CZ2001951A3

CZ2001951A3 - Prostředky obsahující streptokokový Cbeta protein

Info

Publication number: CZ2001951A3
Application number: CZ2001951A
Authority: CZ
Inventors: Karen O. Long-Rowe; Milan S. Blake
Original assignee: Baxter Healthcare S. A.
Priority date: 1998-09-17
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2001-11-14
Also published as: EP1114143A1; AU6049599A; HUP0103502A2; NO20011381D0; PL347058A1; WO2000015760A1; CA2343051A1; EP1114143A4; NO20011381L; SK3482001A3; JP2002525041A

Description

Prostředky obsahující streptokokový Οβ protein

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká proteinových fragmentů nebo peptidů, které vyvolávají tvorbu protilátek, které jsou baktericidní pro Gram-pozitivní bakterie pouze s komplementem, tj. jejich aktivita není závislá na opsonofagocytárním mechanismu. Předkládaný 'vynález se také týká fragmentů beta antigenu streptokoků skupiny B, stejně jako jejich mutantů majících sníženou nebo eliminovanou schopnost vazby na lidský IgA. Tyto fragmenty si zachovávají imunologické vlastnosti použitelné pro přípravu konjugátových vakcín proti Streptokokům skupiny B. Vynález se také týká izolace a přečištění Οβ proteinu streptokoků skupiny B a jejich mutantů a/nebo fragmentů.

Dosavadní stav techniky

Streptokoky jsou velkou a různorodou skupinou Grampozitivních bakterií, které se dělí do několika skupin podle antigenicity a struktury polysacharidu buněčné stěny (Lancefield, R.C., J. Exp. Med. 57: 571-595 (1933); Lancefield, R.C., Proč. Soc. Exp. Biol. and Med. 38: 473-478 (1938)) . Skupina A streptokoků jsou bakterie, které jsou u člověka nej častější a které způsobují streptokokovou angínu. Streptokoky skupiny A jsou také spojeni se závažnějšími infekcemi, jako je revmatická horečka, streptokokové impetigo a sepse.

Streptokoky skupiny B nebyly známé jako lidské patogeny ve standardních lékařských učebnicích do roku 1970. Od té doby studie prokázaly, že streptokoky skupiny B jsou významnými

perinatálnimi patogeny jak je Spojených Státech Amerických, tak v rozvojových zemích (Smith, A.L. and Haas, J., Infections of the Centrál Nervous Systém, Raven Press, Ltd., New York, str. 313-333 (1991)). Systémové infekce streptokoky skupiny B během prvních dvou měsíců života postihují přibližně tři z 1000 novorozenců (Dillon, H.C., Jr., et al., J. Pediat. 110:31-36 (1987), což vede k 11000 případům ročně ve Spojených Státech Amerických. Tyto infekce se projevují jako kongenitální pneumonie, sepse a meningitida. Významný počet takto postižených dětí umírá nebo mají trvalé neurologické následky. Kromě toho mohou tyto infekce streptokoky skupiny B mít podíl na vysoké morbiditě spojené s těhotenstvím, která postihuje téměř 50000 žen ročně. Další skupinou rizikovou z hlediska infekce streptokoky skupiny B jsou jedinci s kongenitálně, chemoterapeuticky nebo jinak změněnou imunitní reakcí.

Streptokoky skupiny B mohou být dále rozděleny na nejméně 9 různých typů, jako jsou typy la, lb, II, III, IV, V, VI, VII a VIII, podle kapsulárního polysacharidu bakterií. Z těchto typů jsou patogeneticky nejvýznamnější streptokoky mající kapsulární polysacharid typu la, lb, II, III a V. Streptokoky skupiny B těchto 4 typů představují více než 90% všech popsaných případů. Struktura každého z těchto různých typů polysacharidů byla popsána a charakterizována (Jennings. H.J., et al.. Biochemistry 22:1258-1263 (1983); Jennings, H.J., et al., Can. J. Biochem. 58:112-120 (1980); Jennings, H.J., et al., Proč. Nat. Acad Sci. USA. 77:2931-2935 (1980); Jennings, H.J., et al., J. Biol. Chem. 258:]793-]798 (1983); Wessels, M.R., et al., J. Biol. Chem. 262:8262-8267 (1987). Jak bylo zjištěno pro mnoho jiných lidských bakteriálních patogenů, i kapsulární polysacharidy streptokoků skupiny B, když jsou použity jako vakcíny, poskytují velmi účinnou ochranu před • · infekci těmito bakteriemi. Toto poprvé popsal Lancefield potom později Kasper a spol. (Baker, C.J., et al., N. Engl. J.

Med. 319: 1180-1185 (1988); Baltimore,

D.L., et al.. J. Exp.

Med. 149:327-339 (1979); Madoff, L.C., et al., J.

Clin.

Invest. 94:286-292 (1994); Marques, M.B., et al.,

Immun. 62:1593-1599 (1994); Wessels, M.R., et al.

Infect.

J. Clin.

Invest. 86:1428-1433 (1990); Wessels, M.R., et al., Infect.

Immun. 61:4760-4766 (1993); Wyle, S.A., et al., J Infect. Dis.

126:514-522 (1972)).Nicméně, podobně jako mnoho jiných kapsulárnich polysacharidových vakcín (Anderson, P. et al., J Clin. Invest. 51:39-44 (1972); Gold, R., et al., J. Clin.

Invest. 56:1536-1547 (1975); Gold, R., et al., J. Infect. Dis.

136S:S31-S35 (1977); Gold, R.M.,et al., J. Infect. Dis. 138:731-735 (1978); Makela, P.R.H., et al., J. Infect. Dis. 136.-S43-50 (1977); Peltola, A., et al., Pediatrics 60:730-737 (1977); Peltola, H.. et al. N. Engl. J. Med. 297:686-691 (1977)), jsou vakciny připravené z čistých kapsulárnich uhlovodanů typu la, Ib, II a III relativně slabými imunogeny a mají malou účinnost u dětí mladších 18 měsíců (Baker, C.J. a Kasper, D.L.. Rev. Inf. Dis. 7:458-467 (1985); Baker, C.J., et al., N. Engl. J. Med 319: 1180-1185 (1988); Baker, C.J., et al., New Engl. J. Med 322:1857-1860 (1990)). Tyto čisté polysacharidy jsou klasifikovány jako antigeny nezávislé na T-lymfocytech, protože indukují podobnou imunologickou odpověď u zvířat, která nemají T-lymfocyty (Howard, J.G., et al., Cell. Immunol. 2:614-626 (1971). Předpokládá se, že tyto polysacharidy nevyvolávají sekundární dosycovací reakci, protože neinteragují s T-lymfocyty a proto nevyvolávají následnou odpověď pomocných T lymfocytů prostřednictvím sekrece různých cytokinů. Z tohoto důvodu vede každé následné podání polysacharidu ve vakcíně k uvolnění konstantního ·· ·· ···· ·· • •·· · · · · • · · · · · · · · množství protilátek, zatímco antigen dependentní na Tlymfocytech vyvolává zvyšující se koncentraci protilátek při každém podání dávky.

Goebel a Avery v roce 1931 zjistili, že po kovalentním navázání čistého polysacharidu na protein je možno vyvolat imunitní reakci na polysacharid, která nemohla být dosažena polysacharidem samotným (Avery, O.T. and Goebel, W.F., J Exp. Med. 54:437-447 (1931); Goebel. W.F. and Avery, O.T., J. Exp. Med. 54:431-436 (1931)). Tato pozorování vytvořila základ pro současnou technologii konjugovaných vakcín. Následovalo mnoho studií, které prokázaly, že když jsou polysacharidy navázány na proteiny před jejich podáním ve vakcínách, změní se imunitní odpověď na polysacharidy z odpovědi nezávislé na Tlymfocytech na odpověď závislou na T-lymfocytech. Pro přehled viz Dick, W.E., Jr. and Beurret, M.. Glycoconjugates of bacterial carbohydrate antigens In: Contributions to Microbiology and Immunology, Cruse et al., eds., str. 48-114 (1989); Jennings, H.J. and Sood, R.K., Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee, Y.C. and Lee, R.T., eds., Academie Press, New York, str. 325-371 (1994); a Robbins, J.B. and Schneerson. R., J. Infect. Dis. 161:821-832 (1990).

V současnosti je většina z těchto vakcín obsahujících konjugát polysacharid-protein připravena z dobře známých proteinů, jako je tetanický toxoid a difterický toxoid a jejich mutanty. Tyto proteiny byly původně použity proto, že jsou ověřeny pro použití u člověka a jsou dobře charakterizovány. Nicméně, jak se více a více polysacharidů navazuje na tyto proteiny a používá jako vakciny, objevuje se interference mezi různými vakcínami, které využívají stejný protein. Například, pokud se několik různých polysacharidů naváže na tetanický toxoid a podá se postupně, je imunitní odpověď na první podaný polysacharidový konjugát mnohem větší než na poslední. Pokud • «· ·· ···· ·· ···* · · · · * · • · * · · · · · · · je, nicméně, každý polysacharid navázán na jiný protein a podán sekvenčně, je imunitní odpověď na každý polysacharid stejná. Potlačení reakce nosičem je termín používaný pro tento pozorovaný jev. Jedním přístupem pro řešení tohoto problému je použít takových protein a polysacharid, které pocházejí ze stejného organismu.

Mezi různými antigeny používanými pro klasifikaci a rozdělení do podskupin pro streptokoky skupiny B je jeden protein známý jako lbe antigen. Tento proteinový antigen poprvé popsali Wilkinson a Eagon v roce 1971 (Wilkinson, H.W. and Eagon, R.G., Infect. Immun. 4:596-604 (1971) a je známo, že se skládá ze dvou odlišných proteinů označených jako a a β. Později bylo prokázáno, že lbe antigen je účinný, když je použit jako vakcína v myším modelu infekce (Lancefield, R.C., el al., J Exp. Med. 142:165-179 (1975).

Izolaci, přečištění a funkční charakterizaci beta antigenního (θβ) proteinu streptokoků skupiny B provedli Russell-Jones, et al. (Russell-Jones, G.J. and Gotschlich. E.C., J. Exp. Med. 160: 1476-1484 (1984); Russell-Jones. G.J., et al., J. Exp. Med. 160: 1467-1475 (1984).

Při testování IgA vazebné afinity povrchových proteinů z různých GBS kmenů extrahovali Russell-Jones et al. nejprve θβprotein za použití Triton-X100 detergentní metody (RussellJones, G.J. et al., J Exp.Med 160: 1467-1475 (1984)). Ačkoliv identifikovali 130 kDa protein, který se trvale asocioval s IgA vazebnou aktivitou, byl protein již kontaminován menšími proteiny, z nichž některé se vázaly na IgA. Předpokládali, že tyto proteiny s nižší molekulovou hmotností jsou degradační produkty vzniklé působením necharakterizované bakteriální proteasy. Russell-Jones et al. snížili proteolytickou aktivitu « Λ · · * · · • « · ···· · · • · · · « · · · · extrahováním θβ proteinu v horkém SDS a potom přečistili protein SDS-gelovou chromatografii. Ačkoliv získali značně čistý protein, nevedl tento způsob k zisku konečného produktu v dostatečném množství a čistotě pro následnou konjugaci na bakteriální polysacharid.

Madoff et al. získali θβ protein za použití preparativní SDS-PAGE a elektroeluce θβ proteinu (Madoff et al., Infect. Immun. 60(12):4989-4994 (1992)). Tento způsob také nezvyšoval výnos. Jerlstrom et al. (1996) získali fragmenty ύβ proteinu z inklusních tělísek produkovaných v buňkách, které nadměrně exprimovaly fragmenty θβ proteinu (Jerlstrom et al. , Infect. Immun. 64 (7): 2787-2793 (1996). Inklusní tělíska byly nejprve solubilizovány v 8M močovině. Získaný supernatant se potom zpracoval FPLC za použití Mono QI1I iontoměničové kolony. Ačkoliv výtěžek a čistota nejsou popsány podrobně, zdá se, že určitého přečištění bylo dosaženo pouze izolací inklusních tělísek.

Russell-Jones et al. prokázali, že jednou vlastností θβ proteinu je to, že se specificky váže na lidský IgA imunoglobulin. Vazebné místo na IgA molekule bylo lokalizováno na Fc část těžkého řetězce tohoto imunoglobulinu. Dále prokázali, že θβ protein se skládá z jednoho polypeptidu majícího molekulovou hmotnost 130 kDa. Gen odpovědný za expresi θβ proteinu byl klonován (Oleát, P.H. and Timmis, K.N., Infect. Immun. 55; 1151-1155 (1987) a sekvencován (Jerlstrom, P.G., et al., Molec. Microbiol. 5:843-849 (1991)) skupinou vedenou Timmisem. Jeho pozdější práce prokázala, že vazebná aktivita na IgA může být přisouzena 746 bp DNA fragmentu v rozsahu od BglII restrikčního místa do Hpal restrikčního místa.

• ·· >····· · · 9

9·· 9 · · · · · · ··« ····· ·· ♦ ··««« · · ♦ · * ···<·· · · · * 9· · · · · · · · · · · ···

Jak bylo uvedeno výše, Lancefieldova práce z roku 1975 prokázala, že lbe antigen je účinným vakcinačnim antigenem v myším modelu infekce streptokoky skupiny B (Lancefield, R.C.,et al., J. Exp. Med 142:165-179 (1975)). V této době nebylo jasné, zda je za tuto ochranu odpovědná alfa nebo beta proteinová složka lbe antigenu. Madoff et al. začal řešit tento problém a prokázal, že přečištěný θβ protein použitý jako vakcina může chránit novorozené myši před experimentální infekci streptokoky skupiny B exprimujicimi tento protein (Madoff et al., Infect. Immun. 60(12):4989-4994 (1992)). Madoff et al. také prokázali, že když naváži typ II streptokokového kapsulárniho polysacharidu na θβ protein, může tato vakcina chránit mladé myši před infekci jak streptokoky skupiny B III typu (neexprimujicimi Εβ), tak streptokoky skupiny B lb typu (exprimujicimi Οβ, ale bez kapsulárniho polysacharidu III typu) Madoff, L.C., et al., J. Clin. Invest. 94:286-292 (1994)). Tak má vakcina obsahující konjugát θβ proteinu několik funkcí: polysacharid vyvolává tvorbu protektivních protilátek k polysacharidovému obalu a θβ protein vyvolává tvorbu protektivních protilátek k proteinu, stejně jako modifikuje imunitní reakci na polysacharid z odpovědi nezávislé na T-lymfocytech na odpověď závislou na Tlymfocytech.

Tato strategie využívající konjugátu ρο^33θή3ηίάη-0β proteinu funguje dobře u myší. Jasné však je, že cílem je ochrana lidí před infekcemi streptokoky skupiny B. Jedinou překážkou použití stejné strategie u lidí je to, že θβ protein se váže na lidské IgA imunoglobuliny nespecificky (θβ se neváže specificky na myší IgA). Tato vazebná aktivita θβ na lidský IgA může snižovat účinnost ρο1γ33θΗ3ηίά-θβ protein konjugátové vakcíny u lisí, protože antigen navázaný na IgA může být eliminován ze systému tak rychle, že nedojde k indukci protilátkové odpovědi specifické pro antigen. Dále, potenciálně protektivni epitopy Cp proteinu mohou být zakryty po vazbě IgA na θβ molekulu. Proto je výhodné připravit Οβ protein, který by neměl vazebnou kapacitu pro IgA, ale který by si zachovával tolik přirozené struktury, kolik je možné.

S tímto cílem se několik skupin pokoušelo stanovit vazebný region pro IgA v θβ proteinu. Brady a Boyle (Infect. Immunol. 57: 1573-1581 (1989)) identifikovali některé formy β antigenu streptokoků skupiny B, které se neváží na Fc region IgA. Brady a Boyle také pozorovali, že některé kmeny testované v jejich studii secernují formy antigenu s nízkou molekulovou hmotností. HG806 secernoval přibližně 38 kDa formu, která se nevázala na Fc lidského IgA. Dva další kmeny, 2AR a DL471B, secernovaly přibližně 55 a 53 kDa formy, v příslušném pořadí. Nicméně, tyto formy vykazovaly vazbu na IgA-Fc.

