KR101788340B1 - 미처리된 및 부분적으로 처리된 신경독 타입 ａ를 결정하기 위한 시스템 - Google Patents

미처리된 및 부분적으로 처리된 신경독 타입 ａ를 결정하기 위한 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경독 제조중에 안정성 및 품질제어용 도구에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 캡처 항체를 부분적으로 처리된 및 미처리된 보툴리눔 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)에 결합시키는 조건하에서 부분적으로 처리된 및 미처리된 BoNT/A에 특이적으로 결합한 캡처 항체와 용액 시료를 접촉하여 복합물을 형성하는 단계, 및 상기 형성된 복합물의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 양이 상기 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A의 양을 나타내는, 처리된 및 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A를 포함한 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법을 실시하기 위한 장치 및 키트를 고려한다.

Description

미처리된 및 부분적으로 처리된 신경독 타입 Ａ를 결정하기 위한 시스템{SYSTEM FOR DETERMINING UNPROCESSED AND PARTIALLY PROCESSED NEUROTOXIN TYPE A}
본 발명은 신경독 제조중에 안정성 및 품질제어용 도구에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 캡처 항체를 부분적으로 처리된 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)에 결합시키는 조건하에서 부분적으로 처리된 및 미처리된 BoNT/A에 특이적으로 결합한 캡처 항체와 용액 시료를 접촉하여 복합물을 형성하는 단계, 및 상기 형성된 복합물의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 양이 상기 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A의 양을 나타내는, 처리된 및 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A를 포함한 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법을 실시하기 위한 장치 및 키트를 고려한다.
보툴리누스균 및 파상풍균(Clostridium botulinum and Clostridium tetani ) 은 매우 강력한 신경독, 즉 보툴리눔 독소(BoNT) 및 파상풍 독소 (TeNT)를 각각 생성한다. 이들 크로스티리디아성 신경독은 뉴런 세포에 특이적으로 결합하고 신경전달물질의 방출을 방해한다. 각각의 독소는 비활성 미처리된 약 150 kDa 단쇄 단백질로서 합성된다. 번역후 처리는 디설피드 가교의 형성 및 세균성 프로테아제에 의한 단백질 분해(상성) 제한을 수반한다. 활성 신경독은 2개의 사슬, 대략 50 kDa의 N-말단 경쇄 및 대략 100kDa의 C-말단 중쇄로 이루어지고, 이들은 디술피드 결합에 의해서 결합한다. 신경독은 구조적으로 및 기능적으로 3개의 영역; 즉 촉매 경쇄, 전좌영역을 포함한 중쇄의 N-말단 절반 및 수용기 결합 부위를 함유한 중쇄의 C-말단 절반으로 이루어진다. (Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49 참조.). 보툴리눔 신경독은 150 kDa 신경독 단백질 및 관련된 비-신경독 복합 단백질을 포함한 분자의 복합물로서 합성된다. 상기 복합물의 크기는 크로스티리디아성 변종 및 300 kDa으로부터, 500 kDa 초과 및 900 kDa의 범위의 독특한 신경독 항원형에 기초해서 달라진다. 이들 복합물 내의 비독성 복합 단백질은 신경독을 안정화시키고, 그 열화로부터 보호한다(Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26참조).
보툴리누스균은 A 내지 G 라는 7개의 항원에 관련된 독특한 신경독의 항원형을 분비한다. 파상풍균에 의해 분비된 관련된 TeNT와 함께 모든 항원형은 SNARE 단백질을 절단함으로써 시냅스 엑소사이토시스를 차단하는 Zn2 + 엔도프로테아제이다(Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759 참조). CNT는 보툴리눔 중독증 및 파상풍에서 발견되는 이완성 근육 마비를 일으킨다 (Fischer 2007, PNAS 104, 10447 참조).
독성 작용에도 불구하고, 보툴리눔 독소 복합물은 많은 질병의 치료제로서 사용되었다. 보툴리눔 독소 항원형 A(BoNT/A)은 사시성, 안검경련 및 다른 장애의 치료용으로 1989년 미국에서 인간에 대해서 승인되었다. BoNT/A 단백질 제제로서 예를 들면, 상품명 BOTOX (Allergan Inc) 또는 상품명 DYSPORT (Ipsen Ltd)가 시판된다. 복합 단백질을 함유하지 않은 개선된 BoNT/A 제제로서 상품명 XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH)가 시판된다. 치료 적용에 대해서, 제제를 근육에 직접 주입해서 치료한다. 약리적인 pH에서, 단백질 복합물로부터 독소를 방출하고 소망의 약리작용을 일으킨다. 보툴리눔 독소의 작용은 일시적이고, 이는 치료작용을 유지하기 위해서 보툴리눔 독소의 반복적인 투여가 필요한 이유이다.
크로스티리디아성 신경독은 수의근 강도를 약하게 하고, 사시증, 국소성 근긴장이상증, 예를 들면 경부 근긴장이상증 및 양성 본태성 안검경련의 치료에 효과적이다. 이들은 안면경련 경감, 및 국소경직 경감시키고, 또한 광범위한 지표, 예를 들면 유장관 장애, 다한증 및 미용성 주름 개선에서 효과적인 것을 나타낸다(Jost 2007, Drugs 67, 669 을 참조한다).
크로스티리디아성 신경독의 제조방법 중, 활성 신경독 폴리펩티드의 정성적 및 정량적 결정 및 품질 관리가 특히 중요하다. 현재 시판된 신경독 제제는 소망의 활성(처리된 또는 성숙한) 신경독 이외에, 다른 양의 단백질 분해의, 미처리된 전구체 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드를 포함한다. 단백질 분해의 미처리된 전구체 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드는 일부 아미노산에서 성숙(활성, 처리된) 신경독 폴리펩티드와 다르다. 따라서, 이들은 화학적 및 물리적 특성을 기초해서 정량적으로 거의 구분할 수 없다. 한편, 전체 단백질 중 단백질 분해의 미처리된 전구체 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드의 일부는 이러한 제제 내에서 중요하고, 즉 그 제제의 특이적 활성에 관련된다.
제제에서 전체의 신경독 함량을 결정하기 위한 분석은 종래에 공지되어 있다. 이들 분석은 lmmuno-PCR 또는 Sandwich ELISA (Lindstrom 2006, Clin Microbiol. Rev. 19(2): 298-314; Volland 2008, J Immunnol Methods 330(1-2): 120-129)에 기초한다. 그러나, 상기 기재된 바와 같이, 전체의 신경독 함량을 분석하기 위한 방법을 적용함으로써 바람직하지 않은 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독의 함량을 결정할 수 없다.
따라서, 제제에서 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 분자, 특히 BoNT/A 분자의 함량을 결정하기 위한 수단 및 방법이 바람직하지만, 아직 이용가능하지 않다.
본 발명은 처리된 및 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)를 포함한 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A의 양을 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은,
i) 항체가 부분적으로 처리된 및 미처리된 BoNT/A에 결합한 조건하에서 부분적으로 처리된 및 미처리된 BoNT/A에 특이적으로 결합한 캡처 항체와 용액 시료를 접촉하여 복합물을 형성하는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 형성된 복합물의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 복합물의 양은 상기 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A의 양을 나타낸다.
상기 캡처 항체는,
a) SEQ ID NO: 1 (TKSLDKGYNKA) 에 나타낸 아미노산 서열을 포함한 펩티드 면역원에 의해서 면역된 동물로부터 폴리클로날 항혈청을, 상기 폴리클로날 항혈청으로 이루어진 비특이적 항체 및 캡처 펩티드를 포함한 캡처 복합물을 형성한 조건하에서 캡처 펩티드 SLD, LDK 및 YNK에 접촉하는 단계;
b) 상기 폴리클로날 항혈청에서 상기 캡처 복합물을 제거하는 단계;
c) 상기 폴리클로날 항혈청을, 상기 펩티드, 및 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체를 포함한 복합물을 형성하는 조건하에서 SEQ ID NO:1를 포함한 또는 필수적으로 이루어진 펩티드에 접촉하는 단계;
d) 상기 항혈청으로부터 단계 c)에서 형성된 복합물을 제거하는 단계; 및
e) 상기 복합물로부터 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체를 방출하는 단계를 포함한 방법에 의해서 얻어질 수 있다.
본 발명의 방법은 전체 또는 적어도 일부 자동화에 의해서 분석될 수 있다. 이러한 자동화는 상기 용액에서 상기 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A의 양의 결정에 적당한 알고리즘을 실시한 로보트 장치 또한 컴퓨터 시스템을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 단계 i) 및 ii)의 전, 후 또는 사이에 실시된 추가의 단계를 포함할 수 있다. 일 형태에서, 이러한 추가의 단계는 시료의 전처리 단계, 세정 또는 정제 단계 또한 데이터 마이닝(data mining) 단계를 포함할 수 있다. 일 형태에서, 상기 단계는 수반한 실시예에 관련된 것을 포함한다.
