JP2004512004A - ボツリヌス神経毒に対する組換えワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
発明の背景
発明の分野
本発明は、ボツリヌス神経毒(BoNT)の防御エピトープを含むポリペプチドをコードする合成遺伝子の調製と発現に関する。本発明はまた、発現されたペプチドを使用してボツリヌスに対するワクチン接種を施す方法に関する。
【0002】
関連技術
胞子形成性で偏性嫌気性のグラム陽性バチルスであるクロストリジウム(Clostridium)は、8つの形の抗原として区別可能な外毒素を産生する。破傷風神経毒(Tetanus neurotoxin)(TeNT)は、破傷風菌(Clostridium tetani)により産生されるが、一方ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)は、特異的な中和により血清学的に区別される7つの異なる神経毒を産生する。ボツリヌス神経毒(BoNT)は、血清型A、B、C1、D、E、F、およびGと呼ばれる。ボツリヌス神経毒(BoNT)は、最も毒性の高い公知の物質であり、そしてボツリヌス中毒症の原因物質である。BoNTは、神経筋接合部で神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を阻害することにより、その作用を発揮し(Habermann, E.ら, (1986),「クロストリジウムの神経毒:細胞および分子レベルでの取扱いと作用」, Cur. Top. Microbiol. Immunol., 129:93−179;Schiavo, G.ら, (1992a),「破傷風およびボツリヌス−B神経毒はシナプトブレビン(Synaptobrevin)のタンパク分解性切断により神経伝達物質の放出をブロックする」, Nature, 359:832−835;Simpson, L. L., (1986),「ボツリヌス毒素と破傷風毒素の分子薬理学」, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 26:427−453)、これによって弛緩性麻痺の症状に至らせる。実際、毒素のほんの少数の分子だけで、神経細胞の作用を破壊できる。特異的な神経毒に対して誘導されるポリクローナル抗体は、その毒素の毒性作用を中和することができるが、別の毒素の血清型を交差中和できない。すなわち、7つ全ての毒素に対して防御するためには、7つのワクチンが必要である。
【0003】
ボツリヌス神経毒は、単一の150kDaポリペプチド鎖として翻訳され、次いで翻訳後ニックを入れられて、ジスルフィド結合により連結されたままの、100kDa重鎖と50kDa軽鎖とからなる二鎖を形成する(DasGupta, B. R.ら, (1972),「ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)A、B、およびE型毒素における共通のサブユニット構造」, Biophys. Res. Commun., 48:108−112;DasGupta, B. R., (1989),「ボツリヌス神経毒の構造」, Botulinum Neurotoxin and Tetanus Toxin, (Simpson, L. L.編), pp. 53−67, Academic Press, New York)。クロストリジウム株の多くは特異的な内因性プロテアーゼを含み、該プロテアーゼはアミノ末端から分子中へのおよそ3分の1に位置するプロテアーゼ感受性ループで毒素を活性化する。還元および分画(電気泳動またはクロマトグラフィーによる)によって、2つの鎖を分離することができる。一方の鎖は、約100kDaのMrを持ち重鎖と呼ばれ、他方の鎖は、約50kDaのMrを持ち軽鎖と呼ばれる。
【0004】
神経中毒の作用機序は、それぞれ神経毒タンパク質の別々の部分により遂行される3つの重要な事象の相互作用により行われる。最初に、重鎖のカルボキシ側半分(断片CまたはHC)が、コリン作動性神経細胞への受容体特異的結合のために必要とされる(Black, J. D.ら, (1986),「神経終末との125I−ボツリヌス神経毒の相互作用。I.運動神経上のAおよびB型に対する区別可能な膜アクセプターの超微細構造オートラジオグラフィーによる局在化と定量」, J. Cell Biol., 103:521−534;Nishiki, T.−I.ら, (1994),「ラット脳シナプトソームにおけるボツリヌス菌(Clostridium botulinum)B型神経毒に対するタンパク質受容体の同定」, J. Biol. Chem., 269:10498−10503;Shone, C. C.ら, (1985),「トリプシンによるボツリヌス菌(Clostridium botulinum)A型神経毒の不活化および2つのトリプシン性断片の精製。重鎖サブユニットのCOOH末端付近のタンパク分解作用が毒素結合活性を破壊する」, Eur. J. Biochem., 151:75−82)。ポリシアロガングリオシド(van Heyningen, W. E., (1968),「破傷風」, Sci. Am., 218:69−77)が、毒素に対する受容体として作用しうることを示唆する証拠が存在するが、特異的受容体を支持するデータは不確かなままである(Middlebrook, J. L., (1989),「タンパク質毒素に対する細胞表面受容体」, Botulinum Neurotoxins and Tetanus Toxin, (Simpson, L. L.編) pp. 95−119, Academic Press, New York)。結合後、毒素は、受容体介在性エンドサイトーシスによりエンドソーム中にインターナリゼーションされる(Shone, C. C.ら, (1987),「ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)A型神経毒の重鎖サブユニットのNH2−末端からの50−kDa断片は脂質小胞においてチャネルを形成する」, Euro. J. Biochem., 167:175−180)。重鎖のアミノ末端の半分は、エンドソーム膜を横切る軽鎖の転座機序に関係していると考えられる(Simpson, 1986;Poulain, B.ら, (1991),「ボツリヌス神経毒Aからの重鎖および軽鎖並びに破傷風毒素の異種の組合せはアメフラシ(Aplysia)における神経伝達物質の放出を阻害する」, J. Biol. Chem., 266:9580−9585;Montal, M. S.ら, (1992),「破傷風およびボツリヌス神経毒の一次構造におけるイオンチャネル形成モチーフの同定」, FEBS, 313:12−18)。エンドソームの低pH環境は、転座ドメインのコンフォメーション変化を誘発し、これが軽鎖のためのチャネルを形成するかもしれない。中毒の最後の事象は、神経伝達物質の放出に必要な、重要なシナプス小胞タンパク質(Schiavo, 1992a;Oguma, K.ら, (1995),「ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)毒素の構造と機能」, Microbiol. Immunol., 39:161−168;Schiavo, G.ら, (1993),「ボツリヌス神経毒の血清型A、D、およびEの神経終末標的の同定」, J. Biol. Chem., 268:23784−23787;Shone, C. C.ら, (1993),「小胞結合膜タンパク質のアイソホーム−2の合成断片の、ボツリヌスB型神経毒によるタンパク分解性切断」, Eur. J. Biochem., 217:965−971)に及ぼす、軽鎖の亜鉛依存性エンドプロテアーゼ(Schiavo, 1992a;Schiavo, G.ら, (1992b),「破傷風毒素は亜鉛タンパク質であり、その神経伝達物質の放出の阻害およびプロテアーゼ活性は亜鉛に依存する」, EMBO J., 11:3577−3583)の酵素活性に関係する。BoNT血清型A、C1、およびEの軽鎖は、SNAP−25(M25,000のシナプトソーム結合タンパク質)を切断し、血清型B、D、F、およびGは、VAMP/シナプトブレビン(synaptobrevin)(シナプス小胞結合膜タンパク質)を切断し、そして血清型C1は、シナタキシン(synataxin)を切断する。BoNTによるSNAP−25、VAMP、またはシナタキシンの不活化によって、神経細胞がアセチルコリンを放出できなくなり、その結果、神経筋麻痺、さらに症状が未処置のままであれば死に至る可能性がある。
【0005】
ヒトボツリヌス中毒は一般に、A、B、E型毒素、または稀にF型毒素により引き起こされる。AおよびB型は、胃腸管の酵素による消化に抵抗する非常に毒性の高いタンパク質である。食物由来のボツリヌス中毒症は、汚染食物中に存在する毒素により引き起こされるが、創傷性および乳児ボツリヌス中毒症は、それぞれ閉鎖創および胃腸管中のインビボ増殖により引き起こされる。毒素は主として、神経筋接合部での神経伝達物質のアセチルコリンを阻害することにより作用して、麻痺を引き起こす。ボツリヌス中毒症を起こすための別の手段は、生物戦争で起きるかも知れない環境中への毒素の意図的な導入である。ボツリヌス中毒症の原因が、インビボ感染よりは毒素により引き起こされるとき、神経症候の発現は、通常突然であり、摂取後18〜36時間以内に起こる。呼吸不全における最も普通の直接の死因は、横隔膜麻痺である。手作りの缶詰食品は、最も普通の毒素源である。最も頻繁に指摘される毒素は、毒素Aであり、これを原因とするものは、ボツリヌス毒素に起因する罹患率の50%を超えている。
【0006】
少量のボツリヌス毒素でも重篤な病気を引き起こしうるため、毒素に暴露される実験室作業者のような人は、毒素を含む可能性のある試料はすべて、注意深く取り扱うことを身につける必要がある。また、このような作業者は、毒素に対するワクチン接種により病気から防御されることも提案される。さらに、軍人のような、吸入または摂取されうるボツリヌス毒素が環境中に存在しうる条件に暴露される人達は、毒素から防御する必要がある。
【0007】
BoNTの作用を破壊する物質は、1940年代から研究されている。1940年代のフォートディートリック(Fort Detrick)での初期の研究によって、血清型A、B、C1、D、およびE毒素から防御するためのトキソイドワクチンが開発されている。このトキソイドワクチンは、5種のボツリヌス菌(Clostridium botulinum)株を増殖させ、細胞溶解後に増殖培地から毒素を抽出および沈殿させることにより製造された。ホルマリンを粗調製物に加えることにより、神経毒を不活化した。残留ホルマリンは、毒素が非毒性のままであることを保証するため、ワクチン製品中に残しておいた。この製品は、水酸化アルミニウムに吸着させて混和した。現在、治験薬(IND)として利用可能な、血清型A〜Eまでに対する5価のトキソイドワクチン(Anderson, J. H.ら, (1981),「ボツリヌストキソイドの臨床評価」, Biomedical Aspects of Botulism, (Lewis, G. E.編), pp. 233−246, Academic Press, New York;Ellis, R. J., (1982),「疾病管理センターから入手可能な免疫生物学的物質および薬物。性状、勧告、有害反応および血清学的応答」, 第3版, Centers for Disease Control. Atlanta, GA;Fiock, M. A.ら, (1963),「ボツリヌス菌(Clostridiuni Botulinuni)の毒素に対する免疫の研究。IX.精製した5価ABCDEボツリヌストキソイドに対するヒトの免疫学的応答」, J. Immunol., 90:697−702;Siegel, L. S., (1988),「中和試験および酵素結合免疫吸着アッセイ(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)により測定されたボツリヌス5価(ABCDE)トキソイドに対するヒトの免疫応答」, J. Clin. Microbiol., 26:2351−2356)は、危険な個人の特定の集団、すなわちBoNTを取り扱う科学者および医療従事者、並びに兵器として使用される形態の毒素に曝されるかもしれない我々の軍隊を免疫するために使用されている。血清型A、B、およびEは、ヒトにおけるボツリヌス中毒症の大発生に最も関係が深いが、F型も診断されている(Midura, T. F.ら, (1972),「ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)F型:猟獣乾燥肉からの単離」, Appl. Microbiol., 24:165−167;Green, J.ら, (1983),「ヒトボツリヌス中毒症(F型)−稀な型」, Am. J. Med., 75:893−895;Sonnabend, W. F.ら, (1987),「成人におけるボツリヌス菌(Clostridium botulinum)F型による腸内毒素感染。ギラン・バレー(Guillian−Barre)症候群に付随した症例」, Lancet, 1:357−361;Hatheway, C. L., (1976),「ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)F型のトキソイド:精製と免疫原性試験」, Appl. Environ. Microbiol., 31:234−242)。BoNTFに対する単独の1価のトキソイドワクチンが、INDステータス下で利用可能である。Hathewayは、BoNTFが、同種感染攻撃に対してモルモットを防御できることを証明した(Wadsworth, J. D. F.ら, (1990),「ボツリヌスF型神経毒」, Biochem. J., 268:123−128)。
【0008】
