JPH11507827A - Ｆ型ボツリヌス毒素およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 毒素活性を有さないポリペプチドは、Ｆ型ボツリヌス毒素に対する保護を与える。毒素分子のフラグメントと精製部分との融合タンパク質は、溶液からのフラグメントの精製を可能にする。ポリペプチドおよび融合タンパク質を含む薬学的組成物を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｆ型ボツリヌス毒素およびその用途 本発明は、Ｆ型ボツリヌス毒素、Ｆ型ボツリヌス神経毒素のフラグメント、組 み換え手段によるそのフラグメントの産生、およびそのフラグメントをコード化 する合成遺伝子に関する。特に、本発明は、ヒトまたは動物においてＦ型ボツリ ヌス神経毒素（BoNT/F）に対して保護的である、免疫学的応答を誘発し得る新規 のポリペプチドフラグメント、およびそのフラグメントを含むワクチンに関する 。 ボツリヌス神経毒素（BoNTs）は、脊椎動物において強力な神経麻痺効果を発 揮する高分子量タンパク質（約150,000 Da）である。それらは、Clostridium属 に属する嫌気性グラム陽性細菌により合成される。BoNTを産生するクロストリジ ウムの大部分がClostridium Botulinumとして分類される。しかし、最近、Clost ridium baratiおよびClostridium butyricumに類似する単離体がBoNTを産生する ことが示された。抗原性を基準として、BoNTはA〜Gと称される７つの異なるタイ プに細分された。７つの全ての神経毒素（BoNT/A〜BoNT/G）は一本鎖150,000 Da 分子として合成され、続いて切断されて少なくとも一つのジスルフィド架橋によ り結合される重（H）鎖（約100,000 Da）および軽（L）鎖（約50,000 Da）から なる、より強力な二本鎖形態になる。 BoNTの作用は3つの異なる相を含む。第1の相において、毒素は、標的化神経細 胞の外表面上のアクセプターに結合する。続いて、エネルギー依存性内在化工程 により毒素またはその一部が細胞に入る。その後、毒素の活性部分が、神経抹消 において神経伝達物質であるアセチルコリンの細胞内放出をブロックして弛緩性 麻痺を引き起こすことにより神経細胞機能不全を引き起こす。Ｌ鎖は、細胞被毒 の原因となる触媒活性を有し、そしてH鎖は、毒素の細胞への結合およびその後 の内在化を媒介することにより、この部分を細胞質に送達する。 ７つ全てのBoNTの全アミノ酸配列は、その主要なアミノ酸配列における驚くべ き分岐が示されていることが既知である。(Minton,N.P．(1995)、Current Topic s in Microbiology and Immunology、第195巻：161〜187頁)。すなわち、異なる 血清型中の配列同一性は通常40％を超えず、相同の領域は、全類似性をほとんど 示さないアミノ酸領域が挿入された別々のドメインに局在化されている。異なる L鎖（平均サイズ439）の間において、63のアミノ酸が完全に保存される。H鎖（ 平均サイズ843）を通じて、97アミノ酸が同一である。最も顕著な保存領域は、L 鎖とH鎖との間のジスルフィド結合形成に関与する二つのシステイン残基；メタ ロプロテアーゼ活性に関与するL鎖内のヒスチジンリッチモチーフ；および膜架 橋潜在性を有するとして同定された領域に隣接して見い出される高度に保存され たPYI/VXALNモチーフを含む。毒素中の配列分岐の最も顕著な領域は、それぞれ のH鎖のCOOH末端に局在化されている（BoNT/Aの上流のアミノ酸1124）。これは 、このドメインが神経毒素結合に関与し、そして異なる毒素が神経細胞表面上の 異なるアクセプターを標的にするという概念に一致するようである。 西洋諸国における近年の食品保存プロセスの有効性は、ボツリスムの発生を極 めてまれにした。しかし、食品産業における試験生物としてのC.ｂotulinumの頻 繁な使用、および神経生化学者によるこの毒素の使用の増加は、ヒトワクチンに 対する必要性を増加させた。これらのワクチンの処方は1950年代初期から殆ど変 化しておらず：神経毒素の部分的精製製剤がホルムアルデヒド処理によりトキソ イド化され、そして沈殿したアルミニウム塩に吸収される。このような方法論を 用いて、ヒト免疫化のための多価ワクチン（ABCDEまたはABEFに対する）が現在 入手可能である。このようなワクチンは、低免疫応答、およびトキソイド製剤中 の高い割合（60〜90％）の汚染タンパク質によるバッチ間のかなりの変不利益を 被る。従って、最近の研究は、毒素をほぼ均質に精製するための手順の開発に集 中している。