본원에서 사용된 "부분적으로 처리된 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)"는 단쇄 전구체로부터 성숙한 2쇄 폴리펩티드로 처리되지 않거나 단지 부분적으로 처리된, 아직 성숙하지 않은 신경독 항원형 A 폴리펩티드를 의미한다. BoNT/A는 보툴리눔 신경독의 7개의 항원형 중 하나이다. 이는 번역 후 단백질 분해 처리된 1쇄 전구체 분자로서 생성된다. 상기 1쇄 분자는 N-말단 경쇄, 링커 펩티드, 및 C-말단 중쇄를 포함한다. 하나의 단쇄 분자의 단백질 분해 처리중에, 링커 펩티드를 적출해서 중쇄 및 경쇄를 포함하지만 링커 펩티드를 갖지 않는 성숙한 2쇄 분자를 생성한다. 링커 펩티드는 2개의 프로테아제 절단 부위의 옆에 있다. 따라서, 단백질 분해 활성 중에, 부분적으로 처리된 분자가 발생할 것이다. 측면에 있는 프로테아제 절단 부위 중 하나에서만 이들 부분적으로 처리된 분자를 절단해서 링커 펩티드가 경쇄 또는 중쇄에 결합할 것이다. 이러한 분자는 본 발명의 목적에 대해서 부분적으로 처리된 BoNT/A 폴리펩티드라고 한다.
적당한 처리 결과로서, "처리된 BoNT/A"를 얻었다. 상기 처리된 BoNT/A 폴리펩티드는 신경독의 특징인 생화학적 특성, 즉 (a)수용체 결합, (b) 내면화, (c) 엔도솜 멤브레인에 걸친 경쇄가 시토콜로 전좌 및/또는 (d) 시냅스 소포 멤브레인 결합에서 수반된 단백질의 세포내 단백질 분해 절단을 나타낸다. 따라서, 처리된 BoNT/A 폴리펩티드는 활성 또는 성숙 신경독 폴리펩티드라고 하는 경우가 있다. 일 실시형태에서 생물학적 활성은 상기 모든 생물학적 특성에 의한 것이다. 생물적 활성을 평가하기 위한 생체내 실험 분석은 Pearce 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77 and Dressler 2005, Mov Disord 20:1617-1619에 기재된, 생쥐 LD50분석 및 생체외 생쥐 편측 횡격막 분석을 포함한다. 생물적 활성은 일반적으로 생쥐 유닛(MU)으로 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 1 MU는 신경독 성분의 양으로, 복강내 주입 후 특이한 생쥐 개체수의 50%를 죽이는, 즉 생쥐의 LD50이다.
일 형태에서, BoNT/A는 보툴리누스균의 Hall 변종로부터 얻어지고, 또 다른 형태에서 Beecher 1997, J Protein Chem 16: 701-712 or Krieglstein 1994, J Protein Chem 13: 49-57에 기재된 구조(즉, 아미노산 배열)을 갖는다. 또한, BoNT/A를 인코딩하기 위한 아미노산 및 핵산 서열은 GenBank Accession numbers ABD65472.1 또는 GI:89258592 에서 발견되거나 SEQ ID NOs: 2 또는 3에서 표시된다. 일 형태에서, 링커 펩티드의 옆에 있는 프로테아제 절단 부위는 아미노산 K438/T439과 K448/A449 사이에 있다. 따라서, 링커 펩티드는 기본적으로 아미노산 T439 내지 아미노산 K448로 이루어진다.
그러나, 본 발명의 방법은 상기 BoNT/A의 변형도 포함한다. 일 형태에서, 상기 변형은 SEQ ID NO: 2에서 표시된 바와 같은 BoNT/A의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 의해서 인코딩된 아미노산 서열에 비해서, 아미노산 첨가, 치환 및/또는 결실 중 하나를 포함한 아미노산 서열을 갖는 신경독 폴리펩티드이다. 또 다른 실시형태에서, 변형 신경독은 SEQ ID NO:2에서 표시된 바와 같은 BoNT/A의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:3에 의해서 인코딩된 아미노산 서열과 40% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 아미노산 서열은 미처리된 BoNT/A 폴리펩티드의 아미노산 서열을 표시한다. 상응한 부분적으로 처리된 또는 처리된 신경독 폴리펩티드의 서열은 본원에 그 외에 제공된 절단 부위 및 링커 펩티드에 대한 정보에 의해서 상기 서열로부터 추론될 수 있다. 본 발명의 또 다른 형태에서, 변형 BoNT/A 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에서 표시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 서열에 의해서 인코딩된 아미노산 서열과 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에서 사용된 동일은 아미노산 서열의 서열 동일성을 의미하고, 상기 서열은 가장 높은 차수 매치를 얻을 수 있도록 배열한다. 이것은 예를 들면 BLASTP, BLASTN, FASTA, Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403과 같은 컴퓨터 프로그램에서 코드화된 방법 또는 공지된 방법을 사용해서 얻을 수 있다. 동일성 값은 일 형태에서 전체의 아미노산 서열에 대해서 산출된다. 다양한 알고리즘에 기초한 일련의 프로그램은 다른 서열과 비교하기 위해서 당업자에게 이용가능하다. 이러한 점에서, Needleman 및 Wunsch or Smith 및 Waterman의 알고리즘은 특히 신뢰할만한 결과를 제공한다. 서열 배열을 실시하기 위해서, GCG software packet (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)의 일부분인, 프로그램 PileUp (1987, J Mol Evolution 25, 351; Higgins 1989 CABIOS 5, 151) 또는 프로그램 Gap 및 BestFit (Needleman 및 Wunsch 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 및 Waterman 1981, Adv Appl Math 2, 482)이 사용된다. 상기 %로 기재된 동일성 값은 본 발명의 일 형태에서 전체의 서열 영역에 대해서 하기의 셋팅: Gap Weight: 50, Length Weight:　3, Average Match: 10.000 및 Average Mismatch: 0.000인 프로그램 GAP를 사용하여 결정되고, 이는 달리 기재되어 있지 않으면 서열 배열에 대한 표준 셋팅으로 사용될 것이다.
본 발명의 상기 변형은 일 형태에서 BoNT/A의 생물학적 특성의 적어도 하나 및 또 다른 형태에서 BoNT/A의 생물학적 특성의 모두를 유지한다. 부분적으로 처리된 및 미처리된 변형 BoNT/A 폴리펩티드는 본 발명의 방법에서 적용된 항체에 의해서 특이적으로 결합될 수 있는 것이 고안된다. 일 형태에서, 이것은 링커 펩티드에서 SEQ ID NO:1를 포함한 펩티드 서열의 존재에 의해서 달성될 수 있다.
또 다른 형태에서, BoNT/A의 변형은 개선된 또는 변형된 생물학적 특성을 갖는 신경독일 수 있고, 예를 들면 이들은 효소 인식에 대해서 개선되거나 또는 수용체 결합 또는 상기 기재된 임의의 다른 특성이 개선될 수 있는 절단 부위를 포함한다.
일반적으로, 강조 개념은 상기 방법에 적용된 항체가 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드를 특이적으로 인식할 수 있는 것이면, 절단 부위의 상태 및 이들 사이에 특정한 아미노산 서열은 문제가 되지 않지만, 신경독 폴리펩티드의 경쇄 및 중쇄 사이에서 하나 이상의 절단 부위의 존재에 의존하기 때문에 본 발명의 방법을 변경하는 것을 고려할 수 있다. 따라서, 프로테아제 인식 부위 및/또는 중쇄와 경쇄 사이의 링커 펩티드가 대체된 변형 신경독을 적용한 것이다. 이러한 형태에서 적용될 항체는 링커 펩티드 또는 그 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있다.
또 다른 형태에서, SEQ ID NO:1을 포함한 BoNT/A의 링커 펩티드는 예를 들면 핵산 재조합 방법에 의해서 다른 신경독 항원형의 링커에 도입될 수 있고, 본 발명의 방법을 적용함으로써 시료에서 상기 다른 신경독 항원형의 미처리된 및 부분적으로 처리된 폴리펩티드의 양을 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용된 "양"은 폴리펩티드의 절대적인 양, 상기 폴리펩티드의 상대적인 양 또는 농도 또한 이들과 상관관계가 있거나 이들로부터 유도될 수 있는 임의의 값 또는 변수를 포함한다.
본원에서 사용된 "용액"은 성숙한 BoNT/A 폴리펩티드 및 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A 폴리펩티드 전구체를 함유한 임의의 용매 시스템을 의미한다. 상기 용매 시스템은 용매를 포함한다. 본 발명의 다양한 형태에서 용매는 물, 수성 버퍼 시스템, 유기 용매 및 이온 액체이다. 본 발명의 일 형태에서, 이는 수성 용매 시스템이다. 또한, 성숙한 BoNT/A 폴리펩티드 및 부분적으로 처리된 또는 미처리된 전구체 폴리펩티드 및 용매 이외에 용매 시스템은 세균성 폴리펩티드를 포함한 분자도 포함할 수 있다. 일 형태에서, 본 발명의 방법에 적용될 용액은 세균성 세포 배양액 또는 이러한 세균성 세포 배양액으로부터 부분적으로 정제된 또는 이들로부터 정제된 제제일 수 있다.