トキソイドワクチンは利用可能であるが、その現行の使用および製造の容易さには多くの欠点がある。第1に、ボツリヌス菌は胞子形成菌であるため、毒素ベースの製品を製造するためには専用の設備が必要とされる。専用の製造設備を必要とすることは、小さなことではない。1つのワクチンを製造するために、現存する設備を修復し改良するか、または新しい設備を建造し、そして現行の「医薬品の製造および品質管理に関する基準(Good Manufacturing Practices)」(cGMP)により設備を維持することは、極めてコストがかかる。第2に、ボツリヌス菌からの毒素産生の収率は、比較的低い。第3に、トキソイド化プロセスは、大量の毒素の取扱いを伴うため、危険であり、安全予防措置の追加は製造コストを上昇させる。第4に、A〜E型に対するトキソイド製品は、ワクチンの免疫原性または反応性に影響するかもしれないクロストリジウムタンパク質の粗抽出物からなり、そしてF型トキソイドは、部分的にしか精製されていない(IND 5077)。第5に、トキソイド化プロセスは、毒素を不活化するホルムアルデヒドの使用を伴うため、そして残留レベル(0.02%を超えない)のホルムアルデヒドが、毒素の再活性化を防止するために製剤の一部であるため、ワクチンは反応原性である。トキソイドワクチンの追加の成分は、保存剤であるチメロサール(0.01%)であるが、これもまた製品の反応原性を上昇させる。
【0009】
新世代の組換えワクチンの開発は、トキソイドに関係する問題の多くを軽減できるであろう。組換えワクチンは、専用の製造設備に対する必要性を排除するであろう。現在、組換え産物を製造できる多くのcGMP設備が存在し、かつ利用可能である。大量の毒素産生細菌を培養する必要はないであろう。遺伝子改変産物からの製造収率は高いことが期待される。ワクチンは初めから非毒性であるため、ホルマリンでワクチンを処理する必要はないであろう。組換え産物は、より純粋であり、反応原性が低く、かつ十分に性状が明らかにされるであろう。すなわち、専用の設備を維持するのに必要な支出がなく、かつ高い製造収率がワクチン製品のコストを低下させるため、組換え産物のコストは、トキソイドよりもはるかに低いと期待される。
【0010】
発明の概要
本発明の目的は、血清型A〜Gのボツリヌス神経毒に対する防御免疫を誘発できる免疫原性ペプチドを提供することである。
【0011】
本発明の別の目的は、ワクチンが神経毒それ自体として作用しない、ボツリヌス神経毒に対する防御免疫を誘発できるワクチンを提供することである。
【0012】
本発明のさらに別の目的は、ペプチドを発現する組換え生物を増殖させることによる、ボツリヌス神経毒に対するワクチンにおいて使用するための非毒性ペプチドの調製方法を提供することである。
【0013】
本発明のさらに別の目的は、組換え生物の培養物からの非毒性ペプチドの迅速かつ効率的な精製方法を提供することである。
【0014】
これらおよび他の目的は、本発明の1つ以上の以下の実施形態により達成される。
【0015】
1つの実施形態において、本発明は、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のカルボキシ末端部分(HC)をコードする核酸を提供する。BoNTは、BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C1、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択され、上記核酸は、大腸菌(Escherichia coli)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)から選択される組換え生物において発現可能である。好ましくは、核酸は、配列番号1(血清型A)、配列番号7(血清型B)、配列番号9(血清型C1)、配列番号11(血清型D)、配列番号13(血清型E)、配列番号15(血清型F)、および配列番号17(血清型G)から選択される核酸配列を含む。別の好適な実施形態において、核酸は、配列番号2(血清型A)、配列番号8(血清型B)、配列番号10(血清型C1)、配列番号12(血清型D)、配列番号14(血清型E)、配列番号16(血清型F)、および配列番号18(血清型G)から選択される、BoNTのHCアミノ酸配列をコードする。
【0016】
別の実施形態において、本発明は、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のアミノ末端部分(HN)をコードする核酸を提供する。BoNTは、BoNT血清型B、BoNT血清型C1、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択され、上記核酸は、大腸菌(Escherichia coli)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)から選択される組換え生物において発現可能である。好適な実施形態において、核酸は、配列番号21(血清型B)、配列番号23(血清型C1)、配列番号25(血清型D)、配列番号27(血清型E)、配列番号29(血清型F)、および配列番号31(血清型G)から選択される核酸配列を含む。あるいは、核酸は、配列番号22(血清型B)、配列番号24(血清型C1)、配列番号26(血清型D)、配列番号28 (血清型E)、配列番号30(血清型F)、および配列番号32(血清型G)から選択されるBoNTのHNアミノ酸配列をコードする。
【0017】
好ましくは、本発明の核酸は、合成核酸である。好適な実施形態において、核酸の配列は、HCをコードする少なくとも一部のコドンを、宿主生物(これは、グラム陰性細菌、酵母、および哺乳動物細胞系から選択してもよいが、好ましくは、宿主生物は、大腸菌(Escherichia coli)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)である)での発現に好ましいコドンから選択することにより設計される。別の実施形態において、HCをコードする核酸配列は、グアノシンおよびシトシン残基が富化されたHC配列を提供する、HCをコードするコドンを選択することにより設計される。さらに好ましくは、HCまたはHNをコードする核酸は、組換え宿主生物において、同じHC配列をコードする第2の核酸断片(該第2の核酸断片は、HCの野生型ボツリヌス菌(Clostridum botulinum)配列を有する)よりも高い収率で発現される。
【0018】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクターを提供し、ここで、HCおよび/またはHNは、該発現ベクターを用いて宿主生物をトランスフェクトすることにより発現される。本発明の別の実施形態は、BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のカルボキシ末端部分(HC)またはボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のアミノ末端部分(HN)を含むポリペプチドの調製方法を提供し、該方法は、HCまたはHNが発現される条件下で本発明の発現ベクターによりトランスフェクトされた組換え宿主生物を培養することを含んでなる。好ましくは、組換え宿主生物は、真核生物である。別の好適な実施形態において、本発明の方法は、宿主生物から不溶性タンパク質を回収し、それによりHCまたはHNが濃縮された画分を得ることをさらに含む。好ましくは、宿主生物は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)である。
【0019】
さらに別の実施形態において、本発明は、BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のカルボキシ末端部分(HC)を含む免疫原性組成物を提供する。好ましくは、免疫原性組成物は、HCをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた組換え生物を培養することにより調製される。さらに好ましくは免疫原性組成物は、HCが濃縮された不溶性タンパク質画分を該組換え生物から回収する方法により調製される。
【0020】
さらに別の実施形態において、本発明は、BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のアミノ末端部分(HN)を含む免疫原性組成物を提供する。好ましくは、HNを含む免疫原性組成物は、HNをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた組換え生物を培養することにより調製される。さらに好ましくは免疫原性組成物は、組換え生物から回収される、HNが濃縮された不溶性タンパク質画分から調製される。
【0021】
さらに別の実施形態において、本発明は、BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、および/またはBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のカルボキシ末端部分(HC)および/またはボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のアミノ末端部分(HN)に含まれるエピトープ(該エピトープは、それぞれのBoNT血清型に対する防御免疫を誘発する)を含むポリペプチドを含む、免疫原性組成物を提供する。好ましくは免疫原性組成物は、血清が100倍希釈されていても、動物由来の血清において検出可能な、動物のそれぞれのBoNT血清型に対するELISA応答を誘発する。
【0022】
本発明の実施形態の詳細な説明
本発明者らは、霊長類を含む動物が、組換え生物により発現されたボツリヌス神経毒タンパク質の断片を用いて免疫することにより、ボツリヌス神経毒(BoNT)の作用から防御されることを確認した。具体的には、BoNTタンパク質の重鎖のカルボキシ末端とアミノ末端部分に見い出される、それぞれ受容体結合ドメインおよび/または転座ドメイン由来の防御エピトープを含むペプチドは、BoNTの各血清型に対するペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトした組換え生物により発現される。これらの組換え的に産生されたペプチドを用いて免疫することにより、それぞれの血清型のBoNTによる中毒から動物を防御できる抗体が誘発されるであろう。
【0023】
本発明は、ボツリヌス中毒症から防御するための遺伝子工学的に作製されたワクチンを提供する。ワクチンは、「C断片」(HCドメイン)として知られるAおよびB毒素の断片を含む。現在大腸菌(E. coli)マルトース結合タンパク質に融合させたHC断片またはHCポリペプチドの遺伝子セグメント構築体を用いて、大腸菌(E. coli)においてAおよびB毒素のHC断片を産生させることが可能である。この融合産物は、天然毒素のチャレンジに対して非常に優れた防御を提供することが見い出されている。本発明は、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)の毒素に対する防御を提供するために、ワクチンとして使用されるプラスミドおよび組換えタンパク質を提供する。
【0024】
Kozakiらは、「ボツリヌス神経毒に対する抗体」, L. L. Simpson編, 1989, Academic Press, New Yorkにおいて、防御エピトープが、タンパク質の50kDaカルボキシ末端(HC)領域に存在するかも知れないことを示唆した。Thompsonら(1990, Eur. J. Biochem. 189:73−81)は、血清型Aボツリヌス毒素のアミノ酸配列を推定した。DasGuptaら(1990, Biochemie, 72:661−664)は、発現された毒素ポリペプチドの翻訳後切断のための「ニック」部位を同定したが、ここから重鎖の配列を以下のとおり推定することができる(Krieglsteinら, 1994, J. Protein Chem., 13:49−57も参照のこと):
【0025】
Whelanら(Appl. Environ. Microbiol. 58:2345−2354,1992)は、血清型Bボツリヌス毒素のアミノ酸配列を推定している。Schmidtら(1985, Arch. Biochem. Biophys., 238:544−548)は、発現された毒素ポリペプチドの翻訳後切断から生じる重鎖のN末端配列情報を提供しており、そしてこの情報から以下のとおり重鎖の配列を推定することができる:
【0026】
全てのBoNT血清型に関する同様の翻訳後切断によって、類似の重鎖および軽鎖構造体が生成する(Krieglsteinら, 1994, J. Protein Chem., 13:49−57およびここに引用される参考文献を参照のこと)。
【0027】
合成遺伝子の構築
予備実験は、適切なBoNT断片をコードするボツリヌス菌(C. botulinum)で見い出されるDNA配列が、典型的な組換え宿主において十分に発現されないことを示した。従って、それぞれの断片のアミノ酸配列に基づく合成遺伝子の構築が試みられた。
【0028】
合成遺伝子の構築は、異種宿主系における発現を最適化するために使用される方法である。塩基組成(すなわち、A+TパーセントまたはG+Cパーセント)さらには遺伝子配列中の特定のコドンが、1つの生物由来の遺伝子が異なる生物において最適に発現されるかどうかを決定する上である役割を演じる。何故あるコドンが使用され、そしてあるものは使用されないかには理由がある。生物は、対応するtRNAが存在するコドンを使用する。生物が、あるコドンを使用しないなら、これらは、それに特異的なtRNAを欠いている可能性が高い。従って、クロストリジウムDNA(すなわち、クロストリジウム(Clostridium)と呼ばれる細菌の属において見い出される遺伝子)において見い出されるコドンは、塩基組成(すなわち、非常に高いA+T塩基組成)と大腸菌(E. coli)または酵母において普通見い出されないコドン利用の両方に関し、非常に独特である。