しかし、ワクチンの製造における精製毒素の使用は、第1に、それ らを高含量下に製造しなくてはならないこと、第2に、毒素から活性状態への逆 転の可能性を防止するために低レベルのホルムアルデヒドの存在を必要とするこ とという不利益を被る。 他の生物および毒素に対するサブユニットワクチンの産生が、多くの実験機関 により研究されている。この作業は、最も既知の毒素サブタイプ、すなわちAお よびBを焦点として、Ａ型またはＢ型の毒素に対する特異的な免疫性を生じる新 規のワクチンが得られた。しかし新規のワクチンは、他の毒素サブタイプに対す る保護を提供し得ない。 ワクチン成分の組み換え製造は、ワクチンの純度および製造量を大きく進展さ せた。A.J.Makoffら、Bio／Technilogy、第7巻、1989年10月、1043〜1046頁に、 E.coli中での破傷風毒素フラグメントの発現、ならびにその精製およびワクチン としての潜在的な用途が記載されている。それにもかかわらず、その記載されて いる技術は、宿主細胞から精製されたワクチン成分を回収するために数多くの工 程を必要とする。 本発明の一つの目的は、Ｆ型ボツリヌス毒素に対するワクチンを製造すること である。別の目的は、ワクチンの製造を簡単にすることである。さらなる目的は 、ボツリヌス毒素ワクチンの産物を改良することである。本発明のなおさらなる 目的は、存在するワクチンおよび製造法における問題および／または制限を克服 するまたは少なくとも緩和することである。 本発明の第1の局面によれば、Ｆ型ボツリヌス毒素への保護免疫性を誘導する ボツリヌス毒素活性を含まないポリペプチドが提供される。このポリペプチドは 、Ｆ型毒素に対するワクチンの製造に有用であり、多価ワクチンのような従来技 術の組成物と対照的に、トキソイドではなく、ホルムアルデヒドでの予備処理を 必要としない。従来技術の組成物と対照的に、このポリペプチドはまた、通常は 、毒素そのものより小さいサイズである。 本発明の第1の局面の実施態様は、 （a）ボツリヌス毒素活性を有さないこと、および （b）哺乳動物において、Ｆ型ボツリヌス毒素に対して保護的である免疫学的応 答を誘発し得ること を特徴とするポリペプチドを提供する。 「免疫性」および「免疫学的応答」と共に用いられる用語「保護的」は、活性 なボツリヌス毒素Ｆによるチャレンジから生き延びるための増加した能力を示す ために用いられる。この増加は、代表的には、毒素によるチャレンジの際の毒素 に対する抗体の増加した力価または毒素に対する抗体を産生する増大した能力に より媒介される。この用語は、任意の量の毒素に対する絶対的な保護を示すこと を意図しない。 従って、本発明は、Ｆ型ボツリヌス毒素に対する、従来利用できなかった特異 的な保護を提供する。 特定の実施態様において、本発明は、アミノ酸848〜1278（配列番号1）由来の C.botulinum株Langeland BoNT/Fのアミノ酸配列を含むが、メタロプロテアーゼ 活性および毒素内在化（それぞれアミノ酸１〜439および440〜847の間において 見い出される）に必要なL鎖およびH_Nエピトープのアミノ酸配列を欠失している ペプチドまたはペプチド結合体；ヒトまたは他の動物に投与した場合にBoNT/Fに 対して保護的である免疫応答を誘導し得るペプチドを提供する。 より特定の実施態様において、本発明のペプチドは、Clostrldium botulinum 株LangelandのBoNT/Fのアミノ酸配列の848〜1278（配列番号１）由来のアミノ酸 の配列のみから実質的に成るか、またはBoNT/Fのアミノ酸1〜847ではない別のア ミノ酸配列との融合ペプチドの形態の配列から成る。用語「別のアミノ酸配列」 は、完全なタンパク質ならびに使用者の要求に適切な比較的短いアミノ酸配列を 含むことが当業者により理解される。必要に応じて、他のアミノ酸配列は、他の 免疫性または標識化を提供する目的のために、または宿主細胞中のポリペプチド の発現を改変するために、上記の配列に融合して含まれる非C.botulinumである 抗原性タンパク質である。 本発明の別の実施態様において、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素活性を有さ ずそしてＦ型毒素に対する保護免疫性を誘導し得るＦ型ボツリヌス神経毒素のフ ラグメントまたは誘導体を含む。このフラグメントは、トキソイドを有さず、ホ ルムアルデヒドを含まず、そして700アミノ酸より少なく、好ましくは500アミノ 酸より少ない長さを有する。 