본원에 사용된 "시료"는 본 발명의 방법에 의해서 조사될 상기 용액의 일부를 의미한다. 시료는 BoNT/A 및 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A 전구체를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 형태에서, 상기 시료는 소정의 부피 및/또는 소정의 총 단백질 함량을 갖는다. 또 다른 형태에서, 시료는 세포외에서 공급된 분자 표준을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서 사용된 캡처 항체에 용액의 시료를 접촉하는 단계는 캡처 항체 및 시료로 이루어진 상기 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 BoNT/A 폴리펩티드를 물리적으로 근접시켜서 물리적 및/또는 화학적 상호작용을 일으키는 것을 의미한다. 특이적 상호작용을 하는 적당한 조건은 주로 당업자에게 공지된다. 상기 조건은 본 발명의 방법에 적용된 항체 및 용액에 따라서 다르고 지체없이 당업자에 의해서 적용될 수 있다. 또한, 상호작용을 일으키는 데에 충분한 시간은 지체없이 당업자에 의해서 결정될 수 있다. 상기 시간은 상기 방법을 온도, 용매, 조성, pH 값에서 실시한 외생요인에 따라서 다를 것이다. 또한, 본 발명의 방법에서 인용된 접촉한 단계 사이에 접촉에 적당한 상태를 얻기 위해서 세정단계를 실시할 수 있는 것을 알 수 있다. 예를 들면, 단계 i)에서 복합물의 형성 후에, 상기 복합물에 대한 검출제를 적용하기 전에 잔류 용액을 제거할 수 있다.
본 발명의 방법의 일 형태에서, 단계 i) 중에 세제가 존재한다. 따라서, 단계 i) 전에 또는 중에 세제를 시료에 첨가하는 것이 고안된다. 적당한 세제는 이온 및 비-이온성 제제를 들 수 있다. 일 형태에서, 상기 제제는 비이온성 제제이고, 또 다른 형태에서 Tween 20 (폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우레이트)이다.
본 발명의 방법의 일 형태에서, 상기 세제는 0.01%(v/v) 내지 10%(v/v)의 범위의 농도에서 존재한다. 또 다른 형태에서, 상기 농도는 0.2%(v/v) 내지 0.8%(v/v)의 범위, 0.3%(v/v) 내지 0.6%(v/v)의 범위, 및 또 다른 형태에서 농도는 0.5%(v/v)이다.
본 발명의 방법의 또 다른 형태에서, 단계 i)에서 조건은 인산 완충 또는 트리스 완충 생리식염용액의 존재를 포함한다. 일 형태에서, 상기 식염수 용액은 150 내지 350 mM의 농도의 NaCl를 포함한다. 또 다른 형태에서, 상기 농도는 200 내지 300 mM의 범위이고, 또 다른 형태에서 농도는 250 mM이다.
본원에 사용된 바와 같이 "양을 결정하는 단계"는 절대적인 양, 상대적인 양 또는 농도를 정량적 또는 정성적으로 측정하는 단계에 관련된다. 측정은 단계 i)에서 형성된 복합물의 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성에 기초해서 실시할 것이다. 상기 복합물의 양은 직접 또는 간접적으로 결정될 수 있다. 일 형태에서, 검출제는 형성된 복합물과 상호작용하는 것을 적용한다. 상기 검출제는 검출된 복합물의 양과 상호관계가 있는 검출성 라벨을 포함하거나 발생시키고, 그 양을 결정한다. 일 형태에서, 상기 검출제는 복합물에서 존재한 미처리된 또는 부분적으로 처리된 BoNT/A 또는 캡처 항체에 결합한다. 따라서, 또 다른 형태에서, 검출제가 단계 i)에서 형성된 복합물에서 존재한 경우에, 이는 캡처 항체 또는 부분적으로 처리된 또는 미처리된 BoNT/A 또는 둘다에 결합한 항체, 결합 펩티드(예를 들면, BoNT/A 수용체 또는 그 일부), 압타머(aptameter) 또는 작은 분자 화합물일 것이다.
일 형태에서, 검출제는 검출성 라벨을 포함한다. 일 형태에서, 검출성 라벨은 형광제 또는 화학형광 특성을 갖고, 따라서 검출제의 직접적인 검출이 가능하다. 일반적인 형광 라벨은 형광제 단백질(예를 들면 GFP 및 그 유도체), Cy3, Cy5, Texas Red, Fluorescein, 및 Alexa dyes(예를 들면, Alexa 568)를 들 수 있다. 다른 형태에서, 상기 라벨은 방사성 라벨일 수 있다. 일반적인 방사성 라벨은 35S, 125I, 32P, 33P 등을 들 수 있다. 또 다른 형태에서, 검출제는 예를 들면 기질의 변환에 의해서 검출성 신호를 발생시킬 수 있는 효소 활성을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 효소는 퍼옥시다제(예를 들면, 겨자무과 산화효소), 반딧물의 루시퍼라제 또는 알카리성 포스파타제일 수 있다. 상기 형태의 라벨은 검출제에 직접(공유 또는 비공유) 결합될 수 있다. 상기 직접적인 라벨링 이외에, 검출제는 본 발명의 방법의 또 다른 형태에서 간접적으로 라벨링할 수 있다. 상기 간접적인 라벨링은 검출제에 특이적으로 결합하고 검출성 라벨을 갖는 제제의 결합(공유 또는 비공유)을 포함한다. 이러한 제제는 예를 들면 검출제에 특이적으로 결합한 제 2 (고차수) 항체일 수 있다. 이러한 경우에 제 2 항체는 검출성 라벨에 결합될 것이다. 검출성 복합물의 검출에 대해서 고차 항체를 사용할 수 있다. 신호를 증가시키기 위해서 고차 항체를 종종 사용한다. 적당한 고차 항체는 시판 라벨링 시스템, 예를 들면 streptavidin-biotin system (Vector Laboratories, Inc.), Dako LSAB™2 and LSAB™ + system (labeled streptavidin-biotin), 또는 Dako PAP system (Peroxidase Anti-Peroxidase)를 포함할 수 있다.
검출제에 의해서 발생 또는 이들로 이루어진 검출성 라벨의 양은 복합물의 양에 직접 상관관계가 있는 것을 알 수 있다. 복합물의 양은 결정될 분자 종의 양, 즉 시료에서 존재한 미처리 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 분자와 상관관계가 있다. 또한, 시료가 용액의 대표적인 부분인 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 시료에 대해서 결정된 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 BoNT/A 폴리펩티드의 양은 상기 용액에 존재하는 양을 나타낸다.
일 형태에서 미처리된 및 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드의 양의 결정은 소정량의 상기 폴리펩티드를 갖는 표준 용액을 적용함으로써 상기 방법의 검량을 필요로 한다. 이러한 검량을 실시하는 방법은 당업자에게 공지된다. 일 형태에서, 여러 결정은 소정량의 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독과 다른 2개 이상의 상기 표준 용액의 시료에 대해서 본 발명의 방법을 적용함으로써 실시된다.
따라서, 본 발명의 방법의 일 형태에서, 단계 ii)는 복합물의 결정된 양을 참조문헌과 비교한 것을 포함한다. 일 형태에서, 상기 참조문헌은 상기 기재된 바와 같이 2개 이상의 표준 용액으로부터 유도된 검량 곡선이다. 비교 결과, 결정된 복합물 양은 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 BoNT/A 폴리펩티드의 소정량으로 할당될 수 있다.
미처리된 BoNT/A 폴리펩티드는 상기 프로테아제의 절단 부위에서 변이된 BoNT/A 폴리펩티드 전구체를 발현한 보툴리누스균 변종으로부터 얻을 수 있다. 이러한 변종은 종래에 공지된 표준 분자 생물학 방법에 의해서 발생할 수 있다. 또한, 미처리된 BoNT/A는 대장균 또는 단백질 분해 절단에 의해서 BoNT/A를 활성화할 수 있는 프로테아제를 함유하지 않는 다른 세균에서 상기 BoNT/A를 재조합해서 발현함으로써 얻을 수 있다. 또 다른 형태에서, 프로테아제 활성이 상당히 감소하거나 전혀 없는 변종을 검출하고 미처리된 신경독을 형성하기 위해서, 보툴리누스균 세균성 세포 또는 다른 발현 시스템을 변형시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 부분적으로 처리된 및 미처리된 BoNT/A 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 캡처 항체를 필요로 한다. 이러한 항체는, 일 형태에서 상기 기재된 단계 a) 내지 e)를 포함한 상기 기재된 방법에 의해서 얻어질 수 있다. 본원에 사용된 용어는 다음에 설명된다.
본원에 사용된 "항체"는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단쇄 항체, 인간, 인간화, 성숙화(primatized), 또는 키메라 항체, 이중특이적 항체, 합성 항체, 화학적으로 또는 효소적으로 개질된 유도체, 자연적으로 발생하는 및/또는 화학적으로 개질된 핵산으로 이루어진 상기 항체 또는 압타머(aptamer) 중 어느 하나의 파편을 포함한다. 상기 항체의 파편은 F(ab')2, F(ab), Fv 또는 scFv 파편 또는 이들 파편 중 어느 하나의 화학적으로 또는 효소적으로 개질한 유도체를 포함한다. 본 발명의 항체는 상기 펩티드가 부분적으로 처리되거나 미처리된 신경독 폴리펩티드로 합성된다면 상기 펩티드로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합할 것이다.
