KR20200101953A - 보툴리눔 독소 세포 결합 도메인 폴리펩티드 및 섬유증 연관 장애의 치료를 위한 사용 방법 - Google Patents

Abstract

보툴리눔 독소의 결합 도메인에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 기재된다. 폴리펩티드는, 예를 들어 콜라겐 생산 및 세포외 매트릭스 조직화에 관여하는 유전자의 발현을 조정하고, 따라서 질환, 예컨대 ECM 질환, 결합 또는 상피 조직 질환, 내피 질환 또는 섬유화 질환, 예를 들어 ECM, 결합 조직 또는 내피의 섬유화 질환을 치료하거나 그의 발생을 감소시키는데 사용된다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 숙주 세포 및 시스템이 추가로 기재된다.

Description

보툴리눔 독소 세포 결합 도메인 폴리펩티드 및 섬유증 연관 장애의 치료를 위한 사용 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2017년 12월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/608,119 및 2018년 9월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/727,640을 우선권 주장하며, 이들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2018년 12월 19일에 생성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 19980-US-A-NTB_SL.txt이고 크기가 71,997 바이트이다.

기술 분야

본 개시내용은 일반적으로 보툴리눔 독소의 세포 결합 도메인으로부터의 폴리펩티드 및 섬유증과 연관된 질환 및 상태를 포함한 치료적 적용을 위한 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

혐기성 그람 양성 박테리아인 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 널리-기록된 의학적 적용을 갖는 강력한 폴리펩티드 신경독소인 보툴리눔 독소 (BoNT)를 생산한다. 자연 발생 클로스트리디움 독소는 각각, 효소 도메인을 포함하는 대략 50 kDa 경쇄 (LC) 및 N-말단 전위 도메인 (H_N) 및 C-말단 수용체-결합 도메인 (H_C)을 포함하는 대략 100 kDa 중쇄를 포함하는 대략 150 킬로 달톤 (kDa)의 단일-쇄 폴리펩티드로 번역된다. 따라서, 전장 클로스트리디움 독소 분자는 다음 3개의 기능적으로 뚜렷이 다른 도메인을 포함한다: (1) 신경전달물질 방출 기관의 핵심 성분을 특이적으로 표적화하는, 아연-의존성 엔도펩티다제를 함유하는 메탈로프로테아제 영역을 포함하는, LC에 위치한 효소 도메인; (2) 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질 내로의 LC의 방출을 용이하게 하는 중쇄의 아미노-말단 절반 내에 함유된 전위 도메인 (H_N); 및 (3) 표적 세포의 표면에 위치하는 수용체에 대한 독소의 결합 친화도 및 특이성을 결정하는 중쇄의 카르복실-말단 절반 내에서 발견되는 결합 도메인 (H_C). 결합 도메인은 N-말단 서브도메인 (H_CN) 및 C-말단 서브도메인 (H_CC)으로 지정된 대략 동일한 크기의 2개의 별개의 구조적 특색을 포함한다.

이러한 독소 아키텍처는 다양한 면역학적으로-뚜렷이 다른 보툴리눔 신경독소, 예를 들어 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, B, C₁, D, DC, E, F, G, X 및 J에 존재한다. 혈청형에 관계없이, 전장 150 kDa 독소 단백질과 그 내부의 개별 도메인 사이에 현저한 정도의 구조적 및 기능적 상동성이 존재한다. 이와 관련하여, BoNT는 서로 대략 35% 아미노산 동일성을 보유하고 동일한 기능적 도메인 조직화 및 전체 구조 아키텍처를 공유한다. 각 유형의 클로스트리디움 독소 내에는 또한 아미노산 서열이 다소 상이한 하위유형이 존재하지만; 다양한 도메인, 예를 들어 엔도펩티다제, 전위 및 세포-결합 도메인의 도메인 아키텍처는 이러한 개별 하위유형 내에서 또한 보존된다. 예를 들어, 현재 5종의 BoNT/A 하위유형, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3 BoNT/A4 및 BoNT/A5가 존재하며; 이들은 대략 89%의 전체 아미노산 동일성을 공유한다. 상기 슈퍼패밀리의 다른 구성원, 예를 들어 균일한 씨. 테타니(C. tetani) 군에 의해 생산된 파상풍 독소 (TeNT) 및 클로스트리디아 종에 의해 생산된 다른 관련 독소, 예를 들어 BaNT (씨. 바라티이(C. baratii)에 의해 생산됨) 및 BuNT (씨. 부티리쿰(C. butyricum)에 의해 생산됨)는 또한 상기 언급된 클로스트리디움 독소, 예를 들어 BoNT/F 및 BoNT/E와, 예를 들어 아미노산 서열 동일성에 있어서 구조적으로 유사하다.

기존 제약 제제는 전장 클로스트리디움 독소를 함유한다. 전체 클로스트리디움 독소와 비교하여 개선된 치료 프로파일, 예를 들어 개선된 안전성, 증진된 안정성 및/또는 더 우수한 생체내 효능을 제공하면서, 전장과 대등한 (전장보다 더 우수하지 않은 경우에) 생물학적 활성을 갖는 클로스트리디움 독소 단편 및 변이체에 대한 필요성이 존재한다.

본 개시내용의 BoNT 폴리펩티드의 다양한 치료적 적용이 본원에 기재된다. 예를 들어, BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)을 함유하는 폴리펩티드, 그의 단편 또는 변이체로의 처리는 정상 인간 1차 섬유모세포에서 다수의 유전자의 발현을 조정하였다. 예를 들어, 정상 인간 1차 섬유모세포를 본 개시내용의 폴리펩티드로 처리한 것은 세포외 매트릭스 (ECM) 파괴 및 재형성과 관련된, 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP1 및 MMP3 및 메탈로프로테이나제 억제제 TIMP1의 상향-조절, 및 공지된 섬유증 마커이자 알파-평활근 액틴 (α-SMA)의 유도제인 S100 칼슘-결합 단백질 A4 (S100A4)의 하향-조절, 및 섬유모세포 수축성 및 근섬유모세포 형성과 연관된 것으로 공지된 α-SMA/ACTA2 (액틴, 알파 2, 평활근, 대동맥)의 하향-조절을 가져왔다. 이들 관찰은 본 개시내용의 폴리펩티드가, 예를 들어 과량의 또는 손상된 세포외 매트릭스 (ECM) 성분을 제거함으로써 피부 ECM을 생성, 유지 및 복구하는 것과 관련된 단백질의 발현에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 반흔 형성 및 섬유증은 ECM 성분의 이상 생산과 연관되기 때문에, 데이터는 본 개시내용의 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 시사한다. BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)으로의 처리는 또한 qPCR에 기초하여 18종의 섬유모세포 유전자 발현의 유의한 용량-의존성 변화를 가져왔다. 주목할 만하게, 조직 및 ECM 항상성, 재형성, 재생 및 복구와 관련된 것으로 공지된 유전자의 발현은 증가한 반면에 섬유증과 연관된 2종의 유전자의 발현은 감소하였다.

추가적으로, 본 개시내용의 폴리펩티드로의 처리는 원발성 피부 반흔 유래된 섬유모세포로부터, 성숙 콜라겐 섬유의 전구체인 프로콜라겐 펩티드의 분비를 감소시켰으며, 이는 폴리펩티드가 진피 세포외 매트릭스 (ECM)의 주요 성분인 콜라겐 생산에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 반흔 형성 및 섬유증은 콜라겐의 이상 생산과 연관되기 때문에, 이들 관찰은 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 시사한다. 이러한 효과는 본 연구에서 2종의 공지된 항섬유화제인 항-CTGF 및 항-TGFβ 항체의 효과와 유사하거나 더 크며, 이는 본 개시내용의 폴리펩티드가 유사한 또는 추가적인 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 시사한다.

본 개시내용의 폴리펩티드, 예를 들어 BoNT/A (H_C/A)로의 처리는 피브린 히드로겔 검정에서 원발성 피부 켈로이드 반흔-유래된 섬유모세포의 수축성을 감소시켰다. 섬유모세포 수축성은, 예를 들어 섬유모세포가 수축하여 상처를 봉합하거나 기존의 반흔을 변환시키기 때문에, 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 이행 및 반흔 형성과 연관된다. 따라서, 관찰된 데이터는 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 환자에서 상처 봉합 동안 수축성을 억제하고 반흔 형성을 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다.

본 개시내용의 폴리펩티드, 예를 들어 BoNT/A (H_C/A)는 저산소증에 의해 섬유증이 유발된 섬유화 상피 인간 유방암 세포로부터 다수의 단백질의 분비에 영향을 미쳤으며, 예를 들어 피부 ECM의 핵심 구조적 성분인 피브로넥틴, 콜라겐 IV 및 트롬보스폰딘-1의 분비를 감소시켰고, 예를 들어 과량의 또는 손상된 ECM 성분을 분해함으로써 피부 ECM을 생성, 유지 및 복구하는 것과 관련된 메탈로프로테이나제 및 메탈로프로테이나제 억제제 단백질인 MMP1 및 TIMP1의 분비를 증가시켰다. 반흔 형성 및 섬유증은 콜라겐 및 다른 ECM 성분의 이상 생산과 연관되기 때문에, 이들 관찰은 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 그의 단편, 예를 들어 N-말단 절반 (H_CN)이 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 시사한다. 이러한 효과는 공지된 항섬유화제인 항-CTGF (FG-3019) 항체의 효과와 유사하거나 더 크다. 상기 데이터는 인간 환자에서 저산소증 유발된 섬유증, 예를 들어 조직 및 기관의 섬유성 및 반흔을 감소시켜, 예를 들어 조직 및 기관 섬유증의 억제 또는 역전 및 시각적 반흔의 감소를 가져오는데 있어서 본 개시내용의 폴리펩티드, 예를 들어 BoNT/A (H_C/A) 또는 그의 단편, 예를 들어 BoNT/A (H_CN/A)의 용도를 가리킨다. 특히, 켈로이드 섬유모세포를 사용한 실험에서, 데이터는 본 개시내용의 폴리펩티드, 예를 들어 BoNT/A (H_C/A) 또는 그의 단편, 예를 들어 BoNT/A (H_CN/A)가 피부 ECM의 핵심 성분이자 반흔 형성 및 섬유증에서의 매개자인 인간 켈로이드 반흔 섬유모세포 (KF116R) 세포로부터의 피브로넥틴의 분비를 조정한다는 것을 보여준다.

추가의 연구는 본 개시내용의 폴리펩티드, 예를 들어 BoNT/A (H_C/A)가 정상 인간 1차 섬유모세포 (HDFa)로부터 콜라겐 및 락토트랜스페린을 포함한 단백질의 분비를 감소시켰고, 후자의 단백질은 섬유모세포 수축성을 증가시키는 것으로 나타났음을 보여주었다. 반흔 형성 및 섬유증이 콜라겐의 이상 생산 및 증가된 수축성과 연관되기 때문에, 이는 본 개시내용의 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 시사한다.

BoNT/DC (H_C/DC)를 사용한 병행 연구는 유사한 결과를 나타냈다. 예를 들어, H_C/DC 처리는 세포외 매트릭스 파괴 및 재형성과 관련된, MMP1 및 MMP3 및 메탈로프로테이나제 억제제 TIMP1의 상향-조절, 및 공지된 섬유증 유도제인 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 및 섬유모세포 수축성과 연관되고 근섬유모세포 형성의 마커인 알파-평활근 액틴 (α-SMA/ACTA2)의 하향-조절을 포함한, 인간 반흔 유래된 1차 섬유모세포에서의 다수의 유전자의 발현을 조정하였다. H_C/DC는 H_CN/A와 비교하여 일부 유전자 발현을 조정하는데 더 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 이는 상이한 BoNT 혈청형이 상이한 효과를 갖는다는 것을 시사한다. 이들 발견은 다른 추가의 BoNT 혈청형이 BoNT/A (H_C/A) 및 BoNT/DC (H_C/DC)와 유사한 방식으로 섬유증에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다.

본 개시내용은 하기 비제한적 실시양태에 관한 것이다:

한 측면에서, 클로스트리디움 독소, 예컨대 보툴리눔 독소의 결합 도메인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열 및 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 기재된다. 한 실시양태에서, 세포외 매트릭스 (ECM) 조절이상과 연관된 상태 또는 장애를 완화시키거나 그의 발생을 감소시키기 위해 세포 신호전달에 참여하고/거나 표적 세포에서 세포 유전자 발현을 조정하는 폴리펩티드 서열이 기재된다. 한 실시양태에서, 예를 들어 ECM 조직화, 복구, 재생에 관여하는 유전자, 예컨대, 예를 들어 MMP1 (매트릭스 메탈로프로테이나제-1), MMP3 (매트릭스 메탈로프로테이나제-3), TIMP1 (메탈로펩티다제 억제제 1)의 발현을 상향조절함으로써 ECM을 복구하는 폴리펩티드 서열이 기재된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은, 예를 들어 섬유모세포 수축성, 근섬유모세포 형성 및/또는 반흔 형성과 연관된 단백질의 발현 및/또는 분비를 하향-조절함으로써 섬유화 장애를 완화시키거나 그의 발생을 감소시킨다.

또 다른 측면에서, 보툴리눔 독소의 결합 도메인 내의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 1 kDa 내지 약 90 kDa의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드의 분자량은 약 4 kDa 내지 약 60 kD이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드의 분자량은 약 12 kDa 내지 약 50 kD이다.

또 다른 측면에서, 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 분자량은 약 1 kDa 내지 약 90 kDa이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드의 분자량은 약 4 kDa 내지 약 60 kD이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드의 분자량은 약 12 kDa 내지 약 50 kD이다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 독성이 결여된 보툴리눔 독소의 전장 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 독성이 결여된 보툴리눔 독소의 전장 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 중쇄의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 중쇄의 카르복실 또는 C-말단 절편 (H_C)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노 또는 N-말단 절반 (H_CN)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 N-말단 절반과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A), 보툴리눔 독소 혈청형 B (BoNT/B), 보툴리눔 독소 혈청형 C₁ (BoNT/C₁), 보툴리눔 독소 혈청형 D (BoNT/D), 보툴리눔 독소 혈청형 E (BoNT/E), 보툴리눔 독소 혈청형 F (BoNT/F), 보툴리눔 독소 혈청형 G (BoNT/G), 보툴리눔 독소 혈청형 H (BoNT/H), 보툴리눔 독소 혈청형 X (BoNT/X), 엔테로코쿠스(Enterococcus) 종 보툴리눔 독소 J (eBoNT/J) 및 모자이크 보툴리눔 독소 및/또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 모자이크 독소의 예는 BoNT/DC, BoNT/CD 및 BoNT/FA를 포함한다. 한 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A)가 아니다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 섬유증 연관 단백질의 발현을 조정할 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 표적 세포에서 섬유증 연관 단백질, 예컨대, 예를 들어 S100A4 (S100 칼슘-결합 단백질 A4) 및 ACTA2 (액틴, 알파 2, 평활근, 대동맥)를 감소시킬 수 있다. 대안적 실시양태에서, 폴리펩티드는 섬유증 연관 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 섬유모세포, 반흔 유래된 섬유모세포, 켈로이드 반흔 유래된 섬유모세포, 비대성 반흔 유래된 섬유모세포, 섬유화 세포, 암세포 및 근섬유모세포이다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 ECM 조직화, 복구, 재생 및/또는 재형성에 관여하는 세포외 매트릭스 단백질의 발현을 조정할 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 FGFR1 (섬유모세포 성장 인자 수용체 1), MMP1, MMP3, TIMP1, FGF7 (섬유모세포 성장 인자 7), TP63 (종양 단백질 p63), SOD2 (슈퍼옥시드 디스뮤타제 2, 미토콘드리아), UBD (유비퀴틴 D), HAS2, HAS3 (히알루로난 신타제), ADAMTS1 (트롬보스폰딘 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 1), IGF-1 (인슐린-유사 성장 인자 1), IL-6, IL-32 (인터류킨), CCL2 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2), BDKRB1 (브라디키닌 수용체 B1), S1000A4 및 ACTA2로부터 선택된 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 발현을 조정할 수 있다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표적 세포에서 FGFR1, MMP1, MMP3, TIMP1, FGF7 및 TP63으로부터 선택된 유전자를 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 섬유화 세포, 반흔 유래된 섬유모세포를 포함한다.

다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 표적 세포로부터의 프로콜라겐 펩티드 분비를 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표적 세포로부터 수축성을 촉진하는데 관여하는 콜라겐 및/또는 단백질의 발현 및/또는 분비를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 정상 섬유모세포, 반흔 유래된 섬유모세포, 섬유화 세포, 섬유화 암 세포 또는 그의 조합을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 표적 세포, 예컨대, 예를 들어 피부 반흔 섬유모세포의 수축성을 감소시켜 표적 세포의 반흔 형성을 감소시킬 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 표적 세포로부터의 섬유증 연관 단백질의 발현을 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유증 연관 단백질은 피브로넥틴, 콜라겐, 락토트랜스페린, 트롬보스폰딘-1, MMP1, MMP3 및 TIMP1의 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 표적 세포는 섬유모세포, 반흔 유래된 섬유모세포, 섬유화 세포 및 암 세포의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 피브로넥틴, 콜라겐, 트롬보스폰딘-1 및 락토트랜스페린의 생산 및/또는 분비를 감소시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 MMP1, TIMP1의 생산 및/또는 분비를 증가시킬 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드에는 보툴리눔 독소 엔도펩티다제 활성이 결여되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드에는 보툴리눔 독소 전위 활성이 결여되어 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 중쇄의 아미노 말단 (H_N)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 결여되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 12-18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 12-18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 12-18에 제시된 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 12-18에 제시된 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 단 폴리펩티드는 폴리펩티드 서열에 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이를 함유한다. 바람직하게는, 돌연변이체 폴리펩티드, 예를 들어 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26 또는 서열식별번호: 27에 제시된 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 돌연변이체 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 폴리펩티드 서열에 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이를 함유한다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 제공된다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 국소 또는 경피 투여용으로 제제화된다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 키트가 기재된다. 일부 실시양태에서, 키트는 투여에 대한 지침서를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 1개 이상의 패키지를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 세포외 매트릭스 (ECM) 조절이상과 연관된 상태 또는 장애; ECM 질환; 결합 또는 상피 조직 질환; 내피 질환; 및 섬유화 질환; 바람직하게는 섬유화 질환; 및 특히 ECM, 결합 또는 상피 조직 또는 내피 조직의 섬유화 질환을 완화시키고/거나 그의 발생을 감소시키는 방법이 제공된다.

일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 전장 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노 또는 N-말단 절반 (H_CN)의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 20 kDa 내지 약 60 kDa의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 피부 질적 속성을 조정하는 것은 안면 근육의 마비를 수반하지 않는다. 일부 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A), 보툴리눔 독소 혈청형 B (BoNT/B), 보툴리눔 독소 혈청형 C₁ (BoNT/C₁), 보툴리눔 독소 혈청형 D (BoNT/D), 보툴리눔 독소 혈청형 E (BoNT/E), 보툴리눔 독소 혈청형 F (BoNT/F), 보툴리눔 독소 혈청형 G (BoNT/G), 보툴리눔 독소 혈청형 H (BoNT/H), 보툴리눔 독소 혈청형 X (BoNT/X), 엔테로코쿠스 종 보툴리눔 독소 J (eBoNT/J) 및 모자이크 보툴리눔 독소 및/또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 모자이크 독소의 예는 BoNT/DC, BoNT/CD 및 BoNT/FA를 포함한다. 한 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A)가 아니다.

또 다른 측면에서, 섬유화 장애의 완화 및/또는 그의 발생의 감소를 필요로 하는 대상체에서 섬유화 장애를 완화시키고/거나 그의 발생을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 전장 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노 또는 N-말단 절반 (H_CN)의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 N-말단 절반 (H_CN)에 대한 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 20 kDa 내지 약 60 kDa의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, ECM 조절이상과 연관된 상태 또는 장애를 치료하거나 그의 발생을 감소시키는 것은 표적 근육의 마비를 수반하지 않는다.

한 실시양태에서, 섬유화 장애는 특발성 폐 섬유증, 신장 섬유증, 사구체경화증, 안구 섬유증, 골관절염, 경피증, 심장 섬유증 및 간 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 섬유증은 신장, 눈, 폐, 간, 심장 및 피부 (이에 제한되지는 않음)로부터 선택된 기관 또는 결합, 상피 및 내피 조직 (이에 제한되지는 않음)으로부터 선택된 조직을 포함한 임의의 기관 또는 조직에서 발생할 수 있다. 결합 조직은 섬유모세포, 골모세포, 연골세포, 근세포 및 지방세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 반흔의 치료, 완화 및/또는 그의 발생의 감소를 필요로 하는 대상체에서 반흔을 치료, 완화시키고/거나 그의 발생을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 전장 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노 또는 N-말단 절반 (H_CN)의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노 또는 N-말단 절반 (H_CN)의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 20 kDa 내지 약 60 kDa의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, ECM 조절이상과 연관된 상태 또는 장애를 치료하거나 그의 발생을 감소시키는 것은 표적 근육의 마비를 수반하지 않는다.

일부 실시양태에서, 반흔은 피부 반흔, 예컨대, 예를 들어 비대성, 켈로이드, 위축성, 튼살, 피막 구축, 및 제대 반흔, 상처 반흔, 외과적 반흔, 예컨대, 예를 들어 제왕절개, 복부성형술, 유방 확대, 복부 수술, 안면 리프트 또는 필러 주사 후 그로부터 생성된 반흔으로부터 선택된 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 결합, 상피 또는 내피 조직과 연관된 섬유화 장애의 치료 또는 그의 발생 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 섬유화 장애를 치료하거나 그의 발생을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 전장 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노 또는 N-말단 절반 (H_CN)의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노 또는 N-말단 절반 (H_CN)의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 20 kDa 내지 약 60 kDa의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, ECM 조절이상과 연관된 상태 또는 장애를 치료하거나 그의 발생을 감소시키는 것은 표적 근육의 마비를 수반하지 않는다.

일부 실시양태에서, 결합 또는 상피 또는 내피 조직 섬유모세포와 연관된 질환 또는 장애는 피부 반흔 (비대성, 켈로이드, 위축성 (예를 들어 여드름에서), 튼살 및 제대), 상처 반흔, 외과적 반흔 (예를 들어 제왕절개, 복부성형술, 유방 확대, 복부 수술, 안면 리프트 또는 필러 주사 후), 수술후 복강내 유착, 섬유종, 간 섬유증, 간경변증, 췌장염, 양성 전립선 비대증, 섬유화 방광, 간질성 방광염, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 사구체경화증, 심방 섬유증, 심내막심근 섬유증, 신경교 반흔, 동맥 강성, 관절섬유증, 낭성 섬유증, 비-낭성 섬유증, 크론병, 듀피트렌 구축, 종격 섬유증, 골수섬유증, 페이로니병, 신원성 전신 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 복막후 섬유증, 유착성 피막염, 혼합 결합 조직 질환, 안구 섬유증, 골관절염, 경피증, 천식, 및 안구 섬유증 관련 상태를 포함한다. 섬유증은 신장, 눈, 폐, 간, 심장 및 피부 (이에 제한되지는 않음)로부터 선택된 기관 또는 결합, 상피 또는 내피 조직 (이에 제한되지는 않음)으로부터 선택된 조직을 포함한 임의의 기관 또는 조직에서 발생할 수 있다.

다른 실시양태에서, 조성물은 국소, 경피 또는 피내 투여용으로 제제화된다.

한 실시양태에서, 임의의 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 19, 3-18 및 25-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다.

다른 측면에서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드가 제공된다:

(a) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 약 1 kDa 내지 약 90 kDa인 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA;

(b) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 약 1 kDa 내지 약 90 kDa인 폴리펩티드를 코딩하는 합성 DNA;

(c) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 약 1 kDa 내지 약 90 kDa인 폴리펩티드를 코딩하는 코돈-최적화된 DNA; 및

(d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA에 상보적인 DNA.

다른 측면에서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드가 제공된다:

(a) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 50 kDa 미만인 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA;

(b) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 50 kDa 미만인 폴리펩티드를 코딩하는 합성 DNA;

(c) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 50 kDa 미만인 폴리펩티드를 코딩하는 코돈-최적화된 DNA; 및

(d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA에 상보적인 DNA.

다른 측면에서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드가 제공된다:

(a) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 1 kDa 초과 15 kDa 미만인 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA;

(b) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 1 kDa 초과 15 kDa 미만인 폴리펩티드를 코딩하는 합성 DNA;

(c) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 1 kDa 초과 15 kDa 미만인 폴리펩티드를 코딩하는 코돈-최적화된 DNA; 및

(d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA에 상보적인 DNA.

또 다른 측면에서, 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 12-18 및 서열식별번호: 25-27로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 그의 축중물 또는 그의 RNA 등가물에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 그 초과의 % 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2에 제시된 핵산 서열 또는 그의 축중물 또는 그의 RNA 등가물로 본질적으로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 다른 측면에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 클로스트리디움 보툴리눔이 아니다.

다른 측면에서, 키트, 조성물, 및 키트 및 조성물을 사용하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 패키지에, 벡터 및 적합한 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것에 대한 지침서를 포함하는 키트가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 벡터 또는 숙주 세포 및 제약 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 투여하여 폴리펩티드의 발현을 달성하는 것을 포함하는, 섬유화 장애를 치료하고/거나 그의 발생을 감소시키는 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 투여하여 폴리펩티드의 발현을 달성하는 것을 포함하는, 반흔을 치료하고/거나 그의 발생을 감소시키는 방법이 제공된다.

[서열의 간단한 설명]

서열식별번호: 1은 BoNT/A1의 세포 결합 도메인 (H_C/A)의 아미노산 서열이다:

서열식별번호: 19는 N-말단 his-태그를 추가로 포함하는 BoNT/A1의 세포 결합 도메인 (H_C/A)의 아미노산 서열이다 (N-말단 태그를 구성하는 아미노산은 밑줄표시됨):

서열식별번호: 2는 BoNT/A1의 세포 결합 도메인의 DNA 서열이다:

서열식별번호: 3은 BoNT/B의 중쇄 내의 결합 도메인 영역 H_C/B의 아미노산 서열이다 (진뱅크(GENBANK) 수탁 번호 BAE48264):

서열식별번호: 4는 BoNT/C의 중쇄 내의 결합 도메인 영역 H_C/C의 아미노산 서열이다 (진뱅크 수탁 번호 P18640):

서열식별번호: 5는 BoNT/D의 중쇄 내의 결합 도메인 영역 H_C/D의 아미노산 서열이다 (진뱅크 수탁 번호 P19321):

서열식별번호: 6은 BoNT/DC의 중쇄 내의 결합 도메인 영역 H_C/DC의 아미노산 서열이다 (진뱅크 수탁 번호 EF378947):

서열식별번호: 20은 N-말단 his-태그 (N-말단 태그를 구성하는 아미노산은 밑줄표시됨)를 추가로 포함하는, BoNT/DC의 중쇄 내의 결합 도메인 영역의 아미노산 서열이다 (진뱅크 수탁 번호 EF378947):

서열식별번호: 7은 BoNT/E의 중쇄 내의 결합 도메인 영역 H_C/E의 아미노산 서열이다 (진뱅크 수탁 번호 AFV91344):

서열식별번호: 8은 BoNT/F의 중쇄 내의 결합 도메인 영역 H_C/F의 아미노산 서열이다 (진뱅크 수탁 번호 ABS41202):

서열식별번호: 9는 BoNT/G의 중쇄 내의 결합 도메인 영역 H_C/G의 아미노산 서열이다 (진뱅크 수탁 번호 X74162):

서열식별번호: 10은 BoNT/X의 중쇄 내의 결합 도메인 영역 H_C/X의 아미노산 서열이다 (진뱅크 수탁 번호 BAQ12790):

서열식별번호: 11은 세포 결합 도메인의 N-말단 단편으로 지칭되고 H_CN/A로 약칭되는, BoNT/A1의 세포 결합 도메인의 아미노산 서열의 잔기 1-218에 상응하는 아미노산 서열이다 (PDB ID: 3BTA, 4JRA):

서열식별번호: 21은 N-말단 히스티딘 태그 및 BoNT/A1의 세포 결합 도메인 (H_C/A)의 아미노산 서열의 잔기 1-218을 포함하는 아미노산 서열이다 (N-말단 태그를 구성하는 아미노산은 밑줄표시됨):

서열식별번호: 12는 BoNT/B의 결합 도메인의 N-말단 영역 H_CN/B로부터의 아미노산 서열이다 (PDB ID: 2NM1):

서열식별번호: 13은 BoNT/C의 결합 도메인의 N-말단 영역 H_CN/C로부터의 아미노산 서열이다 (PDB ID: 3R4U):

서열식별번호: 14는 BoNT/D의 결합 도메인의 N-말단 영역 H_CN/D로부터의 아미노산 서열이다 (PDB ID: 3N7J):

서열식별번호: 15는 BoNT/DC의 결합 도메인의 N-말단 영역 H_CN/DC로부터의 아미노산 서열이다 (PDB ID: 4ISQ):

서열식별번호: 16은 BoNT/E의 결합 도메인의 N-말단 영역 H_CN/E로부터의 아미노산 서열이다 (PDB: 4ZKT):

서열식별번호: 17은 BoNT/F의 결합 도메인의 N-말단 영역 H_CN/F로부터의 아미노산 서열이다 (PDB ID: 3RSJ):

서열식별번호: 18은 BoNT/G의 결합 도메인의 N-말단 영역 H_CN/G로부터의 아미노산 서열이다 (PDB ID: 2VXR):

본 개시내용의 하나 이상의 실시양태의 세부사항은 첨부 도면/표 및 하기 설명에 제시되어 있다. 본 개시내용의 다른 특색, 목적 및 이점은 도면/표 및 상세한 설명 및 청구범위로부터 분명해질 것이다.
도 1은 10 nM (진한 막대), 100 nM (비어있는 막대) 또는 1 μM (빗금친 막대)의 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 1일 (24시간) 동안 처리한 후 정상 인간 1차 섬유모세포에서의 나타낸 유전자 발현의 배수-변화를 보여주는 막대 그래프이며, 여기서 배수-변화는 비처리 대조군 세포에 비해 표현되어 있다.
도 2는 1 nM (수평선으로 채워짐), 10 nM (비어있는 막대), 100 nM (빗금친 막대) 또는 1 μM (진한 막대)의 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 24시간 동안 처리한 후 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포에서의 나타낸 유전자 발현의 배수-변화를 보여주는 막대 그래프이며, 여기서 배수-변화는 비처리 대조군 세포에 비해 표현되어 있다.
도 3은 1 μM의 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 후 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포로부터 배지 내로 분비된 프로콜라겐 유형 I C-펩티드 (PIP)의 양 (ng/mL)을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 1 μM의 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 후 섬유모세포 수축성 및 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 이행에 대한 척도인, 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포를 갖는 피브린 히드로겔의 크기 (cm²)를 보여주는 막대 그래프이다.
도 5a-5e는 20 pM, 0.1 μM 또는 1 μM의 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 후 저산소증에 의해 섬유증이 유발된 섬유화 MDA-231 세포로부터 배지 내로 분비된, 각각 피브로넥틴, 콜라겐 IV, 트롬보스폰딘-1, MMP1 및 TIMP1의 양 (ng/mL)을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6은 0 (배지 단독 대조군, 비어있는 막대), 20 pM (수평선으로 채워짐), 200 pM (수직선으로 채워짐), 20 nM (빗금친 막대) 또는 200 nM (진한 막대)의 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 1, 4, 7 또는 9일 동안 처리한 후 켈로이드 반흔 섬유모세포 (KF116R) 세포로부터 배지 내로 분비된 피브로넥틴의 정규화된 백분율을 보여주는 막대 그래프이다. 별표는 배지 단독 대조군과 비교하여 p<0.05의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 7은 20 pM의 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (진한 막대)로 처리한 후 정상 인간 섬유모세포 (HDFa)로부터 수집된 배지에서 질량 분광분석법 (MS) 단백질 분석에 의해 검출된 단백질의 양을 보여주는 막대 그래프이다.
도 8은 0.1 μM (진한 막대) 또는 1 μM (빗금친 막대)의 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 또는 1 μM (비어있는 막대)의 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 후 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포에서의 나타낸 유전자 발현의 배수-변화를 보여주는 막대 그래프이다.

다양한 측면이 이하에서 보다 상세히 기재될 것이다. 그러나, 이러한 측면은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본원에 제시된 실시양태에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며; 오히려, 이들 실시양태는 본 개시내용이 철저하고 완전해지도록 제공된다.

정의

값의 범위가 본 개시내용에 제공된 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재된 값이 본 개시내용 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 1 μM 내지 8 μM의 범위가 언급되는 경우, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM 및 7 μM 뿐만 아니라 1 μM 이상의 값의 범위 및 8 μM 이하의 값의 범위가 또한 명시적으로 개시되어 있는 것으로 의도된다.

단수형은 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "아미노산"에 대한 언급은 단일 아미노산 뿐만 아니라 2개 이상의 동일하거나 상이한 아미노산을 포함한다.

