KR20000068496A - Ｂ군 스트렙토코커스 베타 항원의 비-ＩｇＡ Ｆｃ 결합형 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아미노산 서열 A-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12-B를 포함하는 돌연변이 Cβ단백질에 관한 것으로, 상기 서열에서 A는 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 표시된 아미노산 서열 1-164를 포함하고, B가 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열 177에서 시작하여 잔기 1094 내지 1127의 아미노산에서 종결되는 서열을 나타내며, X1-X12가 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, 결합 및 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 서열의 해당 위치에서 발견되는 야생형 아미노산으로 구성된 군에서 각각 선택되며, 상기 아미노산 위치는 하나 이상의 X1내지 X12가 야생형 아미노산 이외의 것임을 조건으로 상기 단백질을 암호하는 천연 아미노산 서열의 제1 아미노산에서부터 번호매김하며, LPXTG 모티프가 돌연변이 Cβ단백질로부터 삭제되어 있을 수 있다. 또한 본 발명은 돌연변이 Cβ단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드 분자 뿐 아니라 이 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터, 이로 형질전환시킨 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 협막 다당류에 공유적으로 접합된 돌연변이 Cβ 단백질을 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 돌연변이 Cβ 단백질과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 동물에게 본 발명의 백신의 치료학적 유효량을 투여하여 동물에게 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
Description
스트렙토코커스는 그 세포벽 다당류의 구조 및 항원성에 근거하여 몇 개의 군으로 분류된 광범위하고 다양한 세트의 그람-양성 박테리아이다(Lancefield, R.C., J. Exp. Med. 57:571-595 (1933); Lancefield, R.C., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 38:473-478 (1938)). 이들 군중 두 개가 심각한 인간의 감염과 관련이 있었다. A군 스트렙토코커스로 분류되는 것들은 사람들에게 가장 친숙하고, "급성 인후염증(strep throat)"을 일으키는 박테리아이다. A군 스트렙토코커스 미생물은 또한 류머티스열, 스트렙토코커스 농가진 및 패혈증의 보다 심각한 감염과 관련이 있다.
B군 스트렙토코커스는 1970년대 초까지 표준 의학 교과서에서 인간의 병원체로서 알려져 있지 않았다. 그 이후로, 연구가 진행되어 B군 스트렙토코커스가 미국에서 뿐만 아니라 개발 도상국에서 중요한 분만기 병원체라는 것이 알려졌다 (Smith, A.L. and J. Haas, Infections of the Central Nervous System, Raven Press, Ltd., 뉴욕 (1991) p.313-333). 출생후 처음 두 달 동안의 전신의 B군 스트렙토코커스 감염은 대략 1000명의 신생아당 3명에게 발병하여(Dillon, H.C., Jr. 등, J. Pediat. 110:31-36 (1987)), 미국에서 연간 11,000명의 환자를 발생시킨다. 이들 감염은 선천성 폐렴, 패혈증 및 수막염의 증상을 일으킨다. 상기 유아의 상당수가 사망하거나 또는 영구적인 신경학적 후유증을 가진다. 또한, 이들 B군 스트렙토코커스 감염은 연간 거의 50,000명의 여성에게서 발생하는 임신 관련 고이환율에 관계될 수 있다. B군 스트렙토코커스 감염의 위험이 있는 다른 사람들로는 선천적으로, 화학요법적으로 또는 기타 수단으로 변형시킨 면역 반응을 가진 사람들이 있다.
B군 스트렙토코커스는 박테리아의 협막 다당류에 근거하여 몇 가지 상이한 유형으로 세분할 수 있다. 이들 상이한 유형중 면역학적으로 가장 중요한 것은 Ia, Ib, II 또는 III 형 협막 다당류를 가진 스트렙토코커스이다. 이들 4개 유형의 B군 스트렙토코커스가 모든 보고된 환자의 90% 이상을 차지한다. 이들 다양한 다당류 유형은 각각 그 구조가 규명되고 특성 분석되었다(Jennings, H.J. 등, Biochemistry 22:1258-1263 (1983); Jennings, H.J. 등, Can. J. Biochem. 58:112-120 (1980); Jennings, H.J. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 77:2931-2935 (1980); Jennings, H.J. 등, J. Biol. Chem. 258:1793-1798 (1983); Wessels, M.R. 등, J. Biol. Chem. 262:8262-8267 (1987)). 다수의 기타 인간의 박테리아 병원체에서 발견되는 바와 같이, B군 스트렙토코커스의 협막 다당류는 백신으로 사용할 때 이들 박테리아에 의한 감염에 대해 매우 효과적이고 효능이 있는 보호 작용을 제공하는 것으로 확인되었다. 이것은 먼저 랜스필드(Lancefield, R.C. 등, J. Exp. Med. 142:165-179 (1975))에 의해 최초로 언급되었고, 보다 최근에는 캐스퍼 등의 다수의 연구진(Baker, C.J. 등, N. Engl. J. Med. 319:1180-1185 (1988); Baltimore, R.S. 등, J. Infect. Dis. 140:81-86 (1979); Kasper, D.L. 등, J.Exp. Med. 149:327-339 (1979); Madoff, L.C. 등, J. Clin. Invest. 94:286-292 (1994); Marques, M.B. 등, Infect. Immun. 62:1593-1599 (1994); Wessels, M.R. 등, J. Clin. Invest. 86:1428-1433 (1990); Wessels, M.R. 등, Infect. Immun. 61:4760-4766 (1993); Wyle, S.A. 등, J. Infect. Dis. 126:514-522 (1972))에 의해 언급되었다. 그러나, 다수의 기타 협막 다당류 백신(Anderson, P. 등, J. Clin. Invest. 51:39-44 (1972); Gold, R. 등, J. Clin. Invest. 56:1536-1547 (1975); Gold, R. 등, J. Infect. Dis. 136S:S31-S35 (1977); Gold, R.M. 등, J. Infect. Dis. 138:731-735 (1978); Makela, P.R.H. 등, J. Infect. Dis. 136:S43-50 (1977); Peltola, A. 등, Pediatrics 60:730-737 (1977); Peltola, H. 등, N. Engl. J. Med. 297:686-691 (1977))과 매우 유사하게, 순수한 Ia, Ib, II 및 III형 협막 탄수화물로부터 제형화된 백신은 비교적 약한 면역원이며 생후 18개월의 아동에서는 거의 효과가 없다(Baker, C.J. and D.L. Kasper. Rev. Inf. Dis. 7:458-467 (1985); Baker, C.J. 등, N. Engl. J. Med. 319:1180-1185 (1988); Baker, C.J. 등, New Engl. J. Med. 322:1857-1860 (1990)). 이들 순수한 다당류는 T 임파구가 결핍된 동물에서 유사한 면역학적 반응을 유도하기 때문에 T 세포와 무관한 항원으로 분류된다(Howard, J. G. 등, Cell. Immunol. 2:614-626 (1971)). 상기 다당류는 T 세포와 상호작용하지 않기 때문에 2차 추가항원 자극 반응을 일으키지 않으며, 그러므로, 다양한 시토킨의 분비를 통해 후속적인 "헬퍼 반응"을 자극하지 못한다. 이러한 이유로, 백신으로서 다당류의 연속 투여는 각각 일정량의 항체의 방출을 초래하며, 반면에 T 세포 의존성 항원은 투여될 때마다 증가하는 항체 농도를 유도할 것이다.
괴벨 및 애버리는 1931년에 순수한 다당류를 단백질에 공유 결합시킴으로써, 다당류만을 사용하여 달성될 수 없는 다당류에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있음을 발견하였다(Avery, O.T. and W.F. Goebel, J. Exp. Med. 54:437-447 (1931); Goebel, W.F. and O.T. Avery, J. Exp. Med. 54:431-436 (1931)). 이러한 관찰은 현재의 접합 백신 기술의 기초를 개시하고 형성하였다. 다수의 연구가 뒤따랐으며, 다당류를 백신으로서 투여하기 이전에 단백질에 결합시키면 다당류에 대한 면역 반응은 T와 무관한 반응으로부터 T 의존성 반응으로 변화한다는 것이 알려졌다(문헌[Dick, W.E., Jr. and M. Beurret, Glycoconjugates of bacterial carbohydrate antigens In: Contributions to Microbiology and Immunology. Cruse 등 편집 (1989) p.48-114; Jennings, H.J. and R.K. Sood, Neoglycoconjugates: Preparation and Applications. Y.C. Lee and R.T. Lee 편집, Academic Press, 뉴욕 (1994) p.325-371; Robins, J.B. and R. Schneerson, J. Infect. Dis. 161:821-832 (1990)] 참조). 현재에는, 상기 다당류-단백질 접합 백신의 대부분은 파상풍 톡소이드 및 디프테리아 톡소이드 또는 그 돌연변이체와 같이 널리 공지된 단백질과 함께 제형화되고 있다. 이들 단백질은 인간에의 사용이 이미 허가되고 잘 특성 분석되어 있기 때문에 처음부터 사용되었다. 그러나, 점점 더 많은 다당류를 상기 단백질에 결합시키고 백신으로서 사용함에 따라, 동일한 단백질을 사용하는 다양한 백신 사이의 충돌이 분명해졌다. 예를 들면, 여러 가지 상이한 다당류를 파상풍 톡소이드에 결합시키고 순차적으로 제공한다면, 최초 투여된 다당류 접합체에 대한 면역 반응은 마지막 투여된 다당류보다 훨씬 더 강할 것이다. 그러나, 각 다당류를 상이한 단백질에 결합시키고, 순차적으로 투여한다면, 각 다당류에 대한 면역 반응은 동일할 것이다. 담체 억제란 이렇게 관찰된 현상을 설명하기 위한 용어이다. 이러한 문제를 극복하기 위한 한 가지 방법은 단백질과 다당류가 동일한 유기체에서 유래하도록 단백질과 다당류를 일치시키는 것이다.
B군 스트렙토코커스를 분류하고 세부군을 나누는데 사용된 다양한 항원들 중에서는, Ibc 항원으로 알려진 단백질이 그 한 가지이다. 이 단백질 항원은 1971년에 윌킨슨 및 이건의 문헌(Wilkinson, H.W. and R.G. Eagon, Infect. Immun. 4:596-604(1971))에 최초로 기재되었으며, 알파 및 베타로 명명된 두 개의 상이한 단백질로 이루어진 것으로 알려졌다. 그 후, Ibc 항원은 랜스필드 등의 문헌(Lancefield, R.C. 등, J. Exp. Med. 142:165-179 (1975))에 마우스의 감염 모델에서 백신 항원으로서 사용할 때 효과적인 것으로 나타나 있다. B군 스트렙토코커스의 베타 항원(Cβ) 단백질의 분리, 정제 및 기능적 특성 분석은 러셀-존스 등(Rusell-Jones, G.J. and E.C. Gotschlich, J. Exp. Med. 160:1476-1484 (1984); Russell-Jones, G.J. 등, J. Exp. Med. 160:1467-1475 (1984))에 의해 수행되었다[미국 특허 제4,757,134호 참조]. 이들 문헌은 Cβ단백질의 성질중의 하나가 인간의 IgA 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 것임을 입증할 수 있다. IgA 분자상에의 결합 부위는 상기 면역글로불린의 중쇄 Fc 부분에 집중되었다. 그들 문헌은 또한 Cβ단백질이 산정 분자량이 130,000 달톤인 단일 폴리펩티드로 구성되었음을 나타내고 있다. 티미스 연구팀이 Cβ 단백질의 발현을 담당하는 유전자를 클론하고(Cleat P.H. 및 K.N. Timmis, Infect. Immun. 55:1151-1155 (1987)) 서열결정하였다(Jerlstrom P.G. 등, Molec. Microbiol. 5:843-849 (1991)). 티미스의 연구로 IgA 결합 활성이 리더 부위인 BglII 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위와 말단 부위인 HpaI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위로 한정되는 746 bp DNA 유전자 단편에 해당한다는 것을 입증하였다.
