JP2002501033A - Ａ型ボツリヌス菌の生物学的活性赤血球凝集素とその使用法 - Google Patents

Ａ型ボツリヌス菌の生物学的活性赤血球凝集素とその使用法

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Abstract

(57)【要約】 Ａ型ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）ニューロトキシン複合体から精製された、単離され、生物学的に活性な33kDaの赤血球凝集素とその使用法について記載する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 連邦出資研究に関する声明 本発明は、海軍調査研究所／米国陸軍エッジウッド研究開発エンジニアリング
センター（N00014-92-2007）、米国農業省（94-37201-1167）、および国立衛生 研究所（NS33740）からの政府助成金を受けて実施した。政府は本発明において 一定の権利を有する。
【０００２】 発明の背景 本発明は、A型ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）ニューロトキシン複合
体からの生物学的に活性な赤血球凝集素の単離に関する。
【０００３】 ボツリヌスニューロトキシン（BoNT）は、マウス致死量が0.3 ng/kgである 極めて強力な蛋白質である。７つのBoNT血清型（A〜G）が異なる株のボツリヌス
菌（Clostridium botulinum）から産生されている。さらに、絡酸菌（C.butyric
um）およびC. バラティ（C. baratii）のような、クロストリジウム（Clostridi
um）属の特定の非ボツリヌス種も、毒素を産生することが示されている。ニュー
ロトキシンは約150 kDaの蛋白質であり、ジスルフィド結合で結合した２つのポ リペプチド鎖（50 kDa軽鎖および100 kDa重鎖）で構成される。
【０００４】 BoNTはしばしば、貯蔵または加工が不適切であった食品において嫌気性条件下
で菌によって産生される。汚染された食物を摂取すると、ボツリヌス中毒症とし
て知られる弛緩性の筋麻痺を引き起こしうる。
【０００５】 BoNTがボツリヌス中毒症を引き起こす作用機序は十分に研究されている。摂取
後、ニューロトキシンは腸粘膜の中を移動して神経筋接合部に近づく。罹患した
接合部で、ニューロトキシンはエンドサイトーシスによってニューロンによって
インターアナライズされる。細胞内で、毒素のプロテアーゼ活性により特定の小
胞および細胞質蛋白質が分解され、ニューロンからの神経伝達物質の放出を停止
させる。このように、シナプス前表面から神経伝達物質が放出できなくなるため
に、患者は麻痺を起こす。このプロセスは、サカグチ（Sakaguchi）、Pharmac.
Ther. 19：165〜194（1983）に概説されている。
【０００６】 発明の概要 本発明は、A型ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）ニューロトキシン複合
体からの生物学的に活性なプロテアーゼ抵抗性赤血球凝集素の単離に基づく。本
蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE
）によって分子量が33 kDaであると推定されており、したがって、本蛋白質およ
び対応するポリペプチドを、本明細書において「Hn-33」と称する。ポリペプチ ドが血液凝集アッセイにおいて赤血球凝集素活性を示せば、Hn-33は「生物学的 に活性」である。
【０００７】 単離された生物学的に活性なHn-33は、胃腸管（GI）での分解から抗原を保護 する経口ワクチンとして、または神経筋接合部の異常な灼熱感を緩和するために
筋肉もしくはその周辺組織への注射に適した薬学的組成物として使用することが
できる。
【０００８】 一般に、本発明は、A型ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）から単離され
た生物学的に活性なHn-33と、少なくとも１つのニューロトキシン、例えばA型ボ
ツリヌスニューロトキシン、E型ニューロトキシン、または破傷風毒素とを含む 組成物を特徴とする。組成物は動物への投与に適した薬学的担体をさらに含んで
いてもよい。薬学的担体はアジュバントであってもよく、または別にアジュバン
トを加えることができる。薬学的担体は例えばポリソルベート、エタノール、デ
ンプン、およびグリセリンを１つまたはそれ以上含むことができる。
【０００９】 もう一つの局面において、本発明はA型ボツリヌス菌（Clostridium botulinum
）の生物学的に活性な単離Hn-33ポリペプチドを特徴とする。単離Hn-33ポリペプ
チドとは、それが本来伴う成分から分離されているポリペプチドである。典型的
に、蛋白質は、それが本来会合している蛋白質および天然に存在する有機分子を
重量で少なくとも60％含まない場合に単離されている。好ましくは、調製物は重
量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少
なくとも99％Hn-33である。そのような単離Hn-33は例えば、A型ボツリヌス菌（C
. botulinum）培養液の分画によって、Hn-33をコードする核酸の発現によって、
または蛋白質の化学合成によって得ることができる。純度は例えば、カラムクロ
マトグラフィーまたはゲル濾過のような適当な方法によって測定することができ
る。生物学的活性Hn-33は、得られたポリペプチドが赤血球凝集素活性を確実に 維持するように単離しなければならない。
【００１０】 本発明のHn-33ポリペプチドは、完全長のポリペプチドである必要はなく、ま た野生型のアミノ酸配列と同一である必要もない。切断、欠失またはアミノ酸置
換を含むHn-33ポリペプチドは、ポリペプチドまたは蛋白質が本明細書に記載の ように生物学的に活性である限り、含まれる。本明細書において用いられるよう
に、「ポリペプチド」および「蛋白質」という用語は互換的に用いられる。
【００１１】 本発明はまた、動物、例えばヒトまたはイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、もしくはウ
マのような野生もしくは家畜動物において、A型ボツリヌス菌（Clostridium bot
ulinum）の生物学的に活性な単離Hn-33とニューロトキシンとを含む、ニューロ トキシンに対する免疫応答を誘発するために有効な量の組成物を動物に、例えば
経口投与することによって、ニューロトキシン、例えばA型ボツリヌスニューロ トキシン、E型ボツリヌスニューロトキシン、またテタヌス毒素に対する免疫応 答を誘起する方法を特徴とする。組成物は、アジュバントおよび／またはHn-33 ／毒素組成物を徐々に放出することができる生体分解性のポリマーをさらに含む
ことができる。
【００１２】 もう一つの局面において、本発明は、組成物がA型ボツリヌス菌（Clostridium
botulinum）の生物学的に活性な単離Hn-33とニューロトキシン、例えばA型ボツ
リヌスニューロトキシン、E型ボツリヌスニューロトキシン、もしくは破傷風毒 素とを含む、神経筋疾患を治療または予防するために有効な量の組成物を投与す
ることによって、動物、例えばヒトにおける神経筋疾患、例えば平滑筋痙縮また
は骨格筋痙縮を治療または予防する方法を特徴とする。例えば、組成物を、治療
を必要とする筋肉または筋肉周辺の組織に注射することができる。組成物はさら
に、ニューロトキシンを徐々に放出することができるポリマーを含むことができ
る。本方法はまた、特定の神経筋頭痛および脳性麻痺を治療するために用いるこ
とができる。
【００１３】 「ニューロトキシン」（または「毒素」）とは、神経筋接合部のシナプス前膜
からの神経伝達物質の放出を阻害する、活性な、弱毒化された、または不活性な
ポリペプチドである。ワクチン組成物に用いる場合、ニューロトキシンは好まし
くは不活性、または少なくとも弱毒化されている。神経筋接合部の異常な灼熱感
を治療するために治療用組成物として用いる場合、ニューロトキシンは好ましく
は完全に活性である。本発明の組成物および方法に用いることが適したニューロ
トキシンには、例えばA型ボツリヌスニューロトキシン、E型ボツリヌスニューロ
トキシン、および破傷風毒素が含まれる。
【００１４】 「アジュバント」とは、本発明のワクチン組成物に組み入れられる、または本
発明のワクチン組成物と同時投与される物質である。アジュバントは、ポリペプ
チドまたはペプチド模倣体を投与後の動物における免疫応答の期間またはレベル
を増加させる。アジュバントはまた、動物または動物の体内の特定の組織、細胞
、または部位への、ポリペプチドまたはペプチド模倣体の輸送を促進することも
可能である。アジュバントの例には、フロイントの不完全アジュバント、フロイ
ントの完全アジュバント、そしてミョウバンが含まれるがこれらに限定せず；ス
クアレン（例えば、MF59、カイロン・コーポレーション、エメリービル、カリフ
ォルニア州）、モノフォスフォリピッドA（例えば、デトックス（登録商標）、 リビ・イムノケミカルリサーチインク、ハミルトン、モンタナ州）、サポニン（
QS-21、ケンブリッジバイオテック、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、非 イオン性界面活性剤（NISV、プロテウス、チェシャー、イギリス）、トコール（
米国特許第5,667,784号）、生体分解性の生体適合性ポリ（D, L-ラクチドコグリ
コライド）（米国特許第5,417,986号）、免疫刺激複合体（ISCOMs）および／ま たはリポソームを含みうる。
【００１５】 特に定義していなければ、本明細書において用いられる技術的および科学的用
語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と
同じ意味を有する。本発明を実践または試験するために適した方法および材料を
下に記載するが、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等のその他の
方法もまた用いることができる。本明細書において言及した全ての刊行物、特許
出願、特許およびその他の参考文献は、参照として本明細書にその全文が組み入
れられる。一致しない場合は、定義を含めて本明細書が優先される。さらに、材
料、方法、および実施例は説明することを目的としており、制限的なものと解釈
してはならない。
【００１６】 本発明のその他の特徴および利点は以下の詳細な説明および特許請求の範囲か
ら明らかになると思われる。
【００１７】 詳細な説明 本発明は、本明細書においてHn-33と称する、A型ボツリヌス菌（Clostridium
botulinum）ニューロトキシン複合体から単離された生物学的に活性なプロテア ーゼ抵抗性赤血球凝集素ポリペプチドに関する。Hn-33は、消化管での分解から 抗原を保護するためにワクチン、例えば経口ワクチンとして、または神経筋接合
部の異常な興奮を緩和するために筋肉もしくはその周辺組織への注射に適した薬
学的組成物として用いることができる。