【0029】
表1は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)中のコドン利用を示すチャートである。この表は、ピキア・パストリス(P. pastoris)で高度に発現される多くの遺伝子において見い出されるコドンを列挙することにより作成した。コドンのデータは、遺伝子を配列決定し、次に該遺伝子においてどのコドンが見い出されたかを列挙することにより得られた。
【0030】
表1から、アミノ酸残基は、複数のコドンによりコードできることが明らかである。ピキア・パストリス(P. pastoris)のコドン利用を用いて合成遺伝子を構築するとき、ピキア・パストリス(P. pastoris)の天然遺伝子中に見い出されるコドンだけを使用するのが好ましく、そして自然の生物の遺伝子に見い出されるものと同じ比率でこれらを維持するよう試みるべきである。クロストリジウム遺伝子が、70%を超える総A+T濃度、及び95%以上のA+Tのスパイクを有するA+T領域を有するとき、酵母のような発現系における発現のためにはこれらを低下させる必要がある。(好ましくは、総A+T濃度は60%未満に下げ、そしてスパイク中のA+Tも60%未満に下げる)。当然、同じコドン比を維持すること(例えば、グリシンについてGGGはなく、GGAは22%で見いだされ、GGTは74%でGGCは3%で見いだされた)と高含量のA+Tを減少させることとのバランスをとることが必要である。遺伝子の構築において、A+Tスパイクを約55%に維持することが好ましい。
【0031】
大腸菌(E. coli)を含むいくつかの生物についてコドン利用を考慮すると、大腸菌(E. coli)のコドン利用を用いる合成遺伝子も、ピキア・パストリス(P. pastoris)において、かなりよく発現することがわかる。同様に、ピキア・パストリス(P. pastoris)のコドン利用を用いる合成遺伝子も、大腸菌(E. coli)において、非常によく発現すると考えられる。
【0032】
ボツリヌス神経毒血清型A〜GのHC断片に対する合成遺伝子を、その合成遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と共に、図1〜10に示す。ボツリヌス神経毒血清型A〜GのHN断片に対する合成遺伝子は、その合成遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と共に、図11〜17に示す。代替遺伝子配列を有する合成遺伝子は、コドン選択に関して本明細書に記載のガイダンスに従って、調製することができる。このような合成遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、好ましくはBoNT血清型タンパク質の内の1つの配列、または防御エピトープを含むその断片である。好適な断片には、BoNT血清型A、B、C1、D、E、F、およびGのHC断片、並びにBoNT血清型A、B、C1、D、E、F、およびGのHN断片が含まれる。このような代替遺伝子配列は、本発明の企図の範囲内である。
【0033】
また、それぞれの血清型のBoNTタンパク質のN末端およびC末端ドメインの両方に由来する防御エピトープを含むタンパク質も、本発明の企図の範囲内である。このようなタンパク質は、転座ドメイン(HN)をコードする配列をHC領域の配列に融合することにより調製することができる。これは、転座ドメイン遺伝子の3’末端の制限酵素部位、さらには終止コドンを除去し、さらにまた開始コドン、制限酵素部位、およびボツリヌス毒素遺伝子の一部ではない遺伝子の5’末端上の任意の他のヌクレオチドを、除去することにより達成される。次にいずれの合成遺伝子にも見い出されない通常の制限酵素部位を、HN遺伝子の3’末端およびHC遺伝子の5’末端に挿入し、そしてこの通常の制限部位を使用して、2つの遺伝子を共に融合させる。
【0034】
組換えペプチドの製造
非毒素断片は、非常に安全であり、ホルマリン処理を必要とせず、そして完全に毒性の親分子に対する顕著な免疫を生成することが証明されている。本発明には、現在利用されているワクチンに対して2つの大きな利点がある。第1に、組換えにより産生されるボツリヌス神経毒(rBoNT)タンパク質断片は、完全に非毒性であり、従って非常に安全である。rBoNT遺伝子を含む宿主細胞(例えば、大腸菌(Escherichia coli)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris))の発酵には、トキソイドワクチンの製造に必要な胞子形成性ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)を発酵するのに現在必要とされるような、高度な生物学的封じ込め設備を必要としない。第2に、合成遺伝子は、高発現系に入れることができ、これを使用して、親生物であるボツリヌス菌(Clostridium botulinum)が産生する毒素よりもはるかに大量の断片を製造することができる。従って、現在可能な量よりもはるかに大量のワクチンが、より容易かつ安全に製造されるため、莫大な費用節約になる。
【0035】
本明細書に記述される合成遺伝子は、適切な宿主生物にトランスフェクトすることにより組換え生産生物を構築し、そして次にこの組換え生物の培養液を使用して、それぞれの血清型のBoNTに対する防御免疫を与えることができる免疫原性ペプチド断片を製造することができる。BoNT断片のトランスフェクションおよび産生の例は、実施例に示す。代替法は、文献に詳細に記述されている(例えば、Maniatis、FritschおよびSambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1982);“DNA Cloning: A Practical Approach,” Volumes I and II (D. N. Glover編, 1985);“Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait編, 1984);“Nucleic Acid Hybridization” (B. D. HamesとS. J. Higgins編, 1985);“Transcription and Translation” (B. D. HamesとS. J. Higgins編, 1984);“Animal Cell Culture” (R. I. Freshney編, 1986);“Immobilized Cells and Enzymes” (IRL Press, 1986);B. Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984)、および Sambrookら, “Molecular Cloning: a Laboratory Manual” (1989)を参照のこと)。このような方法は、文献で十分に説明されており、本発明の範囲内のこれらの方法の改変は、当該分野における技術の範囲内である。
【0036】
BoNT血清型B断片HCに対する合成遺伝子(図4Aを参照のこと)は、酵母発現ベクターpHIL−D4に挿入され、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株GS115の染色体中に組み込まれた。発現産物(図4Bのアミノ酸配列を参照のこと)は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびボツリヌス神経毒血清型Bに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析により示されるように、予測した分子量を有した。発現した組換えBoNTB(HC)は、酵素結合免疫吸着測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay;ELISA)により判定すると、高い抗体力価を誘発し、そしてより重要なことには、これらの循環する血清の力価が、活性な毒素によるチャレンジから、マウス、モルモット、および非ヒト霊長類を防御した。工業的規模の製造プロセス(発酵および精製)が完成しており、cGMPに従ってパイロットロットが製造されている。
【0037】
BoNT血清型C断片HCに対する合成遺伝子(図5Aを参照のこと)は、酵母発現ベクターpHIL−D4に挿入され、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株GS115の染色体中に組み込まれた。発現産物(図5Bのアミノ酸配列を参照のこと)は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびボツリヌス神経毒血清型Cに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析により示されるように、予測した分子量を有した。発現した組換えBoNTC(HC)は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により判定すると、高い抗体力価を誘発し、そしてより重要なことには、これらの循環する血清の力価が、活性な毒素によるチャレンジからマウスを防御した。
【0038】
BoNT血清型D断片HCに対する合成遺伝子(図6Aを参照のこと)は、酵母発現ベクターpHIL−D4に挿入され、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株GS115の染色体中に組み込まれた。発現産物(図6Bのアミノ酸配列を参照のこと)は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびボツリヌス神経毒血清型Dに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析により示されるように、予測した分子量を有した。発現した組換えBoNTD(HC)は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により判定すると、高い抗体力価を誘発し、そしてより重要なことには、これらの循環する血清の力価が、活性な毒素によるチャレンジからマウスを防御した。
【0039】
BoNT血清型E断片HCに対する合成遺伝子(図7Aを参照のこと)は、酵母発現ベクターpHILD2、pHILD3、およびpPIC9K(図7Bを参照のこと)に挿入した。内部EcoRI部位を除去して遺伝子を拡張した、改変形の合成遺伝子(図8を参照のこと)を酵母ベクターpHIL−D4に挿入して、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株GS115の染色体中に組み込んだ。発現産物(図8のアミノ酸配列を参照のこと)は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびボツリヌス神経毒血清型Eに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析により示されるように、予測した分子量を有した。発現した組換えBoNTE(HC)は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により判定すると、高い抗体力価を誘発し、そしてより重要なことには、これらの循環する血清の力価が、活性な毒素によるチャレンジからマウスを防御した。
【0040】
BoNT血清型F断片HCに対する合成遺伝子(図9Aを参照のこと)は、酵母発現ベクターpHIL−D4に挿入され、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株GS115の染色体中に組み込まれた。rBoNTF(HC)ワクチン候補の開発における最初の工程は、ピキア宿主中で満足に発現できる遺伝子を設計することであった。rBoNTF(HC)をコードする合成遺伝子は、天然のクロストリジウム遺伝子の本来のAT濃度を低下させ、そして潜在的にまれなコドンはすべて除去するように構築した。65%を超えるAT含量を有するか、または平均的AT含量を有するがAT濃縮域を含むクロストリジウム遺伝子は、通常複数のターミネーター/ポリアデニル化シグナルを含み、これらは、酵母において発現を試みると、速すぎる転写停止が起きる(Romanos, M. A.ら, (1995),「酵母におけるクローン化遺伝子の発現」, DNA Cloning 2: Expression Systems, (Glover D.ら編), Oxford Univ. Press, London)。本研究における合成遺伝子は、酵母が正しく完全長抗原を産生できるまでに、2回の連続ラウンドの改変を必要とした。発現産物(図9Bのアミノ酸配列を参照のこと)は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびボツリヌス神経毒血清型Fに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析により示されるように、予測した分子量を有した。
【0041】
以前の研究(Hatheway, 1976)は、血清型Fトキソイド抗原が有効であるためには、少なくとも部分的に精製されることが必要であることを証明した。同じ観察は、ピキア細胞で産生されたrBoNTF(HC)抗原についても注目され、粗細胞溶解物は、BoNTFチャレンジに対してマウスを防御しなかった。BoNTFの推定受容体結合ドメインは、酵母から精製され、マウスモデルにおいて有効であることが示された。発現した組換えBoNTF(HC)は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により判定すると、高い抗体力価を誘発し、そしてより重要なことには、これらの循環する血清の力価が、活性な毒素によるチャレンジからマウスを防御した。
