNT移位结构域变异体，诸如保守BuNT移位结构域变异体、非保守BuNT移位结构域变异体、活性BuNT移位结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BuNT移位结构域包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的非天然存在的BuNT移位结构域变异体(诸如保守BuNT移位结构域变异体、非保守BuNT移位结构域变异体、活性BuNT移位结构域片段或其任何组合)的移位结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT移位结构域包含SEQ IDNO:24的非天然存在的BuNT移位结构域变异体(诸如保守BuNT移位结构域变异体、非保守BuNT移位结构域变异体、活性BuNT移位结构域片段或其任何组合)的氨基酸427-847。
在此实施方案的其它方面，BuNT移位结构域包含与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的移位结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的移位结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT移位结构域包含与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸427-847具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸427-847具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BuNT移位结构域包含相对于SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT移位结构域包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:25的氨基酸427-847具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸427-847具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT移位结构域包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的移位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的移位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT移位结构域包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸427-847具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:25的氨基酸427-847具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
本说明书的多个方面部分地提供结合结构域。如本文所用，术语“结合结构域”与“配体”或“靶向部分”同义且指在生理条件下可优先与存在于细胞的表面上的另一分子相互作用的任何分子。细胞表面分子可包含多肽、多糖、脂质，或可具有这些分子中的一者以上的结构特征。如本文所用，术语“优先与…相互作用”是指分子能够在生理条件或大致上近似生理条件的活体外条件下，相对于其它非靶受体在统计上显著更大的程度上结合其靶受体。关于本说明书中公开的梭菌毒素结合结构域，梭菌毒素结合结构域与其同源受体的结合相对于其它受体存在差别。关于本说明书中公开的非梭菌毒素结合结构域，非梭菌毒素结合结构域与其同源受体的结合相对于其它受体存在差别。
因此，在一个实施方案中，相对于非靶受体，选择性结合靶受体的结合结构域对靶受体的解离平衡常数(KD)大例如至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍、至少10,000倍或至少100,000倍。
本说明书的多个方面部分地提供梭菌毒素结合结构域。如本文所用，术语“梭菌毒素结合结构域”是指可执行中毒过程中引发本说明书中公开的修饰梭菌毒素使靶细胞中毒所凭借的总体内化机制的结合步骤的任何梭菌毒素多肽。梭菌毒素结合结构域的非限制性实例包括例如BoNT/A结合结构域、BoNT/B结合结构域、BoNT/C1结合结构域、BoNT/D结合结构域、BoNT/E结合结构域、BoNT/F结合结构域、BoNT/G结合结构域、TeNT结合结构域、BaNT结合结构域和BuNT结合结构域。梭菌毒素结合结构域的其它非限制性实例包括例如SEQID NO:1的氨基酸874-1296、SEQ ID NO:2的氨基酸861-1291、SEQID NO:3的氨基酸869-1291、SEQ ID NO:4的氨基酸865-1291、SEQID NO:5的氨基酸848-1252、SEQ ID NO:6的氨基酸866-1274、SEQID NO:7的氨基酸866-1297、SEQ ID NO:8的氨基酸882-1315、SEQID NO:9的氨基酸858-1268和SEQ ID NO:10的氨基酸848-1251。
梭菌毒素结合结构域包括但不限于天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体，诸如梭菌毒素结合结构域同工型和梭菌毒素结合结构域亚型；非天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体，诸如保守梭菌毒素结合结构域变异体、非保守梭菌毒素结合结构域变异体、其活性梭菌毒素结合结构域片段或其任何组合。
如本文所用，术语“梭菌毒素结合结构域变异体”无论天然是存在或非天然存在的皆指与公开的参考序列(表1)的相应区相比具有至少一个氨基酸变化且可用与那个参考序列的相应区的一致性百分比描述的梭菌毒素结合结构域。除非明确指示，否则适用于实施公开的实施方案的梭菌毒素结合结构域变异体为执行中毒过程中介导梭菌毒素轻链移位的移位步骤的变异体。作为非限制性实例，相较于SEQ IDNO:1的氨基酸874-1296，BoNT/A结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:6的氨基酸861-1291，BoNT/B结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:11的氨基酸869-1291，BoNT/C1结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:13的氨基酸865-1291，BoNT/D结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:15的氨基酸848-1252，BoNT/E结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:18的氨基酸866-1274，BoNT/F结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:21的氨基酸866-1297，BoNT/G结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:22的氨基酸882-1315，TeNT结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；相较于SEQ ID NO:23的氨基酸858-1268，BaNT结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加；且相较于SEQ ID NO:24的氨基酸848-1251，BuNT结合结构域变异体将具有至少一个氨基酸差异，诸如氨基酸取代、缺失或添加。
本领域技术人员应认识到在梭菌毒素的各血清型内，可存在天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体，所述天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体在其氨基酸序列方面以及在编码这些蛋白质的核酸方面多少有些不同。举例来说，目前存在五种BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，其中当与SEQ ID NO:1的BoNT/A结合结构域亚型相比较时，特定结合结构域亚型显示约83-97%氨基酸一致性。作为另一实例，目前存在五种BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，其中当与SEQ ID NO:1的BoNT/A结合结构域亚型相比较时，特定结合结构域亚型显示约83-97%氨基酸一致性。如本文所用，术语“天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体”是指通过天然存在的过程产生的任何梭菌毒素结合结构域，包括但不限于自交替拼接转录物产生的梭菌毒素结合结构域同工型、通过自发突变产生的梭菌毒素结合结构域同工型、和梭菌毒素结合结构域亚型。天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体可以与天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体所基于的参考梭菌毒素结合结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考结合结构域。
天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体的非限制性实例为梭菌毒素结合结构域同工型，诸如BoNT/A结合结构域同工型、BoNT/B结合结构域同工型、BoNT/C1结合结构域同工型、BoNT/D结合结构域同工型、BoNT/E结合结构域同工型、BoNT/F结合结构域同工型、BoNT/G结合结构域同工型、TeNT结合结构域同工型、BaNT结合结构域同工型和BuNT结合结构域同工型。天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体的另一非限制性实例为梭菌毒素结合结构域亚型，诸如来自亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5的结合结构域；来自亚型BoNT/B1、BoNT/B2、二价BoNT/B和非蛋白水解BoNT/B的结合结构域；来自亚型BoNT/C1-1和BoNT/C1-2的结合结构域；来自亚型BoNT/E1、BoNT/E2和BoNT/E3的结合结构域；来自亚型BoNT/F1、BoNT/F2和BoNT/F3的结合结构域；以及来自亚型BuNT-1和BuNT-2的结合结构域。
如本文所用，术语“非天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体”是指借助于人操作产生的任何梭菌毒素结合结构域，包括但不限于通过使用随机诱变或合理设计进行遗传工程改造所产生的梭菌毒素结合结构域和通过化学合成所产生的梭菌毒素结合结构域。非天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体的非限制性实例包括例如保守梭菌毒素结合结构域变异体、非保守梭菌毒素结合结构域变异体、梭菌毒素结合结构域嵌合变异体和活性梭菌毒素结合结构域片段。
如本文所用，术语“保守梭菌毒素结合结构域变异体”是指至少一个氨基酸取代为至少一种性质类似于来自参考梭菌毒素结合结构域序列(表1)的原始氨基酸的性质的另一氨基酸或氨基酸类似物的梭菌毒素结合结构域。性质的实例包括但不限于类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键结能力、氢键结能力、物理化学性质等或其任何组合。保守梭菌毒素结合结构域变异体可以与保守梭菌毒素结合结构域变异体所基于的参考梭菌毒素结合结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素结合结构域。保守梭菌毒素结合结构域变异体的非限制性实例包括例如保守BoNT/A结合结构域变异体、保守BoNT/B结合结构域变异体、保守BoNT/C1结合结构域变异体、保守BoNT/D结合结构域变异体、保守BoNT/E结合结构域变异体、保守BoNT/F结合结构域变异体、保守BoNT/G结合结构域变异体、保守TeNT结合结构域变异体、保守BaNT结合结构域变异体和保守BuNT结合结构域变异体。
如本文所用，术语“非保守梭菌毒素结合结构域变异体”是指以下梭菌毒素结合结构域：其中1)自非保守梭菌毒素结合结构域变异体所基于的参考梭菌毒素结合结构域缺失至少一个氨基酸；2)向非保守梭菌毒素结合结构域所基于的参考梭菌毒素结合结构域中添加至少一个氨基酸；或3)至少一个氨基酸取代为不共享类似于来自参考梭菌毒素结合结构域序列(表1)的原始氨基酸的性质的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守梭菌毒素结合结构域变异体可以与非保守梭菌毒素结合结构域变异体所基于的参考梭菌毒素结合结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考梭菌毒素结合结构域。非保守梭菌毒素结合结构域变异体的非限制性实例包括例如非保守BoNT/A结合结构域变异体、非保守BoNT/B结合结构域变异体、非保守BoNT/C1结合结构域变异体、非保守BoNT/D结合结构域变异体、非保守BoNT/E结合结构域变异体、非保守BoNT/F结合结构域变异体、非保守BoNT/G结合结构域变异体和非保守TeNT结合结构域变异体、非保守BaNT结合结构域变异体和非保守BuNT结合结构域变异体。
如本文所用，术语“活性梭菌毒素结合结构域片段”是指可适用于本说明书的多个方面的多种包含结合结构域的梭菌毒素片段中的任一者，附带条件为这些活性片段可促进LC自细胞内囊泡释放至靶细胞的细胞质中且因此参与执行梭菌毒素蛋白水解裂解底物所凭借的总体细胞机制。梭菌毒素的重链的结合结构域长约400-440个氨基酸且包含结合结构域(表1)。研究已显示结合结构域的移位活性并不必需梭菌毒素重链的结合结构域的整个长度。因此，此实施方案的多个方面包括长度为例如至少350、375、400或425个氨基酸的梭菌毒素结合结构域。此实施方案的其它方面包括长度为例如至多350、375、400或425个氨基酸的梭菌毒素结合结构域。
多种序列比对方法中的任一者可用于确定天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体以及非天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体的一致性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，诸如链段逼近方法。确定一致性百分比的方案是在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的修饰梭菌毒素包含梭菌毒素结合结构域。在此实施方案的一个方面，梭菌毒素结合结构域包含天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体，诸如梭菌毒素结合结构域同工型或梭菌毒素结合结构域亚型。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素结合结构域包含非天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体，诸如保守梭菌毒素结合结构域变异体、非保守梭菌毒素结合结构域变异体、活性梭菌毒素结合结构域片段或其任何组合。
在另一实施方案中，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的疏水性氨基酸可取代为另一疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的脂肪族氨基酸可取代为另一脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的芳香族氨基酸可取代为另一芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的堆叠氨基酸可取代为另一堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性氨基酸可取代为另一极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性较小或中性氨基酸可取代为另一极性较小或中性氨基酸。极性较小或中性氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的带正电荷氨基酸可取代为另一带正电荷氨基酸。带正电荷氨基酸的实例包括例如K、R和H。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的带负电荷氨基酸可取代为另一带负电荷氨基酸。带负电荷氨基酸的实例包括例如D和E。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的小氨基酸可取代为另一小氨基酸。小氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在此实施方案的另一方面，在梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的C-β支链氨基酸可取代为另一C-β支链氨基酸。C-β支链氨基酸的实例包括例如I、T和V。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含BoNT/A结合结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/A结合结构域包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的结合结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/A结合结构域包含SEQID NO:1的氨基酸874-1296。在此实施方案的另一方面，BoNT/A结合结构域包含天然存在的BoNT/A结合结构域变异体，诸如来自BoNT/A同工型的结合结构域或来自BoNT/A亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A结合结构域包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的天然存在的BoNT/A结合结构域变异体，诸如BoNT/A同工型结合结构域或BoNT/A亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A结合结构域包含SEQ ID NO:1的天然存在的BoNT/A结合结构域变异体(诸如BoNT/A同工型结合结构域或BoNT/A亚型结合结构域)的氨基酸874-1296。在此实施方案的另一方面，BoNT/A结合结构域包含非天然存在的BoNT/A结合结构域变异体，诸如保守BoNT/A结合结构域变异体、非保守BoNT/A结合结构域变异体、活性BoNT/A结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/A结合结构域包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的非天然存在的BoNT/A结合结构域变异体(诸如保守BoNT/A结合结构域变异体、非保守BoNT/A结合结构域变异体、活性BoNT/A结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/A结合结构域包含SEQ ID NO:1的非天然存在的BoNT/A结合结构域变异体(诸如保守BoNT/A结合结构域变异体、非保守BoNT/A结合结构域变异体、活性BoNT/A结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸874-1296。
在此实施方案的其它方面，BoNT/A结合结构域包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A结合结构域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸874-1296具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:1的氨基酸874-1296具有至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/A结合结构域包含相对于SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A结合结构域包含相对于SEQID NO:1的氨基酸874-1296具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1的氨基酸874-1296具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A结合结构域包含相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/A结合结构域包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸874-1296具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:1的氨基酸874-1296具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含BoNT/B结合结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/B结合结构域包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的结合结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/B结合结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸861-1291。在此实施方案的另一方面，BoNT/B结合结构域包含天然存在的BoNT/B结合结构域变异体，诸如来自BoNT/B同工型的结合结构域或来自BoNT/B亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B结合结构域包含SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的天然存在的BoNT/B结合结构域变异体，诸如BoNT/B同工型结合结构域或BoNT/B亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B结合结构域包含SEQ ID NO:6的天然存在的BoNT/B结合结构域变异体(诸如BoNT/B同工型结合结构域或BoNT/B亚型结合结构域)的氨基酸861-1291。在此实施方案的另一方面，BoNT/B结合结构域包含非天然存在的BoNT/B结合结构域变异体，诸如保守BoNT/B结合结构域变异体、非保守BoNT/B结合结构域变异体、活性BoNT/B结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/B结合结构域包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的非天然存在的BoNT/B结合结构域变异体(诸如保守BoNT/B结合结构域变异体、非保守BoNT/B结合结构域变异体、活性BoNT/B结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/B结合结构域包含SEQ ID NO:6的非天然存在的BoNT/B结合结构域变异体(诸如保守BoNT/B结合结构域变异体、非保守BoNT/B结合结构域变异体、活性BoNT/B结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸861-1291。
在此实施方案的其它方面，BoNT/B结合结构域包含与SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B结合结构域包含与SEQ ID NO:6的氨基酸861-1291具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:6的氨基酸861-1291具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/B结合结构域包含相对于SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQID NO:10的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B结合结构域包含相对于SEQID NO:6的氨基酸861-1291具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6的氨基酸861-1291具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B结合结构域包含相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/B结合结构域包含相对于SEQ ID NO:6的氨基酸861-1291具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:6的氨基酸861-1291具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含BoNT/C1结合结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/C1结合结构域包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12的结合结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1结合结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸869-1291。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1结合结构域包含天然存在的BoNT/C1结合结构域变异体，诸如来自BoNT/C1同工型的结合结构域或来自BoNT/C1亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1结合结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的天然存在的BoNT/C1结合结构域变异体，诸如BoNT/C1同工型结合结构域或BoNT/C1亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1结合结构域包含SEQ ID NO:11的天然存在的BoNT/C1结合结构域变异体(诸如BoNT/C1同工型结合结构域或BoNT/C1亚型结合结构域)的氨基酸869-1291。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1结合结构域包含非天然存在的BoNT/C1结合结构域变异体，诸如保守BoNT/C1结合结构域变异体、非保守BoNT/C1结合结构域变异体、活性BoNT/C1结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1结合结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的非天然存在的BoNT/C1结合结构域变异体(诸如保守BoNT/C1结合结构域变异体、非保守BoNT/C1结合结构域变异体、活性BoNT/C1结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/C1结合结构域包含SEQ ID NO:11的非天然存在的BoNT/C1结合结构域变异体(诸如保守BoNT/C1结合结构域变异体、非保守BoNT/C1结合结构域变异体、活性BoNT/C1结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸869-1291。
在此实施方案的其它方面，BoNT/C1结合结构域包含与SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1结合结构域包含与SEQ IDNO:11的氨基酸869-1291具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:11的氨基酸869-1291具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/C1结合结构域包含相对于SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1结合结构域包含相对于SEQ ID NO:11的氨基酸869-1291具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11的氨基酸869-1291具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1结合结构域包含相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/C1结合结构域包含相对于SEQ ID NO:11的氨基酸869-1291具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:11的氨基酸869-1291具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含BoNT/D结合结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/D结合结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的结合结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/D结合结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸865-1291。在此实施方案的另一方面，BoNT/D结合结构域包含天然存在的BoNT/D结合结构域变异体，诸如来自BoNT/D同工型的结合结构域或来自BoNT/D亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D结合结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的天然存在的BoNT/D结合结构域变异体，诸如BoNT/D同工型结合结构域或BoNT/D亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D结合结构域包含SEQ ID NO:13的天然存在的BoNT/D结合结构域变异体(诸如BoNT/D同工型结合结构域或BoNT/D亚型结合结构域)的氨基酸865-1291。在此实施方案的另一方面，BoNT/D结合结构域包含非天然存在的BoNT/D结合结构域变异体，诸如保守BoNT/D结合结构域变异体、非保守BoNT/D结合结构域变异体、活性BoNT/D结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/D结合结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的非天然存在的BoNT/D结合结构域变异体(诸如保守BoNT/D结合结构域变异体、非保守BoNT/D结合结构域变异体、活性BoNT/D结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/D结合结构域包含SEQ ID NO:13的非天然存在的BoNT/D结合结构域变异体(诸如保守BoNT/D结合结构域变异体、非保守BoNT/D结合结构域变异体、活性BoNT/D结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸865-1291。
在此实施方案的其它方面，BoNT/D结合结构域包含与SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D结合结构域包含与SEQ ID NO:13的氨基酸865-1291具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:13的氨基酸865-1291具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/D结合结构域包含相对于SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D结合结构域包含相对于SEQ ID NO:13的氨基酸865-1291具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13的氨基酸865-1291具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D结合结构域包含相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/D结合结构域包含相对于SEQ ID NO:13的氨基酸865-1291具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:13的氨基酸865-1291具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含BoNT/E结合结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/E结合结构域包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的结合结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/E结合结构域包含SEQ ID NO:15的氨基酸848-1252。在此实施方案的另一方面，BoNT/E结合结构域包含天然存在的BoNT/E结合结构域变异体，诸如来自BoNT/E同工型的结合结构域或来自BoNT/E亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E结合结构域包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:17的天然存在的BoNT/E结合结构域变异体，诸如BoNT/E同工型结合结构域或BoNT/E亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E结合结构域包含SEQ ID NO:15的天然存在的BoNT/E结合结构域变异体(诸如BoNT/E同工型结合结构域或BoNT/E亚型结合结构域)的氨基酸848-1252。在此实施方案的另一方面，BoNT/E结合结构域包含非天然存在的BoNT/E结合结构域变异体，诸如保守BoNT/E结合结构域变异体、非保守BoNT/E结合结构域变异体、活性BoNT/E结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/E结合结构域包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的非天然存在的BoNT/E结合结构域变异体(诸如保守BoNT/E结合结构域变异体、非保守BoNT/E结合结构域变异体、活性BoNT/E结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/E结合结构域包含SEQ ID NO:15的非天然存在的BoNT/E结合结构域变异体(诸如保守BoNT/E结合结构域变异体、非保守BoNT/E结合结构域变异体、活性BoNT/E结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸848-1252。
在此实施方案的其它方面，BoNT/E结合结构域包含与SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E结合结构域包含与SEQ ID NO:15的氨基酸848-1252具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:15的氨基酸848-1252具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/E结合结构域包含相对于SEQID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:17的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E结合结构域包含相对于SEQ ID NO:15的氨基酸848-1252具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15的氨基酸848-1252具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E结合结构域包含相对于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/E结合结构域包含相对于SEQ ID NO:15的氨基酸848-1252具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:15的氨基酸848-1252具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含BoNT/F结合结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/F结合结构域包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的结合结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/F结合结构域包含SEQ ID NO:18的氨基酸866-1274。在此实施方案的另一方面，BoNT/F结合结构域包含天然存在的BoNT/F结合结构域变异体，诸如来自BoNT/F同工型的结合结构域或来自BoNT/F亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F结合结构域包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:20的天然存在的BoNT/F结合结构域变异体，诸如BoNT/F同工型结合结构域或BoNT/F亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F结合结构域包含SEQ ID NO:18的天然存在的BoNT/F结合结构域变异体(诸如BoNT/F同工型结合结构域或BoNT/F亚型结合结构域)的氨基酸866-1274。在此实施方案的另一方面，BoNT/F结合结构域包含非天然存在的BoNT/F结合结构域变异体，诸如保守BoNT/F结合结构域变异体、非保守BoNT/F结合结构域变异体、活性BoNT/F结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/F结合结构域包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的非天然存在的BoNT/F结合结构域变异体(诸如保守BoNT/F结合结构域变异体、非保守BoNT/F结合结构域变异体、活性BoNT/F结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/F结合结构域包含SEQ ID NO:18的非天然存在的BoNT/F结合结构域变异体(诸如保守BoNT/F结合结构域变异体、非保守BoNT/F结合结构域变异体、活性BoNT/F结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸866-1274。
在此实施方案的其它方面，BoNT/F结合结构域包含与SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F结合结构域包含与SEQ ID NO:18的氨基酸866-1274具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:18的氨基酸866-1274具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/F结合结构域包含相对于SEQID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F结合结构域包含相对于SEQ ID NO:18的氨基酸866-1274具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18的氨基酸866-1274具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F结合结构域包含相对于SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/F结合结构域包含相对于SEQ ID NO:18的氨基酸866-1274具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:18的氨基酸866-1274具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含BoNT/G结合结构域。在此实施方案的一个方面，BoNT/G结合结构域包含SEQ ID NO:21的结合结构域。在此实施方案的其它方面，BoNT/G结合结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸866-1297。在此实施方案的另一方面，BoNT/G结合结构域包含天然存在的BoNT/G结合结构域变异体，诸如来自BoNT/G同工型的结合结构域或来自BoNT/G亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G结合结构域包含SEQ ID NO:21的天然存在的BoNT/G结合结构域变异体，诸如BoNT/G同工型结合结构域或BoNT/G亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G结合结构域包含SEQ ID NO:21的天然存在的BoNT/G结合结构域变异体(诸如BoNT/G同工型结合结构域或BoNT/G亚型结合结构域)的氨基酸866-1297。在此实施方案的另一方面，BoNT/G结合结构域包含非天然存在的BoNT/G结合结构域变异体，诸如保守BoNT/G结合结构域变异体、非保守BoNT/G结合结构域变异体、活性BoNT/G结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BoNT/G结合结构域包含SEQ ID NO:21的非天然存在的BoNT/G结合结构域变异体(诸如保守BoNT/G结合结构域变异体、非保守BoNT/G结合结构域变异体、活性BoNT/G结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BoNT/G结合结构域包含SEQ ID NO:21的非天然存在的BoNT/G结合结构域变异体(诸如保守BoNT/G结合结构域变异体、非保守BoNT/G结合结构域变异体、活性BoNT/G结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸866-1297。
在此实施方案的其它方面，BoNT/G结合结构域包含与SEQ IDNO:21的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:21的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G结合结构域包含与SEQ ID NO:21的氨基酸866-1297具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:21的氨基酸866-1297具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BoNT/G结合结构域包含相对于SEQID NO:21的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G结合结构域包含相对于SEQ ID NO:21的氨基酸866-1297具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的氨基酸866-1297具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G结合结构域包含相对于SEQ ID NO:21的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BoNT/G结合结构域包含相对于SEQ ID NO:21的氨基酸866-1297具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:21的氨基酸866-1297具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含TeNT结合结构域。在此实施方案的一个方面，TeNT结合结构域包含SEQ ID NO:22的结合结构域。在此实施方案的其它方面，TeNT结合结构域包含SEQID NO:22的氨基酸882-1315。在此实施方案的另一方面，TeNT结合结构域包含天然存在的TeNT结合结构域变异体，诸如来自TeNT同工型的结合结构域或来自TeNT亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，TeNT结合结构域包含SEQ ID NO:22的天然存在的TeNT结合结构域变异体，诸如TeNT同工型结合结构域或TeNT亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，TeNT结合结构域包含SEQ ID NO:22的天然存在的TeNT结合结构域变异体(诸如TeNT同工型结合结构域或TeNT亚型结合结构域)的氨基酸882-1315。在此实施方案的另一方面，TeNT结合结构域包含非天然存在的TeNT结合结构域变异体，诸如保守TeNT结合结构域变异体、非保守TeNT结合结构域变异体、活性TeNT结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，TeNT结合结构域包含SEQ ID NO:22的非天然存在的TeNT结合结构域变异体(诸如保守TeNT结合结构域变异体、非保守TeNT结合结构域变异体、活性TeNT结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，TeNT结合结构域包含SEQID NO:22的非天然存在的TeNT结合结构域变异体(诸如保守TeNT结合结构域变异体、非保守TeNT结合结构域变异体、活性TeNT结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸882-1315。