【００１８】 I．生物学的活性Hn-33の製造および単離 A．製造 生物学的活性Hn-33由来蛋白質およびポリペプチドには、生物学的に活性な野 生型Hn-33と機能的特徴を共有する如何なる蛋白質またはポリペプチドも含まれ る。そのような機能的に関連した生物学的活性Hn-33ポリペプチドには、野生型H
n-33配列と比較してHn-33アミノ酸配列内にアミノ酸付加または置換を有するポ リペプチドが含まれる（図９およびイースト（East）ら、System Appl. Microbi
ol. 17：306〜312、1994；配列番号：１を参照のこと）。アミノ酸置換は、関係
する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性特徴
の類似性に基づいて行ってもよい。
【００１９】 例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン
、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含
まれる；極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン
、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる；陽性荷電（塩基性）
アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；ならびに陰性
荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００２０】 アミノ酸配列を改変した生物学的活性Hn-33変異体は、当業者に周知のランダ ム変異誘発法を用いてHn-33 DNAにランダム変異を生じさせることによって（イ ースト（East）ら、Curr. Micorbiol., 29：69〜77、1994に記載されている）、
そして生物学的活性Hn-33を生じるようにポリペプチドを単離することによって 、作製することができる。または、当業者に周知の技法を用いて、Hn-33コード 配列の定方向変異を操作することができる。
【００２１】 生物学的活性Hn-33ポリペプチド変異体をデザインするために、保存された位 置と可変位置とを区別することは有用である。機能が野生型生物学的活性Hn-33 に最も近い変異体を製造する場合、保存された残基が変化していないことが好ま
しい。その上、非保存残基の変化は好ましくは保存的変化である、例えば塩基性
アミノ酸が異なる塩基性アミノ酸に置換されている。機能が変化した変異体を製
造する場合には、可変および／または保存された位置で非保存的変化を行うこと
が好ましい。保存位置および可変位置での欠失も同様に、変異体を作製するため
に用いることができる。
【００２２】 Hn-33コード配列の他の変異も、選択した宿主細胞における発現、例えば大量 生産により適した生物学的活性Hn-33ポリペプチドを作製するために行うことが できる。
【００２３】 生物学的活性Hn-33ポリペプチドは赤血球凝集アッセイにおいて試験陽性であ り（下記）、特定の機能を有する（すなわち、治療蛋白質薬剤を分解から保護す
る）。特定の生物学的活性Hn-33ポリペプチドまたはその変異体が機能的である か否かを決定するために、本発明者らは、本明細書に開示のアッセイ法または本
明細書に組み入れられる参考文献に開示される技術の如何なるものも用いること
ができる。生物学的活性Hn-33ポリペプチドおよび変異体は、完全長の生物学的 活性野生型Hn-33の活性の40％、60％、75％、95％、100％、またはさらにそれよ
り高い割合を有することができる（すなわち、変異体は野生型Hn-33より高い活 性を有しうる）。そのような比較は一般的に、比較される分子が等濃度であるこ
とに基づいている。比較はまた、得られる最大活性の50％に達するために必要な
蛋白質またはポリペプチドの量に基づくことができる。
【００２４】 一般的に、生物学的活性Hn-33は、その天然の宿主であるA型ボツリヌス菌（Cl
ostridium botulinum）から単離することができる（A.T.C.C.第3502号、第17862
号、第19397号、第25763号、および第51385号）。または、本発明の生物学的活 性Hn-33ポリペプチドは、適した発現媒体におけるHn-33コードDNA断片による宿 主細胞の形質転換（トランスフェクション、形質導入または感染）によって産生
することができる。適した発現媒体には、プラスミド、ウイルス粒子、およびフ
ァージが含まれる。昆虫細胞に関しては、バキュロウイルス発現ベクターが適し
ている。発現媒体全体またはその一部を宿主細胞ゲノムに組み入れることができ
る。場合によっては、誘導型発現ベクター、例えばLACSWITCH（登録商標）誘導 型発現系（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いることが望ま
しい。
【００２５】 分子生物学分野の技術者であれば、組換え型蛋白質を提供するために、多様な
発現系の如何なるものをも用いることができることを理解すると思われる。用い
る正確な宿主細胞は本発明にとって重要ではない。
【００２６】 蛋白質およびポリペプチドはまた、植物細胞によって産生させることができる
。植物細胞の場合、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイ
ルスおよびタバコモザイクウイルス）ならびにプラスミド発現ベクター（例えば
Tiプラスミド）が適している。そのような細胞は広範囲の販売元から入手可能で
ある（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックランド、メリ
ーランド州；例えば、アウスユベール（Ausubel）の「分子生物学の現行プロト コール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョンウィリー＆サン
ズ、ニューヨーク州、1994も参照のこと）。形質転換またはトランスフェクショ
ンの方法、および発現媒体の選択は、選択する宿主系に依存するであろう。形質
転換およびトランスフェクション法は例えば、アウスユベール（Ausubel）ら（ 「分子生物学の現行プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）
」、ジョンウィリー＆サンズ、ニューヨーク州、1994）に記載されている；発現
媒体は、例えば「ベクターのクローニング：実験マニュアル（Cloning Vectors ：A Laboratory Manual）」（パウウェルズ（P. H. Pouwels）ら、1985、補則、
1987）に記載のものから選択してもよい。
【００２７】 発現媒体を保有する宿主細胞は、選択した遺伝子の活性化もしくは抑制、形質
転換体の選択、または選択した遺伝子の増幅に必要であるとして採用された従来
の栄養培地において培養することができる。
【００２８】 挿入された核酸配列を有効に翻訳するために特定の開始シグナルを必要として
もよい。これらのシグナルはATG開始コドンおよび隣接する配列を含む。自身の 開始コドンおよび隣接配列を含む本来の生物学的活性Hn-33遺伝子全体を適当な 発現ベクターに挿入する場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要でないかも知れ
ない。それ以外の場合は、おそらくATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグ ナルを提供しなければならない。さらに、開始コドンはインサート全体が確実に
翻訳されるように、所望のコード配列のリーディングフレームと相が一致しなけ
ればならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、多様な天
然物および合成物に由来することができる。発現効率は、適当な転写または翻訳
エンハンサーエレメントを含むことによって増強することができる（例えば、ビ
ットナー（Bittner）ら、Methods in Enzymol., 153：516、1987に開示のもの）
。
【００２９】 好ましいポリペプチドは、正常な生理的条件下で可溶性であるポリペプチドで
ある。融合蛋白質を作製するために、生物学的活性Hn-33の一部（例えば１つま たはそれ以上のドメイン）を無関係な蛋白質またはポリペプチド（すなわち融合
パートナー）に融合させた融合蛋白質も本発明に含まれる。融合パートナーは、
精製、検出、もしくは可溶化を促進するために、または他の幾つかの機能を提供
するために選択される部分となりうる。融合蛋白質は、生物学的活性Hn-33の全 てまたは一部をコードするヌクレオチド配列が、融合パートナーをコードするヌ
クレオチド配列とインフレームで結合しているハイブリッド遺伝子を発現するこ
とによって、一般的に作製される。例えば、発現ベクターpUR278（ルター（Ruth
er）ら、EMBO J. 2：1791、1983）を用いてlacZ融合蛋白質を作製することがで きる。pGEXベクターはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を含む融合蛋
白質として異種ポリペプチドを発現するために用いることができる。一般的に、
そのような融合蛋白質は可溶性であり、グルタチオン・アガロースビーズに吸収
させてその後遊離のグルタチオンの存在下で溶出することによって、溶解した細
胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングした標的遺
伝子産物をGST部分から放出することができるように、トロンビンまたは第Xa因 子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインされる。
【００３０】 融合蛋白質は、発現される融合蛋白質に特異的な抗体を使用することによって
容易に精製することができる。例えば、ジャンクネヒト（Janknecht）ら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88：8972（1981）に記載の系は、ヒト細胞株において発
現された非変性融合蛋白質を容易に精製することができる。この系において、関
係遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレームがヒスチジン残基６個から
なるアミノ末端タグに翻訳的に融合するように、ワクシニア組換えプラスミドに
サブクローニングする。組換え型ワクシニアウイルスに感染させた細胞からの抽
出物をNi2+ニトリロ酢酸-アガロースカラム上にローディングして、ヒスチジン タグをつけた蛋白質をイミダゾール含有緩衝液によって選択的に溶出する。細菌
培養、例えばA型ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）培養に関しても同じ方
法を用いることができる。
【００３１】 または、生物学的活性Hn-33もしくはその一部は免疫グロブリンFc部分に融合 することができる。そのような融合蛋白質はアフィニティカラムを用いて容易に
精製することができる。
【００３２】 本発明のポリペプチド、特に短い、生物学的活性Hn-33断片はまた、化学合成 によっても（例えば、「固相ペプチド合成（Solid Peptide Synthesis）」第二 版、[1984]、ピアスケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノイ州、に記載