【0042】
BoNT血清型G断片HCに対する合成遺伝子(図10Aを参照のこと)は、酵母発現ベクターpHIL−D4に挿入され、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株GS115の染色体中に組み込まれた。発現産物(図10Bのアミノ酸配列を参照のこと)は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびボツリヌス神経毒血清型Gに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析により示されるように、予測した分子量を有した。発現した組換えBoNTG(HC)は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により判定すると、高い抗体力価を誘発し、そしてより重要なことには、これらの循環する血清の力価が、活性な毒素によるチャレンジからマウスを防御した。
【0043】
あるタンパク質を初めて精製するときは、どの画分が生成物を含むかを同定するための実行可能な手段を作成することが重要である。目的のタンパク質が、酵素でないかまたはユニークな波長での吸収がなくても、生成物を同定するための適切な測定法(例えば質量分析)はなお存在する。本発明者らは、ウェスタンブロット分析による免疫学的検出により、rBoNT(HC)の精製をモニターすることを選択した。しかし、毒素全体に対する種々のポリクローナル抗体が利用可能であっても適当な陽性対照がないため、ウェスタンブロットの結果は、精製試料が配列決定されるか、または防御性であることが示されるまで、あいまいなものと解釈される。
【0044】
ピキア細胞からC断片、HN、および/または重鎖(HC)抗原を抽出するときには、重要な問題点が主に2つある。第1の関心事は、これらのタンパク質の溶解度である(すなわち、さらに処理するために可溶性画分に十分な生成物が抽出できるのか?)。第2の関心事は、ポリ核酸および/または他の混入物質の有効な除去であり、これらは必要なクロマトグラフィーを強力に妨害する。
【0045】
両性イオン界面活性剤であるCHAPSは、膜タンパク質を可溶化するのに、最も著しく有効な物質である。膜タンパク質は、疎水性環境に存在しており、この環境から引き離されると、凝集して最終的には沈殿する強い傾向を有する。CHAPSは、膜結合タンパク質が凝集を起こすのを防止する。本発明者らは、この前提を上述のクロストリジウムタンパク質に外挿した。C断片、転座ドメイン(HN)、および重鎖全体は、その天然のパートナー(神経毒の残りのセグメント)を失っており、そのためおそらくそのタンパク質表面上に露出した疎水性領域を持っている。HC、HN、または重鎖は通常、この領域で神経毒の残りの部分に結合している。水性環境におけるタンパク質の自然の傾向としては、その疎水性表面を覆い隠すものであるため、これらの露出した疎水性領域はタンパク質凝集の潜在的な核生成源である。ピキア細胞が、クラッキング緩衝液中に存在するCHAPS(0.3% w/vのオーダー)によって破砕されると、可溶性画分中に単離された断片Cタンパク質の量は、血清型C1では5%未満から80%近くまで上昇することが観察されている。溶解度の劇的な上昇は、さらにC断片血清型AおよびFで認められている。
【0046】
一旦可溶性抗原が産生されると、次の課題は、抽出媒体中に存在する無数のピキア宿主タンパク質、脂質、および他の不純物から、この抗原を分離することである。液体クロマトグラフィーによる化学的分離が実行可能であるためには、ポリ核酸を効率的に除去することが重要である。ヌクレオチドは、C断片(その高いpIのため血清型A、E、およびF)に結合するか、または陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂(C1プロセスの最初の精製工程において使用されるものと同様)に結合する。いずれの場合も、クロマトグラフィーは役に立たなくなる。C断片生成物は、クロマトグラフィー媒体に結合できないか、または許容できないほど高い塩化ナトリウム濃度範囲で溶出する。ピキア細胞は、大量のDNAを持つ。ポリエチレンイミン(PEI)は、ヌクレオチドを容易に沈殿させるポリカチオン性物質である。ピキア細胞抽出物をPEIで処理すると、核酸は効率的に沈殿して、生成物の著しい喪失なしに遠心分離により除去される。さらに重要なことには、ピキアタンパク質からのC断片のクロマトグラフィーによる分離は、劇的に改善される。
【0047】
細胞溶解物の可溶性部分は、典型的には従来の2種のクロマトグラフィー工程により精製される。この研究の最終目的は、安全かつ有効なワクチンとしてBoNTのFDA認可を得ることである。たとえ親和性化学により極めて高分解能で分離が達成できても、樹脂からハプテンが浸出するという有害な影響が残る。すなわち好ましい分離は、陽イオン交換工程に続いて疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を利用するものである。これら2工程は、静電的および疎水性相互作用に基づく分離を提供するため、相互に補完する。抗原が52倍を超えて精製されると推定されたため、陽イオン交換工程は、rBoNTF(HC)の純度を増大させるのに特に効率的であった。精製の効率は、主として多くのピキアタンパク質(pI<7)とrBoNTF(HC)(rBoNTF(HC)の実験上のpIは9.4であった、データは示していない)との間の等電点の有意差に帰し、そうしてピキアタンパク質はカラムフロースルーにおいて除去された。陽イオン交換プールを硫酸アンモニウムで処理すると生じる沈殿物は、大部分はピキアタンパク質であり、rBoNT生成物はほとんど含まれない。HIC工程は、残りの不純物の大部分または全部を除去する。組換え酵母細胞溶解物全体からの可溶性rBoNTF(HC)の収率は28%より大きく、純度は98%を超えると見積もられた。rBoNTA(HC)について同様な精製工程を利用すると、95%を超える純粋な物質が生成した。
【0048】
細胞溶解物の不溶性部分中に、多量のrBoNTF(HC)生成物(30〜40%)が確認された。また抗原は、ペレット中に存在する全タンパク質の35%であった。実際、イオン交換工程後の可溶性rBoNTF(HC)よりも純度が高かった。このことは、酵母で産生される不溶性rBoNT生成物が再可溶化し、均質になるまで精製しうる代替プロセスを示唆している。再可溶化は、ペレットを尿素に再懸濁して、次に非変性緩衝液中で透析して尿素を除去することにより行われる。陽イオン交換化学を用いる単一のクロマトグラフィー工程でも、再可溶化抗原を精製する(ある場合には98%を超えるまで)のに十分な場合もある。全細胞溶解物からの再可溶化rBoNTF(HC)生成物の収率は、>19%と見積もられた。精製した可溶性および再可溶化rBoNTF(HC)のベンチスケールの総収率は、47%すなわち細胞ペースト1Kgあたり240mgを超えると見積もられた。同様の方法は、酵母からrBoNTA(HC)や他のrBoNT断片ペプチドを精製するのに適するであろう。
【0049】
可溶性および再可溶化生成物のCDスペクトルの分析は、相当量のβシートの存在を表し、これは人工神経ネットワーク(Lebeda, F. J.ら, (1997),「溶媒の接近容易性に基づく示差的抗原抗体接触領域の予測」, J. Protein Chem., 16:607−618)を用いてrBoNTF(HC)に関して予測されたもの、およびBoNT血清型Aの結晶構造により決定されたもの(Lacy, D. B.ら, (1998),「ボツリヌス神経毒A型の結晶構造および毒性との関係」, Nat. Struct. Biol., 5:898−902)と一致した。しかしCDは、2つの抗原が類似の折り畳み構造を有することを明らかにしたが、2つのスペクトルの間には微妙な差が存在し、これを2次構造およびこのため3次構造が同一でないことを示唆している。
【0050】
免疫化
精製された可溶性および再可溶化抗原は、折り畳まれたコンフォメーションであると考えられる。しかし、任意の可能性あるワクチンの要点は、防御能を示すことである。この抗原は、中和抗体の産生を誘発するコンフォメーションであるか?この質問に答えるために、マウスにrBoNTF(HC)を接種し、続いて高レベルのrBoNTF毒素でチャレンジした。精製した可溶性rBoNTF(HC)は、0.2μgを3回接種したマウスを、BoNT/F毒素のマウス腹腔内LD50の1000倍によるチャレンジから、完全に防御した。用量と生存率の関係の分析は、用量が生存率のオッズ(オッズ比=2.0、これは1.3から3.1の95%信頼度で、用量の単位増加あたり生存率のオッズが2倍上昇することを意味する)に関係することを示した。接種の回数もまた生存率に関係した。2回接種および3回接種の両方とも、単回接種に比較して生存率のオッズの上昇に関連した(2回接種では1.2〜23の95%信頼度で5.3倍、そして3回接種では4.3〜110の95%信頼度で22倍)。高用量での単回投与が、低用量の複数回接種に匹敵する防御を達成することは、明らかである。また、1μgの精製再可溶化rBoNTF(HC)の3回投与は、BoNTF毒素のマウス腹腔内LD50の5000倍によるチャレンジから、マウスを完全に防御し、これは、溶解物の不溶性画分由来の再折り畳みrBoNTF(HC)も、抗原の好適な供給源となりうることを証明している。
【0051】
個々のELISA抗体力価は、マウス生存率の優れた予測値であると考えられる。マウスの抗体力価が100以上であれば、このマウスは、BoNTF毒素の1000マウス腹腔内LD50によるチャレンジに耐えると予測され、そして実際に生き延びた。rBoNTA(HC)またはrBoNTB(HC)ワクチンを、特定のスケジュール(すなわち、0、4、および8週間目の非経口的筋肉内注入)で2回または3回、マウスにワクチン接種したとき、毒素のLD50の10万または1兆倍でチャレンジしたマウスの生存率は、非常に高い。ELISAによるこれらの動物中の抗体レベルの測定は、生存率が、測定される抗体レベルと相関しうることを示している。マイクロタイタープレートを毒素または断片C自体でコーティングし、次にワクチン接種マウスからの血清を種々の希釈で加え(すなわち、1/100、1/400、1/1600、1/6400などに希釈した血清)てELISAを実施した。断片Cにより、動物で防御を十分誘発できるため、好ましくは断片Cでワクチン接種した動物からの血清中の中和抗体力価の測定は、断片Cでコーティングしたマイクロタイタープレートを用いて実施する。血清中の抗体は、毒素または断片Cに結合し、そして結合抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼに結合した2次抗体(例えば、抗マウスIgG)により検出できる。2次IgGは、断片Cワクチンに対して産生された抗BoNT抗体に結合する。マイクロタイターウェルを洗浄後、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼ酵素に対する基質をウェルに加える。基質は、酵素が基質を切断すれば発色し、そしてこの色の強度を測定する(例えば、405nmで)。典型的には、0.2の測定値をベースとして使用する。すなわち、1/1600の血清の希釈が405nmで0.15の測定値を与え、かつ1/400の希釈が405nmで0.45の測定値を与えるならば、血清中の抗体力価は、1/400希釈として特性決定される(すなわち、400倍の力価)。0.2の測定値が高い希釈で得られるならば、さらに良好な防御が観察されることは明らかである。rBoNTA(HC)ワクチン接種では、100未満のELISA力価のマウスでは、このワクチン接種およびチャレンジの条件下で、わずか14.3%の生存率のみが観察された。rBoNTF(HC)では、100倍のELISA力価のマウスについて、このワクチン接種およびチャレンジの条件下で、100%のマウスが防御された。
【0052】
また、感受性宿主は、免疫応答を増大させるためにアジュバント中に配合された適切なペプチドワクチンを用いて免疫化されることは、当業者には周知であろう。このようなアジュバントは、特に限定されないが、フロイント(Freund’s)(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、キーホールリンペットヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)のような界面活性物質、リゾレシチン、プルロニックポリオール(pluronic polyols)、ポリアニオン、ペプチド、BCG(カルメット・ゲラン杆菌(Bacille Calmette−Guerin))、油性乳剤およびジニトロフェノールを含む。免疫化は、追加の種々の提示および架橋による組合せ(cross−linking permutations)を用いて行うことができる。特に限定されないが、一例として、このような組合せは、担体としてのKLHに架橋したrBoNTペプチド、担体としての任意の他のrBoNTタンパク質に架橋した任意のrBoNTペプチド、それら自己同士で架橋したrBoNTペプチド、および上に列挙される種々のアジュバントにより提示されるこれらの組合せを含む。このような組合せは、本明細書を通して開示される他のペプチドおよび自己集合ペプチドに関して利用可能であることが明白であろう。
【0053】
また、「感受性宿主」という用語の使用が、BoNTによる中毒に対して感受性のこのような哺乳動物宿主を含むことは、当業者には既知であろう。さらに、このような感受性宿主は、本明細書に記載のペプチドワクチンおよび関連する方法を使用して、BoNTからの防御を促進するための処置の対象であることは、明白であろう。
【0054】
実施例