전술한 바와 같이, 1975년의 랑스필드 연구는 Ibc 항원이 B군 스트렙토코커스 감염의 마우스 모델에서 효과적인 백신 항원이었음을 보여주었다(Lancefield R.C. 등, J.Exp.Med. 142:165-179 (1975)). 이 당시에는 Ibc 항원의 알파 단백질 또는 베타 단백질 성분이 이 보호를 담당하는 지 여부가 명백하지 않았다. Madoff 등은 이 문제를 분명하게 하고 백신으로 사용된 정제된 Cβ 단백질이 이 단백질을 발현하는 B군 스트렙토코커스로 실험 감염시킨 어린 마우스를 보호할 수 있다는 것을 입증하였다(Madoff L.C. 등, Infect. Immun. 60:4989-4994 (1992)). Madoff 등은 연구를 진행하여 Cβ 단백질에 III형 스트렙토코커스 협막 다당류를 커플링시켜 접합 백신을 형성하면, 이 백신은 III형 B군 스트렙토코커스(Cβ를 발현하지 않음) 또는 Ib형 B군 스트렙토코커스(Cβ를 발현하나 III형 협막 다당류가 결핍되어 있음)의 감염에 대해 어린 마우스를 보호한다는 것을 보여주었다(Madoff L.C. 등, J. Clin. Invest. 94:286-292(1994)). 따라서, Cβ단백질 접합체 백신은 몇가지 작용을 한다: 다당류는 다당류 협막에 대한 보호성 항체를 유도하고 Cβ 단백질은 단백질에 대한 보호성 항체를 유발할 뿐 아니라 다당류에 대한 면역 반응을 T와 무관한 응답으로부터 T 의존성 응답으로 변형시킨다.
다당류-Cβ 단백질 접합체 방법은 마우스에서 잘 작동한다. 그러나, B군 스트렙토코커스 감염에 대해 인간을 보호하는 것이 분명한 목표이다. 인간에게 동일한 방법을 사용하여 Cβ단백질이 인간 IgA 면역글로블린에 비특이적으로 결합하는 것을 특허 보호하려는 것이다(Cβ는 마우스 IgA에는 결합하지 않는다). Cβ의 인간 IgA 결합 활성은 인간에 대한 다당류-Cβ단백질 접합체 백신의 효능을 감소시킬 수 있으며, 이는 IgA에 결합된 항원이 계로부터 급속하게 제거되어 항원 특이적 항체 응답을 생성하지 않기 때문이다. 더구나, Cβ 단백질상에 유효한 보호성 에피토프는 인간 IgA가 Cβ 분자에 결합하는 경우 은폐된다. 따라서, IgA 결합 능력이 결핍되어 있으나 가능한 천연 구조를 많이 보유하는 변이 Cβ 단백질를 얻는 것이 유리하다.
이러한 목표를 염두에 두고, 몇몇 그룹이 Cβ단백질의 IgA 결합 영역을 결정하고자 하는 시도를 수행하였다. Jerlstrom 등(Molec. Microbiol. 5:843-849 (1991))은 Cβ 단백질의 아단편이 융합단백질로서 발현되어 IgA를 결합할 수 있는 Cβ 단백질의 2개의 영역을 동정하는 실험을 사용하였다. 이들 실험은 IgA 결합 도메인을 Cβ 단백질의 747 bp BglII-HpaI 단편과 1461 bp Hpai-HindIII 단편에 정위시켰다. 더구나, 국제 특허 출원 제 PCT/US/06111은 IgA를 결합하는 영역이 삭제된 Cβ 단백질의 분리 방법을 개시하고 있다.
본 발명은 인간의 IgA에 결합하는 능력이 감소되거나 제거되었으나, B군 스트렙토코커스에 대한 접합 백신의 제형화에 유용한 면역학적 성질을 보유하는 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
도1A-1D는 야생형 Cβ1의 DNA 서열 및 추정된 아미노산 서열을 도시한 것이다(Jerlstrom, P.G.등, Molec. Microbiol. 5: 843-849(1991)). 도 2-4에 도시된 BglII 및 PstI 부위가 동정되었다.
도2는 Cβ 단백질의 IgA 결합 부위를 암호한 Cβ 유전자 영역에 관한 지도로서 2개의 아미노산이 치환되어 돌연변이 dgb2가 생성되었음을 도시한 것이다(표1 참조).
도3은 Cβ 단백질의 IgA 결합 부위를 암호하는 Cβ 유전자 영역에 관한 지도로서 2개의 아미노산이 치환되어 돌연변이 nv34qp가 생성되었음을 도시한 것이다(표1 참조).
도4는 Cβ 단백질의 IgA 결합 부위를 암호한 Cβ 유전자 영역에 관한 지도로서 6개의 아미노산이 상기 단백질중에서 상기 영역으로 부터 삭제되어 돌연변이 dgb1가 생성되었음을 도시한 것이다(표1 참조).
도5는 Cβ 단백질에 의해 ELISA 반응성이 경쟁적으로 억제되었음을 도시한 그래프이다.
도6A-6G는 Cβ 돌연변이 dgb2를 암호하는 유전자의 완전한 DNA 서열(표 1 참조) 및 이 돌연변이의 추정된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 돌연변이 부분은 밑줄로 표시했다.
도7A-7F는 Cβ 돌연변이 nv34qp를 암호하는 유전자의 완전한 DNA 서열 및 이 돌연변이의 추정된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 돌연변이 부분은 밑줄로 표시했다.
도8A-8G는 Cβ 돌연변이 dgb1를 암호하는 유전자의 완전한 DNA 서열(표 1 참조) 및 이 돌연변이의 추정된 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도9A-9G는 Cβ 돌연변이 pnv231을 암호하는 유전자의 완전한 DNA 서열(표 1 참조) 및 이 돌연변이의 추정된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 돌연변이 부분은 밑줄로 표시했다.
바람직한 구체화에 대한 상세한 설명
본 발명은 B군 스트렙토코커스(GBS) 베타 항원의 돌연변이 Cβ 단백질에 관한 것으로서, 이 단백질에 의한 IgA 결합이 제거 또는 감소되었으며 이 단백질의 항원성이 적어도 대부분 보유된 것을 특징으로 한다.
도1A-1D(서열번호 2)에 도시된 야생형 Cβ 서열의 아미노산 잔기 약 163-176사이에 위치한 Cβ 단백질의 영역을 돌연변이처리하면 IgA 결합특성이 감소되거나 제거되었지만 이 단백질의 항원성이 대부분 유지기에 충분한 삼차구조를 보유하는 Cβ 단백질이 생성됨이 밝혀진 바있다(실시예 4 및 5 참조).
Cβ 폴리펩티드의 영역이 IgA 결합에 관여하는 것으로 밝혀진 바있으며, 후술되는 실시예를 통해 상기 영역내에서 아미노산을 치환 또는 삭제하면 IgA 결합이 감소 또는 제거되면서 단백질의 항원성을 유지한다는 것이 입증된 바 있기 때문에, 당업자라면 본 발명의 목적을 달성하기 위해서 Cβ 폴리펩티드의 아미노산 서열을 어떻게 변형시킬 수 있을 지를 알 수 있다. IgA 결합을 제거하는데 적합한 아미노산 치환이란 다른 특성을 갖는 아미노산으로 하나 이상의 잔기를 대체하는 것을 의미한다. 예를 들면, 강친수성의 아미노산은 강소수성의 아미노산으로 치환될 수 있다. 같은 그룹으로 분류할 수 있는 아미노산으로는 지방족 잔기 Ala, Val, Leu 및 Ile; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr; 산 잔기 Asp 및 Glu; 아미드 잔기 Asn 및 Gln; 염기성 잔기 Lys 및 Arg; 및 방향성 잔기 Phe 및 Tyr을 포함한다. 따라서, 당업자라면 IgA 결합을 감소 또는 제거하기 위해서 Cβ 단백질에서 잔기 약 163-176사이의 영역에서 적당한 아미노산을 어떻게 치환 또는 삭제하는 지를 알 수 있다.
아미노산 변화가 단백질 기능에 상당히 부정적인 영향을 일으킬 수 있을 것에 관한 추가의 안내서가 Bowie, J.U., 등의 "단백질 서열에 있어서 메세지를 해독하는 방법: 아미노산 치환에 대한 내성"이라는 명칭으로 Science 247:1306-1310(1990)에 기재되어 있다.
그러므로, 본 발명은 아미노산 서열 A-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12-B를 포함하는 돌연변이 GBS 베타 항원인 Cβ에 관한 것이다. 상기 서열에서 A는 도1A-1D(서열번호 2)에 도시된 아미노산 서열 1-164를 포함하며, B는 도 1A-1D(서열번호 2)에 도시된 아미노산 177로부터 출발하여 1094-1127사이의 아미노산에서 종결되는 서열을을 나타내고, X1-X12는 Ala, Arg, Asp, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, 결합 및 도1A-1D(서열번호 2)에 도시된 서열의 해당 위치에서 발견되는 야생형 아미노산으로 구성된 그룹에서 각각 선택되는데, 여기서 상기 아미노산의 위치는 X1-X12중 적어도 하나가 야생형 아미노산이외의 것임을 조건으로 상기 단백질을 암호하는 천연 아미노산 서열의 첫번째 아미노산 서열로부터 번호 매긴 것이다. 특히 바람직한 돌연변이 Cβ 단백질에 있어서 아미노산 X7및 X12는 Ala(서열번호 3)이고, 다른 바람직한 돌연변이 Cβ 단백질에 있어서 아미노산 X4및 X11은 Pro(서열번호 4)이다. 또다른 바람직한 돌연변이에 있어서 아미노산 X7는 Thr 이고 아미노산 X12는 Leu(서열번호 5)이다. 더욱 바람직한 돌연변이로서 아미노산 X5, X7, X8, X10, X11, 및 X12는 결합으로 각기 대체된 것이다(서열번호 6).