在此实施方案的其它方面，TeNT结合结构域包含与SEQ ID NO:22的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:22的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT结合结构域包含与SEQ ID NO:22的氨基酸882-1315具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:22的氨基酸882-1315具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，TeNT结合结构域包含相对于SEQ IDNO:22的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT结合结构域包含相对于SEQ ID NO:22的氨基酸882-1315具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的氨基酸882-1315具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT结合结构域包含相对于SEQ ID NO:22的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:22的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，TeNT结合结构域包含相对于SEQ ID NO:22的氨基酸882-1315具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ IDNO:22的氨基酸882-1315具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含BaNT结合结构域。在此实施方案的一个方面，BaNT结合结构域包含SEQ ID NO:23的结合结构域。在此实施方案的其它方面，BaNT结合结构域包含SEQID NO:23的氨基酸858-1268。在此实施方案的另一方面，BaNT结合结构域包含天然存在的BaNT结合结构域变异体，诸如来自BaNT同工型的结合结构域或来自BaNT亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT结合结构域包含SEQ ID NO:23的天然存在的BaNT结合结构域变异体，诸如BaNT同工型结合结构域或BaNT亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT结合结构域包含SEQID NO:23的天然存在的BaNT结合结构域变异体(诸如BaNT同工型结合结构域或BaNT亚型结合结构域)的氨基酸858-1268。在此实施方案的另一方面，BaNT结合结构域包含非天然存在的BaNT结合结构域变异体，诸如保守BaNT结合结构域变异体、非保守BaNT结合结构域变异体、活性BaNT结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BaNT结合结构域包含SEQ ID NO:23的非天然存在的BaNT结合结构域变异体(诸如保守BaNT结合结构域变异体、非保守BaNT结合结构域变异体、活性BaNT结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BaNT结合结构域包含SEQ ID NO:23的非天然存在的BaNT结合结构域变异体(诸如保守BaNT结合结构域变异体、非保守BaNT结合结构域变异体、活性BaNT结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸858-1268。
在此实施方案的其它方面，BaNT结合结构域包含与SEQ ID NO:23的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:23的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT结合结构域包含与SEQ ID NO:23的氨基酸858-1268具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:23的氨基酸858-1268具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BaNT结合结构域包含相对于SEQ IDNO:23的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT结合结构域包含相对于SEQ ID NO:23的氨基酸858-1268具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的氨基酸858-1268具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT结合结构域包含相对于SEQ ID NO:23的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:23的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BaNT结合结构域包含相对于SEQ ID NO:23的氨基酸858-1268具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ IDNO:23的氨基酸858-1268具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，梭菌毒素结合结构域包含BuNT结合结构域。在此实施方案的一个方面，BuNT结合结构域包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的结合结构域。在此实施方案的其它方面，BuNT结合结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸848-1251。在此实施方案的另一方面，BuNT结合结构域包含天然存在的BuNT结合结构域变异体，诸如来自BuNT同工型的结合结构域或来自BuNT亚型的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT结合结构域包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的天然存在的BuNT结合结构域变异体，诸如BuNT同工型结合结构域或BuNT亚型结合结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT结合结构域包含SEQ ID NO:24的天然存在的BuNT结合结构域变异体(诸如BuNT同工型结合结构域或BuNT亚型结合结构域)的氨基酸848-1251。在此实施方案的另一方面，BuNT结合结构域包含非天然存在的BuNT结合结构域变异体，诸如保守BuNT结合结构域变异体、非保守BuNT结合结构域变异体、活性BuNT结合结构域片段或其任何组合。在此实施方案的另一方面，BuNT结合结构域包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的非天然存在的BuNT结合结构域变异体(诸如保守BuNT结合结构域变异体、非保守BuNT结合结构域变异体、活性BuNT结合结构域片段或其任何组合)的结合结构域。在此实施方案的另一方面，BuNT结合结构域包含SEQ IDNO:24的非天然存在的BuNT结合结构域变异体(诸如保守BuNT结合结构域变异体、非保守BuNT结合结构域变异体、活性BuNT结合结构域片段或其任何组合)的氨基酸848-1251。
在此实施方案的其它方面，BuNT结合结构域包含与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的结合结构域具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的结合结构域具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT结合结构域包含与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸848-1251具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸848-1251具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BuNT结合结构域包含相对于SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT结合结构域包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:25的氨基酸848-1251具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸848-1251具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT结合结构域包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的结合结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的结合结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，BuNT结合结构域包含相对于SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸848-1251具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:25的氨基酸848-1251具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
本说明书的多个方面部分地提供非梭菌毒素结合结构域。如本文所用，术语“非梭菌毒素结合结构域”是指可执行中毒过程中引发本说明书中公开的修饰梭菌毒素使靶细胞中毒所凭借的总体内化机制的结合步骤的任何多肽。结合结构域的实例描述于例如Keith A.Foster等,Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral SensoryAfferent Functions,美国专利5,989,545；Clifford C.Shone等,Recombinant Toxin Fragments,美国专利6,461,617；Conrad P. Quinn等,Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion,美国专利6,632,440；Lance E.Steward等,Methods And CompositionsFor The Treatment Of Pancreatitis,美国专利6,843,998；J.Oliver Dolly等,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利7,132,259；StephanDonovan,Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain,美国专利公布2002/0037833；Keith A.Foster等,Inhibition of Secretionfrom Non-neural Cells,美国专利公布2003/0180289；Lance E.Steward等,Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use,美国专利公布2006/0211619；KeithA.Foster等,Non-Cytotoxic ProteinConjugates,美国专利公布2008/0187960；Steward,L.E.等,ModifiedClostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and A lteredTargeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells,美国专利申请号11/776,075；Keith A.Foster等,Re-targeted Toxin Conjugates,美国专利申请号11/792,210中；所述文献各自全文以引用的方式并入本文。
非梭菌毒素结合结构域包括但不限于天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体，诸如非梭菌毒素结合结构域同工型和非梭菌毒素结合结构域亚型；以及非天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体，诸如保守非梭菌毒素结合结构域变异体、非保守非梭菌毒素结合结构域变异体、非梭菌毒素结合结构域嵌合体、其活性非梭菌毒素结合结构域片段或其任何组合。
如本文所用，术语“非梭菌毒素结合结构域变异体”无论是天然存在或非天然存在的皆指与参考序列的相应区相比较具有至少一个氨基酸变化且可用与那个参考序列的相应区的一致性百分比描述的非梭菌毒素结合结构域。除非明确指示，否则适用于实施公开的实施方案的非梭菌毒素结合结构域变异体为执行中毒过程的结合步骤的变异体。
本领域技术人员应认识到在各非梭菌毒素结合结构域内，可存在天然存在的变异体，所述天然存在的变异体在其氨基酸序列方面以及在编码这些蛋白质的核酸方面多少有些不同。如本文所用，术语“天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体”是指通过天然存在的过程产生的任何非梭菌毒素结合结构域，包括但不限于自交替拼接转录物产生的非梭菌毒素结合结构域同工型和通过自发突变产生的非梭菌毒素结合结构域同工型。天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体可以与天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体所基于的参考非梭菌毒素结合结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考非梭菌毒素结合结构域。天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体的非限制性实例为非梭菌毒素结合结构域同工型。非梭菌毒素结合结构域同工型的非限制性实例包括例如阿片(opiod)结合结构域同工型、速激肽(tachykinin)结合结构域同工型、黑素皮质素(melanocortin)结合结构域同工型、甘丙肽(galanin)结合结构域同工型、粒蛋白(granin)结合结构域同工型、神经肽Y相关肽结合结构域同工型、神经激素结合结构域同工型、神经调控细胞因子结合结构域同工型、激肽(kinin)结合结构域同工型、生长因子结合结构域同工型、和胰高血糖素(glucagon)样激素结合结构域同工型。
如本文所用，术语“非天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体”是指借助于人操作产生的任何非梭菌毒素结合结构域，包括但不限于通过使用随机诱变或合理设计进行遗传工程改造所产生的非梭菌毒素结合结构域和通过化学合成所产生的非梭菌毒素结合结构域。非天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体的非限制性实例包括例如保守非梭菌毒素结合结构域变异体、非保守非梭菌毒素结合结构域变异体、非梭菌毒素结合结构域嵌合变异体和活性非梭菌毒素结合结构域片段。
如本文所用，术语“保守非梭菌毒素结合结构域变异体”是指至少一个氨基酸取代为至少一种性质类似于来自参考非梭菌毒素结合结构域序列的原始氨基酸的性质的另一氨基酸或氨基酸类似物的非梭菌毒素结合结构域。性质的实例包括但不限于类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键结能力、氢键结能力、物理化学性质等或其任何组合。保守非梭菌毒素结合结构域变异体可以与保守非梭菌毒素结合结构域变异体所基于的参考非梭菌毒素结合结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考非梭菌毒素结合结构域。保守非梭菌毒素结合结构域变异体的非限制性实例包括例如保守阿片结合结构域变异体、保守速激肽结合结构域变异体、保守黑素皮质素结合结构域变异体、保守甘丙肽结合结构域变异体、保守粒蛋白结合结构域变异体、保守神经肽Y相关肽结合结构域变异体、保守神经激素结合结构域变异体、保守神经调控细胞因子结合结构域变异体、保守激肽结合结构域变异体、保守生长因子结合结构域变异体和保守胰高血糖素样激素结合结构域变异体。
如本文所用，术语“非保守非梭菌毒素结合结构域变异体”是指以下非梭菌毒素结合结构域：其中1)自非保守非梭菌毒素结合结构域变异体所基于的参考非梭菌毒素结合结构域缺失至少一个氨基酸；2)向非保守非梭菌毒素结合结构域所基于的参考非梭菌毒素结合结构域中添加至少一个氨基酸；或3)至少一个氨基酸取代为不共享类似于来自参考非梭菌毒素结合结构域序列的原始氨基酸的性质的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守非梭菌毒素结合结构域变异体可以与非保守非梭菌毒素结合结构域变异体所基于的参考非梭菌毒素结合结构域大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考非梭菌毒素结合结构域。非保守非梭菌毒素结合结构域变异体的非限制性实例包括例如非保守阿片结合结构域变异体、非保守速激肽结合结构域变异体、非保守黑素皮质素结合结构域变异体、非保守甘丙肽结合结构域变异体、非保守粒蛋白结合结构域变异体、非保守神经肽Y相关肽结合结构域变异体、非保守神经激素结合结构域变异体、非保守神经调控细胞因子结合结构域变异体、非保守激肽结合结构域变异体、非保守生长因子结合结构域变异体和非保守胰高血糖素样激素结合结构域变异体。
如本文所用，术语“活性非梭菌毒素结合结构域片段”是指可适用于本说明书的多个方面的多种包含结合结构域的梭菌毒素片段中的任一者，附带条件为这些结合结构域片段可优先与同源受体相互作用，且因此参与执行梭菌毒素蛋白水解裂解底物所凭借的总体细胞机制。
多种序列比对方法中的任一者可用于确定天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体以及非天然存在的梭菌毒素结合结构域变异体的一致性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，诸如链段逼近方法。确定一致性百分比的方案是在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的修饰梭菌毒素包含非梭菌毒素结合结构域。在此实施方案的一个方面，非梭菌毒素结合结构域包含天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体，诸如非梭菌毒素结合结构域同工型。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含非天然存在的非梭菌毒素结合结构域变异体，诸如保守非梭菌毒素结合结构域变异体、非保守非梭菌毒素结合结构域变异体、活性非梭菌毒素结合结构域片段或其任何组合。
在另一实施方案中，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的疏水性氨基酸可取代为另一疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在此实施方案的另一方面，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的脂肪族氨基酸可取代为另一脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在此实施方案的另一方面，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的芳香族氨基酸可取代为另一芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的堆叠氨基酸可取代为另一堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性氨基酸可取代为另一极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在此实施方案的另一方面，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性较小的或中性氨基酸可取代为另一极性较小的或中性氨基酸。极性较小的或中性氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在此实施方案的另一方面，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的带正电荷氨基酸可取代为另一带正电荷氨基酸。带正电荷氨基酸的实例包括例如K、R和H。在此实施方案的另一方面，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的带负电荷氨基酸可取代为另一带负电荷氨基酸。带负电荷氨基酸的实例包括例如D和E。在此实施方案的另一方面，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的小氨基酸可取代为另一小氨基酸。小氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在此实施方案的另一方面，在非梭菌毒素结合结构域的多肽链中的一个特定位置上的C-β支链氨基酸可取代为另一C-β支链氨基酸。C-β支链氨基酸的实例包括例如I、T和V。
在另一实施方案中，非梭菌毒素结合结构域包含阿片结合结构域，诸如脑啡肽(enkephalin)、内吗啡肽(endomorphin)、内啡肽(endorphin)、强啡肽(dynorphin)、孤啡肽(nociceptin)或血啡肽(hemorphin)。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含速激肽结合结构域，诸如物质P、神经肽K(NPK)、神经肽γ(NPγ)、神经激肽(neurokinin)A(NKA；物质K、神经激肽α、神经介素L)、神经激肽B(NKB)、血细胞激肽(hemokinin)或内激肽(endokinin)。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素包含黑素皮质素结合结构域，诸如黑素细胞刺激激素(melanocyte stimulating hormone)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropin)或促脂解素(lipotropin)。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含甘丙肽结合结构域，诸如甘丙肽或甘丙肽信息相关肽。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含粒蛋白结合结构域，诸如嗜铬粒蛋白(Chromogranin)A、嗜铬粒蛋白B或嗜铬粒蛋白C。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含神经肽Y相关肽结合结构域，诸如神经肽Y、肽YY、胰腺肽或胰腺二十肽(Pancreatic icosapeptide)。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含神经激素结合结构域，诸如促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone)、甲状旁腺激素(parathyroid hormone)、促甲状腺激素释放激素(thyrotropin-releasinghormone)或生长激素抑制素(somatostatin)。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含神经调控细胞因子结合结构域，诸如纤毛神经营养因子、血型糖蛋白-A(glycophorin-A)、白血病抑制因子、胆碱能分化因子、白介素(interleukin)、制瘤素M(onostatin M)、心肌营养蛋白-1(cardiotrophin-1)、心肌营养蛋白样细胞因子或神经白细胞素(neuroleukin)。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含激肽结合结构域，诸如舒缓激肽(bradykinin)、胰激肽(kallidin)、desArg9舒缓激肽或desArg10舒缓激肽。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含生长因子结合结构域，诸如成纤维细胞生长因子结合结构域、神经生长因子结合结构域、胰岛素生长因子结合结构域、表皮生长因子结合结构域、血管内皮生长因子结合结构域、脑源性神经营养因子结合结构域、生长源性神经营养因子结合结构域、神经营养素(neurotrophin)结合结构域(诸如神经营养素-3、神经营养素-4/5)、激头肽(head activator peptide)结合结构域、神经秩蛋白(neurturin)结合结构域、persephrin结合结构域、青蒿琥酯(artemin)结合结构域、转化生长因子β结合结构域(诸如TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3或TGFβ4)、骨形态发生蛋白结合结构域(诸如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8或BMP10)、生长分化因子结合结构域(诸如GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF10、GDF11或GDF15)、或活化素(activin)结合结构域(诸如活化素A、活化素B、活化素C、活化素E或抑制素(inhibin)A)。在此实施方案的另一方面，非梭菌毒素结合结构域包含胰高血糖素样激素结合结构域，诸如分泌素(secretin)、胰高血糖素样肽(如GLP-1和GLP-2)、垂体腺苷酸环化酶活化肽结合结构域、生长激素释放激素结合结构域、血管活性肠肽结合结构域(如VIP1或VIP2)、胃抑制性多肽结合结构域、降血钙素(calcitonin)相关肽内脏肠肽结合结构域(如促胃液素(gastrin)、促胃液素释放肽或缩胆囊素(cholecystokinin))、或PAR肽结合结构域(如PAR1肽、PAR2肽、PAR3肽或PAR4肽)。
在另一实施方案中，阿片样肽(opioid peptide)包含脑啡肽。在此实施方案的多个方面，脑啡肽包含Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽、Met-脑啡肽MRGL或Met-脑啡肽MRF。在此实施方案的其它方面，脑啡肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29。
在此实施方案的其它方面，脑啡肽包含与SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，脑啡肽包含相对于SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQID NO:29具有例如至少1、2或3个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有例如至多1、2或3个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，脑啡肽包含相对于SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有例如至少1、2或3个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29具有例如至多1、2或3个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，阿片样肽包含牛肾上腺髓质-22(BAM22)肽。在此实施方案的多个方面，BAM22肽包含BAM22肽(1-12)、BAM22肽(6-22)、BAM22肽(8-22)或BAM22肽(1-22)。在此实施方案的其它方面，BAM22肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:31的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:32的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:33的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:34的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22或SEQ ID NO:35的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22。
在此实施方案的其它方面，BAM22肽包含与SEQ ID NO:30的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:31的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ IDNO:32的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQID NO:33的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:34的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22或SEQ ID NO:35的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:30的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:31的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:32的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:33的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ IDNO:34的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22或SEQ ID NO:35的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。
在此实施方案的其它方面，BAM22肽包含相对于SEQ ID NO:30的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:31的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ IDNO:32的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQID NO:33的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:34的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22或SEQ ID NO:35的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22具有例如至少1、2、3、4或5个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:30的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:31的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:32的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:33的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:34的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22或SEQ ID NO:35的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22具有例如至多1、2、3、4或5个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在此实施方案的其它方面，BAM22肽包含相对于SEQ ID NO:30的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:31的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ IDNO:32的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQID NO:33的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:34的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22或SEQ ID NO:35的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22具有例如至少1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:30的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:71的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:32的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:33的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22；SEQ ID NO:34的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22或SEQ ID NO:35的氨基酸1-12、氨基酸6-22、氨基酸8-22或氨基酸1-22具有例如至多1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，阿片样肽包含内吗啡肽。在此实施方案的多个方面，内吗啡肽包含内吗啡肽-1或内吗啡肽-2。在此实施方案的其它方面，内吗啡肽包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37。
在此实施方案的其它方面，内吗啡肽包含与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:36或SEQ IDNO:37具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，内吗啡肽包含相对于SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37具有例如至少1、2或3个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37具有例如至多1、2或3个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，内吗啡肽包含相对于SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37具有例如至少1、2或3个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37具有例如至多1、2或3个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，阿片样肽包含内啡肽。在此实施方案的多个方面，内啡肽包含内啡肽-α、新内啡肽-α、内啡肽-β、新内啡肽-β或内啡肽-γ。在此实施方案的其它方面，内啡肽包含SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43。
在此实施方案的其它方面，内啡肽包含与SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQID NO:43具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，内啡肽包含相对于SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43具有例如至少1、2、3、4或5个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43具有例如至多1、2、3、4或5个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，内啡肽包含相对于SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43具有例如至少1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43具有例如至多1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，阿片样肽包含强啡肽。在此实施方案的多个方面，强啡肽包含强啡肽A、强啡肽B(亮脑啡肽(leumorphin))或强啡肽B(rimorphin)。在此实施方案的其它方面，强啡肽包含SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74。
在此实施方案的其它方面，强啡肽包含与SEQ ID NO:44、SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53或SEQID NO:69具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:69具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，强啡肽包含相对于SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:69具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:69具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，强啡肽包含相对于SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:69具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:69具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，阿片样肽包含孤啡肽。在此实施方案的多个方面，孤啡肽包含孤啡肽RK、孤啡肽、神经肽1、神经肽2或神经肽3。在此实施方案的其它方面，孤啡肽包含SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84。
在此实施方案的其它方面，孤啡肽包含与SEQ ID NO:75、SEQID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ IDNO:84具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，孤啡肽包含相对于SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，孤啡肽包含相对于SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，阿片样肽包含血啡肽。在此实施方案的多个方面，血啡肽包含LVVH7、VVH7、VH7、H7、LVVH6、LVVH5、VVH5、LVVH4和LVVH3。在此实施方案的其它方面，血啡肽包含SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93。
在此实施方案的其它方面，血啡肽包含与SEQ ID NO:85、SEQID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，孤啡肽包含相对于SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93具有例如至少1、2或3个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93具有例如至多1、2或3个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，孤啡肽包含相对于SEQ ID NO:85、SEQID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93具有例如至少1、2或3个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93具有例如至多1、2或3个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，非梭菌毒素结合结构域包含甘丙肽结合结构域。在此实施方案的多个方面，甘丙肽结合结构域包含甘丙肽或甘丙肽信息相关肽(GMAP)。在此实施方案的其它方面，甘丙肽结合结构域包含SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:95。
在此实施方案的其它方面，甘丙肽结合结构域包含与SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:95具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:95具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，甘丙肽结合结构域包含相对于SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:95具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:95具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，甘丙肽结合结构域包含相对于SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:95具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:95具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，非梭菌毒素结合结构域包含速激肽结合结构域。在此实施方案的多个方面，速激肽结合结构域包含物质P、神经肽K(NPK)、神经肽γ(NPγ)、神经激肽A(NKA；物质K、神经激肽a、神经介素L)、神经激肽B(NKB)、血细胞激肽或内激肽。在此实施方案的其它方面，速激肽结合结构域包含SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:107。
在此实施方案的其它方面，速激肽结合结构域包含与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:107具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:107具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，速激肽结合结构域包含相对于SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:107具有例如至少1、2、3、4或5个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:107具有例如至多1、2、3、4或5个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，速激肽结合结构域包含相对于SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:107具有例如至少1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:107具有例如至多1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
在另一实施方案中，非梭菌毒素结合结构域包含神经肽Y相关肽结合结构域。在此实施方案的多个方面，神经肽Y相关肽结合结构域包含神经肽Y(NPY)、肽YY(PYY)、胰腺肽(PP)或胰腺二十肽(PIP)。在此实施方案的其它方面，神经肽Y相关肽结合结构域包含SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112。
在此实施方案的其它方面，神经肽Y相关肽结合结构域包含与SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸一致性；或与SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112具有例如至多70%、至多75%、至多80%、至多85%、至多90%或至多95%氨基酸一致性的多肽。在此实施方案的其它方面，神经肽Y相关肽结合结构域包含相对于SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQID NO:111或SEQ ID NO:112具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。在此实施方案的其它方面，神经肽Y相关肽结合结构域包含相对于SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQ IDNO:112具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失、添加和/或取代；或相对于SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失、添加和/或取代的多肽。
设想本说明书中公开的梭菌毒素嵌合体可在任何以及所有位置中包含非梭菌结合结构域，附带条件为梭菌毒素嵌合体可执行中毒过程。非限制性实例包括使非梭菌结合结构域定位在修饰梭菌毒素的氨基端上；使非梭菌结合结构域定位在修饰梭菌毒素的梭菌毒素酶促结构域与移位结构域之间；以及使非梭菌结合结构域定位在修饰梭菌毒素的羧基端上。其它非限制性实例包括使非梭菌结合结构域定位在修饰梭菌毒素的梭菌毒素酶促结构域与梭菌毒素移位结构域之间。天然存在的梭菌毒素的酶促结构域含有天然起始甲硫氨酸。因此，在酶促结构域不处于氨基端位置中的结构域组构中，包含起始甲硫氨酸的氨基酸序列应置放在氨基端结构域的前方。同样，当非梭菌结合结构域处于氨基端位置中时，包含起始甲硫氨酸和蛋白酶裂解位点的氨基酸序列在非梭菌结合结构域需要游离氨基端的情形下可以可操作地连接，参见例如Shengwen Li等,Degradable Clostridial Toxins,美国专利申请11/572,512(2007年1月23日)，其据此全文以引用的方式并入本文。此外，本领域中已知当添加可操作地连接于包含起始甲硫氨酸的另一多肽的氨基端的多肽时，可缺失原始甲硫氨酸残基。