Dále Jerlstrom, P.G., et al. (Molec. Microbiol. 5:843-849 (1991)) provedli pokusy, ve kterých byly subfragmenty θβ proteinu exprimovány jako fúsní proteiny, pro identifikaci dvou regionů ΰβ proteinu schopných vazby na IgA. Tyto pokusy lokalizovaly vazebné domény pro IgA do 747 bp BglII-Hpal fragmentu a 1461 bp Hpal-HindlII fragmentu Οβ proteinu.

US Patenty č. 5595740 a 5766606 popisují deleční mutanty θβ protein, které neobsahují větší region této domény a které se neváží na IgA. Dále, Mezinárodní patentová přihláška č. PCT/US97/15319 popisuje 12 aminokyselinovou doménu θβ proteinu, jejíž mutace vede ke snížení nebo eliminaci vazby na IgA.

« · • · • 4 • · ·

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká proteinových fragmentů nebo peptidů, které vyvolávají tvorbu protilátek, které jsou baktericidní pro Gram-pozitivní bakterie pouze s komplementem, tj. jejich aktivita není závislá na opsonofagocytárním mechanismu.

Vynález se také týká proteinového fragmentu nebo peptidu příbuzného s β-antigenem streptokoků skupiny B (GBS), který obsahuje imunogenní IgG vazebnou doménu proteinu. Výhodně je vazba proteinového fragmentu nebo peptidu na IgA snížena nebo eliminována.

Přesněji se předkládaný vynález týká proteinového fragmentu nebo peptidu obsahujícího region bohatý na prolin, ve kterém je alespoň každý třetí zbytek prolin. Ve výhodném provedení obsahuje proteinový fragment nebo peptid kontinuální (opakovanou) aminokyselinovou sekvenci mající vzorec:

-[P-Yi-Y₂-P-Yi-Y2]r- nebo -[Yi-Y2-P-Yi-Y2-P]r-, kde Yi představuje buď kyselý nebo bazický aminokyselinový zbytek, Y2 představuje neutrální aminokyselinový zbytek a r je celé číslo od 1 do 5.

Lépe Yi znamená D nebo K a Y2 znamená V nebo L. r je nejlépe 4.

Nejlépe je Y2 hydrofobní aminokyselina.

Vynález se také týká peptidu nebo proteinového fragmentu majícího vzorec Y-X-Z, kde X znamená alespoň osm kontinuálních aminokyselinových zbytků mezi aminokyselinami 828 a 1027, protein), Y znamená vodík nebo N-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), která je navázána nebo N-koncový fragment a/nebo jeho mutant, a Z znamená na X, vodík nebo C-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID • ·· ♦ · ···* ·· • · φ · · · · ··· • · · · ···· · φ

NO: 2), která je navázána na X, nebo N-koncový fragment a/nebo jeho mutant, s podmínkou, že alespoň jedna z aminokyselin 1164 obr. 1 (SEQ ID NO: 2), pokud je přítomna v Y, je nepřirozená, a s další podmínkou, že protein má alespoň jeden N-koncový nebo C-koncový fragment aminokyselinové sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2).

Vynález se také týká peptidů nebo proteinového fragmentu podle předkládaného vynálezu, jak byl popsán výše, kde Y představuje aminokyselinovou sekvenci obsahující AX1X2X3X4X5X6X7X7X8X9X10X11X12-B, kde A z?,hr/7í//e aminokyseliny 1-164 sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2) nebo její N-koncový fragment, B představuje sekvenci začínající od aminokyseliny 177 a končící aminokyselinou navázanou na X, a X1-X12 jsou každý nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, vazbu a přirozené aminokyseliny nacházející se v příslušné pozici sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), kde aminokyselinové pozice jsou číslovány od první aminokyseliny přirozené aminokyselinové sekvence kódující protein, s podmínkou, že alespoň jeden z X1-X12, včetně, je jiný než přirozená aminokyselina.

Vynález se také týká polynukleotidové molekuly kódující · peptid nebo fragment proteinu podle předkládaného vynálezu, stejně jako vektorů obsahujících takový polynukleotid a hostitelských buněk transformovaných vektorem.

Vynález se také týká konjugátu obsahujícího peptid nebo proteinový fragment podle předkládaného vynálezu kovalentně konjugovaný na kapsulární polysacharid. Alternativně může být peptid nebo proteinový fragment konjugovaný na nebo v komplexu s porinovým proteinem, proteosomem nebo jiným proteinovým nosičem.

• ·· «···«· ·· · • · · · · · · · · · · • · · · · · · · · · * ««···· ···< φ • · ♦ · · ···» ··· ·· · · «·· ·· · · ·

Vynález se také týká vakcín obsahujících peptid nebo proteinový fragment podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Vynález se také týká způsobu pro indukci imunitní odpovědi u zvířete, při kterém je zvířeti podána vakcína podle předkládaného vynálezu v účinné dávce.

Vynález se také týká způsobu pro získání v podstatě čistého Cp proteinu nebo jeho fragmentu nebo mutantu, který zahrnuje:

(a) získání Cp proteinu v buněčných extraktech (b) zpracování Οβ proteinu iontoměničovou chromatografií a odběr frakcí obsahujících Cp protein;

(c) sloučeni a ředění frakcí obsahujících CP protein;

(d) zpracování naředěných frakcí obsahujících CP protein ligandovou afinitní nebo gelovou filtrační chromatografií a odběr frakcí;

kde tímto způsobem se získá v podstatě čistý Cp protein nebo jeho fragment a/nebo mutant.

Vynález se také týká způsobu pro získání ϋβ proteinu nebo jeho fragmentu a/nebo mutantu z bakteriálních buněk, které jsou transfektovány nukleotidovými sekvencemi kódujícími CP protein nebo jeho fragment a/nebo mutant, kde tyto buňky exprimují CP protein nebo jeho fragment nebo mutant.

Vynález se také týká způsobu pro získání CP protein z bakteriálních buněk přirozeně produkujících CP protein.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje DNA sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci pro přirozený Οβί (Jerlstróm, P.G. et al., Molec. Microbiol. 5: 843-849 (1991)). Jsou označena BglII a Pstl místa uvedená na obr. 2, 3 a 4.

Obr. 2A a 2B ukazují eluční profily proteinu pro chromatografickou Q® kolonu (1,6 x 20 cm) a heparinovou kolonu (1,6 x 20 cm), v příslušném pořadí, za následujících podmínek: průtok - 5 ml/min., atenuace - 0,2; a gradient - 0 - 0,1 M NaCl/0,5% Zwittergent®/0,25 mM Tris(HCl), pH 7,6-7,8, 10 ml/frakci.

Obr. 3A a 3B ukazují data pro přečištění Οβ proteinu a SDS-PAGE odpovídajících přípravků. Obr. 3A ilustruje přečištění Οβ proteinu na Q® a heparinové koloně. Obr. 3B ukazuje přečištění Οβ proteinu na Q® a S300 gelové filtrační koloně.

Obr. 4A a 4B ukazují štěpení Οβ proteinu termolysinem. Obr. 4A ukazuje SDS-PAGE ilustrující charakter štěpení s výslednými fragmenty zřetelné molekulové hmotnosti 35 kDa a 25 kDa na tricinových gelech. Obr. 4B je westernový přenos sondovaný protilátkou 52.2, který ukazuje, že hlavní fragmenty reagují s protilátkou.

Obr. 5 ukazuje separaci a získání fragmentů Οβ proteinu westernovým přenosem a jejich následné rozdělení na nitrocelulosové membráně. Podíly byly zpracovány na SDS-gelech pro potvrzení zisku proteinu.

Obr. 6 ukazuje SDS-PAGE Οβ proteinu štěpeného termolysinem

separovaného gelovou filtrací na Sephacryl®-100.

Obr. 7 ukazuje SDS-PAGE Arg-C fragmentů TI peptidů.

Obr. 8 ukazuje sekvenci přirozeného Οβ proteinu z S.

agalactiae. Analýza N-koncové sekvence ukázala, kde termolysin generoval fragmenty TI a T2 (N-koncová část sekvence je podtržena). Teoretické štěpení fragmentu TI ArgC je zakroužkováno.

Obr. 9A a 9B jsou grafická znázornění vazby protilátky na 8merový a 20-merový mimotop, v příslušném pořadí. Dvojité pokusy byly provedeny pro každý mimotop, s proplachem pro každý vazebný pokus (dva sloupce). Určitá variabilita je způsobena neúplným promytím.

Obr. 10 je grafické znázornění inhibice vazby protilátky na 20-merové mimotopy tím, že protilátka se předem zpracuje syntetickým peptidem odpovídajícím aminokyselinám 890-906 obr. 8. Jedna sada dat pro 20-mery z pokusu podle obr. 9B (prázdné sloupce) je použita jako pozitivní kontrola pro protilátku nezpracovanou syntetickým peptidem.

Obr. 11 je grafické znázornění baktericidní inhibice Οβ proteinem a jeho fragmenty vzešlými z štěpení termolysinem.

Obr. 12 je grafické znázornění přežívání streptokoků Ib skupiny B v baktericidním testu za použití protilátky k přirozenému Οβ proteinu.

Obr. 13 je grafické znázornění přežívání streptokoků Ib skupiny B v baktericidním testu za použití Ser-peptidové protilátky k Οβ proteinu.

Obr. 14 ukazuje vazbu Ser-peptidové protilátky na přenesené kolonie streptokoků lb skupiny B za použití antiséra přečištěného tetanickou kolonou samotnou a tetanickou a protein G kolonou.

Obr. 15 je grafické znázornění korelace růstu streptokoků lb skupiny B a vazby Ser-peptidové protilátky. Vazba Serpeptidové protilátky začíná během počáteční růstové fáze a dosahuje vrcholu během logaritmické růstové fáze. Jakmile dosáhnou bakterie stacionární fáze a dělení ustane, klesá vazba protilátky na nulovou hodnotu.

Obr. 16 je grafické znázornění vazby králičí protilátky 52.2 a inhibice vazby na překrývající se 8-měrové mimotopy, které představují sekvence R2 peptidového fragmentu štěpeného Arg-C. Přesněji, sloupcový graf ilustruje sekvence s nejvyšší afinitou k protilátce (neabsorbované) a schopnost intaktního Οβ proteinu inhibovat vazbu protilátky 52.2 na mimotopy (absorbované).

Podrobný popis vynálezu

Bylo zjištěno, že antigenní proteinové fragmenty a peptidy podle předkládaného vynálezu mohou indukovat tvorbu protilátek, které zabíjejí streptokoky pouze za účasti komplementu. Tato baktericidní aktivita, v protikladu k opsonofagocytose, při které jsou bakterie zabíjeny uvnitř bílých krvinek, nebyla nikdy pozorována pro Gram-pozitivní bakterie při použití protilátek specifických pro tyto bakterie. Skutečně, protilátky indukované kapsulárním polysacharidem streptokoků exprimujících Οβ protein nezabíjejí streptokoky, pokud nejsou přítomny leukocyty.

• ·· ·· ···· ·· ···· ··· ··· • · · · ···· · ·

Výzkum antigenniho charakteru Οβ proteinu vedl k objevu antigenniho regionu s charakteristikami společnými pro Grampozitivní bakterie. Protilátky namířené proti proteinovým fragmentům a peptidům na bázi aminokyselinové sekvence tohoto regionu θβ proteinu mají baktericidní aktivitu, která není závislá na opsonofagocytárním mechanismu. Proto se vynález týká proteinových fragmentů nebo peptidů, které indukují protilátky, které jsou baktericidní pro Gram-pozitivní bakterie pouze s komplementem, t.j. jejich aktivita není závislá na opsonofagocytárním mechanismu.

Antigenní proteinové fragmenty a peptidy podle předkládaného vynálezu jsou odvozeny od C-koncových aminokyselinových sekvencí přirozených proteinů Grampozitivních bakterií a předpokládá se, že jsou zanořeny ve stěně bakterie. V přirozených bakteriálních proteinech jsou antigenní regiony proteinových fragmentů a peptidů podle předkládaného vynálezu přístupny vazbě na protilátky během buněčného dělení. V oblasti, kde z jedné bakterie vznikají dvě, se buněčná stěna rozruší na malé části a remodeluje se. Tato oblast je známa jako septální rovina. Přesně v této oblasti během buněčného dělení jsou antigenní regiony přístupné pro vazbu protilátky a aktivaci komplementu. Výsledky konfokální mikroskopie (příklad 13) jasně ukazuji, že protilátky proti proteinovým fragmentům se váží specificky v oblasti septální roviny a více protilátek se váže na dělící se buňky než na nedělící se buňky. Výsledky FACS analýz potvrdily tyto výsledky a přidaly další důkazy pro toto pozorování. Kromě toho, Coleman et al. provedli dříve stejná pozorování.

Coleman et al. použili značeni koloidním zlatém pro • ·· ♦«···· ·« · ···« · · · ···· • · « · ···· · · · • · · · · · ··· · · ····· ·«·· ··· ·· ·· ··· ·· ··· studováni vazebných míst pro imunoglobuliny a Cp antigenů u streptokoků skupiny B (Coleman et al., Infect Immunol. 58: 332-340 (1990)). Koloidní zlato bylo konjugováno na IgA pro charakterizování vazebných vlastností IgA a na IgG pro charakterizování vazby IgG. Elektronová mikroskopie, kterou provedli Coleman et al., ukázala, neimunologická vazba lidského IgA byla přítomna na povrchu bakterií, zatímco anti-cp specifická vazby IgG byla lokalizována do oblasti septálních rovin dělících se bakteriálních buněk.

Proto bylo jedním předmětem předkládaného vynálezu určení toho, zda je specifické místo na θβ protein odpovědné za indukci protilátek majících tuto jedinečnou baktericidní aktivitu. Identifikace takového místa by umožnila jeho použití ve vakcíně proti streptokokům skupiny B.

Přesněji se předkládaný vynález týká proteinového fragmentu nebo peptidu obsahujícího region bohatý na prolin, ve kterém je alespoň každý třetí zbytek prolin a kde protilátky namířené proti uvedenému proteinovému fragmentu nebo peptidu jsou baktericidní pro Gram-pozitivní bakterie pouze za přítomnosti komplementu. Ve výhodném provedení obsahuje proteinový fragment nebo peptid kontinuální (opakovanou) aminokyselinovou sekvenci mající vzorec: -[P-Yi-Y2-P-Yi-Y2]r- nebo -[Y1-Y2-P-Y1-Y2P]r~, kde Yi představuje buď kyselý nebo bazický aminokyselinový zbytek, Y₂ představuje neutrální aminokyselinový zbytek a r je celé číslo od 1 do 5. Lépe Yi znamená D nebo K a Y₂ znamená V nebo L. r je nejlépe 4. Nejlépe je Y₂ hydrofobní aminokyselina.

V jiném provedení obsahuje proteinový fragment nebo peptid kontinuální (opakovanou) aminokyselinovou sekvenci mající vzorec: -[P-D-Y3~P-K-L]_r- nebo -[K-L-P-D-Y3-P]r-, kde Y3 • 4 4 ······ 4 ·4

4 · 4 4 · · · ··*

4· 4 · · · 4 4 4 ·· ·· ·«· · ··· ·· ··· ·· · 4 4» • 44 44 ·4 444 44 44 4 představuje V nebo A. Lépe Y3 znamená V. r je nejlépe JtcxyxU'

V jiném provedení obsahuje proteinový fragment nebo peptid kontinuální (opakovanou) aminokyselinovou sekvenci mající vzorec: -[S-P-K-Y₄-P-E-A-P-Y5-V-P-E]_r-, kde Y₄ představuje T nebo A a Y5 představuje H nebo R. Lépe Y₄ znamená T a Y5 znamená H.

r je nejlépe Předkládaný vynález se týká proteinových fragmentů nebo peptidů podle předkládaného vynálezu, které obsahují imunogenni vazebnou doménu pro IgG schopnou indukovat tvorbu protilátek popsaných výše. Výhodně je vazba proteinového fragmentu nebo peptidu na IgA snížena nebo eliminována. Ve výhodném provedení obsahuje tato doména peptidovou sekvenci tvořenou alespoň 8 aminokyselinami sekvence mezi pozicemi 828 a 1027 aminokyselinové sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2).