本発明のさらなる特別な実施態様において、フラグメントは、 （a）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸848〜1278（配列番号1）、 （b）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸848〜991（配列番号2）、 （c）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸992〜1135（配列番号3）、および （d）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸1136〜1278（配列番号4） から選択される。 本発明はまた、繰り返し部分において共に結合しているＦ型ボツリヌス毒素の 複数のフラグメントを含む合成ポリペプチドである、毒素誘導体にも関する。こ の誘導体は、上記のフラグメントの二量体を含み得る。 本発明の第1の局面はまた、ボツリヌス毒素活性を有さず、そしてボツリヌス 毒素に対して保護免疫性を誘導し得、それらのプロセシングを容易にするために 適合される組成物である、ポリペプチド組成物を提供する。このことは、結果と して得られるワクチンにおいて望ましくない任意の成分の混合物からポリペプチ ドを分離しなくてはならないので、ワクチンの製造において有利である。このよ うな適合した組成物は、 （1）ボツリヌス毒素活性を有さずそしてボツリヌス毒素に対して保護免疫性を 誘導し得ないポリペプチド；および （2）組成物の精製のために適合されたポリペプチド を含む。 例えば、成分（2）は、水溶液からの組成物の精製を容易にするために適合され 、そして必要に応じて抗体、抗体の結合領域、イオン交換カラムに結合するよう に適合されたポリペプチド、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合す る ように適合されたポリペプチドまたは精製リガンドを含む。 この組成物は、好ましくは、例えば融合ポリペプチドの形態で、成分（1）お よび（2）を含む単一のポリペプチドを含むか、またはそれから成る。 組成物の使用において、組成物を発現する溶解された細胞由来の上清のような 混合物からの組成物の抽出は、迅速で簡単なプロセスにされる。組成物において 、成分（1）のワクチン接種特性が実質的に保持される、すなわち組成物の精製 後にさらなる改変の必要なくして、特に成分（2）を除去する必要なくして、組 成物がワクチン中で用いられることは特に有利である。組成物の成分（1）の候 補として、本発明の第１の局面により先に記載された全てのポリペプチドが適切 である。さらに、毒素活性を有さない、破傷風毒素のフラグメントが適切である 。 従って、本発明の特別な実施態様によるポリペプチドは、 （a）Ｆ型ボツリヌス神経毒素のアミノ酸848〜1278（配列番号1）と （b）精製部分 との融合タンパク質を含む。 アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように精製部分が適合さ れることが好ましい。代表的な精製部分は、50〜500のアミノ酸を含む。特定の 実施態様において、融合タンパク質は、精製部分としてマルトース結合タンパク 質を含む。この融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーカラムを 用いる精製に特に適切であり、以下に記載するように有用なワクチン接種特性を 有することがわかった。 第2の局面によれば、本発明は、本発明の第1の局面のポリペプチドおよび薬学 的に受容可能なキャリアを含む、ボツリヌス毒素に対するワクチンを提供する。 適切なキャリアは、ワクチンの調製における当業者に公知である。本明細書中 以下に記載される実施態様において、キャリアは、フロイントアジュバントを含 む。別の適切なキャリア成分は沈殿したミョウバン塩である。 本発明の第3の局面において、本発明のポリペプチドをコードする組み換えDNA が提供される。このような組み換えDNAは、従来、二本鎖配列の各末端で標的化 されているプライマーを用いて、所望の配列、例えばBoNT/F₈₄₈〜₁₂₇₈をコード するDNAのPCR増幅により提供される。必要に応じて、PCRで用いられるテンプレ ート配列は、天然のクロストリジウムの遺伝子を表わす。しかし、本発明の好ま しい実施態様において、使用される配列は、天然クロストリジウムタンパク質と 同じアミノ酸をコードするが、コドンの用法が変化している合成配列である。合 成遺伝子は少なくとも40％のGC含量、好ましくは少なくとも45％、そして最も好 ましくは少なくとも50％を有することが好ましい。 このような合成配列の場合、本発明の一つの実施態様において、その構築中に 、DNAフラグメントの先端に位置する組み込まれた適切な制限エンドヌクレアー ゼ認識部位の使用を通して、選択された発現プラスミドへの挿入が達成される。 