の方法によって）産生することができる。
【００３３】 B．単離 天然に存在する型および組換え型のHn-33の双方を単離して生物活性に関して 試験しなければならない。分泌型は、培養培地から単離することができるが、非
分泌型は宿主細胞から単離しなければならない。ポリペプチドはアフィニティク
ロマトグラフィーによって単離することができる。一つの例において、抗Hn-33 蛋白質抗体（本明細書に記載のように産生した）をカラムに結合させて、これを
用いて生物学的活性Hn-33蛋白質を単離する。アフィニティクロマトグラフィー の前に生物学的活性Hn-33保有細胞を溶解および分画することは、標準的な方法 によって実施することができる（例えば、アウスユベール（Ausubel）ら、上記 を参照のこと）。または生物学的活性Hn-33融合蛋白質、例えば生物学的活性Hn-
33マルトース結合蛋白質、生物学的活性Hn-33-β-ガラクトシダーゼ、もしくは 生物学的活性Hn-33-trpE融合蛋白質を構築して、これを用いて生物学的活性Hn-3
3を単離することができる（例えば、アウスユベール（Ausubel）ら、上記；ニュ
ーイングランド・バイオラブズ、ビバリー、マサチューセッツ州、を参照のこと
）。
【００３４】 例えば、ボツリヌス菌（C. botulinum）をN-Zアミンに基づく増殖培地中で増 殖させて、細胞を回収する。酸による沈殿および遠心後、細胞を溶解してRNアー
ゼAで処理する。細胞抽出物をDEAE-セファデックスA-50カラム上で分画して、プ
ールした分画を硫酸アンモニウムで沈殿させる。次に沈殿した蛋白質を再度溶解
してG-100セファデックスカラム上で分画すると、単離された生物学的活性Hn-33
が得られる。
【００３５】 単離した後、Hn-33ポリペプチドは、必要に応じて、さらなる加工によって生 物活性が損なわれない限り（本明細書に記載の赤血球凝集アッセイにおいて測定
して）、さらに精製および／または濃縮することができる。超遠心および／また
は沈殿（例えば、硫酸アンモニウム）、微細濾過（例えば0.45 μmの酢酸セルロ
ースフィルターによる）、限外濾過（例えば、分粒メンブレンおよび再循環濾過
を用いて）、ゲル濾過（例えば、セファロースCL-6B、CL-4B、CL-2B、6B、4B、 または2B、セファクリルS-400、もしくはS-300、セファロース6またはウルトロ ゲルA2、A4、もしくはA6；全てファルマシア社から入手可能）、急速蛋白質液体
クロマトグラフィー（FPLC）、および液体高速クロマトグラフィー（HPLC）を含
む、多様な精製および濃縮法が当技術分野で周知である（例えば、フィッシャー
（Fisher）、「生化学と分子生物学の実験技術（Laboratory Techniques in Bio
chemistry and Molecular Biology）」、ワーク＆バードン（Work and Burdon）
編、エルゼビア、1980を参照のこと）。
【００３６】 C．物理特性 単離技法を行った後、生物学的活性Hn-33の濃度および純度は容易に測定する ことができる。例えば、ポリペプチド濃度および収量は、バイオラド社から販売
されている試薬を用いてブラッドフォードアッセイの変法によって測定すること
ができる。純度は例えば、SDS-PAGE上での蛋白質試料のアッセイから得られたバ
ンドから推定することができる。
【００３７】 Hn-33変異蛋白質のその他の物理特性も測定することができる。蛋白質の分子 量は当技術分野で周知の方法、例えばSDS-PAGE、レーザー脱離質量分光法、およ
びカラムクロマトグラフィーによって推定することができる。さらに、二次構造
は、フ（Fu）ら、Appl. Spectrosc., 48：1432〜1441（1994）に記述のように円
二色性分析によって分析することができる。
【００３８】 II．Hn-33の特徴付け A．生物活性 単離されたHn-33蛋白質は、ダスグプタ（DasGupta）ら、Can. J. Microbiol.,
23：1257〜1260（1977）および下記の実施例２に記載のような赤血球凝集アッ セイを用いて生物活性の有無を解析することができる。簡単に説明すると、マイ
クロタイタープレートのU底ウェルにおいて少量（例えば、50 μl溶液）のHn-33
ポリペプチド試料（例えば、１ ng/ml〜15または20 μg/ml、例えば416 ng/ml）
に、洗浄した赤血球細胞（例えば0.5％w/w浮遊液0.05 ml）を加える。赤血球凝 集活性は、Hn-33を加えて30分以内に赤血球細胞が凝集して、ウェルの底で環ま たは点を形成しない場合に認められる。Hn-33ポリペプチドは、上記アッセイに おいて300 ng/mlもの低いHn-33の濃度で血液凝集が起こった場合に、生物活性を
有すると見なされる。
【００３９】 B．機能 単離された生物学的活性Hn-33ポリペプチドは、下記の実施例２および６に記 載のように生物学的に活性な野生型Hn-33蛋白質機能の割合に関して解析するこ とができる。簡単に説明すると、Hn-33およびニューロトキシン蛋白質はHn-33：
ニューロトキシンが少なくとも重量比で１となるように混合する。混合液をプロ
テアーゼ消化緩衝液に対して30分間透析して、少なくとも20分消化させて、その
後SDS-PAGEおよび標準的な可視化技法（例えば、ゲルのクーマシーブルー染色）
によって分析した。生物学的活性Hn-33ポリペプチドは、好ましくは野生型の生 物学的活性Hn-33蛋白質の保護機能の少なくとも40、60、80、90、100％、または
さらにそれより高い割合を示す。
【００４０】 C．抗体 生物学的活性Hn-33ポリペプチドを用いて、抗Hn-33抗体、例えば蛋白質の生物
学的活性型に特異的な抗体を作製することができる。そのような生物学的活性特
異的抗体は、A型ニューロトキシン複合体の増強、阻害または検出を必要とする 診断的および治療的技法において用いることができる。
【００４１】 生物学的活性Hn-33ポリペプチド（または免疫原性断片もしくは類似体）を用 いて、抗体を産生することができる。一般的に生物学的活性Hn-33は、KLHのよう
な担体蛋白質とカップリングさせて（アウスユベール（Ausubel）ら、上記に記 載のように）、アジュバントと混合して、宿主哺乳動物に注射してポリクローナ
ル抗体を産生させることができる。これらの抗体は抗原アフィニティクロマトグ
ラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗体は、免疫した動物
の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。
【００４２】 特に、生物学的活性Hn-33蛋白質を注射することによって様々な宿主動物を免 疫することができる。宿主動物には、ウサギ、マウス、モルモット、およびラッ
トが含まれる。宿主の種に応じて、フロイントのアジュバント（完全および不完
全）、水酸化アルミニウムのような鉱質ゲル、リゾレシチンのような界面活性物
質、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性懸濁液、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG（カルメット ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）
のようなおそらく有用なヒトアジュバントを含むがこれらに限定しない様々なア
ジュバントを、免疫応答を増強するために用いることができる。
【００４３】 抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗
体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、およびFab発現ライブラリを用いて産生 した分子が含まれる。
【００４４】 特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、上記の生
物学的活性Hn-33ポリペプチドおよび標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製 することができる（例えば、コーラー（Kohler）ら、Nature 256：495、1975；
コーラー（Kohler）ら、Eur. J. Immunol. 6：511、1976；コーラー（Kohler） ら、Eur. J. Immunol. ：292、1976；ハンマーリング（Hammerling）ら、「モノ
クローナル抗体とT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hy
bridomas）」、エルセビア、ニューヨーク、1981；米国特許第4,376,110号；コ スバー（Kosbor）ら、Immunology Today 4：72、1983；コール（Cole）ら、Proc
. Natl. Acad. Sci. USA, 80：2026、1983；コール（Cole）ら、「モノクローナ
ル抗体と癌療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」、アランRリ ス・インク、77〜96頁、1983；およびアウスユベール（Ausubel）ら、上記、を 参照のこと）。そのような抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびその他の如何 なるサブクラスも含む、免疫グロブリンの如何なるクラスともなりうる。本発明
のMabを産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養してもよい 。これはインビボで高力価のmAbが産生されることから、現在好ましい製造法で ある。
【００４５】 一度産生されたら、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば
アウスユベール（Ausubel）ら（上記）に記述のように、標準的な方法によるウ ェスタンブロットまたは免疫沈降分析によって、特異的な生物学的活性Hn-33を 認識するか否かを試験する。生物学的活性Hn-33を特異的に認識して結合する抗 体は例えば、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）に感染した哺乳動物によ って産生された生物学的活性Hn-33のレベルまたはA型ニューロトキシンのレベル
をモニターする（例えば、生物学的活性Hn-33の量または細胞下分布位置を決定 する）イムノアッセイにおいて用いることができる。
【００４６】 本発明の抗体は、例えば高度保存領域外に存在し、荷電残基が高頻度であると
いった基準に基づいて抗原性であると思われる生物学的活性Hn-33蛋白質の断片 を用いて産生することができる。そのような断片は、不連続な、生物学的活性特
異的エピトープもまた含むことができる。一つの特定の例において、そのような
断片をPCRの標準的な技術によって作製し、その後pGEX発現ベクターにクローニ ングする（アウスユベール（Ausubel）ら、上記）。融合蛋白質を大腸菌に発現 させて、アウスユベール（Ausubel）ら（上記）に記載のようにグルタチオンア ガロースアフィニティマトリクスを用いて精製する。