因此，在一个实施方案中，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含非梭菌结合结构域、移位结构域、外源性蛋白酶裂解位点和酶促结构域(图3A)。在此实施方案的一个方面，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含非梭菌结合结构域、梭菌毒素移位结构域、外源性蛋白酶裂解位点和梭菌毒素酶促结构域。
在另一实施方案中，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含非梭菌结合结构域、酶促结构域、外源性蛋白酶裂解位点和移位结构域(图3B)。在此实施方案的一个方面，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含非梭菌结合结构域、梭菌毒素酶促结构域、外源性蛋白酶裂解位点、梭菌毒素移位结构域。
在另一实施方案中，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含酶促结构域、外源性蛋白酶裂解位点、非梭菌结合结构域和移位结构域(图4A)。在此实施方案的一个方面，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含梭菌毒素酶促结构域、外源性蛋白酶裂解位点、非梭菌结合结构域和梭菌毒素移位结构域。
在另一实施方案中，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含移位结构域、外源性蛋白酶裂解位点、非梭菌结合结构域和酶促结构域(图4B)。在此实施方案的一个方面，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含梭菌毒素移位结构域、非梭菌结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点和梭菌毒素酶促结构域。
在另一实施方案中，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含酶促结构域、非梭菌结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点和移位结构域(图4C)。在此实施方案的一个方面，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含梭菌毒素酶促结构域、非梭菌结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、梭菌毒素移位结构域。
在另一实施方案中，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含移位结构域、非梭菌结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点和酶促结构域(图4D)。在此实施方案的一个方面，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含梭菌毒素移位结构域、非梭菌结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点和梭菌毒素酶促结构域。
在另一实施方案中，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含酶促结构域、外源性蛋白酶裂解位点、移位结构域和非梭菌结合结构域(图5A)。在此实施方案的一个方面，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含梭菌毒素酶促结构域、外源性蛋白酶裂解位点、梭菌毒素移位结构域和非梭菌结合结构域。
在另一实施方案中，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含移位结构域、外源性蛋白酶裂解位点、酶促结构域和非梭菌结合结构域(图5B)。在此实施方案的一个方面，修饰梭菌毒素可包含氨基至羧基单一多肽线性顺序，其包含梭菌毒素移位结构域、非梭菌结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点和梭菌毒素酶促结构域。
本说明书的多个方面部分地提供失活裂解位点。如本文所用，术语“失活裂解位点”是指足以达成由存在于间质液或循环系统(诸如心血管系统或淋巴系统)中的蛋白酶在易切断键处进行选择性蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。所述失活裂解位点以融合蛋白形式可操作地连接于本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。根据定义，失活裂解位点易受由存在于间质液或循环系统中的至少一种蛋白酶进行的选择性裂解。失活裂解位点的非限制性实例包括凝血酶裂解位点、纤溶酶裂解位点、凝血因子VIIa裂解位点、凝血因子IXa裂解位点、凝血因子Xa裂解位点、凝血因子XIa裂解位点、凝血因子XIIa裂解位点、血浆激肽释放酶裂解位点、蛋白酶活化G蛋白偶联受体-1(PAR1)裂解位点、PAR2裂解位点、PAR3裂解位点、PAR4裂解位点、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)裂解位点、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)裂解位点、弗林蛋白酶裂解位点、尿激酶型纤溶酶原活化因子(uPA)裂解位点、组织型纤溶酶原活化因子(tPA)裂解位点、类胰蛋白酶-ε裂解位点、小鼠肥大细胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位点、內皮素转化酶-1(ECE-1)裂解位点、凯尔血型裂解位点、DPPIV裂解位点、具有血小板反应蛋白1型基序的ADAM金属肽酶-13(ADAMTS13)裂解位点和组织蛋白酶L裂解位点(表4)。
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设想任何以及所有长度的失活裂解位点皆可适用于本说明书的多个方面，附带条件为所述失活裂解位点能够由间质液或循环系统蛋白酶裂解。因此，在此实施方案的多个方面，失活裂解位点的长度可为例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸。在此实施方案的其它方面，失活裂解位点的长度可为例如至多3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸。
适用于本说明书的多个方面的失活裂解位点包括但不限于天然存在的失活裂解位点；天然存在的失活裂解位点变异体；和非天然存在的失活裂解位点变异体，诸如保守失活裂解位点变异体、非保守失活裂解位点变异体和失活裂解位点肽模拟物。如本文所用，术语“失活裂解位点变异体”无论是天然存在或非天然存在的皆指与公开的参考序列的相应区相比较具有至少一个氨基酸变化且可用与那个参考序列的相应区的一致性百分比描述的失活裂解位点。多种序列比对方法中的任一者可用于确定一致性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，诸如链段逼近方法。确定一致性百分比的方案是在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
如本文所用，术语“天然存在的失活裂解位点变异体”是指不借助于任何人操作产生的任何失活裂解位点。失活裂解位点的非限制性实例包括凝血酶裂解位点变异体、纤溶酶裂解位点变异体、凝血因子V裂解位点变异体、凝血因子VII裂解位点变异体、凝血因子VIII裂解位点变异体、凝血因子IXa裂解位点变异体、凝血因子Xa裂解位点变异体、凝血因子XIa裂解位点变异体、凝血因子XIIa裂解位点变异体、血浆激肽释放酶裂解位点变异体、MMP-2裂解位点变异体、MMP-9裂解位点变异体、弗林蛋白酶裂解位点变异体、u-纤溶酶原活化因子裂解位点变异体、t-纤溶酶原活化因子裂解位点变异体、类胰蛋白酶-ε裂解位点变异体、mMCP-7裂解位点变异体、ECE-1裂解位点变异体、KBGP裂解位点变异体、组织蛋白酶L裂解位点变异体、PAR1裂解位点变异体、PAR2裂解位点变异体、PAR3裂解位点变异体、PAR4裂解位点变异体和ADAM-TS13裂解位点变异体。
如本文所用，术语“非天然存在的失活裂解位点变异体”是指借助于人操作产生的任何失活裂解位点，包括但不限于通过使用随机诱变或合理设计进行遗传工程改造所产生的失活裂解位点变异体和通过化学合成所产生的失活裂解位点变异体。非天然存在的失活裂解位点变异体的非限制性实例包括例如保守失活裂解位点变异体、非保守失活裂解位点变异体和失活裂解位点肽模拟物。
如本文所用，术语“保守失活裂解位点变异体”是指至少一个氨基酸取代为至少一种性质类似于来自参考失活裂解位点序列的原始氨基酸的性质的另一氨基酸或氨基酸类似物的失活裂解位点。性质的实例包括但不限于类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键结能力、氢键结能力、物理化学性质等或其任何组合。保守失活裂解位点变异体可以与保守失活裂解位点变异体所基于的参考失活裂解位点大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考失活裂解位点。保守失活裂解位点变异体的非限制性实例包括例如保守凝血酶裂解位点变异体、保守纤溶酶裂解位点变异体、保守凝血因子V裂解位点变异体、保守凝血因子VII裂解位点变异体、保守凝血因子VIII裂解位点变异体、保守凝血因子IXa裂解位点变异体、保守凝血因子Xa裂解位点变异体、保守凝血因子XIa裂解位点变异体、保守凝血因子XIIa裂解位点变异体、保守血浆激肽释放酶裂解位点变异体、保守MMP-2裂解位点变异体、保守MMP-9裂解位点变异体、保守弗林蛋白酶裂解位点变异体、保守u-纤溶酶原活化因子裂解位点变异体、保守t-纤溶酶原活化因子裂解位点变异体、保守类胰蛋白酶-ε裂解位点变异体、保守mMCP-7裂解位点变异体、保守ECE-1裂解位点变异体、保守KBGP裂解位点变异体、保守组织蛋白酶L裂解位点变异体、保守PAR1裂解位点变异体、保守PAR2裂解位点变异体、保守PAR3裂解位点变异体、保守PAR4裂解位点变异体和保守ADAM-TS13裂解位点变异体。
如本文所用，术语“非保守失活裂解位点变异体”是指以下失活裂解位点：其中1)自非保守失活裂解位点变异体所基于的参考失活裂解位点缺失至少一个氨基酸；2)向非保守失活裂解位点所基于的参考失活裂解位点中添加至少一个氨基酸；或3)至少一个氨基酸取代为不共享类似于来自参考失活裂解位点序列(表4)的原始氨基酸的性质的任何性质的另一氨基酸或氨基酸类似物。非保守失活裂解位点变异体可以与非保守失活裂解位点所基于的参考失活裂解位点大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考失活裂解位点。非保守失活裂解位点变异体的非限制性实例包括例如非保守凝血酶裂解位点变异体、非保守纤溶酶裂解位点变异体、非保守凝血因子V裂解位点变异体、非保守凝血因子VII裂解位点变异体、非保守凝血因子VIII裂解位点变异体、非保守凝血因子IXa裂解位点变异体、非保守凝血因子Xa裂解位点变异体、非保守凝血因子XIa裂解位点变异体、非保守凝血因子XIIa裂解位点变异体、非保守血浆激肽释放酶裂解位点变异体、非保守MMP-2裂解位点变异体、非保守MMP-9裂解位点变异体、非保守弗林蛋白酶裂解位点变异体、非保守u-纤溶酶原活化因子裂解位点变异体、非保守t-纤溶酶原活化因子裂解位点变异体、非保守类胰蛋白酶-ε裂解位点变异体、非保守mMCP-7裂解位点变异体、非保守ECE-1裂解位点变异体、非保守KBGP裂解位点变异体、非保守组织蛋白酶L裂解位点变异体、非保守PAR1裂解位点变异体、非保守PAR2裂解位点变异体、非保守PAR3裂解位点变异体、非保守PAR4裂解位点变异体和非保守ADAM-TS13裂解位点变异体。
如本文所用，术语“失活裂解位点肽模拟物”是指至少一个氨基酸取代为至少一种性质类似于第一氨基酸的性质的非天然寡聚物的失活裂解位点。性质的实例包括但不限于肽一级结构元件的拓扑学、肽一级结构元件的功能性、肽二级结构元件的拓扑结构、肽二级结构元件的功能性等或其任何组合。失活裂解位点肽模拟物可以与失活裂解位点肽模拟物所基于的参考失活裂解位点大致上相同的方式起作用，且可在本说明书的任何方面替代参考失活裂解位点。对于肽模拟物方法的实例，参见例如Amy S.Ripka和Daniel H.Rich,Peptidomimeticdesign,2(4)Curr.OPIN.CHEM.BIOL.441-452(1998)；以及M.AngelsEstiarte和Daniel H.Rich,Peptidomimetics for Drug Design,803-861(BURGER’S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY第1卷PRINCIPLE AND PRACTICE,Donald J.Abraham编著,Wiley-lnterscience,第6版2003)。失活裂解位点肽模拟物的非限制性实例包括例如凝血酶裂解位点肽模拟物、纤溶酶裂解位点肽模拟物、凝血因子V裂解位点肽模拟物、凝血因子VII裂解位点肽模拟物、凝血因子VIII裂解位点肽模拟物、凝血因子IXa裂解位点肽模拟物、凝血因子Xa裂解位点肽模拟物、凝血因子XIa裂解位点肽模拟物、凝血因子XIIa裂解位点肽模拟物、血浆激肽释放酶裂解位点肽模拟物、MMP-2裂解位点肽模拟物、MMP-9裂解位点肽模拟物、弗林蛋白酶裂解位点肽模拟物、u-纤溶酶原活化因子裂解位点肽模拟物、t-纤溶酶原活化因子裂解位点肽模拟物、类胰蛋白酶-ε裂解位点肽模拟物、mMCP-7裂解位点变异体、ECE-1裂解位点肽模拟物、KBGP裂解位点肽模拟物、组织蛋白酶L裂解位点肽模拟物、PAR1裂解位点肽模拟物、PAR2裂解位点肽模拟物、PAR3裂解位点肽模拟物、PAR4裂解位点肽模拟物和ADAM-TS13裂解位点肽模拟物。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素包含失活裂解位点。在此实施方案的一个方面，梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、梭菌毒素结合结构域和失活裂解位点。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素包含天然存在的失活裂解位点变异体，诸如失活裂解位点同工型。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素包含非天然存在的失活裂解位点变异体，诸如保守失活裂解位点变异体、非保守失活裂解位点变异体或活性失活裂解位点片段或其任何组合。
在另一实施方案中，梭菌毒素嵌合体包含失活裂解位点。在此实施方案的一个方面，梭菌毒素嵌合体包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和失活裂解位点。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素嵌合体包含天然存在的失活裂解位点变异体，诸如失活裂解位点同工型。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素嵌合体包含非天然存在的失活裂解位点变异体，诸如保守失活裂解位点变异体、非保守失活裂解位点变异体或活性失活裂解位点片段或其任何组合。
在另一实施方案中，在失活裂解位点中的一个特定位置上的疏水性氨基酸可取代为另一疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在此实施方案的另一方面，在失活裂解位点中的一个特定位置上的脂肪族氨基酸可取代为另一脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在此实施方案的另一方面，在失活裂解位点中的一个特定位置上的芳香族氨基酸可取代为另一芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在失活裂解位点中的一个特定位置上的堆叠氨基酸可取代为另一堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在此实施方案的另一方面，在失活裂解位点中的一个特定位置上的极性氨基酸可取代为另一极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在此实施方案的另一方面，在失活裂解位点中的一个特定位置上的极性较小的或中性氨基酸可取代为另一极性较小的或中性氨基酸。极性较小的或中性氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在此实施方案的另一方面，在失活裂解位点中的一个特定位置上的带正电荷氨基酸可取代为另一带正电荷氨基酸。带正电荷氨基酸的实例包括例如K、R和H。在此实施方案的另一方面，在失活裂解位点中的一个特定位置上的带负电荷氨基酸可取代为另一带负电荷氨基酸。带负电荷氨基酸的实例包括例如D和E。在此实施方案的另一方面，在失活裂解位点中的一个特定位置上的小氨基酸可取代为另一小氨基酸。小氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在此实施方案的另一方面，在失活裂解位点中的一个特定位置上的C-β支链氨基酸可取代为另一C-β支链氨基酸。C-β支链氨基酸的实例包括例如I、T和V。
本说明书的多个方面部分地公开凝血酶裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“凝血酶裂解位点”是指足以达成在适于凝血酶蛋白酶活性的条件下由凝血酶在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由凝血酶裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但凝血酶裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO:113)，其中X1优选为S、T、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)、脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为任何氨基酸；X3优选为F、S、T、酰胺氨基酸(如N或Q)、或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4优选为S、T、带正电荷氨基酸(如H、K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X5、X6和X7独立地为任何氨基酸。表4列出凝血酶(SEQ ID NO:114-123)的示例性参考裂解位点。其它凝血酶裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived,Database-SearchablePeptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,NucleicAcids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALarge and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPSDatabase,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含凝血酶裂解位点。在此实施方案的一个方面，凝血酶裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:113，其中X1为S、T、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)、脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为任何氨基酸；X3为F、S、T、酰胺氨基酸(如N或Q)、或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为S、T、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X5、X6和X7独立地为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，凝血酶裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:113，其中X1为S、Q、K或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为N、Q、G、P、A、V、L或I；X4为S、T、H、G、A、L或I；X5为S、T、Q、K、R、F、Y或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为S、T、Q、K、R、G、P、A、V、L或I；且X7为S、T、Q、K、R、G、P、A、V、L或I。在此实施方案的另一方面，凝血酶裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:113，其中X1为Q、G、P、A、V、L、I或M；X2为S、T、D、E、G、A、V或I；X3为G、P、A、V或L；X4为S、G、A或L；X5为Q、K、F、A、V或L；X6为S、Q、K、R、G、P、V或L；且X7为S、T、K、G、V、L或I。在此实施方案的其它方面，凝血酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123。
本说明书的多个方面部分地公开纤溶酶裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“纤溶酶裂解位点”是指足以达成在适于纤溶酶蛋白酶活性的条件下由纤溶酶在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由纤溶酶裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。纤溶酶以类似于胰蛋白酶(Trypsin)的特异性的特异性催化Lys|键和Arg|键的裂解。然而，纤溶酶为一种效率比胰蛋白酶低得多的酶，且仅裂解蛋白质中的这些键中的一些。胰蛋白酶主要在氨基酸赖氨酸或精氨酸的羧基侧处裂解肽链，除了当任一者后接脯氨酸时。
本说明书的多个方面部分地公开凝血因子VIIa裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“凝血因子VIIa裂解位点”或“FVIIa裂解位点”是指足以达成在适于FVIIa蛋白酶活性的条件下由FVIIa在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由FVIIa裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但FVIIa裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO:124)，其中X1优选为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、碱性氨基酸(如K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为Q、S、T、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为Q、S、T或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4、X5、X6和X7独立地为任何氨基酸。表4列出FVIIa的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:125-133)。其它FVIIa裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如J.H.Morrissey,Coagulation Factor VIIa.HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES,第1659-1662页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier,London,第2版,2004)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying ProteaseCleavage Sites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidaseDatabase,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；NeilD.Rawlings等,ALarge and Accurate Collection of  Peptidase Cleavagesin the MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含凝血因子VIIa裂解位点。在此实施方案的一个方面，凝血因子VIIa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:124，其中X1为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、碱性氨基酸(如K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为Q、S、T、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为Q、S、T或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X4、X5、X6和X7独立地为任何氨基酸。在此实施方案的其它方面，凝血因子VIIa裂解位点包含例如SEQ ID NO:125、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133。
本说明书的多个方面部分地公开凝血因子IXa裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“凝血因子IXa裂解位点”或“FIXa裂解位点”是指足以达成在适于FIXa蛋白酶活性的条件下由FIXa在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由FIXa裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但FIXa裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO:134)，其中X1优选为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2优选为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为S、T、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X4、X5、X6和X7独立地为任何氨基酸。表4列出FIXa的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:135-138)。其它FIXa裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如A.T.Thompson,Molecular Biology ofFactor IX.HEMOSTASIS AND THROMBOSIS,BASIC PRINCIPLESAND CLINICAL PRACTICE,第128-129页(R.W. Colman,J.Hirsh,V.J.Marder,A.W Clowes,J.N.George编著;Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,第2版,2001)；S.Kawabata和S.Iwanaga,Russellysin.HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES,第683-684页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier,London,第2版,2004)；A.E.Schmidt和S.P Bajaj,Coagulation factorIXa.HANDBOOK OF PROTEOLYTIC ENZYMES,第1655-1659页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier,London,第2版,2004)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying ProteaseCleavage Sites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidaseDatabase,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010);NeilD.Rawlings等,ALarge and Accurate Collection of PeptidaseCleavagesinthe MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含凝血因子IXa裂解位点。在此实施方案的一个方面，凝血因子IXa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:134，其中X1为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为S、T、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X4、X5、X6和X7独立地为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，凝血因子IXa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:134，其中X1为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为S、T、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4、X5、X6和X7独立地为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的其它方面，凝血因子IXa裂解位点包含例如SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138。
本说明书的多个方面部分地公开凝血因子Xa裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“凝血因子Xa裂解位点”或“FXa裂解位点”是指足以达成在适于FXa蛋白酶活性的条件下由FXa在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由FXa裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但FXa裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO:139)，其中X1为任何氨基酸，X2优选为G、A、S、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如Q和N)或芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)，X3优选为芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4优选为酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5、X6和X7独立地为任何氨基酸。表4列出FXa的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:140-155)。其它FXa裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如D.L.Greenberg和E.W. Davie,BloodCoagulation Factors:Their Complementary DNAs,Genes,andExpression.HEMOSTASIS AND THROMBOSIS,BASIC PRINCIPLESAND CLINICAL PRACTICE,第34-35页(R.W. Colman,J.Hirsh,V. J.Marder,A.W Clowes,J.N.George编著;Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,第2版,2001)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-Searchable Peptide Libraries forIdentifying ProteaseCleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,NucleicAcids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS:The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,A Large and AccurateCollection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含凝血因子Xa裂解位点。在此实施方案的一个方面，凝血因子Xa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:139，其中X1为任何氨基酸，X2为G、A、S、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如Q和N)或芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)，X3为芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5、X6和X7独立地为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，凝血因子Xa裂解位点包含共有序列SEQID NO:139，其中X1为E、F、P、A、L或I；X2为S、Q、D、E、F、G或A；X3为F、G或P；X4为S、T、L或I；X5为S、F、A或V；X6为S、T、E、N、H、G、A或M；且X7为S、N、D、Q、K、R或G。在此实施方案的另一方面，凝血因子Xa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:139，其中X1为I或A；X2为E或F；X3为F、G或P；X4为S、T或I；X5为S、F或V；X6为E或G；且X7为S或G。在此实施方案的其它方面，凝血因子Xa裂解位点包含例如氨基酸序列SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154或SEQ ID NO:155。
本说明书的多个方面部分地公开凝血因子XIa裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“凝血因子XIa裂解位点”或“FXIa裂解位点”是指足以达成在适于FXIa蛋白酶活性的条件下由FXIa在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由FXIa裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但FXIa裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO:156)，其中X1优选为酸性氨基酸(如D或E)、碱性氨基酸(如K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2优选为酸性氨基酸(如D或E)、酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为H、不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4优选为H、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5优选为酸性氨基酸(如D和E)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6优选为酰胺氨基酸(如Q和N)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X7优选为不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。表4列出FXIa的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:157-166)。其它FXIa裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如P. N.Walsh,CoagulationFactor Xla.Handbook of Proteolytic Enzymes,第1651-1655页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier,London,第2版,2004)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived,Database-Seapchable Peptide Libraries for Identifying ProteaseCleavage Sites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The PeptidaseDatabase,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；NeilD.Rawlings等,ALargeandAccurate Collection of Peptidase Cleavagesinthe MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含凝血因子XIa裂解位点。在此实施方案的一个方面，凝血因子XIa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:156，其中X1为酸性氨基酸(如D或E)、碱性氨基酸(如K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为酸性氨基酸(如D或E)、酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为H、不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为H、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5为酸性氨基酸(如D和E)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为酰胺氨基酸(如Q和N)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X7为不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，凝血因子XIa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:156，其中X1为酸性氨基酸(如D或E)或碱性氨基酸(如K和R)；X2为芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5为酸性氨基酸(如D和E)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X7为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，凝血因子XIa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:156，其中X1为D或K；X2为F或L；X3为T或P；X4为A或V；X5为E或V；X6为T或G；且X7为G或V。在此实施方案的其它方面，凝血因子XIa裂解位点包含例如SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165或SEQ IDNO:166。
本说明书的多个方面部分地公开凝血因子XIIa裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“凝血因子XIIa裂解位点”或“FXIIa裂解位点”是指足以达成在适于FXIIa蛋白酶活性的条件下由FXIIa在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由FXIIa裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但FXIIa裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO:167)，其中X1优选为不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2优选为酸性氨基酸(如D和E)、碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5优选为不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X7优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。表4列出FXIIa的示例性参考裂解位点(SEQID NO:168-172)。其它FXIIa裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如O.D.Ratnoff,Coagulation Factor XIIa.Handbook of Proteolytic Enzymes,第1642-1644页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier,London,第2版,2004)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-SearchablePeptideLibrariesfor Identifying Protease Cleavage Sites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidase Database,NucleicAcids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALarge andAccurate Collection of Peptidase Cleavagesinthe MEROPSDatabase,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含凝血因子XIIa裂解位点。在此实施方案的一个方面，凝血因子XIIa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:167，其中X1为不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为酸性氨基酸(如D和E)、碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5为不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X7为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的其它方面，凝血因子XIIa裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:167，其中X1为S、T、P或I；X2为Q、K、S或M；X3为K、T、G或P；X4为L、I或V；X5为T或V；X6为G或L；且X7为G。在此实施方案的其它方面，凝血因子XIIa裂解位点包含例如SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172。