Cβ 단백질은 막이 결합된 야생형 상태에 있기 때문에 Cβ 단백질의 경막 도메인의 소수성 잔기를 제거함으로써 상술한 Cβ 돌연변이의 정제를 개선시키는 것이 가능하다[경막 도메인은 도1A-1D(서열번호 2)에 도시된 서열의 잔기 1095-1127에 상응한다]. 이것은 소수성 잔기를 비소수성 잔기로 치환하거나 또는 소수성 잔기를 삭제하므로써 이루어질 수 있다[이 서열의 잔기 1108-1116은 도 1A-1D(서열번호 2)에 도시되어 있다]. 막결합 Cβ를 정제하기 위해서는 세정제를 사용할 것이 요구되지만 소수성 막 스패닝 영역이 결핍된 돌연변이 Cβ의 경우는 세정제 없이 정제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 경막의 도메인을 보충하는 9개의 소수성 잔기를 삭제하거나 또는 이를 비소수성 아미노산으로 치환한 돌연변이 Cβ에 관한 것이다.
Cβ의 IgA-결합 능력은 Cβ의 이량체화 반응을 요구할 수도 있음이 밝혀진 바있다. 따라서, Cβ의 IgA-결합 영역이 전술한 바와 같이 변이되지 않을 때조차도 이량체화 반응에 필요한 것으로 간주되는 Cβ 영역의 돌연변이는 IgA와 결합할 수없는 Cβ형을 생산할 수 있다. 도1A-1D(서열번호 2)에 도시된 서열의 잔기 729 내지 C-말단의 일부를 삭제하면 Cβ의 이량체화 반응의 필요성이 제거된다. 이러한 발견을 지지하는 실험 결과가 표 1에 나타나 있다. Cβ 단편 몇개를 두개의 다른 벡터 각각에 삽입하였다. 표 1에서 서열 앞뒤로 괄호가 표시되어 있는 경우 이는 그 단편 말단에서 Cβ 서열이 더 이상 연장되지 않는다는 의미, 즉 벡터내에 삽입된 뉴클레오티드 서열은 상기 표에 도시된 아미노산만을 암호하지 Cβ 서열은 전혀 암호하지 않는다는 의미이다. 표에서 서열 앞뒤가 생략되어 있는 표시는 단편의 말단에 존재하는 나머지 Cβ 서열이 벡터내에 포함되어 있다는 것을 의미한다. 표의 상단부에 기재된 펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 벡터 pTOPE 또는 벡터 pET17b로 삽입하였다. 이들 두개의 벡터 모두는 T7 프로모터로부터 삽입된 단편을 발현하며, 또한 삽입체에 의해 암호된 아미노산 서열에 대해10 캡시드 단백질 N 말단의 단편을 함유하는 융합 단백질을 생산한다. 하지만, pET17b가10 단백질중 8개의 아미노산만 암호하는 반면 pTOPE는10 단백질의 288 아미노산 단편을 암호한다.
표1에 제시된 바와 같이, pET17b에서 생산한 Cβ의 특정 단편은 감소된 IgA-결합을 나타낸 반면, pTOPE에 의해 생산된 동일한 단편은 IgA에 결합할 수 있다. 테스트된 단편은 이량체화 반응에 관여하는 것으로 추정되는 Cβ 영역이 삭제되어 있지만, 추정되는 IgA 결합 도메인중에 어떠한 돌연변이체도 포함하지 않는다(표1의 하단에 도시한 바와 같이 벡터 pET24b내에 삽입된 Cβ 단편은 추정되는 이량체를 함유하지만, 그럼에도 불구하고, 상술한 것처럼 IgA 결합 도메인에서 돌연변이로 인해 감소된 IgA 결합을 나타낸다). pTOPE로부터 생산시 이들 Cβ단편이 DNA와 결합하는 것은 10 단백질의 288 아미노산 단편이 Cβ 단편의 이량체화 반응을 수행하기 때문이다. 이것은10 캡시드 단백질이 일반적으로 소중합체를 형성하는 요인과; 소중합체화에 관여하는 영역이 삽입된 Cβ 단편의 이량체화 반응을 수행하여 IgA-결합을 일으키게 하는 요인에 기인한 것이다. 따라서, 본 발명은 Cβ의 이량체화 반응의 도메인에서 돌연변이를 가지며 IgA에 결합할 수 없는 돌연변이 Cβ 단백질에 관한 것이다. 물론, 야생형의 Cβ 단백질의 항원성을 될 수 있는 대로 많이 보유하는 IgA 비결합 Cβ 단백질을 생산하기 위해서 Cβ 의 이량체화 반응이 방해받아서는 안된다.
이. 콜리에서 Cβ 단백질을 생산하는 것이 문제되는 이유는 이 단백질이 이. 콜리 시그날 펩티다제에 의해 특정 영역에서 절단될 수도 있음이 밝혀진 바있기 때문이다. 이 절단으로 인해 야생형 Cβ 단백질의 수많은 항원성 에피토프가 부족하기 때문에 백신으로 사용하기에는 확실히 부적합한 절단된 단백질이 생산된다. 또한 절단 부위는 서열 분석 및 매트릭스 보조의 레이저 탈착이 개시된 시간에 따른 플라이트(MALDI-TOF) 질량 분광계에 의해 예측된 바있다(von Heijne, Nucleic Acids Res. 14: 4683-4690(1986)). 절단부위는 도1A-1D(서열번호 2)에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 538-539(알라닌후 및 글루타민전)사이에 있다. 시그날 펩티다제 인식 부위는 도1A-1D(서열번호 2)의 아미노산 서열 잔기 521-541사이에 위치한 20개의 아미노산 스트레치내에 위치한다. 그러므로, 이 영역을 삭제하면 Cβ 단백질 또는 이의 IgA 비결합 돌연변이는 이. 콜리내에서 성공적으로 생산될 수 있다. 또한, 시그날 펩티다제가 매우 엄격한 서열 특이성을 가지고 있기 때문에 이 영역내에서 심지어 단일의 보존성 아미노산 치환체를 비롯한 시그날 펩티다제 인식 서열을 변경하면 이. 콜리에 의한 Cβ의 절단이 일어나는 것을 제거할 수 있다. 이 시그날 펩티다제에 의한 절단에 필요한 인식 서열은 GluLeuIleLysSerAlaGlnGlnGlu(서열번호 11)로서 이는 제1A-1D(서열번호 2)에 도시된 서열의 아미노산 잔기 533-541에 상응한다. 삭제하든지 또는 비보전성 치환을 수행하므로써 이 서열의 세린 또는 알라닌 잔기를 변경하면 시그날 펩티다제에 의해 절단이 제거된다. 물론, Cβ의 돌연변이 유발을 최소로 유지시키면 야생형 항원의 삼차구조가 보유되어 면역 반응이 유도되는 것이 이상적이다.
그러므로, 본 발명은 GBS 베타 항원의 돌연변이 Cβ 단백질에 관한 것으로서 Cβ 단백질에 의한 IgA 결합이 상술한 임의의 돌연변이에 의해 감소되거나 또는 제거되고, 제1A-1D도(서열번호 2)에 도시한 아미노산 서열의 아미노산 잔기 521-541중의 적어도 하나가 (a) 삭제되거나 또는 (b) 변경됨으로써 Cβ가 이. 콜리 중에서 생성될 때 상기 단백질이 절단되지 않는 것을 특징으로 한다. 바람직한 구체화에 있어서, 도1A-도1D에 도시된 아미노산 잔기 533-541(서열번호 2)중 적어도 하나가 (a) 삭제되거나 또는 (b) 변경된다. 더욱 바람직한 구체화에 있어서, 도1A-도1D(서열번호 2)에 도시된 아미노산 잔기 537 및 538중 적어도 하나가 (a) 삭제되거나 또는 (b) 변경되었다. 물론, 당업자라면 통상의 실험 및 von Heijine(Nucleic Acids Res 14; 4683-4690(1986))의 문헌을 통하여 적당한 아미노산 치환체를 결정할 수 있을 것이다.
본 발명은 본 발명의 돌연변이 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터, 및 이에 의해 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 신규의 돌연변이 Cβ 폴리펩티드의 발현에 관한 것으로서 이 Cβ 단백질에 의한 IgA 결합이 숙주세포내에서 감소되거나 제거되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 폴리펩티드를 클로닝하고 발현하는데 사용될 수 있는 원핵 숙주는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 숙주세포에서 복제하는 벡터 또한 잘 알려져 있다.
바람직한 원핵 세포 숙주로는, 국한하는 것은 아니지만, 에스케리키아속, 바실러스속, 스트렙토마이세스속, 슈도모나스속, 살모넬라속, 세라티아속, 및 크산토모나스속등이 있다. 이러한 원핵 숙주의 2가지 예로는 이. 콜리 DH10B 및 DH5αF'IQ(LT1, 미국 매릴랜드 개티즈버그 소재)가 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 클로닝하고 형질발현하는데 바람직한 숙주는 이. 콜리 BL21(미국, 위스콘신주, 노바겐)이다. 이는 DE3 파지에 대해 용원성이다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 이 재조합 벡터에 의해 유전공학적으로 제작된 숙주세포, 및 재조합 기술에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 것에 관한 것이다.
숙주세포를 유전공학적으로 조작하여 핵산 분자를 혼입하면 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 공지된 감염기술, 형질도입기술, 형질 감염기술, 및 형질전환기술을 사용하여 재조합 작제물을 숙주세포내로 도입시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 다른 폴리뉴클레오티드와 함께 도입될 수 있다. 다른 폴리뉴클레오티드 또한 독립적으로 또는 함께 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 연결하여 도입시킬 수 있다.
그러므로, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 숙주세포에서 증식용 선택 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 벡터 작제물은 전술한 기술에 의해 숙주세포내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예를 들면, 인산칼슘 침전물, 또는 하전된 지방을 갖는 복합체중에서 DNA로 도입된다. 전기투과기술을 사용하면 숙주세포내로 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 벡터가 바이러스인 경우, 이는 시험관내에서 팩킹되거나 또는 팩킹 세포내로 도입된 뒤 팩킹된 바이러스를 세포내로 형질도입할 수도 있다. 본 발명에 따라 폴리뉴클레오티드를 제조하고 이를 세포내로 도입하는 데 적합하게 사용할 수 있는 다양한 범주의 기술은 널리 공지되어 있는데 이들은 당업계에 이미 통상적인 것들이다. 이러한 기술은 수많은 실험 매뉴얼의 하나로 예시되고 있는 Sambrook등에 자세히 나타나 있다.