本発明のさらに完全な理解を促進するために、いくつかの実施例を以下に示す。しかし本発明の範囲は、これらの実施例に開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、これらは、説明のみを目的とする。
【0055】
実施例 1 . rBoNTF(HC ) をコードする合成遺伝子の合成およびクローニング
ボツリヌス神経毒血清型Fの推定断片C領域をコードする合成遺伝子を、大腸菌(Escherichia coli)における発現のために設計および構築した(Holleyら, Vaccineに投稿中)。組換えBoNTF(HC)1遺伝子は、マルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質として、大腸菌(E. coli)中で1mg/L培養液の収率で発現した(図18を参照のこと)。
【0056】
同じ遺伝子を、酵母ピキア・パストリス(P. pastoris)中の発現試験のために使用した。この特定の宿主は、高レベルの組換えタンパク質を産生することができるため(Cregg, J. M.ら, (1993),「ピキア・パストリス(Pichia pastoris)中の外来遺伝子発現における最近の進歩」, Bio/Technology, 11:905−909;Romanos, M.A.ら, (1992),「酵母における外来遺伝子発現:総説」, Yeast, 8:423−488;Sreekrishna, K.ら, (1988),「メチロトローフ(Methylotrophic)な酵母であるピキア・パストリス(Pichia pastoris)中の異種タンパク質の高レベル発現」, J. Bas. Microbiol., 28:265−278 )、およびエンドトキシンを欠いているため製品開発しやすいことから、特に選択された。抗原の細胞内発現は、組換えタンパク質のグリコシル化の可能性を回避するために利用した。rBoNTF(HC)1遺伝子は、酵母ベクターpHILD4のユニークなEcoR I部位に挿入するためにその3’末端を修飾した。rBoNTF(HC)1遺伝子を含む組換え構築体は、次にSacIで線状化し、このカセットをピキア・パストリス(Pichia pastoris)株のGS115の染色体アルコールオキシダーゼ(AOX 1)中に組み込んだ(Clare, J.J.ら, (1991),「遺伝子の多重タンデム組み込みを含むピキア・パストリス(Pichia pastoris)株中の破傷風毒素断片Cの高レベル発現」, Bio/Technology, 9:455−460)。選択マーカーのヒスチジンデヒドロゲナーゼ(Cregg, J.M.ら, (1985),「形質転換の宿主系としてのピキア・パストリス(Pichia pastoris)」, Mol. Cell. Biol., 5:3376−3385)およびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ3’(I)(Scorer, C. A.ら, (1994),「高レベルの外来遺伝子発現のためのピキア・パストリス(Pichia pastoris)の高コピー数形質転換株のG418を使用する迅速選択」, Bio/Technology, 12:181−184)を発現する酵母の形質転換株を単離した。これらの単離株は、メタノールによる誘導後、rBoNTF(HC)を発現するその能力に関してさらに特性決定した。構築された種々の形質転換株は選択マーカーを発現できたが、これらの単離株では、SDS/PAGEおよびブロット分析により判定したところrBoNTF(HC)の発現は観察されなかった(データは示していない)。
【0057】
SDS/PAGE 、ウェスタンブロット、およびタンパク質測定
総タンパク質濃度は、BSAを標準物質とするPierceBCA(登録商標)(ビシンコニン酸)タンパク質測定キットにより測定した。rBoNTF(HC)生成物の純度は、すでに報告されている(Byrne, M. P.ら, (1998),「組換えワクチン候補としてのピキア・パストリス(Pichia pastoris)からのボツリヌス神経毒A型結合ドメインの精製、力価、および効力」, Infect. Immun., 66:4817−4822)ように、ノーベックス(Novex)(サンジエゴ、カリホルニア州、米国)ゲル電気泳動用備品、試薬、プロトコール、および国立衛生研究所(National Institutes of Health)(NIH)イメージングソフトウェアを用いるSDS/PAGEにより評価した。すでに報告されている(Byrne, 1998)ようにウェスタンブロット測定法を使用して、rBoNTF(HC)を含むFPLC画分を同定した。なお、以下の変更を加えた。使用した1次抗体は、1μg/mlで3時間インキュベートしたポリクローナルのプロテインGセファロース精製したウマ抗BoNTF抗体である。使用した2次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したアフィニティー精製ヤギ抗ウマIgG(カークガード・ペリーラボラトリーズ(Kirkegaard & Perry Laboratories)、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国)であり、1μg/mlで2時間測定した。
【0058】
実施例 2 . rBoNTF(H C ) をコードする合成遺伝子の合成およびクローニング
続いて第2の合成遺伝子のrBoNTF(HC)2を、ピキア・パストリス(P. pastoris)中での発現を促進するように設計した。遺伝子の再設計は、AT濃縮域のスパイクがなお残存するrBoNTF(HC)1遺伝子の特異的領域を低下させることを意図して行った。以前の研究により、クロストリジウムDNA中のまれなコドン(Makoff, A. J.ら, (1989),「大腸菌(E. coli)中の破傷風毒素断片Cの発現:まれなコドンの除去による高レベル発現」, Nucleic Acids Res., 17:10191−10201)および/または高濃縮AT塩基組成(Romanos, M. A.ら, (1991),「酵母中の破傷風毒素断片Cの発現:AT濃縮DNA中の偶然のポリアデニル化部位を除去するために遺伝子合成が必要である」, Nucleic Acids Res., 19:1461−1467)は、大腸菌(E. coli)および酵母中のクロストリジウム遺伝子の最適な発現とは、両立しないことが判っている。rBoNTF(HC)断片をコードする第2の合成遺伝子は、ピキア・パストリス(P. pastoris)のコドン利用を用いて設計および構築された(Sreekrishna, K., (1993),「メチロトローフな酵母であるピキア・パストリス(Pichia pastoris)中のタンパク質の発現と分泌を最適化するための戦略」, Industrial Micororganisms : Basic and Applied Molecular Genetics, (Baltz, R. H.ら, 編), pp. 119−126, Am. Soc. Microbiol., Washington, DC)。簡単に述べると、F(HC)のアミノ末端領域(EcoRIおよびPstI部位が両側に隣接する423ヌクレオチド)、F(HC)の中央領域(PstIおよびSalI部位が両側に隣接する606ヌクレオチド)およびF(HC)のカルボキシ末端領域(SalIおよびEcoRI部位が両側に隣接する336ヌクレオチド)をコードする相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングして、pUCまたはPCRゼロブラント(zero−blunt)プラスミドベクター中にクローン化した。天然のクロストリジウムF(HC)DNA中のAT塩基組成は、平均して76%であり、一方rBoNTF(HC)1は平均58%であり、rBoNTF(HC)2は53%である(図19)。rBoNTF(HC)2の合成遺伝子配列およびこれがコードする432アミノ酸は、図9に示される。ヌクレオチド配列決定後、クローン化断片は、適切な制限エンドヌクレアーゼにより切り出し、アガロースゲル電気泳動により分離して精製した。単離DNA断片を、EcoR I消化し脱リン酸化したプラスミドpHILD4中に同時に連結した。rBoNTF(HC)2遺伝子を含むベクターは、上述のようにピキア・パストリス(P. pastoris)の染色体AOX1遺伝子座中に組み込んだ。選択マーカー(ヒスチジンデヒドロゲナーゼおよびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ3’(I))を発現する形質転換体を単離して、rBoNTF(HC)を発現するその能力について試験した。rBoNTF(HC)1遺伝子とは異なり、rBoNTF(HC)2は、メタノールによる誘導後に発現して、SDS/PAGEおよびウェスタンブロット分析により判定したところ約50000ダルトンの予測された分子量が得られた(図20)。コードされるポリペプチドの推定分子質量は50,250ダルトンであった。
【0059】
実施例 3 .ピキア・パストリス( P. pastoris )中の rBoNTF(H C ) の発現および細胞破砕
酵母ピキア・パストリス(P. pastoris)株について、rBoNTF(HC)の大規模発酵条件および最適細胞内発現を調べた。
【0060】
タンパク質発現
ピキア・パストリス(P. pastoris)の接種用ストック培養液は、0.5LのYNB培地(アミノ酸を含まない酵母の窒素塩基13.4g/L、20g/Lグリセロール、0.4mg/Lビオチン、100mMリン酸ナトリウム中、pH6.0)を含む振盪フラスコ中で増殖させた。培養液は、30℃で20吸光度単位のA600を達成するまで増殖させて、次にこれを使用して、2.5L基本塩培地(basal−salt medium)とPTM4微量無機塩類および4%グリセロールを含む5L BioFlo 3000発酵槽(New Brunswick Scientific、エジソン、ニュージャージー州、米国)に接種した。溶存酸素は40%に維持し、そしてpHは30%水酸化アンモニウムで5.0に維持した。最初のグリセロールが消費された後、50%(w/v)グリセロールを20g/L/時の速度で1時間加え、次に3時間かけて0g/L/時まで線形に低下させた。培地は、1.5gメタノール/L培地で強化した。メタノール供給は、4g/L/時で開始して、10時間かけて9g/L/時まで線形に上昇させた。メタノール供給速度は、溶存酸素−スパイク法を用いることにより調整した(Chiruvolu, V.ら, (1997),「供給−バッチ発酵中のピキア・パストリス(Pichia pastoris)のアルコールオキシダーゼ−欠損株中の組換えタンパク質発現」, Enzyme Microbiol. Technol., 21:277−283)。10時間のメタノール誘導後、Beckman A−10ローター(Beckman Instruments、パロアルト、カリホルニア州、米国)を用いて6000g、4℃で10分間遠心分離することにより細胞を回収し、次に−20℃で保存した。
【0061】
タンパク質発現
ピキア・パストリス(P. pastoris)の接種用ストック培養液は、0.5LのYNB培地(アミノ酸を含まない酵母の窒素塩基13.4g/L、20g/Lグリセロール、0.4mg/Lビオチン、100mMリン酸ナトリウム中、pH6.0)を含む振盪フラスコ中で増殖させた。培養液は、30℃で20吸光度単位のA600を達成するまで増殖させて、次にこれを使用して、2.5L基本塩培地(basal−salt medium)とPTM4微量無機塩類および4%グリセロールを含む5L BioFlo 3000発酵槽(New Brunswick Scientific、エジソン、ニュージャージー州、米国)に接種した。溶存酸素は40%に維持し、そしてpHは30%水酸化アンモニウムで5.0に維持した。最初のグリセロールが消費された後、50%(w/v)グリセロールを20g/L/時の速度で1時間加え、次に3時間かけて0g/L/時まで線形に低下させた。培地は、1.5gメタノール/L培地で強化した。メタノール供給は、4g/L/時で開始して、10時間かけて9g/L/時まで線形に上昇させた。メタノール供給速度は、溶存酸素−スパイク法を用いることにより調整した(Chiruvolu, V., 1997)。10時間のメタノール誘導後、Beckman JA−10ローター(Beckman Instruments、パロアルト、カリホルニア州、米国)を用いて6000×g、4℃で10分間遠心分離することにより細胞を回収し、次に−20℃で保存した。
【0062】
細胞破砕および試料調製
11gの凍結細胞ペーストを、100mlの50mM Na2HPO4/2mM Na2EDTA/1mM PMSF、pH6.8に4℃で再懸濁した。懸濁細胞は、21000psiでマイクロ流動化装置(モデル110Y、Microfluidics Corp. ニュートン、マサチューセッツ州、米国)に、連続3回通過させることにより破砕した。破砕物の温度は、出口路および回収フラスコを氷で冷却して、プロセス全体を10℃未満に保持した。顕微鏡で測定して、95%を超える細胞が破砕されたと判定された。これに比較して、これまでのプロトコールでは、細胞を効率的に破砕するには、Gaulinホモジェナイザーに8〜10回通過させることが必要であった。細胞溶解物のSDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析は、発現されたrBoNTF(HC)が総タンパク質の<0.5%であることを示した。生じた細胞溶解物容量は、11mg/mlのタンパク質濃度で105mlであった。細胞破片と不溶性タンパク質は、Sorval SS−34ローター(Sorval Instruments、ニュートン、コネチカット州、米国)を用いて15000g、4℃で15分間遠心分離して除去した。生じた抽出物は、脂質と多量の核酸の存在のため、目立って濁っていた。rBoNTF(HC)は、計算された等電点9.1を有しており、おそらくDNAと強力に相互作用するため、ポリヌクレオチドを消化しかつ精製を促進するために、DNアーゼを細胞抽出物に加えた。ポリヌクレオチドを除去するため、抽出物は、室温で30分間、DNアーゼ(100単位/ml、Aldrich)およびZnCl2(2mM、Aldrich)で処理し、次に50mM Na2HPO4/2mM Na2EDTA/1mM PMSF、pH6.8中で4℃で、10kDa分子量カットオフ(MWCO)の Slide−A−Lyzer 透析カセット(Pierce)により十分に透析した。透析中に沈殿物が発生したため、これをSorval SS−34ローターを用いて15000g、4℃で15分間遠心分離して分離した。透明になった抽出物は、7.8mg/mlの総タンパク質を含み、そして可溶性rBoNTF(HC)のFPLC精製のための出発物質として使用し、一方ペレットは、再可溶化rBoNTF(HC)精製のための出発物質として使用した。