"특이적으로 결합"은 본 발명의 항체가 일반적으로 상기 부분적으로 처리된, 또는 상기 미처리된 신경독 폴리펩티드 또는 다른 폴리펩티드에 다른 에피토프와 상당한 정도로 교차 반응하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 형태에서, 본 발명의 항체는 상기 활성적인, 완전히 처리된 신경독 폴리펩티드와 교차 반응하지 않는다. 에피토프 특이성은 본 발명의 항체의 중요한 특징이다. 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 대 처리된 신경독에 대한 항체의 특이성은 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상 또는 98% 이상, 99% 이상이다. 특이적 결합은 각종 공지의 방법, 예를 들면 경쟁적인 연구 또는 SDS PAGE의 웨스턴 블롯 분석에 의해서 시험할 수 있다. 또 다른 중요한 특성은 항체의 감도이다. 본 발명의 형태에서, 감도는 시료로 이루어진 처리된 신경독의 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상이 결합되도록 할 것이다. 감도는 공지의 방법에 의해서 시험할 것이다. 당업자는 일상 실험을 사용하여 각각의 결정을 위한 조작 및 최적의 분석 조건을 결정할 수 있다. 결합 연구에 대한 종래의 방법은 방사면역측정, ELISA, 평형 투석, 등온 미소열량 측정, BIACORE® 분석 (표면 플라즈몬 공명, SPR) 또는 다른 표면 흡착 방법을 포함한다. 본 발명의 항체의 감도와 같은 결합 특성은 이론상으로 센서 표면에 나타낸 고정된 항원(리간드)을 사용한 결합 연구에 의해서 결정될 수 있다. 시험될 항체(검체)는 이동상, 즉 용액으로 제공될 것이다. 일부 경우에, 항원은 상기 캡처 분자라고 하는 또 다른 고정된 분자와의 결합을 통해서 표면에 간접적으로 부착된다. 항체는 고정된 항원을 갖는 표면에 별개의 펄스로 주입하면, 기본적으로 3개의 상태로 나눌 수 있다: (i) 시료 주입중에 항원과 항체의 결합, (ii) 항체 결합 속도가 항체-항원 복합물로부터 해리되어 균형을 유지한 시료의 주입중에 평형 또는 정상상태, (iii) 버퍼흐름동안 표면으로부터 항체의 해리. 이러한 분석은 이동상으로서 항원 함유 용액 및 조사될 고정된 항체를 이용하여 교대로 실시될 수 있다. 결합 및 해리 상태는 검체-리간드 상호작용의 키네틱에 대한 정보를 제공한다 (ka 및 kd, 복합물 형성 및 해리 속도, kd/ka=KD). 평형상태는 검체-리간드 상호작용(KD)의 친화성에 대한 정보를 제공한다. 본 발명의 형태에서, 본 발명의 항체는 0.5μM 미만의 KD를 갖고, 일 형태에서 0.05μM 미만, 또 다른 형태에서 0.02μM 미만이다.
본 발명의 방법에 적용된 항체는 일 형태에서 높은 감도 및 특이성을 갖는 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드의 검출이 가능하고, 일 형태에서 검출 한계는 1000 pg/mL 미만, 300 pg/mL 미만, 100 pg/mL 미만, 일 형태에서 50 내지 80 pg/mL, 또 다른 형태에서 69 pg/mL이다. 또 다른 형태에서, 검출 한계는 30 pg/mL 미만, 10 pg/mL 미만, 3 pg/mL 미만, 일 형태에서 1 pg/mL 이하일 수 있다.
본 발명에서 칭하는 항체는, 예를 들면 Harlow 및 Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 Kohler 1975, Nature 256, 495, 및 Galfre, 1981, Meth Enzymol 73, 3에 기재된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 상기 방법은 면역된 포유류로부터 유도된 생쥐골수종 세포와 비장세포의 결합 단계를 포함한다. 항체는 공지된 방법에 의해서 더욱 개선될 수 있다. 예를 들면, BIACORE®system 에서 사용된 표면 플라즈몬 공명이 사용되어 단백질 분해의 미처리된 신경독 폴리펩티드 내에서 상술한 에피토프에 결합한 파지 항체의 효율을 증가시킬 수 있다. (Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J. Immunol Methods 183, 7 참조)
상기 기재된 "펩티드 면역원"은 비인간 동물의 면역 반응을 유도하는 방법으로 제공된, SEQ ID NO: 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 의미한다.
일 형태에서, SEQ ID NO:1을 갖는 상기 펩티드는 종래에 공지된 임의의 링커 또는 결합 절차에 의해서 캐리어 단백질에 결합된다.
또 다른 형태에서, 상기 면역원은 KLH를 더욱 포함하고, 더욱 다른 형태에서 상기 KLH는 링커 N-[감마-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르(GMBS)를 경유한 SEQ ID NO: 1을 갖는 펩티드에 결합된다. 또 다른 형태에서, 상기 KLH를 링커 GMBS를 경유한 SEQ ID NO: 1를 갖는 펩티드에 시스테인, 일 형태에서 C-말단 시스테인을 통해서 결합한다. 링커 분자, 예를 들면 GMBS에 의해서 펩티드에 KLH를 결합하는 방법은 종래에 공지되어 있거나 후술한 실시예에서 기재되어 있다.
또 다른 형태에서, 오발부민은 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 오발부민은 링커 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 통해서 시스테인 잔기에 가교결합되고, 일 형태에서 C 말단 시스테인 잔기에 결합될 것이다. 이러한 형태에서, 상기 시스테인을 C-말단에 첨가한, SEQ ID NO:1의 아미노산 X 내지 Y로 이루어진 펜타펩티드를 사용한 것이 고안된다.
또 다른 형태에서, 비인간 동물은 포유류이고, 일 형태에서는 쥐, 생쥐, 토끼, 양, 또는 염소이다. 본 발명의 방법을 실시하기 전에, 폴리콜로날 항혈청의 소스인 비인간 동물은 상술한 펩티드 면역원을 사용해서 면역될 것이다. 비인간 동물의 면역 방법은 종래공지되어 있거나 후술한 실시예에 기재되어 있다. 상기 면역 결과, 비인간 동물은 펩티드 면역원에 대해서 폴리클로날 항체를 생성할 것이다.
폴리클로날 항혈청은 다양한 방법에 의해서 비인간 동물로부터 얻어질 수 있다. 일 형태에서, 공지되어 있고 후술한 실시예에서 기재된 표준 방법에 의해서 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 얻어진다. "폴리클로날 항혈청"은 상기 동물로부터 정제되고 부분적으로 정제된 혈청을 포함한다. 이러한 폴리클로날 항혈청은 상술한 방법의 원료이다. 폴리클로날 항혈청은 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 BoNT/A 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 소망의 하나 이상의 항체 이외에, 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 BoNT/A 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는 추가의 항체를 포함할 수 있다.
이들 바람직하지 않은 크로스-반응 항체는 폴리클로날 항혈청 및 캡처 펩티드로 이루어진 비특이적 항체를 포함하는 캡처 복합물을 형성하고, 폴리클로날 항혈청으로부터 상기 캡처 복합물을 제거하여 부분적으로 정제된 플리클로날 항혈청을 얻는 조건하에서, 상기 폴리클로날 항혈청을 캡처 펩티드 SLD, LDK 및 YNK와 접촉시킴으로써 소망의 특이적 항체로부터 분리한다. 일 형태에서, 상기 방법에서 수반 실시예에 기재된 유도체의 형태로 상기 캡처 펩티드를 적용할 수 있다.
상기 부분적으로 정제된 폴리클로날 항혈청은 SEQ ID NO:1에서 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 접촉시킨다. 일 형태에서, 상기 펩티드는 본원에서 그 외에 상세하게 기재된 바와 같이 캐리어에 고정한다. 상기 접촉 결과, 잔류한 폴리클로날 혈청으로부터 제거될 수 있는 펩티드와 특이적 항체의 복합물이 형성된다. 특이적 항체는 제거된 복합물로부터 방출될 수 있다. 이러한 복합물로부터 항체를 방출하는 데에 적당한 방법은 본원에 기재된다.
일 형태에서, 상기 항체를 얻기 위한 방법의 단계 a) 내지 e)는 친화성 크로마토그래피에 의해서 실시된다. 본 발명에서 사용된 친화성 크로마토그래피는 크로마토그래피에서 사용된 정지상에 대해서 다른 친화성에 기초한 이동상의 분자를 분리하는 방법을 말한다. 일 형태에서, 상기 방법은 고정화 리간드로부터 화합물의 선택적 흡착 및 회수를 의미한다. 또 다른 형태에서, 상기 방법은 대상 화합물을 결합하기 위해서 비즈 및 다공성 매트릭스에 대한 적당한 선택적인 리간드를 사용해서 관련된 화합물 및 단백질을 매우 특이적이고 효율적으로 정제한 후, 온화한 조건하에서 회수될 수 있는 것으로 고안된다. 상기 방법은 예를 들면 항원과 항체 사이, 효소와 기질 사이 또는 수용체와 리간드 사이의 매우 특이적 상호작용에 기초한다. 또 다른 형태에서, 칼럼 크로마토그래피로서 상기 친화성 크로마토그래피가 실시된다. 상기 특징적인 친화성 크로마토그래피는 일 형태에서 면역흡수체 크로마토그래피 및, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 가역 상태 크로마토그래피 및 또 다른 형태에서, 본 발명의 항체인 결합제를 적용한 면역친화성 크로마토그래피이다. 일 형태에서, 본원에서 말하는 정지상은 고체 매트릭스로서 상술한 제제로 이루어진다. 상기 제제는 일 형태로 고체 매트릭스에 결합된 폴리펩티드 캐리어에 결합되고, 또 다른 형태에서 고체 매트릭스에 커플링된 단백질 A에 결합된다.