【００４７】 場合によっては、抗血清の低親和性または特異性に関して起こりうる問題を最
小限にすることが望ましい可能性がある。そのような場合、２つまたは３つの異
なる融合蛋白質を作製して、それぞれの融合物をウサギ少なくとも２羽に注射す
ることができる。抗血清は、一連の注射、好ましくは少なくとも３回の追加注射
を含む注射によって作製することができる。
【００４８】 抗血清はまた、組換え型生物学的活性Hn-33ポリペプチドまたはグルココルチ コイド受容体、CAT、またはルシフェラーゼのような対照蛋白質を免疫沈降させ るか否かをチェックする。
【００４９】 抗体は例えば、診断アッセイの一部として生体試料中の生物学的活性Hn-33を 検出するために、および他の治療的アプローチによる医学的処置の有効性を評価
するために用いることができる。抗体はまた、生物学的活性Hn-33の分布に及ぼ す候補化合物の影響を測定するスクリーニングアッセイにも用いることができる
。
【００５０】 さらに、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適当な生
物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることによっ
て、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術を用いることができる（モリ
ソン（Morrison）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81：6851、1984；ニューバ
ーガー（Neuberger）ら、Nature 312：604、1984；タケダ（Takeda）ら、Nature
, 314：452、1984）。キメラ抗体は、マウスMabに由来する可変領域とヒト免疫 グロブリン定常領域とを有する分子のように、異なる部分が異なる動物種に由来
する分子である。
【００５１】 または、単鎖抗体の産生に関して記述された技術（米国特許第4,946,778号、 第4,946,778号、および第4,704,692号）を、生物学的活性Hn-33に対する単鎖抗 体を産生するように応用することができる。単鎖抗体はアミノ酸架橋によってFv
領域の重鎖および軽鎖断片を結合させることによって形成され、単鎖ポリペプチ
ドが得られる。
【００５２】 特異的エピトープを認識して結合する抗体断片は、既知の技術によって産生す
ることができる。例えば、そのような断片は、抗体分子のペプシン消化によって
産生することができるF(ab')2断片、およびF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還
元することによって作製することができるFab断片を含むがこれらに限定しない 。または、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片を迅速かつ容易に同定 することができるFab発現ライブラリを構築することができる（ヒューズ（Huse ）ら、Science, 246：1275、1989）。
【００５３】 生物学的活性Hn-33に対する抗体は、今度はこれを用いて、当業者に周知の技 法を用いて（例えば、グリーンスパン（Greenspan）ら、FASEB J., 7：437、199
3；ニシノフ（Nissinoff）、J. Immunol., 147：2429、1991を参照のこと）、生
物学的活性Hn-33の一部に類似する抗イディオタイプ抗体を作製するために用い ることができる。例えば、生物学的活性Hn-33に結合して、生物学的活性Hn-33の
リガンド（例えば、o-ニトロフェニル-β-Dガラクトシドまたはイソプロピル-β
-D-チオガラクトシド）の結合を競合的に阻害する抗体を用いて、生物学的活性H
n-33のリガンド結合ドメインに類似し、したがって生物学的活性Hn-33のリガン ドを中和する抗イディオタイプを作製することができる。そのような中和抗イデ
ィオタイプ抗体またはそのような抗イディオタイプ抗体のFab断片を治療レジメ に用いることができる。
【００５４】 D．プロテアーゼ抵抗性 生物学的活性Hn-33または生物学的活性Hn-33を含む複合体は現在、多様なプロ
テアーゼに抵抗性であることが示されている。このプロテアーゼ抵抗性は当技術
分野において周知の方法によって試験することができる。例えば、Hn-33またはH
n-33複合体の既定量（例えば、10 μg〜100 mg）を、選択したプロテアーゼを含
む溶液（例えば、トリプシン、キモトリプシン、サブチリシン、ペプシン、カテ
プシンB、アンコード、アスパラギナーゼ、ブロメレイン、クロストレイペイン 、フィシン、カリクレイン、またはパパイン）と、既定のw/w比（例えば、Hn-33
：プロテアーゼ比が25：１〜1000：１）で、既定の時間（例えば、10分〜24時間
）混合する。消化は、それぞれのプロテアーゼに適した温度（例えば室温または
37℃）およびpHで実施し、当技術分野で既知の如何なる数のプロテアーゼ阻害剤
（例えばPMSF）も消化物に加えることによって停止させることができる。
【００５５】 E．ニューロトキシンプロテアーゼ活性に及ぼす影響 生物学的活性Hn-33は多くのニューロトキシン（例えば、A型ボツリヌスニュー
ロトキシン、E型ボツリヌスニューロトキシン、および破傷風毒素）のプロテア ーゼ活性に影響を及ぼしうる。単離された生物学的活性Hn-33を含むニューロト キシン複合体のプロテアーゼ活性は、少なくとも１つの切断産物（例えば、SNAP
-25）を検出することができる（例えば、SNAP-25 C-末端に結合する抗体を用い たウェスタンブロッティングによって）適した基質（例えば、グルタチオン-S- トランスフェラーゼ-SNAP-25融合蛋白質、VAMP-2、シンテキシン−C1型ボツリヌ
スニューロトキシン専用、またはセルブレビン）を用いて測定することができる
。さらなる物質（例えば、糖またはSDSのような洗浄剤）を消化物に加えて、さ らなる物質がニューロトキシンプロテアーゼ活性に及ぼす影響を調べることがで
きる。
【００５６】 III．生物学的活性Hn-33を含む薬学的組成物の調製 生物学的活性Hn-33はA型ボツリヌスニューロトキシンを蛋白質分解から保護す
るため（下記の実施例６に示す）、Hn-33は、ワクチンまたは治療薬のような薬 学的組成物の調製における担体蛋白質として有用である。
【００５７】 Hn-33ならびにA型およびE型ボツリヌスニューロトキシンの単離および精製を 下記に示す。破傷風毒素はシアボ（Schiavo）ら、Methods Enzymol. 248：643〜
652（1995）に記述の方法に従って単離および精製することができる。
【００５８】 A．ワクチン組成物 本発明は、活性であっても不活性であってもよい少なくとも１つのニューロト
キシン（例えばA型ボツリヌスニューロトキシン、E型ボツリヌスニューロトキシ
ン、または破傷風毒素）、生物学的活性Hn-33（または生物学的活性免疫原性断 片もしくはその誘導体）、および選択的に、希釈剤である燐酸緩衝生理食塩液ま
たは重炭酸塩溶液（例えば、0.24 M NaHCO3）のような薬学的に許容される担体 を含むワクチン組成物（例えば、経口ワクチン）を含む。組成物において用いら
れる担体は、投与様式および経路、ならびに標準的な薬学的実践法に基づいて選
択される。適した薬学的担体および希釈剤は、それらを利用する薬学的必要性と
共に、レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）に記載 されている。アジュバント、例えばコレラ毒素、大腸菌熱不安定エンテロトキシ
ン（LT）、リポソーム、または免疫刺激複合体（ISCOM）も、新規ワクチン組成 物に含むことができる。
【００５９】 当業者は、ニューロトキシンワクチンの調製において、シン（Singh）ら（Tox
icon., 27：403〜410、1990）にさらなる手引きを得ることができる。簡単に説 明すると、ニューロトキシン約0.1〜２ mg（例えば、A型ボツリヌスニューロト キシンもしくは破傷風毒素またはその弱毒化変異体）および生物学的活性Hn-33
0.1〜２ mg（例えば、Hn-33：ニューロトキシン比は、重量で１：１〜20：１と なりうる）を生理的緩衝液（例えば、pH ４〜7.5の緩衝液）に加えて、Hn-33が ニューロトキシンに結合するよう十分な時間（例えば、５分〜２時間）インキュ
ベートする（例えば、４℃〜30℃）。
【００６０】 B．治療組成物 シナプス前神経終末からのアセチルコリンの過剰放出に関連した何らかの疾患
または不快感は、Hn-33ニューロトキシン複合体によって治療することができる 。これらの疾患は、痙性斜頚、本態性振戦、頚性発声障害、筋肉硬直、斜視、眼
瞼痙攣、口顎筋失調症、心血管、胃腸管、もしくは尿路系の括約筋の痙攣、およ
びソラジン（登録商標）またはハルドール（登録商標）のような抗精神薬による
治療の結果起こる可能性がある遅発性ジスキネジーのような、平滑筋または骨格
筋痙攣に関連する。
【００６１】 治療組成物を製剤化するために、Hn-33を適した温度（０〜37℃）で生理的緩 衝液（例えば燐酸緩衝生理食塩液）中で少なくとも１：１の重量でニューロトキ
シンと混合する。得られたHn-33／ニューロトキシン複合体は例えば、凍結乾燥 して滅菌脱イオン水に溶解することができる。その後適当な薬学的担体（例えば
、上記のもののように）を加えることができる。
【００６２】 治療組成物は溶液、懸濁液、坐剤、錠剤、顆粒、粉剤、カプセル剤、軟膏また
はクリームとして製剤化することができる。これらの組成物の調製において、少
なくとも１つの薬学的担体を含めるべきである。薬学的担体の例には、溶媒（例
えば、水もしくは生理食塩液）、溶解補助剤（例えばエタノール、ポリソルベー
ト、もしくはクレモフォアEL（登録商標））、等張剤、保存剤、抗酸化剤、賦形
剤（例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、マンニトール、マルトース、燐
酸水素カルシウム、無水ケイ酸、もしくは炭酸カルシウム）、結合剤（例えば、
デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロース、もしくはアラビアゴム）、潤滑剤（例え
ばステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくは硬化油）または安定化剤（例え
ば、乳糖、マンニトール、マルトース、ポリソルベート、マクロゴール、もしく
はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）が含まれる（を加えることができる）。必
要であれば、グリセリン、ジメチルアセトアミド、70％乳酸ナトリウム、界面活
性剤、水酸化ナトリウムのような塩基性物質、エチレンジアミン、エタノールア
ミン、重炭酸ナトリウム、アルギニン、メグルミン、またはトリスアミノメタン
を加える。ポリ-D, L-ラクチド-コ-グリコライドまたはポリグリコライドのよう
な生体分解性ポリマーは、組成物を徐々に放出することが望ましい場合、バルク
マトリクスとして用いることができる（例えば、米国特許第5,417,986号、第4,6
75,381号、および第4,450,150号を参照のこと）。溶液、錠剤、顆粒、またはカ プセル剤のような薬学的調製物はこれらの成分と共に形成することができる。組