본 발명의 범주에서, 벡터는 예를 들면 플라스미드 벡터, 1본쇄 파지 벡터 또는 2본쇄 파지 벡터, 1본쇄 RNA나 DNA 또는 2본쇄 RNA나 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 이 벡터는 바람직하게는 DNA 및 RNA를 세포내로 도입하는 기술을 사용하여 세포내로 폴리뉴클레오티드, 바림직하게는 DNA로서 도입할 수 있다. 파지 및 바이러스성 벡터의 경우에, 벡터가 존재할 수 있으며 이를 감염 및 형질도입에 잘 알려진 기술로 팩킹된 또는 협막화된 바이러스로서 세포내로 도입할 수 있다. 바이러스 벡터는 유효한 복제 또는 결함이 있는 복제를 할 수 있다. 후자의 경우 바이러스 증식은 숙주세포를 보완하는 경우에만 일어난다.
본 발명의 특정 범주로서, 바람직한 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 발현하는 데 적합한 것들이다. 일반적으로 이러한 벡터는 발현될 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 숙주내에서 발현하는 데 효과적인 시스 작용성 대조 영역을 포함한다. 적합한 트랜스 작용성 인자로는 숙주에 의해 공급되는 것이든지, 벡터에 의해 보완되는 것이든지, 또는 숙주내로 도입시에 벡터 자체에 의해 공급되는 것이 있다.
이러한 점을 고려한 특정 바람직한 구체화에 있어서, 벡터는 특이적 형질 발현을 제공한다. 이러한 특이적 발현은 세포의 특정 타입에서만 일어나는 형질발현 또는 유도성 형질 발현이거나 또는 유도성이면서 세포 특이성인 것 일 수 있다. 특히 바람직한 유도성 벡터로는 온도 및 영양 첨가제같이 조작하기 쉬운 환경적인 요인에 의해 형질 발현으로 유도가능한 벡터가 있다. 원핵 숙주 및 진핵 숙주용의 구조성 및 유도성 발현 벡터를 비롯한 본 발명의 범주에 적합한 벡터는 널리 공지되어 있으며 당업자에 의해 현재 통상적으로 사용되고 있다(US 특허 5,464,758).
유전공학적으로 제작된 숙주세포를 통상의 영양배지에서 배양하는 데, 이 배지는 상술한 바와 같이 프로모터를 활성화시키거나 형질전환체를 선택하거나 또는 유전자를 증폭시키기 위해 적절히 변형시킬 수 있다. 발현에 선택된 숙주세포와 함께 사전에 사용되었던 배양 조건인 온도, pH등은 당업자가 명백히 알 수 있는 것으로서 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 데도 적합하다.
각종 발현 벡터를 사용하면 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 이러한 벡터로는 염색체 유도 벡터, 에피좀 유도 벡터 및 바이러스 유도 벡터, 예를 들면, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피좀, 효모 염색체 엘리먼트, 바이러스(바큘로바이러스, 파보바 파이러스[SV 40J, 백시니아 바이러스, 아데노 바이러스, 가금류의 폭스 바이러스, 가성광견병 바이러스, 레트로 바이러스]에서 얻은 벡터, 이의 조합물에서 얻은 벡터(예, 코스미드와 파지미드같은 플라스미드와 박테리오파지 유전 엘리먼트의 조합물)가 있으며, 이들 모두가 본 발명의 범주에서 사용될 수 있는 것이다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를 유지 또는 증식하거나 또는 이를 숙주에서 발현하는 데 적합한 어떠한 벡터도 이와 같은 관점에서 사용될 수 있다.
본 발명에 적합한 DNA 분자는 잘 알려진 다양한 기술에 의해 벡터내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열 및 발현 벡터를 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 자른 뒤 이를 T4 DNA 리가제를 사용하여 제한 단편을 연결하므로써 발현 DNA분자를 연결한다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 제한 및 연결방법은 당업계에 잘 알려져 있고 당업자에게는 통상적인 것들이다. 이러한 점에서 당업계에 공지되고 통상적인 대안적인 기술을 사용하여 발현 벡터를 제작하는 방법은 상기 인용한 Sambrook등의 문헌에 잘 나타나 있다.
발현 벡터에 삽입된 DNA 분자는 예를 들면 프로모터를 비롯한 적합한 발현 대조 서열에 작동가능하게 결합하여 mRNA 전사를 수행한다. 이러한 프로모터의 대표예로는 파지 람다 PL 프로모터, 이. 콜리 lac, trp 및 tac 프로모터, SV 40 초기 및 말기 프로모터, 및 레트로바이어스 LTR의 프로모터를 포함하는 데 이들은 단지 예에 불과하다. 전술되지 않은 다수의 프로모터가 본 발명에 적합하게 사용될 수 있음은 잘 알려져 있고 당업자라면 또한 쉽게 본명세서에 기술된 내용 및 실시예를 기초로 이를 쉽게 사용할 수 있음을 알 것이다.
일반적으로, 발현 작제물은 전사 개시 및 종결에 적합한 부위 및 이러한 전사된 부위에서 해독을 위한 리보좀 결 합부위를 포함한다. 작제물에 의해 발현되는 성숙한 전사물의 암호 부위는 출발부위에서의 해독 개시 AUG와 해독될 폴리펩티드의 말단에 적절하게 위치한 종결 코돈을 포함한다.
또한 작제물은 발현을 일으킬 뿐아니라 이를 조절하는 대조영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 영역은 통상의 절차에 따라 리프레서 결합 부위, 인헨서같은 전사를 조절하므로써 작동된다.
증식 및 발현벡터는 선택가능한 마커를 포함한다. 이러한 마커의 예로는 증폭에 적합한 것이거나 또는 벡터는 이 목적에 적합한 부가의 마커를 함유할 수 있다. 이러한 점에서 발현 벡터는 형질전환된 숙주세포를 선택하기 위한 표현형 특징을 제공할 수 있도록 하나 이상의 선택 가능한 마커유전자를 함유하는 것이 바람직하다. 바람직한 마커로는 진핵세포의 배양물 경우 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성을 포함하며, 이. 콜리 및 다른 박테리아를 배양하기 위한 경우는 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
본명세서에 적합한 DNA 서열을 함유하는 벡터, 적합한 프로모터 및 다른 적합한 대조 서열을 함유하는 벡터는 바람직한 폴리펩티드를 발현하는 데 적합한 공지된 기술을 사용하여 적합한 숙주내로 도입할 수 있다.
적절한 숙주의 대표적인 예로는 박테리안 세포, 예컨대 이.콜리(E.coli), 스트렙토마이시스(Streptomyces) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 세포가 있다. 각종 발현 작제물에 대한 숙주는 공지되어 있으며, 당업자라면 용이하게 개시된 문헌에서 본 발명에 따라 폴리펩티드를 발현하는 숙주를 선택할 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 전술한 1종 이상의 서열을 포함하는 재조합 작제물, 예컨대 발현 작제물을 포함한다. 작제물은 본 발명의 서열이 삽입된 벡터, 예컨대 플라스미드나 바이러스 벡터를 포함한다. 이 서열은 정방향 또는 역방향으로 삽입할 수 있다. 특정 바람직한 일양태에서, 작제물은, 예컨대 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터를 비롯하여 조절 서열을 더 포함한다. 다수의 적절한 벡터와 프로모터가 당업자에게 알려져 있으며, 본 발명에 사용하기 적절한 다수의 시판용 벡터가 있다.
본 발명은 인간 IgA에 결합하는 능력이 감소되거나 제거된 단백질의 작제에 관한 것이기 때문에, 본 발명은 시험관내 돌연변이 유발 방법을 사용하여 돌연변이 Cβ단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 다수의 시험관내 돌연변이 유발법은 당업자들에게 알려져 있으며, 몇가지 방법을 예로서 하기에 기재하였다.
한 방법은 적절한 제한 효소로 플라스미드를 부분 분해 또는 완전 분해 한 후 다시 플라스미드를 생성시키기 위해서 말단을 결찰시킨 플라미스미드내로 삽입된 플라스미드 분자내에 삭제 또는 삽입을 도입하는 것이다. 먼저 제한 부위에서 플라스미드를 절단하고 선형 DNA를 조절된 뉴클레아제 분해시켜 각 말단에 작은 그룹의 염기를 제거하여 매우 짧은 결실을 만들 수 있다. 정확한 삽입체는 2본쇄 올리고뉴클레오티드 링커를 단일 절단 부위에서 절단된 플라스미드에 결찰시켜 만들 수 있다.
화학법을 사용하여 1본쇄 폴리뉴클레오티드 분자에 변이를 도입할 수 있다. 예를 들어, 시토신 잔기에서의 단일 염기쌍 변화는 바이설파이트와 같은 화학물을 이용하여 만들 수 있으며, 시토신을 우라실로 탈아민시켜 GC 염기쌍을 AT 염기쌍으로 전환시킨다.
올리고뉴클레오티드 유도된 돌연변이 유발은 DNA 분자를 따라 소정의 부위에서 모든 가능한 부류의 염기쌍 변화가 만들어 질 수 있도록 사용한다. 일반적으로, 이 기술은 해당 1본쇄 뉴클레오티드 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드(하나 이상의 부정합은 제외)를 어닐링하는 것을 포함한다. 이 부정합된 올리고뉴클레오티드를 DNA 폴리머라제로 확장하고, 하나의 가닥상에 원하는 서열 변화를 포함하는 2본쇄 DNA 분자를 생성한다. 서열 변화는 변화가 유전자의 암호 영역에서 만들어지는 경우 물론 아미노산의 삭제, 치환 또는 삽입을 일으킨다. 이어서, 2본쇄 폴리뉴클레오티드를 적절한 발현 벡터내로 삽입하여 변이 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 전술한 올리고뉴클레오티드를 유도하는 돌연변이 유발은 PCR 과정을 통해 수행할 수 있다. 이러한 계의 예로는 실시예 4에서 사용한 Ex-SiteTMPCR 부위-유도된 돌연변이 유발 기법(캘리포니아에 소재하는 스트라타젠)이 있다.
Ex-SiteTMPCR 부위-유도된 돌연변이 유발 기법을 사용하여, 몇가지 다른 올리고뉴클레오티드를 제조하여 해당 영역에서 DNA 서열의 상이한 변화를 유도할 수 있다. 특정 구체화에서, 프라이머가 도 1A 내지 1D(서열 번호 2)(도 2 및 표 1 참조)에 도시된 서열의 아미노산 170과 175에서 리신을 알라닌으로 변화시키는 데 필요한 서열을 포함하는 중복 프라이머를 얻었다. Cβ613이라고 명명한 정방향 프라이머의 서열(서열 번호 6)은 5'-GTT GAA GCA ATG GCA GAG CAA GCG GGA ATC ACA AAT GAA G-3'이고 Cβ 642R로 명명한 역방향 프라이머 서열(서열 번호 7)은 5'-GAT TCC CGC TTG CTC TGC CAT TGC TTC AAC TTG ACT TTT TTG-3'이다(치환은 굵은 글씨로 나타냄). 이들 올리고뉴클레오티드를 pNV222 주형과 조합하며, 상기 주형은 pSP76 벡터내에 삽입된 Cβ 유전자로 구성된다. PCR을 수행하고 생성물을 결찰시켜 이.콜리 균주 DH5α내로 도입하여, 돌연변이 Cβ 유전자를 포함하는 클론을 생성한다.