단어 "약"은 그 값의 플러스 또는 마이너스 10%의 범위를 의미하며, 예를 들어 본 개시내용의 문맥이 달리 나타내거나 이러한 해석과 불일치하지 않는 한, "약 50"은 45 내지 55를 의미하고, "약 25,000"은 22,500 내지 27,500 등을 의미한다. 예를 들어, 수치, 예컨대 "약 49, 약 50, 약 55"의 목록에서, "약 50"은 이전 및 후속 값 사이의 간격(들)의 절반 미만으로 연장되는 범위, 예를 들어 49.5 초과 52.5 미만을 의미한다.

"투여" 또는 "투여하는"은 대상체에게 제약 조성물을 제공하는 (즉, 투여하는) 단계 또는 대안적으로, 대상체가 제약 조성물을 받는 단계를 의미한다. 본원에 개시된 제약 조성물은 다양한 방법에 의해 국부로 투여될 수 있다. 예를 들어, 근육내, 피내, 피하 투여, 척수강내 투여, 복강내 투여, 국소 (경피), 점적주입 및 이식 (예를 들어, 느린-방출 장치, 예컨대 중합체 임플란트 또는 미니삼투 펌프의 것)이 모두 적절한 투여 경로일 수 있다.

"완화시키는"은 통증, 두통, 또는 상태 또는 장애의 임의의 증상 또는 원인의 발생의 감소를 의미한다. 따라서, 완화는 일부 감소, 유의한 감소, 거의 총체적 감소 및 총 감소를 포함한다.

용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 자연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체, 입체이성질체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 이 정의에는 다음과 같은 천연 아미노산: (1) 히스티딘 (His; H) (2) 이소류신 (Ile; I) (3) 류신 (Leu; L) (4) 리신 (Lys; K) (5) 메티오닌 (Met; M) (6) 페닐알라닌 (Phe; F) (7) 트레오닌 (Thr; T) (8) 트립토판 (Trp; W) (9) 발린 (Val; V) (10) 아르기닌 (Arg; R) (11) 시스테인 (Cys; C) (12) 글루타민 (Gln; Q) (13) 글리신 (Gly; G) (14) 프롤린 (Pro; P) (15) 세린 (Ser; S) (16) 티로신 (Tyr; Y) (17) 알라닌 (Ala; A) (18) 아스파라긴 (Asn; N) (19) 아스파르트산 (Asp; D) (20) 글루탐산 (Glu; E) (21) 셀레노시스테인 (Sec; U); 다음과 같은 비천연 아미노산: (a) 시트룰린 (Cit); (b) 시스틴; (c) 감마-아미노 부티르산 (GABA); (d) 오르니틴 (Orn); (f) 테아닌; (g) 호모시스테인 (Hey); (h) 티록신 (Thx); 및 아미노산 유도체, 예컨대 베타인; 카르니틴; 카르노신 크레아틴; 히드록시트립토판; 히드록시프롤린 (Hyp); N-아세틸 시스테인; S-아데노실 메티오닌 (SAM-e); 타우린; 티라민이 포함된다.

"아미노산 잔기"는 폴리펩티드 내로 혼입된 개별 아미노산 단위를 의미한다.

"동물 단백질 무함유"는 혈액 유래된, 혈액 풀링된 및 다른 동물 유래된 생성물 또는 화합물의 부재를 의미한다. "동물"은 포유동물 (예컨대 인간), 조류, 파충류, 어류, 곤충, 거미 또는 다른 동물 종을 의미한다. "동물"은 미생물, 예컨대 박테리아를 배제한다. 따라서, 동물 단백질 무함유 제약 조성물은 보툴리눔 신경독소를 포함할 수 있다. 예를 들어, "동물 단백질 무함유" 제약 조성물은 혈청 유래된 알부민, 젤라틴 및 다른 동물 유래된 단백질, 예컨대 이뮤노글로불린이 실질적으로 없거나 본질적으로 없거나 전혀 없는 제약 조성물을 의미한다. 동물 단백질 무함유 제약 조성물의 예는 (활성 성분으로서의) 보툴리눔 독소 및 안정화제 또는 부형제로서의 적합한 폴리사카라이드를 포함하거나 이로 이루어진 제약 조성물이다.

본원에 사용된 독소의 "결합 도메인"은 야생형 결합 도메인, 그의 변이체 및/또는 단편을 포괄한다.

"보툴리눔 독소"는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해 생산된 신경독소 뿐만 아니라 비-클로스트리디움 종에 의해 재조합적으로 제조된 보툴리눔 독소 (또는 그의 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. 본원에 사용된 어구 "보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, H 및 X 및 그의 하위유형, 모자이크 독소, 예컨대 BoNT/DC 및 BoNT/CD 및 그의 임의의 다른 유형의 하위유형, 또는 각 경우에 이들 중 임의의 것의 재조작된 단백질, 유사체, 유도체, 상동체, 부분, 하위-부분, 변이체 또는 버전을 포괄한다. 본원에 사용된 "보툴리눔 독소"는 또한 "변형된 보툴리눔 독소"를 포괄한다. 추가로, 본원에 사용된 "보툴리눔 독소"는 또한 보툴리눔 독소 복합체 (예를 들어, 300, 600 및 900kDa 복합체), 뿐만 아니라 복합 단백질과 회합되지 않은 보툴리눔 독소의 신경독성 성분 (150 kDa)을 포괄한다.

"클로스트리디움 독소"는 클로스트리디움 독소가 세포를 중독시키게 하고 클로스트리디움 독소의 저 또는 고 친화도 클로스트리디움 독소 수용체에 대한 결합, 독소/수용체 복합체의 내재화, 클로스트리디움 독소 경쇄의 세포질 내로의 전위 및 클로스트리디움 독소 기질의 효소적 변형을 포괄하는 전체 세포 메카니즘을 실행할 수 있는 클로스트리디움 독소 균주에 의해 생산된 임의의 독소를 지칭한다. 클로스트리디움 독소의 비제한적 예는 보툴리눔 독소, 예컨대 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C₁, BoNT/D, BoNT/CD, BoNT/DC, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H (일명 FA형 또는 HA형), BoNT/X, eBoNT/J, 파상풍 독소 (TeNT), 바라티이(Baratii) 독소 (BaNT) 및 부티리쿰 독소 (BuNT)를 포함한다. 신경독소가 아닌 BoNT/C₂ 세포독소 및 BoNT/C₃ 세포독소는 용어 "클로스트리디움 독소"로부터 배제된다. 용어 클로스트리디움 독소는 또한 대략 150-kDa 클로스트리디움 독소 단독 (즉 NAP를 갖지 않음)을 포함한다. 클로스트리디움 독소는 자연 발생 클로스트리디움 독소 변이체, 예컨대, 예를 들어 클로스트리디움 독소 이소형 및 클로스트리디움 독소 하위유형; 비-자연 발생 클로스트리디움 독소 변이체, 예컨대, 예를 들어 그의 보존적 클로스트리디움 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체, 클로스트리디움 독소 키메라 변이체 및 활성 클로스트리디움 독소 단편, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 클로스트리디움 독소는 또한, 클로스트리디움 독소 및 비-독소 연관 단백질 (NAP)을 포함하는 복합체, 예컨대, 예를 들어 보툴리눔 독소 복합체, 파상풍 독소 복합체, 바라티이 독소 복합체 및 부티리쿰 독소 복합체를 지칭하는 클로스트리디움 독소 복합체를 포함한다. 클로스트리디움 독소 복합체의 비제한적 예는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해 생산된 것들, 예컨대, 예를 들어 900-kDa BoNT/A 복합체, 500-kDa BoNT/A 복합체, 300-kDa BoNT/A 복합체, 500-kDa BoNT/B 복합체, 500-kDa BoNT/C₁ 복합체, 500-kDa BoNT/D 복합체, 300-kDa BoNT/D 복합체, 300-kDa BoNT/E 복합체 및 300-kDa BoNT/F 복합체를 포함한다.

"세포 표현형"은 유전자 발현, 단백질 발현, 인자의 합성, 및/또는 세포의 구조 및/또는 기능 및/또는 세포외 매트릭스 구조 및 피지를 비롯한, 세포가 한 부분인 조직에 영향을 미치는 단백질 및 인자의 분비에 있어서의 임의의 변화를 지칭한다.

생물학적 활성 성분에 적용되는 "유효량"은 일반적으로 대상체에서 목적하는 변화를 일으키는데 충분한 성분의 양을 의미한다. 예를 들어, 목적하는 효과가 섬유증 연관 단백질 발현의 감소인 경우, 성분의 유효량은 유의한 독성을 초래하지 않으면서 섬유증 연관 단백질 발현의 적어도 실질적인 감소를 일으키는 양이다. 이러한 실시양태의 다른 측면에서, 치료 유효 농도의 클로스트리디움 독소 활성 성분은 치료될 질병과 연관된 증상을, 예를 들어 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90% 또는 최대 100%만큼 감소시킨다.

"중쇄"는 보툴리눔 신경독소의 중쇄를 의미한다. 이는 약 100kDa의 분자량을 갖고 H 쇄 또는 H로 지칭될 수 있다.

H_C는 보툴리눔 신경독소의 H 쇄의 카르복실 말단 절편과 대략 등가인, H 쇄로부터 유래된 단편 (약 50kDa), 또는 무손상 H 쇄에서 그러한 단편에 상응하는 부분을 의미한다. 이는 운동 뉴런에 대한 고친화도 시냅스전 결합에 관여하는 천연 또는 야생형 보툴리눔 신경독소의 부분을 함유하는 것으로 여겨진다.

H_N은 보툴리눔 신경독소의 H 쇄의 아미노 말단 절편과 대략 등가인, H 쇄로부터 유래된 단편 (약 50kDa), 또는 무손상 H 쇄에서 그러한 단편에 상응하는 부분을 의미한다. 이는 L 쇄의 세포내 엔도솜 막에 걸친 전위에 관여하는 천연 또는 야생형 보툴리눔 신경독소의 부분을 함유하는 것으로 여겨진다.

"상동체"는 동일한 생물학적 기능을 수행하는 단백질, 예를 들어 동일한 클로스트리디움 독소 패밀리에 속하고 공통 활성, 예를 들어 수용체-결합 활성을 제공하는 단백질의 군에서의 단백질을 의미한다. 상동체는 일반적으로 상동 유전자에 의해 발현된다.

"단리된"은 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열이 그가 자연 발생한 야생 또는 천연 서열로부터 분리되거나 또는 그 서열이 자연 발생하는 환경과 상이한 환경에 있는 것을 의미한다.

"경쇄"는 클로스트리디움 신경독소의 경쇄를 의미한다. 그는 약 50kDa의 분자량을 갖고, L 쇄, L 또는 보툴리눔 신경독소의 단백질분해 도메인 (아미노산 서열)으로 지칭될 수 있다.

LH_N 또는 L-H_N는 H_N 도메인과 커플링된 L 쇄 또는 그의 기능적 단편을 함유하는 클로스트리디움 신경독소로부터 유래된 단편을 의미한다. 이는 H_C 도메인을 제거하거나 변형시키기 위해, 무손상 클로스트리디움 신경독소로부터 단백질분해에 의해 수득될 수 있다.

"이식물"은 제어 방출 (예를 들어, 펄스형 또는 연속) 조성물 또는 약물 전달 시스템을 의미한다. 이식물은, 예를 들어 인체 내로 주사, 삽입 또는 이식될 수 있다.

"국부 투여"는, 예컨대, 예를 들어 근육내 또는 피내 또는 피하 주사 또는 국소 투여를 통해 제약의 생물학적 효과가 요구되는 부위인, 동물 신체 상의 또는 그 내부의 부위에 또는 그 주변에 제약을 직접 투여하는 것을 의미한다. 국부 투여는 전신 경로의 투여, 예컨대 정맥내 또는 경구 투여를 배제한다. 국소 투여는 제약 작용제가 환자의 피부에 적용되는 국부 투여의 한 유형이다.

"변형된 보툴리눔 독소"는 그의 아미노산 중 적어도 1개가 천연 보툴리눔 독소와 비교하여 결실, 변형 또는 대체된 것인 보툴리눔 독소를 의미한다. 추가적으로, 변형된 보툴리눔 독소는 재조합적으로 생산된 신경독소 또는 재조합적으로 제조된 신경독소의 유도체 또는 단편일 수 있다. 변형된 보툴리눔 독소는 천연 보툴리눔 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성, 예컨대 보툴리눔 독소 수용체에 결합할 수 있는 능력 또는 뉴런으로부터 신경전달물질 방출을 억제시킬 수 있는 능력을 유지한다. 변형된 보툴리눔 독소의 한 예는 한 보툴리눔 독소 혈청형 (예컨대 혈청형 A)으로부터의 경쇄를 갖고 다른 보툴리눔 독소 혈청형 (예컨대 혈청형 B)으로부터의 중쇄를 갖는 보툴리눔 독소이다. 변형된 보툴리눔 독소의 또 다른 예는 신경전달물질, 예컨대 물질 P에 커플링된 보툴리눔 독소이다.

"돌연변이"는 자연 발생 단백질 또는 핵산 서열의 구조적 변형을 의미한다. 예를 들어, 핵산 돌연변이의 경우, 돌연변이는 DNA 서열 중 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 부가 또는 치환일 수 있다. 단백질 서열 돌연변이의 경우, 돌연변이는 단백질 서열 중 1개 이상의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환일 수 있다. 예를 들어, 단백질 서열을 구성하는 특정 아미노산은 또 다른 아미노산, 예를 들어 아미노산 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 티로신 또는 임의의 다른 자연 또는 비-자연 발생 아미노산 또는 화학적으로 변형된 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질 서열에 대한 돌연변이는, DNA 서열이 전사되고 생성된 mRNA가 번역될 때 돌연변이된 단백질 서열을 생산하는 상기 DNA 서열에 대한 돌연변이의 결과일 수 있다. 단백질 서열에 대한 돌연변이는 또한 목적하는 단백질 서열에 대한 목적하는 돌연변이를 함유하는 펩티드 서열을 융합시킴으로써 생성될 수 있다.

"환자"는 의학적 또는 수의학적 관리를 받는 인간 또는 비-인간 대상체를 의미한다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 조성물은 임의의 동물, 예컨대, 예를 들어 포유동물 등을 치료하는 데 사용될 수 있다.

"펩티드" 및 "폴리펩티드"는 그의 크기와 상관없이 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 쇄로 구성된 임의의 중합체를 지칭한다. "단백질"이 종종 비교적 큰 폴리펩티드와 관련하여 사용되고 "펩티드"가 종종 작은 폴리펩티드와 관련하여 사용되지만, 관련 기술분야에서의 이들 용어의 용법은 중복되고 다양하다. 따라서, 단순성을 위해, 일부 경우에서는 관련 기술분야가 동일한 중합체를 "단백질"로 지칭할 수도 있지만 본원에서는 용어 "폴리펩티드"가 사용될 것이다. 달리 나타내지 않는 한, 폴리펩티드에 대한 서열은 아미노 말단으로부터 카르복실 말단까지 순서대로 제공된다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열은, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 주어진 비교 범위에 걸쳐 참조 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 경우에 참조 서열과 "실질적으로 동일하거나" 또는 "실질적으로 유사하다". 따라서, 실질적으로 유사한 서열은, 예를 들어 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것을 포함한다. 서로 동일한 2개의 서열도 또한 실질적으로 유사하다. 비교 범위 또는 비교 서열의 길이는 일반적으로 적어도 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 길이이거나 또는 보툴리눔 독소 단편의 결합 도메인, 예를 들어 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 150, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425개 인접 아미노산을 포함하는 단편의 길이일 것이다. 서열 동일성은 참조 서열에 기초하여 계산되고, 서열 분석을 위한 알고리즘은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 2개의 아미노산 서열의 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 다른 폴리펩티드와의 최적 정렬을 위해 1개의 폴리펩티드의 서열에 갭이 도입될 수 있다). 이어서 상응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 잔기가 비교된다. 1개의 서열에서의 위치가 다른 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유되는 경우에, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성은 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 퍼센트 서열 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x 100). 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성은 벡터 NTI(VECTOR NTI) 소프트웨어 패키지 (인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.), 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 결정될 수 있다. 2개의 폴리펩티드의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 갭 개방 페널티 10 및 갭 연장 페널티 0.1이 사용될 수 있다. 모든 다른 파라미터는 디폴트 설정으로 설정될 수 있다. 서열 상동성을 결정하기 위한 또 다른 소프트웨어 도구는 국립 생물 정보 센터 (NCBI)로부터의 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (BLAST)이다. 예를 들어, BLAST는 단백질 서열을 비교하고 동일하거나 유사한 아미노산 잔기, 상동성, 갭 등의 백분율을 계산할 수 있다.

"말초로 투여하는" 또는 "말초 투여"는 피하, 피내, 경피 또는 피하 투여를 의미하지만, 근육내 투여를 배제한다. "말초"는 피하 위치를 의미하고, 내장 부위를 제외한다.

"제약 조성물"은 활성 제약 성분, 예컨대, 예를 들어 클로스트리디움 독소 활성 성분, 예컨대 보툴리눔 독소 및 적어도 1종의 추가의 성분, 예컨대, 예를 들어 안정화제 또는 부형제 등을 포함하는 조성물을 의미한다. 따라서 제약 조성물은 대상체, 예컨대 인간 환자에 대한 진단적 또는 치료적 투여에 적합한 제제이다. 제약 조성물은, 예를 들어 동결건조 또는 진공 건조 상태의 제약 조성물, 동결건조 또는 진공 건조 제약 조성물의 재구성 후에 형성된 용액, 또는 재구성을 필요로 하지 않는 용액 또는 고체로서의 제약 조성물일 수 있다.

"약리학상 허용되는 부형제"는 "약리학적 부형제" 또는 "부형제"와 동의어이고, 포유동물에게 투여되었을 때 실질적으로 장기간의 또는 영구적인 유해한 영향을 미치지 않는 임의의 부형제를 지칭하며, 화합물, 예컨대, 예를 들어 안정화제, 벌킹제, 동결-보호제, 동결건조-보호제, 첨가제, 비히클, 담체, 희석제 또는 보조제를 포괄한다. 부형제는 일반적으로 활성 성분과 혼합되거나 또는 활성 성분을 희석 또는 봉입할 수 있도록 허용되고, 고체, 반고체 또는 액체 작용제일 수 있다. 클로스트리디움 독소 활성 성분을 포함하는 제약 조성물은 활성 성분의 제약상 허용되는 조성물로의 가공을 용이하게 하는 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있는 것으로 또한 고려된다. 임의의 약리학상 허용되는 부형제는 그가 클로스트리디움 독소 활성 성분과 비상용성이 아닌 한, 제약상 허용되는 조성물에 그를 사용하는 것도 고려된다. 약리학상 허용되는 부형제의 비제한적 예는, 예를 들어 문헌 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7^th ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20^th ed. 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10^th ed. 2001); 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4^th edition 2003)] (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.

제약 조성물의 구성 성분은 단일 조성물에 포함될 수 있거나 (즉, 임의의 필요한 재구성 유체를 제외한 모든 구성 성분이 제약 조성물의 초기 배합 시점에 존재함) 또는 예를 들어 제약 조성물의 초기 배합 시점에는 존재하지 않는 성분을 함유할 수 있는 2-성분 시스템, 예를 들어 재구성 비히클로 재구성되는 진공-건조 조성물로서 포함될 수 있다. 2-성분 시스템은 장기간 보관 저장 동안 2-성분 시스템의 제1 성분과 충분히 상용성이 아닌 성분을 혼입시키는 것이 가능하다는 것을 비롯한, 여러 이익을 제공할 수 있다. 예를 들어, 재구성 비히클은 보존제를 포함할 수 있으며, 이는 사용 기간 동안, 예를 들어 1주의 냉장 저장 동안 미생물 성장으로부터의 충분한 보호를 제공하지만, 그것이 독소를 분해할 수도 있는 2년의 냉동고 저장 기간 동안에는 존재하지 않는다. 장기간 동안 보툴리눔 독소 또는 다른 성분과 상용성일 수 없는 다른 성분은 이러한 방식으로 혼입될 수 있고; 즉, 대략 사용 시점에 제2 비히클에 (예를 들어 재구성 비히클에) 첨가될 수 있다. 제약 조성물은 또한 보존제, 예컨대 벤질 알콜, 벤조산, 페놀, 파라벤 및 소르브산을 포함할 수 있다. 제약 조성물은, 예를 들어 부형제, 예컨대 표면활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 보존제; 생리학상 분해가능한 조성물, 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 항산화제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합체 또는 소수성 물질 및 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.] (이는 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있는 다른 성분을 포함할 수 있다.

"폴리사카라이드"는 2종 초과의 사카라이드 분자 단량체의 중합체를 의미한다. 단량체는 동일하거나 상이할 수 있다.

"안정화제", "안정화 작용제" 또는 "안정화제"는 비안정화 조성물에 비해 제약 조성물의 효력이 증가되도록 클로스트리디움 독소 활성 성분을 안정화시키는 작용을 하는 물질을 의미한다.

"안정화제"는 부형제를 포함할 수 있고, 단백질 및 비-단백질 분자를 포함할 수 있다.

"계면활성제"는 천연 또는 합성 친양쪽성 화합물을 지칭한다. 계면활성제는 비-이온성, 쯔비터이온성 또는 이온성일 수 있다. 계면활성제의 비제한적 예는 폴록사머, 폴리소르베이트 및 그의 조합을 포함한다.

"치료 제제"는 장애 또는 질환, 예컨대, 예를 들어 피지선의 과다활성 (즉 지루)을 특징으로 하는 장애 또는 질환을 치료하여 그를 완화시키는데 사용될 수 있는 제제를 의미한다.

"치료 유효 농도", "치료 유효량", "유효량", "유효 용량" 및 "치료 유효 용량"은 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 클로스트리디움 독소 활성 성분의 최소 용량을 지칭하고, 치료될 질병과 연관된 증상을 감소시키기에 충분한 용량을 포함한다.

"국소 투여"는 신경독소의 전신 투여는 배제한다. 다시 말해서 및 전형적인 치료 경피 방법과 달리, 보툴리눔 독소의 국소 투여를 통해서는 상당량의, 예컨대 대다수의 신경독소가 환자의 순환계를 통과하지 않게 된다.

"치료하는"은, 예를 들어 섬유화 장애, 세포외 매트릭스와 연관된 장애, 결합, 상피 또는 내피 조직과 연관된 장애 등과 같은 상태 또는 장애의 적어도 1종의 증상을 일시적으로 또는 영구적으로 완화시키거나 (또는 제거하는) 것을 의미한다. 상기 용어는 질환의 치유 뿐만 아니라 질환의 예방, 제어, 또는 심지어 질환 또는 질환 증상을 완화시키기 위해 취해지는 단계를 포함한다. 예를 들어, 장애, 예컨대 섬유증, 예를 들어 특발성 폐 섬유증 (IPF) 또는 낭성 섬유증 (CF)을 치료하는 방법과 관련하여, 실시양태는 일반적으로 화합물 또는 조성물을 받지 않은 대상체에 비해 대상체에서 의학적 상태 (예를 들어, IPF 또는 CF)의 증상의 빈도를 감소시키거나 또는 그의 발병을 지연시키는 화합물 또는 조성물의 투여를 포함한다. 이는 대상체의 상태 (예를 들어, 폐 용량 퇴행)를 개선 또는 안정화시키는 방식으로 상태의 증상, 임상 징후 및 기저 병리상태를 역전, 감소 또는 정지시키는 것을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 치료적 실시양태는 대상체의 조직, 예를 들어 기도의 내피 조직을 전달 시스템과 접촉시킴으로써 수행된다. 본원에 정의된 "접촉하는"은 활성 성분을 포함하는 조성물 (예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드를 함유하는 활성 제약 성분 또는 API)을 시험 튜브, 플라스크, 조직 배양물, 칩, 어레이, 플레이트, 마이크로플레이트, 모세관 등에서 표적, 예를 들어 세포 표적을 함유하는 샘플 내로 도입하고, 펩티드 또는 화합물이 표적에 결합하는 것을 허용하기에 충분한 온도 및 시간에서 인큐베이션하는 것을 의미한다. 생체내 치료와 관련하여, "접촉하는"은 폴리펩티드가 본 개시내용의 질환, 예를 들어 IPF, CF의 치료를 위해 환자 또는 대상체 내로 도입되고, 폴리펩티드 또는 화합물이 환자의 표적 조직, 예를 들어 상피 조직과 생체내에서 접촉하게 되는 것을 의미한다.

일부 실시양태에서, 치료적 적용은 질환, 예컨대 IPF 또는 CF를 앓고 있는 대상체, 예를 들어 환자에게 조성물 또는 키트를 투여함으로써 수행된다. 용어 "투여하는"은 요법으로서, 예컨대 약물이 그의 의도된 목적을 수행하는데 수용되고 효과적일 방식으로 이러한 약물을 배치함으로써 적용하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "본 개시내용의 질환" 또는 "본 개시내용의 장애"는 하기 부류의 질환: 세포외 매트릭스 질환; 결합 또는 상피 조직 질환; 내피 질환; 및 섬유화 질환; 바람직하게는 섬유화 질환; 및 특히 ECM, 결합 또는 상피 조직, 또는 내피 조직의 섬유화 질환 중 하나를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "세포외 매트릭스 질환" 또는 "세포외 매트릭스 (ECM)와 연관된 질환"은 ECM 또는 그의 1종 이상의 성분과 연관된 상태, 장애 또는 질환을 지칭한다. ECM은 세포내 통신을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 생물학적 기능에 관여하는 것에 추가로, 세포에 대한 구조적 지지를 제공한다. ECM의 성분은 프로테오글리칸 (예를 들어, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 및 케라틴 술페이트), 비-프로테오글리칸 폴리사카라이드 (예를 들어, 히알루론산), 섬유, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 세포외 매트릭스는 또한 신호전달 분자, 예컨대 성장 인자 및 시토카인에 대한 데포로서의 역할을 한다. 세포외 매트릭스 질환은 ECM의 1개 이상의 기능의 조절이상 (예를 들어, 조절이상 세포내 통신 및/또는 이동), 또는 ECM의 1종 이상의 성분의 조절이상 (예를 들어, ECM의 1종 이상의 성분의 증가된 또는 감소된 활성 및/또는 생산)과 연관된 질환을 포함한다. 세포외 매트릭스 질환은 또한 ECM의 변경된 분해 및 재형성과 연관된 질환 및 ECM에서의 작용제, 예를 들어 면역복합체 및 다른 면역 생성물의 변경된 (예를 들어, 증가 또는 감소된) 축적과 연관된 질환을 포함한다. 세포외 매트릭스 질환은 아테롬성동맥경화증, 암, 아밀로이드 질환, 사구체 질환, 혈관간 질환, 염증성 상태, 및 발달 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 암은 급성 림프모구성 백혈병, 피부섬유종, 유방암, 유방 암종, 신경교종 및 교모세포종, 횡문근육종 및 섬유육종, 결합조직형성, 혈관지방종, 혈관평활근종, 결합조직형성 암, 및 전립선, 난소, 결장직장, 췌장, 위장 및 간암 및 다른 종양 성장 및 이행를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "결합 조직과 연관된 질환" 또는 "결합 조직 질환"은 결합 조직 또는 그의 1종 이상의 성분과 연관된 상태, 장애 또는 질환을 지칭한다. 용어 "결합 조직"은 신체의 상이한 유형의 조직 및 기관을 지지, 연결 또는 분리하는 조직을 지칭한다. 이는 4가지 일반적 부류의 동물 조직 중 하나이다. 결합 조직은 중추 신경계를 비롯하여 모든 곳에서 발견된다. 이는 다른 조직들 사이에 위치한다. 모든 결합 조직은 3가지 주요 성분: 분쇄 물질, 섬유 및 세포를 갖는다. 바람직한 결합 조직은 콜라겐 섬유를 포함하는 조직이다. 결합 조직 질환의 대표적인 예는 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 류마티스 관절염, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 혼합 결합 조직 질환, 감염성 호산구증가증, 다발근염, 피부근염, 결절성 동맥주위염, 베게너-육아종증, CREST-증후군 및 SHARP-증후군; 바람직하게는 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 류마티스 관절염, 전신 경화증 또는 쇼그렌 증후군을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "상피 조직과 연관된 질환" 또는 "상피 조직 질환"은 결합 조직 또는 그의 1종 이상의 성분과 연관된 상태, 장애 또는 질환을 지칭한다. 용어 "상피 조직"은 신체 전체에 걸쳐 기관 및 혈관의 외부 표면을 싸고 있는 조직, 뿐만 아니라 다수의 내부 기관 내의 공동의 내부 표면을 지칭한다. 이는 4가지 일반적 부류의 동물 조직 중 하나이다. 상피 또는 결합 조직 질환의 대표적인 예는 습진, 아토피성 피부염, 건선, 피부 반흔 (비대성, 켈로이드, 위축성 (예를 들어 여드름에서), 튼살 및 제대), 상처 반흔, 외과적 반흔 (예를 들어 제왕절개, 복부성형술, 유방 확대, 복부 수술, 안면 리프트 또는 필러 주사 후), 수술후 복강내 유착, 섬유종, 간 섬유증, 간경변증, 췌장염, 양성 전립선 비대증, 섬유화 방광, 간질성 방광염, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 사구체경화증, 심방 섬유증, 심내막심근 섬유증, 신경교 반흔, 동맥 강성, 관절섬유증, 낭성 섬유증, 비-낭성 섬유증, 크론병, 듀피트렌 구축, 종격 섬유증, 골수섬유증, 페이로니병, 신원성 전신 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 복막후 섬유증, 유착성 피막염, 혼합 결합 조직 질환, 안구 섬유증, 골관절염, 경피증, 및 천식 등을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "내피와 연관된 질환" 또는 "내피 질환"은 내피 조직 또는 그의 1종 이상의 성분과 연관된 상태, 장애 또는 질환을 지칭한다. 용어 "내피"는 혈관 및 림프관의 내부 표면을 싸고 있어 내강 및 혈관 벽의 나머지 부분에서 순환 혈액 또는 림프 사이의 계면을 형성하는, 내피 세포로 불리는 단순한 또는 단일층의 편평 세포의 얇은 층을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 내피 장애는 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병성 신경병증, 졸중, 아테롬성동맥경화증, 당뇨병, 재협착, 관상 동맥 질환, 말초 혈관 질환, 혈관 누출, 혈관염, 혈관염증, 베게너병, 위 또는 경구 궤양화, 간경변증, 간신증후군, 크론병, 탈모, 피부 자반증, 모세혈관확장증, 정맥호 형성, 지연된 상처 치유, 전자간증, 패혈증, 허혈-재관류 손상, 고혈압, 만성 또는 급성 감염, 월경과다, 신생아 호흡 곤란, 폐 섬유증, 기종, 신병증, 사구체신염, 경피증, 및 혈관 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 내피 질환은 불충분한 혈관신생, 고혈압, 혈관수축, 혈관 누출, 변경된 혈관운동 긴장, 과다응고, 항염증 특성 및 불량한 내피 세포 건강을 특징으로 한다.

본원에 사용된 용어 "섬유화 장애" 또는 "섬유화 질환"은 일반적으로, 예를 들어 손상으로 인한 결합 조직의 비후 또는 반흔형성을 특징으로 하는, 진행성 및/또는 과도한 섬유증을 특색으로 하는 의학적 상태를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 섬유화 질환은 염증발생 또는 손상된 조직 내 및 주변에 세포외 매트릭스의 과도한 침착이 일어나는 것을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 섬유화 장애 또는 질환은 섬유화 병소 또는 병변 내 및 주변에 근섬유모세포의 지속적인 존재와 연관된다. 과도하고 지속적인 섬유증은 정상 조직을 점진적으로 재형성하고 파괴할 수 있어, 이환 기관의 기능장애 및 부전 및 궁극적으로 사망으로 이어질 수 있다.

일부 실시양태에서, 섬유화 장애는 하나의 세포 유형의 또 다른 유형으로의 직접적인 전환을 지칭하는 "전환분화"를 특징으로 할 수 있다. 특히, 섬유화 장애 또는 섬유화 질환은 ECM, 결합 조직, 내피 조직 또는 그의 조합의 섬유증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어 섬유화 질환은 정상 상처 치유에 의해 촉발되는 섬유증은 제외한다.