成物を経口投与する場合には、着香料および着色剤を加えることができる。
【００６３】 IV. 生物学的活性Hn-33を含む薬学的組成物の投与 新しいワクチンおよび治療組成物を、いかなる適当な経路、例えば、静脈内、
動脈内、局所注射、腹腔内、胸膜内、経口、皮下、筋肉内、舌下、表皮内、また
は直腸内からも投与することができる。
【００６４】 Ａ．ワクチン ワクチンの投与量は、当業者であれば決定することができるとおり、例えば、
ワクチン抗原の種類、アジュバントを抗原と同時に投与するかどうか、同時投与
するアジュバントの型、投与の様式および頻度、ならびに望まれる効果（例えば
、予防または治療）に応じて異なると考えられる。一般に、新しいワクチン抗原
は、ヒト成人用量として1μg〜100mgの範囲の量で投与する。アジュバントをワ クチンと同時に投与する場合は、ヒト成人用量として1ng〜1mgの範囲の量を一般
に用いることができる。当業者であれば決定することができるとおり、必要に応
じて投与を繰り返す。例えば、初回抗原刺激の後に1週間の間隔で3回の追加抗原
を投与することもできる。同じ製剤を用いて、追加抗原注射を初回免疫の8〜12 週間後に行うこともでき、2回目の追加免疫を16〜20週間後に行うこともできる 。血清またはT細胞を個人から採取して、ワクチンによって誘発されたニューロ トキシンに対する免疫応答を試験することもできる。特定の抗原に対する抗体ま
たは細胞障害性T細胞のアッセイ法は、当技術分野でよく知られている。さらな る追加抗原を必要に応じて投与することもできる。Hn-33、ニューロトキシン、 または薬学的組成物の量を変えることにより、最大の免疫応答を誘発するために
免疫化プロトコルを最適化することができる。
【００６５】 前述の組成物をヒトに投与する前に、動物における毒性および有効性試験を行
うことが望ましい。有効性試験の例において、マウス（例えば、スイス−ウェブ
スターマウス）に経口または非経口経路からHn-33およびニューロトキシン（例 えば、破傷風毒素またはＡ型ボツリヌスニューロトキシン）を含む組成物でワク
チン接種することができる。初回ワクチン接種後、または任意の追加ワクチン接
種後、マウス（および疑似ワクチン接種を受けた対応する対照マウス）を、LD95 用量の毒素で攻撃する。Hn-33／毒素投与を受けたマウスの死亡率が、疑似ワク チン接種を受けたマウスのものよりも低い場合、有効性が確定される。好ましく
は、死亡率の差は統計学的に有意である。前述の試験法において、マウスの代わ
りにウサギを用いることができる。
【００６６】 または、新しいHn-33／ニューロトキシンワクチン組成物をISCOMとして投与す
ることもできる。トキソプラズマ症およびエプスタイン・バーウイルスによる腫
瘍を含む、様々な実験的感染モデルにおいて、ISCOMを抗体の送達媒体として用 い、防御免疫が誘発されている（モワット（Mowat）ら、Immunology Today、12 ：383〜385、1991）。カプセル化してISCOMとされた抗原は、1μgという低用量 でクラスI仲介性の細胞障害性T細胞の応答を引き起こすことが明らかにされてい
る（タカハシ（Takahashi）ら、Nature、344：873〜875、1990）。ポリペプチド
は、リポソームについて前述されたものと同様の様式および用量でISCOMを用い て細胞中に送達される。
【００６７】 Ｂ．治療組成物 患者に投与されるHn-33／ニューロトキシン複合体の用量は、一般に、患者の 状態の重症度、年齢、体重、性別、および全身の健康状態や、マウスに対するLD 50 値の倍数で表される毒素の強度によって異なることになる。
【００６８】 ヒトの治療に適用される用量は、治療を必要とする筋肉の量にほぼ比例する。
一般に、患者に投与される用量は、特定の用途に応じて、約0.01〜約1,000ユニ ット、例えば約5〜50もしくは100、または200〜500ユニットであり得る。1ユニ ットとは、スイス−ウェブスターマウス群（一般に、体重平均20gの18〜20匹の 雌マウス群）の50％を死亡させるHn-33／ニューロトキシンの量と定義される。 用量は、治療中の疾患または状態の症状を軽減するのに十分なアセチルコリン神
経伝達物質の放出低下を得るために、量または頻度のいずれかで調製される。
【００６９】 医師、薬剤師、およびその他の当業者は、治療上最も有効な治療法を決定する
ことができるが、これは患者ごとに異なると思われる。ボツリヌス菌毒素の強度
およびその作用持続時間を考慮して、低頻度で投与し（例えば、10〜200ユニッ トの筋肉内注射を、例えば、4〜6ヶ月に1回、または数週間ごとに1回）、好まし
くは毒素の緩徐放出を可能にするポリマーで作られた埋植物で投与する。当業者
はまた、治療法が毒素による安全性および作用の問題に関して釣り合ったもので
なければならないことも認識している。
【００７０】 一般に、Hn-33／ニューロトキシン複合体は、生理食塩液などの生理的に許容 される溶液に懸濁され、筋肉内注射によって投与される。注射の前に、神経筋接
合部の濃度が最も高い部位に毒素複合体を注射するために、筋肉群の解剖学的構
造に対し、注意深い考察がなされなければならない。筋肉の量があまり多くない
場合、注射は非常に細い、中空の、テフロンコーティングされた針で、筋電図記
録法により誘導して行うことができる。筋肉内での針の位置を、毒素の注射前に
確認しなければならず、全身麻酔、局所麻酔、またはその他の鎮静法を、所定の
患者の年齢および特定の必要性と、注射しようとする部位の数に応じて、主治医
の自由裁量で用いることができる。
【００７１】 一例として、抗精神病薬による治療の結果、遅発性ジスキネジアをわずらう成
人男性患者を、50〜200ユニット（本明細書で定義しているとおり）のHn-33／ボ
ツリヌスニューロトキシン複合体を顔面筋に直接注射することによって治療する
ことができる。3日以内に、遅発性ジスキネジアの症状、すなわち、口顔運動異 常、アテトーシス、ジストニー、舞踏病、チック、およびしかめ面が顕著に低減
される。
【００７２】 脳虚血、または脳もしくは脊髄外傷性損傷に続発する痙性も同様に、治療の影
響を受けやすい。
【００７３】 シナプス後の標的が、筋肉ではなく腺、神経叢、または神経節である場合、Hn
-33／ニューロトキシン複合体を、大量の発汗、流涙、および粘液分泌をコント ロールするために投与することができる。例えば、過剰な一側性発汗の見られる
成人男性患者を、0.01〜50ユニット（本明細書で定義しているとおり）のHn-33 ／ニューロトキシン複合体を腺神経叢、神経節、脊髄、または中枢神経系に投与
することによって治療することができる。好ましくは、機能不全に陥って過剰の
発汗をきたす神経叢または神経節を直接治療する。Hn-33／ニューロトキシン複 合体の脊髄または脳への投与は、可能ではあるが、全身性衰弱をきたすことがあ
る。
【００７４】 治療することのできる他の状態には、緊張性頭痛およびスポーツ外傷または関
節炎性収縮が原因の疼痛が含まれる。必要があれば、過活動筋肉を筋電図記録法
（EMG）によって特定することができる。
【００７５】実施例 本発明が以下の実施例においてさらに詳しく記載されるが、これらの実施例は
特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【００７６】実施例１：生物学的活性Hn-33の単離 ボツリヌス菌（C. botulinum）、ホール株（ATCC第3502番として得られる）を
、N-Zアミンに基づく増殖培地中で増殖させ、ダスグプタ（DasGupta）ら、Toxic
on.、22：415〜424（1984）に記載の方法を下記のとおりに改変した方法に従い 、Hn-33を単離した。32リットルの培養物を4個の9Lパイレックス性ガラスビン中
、37℃で撹拌せずに増殖させた。増殖10日後に細胞を回収した。酸沈殿および遠
心沈降の後、細胞ペレットを抽出し、リボヌクレアーゼＡで消化した。次いで、
消化した粗抽出物を、2本のDEAE-セファデックスA-50カラム（2.5×60cm）に0.0
5Mクエン酸緩衝液（pH5.5）を用いて通過させた。このカラムから、ボイド容量 中に大きな溶出ピークが得られた（図１）。粗ボツリヌスニューロトキシン複合
体を含む最初のピークを2本のカラムから集め、0.351g/mlの硫酸アンモニウム溶
液により沈殿させた。
【００７７】 沈殿した蛋白質を50mMクエン酸緩衝液（pH5.5）に再度溶解し、同じ緩衝液に 対して多量に透析した後、G-100セファデックスカラム（2.5×70cm）に吸着させ
た。蛋白質を同じ緩衝液を用い、流速40ml/hrで溶出した。蛋白質をさらにクロ マトグラフィーで分離して、2つのピークを得た（図２）。G-100カラム溶出の第
1と第2の両方のピークを集めて、さらに分析にかけた。
【００７８】 Ａ型ボツリヌスニューロトキシンを単離するために、粗ニューロトキシン複合
体を前述のとおりに平衡化した第2のDEAE-A-50カラムに吸着させ、0〜0.5M NaCl
グラジエント緩衝液を用いて溶出した。第1の溶出ピークのニューロトキシンを 、20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.9）中、SP-C-50カラムに吸着させ、0〜0.5M
NaClグラジエント緩衝液で溶出することにより、さらに精製した。ニューロト キシンは2つの溶出ピークの第2のピークに含まれている。
【００７９】 Ａ型ボツリヌス複合体の電気泳動による分析を、ファストシステム（PhastSys
tem）電気泳動装置（ファルマシア社（Pharmacia LKB）、ニュージャージー州ピ
スカタウェイ）で4〜15％のグラジエントアクリルアミドゲルを用いて実施した 。電気泳動データをCCD固体ビデオカメラ（ITTI Inc.、フロリダ州セントピータ
ースバーグ）を用いて、分子量測定および各バンドの相対量評価について分析し
た。高分子量標準をバイオラド社（Bio-Rad）から購入し、試料の蛋白質分子量 の測定に用いた。
【００８０】 第1の溶出バンド中で得られた蛋白質群（図２）は、Ａ型ボツリヌスニューロ トキシン複合体と呼ばれている。セファデックスG-100カラムの第2の溶出ピーク
は、33kDaの単一の蛋白質、言い換えると赤血球凝集素-33すなわちHn-33と呼ば れる蛋白質を含んでいた。
【００８１】 Ａ型ニューロトキシン複合体の各成分の相対量を、第1のDEAE-A-50溶出蛋白質
から得られたSDS-PAGEバンドの濃度計測により定量した。非還元条件下で、142k
Daのバンドの相対含有量は25％であったのに対し、120kDaのバンド（ニューロト
キシンに相当）は7％であった。ニューロトキシン関連蛋白質（NAP）の他の成分
が、かなりの比率で存在した（54kDa、16％；33kDa、25％；20kDa、9％；17kDa 、6％；および14kDa、12％）。一般に、精製したHn-33の収率は、セファデック スG-100クロマトグラフィー段階の後で約2％であった。
【００８２】 複合体の濃度（1.66mg/ml）およびニューロトキシンの濃度（1.63mg/ml）を、
吸光係数ε（278nm）にしたがって求めた。Hn-33の濃度を、ウィテイカー（Whit
aker）ら、Anal. Biochem.、109：156〜159（1980）に記載の方法により、係数(
A235−A278)/2.51を用いて求めた。分母の2.51という数字は、吸光度と蛋白質濃