V jiném výhodném provedení se vynález týká peptidu nebo proteinového fragmentu podle předkládaného vynálezu majícího vzorec Y-X-Z, kde X znamená alespoň osm kontinuálních aminokyselinových zbytků mezi aminokyselinami 828 a 1027, včetně sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2), Y znamená vodík nebo N-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), která je navázána na X, nebo její N-koncový fragment a/nebo mutant, a Z znamená vodík nebo C-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), která je navázána na X, nebo její N-koncový fragment a/nebo mutant, s podmínkou, že alespoň jedna z aminokyselin 1-164 obr. 1 (SEQ ID NO: 2), pokud je přítomna v Y, je nepřirozená, a s další podmínkou, že protein má alespoň jeden N-koncový nebo Ckoncový fragment aminokyselinové sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2) .

« * · · · «· · · ·

Lépe neobsahuje Y alespoň aminokyseliny 1-176 podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Také lépe, Z obsahuje alespoň aminokyselinu 901 podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Výhodně nemá peptid nebo proteinový fragment podle předkládaného vynálezu aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 31. Výhodně není peptid nebo proteinový fragment podle předkládaného vynálezu přibližně 55, 53 nebo 38 kDa polypeptid secernovaný kmeny 2Ar, DL471B nebo HG 806 streptokoků skupiny B, v příslušném pořadí.

Výhodně je epitopová sekvence X vybrána ze skupiny zahrnující PPKTPDVP (SEQ ID NO: 32), PDVPKLPD (SEQ ID NO: 33), KLPDVPKL (SEQ ID NO: 34), VPKLPDVP (SEQ ID NO: 35), KLPDAPKL (SEQ ID NO: 36), APKLPDGL (SEQ ID NO: 37), ETPDTPKI (SEQ ID NO: 38), RTVRLALG (SEQ ID NO: 39) a GGGTVRVF (SEQ ID NO: 40). Ve výhodném provedení představuje X jakoukoliv z osmi, devíti, desíti, jedenácti, dvanácti, třinácti, čtrnácti, patnácti, šestnácti, sedmnácti, osmnácti, devatenácti, dvaceti nebo jednadvaceti aminokyselinových sekvencí z aminokyselin 8281027, včetně sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2).

V jiném provedení se vynález týká peptidu nebo proteinového fragmentu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci skládající se z jakýchkoliv 8 sousedních zbytků aminokyselinové sekvence mezi zbytky 828 a 1027, včetně sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2) Výhodně je 8 sousedních zbytků vybráno ze skupiny zahrnující PPKTPDVP (SEQ ID NO: 32), PDVPKLPD (SEQ ID NO: 33), KLPDVPKL (SEQ ID NO: 34), VPKLPDVP (SEQ ID NO: 35), KLPDAPKL (SEQ ID NO: 36), APKLPDGL (SEQ ID NO: 37), ETPDTPKI (SEQ ID NO: 38), RTVRLALG (SEQ ID NO: 39) a GGGTVRVF (SEQ ID NO: 40).

V jiném výhodném provedení se vynález týká peptidu nebo proteinového fragmentu podle předkládaného vynálezu majícího • ·· ··«·«· · v· • · · 0 · · · · ··« ··· * · · · · · ·· • 3 · · « « »···· • · « · · · 0 ·· ·»· ** Γ « ·#· ····· vzorec Υ-Χ-Ζ, kde X znamená jakýchkoliv dvacet sousedních aminokyselinových zbytků mezi aminokyselinami 828 a 1027, včetně sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2), Y znamená vodík nebo N-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), která je navázána na X, nebo její N-koncový fragment a/nebo mutant, a Z znamená vodík nebo C-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), která je navázána na X, nebo její N-koncový fragment a/nebo mutant, s podmínkou, že alespoň jedna z aminokyselin 1-164 podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), pokud je přítomna v Y, je nepřirozená, a s další podmínkou, že protein má alespoň jeden N-koncový nebo Ckoncový fragment aminokyselinové sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Výhodně je X vybrán ze skupiny zahrnující SPKTPEAPKIPEPPKTPDVP (SEQ ID NO: 41), PEAPKPEPPKTPDVPKLPD (SEQ ID NO: 42), KIPEPPKTPDVPKLPDVPKL (SEQ ID NO: 43), PPKTPDVPKLPDVPKLPDVP (SEQ ID NO: 44), PDVPKLPDVPKLPDVPKLPD (SEQ ID NO: 45) a KLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 46). Výhodně také Y neobsahuje alespoň aminokyseliny 1-176 podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2).

V jiném provedení se vynález týká peptidu nebo proteinového fragmentu obsahujícího jakýchkoliv 12 sousedních zbytků aminokyselinové sekvence mezi zbytky 828 a 1027, včetně sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Výhodně je 12 zbytků vybráno ze skupiny zahrnující SPKTPEAPKIPEPPKTPDVP (SEQ ID NO: 41), PEAPKPEPPKTPDVPKLPD (SEQ ID NO: 42), KIPEPPKTPDVPKLPDVPKL (SEQ ID NO: 43), PPKTPDVPKLPDVPKLPDVP (SEQ ID NO: 44), PDVPKLPDVPKLPDVPKLPD (SEQ ID NO: 45) a KLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 46).

V jiném výhodném provedení se vynález týká peptidu nebo proteinového fragmentu podle předkládaného vynálezu majícího vzorec Y-X-Z, kde X znamená alespoň 21 sousedních

4* 44 4 4·** • 4 · · > * · 4» »4*

4» 4*4 a44

4 4 4 44 • 44 ··>*· • 4· ♦ 44 4

44 • 4·

44« »44 · 4 aminokyselinových zbytků mezi aminokyselinami 828 a 1027, včetně sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2), Y znamená vodík nebo N-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), která je navázána na X, nebo její N-koncový fragment a/nebo mutant, a Z znamená vodík nebo C-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), která je navázána na X, nebo její N-koncový fragment a/nebo mutant, s podmínkou, že alespoň jedna z aminokyselin 1-164 podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), pokud je přítomna v Y, je nepřirozená, a s další podmínkou, že protein má alespoň jeden N-koncový nebo Ckoncový fragment aminokyselinové sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Výhodně X obsahuje aminokyselinovou sekvenci mezi aminokyselinami 828 a 1027, včetně sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Výhodně také Y neobsahuje alespoň aminokyseliny 1176 podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2).

V jiném provedení se vynález týká peptidů nebo proteinového fragmentu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci skládající se z alespoň 21 sousedních zbytků aminokyselinové sekvence mezi zbytky 828 a 1027, včetně sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Výhodně obsahuje peptid nebo proteinový fragment podle předkládaného vynálezu aminokyselinovou sekvenci PDVPKLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 47). Nevýhodněji obsahuje peptid nebo proteinový fragment podle předkládaného vynálezu aminokyselinovou sekvenci mezi zbytky 828 a 1027, včetně sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2).

Je třeba si uvědomit, že ačkoliv bylo na obr. 1 a jinde v předkládaném vynálezu použito číslování podle Jerlstrom, P.G. et al., Molec. Microbiol. 5: 843-849 (1991), zahrnují peptidy, proteinové fragmenty a nukleové kysljeiny podle předkládaného vynálezu také přirozené sekvence Οβ proteinu, jak jsou popsány v Hedén, L.O. et al., Eur. J. Immunol. 21: 1481-1490, (1991).

• · · · « ' ₉ • · · ···· * 4

Ačkoliv se sekvence popsané Jerlstromem et al. a Hedénem et al. navzájem liší pouze minimálně, dva rozdíly v aminokyselinách jsou specificky utfAílěny jako příklady variací spadajících do rozsahu předkládaného vynálezu. Zatímco sekvence podle Jerlstróma et al. uvedená na obr. 1 uvádí v pozici 878 Lys, příslušná aminokyselina v sekvenci podle Hedéna et al je Glu. Jedstrom et al. také popisují tři kompletní repetitivní sekvence PVDPKL (SEQ ID NO: 51), zatímco Hedén et al. uvádějí pouze dvě opakování sekvence o šesti zbytcích (třetí repetitivní sekvence v sekvenci podle Hedén et al. mající Ala místo Val odpovídá pozici 897 v sekvenci podle Jerlstrom et al.). Takové variace mohou vzniknout v důsledku zadrhávání DNA polymerasy nebo syntézy za posunu řetězce, když jsou čteny opakující se sekvence, jako jsou sekvence, které jsou zde uvedeny. Proteiny a nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu proto zahrnují takové drobné variace, jako jsou variace mezi sekvencemi popsanými Jerlstromem et al. a Hedénem et al.

Mutace regionu θβ proteinu umístěného mezi aminokyselinovými zbytky 163 a 176 přirozené Cβ sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2) vedou ke vzniku proteinového fragmentu nebo peptidu, který má sníženou nebo eliminovanou vazbu na IgA, ale který si v dostatečném rozsahu zachovává svou terciární strukturu, takže si udržuje většinu své antigenicity (příklady 4 a 5). Substituce nebo delece aminokyselin v tomto regionu snižují nebo eliminují vazbu IgA za současného zachování antigenicity proteinu. Tak je možno měnit aminokyselinovou sekvenci θβ proteinu tak, aby se nevázal na IgA. Vhodnými aminokyselinovými substitucemi eliminujícími vazbu na IgA jsou nahrazení jednoho nebo více zbytků aminokyselinami s jinými vlastnostmi. Například silně hydrofilní aminokyselina může • ·· ·· ···· ·· • · · β · · c··· • · · · ···· ·· * · ··· · ···· • · · · · · ·· • · · · · ····· e »« být nahrazena silně hydrofobní aminokyselinou. Aminokyseliny, které mohou být zařazeny do stejné skupiny, jsou alifatické aminokyseliny Ala, Val, Leu a Ile, hydroxylové zbytky Ser a Thr, acidické zbytky Asp a Glu, amidové zbytky Asn a Gin, bazické zbytky Lys a Arg, a aromatické zbytky Phe a Tyr. Odborníkům v oboru bude jasné, jak určit vhodné aminokyselinové substituce a delece v regionu mezi zbytky 163 a 176 CP proteinu pro redukci nebo eliminaci jeho vazby na IgA.

Pro popis toho, které aminokyselinové změny budou mít pravděpodobně významný rušivý vliv na funkci, viz Bowie, J.U. et al., Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, Science 247: 1306-1310 (1990)) .

Tak se v jiném aspektu vynález také týká peptidů nebo proteinového fragmentu, jak byl popsán výše, který se neváže na IgA, kde Y představuje aminokyselinovou sekvenci obsahující A-X1X2X3X4X5X6X7X7X8X9X10X11X12-B, kde A zahrne. aminokyseliny 1-164 sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2) nebo její N-koncový fragment, B představuje sekvenci začínající od aminokyseliny 177 a končící aminokyselinou navázanou na X, a X1-X12 jsou každý nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, vazbu a přirozené aminokyseliny nacházející se v příslušné pozici sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), kde aminokyselinové pozice jsou číslovány od první aminokyseliny přirozené aminokyselinové sekvence kódující protein, s podmínkou, že alespoň jeden z X1-X12, včetně, je jiný než přirozená aminokyselina.

Vynález také týká peptidů nebo proteinového fragmentu, jak byl popsán výše, který se neváže na IgA, kde Y představuje aminokyselinovou sekvenci obsahující A-X1X2X3X4X5X6X7X7X8X9• · • · • · · · • ·

XioXiiXi2-B. V zejména výhodném provedení jsou aminokyseliny X7 a X12 Ala (SEQ ID NO: 3). V jiném výhodném provedení jsou aminokyseliny X₄ a X11 Pro (SEQ ID NO: 4). V jiném výhodném provedení je aminokyselina X7 Thr a aminokyselina X12 je Leu (SEQ ID NO: 5). Ve výhodnějším provedení jsou aminokyseliny X5, X7, Xs, Χίο, X11 a X12 každá nahrazena vazbou (SEQ ID NO: 6) .

Ve výhodném provedení jsou proteinové fragmenty a peptidy podle předkládaného vynálezu v podstatě čisté.

Vazebná schopnost Οβ na IgA může vyžadovat dimerizaci Οβ. Proto, i když není vazebný region Οβ pro vazbu na IgA mutován, jak je popsáno výše, může mutace regionu Οβ, o kterém se předpokládá, že je nutný pro dimerizaci, vést ke tvorbě Οβ, který se nemůže vázat na IgA. Delece části Οβ od zbytku 729 do C-konce sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2) eliminuje dimerizaci Οβ. Výsledky pokusů podporující toto zjištění jsou uvedeny v tabulce 1. Několik fragmentů Οβ bylo insertováno do každého ze dvou různých vektorů. Když je před nebo za sekvencí uvedenou v tabulce hranatá závorka, tak to znamená, že Οβ sekvence nedosahuje dále na konec fragmentu, tj. že nukleotidová sekvence insertovaná do vektoru kóduje pouze ty aminokyseliny, které jsou uvedené a ne více θβ sekvence. Když je před nebo za sekvencí v tabulce kulatá závorka, tak to znamená, že zbytek Οβ sekvence na tomto konci fragmentu je také obsažen ve vektoru. Nukleotidové sekvence kódující peptidy uvedené v horní části tabulky byly insertovány buď do vektoru pTOPE nebo do vektoru pET17b. Oba tyto vektory umožňují expresi insertovaných fragmentů z T7 promotoru a oba produkují fúsní proteiny obsahující fragment φ10 kapsidového proteinu na N-konci vzhledem k aminokyselinové sekvenci kódované insertem. Nicméně, zatímco pET17b kóduje pouze 8 aminokyselin φΙΟ • · · · · · • · · a

proteinu, pTOPE kóduje 288 aminokyselinový fragment φ10 proteinu.

Název Sekvence

Jak je uvedeno v tabulce 1, některé fragmenty θβ produkované z pET17b vykazovaly sníženou vazbu na IgA, zatímco stejný fragment produkovaný pTOPE byl schopen vazby na IgA. Testované fragmenty θβ neobsahovaly region odpovědný za dimerizaci, ale neměly žádnou mutaci v doméně pro vazbu na IgA (povšimněte si, že θβ fragmenty insertované do vektoru pET24b, uvedené dole v tabulce 1, obsahují domnělý dimerizační region, ale přesto vykazují sníženou vazbu na IgA v důsledku mutace IgA vazebných domén, jak bylo popsáno výše). Předpokládá se, že tyto θβ fragmenty se váží na IgA, jsou-li produkovány z pTOPE, protože 288 aminokyselinový fragment φΙΟ proteinu umožňuje dimerizaci θβ fragmentu. Toto může být způsobeno skutečností, že φΙΟ kapsidový protein za normálního stavu vytváří oligomery; region odpovědný za oligomerizaci může umožňovat dimerizaci insertovaných θβ fragmentů a tak vazbu IgA. Proto se předkládaný vynález také týká peptidu nebo proteinového fragmentu obsahujícího mutaci v dimerizační doméně θβ, kde mutantní θβ protein není schopen vazby na IgA. Samozřejmě, pro produkci peptidu nebo proteinového fragmentu nevážícího se na IgA, který si zachovává co nejvíce antigenicity přirozeného θβ proteinu, by neměla být dimerizace θβ protein u narušena.

Ve výhodném provedení je alespoň jeden z aminokyselinových zbytků 521-541 aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2) buď (a) deletován, nebo (b) pozměněn tak, že protein není štěpen v tomto regionu, když je θβ produkován v E. coli. Ve výhodnějším provedení je alespoň jeden z aminokyselinových zbytků 533-541 aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2) buď (a) deletován, nebo (b) pozměněn. Ve ještě výhodnějším provedení je alespoň jeden z aminokyselinových zbytků 537-538 buď (a) deletován, nebo (b) pozměněn. Odborník v oboru bude schopen určit vhodné aminokyselinové substituce

• · · · · · · běžným experimentováním a pomocí odkazu na článek Von Heijneho (Nucleic Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)).

Protože θβ protein je, ve svém přirozeném stavu, vázaný na membránu, je možné zlepšit přečištění výše uvedeného θβ proteinu, jeho mutantů a/nebo fragmentů pomocí eliminace hydrofobních zbytků transmembránové domény θβ proteinu (transmembránová doména odpovídá zbytkům 1095-1127 sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2)). Toto může být provedeno substitucí nehydrofobních zbytků za hydrofobni zbytky (zbytky 1108-1116 sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2)) nebo deleci hydrofobních zbytků. Zatímco přečištění θβ vázaného na membránu vyžaduje použití detergentního činidla, mutantní θβ neobsahující hydrofobni transmembránový region může být přečištěn bez použití detergentního činidla. Proto se vynález také týká peptidů nebo proteinového fragmentu, ve kterém je devět hydrofobních zbytků vytvářejících transmembránovou doménu deletováno nebo nahrazeno nehydrofobními aminokyselinami.