하기 시판용 벡터를 본 발명에 사용할 수 있다. 박테리아에 사용하기 바람직한 벡터로는 pQE70, pQE60 및 pQE-9(퀴아겐에서 입수가능); pBS 벡터, 파지스크립트 벡터, 블루스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(스트라타젠에서 입수가능); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(파마시아에서 입수 가능); pUC18, pUC19 및 pPROEX-1(LT1에서 입수가능); 및 pTOPE, pET17b 및 pET24a(위스콘신주 매디슨에 소재하는 노바겐에서 입수가능)이 있다. 이들 벡터는 단지 시판용의 일례로 목록화한 것이며 당업계에 공지된 벡터를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어 숙주내에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 도입, 유지, 증식 또는 발현에 적절한 임의의 기타 플라스미드 또는 벡터를 본 발명에 사용할 수 있다.
프로모터 영역은, 해당 프로모터 단편. 즉 프로모터를 포함할 수 있는 단편을 도입하는 제한 부위(들) 다운스트림에 있는 프로모터 영역이 결핍된 리포터 전사 유니트, 예컨대 클로로암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제("CAT") 전사 유니트를 사용하여 원하는 임의의 유전자로부터 선택할 수 있다. 알려진 바와 같이, CAT 유전자의 업스트립에 있는 제한 부위에 프로모터 함유 단편을 벡터내로 도입시키면 CAT 활성이 생성되는데, 이는 표준 CAT 분석으로 검출할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 벡터는 공지되어 있으며 용이하게 이용가능하다. 이러한 벡터중 2가지는 pKK232-8 및 pCM7이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 프로모터는 잘 알려지고 용이하게 이용되고 있는 프로모터일 뿐 아니라 리포터 유전자를 사용하여 전술한 기술로 용이하게 얻을 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 적합한 알려진 박테리아 프로모터로는 이.콜리 lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR, PL 프로모터 및 trp 프로모터가 있다.
숙주세포에서 발현에 적절한 벡터 및 프로모터의 선택법은 잘 알려져 잇으며, 발현 벡터 작제, 벡터를 숙주내로 도입 및 숙주내에서의 발현과 같은 필수적인 기술은 당업계에서는 일반적인 기술이다.
또한 본 발명은 전술한 작제물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다.
숙주 세포내의 작제물은 통상적인 방법을 사용하여 재조합 서열이 암호하는 유전자 생성물을 생산할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 펩티드 합성기로 합성할 수 있다.
하기 적절한 숙주 균주의 형질전환 및 적절한 세포 밀도로의 숙주 균주의 증식은, 선택된 프로모터가 유도성인 경우, 적절한 수단(예, 온도 이동 또는 화학적 유도제에 노출)으로 유도하고 세포를 추가의 기간동안 배양한다.
통상 세포는 원심분리에 의해 수거하고, 물리 수단이나 화학 수단으로 파괴하고, 생성 미정제 추출물은 추가로 정제한다.
단백질 발현에 사용되는 미생물 세포는 임의의 통상적인 방법, 냉동-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용과 같은 방법으로 파괴할 수 있으며, 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
또한 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 돌연변이 Cβ단백질을 포함하는 백신에 관한 것이며, Cβ단백질에 의한 IgA 결합은 본원에 개시된 바와 같이 감소 또는 제거된다. 바람직한 구체화에서, 단백질은 다당류에 접합된다.
본 발명의 접합체는 환원성 아민화에 의해 Cβ단백질의 1차 아미노기(즉, 리신 잔기)를 다당류 환원성 말단기와 반응시켜 형성될 수 있다. 다당류는 단백질의 임의의 또는 전체 1차 아미노기에 접합시킬 수 있다. 환원기는 선택적 가수분해 또는 특이적 산화 분해, 또는 이 두 방법의 조합에 의해 형성할 수 있다. 과요오드산염과 다당류의 조절된 산화 반응 후 Cβ 단백질과 환원성 아민화 반응을 수행하는 Jennings 등의 방법[미국 특허 제4,356,170]으로 Cβ단백질을 다당류에 접합시킨다.
바람직한 구체화에서, 다당류는 Ia, II, III 및 V형에서 선택된 B군 스트렙토코커스 협막 다당류중 하나이다. [참고, Baker C.J. 및 D.L. Kasper. Rev.Inf.Dis. 7:458-467(1985); Baker C.J. 등, N. Engl. J. Med. 319:1180-1185(1988); Baker C.J. 등 New Engl. J. Med. 322:1857-1860 (1990)]. 백신은 B군 협막 다당류 Ia형에 접합된 Cβ(Cβ-Ia); B군 협막 다당류 II형에 접합된 Cβ(Cβ-II); B군 협막 다당류 III형에 접합된 Cβ(Cβ-III); 및 B군 협막 다당류 V형에 접합된 Cβ(Cβ-V)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 Cβ단백질-다당류 접합체를 포함하는 조합 백신일 수 있다. 백신은 Cβ-Ia, Cβ-II, Cβ-III 및 Cβ-V를 포함하는 조합 백신이 가장 바람직하다. 조합 백신은 B군 스트렙토코커스 Ia, II, III V 및 Ib 형(Ib형 B군 스트렙토코커스도 Cβ를 발현함)에 대한 항체를 유도한다. 더구나, 조합 백신의 다당류에 대한 면역 반응은 T 의존성 응답이다.
본 발명의 백신은 1종 이상의 Cβ 단백질 백신 또는 접합체 백신을 투여 경료에 따라 유효량으로 포함한다. 피하 또는 근육내 투여 경로가 바람직하지만, 본 발명의 백신은 복강내 또는 정맥내 경로로 투여할 수 있다. 당업자라면 임의의 특정 치료 프로토콜에 대한 투여량이 과도한 실험없이 용이하게 결정될 수 있다는 것을 알 것이다. 각 접합체에 대해, 적절한 양은 체중 1 kg당 2㎍∼100㎍ 단백질로 예상된다. 바람직한 구체화에서, 백신은 약 2㎍의 Cβ단백질 또는 동량의 단백질-다당류 접합체를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체화에서, 백신은 약 5 ㎍의 Cβ 단백질 또는 동량의 단백질-다당류 접합체를 포함한다.
본 발명의 백신은 경구용의 캡슐, 액상 용액, 현탁액 또는 엘릭시르와 같은 형태 또는 용액이나 현탁액과 같은 무균성 액상 형태로 사용할 수 있다. 임의의 불활성 담체는 염수, 인산완충 염수, 또는 IgA Fc 비결합 B군 스트렙토코커스 Cβ단백질 또는 접합체 백신이 적절한 가용 특성을 가지는 임의의 담체가 사용되는 것이 바람직하다. 백신은 단일 제제의 형태 또는 다량 백신화 프로그램에 사용할 수 있는 다용량 플라스크일 수 있다. 백신의 제조 및 사용 방법에 대해 문헌[Remington의 Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,Easton, PA, Oslo(ed.)(1980); 및 New Trends and Development in Vaccines, Voller 등(ed.) University Park Press, Baltimore, MD(1978)] 참조.
본 발명의 백신은 Cβ-특이적 항체를 증진시키는 보조제를 더 포함할 수 있다. 이 보조제는 각종 오일 제제, 예컨대 프로인트 완전 보조액(CFA), 스테아릴 티로신(ST, 미국 특허 제4,258,029호 참조), MDD로 알려진 디펩티드, 사포닌(참조, 미국 특허 제5,057,540)수산화알루미늄 및 림프계 시토신을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
프로인트 보조액은 면역원성 물질과 혼합된 물 및 광유의 에멀션이다. 프로인트 보조액이 강력하지만, 일반적으로 인간에게 투여하는데 사용하지 않는다. 대신에, 보조액 명반(수산화나트륨) 또는 ST가 인간 투여용을 사용될 수 있다. Cβ 단백질 백신 또는 이의 접합체 백신을 수산화알루미늄상에 흡착하여 주입후 서서히 방출하도록 할 수 있다. 또한 백신을 Fullerton의 미국 특허 제4,235,877호에 따라 리포좀내로 협막화할 수 있다.
또 다른 바람직한 일양태에서, 본 발명은 전술한 방법으로 제조한 본 발명의 백신을 동물에게 면역 반응을 유도할 수 있는 유효량으로 투여하는 단계를 포함하여 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 예시용으로 제시된 하기의 실시예에 의해서 본 발명을 더욱 용이하게 이해할 수 있을 것이며, 이는 특정한 언급이 없는 한 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
본 발명은 돌연변이 Cβ 단백질에 관한 것으로서, 이 단백질에 의한 IgA 결합이 감소 또는 제거되는 한편 다당류-단백질 접합체 단독 또는 이의 일부를 투여했을때 이 단백질의 항원성이 실질적으로 보유되는 것을 특징으로 한다.
특히, 본 발명은 아미노산 서열 A-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12-B을 포함하는 돌연변이 Cβ 단백질에 관한 것이다. 상기 서열에서 A는 도1A-1D(서열번호 2)에 도시된 아미노산 서열 1-164를 포함하며, B는 도 1A-1D(서열번호 2)에 도시된 아미노산 177로부터 출발하여 1094-1127사이의 아미노산에서 종결하는 서열을 나타내고, X1-X12는 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, 결합 및 도1A-1D(서열번호 2)에 도시된 서열의 해당 위치에서 발견되는 야생형 아미노산으로 구성된 그룹에서 각기 선택되는데, 여기서 상기 아미노산의 위치는 X1-X12중 적어도 하나가 야생형 아미노산 이외의 것임을 조건으로 상기 단백질을 암호하는 천연 아미노산 서열의 첫번째 아미노산 서열로부터 번호를 매긴 것이다.
본 발명은 돌연변이 Cβ단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드 분자와, 이 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 벡터 및 이에 의해 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 돌연변이 Cβ 단백질과 이것에 공유적으로 결합된 협막 다당류를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
본 발명은 나아가 본 발명의 돌연변이 Cβ단백질 및 약학적 허용 담체를 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 발명은 더 나아가 본 발명의 백신 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하여 동물에게서 면역 반응을 유도해내는 방법에 관한 것이다.