度との相関を最良にし、芳香族アミノ酸による235nmの吸光度への影響を補正す るよう、経験的に決められたものである。
【００８３】 Hn-33の分子量を、単離蛋白質をマトリクス補助レーザー脱離質量分光法にか けることによって、さらに確認した。シナピニン酸中15pmoleのHn-33を、ボイジ
ャー-RPバイオスペクトロメトリーワークステーション（Voyager-RP Biospectro
metry Workstation）（パーセプティブバイオシステム（PerSeptive Biosystem ）、マサチューセッツ州ボストン）で、製造者の指示に従い分析した。分光計を
30,000Vの加速電位で操作し、蛋白質を336Wの強度のレーザーで脱離した。平均1
74回の走査によりスペクトルを得た。BSAを、一価または二価いずれかのイオン を用いて、分子量割当てのための標準として適用した。
【００８４】 得られた質量スペクトル（図３Ａおよび３Ｂ）により、33,389に主なバンドと
、66,945（二量体）および100,359（三量体）にかなりのピークが認められた。 図３Ｂの拡大図に示すとおり、133,717（四量体）に弱いピークが観察された。3
3,389よりも小さい質量は、おそらく、Hn-33のより高度に荷電された化学種また
は少量の不純物であると考えられる。
【００８５】 単離された生物学的活性Hn-33の四次構造を、ゲル濾過クロマトグラフィーを 用いてさらに調べた。50mMクエン酸緩衝液（pH5.5）中、3.4mg/mlで、Hn-33をセ
ファデックスG-200カラム（1.5×80cm）に吸着させた。標準溶出容量を、チトク
ロームC、12.4kDa；炭酸脱水酵素、29kDa；BSA、66kDa；アルコール脱水素酵素 、150kDa；およびアポフェリチン、443kDaで得た。標準Rf値に対する標準MW値の
対数のプロット（図４）、およびHn-33の溶出容量との比較から、Hn-33二量体と
考えられる69kDaの分子量が示された。図４において、灰色の陰影は標準MW蛋白 質の溶出特性を示しており、黒色の陰影はHn-33の溶出特性を示している。この アッセイから、三量体構造が優性であることが示唆される。
【００８６】実施例２：単離Hn-33の赤血球凝集活性の測定 生物活性を、ダスグプタ（DasGupta）ら、（1977）、上記に記載の赤血球凝集
アッセイにより測定した。新しく採取したヒト血液（Ａ型陽性）を、ただちに溶
液（ガンマバイオロジカルズ社（Gammma Biologicals, Inc.）、テキサス州ヒュ
ーストン）で処理し、使用前に0.8％NaClで洗浄した。洗浄したヒト赤血球（0.5
重量％懸濁液0.05ml）を、U底マイクロタイタープレート（ファルコン（Falcon ）、ニュージャージー州ベクトンディキンソン）のウェルに入れたＡ型ボツリヌ
ス毒素、Hn-33、またはニューロトキシン複合体の75mM NaCl溶液0.05mlに加えた
。ニューロトキシン、Hn-33、または複合体13.33μg/mlの濃度から出発した、2 倍の連続希釈をアッセイに用いた。赤血球凝集活性は、4時間のインキュベーシ ョン後に、ウェルの底で赤血球が環または点を形成しなかった場合に認められた
。
【００８７】 精製したHn-33は、前述のアッセイにおいて416ng/mlの濃度で赤血球凝集活性 を示し、この活性は0.05％のSDSによって阻止された。全ニューロトキシン複合 体（すべてのニューロトキシン関連蛋白質を含む）の赤血球凝集活性が、最小濃
度52ng/mlで認められた。精製したニューロトキシンは、13.33μg/ml以下の濃度
で赤血球凝集活性を全く示さなかった。
【００８８】 炭水化物がHn-33の赤血球凝集活性を阻止するかどうかを調べるために、0.5μ
gの単離Hn-33を、胃腸管上皮細胞の先端表面に見られる2種の糖、o-ニトロフェ ニル-β-D-ガラクトシドまたはイソプロピル-β-D-チオガラクトシドの連続希釈
液（初期濃度66.7mMから出発）と混合し、次いで赤血球凝集アッセイにかけた。
33mMの炭水化物濃度で、前述のいずれの糖もHn-33赤血球凝集活性を阻害し、Hn-
33がこれらの糖に結合していることが示された。これらの結果より、新しいHn-3
3／ニューロトキシンワクチン組成物は、胃腸管上皮細胞の表面にあるこれらの 糖に結合し、Hn-33／ニューロトキシンワクチン組成物が体内に入るのを促進し ていることが示唆される。
【００８９】 ニューロトキシン複合体の異なる成分の赤血球凝集活性に対する寄与を調べる
ために、Hn-33特異抗体を用いて赤血球凝集を阻止した。Hn-33特異抗体は、オジ
ャート（Ogert）ら、Anal. Biochem.、205：306〜312（1992）に記載のとおり、
ウマ抗Ａ型ニューロトキシン複合体抗血清をプロテインGマトリクスカラム上で 分画し、続いてHn-33をアフィゲル（Affigel）15マトリクス（バイオラド社（Bi
o-Rad）、カリフォルニア州ハーキュリーズ）に吸着させることによってつくら れたHn-33アフィニティカラムで分画することにより、単離した。IgG画分をアフ
ィゲル（Affigel）（登録商標）カラムに吸着させた後、カラムを0.15Mリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.0）で洗浄し、0.2M塩酸グリシンで溶出した。
【００９０】 Hn-33抗体の特異性を、Ａ型ニューロトキシン複合体蛋白質のウェスタンブロ ッティング法により確認した。ニューロトキシン複合体を12.5％SDS-ポリアクリ
ルアミドゲル（厚さ0.75mm、8×9cmのミニゲル）上で還元条件下（2-メルカプト
エタノール添加）、ミニプロテアン（Mini-PROTEAN）II(登録商標)電気泳動セル
（バイオラド社（Bio-Rad））を用いて分離した。次いで、蛋白質のバンドを、 ミニトランスブロット（Mini Trans-Blot）電気泳動トランスファーセル（バイ オラド社（Bio-Rad））をタウビン（Towbin）ら、Proc. Natl. Acad. Svi. USA 、76：4350（1979）に記載の方法に従って用いてトランスブロッティングするこ
とにより、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。この後の段階で
抗体へのいかなる非特異的結合も阻止するために、ニトロセルロースメンブレン
をBSAの3％PBS溶液により、室温で1時間処理した。エレクトロブロッティングし
た蛋白質を、3％BSAに溶解した50μg/mlの抗体溶液にメンブレンを4℃で終夜浮 遊させることにより、Hn-33抗体をプローブに用いて調べた。結合していない抗 体を、メンブレンを0.05％トゥイーン20（登録商標）／PBS溶液を200mlずつ用い
て4回洗浄することにより、除去した。続いて、メンブレンを抗ウマIgG−ペルオ
キシダーゼ結合体の3％BSA溶液中1：10,000希釈液と共に室温で1時間インキュベ
ートした。結合した抗体を、α-クロロナフトールの発色酸化により検出した。 この方法から、アフィニティ精製したHn-33抗体は33kDaのバンドだけを認識する
ことが示された。
【００９１】 Hn-33特異的抗体は、より高い抗体濃度でHn-33および複合体の赤血球凝集活性
を完全に阻止した。1.33μg/mlのHn-33によって誘発された赤血球凝集活性は、4
12ng/mlのHn-33抗体によって阻止されたが、206ng/mlの抗体では阻止されなかっ
た。しかし、1.33μg/mlのＡ型ニューロトキシン複合体によって誘発された赤血
球凝集活性は、412ng/mlと206ng/mlの両方の濃度のHn-33抗体によって阻止され た。後者の結果から、Hn-33はＡ型複合体における唯一の主な赤血球凝集素蛋白 質であることが示された。
【００９２】実施例３：単離された生物学的活性Hn-33は翻訳後改変されている 単離された生物学的活性Hn-33のN末端アミノ酸配列を以下のとおりに決定した
。約10pmoleの精製したHn-33を試料緩衝液（0.5Mショ糖、15％SDS、312.5mMトリ
ス、10mM EDTA）に溶解し、12.5％SDS-PAGEゲル（厚さ0.75mm、8×9cmのミニゲ ル）で、ミニプロテアン（Mini-PROTEAN）II電気泳動セル（バイオラド社（Bio-
Rad））を用いた電気泳動にかけた。次いで蛋白質をタウビン（Towbin）緩衝液 （25mMトリス、192mMグリシン、および20％メタノール）中、ミニトランスブロ ット（Mini Trans-Blot）電気泳動トランスファーセル（バイオラド社（Bio-Rad
））を用いて60Vで氷浴中、終夜トランスファーした。翻訳後切断を、エドマン 分解法と、その後の自動シーケンサー（アプライドバイオシステムモデル（Appl
ied Biosystem Model）473A、ベイラー大学医学部生体分子蛋白質配列決定施設 （Biomolecular Protein Sequencing Facility of Baylor College of Medicine
）、テキサス州ヒューストン）による分析を用いて調べた。
【００９３】 0.2Mトリシン、10mMトリス-HCl、1mM EDTA、および2.5％SDS（pH8.0）を用い たSDS-PAGEゲルで単一の均質なバンドとして現れた同じ蛋白質が、配列決定用の
蛋白質を調製するために用いたゲルでは3つの異なるバンドとして現れた。これ らのバンドの起源を確認するために、上のバンドは以前に単離されたHn-33と等 しいため、発明者らは下の2つのバンドの配列決定を行った。両方のバンドの蛋 白質は、同じN末端配列VIQNSLNDKI（配列番号：２）を有していた。この配列は 、イースト（East）ら、Syst. Appl. Nicrobiol.、17：306〜312（1994）に記載
のとおり、Hn-33の+6位の配列（MEHYSVIQNSLNKDI；配列番号：３）に対応してい
た。したがって、前述の結果より、成熟蛋白質は翻訳後切断産物として存在する
ことが示唆される。
【００９４】実施例４：Hn-33の二次構造はβ-シートを含む 単離された生物学的活性Hn-33の二次構造を分析するために、蛋白質を遠紫外 円二色性（CD）試験およびFT-IR分光法にかけた。CDスペクトルを、ジャスコ（J
asco）J715分光偏光計でパス長1mmの石英キュベットを室温で用い、走査速度20n
m/min、応答時間8秒で記録した。スペクトルの記録に用いた蛋白質濃度は0.2mg/
mlであった。対照とSDS処理スペクトルとの最終比較のために、SDS溶液の基準ス
ペクトルを差し引いた。二次構造の含有量を、ヤング（Yang）ら（Meth. Enzymo
l.、130：208〜269、1986）の方法により推定した。
【００９５】 Hn-33を0.05％SDSで処理すると生物活性が消失した（実施例２参照）ことから
、Hn-33のCDスペクトルをSDSのミセル形成濃度よりも低い濃度（0.05％）および
ミセル形成濃度（0.5％）存在下および非存在下で収集した。図５は、一連のス ペクトルを示しており、図中、実線はSDSなしのHn-33、広い破線は0.05％SDS存 在下でのHn-33、および狭い破線は0.5％SDS存在下でのHn-33を表している。CDス
ペクトルにおいて、205nmの大きな負ピークと、187nmの正のバンドが認められた
。Hn-33の0.05％SDSによる処理は、CDスペクトルの形を著しく変化させ、205nm の負ピークのシフトが見られた。正のCDバンドは187から190nmにシフトした。Hn