【0063】
実施例 4 .ピキア・パストリス( P. pastoris )からの rBoNTF(H C ) の従来の精製法
rBoNTF(HC)タンパク質は、FPLC系および2つのクロマトグラフィー工程を用いて均質になるまで精製した。最初に、材料を陽イオン交換クロマトグラフィーに付した(図21A)。
【0064】
可溶性 rBoNTF(H C ) の FPLC 精製
可溶性rBoNTF(HC)は、Pharmaciaモデル500 FPLCシステム(Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン)を、溶出をプログラムしてA280をモニターしながら使用して精製した。出発物質は、2ml/分(150cm/時)の流量で、50mM Na2HPO4/2mM Na2EDTA/1mM PMSF、pH6.8(緩衝液A)で平衡化させたPharmaciaHR 10/10 Mono S陽イオン交換カラムにロードした。カラムを16ml(カラム体積の2倍)の緩衝液Aで洗浄した。フロースルーと洗浄液を別々に回収して、次の分析のために保存した。タンパク質は、80ml(カラム体積の10倍)にわたる0〜300mM NaClの線形勾配、次に20ml(カラム体積の2.5倍)にわたる300〜1000mM NaClの線形勾配、そして次に10ml(カラム体積の1.25倍)にわたる1000mMのアイソクラチック勾配でカラムから溶出した。線形およびアイソクラチック勾配を通して4ml画分を回収した。この工程は、多くのピキアタンパク質がpH5と7の間の等電点を有しており、よって結合せずにカラムを通過するため、非常に効率的であった。230と260mM NaClの間に溶出する画分は、ウェスタンブロット分析によりrBoNTF(HC)が陽性であったため、これをプールした。プールした画分は、撹拌棒で撹拌しながら、2M (NH4)2SO4/50mM Na2HPO4/2mM Na2EDTA/25mM NaCl、pH7.5をゆっくり加えることにより、1.5M硫酸アンモニウムに調整した。タンパク質沈殿物が生成したが、これは主として酵母タンパク質であり、少量のrBoNTF(HC)生成物(約10%)を有した。沈殿物を、Sorval SS−34ローターを用いて6000g、4℃で10分間で遠心分離して除去した。幸いにも、Mono Sカラム画分のプールを硫酸アンモニウムで希釈すると、ほとんどのrBoNTF(HC)生成物は溶液中に残り(約90%)、一方かなりの量のピキアタンパク質が塩析された。第1工程は、所望の生成物を総タンパク質の<0.5から26%まで濃縮した(表2)。
【0065】
HICを第2のクロマトグラフィー工程として使用して(図21B)、表面疎水性の差に基づきタンパク質を分離した。ネオペンチル化学は、rBoNTF(HC)との適当な疎水性相互作用を提供することが判明した。上清は、1ml/分(75cm/時)の流量で、1.5M (NH4)2SO4/50mM Na2HPO4/2mM Na2EDTA/25mM NaCl、pH7.5(緩衝液B)で平衡化させたPharmaciaアルキルスーパーオース(superose)10/10疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)カラムにロードした。カラムを8ml(カラム体積の1倍)の緩衝液Bで洗浄した。タンパク質は、60ml(カラム体積の7.5倍)にわたり1.5から0Mまで低下する(NH4)2SO4の線形勾配でカラムから溶出した。rBoNTF(HC)は、0.92M硫酸アンモニウムで、0.52mg/mlのタンパク質濃度で3mlの容量でHICカラムから溶出した。ウェスタンブロット分析により陽性でかつSDS/PAGEにより単一バンドのみを示した画分をプールして、50mM Na2HPO4/2mM Na2EDTA、pH6.8中で十分に透析した。
【0066】
細胞抽出物からの精製産物の回収率は、42%を超えると見積もられた(表2)(1kgの細胞ペーストあたり140 mgの終了)。生じたrBoNTF(HC)は、わずかに(4μg)過充填したときでさえSDS−PAGEにより単一バンドしか検出されなかった(図20)ため、純度98%を超えると判定された。毛細管等電点電気泳動は、抗原が9.4の等電点を有することを示した(データは示していない)が、これは、計算pI9.1と無理なく一致する。
【0067】
表 2 .可溶性 rBoNTF(H C ) の精製
総タンパク質濃度は、PierceBCA(登録商標)測定法により測定した。rBoNTF(HC)は、ウェスタンブロット分析により同定して、NIHイメージングソフトウェアを用いるピクセルデンシトメトリーにより、SDS/PAGEの個々のレーンを分析して見積もった。
【0068】
【表2】
【0069】
精製した可溶性および再可溶化 rBoNTF(H c ) の CD
精製した可溶性および再可溶化rBoNTF(HC)を、ジャスコ(Jasco)600分光偏光計(Japan Spectroscopy company、東京、日本)を用いるCD分光法に付した。実験は、1cm光路長のセル中で10mM Na2HPO4、pH7.0中の30μg/ml(0.62μM)の濃度で行った。スペクトルは、2秒の応答、および帯域幅1nmで10nm/分の走査速度で260〜200nmを走査した、4回の集積の平均として得られた。温度は、ペルティエ(Peltier)の温度調整装置を用いて20℃に維持した。
【0070】
精製抗原の遠紫外線円偏光二色性スペクトルの分析(図22)は、233nmに陽性ピークと214nmに最小値を示した。このことは、分子が折り畳まれたコンフォメーションをとり、多数のβシートを有することを示唆する。
【0071】
実施例 5 .再可溶化 rBoNTF(H C ) の精製
ウェスタンブロット分析により、発現rBoNTF(HC)全体の約30〜40%が、細胞溶解後不溶性ペレット中に存在することが判った。この不溶性タンパク質が回収できるかどうかを検討するため、ペレットを変性剤の尿素中に抽出し、次に非変性性緩衝液中で透析した。
【0072】
再可溶化 rBoNTF(H C ) の FPLC 精製
細胞溶解物ペレットを、20mlの3M尿素/50mM Na2HPO4、pH7.0中に再懸濁して、ラブクェーク(Labquake)回転装置で4℃で15時間抽出した。変性緩衝液により可溶化されない細胞成分を、ソーバル(Sorval)SS−34ローターを用いて15000g、4℃で10分間遠心分離して除去した。上清を、緩衝液A中で10kDa MWCOピアース(Pierce)スライドAライザー(Slide−A−Lyzer)透析カセットを用いて十分に透析した。わずかな沈殿物が透析中に生成したため、これを上述のように遠心分離により除去した。ウェスタンブロット分析は、rBoNTF(HC)が上清中にのみ存在することを示したが、これはSDS/PAGEにより純度約35%であることが推定された。上清を、Pharmacia HR 10/10モノS陽イオン交換カラムに充填して、上記と同じ条件により分離した。単一の陽性rBoNTF(HC)バンド(SDS/PAGEおよびウェスタンブロット分析)のみを含む画分をプールして、10kDa MWCO透析カセットで50mM Na2HP04/2mM Na2EDTA、pH 6.8中で透析した。最終的な再可溶化rBoNTF(HC)産物は、SDS/PAGEにより測定して純度98%を超えると判定された。
【0073】
単回の陽イオン交換クロマトグラフィー分離工程後、rBoNTF(HC)は、SDS−PAGEにより判定すると純度98%を超えた。精製された再可溶化rBoNTF(HC)の総収率は、細胞ペースト1kgあたり100mgであった。精製された再可溶化抗原のコンフォメーションは、CD分光分析により測定されるように顕著なβシートを示した(図22)。しかし、全体の折り畳みは、細胞溶解物上清から精製されたrBoNTF(HC)により示されるものとわずかに異なるようであった。主な差異は233nmの陽性ピークの欠如であり、これはβシート含量の差を示している。
【0074】
実施例 6 .マウス免疫原性および効力試験
組換えrBoNTF(HC)の免疫原性を評価するために、細胞溶解物の可溶性画分からの精製rBoNTF(HC)を、1回、2回、または3回投与を1匹当たり0.008〜5μgの範囲の用量でマウスに接種した。
【0075】
マウス接種および BoNTF 毒素チャレンジ
マウス(受領時体重16〜22gのCrl:CD−1、ICRマウス(Charles River、ノースカロライナ州、米国)に、精製rBoNTF(HC)を筋肉内(i.m.)注射した。最後のrBoNTF(HC)注射の21日後、0.2%(w/v)ゼラチン/0.4%(w/v)Na2HPO4、pH6.2に希釈したBoNT毒素複合体(ランゲランド(Langeland)株)を、マウス1匹当たり100μlの総容量にして腹腔内(i.p.)投与によりマウスをチャレンジした。5匹の未処理マウスの群も毒素対照として使用した。マウスを毎日観察したところ、チャレンジの5日後に死亡を記録した。全ての動物処置法は、AAALAC認定施設の適用規則に従った。
【0076】
精製可溶性rBoNTF(HC)の効力は、1匹当たり0.008、0.04、0.2、1.0、または5.0μgのrBoNTF(HC)(100μlの0.9%(w/v)生理食塩水中0.2%(v/v)アルヒドロゲル(Alhydrogel)(Superfos Biosector、クイストガルト(Kvistgaard)、デンマーク)に希釈)を14日間隔で1回、2回、または3回投与した5匹の雌マウスの接種群により求めた。チャレンジの2日前、マウスから眼窩後方で採血して、血清をELISA試験のために回収した。マウスをBoNTF毒素複合体のマウス腹腔内LD50の1000倍でチャレンジした。
【0077】
5匹の未処理対照を含めて全てのマウスを、BoNTF毒素のマウス腹腔内LD50の1000倍でチャレンジした。対照は全て2〜4時間以内に死亡した。用量応答は、異なる回数の接種を受けたマウスの群から観察された(表3)。5μgの単回接種は、5匹中4匹のマウスを防御したが、一方0.2μg以下の用量では1匹のマウスを防御したかまたは防御しなかった。2回および3回の接種は、0.2および0.04μgの用量でそれぞれ5匹中4匹および5匹中5匹のマウスを防御した。試験した全ての用量レベルで、生存マウスの数は、接種の回数と共に上昇した。
【0078】
個々のマウスの血清抗体力価をELISAにより測定し、続いて本試験の各群について幾何平均力価を計算した。
【0079】
マウス血清 ELISA
個々のマウス血清ELISAを、以下の相違点を除いて、すでに報告されている(Byrne, 1998)ように実施した。ボツリヌス神経毒血清型F(ランゲランド(Langeland)株、Food Research Institute、University of Wisconsin、マジソン、ウィスコンシン州、米国)をコーティング抗原として使用して、各アッセイのための陽性対照は、マウスIgGモノクローナル抗体の7F8.G2.H3とした(Brown, D. R.ら, (1997),「ボツリヌス神経毒血清型Fに対する中和モノクローナル抗体の同定と特性付け(Identification and Characterization of a Neutralizing Monoclonal Antibody Against Botulinum Neurotoxin, Serotype F, Following Vaccination with Active Toxin)」, Hybridoma, 16:447−456)。
【0080】
表 3 .精製可溶性 rBoNTF(H C ) を接種後のマウスの生存率、抗体群 ELISA 力価、および血清中和力価
最終接種の21日後にBoNTF毒素の腹腔内LD50の1000倍でマウスをチャレンジした。抗体ELISA力価を、バックグラウンド補正後に0.2AUを超えるOD405を有する最高希釈の逆数として測定した。幾何平均ELISA力価を、個々の力価の対数の幾何平均をとることにより測定した。幾何平均の標準偏差も報告する。ELISA力価がアッセイの検出限界以下と測定された場合(<100)、ELISA力価には、25という値を任意に割り当てた。1.4という幾何平均力価は、その群内の全てのELISA力価が検出限界を下回ったことを意味する。
【0081】
【表3】
【0082】
統計解析
ロジスティック回帰モデルを使用して、幾何平均ELISA力価および個々の力価と生存率との関連を、SAS、バージョン6.10を用いて試験した。幾何平均力価は、防御とよく相関した(表3)。生存マウスのいない3群は、アッセイの検出限界を下回る幾何平均力価であった(1.4)。同様に、完全な防御を示した4群は、2.8以上の幾何平均力価であった。個々のマウス抗体力価は、防御と極めてよく相関した(表4)。力価が100未満であって生存したマウスは38匹中わずか7匹であった。一方、力価が100以上であったものは34匹中34匹が生存した。試験中1匹のマウスは、「非応答者(nonresponder)」と分類することができた。このマウスは、最高用量レベルで2回注射を受けたが、抗体力価は検出限界を下回り、BoNTFチャレンジに生き残らなかった。この群の残りのマウスは、1600以上の力価であった。