실시예 1
Cβ암호 유전자의 클로닝 및 발현
Cβ 단백질상에 IgA 결합 부위를 정위하게 위해서, 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 제1 올리고뉴클레오티드인 올리고 1은 성숙 단백질의 5' 말단에 해당하며, 그 서열(서열 번호 8)은 5'-AAGGATCCAAGTGAGCTTGTAAAGGACGAT-3'이며, BamHI 부위를 포함한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 유전자의 짧은 3' 말단을 포함하며, 그 서열(서열 번호 9)은 5'-AAAACTCGAGTTTCTTTTCCGTTGTTGATGTA-3'이며 XhoI 부위를 포함한다. 유전자의 3' 말단에 대한 올리고뉴클레오티드는 대부분의 그람 양성 세포벽 단백질에서 발견되는 LPXTG 모티프를 제거하도록 선택하였다. 이 서열 모티프는 이들 세포벽 단백질의 프로세싱과 관련되어 있는 것으로 보이며 결국 펩티도글리칸에 공유적으로 결합되는 단백질의 일부분이다(Navarre W.W. 및 O.Schneewind, Molec. Microbiol. 14:115-121 (1994); Schneewind O. 등, Science 268:103-106(1995)). Cβ단백질에 대한 유전자를 포함하는 균주 A909 B군 스트렙토코커스에서 얻은 염색체 DNA를 주형으로 사용하고 표준 PCR 과정을 이용하여, 1% 아가로스 겔에서 전기영동으로 관찰시 약 3.2 kb의 생성물이 생성되었다. Cβ 단백질 유전자를 함유하는 PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 제한 효소 BamHI 및 XhoI로 절단하였다. 이 BamHI-XhoI DNA 단편은 카르복실 말단의 최종 33개의 아미노산을 제외하고, 추정 IgA 결합 부위를 비롯하여 전체 Cβ단백질에 대한 서열을 포함하였다. 이어서, DNA를 적절하게 제한 분해된 T7 발현 플라스미드 pET17b(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 노바겐)내로 표준 T4 리가아제 과정을 사용하여 결찰시켰다. 그 후, 제조업자의 프로토콜(노바겐 인코포레이티드)에 따라 플라스미드를 이.콜리 균주 BL21(DE3)내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 이.콜리 세포를 50 ㎍/㎖의 카르베니실린 함유 LB 평판에서 선별하였다. 이들 평판을 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 형질전환 콜로니를 조심스럽게 IPTG로 포화된 니트로셀룰로스 필터상에 옮겼다. 30분 후, 실온에서 15분 동안 클로로포름 증기 챔버내에 필터를 두어 박테리아를 세포용해시켰다.
필터를 챔버에서 제거한 후, 콜로니를 위로 하여 와트만 3MM 필터상에 두었으며, 상기 필터는 20 mM 트리스-HCl, pH7.9, 6M 우레아 및 0.5 M NaCl로 미리 포화시킨 것이다. 15분 후에, 필터를 PBS내에서 3회 세척하고 PBS-트윈에서 정제된 인간 IgA와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. PBS-트윈에서 필터를 재세척하고 염소 항인간 IgA-알카리 포스파타제 접합체(미국 펜실베니아 웨스트 체스터에 소재하는 캐펠 리서치 프로덕츠)를 사용하여 표준 과정을 진행하였다. 높은 IgA 결합 활성을 나타내는 몇개 콜로니를 선별하고 카르베니실린을 함유하는 1㎖의 LB 브로스에서 밤새 30℃하에 증식시켰다. 이어서, 이들 배양물을 새로운 LB-카르베니실린 브로스로 1:100으로 희석하고 6시간 더 30℃에서 항온처리하였다. 이어서, IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고 배양물은 추가의 2시간 동안 30℃에서 계속 유지한다. 세포를 원심분리로 수거하고, 물에 재현탁시킨 후 수회 냉동-해동 사이클을 수행하였다. 세포를 다시 원심분리로 수거하고 상등액은 IgA 결합 활성을 검사하기 위해 보관하였다.
실시예 2
Cβ의 IgA 결합 도메인의 동정
재조합 Cβ 단백질을 생성하는 특정 안정한 플라스미드를 얻었으며, 발현된 단백질을 인간 IgA에 결합시키는 노바토프 시스템(노바겐 인코포레이티드)의 것과 유사한 방법을 사용하여 Cβ의 IgA 결합 영역을 정위하였다. 이 과정은 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 간단히 요약하면, Cβ유전자를 함유하는 정제된 플라스미드를 DNaseI으로 무작위 분해하고 2% 저 융점 아가로스 겔에서 전기영동시켰다. 100 염기쌍 내지 300 염기쌍 크기에 해당하는 DNA 단편을 겔로부터 절취하고, 정제하고, TE 완충액에 재현탁시켰다. 단일 dA를 추천 반응 혼합물을 사용하여 단편에 첨가하고 단편을 단일 dT 말단을 포함하는 pETOPET 벡터내로 결찰시켰다. 표준 결찰 과정 후에, 플라스미드를 컴피턴트 NovaBlue(DE3) 세포(노바겐 인코포레이티드)내로 형질전환시키고 50 ㎍/㎖ 카르베니실린을 함유하는 LB 평판에서 평판배양하였다. 이들 평판을 밤새 37℃에서 항온처리하였다. 형질전환 콜로니를 실시예 1에 개시한 바와 같이 IgA 결합 활성을 시험하였다. 몇가지 콜로니를 IgA에 대한 결합력을 기초로 선별하였다. 각각의 콜로니에서 얻은 박테리아를 새로운 LB 평판에 별도로 접종하고 전과 같이 IgA 결합 능력에 대해 재시험하였다. 플라스미드 제제를 표준 방법에 의해 제조하고 서열 결정하였다.
클론된 Cβ단백질 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열을 전술한 바와 같이 변성된 2본쇄 플라스미드 DNA 주형을 사용한 디데옥시 방법으로 결정하였다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, 뉴욕, 뉴욕주 (1993)). 시퀴나제 II 키트(미국 오하이오주 클리브랜드에 소재하는 유나이티드 스테이츠 바이오케미칼 코포레이션)을 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 도 1A 내지 1D에 도시되어 있는 Cβ 유전자의 일부분을 포함하는 DNA 최소 단편을 얻었다. 이 서열의 해독은 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 성숙 Cβ단백질의 아미노산 101 내지 230에 해당한다. 더 짧은 DNA 단편에 대한 시도는 임의의 IgA 결합 활성을 얻는 데 실패하였다.
실시예 3
ELISA 억제 분석; 펩티드 결합 연구
Cβ단백질의 영역내에 포함되는 아미노산 서열에 해당하는 몇몇 합성 펩티드를 만들었다. 펩티드는 ABI 430A 펩티드 합성기(미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템즈)상에서 NMP t-부톡시카르보닐 화학물을 사용하여 합성하였고 탈보호시켰다. 수지의 시료로부터 얻은 펩티드는 아니졸의 존재하에(0℃/1h) HF로 처리하여 수지로부터 제거하였다. 이들 펩티드의 예비 정제를 C18 컬럼(2.14ID×30 cm)(미국 매사츄세츠주 워보른에 소재하는 다이나막스-레이닌)를 사용하여 수행하였다. 이 펩티드는 워터스 피코택 시스템(미국 매사츄세츠주 밀포드에 소재하는 워터스)을 사용하여 PTC 아미노산 분석으로 정량화하였다. 일반적으로 총 용출 프로필의 75%∼85%를 구성하는 주요 피크로서 C18컬럼으로부터 합성된 펩티드를 용출시켰다. 정제된 펩티드의 아미노산 조성은 펩티드를 합성하는 데 사용한 서열과 일치하였다. 하기와 같이 이들 펩티드를 ELISA 억제 분석에 사용하여 정제된 Cβ 단백질에 대한 인간 IgA의 결합을 차단하였다. 미량역가판(미국 뉴저지주 넵튠에 소재하는 눙크 이뮤노 플레이트 IIF, 뱅가드 인터내쇼날)은 0.02% 아지드를 포함하는 0.1M 탄산염 완충액, pH 9.6내에 2.0 ㎍/㎖의 농도로 정제된 Cβ1 웰당 0.1 ㎖를 첨가하여 감작시켰다. 이 평판을 실온에서 밤새 항온처리하였다. 평판을 0.9% NaCl, 0.05% Brij35, 10 mM 아세트산나트륨 pH 7.0, 0.02% 아지드로 5회 세척하였다. 정제된 인간 IgA 골수종 단백질을 카펠 래보러터리즈에서 구입하고, 0.5% Brij 35를 함유한 PBS에서 희석시키고 평판에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 평판을 다시 전과 같이 세척하고 2차 항체, 알카리 포스파타제 접합된 염소 항-인간 IgA(미국 캘리포니아 벌링게임에 소재하는 탱고 인코포레이티드)를 PBS-Brij에서 희석하고, 평판에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 평판을 전과 같이 세척하고 0.1 M 디에탄올아민, 1mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2, 0.02% 아지드, pH9.8내에 p-니트로페닐포스페이트(시그마 포스파타제 기질 104)(1㎎/㎖)를 첨가하였다. 이 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 Elida-5 미량역가판독기(미국 뉴욕주 뉴욕에 소재하는 피지카)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 웰은 1차 및/또는 2차 항체가 결핍되어 있었다. 이는 ELISA 분석법에서 최대의 1/2 판독을 제공하는 인간 IgA 골수종 단백질의 역가를 얻기 위해 행하였다. 이 역가를 억제 ELISA에 사용하였다. 미량역가판을 감작시키고 전과 같이 세척하였다. 정제된 합성 펩티드를 첨가하고 PBS-Brij에서 희석시켰다. 최대치의 1/2 판독을 제공하는 인간 IgA 골수종 단백질의 희석물을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 평판을 재세척하고 접합된 제2 항체를 전술한 바와 같이 첨가하였다. 이어서, 평판을 전술한 바와 같이 처리하고 판독하였다. 억제율(%)은 하기와 같이 계산하였다.
1-(첨가된 펩티드를 포함하는 ELISA 값)/(첨가된 펩티드를 포함하지 않는 ELISA 값)
이 ELISA 분석에서 억제되는 펩티드는 서열 Asn-His-Gln-Lys-Ser-Gln-Val-Glu-Lys-Met-Ala-Glu-Gln-Lys-Gly(서열 번호 10)을 포함한다. 이는 Cβ의 최소한 일부분의 IgA 결합 도메인이 이 서열을 포함하는 단백질의 영역내에 포함된다는 것을 제안하는 것이다.