Produkce θβ proteinu z E. coli může být problematická, protože protein je štěpen ve specifickém regionu, pravděpodobně signální peptidasou E. coli. Toto štěpení vede ke vzniku zkráceného proteinu, který nemusí být ideální pro vakcinaci, protože mu mohou chybět antigenní epitopy přirozeného θβ proteinu. Místo štěpení může být určeno z analýzy sekvence a MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií (Von Heijne, Nucleic Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)). Místo štěpení je mezi aminokyselinovými zbytky 538 a 539 (po alaninu a před glutaminem) aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Rozpoznávací místo pro signální peptidasu je umístěno ve 20 aminokyselinách umístěných mezi

uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Proto může být po deleci tohoto regionu protein úspěšně produkován v E. coli. Dále, protože má signální peptidasa velmi přísnou specificitu sekvence, může alterace rozpoznávací sekvence pro signální peptidasu, i jediná konzervativní aminokyselinová substituce v tomto regionu, eliminovat štěpení proteinu v E. coli. Předpokládá se, že rozpoznávací sekvence nutná pro štěpení touto signální peptidasou je GluLeuIleLysSerAlaGlnGlnGlu (SEQ ID NO: 11), což odpovídá aminokyselinovým zbytkům 533-541 sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Předpokládá se, že alterace šeřinu nebo alaninu v této sekvenci, bud' deleci nebo nekonzervativní substitucí, bude eliminovat štěpení signální peptidasou. Samozřejmě, že mutagenese Οβ sekvence bude pokud možno minimální, aby byla zachována terciární struktura přirozené antigenů za účelem vyvolání imunitní reakce.

Vynález se také týká polynukleotidových molekul kódujících peptidy a proteinové fragmenty podle předkládaného vynálezu, vektorů obsahujících tyto polynukleotidové molekuly a hostitelských buněk transformovaných těmito vektory.

Vynález se také týká exprese proteinových fragmentů a peptidů podle předkládaného vynálezu v buněčném hostiteli. Prokaryotické hostitelské buňky, které mohou být použity pro klonování a expresi proteinových fragmentů a peptidů podle předkládaného vynálezu, jsou dobře známé v oboru. Vektory, které se replikují v takových hostitelských buňkách, jsou také dobře známé.

Výhodnými prokaryotickými hostiteli jsou například bakterie rodu Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Xanthomonas atd. Dvěma takovými prokaryotickými hostiteli jsou E. coli DH10B a DH5aF'IQ (dostupné od LTI, Gaithersburg, MD). Nejvýhodnějšim hostitelem pro klonování a expresi proteinových fragmentů a peptidů podle předkládaného vynálezu je E. coli BL21 (Novagen lne., Madison, WI), která je lysogenní pro DE3 fág.

Předkládaný vynález se také týká vektorů, které obsahují izolovanou DNA molekulu kódující peptidy a proteinové fragmenty podle předkládaného vynálezu, hostitelských buněk, které jsou geneticky upravené rekombinantními vektory a produkce proteinů nebo polypeptidů podle předkládaného vynálezu rekombinantními technikami.

Hostitelské buňky mohou být geneticky upraveny tak, aby inkorporovaly molekuly nukleové kyseliny a exprimovaly proteinové fragmenty nebo peptidy podle předkládaného vynálezu. Například rekombinantní konstrukty mohou být vkládány do hostitelských buněk za použití dobře známých technik infekce, transdukce, transfekce a transformace. Polynukleotidy mohou být vkládány samostatně nebo s jinými polynukleotidy. Takové jiné polynukleotidy mohou být vkládány nezávisle, současně nebo ve vazbě na polynukleotidy podle předkládaného vynálezu.

Například polynukleotidy mohou být navázány na vektor obsahující selektovatelný markér pro propagaci v hostiteli. Vektorový konstrukt může být vložen do buněk pomocí výše uvedených technik. Obecně, plasmidový vektor je vložen jako DNA ve sraženině, jako je sraženina fosforečnanu vápenatého, nebo v komplexu s lipidem s nábojem. Elektroporace může být také použita pro vkládání polynukleotidů do hostitele. Pokud je vektorem virus, může být připraven in vitro nebo může být vložen do buněk a tak může být přenesen do buněk. Je známo

mnoho technik vhodných pro přípravu polynukleotidu a pro vkládání polynukleotidu do buněk podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu. Takové techniky jsou uvedeny v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Sambrook et al., ed, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), kde jsou uvedeny příklady laboratorních manuálů pro takové techniky.

V tomto aspektu vynálezu může být vektorem například plasmidový vektor, j ednořetězcový nebo dvouřetězcový vektor fágový vektor nebo j ednořetězcový nebo dvouřetězcový RNA nebo

DNA virový vektor.

takové vektory mohou být vloženy do buněk jako polynukleotidy, výhodně DNA, za použití technik pro vkládání DNA a RNA do buněk. Vektory, v případě fágových nebo virových vektorů, mohou být vloženy do buněk ve formě sbaleného nebo enkapsulovaného viru, za použití dobře známých technik pro infekci a transdukci. Virové vektory mohou být schopné replikace nebo defektní v replikaci. V druhém případě může propagace viru probíhat pouze v komplementujícich hostitelských buňkách.

Výhodnými vektory jsou, v některých aspektech, ty, které jsou určeny pro expresi proteinových fragmentů nebo peptidů podle předkládaného vynálezu. Obecně, takové vektory obsahují cis-působící kontrolní region účinný pro dosaženi exprese v hostiteli operativně navázaný na exprimovaný polynukleotid. Vhodné trans-působící elementy jsou buď dodány hostitelem, nebo komplementujícím vektorem, nebo mohou být dodány vektorem samotným po jeho vložení do hostitele.

V některých výhodných provedeních jsou vektory určeny pro specifickou expresi. Takové specifické vektory mohou být indukovatelné nebo se mohou exprimovat pouze v určitých typech ·· ·· ···· ·· · • · · * · ·· • ····· · · φ ··· · · · · · · • · ·· ··· ·· ,,, buněk, nebo mohou být jak indukovatelné, tak specifické pro určitý typ buněk. Z indukovatelných vektorů jsou výhodné zejména ty vektory, které jsou indukovatelné faktory prostředí, které se snadno upravují, jako je teplota a přítomnost živin. Jsou známé různé vektory vhodné pro tento aspekt předkládaného vynálezu, včetně konstitutivních a indukovatelných expresních vektorů pro použití v prokaryotických a eukaryotických hostitelských buňkách a takové vektory jsou běžně používány odborníky v oboru (US

Patent č. 5464758).

Upravené hostitelské buňky mohou být kultivovány v běžných živných mediích, která mohou být modifikována pro například aktivaci promotorů, selekci transformantů nebo amplifikaci genů. Kultivační podmínky, jako je teplota, pH a podobně, které byly popsány dříve pro hostitelské buňky vybrané pro expresi, budou vhodné pro expresi proteinových fragmentů nebo peptidů podle předkládaného vynálezu, jak je jasné odborníkům v oboru.

Pro expresi proteinového fragmentu nebo peptidu podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány různé expresní vektory. Mezi takové vektory patří chromosomální, episomální a virové vektory, například vektory odvozené od bakteriálních plasmidů, od bakteriofágů, od kvasinkových episomů, od kvasinkových chromosomálních elementů, od virů jako jsou bakuloviry, papova viry, jako je SV40, viry vakcinie, adenoviry, drůbeží pox viry, pseudorabies viry a retroviry, a z vektorů odvozených od jejich kombinací, jako jsou vektory připravené z plasmidových a bakteriofágových genetických elementů, jako jsou kosmidy a fagemidy, které všechny mohou být použity pro expresi podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu. Obecně, jakýkoliv vektor vhodný pro udržování nebo • 4 · · · · propagaci polynukleotidu, nebo pro expresi polypeptidu nebo proteinu v hostiteli, může být použit pro tuto expresi.

Vhodná DNA molekula může být insertována do vektoru jakoukoliv ze známých a běžných technik. 6becně, DNA molekula pro expresi je navázána na expresní vektor štěpením DNA sekvence a expresního vektoru jednou nebo více endonukleasami a spojením restrikčnich fragmentů dohromady pomocí T4 DNA ligasy. Postupy pro restrikci a ligaci jsou známé odborníkům v oboru. Vhodné techniky pro tento postup, a pro konstrukci expresních vektorů za použití alternativních technik, jsou odborníkům známé a jsou uvedeny podrobně v Sambrook et al., výše.

DNA molekula insertovaná v expresním vektoru je operativně navázaná na vhodné expresní kontrolní sekvence, včetně, například, promotoru pro řízení transkripce mRNA. Příklady takových promotorů jsou PL promotor fágu lambda, lac, trp a tac promotory E. coli, SV40 časné a pozdní promotory a promotory retrovirových LTR. Je třeba si uvědomit, že v oboru je známo mnoho promotorů vhodných pro tento aspekt vynálezu, které mohou být použity způsobem popsaným v diskusi a v příkladech.

Obecně, expresní konstrukty budou obsahovat místa pro iniciaci a ukončení transkripce a - v transkribovaném regionu - vazebné místo pro ribosom pro translaci. Kódující část zralých transkriptů exprimovaných konstrukty bude obsahovat translační iniciační kodon AUG na začátku a terminační kodon ve vhodné pozici na konci polypeptidu, který má být translatován.

Kromě toho mohou konstrukty také obsahovat kontrolní • ·* · * « · * β ·· •» * » « ♦ · • · * ♦ · · · · « • · · ♦ « € « _Β * * ♦· ··· ·· ··· regiony, které reguluji i provádějí expresi. Obecně, jak je běžné, budou takové regiony kontrolovat transkripci a budou mezi ně patřit například vazebná místa pro represory a zesilovače transkripce.

Vektory pro propagaci a expresi budou obvykle obsahovat selektovatelné markéry. Takové markéry mohou být také vhodné pro amplifikaci nebo mohou pro tento účel vektory obsahovat další markér. V tomto ohledu expresní vektory výhodně obsahují jeden nebo více selektovatelných markerových genů způsobujících určitý fenotypový znak vhodný pro selekci transformovaných hostitelských buněk. Mezi výhodné markéry patří geny pro resistenci na neomycin nebo dihydrofolatreduktasu pro kultury eukaryotických buněk a geny pro resistenci na tetracyklin nebo ampicilin pro kultivaci E. coli nebo jiných bakterií.

Vektor obsahující vhodnou DNA sekvence, jak zde byla popsána, stejně jako vhodný promotor a jiné vhodné kontrolní sekvence, může být vložen do vhodného hostitele pomocí různých známých technik za účelem dosažení exprese požadovaného polypeptidu nebo proteinu v buňkách. Representativními příklady vhodných hostitelů jsou bakteriální buňky, jako jsou buňky E. coli, Streptomyces a Salmonella typhimurium. Jsou známí hostitelé pro různé expresní konstrukty a odborníci budou podle předkládaného vynálezu schopni vybrat hostitele pro expresi proteinového fragmentu nebo peptidu podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález také zahrnuje rekombinantní konstrukty, jako jsou expresní konstrukty, obsahující jednu nebo více sekvencí popsaných výše. Konstrukty zahrnují vektory, jako jsou plasmidové nebo virové vektory, do kterých byla

může být insertována v obvyklé nebo reversní orientaci. V některých výhodných provedeních tohoto aspektu obsahuje konstrukt dále regulační sekvence, včetně například promotoru, operativně navázané na sekvenci. Odborníkům v oboru je znám velký počet vhodných vektorů a promotorů a existuje mnoho komerčně dostupných vektorů vhodných pro použití v předkládaném vynálezu.

Protože se vynález týká také konstrukce polypeptidu nebo proteinu majícího redukovanou nebo eliminovanou schopnost vazby na lidský IgA, týká se také metod pro mutagenesi in vitro pro přípravu proteinových fragmentů nebo peptidů podle předkládaného vynálezu. Odborníkům v oboru je známo mnoho metod mutagenese in vitro; některé jsou zde uvedeny jako příklady.

Jedna taková metoda zahrnuje vkládání delecí nebo insercí do polynukleotidové molekuly insertované do plasmidu, pomocí částečného nebo úplného štěpení plasmidu vhodným restrikčním enzymem a potom ligace konců za opětovného vzniku plasmidu. Velmi krátké delece mohou být provedeny nejprve rozstřižením plasmidu v restrikčním místě a potom kontrolovaným štěpením lineární DNA nukleasou pro odstranění malých skupin baží na každém konci. Přesné inserce mohou být provedeny také ligací dvouřetězcových oligonukleotidových spojovacích prvků do plasmidu rozstřiženého v jediném restrikčním místě.

Chemické metody mohou být také použity pro vkládání mutací do jednořetězcové polynukleotidové molekuly. Například změna jednoho páru baží v cytosinových zbytcích může být provedena za použití chemických činidel, jako je bisulfit, která deaminují cytosin na uráčil, což mění GC pár baží na AT pár • · ·» «· ·«♦ · · · • « φ · · · · ··· baží. Výhodně se používá oligonukleotidy řízená mutagenese, která vytváří všechny možné třídy změn páru baží v jakémkoli vybraném místě molekuly DNA. obecně, tato technika vyžaduje tepelné zpracování oligonukleotidů komplementárního (s výjimkou jedné nebo více baží) k vybrané jednořetězcové nukleotidové sekvenci. Chybně spárovaný oligonukleotid se potom prodlouží DNA polymerasou, za vzniku dvouřetězcové DNA molekuly, která obsahuje požadovanou změnu v jednom řetězci. Tato změna může samozřejmě vést k deleci, substituci nebo inserci aminokyseliny, pokud je tato změna provedena v kódujícím regionu genu. Dvouřetězcový polynukleotid může být potom insertován do vhodného expresního vektoru a tak může být produkován mutantní polypeptid. Výše uvedené oligonukleotidy řízená mutagenese může být samozřejmě provedena pomocí PCR. Příkladem takového systému je technika Ex-Site® PCR místně cílené mutagenese (Stratagene, CA) použitá v příkladu 4.

Pomocí techniky Ex-Site® PCR místně cílené mutagenese bylo připraveno několik oligonukleotidů pro indukci různých změn v DNA sekvenci vybraného regionu. V jednom příkladu se připravily překrývající se primery, kde oba primery obsahovaly sekvenci nutnou pro změnu lysinu na alanin v aminokyselinách 170 až 175 v sekvenci uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2) (Tabulka 1). Primer ve směru kódující sekvence, označený CP 613, měl sekvenci (SEQ ID NO: 6) 5'-GTT GAA GCA ATG GCA GAG CAA GCG GGA ATC ACA AAT GAA G-3', a reverzní primer, označený Οβ 642R, měl sekvenci (SEQ ID NO: 7) 5'-GAT TCC CGC TTG CTC TGC CAT TGC TTC AAC TTG ACT TTT TTG-3¹ (substituce jsou uvedeny tučně). Tyto oligonukleotidy byly kombinovány s pNV222 templátem, který se skládal z Οβ genu insertovaného do pSP76 vektoru. Provedla se PCR a produkty se ligovaly a vložily se do E. coli kmene DH5a, za vzniku klonů obsahujících mutantní Οβ gen.

• · · ·· ···· ·· ···· · * fe ··· • · ♦ · ···· · ·

Následující vektory, které jsou komerčně dostupné, mohou být použity v předkládaném vynálezu. Výhodnými vektory pro bakterie jsou pQE70, pQE60 a pQE-9, dostupné od Qiagen; |iBS vektory, Phagescript vektory, Bluescript® vektory, pNH8A, pNH16a, pNH18a, pNH46A, dostupné od Stratagene; ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 dostupné od Pharmacia; pUC18, pUC19 a pPROEX-1, dostupné od LT1, a pTOPE, pET17b a pET24a (Novagen, lne., Madison, WI). Tyto vektory jsou uvedeny pouze pro ilustraci množství komerčně dostupných a dobře známých expresních vektorů, které jsou vhodné pro použití v předkládaném vynálezu. Je třeba si uvědomit, že jakýkoliv jiný plasmid nebo vektor, vhodný pro - například - vložení, udržování, propagaci nebo expresi polynukleotidu, proteinového fragmentu nebo peptidu podle předkládaného vynálezu v hostiteli, může být použit v tomto aspektu předkládaného vynálezu.