どのような手段によっても、BoNT/Fペプチドをコードする組み換えDNAが生成 され、それが適切な発現ベクター中に連結し、所望であればこの段階で、配列を コードする所望の融合ペプチドへの遺伝子融合が生じ、そして得られるベクター が、適切な細胞株、例えば、E.coliまたはPichia pastorisのような酵母に導入 される。所望の産物を産生する細胞株は、確立された手順、例えばウエスタンブ ロッティングまたはELISAを通して選択される。 本発明の第４および第５の局面は、それぞれ、第３の局面のDNAを組み込むプ ラスミドベクター、およびそのプラスミドを含み、そしてDNAを発現する細胞株 を提供する。 本発明はまた、活性なワクチン接種剤の精製が、精製のために適合されたポリ ペプチド配列と組み合わされてその発現により容易化される、毒素ワクチンの製 造のための方法を提供する。従って、本発明の第6の局面は毒素ワクチンの製造 のための方法を提供する。このワクチンは毒素活性を有さずそして毒素に対する 保護免疫性を誘導し得るワクチン接種ポリペプチドを含み、ここでこの方法は、 融合タンパク質、上記のワクチン接種ポリペプチドを含む上記の融合タンパク質 および精製部分をコードするDNA配列を宿主細胞中で発現する工程、この融合タ ンパク質を含む宿主細胞から抽出物を得る工程、およびそこから融合タンパク質 を精製する工程を包含する。 本発明の第6の局面の好ましい実施態様において、本発明の第1の局面のポリペ プチドを含むワクチンを製造する方法であって、以下の工程： （a）融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞中で発現する工程であって、こ のタンパク質が（i）ボツリヌス毒素のフラグメントであって、このフラグメン トは毒素活性を有さずそしてボツリヌス毒素に対する保護免疫性を誘導し得るボ ツリヌス毒素のフラグメント、および（ii）アフィニティークロマトグラフィー カラムに結合するように適合された精製部分との融合である、工程、 （b）上記の宿主細胞から、融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、および （c）アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて融合タンパク質を精製 する工程 を含む方法が提供される。 本発明の実施態様の使用において、融合タンパク質が、基質を用いる溶出によ りカラムから除去される。この方法は、必要に応じて、融合タンパク質を解裂す る工程、および毒素フラグメントを保持する工程を包含する。この方法は、特異 的にＦ型毒素を用いるが、全ての他のボツリヌス毒素および破傷風毒素に対して もまた適用される。 この方法により、本発明は、他のクロストリジウムタンパク質による汚染を含 まないボツリヌス毒素Ｆ型フラグメントの調製を可能にする。これらは、Clostr idium菌の培養物由来の従来技術の製剤をしばしば汚染するものである。 得られる融合タンパク質または毒素フラグメントは、代表的には、実質的に純 粋な形態であり、そしていくつかの簡単な工程においてワクチンまたは他の薬学 的組成物中に組み込むのに適切である。 BoNT/F由来ペプチドを含む特定の融合タンパク質の作成が、BoNT/Fの最初の単 離において有用であり、それに続く切断は必要に応じてBoNT/F関連ペプチドを精 製するために用いられることに注目すべきである。翻訳の補助のためにBoNT/Fを コードするDNAの５'末端にコドンが付加される場合、これらのアミノ酸は、必要 に応じて、例えば、ペプチドの分泌またはより簡潔には翻訳を開始するためのNH₂ 末端メチオニンの付加をもたらすために用いられるような、最終的なペプチド のNH₂末端にて保持される。 本発明の第7の局面は、薬学的組成物を作製する方法であって、以下： （a）融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞中で発現する工程であって、上 記のタンパク質が（i）毒素活性を有さず、そしてボツリヌス毒素に対する保護 免疫性を誘導し得るボツリヌス毒素またはそのフラグメント、と（ii）アフィニ ティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合された精製部分との融合 である、工程、 （b）上記の宿主細胞から、融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、 （c）アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて融合タンパク質を精製 する工程、および （d）精製された融合タンパク質を薬学的組成物に組み込む工程を包含する方法 を提供する。 