【0083】
表 4 .精製可溶性 rBoNTF(H C ) を接種後の個々の ELISA 抗体力価と防御との相関
血清を各マウスから個々に採血した。力価は、バックグラウンド補正後0.2AUを超えるOD405を有する最高希釈の逆数である。最終接種の21日後にBoNTF毒素の腹腔内LD50の1000倍でマウスをチャレンジした。
【0084】
【表4】
【0085】
再可溶化抗原も、BoNT毒素チャレンジからマウスを防御するその能力により、免疫原性および防御効力に関して評価した。10匹の雄マウスの群はそれぞれ、1匹当たり1μgまたは5μgのrBoNTF(HC)(100μlの0.9%(w/v)生理食塩水中0.2%(v/v)アルヒドロゲル(Alhydrogel)に希釈)を14日間隔で3回接種した。チャレンジの2日前、マウスの眼窩後方から採血して、ELISA試験のために血清を回収した。1μg用量を接種したマウスを、BoNTF毒素のマウス腹腔内LD50の5000倍でチャレンジしたところ、10匹中10匹のマウスがチャレンジに生き残った。1μg用量を接種した群で100%防御が観察されたため、5μgを3回投与した群を、抗原の限界を試験するために2桁大きいチャレンジレベルに付した。従って、5μg用量群にはBoNTF毒素のマウス腹腔内LD50の500,000倍でチャレンジした。マウスは1匹もチャレンジに生き残らなかった;しかし死亡までの時間に有意な遅延が観察された(24〜48時間)。全ての対照マウスはチャレンジ後2〜4時間以内に死亡した。
【0086】
実施例 7 . rBoNTA(H C ) をコードする合成遺伝子の合成およびクローニング
ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)により産生される毒素からの防御を提供するため遺伝子工学的に操作したタンパク質の調製を、大腸菌(E. coli)で行った。
【0087】
制限エンドヌクレアーゼおよびDNA修飾酵素は、GIBCO BRL(ゲーサーズバーグ、メリーランド州)から入手した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試薬は、Perkin−Elmer Cetus(ノーウォーク、コネチカット州)から購入した。SDS PAGE用成形済みゲルおよび泳動緩衝液は、Amersham(アーリントンハイツ、イリノイ州)から得た。全てのオリゴヌクレオチドは、Macromolectular Resources(フォートコリンズ、コロラド州)により合成された。ELISA試薬は、自家入手したか、またはSigma(セントルイス、ミズーリ州)またはKirkegard and Perry Laboratories(ゲーサーズバーグ、メリーランド州)から入手した。
【0088】
大腸菌(Escherichia coli)宿主は、GIBCO BRLからコンピテント細胞として購入したK12DH5aとした。New England Biolabs(ビバリー、マサチューセッツ州)からの発現ベクターpMAL、およびPharmacia LKB(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)からのpKK233−2は、製造業者の標準的プロトコールにより使用した。ボツリヌス菌(c. botulinum)毒素血清型AのHCドメインのDNAクローンコードは、Nigel Mintonから提供いただいたpCBA3とした。
【0089】
適切な末端制限酵素部位を組み込むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ボツリヌス菌(C. botulinum)クローンpCBA3のHC領域をPCR増幅した。ゲル精製挿入DNAおよびベクターDNAを、適切な制限酵素で切断し、低融点アガロースで精製して、室温で一晩連結させた。コンピテントDH5a宿主細胞を、供給業者の推奨に従って形質転換して、100μg/mlのアンピシリンを有するLBプレートにプレーティングした。タンパク質電気泳動を、成形済み11〜20% SDS PAGEで製造業者の推奨パラメーターで実施した。ELISAプレートは、捕捉抗体(ウマ抗ボツリヌスAポリクローナル血清)とともに一晩インキュベートし、次にスキムミルクでブロッキングし、次いで種々の希釈した試験物質、シグナル抗体(ウサギ抗ボツリヌスAポリクローナル血清)、シグナルHRP結合抗(ウサギIgG)およびABTS基質溶液を適用した。プレートは、自動リーダーで405nmで読みとった。
【0090】
A鎖のC断片の配列は、以下のとおり推定された:
【0091】
C断片タンパク質配列は、大腸菌(E. coli)最適コドン利用を用いて逆翻訳した。次に多くの箇所で遺伝子を改変して、制限部位、開始コドン、終止コドンを挿入した。ベクター中での使用に分子がさらに適するように、他の変更も行った。終始、ここから生成するタンパク質配列の忠実度は維持した。
【0092】
合成遺伝子の配列は、以下のとおり見い出される:
【0093】
この遺伝子は、+および−鎖の配列に対応する、約60〜65塩基の多数のオリゴマーを用いて合成されている。オリゴマーには7塩基の重複があった。オリゴマーをアニーリングさせて、連結することにより、それぞれ250〜300塩基対の5つのサブユニットを形成した。各サブユニットは、完全な遺伝子を形成するのに正しい順序で集合できるように、その末端に制限部位を有するように設計された。確認すると、この正確な遺伝子は7つの欠失エラーがあることが判った。これらのエラーは、in vitro突然変異誘発を用いて修復され、修復部位を配列決定して確認した。
【0094】
実施例 8 . rBoNTB(H C ) をコードする合成遺伝子の合成とクローニング
Whelanのボツリヌス毒素血清型BのC断片を試験して、下記配列を有するタンパク質の部分をC断片と定義した:
【0095】
大腸菌(E. coli)における発現用合成遺伝子は、A鎖のC断片に対する遺伝子の合成に関する上述の方法で、すなわち、7塩基が重複した+および−鎖の配列に対応する約60〜65塩基の多数のオリゴマーを用いて生産した。オリゴマーをアニーリングさせて、連結することにより、それぞれ250〜300塩基対のサブユニットを形成した。各サブユニットは、完全な遺伝子を形成するのに正しい順序で集合できるように、その末端に制限部位を有するように設計された。B毒素のC断片をコードする合成遺伝子は、以下のとおりであった:
【0096】
クローニング:
超音波処理したIPTG誘導組換えpMAL融合大腸菌(E. coli)培養物の上清を、ELISAおよびクマシーブリリアントブルーで染色したSDS−PAGEゲルによりボツリヌスHC発現産物の存在に関して試験したが、失敗に終わった。非融合産物としてHC断片を発現させる試みは失敗に終わった。pKK233−2中の推定クローン由来のプラスミドDNAの初期特性付けにより、予測されるサイズの挿入配列が存在することが示された。さらに、SDS−PAGEは、誘導後に約50kDaのタンパク質の存在を示した。しかし組換え体は不安定なようであり、これや他の培養物をさらに調製しても、これらの結果を再現することができなかった。その後このアプローチは、融合産物発現のために断念した。
【0097】
実施例 9 .免疫化試験:
発現されたHC融合産物を定量する試みは失敗したが、産物のワクチンとしての可能性を評価するために、マウスで限定的免疫化試験を実施した。最初のワクチン接種では、濃縮された粗大腸菌(E. coli)溶解物を完全フロイント(Freund’s)アジュバントと共に用いた。2週間後、フロイント不完全アジュバントと共にアミロースカラムで精製した発現産物を用いて、マウスを追加免疫した。この時点で、第2群の5匹のマウスに、フロイント不完全アジュバント中のアミロース精製産物を単回ワクチン接種として投与した。さらに2週間後、両群を毒素のLD50の3倍量を腹腔内投与してチャレンジした。HCによる2回の免疫化を受けた11匹のマウスすべてが生き残り、一方pMALベクター単独を投与された12匹中6匹の対照マウスが死亡した。同様に、1回のHCワクチン接種を受けた5匹のマウスすべてが生き残り、一方pMALベクター単独を投与されたマウスは死亡した。
【0098】
毒素のLD50の3倍で初回チャレンジの4週間後、2回の免疫化を受けた11匹中9匹のマウスに毒素のLD50用量の30、300、または1200倍を暴露した。LD50の30および300倍の毒素によるチャレンジで倒れたマウスは、18時間後に健常に見えたため、ボツリヌス毒素中毒に典型的な死を示さなかったが、それから数時間後死んでいた。対照的に、LD50用量の1200倍で死んだマウスは、18時間後に検査すると瀕死状態に見え、死亡するまでそのままだった。この反応は、ボツリヌス毒素誘導性麻痺で通常観察される症候に一致する。2回目のチャレンジに関する追加のデータを表5に示す。従って、遺伝子工学的に操作された毒素による免疫化は、大量の毒素に対して防御することが示された。
【0099】
また、遺伝子工学的に操作された毒素を用いて抗体を産生することができる。この毒素は、動物において病原性ではないため、大量の抗毒素をより安価に生産することができる。また、ハイブリドーマ法を用いて抗毒素を生産することができる。
【0100】
【表5】
【0101】
実施例 10 rBoNTA(H C ) 精製および防御効果
組換えBoNTA(HC)ペプチドを、酵母中で組換えにより産生させた。BoNTA(HC)の精製プロセスの第1工程は、ストリームライン(Streamline)拡張床クロマトグラフィーカラムであった。産物を塩化ナトリウムの段階的勾配により溶出した。拡張床クロマトグラフィーカラムから溶出した産物は、0.92mg/mlの総タンパク質濃度で純度10%と推定された。塩類を透析除去後、さらに精製するため、この物質をモノS陽イオン交換カラムに充填した。ウェスタンブロットおよびELISAデータは、BoNTA(HC)が110mM塩化ナトリウムでカラムから溶出したことを示した。最終精製工程としてモノSプールをHICに付して、この物質を1.5M硫酸アンモニウムに調整した。モノS産物をHICカラムに充填して、低下する硫酸アンモニウム勾配で溶出した。1.04M硫酸アンモニウムで溶出した産物と、BoNTA(HC)免疫陽性画分とを合わせて、透析して硫酸アンモニウムを除去した。50kDaのBoNTA(HC)バンドだけをSDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析により検出したが、これは最終工程後には純度95%を超えると判定された。この精製物質の防御効果を、マウスを1回投与で免疫化し、続いてBoNTA(HC)のLD50の1000倍でチャレンジすることにより測定した。結果は以下の表6に示す。
【0102】
【表6】
【0103】
実施例 11 rBoNTB(H C ) 精製および防御効果
組換えBoNTB(HC)ペプチドを、酵母中で組換えにより産生させた。BoNTB(HC)の精製プロセスに利用される第1の分離法は、ストリームラインクロマトグラフィー(Pharmacia)であり、これは、単回通過拡張床吸着操作であり、粗供給ストックまたは細胞溶解物から前もって清澄化することなくタンパク質を回収することができる。MES緩衝液系がSP樹脂への不必要なタンパク質の結合をかなりの割合で妨げるため、この工程で顕著に浄化された。タンパク質を、カラムに樹脂1mLあたり123mgの濃度で、10mM NaClを含む20mM MES緩衝液、pH5.7を用いて充填した。産物のプールを単一工程で溶出した。検討した条件下で、平均して充填した総タンパク質の3.9%を溶出ピークで回収し、産物のプールは、SDS−PAGEに基づくと、約70%のBoNTB(HC)断片であった。
【0104】
本プロセスにおいて第2のクロマトグラフィー工程は、別の強力な陽イオン交換樹脂であるポロス(Poros)HSを利用する。この緩衝液系は、ストリームラインSPに使用したものと類似であるが、ポロスHSの選択性の向上により、産物ピークを純度約85%に富化した。産物ピークは、勾配中に約130mM NaClで溶出した。強力に結合したタンパク質は、1M NaClで溶出した。
【0105】
最終クロマトグラフィー工程は、ポロスPIカラムを利用した。SDS−PAGEおよびIEFによるPI画分の分析によって、SDS−PAGE上で50kDaである産物バンドの単一バンドは、pH8.0画分中に存在することが明らかになった。精製BoNTB(HC)断片の2−D電気泳動による分析によって、PI−ピーク1画分から、1つの主要なスポットと2つの小さな弱いスポットが生じた。ピーク2は、50kDaと47kDaに対応する2つの異なる分子量に幾つかのスポットを含んでいた。おそらくこれらのスポットは、異なるアイソホームを表す。1次元で検出されたIEFのバンドパターンは、2つのピークについてファスト(Phast)IEFで見られたものと一致する。この物質の防御効力は、1回投与に続いてBoNTB(HC)のLD50の1000倍によるチャレンジの力価アッセイにより決定した。結果は、以下の表7に示す。
【0106】
【表7】
【0107】
実施例 12 rBoNTC(H C ) 精製および防御効果