Promotorové regiony mohou být vybrány z jakéhokoliv požadovaného genu za použití vektorů, které obsahují reportérovou transkripční jednotku neobsahující promotorový region, jako je chloramfenikol-acetyltransferasová (CAT) transkripční jednotka, za restrikčním místem nebo místy pro vložení vybraného promotorového fragmentu, t.j. fragmentu, který může obsahovat promotor. Jak je dobře známo, vložení fragmentu obsahujícího promotor do vektoru v restrikčním místě před CAT genem vyvolá produkci CAT aktivity, která může být detekována standardními CAT testy. Vektory vhodné pro tento účel jsou známé a snadno dostupné. Dva takové vektory jsou pKK232-8 a pCM7. Proto, promotory pro expresi polynukleotidu podle předkládaného vynálezu nejsou pouze známé a snadno dostupné promotory, ale také promotory, které mohou být získány technikou uvedenou výše, za použití reporterového ··· · · » ·» · ··· • - · ····· · · · * · · · 4 · ··· · · • · * · · ···· ··· · · ·· ··· ·· ··· genu.

Mezi známé bakteriální promotory vhodné pro expresi polynukleotidů a polypeptidů podle předkládaného vynálezu patří E. coli láci a lacZ promotory a T3 a T7 promotory, gpt promotor, lambda PR, PL promotory a trp promotor.

Výběr vhodných vektorů a promotorů pro expresi v hostitelských buňkách je dobře známý a techniky pro konstrukci expresních vektorů a vkládání vektoru do hostitele a expresi vektoru v hostiteli jsou dobře známé v oboru.

Předkládaný vynález se také týká hostitelských buněk obsahujících konstrukty popsané výše. Hostitelskou buňkou může být prokaryotická buňka, jako je bakteriální buňka.

Konstrukt v hostitelských buňkách může být použit běžným způsobem pro produkci genového produktu kódovaného rekombinantní DNA sekvencí. Alternativně mohou být proteinové fragmenty a peptidy podle předkládaného vynálezu produkovány synteticky na běžném syntezátoru peptidů.

Po transformaci vhodného hostitelského kmene a po kultivaci hostitelského kmene do vhodné hustoty buněk, je - pokud je promotor indukovatelný - provedena indukce vhodnými prostředky, například změnou teploty nebo přidáním chemického indukčního činidla, a buňky se kultivují po další období.

Potom jsou buňky obvykle získány odstředěním, jsou desintegrovány vhodnými fyzikálními nebo chemickými prostředky a získaný surový extrakt se uskladní pro další přečištění.

Mikrobiální buňky použité pro expresi proteinů mohou být

desintegrovány jakoukoliv běžnou metodou, včetně cyklů mrazení-rozmrazování, sonikace, mechanické desintegrace nebo použití činidel provádějících lýzu buněk; takové techniky jsou dobře známé odborníkům v oboru.

Výhodně mohou být peptidy připraveny za použití dobře známých metod syntézy peptidů na pevné fázi. Termín peptid označuje sloučeninu obsahující maximálně 100 aminokyselin. Protein se skládá z více než 100 aminokyselin. Výhodně se peptidy skládají z 8-50 aminokyselin.

V jiném aspektu se vynález týká způsobu pro izolaci a přečištění proteinů a polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Byl objeven způsob pro izolaci a přečištění proteinů a polypeptidů podle předkládaného vynálezu, při kterém jsou získána velká množství v podstatě čistého proteinu. Termín v podstatě čistý označuje, že protein nebo polypeptid získaný způsobem podle předkládaného vynálezu má alespoň 85% čistotu se zanedbatelnou kontaminací nukleovými kyselinami a polysacharidy. Jednou výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je to, že je použitelný pro velká množství. To znamená, že způsob je možno upravit pro přečištění velkých množství proteinu. Kolony použité při přečištění lze použít pro velké objemy/koncentrace vzorku, za použití ředění vzorku místo zahuštění vzorku při aplikaci vzorku z jedné kolony do druhé, a obě kolony používají stejný pufr jako mobilní fázi. Kromě toho, tento přečišťovací způsob je použitelný pro přečištěni mutantů a/nebo fragmentů θβ proteinu získaných jak z rekombinantních E. coli, tak normálních streptokoků.

Dále, použití inhibitorů proteas a detergentního činidla při přečištěni umožňuje přečištění za použití iontoměničových a heparinových kolon s minimalizovanou degradací produktu.

Konečně, výtěžky produktu jsou vyšší než při dříve používané technice gelové filtrační chromatografie (Russel-Jones et al., J. Exp. Med. 160: 1467-1475 (1984); Madoff et al., Infect. Immunol. 59(1): 204-210 (1991)), protože najednou mohou být zpracovány větší objemy vzorku. Tento vekoobjemový způsob také minimalizuje čas nutný pro přečištění.

Vynález se týká způsobu pro získání v podstatě čistého Οβ proteinu nebo jeho fragmentu a/nebo mutantu, který zahrnuje:

(a) získáni CP proteinu v buněčných extraktech;

(b) zpracování cP proteinu iontoměničovou chromatografií a odběr frakcí obsahujících CP protein;

(c) sloučení a ředění frakcí obsahujících Cp protein;

Ve výhodném provedení se použije aniontoměničové medium.

Výhodněji má aniontové medium funkční skupinu vybranou ze skupiny zahrnující terciální amin, kvartem! ammonium, kvarterní alkylamin, kvarterní alkylalkanolamin, diethylaminoethyl, diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethyl, trimethyihydroxypropyl, trimethylbenzylammonium, dimethylethanolbenzylammonium a dimethylethanolamin. Ještě lépe je funkční skupinou kvarterní ammoniová skupina. Nejlépe je kvarterní ammoniová skupina trimethylaminomethylová skupina.

Ve výhodném provedení obsahuje iontoměničové medium funkční skupinu popsanou výše imobilizovanou na pevném nosiči, • ·· ·· ···· · ♦ « · · · ··* ··· ·· · · ···· · · například na agarose, dextranu, celulose nebo polystyrenu. Lépe je pevný nosič ve formě korálků. Nejlépe je pevným nosičem zesítěná agarosa.

Ve výhodném provedení se použije ligandové afinitní medium. Výhodně je ligandem afinitního media molekula podobná heparinu. Lépe je molekulou podobnou heparinu glykosaminoglykan. Ještě lépe je molekula podobná heparinu vybrána ze skupiny zahrnující chondroitinsulfat, dermatansulfat, keratansulfat a hyaluronat. Nejlépe je molekulou podobnou heparinu heparin.

Ve výhodném provedení obsahuje ligandové afinitní medium ligand imobilizovaný na pevném nosiči, například na agarose, dextranu, celulose nebo polystyrenu. Lépe je pevný nosič ve formě korálků. Nejlépe je pevným nosičem zesítěná agarosa.

V jiném provedení jsou frakce obsahující θβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant, zpracovány gelovou filtrační chromatografií. nejlépe je gelové filtrační medium zesítěný kopolymer allyl dextranu/N,N'-methylenbisakrylamidu.

Ve výhodném provedení je θβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant zpracován iontoměničovou nebo ligandovou afinitní chromatografií v pufru obsahujícím detergentní činidlo na bázi obojetného iontu. Výhodně je detergentním činidlem na bázi obojetného iontu CHAPS (3-((3cholamidopropyl)dimethyl-ammonio)-1-propansulfonat).Také výhodným detergentním činidlem na bázi obojetného iontu je Empigen® BB (alkyldimethylamin betainy, od Albright and Wilson Americas lne., Glen Allen, VA). Nejlépe je detergentní činidlo na bázi obojetného iontu vybráno ze skupiny zahrnující noktylové, n-decylové, n-dodecylové, n-tetradecylové a n41

hexadecylové deriváty N,N-dimethyl-3-ammonio-l-propansulfonatu (Zwittergent® od Calbiochem, La Jolla, CA). Nejlépe je detergentní činidlo použito v koncentraci přibližně 1% až 10%. Nejlépe je koncentrace detergentního činidla přibližně 5%.

Ve výhodném provedení je θβ protein nebo jeho mutant a/nebo fragment zpracován chromatografií na prvním mediu v pufru obsahujícím inhibitor proteasy. Výhodně je inhibitorem proteasy inhibitor serin-proteasy. Lépe je inhibitor proteasy vybrán ze skupiny zahrnující DFP, PMSF a APMSF. Nejlépe je inhibitorem proteasy 4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluorid-HCl (PEFABLOC SC nebo PEFABLOC PLS od Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN, který může také obsahovat tyramin).

Ve výhodném provedení je eluát obsahující ϋβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant z prvního chromatografického media naředěn přibližně třikrát pufrem obsahujícím přibližně 10%-20^ detergentního činidla na bázi obojetného iontu před ligandovou afinitní nebo gelovou filtrační chromatografií na druhém mediu.

Ve výhodném provedení je θβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant eluován z prvního nebo druhého chromatografického media pomocí eluens obsahujícího gradient soli. Idejlépe je gradient soli gradient obsahující koncentrace soli přibližně 0,0 M, 0,05 M, 0,075 M a 0,09 M soli. Nejlépe je gradient soli lineární gradient od přibližně 0,0 M soli do přibližně 0,1 M soli. Nejlépe je solí NaCl nebo KC1. Nejlépe je solí NaCl.

Ve výhodném provedení je způsob pro získání v podstatě čistého Οβ proteinu nebo jeho fragmentu nebo mutantu proveden • ♦ • · · · • * • · · · při pH od přibližně 7,0 do přibližně 8,0. Nejlépe je způsob proveden při pH od přibližně 7,6 do přibližně 7,8.

Ve výhodném provedeni obsahuje eluftiltdále od přibližně 0,1% do přibližně 1,0% detergentního činidla na bázi obojetného iontu. Lépe obsahuje elutí^É přibližně 0,5% detergentního činidla na bázi obojetného iontu.

V jiném provedení je θβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant získán z bakteriálních buněk, které jsou transfektovány nukleotidovými sekvencemi kódujícími θβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant, kde tyto buňky nadměrně exprimují θβ protein nebo jeho fragment nebo mutant. Nejlépe jsou bakteriálními buňkami buňky E. coli. Nejlépe je θβ protein nebo jeho fragment nebo mutant získán:

(a) desintegrací buněk;

(b) vysrážením neproteinového materiálu z buněk přidáním ethanolu/CaClž za dosažení koncentrace přibližně 20% (obj./obj.) ethanolu/0,1 M CaC12;

(c) odstraněním vysráženého neproteinového materiálu za zisku roztoku;

(d) vysrážením proteinu z roztoku přidáním ethanolu za dosažení koncentrace přibližně 80% (obj./obj.) a odebráním vysráženého proteinu; a (e) resuspendováním vysráženého proteinu v pufrovacím roztoku obsahujícím od přibližně 3% do přibližně 7% detergentního činidla na bázi obojetného iontu.

V jiném výhodném provedení se θβ protein získá z bakteriálních buněk přirozeně produkujících θβ protein. Nejlépe jsou bakteriálními buňkami buňky Streptococcus agalactiae. Nejlépe je θβ protein nebo jeho fragment nebo mutant získán:

(a) varem bakteriálních buněk v pufru obsahujícím od přibližně 3% do přibližně 7% detergentního činidla na bázi obojetného iontu za zisku roztoku;

(b) ochlazením roztoku v ledové lázni;

(c) přidáním chladného roztoku CaC12/ethanolu za zisku koncentrace přibližně 20% (obj./obj.) ethanolu/přibližně 0,1 M CaC12;

(d) odstraněním vysráženého neproteinového materiálu za zisku roztoku;

(e) vysrážením proteinu z roztoku přidáním ethanolu za dosažení koncentrace přibližně 80% (obj./obj.) a odebráním vysráženého proteinu; a (f) resuspendováním vysráženého proteinu v pufrovacím roztoku obsahujícím od přibližně 3% do přibližně 7% detergentního činidla na bázi obojetného iontu.

Vynález se také týká vakciny obsahující proteinový fragment nebo peptid podle předkládaného vynálezu, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem. V jednom aspektu se vynález týká proteinových fragmentů nebo peptidu, které vyvolávají tvorbu protilátek, které jsou baktericidní pro Gram-pozitivní bakterie pouze s komplementem, tj. jejich aktivita není závislá na opsonofagocytárním mechanismu. Tyto proteinové fragmenty a peptidy podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodné pro produkci vakcín pro použití u pacientů s narušenou buněčnou imunitou, například u pacientů po chemoterapii a u pacientů s leukémiemi.

Protože je region bohatý na prolin u streptokoků charakteristický pro Gram-pozitivní bakterie, předpokládá se, že vakciny podle předkládaného vynálezu budou použitelné pro vyvolání imunitní reakce proti dalším Gram-pozitivním bakteriím, včetně například Bacillus acidocaldarius, Bacillus • · · · · · · • · · ···· · ·

Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus anthracis, Bacillus azotofixans, Bacillus azotoformans, Bacillus badius, Bacillus benzoevorans, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus cycloheptanicus, Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus globisporus, Bacillus glucanolyticus, Bacillus gordonae, Bacillus halodenitrificans, Bacillus insolitus, Bacillus kaustophilus, Bacillus larvae, Bacillus laterosporus, Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus macerans, Bacillus macquariensis, Bacillus marinus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pabuli, Bacillus pantothenticus, Bacillus pasteurii, Bacillus polymyxa, Bacillus popilliae, Bacillus psychrophilus, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus schlegelii, Bacillus simplex, Bacillus sphaericus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus thermoglucosidasius, Bacillus thermoleovorans, Bacillus thuringiensis, Bacillus validus, Clostridium absonum, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum. Clostridium acidiurici, Clostridium aerotolerans, Clostridium aminovalericum, Clostridium argentinense, Clostridium aurantibutyricum, Clostridium barati, Clostridium barkeri, Clostridium beijerinckii, Clostridium bifermentans, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium carnis, Clostridium celatum, Clostridium cellobioparum, Clostridium cellulolylicum. Clostridium cellulovorans, Clostridium chauvoei, Clostridium clostridiifořme, Clostridium coccoides, Clostridium cochlearium, Clostridium cocleatum, Clostridium colinum, Clostridium collagenovorans, Clostridium cylindrosporum, Clostridium difficile, Clostridium disporicum, Clostridium

durum, Clostridium fallax, Clostridium felsineum, Clostridium fervidus, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ghoni, Clostridium glycolicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium hastiforme, Clostridium histolyticum, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium intestinalis, Clostridium irregularis, Clostridium kluyveri, Clostridium lentoputrescens, Clostridium leptům, Clostridium limosum, Clostridium lituseburense, Clostridium magnum, Clostridium malenominatum, Clostridium mangenotii, Clostridium methylpentosum, Clostridium novyi, Clostridium oceanicum, Clostridium orbiscindens, Clostridium oroticum, Clostrildium papyrosolvens, Clostridium paraputrificum, Clostridium pasteurianum, Clostridium perfringens, Clostridium polysaccharolyticum, Clostridium populeti, Clostridium propionicum, Clostridium proteolyticum, Clostridium purinolyticum, Clostridium putrefaciens, Clostridium putrificum, Clostridium quericolum, Clostridium ramosum, Clostridium rectum, Clostridium roseum, Clostridium saccharolyticum, Clostridium sardiniensis, Clostridium sartagoformum, Clostridium scatologenes, Clostridium scindens, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium sphenoides, Clostridium spiroforme, Clostridium sporogenes, Clostridium sporosphaeroides, Clostridium stercorarium, Clostridium sticklandii, Clostridium subterminale, Clostridium symbiosum, Clostridium tertium, Clostridium tetani, Clostridium tetanomorphum, Clostridium thermoaceticum, Clostridium thermoautotrophicum, Clostridium thermocellum, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermolacticum, Clostridium thermosaccharolyticum, Clostridium thermosulfurogenes, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium villosum, Clostridium xylanolyticum, Corynebacterium accolens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae,

PG

Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium hoagii, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium liquefaciens, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium renale, Corynebacterium striatum, Corynebacterium variabilis, Corynebacterium vitarumen, Corynebacterium xerosis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Erysipelothrix tonsillarum, Lactobacillus acecotolerans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Laccobacillus intestinalis, Lactobacillus jensenii, Laclobacillus kefir, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus murinus, Laclobacillus oris, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus saké, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfrancisco, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus vaccinostercus, • ·· · · ···· ·· • · · · · · » · · ♦ • · · · · · · · · ·

Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Leuconostoc amelibiosum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc cifreum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc oenos, Leuconostoc paramesenteroides, Leuconostoc pseudomesenteroides, Listeria grayi, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeria murrayi, Listeria seeligeri, Listeria welshimeri, Micrococcus agilis, Micrococcus halobius, Micrococcus kris*tinae, Micrococcus zuceus, Micrococcus lylae, Micrococcus nishinomiyaensis, Micrococcus roseus, Micrococcus sedencarius, Micrococcus varians, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus asaccharolyticus, Peptostreptococcus heliotrinreducens, Peptostreptococcus hydrogenalis, Peptostreptococcus indolicus. Peptostreptococcus magnus, Peptostreptococcus micros, Peptosteptococcus prevotii, Peptostreptococcus productus, Peptostreptococcus tetradius, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium lymphophilum, Propionibacterium propionicum, Propionibacterium thoenii, Sebaldella termitidus, Staphylococcus arleltae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus caseolyticus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus felis, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri,

Staphylococcus xylosus, Streptococcus adjacens, Streptococcus agalactiae, Streptococcus alactolyticus, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus cricetus, Streptococcus defectivus, Streptococcus downei, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus equinus, Streptococcus ferus, Streptococcus gordonii, Streptococcus hansenii, Streptococcus hyointestinalis, Srreptococcus iniae, Streptococcus intestinalis, Streptococcus macacae, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguis, Streptococcus parvulus, Streptococcus pleomorphus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus porcinus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus uberis a Streptococcus vestibularis.