-33の0.5％SDSによる処理は、205nmのピークを0.05％SDSのスペクトルに比べて わずかに増大させた。二次評価により、Hn-33はα-ヘリックス6％、β-シート55
％、およびランダムコイル39％であることが示唆された。0.05％SDS存在下では 、推定組成はα-ヘリックス10％、β-シート48％、およびランダムコイル42％に
シフトした。0.5％SDS存在下では、0.05％SDSに比べ、組成はランダムコイルの 割合が非常にわずかに変化しただけで、α-ヘリックス10％、β-シート48％、お
よびランダムコイル41％となった。したがって、Hn-33のSDSによる処理は、Hn-3
3構造のα-ヘリックス含有量を増加させ、β-シート含有量を減少させた。しか し、SDSのミセル形成濃度よりも低い濃度とミセル形成濃度とで、Hn-33ポリペプ
チドに構造的差異はほとんど見られなかった。
【００９６】 Hn-33の二次構造を、フ（Fu）ら、Appl. Spectrosc.、48：1432〜1441（1994 ）に記載のとおり、ニコレット（Nicolet）8210 FT-IR分光計を用いてさらに分 析した。0.65mg/mlのHn-33を含む溶液1mlを、60°水平セレン化亜鉛、減衰全反 射クリスタルにのせた。スペクトルを4／cmの解像度で256回の走査から構築した
。スペクトルはすべて、9点サビツキー-ゴレイ（Savitsky-Golay）のアルゴリズ
ムを用いて平滑化し、データ分析のために100を乗じた。平均スペクトルを別々 に記録した8つのスペクトルから得た。二次構造分析のために、データ処理をフ （Fu）ら（1994）、上記の方法から、LCソフトウェア（ラブカルク（LabCalc） 、ガラクティックインダストリーズ社（Galactic Industries Co.）、ニューハ ンプシャー州セーラム）を用いることによって改変した。バッセル（Bassel）脱
重畳関数を、ガンマ係数3.3、フィルター係数0.355で選択した。脱重畳したスペ
クトルをまず固定バンド位置および浮動した半分の高さのバンド幅に適合させ、
個別に分離したすべてのバンドに対して最も妥当なバンド強度が得られるように
、バンドを形成した。固定バンド位置を解放して、曲線に最も適合する結果を得
た。コンピューター計算を用いて、各パラメーターを最も適合するまで（最良の
自乗平均値によって決定）変動させた。得られた一群のパラメーターを、次いで
、最も良く分離された基礎バンドを得るために、バンドを元の蛋白質スペクトル
に適合させるように適用した。近隣のバンドによる影響を除去するために、アミ
ドI領域を1550〜1750cm-1で分析し、アミドIII領域を1400〜1200cm-1で分析した
。様々な二次構造へのバンドの割当ては、フ（Fu）ら（1994）、上記で用いられ
ている割当てに基づいて行った。
【００９７】 Hn-33のアミドIおよびIIIのIRスペクトルを、図６Ａおよび６Ｂに示している 。大きな吸収バンドが、アミドIおよびアミドIII領域でそれぞれ1632および1237
cm-1に認められ、β-シートがHn-33構造において優性であることが示唆される。
アミドIおよびIIIの分離されたバンド位置と、その寄与および二次構造型への割
当てを調べた。アミドIのバンド分析に基づけば、Hn-33はβ-シート74％、α-ヘ
リックスはなし、およびβ-ターンまたは不規則構造26％からなる。アミドIIIの
バンド分析に基づけば、Hn-33はβ-シート77％、α-ヘリックスはなし、および β-ターンまたは不規則構造23％からなる。個々の二次構造型には小さな差はあ るが、2つのアミド領域からのデータは概して矛盾がなく、前述の遠紫外CD分析 と一致していた。
【００９８】 1370cm-1に見られた広いバンド（図６Ｂ）は、一般に蛋白質と関連がなく、補
欠分子団を示すと考えられる。発明者らは、シッフ試薬キット（シグマ社（Sigm
a）、ミズーリ州セントルイス）を製造者の指示にしたがって、またドーナー（D
oerner）ら、Anal. Biochem.、187：147〜150（1990）に記載のとおりに用いて 、炭水化物について試験した。炭水化物は認められなかった。
【００９９】実施例５：単離された生物学的活性Hn-33はプロテアーゼ抵抗性である 生物学的に活性なHn-33を前述の実施例１に記載のとおりに単離した。Hn-33の
消化をデレジエウィクツ（Deresiewicz）ら、Biochemistry、33：12844〜12851 （1994）に記載のとおりに実施した。蛋白質分解による断片化の程度を、消化反
応物のSDS-PAGEを実施した後、前述のウェスタンブロッティングを行うことによ
り、モニターした。結果は一般に完全なポリペプチドのパーセンテージで表され
、SDS-PAGEゲル上の全長バンドとして残っているポリペプチドの量を意味する。
分解されたパーセンテージは100から完全なもののパーセンテージを差し引いた ものである。
【０１００】 相対的に高濃度のトリプシン（1mg/mlまでで24時間）はHn-33を分解しなかっ た。より緩和な条件（01mg/mlで30分間）で、Ａ型ニューロトキシン複合体は分 解された。Hn-33は、α-キモトリプシン、スブチリシン、およびペプシンを含む
、試験したプロテアーゼすべての蛋白質分解攻撃に抵抗性であった。低pH条件（
下記のペプシンの条件参照）または炭水化物を添加した場合でも、抵抗性が観察
された。
【０１０１】 Hn-33を50mMトリス（pH7.0）および5mM CaCl2中、プロテアーゼと250：1の重 量比でインキュベートすることにより、トリプシン消化を実施した。炭水化物（
o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシドおよびイソプロピル-β-D-チオガラクトシ
ド）を最終濃度66.7mM（Hn-33赤血球凝集活性を阻害した濃度）となるよう任意 に加えた場合、インキュベーションは25℃で30分間行った。
【０１０２】 他のプロテアーゼによる消化は下記のとおりであった。ペプシン消化は、50mM
酢酸アンモニウム（pH2.0）および2mM EDTA中、蛋白質：プロテアーゼ比＝25：1
で実施した。α-キモトリプシン消化は、50mMトリス（pH7.8）および5mM CaCl2 中、蛋白質：プロテアーゼ比＝1000：1で実施した。スブチリシン消化は、0.1mM
重炭酸アンモニウム（pH7.5）および1mMグアニジン-HCl中、蛋白質：プロテアー
ゼ比＝25：1で実施した。トリプシンおよびα-キモトリプシン消化は室温で行い
、ペプシンおよびスブチリシン消化は37℃で行った。反応物中に1mM PMSFを加え
ることによって、消化を停止させた。停止した反応を次いで、SDS-PAGE泳動緩衝
液中で煮沸した後、8〜25％のグラジエントゲルに吸着させた。Hn-33は、本明細
書で試験したすべてのプロテアーゼに対し、高度に抵抗性であった（SDS-PAGEゲ
ルで示されるとおり、消化されたのはポリペプチドの5％未満であった）。
【０１０３】 これらの結果より、Hn-33は胃腸管で見いだされる様々なプロテアーゼに対し 抵抗性であることが示されており、ポリペプチド（またはその断片もしくは誘導
体）が胃腸管に投与された場合にも安定であることが示唆され、したがって、経
口ワクチン組成物を安定化するために有用であると考えられる。
【０１０４】実施例６：単離された生物学的活性Hn-33はＡ型ニューロトキシンに結合し、得 られた複合体を蛋白質分解から保護する Ａ型ニューロトキシンおよびHn-33を、前述の実施例１に記載のとおりに、Ａ 型ボツリヌス菌（C. botulinum）から精製した。
【０１０５】 ニューロトキシンとHn-33との直接の結合を調べるために、3mlの0.05Mクエン 酸ナトリウム（pH5.5）中、5mgのニューロトキシンを1.7mgのHn-33と混合した（
これは、ニューロトキシン：Hn-33のモル比＝1：1.5に相当する）。混合物を室 温で30分間インキュベートした後、あらかじめ0.05Mクエン酸緩衝液（pH5.5）で
平衡化したセファデックス（登録商標）G-200カラム（1.5×100cm）に吸着させ た。蛋白質を同じ緩衝液を用いて、流速12ml/hで溶出した。1.7mlの画分を集め 、280nmの吸光度をモニターすることによって蛋白質含有量を推定した。ピーク 画分を8〜25％SDS-PAGEゲルで分析した。
【０１０６】 各2mgの標準蛋白質（チトクロームC、12.4kDa；炭酸脱水酵素、29kDa；BSA、6
6kDa；アルコール脱水素酵素、150kDa；およびアポフェリチン、443kDa）を0.05
Mクエン酸ナトリウム（pH5.5）に溶解し、セファデックスG-200カラムに吸着さ せて、直前に述べた様式で溶出した。ブルーデキストランに標準蛋白質を泳動さ
せて、カラムのボイド容量を推定した。Hn-33およびそのニューロトキシンとの 複合体に対応するピークの分子量を、標準Rf値に対する標準MWの対数のプロット
を用いて推定した。
【０１０７】 Hn-33／ニューロトキシン混合物は2つのピークで溶出された（図７）。ピーク
の画分を実施例１に記載のとおりSDS-PAGEにかけた後、クーマシー染色を行った
ところ、第1のピークは140kDaと33kDaの蛋白質を含み、第2のピークは33kDaの蛋
白質だけを含むことが示された。280nmの吸光度およびSDS-PAGEに基づき、約94 ％のHn-33がニューロトキシンに結合していると推定された。
【０１０８】 ニューロトキシン単独、ニューロトキシン複合体、または同じ量のニューロト
キシンとHn-33（混合して室温で30分間インキュベートした）を、各プロテアー ゼに特異的な消化緩衝液中で30分間透析し、次いで実施例２に記載のとおりに消
化を行った。予期されたとおり、ニューロトキシン複合体は、ペプシン、トリプ
シン、スブチリシン、およびα-キモトリプシンを含む消化物中で、少なくとも6
0％が完全なまま残った。
【０１０９】 ペプシンは20分後に「裸の」ニューロトキシンを消化し始め、60分後にはニュ
ーロトキシンを完全に消化した。Hn-33が「裸の」ニューロトキシンインキュベ ーション中に含まれる場合、ニューロトキシンは消化90分後でも少なくとも75％
が完全なまま残った。トリプシンおよびキモトリプシンを別々の実験で用いた場
合にも、同様の結果が得られた。これらの実験から、Hn-33は、低pHや上皮細胞 表面炭水化物の存在を含む、胃腸管の環境を模擬した条件下で、ニューロトキシ
ンを蛋白質分解から保護しうることが示された。したがって、単離された生物学
的活性Hn-33は、ボツリヌスニューロトキシン蛋白質を蛋白質分解から保護する と考えられる。
【０１１０】実施例７：単離された生物学的活性Hn-33のワクチンにおける使用 1mgの単離された生物学的活性Hn-33を、1mgのＡ型ボツリヌスニューロトキシ ンと共に、リン酸緩衝食塩液中でインキュベートして、Hn-33ワクチン組成物を 調製する。Hn-33をニューロトキシンに結合させるために十分インキュベートし た後、混合物を凍結乾燥し、100mlの滅菌脱イオン水に再懸濁して、ワクチンを 作製する。ワクチンを経口により投与する。
【０１１１】 ワクチンを動物モデルで試験するために、本実施例で前述したとおりに調製し
た200μgのHn-33／ニューロトキシン複合体を含むワクチンで、ウサギの胃に挿 入した栄養針から、ウサギを経口的に免疫化する。ニューロトキシンを含まない