섬유화 장애 또는 섬유화 질환의 비제한적 예는 피부 반흔, 상처 반흔, 외과적 반흔, 수술후 복강내 유착, 섬유종, 간 섬유증, 간경변증, 췌장염, 양성 전립선 비대증, 유방 섬유증, 섬유화 방광, 간질성 방광염, 폐 섬유증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 혈관 섬유증 (예를 들어, 아테롬성동맥경화증, 협착, 재협착), 신장 섬유증, 사구체경화증, 심방 섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 신경교 반흔, 동맥 강성, 관절섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 거대 섬유증 (예를 들어, 폐), 만성 신장 질환 (CKD), 신원성 전신 섬유증, 크론병, 비대성 반흔형성, 켈로이드, 경피증, 전신 경화증 (예를 들어, 피부, 폐), 관절섬유증 (예를 들어, 무릎, 어깨, 다른 관절), 페이로니병, 듀피트렌 구축, 유착성 피막염, 기관 이식 연관 섬유증, 허혈 연관 섬유증, 낭성 섬유증, 비-낭성 섬유증, 혼합 결합 조직 질환, 안구 섬유증, 골관절염, 경피증, 천식 등을 포함한다. 바람직하게는, 섬유화 장애는 섬유화 유방 질환; 켈로이드 반흔; 간 섬유증; 섬유화 방광; 섬유성 조직의 증식증, 예를 들어 양성 전립선 비대증; 췌장염; 유착, 예를 들어 복강내 유착; 반흔형성, 예를 들어 비대성 반흔 또는 그의 조합이다.

본원에 사용된 용어 "변이체"는 적어도 1개의 변형 또는 아미노산 (또는 핵산) 치환에 의해 모 서열과 상이한 서열을 갖는 생체분자 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산)를 지칭한다. 따라서, 변이체 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 적어도 1개의 변형 또는 치환을 포함한다. 변이체 폴리펩티드를 일으키는 변형의 유형은, 예를 들어 1개 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환, 전위 등을 포함한다.

폴리펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 조성물

상기 언급된 바와 같이, 한 측면에서, 클로스트리디움 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소는 보툴리눔 독소이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 독성이 결여된 보툴리눔 독소의 전장 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 독성이 결여된 보툴리눔 독소의 전장 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 중쇄의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 중쇄의 카르복실 또는 C-말단 절편 (H_C)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노 또는 N-말단 절반 (H_CN)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 N-말단 절반과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 BoNT/A이다. 또 다른 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 모자이크 독소이다. 한 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 BoNT/DC이다. 대안적 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 BoNT/A가 아니다.

또 다른 측면에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드의 분자량은 약 1 kDa 내지 약 90 kD, 또는 약 20 kDa 내지 약 60 kD, 또는 약 22 kDa 내지 약 50 kD이다.

보툴리눔 독소 혈청형 및 하위유형의 아미노산 서열은 공지되어 있고, 표 1은 전위를 위한 대략적인 경계 영역, 엔도펩티다제 및 결합 도메인 뿐만 아니라 그의 예시적인 진뱅크/유니프롯(UNIPROT) 수탁 번호(들)를 제공한다. BoNT 독소의 대표적인 혈청형, 예를 들어 유형 A, 유형 B, 유형 C₁, 유형 D, 유형 E, 유형 F, 유형 G (관련 구성원 포함)는 또한 미국 특허 번호 7,892,565 및 8,486,422에 개시되어 있다. 잠재적 제8 유형 ("유형 H")은 문헌 [Dover et al., J Infect Dis., 209(2):192-202, 2014 (PMID: 24106295)]에 기재되었다. 최근의 보고는 이러한 신규 신경독소를 BoNT/H, BoNT/FA 또는 BoNT/HA로서 다양하게 기재하였다. 문헌 [Maslanka et al., J Infect Dis., 213(3): 379-385, 2016; Peck et al., Toxins (Review), 9(1): 38, 2017]을 참조한다. 모자이크 보툴리눔 독소, 예컨대 BoNT/DC 및 BoNT/CD가 또한 공지되어 있다.

표 1

한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소는 BoNT/A로부터 유래된다. 대안적 실시양태에서, 클로스트리디움 독소는 BoNT/A로부터 유래되지 않고, 예를 들어 클로스트리디움 독소는 BoNT/B, BoNT/C₁, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H, BoNT/DC, BoNT/CD, BoNT/X, eBoNT/J, TeNT, BaNT, BuNT 또는 그의 조합으로부터 유래된 클로스트리디움 독소이다.

또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 독소는 클로스트리디움 독소의 다양한 하위유형으로부터 유래된다. 본원에 사용된 용어 "하위유형"은 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 갖고 상이한 유전자에 의해 코딩되거나 또는 상이한 엑손이 제거된 동일한 유전자로부터의 RNA 전사체에 의해 코딩되는 임의의 2개 이상의 기능적으로 유사한 단백질을 지칭할 수 있다. "하위유형"은 또한 성숙 및 미성숙 서열을 포함한, 이러한 단백질을 코딩하는 임의의 서열을 지칭할 수 있다. 따라서, "하위유형"은, 문맥에 의해 단지 하나 아니면 다른 것을 지칭하는 것으로 언급되어 있거나 달리 이해되지 않는 한, 상기 언급된 클로스트리디움 독소 중 1종 이상을 코딩하는 유전자 뿐만 아니라 유전자의 단백질 생성물을 포함한다. 종종 하위유형으로 불리는 적어도 40종의 고유한 BoNT가 DNA 서열분석에 의해 확인되었고; 일부는 BoNT 기능에 영향을 미친다 (Rossetto et al., Nature Reviews Microbiol., 12, 535-49, 2014). 예를 들어, 분자 연구는 BoNT 혈청형 C 및 D의 구조적 성분을 함유하는 단일 BoNT의 교차-반응성 혈청학적 관찰에 대한 증거를 제공하였다. 문헌 [Arndt et al. (J Mol Biol., 362(4):733-42, 2006) 및 Hill et al., (J Bacteriol., 189:818-32, 2007)]을 참조한다. 일부 경우에, BoNT/F의 서열은 특히 가변적이며 (Raphael et al., Appl Environ Microbiol., 76(14):4805-12, 2012), 이는 시냅스 소포 막 단백질, 예컨대 VAMP-2의 절단에 관한 기능적 다양성을 유도하는 것으로 밝혀졌다 (Kalb et al., Anal Chem., 86:3254-62, 2014).

한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소는 다양한 BoNT/A 하위유형, 예컨대, 예를 들어 A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A9, A10; BoNT/B 하위유형, 예컨대, 예를 들어 B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, Bnp 및 Bbv; BoNT/C 하위유형, 예컨대, 예를 들어 C 및 CD; BoNT/D 하위유형, 예컨대, 예를 들어 D 및 DC; BoNT/E 하위유형, 예컨대, 예를 들어 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9; BoNT/F 하위유형, 예컨대 예를 들어 F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7; 및 BoNT/G 하위유형, 예컨대, 예를 들어 하위유형 G로부터 유래된다. BoNT 하위유형은 키메라 BoNT, 예를 들어 BoNT/DC, BoNT/CD, BoNT/FA 등을 포함한다. 문헌 [Rossetto et al., Nature Reviews Microbiol., 12, 535-49, 2014; Montecucco et al., MBio 6:e02131-14, 2015]; 미국 특허 번호 8,841,111 및 미국 특허 번호 8,697,413을 참조한다. 예를 들어 벡터 NTI (써모 피셔(Thermo Fisher), 캘리포니아주 칼스배드)와 같은 소프트웨어를 통해 수행된 서열 정렬의 분석은 개별 BoNT/A 하위유형들 사이에 높은 정도의 서열 동일성을 나타낸다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 컨센서스 위치에서 약 78.9% (예를 들어, 정렬 소프트웨어에 따라 75% 내지 80%)의 전체 서열 동일성 및 약 99.3%의 훨씬 더 큰 서열 동일성 (예를 들어, 정렬 소프트웨어에 따라 95% 내지 99.9%)이 존재한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 클로스트리디움 독소의 상동체에 관한 것이다. 용어 "상동체"는 동일한 생물학적 기능을 수행하는 단백질, 예를 들어 동일한 클로스트리디움 독소 패밀리에 속하고 공통 활성을 제공하는 단백질의 군에서의 단백질을 의미한다. 상동체는 일반적으로 상동 유전자에 의해 발현된다. 상동 유전자와 관련하여, 상동체는 오르토로그, 예를 들어 공통 조상 유전자로부터 종분화에 의해 진화하였고 동일한 기능을 보유하는 단백질을 코딩하는, 상이한 종에서 발현되는 유전자를 포함하지만, 파라로그, 예를 들어 중복에 의해 관련이 있지만 상이한 기능을 갖는 단백질을 코딩하도록 진화한 유전자는 포함하지 않는다. 상동 유전자는 자연 발생 대립유전자 및 인공-생성된 변이체를 포함한다. 유전자 코드의 축중성은 유전자로부터 생산된 폴리펩티드의 아미노산 서열이 변하도록 하지 않으면서 유전자의 단백질 코딩 서열의 적어도 1개의 염기를 상이한 염기로 치환시킬 가능성을 제공한다. 최적으로 정렬된 경우, 상동체 단백질은 대상 단백질, 예를 들어 BoNT/A1 또는 H_C 도메인, 특히 H_CN 도메인, 특히 H_CN 도메인의 N-말단 절반을 포함하는 그의 단편과 비교하여 전형적으로 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5% 또는 그 초과 %의 동일성 또는 유사성을 갖는다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, 상동체 단백질은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 12-18의 폴리펩티드에 대해 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 그 초과 %의 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

한 실시양태에서, 상동 클로스트리디움 독소는 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 퍼센트 서열 상동성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 단백질 서열과 비교하여 단백질 서열 내의 동일하거나 유사한 잔기 (컨센서스)를 참조 서열의 길이로 나눈 것의 퍼센트로서 정의되는 퍼센트 상동성에 기초하여 그룹핑된다. 컨센서스 치환은 아미노산이 유사한 아미노산으로 치환되도록 하는 치환이다. 아미노산은 여러 특징, 예를 들어 크기, 형상, 소수성, 친수성, 전하, 등전점, 극성, 방향족성 등에 있어서 유사할 수 있다. 퍼센트 아미노산 서열 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 통상적인 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 서열은 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 정렬될 수 있다. 한 실시양태에서, 퍼센트 상동성은 쌍별 정렬을 수행하고 잔기 치환의 매트릭스를 사용하여 미가공 점수를 제공하는, NCBI를 통해 이용가능한 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (BLAST)을 사용하여 컴퓨터 계산된다. 본원에서, BLAST에 의해 컴퓨터 계산된 비트 점수는 서열 길이 및 갭 크기를 고려한 정규화된 점수이다. 생물정보학에서 이해되는 바와 같이, 283 비트의 점수는 제시된 것보다 더 우수한 정렬이 발견되고, 검색은 2²⁸³ (또는 2x10⁸⁵) 유닛 (예를 들어, 아미노산 또는 핵산)의 공간을 포괄해야 할 것임을 의미한다. 따라서, 비트 점수가 높을수록 매치가 더 고도로 유의하다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 이어서 더 긴 서열에 대해 서열 상동성이 계산되며, 즉 더 짧은 서열이 더 긴 서열의 한 부분과 100% 서열 동일성을 나타내더라도, 전체 서열 동일성은 100% 미만일 것이다.

대안적 실시양태 하에서, 변이체 클로스트리디움 독소는 하나 이상의 상기 언급된 클로스트리디움 독소에 대해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과 정도의 동일성을 공유하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 변이체 클로스트리디움 독소는 유니프롯 수탁 번호 P0DPI1 (예를 들어, 유형 A); P10844 (예를 들어, 유형 B); P18640 (예를 들어, 유형 C₁); P19321 (예를 들어, 유형 D); Q00496 (진뱅크 #CAA44558) (예를 들어, 유형 E); P30996 (예를 들어, 유형 F); Q60393 (예를 들어, 유형 G); 진뱅크 ID: KGO15617 (UNIPARC ID: 00052C1529) (유형 H); 진뱅크 ID: BAQ12790 (UNIPARC ID: 0005822796) (유형 X); 유니프롯 수탁 번호 P04958 (예를 들어, TeNT); Q45851 (예를 들어, BaNT); 또는 P30995 (예를 들어, BuNT)에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과, 예를 들어 약 99.9% 서열 동일성을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 변이체 클로스트리디움 독소는 (a) BoNT/A로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 수탁 번호 AF488749 (핵산) 및 AAQ06331 (단백질); (b) BoNT/B로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 수탁 번호 AB232927 (핵산) 또는 BAE48264 (단백질); (c) BoNT/C1으로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # CAA47060 (핵산); 유니프롯 # P18640 (단백질); (d) BoNT/D로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # X54254 (핵산); 유니프롯 # P19321 (단백질); (e) BoNT/DC로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # EF378947 (핵산); ABP48747 (단백질); (f) BoNT/E로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # JX424539 (핵산); AFV91344 (단백질); (g) BoNT/F로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # ABS41202 (단백질); ABS41202를 코딩하는 DNA (예를 들어, cDNA); (h) BoNT/G로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # X74162 (핵산); 유니프롯 # Q60393 (단백질); (i) BoNT/X로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 ID: BAQ12790 (단백질); 또는 (j) eBoNT/J로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # OTO22244; 유니프롯 # A0A242DI27 (단백질)에 제시된 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과, 예를 들어 약 99.9% 서열 동일성을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 변이체 클로스트리디움 독소는 (1) BoNT/A2 치바(Chiba) 균주로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # AB443580 (핵산); BAH03558 (단백질); (b) 교토(Kyoto)-F 균주로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # X73423 (핵산); CAA51824 (단백질); (c) BoNT/A3 로치 마레(Loch Maree) 균주로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # DQ185900 (핵산); ABA29017 (단백질); (d) BoNT/A4 657Ba 균주로부터 유래된 독소에 대해 (진뱅크 # EU341307 (핵산); ABY56338 (단백질); (e) BoNT/A5A 661222 균주로부터 유래된 독소에 대해 (진뱅크 # HM153705 (핵산); ADJ68235 (단백질); (f) BoNT/A6 CDC41370 균주로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # FJ981696 (핵산); ACW83602 (단백질); BoNT/A7 2008-148 균주로부터 유래된 독소에 대해 진뱅크 # JQ954969 (핵산); AFV13854 (단백질)에 제시된 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과, 예를 들어 약 99.9% 서열 동일성을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 변이체 클로스트리디움 독소는 돌연변이체 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편을 포함한다. 전형적으로, 돌연변이체 클로스트리디움 독소는 핵심 클로스트리디움 독소 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편, 예를 들어 서열식별번호: 1의 전장 BoNT/A 서열 또는 H_C 단편 내의 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과, 예를 들어 10개 이하의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이체 클로스트리디움 독소의 대표적인 예는, 예를 들어 W1266L 및 Y1267S를 포함하는 제1 BoNT/A 돌연변이체 또는 그의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 W391L 및 Y392S를 포함하는 BoNT/A 돌연변이체의 H_C 단편; 서열식별번호: 26에 제시된 돌연변이체 서열) 또는 T1145A 및 T1146A를 포함하는 제2 BoNT/A 돌연변이체 또는 그의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 T270A 및 T271A를 포함하는 BoNT/A 돌연변이체의 H_C 단편; 서열식별번호: 25에 제시된 돌연변이체 서열) 또는 G1292R을 포함하는 제3 BoNT/A 돌연변이체 또는 그의 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 G417R을 포함하는 BoNT/A 돌연변이체의 H_C 단편; 서열식별번호: 27에 제시된 돌연변이체 서열)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편은 비-돌연변이 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편과 비교하여 조정된, 예를 들어 감소된 시험관내 또는 생체내 활성을 갖고, 따라서 돌연변이체 폴리펩티드는 그의 비-돌연변이 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편의 약리학적 특성을 조정하는데 사용될 수 있다.

전반적 방법, 국부 방법 및 하이브리드 방법, 예컨대, 예를 들어 절편 접근 방법을 비제한적으로 포함한 임의의 다양한 서열 정렬 방법이 퍼센트 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 퍼센트 동일성을 결정하는 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내에 있는 본원의 교시로부터 상용적인 절차이다.

한 실시양태에서, 변이체 클로스트리디움 독소는 변이체 클로스트리디움 독소의 활성을 보존하도록 선택되는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 반-보존된 잔기는 전하, 극성 및/또는 크기를 보존하는 변화를 허용할 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 수탁되어 있는 유니프롯 및/또는 진뱅크 서열에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 클로스트리디움 독소는 1개 이상의 치환을 가질 수 있으며, 여기서 치환된 아미노산은 공지된 20개의 아미노산 중 어느 하나일 수 있고, 여기서 변이체 클로스트리디움 독소는 그의 활성, 예를 들어 세포-결합 활성 또는 세포-신호전달 활성 또는 그의 조합을 유지한다 (실시예 섹션 참조). 바람직하게는, 아미노산은 보존된 또는 반-보존된 방식으로 치환된다. 보존된 아미노산 치환의 예시적인 유형은, 예를 들어 비-극성 (소수성) 잔기를 또 다른 비-극성 (소수성) 잔기로 치환하는 것, 예컨대 I, V, L 또는 M을 서로 치환하는 것, 하나의 극성 (친수성)의 비-하전된 잔기를 또 다른 극성의 비-하전된 잔기로 치환하는 것, 예컨대 Q를 N으로, G를 S로 치환하거나 또는 그 반대의 경우, 또는 하전된 잔기를 또 다른 유사하게 하전된 잔기로 치환하는 것, 예컨대 K, R 또는 H를 서로 치환하거나, D를 E로 치환하거나 또는 그 반대의 경우를 포함한다. 다른 한편으로는, 비-보존적 치환은 비-극성 (소수성) 잔기, 예컨대 I, V, L, A, M을 극성 (친수성) 잔기, 예컨대 C, Q, D, K로 치환하는 것 및/또는 그 반대의 경우를 포함한다. 한 실시양태에서, 용어 "보존된 치환"은 하기 "강한" 군 중 하나 내의 아미노산 치환을 나타내고: STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY 및/또는 FYW; 및 용어 "반-보존된 치환"은 하기 "약한" 군 중 하나 내의 아미노산 치환을 나타낸다: CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, FVLIM 및/또는 HFY. 보존된 또는 반-보존된 아미노산 치환을 제조하는 방법은 관련 기술분야, 예를 들어 문헌 [Risler et al., J. Mol. Biol., 204:1019-1029, 1988; Niefind et al., J. Mol. Biol. 219:481-497, 1991; 및 Overington et al. Protein Science, 1:216-226, 1992]에 공지되어 있다. 핵심 클로스트리디움 독소 서열 (예를 들어, BoNT/A 서열) 내의 보존된 및 반-보존된 아미노산 치환의 예시적인 유형은 CLUSTAL 다중 서열 정렬을 통해 관찰가능하며, 여기서 별표 (*)는 동일성을 나타내고, 세미콜론 (:)은 보존된 치환을 나타내고, 마침표 (.)는 반-보존된 치환을 나타낸다.

본 개시내용의 클로스트리디움 독소 변이체는 자연 발생 변이체 또는 비-자연 발생 변이체일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "자연 발생 클로스트리디움 독소 변이체"는 교대로 스플라이싱된 전사체로부터 생산된 클로스트리디움 독소 이소형, 자발적 돌연변이에 의해 생산된 클로스트리디움 독소 이소형 및 클로스트리디움 독소 하위유형을 비제한적으로 포함한, 임의의 인간 조작의 도움 없이 생산된 임의의 클로스트리디움 독소를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "비-자연 발생 클로스트리디움 독소 변이체"는 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 설계를 사용하는 유전자 조작에 의해 생산된 클로스트리디움 독소 및 화학적 합성에 의해 생산된 클로스트리디움 독소를 비제한적으로 포함한, 인간 조작의 도움으로 생산된 임의의 클로스트리디움 독소를 지칭한다. 비-자연 발생 클로스트리디움 독소 변이체의 비제한적 예는, 예를 들어 보존적 클로스트리디움 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체 및 활성 클로스트리디움 독소 단편을 포함한다. 비-천연 클로스트리디움 독소는, 예를 들어 화학적 모이어티, 태그, 리간드 등의 첨가를 통해 번역후 변형된 천연 클로스트리디움 독소를 추가로 포함한다.

본원에 사용된 용어 "보존적 클로스트리디움 독소 변이체"는 적어도 1개의 아미노산이 참조 클로스트리디움 독소 서열로부터의 원래 아미노산의 특성과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해 치환된 것인 클로스트리디움 독소를 지칭한다 (예를 들어, 표 1 참조). 이러한 특성의 예는 유사한 크기, 표면 형태, 전하, 소수성, 친수성, 친지성, 공유-결합 능력, 수소-결합 능력, 물리화학적 특성 등 또는 그의 임의의 조합을 비제한적으로 포함한다. 보존적 클로스트리디움 독소 변이체는 보존적 클로스트리디움 독소 변이체가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소와 실질적으로 동일한 방식으로 기능할 수 있고, 본 명세서의 임의의 측면에서 참조 클로스트리디움 독소를 치환시킬 수 있다. 보존적 클로스트리디움 독소 변이체는 보존적 클로스트리디움 독소 변이체가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 아미노산을 치환할 수 있다. 보존적 클로스트리디움 독소 변이체는 또한 보존적 클로스트리디움 독소 변이체가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소로부터 적어도 5, 10, 15, 20 또는 25개의 인접 아미노산을 치환할 수 있다. 보존적 클로스트리디움 독소 변이체의 비제한적 예는, 예를 들어 보존적 BoNT/A 변이체, 보존적 BoNT/B 변이체, 보존적 BoNT/C₁변이체, 보존적 BoNT/D 변이체, 보존적 BoNT/E 변이체, 보존적 BoNT/F 변이체, 보존적 BoNT/G 변이체, 보존적 BoNT/H 변이체, 보존적 BoNT/X 변이체, 보존적 eBoNT/J 변이체, 보존적 TeNT 변이체, 보존적 BaNT 변이체 및 보존적 BuNT 변이체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체"는 (a) 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소로부터 적어도 1개의 아미노산이 결실되거나; (b) 비-보존적 클로스트리디움 독소가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소에 적어도 1개의 아미노산이 부가되거나; 또는 (c) 참조 클로스트리디움 독소 서열로부터의 원래의 아미노산과 특성과 유사한 어떠한 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해 적어도 1개의 아미노산이 치환된 클로스트리디움 독소를 지칭한다 (예를 들어, 표 1 참조). 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소와 실질적으로 동일한 방식으로 기능할 수 있고, 본 명세서의 임의의 측면에서 참조 클로스트리디움 독소를 치환시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소로부터 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산 및 10개 이상의 아미노산을 결실시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소에 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산 및 10개 이상의 아미노산을 부가할 수 있다. 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 아미노산을 치환시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체는 또한 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체가 기초로 하는 참조 클로스트리디움 독소로부터 적어도 5, 10, 15, 20 또는 25개의 인접 아미노산을 치환시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체의 비제한적 예는, 예를 들어 비-보존적 BoNT/A 변이체, 비-보존적 BoNT/B 변이체, 비-보존적 BoNT/C₁ 변이체, 비-보존적 BoNT/D 변이체, 비-보존적 BoNT/E 변이체, 비-보존적 BoNT/F 변이체, 비-보존적 BoNT/G 변이체, 비-보존적 BoNT/H 변이체, 비-보존적 BoNT/X 변이체, 비-보존적 eBoNT/J 변이체, 비-보존적 TeNT 변이체, 비-보존적 BaNT 변이체 및 비-보존적 BuNT 변이체를 포함한다. 또한, 임의의 다양한 클로스트리디움 독소 단편이 본 명세서의 측면에 유용할 수 있는 것으로 고려되며, 단 이들 활성 단편은 클로스트리디움 독소를 결합 파트너, 예를 들어 시냅스 소포 당단백질에 결합시키는 전체 세포 메카니즘을 실행할 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태의 측면은, 예를 들어 적어도 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 또는 적어도 1200개의 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리디움 독소 단편을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 다른 측면은, 예를 들어 최대 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 또는 최대 1200개 아미노산의 길이인 클로스트리디움 독소 단편을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 실시양태는 추가로 변이체 클로스트리디움 독소 폴리펩티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 선형 쇄 또는 분지형 아미노산, 펩티드모방체, 뿐만 아니라 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 분자를 포함한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 공유 결합, 예를 들어 펩티드 결합을 통해 서로 결합된 복수의 아미노산 잔기, 예를 들어 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 또는 그 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. "아미노산 잔기"는 본 개시내용의 폴리펩티드 내로 혼입된 개별 아미노산 단위를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 자연 발생 또는 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체, 입체이성질체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 이 정의에는 다음과 같은 천연 아미노산: (1) 히스티딘 (His; H) (2) 이소류신 (Ile; I) (3) 류신 (Leu; L) (4) 리신 (Lys; K) (5) 메티오닌 (Met; M) (6) 페닐알라닌 (Phe; F) (7) 트레오닌 (Thr; T) (8) 트립토판 (Trp; W) (9) 발린 (Val; V) (10) 아르기닌 (Arg; R) (11) 시스테인 (Cys; C) (12) 글루타민 (Gln; Q) (13) 글리신 (Gly; G) (14) 프롤린 (Pro; P) (15) 세린 (Ser; S) (16) 티로신 (Tyr; Y) (17) 알라닌 (Ala; A) (18) 아스파라긴 (Asn; N) (19) 아스파르트산 (Asp; D) (20) 글루탐산 (Glu; E) (21) 셀레노시스테인 (Sec; U); 다음과 같은 비천연 아미노산: (a) 시트룰린 (Cit); (b) 시스틴; (c) 감마-아미노 부티르산 (GABA); (d) 오르니틴 (Orn); (f) 테아닌; (g) 호모시스테인 (Hey); (h) 티록신 (Thx); 및 아미노산 유도체, 예컨대 베타인; 카르니틴; 카르노신 크레아틴; 히드록시트립토판; 히드록시프롤린 (Hyp); N-아세틸 시스테인; S-아데노실 메티오닌 (SAM-e); 타우린; 티라민이 포함된다.

한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소는 모 클로스트리디움 독소의 유도체, 예를 들어 유니프롯 등록 번호 P0DPI1 (예를 들어, 유형 A); P10844 (예를 들어, 유형 B); P18640 (예를 들어, 유형 C₁); P19321 (예를 들어, 유형 D); Q00496 (진뱅크 #CAA44558) (예를 들어, 유형 E); P30996 (예를 들어, 유형 F); Q60393 (예를 들어, 유형 G); 진뱅크 ID: KGO15617 (UNIPARC ID: 00052C1529) (유형 H); 진뱅크 ID: BAQ12790 (UNIPARC ID: 0005822796) (유형 X); 유니프롯 수탁 번호 P04958 (예를 들어, TeNT); Q45851 (예를 들어, BaNT); 또는 P30995 (예를 들어, BuNT)에 제시된 아미노산 서열의 유도체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "유도체"는 개별 아미노산 또는 상기 언급된 폴리펩티드 (그의 단편 포함)의 염, 아미드, 에스테르, 산, 염기, 용매화물, 수화물, 다형체 또는 전구약물을 포함한다. 이러한 유도체는 이러한 유도체화를 위해 공지된 방법을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 유도체는 실질적인 독성 효과 없이 동물 또는 인간에게 투여될 수 있고, 생물학적으로 활성이거나 또는 전구약물이다.

한 예에서, 유도체는 아미노산 또는 독소 폴리펩티드의 염을 포함한다. 용어 "염"은 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 적합한 유기 및 무기 반대 이온으로부터 유래된 염을 포함하고, 예를 들어 상기 언급된 아미노산의 염산 염 또는 브로민화수소산 염 또는 알칼리성 또는 산성 염을 포함한다.

원하는 경우에, 유도체는 추가로 또는 대안적으로 용매 부가 형태, 예를 들어 용매화물 또는 알콜레이트일 수 있다. 용매화물은 화학량론적 또는 비-화학량론적 양의 용매를 함유하고, 허용되는 용매, 예컨대 물, 에탄올 등과의 결정화 과정 동안 형성될 수 있다. 용매가 물인 경우에는 수화물이 형성되고; 용매가 알콜인 경우에는 알콜레이트가 형성된다. 본원에 기재된 화합물의 용매화물은 상용 기술을 사용하여 편리하게 제조되거나 형성될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 독소의 다형체가 본원에 개시된다. 다형체는 본원에 기재된 클로스트리디움 독소의 대안적인 결정 형태를 지칭한다. 단백질 (또는 폴리펩티드) 샘플의 다형체 순도는 분말 X선 회절, IR/라만 분광분석법과 같은 기술을 사용하고, 일부 경우에는 그의 광학 특성에서의 차이를 이용하여 검사될 수 있다 (Thomas et al., Chemical Communications, 48: 10559-10561 (2012)).

유도체는 원하는 바에 따라 아미노산의 아미드 또는 에스테르 및/또는 아미노산의 이성질체 (예를 들어, 호변이성질체 또는 입체이성질체)를 추가로 포함할 수 있다.

도메인

본 개시내용의 실시양태는 추가로 상기 언급된 클로스트리디움 독소에 존재하는 도메인 및 부위, 예를 들어 전위 도메인 (H_N), 엔도펩티다제 도메인, 또는 세포-결합 도메인, 예컨대 그의 서브-도메인, 예를 들어 H_CN 서브-도메인 또는 H_CC 서브도메인에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 클로스트리디움 독소 내의 1개 이상의 도메인 또는 서브도메인 내에 위치한 세포-결합 부위를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드는, 예를 들어 클로스트리디움 독소 세포-결합 도메인의 1개 이상의 아미노산 모티프를 포함할 수 있다. 예시적인 클로스트리디움 독소에서 발견되는 각각의 도메인 및 서브도메인에 대한 경계 영역은, 예를 들어 미국 특허 번호 8,697,413 (전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 다양한 도메인의 경계 영역은 관련 기술분야에 공지된 생물정보학 도구 (예를 들어, INTERPRO 또는 PROSITE)를 사용하여 근사화될 수 있다. 따라서, '413 특허에 개시된 바와 같은 경계 영역은 절대적인 것이 아니고, 예를 들어 미국 특허 번호 8,841,111 및 미국 특허 번호 8,512,992 (전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이, 부차적 변이, 예를 들어 개별 도메인의 길이 및/또는 분자량의 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1% 또는 그 미만 %의 변화를 각각 나타내는, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20개 또는 그 초과의 아미노산의 차이가 허용가능하다.

클로스트리디움 독소 또는 그의 단편의 결합 활성은 상용 기술, 예를 들어 방사성-표지 검정, 경쟁적 결합 검정, 시험관내 결합 검정, 예컨대 비아코어(BIAcore) 표면 플라즈몬 (SPR) 기술, 수용체 인산화, 이량체화 또는 신호전달 검정 등을 사용하여 검정될 수 있다. 클로스트리디움 독소 단편에 상응하는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 평가하기 위한 대표적인 검정은, 예를 들어 클로스트리디움 독소 변이체에 의해 매개되는 유전자 발현에서의 조정을 평가하는 것을 포함하거나, 실시예 섹션에 기재된 복수의 유전자의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 활성은, 예를 들어 표적 세포, 예컨대 섬유모세포, 섬유화 세포, 암 세포, 각질세포, 멜라닌세포, 지방세포, 뉴런 등에서의 섬유증 연관 유전자의 발현 및/또는 그에 대한 효과의 측정을 통해 기능적으로 평가될 수 있다. 표적 세포, 예컨대 정상 또는 반흔 유래된 섬유모세포 및 암 세포로부터 분비된 단백질의 양을 정량화하는 것을 수반하는 대표적인 방법이 실시예에 제공된다.

한 실시양태에서, 생물학적 활성 단편은 클로스트리디움 독소의 적어도 100, 300, 500, 600, 800, 1000, 1200개 또는 그 초과의 인접 아미노산을 포함한다. 본원에 기재된 클로스트리디움 독소의 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법 (예를 들어, 재조합 생명공학 기술)에 의해 생성될 수 있다. 단편 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 방법 (예를 들어, 면역원성 기술, 예컨대 면역블롯팅 또는 ELISA 또는 단백질 염색 기술, 예컨대 은 염색)을 사용하여 검출될 수 있다.