본 발명의 방법을 실시하기 위해서, 캡처 항체는 고체 담체에 공유 또는 비공유결합될 수 있다. 이러한 고체 담체 물질이 또한 공지되어 있고, 특히 세파로오스, 세파덱스; 아가로스, 세파셀, 마이크로셀룰로오스 및 알기네이트-비즈로 이루어진 군으로부터 선택된 시판 다당류 매트릭스, 폴리펩티드 매트릭스, 폴리스티렌 비드, 라텍스 비드, 마그네틱 비드, 콜로이드 금속 입자, 유리, 플라스틱 및/또는 실리콘 칩 및 표면, 니트로셀룰로오스 스트립, 멤브레인, 시트, 듀라시트(duracyte), 반응 트레이의 웰 및 월(well and wall), 플라스틱 튜브를 들 수 있다. 목적의 적용에 따라서, 상기 고체 담체는 별개의 바이엘(separate vials)의 형태이거나 이것으로 구성될 수 있다. 또한, 상기 고체 담체는 멀티-웰 플레이트의 형태이거나 이것으로 구성될 수 있다. 상기 고체 담체에 따라서, 펩티드 및 단백질의 고체 담체의 자유로운 결합 부위를 차단하기 위해서 본 발명의 방법에서 고체 담체의 적용 전에 차단 단계를 실시할 필요가 있다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 BoNT/A 전구체 분자, 즉 미처리된, 하나의 사슬 BoNT/A 및/또는 부분적으로 처리된 BoNT/A의 특이적 결정이 가능하다. 이들 전구체 분자는 통상 치료 또는 화장 목적으로 적용될 BoNT/A 제제에서 바람직하지 않은 오염물이다. 또한, 이들의 함량을 소량까지 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 BoNT/A 제제를 제조하기 위해서 효율적인 품질관리 및 제품 안전성 관리가 가능하다. 또한, BoNT/A 제제를 제조할 때, 정제 및/또는 처리 단계의 효능을 모니터링할 수 있다. 본 발명의 근본적인 연구에서, 폴리클로날 혈청은 염소의 면역원(항링커 펩티드 scBoNT/A-serum)으로서 KLH에 결합된 링커 펩티드를 사용해서 미처리된 보툴리눔 신경독 타입 A(BoNT/A)를 공격한다. 친화성 정제 후에도, 혈청은 SDS PAGE의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석에서 처리된 BoNT/A에 대해서 크로스 반응성을 나타냈다. 크로스 반응성은 링커 펩티드, 또한 처리된 BoNT/A의 경쇄 및 중쇄에서 발생하는 트리펩티드(SLD, LDK 및 YNK)의 인지에 의존한다. 염소 면역혈청의 제 2 배치는 2단계의 친화성 크로마토그래피를 통해서 정제되고, 크로스 반응 트리펩티드 항체를 제거했다. 제 2의 항링커 펩티드 ScBoNT/A-혈청은 웨스턴 블롯에서 처리된 BoNT/A에 대해서 크로스 반응성을 나타내지 않았다.
일 형태에서, 상기 일반적인 단계를 포함한 본 발명의 방법은 다음의 구체적인 단계를 포함한다:
1)상기 기재된 방법에 의해서 얻어진 캡처 항체를 고체 담체(예를 들면, 멀티 웰 플레이트)에 면역시키는 단계
2) 비-고정된 캡처 항체를 세정에 의해서 제거하는 단계
3) 고체 담체에서 자유로운 펩티드/단백질 결합 부위를 적당한 차단 버퍼를 적용함으로써 차단하는 단계(하기 실시예 참조)
4) 차단 버퍼를 세정에 의해서 제거하는 단계
5) 캡처 복합물을 형성한 조건하에서 검량에 사용된 표준 용액 또는 분석될 용액의 시료를 적용하는 단계
6) 결합되지 않은 시료 물질을 세정에 의해서 제거하는 단계
7) 검출 복합물을 형성한 조건하에서 검출제(예를 들면, 효소, 예를 들면 퍼옥시다제에 직접 또는 간접적으로 결합된 제 1, 및 선택적으로 높은 차수의 검출 항체)
8) 결합되지 않은 검출 항체를 세정에 의해서 제거하는 단계
9) 상기 검출제(예를 들면, 검출 복합물에 발색성 기질을 적용하고 광학 밀도의 결정에 의해서 기질 변환을 측정)에 의해서 유도된 상기 검출 신호 결정
그러나, 본 발명의 방법은 상기로부터 유도가능한 임의의 구체적인 단계에 의해서 실시될 수 있다.
본 발명은 처리된 및 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A 폴리펩티드를 포함한 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 양을 결정하기 위한 장치를 고려한다:
i) 상기 기재된 바와 같이 캡처 항체를 포함한 분석 유닛, 상기 분석 유닛은 상기 용액 시료를 상기 캡처 항체와 접촉할 수 있다
ii) 상기 분석 유닛에서 형성된 복합물의 양을 결정하기 위한 리더 시스템 및 결정된 복합물의 양에 기초한 상기 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A 폴리펩티드의 양을 산출할 수 있는 데이타 처리 시스템을 포함한 평가 유닛
본원에 사용된 "장치"는 결정을 하기 위해서 서로 동작가능하도록 결합된 적어도 상기 분석 유닛 및 평가 유닛의 배열을 포함한 시스템에 관한 것이다. 일 형태에서, 배열은 용액 시료와 캡처 항체를 접촉시키기 위해서 상기 기재된 고체 담체, 예를 들면 바이엘의 형태로 존재할 수 있는 상기 기재된 캡처 항체를 고정한 고체 담체일 수 있다. 또한, 상기 장치는 일 형태에서 검출 복합물의 양을 결정하기 위한 리더 시스템을 포함할 수 있다. 사용될 검출제의 종류에 따라서, 이러한 시스템은 발생된 신호의 검출장치를 포함할 것이다. 또한, 유닛은 일 형태에서 리더 시스템으로부터 얻어진 데이터를 처리하기 위해서 컴퓨터 기반 알고리즘을 포함할 수 있다. 상기 알고리즘은 바람직한 폴리펩티드의 양을 산출할 수 있다. 일 형태에서, 이것은 용액 또는 그 시료에서 존재한 폴리펩티드의 양을 결정하기 위해서 검량 표준물질과 측정된 신호를 비교함으로써 달성된다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 캡처 항체를 포함한, 처리된 및 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A 폴리펩티드를 포함한 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 양을 결정하기 위한 키트를 포함한다.
본원에 사용된 "키트"는 상기 기재된 캡처 항체, 및 일 형태에서 본원에 그 외에 기재된 검출제 및/또는 하나 이상의 검량 표준물질의 수집을 의미한다. 상기 키트 성분은 함께 패키징되거나 되지 않을 수 있다. 상기 키트의 성분은 별도의 바이엘(즉, 별도의 부분의 키트로서)로 구성되거나 하나의 바이엘에 제공된다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 언급한 방법을 실시하는 데에 사용되는 것을 알 수 있다. 일 형태에서, 모든 성분은 상기에 언급된 방법을 실시하기 위해서 즉시 제공된다. 또 다른 형태에서, 키트는 상기 방법을 실시하기 위한 설명서를 포함한다. 설명서는 종이 또는 전자 형태의 사용자 메뉴얼로 제공될 수 있다. 예를 들면 메뉴얼은 본 발명의 키트를 사용하여 상기 방법을 실시할 때 얻어진 결과를 해석하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트의 일 형태에서, 상기 키트는 캡처 항체 및 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 BoNT/A 폴리펩티드를 포함한 복합물의 양을 결정하기 위한 하나 이상의 검출체를 포함한다.
본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은 본 명세서에서 구체적으로 기재된 기재 내용 및 그 전체 내용에 대해서 참조로 포함되어 있다.
본 발명은 신경독 제조중에 안정성 및 품질제어용 도구에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 캡처 항체를 부분적으로 처리된 및 미처리된 보툴리눔 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)에 결합시키는 조건하에서 부분적으로 처리된 및 미처리된 BoNT/A에 특이적으로 결합한 캡처 항체와 용액 시료를 접촉하여 복합물을 형성하는 단계, 및 상기 형성된 복합물의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 양이 상기 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A의 양을 나타내는, 처리된 및 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A를 포함한 용액에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법을 실시하기 위한 장치 및 키트를 고려한다.