典型的に50〜500のアミノ酸を含む精製部分は、水溶性であり、アフィニティ ークロマトグラフィーカラムに結合する。 本発明者らは、精製部分を保持する融合タンパク質は、Ｆ型ボツリヌス毒素に 対するワクチンの製造において有利であることを発見した。ワクチン活性は融合 タンパク質中に見い出されるので、精製タンパク質はワクチン製造の前に除去さ れる必要はなく、従って製造プロセスが簡略化される。精製タンパク質が、アフ ィニティークロマトグラフィーカラムを用いて結合しかつ精製し得る球状の水溶 性タンパク質であることが好ましい。精製タンパク質が高度に免疫原性であるこ とがさらに好ましい。従って、特に好ましい融合タンパク質は、毒素活性を有さ ないボツリヌス毒素のフラグメント、免疫原性領域、およびアフィニティークロ マトグラフィーカラムに結合するように適合された精製領域を含む。 用語、免疫原性領域は、ヒトまたは他の動物の免疫系の刺激を誘導することが 既知であるタンパク質中のアミノ酸の配列を記載するために上記で用いられる。 このような免疫原性領域の例は、キーホールリムペットヘモシアニンを含む。 本発明のさらなる局面は、融合タンパク質を含む薬剤、本発明のワクチンおよ び組成物を用いる哺乳動物のワクチン接種の方法、および本発明のポリペプチド 、ワクチンおよび組成物に対して惹起される抗血清を提供する。 ここで以下に本発明の特定の実施態様を記載し、これは以下の図面により図示 される。 図１：BoNT毒素の３つの主要なドメインを示す。数字は、C. botulinum Lange la面株のBoNT/F中のこれらの３つのドメインに隣接するアミノ酸の位置を示す； 図２：合成遺伝子ブロックがPCRによりアセンブリされる方法の概略図を表す ； 図３：作成された組換えプラスミド（pFHC206）の例を示し、ここで図５中の 合成DNAフラグメントは発現プラスミドpMal-C2中に挿入されている； 図４：MBP-B0NT/F_848-1278組換えタンパク質で免疫したマウスで得たBoNT/Fに 対する抗体力価を示す。 配列番号５は、H_cフラグメントをコードするClostridium botulinum Ｆ型Lang eland株由来のBoNT/F遺伝子領域のヌクレオチド配列を示す。 配列番号６は、BoNT/F H_cフラグメントをコードする合成DNA配列を示し、これ は、E．coliの高度に発現する遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンを用いる。B oNT/F Ser₈₄₈に対応するコドンは、ヌクレオチド12位から始まる。これは、NH₂ 末端メチオニンコドンを特定するコドンならびにＮdeIおよびBamHIの制限部位に よってプロセシングされる。Asn₁₂₇₈のコドンはヌクレオチド1302位で開始し、 そして翻訳終結コドン（nt 1305〜1308）およびXbaIの制限部位が続く。実施例 高度に発現されたE．coli遺伝子により利用されるコドンを用いるBoNT/FのH_cを コードする合成DNAフラグメントの作製 BoNT/F_848-1278をコードする合成配列は、DNASTAR Inc（Madion，USA）のREVT RANSプログラムを用いるBoNT/Fアミノ酸配列の逆翻訳により設計された。使用し たコドンコードは、「強度発現Ｅ．coli逆翻訳コード」(SECOLI.RTC)であった。 次いで、構築を容易にするため、多くの変更を行って、BamHIおよびNdeIの唯一 の隣接近位部位、XbaIの遠位隣接部位、および有paI MluI，およびSplIの内部部 位を含むフラグメントの長さに沿って戦略ポイントにおいて制限酵素認識部位を 導入した。次いで、本質的にその他の文献（Sandhuら（1992）Biotechniques 12 :14-16）に記載されている様な手順により、100merのオリゴヌクレオチドをオー バーラップさせることによりこの遺伝子を構築した。 簡潔に言うと、この遺伝子は４つの異なるブロック（Ａ，Ｂ、Ｃ、およびＤ） として構築され、それぞれのサイズは約350bpである。各ブロックは、４つの100 merの改変オリゴヌクレオチドからアセンブリされており、これらは互いに20の ヌクレオチドでオーバーラップしている。これら４つのオリゴヌクレオチドをPC Rにおいて用いて、複合c.350 bpの２本鎖DNAフラグメントを作製した。このフラ グメントを続いて20merの隣接プライマーを用いて増幅した。次いで、各ブロッ クの増幅フラグメントをプラスミドpCRII（Invitrogen Corp.）