특정 실시양태에서, 단편 폴리펩티드는 적합한 숙주, 예를 들어 바큘로바이러스, 이. 콜라이, 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서 발현되는 경우에 분비될 수 있다. 본원에 사용된 "분비된"은 발현된 폴리펩티드가 통상적인 기술, 예를 들어 ELISA 검정을 사용하여 검출가능한 수준으로 숙주 세포에서 배양 배지 내로 분비된다는 것을 의미한다. 분비 형태의 단백질을 합성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 표적 세포의 표면에 위치한 수용체 복합체에 대한 결합 시 표적 세포의 유전자 발현 및/또는 대사 활성을 조정하는, 클로스트리디움 독소 결합 도메인을 포함하는 중쇄의 카르복시 말단 영역 (H_C 영역)을 포함하는 클로스트리디움 독소 단편에 관한 것이다. 클로스트리디움 독소의 중쇄로부터의 H_C 영역은 대략 400-440개 아미노산의 길이이고, 결합 도메인을 포함한다 (표 1). 따라서, 이러한 실시양태의 측면은, 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 또는 425개 아미노산의 길이를 갖는 결합 도메인을 포함하는 클로스트리디움 독소 H_C 영역을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 다른 측면은, 예를 들어 최대 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 또는 425개 아미노산의 길이를 갖는 결합 도메인을 포함하는 클로스트리디움 독소 H_C 영역을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 결합 도메인 단편에 관한 것이다: BoNT/A (예를 들어, 유니프롯 # P0DPI1)의 아미노산 N872-L1296; BoNT/B (예를 들어, 유니프롯 #P10844)의 아미노산 E859-E1291; BoNT/C₁ (예를 들어, 유니프롯 #P18640)의 아미노산 N867-E1291; BoNT/D (예를 들어, 유니프롯 #P19321)의 아미노산 S863-E1276; BoNT/E (예를 들어, 유니프롯 #Q00496 또는 진뱅크 #CAA44558)의 아미노산 R846-K1252; BoNT/F (예를 들어, 유니프롯 #P30996)의 아미노산 K865-E1274; BoNT/G (예를 들어, 유니프롯 #Q60393)의 아미노산 N864-E1297; BoNT/H (예를 들어, 진뱅크 #KGO15617)의 아미노산 Y844-L1288; TeNT (예를 들어, 유니프롯 #P04958)의 아미노산 I880-D1315; BaNT (예를 들어, 유니프롯 #Q45851)의 아미노산 I858-E1268; 또는 BuNT (예를 들어, 유니프롯 #P30995)의 아미노산 K848-K1251.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 독성이 결여된 전장 보툴리눔 독소의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 독성이 결여된 보툴리눔 독소의 전장에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 중쇄의 카르복실 또는 C-말단 절편 (H_C)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 중쇄의 C-말단 절편에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 N-말단 절반의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 N-말단 절반에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A), 보툴리눔 독소 혈청형 B (BoNT/B), 보툴리눔 독소 혈청형 C₁ (BoNT/C₁), 보툴리눔 독소 혈청형 D (BoNT/D), 보툴리눔 독소 혈청형 E (BoNT/E), 보툴리눔 독소 혈청형 F (BoNT/F), 보툴리눔 독소 혈청형 G (BoNT/G), 보툴리눔 독소 혈청형 H (BoNT/H), 보툴리눔 독소 혈청형 X (BoNT/X) 및 모자이크 보툴리눔 독소 및/또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 모자이크 독소의 예는 BoNT/DC, BoNT/CD 및 BoNT/FA를 포함한다. 한 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A)가 아니다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은, 예를 들어 약 1 kDa 내지 약 160 kDa, 약 5 kDa 내지 약 160 kDa, 약 20 kDa 내지 약 150 kDa, 약 40 kDa 내지 약 120 kDa, 약 50 kDa 내지 약 80 kDa, 약 5 kDa 내지 약 15 kDa, 약 10 kDa 내지 약 20 kDa, 약 20 kDa 내지 약 30 kDa, 약 30 kDa 내지 약 40 kDa, 약 40 kDa 내지 약 50 kDa, 약 50 kDa 내지 약 60 kDa, 약 60 kDa 내지 약 70kDa, 약 70 kDa 내지 약 80 kDa, 약 80 kDa 내지 약 90 kDa, 약 90 kDa 내지 약 100 kDa, 약 100 kDa 내지 약 110 kDa, 약 110 kDa 내지 약 120 kDa, 약 120 kDa 내지 약 130 kDa, 약 130 kDa 내지 약 140kDa, 약 140 kDa 내지 약 150 kDa 또는 그 초과의 범위, 예컨대 그 사이의 모든 값, 예를 들어 약 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa, 15 kDa, 16 kDa, 17 kDa, 18 kDa, 19 kDa, 20 kDa, 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 28 kDa, 29 kDa, 30 kDa, 31 kDa, 32 kDa, 33 kDa, 34 kDa, 35 kDa, 36 kDa, 37 kDa, 38 kDa, 39 kDa, 40 kDa, 41 kDa, 42 kDa, 43 kDa, 44 kDa, 45 kDa, 46 kDa, 47 kDa, 48 kDa, 49 kDa, 50 kDa, 51 kDa, 52 kDa, 53 kDa, 54 kDa, 55 kDa, 56 kDa, 57 kDa, 58 kDa, 59 kDa, 60 kDa, 61 kDa, 62 kDa, 63 kDa, 64 kDa, 65 kDa, 66 kDa, 67 kDa, 68 kDa, 69 kDa, 70 kDa, 71 kDa, 72 kDa, 173 kDa, 74 kDa, 75 kDa, 76 kDa, 77 kDa, 78 kDa, 79 kDa, 80 kDa, 81 kDa, 82 kDa, 83 kDa, 84 kDa, 85 kDa, 86 kDa, 87 kDa, 88 kDa, 89 kDa, 90 kDa, 91 kDa, 92 kDa, 93 kDa, 94 kDa, 95 kDa, 96 kDa, 97 kDa, 98 kDa, 99 kDa, 100 kDa, 101 kDa, 102 kDa, 103 kDa, 104 kDa, 105 kDa, 106 kDa, 107 kDa, 108 kDa, 109 kDa, 110 kDa, 111 kDa, 112 kDa, 113 kDa, 114 kDa, 115 kDa, 116 kDa, 117 kDa, 118 kDa, 119 kDa, 120 kDa, 121 kDa, 122 kDa, 123 kDa, 124 kDa, 125 kDa, 126 kDa, 127 kDa, 128 kDa, 129 kDa, 130 kDa, 131 kDa, 132 kDa, 133 kDa, 134 kDa, 135 kDa, 136 kDa, 137 kDa, 138 kDa, 139 kDa, 140 kDa, 141 kDa, 142 kDa, 143 kDa, 144 kDa, 145 kDa, 146 kDa, 147 kDa, 148 kDa, 149 kDa, 150 kDa 또는 그 초과 내지, 예를 들어 약 155 kDa, 약 160 kDa, 약 165 kDa, 약 170 kDa, 약 175 kDa, 약 180 kDa, 약 190 kDa, 약 200 kDa, 약 225 kDa, 약 250 kDa, 약 275 kDa 또는 그 초과의 평균 분자량을 갖는 클로스트리디움 독소 변이체 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은, 예를 들어 약 1 kDa 내지 약 50 kDa, 약 5 kDa 내지 약 35 kDa, 약 10 kDa 내지 약 30 kDa, 약 15 kDa 내지 약 25 kDa, 약 5 kDa 내지 약 15 kDa, 약 5 kDa 내지 약 10 kDa, 약 10 kDa 내지 약 20 kDa, 약 10 kDa 내지 약 15 kDa, 약 20 kDa 내지 약 30 kDa, 약 20 kDa 내지 약 25 kDa, 또는 50 kDa 초과의 범위, 예컨대 그 사이의 모든 값, 예를 들어 약 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa, 15 kDa, 16 kDa, 17 kDa, 18 kDa, 19 kDa, 20 kDa, 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 28 kDa, 29 kDa, 30 kDa, 31 kDa, 32 kDa, 33 kDa, 34 kDa, 35 kDa, 36 kDa, 37 kDa, 38 kDa, 39 kDa, 40 kDa, 41 kDa, 42 kDa, 43 kDa, 44 kDa, 45 kDa, 46 kDa, 47 kDa, 48 kDa, 49 kDa, 50 kDa 또는 그 초과의 분자량을 갖는 클로스트리디움 독소의 결합 도메인의 N-말단 서브-도메인 (H_CN)에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노 또는 N-말단 절반 (H_CN)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 클로스트리디움 독소의 결합 도메인의 N-말단 절반의 처음 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250개 또는 그 초과 개수의 인접 아미노산을 포함하는, 클로스트리디움 독소의 결합 도메인의 아미노-말단 (N-말단) 절반과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 실시양태에서, 폴리펩티드는, 예를 들어 약 1 kDa 내지 약 25 kDa, 약 5 kDa 내지 약 20 kDa, 약 6 kDa 내지 약 15 kDa, 약 8 kDa 내지 약 15 kDa, 약 8 kDa 내지 약 14 kDa, 약 6 kDa 내지 약 25 kDa, 약 8 kDa 내지 약 20 kDa, 약 10 kDa 내지 약 15 kDa의 범위, 예컨대 그 사이의 모든 값, 예를 들어 약 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 5.5 kDa, 6 kDa, 6.5 kDa, 7 kDa, 7.5 kDa, 8 kDa, 8.5 kDa, 9 kDa, 9.5 kDa, 10 kDa, 10.5 kDa, 11 kDa, 11.5 kDa, 12 kDa, 12.5 kDa, 13 kDa, 13.5 kDa, 14 kDa, 14.5 kDa, 15 kDa, 15.5 kDa, 16 kDa, 16.5 kDa, 17 kDa, 17.5 kDa, 18 kDa, 19 kDa, 20 kDa 또는 그 초과의 분자량을 가질 수 있다.

관련 실시양태에서, 본 개시내용은, 예를 들어 약 1 kDa 내지 약 50 kDa, 약 5 kDa 내지 약 35 kDa, 약 10 kDa 내지 약 30 kDa, 약 15 kDa 내지 약 25 kDa, 약 5 kDa 내지 약 15 kDa, 약 5 kDa 내지 약 10 kDa, 약 10 kDa 내지 약 20 kDa, 약 10 kDa 내지 약 15 kDa, 약 20 kDa 내지 약 30 kDa, 약 20 kDa 내지 약 25 kDa, 또는 50 kDa 초과의 범위, 예컨대 그 사이의 모든 값, 예를 들어 약 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa, 15 kDa, 16 kDa, 17 kDa, 18 kDa, 19 kDa, 20 kDa, 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 28 kDa, 29 kDa, 30 kDa, 31 kDa, 32 kDa, 33 kDa, 34 kDa, 35 kDa, 36 kDa, 37 kDa, 38 kDa, 39 kDa, 40 kDa, 41 kDa, 42 kDa, 43 kDa, 44 kDa, 45 kDa, 46 kDa, 47 kDa, 48 kDa, 49 kDa, 50 kDa 또는 그 초과의 분자량을 갖는 클로스트리디움 독소의 결합 도메인의 C-말단 서브-도메인 (H_CC)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 환원성 겔 전기영동에 의해 결정 시에, 상기 언급된 분자량, 예를 들어 약 1 kDa 내지 약 150 kDa, 특히 약 5 kDa 내지 약 90 kDa, 특히 약 10 kDa 내지 약 70 kDa을 갖는 클로스트리디움 독소 단편을 제공한다.

다른 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 (그의 단편 포함)의 분자량은 관련 기술분야에 공지된 생물정보학 도구 (예를 들어, PROTPARAM 또는 COMPUTE pI/MW)를 사용하여 이론적으로 컴퓨터 계산된다. 예를 들어, PROTPARAM에 기초하여, 전장 BoNT/A (유니프롯 # P0DPI1)는 약 149.3 kDa의 이론적 분자량을 갖고, 한편 아미노산 449 내지 1296 (848개 아미노산)을 포함하는 H_C 도메인은 약 98.2 kDa의 이론적 MW을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 아미노산 873 내지 1092에 걸쳐있는 BoNT/A (유니프롯 # P0DPI1)의 H_CN 도메인은 PROTPARAM에 기초하여 약 26.1 kDa의 이론적 분자량을 갖는다. 추가 실시양태에서, 아미노산 873 내지 980에 걸쳐있는 BoNT/A (유니프롯 # P0DPI1)의 H_CN 도메인의 근위 N-말단 단편은 약 12.65 kDa의 이론적 분자량을 갖는다.

동일한 서열 및 컨센서스 서열의 확인을 위한 서열 정렬 분석에 사용된 다양한 혈청형의 BoNT로부터 유래된 BoNT H_C 도메인 및 H_CN 도메인의 대표적인 아미노산 서열은 본원에서 서열식별번호: 3-9로 식별된다.

변형

일부 경우에, 클로스트리디움 독소 (또는 그의 도메인 또는 서브-도메인)는 1개 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 고리화될 수 있다. 또 다른 예로서, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은, 예를 들어 1개 이상의 D-아미노산을 포함한 1개 이상의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 1차 서열을 변경시키지 않는 관심 변형은 폴리펩티드의 화학적 유도체화, 예를 들어 아세틸화 또는 카르복실화를 포함한다. 또한, 글리코실화의 변형, 예를 들어 폴리펩티드의 합성 및 프로세싱 동안에 또는 추가 프로세싱 단계에서 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써; 예를 들어 폴리펩티드를 글리코실화에 영향을 미치는 효소, 예컨대 포유동물 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소에 노출시킴으로써 만들어진 변형이 포함된다. 또한, 인산화된 아미노산 잔기, 예를 들어 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.

또한, 단백질분해성 분해에 대한 저항성을 개선시키거나 용해도 특성을 최적화하거나 이들을 치료제로서 보다 적합하게 하기 위해 통상의 분자 생물학 기술 및/또는 합성 화학을 사용하여 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편이 제공된다. 이러한 폴리펩티드의 유사체는 자연 발생 L-아미노산 이외의 잔기, 예를 들어 D-아미노산 또는 비-자연 발생 합성 아미노산을 함유하는 것이 포함된다.

독소는 다양한 목적을 위해 매우 다양한 다른 올리고펩티드 또는 단백질에 연결될 수 있다. 대상 폴리펩티드의 발현을 제공함으로써, 다양한 번역후 변형이 달성될 수 있다. 예를 들어, 적절한 코딩 서열을 사용함으로써, 파르네실화 또는 프레닐화를 제공할 수 있다. 예를 들어, 독소는 지질 막, 예컨대 리포솜에 결합될 수 있도록 말단에서 지질 기에 결합될 수 있다.

클로스트리디움 독소 또는 그의 단편에 대한 다른 적합한 변형은, 예를 들어 (1) 폴리펩티드 말단의 말단-캡핑, 예컨대 C-말단의 아미드화 및/또는 N-말단의 아세틸화 또는 탈아미노화; (2) 구조 내 펩티드모방체 요소를 도입하는 것; 및 (3) 고리화를 포함하며, 여기서 폴리펩티드의 고리화는 자연 아미노산 또는 비-자연 발생 빌딩 블록을 통해 일어날 수 있다.

변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은, 예를 들어 아미노산 측쇄가 α-탄소 대신에 폴리펩티드 백본의 질소에 연결된 펩토이드 (N-치환된 올리고글리신)일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zuckermann et al., J. Am. Chem. Soc. 114, 10646, 1992]을 참조한다.

대상 독소는 자연 발생 및 비-자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 폴리펩티드에 특수 특성을 전달하기 위해 D-아미노산, D -및 L-아미노산의 조합, 및 다양한 "설계자" 아미노산 (예를 들어, β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산 및 Nα-메틸 아미노산 등)을 포함할 수 있다.

융합 단백질 및 연결된 단백질

본 명세서에 개시된 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 임의로 1종 이상의 추가의 성분을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 임의적 성분의 비제한적 예로서, 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 가요성 스페이서를 포함하는 가요성 영역을 추가로 포함할 수 있다. 가요성 스페이서의 비제한적 예는, 예를 들어 G-스페이서 GGGGS (서열식별번호: 22) 또는 A-스페이서 EAAAK (서열식별번호: 23)를 포함한다. 폴리펩티드의 특징, 속성 또는 특성을 최적화하기 위해 폴리펩티드 영역의 길이를 조정하는데 가요성 스페이서를 포함하는 가요성 영역이 사용될 수 있다. 이러한 가요성 영역은 융합 단백질로서 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편에 인-프레임으로 작동가능하게 연결된다. 비제한적 예로서, 1개 이상의 가요성 스페이서를 직렬로 포함하는 폴리펩티드 영역은 프로테아제 절단 부위를 보다 잘 노출시켜 프로테아제에 의한 그 부위의 절단을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적 예로서, 1개 이상의 가요성 스페이서를 직렬로 포함하는 폴리펩티드 영역은 리간드 도메인을 보다 잘 제시하여 그 리간드 도메인이 수용체 상의 그의 결합 도메인에 결합하는 것을 용이하게 하는데 사용될 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 가요성 스페이서를 포함하는 가요성 영역을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 복수의 가요성 스페이서를 직렬로 포함하는 가요성 영역을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 측면들에서, 가요성 영역은 직렬로, 예를 들어 적어도 1개의 G-스페이서, 적어도 2개의 G-스페이서, 적어도 3개의 G-스페이서, 적어도 4개의 G-스페이서 또는 적어도 5개의 G-스페이서를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 다른 측면에서, 가요성 영역은 직렬로, 예를 들어 최대 1개의 G-스페이서, 최대 2개의 G-스페이서, 최대 3개의 G-스페이서, 최대 4개의 G-스페이서 또는 최대 5개의 G-스페이서를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 가요성 영역은 직렬로, 예를 들어 적어도 1개의 A-스페이서, 적어도 2개의 A-스페이서, 적어도 3개의 A-스페이서, 적어도 4개의 A-스페이서 또는 적어도 5개의 A-스페이서를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 가요성 영역은 직렬로, 예를 들어 최대 1개의 A-스페이서, 최대 2개의 A-스페이서, 최대 3개의 A-스페이서, 최대 4개의 A-스페이서 또는 최대 5개의 A-스페이서를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 동일한 가요성 스페이서의 1개 이상의 카피, 상이한 가요성-스페이서 영역의 1개 이상의 카피 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 가요성 영역을 포함할 수 있다.

클로스트리디움 독소의 특성

독성 프로파일의 결여

한 실시양태에서, 본 개시내용은 감소된 독성 또는 결여된 독성을 포함한 변형된 독성의 클로스트리디움 독소 (예를 들어, BoNT/A) 또는 그의 단편에 관한 조성물 및 방법을 고려한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 특히 가용성 NSF 부착 단백질 수용체 ("SNARE") 단백질을 선택적으로 절단하는 아연 (Zn²⁺) 엔도펩티다제인 클로스트리디움 독소의 독성 활성은 경쇄에 함유된다. SNARE 단백질은 형질 막의 세포질 표면을 갖는 신경전달물질-함유 소포의 인식 및 도킹 및 형질 막과 소포의 융합에 중요하다. TeNT, BoNT/B BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G는 시냅토솜 막 단백질인 시냅토브레빈 (소포-연관 막 단백질 (VAMP)로도 불림)의 분해를 유발한다. 시냅스 소포의 표면으로부터 연장되는 VAMP의 시토졸 도메인의 대부분은 이들 절단 사건 중 어느 하나의 결과로서 제거된다. BoNT/A 및 BoNT/E는 주로 형질 막의 시토졸 표면에 결합되고 이에 존재하는 형질 막-연관 단백질 SNAP-25를 선택적으로 절단한다. BoNT/C는 덩어리 대부분이 시토졸에 노출된 내재성 단백질인 신탁신을 절단한다. 신탁신은 시냅스전 말단 활성 구역에서 칼슘 채널과 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편의 독성은 신경근육 마비의 유도 (이는 독소 분자가 세포에 진입하여 신경전달물질 방출을 억제하는 능력의 지표임)의 측면에서 검정된다. 일부 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편의 독성은 독소 구축물의 복강내 주사 시 시험 동물, 예를 들어 마우스 군의 50% (1/2)에서 사망을 유도하는 독소의 양인 LD₅₀ 값의 측면에서 검정된다. 미국 특허 번호 7,749,514 및 9,284,545를 참조한다.

이러한 실시양태의 측면에서, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 자연 발생 클로스트리디움 독소로서의 독성으로서, 예를 들어 약 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 >99%이다. 이러한 실시양태의 측면에서, 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 자연 발생 클로스트리디움 독소로서의 독성으로서, 예를 들어 최대 10%, 자연 발생 클로스트리디움 독소로서의 독성으로서 최대 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 <95%이다. 바람직하게는, 본 개시내용의 클로스트리디움 독소 단편 또는 변이체는, 예를 들어 대상체에게 통상적인 방식으로 적용되는 경우에 독성이 결여되어 있다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 변형된 독성의 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 적용이 발견된다: (a) 연구 (즉, 예를 들어 BoNT/A의 작용 메카니즘, 예컨대 그의 결합, 전위 및 약동학, 및 해독제를 개발하고 시험하기 위한 그의 사용에 대한 연구); (c) 실내 방출에 대한 위험 및 진단을 평가하기 위한 연구; (d) 영장류를 포함한 포유동물에서 약동학을 조사하기 위한 연구; (d) 백신 개발; (e) 항체 개발 (요법 및 진단용); 및 (f) 임상 치료 용도.

클로스트리디움 독소의 독성은 상용 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 다단계 메카니즘은 BoNT에 의한 세포 중독에 관여한다 (Chaddock et al., Trends Biochem. Sci. 27, 552-558, 2002). 신경독소는 중쇄 (H)를 통해 뉴런의 시냅스전 신경 종말에 결합하고, 수용체-매개 세포내이입에 의해 진입한다 (Schiand et al., Physio. Rev. 80, 717-755, 2000). 낮은 pH의 엔도솜은 H_CN에 의한 채널 형성을 유도하는 것으로 여겨지며, 이는 LC의 시토졸 내로의 전위를 가능하게 한다 (Li et al., Biochemistry 39, 6466-6474, 2000). LC는 시냅스 소포 융합에 필수적인 3종의 상이한 SNARE 단백질 중 하나를 특이적으로 절단하는 아연 엔도펩티다제로서 작용하는 것으로 여겨진다 (Montecucco et al., Trends Biochem. Sci. 18, 324-327, 1993; Li et al., Toxin Rev. 18, 95-112, 1999). 한 실시양태에서, BoNT/A 및 BoNT/E는 독립적으로, 막 융합의 특이성을 설명하고 시냅스 소포와 형질 막을 함께 합친 조밀한 복합체를 형성함으로써 융합을 직접 실행하는 것으로 제안된, 트랜스-SNARE 복합체의 성분인 시냅토솜-연관 단백질 25 (SNAP-25)를 절단한다. 또 다른 실시양태에서, TeNT 및/또는 BoNT/B, /D, /F 및 /G는 시냅스전 막과 시냅스 소포의 도킹 및/또는 융합에 관여하는 단백질인 셀루브레빈을 절단한다. 한 실시양태에서, BoNT/C₁은 신탁신 및 SNAP-25를 절단한다. SNARE 단백질이 절단되면, 신경전달물질 (즉, 예를 들어 아세틸콜린)의 방출이 방지되어, 궁극적으로는 이완성 근육 마비로 이어진다 (Montecucco et al., Q. Rev. Biophys, 28:423-472 (1995)). 보툴리눔 신경독소 활성 부위는 HEXXH+E 아연-결합 모티프를 포함하는 것으로 여겨진다 (Li et al., Biochemistry 39, 2399-2405, 2000). 일반적 입체형태 및 활성 부위 잔기는 모든 클로스트리디움 신경독소에서 보존되는 것으로 보인다 (Agarwal et al., Biochemistry 44, 8291-8302, 2005). 예를 들어, BoNT/A 활성 부위 내의 아미노산 잔기는 H223-E224-L225-I226-H227+ E262 (서열식별번호: 24로 개시된 "H223-E224-L225-I226-H227")를 포함하며, 이는 모두가 아니더라도 대부분의 BoNT 하위유형에서 보존된다.

따라서, 본 개시내용은 엔도펩티다제 활성 또는 전위 활성 또는 엔도펩티다제 활성 및 전위 활성 둘 다가 결여된 클로스트리디움 독소의 비-독성 형태에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 엔도펩티다제 활성이 결여된 클로스트리디움 독소 변이체가 본원에 제공된다. 이러한 변이체는, 예를 들어 엔도펩티다제 활성을 부여하는 활성 부위를 구성하는 1개 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이 또는 결실을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 엔도펩티다제 활성이 결여된 클로스트리디움 독소 변이체는 경쇄 (LC) 도메인을 구성하는 아미노산의 상당한 부분의 결실, 예를 들어 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 >99%의 결실을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 변이체는 엔도펩티다제 활성 및 전위 활성 둘 다가 결여되어 있다. 이러한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 변이체는 (a) 경쇄 (LC) 도메인을 구성하는 아미노산 및 (b) 전위 도메인을 구성하는 아미노산의 상당한 부분의 결실을 포함할 수 있다.

BoNT/A와 관련하여, 본 개시내용은 SNAP-25를 절단하지 않는 단편을 고려한다. SNAP-25 절단 활성을 측정하는 시약 및 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Mizanur et al., PLoS One, 9(4), e95188, 2014]을 참조한다.

본 개시내용은 추가로 불활성 클로스트리디움 독소 (그의 단편 포함)에 관한 것이다. 용어 "불활성 클로스트리디움 독소"는 세포에 독성이 아닌 클로스트리디움 독소를 의미한다. 예를 들어, 불활성 클로스트리디움 독소는 세포 또는 신경 종말로부터 신경전달물질의 방출을 방해하는 능력이 최소이거나 없다. 일부 실시양태에서, 불활성 클로스트리디움 독소는 활성인 동일한 클로스트리디움 독소의 신경독성 효과 (예를 들어, 신경전달물질의 방출을 억제하는 능력)의 약 50%, 예를 들어 약 40%, 약 25%, 약 10%, 약 5% 또는 그 미만 %, 예를 들어 약 2%를 갖는다. 예를 들어, 불활성 보툴리눔 독소 (iBoNT)는 활성인 동일한 BoNT (예를 들어, 전장 BoNT)의 신경독성 효과의 약 50%, 예를 들어 약 40%, 약 25%, 약 10%, 약 5% 또는 그 미만 %, 예를 들어 약 2%를 갖는다. 전장 불활성 보툴리눔 독소는, 예를 들어 미국 특허 번호 6,051,239 및 미국 특허 번호 7,172,764에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 불활성 클로스트리디움 독소는 항원성을 감소시키기 위해 변형된 (예를 들어, 글리코실화된) 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 불활성 클로스트리디움 독소는 단일 쇄 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 본 개시내용의 불활성 클로스트리디움 독소는 경쇄 (LC) 도메인 및/또는 전위 도메인이 결여된 전장 클로스트리디움 독소의 단편을 포함하며, 여기서 단편 클로스트리디움 독소는 추가로 항원성을 감소시키기 위해 임의로 글리코실화된다.

본원에 사용된 용어 "감소된 항원성"은 포유동물에서 항체 생산을 유도하는 불활성 클로스트리디움 독소의 능력이 전장 클로스트리디움 독소의 항원성 효과보다 더 적은 것, 예를 들어 전장 클로스트리디움 독소의 항원성 효과의 약 100% 미만, 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 예를 들어 약 40%, 약 25%, 약 10%, 약 5% 또는 그 미만 %, 예를 들어 약 2%인 것을 의미한다. 예를 들어, 글리코실화된 분자는 포유동물에서 항체 생산에 대한 면역 반응을 유도하는 능력이 최소이거나 없기 때문에 감소된 항원성을 가질 수 있다. 또한, 분자 상의 에피토프 영역은 포유동물에서의 항체의 유도를 담당한다. 따라서, 에피토프 영역이 돌연변이되거나 결실된 분자는 이들 영역이 항체 생산을 자극하는 분자 상에 더 이상 존재하지 않기 때문에 감소된 항원성을 가질 수 있다. 미국 특허 번호 7,172,764를 참조한다. 예를 들어, 중쇄 내 카르복시 말단 (Hc)에서 돌연변이되거나 결실된 에피토프 영역을 포함하는 iBoNT는 전장 클로스트리디움 독소와 비교하여 감소된 항원성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리코실화된 BoNT를 포유동물에게 투여하는 것은 글리코실화되지 않은 동일한 BoNT의 투여와 비교하여 약 2배, 바람직하게는 4배, 보다 바람직하게는 8배 또는 그 초과만큼 더 적은 항체 생산을 유도한다. 본 개시내용의 클로스트리디움 독소의 항원성은 관련 기술분야, 예를 들어 문헌 [Atassi et al., Protein J., 23(1):39-52, 2004]에 공지된 방법 및 도구를 사용하여 결정될 수 있다.

본원에 개시된 실시양태는 추가로, 예를 들어 생화학적 검정, 시험관내 세포-기반 검정, 생체내 약리학적 검정 등을 포함하는, 클로스트리디움 독소 (그의 단편 및 변이체 포함)의 독성을 검정하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 단편 또는 변이체는 표준 엔도펩티다제 검정에서 엔도펩티다제 활성이 결여되어 있다 (시험관내 검정의 변형에 대해 미국 특허 번호 8,618,261; 미국 특허 번호 8067231; 미국 특허 번호 8,124,357; 미국 특허 번호 7,645,570 참조). 또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 단편 또는 변이체는 비-치사성이다.

세포 신호전달의 조정

관련 실시양태에서, 예를 들어 FGFR1, MMP1, MMP3, TIMP1, FGF7, TP63, SOD2, UBD, HAS2, HAS3, ADAMTS1, IGF-1, IL-6, IL-32, CCL2, BDKRB1, S100A4 및 ACTA2를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 섬유증 연관 유전자의 발현을 조정하는 클로스트리디움 독소, 그의 서브-도메인 또는 단편 또는 그의 변이체가 본원에 제공된다.

이들 섬유증 연관 유전자 발현의 변화는 세포외 매트릭스 구조를 포함한 섬유증 연관 세포, 조직 및/또는 기관의 구조적 및 기능적 특징에 영향을 미쳐, 섬유모세포 증식, 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 이행, 섬유모세포 수축성, 세포외 매트릭스 (ECM) 성분의 생성 및/또는 분비, 예컨대, 예를 들어 콜라겐, 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 및 매트릭스 세포성 단백질 생산/분비의 변화를 가져온다. 예를 들어, 도 1에 제시된 바와 같이, 본 방법에 따라 제공된 폴리펩티드로의 정상 섬유모세포의 처리는 ECM 복구 및 재형성에 관여하는 유전자, 예컨대, 예를 들어 MMP1 및 MMP3의 발현을 증가시키고, 섬유모세포 수축성 및 근섬유모세포 형성과 연관된 유전자, 예컨대, 예를 들어 S100A4 및 ACTA2의 발현을 감소시켰다. 섬유증 및 반흔 형성이 섬유모세포 수축성, 근섬유모세포 형성과 연관되기 때문에, 얻은 결과는 본 방법에 따라 제공된 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. "조정하다"란, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체가 표적 세포, 예를 들어 섬유모세포, 각질세포, 멜라닌세포, 피지세포, 면역 세포, 골모세포, 연골세포, 근세포, 지방세포, 신경교 세포 또는 뉴런과 접촉될 때, 대조군 (예를 들어, BSA 처리)과 비교하여 상기 언급된 유전자 중 1종 이상의 발현의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배 또는 그 초과의 변화를 발생시키는 것을 의미한다. 유전자 발현을 측정하는 방법, 예를 들어 마이크로어레이 분석 또는 정량적 PCR 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 대표적인 방법이 실시예 섹션에 예시된다.

특히, 표적 세포, 예를 들어 정상 섬유모세포 또는 반흔 유래된 섬유모세포, 섬유화 세포, 암 세포와 접촉될 때, FGFR1, MMP1, MMP3, TIMP1, FGF7, TP63, S100A4 및 ACTA2로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 조정하는 클로스트리디움 독소, 그의 서브도메인 또는 단편 또는 변이체가 본원에 제공된다. 특히, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 상기 언급된 6종의-유전자 시그너쳐에서 각각의 유전자의 발현을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배 또는 그 초과만큼 조정한다 (예를 들어, 증가시킨다). 이들 세포외 매트릭스 연관 유전자 발현의 변화는 진피 세포외 매트릭스 (ECM)를 생성, 유지 및 복구하는데 관여하는 단백질의 생산 또는 분비에 영향을 미친다. 반흔 형성 및 섬유증은 일부 ECM 성분의 과량 생산과 연관되기 때문에, 얻은 결과는 본 방법에 따라 제공된 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

추가적으로, 본 개시내용은 피브로넥틴의 발현 또는 분비를 조정하는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체에 관한 것이다. 본원에 사용된 "피브로넥틴"은 ECM 내의 성분 단백질, 예를 들어 콜라겐, 피브린 및 헤파란 술페이트 프로테오글리칸에 결합하는 세포외 매트릭스의 고분자량 (~440kDa) 당단백질을 지칭한다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 세포, 예를 들어 섬유모세포와 접촉될 때, 피브로넥틴의 발현 또는 분비를 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 또는 그 초과만큼 조정한다. 피브로넥틴 발현/분비의 변화는 세포외 매트릭스 구조를 포함한 진피의 구조 및 기능에 영향을 미쳐, 항-섬유화 효과를 가져온다.

표적 세포에 대한 효과

본 개시내용은 추가로 표적 세포, 예를 들어 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체가 결합하는 세포의 하나 이상의 특색을 변화시키는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 특색은 기능적 속성, 예컨대 섬유모세포 수축성, 이동, 분화, 분비 (예를 들어, ECM 성분) 및 부착 (서로 및 매트릭스에 대한)이다. 또 다른 실시양태에서, 특색은 ECM 복구에 관여하는 유전자와 같은 유전자의 조정된 발현이다. 특정한 실시양태에서, 특색은 매개자의 존재 하에 단백질의 감쇠된 생산 또는 분비, 예를 들어 피브로넥틴 및 반흔 유래된 섬유모세포로부터의 콜라겐 분비의 감쇠이다. 실시예에 제시된 바와 같이, 표적 세포, 예를 들어 섬유모세포와 접촉될 때, 클로스트리디움 독소 단편은 특이적 단백질 분비 및/또는 유전자 발현에서 주목할 만한 변화를 발생시킨다. 추가적으로, 저산소증-유발된 섬유화 암 세포를 클로스트리디움 독소 단편으로 처리하는 것은 공지된 항섬유화제, 예를 들어 FG-3019와 동일한 단백질 분비에 대한 효과를 가져왔다.