실시예
실시예 1: 면역원 및 항체의 생성
면역원의 생성
1. 링커펩티드-면역원 I: 서열 NH2-TKSLDKGYNK-Cys-COOH 을 갖는 펩티드는 외부의 공급자에 의해서 생성한 후 링커 GMBS에 의해서 캐리어-단백질 KLH에 결합한다.
2. 링커펩티드-면역원 II: a)오발부민의 활성; 2.18mg의 설포-SMCC(설퍼숙신이미딜-4(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트)를 50㎕ DMSO에서 용해시켰다. 그 다음에 7.5mg/mL 오발부민(버퍼:5mM 소디움포스페이트; 0.9% NaCl)을 함유하는 2.5mL의 오발부민 용액을 첨가하고, 그 용액을 실온에서 1시간동안 회전배양했다. 버퍼는 PD10 칼럼을 사용하여 실시하고, 10 mM 소디움포스페이트; 0.9% NaCl을 함유하는 3.5 mL 버퍼에서 활성화된 오발부민을 용출시켰다. b)오발부민에 펩티드의 결합; 8mg의 펩티드 Ac-DKGYN-Cys-COOH 을 250㎕ H2O 및 2.5㎕ 500 mM TCEP·HCL(트리스[2-카르복시에틸]포스핀 하이드로클로라이드)에서 용해하고, 그 다음에 1mM NaOH로 중화시켰다. 마지막으로, 활성화된 오발부민을 첨가하고, 그 반응 혼합물을 실온에서 4.4h동안 회전 배양했다. 10 mM 시스테인 용액을 첨가함으로써, 잔류하는 반응기를 1h동안 회전배양함으로써 차단했다. 투석을 10 mM 소디움 포스페이트; 0.9% NaCl을 사용하여 실시했다.
면역
면역에 의해서 항혈청을 얻었다.
1)항링커펩티드 scBoNT/A-혈청 I: 면역원으로서 상기 링커펩티드 면역원 I은 링커 GMBS에 의해서 캐리어-단백질 KLH에 결합된 것을 사용하였다. 2마리 염소 각각에 우선 Freud' s 보조제에서 용해된 300㎍의 링커펩티드 면역원 I을 피하에 주사하고 마지막으로 불완전한 Freud' s 보조제에서 100㎍의 링커펩티드 면역원 I을 2주 간격으로 4회 피하에 면역시켰다. 49, 63, 77 및 84 일후에 항혈청을 수집했다. 친화성 크로마토그래피는 마지막 84일의 채혈로부터 수집된 혈청을 사용하여 실시했다.
2) 항링커펩티드 scBoNT/A-혈청 II: 면역원으로서 링커 SMCC에 의해서 캐리어-단백질 오발부민에 결합된 상기 링커펩티드 면역원 II을 사용하였다. 2마리 토끼 각각에 우선 Freud' s 보조제에서 300㎍의 링커펩티드 면역원 II을 피내에 면역시키고 마지막으로 Montanide ISA 206에서 150㎍의 링커펩티드 면역원 II을 2주 간격으로 5회 면역시켰다. 친화성 크로마토그래피는 60일 또는 110일의 채혈로부터 수집된 혈청을 사용하여 실시했다.
혈청의 2단계 친화성 크로마토그래피
1. 매트릭스의 발생: 2단계 친화성 크로마토그래피에 대해서, 다른 펩티드를 함유하는 2개의 다른 울트라 링크 요오드아세틸 매트릭스를 발생시켰다.
일측에, 크로스 반응 펩티드, SLD, LDK 및 YNK 는 하기의 펩티드의 형태: Ac-ELDKYN-Cys-COOH (SEQ ID NO: 4), NH2-NISLDL-Cys-COOH (SEEQ ID NO: 5) and NH2-YYNKF-Cys-COOH (SEQ ID NO: 6)로 나타내고, 하기의 일반적인 설명에 따라서 매트릭스에 결합했다. 타측에, 링커 펩티드(SEQ ID NO: 1)를 하기의 일반적인 설명에 따라서 하기 유도체의 형태로 매트릭스에 결합하였다: Ac-TKSLDKGYNKA-Cys-COOH
일반적인 설명:
커플링 버퍼: 50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5. 사용될 UltraLink® Iodoacyl Gel 부피의 20배와 동일한 부피의 버퍼를 제조했다.
L-시스테인 HCL; 세정액: 1 mM 소디움클로라이드 (NaCl).
상부 및 하부에서 캡핑될 수 있는 gravity-flow 또는 spin column을 비우는 단계:
펩티드 또는 단백질 시료를 제조하는 단계
상기 펩티드를 결합 버퍼로 용해하는 단계
UltraLink®Iodoacyl Gel에 결합:
1. gravity-flow column에 하부 캡을 갖고, 원하는 양의 UltraLink®Iodoacyl Gel 슬러리를 첨가하고, 겔을 15분 동안 정치시킨 단계;
2. 팩킹된 칼럼으로부터 액체를 배수하고, UltraLink®Iodoacyl Gel을 칼럼으로부터 배수된 겔베드의 상부에 버퍼를 첨가함으로써 5 겔-베드 부피의 결합 버퍼로 세정/평형화하는 단계. 겔베드를 건조시키지 않는다.
3. 하부 캡을 대체하고 상기 제조된 술피드릴 함유 시료를 첨가하는 단계
UltraLink®Iodoacyl Gel 1mL 당 시료 대략 1mL를 가할 수 있다.
4. 상부 캡을 대체하고 실온에서 15분동안 칼럼을 혼합하는 단계
5. 칼럼을 똑바로 세우고, 실온에서 30분동안 혼합없이 배양하는 단계
6. 상부 및 하부 칼럼 캡을 제거하고 상기 용액을 배수하는 단계
7. 칼럼을 3 겔-배드 부피의 결합 버퍼로 세정하는 단계
겔에 비특이적 결합 부위를 차단.
1. 칼럼에 하부 캡을 대체하는 단계
2. 결합버퍼에서 50 mM L-시스테인 HCL의 용액을 제조하고, 1mL 용액을 각각 겔 1mL용 칼럼에 첨가하는 단계
3. 상부 캡을 대체하고 실온에서 15분동안 혼합한 후, 상기 반응을 실온에서 추가의 30분동안 혼합없이 배양하는 단계
2. 2단계의 친화성 크로마토그래피:
우선, 정제된 혈청을 혈액으로부터 분리한다. 조-혈청(crude serum)을 크로스 반응 트리펩티드를 함유하는 칼럼에 제공한다. 크로스 반응 항체를 트리펩티드에 결합시키고 상기 조 혈청으로부터 분리한다. 제 1 칼럼의 유체는 결합된 링커펩티드를 함유한 제 2 칼럼에 제공된다. 상기 링커펩티드 특이적 항체를 링커펩티드에 결합시켜서 제 2 칼럼의 제 2 유체에서 발견된 조 혈청으로부터 분리한다. 낮은 친화성 항-링커펩티드 scBoNT/A 항체는 PBS 버퍼(0.5 M NaCl)로 매우 엄격한 세정에 의해서 칼럼으로부터 제거한다. 그 다음에, 결합된 높은 친화성 항링커펩티드 scBoNT/A 항체를 용출시키고 농축한다. 이러한 농축액은 사용된 항 링커펩티드 scBoNT/A 혈청에 상응한다.
실시예 2: 항체 특이성의 시험 및 확인
시약 ELISA:
코팅 버퍼: 0.005 M - 1M Tris; 0.9 % NaCl, 바람직하게 0.01 M - 0.2 M Tris; 0.9 % NaCl, pH = 8.5.
캡처 항체 (Catcher antibody): 항링커펩티드 scBoNT/A 혈청.
차단 및 항체 희석액 버퍼: 0.01 M 소디움 포스페이트에서 0.5 % - 5 % BSA; 0.9% NaCl, pH = 7.4.
시료 버퍼: 0.005 M- 1 M 소디움 포스페이트에서 0.5 % - 5 % BSA; 0.1 - 0.5 M NaCl; 0.005 - 0.1 M 소디움 포스페이트에서 0.01 % - 1 % Tween 20, 바람직하게 1 % - 3 % BSA; 0.15 M-0.4 M NaCl; 0.05 % - 0.5 % Tween 20, pH = 7.4.
세정 버퍼: 0.01 M 소디움 포스페이트; 0.9 % NaCl; 0.05 % Tween 20, pH = 7.4.
검출 항체: BoNT/A에 대한 모노클로날 항체.
제 2 항체: 퍼옥시다제에 콘쥬게이트된 폴리클로날 항 생쥐 IgG (H&L) 항체.
기질: 시판 TMB.
2. 웨스턴 블롯 시약:
시판되는 시료 버퍼 변성
시판 SDS 겔
MES 러닝버퍼 (SDS PAGE): 시판.
PVDF membrane: 시판.
트랜스퍼 버퍼 (Western Blot): 시판.
시료: Dichain-BoNT/A 및 scBoNT/A를 갖는 보툴리눔 신경독 A.
제 1 항체: 항 링커펩티드 scBoNT/A 혈청.
