JP5709877B2 - プロセシングされていない及び部分的にプロセシングされたa型ニューロトキシンを測定するためのシステム - Google Patents
プロセシングされていない及び部分的にプロセシングされたa型ニューロトキシンを測定するためのシステム Download PDFInfo
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Description
(i)該溶液のサンプルを、部分的にプロセシングされたBoNT/A及びプロセシングされていないBoNT/Aと特異的に結合する捕捉抗体と、該抗体と該部分的にプロセシングされたBoNT/A及びプロセシングされていないBoNT/Aとの結合を可能にする条件下で接触させ、それにより複合体が形成されるステップと、
(ii)ステップ(i)で形成された複合体の量を測定し、それにより該複合体の量が上記溶液中の部分的にプロセシングされたBoNT/A及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aの量を示すステップと
を含み、上記捕捉抗体が、以下のステップ:
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列(TKSLDKGYNKA)を含むペプチド免疫原により免疫された動物由来のポリクローナル抗血清を、次の捕捉ペプチドSLD、LDK及びYNKと、該ポリクローナル抗血清に含まれる非特異的抗体及び該捕捉ペプチドを含む捕捉複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップ、
(b)上記捕捉複合体をポリクローナル抗血清から除去するステップ、
(c)ポリクローナル抗血清を、配列番号1を含む又はそれから本質的になるペプチドと、上記ペプチドとプロセシングされていないニューロトキシンポリペプチド又は部分的にプロセシングされたニューロトキシンポリペプチドと特異的に結合する抗体とを含む複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップ、
(d)ステップ(c)で形成された複合体を上記抗血清から取り出すステップ、
(e)プロセシングされていないニューロトキシンポリペプチド又は部分的にプロセシングされたニューロトキシンポリペプチドと特異的に結合する抗体を、上記複合体から遊離させるステップ
を含む方法により得られるものである、上記方法に関する。
(1) 固相支持体(例えばマルチウエルプレート)上に、上記方法により得られた捕捉抗体を固定化するステップ;
(2) 非固定化捕捉抗体を洗浄により除去するステップ;
(3) 好適なブロッキングバッファーの使用により固相支持体上のフリーのペプチド/タンパク質結合部位をブロッキングするステップ(以下の実施例参照);
(4) ブロッキングバッファーを洗浄により除去するステップ;
(5) 分析対象の溶液のサンプル、又は較正用に使用する標準溶液のサンプルを、捕捉複合体の形成を可能にする条件下で添加するステップ;
(6) 未結合のサンプル物質を洗浄により除去するステップ;
(7) 検出試薬(例えば、一次検出抗体、場合により、酵素(ペルオキシダーゼなど)と直接又は間接的に結合させた高次の検出抗体)を、検出複合体の形成を可能にする条件下で添加するステップ;
(8) 未結合の検出試薬を洗浄により除去するステップ;
(9) (例えば、発色基質を検出複合体に添加し、基質の変換を光学密度の測定により測定することにより)検出試薬により生じる検出シグナルを測定するステップ。
(i)上で特定した捕捉抗体を含む分析ユニットであって、該溶液のサンプルと該捕捉抗体との接触を可能にする分析ユニット、並びに
(ii)分析ユニットにおいて形成された複合体の量を測定するためのリーダーシステムと、該複合体の測定量に基づいて、該溶液中の部分的にプロセシングされたBoNT/Aポリペプチド及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aポリペプチドの量を算出することができるデータプロセシングシステムとを備えた評価ユニット
を備えたデバイスも包含する。
免疫原の作製
1. リンカーペプチド‐免疫原I:
NH2-TKSLDKGYNK-Cys-COOHの配列を有するペプチドを外部の提供業者に作製させ、その後、リンカーGMBSによってキャリアタンパク質KLHと結合させた。
a)オボアルブミンの活性化;2.18 mgのスルホ-SMCC(スルホスクシンイミジル-4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート)を50μlのDMSOに溶解した。その後、7.5 mg/mlオボアルブミンを含有する2.5 mlのオボアルブミン溶液(バッファー:5mMリン酸ナトリウム;0.9%NaCl)を加え、この溶液を室温で1時間、回転させながらインキュベートした。PD10カラムを用いてバッファー交換を行い、10 mM リン酸ナトリウム;0.9%NaClを含有する3.5 mlのバッファーに活性化オボアルブミンを溶出した。