中に直接クロー ン化した。４ブロック全ての隣接プライマーは、それらを続いて隣接フラグメン ト中へのアセンブリができるような制限酵素部位を含むように設計した。従って 、ブロックＡはBamHI（5'）とHpaI（3'）で、ブロックＢはHpaI（5'）とMluI（3 '）で、ブロックＣはMluI（5'）とSplI（3'）で、ブロックＤはSplL（5'）とXba I（3'）で隣接した。従って、各ブロックは適切な酵素での切断によりそれらの それぞれのpCRII由来組換えプラスミドから放出され、そして単離したフラグメ ントを、BamHIおよびXbaIを用いて切断したpMTL23（Chambersら（1988年）、Gen e 68:139-149）プラスミドDNAに連結した。次いで、４つのブロック全てが予測 される順序で挿入されているクローンを選択した。これは、ルーチンの方法（Ma nlatisら（1989年）、Molecular Cloning a Laboratory Manual、Cold Spring H arbor Laboratory Press）を用いるヌクレオチド配列決定により確認し、そして 設計したpFHC23と称するプラスミドを得た。C ．botulinum Langeland株のBoNT/FのH_cプチド（848〜1278）の作製 C．botulinumのBoNT/Fに対するワクチン候補物は、H_cフラブメント、アミノ酸 848-1278をコードする合成遺伝子のフラグメントを発現することにより産生した 。このDNAフラグメントを、約1.3 kb BamHI-XhoI制限フラグメントとしてプラス ミドpFHC23から単離し、そしてPUC9（VieiraおよびMessing（1982）、Gene 19:2 59-268）の唯一のBamHIとSalIとの間に挿入し、プラスミドpFHC29を作製した。 次いでこのインサートをEcoRI-XbaIフラグメントとしてpFHC29から再単離し、そ して市販の発現ベクターpMal-c2（New England Biolabs）の同等の部位の間に挿 入し、最終プラスミドpFHC206を得た。得られたプラスミドは、マルトース結合 タンパク質（MBP）をコードするベクターを有する融合タンパク質としてBoNT/F_{8 48-1278} を発現した。 融合タンパク質産物（MBP-BoNT/F_848-1278）は、pFHC206を含む細胞株から以 下の様式により調製した。pFHC206を含むE．colli１リットルの培地（0.8Mソル ビトール、0.6％カザミノ酸、50μg/mLアンピシリンを補充したM9）中で、37℃ で振騰しながら（200rpm）、OD₆₀₀が1.0に達するまで培養した。この時点で、IP TGを最終濃度1mMで添加し、そして27℃でさらに４時間振騰を続けた。遠心分離 （5000×g）により細胞を採取し、溶解緩衝液（Protein Fusion and Purificati on System，New England Biolabs）20mL中で再懸濁し、そして超音波により細胞 を破砕した。180mLのSephacel S100含有GPCカラムに溶解物をアプライし、排出 画分中のタンパク質を回収した。次いで、この画分中のMBP-BoNT/F H_848-1278融 合タンパク質を穏やかに振騰しながら（10rpm）３時間にわたってAmylose樹脂（ New England Laboratories）４〜６mL容量で室温で吸着させた。次いで、組換え 融合タンパク質を、5mMマルトース含有緩衝液（0.01M Tris HCl、 pH7.0）中に 溶出した。溶出したタンパク質をAmicon PM30メンブレンフィルターを用いて濃 縮した。ワクチン候補物の毒性 ワクチン融合ペプチド候補物の毒性を、４匹のマウスの群への総組換えMBP-Bo NT/F_848-1278タンパク質の25μg量の腹腔内接種により測定した。このワクチン 候補物は耐性に優れ、マウスは接種後２週間まで急性または慢性の毒性の兆候を 示さなかった。ワクチン候補物に対する抗体応答 ワクチン候補物を、４匹のマウスの群に完全なフロイントアジュバント中で腹 腔内接種により投与し、そしてその後さらに３回２週間間隔で追加（booster） 接種を行った。精製したC．botulinum Langeland株のBoNT/Fに対する抗体応答を 、ELISAによりモニターした（図４）。毒素チャレンジに対する防御 MBP-BoNT/F_848-1278融合タンパク質で免疫した動物を、種々の用量の精製した C.botulinum Langeland株のBoNT/Fで腹腔内チャレンジに供した。12 LD₅₀以上の 用量で、コントロールの非免疫マウスは全て24時間以内に死亡した。