本说明书的多个方面部分地公开激肽释放酶1裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“激肽释放酶1裂解位点”是指足以达成在适于激肽释放酶1蛋白酶活性的条件下由激肽释放酶1在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由激肽释放酶1裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但激肽释放酶1裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3X4*(R/K/S)X5X6X7(SEQ ID NO:173)，其中X1优选为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如Q和N)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为任何氨基酸；X3为任何氨基酸；X4优选为带正电荷氨基酸(如H、K和R)、大非极性氨基酸(如F、I、L、M和V)或芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)；X5为任何氨基酸；X6为任何氨基酸；且X7为任何氨基酸。表4列出激肽释放酶1的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:174-198)。其它激肽释放酶1裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如R.W.Colman,ContactActivation Pathway:Infammation,Fibrinolytic,Anticoagulant，Antiadhesive,and Antiangiogenic Activities.HEMOSTASIS ANDTHROMBOSIS,BASIC PRINCIPLES AND CLINICAL PRACTICE,第103-104页(R.W.Colman,J.Hirsh,V. J.Marder,A.W Clowes,J.N.George编著;Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,第2版,2001)；J.Chao,Human Kallikrein1,Tissue Kallikrein.Handbook ofProteolytic Enzymes,第1577-1580页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier，London,第2版,2004)；H.X.Li等,Substrate Specificity of Human Kallikreins1and6Determined byPhageDisplay，Protein Sci.17:664-672(2008)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-Searchable Peptide Libraries forIdentifying Protease CleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidase Database,NucleicAcids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS:ThePptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALargeandAccurateCollection ofPeptidaseCleavagesinthe MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含激肽释放酶1裂解位点。在此实施方案的一个方面，激肽释放酶1裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:173，其中X1为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如Q和N)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为任何氨基酸；X3为任何氨基酸；X4为带正电荷氨基酸(如H、K和R)、大非极性氨基酸(如F、I、L、M和V)或芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)；X5为任何氨基酸；X6为任何氨基酸；且X7为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，激肽释放酶1裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:173，其中X1为D、S、T或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为S、T、A、P或V；X3为S、F或L；X4为R或芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)；X5为R、S、T或A；X6为R、S或G；且X7为R、G或A。在此实施方案的其它方面，激肽释放酶1裂解位点包含例如SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:198。
本说明书的多个方面部分地公开蛋白C裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“蛋白C裂解位点”是指足以达成在适于蛋白C蛋白酶活性的条件下由蛋白C在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由蛋白C裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但蛋白C裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)X4X5X6X7(SEQ ID NO:199)，其中X1优选为碱性氨基酸(如K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2优选为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4优选为酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5优选为酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6优选为酰胺氨基酸(如Q和N)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)；X7优选为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。表4列出蛋白C的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:200-209)。其它蛋白C裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如L.Shen和B.Dahiback,ProteinC.Handbook of Proteolytic Enzymes,第1673-1677页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier,London,第2版,2004)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-Searchable Peptide Libraries forIdentifyingProtease CleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,NucleicAcids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS:The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALargeand AccurateCollection ofPeptidaseCleavagesinthe MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含蛋白C裂解位点。在此实施方案的一个方面，蛋白C裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:199，其中X1为碱性氨基酸(如K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3和X4独立地为酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5为酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为酰胺氨基酸(如Q和N)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)；X7为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如Q和N)、碱性氨基酸(如K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，蛋白C裂解位点包含序列SEQ ID NO:199，其中X1为K、R或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为D、E、Q、N或K；X3为P、L、T、Q、K或R；X4为G、I、S、N或K；X5为Q、N、K、F或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为F、S、N、Q、K或H；X7为L、I、T、K、D、E、Q或N。在此实施方案的其它方面，蛋白C裂解位点包含例如SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:209。
本说明书的多个方面部分地公开纤溶酶原裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“纤溶酶原裂解位点”是指足以达成在适于纤溶酶原蛋白酶活性的条件下由纤溶酶原在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由纤溶酶原裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但纤溶酶原裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO:210)，其中X1优选为带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2优选为酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4优选为带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5优选为带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为任何氨基酸；X7优选为H、F、Y、R、不带电荷氨基酸(如C、S和T)、脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。表4列出纤溶酶原的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:211-240)。其它纤溶酶原裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-Searehable PeptideLibrariesforIdentifying Protease CleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALargeandAccurate Collection ofPeptidaseCleavagesinthe MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含纤溶酶原裂解位点。在此实施方案的一个方面，纤溶酶原裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:211，其中X1为带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5为带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为任何氨基酸；X7为H、F、Y、R、不带电荷氨基酸(如C、S和T)、脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，纤溶酶原裂解位点包含序列SEQ ID NO:211，其中X1为K、R、S、T、A、G、L或P；X2为D、E、Q、N、K、R、S、T、A、G、I或L；X3为N、Q、S、F、Y、A或L；X4为K、R、S、A、G、L或V；X5为K、R、N、S、F、Y、A、I、L、P或V；X6为K、R、N、S、F、Y、A、G、L、P或V；X7为R、S、T、F、Y、A、G、I、L或P。在此实施方案的其它方面，纤溶酶原裂解位点包含例如SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239或SEQ ID NO:240。
本说明书的多个方面部分地公开基质金属蛋白酶-2裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“基质金属蛋白酶-2裂解位点”或“MMP-2裂解位点”是指足以达成在适于MMP-2蛋白酶活性的条件下由MMP-2在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由MMP-2裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但MMP-2裂解位点的一般化共有序列为X1(P/A/V/L/I)X2X3*(V/L/I/F/Q)X4X5X6(SEQ ID NO:241)，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6为任何氨基酸。表4列出MMP-2的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:242-273)。其它MMP-2裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-SearchablePeptideLibraries forIdentifying ProteaseCeavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidase Database,NucleicAcids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS:The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALargeandAccurateCollection ofPeptidaseCleavagesinthe MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含基质金属蛋白酶-2裂解位点。在此实施方案的一个方面，基质金属蛋白酶-2裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:241，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，基质金属蛋白酶-2裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:241，其中X1为酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为酸性氨基酸(如D和E)、碱性氨基酸(如K和R)、酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为H、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为碱性氨基酸(如K和R)、酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5为酸性氨基酸(如D和E)、碱性氨基酸(如K和R)、酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为酸性氨基酸(如D和E)、碱性氨基酸(如K和R)、酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，基质金属蛋白酶-2裂解位点包含序列SEQ ID NO:241，其中X1为G、P、A、V、L、I、S、T、E或Q；X2为G、A、L、S、N、Q、W或K；X3为G、P、A、S、Q、D、E或H；X4为G、A、V、L、I、F、S、T、Q或K；X5为G、A、V、S、T、Q或K；X6为G、P、A、V、L、I、S、T、D、E、K、N或Q。在此实施方案的另一方面，基质金属蛋白酶-2裂解位点包含序列SEQ ID NO:241，其中X1为G、A或L或Q；X2为G、A或S；X3为G、A、S或N；X4为A、V、L、I或K；X5为G、A或S；X6为G、P、A、V、L或D。在此实施方案的其它方面，基质金属蛋白酶-2裂解位点包含例如SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267、SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272或SEQ ID NO:273。
本说明书的多个方面部分地公开基质金属蛋白酶-9裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“基质金属蛋白酶-9裂解位点”或“MMP-2裂解位点”是指足以达成在适于MMP-9蛋白酶活性的条件下由MMP-9在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由MMP-9裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但MMP-9裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3X4*X5X6X7X8(SEQ IDNO:274)，其中X1优选为F、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2优选为F、Y、S、T、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为F、Y、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为任何氨基酸；X5优选为S、T、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为任何氨基酸；X7为任何氨基酸；X8优选为F、Y、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。表4列出MMP-9的示例性参考裂解位点(SEQID NO:275-319)。其它MMP-9裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如S.L.Kridel等,Substrate HydrolysisbyMatrix Metalloproteinase-9,J.Biol.Chem.276:20572-20578(2001)；E.Y Zhen等,CharacterizationofMetalloproteaseCleavage ProductsofHuman ArticularCartilage,Arthritis Rheum.58:2420-2431(2008)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived,Database-SearchablePeptideLibrariesfor Identifying ProteaseCleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,NucleicAcids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALarge and AccurateCollectionof PeptidaseCleavages in the MEROPSDatabase,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含基质金属蛋白酶-9裂解位点。在此实施方案的一个方面，基质金属蛋白酶-9裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:274，其中X1为F、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为F、Y、S、T、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为F、Y、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为任何氨基酸；X5为S、T、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为任何氨基酸；X7为任何氨基酸；X8为F、Y、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，基质金属蛋白酶-9裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:274，其中X1为G、V、L、I、F、S、Q、K或R；X2为P、A、V、L、I或S；X3为G、P、A、V、L、S、Q、E、K或R；X4为G、P、A、V、L、F、S、N、E或K；X5为A、V、L、I、M、F,S、Q或K；X6为P、A、V、L、I、S、T、Q、E、K或R；X7为G、A、V、L、S或T；X8为G、P、A、V、L、F、T、D、E、K或R。在此实施方案的另一方面，基质金属蛋白酶-9裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:274，其中X1为G或L；X2为P、A或V；X3为P、A、R、K或S；X4为G；X5为A、V、L或I；X6为T、Q、K或R；X7为G、A或S；X8为G、P、A、V或E。在此实施方案的其它方面，基质金属蛋白酶-9裂解位点包含例如SEQID NO:275、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280、SEQ ID NO:281、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:305、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:309、SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:311、SEQ ID NO:312、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:318或SEQ ID NO:319。
本说明书的多个方面部分地公开弗林蛋白酶裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“弗林蛋白酶裂解位点”是指足以达成在适于弗林蛋白酶蛋白酶活性的条件下由弗林蛋白酶在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由弗林蛋白酶裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但弗林蛋白酶裂解位点的一般化共有序列为(R/I/A)X1(R/K/A/P)R*X2*X3X4X5(SEQ ID NO:320)，其中X1、X2、X3、X4和X5为任何氨基酸。表4列出弗林蛋白酶的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:321-346)。其它弗林蛋白酶裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如A.Basak等,Implication ofthe Proprotein Convertases Furin,PC5And PC7intheCleavage ofSurface Glycoproteins ofHong Kong，Ebolaand RespiratorySyncytialViruses:AComparativeAnalysiswithFluorogenicPeptides,Biochem.J.353:537-545(2001)；O.Bader等,ProcessingofPredictedSubstratesof Fungal Kex2Proteinases from Candida albicans,Cglabrata,Saccharomyces cerevisiaeandPichiapastoris,BMC Microbiol.8:116(2008)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying ProteaseCleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidaseDatabase,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；NeilD.Rawlings等,ALargeandAccurate CollectionofPeptidaseCleavagesinthe MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含弗林蛋白酶裂解位点。在此实施方案的一个方面，弗林蛋白酶裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:320，其中X1、X2、X3、X4和X5为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，弗林蛋白酶裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:320，其中X1为F、S、T、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为G、P、M、F、Y、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)或不带电荷氨基酸(如C、S和T)；X3为G、P、A、V、L、I、F、W、S、T、N、Q、D、H、K或R；X4为F、Y、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X5为F、Y、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，弗林蛋白酶裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:320，其中X1为K、R、S或T；X2为D、E、S、A或G；X3为A、V、L或I；且X4为S、G、D、E或R；且X5为G、P、A、S、T、Q、D或E。在此实施方案的其它方面，弗林蛋白酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:323、SEQ ID NO:324、SEQ ID NO:325、SEQ ID NO:326、SEQ ID NO:327、SEQ ID NO:328、SEQ ID NO:329、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:334、SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345或SEQ ID NO:346。
本说明书的多个方面部分地公开u-纤溶酶原活化因子裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“u-纤溶酶原活化因子裂解位点”或“u-PA裂解位点”是指足以达成在适于u-PA蛋白酶活性的条件下由u-PA在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由u-纤溶酶原活化因子裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但u-PA裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)*X4*X5X6X7(SEQ ID NO:347)，其中X1为任何氨基酸；X2优选为不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为任何氨基酸；X5优选为碱性氨基酸(如K和R)、芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6优选为不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X7为任何氨基酸。表4列出u-PA的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:347-368)。其它u-PA裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如V. Ellis,u-PlasminogenActivator.Handbook of Proteolytic Enzymes,第1677-1683页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier,London,第2版,2004)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-SearchablePeptide Libraries forIdentifyingProtease CleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,NucleicAcids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS:The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALargeand AccurateCollection ofPeptidaseCleavagesinthe MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含u-纤溶酶原活化因子裂解位点。在此实施方案的一个方面，u-纤溶酶原活化因子裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:347，其中X1为任何氨基酸；X2为不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为任何氨基酸；X5为碱性氨基酸(如K和R)、芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为不带电荷氨基酸(如C、S和T)、芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X7为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，u-纤溶酶原活化因子裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:347，其中X1为P、A、L、S、T、C、N或R；X2为G、P、L、Y、S或T；X3为G、A、S或N；且X4为G、A、V、I、Y、S或R；X5为P、V、L、F或R；X6为G、A、V、Y、S或T；且X7为G、V、L、F、Y、N或H。在此实施方案的另一方面，u-纤溶酶原活化因子裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:347，其中X1为P、A、L、S、T、C、N或R；X2为G、Y或S；X3为G或S；且X4为G、A、V、I、Y、S或R；X5为V或R；X6为T或Y；且X7为G、V、L、F、Y、N或H。在此实施方案的其它方面，u-纤溶酶原活化因子裂解位点包含例如SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:349、NO:350、SEQ ID NO:351、SEQID NO:352、SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:355或SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:361、SEQ ID NO:362、SEQ ID NO:363、SEQ ID NO:364、SEQ ID NO:365、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:367或SEQ ID NO:368。
本说明书的多个方面部分地公开t-纤溶酶原活化因子裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“t-纤溶酶原活化因子裂解位点”或“t-PA裂解位点”是指足以达成在适于t-PA蛋白酶活性的条件下由t-PA在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由t-PA裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但t-PA裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(R/K)*X4*X5X6X7(SEQ ID NO:369)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7为任何氨基酸。表4列出t-PA的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:370-373)。其它t-PA裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如H.R.Lijnen和D.Collen,t-PlasminogenActivator.Handbook of Proteolytic Enzymes,第1684-1689页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier,London,第2版,2004)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries forIdentifyingProteaseCleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：ThePeptidase Database,NucleicAcids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS:The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALargeandAccurateCollection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含t-纤溶酶原活化因子裂解位点。在此实施方案的一个方面，t-纤溶酶原活化因子裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:369，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，t-纤溶酶原活化因子裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:369，其中X1为酰胺氨基酸(如N和Q)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为酰胺氨基酸(如N和Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为酰胺氨基酸(如N和Q)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5为碱性氨基酸(如K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X7为酸性氨基酸(如D和E)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，t-纤溶酶原活化因子裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:369，其中X1为A、P、C或N；X2为A、L、P或Q；X3为G、L、S或F；X4为I、V、M或Y；X5为A、V或K；X6为G、V或P；且X7为G、L或D。在此实施方案的其它方面，t-纤溶酶原活化因子裂解位点包含例如SEQ ID NO:370、SEQ ID NO:371、SEQ ID NO:372或SEQ ID NO:373。
本说明书的多个方面部分地公开类胰蛋白酶-ε裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“类胰蛋白酶-ε裂解位点”或“Prosemin裂解位点”是指足以达成在适于类胰蛋白酶-ε蛋白酶活性的条件下由类胰蛋白酶-ε在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由类胰蛋白酶-ε裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但类胰蛋白酶-ε裂解位点的一般化共有序列为*(R/K)X1X2X3X4(D/E)(SEQ ID NO:374)，其中X1、X2、X3和X4独立地为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。表4列出类胰蛋白酶-ε的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:375-386)。其它类胰蛋白酶-ε裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying ProteaseCleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The PeptidaseDatabase,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；NeilD.Rawlings等,A Largeand A ccurate Collection of Peptidase Cleavagesin the MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含类胰蛋白酶-ε裂解位点。在此实施方案的一个方面，类胰蛋白酶-ε裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:374，其中X1、X2、X3和X4独立地为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，类胰蛋白酶-ε裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:374，其中X1为I或V；X2为I或V；X3为G或S；X4为G或S。在此实施方案的其它方面，类胰蛋白酶-ε裂解位点包含例如SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:379、SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385或SEQ ID NO:386。
本说明书的多个方面部分地公开小鼠肥大细胞蛋白酶-7裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“小鼠肥大细胞蛋白酶-7裂解位点”或“mMCP-7裂解位点”是指足以达成在适于mMCP-7蛋白酶活性的条件下由mMCP-7在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由mMCP-7裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但mMCP-7裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3(K/R)*X4X5X6X7(SEQ ID NO:387)，其中X1为任何氨基酸；X2优选为酰胺氨基酸(如N或Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X4、X5、X6、X7为任何氨基酸。表4列出mMMCP-7的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:388-391)。其它mMMCP-7裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable PeptideLibraries for Identifying ProteaseCleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALargeandAccurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含小鼠肥大细胞蛋白酶-7裂解位点。在此实施方案的一个方面，小鼠肥大细胞蛋白酶-7裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:387，其中X1为任何氨基酸；X2为酰胺氨基酸(如N或Q)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X4、X5、X6、X7独立地为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，小鼠肥大细胞蛋白酶-7裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:387，其中X1为任何氨基酸；X2为G、S或Q；X3为A、P或S；且X4、X5、X6、X7为任何氨基酸。在此实施方案的其它方面，小鼠肥大细胞蛋白酶-7裂解位点包含例如SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390或SEQ ID NO:391。
本说明书的多个方面部分地公开內皮素转化酶-1裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“內皮素转化酶-1裂解位点”或“ECE-1裂解位点”是指足以达成在适于ECE-1蛋白酶活性的条件下由ECE-1在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由ECE-1裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但ECE-1裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3X4*(F/L/I/V/Y)5X6X7(SEQ IDNO:392)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7为任何氨基酸。表4列出ECE-1的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:393-412)。其它ECE-1裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如K.Ahn和G. D.Johnson,Endothelin-Converting Enzyme-1.Handbookof Proteolytic Enzymes,第429-434页(A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编著;Elsevier,London,第2版,2004)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived,Database-Searchable PeptideLibraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALargeandAccurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含內皮素转化酶-1裂解位点。在此实施方案的一个方面，內皮素转化酶-1裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:392，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7独立地为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，內皮素转化酶-1裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:392，其中X1为G、P、Y、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)或不带电荷氨基酸(如C、S和T)；X2为F、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为S、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为S、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X5为F、W、S、C、N、E、带正电荷氨基酸(如H、K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为G、P、V、L、F、Y、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)或不带电荷氨基酸(如C、S和T)；且X7为P、A、V、L、M、F、Y、S、N、D或K。在此实施方案的另一方面，內皮素转化酶-1裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:392，其中X1为G、P、Y、C、D、K、R或H；X2为P、L、I、F、S、C、Q、D、R或H；X3为V、L、I、S、Q、K或R；X4为G、P、L、F、Y、W或R；X5为V、I、M、F、N、R或H；X6为P、L、F、T、E或H；且X7为P、V、L、F、S、N、D或K。在此实施方案的另一方面，內皮素转化酶-1裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:392，其中X1为G、D或H；X2为I或F；X3为V、I、S、Q或K；X4为P、F或W；X5为I、N、R或H；X6为L、T或H；且X7为P、S或D。在此实施方案的其它方面，內皮素转化酶-1裂解位点包含例如SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:395、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:407、SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411或SEQ ID NO:412。