免疫付与により抗血清を得た。
免疫原として、リンカーGMBSによりキャリアタンパク質KLHに結合されたリンカーペプチド-免疫原Iを用いた。2頭のヤギに、リンカーペプチド-免疫原Iの皮下注射により、それぞれ最初はフロイントアジュバントに溶解した300μgのリンカーペプチド-免疫原Iを用いて免疫付与し、最終的には2週間周期で4回、不完全フロイントアジュバント中100μgのリンカーペプチド-免疫原Iを用いて免疫付与した。49、63、77及び84日後に抗血清を採取した。84日目の最後の採血から回収した血清を用いて、アフィニティクロマトグラフィーを行った。
免疫原として、リンカーSMCCによりキャリアタンパク質オボアルブミンに結合されたリンカーペプチド-免疫原IIを用いた。2羽のウサギに、リンカーペプチド-免疫原IIの腹腔内注射により、それぞれ最初はフロイントアジュバント中300μgのリンカーペプチド免疫原IIを用いて免疫付与し、最終的には2週間周期で5回、Montanide ISA 206中150μgのリンカーペプチド免疫原IIを用いて免疫付与した。60又は110日目の採血からそれぞれ回収した血清を用いて、アフィニティクロマトグラフィーを行った。
1.マトリックスの作製:
2段階アフィニティクロマトグラフィーのために、異なるペプチドを含有している2つの異なるultra linkヨードアセチルマトリックスを作製した。
カップリングバッファー:50 mM Tris、5 mM EDTA-Na、pH 8.5。使用するUltraLink(登録商標)ヨードアシルゲルの20倍量に相当する容量のバッファーを調製する。
L-システインHCl;洗浄液:1 mM塩化ナトリウム(NaCl)。
上部と下部の両方に蓋をしうる空の重力流カラム又はスピンカラム。
ペプチドをカップリングバッファーに溶解する。
1. 重力流カラムの下部に蓋をして、目的とする量のUltraLink(登録商標)ヨードアシルゲルスラリーを加え、ゲルを15分間かけて安定させる。
2. 充填したカラムから液を流出させ、ゲルベッドの5倍容量のカップリングバッファーを用いて、バッファーをゲルベッドの上部に添加し、カラムを通して流出させることによって、UltraLink(登録商標)ヨードアシルゲルを洗浄/平衡化する。ゲルベッドを干上がらせてはならない。
3. 下部の蓋をして、用意したスルフヒドリル含有サンプルを添加する。1 mlのUltraLink(登録商標)ヨードアシルゲルあたり、約1 mlのサンプル溶液が使用できる。
4. 上部の蓋をして、カラムを室温で15分間混合する。
5. カラムを直立させ、室温で30分間混合せずにインキュベートする。
6. 続いて上部と下部のカラムの蓋を取り、液を流出させる。
7. ゲルベッドの3倍容量のカップリングバッファーを用いて、カラムを洗浄する。
1. カラムの下部に蓋をする。
2. カップリングバッファー中50 mM L-システイン HClの溶液を調製し、ゲル1 mlごとに1 mlのこの溶液をカラムに加える。
3. 上部の蓋をして、室温で15分間混合し、その後、混合せずに更に30分間室温でその反応をインキュベートする。
精製しようとする血清を、まず血液から分離する。未精製の血清を、交差反応性トリペプチドを含有する第一カラムに加える。交差反応性抗体はトリペプチドに結合し、未精製の血清から分離される。この第一カラムのフロースルーを、結合したリンカーペプチドを含有する第二カラムに加える。リンカーペプチド特異的抗体はリンカーペプチドに結合し、従って、第二カラムの2番目のフロースルーに見出される未精製血清から分離される。低アフィニティ抗リンカーペプチドscBoNT/A抗体を、PBSバッファー(0.5 M NaCl)を用いた高ストリンジェンシー洗浄によってカラムから除去する。その後、結合した高アフィニティ抗リンカーペプチドscBoNT/A抗体を溶出し、濃縮する。この濃縮物が、使用される抗リンカーペプチドscBoNT/A血清に相当する。
1. ELISA試薬:
コーティングバッファー:0.005 M〜1M Tris;0.9 %NaCl、好ましくは0.01 M〜0.2 M Tris;0.9%NaCl、pH=8.5。
捕捉抗体:抗リンカーペプチドscBoNT/A血清。
ブロッキング及び抗体希釈バッファー:0.01 Mリン酸ナトリウム中0.5%〜5%BSA;0.9%NaCl、pH=7.4。
サンプルバッファー:0.005 M〜1 Mリン酸ナトリウム中0.5%〜5%BSA;0.1〜0.5 M NaCl;0.01%〜1%Tween 20、好ましくは0.005〜0.1 Mリン酸ナトリウム中1%〜3%BSA;0.15 M〜0.4 M NaCl;0.05%〜0.5%Tween 20、pH=7.4。
洗浄バッファー:0.01 Mリン酸ナトリウム;0.9%NaCl;0.05%Tween 20、pH=7.4。
検出抗体:BoNT/Aに対するモノクローナル抗体。
二次抗体:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたポリクローナル抗マウスIgG(H&L)抗体。