제 2 항체: 알칼리성 포스파타제에 콘쥬게이트된 폴리클로날 당나귀 항-염소 항체 IgG (H&L).
차단 및 항체 희석액 버퍼: 0.01 M - 0.1 M Tris에서 0.5 % - 5 % BSA; 0.9 % NaCl; 0.05 % - 5 % Tween 20, pH = 7.4.
세정 버퍼: 0.01 M -0.1 M Tris; 0.9 % NaCl; 0.05 % - 5 % Tween 20, pH = 7.4.
Tris 버퍼: 0.025 M Tris, pH = 8.0.
기질: BCIP/NBT, 시판.
a) BoNT/B 및 BoNT/E에 대한 항혈청의 특이성: BoNT/B 및 BoNT/E에 대한 항혈청의 특이성을 결정하기 위해서, ELISA에서 물질의 회수율을 분석했다. 미세적정판은 0.5 ㎍ 항링커펩티드 scBoNT/A-혈청/mL 을 함유하는 100 ㎕/웰의 코팅 버퍼로 실온에서 16h동안 배양한 후 세정 버퍼로 3회 세정했다. 200㎕/웰 차단 용액을 미세적정판에 첨가하고 실온에서 1h동안 배양했다. 항원 scBoNT/A (시료 버퍼 내의 희석액 시리즈; pg/ml 농도) 를 검량 표준물질로서 사용하고, 미세적정판은 100㎕/웰 검량 표준물질로 배양했다. BoNT/B 또는 BoNT/E을 시료 버퍼에서 희석하고 미세적정판에 100㎕/웰의 부피로 도포했다. 양측 물질을 과잉으로 도포하고, 200ng/mL의 희석액을 사용한다. 시료 및 표준물질은 37℃에서 2h동안 배양했다. 미세적정판은 세정 버퍼로 3회 세정했다. 100 ㎕의 검출 버퍼/웰을 첨가하고 실온에서 1h동안 배양했다. 미세적정판은 세정버퍼로 3회세정했다. 그 다음에 실온에서 제 2 항체의 100㎕/웰을 1시간동안 배양한다. 그 다음에, 미세적정판은 세정 버퍼로 3회 세정했다.
검출 반응은 100㎕기질/웰의 첨가에 의해서 시작된다. 실온에서 30분간 배양후, 반응은 50㎕의 2M H2SO4/웰을 첨가해서 중단하고 흡수율은 450nm에서 결정한다. 특이성을 결정하기 위해서, BoNT/B 및 BoNT/E 농도를 표준화에 의해서 산출한다. 회수율을 산출함으로써, 스테로타입 B 및 C의 항 링커펩티드 scBoNT/A의 특이성을 결정할 수 있다. 회수율이 낮을수록 크로스 반응성이 낮고, scBoNT/A에 따라서 혈청의 특이성이 양호하게 된다.
b) Dichain BoNT/A에 대한 항링커펩티드 scBoNT/A 의 특이성: 활성화 Dichain-BoNT/A 에 따른 항혈청의 특이성을 결정하기 위해서, 웨스턴 블롯팅에 의한 면역조직학적 검출이 실시된다. NT 시료(사용된 시료에 의존하는 Dichain-BoNT/A인 50ng 이상의 scBoNT/A)는 SDS-PAGE에 의해서 환원조건하에서 분자량에 따라서 scBoNT/A, LC 및 HC (Dichain-BoNT/A) 로 분리된다. 단백질은 PVDF 막에 블롯팅된다. 막은 실온에서 1h동안 20 mL 차단 버퍼로 차단된다. 상기 차단 버퍼를 제거하고 0.005 mg/mL 항 링커펩티드 scBoNT/A 혈청을 함유한 20mL의 제 1 항체 용액을 첨가한다. 제 1 항체는 4℃에서 1일밤 배양한다. 항체 함유 용액을 제거하고 상기 막을 37℃에서 20 mL 세정버퍼로 30분간 3회 세정한다. 그 다음에, 상기 막을 실온에서 20mL의 제 2 항체를 0.4㎍/mL 농도로 3h동안 배양한다. 제 2 항체 용액이 제거되고 상기 막은 37℃에서 20mL의 세정 버퍼로 30분간 3회 세정한다. 또한, 상기 막을 실온에서 5분간 20mL의 25mM TRIS 버퍼로 1회 세정한다.
검출 반응은 기질 첨가에 실시된다. 기질을 15분동안 배양하고 물을 첨가해서 착색반응을 중단시킨다. 특이성은 150kDa에서 scBoNT/A band 의 염색에 의해서 결정된다. 항 링커펩티드의 특이성은 150kDa 특이성 밴드가 검출되지만 100kDa (HC) 및 50kDa (LC)에서 Dichain BoNT/A 에 대한 밴드 특이성이 검출되지 않을 때 결정된다.
다른 전하의 scBoNT/A함량은 상기 기재된 ELISA 조건을 사용하여 결정하고 SDS PAGE에 의해서 결정된 함량과 비교한다. 결과는 하기의 표1에 기재된다.
SDS PAGE 대 ELISA에 의해서 결정된 scBoNT/A
시료 번호 SDS PAGE 에 의한 scBoNT /A (%) ELISA 에 의한 scBoNT /A (%)
1 9.5 11.97
2 0.4 0.64
3 0.8 0.68
4 3.5 3.97
5 0.8 0.13
6 2.1 1.36
7 1.1 1.12
8 1.5 1.33
9 2.0 1.88
SEQUENCE LISTING <110> Merz Pharma GmbH & Co. KGaA <120> System for determining unprocessed and partially processed neurotoxin type A <130> MP66449PC <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 1 Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 1296 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 2 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 450 455 460 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 465 470 475 480 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 485 490 495 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 500 505 510 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 515 520 525 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 530 535 540 Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu 545 550 555 560 His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu 565 570 575 Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys 580 585 590 Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu 595 600 605 Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr 610 615 620 Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 625 630 635 640 Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu 645 650 655 Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala 660 665 670 Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys 675 680 685 Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu 690 695 700 Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys 705 710 715 720 Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 725 730 735 Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn 740 745 750 Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp 755 760 765 Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile 770 775 780 Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met 785 790 795 800 Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys 805 810 815 Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly 820 825 830 Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp 835 840 845 Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 865 870 875 880 Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 885 890 895 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 900 905 910 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 915 920 925 Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 930 935 940 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn 945 950 955 960 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 965 970 975 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu 980 985 990 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005 Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg 1010 1015 1020 Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln 1025 1030 1035 Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile 1040 1045 1050 Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp 1055 1060 1065 Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu 1070 1075 1080 Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys 1085 1090 1095 Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met 1100 1105 1110 Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val 1115 1120 1125 Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val 1130 1135 1140 Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr 1145 1150 1155 Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile 1160 1165 1170 Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn 1175 1180 1185 Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu 1190 1195 1200 Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser 1205 1210 1215 Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn 1220 1225 1230 Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly 1235 1240 1245 Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala 1250 1255 1260 Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu 1265 1270 1275 Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu 1280 1285 1290 Arg Pro Leu 1295 <210> 3 <211> 3891 <212> DNA <213> Clostridium botulinum <400> 3 atgccatttg ttaataaaca atttaattat aaagatcctg taaatggtgt tgatattgct 60 tatataaaaa ttccaaatgc aggacaaatg caaccagtaa aagcttttaa aattcataat 120 aaaatatggg ttattccaga aagagataca tttacaaatc ctgaagaagg agatttaaat 180 ccaccaccag aagcaaaaca agttccagtt tcatattatg attcaacata tttaagtaca 240 gataatgaaa aagataatta tttaaaggga gttacaaaat tatttgagag aatttattca 300 actgatcttg gaagaatgtt gttaacatca atagtaaggg gaataccatt ttggggtgga 360 agtacaatag atacagaatt aaaagttatt gatactaatt gtattaatgt gatacaacca 420 gatggtagtt atagatcaga agaacttaat ctagtaataa taggaccctc agctgatatt 480 atacagtttg aatgtaaaag ctttggacat gaagttttga atcttacgcg aaatggttat 540 ggctctactc aatacattag atttagccca gattttacat ttggttttga ggagtcactt 600 gaagttgata caaatcctct tttaggtgca ggcaaatttg ctacagatcc agcagtaaca 660 ttagcacatg aacttataca tgctggacat agattatatg gaatagcaat taatccaaat 720 agggttttta aagtaaatac taatgcctat tatgaaatga gtgggttaga agtaagcttt 780 gaggaactta gaacatttgg gggacatgat gcaaagttta tagatagttt acaggaaaac 840 gaatttcgtc tatattatta taataagttt aaagatatag caagtacact taataaagct 900 aaatcaatag taggtactac tgcttcatta cagtatatga aaaatgtttt taaagagaaa 960 tatctcctat ctgaagatac atctggaaaa ttttcggtag ataaattaaa atttgataag 1020 ttatacaaaa tgttaacaga gatttacaca gaggataatt ttgttaagtt