Ve výhodném provedeni je proteinový fragment nebo peptid konjugovaný na polysacharid. Konjugáty podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny reakcí redukujícího konce skupin polysacharidu s primárními amino- skupinami (například lysinových zbytků) proteinu redukční aminací. Polysacharid může být konjugován na jakoukoliv nebo na všechny primární amino- skupiny proteinu. Redukční skupiny mohou být připraveny selektivní hydrolýzou nebo specifickým oxidativním štěpením nebo kombinací obou reakci. Výhodně je proteinový fragment nebo peptid konjugován na polysacharid způsobem podle Jennings et al., US patent č. 4356170, který zahrnuje řízenou oxidaci polysacharidu jodistanem, po které následuje redukční aminace proteinem podle předkládaného vynálezu.

Ve výhodném provedení je polysacharid jedním z kapsulárních polysacharidu streptokoků skupiny B ze skupin la, II, III a V.

Viz Baker, C.J. and Kasper, D.L., Rev. Inf. Dis. 7: 458-467 (1985); Baker, C.J., et al., N. Engl. J. Med. 319: 1180-1185 (1988); Baker, C.J., et al., N. Engl. J. Med. 322: 1857-1860 (1990). Vakcínou může také kombinovaná vakcína obsahující jeden nebo více konjugátu proteinový fragment nebo peptidpolysacharid vybraných ze skupiny skládající se z proteinového fragmentu nebo peptidu podle předkládaného vynálezu konjugovaného na: kapsulární polysacharid skupiny B typu la (protein-Ia), kapsulární polysacharid skupiny B typu II (protein-II), kapsulární polysacharid skupiny B typu III (protein-III), a kapsulární polysacharid skupiny B typu V (protein-V). Nejlépe je vakcína kombinovaná vakcína obsahující protein-Ia,protein-II, protein-III a protein-V. Taková kombinovaná vakcína může vyvolat tvorbu protilátek proti streptokokům skupiny B typů la, II, III, V a Ib (protože typ Ib streptokoků skupiny B také exprimuje θβ. Dále, imunitní reakce na polysacharidy kombinované vakcíny bude T-dependentní reakce.

Vakcína podle předkládaného vynálezu může obsahovat konjugát obsahující peptid nebo proteinový fragment podle předkládaného vynálezu kovalentně konjugovaný na kapsulární polysacharid. Alternativně může být peptid nebo proteinový fragment konjugovaný nebo komplexovaný s pórovým proteinem, proteosomem nebo jiným proteinovým nosičem. Viz US patent č. 5439808, který popisuje způsoby pro přípravu porinu zevní membrány skupiny B z N. meningitidis, a WO 95/03069, který popisuje přípravu P2 porinu z H. influenzae.

Vakcína podle předkládaného vynálezu zahrnuje jednu nebo více vakcín obsahujících proteinových fragment nebo peptid nebo konjugátových vakcín, ve kterých účinná množství závisejí na způsobu podání. Ačkoliv jsou výhodné podkožní nebo

nitrosvalové způsoby podáni, může být vakcina podle předkládaného vynálezu podána také intraperitoneálně nebo intravenosně. Odborníkům v oboru bude jasné, že dávka podaná v jakémkoliv léčebném protokolu může být snadno určena bez nežádoucího experimentování. S ohledem na každý konjugát mohou být vhodné dávky v rozmezí od 2 pg proteinového fragmentu nebo peptidu na kg tělesné hmotnosti až 100 pg na kg tělesné hmotnosti. Ve výhodném provedení obsahuje vakcina přibližně 2 pg proteinového fragmentu nebo peptidu nebo ekvivalentní množství konjugátu proteinového fragmentu nebo peptidu a polysacharidu. Ve jiném výhodném provedení obsahuje vakcina přibližně 5 pg proteinového fragmentu nebo peptidu nebo ekvivalentní množství konjugátu proteinového fragmentu nebo peptidu a polysacharidu.

Vakcina podle předkládaného vynálezu může být použita v takových formách, jako jsou kapsle, kapalné roztoky, suspenze nebo elixíry pro orální podání, nebo jako jsou sterilní kapalné formy, jako jsou roztoky nebo suspenze. Výhodně je použit jakýkoliv inertní nosič, jako je salinický roztok, fosfátem pufrovaný salinický roztok nebo jakýkoliv jiný nosič, ve kterém má proteinový fragment nebo peptid nebo konjugát vhodnou rozpustnost. Vakcíny mohou být ve formě jednodávkových prostředků nebo ve formě multidávkových nádob, které mohou být použity pro masivní vakcinační programy. Pro způsoby přípravy a použití vakcín viz Remington's Pharmaceutical Sci^ces, Mack Publishing Company, Easton, PA, Osol (ed) (1980); a New Trends and Developements in Vaccines, Voliér et al., (ed.) (1980), University Park Press, Baltimore,

MD (1978).

Vakcíny podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat adjuvans, které zesiluje produkci protilátek specifických pro • ♦ 4 4« · φ · 4 44

4 4 4 4 * *44 ·· 4 · «4·4 · 4 protein. Mezi taková adjuvans patří, například, různé olejové přípravky jako je Freundovo kompletní adjuvans (CFA), stearyl tyrosin (ST, viz US patent č. 4258029), dipeptid známý jako MDP, saponin (viz US patent č. 5057029) hydroxid hlinitý a lymfatický cytokin.

Freundovo adjuvans je emulse minerálního oleje a vody, která je smísena s imunogenní substancí. Ačkoliv je Freundovo adjuvans účinné, není obvykle podáváno lidem. Místo něj může být u člověka použito adjuvans na bázi kamence (hydroxidu hlinitého) nebo ST. Proteinový fragment nebo peptid nebo konjugát ve vakcínách mohou být adsorbovány na hydroxid hlinitý, ze kterého jsou pomalu uvolňovány po injekci. Vakcina může být také enkapsulována v liposomech podle Fullerton, US patent 4235877.

V jiném výhodném provedení se předkládaný vynález týká způsobu pro indukci imunitní odpovědi u zvířete, při kterém je zvířeti podána vakcina podle předkládaného vynálezu, připravená zde uvedeným způsobem, v množství účinném pro indukci imunitní odpovědi.

Po uvedeném popisu bude vynález dále dokreslen v následujících příkladech, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Klonování a exprese genu kódujícího θβ

Pro lokalizaci vazebného místa pro IgA na θβ proteinu byly syntetizovány dva oligonukleotidy. První oligonukleotid, oligo 1, odpovídá 5' konci zralého proteinu a má sekvenci (SEQ · W ·

ID NO: 8) : 5'-AAGGATCCAAGTGAGCTTGTAAAGGACGAT-3', která obsahuje BamHI místo. Druhý oligonukleotid odpovídá 3' konci genu a má sekvenci (SEQ ID NO: 9) : 5'-AAAACTCGAGTTTCTTTCCGTTGTTGATGTA-3', a obsahuje XhcI místo. Oligonukleotid pro 3' konec genu byl vybrán pro eliminaci LPXTG motivu existujícího ve většině proteinů stěny Gram-pozitivních buněk. Bylo prokázáno, že motiv sekvence se účastní zpracování těchto proteinů buněčné stěny a je čászí těchto proteinů, která se případně kovalentně váže na peptidoglykan (Navarre, W. W. a Schneewind, 0., Molec. Microbiol. 14:115-121 (1994); Schneewind, 0., et al., Science 268:103-106 (1995). Za použití chromosomální DNA kmene A909 streptokoků skupiny B obsahující gen pro 0β protein jako templátu a za použití standardní PCR techniky byl připraven produkt velikcsti přibližně 3,2 kb, jak bylo určeno elektroforesou na 1% agarosovém gelu. PCR produkt obsahující gen pro CP prczein byl potom štěpen restrikčními endonukleasami BamHI a Xhol. Tento BamHI-Xhol DNA fragment obsahoval sekvenci pro celý cp protein s výjimkou posledních 33 aminokyselin na karboxylovém konci, včetně domnělého vazebného místa pro IgA. DNA fragment byl potom ligován do vhodně restrikčně štěpeného T7 expresního plasmidu pET17b (Novagen, lne., Madison WI) za použití standardního T4 ligasového poszupu. Plasmid byl potom transformován do E. coli kmene BL21(DE3) podle návodu výrobce (Novagen, lne.). Buňky E. coli obsahující plasmid byly selektovány na LB plotnách obsahujících 50 μ9/Γη1 karbencilinu. Transformované kolonie byly opatrně přeneseny na nitrocelulosové filtry nasycené IPTG. Po 30 minutách byly bakterie lysovány umístěním filtrů do komůrek s odpařováním chloroformu na dobu 15 minut při teplotě okolí.

Po odstranění filtrů z komůrek byly filtry umístěny, koloniemi nahoru, na Whatman® 3MM filtr, který byl předem nasycen 20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 6 M močovinou a 0,5 M NaCl. Po

dobu 1 hodiny s přečištěným lidským IgA v PBS-Tween®. Filtry se potom znova promyly v PBS Tween® a vyvíjely se standardní technikou (Blake, M.S., et al., Analyt. Biochem. 136: 175-17 (1984)) za použití konjugátu kozí protilátky proti lidskému IgA - alkalické fosfatasy (Cappel Research Products, West Chester, PA). Selektovalo se několik kolonií vykazujících vysokou vazebnou aktivitu pro IgA a tyto se kultivovaly přes noc v 1 ml LB bujónu obsahujícím karbencilin při 30 °C. Kultury se potom ředily 1 ku 100 čerstvým LB-karbencilínovým bujónem a inkubovaly se po dobu 30 minut po dobu dalších 6 hodin. Exprese se potom indukovala přidáním IPTG a kultivace pokračovala po dobu 2 hodin při 3 0 °C. Buňky se odebraly odstředěním a podrobily se několika cyklům zmrazenírozmrazení. Buňky se potom znovu odstředily a supernatanty se uskladnily pro stanovení jejich vazebné afinity pro IgA.

Příklad 2: Identifikace vazebné domény pro IgA na cp

Po přípravě stabilního plasmidu produkujícího rekombinantní Cp protein, který se váže na lidský IgA, se strategie podobná strategii Novatope® systému (Novagen, lne.) použila pro lokalizaci vazebného regionu pro IgA Οβ. Tento postup byl proveden podle návodu výrobce. Stručně, přečištěný plasmid obsahující Οβ gen byl náhodně štěpen DNAsou I a byl zpracován elektroforesou na 2% agarosovém gelu s nízkou teplotou tání. Fragmenty DNA odpovídající velikostem mezi 100 a 300 páry baží se excidovaly z gelu, přečistily se a resuspendovaly se v TE pufru. Jediný dA se přidal k fragmentům za použití doporučené reakční směsi a fragmenty se ligovaly v pETOPET vektoru, který obsahoval jeden dT konec. Po standardní ligační proceduře se plasmidy transformovaly do kompetentních NovaBlue (DE3) buněk (Novagen, lne.) a umístily se na LB plotny obsahující 50 μ9/τη1 karbencilinu. Tyto plotny se potom inkubovaly přes noc při 37 • ·· ·· · · · · ·· ···· · · · · · · ·· * · ···· · · • · ··· · ··· · ··· ·· · ·· ····· ····· ·· · °C. Transformované kolonie se testovaly na vazebnou aktivitu pro IgA, jak bylo popsáno v příkladu 1. Několik se selektovalo podle jejich vazby na IgA. Bakterie z každého z těchto klonů se naočkovaly samostatně na čerstvé LB plotny a retestovaly se na vazbu na IgA způsobem popsaným výše. Z každého klonu se standardním způsobem připravily plasmidové přípravky a ty se sekvencovaly.

Nukleotidové sekvence klonovaných θβ proteinových genových fragmentů se určily dideoxy metodou za použití denaturované dvouřetězcové plasmidové DNA jako templátu, jak je popsáno v literatuře (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N.Y. (1993)) . Sekvenasa II kity (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) se použily podle návodu výrobce. Nejmenší získaný fragment DNA, který obsahoval část θβ genu, je uveden na obr. 1. Translace této sekvence odpovídá aminokyselinám 101 až 230 zralého θβ proteinu uvedeného na obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Pokusy o zkrácení tohoto DNA fragmentu selhaly v získání jakékoliv IgA vazebné aktivity.

Příklad 3: ELISA inhibiční testy: Studie vazby peptidu

Bylo připraveno několik syntetických peptidů odpovídajících aminokyselinové sekvenci obsažené v tomto regionu θβ proteinu. Peptidy byly syntetizovány za použití NMP t-butoxykarbonylové techniky na ABI 4 30A peptidovém syntezátoru (Applied Biosystems, Foster City, CA) a byly zbaveny chránících skupin. Peptidy byly z pryskyřice odstraněny reakcí pryskyřice s HF za přítomnosti anisolu (0 °C/1 hodina). Preparativní přečištěni těchto peptidů bylo provedeno za použití C18 kolony (2,14 ID x 30 cm) (Dynamax, Rainin, Woburn, MA). Peptidy byly kvantifikovány PTC aminokyselinovou analýzou za použití Waters Picotag systému • ·· ·· ···· · · • · « · · · * ··· ·· Φ · «··· 9 · • · ··» 9 · · · · (Waters, Milford, ΜΑ). Syntetizované peptidy eluovaly z C18 kolony jako hlavní pík zahrnující 75-85% celkového elučního profilu. Aminokyselinové složení přečištěných peptidů bylo v souladu se sekvencí, která byla použita pro syntetizování peptidů. Peptidy byly použity v ELISA inhibič^ních testech pro blokování vazby lidského IgA na přečištěný ϋβ protein, za použití následujícího postupu. Mikrotitrační plotny (NuncImmuno Plate IIF, Vangard International, Neptune, NJ) se sřigzibilizovaly přidáním 0,1 ml na jamku přečištěného θβ v koncentraci 2,0 pg/ml v 0,1 M uhličitanovém pufru, pH 9,6 s 0,02% azidem. Plotny se potom inkubovaly přes noc při teplotě okolí. Plotny se promyly 5-krát 0,9% NaCl, 0,05% Brij 35, 10 mM octanem sodným pH 7,0, 0,02% azidem.