클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 세포 효과는 실시예에서 상세히 설명되는 기술들을 사용하여 검정될 수 있다. 세포 수준에서의 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 효과를 검정하기 위해 다양한 표적 세포, 예를 들어 섬유모세포, 각질세포, 지방세포, 골모세포, 연골세포, 근세포, 신경교 세포, 뉴런; 세포주; 및 결합, 상피, 및 내피 조직을 포함한 조직이 사용될 수 있다.

폴리뉴클레오티드

본 개시내용의 측면은 부분적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드 분자"는 "핵산 분자"와 동의어이고, 뉴클레오티드, 예컨대 예를 들어 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 임의의 길이의 중합체 형태를 의미한다. 자연 발생 및 비-자연 발생 DNA 분자 및 자연 발생 및 비-자연 발생 RNA 분자를 비제한적으로 포함한, 본 명세서에 개시된 변형된 클로스트리디움 독소를 코딩할 수 있는 임의의 및 모든 폴리뉴클레오티드 분자가 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 자연 발생 및 비-자연 발생 DNA 분자의 비제한적 예는 단일 가닥 DNA 분자, 이중 가닥 DNA 분자, 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 벡터 구축물, 예컨대 예를 들어 플라스미드 구축물, 파지미드 구축물, 박테리오파지 구축물, 레트로바이러스 구축물 및 인공 염색체 구축물을 포함한다. 자연 발생 및 비-자연 발생 RNA 분자의 비제한적 예는 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA 및 mRNA를 포함한다.

한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 분자는 상기 언급된 클로스트리디움 독소, 그의 돌연변이체 또는 변이체, 그의 도메인 및/또는 서브-도메인, 그의 생물학적 활성 또는 면역원성 단편, 그의 다량체, 키메라 및 그의 융합 구축물, 그의 태그부착된 구축물, 그의 모방체 또는 그의 조작된 또는 합성 유도체의 다른 형태 중 하나 이상을 코딩한다. 특히, 폴리뉴클레오티드 분자는 DNA 분자이고, 특히, 폴리뉴클레오티드는 cDNA 분자이다. 또한, 상기 언급된 클로스트리디움 독소 (그의 돌연변이체, 변이체 또는 단편 포함) 중 1종 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 특히, 폴리뉴클레오티드는 BoNT/A (그의 상동체 포함)의 세포-결합 도메인, 예를 들어 BoNT/B, BoNT/C₁, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H, TeNT, BaNT 또는 BuNT의 세포-결합 도메인을 코딩하는 cDNA 분자이다. 특히 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 BoNT/A 또는 그의 돌연변이체 (그의 상동체 포함)의 세포-결합 도메인의 중쇄 N-말단 서브-도메인 (H_CN), 예를 들어 BoNT/B, BoNT/C₁, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H, BoNT/X, eBoNT/J, TeNT, BaNT 또는 BuNT의 H_CN 서브-도메인을 코딩하는 cDNA 분자이다.

본 개시내용은 또한 상기 언급된 클로스트리디움 독소 (그의 단편 포함) 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 핵산, 예를 들어 비-천연 핵산을 제공한다.

서열식별번호: 1, 19, 서열식별번호: 3-18에 제시된 클로스트리디움 독소 단편 서열, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30개 또는 그 초과의 아미노산 치환 (바람직하게는 보존된 또는 반-보존된 아미노산 치환)을 갖는 그의 변이체, 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 (그에 대한 상보적 가닥 포함), 또는 그의 RNA 등가물, 또는 그의 상보적 RNA 등가물이 본원에 포함된다.

또한, 서열식별번호: 1, 19, 서열식별번호: 3-18의 클로스트리디움 독소 단편 서열, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 4-10, 5-10, 또는 5 내지 15개의 아미노산 치환 (바람직하게는 보존된 또는 반-보존된 아미노산 치환)을 갖는 그의 변이체, 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 (그에 대한 상보적 가닥 포함), 또는 그의 RNA 등가물, 또는 그의 상보적 RNA 등가물이 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26 또는 서열식별번호: 27에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 BoNT/A 돌연변이체의 단편을 코딩한다.

본 개시내용은 추가로 클로스트리디움 독소 단편의 핵산 상동체, 예를 들어 H_C 도메인, 특히 H_CN 도메인 및 특히 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C₁, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H, BoNT/DC, BoNT/X, eBoNT/J, TeNT, BaNT, BuNT (그의 상기 언급된 하위유형 포함)로 이루어진 군으로부터 선택된 클로스트리디움 독소의 H_CN 도메인의 N-말단 절반을 코딩하는 단편에 관한 것이다. 실질적 상동성을 갖는 서열은 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 서열 또는 서열식별번호: 1, 19 또는 서열식별번호: 3-18 중 어느 하나를 코딩하는 핵산과 적어도 50%, 특히 적어도 65%, 특히 적어도 80% 동일성 또는 그 초과 % 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 서열 동일성은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들어 BLAST v2.1을 사용하여 계산될 수 있다. 또한, 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Gish et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang et al., Genome Res. 7:649-656, 1997]을 참조한다.

추가로 본원에 개시된 실시양태는 상기 개시된 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭을 수반하는 절차, 제한 효소 반응, 아가로스 겔 전기영동, 핵산 라이게이션, 박테리아 형질전환, 핵산 정제, 핵산 서열분석 및 재조합-기반 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본 명세서에 개시된 변형된 클로스트리디움 독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제조하는데 필요할 수 있는 널리-확립된 분자 생물학 기술은, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내에 있는 본원의 교시로부터 상용적인 절차이다. 변형된 클로스트리디움 독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제조하는데 필요한 구체적 프로토콜의 비제한적 예가, 예를 들어 문헌 [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004)]에 기재되어 있다. 추가적으로, 변형된 클로스트리디움 독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제조하는데 유용한 다양한 상업적으로 입수가능한 생성물이 폭넓게 이용가능하다. 이들 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내에 있는 본원의 교시로부터 상용적인 절차이다.

본 개시내용의 또 다른 측면은, 예를 들어 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 구축물을 세포 내로 도입하는 단계 및 발현 구축물을 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.

본 명세서에 개시된 방법은 부분적으로 본 명세서에 개시된 모든 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 따라서, 이러한 실시양태의 측면은, 비제한적으로, 자연 발생 클로스트리디움 독소, 자연 발생 클로스트리디움 독소 변이체, 예컨대 예를 들어 클로스트리디움 독소 이소형 및 클로스트리디움 독소 하위유형, 비-자연 발생 클로스트리디움 독소 변이체, 예컨대 예를 들어 보존적 또는 반-보존적 클로스트리디움 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체, 상기 언급된 독소 중 1종 이상을 포함하는 키메라 또는 융합 구축물, 클로스트리디움 독소의 적어도 1개의 도메인 (예를 들어, 중쇄의 결합 도메인) 또는 서브-도메인 (예를 들어 결합 도메인의 N-말단 절반)을 포함하는 클로스트리디움 독소 단편, 예를 들어 생물학적 활성 단편 또는 면역원성 단편, 이러한 클로스트리디움 독소 또는 단편 또는 변이체를 포함하는 키메라 또는 융합 구축물, 태그부착된 구축물, 조작된 구축물, 합성 구축물, 또는 그의 임의의 조합을 생산하는 것을 포함한다.

본 명세서에 개시된 방법은 부분적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 특히, 폴리뉴클레오티드 분자는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질을 포함한, 본원에 개시된 임의의 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩한다. 본 명세서에 개시된 임의의 및 모든 폴리뉴클레오티드 분자가 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 이러한 실시양태의 측면은 자연 발생 및 비-자연 발생 DNA 분자, 예컨대 단일 가닥 DNA 분자, 이중 가닥 DNA 분자, 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 벡터 구축물, 예컨대 예를 들어 플라스미드 구축물, 파지미드 구축물, 박테리오파지 구축물, 레트로바이러스 구축물 및 인공 염색체 구축물을 비제한적으로 포함한다. 자연 발생 및 비-자연 발생 RNA 분자의 비제한적 예는 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA 및 mRNA를 포함한다.

본 명세서에 개시된 방법은 부분적으로 발현 구축물을 포함한다. 발현 구축물은 세포 또는 무세포 추출물에서 폴리뉴클레오티드 분자를 발현시키는데 유용한 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 벡터, 예컨대 비제한적으로, 바이러스 발현 벡터; 원핵 발현 벡터; 진핵 발현 벡터, 예컨대 예를 들어 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 및 포유동물 발현 벡터; 및 무세포 추출물 발현 벡터가 사용될 수 있다. 추가로, 이들 방법의 측면을 실시하는데 유용한 발현 벡터는 구성적, 조직-특이적, 세포-특이적 또는 유도성 프로모터 요소, 인핸서 요소 또는 둘 다의 제어 하에 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 발현시키는 것을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 발현 벡터로부터 발현 구축물을 제조 및 사용하기 위한 널리 확립된 시약 및 조건과 함께 발현 벡터의 비제한적 예는 상업적 판매업체로부터 용이하게 입수가능하다. 적절한 발현 벡터의 선택, 제조 및 사용은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내에 있는 본원의 교시로부터의 상용적인 절차이다.

따라서, 이러한 실시양태의 측면은 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 바이러스 발현 벡터; 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 원핵 발현 벡터; 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 효모 발현 벡터; 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 곤충 발현 벡터; 및 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 포유동물 발현 벡터를 비제한적으로 포함한다. 이러한 실시양태의 다른 측면은 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 무세포 추출물 발현 벡터를 포함하는 무세포 추출물을 사용하여 본 명세서에 개시된 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 발현시키기에 적합한 발현 구축물을 비제한적으로 포함한다.

본 명세서에 개시된 방법은 부분적으로 세포를 포함한다. 임의의 및 모든 세포가 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 이러한 실시양태의 측면은 원핵 세포, 예컨대 비제한적으로 호기성, 미호기성, 호이산화탄소성, 통성, 혐기성, 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 세포, 예컨대, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 클로스트리디아 페르프린겐스(Clostridia perfringens), 클로스트리디아 디피실레(Clostridia difficile), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 네이세리아 메닌기룰스(Neisseria meningirulls), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로부터 유래된 것; 및 진핵 세포, 예컨대 비제한적으로 효모 균주, 예컨대, 예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 안구스타(Pichia angusta), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 유래된 것; 곤충으로부터 유래된 곤충 세포 및 세포주, 예컨대, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 및 만투카 섹타(Manduca Sexta)로부터 유래된 것; 자포동물문에 속하는 유기체 (예를 들어, 히드라, 말미잘, 해파리 또는 산호, 예를 들어 앱타시아 종(Aiptasia sp.)) 및/또는 자포동물문으로부터 유전자 형질전환된 유기체의 가시 세포 (구체적으로, 자포, 자세포 또는 자포세포) (미국 특허 번호 6,923,976 참조) 및 포유동물 세포 및 포유동물 세포로부터 유래된 세포주, 예컨대, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 소, 말, 영장류 및 인간으로부터 유래된 것의 균주를 비제한적으로 포함한다. 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (2004); 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(European Collection of Cell Cultures) (2204); 및 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (2004)로부터 얻을 수 있다. 적절한 세포주를 선택, 제조 및 사용하기 위한 구체적 프로토콜의 비제한적 예는, 예를 들어 문헌 [INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al., eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4^th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3^rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 상기 문헌, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2^nd ed. 2002); 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 상기 문헌, (2004)]에 기재되어 있다. 여기서 세포는 자포동물 세포이고, 이는 상용 전기천공 기술을 사용하거나 또는 이중 가닥 RNA를 사용하여 형질전환될 수 있다. 문헌 [Wittlieb et al., PNAS USA, 103(16):6208-11, 2006; Pankow et al., PLoS One, 2(9):e782, 2007; Khalturin et al., PLoS Biol., 6(11):e278, 2008]을 참조한다. 이들 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내에 있는 본원의 교시로부터 상용적인 절차이다.

본 명세서에 개시된 방법은 부분적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 분자는 상기 세포에 의해 일시적으로 또는 안정하게 유지될 수 있다. 안정하게 유지된 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외의 것이어서 자율적으로 복제될 수 있거나, 또는 세포의 염색체 물질 내로 통합되어 비-자율적으로 복제될 수 있다. 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자를 세포 내로 도입하기 위한 임의의 및 모든 방법이 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 핵산 분자를 세포 내로 도입하는데 유용한 방법은 화학-매개 형질감염, 예컨대, 예를 들어 인산칼슘-매개, 디에틸-아미노에틸 (DEAE) 덱스트란-매개, 지질-매개, 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개, 폴리리신-매개 및 폴리브렌-매개; 물리적-매개 형질감염, 예컨대, 예를 들어 바이오리스틱 입자 전달, 미세주사, 원형질체 융합 및 전기천공; 및 바이러스-매개 형질감염, 예컨대, 예를 들어 레트로바이러스-매개 형질감염을 비제한적으로 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3^rd ed. 2001)] 참조). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 발현 구축물을 세포 내로 도입하는 구체적 방법의 선택이 부분적으로는 세포가 발현 구축물을 일시적으로 함유할 것인지 또는 세포가 발현 구축물을 안정하게 함유할 것인지 여부에 따라 결정될 것이라는 것을 이해한다. 이들 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내에 있는 본원의 교시로부터 상용적인 절차이다.

이러한 실시양태의 한 측면에서, 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 세포 내로 도입하기 위해 형질감염으로 지칭되는 화학적-매개 방법이 사용된다. 화학적-매개 형질감염 방법에서, 화학 시약은 그의 세포 내로의 흡수를 용이하게 하는 핵산과 복합체를 형성한다. 이러한 화학 시약은 인산칼슘-매개 (예를 들어, 문헌 [Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of Adherent and Suspended Cells by Calcium Phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004)] 참조); 디에틸-아미노에틸 (DEAE) 덱스트란-매개, 지질-매개, 양이온성 중합체-매개, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개 및 폴리리신-매개 및 폴리브렌-매개 (예를 들어, 문헌 [Chun Zhang et al., Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery to Brain-Derived Cells, 33(2) Methods 144-150 (2004)] 참조)를 비제한적으로 포함한다. 이러한 화학적-매개 전달 시스템은 표준 방법에 의해 제조될 수 있고, 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 셀펙트(CELLPHECT) 형질감염 키트 (아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이); 포유동물 형질감염 키트, 인산칼슘 및 DEAE 덱스트란 (스트라타진, 인크.(Stratagene, Inc.)); 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)™ 형질감염 시약 (인비트로젠, 인크.(Invitrogen, Inc.), 캘리포니아주 칼스배드); 엑스젠(EXGEN) 500 형질감염 키트 (퍼멘타스, 인크.(Fermentas, Inc.), 미국 메릴랜드주 하노버), 및 슈퍼펙트(SUPERFECT) 및 에펙틴(EFFECTINE) 형질감염 키트 (퀴아젠, 인크.(Qiagen, Inc.), 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 참조한다.

이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 세포 내로 도입하기 위해 물리적-매개 방법이 사용된다. 물리적 기술은 전기천공, 바이오리스틱 및 미세주사를 비제한적으로 포함한다. 바이오리스틱 및 미세주사 기술은 핵산 분자를 세포 내로 도입하기 위해 세포 벽을 천공한다 (예를 들어, 문헌 [Biewenga et al., J. Neurosci. Methods, 71(1), 67-75 (1997); 및 O'Brien et al., Methods 33(2), 121-125 (2004)] 참조). 전기투과화로도 지칭되는 전기천공은, 핵산 분자가 진입하여 모든 세포 유형의 안정하고 일시적인 형질감염에 효과적으로 사용될 수 있는, 막 내의 일시적 세공을 생성하기 위해 짧은 고-전압 전기 펄스를 사용한다 (예를 들어, 문헌 [M. Golzio et al., 33(2) Methods 126-135 (2004); 및 Gresch et al., 33(2) Methods 151-163 (2004)] 참조).

이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 세포 내로 도입하는기 위해 형질도입으로 지칭되는 바이러스-매개 방법이 사용된다. 일시적 형질도입의 바이러스-매개 방법에서, 바이러스 입자가 숙주 세포에 감염되어 복제되는 과정은 이러한 메카니즘을 사용하여 핵산 분자를 세포 내로 도입하기 위해 조작된다. 바이러스-매개 방법은 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 단순 포진 바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스 및 바큘로바이러스를 비제한적으로 포함한 매우 다양한 바이러스로부터 개발되었다 (예를 들어 문헌 [Blesch et al., 33(2) Methods 164-172 (2004); 및 Federico et al., 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); Poeschla et al., 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Benihoud et al., 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); Bueler et al., 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Lai et al., 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Burton et al., 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Grandi et al., 33(2) Methods 179-186 (2004); Frolov et al., 93(21) PNAS USA 11371-11377 (1996); Ehrengruber et al., 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Kost et al., 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); 및 Huser et al., 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003)] 참조).

비-외피보유 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스는, 아데노바이러스가 약 36 kb의 비교적 큰 폴리뉴클레오티드 분자를 취급하고, 높은 역가에서 생산되고, 매우 다양한 분열 및 비-분열 세포 둘 다를 효율적으로 감염시킬 수 있기 때문에 포유동물 세포 형질도입을 위해 종종 선택된다 (예를 들어, 문헌 [Hermens et al., 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); 및 Mizuguchi et al., 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001)] 참조). 아데노바이러스-기반 시스템을 사용하는 형질도입은, 핵산 분자가 숙주 세포 염색체 내로 통합되기 보다는 세포 핵 내의 에피솜으로부터 운반되기 때문에 연장된 단백질 발현을 지지하지 않는다. 아데노바이러스 벡터 시스템 및 이러한 벡터를 사용하는 방법에 대한 구체적 프로토콜은, 예를 들어 바이라파워(VIRAPOWER)™ 아데노바이러스 발현 시스템 (인비트로젠, 인크., 미국 캘리포니아주 칼스배드) 및 바이라파워™ 아데노바이러스 발현 시스템 지시 매뉴얼 25-0543 버전 A (인비트로젠, 인크.) 및 아드이지(ADEASY)™ 아데노바이러스 벡터 시스템 (스트라타진, 인크., 미국 캘리포니아주 라호야) 및 아드이지™ 아데노바이러스 벡터 시스템 지시 매뉴얼 (스트라타진, 인크.)에 개시되어 있다.

폴리뉴클레오티드 분자 전달은 또한 단일 가닥 RNA 레트로바이러스, 예컨대, 예를 들어 온코레트로바이러스 및 렌티바이러스를 사용할 수 있다. 레트로바이러스-매개 형질도입은 종종 100%에 가까운 형질도입 효율을 생성하고, 감염 다중도 (MOI)를 변화시킴으로써 프로바이러스 카피수를 용이하게 제어할 수 있으며, 세포를 일시적으로 또는 안정하게 형질도입시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tonini et al., 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Blesch et al., 33(2) Methods 164-172 (2004); Recillas-Targa et al., 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); 및 Wolkowicz et al., 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004)] 참조). 레트로바이러스 입자는 지질 외피로 둘러싸인 단백질 캡시드 내에 패키징된 RNA 게놈으로 이루어진다. 레트로바이러스는 그의 RNA를 리버스 트랜스크립타제와 함께 세포질 내로 주입함으로써 숙주 세포를 감염시킨다. 이어서 RNA 주형은 선형 이중 가닥 cDNA으로 역전사되고, 이는 숙주 세포 게놈 내로 통합되어 그 자체를 복제한다. 바이러스 입자는 수직적으로 (프로바이러스를 통해 모 세포에서 딸 세포로), 뿐만 아니라 수평적으로 (비리온을 통해 세포에서 세포로) 둘 다로 확산된다. 이러한 복제 전략은 관심 핵산 분자가 숙주 세포의 염색체 내로 안정하게 통합되어 단백질의 장기간 발현을 가능하게 하기 때문에 장기간 지속 발현을 가능하게 한다. 예를 들어, 동물 연구는 다양한 조직 내로 주사된 렌티바이러스 벡터가 1년 초과 동안 지속적인 단백질 발현을 일으킨다는 것을 보여주었다 (예를 들어, 문헌 [Naldini et al., 272(5259) Science 263-267 (1996)] 참조). 온코레트로바이러스-유래 벡터 시스템, 예컨대, 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV)는 폭넓게 사용되고, 많은 상이한 비-분열 세포를 감염시킨다. 렌티바이러스는 또한 분열 및 비-분열 세포를 포함한 많은 상이한 세포 유형을 감염시킬 수 있고, 고도로 특이적인 세포 표적화를 가능하게 하는 복합 외피 단백질을 보유한다.

레트로바이러스 벡터 및 이러한 벡터를 사용하는 방법에 대한 구체적 프로토콜은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,464,758; 미국 특허 번호 5,814,618; 미국 특허 번호 5,514,578; 미국 특허 번호 5,364,791; 미국 특허 번호 5,874,534; 및 미국 특허 번호 5,935,934에 개시되어 있다. 추가로, 이러한 바이러스 전달 시스템은 표준 방법에 의해 제조될 수 있고, 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 BD™ TET-OFF 및 TET-ON 유전자 발현 시스템 (비디 바이오사이언시스(BD Bioscience)-클론테크(Clonetech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토) 및 BD™ TET-OFF 및 TET-ON 유전자 발현 시스템 사용자 매뉴얼 (비디 바이오사이언시스), 진스위치(GENESWITCH)™ 시스템 (인비트로젠, 인크., 미국 캘리포니아주 칼스배드) 및 진스위치™ 시스템인 포유동물 세포용 미페프리스톤-조절 발현 시스템 버전 D, 25-0313 (인비트로젠, 인크., (Nov. 4, 2002); 바이라파워™ 렌티바이러스 발현 시스템 (인비트로젠, 인크., 미국 캘리포니아주 칼스배드) 및 바이라파워™ 렌티바이러스 발현 시스템 지시 매뉴얼 (인비트로젠, 인크.); 및 컴플리트 컨트롤(COMPLETE CONTROL)® 레트로바이러스 유도성 포유동물 발현 시스템 (스트라타진, 미국 캘리포니아주 라호야) 및 컴플리트 컨트롤® 레트로바이러스 유도성 포유동물 발현 시스템 지시 매뉴얼을 참조한다.

본 명세서에 개시된 방법은 부분적으로 폴리뉴클레오티드 분자로부터 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 발현시키는 것을 포함한다. 세포-기반 시스템 및 무세포 발현 시스템을 비제한적으로 포함한 임의의 다양한 발현 시스템이 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 발현시키는데 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 세포-기반 시스템은 바이러스 발현 시스템, 원핵 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 바큘로바이러스 발현 시스템, 곤충 발현 시스템 및 포유동물 발현 시스템을 비제한적으로 포함한다. 무세포 시스템은 밀 배아 추출물, 토끼 망상적혈구 추출물 및 이. 콜라이 추출물을 비제한적으로 포함하고, 일반적으로 본원에 개시된 방법과 동등하다. 발현 시스템을 사용하는 폴리뉴클레오티드 분자의 발현은 유도성 발현, 비-유도성 발현, 구성적 발현, 바이러스-매개 발현, 안정하게 통합된 발현 및 일시적 발현을 비제한적으로 포함한 임의의 다양한 특징을 포함할 수 있다. 잘 특징화되어 있는 벡터, 시약, 조건 및 세포를 포함하는 발현 시스템은 널리 확립되어 있고, 텍사스주 오스틴 소재 암비온, 인크.(Ambion, Inc.); 캘리포니아주 팔로 알토 소재 비디 바이오사이언시스-클론테크; 캘리포니아주 샌디에고 소재 비디 바이오사이언시스 파밍겐(Pharmingen); 캘리포니아주 칼스배드 소재 인비트로젠, 인크.; 캘리포니아주 발렌시아 소재 퀴아젠, 인크.; 인디애나주 인디애나폴리스 소재 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science); 및 캘리포니아주 라호야 소재 스트라타진을 비제한적으로 포함하는 상업적 판매업체로부터 용이하게 입수가능하다. 적절한 이종 발현 시스템의 선택 및 사용에 대한 비제한적 예는, 예를 들어 문헌 [PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); 및 Rai et al., 80(9) Curr. Sci. 1121-1128, (2001)]에 기재되어 있다. 이들 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내에 있는 본원의 교시로부터 상용적인 절차이다.

다양한 세포-기반 발현 절차가 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 코딩되는 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 발현시키는데 유용하다. 예는 바이러스 발현 시스템, 원핵 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 바큘로바이러스 발현 시스템, 곤충 발현 시스템 및 포유동물 발현 시스템을 비제한적으로 포함한다. 바이러스 발현 시스템은 바이라파워™ 렌티바이러스 (인비트로젠, 인크.) 아데노바이러스 발현 시스템 (인비트로젠, 인크.), 아드이지™ XL 아데노바이러스 벡터 시스템 (스트라타진) 및 바이라포트® 레트로바이러스 유전자 발현 시스템 (스트라타진)을 비제한적으로 포함한다. 원핵세포 발현 시스템의 비제한적 예는 챔피온(CHAMPION)™ pET 발현 시스템 (이엠디 바이오사이언시스(EMD Biosciences)-노바젠(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨), 트리엑스(TRIEX)™ 박테리아 발현 시스템 (이엠디 바이오사이언시스-노바젠, 미국 위스콘신주 매디슨), 퀴아익스프레스(QIAEXPRESS)® 발현 시스템 (퀴아젠, 인크.), 및 아피니티(AFFINITY)® 단백질 발현 및 정제 시스템 (스트라타진)을 포함한다. 효모 발현 시스템은 이지셀렉트(EASYSELECT)™ 피키아 발현 키트 (인비트로젠, 인크.), 예스-에코(YES-ECHO)™ 발현 벡터 키트 (인비트로젠, 인크.), 및 스펙트라(SPECTRA)™ 에스. 폼베 발현 시스템 (인비트로젠, 인크., 캘리포니아주 칼스배드)을 비제한적으로 포함한다. 바큘로바이러스 발현 시스템의 비제한적 예는 바큘로다이렉트(BACULODIRECT)™ (인비트로젠, 인크.), 박-투-박(BAC-TO-BAC)® (인비트로젠, 인크.), 및 비디 바큘로골드(BD BACULOGOLD)™ (비디 바이오사이언시스-파밍겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 포함한다. 곤충 발현 시스템은 드로소필라 발현 시스템 (DES®) (인비트로젠, 인크., 캘리포니아주 칼스배드), 인섹트셀렉트(INSECTSELECT)™ 시스템 (인비트로젠, 인크.), 및 인섹트다이렉트(INSECTDIRECT)™ 시스템 (이엠디 바이오사이언시스-노바젠)을 비제한적으로 포함한다. 포유동물 발현 시스템의 비제한적 예는 T-REX™ (테트라시클린-조절 발현) 시스템 (인비트로젠, 인크.), FLP-IN™ T-REx™ 시스템 (인비트로젠, 인크.), PCDNA™ 시스템 (인비트로젠, 인크.), pSecTag2시스템 (인비트로젠, 인크.), 익스체인저(EXCHANGER)® 시스템, 인터플레이(INTERPLAY)™ 포유동물 TAP 시스템 (스트라타진), 컴플리트 컨트롤® 유도성 포유동물 발현 시스템 (스트라타진) 및 락스위치(LACSWITCH)® II 유도성 포유동물 발현 시스템 (스트라타진)을 포함한다.

본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 코딩되는 변형된 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 발현시키는 또 다른 절차는 무세포 발현 시스템, 예컨대 비제한적으로 원핵 추출물 및 진핵 추출물을 사용한다. 원핵 세포 추출물의 비제한적 예는 RTS 100 이. 콜라이 HY 키트 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스), 액티브프로(ACTIVEPRO) 시험관내 번역 키트 (암비온, 인크., 미국 텍사스주 오스틴), 에코프로(ECOPRO)™ 시스템 (이엠디 바이오사이언시스) 및 익스프레스웨이(EXPRESSWAY)™ 플러스 발현 시스템 (인비트로젠, 인크.)을 포함한다. 진핵 세포 추출물은 RTS 100 밀 배아 CECF 키트 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스), TNT® 커플링된 밀 배아 추출물 시스템 (프로메가 코포레이션(Promega Corp.)), 밀 배아 IVT™ 키트 (암비온, 인크.), 레트산 용해물 IVT™ 키트 (암비온, 인크.), 프로테인스크립트(PROTEINSCRIPT)® II 시스템 (암비온, 인크.) 및 TNT® 커플링된 망상적혈구 용해물 시스템 (프로메가 코포레이션)을 비제한적으로 포함한다.

코돈 최적화된 서열

상기 언급된 핵산 서열 및 벡터의 코돈-최적화된 서열이 본원에 포함된다. 숙주 세포, 예를 들어 박테리아, 예컨대 이. 콜라이 또는 곤충 Hi5 세포에서의 발현을 위한 코돈 최적화는 미국 아이오와주 코랄빌 소재 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.)로부터 무료로 입수가능한 코돈 최적화 도구 (CODONOPT)를 사용하여 수행할 수 있다.

조성물

본 개시내용의 실시양태는 추가로 1종 이상의 클로스트리디움 독소 (그의 단편 또는 변이체 포함) 및 담체를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 추가 실시양태는 핵산, 코돈-최적화된 핵산, 벡터 및 생산 시스템, 예를 들어 1종 이상의 클로스트리디움 독소 (그의 단편 또는 변이체 포함)를 코딩하는 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 개시내용의 실시양태는 1종 이상의 클로스트리디움 독소 (그의 단편 또는 변이체 포함)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 제약상 허용되는 제약 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 개체에게 투여되는 경우에 유해한, 알레르기성 또는 다른 부적절하거나 원치않는 반응을 일으키지 않는 임의의 분자 물질 또는 조성물을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 조성물"은 "제약 조성물"과 동의어이고, 치료상 유효한 농도의 활성 성분, 예컨대, 예를 들어 본 명세서에 개시된 임의의 클로스트리디움 독소, 단편, 변이체 또는 키메라를 지칭한다. 클로스트리디움 독소 또는 클로스트리디움 독소 단편 또는 그의 변이체를 포함하는 제약 조성물은 의학적 및 수의학적 적용에 유용하다. 제약 조성물은 환자에게 단독으로 또는 다른 보충 활성 성분, 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합되어 투여될 수 있다. 제약 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 연화, 유화, 캡슐화, 포획 및 동결건조를 비제한적으로 포함한 임의의 다양한 공정을 사용하여 제조될 수 있다. 제약 조성물은 멸균 용액, 현탁액, 에멀젼, 동결건조물, 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 분말, 시럽, 엘릭시르 또는 투여에 적합한 임의의 다른 투여 형태를 비제한적으로 포함한 임의의 다양한 형태를 취할 수 있다.

본 명세서에 개시된 클로스트리디움 독소 또는 클로스트리디움 독소 단편 또는 변이체를 포함하는 제약 조성물은 활성 성분의 제약상 허용되는 조성물로의 가공을 용이하게 하는 제약상 허용되는 담체를 임의로 포함할 수 있는 것으로 또한 고려된다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 투여시 장기간 또는 영구적 유해 효과를 실질적으로 갖지 않는 임의의 담체를 지칭하고, "제약상 허용되는 비히클, 안정화제, 희석제, 첨가제, 보조제 또는 부형제"와 같은 용어를 포괄한다. 이러한 담체는 일반적으로 활성 화합물과 혼합되거나 또는 활성 화합물을 희석 또는 봉입하도록 허용되고, 고체, 반-고체 또는 액체 작용제일 수 있다. 활성 성분은 가용성일 수 있거나 또는 목적하는 담체 또는 희석제 중 현탁액으로서 전달될 수 있는 것으로 이해된다. 수성 매질, 예컨대, 예를 들어 물, 염수, 글리신, 히알루론산 등; 고체 담체, 예컨대, 예를 들어 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등; 용매; 분산 매질; 코팅; 항박테리아제 및 항진균제; 등장화제 및 흡수 지연제; 또는 임의의 다른 불활성 성분을 비제한적으로 포함한, 임의의 다양한 제약상 허용되는 담체가 사용될 수 있다. 약리학상 허용되는 담체의 선택은 투여 방식에 좌우될 수 있다. 임의의 약리학상 허용되는 담체가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 제약상 허용되는 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 이러한 제약 담체의 구체적 용도의 비제한적 예는 문헌 [PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001); 및 HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003)]에서 찾아볼 수 있다. 이들 프로토콜은 상용적인 절차이며, 임의의 변형은 본원의 교시로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내에 있다.