本说明书的多个方面部分地公开凯尔血型蛋白裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“凯尔血型蛋白裂解位点”或“KBGP裂解位点”是指足以达成在适于KBGP蛋白酶活性的条件下由KBGP在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由KBGP裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但KBGP裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3X4*X5X6X7X8(SEQ ID NO:413)，其中X1优选为酸性氨基酸(如D和E)；X2优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4优选为芳香族氨基酸(如F、W和Y)；X5优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6优选为酰胺氨基酸(如N和Q)；X7为不带电荷氨基酸(如C、S和T)；X8优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。表4列出KBGP的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:414-415)。其它KBGP裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-Searchable PeptideLibraries for Identifying Protease Cleavage Sites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；Neil D.Rawlings等,ALargeandAccurateCollection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含凯尔血型蛋白裂解位点。在此实施方案的一个方面，凯尔血型蛋白裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:413，其中X1为酸性氨基酸(如D和E)；X2为T或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为芳香族氨基酸(如F、W和Y)；X5为T或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X6为酰胺氨基酸(如N和Q)；X7为不带电荷氨基酸(如C、S和T)或C-β支链氨基酸(如I、V或T)；X8为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，凯尔血型蛋白裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:413，其中X1为D；X2为I、V或T；X3为I、V或T；X4为W；X5为I、V或T；X6为N；X7为T；X8为P。在此实施方案的其它方面，凯尔血型蛋白裂解位点包含例如SEQ ID NO:414或SEQ ID NO:415。
本说明书的多个方面部分地公开组织蛋白酶L裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“组织蛋白酶L裂解位点”是指足以达成在适于组织蛋白酶L蛋白酶活性的条件下由组织蛋白酶L在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由组织蛋白酶L裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但组织蛋白酶L裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3X4*X5X6X7X8(SEQ ID NO:416)，其中X1优选为W、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为任何氨基酸；X3优选为L、V、F或Y；且X4、X5、X6、X7和X8为任何氨基酸。表4列出组织蛋白酶L的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:417-443)。其它组织蛋白酶L裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。参见例如J.C.Kelly等,Profiling of Calpain Activity with a SeriesofFRET-BasedSubstrates,Biochim.Biophys.Acta1794:1505-1509(2009)；O.Schilling和C.M.Overall,Proteome-Derived，Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying ProteaseCleavageSites,Nat.Biotechnol.26:685-694(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The Peptidase Database,Nucleic Acids Res.36(数据库专刊):D320-D325(2008)；Neil D.Rawlings等,MEROPS：The PeptidaseDatabase,Nucleic Acids Res.38(数据库专刊):D227-D233(2010)；NeilD.Rawlings等,A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavagesin the MEROPS Database,数据库付梓中(2010)，其各自全文以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含组织蛋白酶L裂解位点。在此实施方案的一个方面，组织蛋白酶L裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:416，其中X1为W、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)、带正电荷氨基酸(如H、K和R)、不带电荷氨基酸(如C、S和T)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X2为任何氨基酸；X3为L、V、F或Y；且X4、X5、X6、X7和X8为任何氨基酸。在此实施方案的另一方面，组织蛋白酶L裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:416，其中X1为G、P、A、L、Q、E或K；X2为芳香族氨基酸(如F、W和Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X3为L、V、F或Y；X4为G、A、F、T、Q、E、K或R；X5为G、A、S、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)或带正电荷氨基酸(如H、K和R)；X6为P、A、L、I、S、Q、酸性氨基酸(如D和E)或带正电荷氨基酸(如H、K和R)；X7为带正电荷氨基酸(如H、K和R)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X8为P、L、S、T、酸性氨基酸(如D和E)、酰胺氨基酸(如N和Q)或碱性氨基酸(如K和R)。在此实施方案的另一方面，组织蛋白酶L裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:416，其中X1为G、A、Q、E或K；X2为G、P、L或F；X3为L、V、F或Y；X4为G、A、F、T、Q、E、K或R；X5为A、S、Q、E、K或R；X6为P、A、L、I、S或E；X7为P、L或R；且X8为P、L、S或K。在此实施方案的其它方面，组织蛋白酶L裂解位点包含例如SEQ IDNO:417、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:419、SEQ ID NO:420、SEQID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428、SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:430、SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:440、SEQ ID NO:441、SEQ ID NO:442或SEQ ID NO:443。
本说明书的多个方面部分地公开PAR1裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“PAR1裂解位点”是指足以达成在适于PAR1蛋白酶活性的条件下由PAR1在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由PAR1裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但PAR1裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3X4(KR)X5(SEQID NO:444)，其中X1优选为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)；X2优选为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)或芳香族氨基酸(如F、H、W或Y)；X3优选为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)或芳香族氨基酸(如F、H、W或Y)；X4优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X5优选为酰胺氨基酸(如N和Q)或芳香族疏水性氨基酸(如F、W或Y)。表4列出PAR1的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:445-452)。其它PAR1裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含PAR1裂解位点。在此实施方案的一个方面，PAR1裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:444，其中X1为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)；X2为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)或芳香族氨基酸(如F、H、W或Y)；X3为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)或芳香族氨基酸(如F、H、W或Y)；X4为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X5为酰胺氨基酸(如N和Q)或芳香族疏水性氨基酸(如F、W或Y)。在此实施方案的另一方面，PAR1裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:444，其中X1为S、T或G；X2为F或Y；X3为L、P或F；X4为A、G、I或L；且X5为F或N。在此实施方案的其它方面，PAR1裂解位点包含例如SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:446、SEQID NO:447、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:450、SEQ ID NO:451或SEQ ID NO:452。
本说明书的多个方面部分地公开PAR2裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“PAR2裂解位点”是指足以达成在适于PAR2蛋白酶活性的条件下由PAR2在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由PAR2裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但PAR2裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3X4(KR)X5(SEQID NO:453)，其中X1优选为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)；X2优选为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)；X3优选为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)；X4优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X5优选为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)。表4列出PAR2的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:454-455)。其它PAR2裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含PAR2裂解位点。在此实施方案的一个方面，PAR2裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:453，其中X1为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)；X2为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)；X3为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)；X4为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X5为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)。在此实施方案的另一方面，PAR2裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:453，其中X1为S；X2为I或L；X3为I或L；X4为A或G；X5为L或V。在此实施方案的其它方面，PAR2裂解位点包含例如SEQ ID NO:454或SEQ ID NO:455。
本说明书的多个方面部分地公开PAR3裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“PAR3裂解位点”是指足以达成在适于PAR3蛋白酶活性的条件下由PAR3在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由PAR3裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但PAR3裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3X4X5X6(SEQ IDNO:456)，其中X1优选为小非极性氨基酸(如A、C、G、S和T)；X2优选为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)；X3优选为酰胺氨基酸(如N和Q)或碱性氨基酸(如K和R)；X4优选为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)；X5优选为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)或小极性氨基酸(如D、N或P)；且X6优选为酸性氨基酸(如D和E)或小极性氨基酸(如D、N或P)。表4列出PAR3的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:457-459)。其它PAR3裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含PAR3裂解位点。在此实施方案的一个方面，PAR3裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:456，其中X1为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)；X2为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)；X3为酰胺氨基酸(如N和Q)或碱性氨基酸(如K和R)；X4为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)；X5为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)或小极性氨基酸(如D、N或P)；且X6为酸性氨基酸(如D和E)或小极性氨基酸(如D、N或P)。在此实施方案的另一方面，PAR3裂解位点包含共有序列SEQ IDNO:456，其中X1为S或T；X2为F；X3为N或R；X4为A或G；X5为A、G或N且X6为P或E。在此实施方案的其它方面，PAR3裂解位点包含例如SEQ ID NO:457、SEQ ID NO:458或SEQ ID NO:459。
本说明书的多个方面部分地公开PAR4裂解位点作为失活裂解位点。如本文所用，术语“PAR4裂解位点”是指足以达成在适于PAR4蛋白酶活性的条件下由PAR4在易切断键处进行可检测蛋白水解的易切断键以及相邻识别元件或不相邻识别元件或两者。设想由PAR4裂解的任何氨基酸序列皆可适用于本说明书的多个方面。尽管已知例外情况，但PAR4裂解位点的一般化共有序列为X1X2X3X4(K/R/Q/F)X5(SEQ ID NO:460)，其中X1优选为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)；X2优选为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)或芳香族氨基酸(如F、H、W或Y)；X3优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4优选为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X5优选为碱性氨基酸(如K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W或Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。表4列出PAR4的示例性参考裂解位点(SEQ ID NO:461-478)。其它PAR4裂解位点在本领域中为熟知的或可通过常规方法确定。
因此，在一个实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含PAR4裂解位点。在此实施方案的一个方面，PAR4裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:460，其中X1为小非极性氨基酸(如A、C G、S和T)；X2为大非极性氨基酸(如F、I、L、M、V)或芳香族氨基酸(如F、H、W或Y)；X3为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；X4为脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)；且X5为碱性氨基酸(如K和R)、芳香族疏水性氨基酸(如F、W或Y)或脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在此实施方案的另一方面，PAR4裂解位点包含共有序列SEQ ID NO:460，其中X1为A、G、S或T；X2为F或Y；X3为A或P；X4为A或G；且X5为A、V、P、F、W、Y或K。在此实施方案的其它方面，PAR4裂解位点包含例如SEQ ID NO:461、SEQ ID NO:462、SEQ ID NO:463、SEQ ID NO:464、SEQ ID NO:465、SEQ ID NO:466、SEQ ID NO:467、SEQ ID NO:468、SEQ ID NO:469、SEQ ID NO:470、SEQ ID NO:471、SEQ ID NO:472、SEQ ID NO:473、SEQ ID NO:474、SEQ ID NO:475、SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:477或SEQ ID NO:478。
失活裂解位点的位置为受制于若干准则的关键方面。首先，失活裂解位点的置放不应大致上影响梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体使其靶细胞中毒的能力。如本文所用，关于中毒的术语“不大致上影响”是指本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体仍可执行梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体进入靶细胞且蛋白水解裂解靶底物所凭借的总体中毒机制且所述总体中毒机制涵盖梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体结合低或高亲和力受体复合物、毒素/受体复合物内化、轻链移位至细胞质中和酶促修饰靶底物。
在此实施方案的一个方面，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体使靶细胞中毒的程度可与相同或类似但未进行失活裂解位点修饰的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体相同。在此实施方案的其它方面，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体使靶细胞中毒的程度可为相同或类似但未进行失活裂解位点修饰的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的例如至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。在此实施方案的其它方面，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体使靶细胞中毒的程度可为相同或类似但未进行失活裂解位点修饰的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的例如至多50%、60%、70%、80%、90%或95%。
其次，失活裂解位点的置放应位于毒素或梭菌毒素嵌合体的表面暴露区处而非内部包埋在蛋白质内或由二级结构元件遮蔽。失活裂解位点的适当表面暴露有助于位点接近其相应蛋白酶，由此使得能够进行蛋白水解裂解。由其相应蛋白酶对失活裂解位点进行的蛋白水解裂解大致上使梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体使细胞中毒的能力失活。如本文所用，关于中毒的术语“大致上使…失活”是指本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体在失活裂解位点处进行裂解之后执行梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体进入靶细胞且蛋白水解裂解靶底物所凭借的总体中毒机制的能力降低且所述总体中毒机制涵盖梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体结合低或高亲和力受体复合物、毒素/受体复合物内化、轻链移位至细胞质中和酶促修饰靶底物。
在此实施方案的一个方面，相较于相同或类似但处于未蛋白水解裂解状态(即中毒裂解位点完整或未裂解)的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，在失活裂解位点处对本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体进行的蛋白水解裂解导致毒素完全不能使靶细胞中毒。在此实施方案的其它方面，相较于相同或类似但处于未蛋白水解裂解状态的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，在失活裂解位点处对本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体进行的蛋白水解裂解导致使靶细胞中毒的能力降低例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在此实施方案的其它方面，相较于相同或类似但处于未蛋白水解裂解状态的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，在失活裂解位点处对本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体进行的蛋白水解裂解导致使靶细胞中毒的能力降低例如至多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
在本说明书的一个方面，失活裂解位点位于失活裂解位点区内。如本文所用，术语“失活裂解位点区”是指梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的可进行修饰以含有失活裂解位点的氨基酸序列，因为所述修饰将不大致上破坏蛋白质使靶细胞中毒的能力；且在暴露于其同源蛋白酶后，失活裂解位点将被裂解并大致上使梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体失活。失活裂解位点的位置可为失活裂解位点区内的任何地方，附带条件为所述位置将不大致上影响梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体使靶细胞中毒的能力；且在暴露于其同源蛋白酶后，失活裂解位点的裂解将大致上使梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体失活。表5列出适合与本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体一起使用的示例性失活裂解位点区。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的多个方面，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。
在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸462-496；SEQ ID NO:3的氨基酸458-492；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸464-487；SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸463-496；SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸458-491；SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸434-467；SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸453-486；SEQ IDNO:21的氨基酸458-491；SEQ ID NO:22的氨基酸475-508；SEQ IDNO:23的氨基酸443-476；或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸434-467。
在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸618-634；SEQ ID NO:3的氨基酸614-630；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸605-621；SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸613-629；SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸609-625；SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸587-603；SEQ IDNO:18的氨基酸604-620；SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸605-621；SEQ ID NO:21的氨基酸610-626；SEQ ID NO:22的氨基酸627-643；SEQ ID NO:23的氨基酸596-612；或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸587-603。
Figure BDA00002756375801841
Figure BDA00002756375801851
在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸638-651；SEQ ID NO:3的氨基酸634-647；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸625-638；SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸633-646；SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸629-642；SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸607-620；SEQ IDNO:18的氨基酸624-637；SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸625-638；SEQ ID NO:21的氨基酸630-643；SEQ ID NO:22的氨基酸647-660；SEQ ID NO:23的氨基酸616-629；或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸607-620。
在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸665-687；SEQ ID NO:3的氨基酸661-683；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸652-674；SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸660-682；SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸656-678；SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸634-659；SEQ IDNO:18的氨基酸651-676；SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸652-677；SEQ ID NO:21的氨基酸657-679；SEQ ID NO:22的氨基酸674-696；SEQ ID NO:23的氨基酸643-668；或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸634-659。
在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸752-765；SEQ ID NO:3的氨基酸748-761；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸739-752；SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸747-760；SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸743-756；SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸724-739；SEQ IDNO:18的氨基酸741-756；SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸742-757；SEQ ID NO:21的氨基酸744-757；SEQ ID NO:22的氨基酸761-774；SEQ ID NO:23的氨基酸733-748；或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸724-739。
在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸826-835；SEQ ID NO:3的氨基酸824-831；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸813-824；SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸821-830；SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸817-826；SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸800-809；SEQ IDNO:18的氨基酸817-826；SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸818-827；SEQ ID NO:21的氨基酸818-827；SEQ ID NO:22的氨基酸835-844；SEQ ID NO:23的氨基酸809-819；或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸800-809。
在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸844-863；SEQ ID NO:3的氨基酸840-859；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸831-850；SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸839-858；SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸835-854；SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸818-837；SEQ IDNO:18的氨基酸835-854；SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸836-855；SEQ ID NO:21的氨基酸836-855；SEQ ID NO:22的氨基酸854-871；SEQ ID NO:23的氨基酸828-847；或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸818-837。
在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的氨基酸871-895；SEQ ID NO:3的氨基酸867-891；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸858-882；SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸866-890；SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸862-886；SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸845-869；SEQ IDNO:18的氨基酸862-886；SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸863-887；SEQ ID NO:21的氨基酸863-887；SEQ ID NO:22的氨基酸879-903；SEQ ID NO:23的氨基酸855-879；或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸845-869。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的BoNT/A或BoNT/A嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的BoNT/A或BoNT/A嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸462-496、618-634、638-651、665-687、752-765、826-835、844-863或871-895；或包含SEQ ID NO:3的氨基酸458-492、614-630、634-647、665-687、748-761、822-831、840-859或867-891。在此实施方案的其它方面，包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点的BoNT/A由SEQ ID NO:530、SEQ ID NO:532、SEQ ID NO:534或SEQ ID NO:536编码。在此实施方案的其它方面，包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点的BoNT/A包含SEQ ID NO:531、SEQ ID NO:533、SEQ ID NO:535或SEQ ID NO:537。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的BoNT/B或BoNT/B嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的BoNT/B或BoNT/B嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸464-487、605-621、625-638、652-674、739-752、813-824、831-850或858-882。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的BoNT/C1或BoNT/C1嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的BoNT/C1或BoNT/C1嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸463-496、613-629、633-646、660-682、747-760、821-830、839-858或866-890。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的BoNT/D或BoNT/D嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的BoNT/D或BoNT/D嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸458-491、609-625、629-642、656-678、743-756、817-826、835-854或862-886。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的BoNT/E或BoNT/E嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的BoNT/E或BoNT/E嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQID NO:17的氨基酸434-467、587-603、607-620、634-659、724-739、800-809、818-837或845-869。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的BoNT/F或BoNT/F嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的BoNT/F或BoNT/F嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:18的氨基酸453-486、604-620、624-637、651-676、741-756、817-826、835-854或862-886；或包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸453-486、605-621、625-638、652-677、742-757、818-827、836-855或863-887。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的BoNT/G或BoNT/G嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的BoNT/G或BoNT/G嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:21的氨基酸458-491、610-626、630-643、657-679、744-757、818-827、836-855或863-887。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的TeNT或TeNT嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的TeNT或TeNT嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:22的氨基酸475-508、627-643、647-660、674-696、761-774、835-844、854-871或879-903。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的BaNT或BaNT嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的BaNT或BaNT嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:23的氨基酸443-476、596-612、616-629、643-668、733-748、809-819、828-847或855-879。
在此实施方案的另一方面，本说明书中公开的BuNT或BuNT嵌合体包含位于来自移位结构域或HCN亚结构域的失活裂解位点区内的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，本说明书中公开的BuNT或BuNT嵌合体包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸434-467、587-603、607-620、634-659、724-739、800-809、818-837或845-869。
在本说明书的一个方面，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大于相同或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限。换句话说，相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，添加失活裂解位点会增加梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限。
因此，在一个实施方案中，相对于相同或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限较大。在此实施方案的多个方面，相对于相同或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、至少200%、210%、至少220%、至少230%、至少240%、至少250%、至少260%、至少270%、至少280%、至少290%或至少300%。在此实施方案的其它方面，相对于相同或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大例如至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多100%、110%、至多120%、至多130%、至多140%、至多150%、至多160%、至多170%、至多180%、至多190%、至多200%、210%、至多220%、至多230%、至多240%、至多250%、至多260%、至多270%、至多280%、至多290%或至多300%。在此实施方案的其它方面，相对于相同或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大例如约10%至约300%、约20%至约300%、约30%至约300%、约40%至约300%、约50%至约300%、约60%至约300%、约70%至约300%、约80%至约300%、约90%至约300%或约100%至约300%。
在实施方案的其它方面，相对于相同或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大例如至少1倍、至少1倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在实施方案的其它方面，相对于相同或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大例如至少1倍、至多1倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍、至多9倍或至多10倍。在此实施方案的其它方面，包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大例如约1倍至约10倍、约1倍至约9倍、约1倍至约8倍、约1倍至约7倍、约1倍至约6倍、约1倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍或约2倍至约5倍。
在另一实施方案中，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，会增加梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限的失活裂解位点添加。在此实施方案的多个方面，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，会使梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、至少200%、210%、至少220%、至少230%、至少240%、至少250%、至少260%、至少270%、至少280%、至少290%或至少300%的失活裂解位点添加。在此实施方案的其它方面，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，会使梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加例如至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多100%、110%、至多120%、至多130%、至多140%、至多150%、至多160%、至多170%、至多180%、至多190%、至多200%、210%、至多220%、至多230%、至多240%、至多250%、至多260%、至多270%、至多280%、至多290%或至多300%的失活裂解位点添加。在此实施方案的其它方面，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，会使梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加例如约10%至约300%、约20%至约300%、约30%至约300%、约40%至约300%、约50%至约300%、约60%至约300%、约70%至约300%、约80%至约300%、约90%至约300%或约100%至约300%的失活裂解位点添加。