同量の食塩液を、同じタイプで同じ体重の別のウサギに対照として投与する。こ
のようなワクチン投与は、カレム（Karem）ら、Infect. Immun.、63：4557〜456
3（1995）に記載されている。ウサギをボツリヌス症候群の徴候について観察す る。2回の追加免疫注射を、それぞれHn-33／ニューロトキシン複合体200μgの用
量で行い、1回目の追加免疫は初回接種の2週間後、2回目の追加免疫は初回接種 の6週間後に行う。ウサギを再度、ボツリヌスの徴候について観察する。
【０１１２】 初回および追加免疫後、血清およびT細胞を、ニューロトキシンワクチンに対 する免疫応答について試験する。次いで、すべてのウサギを、対応するニューロ
トキシンまたはニューロトキシン複合体のLD50用量で皮下攻撃する。免疫化ウサ
ギを対照群と比較して、症状および死亡率に変化があればすべて、記録して分析
する。
【０１１３】実施例８：単離された生物学的活性Hn-33はボツリヌスニューロトキシンのプロ テアーゼ活性を増強する Hn-33がＡ型ボツリヌスニューロトキシン蛋白質のプロテアーゼ活性を増強し うるかどうかを調べるために、Hn-33存在下および非存在下でニューロトキシン のSNAP-25-GST融合蛋白質を切断する能力を調べた。
【０１１４】 SNAP-25は、シナプス小胞のシナプス前膜への融合に関係があるとされる膜関 連蛋白質である。ボツリヌスニューロトキシンは、SNAP-25をC末端から9および2
6アミノ酸の部位で切断する（ウィリアムス（Williams）ら、J. Biol. Chem.、2 71 ：7694〜7699、1996；およびソルナー（Sollner）ら、Nature、362：318〜324
、1993）。
【０１１５】 SNAP-25-GST融合蛋白質は、スミス（Smith）ら、Meth. Molec. Cell. Biol.、 4 ：220〜229（1993）に記載の標準的方法を用いて精製した。精製した融合蛋白 質を、50mMトリス、10mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、2mM MgCl2、0.3nM CaC
l2、1mM 2-メルカプトエタノール、および0.1％NaN3（pH7.6、4℃）に溶解し、 透析した。
【０１１６】 Ａ型ボツリヌスニューロトキシンを前述の実施例１に記載のとおりに精製した
。Ｅ型ボツリヌスニューロトキシンを、ギメネズ（Gimenez）ら、Appl. Environ
. Microbiol.、53：2827〜2830（1987）に記載され、下記のとおりに改変した方
法で精製した。沈殿したＥ型ニューロトキシンを0.02Mリン酸ナトリウム（pH7.4
）に溶解し、これに対して12〜16時間透析した。次いで、複合体を直前に記載の
緩衝液で平衡化したDEAE-セファデックスA-50カラムに吸着させた。結合してい ない物質をカラム容量の10倍の緩衝液で洗浄したが、ほとんどの複合体はカラム
に結合していた。Ｅ型ニューロトキシンを、0.2M NaClグラジエントでA280測定 値がバックグラウンドのレベルに到達するまで溶出した。
【０１１７】 消化を、1.7μMのニューロトキシンおよび5μMのSNAP-25融合蛋白質を含む0.0
1Mリン酸緩衝液（pH7.4）中、37℃で30分間実施した。消化前に5μgのHn-33を任
意に加えた。ジスルフィド結合を還元するために、消化物を任意に20mM DTTと37
℃で30分間、予備インキュベートした。次いで、SDS-PAGE試料緩衝液を加え、消
化物を100℃で4分間加熱することにより、消化を停止させた。次いで30μlの試 料を12％SDS-PAGEゲル上で分離し、SNAP-25のC末端の12アミノ酸に対して生じさ
せた抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。切断された基質の量を、
前述の実施例６に記載のとおりに定量した。
【０１１８】 Ａ型ニューロトキシンは、前述の条件下でSNAP-25融合蛋白質の57％を切断し たが、Ｅ型ニューロトキシンはSNAP-25融合蛋白質の28％を切断したにすぎなか った。Hn-33存在下では、Ａ型ニューロトキシンは融合蛋白質の80％を切断し、 Ｅ型ニューロトキシンは融合蛋白質の47％を切断した（図８）。したがって、消
化前にニューロトキシンにHn-33を加えることにより、ボツリヌスニューロトキ シンによる基質切断が増強され、Hn-33およびニューロトキシンを含む治療組成 物が高い治療活性を有しうることが示された。このような改善された組成物は、
非ニューロトキシン成分が原因の副作用のために、より強い神経毒活性または投
与薬物の減量を必要とする患者にとって有用である。
【０１１９】その他の態様 本発明をその詳細な説明と共に述べてきたが、前述の説明は例示のためのもの
であって、特許請求の範囲で定義されている本発明の範囲を限定するものではな
いことが理解されるべきである。その他の局面、利点、および改変は特許請求の
範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１、２、４、および７】 クロマトグラフィーカラムからの溶出プロフ
ィールである。図１のプロフィールは、粗なA型ボツリヌス菌（C. botulinum） 抽出物のSEAE-セファデックスA-50カラムによる分離である。図２のプロフィー ルは、粗A型ボツリヌスニューロトキシン複合体のセファデックスG-100カラムに
よる分離である。図４のプロフィールは、単離した生物学活性Hn-33（黒色）お よび標準蛋白質（灰色）のセファデックスG-200カラムによる分離である。図７ のプロフィールは、Hn-33/A型ニューロトキシン組成物のセファデックスG-200カ
ラムによる分離である。
【図３Ａおよび３Ｂ】 Hn-33のマトリクス補助レーザー脱離質量分光法の グラフである。図3Bのスペクトルは図3Aのスペクトルを拡大している。
【図５】 HN-33の遠紫外線CDスペクトルのグラフである。
【図６Ａおよび６Ｂ】 Hn-33のIRスペクトルのグラフである。
【図８】 ボツリヌスニューロトキシンによるSNAP-25基質の切断を示す棒 グラフである。
【図９】 完全長のHn-33ポリペプチドのアミノ酸配列である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/08 Ａ６１Ｐ 9/08 13/06 13/06 21/00 21/00 21/02 21/02 25/14 25/14 Ｃ０７Ｋ 14/33 Ｃ０７Ｋ 14/33 (72)発明者 シャルマ シャシ カント アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ニ ュー ベッドフォード トレモント スト リート 52 Ｆターム(参考） 4C076 AA11 BB01 BB15 CC09 DD46 FF12 4C085 AA05 AA38 BA12 BA41 CC07 EE03 FF12 FF14 FF17 GG03 GG08 4H045 AA10 AA30 CA11 DA83 EA21 EA22 EA31 FA73 GA05 GA06 GA15 GA22 GA23

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 A型ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）から単離された
    生物学的活性Hn-33とニューロトキシンとを含む組成物。
  2. 【請求項２】 ニューロトキシンが、A型ボツリヌスニューロトキシン、E型
    ボツリヌスニューロトキシン、および破傷風毒素からなる群より選択される、請
    求項１記載の組成物。
  3. 【請求項３】 ニューロトキシンがA型ボツリヌスニューロトキシンである 、請求項１記載の組成物。
  4. 【請求項４】 組成物が、本質的にHn-33、少なくとも１つのニューロトキ シン、および動物への投与に適した薬学的担体で構成される、請求項１記載の組
    成物。
  5. 【請求項５】 薬学的担体がアジュバントである、請求項４記載の組成物。
  6. 【請求項６】 薬学的担体がポリソルベート、エタノール、デンプン、およ
    びグリセリンからなる群より選択される、請求項４記載の組成物。
  7. 【請求項７】 A型ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の生物学的に活
    性な単離Hn-33。
  8. 【請求項８】 動物においてニューロトキシンに対する免疫応答を誘発する
    方法であって、ニューロトキシンに対する免疫応答を誘発するために有効な量の
    組成物を動物に投与することを含み、組成物がA型ボツリヌス菌（Clostridium b
    otulinum）の単離された生物学的活性Hn-33とニューロトキシンとを含む方法。
  9. 【請求項９】 組成物がアジュバントをさらに含む、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項10】 ニューロトキシンがA型ボツリヌスニューロトキシン、E型ボ
    ツリヌスニューロトキシン、および破傷風毒素からなる群より選択される、請求
    項６記載の方法。
  11. 【請求項11】 ニューロトキシンがA型ボツリヌスニューロトキシンである 、請求項８記載の方法。
  12. 【請求項12】 組成物が動物に経口投与される、請求項８記載の方法。
  13. 【請求項13】 組成物がニューロトキシンを徐々に放出させる生体分解性ポ
    リマーをさらに含む、請求項８記載の方法。
  14. 【請求項14】 動物がヒトである、請求項８記載の方法。
  15. 【請求項15】 動物における神経筋疾患を治療または予防する方法であって
    、神経筋疾患を治療または予防するために有効な量の組成物を動物に投与するこ
    とを含み、組成物がA型ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の単離された生
    物学的活性Hn-33とニューロトキシンとを含む方法。
  16. 【請求項16】 ニューロトキシンがA型ボツリヌスニューロトキシン、E型ボ
    ツリヌスニューロトキシン、および破傷風毒素からなる群より選択される、請求
    項15記載の方法。
  17. 【請求項17】 ニューロトキシンがA型ボツリヌスニューロトキシンである 、請求項15記載の方法。
  18. 【請求項18】 組成物が治療を必要とする筋肉または筋肉の周辺組織に注射
    される、請求項15記載の方法。
  19. 【請求項19】 組成物がニューロトキシンを徐々に放出させるポリマーをさ
    らに含む、請求項15記載の方法。
  20. 【請求項20】 神経筋疾患が、平滑筋痙攣および骨格筋痙攣からなる群より
    選択される、請求項15記載の方法。
  21. 【請求項21】 神経筋疾患が頭痛である、請求項15記載の方法。
  22. 【請求項22】 神経筋疾患が脳性麻痺である、請求項15記載の方法。
  23. 【請求項23】 動物がヒトである、請求項15記載の方法。
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