免疫群のマ ウスは全て、2.4×10⁴ LD₅₀までのチャレンジでは生存していた。初回の1.8 LD_{5 0} のチャレンジで生存していた免疫したマウスの内の１匹は、その後のさらなる1 0⁶LD₅₀のチャレンジに対して免疫性を示した。 表１：C．botulinum Langeland株のBoNT/Fでのチャレンジに対する防御は、MBP- BoNT/F_848-1278融合タンパク質ワクチンにより提供された。４匹のマウスの群に 14日間隔で、アジュバントと混合した合計４×25μgの腹腔内用量の抗原を与え た。50日後、マウスを種々のレベルの精製したBoNT/F（C．botulinum Langeland 株から単離した）の腹腔内チャレンジに供し、そして４日後までの死亡を記録し た。 ^a＝この群から生存している個体に打ち一体は10⁶LD₅₀に等価のBONT/Fチャレンジ に対して防御を連続的に示した。 本発明は、C．botulinum Langeland株から単離したBoNT/Fのフラグメント（アミ ノ酸848-1278など）のワクチンとしての使用を提供する。このフラグメントは、 その免疫原性特性を保持するが、MBPとなお融合しており、さらなる精製工程は 不要である。この組換え融合タンパク質は、25μgまでの用量でマウスに毒性が ないことが明らかである。反復用量により、BoNT/Fチャレンジに対して動物を防 御する有意な抗体応答が産生された。ワクチンとして、これは、ホルムアルデヒ ド処理によりトキソイド化される神経毒素を上回るいくつかの利点を提供する。 最も注目されるのは、それがより簡単に、および活性な毒素非存在のためにより 低レベルの汚染物質で調製され得ることである。他の汚染C．botulinumタンパク 質の非存在、および部分的にトキソイド化された物質はまた、これをワクチン適 用のために本質的に、より安全にし、そして反応原性（reactogenic）をより小 さくする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マウチライン，マーガレット ランブル イギリス国 エスピー７ ９ビーキュー ドーセット，シャフテスバリー，セムリ ー，ベイカーズ ヒル，スリー ドーマー ズ（番地なし) (72)発明者 ミントン，ニゲル ピーター イギリス国 エスピー１ ３ビーゼット ウィルトシャー，サリスバリー，モバーリ ー ロード 27 (72)発明者 パセチニック，ブラディミール アーティ モビッチ イギリス国 エスピー４ ４エイチユー ウィルトシャー，シリュートン，カッパー ビーチ クローズ １ (72)発明者 ティトボール，リチャード ウィリアム イギリス国 エスピー４ オージェイキュ ー，ウィルトシャー，サリスバリー，ポー トン ダウン（番地なし），ケミカル ア ンド バイオロジカル セクター

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ボツリヌス毒素活性を有さず、そしてトキソイドを有さないポリペプチドで あって、Ｆ型ボツリヌス毒素への保護免疫性を誘導する、ポリペプチド。 ２．ポリペプチドであって： （a）ボツリヌス毒素活性を有さないこと、 （b）トキソイドを有さないこと、および （c）哺乳動物において、Ｆ型ボツリヌス毒素に対して保護的である免疫学的応 答を誘発し得ること を特徴とする、ポリペプチド。 ３．Ｆ型ボツリヌス神経毒素の重鎖のフラグメントまたは誘導体を含む、請求項 １または２に記載のポリペプチド。 ４．前記フラグメントまたは前記誘導体が600までのアミノ酸長である、請求項 ３に記載のポリペプチド。 ５．前記フラグメントが： （a）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸848〜1278、 （b）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸848〜991、 （c）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸992〜1135、および （d）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸1136〜1278 から選択される、請求項３または４に記載のポリペプチド。 ６．前記誘導体が、請求項５に記載の（a）〜（d）の任意のフラグメントの二量 体を含む、請求項３または４に記載のポリペプチド。 ７．ワクチンの製造に用いるポリペプチド組成物であって： （1）毒素活性を有さず、そして哺乳動物においてボツリヌス毒素に対して保護 免疫性を誘導し得るポリペプチド；および （2）該組成物の精製を容易にするかまたは向上させるために適合されたポリペ プチド を含む、ポリペプチド組成物。 ８．前記組成物が（1）と（2）との融合タンパク質を含む、請求項７に記載のポ リペプチド組成物。 ９．請求項７または８に記載のポリペプチド組成物であって： （1）請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド；および （2）クロマトグラフィーカラムに結合するように適合されたポリペプチドを含 む、ポリペプチド組成物。 １０．アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合されたポ リペプチドを含む、請求項７〜９のいずれかに記載のポリペプチド組成物。 １１．請求項８に記載のポリペプチド組成物であって： （a）Ｆ型ボツリヌス神経毒素のアミノ酸848〜1278と （b）精製部分 との融合タンパク質を含む、ポリペプチド組成物。 １２．薬学的に受容可能なキャリア、および請求項１〜６のいずれかに記載のポ リペプチドまたは請求項７〜１１のいずれかに記載のポリペプチド組成物を含む 、ワクチン。 １３．請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項７〜１１のい ずれかに記載のポリペプチド組成物をコードする、組み換えDNA。 １４．請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項７〜１１のい ずれかに記載のポリペプチド組成物を製造する方法であって： （a）融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞中で発現させる工程であって、 該タンパク質が（i）Ｆ型ボツリヌス毒素のフラグメントまたは誘導体と（ii） クロマトグラフィーカラムに結合するように適合された部分との融合物である、 工程、 （b）該宿主細胞から、該融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、および （c）クロマトグラフィーカラムを用いて該融合タンパク質を精製する工程を包 含する、方法。 １５．前記クロマトグラフィーカラムがアフィニティークロマトグラフィーカラ ムであり、そして前記融合タンパク質が基質での溶離により該カラムから除去さ れる、請求項１４に記載の方法。 １６．前記融合タンパク質を解離する工程、および前記毒素フラグメントまたは 誘導体を保持する工程をさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。 １７．薬学的組成物の製造方法であって： （a）融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞中で発現する工程であって、該 タンパク質は（i）毒素活性を有さず、かつボツリヌス毒素に対する保護免疫性 を誘導し得るポリペプチドと（ii）クロマトグラフィーカラムに結合するように 適合された精製部分との融合物である、工程、 （b）該宿主細胞から該融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、 （c）クロマトグラフィーカラムを用いて該融合タンパク質を精製する工程、お よび （d）該精製された融合タンパク質を薬学的組成物に組み込む工程 を包含する、方法。 １８．前記精製部分がアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合する、請 求項１７に記載の方法。 １９．薬学的組成物であって： （a）融合タンパク質であって、該タンパク質が（i）毒素活性を有さず、かつボ ツリヌス毒素に対する保護免疫性を誘導し得るポリペプチドと（ii）クロマトグ ラフィーカラムに結合するように適合されたポリペプチドとの融合物である融合 タンパク質であり、および （b）薬学的に受容可能なキャリア を含む、薬学的組成物。 ２０．前記融合タンパク質が請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドを含 む、請求項１９に記載の薬学的組成物。 ２１．前記融合タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合 するように適合されたポリペプチドを含む、請求項１９または２０に記載の薬学 的組成物。 ２２．請求項１２に記載のワクチンを哺乳動物に投与する工程を包含する、ボツ リヌス毒素に対して該哺乳動物をワクチン接種する方法。 ２３．請求項１９〜２１のいずれかに記載の薬学的組成物を哺乳動物に投与する 工程を包含する、ボツリヌス毒素に対して該哺乳動物をワクチン接種する方法。