在此实施方案的其它方面，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，会使梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加例如至少1倍、至少1倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的失活裂解位点添加。在此实施方案的其它方面，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，会使梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加例如至多1倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍、至多9倍或至多10倍的失活裂解位点添加。在此实施方案的其它方面，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含相对于相同或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，会使梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加例如约1倍至约10倍、约1倍至约9倍、约1倍至约8倍、约1倍至约7倍、约1倍至约6倍、约1倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍或约2倍至约5倍的失活裂解位点添加。
在另一实施方案中，失活裂解位点区可进行修饰以包括单一失活裂解位点。在另一实施方案中，失活裂解位点区可进行修饰以包括多个失活裂解位点裂解位点。在此实施方案的多个方面，失活裂解位点裂解位点区可包含例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，失活裂解位点裂解位点区可包含例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，失活裂解位点裂解位点区可包含例如2-10个失活裂解位点、2-8个失活裂解位点、2-6个失活裂解位点、2-4个失活裂解位点、2-3个失活裂解位点、3-9个失活裂解位点、3-7个失活裂解位点、3-5个失活裂解位点或3-4个失活裂解位点。
在另一实施方案中，失活裂解位点区可进行修饰以包括仅一种类型的失活裂解位点，诸如凝血酶裂解位点。在另一实施方案中，失活裂解位点区可进行修饰以包括多种不同类型的失活裂解位点，诸如凝血酶裂解位点、因子Xa裂解位点、MMP-2裂解位点和MMP-9裂解位点。在此实施方案的多个方面，失活裂解位点区可包含例如至少2、3、4或5种不同类型的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，失活裂解位点区可包含例如至多2、3、4或5种不同类型的失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，失活裂解位点区可包含例如2-5种不同类型的失活裂解位点、2-4种不同类型的失活裂解位点、2-3种不同类型的失活裂解位点、3-5种不同类型的失活裂解位点或3-4种不同类型的失活裂解位点。
修饰失活裂解位点区以包括失活裂解位点可通过改变失活裂解位点区内的至少一个氨基酸来达成。氨基酸改变的非限制性实例包括缺失氨基酸、添加氨基酸或用不同氨基酸取代原始氨基酸。在此实施方案的多个方面，通过改变失活裂解位点区内例如至少1、2、3、4或5个氨基酸来修饰失活裂解位点区以包括失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，通过改变失活裂解位点区内例如至多1、2、3、4或5个氨基酸来修饰失活裂解位点区以包括失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，通过改变例如失活裂解位点区内1-5个氨基酸、失活裂解位点区内1-4个氨基酸、失活裂解位点区内1-3个氨基酸、失活裂解位点区内1-2个氨基酸、失活裂解位点区内2-5个氨基酸、失活裂解位点区内2-4个氨基酸、失活裂解位点区内2-3个氨基酸、失活裂解位点区内3-5个氨基酸或失活裂解位点区内4-5个氨基酸来修饰失活裂解位点区以包括失活裂解位点。
在此实施方案的多个方面，通过缺失、添加、取代或其任何组合失活裂解位点区内例如至少1、2、3、4或5个氨基酸来修饰失活裂解位点区以包括失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，通过缺失、添加、取代或其任何组合失活裂解位点区内例如至多1、2、3、4或5个氨基酸来修饰失活裂解位点区以包括失活裂解位点。在此实施方案的其它方面，通过缺失、添加、取代或其任何组合例如失活裂解位点区内1-5个氨基酸、失活裂解位点区内1-4个氨基酸、失活裂解位点区内1-3个氨基酸、失活裂解位点区内1-2个氨基酸、失活裂解位点区内2-5个氨基酸、失活裂解位点区内2-4个氨基酸、失活裂解位点区内2-3个氨基酸、失活裂解位点区内3-5个氨基酸或失活裂解位点区内4-5个氨基酸来修饰失活裂解位点区以包括失活裂解位点。
修饰失活裂解位点区以包括失活裂解位点可使用本领域技术人员已知的标准诱变程序来达成。诱变程序以及充分表征的试剂、条件和方案的非限制性实例可容易地从包括但不限于BDBiosciences-Clontech,Palo Alto,CA；BD Biosciences Pharmingen,SanDiego,CA；Invitrogen公司,Carlsbad,CA；QIAGEN公司,Valencia,CA；和Stratagene,La Jolla,CA在内的商业供应商获得。这些方案是在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
如上所提及，本说明书中公开的梭菌毒素和梭菌毒素嵌合体翻译成单链多肽，其随后通过蛋白水解断裂在二硫环区内被裂解。此翻译后加工产生由单一二硫键和非共价相互作用保持在一起的双链分子。二硫环区内的蛋白水解断裂可通过使用天然存在于双链环区内的内源性蛋白酶裂解位点或通过工程改造双链环区以包含外源性蛋白酶裂解位点来达成。
本说明书的多个方面部分地公开双链环区。如本文所用，术语“双链环区”是指梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的侧接有半胱氨酸氨基酸且含有用于将梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的单链形式转化成其双链形式的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列(表6)。双链环区的非限制性实例包括BoNT/A的包含SEQ ID NO:1的氨基酸430-454的双链环区；BoNT/B的包含SEQ ID NO:2的氨基酸437-446的双链环区；BoNT/C1的包含SEQ ID NO:3的氨基酸437-453的双链环区；BoNT/D的包含SEQ ID NO:4的氨基酸437-450的双链环区；BoNT/E的包含SEQ ID NO:5的氨基酸412-426的双链环区；BoNT/F的包含SEQ ID NO:6的氨基酸429-445的双链环区；BoNT/G的包含SEQ IDNO:7的氨基酸436-450的双链环区；和TeNT的包含SEQ ID NO:8的氨基酸439-467的双链环区(表6)。
Figure BDA00002756375801951
Figure BDA00002756375801961
因此，在一个实施方案中，双链环区包含梭菌毒素双链环区。在此实施方案的多个方面，双链环区包含例如BoNT/A双链环区、BoNT/B双链环区、BoNT/C1双链环区、BoNT/D双链环区、BoNT/E双链环区、BoNT/F双链环区、BoNT/G双链环区、TeNT双链环区、BaNT双链环区或BuNT双链环区。在此实施方案的其它方面，双链环区包含例如包含SEQ ID NO:1的氨基酸430-454的BoNT/A双链环区；包含SEQ ID NO:2的氨基酸437-446的BoNT/B双链环区；包含SEQ ID NO:3的氨基酸437-453的BoNT/C1双链环区；包含SEQID NO:4的氨基酸437-450的BoNT/D双链环区；包含SEQ ID NO:5的氨基酸412-426的BoNT/E双链环区；包含SEQ ID NO:6的氨基酸429-445的BoNT/F双链环区；包含SEQ ID NO:7的氨基酸436-450的BoNT/G双链环区；或包含SEQ ID NO:8的氨基酸439-467的TeNT双链环区；包含SEQ ID NO:9的氨基酸421-435的BaNT双链环区；或包含SEQ ID NO:10的氨基酸412-426的BuNT双链环区。
本说明书的多个方面部分地公开内源性双链环蛋白酶裂解位点。如本文所用，术语“内源性双链环蛋白酶裂解位点”与“天然存在的双链环蛋白酶裂解位点”同义且表示见于天然存在的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的双链环区内的天然存在的蛋白酶裂解位点且包括但不限于天然存在的梭菌毒素双链环蛋白酶裂解位点变异体，诸如梭菌毒素双链环蛋白酶裂解位点同工型和梭菌毒素双链环蛋白酶裂解位点亚型。内源性蛋白酶裂解位点的非限制性实例包括例如BoNT/A双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/B双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/C1双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/D双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/E双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/F双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/G双链环蛋白酶裂解位点和TeNT双链环蛋白酶裂解位点。
尽管蛋白酶的身份当前未知，但已确定许多梭菌毒素的双链环蛋白酶裂解位点。在BoNT中，在K448-A449处裂解会将BoNT/A的单一多肽形式转化成双链形式；在K441-A442处裂解会将BoNT/B的单一多肽形式转化成双链形式；在K449-T450处裂解会将BoNT/C1的单一多肽形式转化成双链形式；在R445-D446处裂解会将BoNT/D的单一多肽形式转化成双链形式；在R422-K423处裂解会将BoNT/E的单一多肽形式转化成双链形式；在K439-A440处裂解会将BoNT/F的单一多肽形式转化成双链形式；且在K446-S447处裂解会将BoNT/G的单一多肽形式转化成双链形式。在A457-S458处蛋白水解裂解TeNT的单一多肽形式会产生双链形式。在K431-N432处蛋白水解裂解BaNT的单一多肽形式会产生双链形式。在R422-K423处蛋白水解裂解BuNT的单一多肽形式会产生双链形式。所述双链环蛋白酶裂解位点以融合蛋白形式可操作地连接于梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。然而，也应注意双链环内的其它裂解位点也似乎被裂解，从而导致产生所损失的小肽片段。作为一个非限制性实例，BoNT/A单链多肽裂解最终导致损失双链环内含10个氨基酸的片段。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含包括内源性双链环蛋白酶裂解位点的双链环区。在此实施方案的多个方面，位于双链环区内的内源性双链环蛋白酶裂解位点包含例如BoNT/A双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/B双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/C1双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/D双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/E双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/F双链环蛋白酶裂解位点、BoNT/G双链环蛋白酶裂解位点、TeNT双链环蛋白酶裂解位点、BaNT双链环蛋白酶裂解位点或BuNT双链环蛋白酶裂解位点。在此实施方案的其它方面，位于双链环区内的内源性双链环蛋白酶裂解位点包含例如BoNT/A的包含SEQ ID NO:1的氨基酸430-454的双链环区；BoNT/B的包含SEQ ID NO:2的氨基酸437-446的双链环区；BoNT/C1的包含SEQ ID NO:3的氨基酸437-453的双链环区；BoNT/D的包含SEQ ID NO:4的氨基酸437-450的双链环区；BoNT/E的包含SEQ ID NO:5的氨基酸412-426的双链环区；BoNT/F的包含SEQ ID NO:6的氨基酸429-445的双链环区；BoNT/G的包含SEQ IDNO:7的氨基酸436-450的双链环区；或TeNT的包含SEQ ID NO:8的氨基酸439-467的双链环区；BaNT的包含SEQ ID NO:9的氨基酸421-435的双链环区；或BuNT的包含SEQ ID NO:10的氨基酸412-426的双链环区。
本说明书的多个方面部分地公开外源性蛋白酶裂解位点。如本文所用，术语“外源性蛋白酶裂解位点”与“工程改造的蛋白酶裂解位点”、“非天然存在的蛋白酶裂解位点”或“非天然蛋白酶裂解位点”同义且表示通常不存在于来自天然存在的梭菌毒素的双链环区中的蛋白酶裂解位点。双链环区内的所述工程改造的或外源性蛋白酶裂解位点用于将本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的单链多肽形式转化成其双链形式。设想任何以及所有外源性蛋白酶裂解位点皆可用于将梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的单链多肽形式转化成其适用于实施本说明书的多个方面的活性双链形式。外源性蛋白酶裂解位点的非限制性实例包括例如植物木瓜蛋白酶(papain)裂解位点、昆虫木瓜蛋白酶裂解位点、甲壳动物木瓜蛋白酶裂解位点、肠激酶裂解位点、人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点、人肠病毒3C蛋白酶裂解位点、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶裂解位点、烟草叶脉斑点病毒(TVMV)裂解位点、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解位点、羟胺裂解位点或卡斯帕酶(Caspase)3裂解位点。位于双链环内的工程改造的蛋白酶裂解位点描述于例如Dolly等,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利7,419,676；Dolly等,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利7,422,877；Steward等,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利公布2009/0069238；Steward等,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利公布2008/0032930；Steward等,Activatable RecombinantNeurotoxins,美国专利公布2009/0018081；Steward等,ActivatableRecombinant Neurotoxins,美国专利公布2009/0005313；Steward等,Activatable Recombinant Neurotoxins,美国专利公布2009/0004224中；所述专利各自据此全文以引用的方式并入本文。
设想任何以及所有长度的外源性蛋白酶裂解位点皆可适用于本说明书的多个方面，附带条件为外源性蛋白酶裂解位点可由其相应蛋白酶裂解。因此，在此实施方案的多个方面，外源性蛋白酶裂解位点的长度可为例如至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50个或至少60个氨基酸；或至多6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50个或至少60个氨基酸。
在一个实施方案中，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体包含包括外源性蛋白酶裂解位点的双链环区。在此实施方案的多个方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如植物木瓜蛋白酶裂解位点、昆虫木瓜蛋白酶裂解位点、甲壳动物木瓜蛋白酶裂解位点、非人肠激酶蛋白酶裂解位点、烟草蚀刻病毒蛋白酶裂解位点、烟草叶脉斑点病毒蛋白酶裂解位点、人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点、人肠病毒3C蛋白酶裂解位点、枯草杆菌蛋白酶裂解位点、羟胺裂解位点、SUMO/ULP-1蛋白酶裂解位点和非人卡斯帕酶3裂解位点。
在此实施方案的一个方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如非人肠激酶裂解位点。在实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如牛肠激酶蛋白酶裂解位点。在实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:480。
在此实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如烟草蚀刻病毒蛋白酶裂解。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如共有序列E X1X2YX3Q*G(SEQ ID NO:481)或E X1X2Y X3Q*S(SEQ ID NO:482)，其中X1、X2和X3为任何氨基酸。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:483、SEQ ID NO:484、SEQ ID NO:485、SEQ ID NO:486、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:488、SEQ ID NO:489、SEQ ID NO:490、SEQ ID NO:491或SEQ IDNO:492。
在此实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如烟草叶脉斑点病毒蛋白酶裂解位点。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如共有序列X1X2VRFQ*G(SEQ ID NO:493)或X1X2VRFQ*S(SEQ ID NO:494)，其中X1和X2独立地为任何氨基酸。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:495、SEQID NO:496、SEQ ID NO:497或SEQ ID NO:498。
在此实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如人鼻病毒3C蛋白酶裂解位点。在实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如共有序列X1X2LFQ*GP(SEQ ID NO:499)，其中X1为任何氨基酸，以酸性氨基酸(如D或E)为优选；且X2优选为S、T和脂肪族疏水性氨基酸(如G、P、A、V、L、I和M)。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:502、SEQ ID NO:503、SEQ ID NO:504或SEQ ID NO:505。在实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如由裂解的人鼻病毒3C蛋白酶。
在此实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如枯草杆菌蛋白酶裂解位点。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如共有序列X1X2X3X4H*Y(SEQ ID NO:506)或X1X2X3X4YH*(SEQ ID NO:507)，其中X1、X2、X3和X4独立地为任何氨基酸。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:508、SEQ ID NO:509或SEQ ID NO:510。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如由
Figure BDA00002756375802011
裂解的枯草杆菌蛋白酶裂解位点。
在此实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如羟胺裂解位点。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如二肽N*G。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:511或SEQ ID NO:512。
在此实施方案的另一方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如SUMO/ULP-1蛋白酶裂解位点。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如共有序列GG*X1X2X3(SEQ ID NO:513)，其中X1、X2和X3独立地为任何氨基酸。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:514。
在此实施方案的一个方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如卡斯帕酶3裂解位点。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如非人卡斯帕酶3蛋白酶裂解位点。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如共有序列DX1X2D*X3(SEQ ID NO:515)，其中X1为任何氨基酸，以酸性氨基酸(如D和E)为优选，X2为任何氨基酸且X3为氨基酸，以小非极性氨基酸(如A、C、G、S和T)为优选。在实施方案的其它方面，位于双链环区内的外源性蛋白酶裂解位点包含例如SEQ ID NO:516、SEQ ID NO:517、SEQ ID NO:518、SEQ ID NO:519、SEQ ID NO:520或SEQ ID NO:521。
双链环区可进行修饰以使天然存在的双链环蛋白酶裂解位点置换为外源性蛋白酶裂解位点。在此修饰中，使天然存在的双链环蛋白酶裂解位点不可操作且因此不能由其蛋白酶裂解。仅外源性蛋白酶裂解位点可由其相应外源性蛋白酶裂解。在此类型的修饰中，外源性蛋白酶位点以融合蛋白形式可操作地连接于梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体且位点可由其相应外源性蛋白酶裂解。用外源性蛋白酶裂解位点置换内源性双链环蛋白酶裂解位点可为位点取代，其中在接近内源性位点的裂解位点位置的位置处对外源性位点进行工程改造。用外源性蛋白酶裂解位点置换内源性双链环蛋白酶裂解位点可为添加外源性位点，其中在不同于内源性位点的裂解位点位置的位置处对外源性位点进行工程改造，从而使内源性位点被工程改造成不可操作。蛋白酶裂解位点的位置和种类可为关键的，因为某些结合结构域需要游离氨基端或羧基端氨基酸。举例来说，当将肽结合结构域置放在两个其它结构域之间时，例如参见图4，选择蛋白酶裂解位点的准则可为裂解其位点的蛋白酶是否留下平切口，从而暴露结合结构域的为结合结构域选择性结合其受体所必需的游离氨基端或羧基端。
可通过改变侧接由天然存在的双链环蛋白酶裂解的肽键的两个氨基酸中的至少一者来使天然存在的蛋白酶裂解位点不可操作。可进行更广泛的改变，附带条件为双链环区的两个半胱氨酸残基保持完整且区仍然可形成二硫桥键。氨基酸改变的非限制性实例包括缺失氨基酸或用不同氨基酸置换原始氨基酸。因此，在一个实施方案中，通过改变至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个氨基酸(包括侧接由天然存在的蛋白酶裂解的肽键的两个氨基酸中的至少一者)来使天然存在的蛋白酶裂解位点不可操作。在另一实施方案中，通过改变至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个氨基酸(包括侧接由天然存在的蛋白酶裂解的肽键的两个氨基酸中的至少一者)来使天然存在的蛋白酶裂解位点不可操作。
应了解本说明书中公开的修饰梭菌毒素可任选更包含包括柔性间隔子的柔性区。包含柔性间隔子的柔性区可用于调整多肽区的长度以使多肽的特征、属性或性质最优化。作为一个非限制性实例，包含一个或多个串联柔性间隔子的多肽区可用于更充分暴露蛋白酶裂解位点，由此促进由蛋白酶裂解那个位点。作为另一非限制性实例，包含一个或多个串联柔性间隔子的多肽区可用于更充分呈现肽结合结构域，由此促进那个结合结构域结合其受体。
构成肽的柔性间隔子的长度为至少一个氨基酸且其包含具有小侧链R基团的不带电荷氨基酸，诸如小非极性氨基酸(如A、C、G、S和T)。因此，在一个实施方案中，柔性间隔子的长度可为例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸；或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，柔性间隔子可例如介于1-3个氨基酸之间、介于2-4个氨基酸之间、介于3-5个氨基酸之间、介于4-6个氨基酸之间或介于5-7个氨基酸之间。柔性间隔子的非限制性实例包括例如G间隔子，诸如GGG、GGGG(SEQ ID NO:522)和GGGGS(SEQ ID NO:523)；或A间隔子，诸如AAA、AAAA(SEQ ID NO:524)和AAAAT(SEQ ID NO:525)。所述柔性区以融合蛋白形式可操作地同框连接于修饰梭菌毒素。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可更包含包括柔性间隔子的柔性区。在另一实施方案中，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可更包含包括多个串联柔性间隔子的柔性区。在此实施方案的多个方面，柔性区可以串联方式包含例如至少1、2、3、4或5个G间隔子；或至多1、2、3、4或5个G间隔子。在此实施方案的其它方面，柔性区可以串联方式包含例如至少1、2、3、4或5个A间隔子；或至多1、2、3、4或5个A间隔子。在此实施方案的另一方面，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可包含包括相同柔性间隔子的一个或多个拷贝、不同柔性间隔子区的一个或多个拷贝或其任何组合的柔性区。
设想本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可在任何以及所有位置中包含柔性间隔子，附带条件为所述梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体能够执行总体中毒过程。在此实施方案的多个方面，柔性间隔子位于例如酶促结构域与移位结构域、酶促结构域与结合结构域、酶促结构域与外源性蛋白酶裂解位点之间。在此实施方案的其它方面，柔性间隔子位于例如结合结构域与移位结构域、结合结构域与酶促结构域、结合结构域与外源性蛋白酶裂解位点之间。在此实施方案的其它方面，柔性间隔子位于例如移位结构域与酶促结构域、移位结构域与结合结构域、移位结构域与外源性蛋白酶裂解位点之间。
作为任选组分的另一非限制性实例，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可更包含表位结合区。表位结合区可用于广泛多种涉及例如蛋白质纯化和蛋白质观测的程序中。所述表位结合区以融合蛋白形式可操作地同框连接于修饰梭菌毒素。表位结合区的非限制性实例包括例如FLAG、ExpressTM、人流感病毒血球凝集素(HA)、人p62c-Myc蛋白(c-MYC)、水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-G)、单纯疱疹病毒(HSV)的糖蛋白-D前体、V5、AU1和AU5；亲和力结合区，诸如聚组氨酸(HIS)、抗生蛋白链菌素结合肽(strep)和生物素或生物素化序列；肽结合区，诸如谷胱甘肽-S转移酶的谷胱甘肽结合结构域、钙调蛋白结合蛋白的钙调蛋白结合结构域和麦芽糖结合蛋白的麦芽糖结合结构域。用于选择、制备和使用适当结合肽的特定方案的非限制性实例描述于例如Epitope Tagging,第17.90-17.93页(Sambrook和Russell编著,MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL,第3卷,第3版2001)ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Edward Harlow和David Lane编著,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1998)；和USING ANTIBODIES:A LABORATORYMANUAL:PORTABLE PROTOCOL No.I(Edward Harlow和DavidLane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998)中。此外，结合肽以及充分表征的试剂、条件和方案的非限制性实例可容易地自包括但不限于BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,CA；BD BiosciencesPharmingen,San Diego,CA；Invitrogen公司,Carlsbad,CA；QIAGEN公司,Valencia,CA；和Stratagene,La Jolla,CA在内的商业供应商获得。这些方案是完全在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
因此，在一个实施方案中，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可更包含表位结合区。在另一实施方案中，本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可更包含多个表位结合区。在此实施方案的多个方面，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可包含例如至少1、2、3、4或5个表位结合区。在此实施方案的其它方面，梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体可包含例如至多1、2、3、4或5个表位结合区。在此实施方案的另一方面，修饰梭菌毒素可包含相同表位结合区的一个或多个拷贝、不同表位结合区的一个或多个拷贝或其任何组合。
表位结合区的位置可处于各种位置中，包括但不限于在梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的氨基端上、在梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体中或在梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的羧基端上。因此，在一个实施方案中，表位结合区位于梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的氨基端上。在另一实施方案中，表位结合区位于修饰梭菌毒素的羧基端上。
本说明书的多个方面部分地提供多核苷酸分子。如本文所用，术语“多核苷酸分子”与“核酸分子”同义且表示核苷酸的聚合形式，诸如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。设想可编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的任何以及所有多核苷酸分子皆可适用，包括但不限于天然存在的和非天然存在的DNA分子以及天然存在的和非天然存在的RNA分子。天然存在的和非天然存在的DNA分子的非限制性实例包括单链DNA分子、双链DNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、载体构建体，诸如质粒构建体、噬菌粒构建体、噬菌体构建体、反转录病毒构建体和人工染色体构建体。天然存在的和非天然存在的RNA分子的非限制性实例包括单链RNA、双链RNA和mRNA。
可能为制备编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子所必需的已充分确定的分子生物学技术(包括但不限于涉及基于聚合酶链式反应(PCR)扩增、限制酶反应、琼脂糖凝胶电泳、核酸连接、细菌转化、核酸纯化、核酸测序和重组的技术的程序)是完全在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。为制备编码修饰梭菌毒素的多核苷酸分子所必需的特定方案的非限制性实例描述于例如MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL,同上,(2001)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Frederick M.Ausubel等编著John Wiley&Sons,2004)中。另外，适用于制备编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子的多种市售产品可广泛获得。这些方案是完全在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
因此，在一个实施方案中，多核苷酸分子编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。
本说明书的另一方面部分地提供一种产生本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的方法，所述方法包括在细胞中表达编码梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子的步骤。本说明书的另一方面提供一种产生本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的方法，所述方法包括将包含编码梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子的表达构建体引入细胞中并在所述细胞中表达所述表达构建体的步骤。
本说明书中公开的方法部分地包括梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。设想本说明书中公开的任何以及所有梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体皆可使用本说明书中公开的方法来产生。也设想编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的任何以及所有多核苷酸分子皆可适用于使用本说明书中公开的方法来产生本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。
本说明书中公开的方法部分地包括表达构建体。表达构建体包含本说明书中公开的可操作地连接于表达载体的多核苷酸分子，所述表达载体适用于在细胞或无细胞提取物中表达所述多核苷酸分子。广泛多种表达载体可用于表达编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子，所述表达载体包括但不限于病毒表达载体；原核表达载体；真核表达载体，诸如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体；和无细胞提取物表达载体。应进一步了解适用于实施这些方法的多个方面的表达载体可包括那些在组成性、组织特异性、细胞特异性或可诱导启动子元件、增强子元件或两者控制下表达梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的表达载体。表达载体以及用于制备和使用由所述表达载体获得的表达构建体的已充分确定的试剂和条件的非限制性实例可容易地自包括但不限于BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,CA；BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA；Invitrogen公司,Carlsbad,CA；EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI；QIAGEN公司,Valencia,CA；和Stratagene,La Jolla,CA在内的商业供应商获得。适当表达载体的选择、制备和使用是完全在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
因此，在此实施方案的多个方面，编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子可操作地连接于表达载体。在此实施方案的多个方面，表达载体为例如病毒表达载体、原核表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物表达载体。在此实施方案的其它方面，编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子可操作地连接于无细胞提取物表达载体。
本说明书中公开的方法部分地包括细胞。设想可使用任何以及所有细胞。因此，此实施方案的多个方面包括但不限于原核细胞，包括但不限于需氧、微嗜氧、嗜二氧化碳、兼性、厌氧、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞菌株，诸如源于例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridiaperfringens)、艰难梭菌(Clostridia difficile)、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、外链甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、Neisseriameningirulls、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的那些菌株；以及真核细胞，包括但不限于酵母菌株，诸如源于毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)的那些菌株；昆虫细胞和源于昆虫的细胞系，诸如源于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)的那些细胞；以及哺乳动物细胞和源于哺乳动物细胞的细胞系，诸如源于小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人的那些细胞。细胞系可自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)、欧洲细胞培养物集存库(European Collection of Cell Cultures)以及德国微生物和细胞培养物集存库(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)获得。用于选择、制备和使用适当细胞系的特定方案的非限制性实例描述于例如INSECT CELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus F.A.Goosen等编著,Marcel Dekker，1993)；INSECT CELLCULTURES:FUNDAMEN TAL AND APPLIED ASPECTS(J.M.Vlak等编著,Kluwer Academic Publishers,1996)；Maureen A.Harrison和IanF.Rae,GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE(CambridgeUniversity Press,1997)；CELL AND TISSUECULTURE:LABORATORY PROCEDURES(Alan Doyle等编著,JohnWiley and Sons,1998)；R.Ian Freshney，CULTURE OF ANIMALCELLS:A Manual of Basic TECHNIQUE(Wiley-Liss,第4版2000)；ANIMAL CELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John R.W.Masters编著,Oxford University Press,第3版2000)；MOLECULARCLONING A LABORATORY MANUAL,同上，(2001)；BASIC CELLCULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis,Oxford Press,第2版2002)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，同上，(2004)中。这些方案是在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
本说明书中公开的方法部分地包括将多核苷酸分子引入细胞中。引入细胞中的多核苷酸分子可由那个细胞短暂或稳定维持。稳定维持的多核苷酸分子可在染色体外且自主复制，或其可整合至细胞的染色体物质中且以非自主方式复制。设想可使用用于将本说明书中公开的多核苷酸分子引入细胞中的任何以及所有方法。适用于将多核苷酸分子引入细胞中的方法包括但不限于化学介导的转染或转化，诸如氯化钙介导、磷酸钙介导、二乙基-氨乙基(DEAE)葡聚糖介导、脂质介导、聚乙烯亚胺(PEI)介导、聚赖氨酸介导和聚凝胺介导的转染或转化；物理介导的转染或转化，诸如基因枪粒子递送、显微注射、原生质体融合和电穿孔；以及病毒介导的转染，诸如反转录病毒介导的转染，参见例如Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells,第16.1-16.62页(Sambrook和Russell编著,Molecular Cloning ALaboratory Manual,第3卷,第3版2001)。本领域技术人员了解对用以将表达构建体引入细胞中的特定方法的选择将部分地取决于细胞将短暂地含有表达构建体还是细胞将稳定地含有表达构建体。这些方案是在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
在此实施方案的一个方面，使用称为转染的化学介导的方法将编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子引入细胞中。在化学介导的转染方法中，化学试剂与核酸形成促进其吸收至细胞中的复合物。所述化学试剂包括但不限于磷酸钙介导，参见例如Martin Jordan和Florian Worm,Transfection of adherent andsuspended cells by calcium phosphate,33(2)Methods136-143(2004)；二乙基-氨乙基(DEAE)葡聚糖介导、脂质介导、阳离子聚合物介导(如聚乙烯亚胺(PEI)介导和聚赖氨酸介导)和聚凝胺介导，参见例如ChunZhang等,Polyethylenimine strategies for plasmid delivery tobrain-derived cells,33(2)Methods144-150(2004)。所述化学介导的递送系统可通过标准方法制备且可商购获得，参见例如CellPhect转染试剂盒(Amersham Biosciences,Piscataway，NJ)；哺乳动物磷酸钙和DEAE葡聚糖转染试剂盒(Stratagene公司,La Jolla,CA)；LIPOFECTAMINETM转染试剂(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)；ExGen500转染试剂盒(Fermentas公司,Hanover,MD)以及SuperFect andEffectene转染试剂盒(Qiagen公司,Valencia,CA)。
在此实施方案的另一方面，使用物理介导的方法将编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子引入细胞中。物理技术包括但不限于电穿孔、基因枪和显微注射。基因枪和显微注射技术刺穿细胞壁以将核酸分子引入细胞中，参见例如Jeike E.Biewenga等,Plasmid-mediated gene transfer in neurons using thebiolistics technique,71(1)J.Neurosci.Methods67-75(1997)；以及JohnO’Brien和Sarah C.R.Lummis,Biolistic and diolistic transfection:usingthe gene gun to deliver DNA and lipophilicdyes into mammalian cells,33(2)Methods121-125(2004)。也称为电渗透的电穿孔使用短暂高电压电脉冲来在膜中产生核酸分子进入所穿过的短暂孔且可有效用于所有细胞类型的稳定和短暂转染，参见例如M.Golzio等,Invitro andinvivo electric field-mediated permeabilization,gene transfer，andexpression,33(2)Methods126-135(2004)；和Oliver Gresch等,Newnon-viral method for gene transfer into primary cells,33(2)Methods151-163(2004)。