실시예 4
Cβ를 암호하는 유전자의 올리고뉴클레오티드 유도된 돌연변이 유발
IgA 결합 활성에 대한 Cβ단백질내에 이 영역의 중요성을 확인하고 이를 위해서 백신 제제에 사용되는 돌연변이 단백질의 생성을 개시하기 위해서, 변형 Ex-SiteTMPCR 부위 유도된 돌연변이 유발 프로토콜을 스트라젠(미국 캘리포니아 스트라타젠)에 의해 개발된 대로 사용하였다. 사용된 주형은 pNV222로 명명된 플라스미드로서 pSP76 벡터(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 프로메가)내로 삽입된 Cβ유전자로 구성되어 있다. DNA 올리고뉴클레오티드를 어플라이드 바이오시스템즈 모델 292 DNA 합성기(미국 캘리포니아 포스터 시티)에서 합성하였다. 올리고뉴클레오티드를 매 15분 마다 온화하게 교반하면서 2시간 동안 수산화암모늄 1.5 ㎖로 처리하여 컬럼으로부터 수동적으로 절단하였다. 16 시간 내지 18 시간 동안 55℃에서 탈보호시켰다. 탈보호후에, 건조시키고, 이를 직접 사용하거나 또는 올리고뉴클레오티드 정제 컬럼(미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템즈)으로 정제하였다. 몇가지 상이한 올리고뉴클레오티드를 만들어 해당 영역에서 DNA 서열에 상이한 변화를 유도하였다. 하기와 같은 예가 있다. 특정 실시예에서, 프라이머는 중복 프라이머로서 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 서열중 아미노산 170 및 175에 리신을 알라닌으로 변화시킬 필요가 있는 서열을 포함한다. 정방향 프라이머는 Cβ613으로 명명되며, 서열(서열 번호 6) 5'-GTT GAA GCA ATG GCA GAG CAA GCG GGA ATC ACA AAT GAA G-3'을 가지며, 역방향 프라이머는 Cβ642R로 명명하며 서열(서열 번호 7) 5'-GAT TCC CGC TTG CTC TGC CAT TGC TTC AAC TTG ACT TTT TTG-3'을 가진다(굵은 글씨가 치환됨). 반응 조건은 하기와 같다. 10 ng pNV222 주형, 15 pmol의 각 프라이머, 1 mM의 각 dNTP, 1 X VENT 폴리머라제 완충액(20 mM 트리스-HCl, pH7.5; 10 mM KCl; 10 mM(NH4)2SO4; 2 mM MgSO40.1%(v/v) 트리톤(등록상표) X-100; 0.1 ㎎/㎖ 소혈청 알부민(BSA)), 10 유니트의 벤트 폴리머라제 및 H2O(전체가 100 ㎕가 되는 양). Hot Start 프로토콜(미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 퍼킨 엘머)에 따라서 PCR Gem 10 왁스 비드로 반응물을 제조하였다. 반응은 하기의 조건하에 퍼킨 엘머 써머사이클러(미국 캘리포니아 포스터시티에 소재하는 퍼킨 엘머)에서 수행하였다: 94℃에서 5분 동안 1 사이클; 94℃에서 30초, 37℃에서 2분, 72℃에서 10분 동안 10 사이클; 94℃에서 30초, 55℃에서 2분, 72℃에서 10분 동안 30 사이클; 및 72℃에서 12분 동안 1 사이클. 반응물을 10 유니트의 DpnI로 37℃에서 30분 동안 처리하여 주형 DNA를 파괴한 후 PfuI 폴리머라제로 72℃에서 60분 동안 처리하여 임의의 남아 있는 돌출부를 채운다. 반응물은 1X 벤트 완충액+0.38 mM dATP내에서 1:4.6으로 희석하였다. 희석 반응물을 24 시간 동안 25℃에서 결찰시키고 컴피턴트 DH5α세포(미국 매릴랜드주 게티스버그에 소재하는 기브코/BRL)내로 형질전환시켰다. 선별된 콜로니를 3㎖의 LB+카나마이신(50 ㎎/㎖)내에서 16 시간 내지 18 시간 동안 37℃하에 증식시켰다. QIAspinTM컬럼(미국 캘리포니아주 캐츠워스에 소재하는 퀴아겐)을 사용하여 DNA를 제조하였다. 0.8 % 아가로스 겔에서 삽입 크기에 대해 클론을 분석한 후 서열 결정하였다. 선별된 클론을 100 ㎖의 LB + 카나마이신(50 ㎎/㎖)에서 16 시간 내지 18 시간동안 37℃하에 증식시켰다. 퀴아겐-팁 100(미국 캘리포니아주 캐츠워스에 소재하는 퀴아겐)을 사용하여 DAN를 제조하였다. 이어서, NdeI 및 PstI로 분해하고 0.8% 아가로스 겔에서 조작하여 변이된 영역을 분리하였다. 2300 bp 단편은 젠-클린 스핀 키트TM(미국 캘리포니아주 비스타에 소재하는 바이오 101)를 사용하여 겔로부터 분리 및 정제하였다. 발현 벡터 pET24a(노바겐) 및 천연 Cβ유전자로 구성된 pNV34로 명명한 클론을 NdeI 및 PstI로 분해하고 0.8% 아가로스 겔에서 조작하였다. pET 벡터와 남은 Cβ유전자를 포함하는 거대 백드(6300 bp)를 젠-클린 스핀 키트TM(바이오 101)를 사용하여 겔로부터 분리 및 정제하였다. 이들 2개의 단편을 24시간 동안 4℃에서 결찰시키고 펌피턴트 BL21(DE3) 세포내로 형질전환시켰다. 선별된 콜로니를 3 ㎖의 LB + 카나마이신(50 ㎎/㎖)에서 16 시간 내지 18 시간 동안 37℃에서 증식시켰다. QIAspinTM컬럼(퀴아겐)을 사용하여 DNA를 제조하고 클론을 0.8% 아가로스 겔상에서 삽입 크기에 대해 분석하였다.
또한 2개의 글루타미닐 잔기를 프롤리닐 잔기로 대체한 변이 Cβ단백질을 암호하는 클론(도 3)과, Cβ유전자내에 삭제가 발생하여 해당 영역에 6개 아미노산 결실을 일으키는 변이 Cβ단백질을 암호하는 클론(도 4)을 작제하였다.
IgA 결합 활성이 결핍되어 있거나 감소되었지만 여전히 항-βag 항혈청과 반응하는 Cβ단백질을 발현하는 클론을 선별하고(실시예 5 참고), 100 ㎖의 LB + 카나마이신(50 ㎎/㎖)에서 16 시간 내지 18 시간 동안 37℃에서 증식시켰다. 이들 클론중 플라스미드 DNA를 퀴아겐 팁 100(퀴아겐)을 사용하여 제조하고 변이된 Cβ유전자를 완전히 서열결정하였다.
실시예 5
Cβ돌연변이체에 의한 IgA 결합의 웨스턴 블롯 및 ELISA 분석
변이된 유전자가 암호하는 단백질을 발현하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 Cβ단백질을 암호하는 유전자의 변이가 Cβ항원성을 보유하면서 IgA 결합을 감소시키거나 제거하는지 여부를 결정하였다. 2개의 웨스턴 블롯을 각 시료에 대해 만들어 정제된 인간 IgA 골수종 단백질 또는 과면역 토끼 항-βag 단백질 항혈청과 반응시켰다. 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 서열중 아미노산 170 및 175에서 리신이 알라닌으로 변화된 Cβ단백질을 발현하는 클론은 거의 IgA 결합 활성을 가지고 있지 않으나 항-Cβ 항혈청과 반응하는 단백질의 능력은 여전히 높은 것으로 나타난다. IgA 결합 활성은 또한 2개의 글루타미닐 잔기가 프롤리닐 잔기에 의해 대체된 Cβ 단백질을 발현하는 클론(도 3) 및 6개의 아미노산 결실을 가지는 Cβ단백질을 암호하는 클론(도 4)내에서 실질적으로 제거되었지만 항-Cβ항혈청과의 반응성은 2가지 경우에서 유지되었다. 6개의 아미노산 결실이 있는 클론에 대한 자료는 Cβ단백질의 IgA 결합 활성을 담당하는 잔기가 단백질의 이 영역내에 있으며, 이 지역내에 기타 가능한 변이가 IgA 결합 활성에 영향을 준다.
경쟁적 억제 ELISA를 사용하여 더욱 정확하게 서열 변형이 Cβ 단백질상에서 이루어진 항원의 양 및/또는 구조 변화를 결정할 수 있었다. 미량역가판(미국 뉴저지주 넵툰에 소재하는 눙크-이뮤노 플레이트 IIF, 뱅가드 인터내쇼날)은 0.02% 아지드를 포함하는 0.1M 탄산염 완충액, pH 9.6내에 2.0 ㎍/㎖의 농도로 정제된 Cβ웰당 0.1 ㎖를 첨가하여 감작시켰다. 이 평판을 실온에서 밤새 항온처리하였다. 평판을 0.9% NaCl, 0.05% Brij35, 10 mM 아세트산나트륨 pH 7.0, 0.02% 아지드로 5회 세척하였다. Cβ단백질에 대한 과면역 토끼 항혈청은 0.5% Brij 35를 함유한 PBS에서 희석시키고 평판에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 평판을 다시 전과 같이 세척하고 2차 항체, 알카리 포스파타제 접합된 염소 항-토끼 IgG(미국 캘리포니아 벌링게임에 소재하는 탱고 인코포레이티드)를 PBS-Brij에서 희석하고, 평판에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 평판을 전과 같이 세척하고 0.1 M 디에탄올아민, 1mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2, 0.02% 아지드, pH9.8내에 p-니트로페닐포스페이트(시그마 포스파타제 기질 104)(1㎎/㎖)를 첨가하였다. 이 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 Elida-5 미량역가판독기(미국 뉴욕주 뉴욕에 소재하는 피지카)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 웰은 1차 및/또는 2차 항체가 결핍되어 있었다. 이는 ELISA 분석법에서 최대의 1/2 판독을 제공하는 토끼 항-Cβ단백질의 역가를 얻기 위해 행하였다. 이 역가를 억제 ELISA에 사용하였다. 미량역가판을 감작시키고 전과 같이 세척하였다. 정제된 Cβ 단백질 또는 Cβ 단백질의 변이체를 첨가하고 PBS-Brij에서 희석시켰다. 최대치의 1/2 판독을 제공하는 토끼 항-Cβ단백질의 희석물을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 평판을 재세척하고 접합된 제2 항체를 전술한 바와 같이 첨가하였다. 이어서, 평판을 전술한 바와 같이 처리하고 판독하였다. 억제율(%)은 하기와 같이 계산하였다.
1-(첨가된 단백질을 포함하는 ELISA 값)/(첨가된 단백질을 포함하지 않는 ELISA 값)
도 4는 이들 억제 ELISA 분석 중 하나의 결과를 나타내는 것이다. 이 분석에서 스트렙토코커스에서 얻은 야생형 Cβ단백질의 억제를 재조합 Cβ단백질과 비교하였고 글루타미닐을 프롤리닐로 치환한 돌연변이체 모두 이.콜리에서 발현하였다. 도면에 도시된 바와 같이, 이 분석은 Cβ단백질의 재조합체에서 막 스패닝 영역의 부재를 검출하기에 충분히 감응성이 있다. 그러나, 야생형 서열을 포함하는 재조합 Cβ단백질은 IgA 결합 활성이 부족한 치환 돌연변이와 비교할 때 항원 차이가 최소이다. 이는 치환 변이가 Cβ 단백질의 대부분의 항원 특성을 유지하나 원하지 않는 IgA 결합 활성이 결핍되어 있다는 것을 제안하는 것이다.
바람직한 특정 양태들에 대해 전술하였지만, 본 발명을 제한하려는 것은 아님을 인지해야 한다. 당업자라면 개시된 양태들에서 각종 변형이 가능하며, 이러한 변형도 본 발명에 속하며, 본 발명의 범위는 하기 청구항에 의해 한정된다는 것을 알 것이다. 인용한 모든 특허 및 공보는 참고로 인용한 것이다.