Přečištěný lidský IgA myelomový protein se zakoupil od Cappel Laboratories, naředil se v PBS s 0,5% Brij 35, přidal se na plotny a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě okolí. Plotny se potom znovu promyly způsobem popsaným výše a přidala se sekundární protilátka, kozí protilátka proti lidskému IgA konjugovaná na alkalickou fosfatasu (Tágo lne., Burlingame, CA), která se naředila v PBS-Brij, a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě okolí. Plotny se potom promyly způsobem popsaným výše a přidal se p-nitrofenylfosfat (Sigma 104® fosfatasový substrát) (1 mg/ml) v 0,1 M diethanolaminu, 1 mM MgC12, 0,1 mM ZnC12, 0,02% azid, pH 9,8. Plotny se potom inkubovaly při 37 °C po dobu 1 hodiny a absorbance při 405 nm se určila za použití Elida-5 čtečky mikroploten (Physica, New York, NY). Kontrolní jamky neobsahovaly buď primární, nebo sekundární protilátku. Tento postup se provedl pro stanovení titru lidského IgA myelomového proteinu, který povede k polovině maximálního výsledku v ELISA testu. Tento titr byl použit v inhibiční ELISA. Mikrotitrační plotny se senzibilizovaly a promyly se způsobem popsaným výše. Přidaly se přečištěné lidské peptidy a naředily se v PBS-Brij. Potom se přidalo ředění lidského • ·· ······ ·· · ··· · · ·· · ··· • * · · ···· · · · ·····* ···· · ··· ·· · ··· ··· «· · · ♦·· · · · · ·

IgA myelomového proteinu, které dávalo polovinu maximální výsledku. Směs se potom inkubovala po dobu 1 hodiny při teplotě okolí. Plotny se znovu promyly a přidala se konjugovaná druhá protilátka, jak bylo uvedeno výše. Plotny se potom zpracovaly a odečítaly způsobem popsaným výše. Procento inhibice se vypočítalo následujícím způsobem:

1-(výsledek ELISA s přidaným peptidem)/(výsledek ELISA bez přidaného peptidů)

Peptid inhibující v tomto ELISA testu obsahoval sekvenci Asn-His-Gln-Lys-Ser-Gln-Val-Glu-Lys-Met-Ala-Glu-Gln-Lys-Gly (SEQ ID NO: 10). Předpokládá se, že alespoň část vazebné domény pro IgA na θβ je obsažena v regionu proteinu obsahujícím tuto sekvenci.

Příklad 4: Oligonukleotidy řízená mutagenese genu kódujícího

Οβ

Pro potvrzení důležitosti tohoto regionu v Οβ proteinu pro vazbu na IgA a pro zahájení příprav mutantních proteinů, které budou nakonec použity ve vakcínách, byl použit modifikovaný Ex-Site® protokol pro PCR místně cílenou mutagenesi, jak byl vyvinut ve Stratagene (Stratagene, CA). Použitým templátem byl plasmid označený pNV222, který obsahoval ΰβ gen insertovaný do pSP76 vektoru (Promega, Madison, M). DNA oligonukleotidy byly syntetizovány na Applied Biosystems model 292 DNA Synthesizer (Foster City, CA). Oligonukleotidy byly manuálně odštěpeny z kolony reakcí s 1,5 ml hydroxidu amonného po dobu 2 hodin s jemným míšením každých 15 minut. Chránící skupiny byly odstraněny při 55 °C během 1618 hodin. Po odstranění chránících skupiny byly oligonukleotidy sušeny a byly použity přímo nebo popřečištění na kolonách pro přečištění oligonukleotidů (Applied Biosystems, Foster City, CA). Bylo připraveno několik různých • · • « oligonukleotidů pro indukci různých změn v DNA sekvenci vybraného regionu. Příklad je uveden dále. PřiměřM v tomto příkladu byly překrývající se primery, oba obsahující sekvenci nutnou pro změnu lysinu na alanin v aminokyselinách 170 a 175 sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2). Primer ve směru kódující sekvence, označený θβ613, měl sekvenci (SEQ ID NO: 6) 5'-GTT GAA GCA ATG GCA GAG CAA GCG GGA ATC ACA AAT GAA G-3’, a reverzní primer, označený θβ 642R, měl sekvenci (SEQ ID NO: 7) 5'-GAT TCC CGC TTG CTC TGC CAT TGC TTC AAC TTG ACT

TTT TTG-3' (substituce jsou uvedeny tučně). Reakční podmínky byly následující: 10 ng pNV222 templátu, 15 pmol každého primeru, 1 mM každého dNTP, 1 x Vent polymerasový pufr (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM KC1; 10 mM (NHíhSO^· 2 mM MgSO₄, 0,1% (obj./obj) Triton X-1OO; 0,1 mg/ml hovězí sérový albumin (BSA) ) , 10 jednotek Vent polymerasy a H2O do 100 μΐ. Reakce byly provedeny s PCR Gem 10 voskovými korálky, jako v Hot Start Protocolu (Perkin Elmer, Foster City, CA). Reakce byly provedeny na Perkin Elmer® Thermocycler (Perkin Elmer, Foster City, CA) za následujících podmínek: 1 cyklus 94°C po dobu 5 minut; 10 cyklů 94 °C po dobu 30 sekund, 37°C po dobu 2 minut, 72°C po dobu 10 minut; 30 cyklů 94°C po dobu 30 sekund, 55°C po dobu 2 minut, 72 °C po dobu 10 minut; a 1 cyklus 72 °C po dobu 12 minut. Reakční směs se zpracovala 10 jednotkami DpnI při 37 °C pro destrukci templátové DNA a potom během 60 minut při 72 °C Pful polymerasou pro doplnění jakýchkoliv přesahujících konců. Reakční směs se naředila 1:4,6 Vent polymerasovým pufrem plus 0,38 mM dATP. Ředěná reakční směs se ligovala po dobu 24 hodin při 25°C a transfTQomovala se do kompetentních DH5ct buněk (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) .

Selektované kolonie se kultivovaly ve 3 ml LB plus kanamycin (50 mg/ml) při 37 °C po dobu 16-18 h . DNA se připravila za použití QIAspin® kolon (Qiagen, Chatsworth, CA). Klony se analyzovaly na velikost insertu na 0,8% agarosových gelech a potom se sekvencovaly. Selektované klony se potom kultivovaly • · • · · * 44 · · · · ·· • · · · · · 444 • •44· • C 4 4· po dobu 16-18

100 (Qiagen, ve 100 ml LB plus kanamycin (50 mg/ml) při 37°C hodin. DNA se připravily za použití Qiagen® tip Chatsworth, CA). Tyto DNA se štěpily Ndel a Psfl a zpracovaly se na 0,8% agarosových gelech pro separování mutovaného regionu. Izoloval se 2300 bp fragment a přečistil se z gelu za použití Gene-Clean Spin Kitu (Bio 101. Vista, CA). Klon označený pNV34, který se skládal z expresního vektoru pET 24a (Novagen, lne.) a přirozeného cp gene, se také štěpil Ndel a Pstl a zpracoval se na 0,8% agarosovém gelu. Větší proužek (6300 bp) obsahující pET vektor a zbytek cp genu se izoloval a přečistil se za použití Gene-Clean Spin Kitu® (Bio 101). Tyto dva fragmenty se ligovaly při 4 0C během 24 hodin a transformovaly se do kompetentních BL21 (DE3) buněk. Selektované kolonie se kultivovaly ve 3 ml LB plus kanamycin (50 mg/ml) při 37°C po dobu 16-18 hodin. DNA se připravily za použití QIAspin® kolon (Qiagen) a klony se analyzovaly na velikost insertu na 0,8% agarosových gelech.

Také se připravily klony kódující mutantní CP proteiny, ve kterých byly dva glutaminové zbytky nahrazeny prolinovými zbytky a ve kterých delece v cp genu vedla k deleci 6 aminokyselin ve vybraném regionu (tabulka 1).

Klony exprimující cp protein, které neměly nebo měly sníženou vazebnou aktivitu pro IgA, ale které stále ještě reagovaly s anti-Pag antisérem, byly selektovány (příklad 5) a kultivovány ve 100 ml LB plus kanamycin (50 mg/ml) při 37°C po dobu 16-18 hodin. Plasmidová DNA z těchto klonů se připravila za použití Qiagen® tip 100 (Qiagen) a mutovaný Cp gen se zcela sekvencoval.

Příklad 5: Westernový přenos a ELISA analýza vazby cp mutantů na IgA • «· «· «··· « · · ♦ · « · ··· t ·· · • · · · ···· · «· • · · * · » ··· ·« • ·» · · · ·«· • · · · · · · «·· ·· ···

Proteiny kódované mutovanými geny byly exprimovány a zpracovány SDS-PAGE a westernovým přenosem pro určení toho, zda mutace v genu kódujícím Cp protein snižují nebo eliminují vazbu na IgA, za zachování CP antigenicity. Pro každý vzorek byly připraveny dva westernové přenosy a reagovaly buď s přečištěným IgA myelomovým proteinem nebo s hyperimmuním králičím antisérem proti Pag proteinu. Klony exprimující Cp protein, ve kterém byl lysin změněn na alanin v aminokyselinách 170 a 175 v sekvenci uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2) nevykazoval téměř žádnou vazebnou aktivitu pro IgA, ale schopnost proteinu reagovat s anti-cP antisérem zůstávala vysoká. Vazebná aktivita pro IgA byla také v podstatě eliminována v klonu exprimujícím CP protein, ve kterém byly dva glutamylové zbytky nahrazeny prolinovými zbytky a v kolnu kódujícím CP protein mající deleci šesti aminokyselin (tabulka), zatímco reaktivita s anti-CP antisérem zůstávala vysoká pro oba tyto klony. Data pro klon s deleci šesti aminokyselin naznačují, že zbytky odpovědné za vazbu na IgA CP protein jsou umístěny v tomto regionu proteinu a že jiné možné mutace v této oblasti budou ovlivňovat vazebnou aktivitu pro IgA.

Kompetitivní inhibiční ELISA byla použita pro přesnější stanovení významu antigenních a/nebo strukturálních změn modifikací sekvence na CP protein. Mikrotitrační plotny (NuncImmuno Plate IIF, Vangard International, Neptune, NJ) byly senzibilizovány přidáním 0,1 ml na jamku přečištěného CP v koncentraci 2,0 μg/ml v 0,1 M uhličitanovém pufru, pH 9,6 s 0,02% azidem. Plotny se potom inkubovaly přes noc při teplotě okolí. Plotny se promyly 5-krát 0,9% NaCl, 0,05% Brij 35, 10 mM octanem sodným pH 7,0, 0,02% azidem. Hyperimuní králičí antisérum k CP proteinu se naředilo v PBS s 0,5% Brij 35, přidalo se na plotnu a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě okolí. Plotny se potom znovu • · • · · ·

protilátka, kozí protilátka proti králičímu IgG konjugované na alkalickou fosfatasu (Tágo lne., Burlingame, CA), která se naředila v PBS-Brij, a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě okolí. Plotny se potom promyly způsobem popsaným výše a přidal se p-nitrofenylfosfat (Sigma 104® fosfatasový substrát) (1 mg/ml) v 0,1 M diethanolaminu, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,02% azidu, pH 9,8. Plotny se potom inkubovaly při 37 °C po dobu 1 hodiny a absorbance při 405 nm se určila za použití Elida-5 čtečky mikroploten (Physica, New York, NY). Kontrolní jamky neobsahovaly bud' primární a/nebo sekundární protilátku. Tento postup se provedl pro stanovení titru králičího antiséra k Cp proteinu, který povede k polovině maximálního výsledku v ELISA testu. Tento titr byl použit v inhibiční ELISA. Mikrotitrační plotny se senzibilizovaly a promyly se způsobem popsaným výše. Přidaly se přečištěné cp proteiny nebo mutace Cp proteinů a naředily se v PBS-Brij. Potom se přidalo ředění králičího séra proti Οβ proteinu, které dávalo polovinu maximální výsledku. Směs se potom inkubovala po dobu 1 hodiny při teplotě okolí. . Plotny se znovu promyly a přidala se konjugované druhá protilátka, jak bylo uvedeno výše. Plotny se potom zpracovaly a odečítaly způsobem popsaným výše. Procento inhibice se vypočítalo následujícím způsobem:

1-(výsledek ELISA s přidaným peptidem)/(výsledek ELISA bez přidaného peptidu)

V tomto testu byla inhibice přirozeného Οβ proteinu od streptokoků srovnávána s rekombinantnim CP proteinem a mutanty obsahujícími změny glutaminu na prolin, které byly exprimovány v E. coli (data nejsou uvedena). Tento test je dostatečně citlivý pro detekci nepřítomnosti transmebránového regionu v rekombinantních cp proteinech. Nicméně, když je rekombinantní Οβ protein obsahující přirozenou sekvenci srovnáván se substitučními mutanty bez vazby na IgA, jsou antigenní rozdíly minimální. Toto ukazuje, že každý substituční mutant si zachovává většinu antigenního charakteru θβ protein, ale nemá nežádoucí vazebnou aktivitu pro IgA.

Příklad 6: Počáteční separace rekombinantního θβ proteinu z E. coli

Buněčné pasty se resuspendovaly v chladném pufru pro desintegraci buněk (5 mM Tris(HCI), pH 7,6-7,8, obsahující 5 mM DTT, 0,2 mg/ml EDTA a PEFABLOC PLUS® proteasový inhibitor (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)). Buněčná suspenze se dvakrát protlačila přes Stansted® přístroj pro desintegraci buněk a potom se odstředila při 12000 x g po dobu 30 minut. Supernatant se dekantoval a neproteinový materiál se vysrážel přidáním ethanolu/CaC12 v konečné koncentraci 20% ethanolu/0,1 M CaC12.

Proteiny se vysrážely 80% ethanolem po separaci odstředěním při 10000 x g po dobu 30 minut a potom se solubilizovaly v pufru obsahujícím 5% Zwitergent® 3,14,25 mM Tris(HCl) a 5 mM DTT, pH 7,6-7,8.

Přiklad 7: Počáteční separace θβ proteinu ze S. agalactiae

Přirozený Cβ protein se získal z membrány Streptococcus agalactiae varem bakterií v pufru obsahujícím 5% Zwitergent® 3,14,25 mM Tris(HCI) a 5 mM DTT, pH 7,6-7,8. Po varu se suspenze ochladila na teplotu 0 až 10 °C v ledové lázni a potom se přidal chladný (0 °C - 4 °C) roztok ethanolu/CaC12 v konečné koncentraci 20% ethanolu/0,1 M CaC12. Roztok se projasnil odstředěním, po kterém se proteiny vysrážely ze supernatantu 80% ethanolem. Proteiny se resolubilizovaly · * * · · · ··· • · · · · · · · · · • · ··· · »·· k v pufru obsahujícím 5% Zwittergent®, 25 mM Tris(HCl), 5 mM

DTT a PEFABLOC PLUS® proteasový inhibitor (Boehringer

Mannheim Corporation, Indianapolis, IN), pH 7,6-7,8.

Příklad 8: Přečištění Οβ proteinu

Optimálně by koncentrace proteinu v 5% Zwittergent/ Tris pufru měly být mezi 0,5-0,8 mg/ml před aplikací do Pharmacia High Perfomance Q® kolony (1,6 x 20 cm). Pro eluci θβ proteinu se použil lineární gradient od 0-0,1 M NaCl v 25 mM Tris(HC1)/0,5% Zwittergent® 3,14, pH 7,6-7,8. Také se mohl použít krokový gradient 0, 50, 75, a 90 mM NaCl v Tris/Zwittergent® pufru a θβ protein eluoval při 75 mM NaCl. Alternativně mohl být θβ protein eluován za použití 60 mM NaCl/0,6% CHAPS v Tris(HCl), pH 7,6-7,8, po promytí kolony v 50 mM NaCl/Tris(HC1)/0,5% Zwittergent® pufru. Οβ protein bude eluovat při nižší koncentraci soli při aplikaci většího množství proteinu do kolony. SDS-PAGE byla použita pro identifikaci θβ frakcí z Q® kolony. Tyto frakce byly sloučeny a přidal se PEFABLOC PLUS® proteasový inhibitor (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Proteinový soubor potom 3-násobně naředil, tj. jeden díl proteinového materiálu na dva díly ředidla (obj./obj.) obsahujícího 15% Zwittergent® 25 mM Tris(HCl) a 5 mM DTT, pH 7,6-7,8. Protein se potom aplikoval do Pharmacia High Performance Heparin Sepharose® kolony (1,6 x 20 cm). Οβ protein byl eluován za použití lineárního gradientu solí (0 -0,1 M NaCl ve 25 mM Tris(HC1)/0,5% Zwittergent®. Obecně, Cβ protein mohl být eluován z heparinové kolony za použití stejných pufrů a gradientů jako pro Q® kolonu. Obr. 1 ilustruje eluční profily Q® a heparinové kolony. Obr. 3A a 3B ukazují data pro přečištění a příslušné SDS-PAGE analýzy.