在此实施方案的另一方面，使用称为转染的病毒介导的方法将编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子引入细胞中。在病毒介导的短暂转导方法中，对病毒粒子感染宿主细胞并在宿主细胞中复制所借助的过程进行操纵以使用此机制将多核苷酸分子引入细胞中。已根据广泛多种病毒(包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、细小核糖核酸病毒、甲病毒和杆状病毒)开发病毒介导的方法，参见例如Armin Blesch,Lentiviraland ML V based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer,33(2)Methods164-172(2004)；和Maurizio Federico,Fromlentivirusesto lentivirus vectors,229Methods Mol.Biol.3-15(2003)；E.M.Poeschla,Non-primatelentiviralvectors,5(5)Curr.Opin.Mol.Ther.529-540(2003)；Karim Benihoud等,Adenovirus vectors for gene delivery,10(5)Curr.Opin.Biotechnol.440-447(1999)；H.Bueler,Adeno-associatedviralvectors for gene transfer and genetherapy，380(6)Biol.Chem.613-622(1999)；Chooi M.Lai等,A denovirus and adeno-associated virusvectors,21(12)DNA Cell Biol.895-913(2002)；Edward A.Burton等,Genedeliveryusingherpes simplex virus vectors,21(12)DNA Cell Biol.915-936(2002)；Paola Grandi等,Targeting HSVamplicon vectors,33(2)Methods179-186(2004)；Ilya Frolov等,Alphavirus-based expressionvectors:strategiesand applications,93(21)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.11371-11377(1996)；Markus U.Ehrengruber,Alphaviralgene transfer inneurobiology，59(1)Brain Res.Bull.13-22(2002)；Thomas A.Kost和J.Patrick Condreay,Recombinant baculoviruses as mammalian cellgene-deliveryvectors,20(4)Trends Biotechnol.173-180(2002)；及A.Huser和C.Hofmann,Baculovirus vectors:novelmammaliancellgene-delivery vehicles and their applications,3(1)Am.J.Pharmacogenomics53-63(2003)。
常选择作为非包膜双链DNA病毒的腺病毒用于哺乳动物细胞转导，因为腺病毒操纵相对较大的约36kb的多核苷酸分子，在高效价下产生且可高效感染广泛多种分裂细胞与非分裂细胞两者，参见例如Wim T.J.M.C.Hermens等,Transient gene transfer to neurons and glia:analysis of adenoviral vector performance in the CNSand PNS，71(1)J.Neurosci.Methods85-98(1997)；和Hiroyuki Mizuguchi等,Approachesforgenerating recombinant adenovirus vectors,52(3)Adv.Drug Deliv.Rev.165-176(2001)。使用腺病毒基系统的转导不支持长期蛋白质表达，因为核酸分子由细胞核中的游离体携带而非整合至宿主细胞染色体中。腺病毒载体系统和如何使用所述载体的特定方案公开于例如VIRAPOWERTM腺病毒表达系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)和VIRAPOWERTM腺病毒表达系统说明手册25-0543版本A,Invitrogen公司,(2002年7月15日)；和ADEASYTM腺病毒载体系统(Stratagene公司,La Jolla,CA)和ADEASYTM腺病毒载体系统说明手册064004f,Stratagene公司中。
多核苷酸分子递送也可使用单链RNA反转录病毒，诸如致癌反转录病毒(oncoretrovirus)和慢病毒(lentivirus)。反转录病毒介导的转导常产生接近100%的转导效率，可通过改变感染复数(MOI)来容易地控制前病毒拷贝数，且可用于短暂或稳定转导细胞，参见例如TizianaTonini等,Transient production of retroviral-and lentiviral-based vectorsfor the transduction ofMammalian cells,285MethodsMol.Biol.141-148(2004)；Armin Blesch,Lentiviral and MLV based retroviralvectorsfor ex vivo and in vivo gene transfer,33(2)Methods164-172(2004)；Felix Recillas-Targa,Gene transfer and expressioninmammaliancell lines and transgenic animals,267Methods Mol.Biol.417-433(2004)；和Roland Wolkowicz等,Lentiviral vectorsforthe delivery ofDNA into mammaliancells,246Methods Mol.Biol.391-411(2004)。反转录病毒粒子由包装在由脂质包膜围绕的蛋白质衣壳中的RNA基因组组成。反转录病毒通过将其RNA连同反转录酶一起注射至细胞质中来感染宿主细胞。RNA模板接着反转录成线性双链cDNA，所述cDNA通过整合至宿主细胞基因组中来复制自身。病毒粒子纵向(通过前病毒自母细胞至子细胞)以及横向(通过病毒体自细胞至细胞)散布。这个复制策略使得能够长期持久表达，因为相关核酸分子稳定整合至宿主细胞的染色体中，由此使得能够长期表达蛋白质。举例来说，动物研究已显示注射至多种组织中的慢病毒载体产生持续蛋白质表达持续1年以上，参见例如Luigi Naldini等,In vivo gene delivery andstable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector，272(5259)Science263-267(1996)。源于致癌反转录病毒的载体系统，诸如莫洛尼(Moloney)鼠类白血病病毒(MoMLV)被广泛使用且感染许多不同非分裂细胞。慢病毒也可感染许多不同细胞类型(包括分裂和非分裂细胞)且具有允许达成高度特异性细胞靶向的复合包膜蛋白。
反转录病毒载体和如何使用所述载体的特定方案公开于例如Manfred Gossen和Hermann Bujard,Tightcontrol of gene expression ineukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters美国专利号5,464,758(1995年11月7日)和Hermann Bujard和Manfred Gossen,Methods for regulating gene expression美国专利号5,814,618(1998年9月29日)；David S.Hogness,Polynucleotides encoding insect steroidhormone receptor polypeptides and cells transformed with same,美国专利号5,514,578(1996年5月7日)和David S.Hogness,Polynucleotideencoding insect ecdysone receptor，美国专利6,245,531(2001年6月12日)；Elisabetta Vegeto等,Progesterone receptor having C.terminalhormone binding domain truncations,美国专利号5,364,791(1994年11月15日)、Elisabetta Vegeto等,Mutated steroid hormone receptors,methods for their use and molecular switch for gene therapy，美国专利号5,874,534(1999年2月23日)和Elisabetta Vegeto等,Mutated steroidhormone receptors,methods for their use and molecular switch for genetherapy，美国专利号5,935,934(1999年8月10日)中。此外，所述病毒递送系统可通过标准方法制备且可商购获得，参见例如BDTMTet-Off and Tet-On基因表达系统(BD Biosciences-Clonetech,Palo Alto,CA)和BDTM Tet-Off and Tet-On基因表达系统使用手册,PT3001-1,BD Biosciences Clonetech,(2003年3月14日)；GENESWITCHTM系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)和GENESWITCHTM系统哺乳动物用米非司酮调控表达系统版本D,25-0313,Invitrogen公司(2002年11月4日)；VIRAPOWERTM慢病毒表达系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)和VIRAPOWERTM慢病毒表达系统说明手册25-0501版本E，Invitrogen公司(2003年12月8日)；及COMPLETE
Figure BDA00002756375802131
反转录病毒可诱导哺乳动物表达系统(Stratagene,La Jolla,CA)和COMPLETE
Figure BDA00002756375802132
反转录病毒可诱导哺乳动物表达系统说明手册,064005e。
本说明书中公开的方法部分地包括自多核苷酸分子表达本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。设想多种表达系统中的任一者可适用于自多核苷酸分子表达本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，所述表达系统包括但不限于细胞基系统和无细胞表达系统。细胞基系统包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。无细胞系统包括但不限于小麦胚芽提取物、兔网织红细胞提取物和大肠杆菌提取物且通常等同于本文公开的方法。使用表达系统表达多核苷酸分子可包括以下多种特征中的任一者：包括但不限于可诱导表达、不可诱导表达、组成性表达、病毒介导的表达、稳定整合表达和短暂表达。包括充分表征的载体、试剂、条件和细胞的表达系统已充分确定且可容易地自包括但不限于Ambion公司Austin,TX；BDBiosciences-Clontech,Palo Alto,CA；BD Biosciences Pharmingen,SanDiego,CA；Invitrogen公司,Carlsbad,CA；QIAGEN公司,Valencia,CA；Roche Applied Science,Indianapolis,IN；和Stratagene,La Jolla,CA在内的商业供应商获得。关于选择和使用适当异质表达系统的非限制性实例描述于例如PROTEIN EXPRESSION.A PRACTICAL APPROACH(S.J.Higgins和B.David Hames编著,Oxford University Press,1999)；JosephM.Fernandez和James P. Hoeffler，GENE EXPRESSION SYSTEMS.USINGNATURE FOR THE ART OF EXPRESSION(Academic Press,1999)；以及Meena Rai和Harish Padh,Expression Systems for ProductionofHeterologous Proteins,80(9)CURRENT SCIENCE1121-1128,(2001)中。这些方案是完全在本领域技术人员的见识内的常规程序且可由本文教义获得。
多种细胞基表达程序适用于表达编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子。实例包括但不限于病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。病毒表达系统包括但不限于VIRAPOWERTM慢病毒(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)、腺病毒表达系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)、ADEASYTM XL腺病毒载体系统(Stratagene,LaJolla,CA)和
Figure BDA00002756375802151
反转录病毒基因表达系统(Stratagene,LaJolla,CA)。原核表达系统的非限制性实例包括CHAMPIONTM pET表达系统(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)、TRIEXTM细菌表达系统(EMD Bio sciences-Novagen,Madison,WI)、
Figure BDA00002756375802152
表达系统(QIAGEN公司)以及
Figure BDA00002756375802153
蛋白质表达和纯化系统(Stratagene,La Jolla,CA)。酵母表达系统包括但不限于EASYSELECTTM毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)、YES-ECHOTM表达载体试剂盒(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)和SPECTRATM粟酒裂殖酵母菌表达系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)。杆状病毒表达系统的非限制性实例包括BACULODIRECTTM(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)、(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)和BDBACULOGOLDTM(BD Biosciences-Pharmigen,San Diego,CA)。昆虫表达系统包括但不限于果蝇表达系统
Figure BDA00002756375802155
(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)、INSECTSELECTTM系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)和INSECTDIRECTTM系统(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)。哺乳动物表达系统的非限制性实例包括T-REXTM(四环素调控表达)系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)、FLP-INTM T-REXTM系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)、pcDNATM系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)、pSecTag2系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)、系统、INTERPLAYTM哺乳动物TAP系统(Stratagene,La Jolla,CA)、COMPLETE可诱导哺乳动物表达系统(Stratagene,LaJolla,CA)和
Figure BDA00002756375802158
II可诱导哺乳动物表达系统(Stratagene,La Jolla,CA)。
表达编码本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的多核苷酸分子的另一程序采用无细胞表达系统，诸如但不限于原核提取物和真核提取物。原核细胞提取物的非限制性实例包括RTS100大肠杆菌HY试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)、ActivePro活体外翻译试剂盒(Ambion公司,Austin,TX)、ECOPROTM系统(EMDBiosciences-Novagen,Madison,WI)和EXPRESSWAYTM加强型表达系统(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)。真核细胞提取物包括但不限于RTS100小麦胚芽CECF试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)、
Figure BDA00002756375802161
偶联小麦胚芽提取物系统(Promega公司,Madison,WI)、小麦胚芽IVTTM试剂盒(Ambion公司,Austin,TX)、网织红细胞溶解产物IVTTM试剂盒(Ambion公司,Austin,TX)、
Figure BDA00002756375802162
II系统(Ambion公司,Austin,TX)和
Figure BDA00002756375802163
偶联网织红细胞溶解产物系统(Promega公司,Madison,WI)。
本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体由细胞以单链形式产生。为达成完全活性，此单链形式必须转化成其双链形式。如上所论述，通过裂解位于本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的双链环区内的蛋白酶裂解位点来达成转化过程。此转化过程可使用标准活体外蛋白水解裂解测定或在如专利申请Ghanshani等,Methodsof Intracellular Conversion of Single-Chain Proteins into their Di-chainForm，代理人案号18469PROV(BOT)中所述的细胞基蛋白水解裂解系统中进行，所述专利申请据此全文以引用的方式并入本文。
本说明书的多个方面部分地公开包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的组合物。在另一方面，组合物为药学上可接受的组合物。如本文所用，术语「药学上可接受」是指任何分子实体或组合物在向个体施用时不会产生不利、过敏或其它不当或不希望的反应。如本文所用，术语“药学上可接受的组合物”与“药用组合物”同义且表示治疗有效浓度的活性成分，诸如本说明书中公开的任何梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。包含梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的药用组合物适用于医学和兽医学应用。药用组合物可单独或与其它补充活性成分、试剂、药物或激素联合向患者施用。可使用多种工艺中的任一者制造药用组合物，所述工艺包括但不限于常规混合、溶解、粒化、糖衣丸制备、磨细、乳化、囊封、包埋和冻干。药用组合物可采用多种形式中的任一者，所述形式包括但不限于无菌溶液、悬浮液、乳液、冻干物、片剂、丸剂、丸粒、胶囊、散剂、糖浆、酏剂或适于施用的任何其它剂型。
也设想包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的药用组合物可任选地包括有助于活性成分加工成药学上可接受的组合物的药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药理学上可接受的载剂”与“药理学载剂”同义且表示在施用时不具有大致上长期或持久有害影响的任何载剂且涵盖诸如“药理学上可接受的媒剂、稳定剂、稀释剂、添加剂、助剂或赋形剂”等术语。所述载剂通常与活性化合物混合或使其稀释或包围活性化合物且可为固体、半固体或液体试剂。应了解活性成分可为可溶解的或可以于所要载剂或稀释剂中的悬浮液形式递送。可使用多种药学上可接受的载剂中的任一者，所述载剂包括但不限于水性介质，诸如水、生理盐水、甘氨酸、透明质酸等；固体载体，诸如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等；溶剂；分散介质；包衣；抗细菌剂和抗真菌剂；等张剂和吸收延迟剂；或任何其它无活性成分。对药理学上可接受的载剂的选择可取决于施用模式。除非任何药理学上可接受的载剂与活性成分不相容，否则涵盖其在药学上可接受的组合物中使用。所述药用载剂的特定使用的非限制性实例可见于PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS(Howard C.Ansel等编著,Lippincott Williams&WilkinsPublishers,第7版1999)；REMINGTON:THE SCIENCE ANDPRACTICE OF PHARMACY(Alfonso R.Gennaro编著,Lippincott,Williams&Wilkins,第20版2000)；GOODMAN&GILMAN’S THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(Joel G. Hardman等编著,McGraw-Hill Professional,第10版2001)；和HANDBOOKOF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(Raymond C.Rowe等,APhAPublications,第4版2003)中。这些方案是常规程序且任何修改皆完全在本领域技术人员的见识内且可由本文教义获得。
进一步设想本说明书中公开的药用组合物可任选地包括但不限于其它药学上可接受的组分(或药用组分)，所述组分包括但不限于缓冲剂、防腐剂、张力调整剂、盐、抗氧化剂、渗透度调整剂、生理物质、药理学物质、增积剂、乳化剂、湿润剂、甜味剂或调味剂等。各种缓冲剂且表示用于调整pH的缓冲剂可用于制备本说明书中公开的药用组合物，附带条件为所得制剂是药学上可接受的。所述缓冲剂包括但不限于乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水和硼酸盐缓冲剂。应了解酸或碱在需要时可用于调整组合物的pH。药学上可接受的抗氧化剂包括但不限于焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基化羟基苯甲醚和丁基化羟基甲苯。适用防腐剂包括但不限于氯化苯甲烃铵、氯丁醇、硫柳汞、乙酸苯汞、硝酸苯汞、稳定氧氯组合物(诸如
Figure BDA00002756375802181
)和螯合剂，诸如DTPA或DTPA-双酰胺、DTPA钙和CaNaDTPA-双酰胺。适用于药用组合物中的张力调整剂包括但不限于盐(诸如氯化钠、氯化钾)、甘露糖醇或甘油和其它药学上可接受的张力调整剂。药用组合物可以盐形式提供且可用许多不同酸(包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和丁二酸)形成。盐倾向于比相应游离碱形式更溶于水性或其它质子性溶剂中。应了解药理学领域中已知的这些和其它物质可包括在适用于本说明书中的药用组合物中。
在一个实施方案中，组合物包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。在此实施方案的一个方面，组合物为包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的药用组合物。在此实施方案的多个方面，包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的药用组合物更包含药理学载剂、药用组分、或药理学载剂与药用组分两者。在此实施方案的其它方面，包含本说明书中公开的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的药用组合物更包含至少一种药理学载剂、至少一种药用组分、或至少一种药理学载剂和至少一种药用组分。
本说明书的多个方面也可如下描述：
1.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含至少一个位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中，其中所述至少一个失活裂解位点包含双重凝血酶-凝血酶位点、因子Xa位点、双重因子Xa-凝血酶位点和/或MMP-9位点。
2.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、梭菌毒素结合结构域、双链环区、外源性蛋白酶裂解位点和至少两个位于失活裂解位点区内的失活裂解位点；其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内。
3.如方面2所述的梭菌毒素，其中所述失活裂解位点包含双重凝血酶-凝血酶位点和/或双重因子Xa-凝血酶位点。
4.一种梭菌毒素嵌合体，所述梭菌毒素嵌合体包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
5.如方面1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸462-496；SEQ ID NO:3的氨基酸458-492；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸464-487；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸463-496；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸458-491；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸434-467；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸453-486；SEQ ID NO:21的氨基酸458-491；SEQ ID NO:23的氨基酸443-476；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸434-467。
6.如方面1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸618-634；SEQ ID NO:3的氨基酸614-630；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸605-621；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸613-629；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸609-625；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸587-603；SEQ ID NO:18的氨基酸604-620；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸605-621；SEQ ID NO:21的氨基酸610-626；SEQ ID NO:23的氨基酸596-612；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸587-603。
7.如方面1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸638-651；SEQ ID NO:3的氨基酸634-647；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸625-638；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸633-646；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸629-642；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸607-620；SEQ ID NO:18的氨基酸624-637；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸625-638；SEQ ID NO:21的氨基酸630-643；SEQ ID NO:23的氨基酸616-629；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸607-620。
8.如方面1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸665-687；SEQ ID NO:3的氨基酸661-683；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸652-674；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸660-682；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸656-678；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸634-659；SEQ ID NO:18的氨基酸651-676；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸652-677；SEQ ID NO:21的氨基酸657-679；SEQ ID NO:23的氨基酸643-668；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸634-659。
9.如方面1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸752-765；SEQ ID NO:3的氨基酸748-761；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸739-752；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸747-760；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸743-756；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸724-739；SEQ ID NO:18的氨基酸741-756；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸742-757；SEQ ID NO:21的氨基酸744-757；SEQ ID NO:23的氨基酸733-748；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸724-739。
10.如方面1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸826-835；SEQ ID NO:3的氨基酸824-831；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸813-824；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸821-830；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸817-826；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸800-809；SEQ ID NO:18的氨基酸817-826；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸818-827；SEQ ID NO:21的氨基酸818-827；SEQ ID NO:23的氨基酸809-819；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸800-809。
11.如方面1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸844-863；SEQ ID NO:3的氨基酸840-859；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸831-850；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸839-858；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸835-854；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸818-837；SEQ ID NO:18的氨基酸835-854；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸836-855；SEQ ID NO:21的氨基酸836-855；SEQ ID NO:23的氨基酸828-847；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸818-837。
12.如方面1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸871-895；SEQ ID NO:3的氨基酸867-891；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸858-882；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸866-890；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸862-886；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸845-869；SEQ ID NO:18的氨基酸862-886；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸863-887；SEQ ID NO:21的氨基酸863-887；SEQ ID NO:23的氨基酸855-879；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸845-869。
13.如方面1至12所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、BaNT酶促结构域和/或BuNT酶促结构域。
14.如方面1至13所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点包含凝血酶裂解位点、纤溶酶裂解位点、凝血因子VIIa裂解位点、凝血因子IXa裂解位点、凝血因子Xa裂解位点、凝血因子XIa裂解位点、凝血因子XIIa裂解位点、血浆激肽释放酶裂解位点、蛋白酶活化G蛋白偶联受体-1(PAR1)裂解位点、PAR2裂解位点、PAR3裂解位点、PAR4裂解位点、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)裂解位点、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)裂解位点、弗林蛋白酶裂解位点、尿激酶型纤溶酶原活化因子(uPA)裂解位点、组织型纤溶酶原活化因子(tPA)裂解位点、类胰蛋白酶-ε裂解位点、小鼠肥大细胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位点、內皮素转化酶-1(ECE-1)裂解位点、凯尔血型裂解位点、DPPIV裂解位点、具有血小板反应蛋白1型基序的ADAM金属肽酶-13(ADAMTS13)裂解位点和/或组织蛋白酶L裂解位点。
15.如方面1至14所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述梭菌毒素移位结构域包含BoNT/A移位结构域、BoNT/B移位结构域、BoNT/C1移位结构域、BoNT/D移位结构域、BoNT/E移位结构域、BoNT/F移位结构域、BoNT/G移位结构域、TeNT移位结构域、BaNT移位结构域和/或BuNT移位结构域。
16.如方面1至15所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点包含双重凝血酶-凝血酶位点、因子Xa位点、双重因子Xa-凝血酶位点和/或MMP-9位点。
17.如方面1至16所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述非梭菌毒素结合结构域包含阿片结合结构域、速激肽结合结构域、黑素皮质素结合结构域、甘丙肽结合结构域、粒蛋白结合结构域、神经肽Y相关肽结合结构域、神经激素结合结构域、神经调控细胞因子结合结构域、激肽结合结构域、生长因子结合结构域和/或胰高血糖素样激素结合结构域。
18.一种BoNT/A，所述BoNT/A包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
19.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/A酶促结构域、BoNT/A移位结构域、BoNT/A结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
20.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/A酶促结构域、BoNT/A移位结构域、BoNT/A结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
21.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/A酶促结构域、BoNT/A移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
22.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/A酶促结构域、BoNT/A移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
23.如方面18至22所述的毒素和/或嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQID NO:5的氨基酸462-496、618-634、638-651、665-687、752-765、826-835、844-863和/或871-895；和/或SEQ ID NO:3的氨基酸458-492、614-630、634-647、665-687、748-761、822-831、840-859和/或867-891。
24.一种BoNT/B，所述BoNT/B包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
25.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/B酶促结构域、BoNT/B移位结构域、BoNT/B结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
26.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/B酶促结构域、BoNT/B移位结构域、BoNT/B结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
27.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/B酶促结构域、BoNT/B移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
28.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/B酶促结构域、BoNT/B移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
29.如方面24至28所述的毒素和/或嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸464-487、605-621、625-638、652-674、739-752、813-824、831-850和/或858-882。
30.一种BoNT/C1，所述BoNT/C1包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
31.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/C1酶促结构域、BoNT/C1移位结构域、BoNT/C1结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
32.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/C1酶促结构域、BoNT/C1移位结构域、BoNT/C1结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
33.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/C1酶促结构域、BoNT/C1移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
34.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/C1酶促结构域、BoNT/C1移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
35.如方面30至34所述的毒素和/或嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12的氨基酸463-496、613-629、633-646、660-682、747-760、821-830、839-858和/或866-890。
36.一种BoNT/D，所述BoNT/D包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
37.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/D酶促结构域、BoNT/D移位结构域、BoNT/D结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
38.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/D酶促结构域、BoNT/D移位结构域、BoNT/D结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
39.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/D酶促结构域、BoNT/D移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
40.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/D酶促结构域、BoNT/D移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
41.如方面36至40所述的毒素和/或嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸458-491、609-625、629-642、656-678、743-756、817-826、835-854和/或862-886。
42.一种BoNT/E，所述BoNT/E包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
43.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/E酶促结构域、BoNT/E移位结构域、BoNT/E结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
44.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/E酶促结构域、BoNT/E移位结构域、BoNT/E结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
45.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/E酶促结构域、BoNT/E移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
46.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/E酶促结构域、BoNT/E移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
47.如方面42至46所述的毒素和/或嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸434-467、587-603、607-620、634-659、724-739、800-809、818-837和/或845-869。
48.一种BoNT/F，所述BoNT/F包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
49.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/F酶促结构域、BoNT/F移位结构域、BoNT/F结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
50.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/F酶促结构域、BoNT/F移位结构域、BoNT/F结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
51.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/F酶促结构域、BoNT/F移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
52.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/F酶促结构域、BoNT/F移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
53.如方面48至52所述的毒素和/或嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:18的氨基酸453-486、604-620、624-637、651-676、741-756、817-826、835-854和/或862-886；和/或SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸453-486、605-621、625-638、652-677、742-757、818-827、836-855和/或863-887。