〈서열표〉
(1) 서열 정보:
(i) 출원인: 노스 아메리칸 백신, 인코포레이티드.
미국 매릴랜드주 20705 벨츠빌 인디언 크릭 코트 12103
발명자: 타이, 조셉 와이.; 블레이크, 밀란 에스.
(ii) 발명의 명칭: B군 스트렙토코커스 베타 항원의 비-IgA Fc 결합형
(iii) 서열의 수: 30
(iv) 서신 주소:
(A) 수신인: 스턴, 케슬러, 골드스타인 앤드 팍스, 피.엘.엘.씨.
(B) 거리명: 슈트 600 노스웨스트주 뉴욕 애비뉴 1100
(C) 도시명: 워싱턴
(D) 주명: DC
(E) 국가명: 미국
(F) 우편번호: 20005
(v) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환 가능
(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리스 #1.0, 버젼 #1.30
(vi) 본 출원의 데이터:
(A) 출원번호: PCT/US97/15319
(B) 출원일: 1997.09.05
(C) 분류기호:
(vii) 선출원의 데이터:
(A) 출원번호: US 60/024,707
(B) 출원일: 1996.09.06
(viii) 대리인/대리회사 정보:
(A) 성명: 에스몬드 로버트 더블유.
(B) 등록번호: 32,893
(C) 참조/서류 번호: 1438.014PC00
(ix) 원거리 통신 정보:
(A) 전화번호: 202-371-2600
(B) 팩스번호: 202-371-2540
(2) 서열번호 1에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 4200 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: CDS
(B) 존재 위치: 320..3811
〈서열 1a〉
〈서열 1b〉
〈서열 1c〉
〈서열 1d〉
〈서열 1e〉
(2) 서열번호 2에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 1164 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 단백질
〈서열 2a〉
〈서열 2b〉
〈서열 2c〉
〈서열 2d〉
(2) 서열번호 3에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 3405 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: CDS
(B) 존재 위치: 1..3405
〈서열 3a〉
〈서열 3b〉
〈서열 3c〉
〈서열 3d〉
(2) 서열번호 4에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 1135 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 단백질
〈서열 4a〉
〈서열 4b〉
〈서열 4c〉
(2) 서열번호 5에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 3384 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: CDS
(B) 존재 위치: 1..3384
〈서열 5a〉
〈서열 5b〉
〈서열 5c〉
〈서열 5d〉
(2) 서열번호 6에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 1128 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 단백질
〈서열 6a〉
〈서열 6b〉
〈서열 6c〉
(2) 서열번호 7에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 3387 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: CDS
(B) 존재 위치: 1..3387
〈서열 7a〉
〈서열 7b〉
〈서열 7c〉
〈서열 7d〉
〈서열 7e〉
(2) 서열번호 8에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 1129 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 단백질
〈서열 8a〉
〈서열 8b〉
〈서열 8c〉
〈서열 8d〉
(2) 서열번호 9에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 3492 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: CDS
(B) 존재 위치: 1..3492
〈서열 9a〉
〈서열 9b〉
〈서열 9c〉
〈서열 9d〉
(2) 서열번호 10에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 1164 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 단백질
〈서열 10a〉
〈서열 10b〉
〈서열 10c〉
(2) 서열번호 11에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 106 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 11〉
(2) 서열번호 12에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 147 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 12〉
(2) 서열번호 13에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 147 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 13〉
(2) 서열번호 14에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 111 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 14〉
(2) 서열번호 15에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 111 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 15〉
(2) 서열번호 16에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 120 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 16〉
(2) 서열번호 17에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 120 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 17〉
(2) 서열번호 18에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 58 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 18〉
(2) 서열번호 19에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 58 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 19〉
(2) 서열번호 20에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 102 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 20〉
(2) 서열번호 21에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 78 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 21〉
(2) 서열번호 22에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 78 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 22〉
(2) 서열번호 23에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 72 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 23〉
(2) 서열번호 24에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 78 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 24〉
(2) 서열번호 25에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 9 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: 펩티드
〈서열 25〉
(2) 서열번호 26에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 40 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
〈서열 26〉
(2) 서열번호 27에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 42 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: cDNA
〈서열 27〉
(2) 서열번호 28에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: cDNA
〈서열 28〉
(2) 서열번호 29에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 무관
(ii) 분자의 타입: cDNA
〈서열 29〉
(2) 서열번호 30에 관한 정보:
(i) 서열의 특성:
(A) 길이: 14 아미노산
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
〈서열 30〉
Claims (29)
- 아미노산 서열 A-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12-B를 포함하는 돌연변이 Cβ단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자로서, 상기 서열에서 A는 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열 1-164를 포함하고, B는 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열 177에서 시작하여 잔기 1094 내지 1127 사이의 아미노산에서 종결되는 서열을 나타내며, X1-X12가 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, 결합 및 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 서열의 해당 위치에서 발견되는 야생형 아미노산으로 구성된 군에서 각각 선택되고, 상기 아미노산 위치는 하나 이상의 X1내지 X12가 야생형 아미노산 이외의 것임을 조건으로 하여 상기 단백질을 암호하는 천연 아미노산 서열의 제1 아미노산에서부터 번호매김하며, LPXTG 모티프가 돌연변이 Cβ단백질로부터 삭제되어 있을 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제1항에 있어서, X1, X5, X7, X8, X10, X11및 X12가 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, 결합 및 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 서열의 해당 위치에서 발견되는 야생형 아미노산으로 구성된 군에서 각각 선택되고, 단 하나 이상의 X1, X5, X7, X8, X10, X11및 X12가 야생형 아미노산 이외의 것임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제1항에 있어서, X1및 X11이 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp 및 결합으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제1항에 있어서, X1및 X11이 Pro인 것이 특징인 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제1항에 있어서, X7및 X12가 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp 및 결합으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제1항에 있어서, X7및 X12가 Ala인 것이 특징인 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제1항에 있어서, X5, X7, X8, X10, X11및 X12가 각각 결합인 것이 특징인 폴리뉴클레오티드 분자.
- 아미노산 서열 A-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12-B를 포함하는 돌연변이 Cβ단백질로서, 상기 서열에서 A는 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열 1-164를 포함하고, B는 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열 177에서 시작하여 잔기 1094 내지 1127 사이의 아미노산에서 종결되는 서열을 나타내며, X1-X12가 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, 결합 및 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 서열의 해당 위치에서 발견되는 야생형 아미노산으로 구성된 군에서 각각 선택되고, 상기 아미노산 위치는 하나 이상의 X1내지 X12가 야생형 아미노산 이외의 것임을 조건으로 하여 상기 단백질을 암호하는 천연 아미노산 서열의 제1 아미노산에서부터 번호매김하며, LPXTG 모티프가 돌연변이 Cβ단백질로부터 삭제되어 있을 수 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이 Cβ단백질.
- 제8항에 있어서, X1, X5, X7, X8, X10, X11및 X12가 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, 결합 및 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 서열의 해당 위치에서 발견되는 야생형 아미노산으로 구성된 군에서 각각 선택되고, 단 하나 이상의 X1, X5, X7, X8, X10, X11및 X12가 야생형 아미노산 이외의 것임을 특징으로 하는 돌연변이 Cβ단백질.
- 제8항에 있어서, X1및 X11이 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp 및 결합으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 돌연변이 Cβ단백질.
- 제8항에 있어서, X1및 X11이 Pro인 것이 특징인 돌연변이 Cβ단백질.
- 제8항에 있어서, X7및 X12가 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp 및 결합으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 돌연변이 Cβ단백질.
- 제8항에 있어서, X7및 X12가 Ala인 것이 특징인 돌연변이 Cβ단백질.
- 제8항에 있어서, X5, X7, X8, X10, X11및 X12가 각각 결합인 것이 특징인 돌연변이 Cβ단백질.
- 제8항에 있어서, 소수성 아미노산 잔기 1108 내지 1116이 비소수성 아미노산으로 대체된 것이 특징인 돌연변이 Cβ단백질.
- 제8항에 있어서, Cβ의 하나 이상의 아미노산 잔기 521 내지 541이 (a) 삭제 또는 (b) 변경되어 이.콜리(E.coli)에서 생성시 이 영역내에서 단백질이 절단되지 않는 것이 특징인 돌연변이 Cβ단백질.
- 제16항에 있어서, Cβ의 하나 이상의 아미노산 잔기 533 내지 541이 (a) 삭제 또는 (b) 변경된 것이 특징인 돌연변이 Cβ단백질.
- 제16항에 있어서, Cβ의 하나 이상의 아미노산 잔기가 (a) 삭제 또는 (b) 변경된 것이 특징인 돌연변이 Cβ단백질.
- 제8항에 기재된 돌연변이 Cβ단백질과 스트렙토코커스 협막 다당류를 포함하는 다당류-단백질 접합체.
- 제1항에 기재된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터.
- 제20항에 기재된 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포.
- 제8항에 기재된 1종 이상의 돌연변이 Cβ단백질과 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 포함하는 백신.
- 제22항에 있어서, 상기 돌연변이 Cβ단백질이 다당류에 접합되어 있는 것이 특징인 백신.
- 제23항에 있어서, 돌연변이 Cβ단백질이 접합된 다당류가 B군 스트렙토코커스 협막 다당류 Ia, II, III 및 V형으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 백신.
- Cβ-Ia, Cβ-II, Cβ-III 및 Cβ-V로 구성된 군에서 선택된 2개 이상의 Cβ단백질-다당류 접합체와 약학적으로 허용 가능한 담체를 함께 포함하고, 각 접합체의 Cβ부분이 제8항에 기재된 돌연변이 Cβ인 조합 백신.
- 제25항에 있어서, 백신이 Cβ-Ia, Cβ-II, Cβ-III 및 Cβ-V과 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 포함하는 것이 특징인 백신.
- 아미노산 서열 A-X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12-B를 포함하는 1종 이상의 돌연변이 Cβ단백질과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신을 포유동물에게 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 서열에서 A는 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열 1-164을 포함하고, B는 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열 177에서 시작하여 잔기 1094 내지 1127의 아미노산에서 종결되는 서열을 나타내며, X1-X12가 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, 결합 및 도 1A 내지 도 1D(서열 번호 2)에 도시된 서열의 해당 위치에서 발견되는 야생형 아미노산으로 구성된 군에서 각각 선택되고, 상기 아미노산 위치는 하나 이상의 X1내지 X12가 야생형 아미노산 이외의 것임을 조건으로 상기 단백질을 암호하는 천연 아미노산 서열의 제1 아미노산에서부터 번호매김하며, LPXTG 모티프가 돌연변이 Cβ단백질로부터 삭제되어 있을 수 있는 것을 특징으로 하는 면역 반응 유도 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 돌연변이 Cβ단백질이 스트렙토코커스 협막 다당류에 접합된 것이 특징인 면역 반응 유도 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 면역 반응 유도 방법.
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