基質:市販のTMB。
市販の変性サンプルバッファー。
市販のSDSゲル。
MES泳動バッファー(SDS-PAGE):市販。
PVDF膜:市販。
転写バッファー(ウェスタンブロット):市販。
サンプル:二本鎖BoNT/A及びscBoNT/Aを含むボツリヌスニューロトキシンA。
一次抗体:抗リンカーペプチドscBoNT/A血清。
二次抗体:アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたポリクローナルロバ抗ヤギ抗体IgG(H&L)。
ブロッキング及び抗体希釈バッファー:0.01 M〜0.1 M Tris中0.5%〜5%BSA;0.9%NaCl;0.05%〜5%Tween 20、pH=7.4。
洗浄バッファー:0.01 M〜0.1 M Tris;0.9%NaCl;0.05%〜5%Tween 20、pH=7.4。
Trisバッファー:0.025 M Tris、pH=8.0。
基質:市販のBCIP/NBT。
BoNT/B及びBoNT/Eに対する抗血清の特異性を決定するために、物質の回収率をELISAで分析した。0.5μg抗リンカーペプチドscBoNT/A血清/mlを含有する100μl/ウェルのコーティングバッファーを含むマイクロタイタープレートを、室温で16時間インキュベートし、その後、洗浄バッファーで3回洗浄する。200μl/ウェルのブロッキング溶液をマイクロタイタープレートに加え、室温で1時間インキュベートする。較正標準として抗原scBoNT/A(サンプルバッファーでの希釈系列;pg/ml濃度)を用い、100μl/ウェルの較正標準を含むマイクロタイタープレートをインキュベートする。BoNT/B又はBoNT/Eをそれぞれサンプルバッファーで希釈し、100μl/ウェルの容量でマイクロタイタープレートに加える。両物質は過剰に加えられ、200 ng/mlの希釈物を用いる。サンプル及び標準を37℃で2時間インキュベートする。マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで3回洗浄する。100μlの検出バッファー/ウェルを加え、室温で1時間インキュベートする。その後、マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで3回洗浄する。次に、100μl/ウェルの二次抗体と共に室温で1時間のインキュベーションを行う。その後、マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで3回洗浄する。
活性化された二本鎖BoNT/Aに対する抗血清の特異性を決定するために、ウェスタンブロッティングによる免疫組織学的検出を行う。NTサンプル(少なくとも50 ngのscBoNT/A、使用するサンプルに応じて二本鎖BoNT/A)を、還元条件下でSDS-PAGEによって、それらの分子量に従ってscBoNT/A、LC及びHC(二本鎖BoNT/A)に分離する。タンパク質をその後、PVDF膜上にブロッティングする。その膜を20 mlのブロッキングバッファーを用いて室温で1時間かけてブロッキングする。ブロッキングバッファーを除去し、0.005μg/mlの抗リンカーペプチドscBoNT/A血清を含有する20 mlの一次抗体溶液を加える。一次抗体を4℃で一晩インキュベートする。抗体含有溶液を除去し、膜を37℃で30分間、20 mlの洗浄バッファーで3回洗浄する。その後、膜を0.4μg/mlの濃度の20 mlの二次抗体と共に、室温で3時間インキュベートする。二次抗体溶液を除去し、膜を37℃で30分間、20 mlの洗浄バッファーで3回洗浄する。更に、膜を室温で5分間、20 mlの25 mM Trisバッファーで1回洗浄する。
Claims (14)
- プロセシングされたニューロトキシンAポリペプチド(BoNT/A)並びに部分的にプロセシングされたBoNT/A及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aを含む溶液中の、部分的にプロセシングされたBoNT/A及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aの量を測定する方法であって、以下のステップ:
(i)該溶液のサンプルを、部分的にプロセシングされたBoNT/A及びプロセシングされていないBoNT/Aと特異的に結合する捕捉抗体と、該抗体と該部分的にプロセシングされたBoNT/A及びプロセシングされていないBoNT/Aとの結合を可能にする条件下で接触させ、それにより複合体が形成されるステップと、
(ii)ステップ(i)で形成された複合体の量を測定し、それにより該複合体の量が上記溶液中の部分的にプロセシングされたBoNT/A及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aの量を示すステップと
を含み、上記捕捉抗体が、以下のステップ:
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むペプチド免疫原により免疫された動物由来のポリクローナル抗血清を、次の捕捉ペプチドSLD、LDK及びYNKと、該ポリクローナル抗血清に含まれる非特異的抗体及び該捕捉ペプチドを含む捕捉複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップ、
(b)上記捕捉複合体をポリクローナル抗血清から除去するステップ、
(c)ポリクローナル抗血清を、配列番号1を含むペプチドと、上記ペプチドとプロセシングされていないニューロトキシンポリペプチド又は部分的にプロセシングされたニューロトキシンポリペプチドと特異的に結合する抗体とを含む複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップ、
(d)ステップ(c)で形成された複合体を上記抗血清から取り出すステップ、
(e)プロセシングされていないニューロトキシンポリペプチド又は部分的にプロセシングされたニューロトキシンポリペプチドと特異的に結合する抗体を、上記複合体から遊離させるステップ
を含む方法により得られるものである、上記方法。 - 免疫原がKLHをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- KLHが、リンカーN-[γ-マレイミドブチリルオキシ] スクシンイミドエステル(GMBS)を介して配列番号1を有するペプチドと連結している、請求項2に記載の方法。
- ステップ(i)における条件が、洗浄剤の存在を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 洗浄剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである、請求項4に記載の方法。
- 洗浄剤が0.01%(v/v)〜10%(v/v)の範囲の濃度で存在する、請求項4又は5に記載の方法。
- 洗浄剤の濃度が0.2%(v/v)〜0.8%(v/v)の範囲、又は0.3%(v/v)〜0.6%(v/v)の範囲である、請求項6に記載の方法。
- ステップ(i)における条件が、リン酸緩衝生理食塩水溶液又はtris緩衝生理食塩水溶液の存在を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液が、150〜350 mMの範囲の濃度でNaClを含む、請求項8に記載の方法。
- NaClの濃度が200〜300 mMの範囲である、請求項9に記載の方法。
- ステップ(ii)が、複合体の量を参照と比較することを含み、それにより複合体の測定量を、所定量のプロセシングされていないBoNT/Aポリペプチドに割り当てることができる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- プロセシングされたニューロトキシンAポリペプチド(BoNT/A)並びに部分的にプロセシングされたBoNT/Aポリペプチド及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aポリペプチドを含む溶液中の、部分的にプロセシングされたBoNT/Aポリペプチド及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aポリペプチドの量を測定するためのデバイスであって、
(i)請求項1〜3のいずれか1項に記載されている捕捉抗体を含む分析ユニットであって、該溶液のサンプルと該捕捉抗体との接触を可能にする分析ユニット、並びに
(ii)分析ユニットにおいて形成された複合体の量を測定するためのリーダーシステムと、該複合体の測定量に基づいて、該溶液中の部分的にプロセシングされたBoNT/Aポリペプチド及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aポリペプチドの量を算出することができるデータプロセシングシステムとを備えた評価ユニット
を備えたデバイス。 - プロセシングされたニューロトキシンAポリペプチド(BoNT/A)並びに部分的にプロセシングされたBoNT/Aポリペプチド及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aポリペプチドを含む溶液中の、部分的にプロセシングされたBoNT/Aポリペプチド及び/又はプロセシングされていないBoNT/Aポリペプチドの量を測定するためのキットであって、請求項1〜3のいずれか1項に記載されている捕捉抗体を含むキット。
- 前記捕捉抗体と、プロセシングされていないBoNT/Aポリペプチド及び/又は部分的にプロセシングされたBoNT/Aポリペプチドとを含む複合体の量を測定するための少なくとも1種の検出試薬をさらに含み、該検出試薬が前記複合体と相互作用する検出試薬である、請求項13に記載のキット。
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