54.一种BoNT/G，所述BoNT/G包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
55.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/G酶促结构域、BoNT/G移位结构域、BoNT/G结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
56.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/G酶促结构域、BoNT/G移位结构域、BoNT/G结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
57.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/G酶促结构域、BoNT/G移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
58.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BoNT/G酶促结构域、BoNT/G移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
59.如方面54至58所述的毒素和/或嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:21的氨基酸458-491、610-626、630-643、657-679、744-757、818-827、836-855和/或863-887。
60.一种BaNT，所述BaNT包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
61.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BaNT酶促结构域、BaNT移位结构域、BaNT结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
62.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BaNT酶促结构域、BaNT移位结构域、BaNT结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
63.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BaNT酶促结构域、BaNT移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
64.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BaNT酶促结构域、BaNT移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
65.如方面60至64所述的毒素和/或嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:23的氨基酸443-476、596-612、616-629、643-668、733-748、809-819、828-847和/或855-879。
66.一种BuNT，所述BuNT包含位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
67.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BuNT酶促结构域、BuNT移位结构域、BuNT结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
68.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BuNT酶促结构域、BuNT移位结构域、BuNT结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
69.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BuNT酶促结构域、BuNT移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
70.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含BuNT酶促结构域、BuNT移位结构域、非梭菌毒素结合结构域、外源性蛋白酶裂解位点、双链环区和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内；其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
71.如方面66至70所述的毒素和/或嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸434-467、587-603、607-620、634-659、724-739、800-809、818-837和/或845-869。
72.如方面1至71所述的毒素和/或嵌合体，其中相对于相同和/或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，包含所述失活裂解位点的所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限较大。
73.如方面72所述的毒素和/或嵌合体，其中相对于相同和/或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，包含所述失活裂解位点的所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、至少200%、210%、至少220%、至少230%、至少240%、至少250%、至少260%、至少270%、至少280%、至少290%和/或至少300%，和/或
其中相对于相同和/或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，包含所述失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多100%、110%、至多120%、至多130%、至多140%、至多150%、至多160%、至多170%、至多180%、至多190%、至多200%、210%、至多220%、至多230%、至多240%、至多250%、至多260%、至多270%、至多280%、至多290%和/或至多300%，和/或
其中相对于相同和/或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，包含所述失活裂解位点的所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大约10%至约300%、约20%至约300%、约30%至约300%、约40%至约300%、约50%至约300%、约60%至约300%、约70%至约300%、约80%至约300%、约90%至约300%、和/或约100%至约300%，或
其中相对于相同和/或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，包含所述失活裂解位点的所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大至少1倍、至少1倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍和/或至少10倍，和/或
其中相对于相同和/或类似但无失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，包含所述失活裂解位点的所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大至少1倍、至多1倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍、至多9倍和/或至多10倍，和/或
其中包含失活裂解位点的所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限大约1倍至约10倍、约1倍至约9倍、约1倍至约8倍、约1倍至约7倍、约1倍至约6倍、约1倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍、和/或约2倍至约5倍。
74.如方面1至73所述的毒素和/或嵌合体，其中相对于相同和/或类似但无附加失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，添加所述失活裂解位点会增加所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限。
75.如方面74所述的毒素和/或嵌合体，其中所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体包含失活裂解位点的添加，相对于相同和/或类似但无所述附加失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，所述添加会使所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、至少200%、210%、至少220%、至少230%、至少240%、至少250%、至少260%、至少270%、至少280%、至少290%和/或至少300%，或
其中所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体包含失活裂解位点的添加，相对于相同和/或类似但无所述附加失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，所述添加会使所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多60%、至多70%、至多80%、至多90%、至多100%、110%、至多120%、至多130%、至多140%、至多150%、至多160%、至多170%、至多180%、至多190%、至多200%、210%、至多220%、至多230%、至多240%、至多250%、至多260%、至多270%、至多280%、至多290%和/或至多300%，或
其中所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体包含失活裂解位点的添加，相对于相同和/或类似但无所述附加失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，所述添加会使所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加约10%至约300%、约20%至约300%、约30%至约300%、约40%至约300%、约50%至约300%、约60%至约300%、约70%至约300%、约80%至约300%、约90%至约300%、和/或约100%至约300%，或
其中所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体包含失活裂解位点的添加，相对于相同和/或类似但无所述附加失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，所述添加会使所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加至少1倍、至少1倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍和/或至少10倍，和/或
其中所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体包含失活裂解位点的添加，相对于相同和/或类似但无所述附加失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，所述添加会使所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加例如至多1倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍、至多9倍和/或至多10倍，和/或
其中所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体包含失活裂解位点的添加，相对于相同和/或类似但无所述附加失活裂解位点的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，所述添加会使所述梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的安全性界限增加约1倍至约10倍、约1倍至约9倍、约1倍至约8倍、约1倍至约7倍、约1倍至约6倍、约1倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍、和/或约2倍至约5倍。
76.一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码根据方面1至75中任一项所述的毒素和/或嵌合体。
77.多核苷酸分子，其中所述分子包含SEQ ID NO:530、SEQ IDNO:532、SEQ ID NO:534和/或SEQ ID NO:536。
78.一种产生梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体的方法，所述方法包括在细胞中表达根据方面76和/或77所述的多核苷酸分子的步骤，其中自所述多核苷酸分子的表达产生所编码的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体。
79.一种产生修饰梭菌毒素的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将根据方面76和/或77所述的多核苷酸分子引入细胞中；和
b.表达所述多核苷酸分子，其中自所述多核苷酸分子的表达产生所编码的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体。
80.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含SEQ ID NO:531、SEQ IDNO:533、SEQ ID NO:535和/或SEQ ID NO:537。
81.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含SEQ ID NO:531。
82.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含SEQ ID NO:533。
83.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含SEQ ID NO:535。
84.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含SEQ ID NO:537。
实施例
仅出于说明目的提供以下非限制性实施例以有助于更完全理解公开的实施方案且决不欲限制本说明书中公开的任何实施方案。
实施例1
鉴定失活裂解位点区
此实施例说明如何鉴定梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体内适于修饰毒素以包含失活裂解位点的区及如何制备包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。
为鉴定蛋白质结构中的一个或多个适合作为潜在失活裂解位点区的位置，最初用电脑软件分析BoNT/A的三维结构以鉴定将更可由蛋白酶接近的表面暴露环或扩展区。在预测可接近的区中，选择以下八个区进行进一步分析：SEQ ID NO:1的氨基酸462-496、SEQ ID NO:1的氨基酸618-634、SEQ ID NO:1的氨基酸638-651、SEQ ID NO:1的氨基酸665-687、SEQ ID NO:1的氨基酸752-765、和SEQ ID NO:1的氨基酸826-835、SEQ ID NO:1的氨基酸844-863、和SEQ ID NO:1的氨基酸871-895。
为确定通过电脑分析鉴定的区是否可充当失活裂解位点区，使用多引物诱变将凝血酶裂解位点遗传工程改造到这些区中并测定其由凝血酶裂解的能力。集合50μL反应，所述反应包含以不同比率与用dam甲基酶高甲基化的DNA模板混合的各自含有所要修饰的单向寡核苷酸引物(125ng各引物)的引物池，所述DNA模板包含编码BoNT/A的表达构建体，诸如包含编码SEQ ID NO:527的SEQ ID NO:526的表达构建体、或包含编码SEQ ID NO:529的SEQ ID NO:528的表达构建体。向此混合物中添加5μL10×PCR缓冲液、1μL脱氧核糖核苷酸(dNTP)、1μL2.5单位/μLPFUULTRATM高保真DNA聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA)、Pfu DNA连接酶、ATP和无核酸酶水至最终体积50μL。热循环仪条件为：96℃持续1分钟，60℃持续30秒，和68℃持续20分钟，共30个循环。在热循环之后，添加1μL Dpnl限制酶(Stratagene,La Jolla,CA)至反应中且在37℃下孵育1小时以消化模板DNA且减少野生型克隆的回收。通过电穿孔将经过消化的反应混合物转化至电感受态大肠杆菌BL21(DE3)Acella细胞(EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD)中，在含有50μg/mL卡那霉素的1.5%Luria-Bertani琼脂板(pH7.0)上涂布，且置放在37℃培育箱中进行过夜生长。含有表达构建体的细菌被鉴定为卡那霉素抗性菌落。使用碱性溶解质粒小量制备程序分离候选构建体且通过测序加以分析以确定所并入突变的频率和身份。表7列出所制备且在此凝血酶扫描分析中测试的包含凝血酶裂解位点的各BoNT/A(BoNT/A-TCS)。
Figure BDA00002756375802371
Figure BDA00002756375802381
Figure BDA00002756375802391
为测定各BoNT/A-TCS的可溶性蛋白表达水平，表达包含各BoNT/A-TCS的表达构建体，通过固定金属亲和色谱纯化且通过SDS-PAGE分析加以分析。首先，使用96孔板，用具有适当表达构建体的BL21(DE3)细胞的单菌落接种100μL含有50μg/mL卡那霉素的PA-0.5G培养基且使其在振荡下在37℃下生长过夜。使用来自此起始培养物的5μL等分试样接种1mL含有50μg/mL卡那霉素的ZYP-5052且使其在振荡下在37℃下生长3.5小时并接着在22℃下生长16小时。添加110μL蛋白质提取试剂的等分试样至96孔板中的各1mL表达培养物中，所述蛋白质提取试剂包含10×FASTBREAKTM细胞溶解试剂(Promega公司,Madison,WI)、250U/mL Benzonase核酸酶(EMD Biosciences-Novagen,Madison,WI)和10×蛋白酶抑制剂混合物III(EMD Biosciences-Calbiochem,Gibbstown,NJ)。接着将75μLHISLINKTM树脂(Promega公司,Madison,WI)转移至各孔中且混合物交替通过吸移和通过在900rpm下振荡30分钟进行混合。将溶解产物转移至孔径为25μm，具有用水预先湿润的膜的过滤板(Promega公司,Madison,WI)中，且通过真空过滤移除液体。树脂用200μL包含100mM HEPES(pH7.5)、10mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤三次。通过添加200μL包含100mM HEPES(pH7.5)、500mM咪唑的洗脱缓冲液，孵育5分钟来洗脱蛋白质且洗脱物通过真空过滤收集至96孔板中。
为进行SDS-PAGE，添加等体积的2×Laemmli样品缓冲液至IMAC纯化的包含凝血酶裂解位点的BoNT/A中，且在95℃下孵育混合物5分钟。上样15μL等分试样且通过使用
Figure BDA00002756375802401
Novex4-12%Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)在变性还原条件下进行MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。洗涤凝胶且于10%甲醇和7%乙酸中固定30分钟。移除洗涤溶液且凝胶在室温下于SYPRO Ruby蛋白凝胶染色溶液中孵育3小时至过夜。染色凝胶于10%甲醇和7%乙酸中脱色30分钟。脱色凝胶用Fluro-S-Max数字成像器(Bio-Rad)观察。
表7中给出表达分析的结果。一般来说，在包含SEQ ID NO:1的氨基酸462-496、SEQ ID NO:1的氨基酸844-863或氨基酸871-895的失活区中具有插入凝血酶裂解位点的毒素表达良好。举例来说，包含A489insLVPRGS的毒素的表达水平为野生型对照构建体的表达水平的约50%且包含D848insLVPRGS或N880insLVPRGS的毒素的表达水平处于或接近对照水平(表7)。这些结果揭示位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域内的失活裂解位点区对用以包括蛋白酶裂解位点的区修饰耐受。
为进一步探究所鉴定失活裂解位点区可耐受引入蛋白酶裂解位点的修饰的程度，修饰毒素以在整个区中包括凝血酶裂解位点。举例来说，制备包含T884insLVPRGS或L862insLVPRGS的毒素以检查包含SEQ ID NO:1的844-863的失活裂解位点区。类似地，制备包含E868insLVPRGS、delE868YIKNIinsLVPRGS、delN872IINTS-insLVPRGS、T876insLVPRGS、L879insVPRGS、delL879NLRYE-insLVPRGS、L881insVPRGS、delL881RYESN-insLVPRGS、Y883insLVPRGS、E884insLVPRGS、S885insLVPRGS、delH887LIDLS-insLVPRGS、L888insLVPRGS、L891insVPRG和delS892RYA-insVPRG的毒素以检查包含SEQ IDNO:1的871-895的失活裂解位点区。进行插入修饰与取代修饰两者以检查修饰类型是否具有任何影响。一般来说，在这些失活区中具有插入凝血酶裂解位点的所有毒素的表达水平皆处于或接近野生型对照构建体的水平。这些结果揭示在移位结构域和/或HCN结合亚结构域内的失活裂解位点区可对置放在失活位点区内任何地方的修饰耐受。
最后，检查失活位点区耐受存在两个或更多个蛋白酶裂解位点的能力(表7)。这些结果指示移位结构域和/或HCN结合亚结构域内的失活裂解位点区可对在失活位点区内置放两个或更多个蛋白酶裂解位点的修饰耐受。
为确定包含凝血酶裂解位点的BoNT/A是否可由凝血酶裂解，进行活体外凝血酶裂解测定。5μg各纯化BoNT/A-TCS与1U凝血酶(Novagen)在23℃下孵育1小时、3小时和18.5小时。也平行设立各BoNT/A-TCS的无酶对照。在各时间点获取样品且用包括DTT的SDS上样缓冲液淬灭并如上所述通过SDS-PAGE加以分析。
表7中给出表达分析的结果。一般来说，对包含SEQ ID NO:1的氨基酸467-496、844-863或871-895的失活裂解位点区进行的用以包括蛋白酶裂解位点的修饰产生易被适当蛋白酶蛋白水解裂解的毒素。
为确定包含凝血酶裂解位点的BoNT/A是否维持其效能，使用细胞基活性测定进行BoNT/A活性测定。为进行细胞基活性测定，将约1.2×106个Neuro-2a或SiMa细胞接种至24孔组织培养板的含有1mL无血清培养基的各孔中，所述培养基含有最低基础培养基、2mMGLUTAMAXTM I以及厄尔氏盐(Earle’s salt)、1×B27补充剂、1×N2补充剂、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES和25μg/mL GT1b。细胞在37℃培育箱中在5%二氧化碳下孵育直至细胞分化，如根据标准和常规形态学准则(诸如生长抑制和轴突扩展)所评估(约3天)。自各孔吸出培养基且替换为1)不含毒素的新鲜培养基(未处理细胞系)或2)含有1nM BoNT/A复合物的新鲜培养基(处理细胞系)。在过夜孵育之后，通过吸出培养基且用200μL1×PBS冲洗各孔来洗涤细胞。为收集细胞，吸出1×PBS，通过添加50μL2×SDS上样缓冲液来溶解细胞，将溶解产物转移至清洁试管中且加热样品至95℃持续5分钟。
为检测裂解SNAP-25产物的存在，通过蛋白质印迹来分析来自各收集样品的等分试样。在此分析中，通过使用
Figure BDA00002756375802421
Novex12%Bis-Tris预制聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)在变性还原条件下进行MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离收集样品的12μl等分试样。通过使用
Figure BDA00002756375802422
SD半干电泳转移槽装置(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)进行蛋白质印迹来将分离肽自凝胶转移于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)上。通过在室温下于含有Tris缓冲盐水(TBS)(25mM2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇盐酸(Tris-HCl)(pH7.4)、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾)、0.1%
Figure BDA00002756375802423
(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)、2%牛血清白蛋白(BSA)、5%脱脂奶粉的溶液中孵育2小时来阻断PVDF膜。阻断膜在4℃下于含有1)以1:5,000稀释的作为一次抗体的α-SNAP-25小鼠单克隆抗体(SMI-81；Sternberger Monoclonals公司,Lutherville,MD)；或2)以1:5,000稀释的作为一次抗体的S9684α-SNAP-25兔多克隆抗血清(Sigma,St.Louis,MO)的TBS、0.1%
Figure BDA00002756375802431
(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)、2%BSA和5%脱脂奶粉中孵育过夜。两种α-SNAP-25小鼠单克隆和兔多克隆抗体均可检测未裂解SNAP-25底物与SNAP-25裂解产物两者，从而允许评估各细胞系中的总体SNAP-25表达和在BoNT/A处理之后裂解SNAP-25的百分比，所述百分比为评估BoNT/A吸收量的参数。一次抗体探测的印迹于TBS、(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)中洗涤三次，每次持续15分钟。经过洗涤的膜在室温下于含有1)以1:10,000稀释的作为二次抗体的偶联至辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)的山羊多克隆抗小鼠免疫球蛋白G重链和轻链(IgG，H+L)抗体(Zymed,South San Francisco,CA)；或2)以1:10,000稀释的作为二次抗体的偶联至辣根过氧化物酶的山羊多克隆抗兔免疫球蛋白G重链和轻链(IgG，H+L)抗体(Zymed,South San Francisco,CA)的TBS、0.1%
Figure BDA00002756375802433
(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)、2%BSA和5%脱脂奶粉中孵育2小时。二次抗体探测的印迹于TBS、0.1%
Figure BDA00002756375802434
(聚氧化乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)中洗涤三次，每次持续15分钟。使用ECL PlusTM蛋白质印迹检测系统(GE Healthcare,Amersham Biosciences,Piscataway，NJ)观察经过标记的SNAP-25产物的信号检测且用Typhoon9410可变模式成像器和成像器分析软件(GE Healthcare,Amersham Biosciences,Piscataway，NJ)对膜进行成像并定量裂解百分比。对像素大小(100至200像素)和PMT电压设置(350至600，通常400)的选择取决于个别印迹。
表7中给出表达分析的结果。一般来说，对包含SEQ ID NO:1的氨基酸467-496、844-863、或871-895的失活裂解位点区进行的用以包括蛋白酶裂解位点的修饰产生能够执行总体中毒过程的强力毒素。
总之，这些结果指示尽管鉴定出八个不同失活裂解区，但并非所有皆能够支持功能性凝血酶裂解位点的插入。一般来说，对包含SEQID NO:1的氨基酸467-496、844-863、和871-895的失活裂解位点区进行的用以包括蛋白酶裂解位点的修饰产生稳定产生毒素，所述毒素能够执行总体中毒过程且对适当蛋白酶的蛋白水解裂解敏感。
因为所有梭菌毒素的三维结构类似，所以BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、TeNT、BaNT和BuNT中的相应位置也适合作为失活裂解位点区。表5列出这些区。
实施例2
蛋白酶裂解位点分析
此实施例说明如何制备包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。
为探究除凝血酶以外的蛋白酶裂解位点是否可用作失活位点，检查包含许多不同蛋白酶裂解位点的毒素。
为制备包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体，如实施例1中所述使用多引物诱变将蛋白酶裂解位点遗传工程改造到失活裂解位点区中。表8列出进行修饰以含有蛋白酶裂解位点的表达构建体。
为确定包含蛋白酶裂解位点的BoNT/A是否可由其同源蛋白酶裂解，基本上如上所述但使用适当蛋白酶而非凝血酶进行活体外蛋白酶裂解测定。在各时间点获取样品且用包括DTT的SDS上样缓冲液淬灭，并如实施例1中所述通过SDS-PAGE加以分析。
表7中给出表达分析的结果。一般来说，对包含SEQ ID NO:1的氨基酸467-496、844-863或871-895的失活裂解位点区进行的用以包括蛋白酶裂解位点的修饰产生易被适当蛋白酶蛋白水解裂解的毒素。
Figure BDA00002756375802451
Figure BDA00002756375802461
Figure BDA00002756375802471
为确定包含蛋白酶裂解位点的BoNT/A是否维持其效能，进行上述细胞基活性测定(表8)。一般来说，包含蛋白酶裂解位点的显示EC50为约20或20以下的毒素被视为保留足以确保使用动物基测定进行评估的效能。
实施例3
活体内分析
此实施例说明如何使用动物基测定分析来评估包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体。
尽管细胞基活性测定为对包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体是否可由其同源蛋白酶裂解的良好评估，但只选择某些候选物在动物基测定中进行评估。
为使用动物基测定测试包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的活性，最初进行活体内趾外展评分(Digit Abduction Score，DAS)测定。将CD-1Fe小鼠称重并置放于具有10只动物的子组中以进行各个别DAS测定。基于以下准则将小鼠纳入特定子组中：1)健康状况良好；2)稳固基线DAS反应为0；3)包括在针对所选子组确定的中值体重范围×±2g中以及4)体重大于17.0g。
使用30号针用以下各物注射各小鼠右后肢的腓肠肌：1)5μL10.0nM包含失活裂解位点的BoNT/A(单一剂量DAS研究)；或2)5μL七种不同剂量中的一种的包含失活裂解位点的BoNT/A(0.01nM、0.04nM、0.12nM、0.37nM、1.11nM、3.33nM和10.0nM；完全剂量DAS研究)。作为对照，左后肢的腓肠肌用5μL不含任何毒素的溶液注射。持续前4天连续观察小鼠的DAS反应。通过由尾部提起各小鼠且确切观察所注射的后肢来读取DAS。后趾外展或无外展揭示归因于注射于肌肉中的测试毒素的麻痹效应。将所注射后肢的趾外展与非注射后肢的趾外展进行比较且相应地加以评分。通过基于峰值平均DAS评分和AUC(曲线下面积)计算以u/Kg和/或ng/Kg表示的ED50剂量来分析DAS数据。这是如下实现的：
1)在各研究中计算各剂量的平均峰值DAS评分；2)在任何研究中引发五例以上死亡的任何剂量皆自考虑排除；3)给定个别研究中使用的最高剂量为引发平均峰值4.0的最低剂量；4)给定个别研究中使用的最低剂量为引发平均峰值0的最高剂量；5)构建各个别研究的平均峰值DAS对log(剂量)的曲线；6)在一些研究中计算多组中各组10只小鼠的AUC值；7)构建各个别研究的平均AUC对log(剂量)的曲线；8)构建各组针对各测试毒素的多个相同研究的x、y重复反应曲线；9)通过使用利用以下方程的三参数逻辑斯谛方程(logisticequation)(Sigma Plot v8.0；SPSS Science,Chicago,Illinois)进行非线性回归(非加权)来分析剂量-反应数据：
y＝a/(1+(x/x0)b)
其中y为反应，a为渐近y最大，b为斜率，x为剂量，且0为ED50剂量，对于峰值ED50确定来说，Y最大设为4(量表上读取的最大DAS)。计算所进行的各八剂量研究的平均(峰值和/或AUC)ED50值。
结果说明所述情况(表9)。一般来说，包含失活裂解位点的显示相对效能为约10或10以上的毒素被视为保留足以确保对其安全性界限进行评估的效能。
为确定包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限，进行小鼠致死性测定。
为计算包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体的安全性界限，用自小鼠致死性测定获得的LD50值除以自完全剂量DAS研究获得的EC50值。若包含失活裂解位点的毒素显示安全性界限值为约15或15以上，则其被视为在失活裂解位点处具有足够活性。
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在DAS分析之后，使用小鼠致死性测定评估包含失活裂解位点的梭菌毒素或梭菌毒素嵌合体以通过比较ED50与LD50来确定安全性界限。
尽管本说明书的多个方面已关于公开的实施方案加以描述，但本领域技术人员将易于了解公开的特定实施例仅说明这些方面且决不限制本说明书。可在不脱离本说明书的精神的情况下进行各种修改。
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Claims (15)

1.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含至少一个位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中，其中所述至少一个失活裂解位点包含双重凝血酶-凝血酶位点、因子Xa位点、双重因子Xa-凝血酶位点和/或MMP-9位点。
2.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、梭菌毒素结合结构域、双链环区、外源性蛋白酶裂解位点和至少两个位于失活裂解位点区内的失活裂解位点；其中所述外源性蛋白酶裂解位点位于所述双链环区内。
3.如权利要求2所述的梭菌毒素，其中所述失活裂解位点包含双重凝血酶-凝血酶位点和/或双重因子Xa-凝血酶位点。
4.一种梭菌毒素嵌合体，所述梭菌毒素嵌合体包含梭菌毒素酶促结构域、梭菌毒素移位结构域、非梭菌毒素结合结构域和位于失活裂解位点区内的失活裂解位点，其中所述失活裂解位点区位于移位结构域和/或HCN结合亚结构域中。
5.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸462-496；SEQ ID NO:3的氨基酸458-492；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸464-487；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸463-496；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸458-491；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸434-467；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸453-486；SEQ ID NO:21的氨基酸458-491；SEQ ID NO:23的氨基酸443-476；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸434-467。
6.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸618-634；SEQ ID NO:3的氨基酸614-630；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸605-621；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸613-629；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸609-625；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸587-603；SEQ ID NO:18的氨基酸604-620；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸605-621；SEQ ID NO:21的氨基酸610-626；SEQ ID NO:23的氨基酸596-612；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸587-603。
7.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸638-651；SEQ ID NO:3的氨基酸634-647；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸625-638；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸633-646；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸629-642；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸607-620；SEQ ID NO:18的氨基酸624-637；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸625-638；SEQ ID NO:21的氨基酸630-643；SEQ ID NO:23的氨基酸616-629；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸607-620。
8.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸665-687；SEQ ID NO:3的氨基酸661-683；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸652-674；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸660-682；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸656-678；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸634-659；SEQ ID NO:18的氨基酸651-676；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸652-677；SEQ ID NO:21的氨基酸657-679；SEQ ID NO:23的氨基酸643-668；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸634-659。
9.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸752-765；SEQ ID NO:3的氨基酸748-761；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸739-752；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸747-760；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸743-756；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸724-739；SEQ ID NO:18的氨基酸741-756；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸742-757；SEQ ID NO:21的氨基酸744-757；SEQ ID NO:23的氨基酸733-748；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸724-739。
10.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸826-835；SEQ ID NO:3的氨基酸824-831；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸813-824；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸821-830；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸817-826；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸800-809；SEQ ID NO:18的氨基酸817-826；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸818-827；SEQ ID NO:21的氨基酸818-827；SEQ ID NO:23的氨基酸809-819；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸800-809。
11.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸844-863；SEQ ID NO:3的氨基酸840-859；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸831-850；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸839-858；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸835-854；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸818-837；SEQ ID NO:18的氨基酸835-854；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸836-855；SEQ ID NO:21的氨基酸836-855；SEQ ID NO:23的氨基酸828-847；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸818-837。
12.如权利要求1至4所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸871-895；SEQ ID NO:3的氨基酸867-891；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸858-882；SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12的氨基酸866-890；SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的氨基酸862-886；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:17的氨基酸845-869；SEQ ID NO:18的氨基酸862-886；SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20的氨基酸863-887；SEQ ID NO:21的氨基酸863-887；SEQ ID NO:23的氨基酸855-879；和/或SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸845-869。
13.如权利要求1至12所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、BaNT酶促结构域和/或BuNT酶促结构域。
14.如权利要求1至13所述的梭菌毒素和/或梭菌毒素嵌合体，其中所述失活裂解位点包含凝血酶裂解位点、纤溶酶裂解位点、凝血因子VIIa裂解位点、凝血因子IXa裂解位点、凝血因子Xa裂解位点、凝血因子XIa裂解位点、凝血因子XIIa裂解位点、血浆激肽释放酶裂解位点、蛋白酶活化G蛋白偶联受体-1(PAR1)裂解位点、PAR2裂解位点、PAR3裂解位点、PAR4裂解位点、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)裂解位点、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)裂解位点、弗林蛋白酶裂解位点、尿激酶型纤溶酶原活化因子(uPA)裂解位点、组织型纤溶酶原活化因子(tPA)裂解位点、类胰蛋白酶-ε裂解位点、小鼠肥大细胞蛋白酶-7(mMCP-7)裂解位点、内皮素转化酶-1(ECE-1)裂解位点、凯尔血型裂解位点、DPPIV裂解位点、具有血小板反应蛋白1型基序的ADAM金属肽酶-13(ADAMTS13)裂解位点和/或组织蛋白酶L裂解位点。
15.一种梭菌毒素，所述梭菌毒素包含SEQ ID NO:531、SEQ IDNO:533、SEQ ID NO:535和/或SEQ ID NO:537。
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