組換えBoNTC(HC)ペプチドを、酵母中で組換えにより産生させた。BoNTC1(HC)の精製プロセスに使用される最初のクロマトグラフィー工程は、モノQ陰イオン交換カラムであった。このカラムを、50mMリン酸ナトリウム、0.2%(W/V)CHAPS、2mM EDTA、pH7.0で平衡化した。CHAPSをカラム緩衝液に導入することで、幅の狭い塩化ナトリウム濃度でカラムから産物を溶出させた。ウェスタン分析によりBoNTC1(HC)陽性の画分をプールして、1M硫酸アンモニウムに調整した。ある程度の沈殿物が生成したが、0.2μ濾過ユニットに通してこれを除去した。清澄化モノQ産物プールを、Pharmaciaアルキルスーパーロース(superose)カラムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーに付した。この最終工程により、BoNTC1(HC)産物を遊離する不純物の残りを除去したが、この産物は、SDS/PAGEにより判定すると純度98%を超えると推定された。この精製物質の防御効果は、マウスを1回投与により免疫化し、続いてBoNTC1(HC)のLD50の1000倍でチャレンジすることにより測定した。結果は、以下の表8に示す。
【0108】
【表8】
【0109】
理解の明瞭さを目的に、前述の発明は、特定の実施態様と共に説明と実施例により、ある程度詳細に記述されているが、他の態様、利点および変法も本発明が属する技術分野の当業者には明らかであろう。前述の説明と実施例は、例示目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。医学、免疫学、ハイブリドーマ法、薬理学、および/または関連分野における当業者に明らかな、本発明を実施するための上述の様式の変法は、本発明の範囲内に含まれることが意図されており、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【0110】
本明細書において言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の技術水準を示している。全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願を、特定して個々に参照することにより組み込むことが示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れるものとする。
【0111】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、BoNT血清型AのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図2】
図2は、BoNT血清型AのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図3】
図3は、BoNT血清型AのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図4】
図4は、BoNT血清型BのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図5】
図5は、BoNT血清型CのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図6】
図6は、BoNT血清型DのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図7】
図7は、BoNT血清型EのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図8】
図8は、BoNT血清型EのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図9】
図9は、BoNT血清型FのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図10】
図10は、BoNT血清型GのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図11】
図11は、BoNT血清型AのHN断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図12】
図12は、BoNT血清型BのHN断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図13】
図13は、BoNT血清型CのHN断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図14】
図14は、BoNT血清型DのHN断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図15】
図15は、BoNT血清型EのHN断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図16】
図16は、BoNT血清型FのHN断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図17】
図17は、BoNT血清型GのHN断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図18】
図18は、BoNT血清型FのHC断片をコードする合成遺伝子の配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。
【図19】
図19は、(A)天然ボツリヌス菌DNA中の推定上の断片C領域のAT塩基含量、(B)合成遺伝子の最初の設計(rBoNTF(HC)1)後のAT含量の減少、(C)ピキア・パストリス(P. pastoris)中で組換えrBoNTF(HC)を発現させるために使用される最終遺伝子設計(rBoNTF(HC)2)のAT含量を示す。
【図20】
図20は、rBoNTF(HC)精製に沿った種々の段階の試料の(A)SDS−PAGEおよび(B)ウェスタンブロットを示す。両方の図からのレーンは、レーン1を除いて同一であり、レーン1では、SDS−PAGEは、ノベックス(Novex)マーク12広範囲分子量マーカーを示し、ウェスタンブロットは、ノベックス・シー・ブルー(Novex See Blue)染色済分子量マーカーを示す。レーン2は細胞溶解物であり、レーン3は細胞抽出物であり、レーン4は透析後の細胞抽出物であり、レーン5はモノS(Mono S)カラムクロマトグラフィー後のrBoNTF(HC)陽性画分のプールであり、そしてレーン6は、疎水性相互作用クロマトグラフィー後のrBoNTF(HC)陽性画分のプールである。
【図21】
図21は、逐次クロマトグラフィーによるrBoNTF(HC)の精製を示す。(A)ピキア・パストリス(P. pastoris)からの抽出物のモノS(Mono S)陽イオン交換クロマトグラフィー。タンパク質を次第に上昇するNaCl勾配により溶出した。ウェスタン分析法によるrBoNTF(HC)陽性の画分を個別にプールして、疎水性相互作用クロマトグラフィー(B)にかけ、タンパク質を次第に低下する硫酸アンモニウム勾配により溶出した。両方のパネルにおいて、A280nmでモニターしたタンパク質を左軸に記録し、クロマトグラム上に勾配トレースを重ねて、溶出条件を右軸に記録する。
【図22】
図22は、光路長1cmのセル中の10mMリン酸ナトリウム(pH7.0)中の30μg/ml(0.62μM)の精製された可溶性(−)および再可溶化(−)rBoNTF(HC)のCDスペクトルを示す。スペクトルは、応答時間2sおよびバンド幅1nmで10nm/分の走査速度で260〜200nmを走査した4回の集積の平均とした。温度はペルティエ(Peltier)の温度制御装置を用いて20℃に維持した。
Claims (25)
- BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C1、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のカルボキシ末端部分(HC)をコードする核酸であって、大腸菌(Escherichia coli)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)から選択される組換え生物において発現可能である、上記核酸。
- 前記核酸は、配列番号1(血清型A)、配列番号7(血清型B)、配列番号9(血清型C1)、配列番号11(血清型D)、配列番号13(血清型E)、配列番号15(血清型F)、および配列番号17(血清型G)から選択される核酸配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記核酸は、配列番号2(血清型A)、配列番号8(血清型B)、配列番号10(血清型C1)、配列番号12(血清型D)、配列番号14(血清型E)、配列番号16(血清型F)、および配列番号18(血清型G)から選択される、BoNTのHCアミノ酸配列をコードする、請求項1に記載の核酸。
- BoNT血清型B、BoNT血清型C1、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のアミノ末端部分(HN)をコードする核酸であって、大腸菌(Escherichia coli)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)から選択される組換え生物において発現可能である、上記核酸。
- 前記核酸は、配列番号21(血清型B)、配列番号23(血清型C1)、配列番号25(血清型D)、配列番号27(血清型E)、配列番号29(血清型F)、および配列番号31(血清型G)から選択される核酸配列を含む、請求項4に記載の核酸。
- 前記核酸は、配列番号22(血清型B)、配列番号24(血清型C1)、配列番号26(血清型D)、配列番号28 (血清型E)、配列番号30(血清型F)、および配列番号32(血清型G)から選択されるBoNTのHNアミノ酸配列をコードする、請求項4に記載の核酸。
- 前記核酸の配列は、HCをコードする少なくとも一部のコドンを、宿主生物での発現に好ましいコドンから選択することにより設計される、請求項1、3、4、または6のいずれか1項に記載の核酸。
- 宿主生物は、グラム陰性細菌、酵母、および哺乳動物細胞系から選択される、請求項7に記載の核酸。
- 宿主生物は、大腸菌(Escherichia coli)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項8に記載の核酸。
- HCをコードする核酸配列は、グアノシンとシトシン残基が富化されたHC配列を提供する、HCをコードするコドンを選択することにより設計される、請求項1、3、4、または6のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記核酸は合成核酸である、請求項1、3、4、または6のいずれか1項に記載の核酸。
- HCまたはHNをコードする核酸は、組換え宿主生物において、HCの野生型ボツリヌス菌(Clostridum botulinum)配列を有する同じHC配列をコードする第2の核酸断片よりも高い収率で発現される、請求項1、3、4、または6のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項1、3、4、または6のいずれか1項に記載の核酸を含む発現ベクターであって、HCまたはHNが、該発現ベクターを用いて宿主生物をトランスフェクトすることにより発現される、上記発現ベクター。
- BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のカルボキシ末端部分(HC)またはボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のアミノ末端部分(HN)を含むポリペプチドの調製方法であって、HCまたはHNが発現される条件下で請求項13の発現ベクターでトランスフェクトされた組換え宿主生物を培養することを含んでなる、上記方法。
- 組換え宿主生物は真核生物である、請求項14に記載の方法。
- 宿主生物から不溶性タンパク質を回収し、それによりHCまたはHNが濃縮された画分を得る、請求項14に記載の方法。
- 宿主生物はピキア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項16に記載の方法。
- BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のカルボキシ末端部分(HC)を含む免疫原性組成物。
- HCをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた組換え生物を培養することによりHCを調製する、請求項18に記載の免疫原性組成物。
- HCが濃縮された不溶性タンパク質画分を、該組換え生物から回収する、請求項19に記載の免疫原性組成物。
- BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のアミノ末端部分(HN)を含む免疫原性組成物。
- HNをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた組換え生物を培養することによりHNを調製する、請求項15に記載の免疫原性組成物。
- HNが濃縮された不溶性タンパク質画分を、該組換え生物から回収する、請求項16に記載の免疫原性組成物。
- BoNT血清型A、BoNT血清型B、BoNT血清型C、BoNT血清型D、BoNT血清型E、BoNT血清型F、およびBoNT血清型Gよりなる群から選択される、ボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のカルボキシ末端部分(HC)またはボツリヌス神経毒(BoNT)の重鎖のアミノ末端部分(HN)に含まれるエピトープであって、それぞれのBoNT血清型に対して防御免疫を誘発する該エピトープを含むポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
- 免疫原性組成物は動物のそれぞれのBoNT血清型に対するELISA応答を誘発し、該ELISA応答は該動物の血清が100倍希釈されていも検出可能である、請求項25に記載の免疫原性組成物。
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