본 명세서에 개시된 제약 조성물은 임의로, 완충제, 보존제, 장성 조정제, 염, 항산화제, 오스몰랄농도 조정제, 생리학적 물질, 약리학적 물질, 벌킹제, 유화제, 습윤제, 감미제 또는 향미제 등을 비제한적으로 포함한 다른 제약상 허용되는 성분 (또는 제약 성분)을 비제한적으로 포함할 수 있는 것으로 추가로 고려된다. pH를 조정하는 것으로 지칭되는 다양한 완충제가 본 명세서에 개시된 제약 조성물을 제조하는데 사용될 수 있으며, 단 생성된 제제는 제약상 허용된다. 이러한 완충제는 아세테이트 완충제, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 및 보레이트 완충제를 비제한적으로 포함한다. 필요에 따라 조성물의 pH를 조정하기 위해 산 또는 염기가 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 제약상 허용되는 항산화제는 메타중아황산나트륨, 티오황산나트륨, 아세틸시스테인, 부틸화 히드록시아니솔 및 부틸화 히드록시톨루엔을 비제한적으로 포함한다. 유용한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살, 아세트산페닐제2수은, 질산페닐제2수은, 안정화된 옥시 클로로 조성물, 예컨대, 예를 들어 퓨라이트(PURITE)® 및 킬레이트화제, 예컨대, 예를 들어 DTPA 또는 DTPA-비스아미드, 칼슘 DTPA, 및 CaNaDTPA-비스아미드를 비제한적으로 포함한다. 제약 조성물에 유용한 장성 조정제는 염, 예컨대, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨 또는 글리세린 및 다른 제약상 허용되는 장성 조정제를 비제한적으로 포함한다. 제약 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 상이한 산을 사용하여 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 또는 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다. 이들 및 약리학 분야에 공지된 다른 물질이 본 명세서에 유용한 제약 조성물에 포함될 수 있는 것으로 이해된다.

한 실시양태에서, 조성물은 클로스트리디움 독소 또는 클로스트리디움 독소 단편 또는 변이체 및 점성 담체를 포함한다. "점성 담체"는 보툴리눔 신경독소와 함께 제제화되는 경우에 제제의 생체내 국부 주사시 국부 주사의 부위로부터 떨어져 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체가 확산되는 정도 및/또는 국부 주사의 부위로부터 확산되는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 양이 유의하게 감소되도록 하는 양으로 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체가 방출되는 데포를 제공하는 생체적합성 화합물을 의미한다. 임의의 적합한 점성 담체, 예를 들어 안과용으로 허용되는 점성 담체가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 점성 담체는 약물 전달 시스템에 목적하는 점도를 제공하는데 효과적인 양으로 존재한다. 유리하게는, 점성 담체는 약물 전달 시스템의 약 0.5 중량% 내지 약 95 중량% 범위의 양으로 존재한다. 사용되는 점성 담체의 구체적 양은, 예를 들어 비제한적으로, 사용되는 구체적 점성 담체, 사용되는 점성 담체의 분자량, 제조 및/또는 사용될 본 약물 전달 시스템에 대해 요구되는 점도 및 기타 인자를 포함한 다수의 인자에 좌우된다.

유용한 점성 담체의 예는 히알루론산, 카르보머, 폴리아크릴산, 셀룰로스 유도체, 폴리카르보필, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 덱스트린, 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 아세테이트, 헤파린, 프로테오글리칸 (HSPG), 헤파린 술페이트 (HS), 그의 유도체 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 점성 담체의 대표적인 유형은 미국 특허 번호 9,044,477; 미국 특허 번호 9,622,957; 미국 특허 번호 9,050,336에 개시되어 있다.

피부 필러가 또한 점성 담체로서 사용될 수 있다. 상기 목적에 적합한 피부 필러는 콜라겐 (멸균 콜라겐은 상표명 자이덤(ZYDERM), 자이플라스트(ZYPLAST), 코스모덤(COSMODERM), 코스모플라스트(COSMOPLAST) 및 오톨젠(AUTOLGEN) 하에 판매됨), 힐라폼(HYLAFORM)® (히알루론산), 레스틸란(RESTYLANE)® (히알루론산), 스컬프트라(SCULPTRA)™ (폴리락트산), 래디어스(RADIESSE)™ (칼슘 히드록실 아파타이트) 및 쥬비덤(JUVEDERM)™을 포함한다. 앨러간, 인크.(Allergan, Inc.) (미국 캘리포니아주 어바인)로부터 입수가능한 쥬비덤™은 생리학적 완충제 중 24 mg/ml의 농도로 제제화된 가교된 히알루론산으로 이루어진 멸균, 생분해성, 비-발열성, 점탄성, 투명, 무색, 균질화된 겔을 포함한다. 대표적인 유형의 피부 필러는 미국 특허 번호 9,622,957; 미국 특허 번호 9,161,970; 미국 특허 번호 9,050,336에 개시되어 있다.

현재 유용한 점성 담체의 분자량은 약 10,000 달톤 또는 그 미만 내지 약 2백만 달톤 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 하나의 특히 유용한 실시양태에서, 점성 담체의 분자량은 약 100,000 달톤 또는 약 200,000 달톤 내지 약 1백만 달톤 또는 약 1.5백만 달톤의 범위이다. 다시, 본 개시내용에 따라 유용한 점성 담체의 분자량은 사용되는 점성 담체의 유형 및 해당 본 약물 전달 시스템의 목적하는 최종 점도, 뿐만 아니라 가능하게는 다른 인자에 기초하여 상당한 범위에 걸쳐 달라질 수 있다.

하나의 매우 유용한 실시양태에서, 담체는 중합체 히알루로네이트 성분, 예를 들어 금속 히알루로네이트 성분, 바람직하게는 알칼리 금속 히알루로네이트, 알칼리 토금속 히알루로네이트 및 그의 혼합물로부터 선택된 것, 및 보다 더 바람직하게는 히알루론산나트륨 및 그의 혼합물로부터 선택된 것이다. 이러한 히알루로네이트 성분의 분자량은 바람직하게는 약 50,000 달톤 또는 약 100,000 달톤 내지 약 1.3백만 달톤 또는 약 2백만 달톤의 범위이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 약 0.05% 내지 약 0.5% (w/v) 범위의 양의 중합체 히알루로네이트 성분을 포함한다. 추가의 유용한 실시양태에서, 히알루로네이트 성분은 조성물의 약 1% 내지 약 4% (w/v) 범위의 양으로 존재한다. 이러한 후자의 경우에, 매우 높은 중합체 점도는 약물 전달 시스템의 추정된 보관 수명, 예를 들어 적어도 약 2년에 걸쳐 종종 재현탁 가공이 필요하지 않은 정도로 입자 침강 속도를 느리게 하는 겔을 형성한다. 이러한 약물 전달 시스템은, 겔이 벌크 용기로부터 바늘 및 시린지에 의해 용이하게 제거될 수 없기 때문에, 사전-충전된 시린지로 시판될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 담체는 열-가역적 겔화제, 예컨대, 예를 들어 폴록사머-407이며, 이는 미국 특허 번호 9,107,815에 기재되어 있다. 열-가역적 겔을 포함하는 이러한 조성물은 (주사에 의해) 저점도 액체로서 투여될 수 있고, 이는 주사 후에 점도가 급속하게 증가한다. 생성된 고점도 매트릭스는 접착성, 생분해성 및 생체적합성이고, 투여 시에 보툴리눔 독소가 방출될 수 있는 데포를 형성하여, 지속 또는 연장 방출 약물 전달 시스템을 제공한다. 이러한 방식으로, 보다 낮은 용량의 보툴리눔 독소가 사용될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 사전-혼합되거나 또는 이중 챔버 시린지의 사용에 의해서와 같이 투여 시에 조합되는 단순한 재구성 비히클 또는 그의 여러 구획으로서 투여될 수 있다. 대표적인 유형의 열-가역적 겔화제는, 예를 들어 미국 특허 번호 8,168,206; 미국 특허 번호 8,642,047; 및 미국 특허 번호 9,278,140에 개시되어 있다.

일부 실시양태에서, 관절 내 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 체류 시간을 증가시키기 위해, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 캡슐화하는 중합체성 매트릭스를 포함하는 제어 방출 시스템에 제공되며, 여기서 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 분획 양은 제어된 방식으로 장기간에 걸쳐 중합체성 매트릭스로부터 방출된다. 제어 방출 신경독소 시스템은, 예를 들어 미국 특허 번호 6,585,993; 미국 특허 번호 6,585,993; 미국 특허 번호 6,306,423; 및 미국 특허 번호 6,312,708에 개시되어 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 국소 조성물에 관한 것이다. 대표적인 예는, 예를 들어 상업적으로 실행가능한 이온성 나노입자 기술 INPART® (트랜스더말 코포레이션(Transdermal Corp.), 미국 미시간주 버밍햄)를 통해 전달되는 BoNT/A 단편, 예를 들어 클로스트리디움 독소 또는 그의 변이체의 전장 중쇄 (H_C) 또는 그의 N-말단 도메인 (H_CN)을 포함하는 국소 크림을 포함한다. 미국 특허 번호 7,838,011; 미국 특허 번호 7,727,537; 미국 특허 번호 8,568,740을 참조한다.

국소 투여를 위한 제약 화합물 및 제제는 연고, 로션 (예를 들어, 피부 관리 로션), 크림, 겔, 점적제, 좌제, 분무제, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 제약 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 사용될 수 있다. 바람직한 국소 투여 제제는 본 발명의 화합물이 국소 전달 작용제, 예컨대 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면활성제와의 혼합물로 존재하는 것을 포함한다. 바람직한 지질 및 리포솜은 중성 (예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성 (예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성 (예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 본 개시내용의 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 리포솜 내에 캡슐화될 수 있거나 또는 그에 대한, 특히 양이온성 리포솜에 대한 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 화합물은 지질에, 특히 양이온성 지질에 복합체화될 수 있다. 바람직한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린 또는 C₁-₁₀ 알킬 에스테르 (예를 들어, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 국소 제제는 미국 특허 번호 6,747,014에 상세히 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 경피 조성물, 보다 구체적으로는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 피부 또는 상피를 통한 수송 또는 전달 (또한 "경피 전달"로 지칭됨)을 가능하게 하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 다양한 치료적, 미적 및/또는 미용적 목적을 위해 대상체에게 보툴리눔 독소를 제공하기 위한 국소 적용으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 국소 전달을 위한 조성물은 독소가 근육 및/또는 다른 피부-연관 구조에 경피로 투여되도록 하는 효율적인 기를 갖는 양으로 하전된 담체 분자를 포함할 수 있다. 수송은 보툴리눔 독소의 공유 변형 없이 일어난다. 예시적인 조성물 및 전달 시스템은 레반스 테라퓨틱스(Revance Therapeutics)에 의해 개발된 패치로 제공된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,568,740; 미국 특허 번호 8,518,414; 미국 특허 번호 9,180,081; 미국 특허 번호 8,404,249; 미국 특허 번호 8,962,548; 미국 특허 번호 9,211,248; 미국 특허 번호 8,398,997; 미국 특허 번호 8,974,774; 미국 특허 번호 8,926,991; 및 미국 특허 번호 8,092,788). 또한, 미국 특허 번호 8,404,249; 미국 특허 번호 9,144,692; 및 미국 특허 번호 7,704,524를 참조한다. 한 실시양태에서, 경피 전달 시스템은 패치이다. 경피 패치는 일반적으로 사람의 피부에 적용될 접착성 층, 제약 작용제를 보유하기 위한 데포 또는 저장소, 및 데포로부터 제약의 누출을 방지하는 외부 표면을 갖는 것을 특징으로 한다. 패치의 외부 표면은 전형적으로 비-접착성이다. 본 개시내용에 따라, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 신경독소가 연장된 기간 동안 안정하게 유지되도록 패치 내로 혼입된다. 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 안정화시키는 중합체 매트릭스 내로 혼입될 수 있고, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체가 매트릭스 및 패치로부터 확산되도록 허용한다. 본 개시내용의 한 실시양태에서, 독소 및 증진제를 함유하는 조성물은 접착성 패치로 제공된다. 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 또한, 패치가 피부에 적용되면 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체가 피부를 통해 확산될 수 있도록 패치의 접착성 층 내로 혼입될 수 있다. 단백질 전달을 위한 접착성 패치의 예는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 296,006 (의장 특허); 미국 특허 번호 6,010,715; 미국 특허 번호 5,591,767; 미국 특허 번호 5,008,110; 미국 특허 번호 5,683,712; 미국 특허 번호 5,948,433; 및 미국 특허 번호 5,965,154를 참조한다. 일부 실시양태에서, 패치는 지질 소포를 포함할 수 있다 (미국 특허 번호 6,165,500 참조). 일부 실시양태에서, 패치는 본 개시내용의 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 자포동물문 (예를 들어, 앱타시아 종)에 속하는 유기체의 쐐기 세포 (구체적으로, 자포, 자세포 또는 자포세포)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 패치는 본 개시내용의 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 특수 세포, 예를 들어 쐐기 세포에서 발현시키는 트랜스제닉 자포동물문 유기체를 포함할 수 있다.

키트

본 개시내용의 또 다른 측면은 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 또는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체에 결합하는 항체를 포함한 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체, 및 지침서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 면역원성 조성물의 일부이다. 또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 접합체 (예를 들어, 태그부착된 단백질)의 일부이다. 본원에 사용된 "지침서"는 대상체에서 장애를 진단, 영상화, 치료, 호전, 완화, 억제, 예방 또는 감소시키는 것 또는 본원에 기재된 경로를 통해 상기 조성물을 투여하는 것에 대한 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 유용성을 전달하는데 사용되는 간행물, 기록물, 다이어그램 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 또한, 지침서는, 예를 들어 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 적절한 용량을 기재할 수 있다. 본 개시내용의 키트의 지침서는, 예를 들어 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 함유하는 용기에 고정되거나, 또는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 함유하는 용기와 함께 운송될 수 있다. 대안적으로, 지침서는 지침서 및 변형된 BoNT/A 폴리펩티드가 수용자에 의해 협력적으로 사용되게 하기 위한 의도로 용기와 별도로 운송될 수 있다.

본 개시내용은 또한 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체 및 대상체에게 폴리펩티드를 전달하기 위한 전달 장치를 포함하는 키트를 포함한다. 예로서, 전달 장치는 압착가능한 분무 병, 계량-용량 분무 병, 에어로졸 분무 장치, 아토마이저, 건조 분말 전달 장치, 자기-추진 용매/분말 분배 장치, 시린지, 바늘, 탐폰 또는 투여량 측정 용기일 수 있다. 키트는 본원에 기재된 바와 같은 지침서를 추가로 포함할 수 있다.

전형적으로, 용기는 1종 이상의 제제, 및 재구성 및/또는 사용에 대한 지시를 표시할 수 있는, 용기 상의 라벨 또는 용기와 회합된 라벨을 보유할 수 있다. 예를 들어, 라벨은 제제가 상기 기재된 바와 같은 농도로 재구성된다는 것을 표시할 수 있다. 라벨은 추가로 제제가, 예를 들어 피부 투여에 유용하거나 또는 피부 투여를 위해 의도된 것임을 표시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 함유하는 안정한 제제의 단일 용량을 함유할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 안정한 제제의 단일 용량은 약 0.5 ml 미만 또는 그 보다 적은 부피로 존재한다. 대안적으로, 제제를 보유하는 용기는 제제의 반복 투여 (예를 들어, 2-6회 투여)를 가능하게 하는 다중-사용 바이알일 수 있다. 키트 또는 다른 제조 물품은 적합한 희석제 (예를 들어, BWFI, 염수, 완충 염수)를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 희석제와 제제의 혼합 시에, 재구성된 제제 중 최종 폴리펩티드 농도는 일반적으로 적어도 1 pg/ml (예를 들어, 적어도 5 pg/ml, 적어도 10 pg/ml, 적어도 20 pg/ml, 적어도 50 pg/ml, 적어도 100 pg/ml, 적어도 300 pg/ml, 적어도 500 pg/ml, 적어도 1 ng/ml, 적어도 3 ng/ml, 적어도 10 ng/ml, 0.1 μg/ml, 0.3 μg/ml, 1 μg/ml, 3 μg/ml, 10 μg/ml, 30 μg/ml, 100 μg/ml, 또는 그 초과)일 것이다. 키트 또는 다른 제조 물품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용에 대한 지침서가 있는 포장 삽입물을 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트 또는 다른 제조 물품은 투여에 대한 지침서를 포함할 수 있다.

장치 및 시스템

본 개시내용의 실시양태는 추가로 클로스트리디움 독소 (그의 단편 또는 변이체 포함)를 포함하는 장치 및/또는 시스템에 관한 것이다. 전달 시스템의 대표적인 예는, 예를 들어 파상풍 및 보툴리눔 항독소를 포함한 다양한 단백질 약물의 캡슐화 및 제어된 전달을 위한 폴리에테르에스테르 공중합체 마이크로스피어 (미국 특허 번호 5,980,948 참조); 보툴리눔 독소를 함유하는 이산 영역을 함유하는 생분해성 중합체의 연속 매트릭스를 포함하는 마이크로구체 입자 (미국 특허 번호 5,902,565)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 수일 내지 수년 범위의 기간에 걸친 신경독소의 펄스형 또는 연속 생체내 방출을 위한 이식물을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,383,509; 미국 특허 번호 6,506,399; 미국 특허 번호 6,312,708; 미국 특허 번호 6,585,993; 및 미국 특허 번호 6,306,423 참조). 본원에 사용된 "이식물"은 일반적으로 제어 방출 (예를 들어, 펄스형 또는 연속) 조성물 또는 약물 전달 시스템에 관한 것이다. 이식물은, 예를 들어 대상체의 신체 내로 주사, 삽입 또는 이식될 수 있다. 이식물은 수일 내지 1년 또는 그 초과 동안, 예를 들어 7일, 15일, 30일, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 또는 그 초과 동안 투여될 수 있다.

하나의 구체적 실시양태에서, 클로스트리디움 독소를 대상체의 피부 내로 전달하기 위한 전달 시스템이 본원에 제공된다. 인간 피부는 2개의 별개의 층을 가지며, 신체 영역에 따라 두께가 약 1.5 내지 약 4 mm 또는 그 초과로 달라진다. 제1 층은 표피로 불리는 표재성 층이다. 이는 비교적 두꺼운 상피이다. 표피의 심부는 진피로 불리는 제2 층이다. 진피는 섬유성 결합 조직이고, 한선 및 신경, 또는 이러한 한선을 신경지배하는 신경 말단을 포함한다. 피부 바로 아래에는 피하 층의 일부로 간주될 수도 있는 피하로 불리는 지방 층이 놓여 있다. 피하 또는 피하 층 아래에는 신체의 특수 구조, 예를 들어 근육의 심부 근막 매몰제가 놓여 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 전달은 동물 또는 인간 대상체의 조직에 클로스트리디움 독소 또는 클로스트리디움 독소를 코딩하는 DNA를 전달한다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소는 신경 말단이 발견되는 피부 층으로 전달된다. 예를 들어, 전달은 진피 층으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전달은 적어도 1개의 피부 층 및 실질적으로 아래의 조직으로 이루어진다. 예를 들어, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체는 피부의 진피 층 및 피하 층으로 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 독소는 피부 및 아래의 근육 조직으로 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 클로스트리디움 독소는 실질적으로 근육 조직으로 전달된다.

담체 및 클로스트리디움 독소 및/또는 클로스트리디움 독소를 코딩하는 DNA를 포함하는 조성물의 소정 부위로의 전달은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단, 예를 들어 바늘-기반 전달 방법 또는 무바늘 전달 방법을 통해 달성될 수 있다.

한 실시양태에서, 조성물은 무바늘 전달을 통해 전달된다. 무바늘 주사기 및 그의 용도는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 무바늘 주사기를 개시하는 미국 특허 번호 6,053,889; 미국 특허 번호 6,013,050; 미국 특허 번호 6,010,478; 미국 특허 번호 6,004,286 및 미국 특허 번호 5,899,880을 참조한다. 한 실시양태에서, 무바늘 주사기는 기다란 관형 노즐을 포함하고, 예를 들어 매체를 피부 표면 쪽으로 및 피부 표면 내로 고속으로 가속화시키는 초음속 기체 유동, 예를 들어 헬륨 격발을 생성하기 위한 적합한 에너지공급 수단에 연결되거나 연결될 수 있다. 이러한 장치는 영국 옥스포드 소재 파우더젝트 파마슈티칼스(POWDERJECT Pharmaceuticals)로부터 구입할 수 있다. 한 실시양태에서, 제공된 기체 압력은 조성물을 표적화된 부위, 예를 들어 진피 내로 방출하기에 충분해야 하지만, 표적을 손상시킬 정도로 커서는 안된다. 또 다른 실시양태에서, 제공된 기체 압력은 조성물을 표적 부위, 예를 들어 진피로 전달하기에 충분하지만, 피부 표면, 예를 들어 상피를 손상시킬 정도로 크지는 않다. 또 다른 실시양태에서, 기체 압력은 조성물을 진피 층으로 전달하기에 충분하지만, 아래의 층, 예를 들어 피하 층 및/또는 근육 조직으로 전달하기에는 충분하지 않다. 또 다른 실시양태에서, 제공된 기체 압력은 약물 입자를 표적화된 부위, 예를 들어 진피 및/또는 실질적으로 아래의 근육 조직으로 방출하기에 충분해야 하지만, 피부 표면을 손상시킬 정도로 커서는 안된다.

무바늘 주사기를 사용하는 것에 대한 이점은, 예를 들어 특정 조직 층, 예를 들어 진피 층으로의 최적의 전달을 포함한다. 추가로, 전달이 진피로 이루어지고 근육 조직으로는 이루어지지 않는 경우에, 치료는 치료될 영역에서 운동 기능의 상실을 유발하지 않을 수 있다. 또한, 무바늘 주사기의 사용은 바늘에 의한 우발적 손상 또는 액체 제트 주입기로부터 체액이 잠재적으로 튀기는 것으로부터 감염의 위험을 제거하여, HIV 및 B형 간염과 같은 혈액-매개 병원체의 교차-오염 가능성을 피함으로써 임상 안전성을 개선시킨다. 무바늘 주사기는 또한 약물 입자의 최적 및 특이적 전달을 제공하여, 통증 또는 피부 손상, 예컨대 타박상 또는 출혈이 거의 없이 상태를 치료한다. 정제된 클로스트리디움 독소를 함유하는 무바늘 시스템은 미국 특허 번호 7,255,865에 개시되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 추가로 클로스트리디움 독소 및 담체를 포함하는 바늘-기반 시스템에 관한 것이다. 대표적인 유형의 주사 시스템은 관련 기술분야에, 예를 들어 미국 특허 번호 8,603,028 (각진 팁 부분을 갖는 주사 장치에 관한 것); 미국 특허 번호 8,801,659 (연부 조직 내로 점성 작용제를 전달하기 위한 주사 장치에 관한 것)에 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 전통적인 전달 시스템, 예를 들어 시린지, 카테터, 바늘 및 다른 장치를 통해 소정 부위 내로 주사될 수 있다.

투여량

한 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 유효량의 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편을 함유한다. 용어 "유효량"은 상태의 치료와 관련되어 사용될 때, 증상을 치료하기에 충분한 용량, 예를 들어 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%일 수 있다. 결합 도메인 (및/또는 그의 단편)만을 포함하는 클로스트리디움 독소와 관련하여, 용량은 일반적으로 0.1-1000 mg/일의 범위이고, 예를 들어 1-500pg/일, 100-5000pg/일, 1-500ng/일, 100-5000ng/일, 1-500μg/일, 100-5000μg/일, 5-1000 mg/일, 10-500 mg/일, 20-500 mg/일, 50-500 mg/일, 10-200 mg/일, 10-100 mg/일 또는 100-500 mg/일의 범위일 수 있으며, 투여될 실제 양은 환자의 연령 및 체중, 환자의 일반적 신체 상태 및 투여 경로를 포함한 관련 상황을 고려하여 의사에 의해 결정된다. 반복 투여가 사용되는 경우에, 투여 빈도는 부분적으로 제약 조성물의 반감기에 좌우된다.

또 다른 실시양태에서, 제제 중 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 농도는 약 1pg/ml 내지 1000pg/ml 독소, 1 ng/ml 내지 1000 μg/ml 독소, 예를 들어 약 10 ng/ml 내지 500 μg/ml 독소, 100 ng/ml 내지 100 μg/ml 독소, 200 ng/ml 내지 500 μg/ml 독소, 200 ng/ml 내지 5000 ng/ml 독소, 500 ng/ml 내지 5000 ng/ml, 10 ng/ml 내지 5000 ng/ml, 20 ng/ml 내지 5000 ng/ml, 50 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 100 ng/ml 내지 10 μg/ml, 100 ng/ml 내지 5000 ng/ml, 100 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 10 ng/ml 내지 100 ng/ml, 200 ng/ml 내지 10 μg/ml, 200 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 500 ng/ml 내지 50 μg/ml, 500 ng/ml 내지 10 μg/ml 또는 1000 ng/ml 내지 10 μg/ml 독소의 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제제 중 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체의 농도는 약 1 pM 내지 500 pM, 0.1 nM 내지 500 μM, 1.0 nM 내지 500 μM, 1.0 nM 내지 100 μM, 1.0 nM 내지 50 μM, 1.0 nM 내지 10 μM, 1.0 nM 내지 500 nM, 1.0 nM 내지 100 nM, 1.0 nM 내지 10 nM, 10 nM 내지 100 μM, 10 nM 내지 50 μM, 10 nM 내지 10 μM, 10 nM 내지 5 μM, 10 nM 내지 1 μM, 50 nM 내지 500 μM, 50 nM 내지 100 μM, 50 nM 내지 10 μM, 50 nM 내지 1 μM, 50 nM 내지 500 nM, 50 nM 내지 100 nM, 1 nM 내지 10 μM, 10 nM 내지 10 μM, 20 nM 내지10 μM, 100 nM 내지 10 μM, 1 μM 내지 1 mM, 1 μM 내지 500 μM, 1 μM 내지 500 μM, 5 μM 내지 500 μM, 10 μM 내지 100 μM, 1 nM 내지 500 μM, 10 nM 내지 100 μM, 10 nM 내지 10 μM, 20 nM 내지 1 μM, 1 nM 내지 500 nM, 10 nM 내지 100 nM, 20 nM 내지 50 nM, 1 nM 내지 100 nM, 3 nM 내지 50 nM 독소의 범위일 수 있다.

투여는 단일 투여량 또는 누적 (연속 투여)일 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 피부 장애의 치료는 본원에 개시된 조성물의 유효 용량의 1회 투여를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 본원에 개시된 조성물의 유효 용량은 미용적 장애의 증상을 나타내는 부위에서 또는 그 근처에서, 예를 들어 단일 주사 또는 침착으로서 개체에게 1회 투여될 수 있다. 대안적으로, 미용적 장애의 치료는 소정 범위의 기간에 걸쳐, 예컨대, 예를 들어 매일, 수일마다 1회, 매주, 매월 또는 매년 수행되는 본원에 개시된 조성물의 유효 용량의 다중 투여를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 본원에 개시된 조성물은 개체에게 매년 1회 또는 2회 투여될 수 있다. 투여 시기는 개체의 증상의 중증도와 같은 인자에 따라 개체마다 달라질 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 조성물의 유효 용량은 개체에게 무한 기간 동안 1개월 1회 또는 개체가 더 이상 요법을 필요로 하지 않을 때까지 투여될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 개체의 상태가 치료 과정에 걸쳐 모니터링될 수 있다는 것 및 투여되는 본원에 개시된 조성물의 유효량이 그에 따라 조정될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

투여 경로

활성제 (예를 들어, 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체)는 생체내 및 생체외 방법, 뿐만 아니라 전신 및 국부 투여 경로를 포함한, 약물 전달에 적합한 임의의 이용가능한 방법 및 경로를 사용하여 개체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 독소 (그의 단편 또는 변이체 포함)는 보툴리눔 독소 요법에 대한 확립된 프로토콜에 따라 투여된다. 용어 "보툴리눔 독소 요법"은 임의의 담체 또는 활성 성분과 조합되고 임의의 투여 경로에 의해 투여되는, 임의의 제제 중 임의의 자연 발생 또는 변형 또는 조작된 형태의 보툴리눔 독소 또는 그의 도메인 또는 단편의 용도를 비제한적으로 포괄한다.

사용 방법

치료적 적용

한 실시양태에서, 본 개시내용은 치료적 적용을 위해 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 ECM 조절이상과 연관된 질환 또는 장애를 치료하고/거나 그의 발생을 감소시키는데 유용하다. 한 실시양태에서, 조성물은 섬유화 장애 또는 섬유화 질환을 치료하고/거나 그의 발생을 감소시키는데 유용하다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 결합 조직 섬유모세포와 연관된 질환 또는 장애를 치료하고/거나 그의 발생을 감소시키는데 유용하다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 폴리펩티드의 분자량은 약 4 kDa 내지 약 60 kDa; 바람직하게는 약 10 kDa 내지 약 60 kD; 특히 약 12 kDa 내지 약 50 kDa인, 세포외 매트릭스 질환; 결합 조직 질환; 내피 질환; 및 섬유화 질환으로부터 선택된 질환의 치료에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 요법은 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C₁, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/FA, BoNT/G, BoNT/H, BoNT/DC, BoNT/CD, BoNT/X 또는 eBoNT/J의 보툴리눔 독소 단편의 투여에 의해 수행되며, 여기서 단편은 약 4 kDa 내지 약 60 kDa; 바람직하게는 약 10 kDa 내지 약 60 kD; 바람직하게는 약 12 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖는다.

일부 실시양태에서, 요법은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 12-18 및 서열식별번호: 25-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 초과 %, 예를 들어 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 보툴리눔 독소 폴리펩티드를 투여함으로써 수행된다.