ttttaaagta 1080 cttaacagaa aaacatattt gaattttgat aaagccgtat ttaagataaa tatagtacct 1140 aaggtaaatt acacaatata tgatggattt aatttaagaa atacaaattt agcagcaaac 1200 tttaatggtc aaaatacaga aattaataat atgaatttta ctaaactaaa aaattttact 1260 ggattgtttg aattttataa gttgctatgt gtaagaggga taataacttc taaaactaaa 1320 tcattagata aaggatacaa taaggcatta aatgatttat gtatcaaagt taataattgg 1380 gacttgtttt ttagtccttc agaagataat tttactaatg atctaaataa aggagaagaa 1440 attacatctg atactaatat agaagcagca gaagaaaata ttagtttaga tttaatacaa 1500 caatattatt taacctttaa ttttgataat gaacctgaaa atatttcaat agaaaatctt 1560 tcaagtgaca ttataggcca attagaactt atgcctaata tagaaagatt tcctaatgga 1620 aaaaagtatg agttagataa atatactatg ttccattatc ttcgtgctca agaatttgaa 1680 catggtaaat ctaggattgc tttaacaaat tctgttaacg aagcattatt aaatcctagt 1740 cgtgtttata catttttttc ttcagactat gtaaagaaag ttaataaagc tacggaggca 1800 gctatgtttt taggctgggt agaacaatta gtatatgatt ttaccgatga aactagcgaa 1860 gtaagtacta cggataaaat tgcggatata actataatta ttccatatat aggacctgct 1920 ttaaatatag gtaatatgtt atataaagat gattttgtag gtgctttaat attttcagga 1980 gctgttattc tgttagaatt tataccagag attgcaatac ctgtattagg tacttttgca 2040 cttgtatcat atattgcgaa taaggttcta accgttcaaa caatagataa tgctttaagt 2100 aaaagaaatg aaaaatggga tgaggtctat aaatatatag taacaaattg gttagcaaag 2160 gttaatacac agattgatct aataagaaaa aaaatgaaag aagctttaga aaatcaagca 2220 gaagcaacaa aggctataat aaactatcag tataatcaat atactgagga agagaaaaat 2280 aatattaatt ttaatattga tgatttaagt tcgaaactta atgagtctat aaataaagct 2340 atgattaata taaataaatt tttgaatcaa tgctctgttt catatttaat gaattctatg 2400 atcccttatg gtgttaaacg gttagaagat tttgatgcta gtcttaaaga tgcattatta 2460 aagtatatat atgataatag aggaacttta attggtcaag tagatagatt aaaagataaa 2520 gttaataata cacttagtac agatatacct tttcagcttt ccaaatacgt agataatcaa 2580 agattattat ctacatttac tgaatatatt aagaatatta ttaatacttc tatattgaat 2640 ttaagatatg aaagtaatca tttaatagac ttatctaggt atgcatcaaa aataaatatt 2700 ggtagtaaag taaattttga tccaatagat aaaaatcaaa ttcaattatt taatttagaa 2760 agtagtaaaa ttgaggtaat tttaaaaaat gctattgtat ataatagtat gtatgaaaat 2820 tttagtacta gcttttggat aagaattcct aagtatttta acagtataag tctaaataat 2880 gaatatacaa taataaattg tatggaaaat aattcaggat ggaaagtatc acttaattat 2940 ggtgaaataa tctggacttt acaggatact caggaaataa aacaaagagt agtttttaaa 3000 tacagtcaaa tgattaatat atcagattat ataaacagat ggatttttgt aactatcact 3060 aataatagat taaataactc taaaatttat ataaatggaa gattaataga tcaaaaacca 3120 atttcaaatt taggtaatat tcatgctagt aataatataa tgtttaaatt agatggttgt 3180 agagatacac atagatatat ttggataaaa tattttaatc tttttgataa ggaattaaat 3240 gaaaaagaaa tcaaagattt atatgataat caatcaaatt caggtatttt aaaagacttt 3300 tggggtgatt atttacaata tgataaacca tactatatgt taaatttata tgatccaaat 3360 aaatatgtcg atgtaaataa tgtaggtatt agaggttata tgtatcttaa agggcctaga 3420 ggtagcgtaa tgactacaaa catttattta aattcaagtt tgtatagggg gacaaaattt 3480 attataaaaa aatatgcttc tggaaataaa gataatattg ttagaaataa tgatcgtgta 3540 tatattaatg tagtagttaa aaataaagaa tataggttag ctactaatgc atcacaggca 3600 ggcgtagaaa aaatactaag tgcattagaa atacctgatg taggaaatct aagtcaagta 3660 gtagtaatga agtcaaaaaa tgatcaagga ataacaaata aatgcaaaat gaatttacaa 3720 gataataatg ggaatgatat aggctttata ggatttcatc agtttaataa tatagctaaa 3780 ctagtagcaa gtaattggta taatagacaa atagaaagat ctagtaggac tttgggttgc 3840 tcatgggaat ttattcctgt agatgatgga tggggagaaa ggccactgta a 3891 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tripeptide for affinity purification 1 <400> 4 Glu Leu Asp Lys Tyr Asn Cys 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tripeptide for affinity purification 2 <400> 5 Asn Ile Ser Leu Asp Leu Cys 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tripeptide for affinity purification 3 <400> 6 Tyr Tyr Asn Lys Phe Cys 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker peptide immunogen <400> 7 Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys Ala Cys 1 5 10

Claims (14)

  1. i) 용액 시료를, 항체가 부분적으로 처리된 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)에 결합한 조건하에서 부분적으로 처리된 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)에 특이적으로 결합한 캡처 항체와 접촉하여 복합물을 형성하는 단계, 및
    ii) 단계 i)에서 형성된 복합물의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 복합물의 양은 상기 용액에서 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 또는 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합의 양을 나타내고,
    상기 캡처 항체는,
    a) SEQ ID NO: 1 에 나타낸 아미노산 서열을 포함한 펩티드 면역원에 의해서 면역된 동물로부터 폴리클로날 항혈청을, 상기 폴리클로날 항혈청으로 이루어진 비특이적 항체 및 캡처 펩티드를 포함한 캡처 복합물을 형성한 조건하에서 다음의 캡처 펩티드 SLD, LDK 및 YNK에 접촉시키는 단계;
    b) 상기 폴리클로날 항혈청에서 상기 캡처 복합물을 제거하는 단계;
    c) 상기 폴리클로날 항혈청을, 상기 펩티드, 및 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체를 포함한 복합물을 형성하는 조건하에서 SEQ ID NO:1를 포함한 펩티드에 접촉시키는 단계;
    d) 상기 항혈청으로부터 단계 c)에서 형성된 복합물을 제거하는 단계; 및
    e) 상기 복합물로부터 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체를 방출하는 단계를 포함한 방법에 의해서 얻어진, 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합, 처리된 신경독 A 폴리펩티드 (BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합, 또는 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합을 포함한 용액에서 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 또는 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합의 양의 결정 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 면역원은 KLH를 더욱 포함한 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 KLH는 링커 N-[감마-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르(GMBS)를 경유한 SEQ ID NO: 1을 갖는 펩티드에 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 i)에서 조건은 세제의 존재를 포함한 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 세제는 폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서,
    상기 세제는 0.01%(v/v) 내지 10%(v/v)의 범위의 농도에서 존재한 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 농도는 0.2%(v/v) 내지 0.8%(v/v)의 범위, 또는 0.3%(v/v) 내지 0.6%(v/v)의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 i)에서 조건은 인산 완충 또는 트리스 완충 생리식염용액의 존재를 포함한 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 용액은 150 내지 350 mM의 범위의 농도의 NaCl를 포함한 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 농도는 200 내지 300 mM의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 ii)는 복합물의 양을 참조문헌과 비교하여 결정된 복합물 양이 미처리된 BoNT/A 폴리펩티드의 소정량에 할당될 수 있는 단계를 포함한 것을 특징으로 하는 방법.
  12. i) 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 따른 캡처 항체를 포함한 분석 유닛, 상기 분석 유닛은 상기 용액 시료를 상기 캡처 항체와 접촉가능한 것, 및
    ii) 상기 분석 유닛에서 형성된 복합물의 양을 결정하기 위한 리더 시스템 및 결정된 복합물의 양에 기초한 상기 용액에서 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 또는 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합의 양을 산출할 수 있는 데이타 처리 시스템을 포함한 평가 유닛을 포함한 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합, 처리된 신경독 A 폴리펩티드 (BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합, 또는 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합을 포함한 용액에서 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 또는 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합의 양을 결정하기 위한 장치.
  13. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 따른 캡처 항체를 포함한, 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합, 처리된 신경독 A 폴리펩티드 (BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합, 또는 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합을 포함한 용액에서 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A), 또는 부분적으로 처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A) 및 미처리된 신경독 A 폴리펩티드(BoNT/A)의 조합의 양을 결정하기 위한 키트.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 키트는 캡처 항체 및 미처리된 BoNT/A 폴리펩티드의 조합, 캡처 항체 및 부분적으로 처리된 BoNT/A 폴리펩티드의 조합, 또는 캡처 항체, 미처리된 BoNT/A 폴리펩티드 및 부분적으로 처리된 BoNT/A 폴리펩티드의 조합을 포함한 복합물의 양을 결정하기 위한 1개 이상의 검출제를 더욱 포함한 것을 특징으로 하는 키트.
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