일부 실시양태에서, 요법은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 12-18 및 서열식별번호: 25-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 보툴리눔 독소 폴리펩티드를 투여함으로써 수행된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 세포외 매트릭스 질환, 예를 들어 아테롬성동맥경화증, 암, 아밀로이드 질환, 사구체 질환, 혈관간 질환, 염증성 상태 및 발달 장애의 치료에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 결합 조직 질환, 예를 들어 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 류마티스 관절염, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 혼합 결합 조직 질환, 감염성 호산구증가증, 다발근염, 피부근염, 결절성 동맥주위염, 베게너-육아종증, CREST-증후군 및 SHARP-증후군; 바람직하게는 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 류마티스 관절염, 전신 경화증 또는 쇼그렌 증후군의 치료 방법에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 내피 질환, 예를 들어 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병성 신경병증, 졸중, 아테롬성동맥경화증, 당뇨병, 재협착, 관상 동맥 질환, 말초 혈관 질환, 혈관 누출, 혈관염, 혈관염증, 베게너병, 위 또는 경구 궤양화, 간경변증, 간신증후군, 크론병, 탈모, 피부 자반증, 모세혈관확장증, 정맥호 형성, 지연된 상처 치유, 전자간증, 패혈증, 허혈-재관류 손상, 고혈압, 만성 또는 급성 감염, 월경과다, 신생아 호흡 곤란, 폐 섬유증, 기종, 신병증, 사구체신염, 경피증, 및 혈관 이상, 또는 불충분한 혈관신생, 고혈압, 혈관수축, 혈관 누출, 변경된 혈관운동 긴장, 과다응고, 항염증 특성 또는 불량한 내피 세포 건강을 특징으로 하는 내피 질환의 치료에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 섬유화 질환, 예를 들어 피부 반흔, 상처 반흔, 외과적 반흔, 비대성 반흔형성, 켈로이드, 신경교 반흔, 수술후 복강내 유착, 섬유종, 간 섬유증, 간경변증, 췌장염, 양성 전립선 비대증, 유방 섬유증, 복막후 섬유증, 예를 들어 섬유화 방광, 간질성 방광염, 폐 섬유증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 혈관 섬유증 (예를 들어, 아테롬성동맥경화증, 협착, 재협착), 신장 섬유증, 사구체경화증, 심방 섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 동맥 강성, 관절섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 진행성 거대 섬유증 (예를 들어, 폐), 만성 신장 질환 (CKD), 신원성 전신 섬유증, 크론병, 경피증, 전신 경화증 (예를 들어, 피부, 폐), 관절섬유종 (예를 들어, 무릎, 어깨, 다른 관절), 페이로니병, 듀피트렌 구축, 유착성 피막염, 기관 이식 연관 섬유증, 허혈 연관 섬유증, 낭성 섬유증, 비-낭성 섬유증, 혼합 결합 조직 질환, 안구 섬유증, 골관절염, 경피증, 또는 천식의 치료에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 섬유화 유방 질환; 켈로이드 반흔; 간 섬유증; 섬유화 방광; 섬유성 조직의 증식증, 예를 들어 양성 전립선 비대증; 췌장염; 유착, 예를 들어 복강내 유착; 반흔형성, 예를 들어 비대성 반흔 또는 그의 조합으로부터 선택된 섬유화 질환의 치료에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 피부 반흔, 상처 반흔, 외과적 반흔 또는 피부 반흔의 치료에 관한 것이다. 통상적으로, 피부 반흔은 피부 부속기, 예컨대 모낭 및 피지선을 함유하지 않고, 전형적으로 이들 구조에 서식하는 줄기 세포도 또한 존재하지 않는다. 보툴리눔 독소 A를 사용한 안면 상처의 치료는 위약과 비교하여 영장류에서 미용적 결과를 개선시키는 것으로 나타났다. 문헌 [Gassner et al., Plast Reconstr Surg 105:1948-1953, 2000]을 참조한다. 따라서, 본 개시내용에 따라, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인은 치료 이익을 전달하기 위해 대상체에서 절제 상처에 인접하게 주사될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 비대성 반흔 또는 켈로이드 반흔의 치료에 관한 것이다. 보툴리눔 독소 A는 병변내 주사에 의한 켈로이드의 치료에 사용되어 왔다. 문헌 [Zhibo et al., Plast Reconstr Surg., 124(5):275-277, 2009]을 참조한다. 따라서, 본 개시내용에 따라, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인은 치료 이익을 전달하기 위해 대상체에서 병변내로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 유착의 치료에 관한 것이다. 유착물은 종종 수술 동안 손상의 결과로서 조직과 기관 사이에 형성되는 섬유성 밴드이다. 이들은 정상적으로 결합되어 있지 않은 조직을 결합시키는 내부 반흔 조직을 포함한다. 실험실 동물 모델에서 수술후 복강내 유착을 예방하는데 보톡스가 평가되었다. 문헌 [Dokur et al., Ann Surg Treat Res., 93(1): 50-56, 2017]을 참조한다. 따라서, 본 개시내용에 따라, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인은 유착에 대한 치료 이익을 전달하기 위해 대상체 내로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 섬유종의 치료에 관한 것이다. 섬유종 (또는 유섬유종)은 섬유성 또는 결합 조직으로 구성된 양성 종양이다. 이들은 중간엽 조직으로부터 발생하는 모든 기관에서 성장할 수 있고, 눈꺼풀에서 가장 두드러진다. 따라서, 본 개시내용에 따라, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인은 섬유종에 대해 치료 이익을 전달하기 위해 경피로 또는 복강내로 대상체 내로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 간 섬유증 또는 간경변증의 치료에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 이들 간 섬유화 질환은 항섬유화제로 치료되며, 이는 간 반흔형성이 발생할 가능성을 감소시키는 것으로 나타났다. 처방되는 항섬유화제는 통상적으로 기저 의학적 상태에 좌우된다. 이들 치료의 예는, 예를 들어 (a) 만성 간 질환을 위한, ACE 억제제, 예컨대 베나제프릴, 리시노프릴 및 라미프릴; (b) C형 간염 바이러스를 위한, α-토코페롤 또는 인터페론-α; 및 (c) 비알콜성 지방간염을 위한, PPAR-α 효능제를 포함한다. 따라서, 본 개시내용에 따라, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인은 간 섬유증 또는 간경변증을 치료하기 위해 대상체 내로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 췌장염, 특히 특정 유전 장애, 예컨대 특히 낭성 섬유증에 의해 유발된 췌장염의 치료에 관한 것이다. 따라서, 본 개시내용에 따라, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인은 췌장염을 치료하기 위해 대상체 내로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 전립선 확대를 특징으로 하는 질환인 양성 전립선 비대증 (BPH)의 치료에 관한 것이다. 특정 연구는 BPH의 발생이 전립선에서 섬유증의 결과 및 근육 조직의 약화라는 것을 시사하였다. 따라서, 본 개시내용에 따라, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인은 BPH를 치료하기 위해 대상체 내로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 유방 섬유증, 예를 들어 유방 수술 후 섬유증의 치료에 관한 것이다. 유방 섬유증은 유방 조직의 밀도의 증점 또는 증가를 특징으로 할 수 있다. 섬유성 유방 조직은 인대, 지지 조직 (기질) 및 반흔 조직을 포함한다. 때때로 이들 섬유성 조직은 유방 영역에서 지방 조직이 더 두드러지게 되어, 가능하게는 단단하거나 고무질인 범프를 생성한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 신장, 대동맥, 신장관 및 다양한 다른 구조를 함유하는 신체의 구획인 복막후강에서 섬유성 조직의 증식을 특색으로 하는 질환인 복막후 섬유증 또는 오르몬드병의 치료에 관한 것이다. 상기 질환은 CT 스캔으로 진단되고, 요법은 글루코코르티코이드에 이어서 DMARD를 스테로이드-절약 작용제로서 또는 스테로이드에 대해 불응성인 경우에 포함할 수 있다. SERM 타목시펜은 다양한 소규모 시험에서 상태를 개선시키는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 개시내용에 따라, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인은 단독으로 또는 상기 언급된 약물 중 하나와 함께 투여되어, 본 개시내용의 조성물을 사용하여 복막후 섬유화 질환, 예컨대 섬유화 방광, 간질성 방광염 (통증성 방광 증후군), 폐 섬유증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 혈관 섬유증 (예를 들어, 아테롬성동맥경화증, 협착, 재협착), 신장 섬유증, 사구체경화증, 심방 섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 동맥 강성, 관절섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 거대 섬유증 (예를 들어, 폐), 만성 신장 질환 (CKD), 신원성 전신 섬유증을 치료할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 폐 섬유증, 예컨대 종격 섬유증 또는 진행성 거대 섬유증 (예를 들어, 폐의 PMF), 낭성 섬유증, 비-낭성 섬유증 또는 천식의 치료에 관한 것이다. PMF는 조밀한 섬유증의 큰 집성 덩어리의 발생 (통상 상부 폐 대역에서)을 특징으로 한다. 폐 섬유증을 갖는 대상체는 종격 내에 다양한 양의 반흔 조직을 가지며, 이는 거기에 위치한 기관에 대한 문제를 유발할 수 있다. 치료는 종격의 어느 구조가 영향을 받는지, 반흔형성의 중증도 및 일부 경우에는 상태의 원인에 좌우된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 IPF의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 개시내용의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, IPF의 치료에 관한 것이다. IPF는 미국에서 대략 100,000명의 환자에게 이환된 폐 실질의 진행성 간질성 섬유증을 특징으로 하는 제한성 폐 질환이다 (Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med 174:810-816, 2006). IPF와 연관된 이러한 간질성 섬유증은 폐 기능의 진행성 상실로 이어져, 대부분의 환자에서 호흡 부전으로 인한 사망을 유발한다. 진단 시점으로부터의 중앙 생존기간은 2-3년이다 (Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med 183:788-824, 2011). 예후는 대단히 심각하고 종종 폐 이식이 유일한 최후수단이다 (Thabut et al., Annals of Internal Medicine 151:767-774, 2009). IPF의 통상의 증상은 숨가쁨; 지속적인 건조, 잦은마른기침; 피로; 설명할 수 없는 체중 감소; 근육 및/또는 관절통 근육; 곤봉증 (손가락 또는 발가락 끝의 비대 및 말림)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 본 개시내용의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서의 만성 폐 질환을 포함한 낭성 섬유증 (CF)의 치료에 관한 것이다. cF에서, 기도의 박테리아 콜로니화는 일반적으로 생후 1년 또는 2년 이내에 발생한다. 낭성 섬유증의 증상은, 예를 들어 복통, 만성 기침 (혈액과 함께 또는 점액질과 함께); 위장 문제 (설사, 대변 내 지방, 가슴쓰림, 중증 변비 또는 다량의 대변); 호흡기 문제 (예를 들어, 폐고혈압, 숨가쁨, 부비동염 또는 천명); 소아의 발달 결함 (예를 들어, 지연된 발달, 지연된 사춘기 또는 느린 성장); 전신 문제, 예컨대 피로 또는 운동 불능을 포함한다. 다른 통상의 증상은, 예를 들어 급성 기관지염, 손발톱의 변형, 감염, 비강 폴립, 폐렴, 염분성 땀 또는 체중 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 개시내용의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-낭성 섬유증의 치료에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물을 사용하는 신장 섬유증, 예컨대 만성 신장 질환 (CKD) 또는 신원성 전신 섬유증 (NSF)의 치료에 관한 것이다. 신장 초음파검사는 CKD 또는 NSF에서의 진단 및 예후 목적, 예를 들어 기저 병리학적 변화가 간질성 섬유증에 기인하는지 여부를 확인하는데 유용하다. 예를 들어, NSF는 피부 섬유모세포 및 수지상 세포의 증식, 비후된 콜라겐 다발, 증가된 탄성 섬유 및 뮤신의 침착물을 보여주고, 특정 보고는 NSF 환자로부터의 피부 생검에서 경화체(sclerotic body) (또한 탄성콜라겐성(elastocollagenous) 볼로 공지됨)의 존재를 기재하였다. 문헌 [Scheinfeld et al., eMedicine, published: May 22, 2018]을 참조한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물을 사용하는 위장 섬유화 장애, 예컨대 크론병의 치료에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물을 사용하는 결합 조직의 섬유증에 의해 유발된 질환, 예를 들어 혼합 결합 조직 질환, 안구 섬유증, 골관절염 또는 경피증의 치료에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물을 사용하는 전신 섬유화 상태에 의해 유발된 섬유화 질환, 예를 들어 전신 경화증 (예를 들어, 피부, 폐), 관절섬유증 (예를 들어, 무릎, 어깨, 다른 관절)의 치료에 관한 것이다. 전형적으로, 이러한 전신 질환을 치료하기 위해, 조성물은 피부에 전신으로, 예를 들어 전신 경화증의 경우에 국소적으로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물을 사용하는 덜 통상적인 섬유화 질환, 예컨대 페이로니병 (음경 섬유증), 듀피트렌 구축 (손가락 굽음), 유착성 피막염 (오십견), 기관 이식 연관 섬유증의 치료에 관한 것이다.

본 개시내용은 추가로 세포외 매트릭스 (ECM) 질환, 결합 조직 질환, 내피 질환 또는 섬유화 질환; 바람직하게는 ECM, 결합 조직 또는 내피의 섬유화 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포외 매트릭스 (ECM) 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 결합 조직 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 내피 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 섬유화 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 피부 반흔, 상처 반흔, 외과적 반흔, 수술후 복강내 유착, 섬유종, 간 섬유증, 간경변증, 췌장염, 양성 전립선 비대증, 유방 섬유증, 섬유화 방광, 간질성 방광염, 폐 섬유증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 혈관 섬유증 (예를 들어, 아테롬성동맥경화증, 협착, 재협착), 신장 섬유증, 사구체경화증, 심방 섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 신경교 반흔, 동맥 강성, 관절섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 거대 섬유증 (예를 들어, 폐), 만성 신장 질환 (CKD), 신원성 전신 섬유증, 크론병, 비대성 반흔형성, 켈로이드, 경피증, 전신 경화증 (예를 들어, 피부, 폐), 관절섬유증 (예를 들어, 무릎, 어깨, 다른 관절), 페이로니병, 듀피트렌 구축, 유착성 피막염, 기관 이식 연관 섬유증, 허혈 연관 섬유증, 낭성 섬유증, 비-낭성 섬유증, 혼합 결합 조직 질환, 안구 섬유증, 골관절염, 경피증, 또는 천식으로부터 선택된 섬유화 질환의 치료, 바람직하게는 섬유화 유방 질환; 켈로이드 반흔; 간 섬유증; 섬유화 방광; 섬유성 조직의 증식증, 예를 들어 양성 전립선 비대증; 췌장염; 유착, 예를 들어 복강내 유착; 반흔형성, 예를 들어 비대성 반흔 또는 그의 조합으로부터 선택된 섬유화 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 개시내용은 추가로 세포외 매트릭스 (ECM) 질환, 결합 조직 질환, 내피 질환 또는 섬유화 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한, 바람직하게는 ECM, 결합 조직 또는 내피의 섬유화 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포외 매트릭스 (ECM) 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 결합 조직 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 내피 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 섬유화 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 피부 반흔, 상처 반흔, 외과적 반흔, 수술후 복강내 유착, 섬유종, 간 섬유증, 간경변증, 췌장염, 양성 전립선 비대증, 유방 섬유증, 섬유화 방광, 간질성 방광염, 폐 섬유증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 혈관 섬유증 (예를 들어, 아테롬성동맥경화증, 협착, 재협착), 신장 섬유증, 사구체경화증, 심방 섬유증, 심장 섬유증, 심내막심근 섬유증, 신경교 반흔, 동맥 강성, 관절섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 거대 섬유증 (예를 들어, 폐), 만성 신장 질환 (CKD), 신원성 전신 섬유증, 크론병, 비대성 반흔형성, 켈로이드, 경피증, 전신 경화증 (예를 들어, 피부, 폐), 관절섬유증 (예를 들어, 무릎, 어깨, 다른 관절), 페이로니병, 듀피트렌 구축, 유착성 피막염, 기관 이식 연관 섬유증, 허혈 연관 섬유증, 낭성 섬유증, 비-낭성 섬유증, 혼합 결합 조직 질환, 안구 섬유증, 골관절염, 경피증, 또는 천식으로부터 선택된 섬유화 질환의 치료, 바람직하게는 섬유화 유방 질환; 켈로이드 반흔; 간 섬유증; 섬유화 방광; 섬유성 조직의 증식증, 예를 들어 양성 전립선 비대증; 췌장염; 유착, 예를 들어 복강내 유착; 반흔형성, 예를 들어 비대성 반흔 또는 그의 조합으로부터 선택된 섬유화 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 상기 제공된 바와 같은 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

추가로 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 조성물은 조성물의 활성을 조정하기 위해 서로 조합되어 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 BoNT/A H_c 단편 및 서열식별번호: 25의 돌연변이체 BoNT/A H_c 단편) 또는 다른 항섬유화제와 조합되어 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 펩티드 또는 화합물과 다른 작용제와의 조합은 독성 문제로 인해 보다 낮은 용량으로 사용될 항섬유화제가 효능이 감소된 항섬유화제의 활성을 증진시키도록 하는데 또는 성분들 사이의 상승작용을 발생시켜 조합이 독립적으로 각 어느 한 성분의 효능의 합계보다 더 효과적이도록 하는데 유용할 수 있다. 조합 요법에서 항미생물성 펩티드와 조합될 수 있는 항섬유화제는, 예를 들어 IPF의 치료를 위해 승인된 피르페니돈 및 닌테다닙을 포함한다.

상기 언급된 치료적 적용의 실시에 있어서, 안면 근육의 마비를 일으키지 않는 클로스트리디움 독소 또는 그의 단편 또는 변이체를 함유하는 조성물을 사용하는 것이 유리하다.

실시예

본원에 기재된 구조, 물질, 조성물 및 방법은 본 개시내용의 대표적인 예인 것으로 의도되고, 본 개시내용의 범주가 실시예의 범주에 의해 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 본 개시내용이 개시된 구조, 물질, 조성물 및 방법에 대한 변형으로 실시될 수 있고, 이러한 변형이 본 개시내용의 영역 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 인지할 것이다.

실시예 1

정상 인간 1차 섬유모세포에서의 세포 유전자 발현에 대한 예시적인 서열식별번호: 19 폴리펩티드의 효과

정상 인간 1차 섬유모세포를 10 nM, 100 nM 또는 1 μM의 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 1일 (24시간) 동안 처리한 것은 qPCR에 기초하여 16종의 섬유모세포 유전자 발현의 유의한 용량-의존성 변화를 가져왔다. 간략하게, 성인 인간 피부 섬유모세포 (HDFa) (써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 C0135C)를 2% FBS 함유 MEM 배지에서 2주 동안 배양한 후에 10 nM, 100 nM 또는 1 μM의 서열식별번호: 19의 폴리펩티드로 1일 (24시간) 동안 처리하였다. 섬유모세포에서 발현되고 ECM 조직화, 염증 또는 표피 자기-재생 (각질세포 줄기 세포 인자)과 관련된 것으로 공지된 유전자의 발현을 평가하였다. cDNA를 슈퍼스크립트 빌로 cDNA 합성 키트 (써모 사이언티픽 #11754050)를 사용하여 역전사에 의해 생성하고, 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스 (써모 사이언티픽 #4444557) 중에 추가로 희석한 후에, 택맨 패스트 플레이트 (써모 사이언티픽 # 4413259) 내의 지정된 웰로 옮겼다. 어플라이드 바이오시스템즈 7500 패스트 리얼-타임 PCR 시스템 (써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 실시간 qPCR을 수행하였다. 각각의 시점에서 비처리 대조군 대비 배수 변화로서 유전자 발현의 변화를 계산하였다 (ΔΔCT = ΔCT (유전자 (시험) - GAPDH (시험)) - ΔCT (유전자 (비처리 대조군) - GAPDH (비처리 대조군)); 배수 변화 = 2(-ΔΔCT)). 2 초과 또는 0.5 미만의 배수 변화 (p-값 ≤0.05)를 관련된 유의한 변화로 간주하였다. 용량-의존성 변화를 보여주는 예시적인 유전자가 도 1에 제시되며, 이는 10 nM (진한 막대), 100 nM (비어있는 막대) 또는 1 μM (빗금친 막대)의 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 24시간 동안 처리한 후 정상 인간 1차 섬유모세포에서의 나타낸 유전자 발현의 배수-변화를 보여주는 막대 그래프이며, 여기서 배수-변화는 비처리 대조군 세포에 비해 표현되어 있다. 결과는 MMP1, MMP3, TIMP1을 포함한, 세포외 매트릭스 파괴 및 재형성에 관여하는 것으로 공지된 유전자가 상향-조절된 반면; S100 칼슘-결합 단백질 A4 (S100A4) 및 알파-평활근 액틴의 유도제 및 알파-평활근 액틴 (α-SMA/ACTA2)을 포함한 섬유증과 연관된 유전자는 하향-조절되었다는 것을 보여준다. 공지된 섬유증 마커인 S100A4 및α-SMA/ACTA2는 섬유모세포 수축성 및 근섬유모세포 형성과 연관된다. 섬유모세포 수축성 및 근섬유모세포 형성 뿐만 아니라, S100A4, ACTA2 및 다른 ECM 성분의 과량 생산은 반흔 형성 및 섬유증에서 소정 역할을 하기 때문에, 이들 결과는 서열식별번호: 19의 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 가질 것이라는 점을 시사한다. 결과는 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 인간 환자에서, 예를 들어 섬유성 조직 및 기관 및 반흔을 포함한 ECM 구조 및 섬유증에 대한 효과를 가져, 예를 들어 조직 및 기관 섬유증의 억제 또는 역전 및 시각적 반흔 감소를 가져올 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 2

켈로이드 반흔 유래된 인간 1차 섬유모세포에서의 세포 유전자 발현에 대한 예시적인 서열식별번호: 21 폴리펩티드의 효과

켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포를 BoNT/A의 결합 도메인의 N-말단 절반 (H_CN/A)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 21)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 것은 qPCR에 기초하여 6종의 섬유모세포 유전자 발현의 유의한 용량-의존성 변화를 가져왔다. 간략하게, 인간 피부 섬유모세포 (KF116R) (셀리서치코퍼레이션 피티이 리미티드(cellResearchCorp Pte Ltd))를 2% FBS 함유 MEM 배지에서 2주 동안 배양한 후에 1 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1 μM의 서열식별번호: 21의 폴리펩티드로 1일 (24시간) 동안 처리하였다. ECM 조직화 및 재형성 (MMP1, MMP3 및 TIMP1) 및 표피 분화 및 자기-재생 (FGFR1, FGF7 및 TP63)과 관련된 것으로 공지된 6종의 섬유모세포-관련 유전자의 발현을 평가하였다. cDNA를 슈퍼스크립트 빌로 cDNA 합성 키트 (써모 사이언티픽 #11754050)를 사용하여 역전사에 의해 생성하고, 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스 (써모 사이언티픽 #4444557) 중에 추가로 희석한 후에, 택맨 패스트 플레이트 (써모 사이언티픽 # 4413259) 내의 지정된 웰로 옮겼다. 어플라이드 바이오시스템즈 7500 패스트 리얼-타임 PCR 시스템 (써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 실시간 qPCR을 수행하였다. 각각의 시점에서 비처리 대조군 대비 배수 변화로서 유전자 발현의 변화를 계산하였다 (ΔΔCT = ΔCT (유전자 (시험) - GAPDH (시험)) - ΔCT (유전자 (비처리 대조군) - GAPDH (비처리 대조군)); 배수 변화 = 2(-ΔΔCT)). 2 초과 또는 0.5 미만의 배수 변화 (p-값 ≤0.05)를 유의한 변화로 간주한다. 용량-의존성 변화를 보여주는 예시적인 유전자가 도 2에 제시되며, 이는 1 nM (수평선으로 채워짐), 10 nM (비어있는 막대), 100 nM (빗금친 막대) 또는 1 μM (진한 막대)의 BoNT/A의 결합 도메인의 N-말단 절반 (H_CN/A) (서열식별번호: 21)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 후 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포에서의 나타낸 유전자 발현의 배수 변화를 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 서열식별번호: 11의 폴리펩티드로 세포를 처리한 것이 진피 세포외 매트릭스 (ECM)를 생성, 유지 및 복구하는 것과 관련된 단백질의 발현을 변화시켰다는 것을 보여준다. ECM 성분의 과량 생산이 반흔 형성 및 섬유증에서 소정 역할을 하기 때문에, 이들 결과는 서열식별번호 21의 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 가질 것임을 시사한다. 결과는 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A) 또는 결합 도메인의 N-말단 절반 (H_CN/A)에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 인간 환자에서 섬유증, 예를 들어 섬유성 조직 및 기관 및 반흔에 영향을 미쳐, 예를 들어 조직 및 기관 섬유증의 억제 또는 역전 및 시각적 반흔 감소를 가져올 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 3

켈로이드 반흔 유래된 인간 1차 섬유모세포로부터의 프로콜라겐 분비에 대한 예시적인 서열식별번호: 19 폴리펩티드의 효과

켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포를 1 μM의 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A) (서열식별번호: 19)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 것은 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포로부터 10% FBS를 갖는 배지 내로의 프로콜라겐 유형 I C-펩티드 (PIP) 분비의 유의한 ~30% 감소를 가져왔다. 감소는 0.1 μM의 TGF-베타에 대한 항체로의 처리 후 관찰된 ~20% 감소, 또는 1 μM의 CTGF에 대한 항체로의 처리 후 관찰된 ~30% 감소와 유사하였다. 간략하게, 인간 피부 켈로이드 섬유모세포 (KF116R)를 2% FBS 함유 MEM 배지에서 정기적으로 배양하였다. 실험을 위해, 세포를 1 μM의 서열식별번호: 19 폴리펩티드, 0.1 μM의 항-TGF-β mAb 또는 1 μM의 항-CTGF mAb로 처리하거나 처리하지 않으면서 2% FBS 배지 중에 유지시키거나 10% FBS 함유 배지로 옮겼다. 24시간 후, 배지를 수집하고, 프로콜라겐 유형 I C-펩티드 (PIP) 수준을 프로콜라겐 유형 I C-펩티드 (PIP) EIA 키트 (타카라 바이오 인크.(Takara BIO INC.) 카탈로그 # MK101)를 사용하여 측정하였다. 데이터는 도 3에 제시되며, 이는 1 μM의 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A) (서열식별번호: 19)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 2종의 공지된 항섬유화제인 0.1 μM의 TGF-베타에 대한 항체 또는 1 μM의 CTGF에 대한 항체로 처리하거나 처리하지 않으면서 2% FBS 중에서 배양하거나 10% FBS 중에서 배양한 후에 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포로부터 배지 내로 분비된 PIP의 양 (ng/mL)을 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 서열식별번호: 19의 폴리펩티드가 1차 피부 반흔 유래된 섬유모세포로부터 성숙 콜라겐 섬유의 공급원인 프로콜라겐 펩티드의 분비를 감소시키는데 있어서 2종의 공지된 항섬유화제만큼 효과적이었다는 것을 보여준다. 과량의 콜라겐 생산은 반흔 형성 및 섬유증에서 소정 역할을 하기 때문에, 이들 결과는 서열식별번호: 19의 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 가질 것임을 시사한다. 결과는 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 인간 환자에서, 예를 들어 콜라겐 생산을 감소시킴으로써 섬유증에 영향을 미쳐, 조직 및 기관 섬유증의 억제 또는 역전 및 시각적 반흔 감소를 가져올 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 4

켈로이드 반흔 유래된 인간 1차 섬유모세포 수축성에 대한 예시적인 서열식별번호: 19 폴리펩티드의 효과

켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포를 1 μM의 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A) (서열식별번호: 19)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 사전-처리한 것은 1일 (24시간) 후 섬유모세포 수축성 및 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 이행의 척도인 피브린 히드로겔 수축성의 유의한 ~50% 감소를 가져왔다. 간략하게, 인간 피부 켈로이드 섬유모세포 (KF116R)를 2% FBS 함유 MEM 배지에서 정기적으로 배양하였다. 실험을 위해, 세포를 1 μM의 서열식별번호: 19 폴리펩티드로 처리하거나 처리하지 않으면서 2% FBS 배지 중에 유지시키거나 10% FBS 함유 배지로 옮겼다. 3일 후, 세포를 트립신처리하고, 1x10⁶개 세포/히드로겔을 치료 패러다임에 따라 1 mg/mL 피브리노겐 및 2.5 U/mL 트롬빈 함유 MEM 배지, 2% 또는 10%의 혼합물인 피브린 히드로겔 내로 포매하였다. 1일 (24시간) 후 고정된 거리에서 사진을 찍고, 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 피브린 히드로겔의 면적 (cm²)을 계산하였다. 데이터는 도 4에 제시되며, 이는 1 μM의 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A) (서열식별번호: 19)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 3일 사전-처리하거나 처리하지 않으면서 포매시키고 2% FBS 배지 또는 10% FBS 배지 중에서 배양한지 1일 후에 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포를 갖는 피브린 히드로겔의 크기 (cm²)를 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 1 μM의 서열식별번호: 19의 폴리펩티드로의 처리가 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포의 섬유모세포 수축성 및 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 이행를 감소시켰다는 것을 보여준다. 섬유모세포 수축성은, 예를 들어 섬유모세포가 수축하여 상처를 봉합하거나 기존의 반흔을 변환시키기 때문에, 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 이행 및 반흔 형성과 연관된다. 결과는 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 섬유모세포 수축성 및 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 이행를 감소시키는데 효과적이고, 따라서 인간 환자에서 섬유증, 예를 들어 섬유성 조직 및 기관 및 반흔에 영향을 미쳐, 예를 들어 상처 치유 동안 더 적은 반흔형성 및/또는 기존 조직 및 기관 섬유증 및 반흔형성의 역전을 가져올 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 5

섬유화 유방암 세포에 대한 예시적인 서열식별번호: 19 및 21 폴리펩티드의 효과

저산소증에 의해 섬유증이 유발된 섬유화 상피 인간 유방 선암종 암 (MDA-MB-231) 세포를 20 pM, 0.1 μM 또는 1 μM의 BoNT/A의 결합 도메인 (HC/A) (서열식별번호: 19)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 BoNT/A의 결합 도메인의 N-말단 절반 (H_CN/A) (서열식별번호: 21)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 것은, 자기 비드 면역흡착 분석에 기초하여, 피브로넥틴 (인테그린, 콜라겐, 피브린 및 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 (예를 들어 신데칸)에 결합하는 세포외 매트릭스의 고분자량 (~440kDa) 당단백질), 콜라겐 IV (상피 세포에 의해 분비되는 세포외 매트릭스 층인 기저판에서 주로 발견되는 콜라겐 유형) 및 트롬보스폰딘-1 (피브로넥틴 및 콜라겐에 결합하여 세포-대-세포 및 세포-대-매트릭스 상호작용을 매개하는 접착성 당단백질)의 배지 내로의 분비의 용량-의존성 유의한 감소, 및 콜라겐을 포함한 세포외 매트릭스를 분해하는 기능을 하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (MMP1) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제의 억제 조절제인 TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1 (TIMP1)의 증가된 분비를 가져왔다. 1 μM의 서열식별번호: 19의 폴리펩티드로 처리한 것은 피브로넥틴, 콜라겐 IV 및 트롬보스폰딘-1 모두의 분비를 다시 정상산소 세포에 대한 수준으로 또는 그에 가깝게 감소시켰고; 서열식별번호: 21의 폴리펩티드로 처리한 것은 피브로넥틴 및 트롬보스폰딘-1의 분비를 정상산소 세포에 대한 수준 미만으로 및 콜라겐 IV의 분비를 다시 정상산소 세포에 대한 수준으로 감소시켰다. 이와 비교하여, 333 nM의 공지된 항섬유화제인 CTGF에 대한 항체 (FG-3019)는 트롬보스폰딘-1의 분비에 영향을 미치지 않았고, 피브로넥틴 분비에 대해 더 적은 억제 효과 및 콜라겐 IV 분비에 대한 유사한 억제 효과를 나타냈다. 간략하게, MDA-MB-231 세포를 ATCC (메릴랜드주 록빌)로부터 획득하고, 10% FBS 및 1% 항생제로 보충된 DMEM 배지 중에서 37℃ 및 5% CO2 하에 배양하였다. 세포를 12-웰 플레이트에 2 x 10⁵개 세포/ml로 시딩하였다. 다음 날, 완전 배지를 제거하고, 세포를 1X PBS로 세척하고, 3가지 상이한 농도: 20 pM, 0.1 및 1 uM의 서열식별번호: 19의 폴리펩티드 및 서열식별번호: 21의 폴리펩티드 및 333 nM 최종 농도의 항-CTGF 항체 FG-3019가 존재하거나 존재하지 않는 무혈청 배지에서 유지시켰다 (n=2, 조건당 2개-웰). 비처리 세포를 a) 표준 CO2 인큐베이터에서 정상산소 (~21% O2) 하에 또는 b) 가습 삼중 기체 모델 (바인더) 인큐베이터에서 저산소 (1% O2) 하에 인큐베이션하였다. 모든 처리된 세포를 낮은 산소 조건 하에 120시간 (h) 동안 유지하고, 세포 배양 상청액을 수집하고, 자기 비드 면역흡착 검정 (이엠디 밀리포어(EMD Millipore), 메릴랜드주)을 사용하여 분석하였다. 세포 배양 배지에 분비된 섬유화유발 마커의 수준을 ELISA-유사 기술: 피브로넥틴, 콜라겐 IV, 트롬보스폰딘-1, MMP1 및 TIMP1을 포함한 특정 단백질 (맞춤 패널)에 대한 항체-접합된 비드로 이루어진 자기 비드 (루미넥스(Luminex))를 사용하여 결정하였다. 각각의 분석물의 배지 농도를 패널 내의 모든 단백질을 함유하는 표준 용액을 사용하여 결정하였다. 데이터는 도 5에 제시되며, 이는 20 pM, 0.1 μM 또는 1 μM의 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, BoNT/A의 결합 도메인의 N-말단 절반 (H_CN/A)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 333 nM의 CTGF에 대한 항체 (FG-3019)로 처리한 후 저산소증에 의해 섬유증이 유발된 섬유화 MDA-231 세포로부터 배지 내로 분비된 피브로넥틴, 콜라겐 IV, 트롬보스폰딘-1, MMP1 및 TIMP1의 양 (ng/mL)을 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 서열식별번호: 19의 폴리펩티드 또는 서열식별번호: 21의 폴리펩티드로의 처리가 섬유화 MDA-MB-231 세포로부터 피브로넥틴, 콜라겐 IV, 트롬보스폰딘-1의 분비를 감소시키고 MMP1 및 TIMP1의 분비를 증가시키는데 효과적이었고, 효과가 공지된 항섬유화제 FG-3019의 효과와 대등하거나 더 강했다는 것을 보여준다. 결과는 실질적으로 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A) 또는 결합 도메인의 N-말단 절반에 상응하는 폴리펩티드가 저산소증 유발된 섬유증을 감소시키는데 효과적이라는 것을 시사한다.

실시예 6

켈로이드 반흔 유래된 섬유모세포로부터의 피브로넥틴 분비에 대한 예시적인 서열식별번호: 19 폴리펩티드의 효과

섬유화 인간 켈로이드 반흔 섬유모세포 (KF116R) 세포를 20 pM, 200 pM, 20 nM 또는 200 nM의 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 1, 4, 7 또는 9일 동안 처리한 것은, 피브로넥틴 효소 면역검정 (EIA)에 기초하여, 인테그린, 콜라겐, 피브린 및 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 (예를 들어 신데칸)에 결합하는 세포외 매트릭스의 고분자량 (~440kDa) 당단백질의 분비의 유의한 시간 및 용량-의존성 감소를 가져왔다. 간략하게, KF116R 세포를 셀리서치코포레이션 (싱가포르)으로부터 획득하고, 2% FBS 및 1% 항생제로 보충된 MEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 하에 배양하였다. 세포를 20 pM, 200 pM, 20 nM 또는 200 nM의 서열식별번호: 19의 폴리펩티드로 처리하기 전 1일 동안 24-웰 플레이트에 2x10⁵개 세포/mL로 시딩하였다. 7 및 9일 처리 동안, 처리한 배지를 제5일에 교체하였다. 피브로넥틴의 측정을 위해, 제1 처리 후 1, 4, 7 및 제9일에 배지를 수집하고, 배지 내로 분비된 피브로넥틴의 양 (ng/mL)을 타카라 피브로넥틴 EIA 키트 (클론테크, Cat#MK115)를 사용하여 측정하였다. 데이터는 도 6에 제시되며, 이는 20 pM, 200 pM, 20 nM 또는 200 nM의 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 후 인간 켈로이드 반흔 섬유모세포 (KF116R) 세포로부터 배지 내로 분비된, 각각의 시점에 대해 배지 단독 대조군에 대해정규화된 피브로넥틴의 정규화된 양을 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 서열식별번호: 19의 폴리펩티드로의 처리가 인간 켈로이드 반흔 섬유모세포 (KF116R) 세포로부터 피브로넥틴의 분비를 감소시키는데 효과적이었다는 것을 보여준다. 반흔 형성 및 섬유증은 피브로넥틴 및 다른 ECM 성분의 과량 생산과 연관되기 때문에, 결과는 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 시사한다.

실시예 7

정상 인간 1차 섬유모세포로부터의 단백질 분비에 대한 예시적인 서열식별번호: 19 폴리펩티드의 효과

정상 인간 1차 섬유모세포 (HDFa)를 20 pM의 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 6일 동안 처리한 것은 수집된 배지의 질량 분광측정법 (MS) 단백질 분석에 기초하여 콜라겐 분비의 유의한 감소 (콜라겐 알파-1(I) 쇄, 57%, 콜라겐 알파-1(III) 쇄, 87%, 콜라겐 알파-2(I) 쇄, 47%) 및 락토트랜스페린의 유의한 감소 (53%)를 가져왔다. 간략하게, 성인 인간 피부 섬유모세포 (HDFa) (써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 C0135C)를 2% FBS 함유 MEM 배지에서 2주 동안 배양한 후에, 20 pM의 서열식별번호: 19의 폴리펩티드로 6일 동안 처리하고, 이어서 배지 단독에서 3일 동안 인큐베이션하였다 (n=3). 배지를 수집하고, 질량 분광측정법 (MS) 단백질 분석에 의해 단백질을 확인하고 정량하였다. 데이터는 도 7에 제시되며, 이는 비처리 및 처리된 1차 인간 섬유모세포로부터 수집된 배지 내의 확인된 단백질 및 각각의 단백질의 평균 양을 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 서열식별번호: 19의 폴리펩티드로의 처리가 콜라겐 및 락토트랜스페린의 분비를 감소시키는데 효과적이었고, 후자의 단백질은 정상 인간 1차 섬유모세포로부터 섬유모세포 수축성을 증가시키는 것으로 나타났음을 보여준다. 반흔 형성 및 섬유증은 콜라겐 및 섬유모세포 수축성의 과량 생산과 연관되기 때문에, 결과는 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 시사한다.

실시예 8

켈로이드 반흔 유래된 인간 섬유모세포에서의 세포 유전자 발현에 대한 예시적인 서열식별번호: 20 및 21 폴리펩티드의 효과.

켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포를 100 nM 또는 1 μM의 BoNT/DC의 결합 도메인 (H_C/DC) (서열식별번호: 20)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 1 μM의 BoNT/A의 결합 도메인의 N-말단 절반 (H_CN/A) (서열식별번호: 21)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 것은 qPCR에 기초하여 섬유모세포-관련 유전자 발현의 유의한 변화를 가져왔다. 간략하게, 인간 피부 켈로이드 섬유모세포 (KF116R)를 2% FBS 함유 MEM 배지에서 2주 동안 배양한 후에 100 nM 또는 1 μM의 서열식별번호: 20의 폴리펩티드 또는 1 μM의 서열식별번호: 21의 폴리펩티드로 1일 (24시간) 동안 처리하였다. ECM 조직화 (COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, COL6A3, COL7A1, ELN, FBN1 및 FN1) 및 재형성 (MMP1, MMP2, MMP3 및 TIMP1) 및 섬유증 및 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 이행 (TGFB1, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2, CTGF, S100A4, VIM, ACTA2, CD34 및 SERPINE1)과 관련된 것으로 공지된 섬유모세포-관련 유전자의 발현을 평가하였다. cDNA를 슈퍼스크립트 빌로 cDNA 합성 키트 (써모 사이언티픽 #11754050)를 사용하여 역전사에 의해 생성하고, 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스 (써모 사이언티픽 #4444557) 중에 추가로 희석한 후에, 택맨 패스트 플레이트 (써모 사이언티픽 # 4413259) 내의 지정된 웰로 옮겼다. 어플라이드 바이오시스템즈 7500 패스트 리얼-타임 PCR 시스템 (써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 실시간 qPCR을 수행하였다. 각각의 시점에서 비처리 대조군 대비 배수 변화로서 유전자 발현의 변화를 계산하였다 (ΔΔCT = ΔCT (유전자 (시험) - GAPDH (시험)) - ΔCT (유전자 (비처리 대조군) - GAPDH (비처리 대조군)); 배수 변화 = 2(-ΔΔCT)). 2 초과 또는 0.5 미만의 배수 변화 (p-값 ≤0.05)를 유의한 변화로 간주한다. 예시적인 유전자 (23종)가 도 8에 제시되며, 이는 100 nM (진한 막대) 또는 1 μM (빗금친 막대)의 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 1 μM (비어있는 막대)의 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리한 후 켈로이드 반흔 인간 1차 섬유모세포에서의 나타낸 유전자 발현의 배수 변화를 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 21의 폴리펩티드로의 처리가 ECM 조직화 및 재형성 및 섬유증 및 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 이행과 관련된 것으로 공지된 유전자의 발현에 영향을 미쳤고; 서열식별번호: 20의 폴리펩티드에 의해 유도된 효과가 서열식별번호: 21의 폴리펩티드에 의해 유도된 효과보다 더 유의한 것으로 보였다는 것을 나타낸다. 결과는 BoNT/DC의 결합 도메인 (H_C/DC) 또는 결합 도메인의 N-말단 절반 (H_CN/A)에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 갖는다는 것을 시사한다. 2종의 상이한 BoNT 혈청형의 결합 도메인에 실질적으로 상응하는 폴리펩티드가 켈로이드 반흔 유래된 인간 섬유모세포에서의 유전자 발현에 영향을 미치는 관찰은 다른 추가의 BoNT 혈청형이 동일한 반흔형성 방지 및 항섬유화 효과를 가질 수 있다는 것을 시사한다.

서열 정렬 소프트웨어 툴을 사용하여, 상이한 BoNT 혈청형들 사이에서 쌍별 서열 정렬을 수행하였으며; 여기서 BoNT/A1의 결합 도메인 (H_C/A)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 1) (진뱅크 # AF488749)을 하기 BoNT 단백질로부터의 결합 도메인의 아미노산 서열과 정렬시켰다: BoNT/B1 (진뱅크 # BAE48264): BoNT/C1 (진뱅크 # P18640); BoNT/D (진뱅크 # P19321); BoNT/DC (진뱅크 # EF378947); BoNT/E (진뱅크 # AFV91344); BoNT/F (진뱅크 # ABS41202); 및 BoNT/G (진뱅크 # X74162). 표 2에 제시된 결과는 BoNT/A1과 다른 BoNT 혈청형, 예를 들어 B1, C1, DC, E, F 및 G사이의 아미노산 수준에서의 퍼센트 동일성 및 상동성이 BoNT/A1과 BoNT/DC 사이의 퍼센트 동일성 및 상동성과 유사하다는 것을 나타냈다. 구체적으로, BLAST 정렬에 따르면, H_C/A 및 H_C/DC는 아미노산 잔기 수준에서 33% 동일하고 54% 유사하며 (컨센서스), 이는 모든 다른 혈청형과 유사하다 (31-51% 동일하고 49-67% 유사하다 (컨센서스)). 실시예 5에 제시된 바와 같이, BoNT/DC의 결합 도메인 (H_C/DC)은 섬유모세포에 영향을 미치는데 BoNT/A의 결합 도메인과 같이 효과적이었다. 따라서, 실시예 5로부터 수득된 BLAST 정렬 및 결과는 BoNT/A 및 BoNT/DC에 추가로 다른 BoNT 혈청형도 인간 피부에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다.

표 2: BLAST를 사용하는 다양한 BoNT 혈청형으로부터 유래된 Hc 단백질들 사이의 쌍별 다중 서열 정렬.

표 2에 제시된 바와 같이, 상이한 BoNT 혈청형들 사이의 정렬 수준은 점수에 의해 나타낸 것처럼 매우 높다. 점수는 미가공 점수 또는 비트 점수의 형태로 제공되며, 여기서 미가공 점수는 잔기 치환의 매트릭스를 사용하여 도구에 의해 직접적으로 컴퓨터 계산된 것이고, 비트 점수는 서열 길이 및 갭 크기를 고려한 정규화된 점수이다. 생물정보학에서 이해되는 바와 같이, 283 비트의 점수는 제시된 것보다 더 우수한 정렬이 발견되고, 검색은 2²⁸³ (또는 2x10⁸⁵) 유닛의 아미노산 공간을 포괄해야 할 것임을 의미한다. 따라서, 비트 점수가 높을수록 매치가 더 고도로 유의하다.

실시예 9

켈로이드 반흔을 치료하기 위한 본 개시내용의 측면에 따라 제공된 예시적인 폴리펩티드의 용도

광 VI형 피부를 갖는 20세 아프리카인 여성은 귀 피어싱 후 발생한 2년 지난 켈로이드 반흔이 좌측 귀에 남아있는 것으로 나타났다. 그녀는 H_C/A 폴리펩티드로 총 3개월의 기간 동안 1개월 1회 치료를 받았다.

H_C/A 폴리펩티드 분말을 염수 중에 용해시켜 (4.5 ng 진공-건조된 분말을 0.25 mL의 멸균 0.9% 염수 중에 재구성함) 1.8 ng/0.1 mL의 용액을 구성하고, 약간 창백해 보일때까지 9-게이지 바늘 (0.3 mm x 0.8 mm)을 사용하여 그녀의 반흔이 있는 신체 내로 주사하였다. 용량은 0.9 ng/cm³ 병변이었다.

기준선 및 치료 6개월 후에 평가를 수행하였다.

기준선과 비교하여, 치료 6개월 후에, 그녀의 반흔은 의사 종합 평가 및 대상체 만족도 점수에 기초하여 양호한 내지 탁월한 개선을 나타냈으며, 홍반, 가려움 및 유연성의 유의한 개선이 있었다. 이러한 개선은 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 상응하는 폴리펩티드로 처리된 섬유모세포가 S100A4 및 ACTA2를 포함한 근섬유모세포 형성과 연관된 유전자의 감소된 발현, 및 ECM 피부 조직 구조를 적절히 유지, 재생 및 복구하는 기능을 하는 피브로넥틴, 콜라겐 및 MMP1을 포함한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 및 프로테이나제의 조정된 발현 및 분비를 갖는 것으로 밝혀진 실시예 1, 3, 5, 6 및 7에 기재된 실험 데이터와 일치하였다.

실시예 10

간 섬유증을 치료하기 위한 본 개시내용의 측면에 따라 제공된 예시적인 폴리펩티드의 용도

알콜 남용 이력을 갖는 55세 남성은 피로 및 식욕 상실의 호소증상을 나타냈다. 혈액 시험으로부터 그는 간 효소가 상승된 것으로 결정되었고, 간 생검에 의해 확인한 후 그는 2기 간 질환인 간 섬유증을 갖는 것으로 진단되었다. 그의 간 부피 (간 크기)는 자기 공명 영상화 (MRI)에 의해 대략 1000 cm³인 것으로 결정되었다. 그는 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 총 3개월의 기간 동안 1개월 1회 치료를 받았다.

(H_C/A) 폴리펩티드 분말을 염수 중에 용해시키고, 4.5 ng 진공-건조된 분말을 0.25 mL의 멸균 0.9% 염수 중에 용해시켜 1.8 ng/0.1 mL의 용액을 구성하고, 간 내로 초음파 시각적 안내를 사용하여 경피로 주사하였다. 용량은 0.9 ng/cm³ 간의 이환 영역이었다. 총 90 ng을 각각의 (100개) 주사 부위에 50 μL (0.9 ng)로 주사하였다.

기준선 및 치료 6개월 후에 평가를 수행하였다.

기준선과 비교하여, 치료 6개월 후에, 간 효소 및 간 크기의 유의한 감소가 측정되었고, 환자는 에너지 수준 및 식욕의 개선을 보고하였다. 이러한 개선은 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 상응하는 폴리펩티드로 처리된 섬유모세포가 S100A4 및 ACTA2를 포함한 근섬유모세포 형성과 연관된 유전자의 감소된 발현, 및 ECM 조직 구조를 적절히 유지, 재생 및 복구하는 기능을 하는 피브로넥틴, 콜라겐 및 MMP1을 포함한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 및 프로테이나제의 조정된 발현 및 분비를 갖는 것으로 밝혀진 실시예 1, 3, 5, 6 및 7에 기재된 실험 데이터와 일치하였다.

실시예 11

섬유화 방광을 치료하기 위한 본 개시내용의 측면에 따라 제공된 예시적인 폴리펩티드의 용도

55세 남성 환자는 만성 요의를 포함한 섬유화 방광 증상을 1일 50회까지 나타냈다. 그는 치료를 위해 비뇨기과 클리닉에 의뢰되었다. 의뢰된 비뇨기과 의사는 H_C/A 펩티드가 그의 상태를 치료하는데 사용될 것을 권장하였다. 1 μM 농도의 H_C/A를 함유하는 용액을 승인된 주사 패러다임당 30개 부위 (방광 기저 내의 15개 부위 (삼각부 내의 2개 포함) 및 후방-측벽 내의 방광 중앙선 및 그 아래의 15개 부위) 내로 주사하였다. 제2 치료 2주 후 점검에서, 환자는 요의의 50% 감소와 함께 삶의 질에 있어서 유의한 개선을 보고하였다. 이러한 개선은 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 상응하는 폴리펩티드로 처리된 섬유모세포가 S100A4 및 ACTA2를 포함한 근섬유모세포 형성과 연관된 유전자의 감소된 발현, 및 ECM 조직 구조를 적절히 유지, 재생 및 복구하는 기능을 하는 피브로넥틴, 콜라겐 및 MMP1을 포함한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 및 프로테이나제의 조정된 발현 및 분비를 갖는 것으로 밝혀진 실시예 1, 3, 5, 6 및 7에 기재된 실험 데이터와 일치하였다.

실시예 12

양성 전립선 비대증의 증상을 치료하기 위한 본 개시내용의 측면에 따라 제공된 예시적인 폴리펩티드의 용도

양성 전립선 비대증의 하부 요로 증상을 치료하기 위한 2가지 용량의 H_C/A 펩티드를 사용한 2-단계, 다기관, 이중 맹검, 무작위화 II상 임상 시험을 수행하였다.

미국 비뇨기과 협회 증상 지수 8 이상, 최대 요 유량 초당 15 ml 미만, 배설 부피 125 ml 이상 및 배설후 잔류 350 ml 이하의 임상 진단된 양성 전립선 비대증을 갖는 50세 이상의 남성에게 2.5 또는 5 ng의 H_C/A 펩티드를 전립선 경직장 주사하도록 무작위화하였다. 1차 결과는 미국 비뇨기과 협회 증상 지수 및/또는 최대 요 유량 및 안전성에 있어서 기준선으로부터 3개월까지 적어도 30% 개선이었다. 남성을 12개월 동안 추적하였다.

총 134명의 남성을 무작위화하고, 치료하고 (2.5 ng으로 68명, 5 ng으로 66명), 3개월에 131명을 평가하고 12개월에 108명을 평가하였다. 각각의 용량은 3-개월 1차 결과 기준을 충족시켰다. 2.5 ng 부문에서, 평균 기준선 미국 비뇨기과 협회 증상 지수 18.8이 각각 3개월 및 12개월에 7.1 및 6.9만큼 감소하였다. 5 ng 부문에서, 기준선 19.5가 각각 8.9 및 7.1만큼 감소하였다. 2.5 단위 부문에서, 초당 10.0 ml의 평균 기준선 최대 요 유량은 각각 2.5 및 2.2만큼 증가하였고, 5 ng 부분에서, 기준선 9.6은 각각 2.6 및 2.3만큼 증가하였다.

2.5 ng 또는 5 ng 단위의 H_C/A 펩티드의 전립선내 주사는 치료 효능 및 안전성에 대한 미리 결정된 기준을 통과하였고, 어느 한 용량을 사용한 무작위화 시험은 보증되었다. 유사한 효능으로 인해 2.5 ng 단위 용량이 바람직할 수 있다. 이러한 개선은 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 상응하는 폴리펩티드로 처리된 섬유모세포가 S100A4 및 ACTA2를 포함한 근섬유모세포 형성과 연관된 유전자의 감소된 발현, 및 ECM 조직 구조를 적절히 유지, 재생 및 복구하는 기능을 하는 피브로넥틴, 콜라겐 및 MMP1을 포함한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 및 프로테이나제의 조정된 발현 및 분비를 갖는 것으로 밝혀진 실시예 1, 3, 5, 6 및 7에 기재된 실험 데이터와 일치하였다.

실시예 13

급성 췌장염에 대한 세룰레인-유도 생체내 마우스 모델에서의 본 개시내용의 측면에 따라 제공된 예시적인 폴리펩티드의 평가

시간당 50 mg/kg 세룰레인을 염수 대조군과 함께 7회 또는 12회 복강내 주사하여 과다자극 급성 췌장염을 유도하였다. 마우스에게 제1 세룰레인 주사 2시간 후에 시작하여 10, 50, 100 또는 250 ng/kg의 H_C/A 펩티드를 7회 복강내 주사하였다. 마우스를 질환 유도 12시간 후에 희생시키고, 혈청 아밀라제, 췌장 부종, 췌장 트립신 활성, 췌장 미엘로퍼옥시다제 활성 및 혈청 인터류킨 (IL-6)에 대해 평가하였다 (비처리 세룰레인 군에 대해 정규화됨).

결과: 세룰레인 급성 췌장염의 중증도에 대한 H_C/A 펩티드의 용량-의존성 보호 효과가 12시간에 관찰되었다. 이러한 개선은 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 상응하는 폴리펩티드로 처리된 섬유모세포가 S100A4 및 ACTA2를 포함한 근섬유모세포 형성과 연관된 유전자의 감소된 발현, 및 ECM 조직 구조를 적절히 유지, 재생 및 복구하는 기능을 하는 피브로넥틴, 콜라겐 및 MMP1을 포함한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 및 프로테이나제의 조정된 발현 및 분비를 갖는 것으로 밝혀진 실시예 1, 3, 5, 6 및 7에 기재된 실험 데이터와 일치하였다.

실시예 14

복강내 유착을 예방하기 위한 본 개시내용의 측면에 따라 제공된 예시적인 폴리펩티드의 용도

수술후 복강내 유착 (PIA)은 외과의사가 개복술 후에 직면하는 가장 중요한 문제 중 하나이다. 본 연구에서, 본 발명자들은 실험적 복강내 유착을 갖는 래트에서 복강내 유착의 예방에 대한 다양한 투여량의 H_C/A 펩티드의 국부 적용의 효과를 평가하는 것을 목표로 하였다.

40마리의 위스타 알비노 암컷 래트를 무작위로 4개의 군으로 분리하였다. 4개의 군을 하기와 같이 결정하였다: 대조군 (군 1, n = 10); 모의 (군 2, n = 10); 10-mg/kg 저용량 H_C/A 펩티드 (군 3, n = 10) 및 30-mg/kg 고용량 HC/A 펩티드 (군 4, n = 10). 모든 래트의 맹장에 장막하 손상을 생성하였다. 제5일에 개복술을 수행하였다. 유착 점수, 조직병리학적 검사 및 E-카드헤린 발현 수준을 평가하였다.

결과: 군 1 및 2 (대조군 및 모의)에 대한 일반적 유착 점수는 군 4 (고용량 H_C/A 펩티드)와 비교하였을 때 유의하게 높은 것으로 결정되었다 (P < 0.001). 일반적 유착 점수의 측면에서 군 3과 군 4 (저용량 대 고용량 H_C/A 펩티드) 사이에 유의한 차이가 있는 것으로 또한 결정되었다 (P <0.05). 쌍 비교에서, 신생혈관형성, 섬유모세포 밀도, 콜라겐 침착 및 염증 세포 수의 측면에서 군 1과 군 2 (대조군 및 모의)와 비교하였을 때 고용량 H_C/A 펩티드 군 (군 4)의 유의한 감소가 있는 것으로 결정되었다 (P <0.05).

결론: 본 연구에서, 고용량 H_C/A 펩티드는 수술후 PIA의 예방에서 효과적인 작용제인 것으로 결정되었다. 이러한 개선은 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 상응하는 폴리펩티드로 처리된 섬유모세포가 S100A4 및 ACTA2를 포함한 근섬유모세포 형성과 연관된 유전자의 감소된 발현, 및 ECM 조직 구조를 적절히 유지, 재생 및 복구하는 기능을 하는 피브로넥틴, 콜라겐 및 MMP1을 포함한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 및 프로테이나제의 조정된 발현 및 분비를 갖는 것으로 밝혀진 실시예 1, 3, 5, 6 및 7에 기재된 실험 데이터와 일치하였다. 이는 또한 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)이 섬유모세포 수축성을 감소시킨다는 것을 보여주는 실시예 4와 일치한다.

실시예 15

무반흔 상처 치유를 촉진하기 위한 래트 모델에서의 본 개시내용의 측면에 따라 제공된 예시적인 폴리펩티드의 용도

260g-310g 범위인 6마리의 마취된 CD 무모 암컷 래트에서 상처를 생성하였다. 멸균 생검 펀치를 사용하여 중앙선 이외에 평균 직경 11.5 mm를 갖는 2개의 대칭적인 전체-두께 절제 상처를 생성하였다.

H_C/A 펩티드를 멸균 포스페이트-완충 염수 중에 최종 농도 5, 10 및 20 pM으로 용해시키고, 절제 가장자리 주변의 7-9개 부위에 주사 부위당 25 μL로 피내로 주사하였다. 비교를 위해, 멸균 포스페이트-완충 염수를 병행하여 주사하였다.

제0일, 제3일, 제7일, 제10일, 제14일 및 제21일에 개별 상처를 사진찍고 측정하였다. 제21일에 조직학에 의해 콜라겐 구조에 접근하도록 조직 생검 샘플을 수집하였다.

결과: 초기, 제3일-제9일에, H_C/A 펩티드 처리된 상처가 더 느리게 치유되었다. 그러나, 제21일에 HC/A 펩티드 처리군에서 반흔은 더 짧고, 더 편평하고, 덜 가시적이었고, 콜라겐 섬유는 더 조직화된 것으로 보였다.

결론: 결과는 수술 직후 H_C/A 펩티드를 주사하는 것이 더 적은 반흔형성으로 상처를 치유한다는 것을 시사한다. 이러한 개선은 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)에 상응하는 폴리펩티드로 처리된 섬유모세포가 S100A4 및 ACTA2를 포함한 근섬유모세포 형성과 연관된 유전자의 감소된 발현, 및 ECM 조직 구조를 적절히 유지, 재생 및 복구하는 기능을 하는 피브로넥틴, 콜라겐 및 MMP1을 포함한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 및 프로테이나제의 조정된 발현 및 분비를 갖는 것으로 밝혀진 실시예 1, 3, 5, 6 및 7에 기재된 실험 데이터와 일치하였다. 이는 또한 BoNT/A의 결합 도메인 (H_C/A)이 섬유모세포 수축성을 감소시킨다는 것을 보여주는 실시예 4와 일치한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 상기 단락에 기재되어 있다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시이며 제한하는 것으로 의도되지는 않는다. 상충하는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.

본원에 인용된 모든 미국 특허 및 공개 또는 비공개 미국 특허 출원은 참조로 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개 외국 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개 참고문헌, 문서, 원고, 과학 문헌은 본원에 참조로 포함된다. 본원에 언급된 과학 데이터베이스 (예를 들어, PUBMED, NCBI, GENBANK, EBI)에 관한 모든 식별자 및 수탁 번호는 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> JACKY, BIRGITTE P.S. BRIDEAU-ANDERSEN, AMY YOU, HUI FRAIL, DONALD E. BRIN, MITCHELL F. <120> BOTULINUM TOXIN CELL BINDING DOMAIN POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE FOR TREATMENTS OF FIBROSIS ASSOCIATED DISORDERS <130> 19980-WO-A-PCT-NTB <140> <141> <150> 62/727,640 <151> 2018-09-06 <150> 62/608,119 <151> 2017-12-20 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 421 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 1 Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu 1 5 10 15 Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp 20 25 30 Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys 35 40 45 Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu 50 55 60 Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser 65 70 75 80 Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn 85 90 95 Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu 100 105 110 Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln 115 120 125 Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr 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Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu 100 105 110 Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln 115 120 125 Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile 130 135 140 Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu 145 150 155 160 Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn 165 170 175 Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile 180 185 190 Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu 195 200 205 Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp 210 215 220 Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn 225 230 235 240 Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg 245 250 255 Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn 260 265 270 Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys 275 280 285 Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg 290 295 300 Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr 305 310 315 320 Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile 325 330 335 Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn 340 345 350 Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn 355 360 365 Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala 370 375 380 Lys Leu Val Ala Ser Asn Leu Ser Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser 385 390 395 400 Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp 405 410 415 Gly Glu Arg Pro Leu 420 <210> 27 <211> 421 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 27 Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu 1 5 10 15 Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp 20 25 30 Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys 35 40 45 Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu 50 55 60 Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser 65 70 75 80 Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn 85 90 95 Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu 100 105 110 Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln 115 120 125 Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile 130 135 140 Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu 145 150 155 160 Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn 165 170 175 Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile 180 185 190 Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu 195 200 205 Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp 210 215 220 Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn 225 230 235 240 Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg 245 250 255 Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn 260 265 270 Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys 275 280 285 Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg 290 295 300 Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr 305 310 315 320 Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile 325 330 335 Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn 340 345 350 Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn 355 360 365 Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala 370 375 380 Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser 385 390 395 400 Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp 405 410 415 Arg Glu Arg Pro Leu 420

Claims (38)

1. 세포외 매트릭스 (ECM) 질환, 결합 조직 질환, 내피 질환 또는 섬유화 장애의 치료 및/또는 그의 발생의 감소를 필요로 하는 대상체에게 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 분자량이 약 4 kDa 내지 약 60 kDa인 폴리펩티드의 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 피부 질적 속성의 조정은 안면 근육의 마비를 수반하지 않는 것인, 상기 대상체에서 세포외 매트릭스 (ECM) 질환, 결합 조직 질환, 내피 질환 또는 섬유화 장애를 치료하고/거나 그의 발생을 감소시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 섬유화 장애가 피부 반흔, 상처 반흔, 외과적 반흔, 수술후 복강내 유착, 섬유종, 간 섬유증, 간경변증, 췌장염, 양성 전립선 비대증, 섬유화 방광, 간질성 방광염, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 사구체경화증, 심방 섬유증, 심내막심근 섬유증, 신경교 반흔, 동맥 강성, 관절섬유증, 낭성 섬유증, 비-낭성 섬유증, 크론병, 듀피트렌 구축, 종격 섬유증, 골수섬유증, 페이로니병, 신원성 전신 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 복막후 섬유증, 유착성 피막염, 혼합 결합 조직 질환, 안구 섬유증, 골관절염, 경피증 및 천식으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 섬유화 장애가 섬유화 유방 질환; 켈로이드 반흔; 간 섬유증; 섬유화 방광; 섬유성 조직의 증식증, 예를 들어 양성 전립선 비대증; 췌장염; 유착, 예를 들어 복강내 유착; 반흔형성, 예를 들어 비대성 반흔 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 분자량이 약 10 kDa 내지 약 60 kD이거나 또는 약 12 kDa 내지 약 50 kDa인 방법.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A), 보툴리눔 독소 혈청형 B (BoNT/B), 보툴리눔 독소 혈청형 C₁ (BoNT/C₁), 보툴리눔 독소 혈청형 D (BoNT/D), 보툴리눔 독소 혈청형 E (BoNT/E), 보툴리눔 독소 혈청형 F (BoNT/F), 보툴리눔 독소 혈청형 F (BoNT/FA), 보툴리눔 독소 혈청형 G (BoNT/G), 보툴리눔 독소 혈청형 H (BoNT/H), 보툴리눔 D/C 모자이크 (BoNT/DC), 보툴리눔 C/D 모자이크 (BoNT/CD), 보툴리눔 독소 혈청형 X (BoNT/X) 및 엔테로코쿠스(Enterococcus) 종 BoNT J (eBoNT/J)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 12-18 및 서열식별번호: 25-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 30% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 12-18 및 서열식별번호: 25-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 것인 방법.
10. 보툴리눔 독소의 결합 도메인의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 분자량이 약 1 kDa 내지 약 90 kDa인 폴리펩티드.
11. 보툴리눔 독소의 결합 도메인에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분자량이 약 1 kDa 내지 약 90 kDa인 폴리펩티드.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 분자량이 약 10 kDa 내지 약 60 kD이거나 또는 약 12 kDa 내지 약 50 kD인 폴리펩티드.
13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A), 보툴리눔 독소 혈청형 B (BoNT/B), 보툴리눔 독소 혈청형 C₁ (BoNT/C₁), 보툴리눔 독소 혈청형 D (BoNT/D), 보툴리눔 독소 혈청형 E (BoNT/E), 보툴리눔 독소 혈청형 F (BoNT/F), 보툴리눔 독소 혈청형 F (BoNT/FA), 보툴리눔 독소 혈청형 G (BoNT/G), 보툴리눔 독소 혈청형 H (BoNT/H), 보툴리눔 D/C 모자이크 (BoNT/DC), 보툴리눔 C/D 모자이크 (BoNT/CD), 보툴리눔 독소 혈청형 X (BoNT/X) 및 엔테로코쿠스 종 BoNT J (eBoNT/J)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 혈청형 A (BoNT/A)가 아닌 것인 폴리펩티드.
15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인이 보툴리눔 독소의 중쇄의 결합 도메인 영역 (H_C)을 포함하는 것인 폴리펩티드.
16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인이 보툴리눔 독소의 중쇄의 결합 도메인 영역의 아미노 말단 (H_CN)을 포함하는 것인 폴리펩티드.
17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR1, MMP1, MMP3, TIMP1, FGF7 및 TP63으로부터 선택된 복수의 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐의 발현을 조정할 수 있는 폴리펩티드.
18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR1, MMP1, MMP3, TIMP1, FGF7, TP63, SOD2, UBD, HAS2, HAS3, ADAMTS1, IGF-1, IL-6, IL-32, CCL2, BDKRB1, S100A4 및 ACTA2로부터 선택된 복수의 유전자의 발현을 조정할 수 있는 폴리펩티드.
19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유모세포 수축성 또는 근섬유모세포 형성과 연관된 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 폴리펩티드.
20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유모세포, 반흔 유래된 섬유모세포, 섬유화 세포, 암 세포, 각질세포, 멜라닌세포, 피지세포, 면역 세포 또는 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 세포에서 유전자 발현을 상승시킬 수 있는 폴리펩티드.
21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포의 기능적 특색을 변화시킬 수 있는 폴리펩티드.
22. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 보툴리눔 독소 엔도펩티다제 활성을 갖거나 또는 보툴리눔 독소 엔도펩티다제 활성이 결여된 폴리펩티드.
23. 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄의 아미노 말단을 포함하는 보툴리눔 독소 전위 도메인 (H_N)이 결여된 폴리펩티드.
24. 제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 12-18 및 서열식별번호: 25-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 30% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
25. 제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 12-18 및 서열식별번호: 25-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
26. 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
27. 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제26항의 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
28. 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제26항의 융합 단백질 및 그의 국소 또는 경피 전달을 위한 허용되는 담체를 포함하는 국소 또는 경피 제약 조성물.
29. 1개 이상의 패키지에, 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제26항의 융합 단백질 및 투여에 대한 지침서를 포함하는 키트.
30. (a) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 약 1 kDa 내지 약 90 kDa인 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA;
    (b) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 약 1 kDa 내지 약 90 kDa인 폴리펩티드를 코딩하는 합성 DNA;
    (c) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 약 1 kDa 내지 약 90 kDa인 폴리펩티드를 코딩하는 코돈-최적화된 DNA; 및
    (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA에 상보적인 DNA
    로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드.
31. (a) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 50 kDa 미만인 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA;
    (b) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 50 kDa 미만인 폴리펩티드를 코딩하는 합성 DNA;
    (c) 보툴리눔 독소의 결합 도메인을 포함하는, 분자량이 50 kDa 미만인 폴리펩티드를 코딩하는 코돈-최적화된 DNA; 및
    (d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA에 상보적인 DNA
    로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드.
32. 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 3-5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 7-10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 12-18 및 서열식별번호: 25-27을 코딩하는 핵산에 대해 적어도 50% 서열 상동성을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
34. 제33항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
35. 제34항에 있어서, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)이 아닌 숙주 세포.
36. 1개 이상의 패키지에, 제33항의 벡터 및 적합한 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것에 대한 지침서를 포함하는 키트.
37. 제33항의 벡터 또는 제34항의 숙주 세포 또는 제29항의 숙주 세포 및 제약 부형제를 포함하는 조성물.
38. 대상체에게 제37항의 조성물을 투여하여 폴리펩티드의 발현을 달성하는 것을 포함하는, 섬유증 연관 장애를 치료하거나 그의 발생을 감소시키는 방법.

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