Pokud byla ve druhé chromatografické separaci použita ·· ·· · · · · · · · ··· ·· · · · · · • · · · ··· · · · • ······ ·· · · · · ·· ··«· ··· • · · · ·· · ·· · · ·

gelová filtrační kolona, byly frakce z Q® kolony obsahující Οβ protein vysráženy přidáním absolutního ethanolu k konečné koncentraci 80% ethanolu. Vysrážené proteiny se získaly odstředěním a resolubilizovaly se v minimálním objemu 25 mM HEPS, 1M NaCl, 5 mM DTT, pH 8,0 s 10% Zwittergent®. Rozpuštěný vzorek se aplikoval do gelové filtrační kolony předem uvedené do rovnováhy ve stejném pufru, ale bez Zwittergent® a DTT pro rekombinantní proteiny, a s Zwittergent® pro přečištění přirozeného proteinu.

Příklad 9: Štěpení Οβ proteinu proteasou a izolace fragmentů

Přečištěný Εβ protein (6,0 - 8,0 mg/ml) v Dulbeccově PBS (Life Technolcgies, Gaithersburg, MD) se štěpil přidáním 0,025 ml 10 mg/ml roztoku termolysinu (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ve 2 0 mM CaCl₂. Reakční směs se inkubovala při 60 °C přes noc s konstantním třepáním. Proteasová aktivita se potom ukončila přidáním 10 mM EDTA (obr. 4A a 4B).

Nejprve vytvořil termolysin peptidové fragmenty TI a T2 (molekulové hmotnosti 35 kDa, resp. 25 kDa) , které byly separovány elektroforesou, byly přeneseny na nitrocelulosu, barveny Ponceau S a potom získány rozpuštěním membrány v acetonitrilu (obr. 5). Po rozpuštění membrány se peptidové fragmenty vysrážely ledově chladným acetonem a odebraly se odstředěním. Po odstředění se peptidové sraženiny rozpustily v PBS a testovaly se na inhibici baktericidní aktivity způsobem podle Fusco et al., Adv. Exp. Med. Biol. 418: 841-845 (1997). Podíly proteinu vysráženého acetonem se také zpracovaly na SDS gelech pro potvrzení zisku proteinu.

Pro zvýšení množství proteinu pro další štěpení se termolysinové fragmenty vysrážely 80% ethanolem a odebraly se odstředěním. Peleta se resolubilizovala v 1-3 ml 10 mM

Tris(HCl)/10 mM CaCl₂, 10% glycerolu, pH 7,2 a aplikovala se do Sephacryl®-100 kolony (1,6 x 40 cm) uvedené do rovnováhy v ml 10 mM Tris (HC1)/10 mM CaCl₂, pH 7,2 (obr. 6).

Izolovaný peptidový fragment Tl se dále štěpil za použití endoproteasy Arg-C z Clostridium histolyticum (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Produkt štěpení Arg-C se testoval na inhibicí baktericidní aktivity. Fragmenty označené R1 a R2 se potom separovaly chromatofokusováním na Mono P® koloně za použití Polybuffer® 74 (Pharmacia, Piscataway, NJ)(obr. 7).

Inhibice baktericidní aktivity za použití neseparovaných termolysinových fragmentů Tl a T2 ukázala 50% inhibicí při koncentraci proteinu 36 μ9/ιη1. Když byly termolysinové fragmenty Tl a T2 separovány a získány elektroforesou a westernovým přenosem, byla zjištěna 50% inhibice baktericidní aktivity při 15 μ9/πι1 a 20 μ9/ιη1 pro Tl, resp. T2 fragment. Tl a T2 peptidy v koncentraci 18 μ9/πι1, resp. 4 0 pg/ml, vedly ke 100% inhibici. Výtěžek Tl peptidu po štěpení Arg-C byl minimální. Koncentrace proteinu pro Arg-C štěpené fragmenty nebyla stanovena. Nicméně, 50% inhibice baktericidní aktivity byla získána při ředění vzorku 1:50. Tato aktivita byla srovnávána s Tl peptidovou frakcí separovanou gelovou filtrací. Tato Tl frakce vykazovala 50% inhibici při 2,5 pg/ml.

Sekvence N-konce pro dva hlavní peptidové fragmenty z termolysinového štěpení Tl a T2 se zřetelnou molekulovou hmotností přibližně 35 kDa a 25 kDa byla získána SDS-PAGE na tricinových gelech, přenesených na PDVF membrány v 10 mM CAPS/10% methanolu, barvením 0,1% Ponceau S v 1% kyselině octové, odbarvením v 5% kyselině octové a důkladným promytím ve vodě za víření. Dobře usušené PDVF části se excidovaly a odeslaly se do MA BioServices® (Rockville, MD) pro

sekvencování.

Analýza sekvence fragmentů získaných štěpením termolysinem určila N-konec TI - VEQDQPAPIPENSE (SEQ ID NO: 52). Pro T2 peptid byl N-konec LAANENNQQKIELTV (SEQ ID NO: 53) . TI peptidový fragment je bližší C-konci Οβ proteinu než T2 peptidový fragment (obr. 8).

Příklad 10: Syntéza peptidů

Chiron Mimotopes Multipin Non-Cleavable Peptide Kit (Chiron Mimotopes, Raleigh, NC) se použil pro syntézu Οβ mutantních peptidů. Počítačový program dodaný s kitem se použil pro přípravu kontinuálních 8-měrových peptidů s překrývajícími se sekvencemi 4 aminokyselinových zbytků za účelem stanovení obecných regionů vazbu na protilátku. Syntéza peptidů využívala FMOC chráněných aminokyselin a DIC/HOBt pro aktivaci aminokyselin, podle návodu výrobce. Chránící skupiny pro vedlejší řetězec byly odstraněny a N-konce peptidů byly acetylovány. Předběžné výsledky ELISA pro 8-měrové peptidy ukazovaly na region vazby na protilátky. Syntetizovaly se 20merové peptidy s překrývajícími se sekvencemi a tyto se použily pro potvrzení počátečních výsledků.

24-měrový peptid, PDVPKLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 47), se také syntetizoval peptidovou syntézou na pevné fázi, štěpil se a přečistil se za zisku peptidů v řádu multimiligramú (Protein/DNA Technology Center, Rockefeller University, NY). Tento peptid se použil v ELISA inhibičních testech.

Pro ELISA se mimotopové hroty blokovaly v 2% BSA/PBS-0,1% Tween® (polyoxyethylensorbitan) (PBS-T) po dobu 30 minut. Po promytí hrotů v alespoň pěti výměnách PBS-T se hroty jemně •9 9999 ·

třepaly v ředěni 1:20000 polyklonálni králičí protilátky 52.2 v 0,05% BSA/PBS T po dobu 1,5 hodiny. Hroty se opět promyly v alespoň pěti výměnách PBS-T a potom se mísily v ředění 1:2000 anti-králičí protilátky konjugované s alkalickou fosfatasou v 0,2% fetálním hovězím séru/PBS-T.

ELISA plotny se vyvíjely v SIGMA 104® fosfatasovém substrátu (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) v diethanolaminovém pufru. Plotny se vyvíjely za konstantního třepání při teplotě okolí po dobu 1 hodiny a potom se odečítaly při 405 nm na čtečce ploten.

Výsledky ELISA ukázaly, že většina vazby protilátky byla namířena proti repetitivní sekvenci lokalizované poblíž Ckonce proteinu. Repetitivní sekvence existuje v Cp proteinu jako PDVPKLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 47). 8-merové sekvence PDVPKLPD (SEQ ID NO: 33), KLPDVPKL (SEQ ID NO: 34), VPKLPDVP (SEQ ID NO: 35), KLPDAPKL (SEQ ID NO: 36) byly odpovědné za většinu vazby protilátky (obr. 9A).V menším rozsahu byla určitá vazba protilátky namířena proti 8-merovým sekvencím ETPDTPKI (SEQ ID NO: 38), RTVRLALG (SEQ ID NO: 39), a GGGTVRVF (SEQ ID NO: 40). Syntetizované 20-merové peptidy připravené pro verifikaci vazby protilátky měly sekvence: SPKTPEAPKIPEPPKTPDVP (SEQ ID NO: 41), PEAPKPEPPKTPDVPKLPD (SEQ ID NO: 42), KIPEPPKTPDVPKLPDVPKL (SEQ ID NO: 43), PPKTPDVPKLPDVPKLPDVP (SEQ ID NO: 44), PDVPKLPDVPKLPDVPKLPD (SEQ ID NO: 45) a KLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 46) (obr. 9B) .

Příklad 11: Inhibice ELISA θβ proteinem a syntetickým peptidem ml ředění 1:20000 polyklonálni králičí protilátky 52.2 v 0,05% BSA/PBS-T obsahujícím 0,1 mg/kg rekombinantního CP proteinu se inkubovalo po dobu 30 minut před testováním hrotů na vazbu protilátky, jak bylo popsáno výše. Výsledky ELISA ukázaly inhibici vazby protilátky na hroty obsahuj/cí sekvence PDVPKLPD (SEQ ID NO: 33), KLPDVPKL (SEQ ID NO: 34), VPKLPDVP (SEQ ID NO: 35), KLPDAPKL (SEQ ID NO: 36). Nicméně, určitá vazba protilátky byla přítomna pro sekvenci RTVRLALG (SEQ ID NO: 39).

V inhibičních pokusech za použití syntetického peptidu PDVPKLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 47), byly 8-merové a 20merové hroty blokovány v BSA. Ve stejnou dobu se 20 ml ředění 1:20000 52.2. anti-Bag králičí protilátky v 0,05% BSA/0,1% Tween®-PBS inkubovalo po dobu 30 minut s (0,1 mg/ml) syntetického peptidu (Protein/DNA Technology Center, Rockefeller University, NY) před testováním hrotů na vazbu protilátky, jak bylo popsáno výše. Jedna sada dvojích 20merových hrotů sloužila jako pozitivní kontrola pro protilátku nevystavenou působení syntetickému peptidu.

Výsledky ELISA ukázaly inhibici vazby protilátky na hroty se sekvencemi PDVPKLPD (SEQ ID NO: 33), KLPDVPKL (SEQ ID NO: 34), VPKLPDVP (SEQ ID NO: 35), KLPDAPKL (SEQ ID NO: 36). Znovu byla pozorována vazba protilátky se sekvencemi ETPDTPKI (SEQ ID NO: 38) a o něco méně s RTVRLALG (SEQ ID NO: 39). Vazba protilátky na 20-merové hroty byla inhibována podobně. Hroty pro pozitivní kontrolu ukázaly vazbu protilátky pro srovnání (obr. 10).

Příklad 12: Baktericidní inhibiční testy pro určení toho, která konkrétní repetitivní aminokyselinová sekvence na θβ vyvolává vazbu protilátky

Králíci byly vakcinováni syntetickým peptidem navázaným na tetanický toxoid pro vyvolání tvorby specifické protilátky k regionu Οβ. Byla získána a přečištěna specifická protilátka proti sekvenci PDVPKLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 48) a • ·· ·· ··»· «· · ···· · * » · · ·· ··« ····· · · · • · ··· · ··· · · ··· ·· · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ··· tato protilátka byla schopna usmrcovat GBS (streptokoky skupiny B) typu Ib. Toto zabíjení bylo srovnáváno s baktericidní aktivitou králičího antiséra k přirozenému θβ holoproteinu.

Materiály a metody

Navázání peptidů na proteinový nosič

Peptidy byly syntetizovány The Rockefeller University

Protein Sequencing Facility za použití NMP t-butoxykarbonylové metody na ABI 430A peptidovém syntezátoru (Applied Biosystems, Foster City, CA). Peptidy byly zbaveny chránících skupin a byly odštěpeny z pryskyřice reakcí s HF za přítomnosti anisolu (0 °C/1 hodina). Preparativní přečištění každého peptidů bylo provedeno na C18 koloně (2,14 ID x 30 cm) (Dynamax-Rainin, Woburn, MA) . Peptidy byly kvantifikovány PTC aminokyselinovou analýzou za použití Waters Picotag systému (Waters, Milford, MA). Syntetizované peptidy eluovaly z C18 kolony jako hlavní pík tvořící více než 95% celkového elučního profilu.

Aminokyselinové složení přečištěných peptidů dobře odpovídalo sekvenci. Analýza hmotnostního spektra (MALDI-TOF), provedená za použití Perseptive Biosystems® DERP Mass Spectrometru pracujícího v lineárním modu za použití kyseliny ahydroxyskořicové jako matrice, určila hmotnost peptidů 2677 kDa, což je v dobrém souladu s vypočítanou molekulovou hmotností přibližně 2658 kDa.

Přibližně 26 mg syntetického peptidů,

SPDVPKLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 49) (označeného Serpeptid), rozpuštěného v 1,5 ml deionizované vody, se citrakonylovalo (Atassi, M.Z. and Habeeb, A.F.S.A., Reaction of proteins with citraconic anhydride v: Methods in Enzymology, Vol. XXV Enzyme Structure Part B, od Hirs, C.H.W.

a Timasheff, S.N., New York, Academie Press, str. 546-533 (1972) přidáním 60 μΐ anhydridu kyseliny citrakonylové v 15 μΐ podílech ve 30 minutových intervalech při teplotě okolí. pH reakční směsi se udržovalo na pH 8 titrací s 5 M NaOH. Reakce pokračovala po dobu 1 hodiny po posledním přidání anhydridu kyseliny citrakonylové a potom se roztok do vyčerpání dialyzoval proti 0,2 M Na₂HPO₄, pH 8,5, za použití 100 MWCO dialyzační trubice.

Serinový zbytek na peptidu se potom oxidoval ve tmě při teplotě okolí po dobu 10 minut za použití 2,2 mg jodistanu sodného (Geoghegan, K.F. a Stroh, J.G., Site-directed conjugation of non-peptide groups to peptides and proteins via periodate oxidation of a 2 amino-aleohol - Application to modification at N-terminal serine, Bioconjugate Chem., 3: 138-146 (1992). Reakce se ukončila přidáním 20 μΐ ethylenglykolu s konstantním míšením po dobu 30 minut a potom se roztok do vyčerpání dialyzoval proti 0,2 M Na₂HPO₄, pH 8,5.

Přečištěný monomer tetanického toxoidu (Statens Seruminstitut, Copenhagen S., Denmark) se rechromatografoval na Superdex® 200. Serinový peptid se navázal na 15 mg tetanického toxoidu redukční aminací za použití 13 mg kyanborohydridu sodného. Reakce pokračovala přes noc při 37 °C a potom se reakční směs do vyčerpání dialyzovala proti kyselině citronové-vodě (pH 4,2) pro odstranění chránících skupin na lysinových zbytcích peptidu. Získalo se přibližně 8 mg produktu (podle gravimetrické analýzy, která zahrnovala nenavázaný peptid). Navazování se sledovalo pomocí HPLC za použití Superdex® peptidové kolony, injikováním podílů peptidu, tetanického toxoidu a směsi peptidu a tetanického toxoidu po vazbě. Potom se konjugát dialyzovaný za použití 12000-14000 MWCO dialyzačních trubic pro odstranění nenavázaného peptidu testoval ELISA. Mikrotitrační plotna se

potáhla 1 μς Ser-peptidového konjugátu při 4 °C přes noc. Polyklonální králičí 52.2 primární protilátka se použila v ředění 1:20000 v PBS-T a potom se použil konjugát alkalická fosfatasa-sekundárni kozí anti-králičí protilátka (ICN, Costa Mesa, CA) v ředění 1:2000 v PBS-T. ELISA plotny se vyvíjely v SIGMA 104® fosfatasovém substrátu v 1 M diethanolaminovém pufru/0,5 mM MgC12, pH 9,8. Plotny se odečítaly při 405 nm na čtečce ploten (Dynex Technologies, lne., Chantilly, VA).

Protilátka proti Ser-peptidu

Bíle králíci New Zealand se imunizovali v den 0 100 μg směsi navázaného a nenavázaného peptidu ve Freundově kompletním adjuvans. V den 21 a 42 se králíci znovu imunizovali 100 μg směsi ve Freundově nekompletním adjuvans. Krev se králíkům odebrala v den 51. Po získání králičího antiséra se provedla ELISA potažením 96-jamkové ELISA plotny 2 μg/ml ϋβ proteinu, potom ředěním protilátky proti serpeptidu od 1:1000 s dvojnásobnými ředěními, za účelem získání titrů.

Dále, pro hodnocení specificity vazby protilátky se mimotopové hroty representující 8-merové sekvence celé θβ molekuly blokovaly ve 2% BSA/PBS-T po dobu 30 minut. Po promytí se hroty inkubovaly s ředěním 1:20000 protilátky proti Ser-peptidu po dobu 1,5 hodiny. Hroty se znovu promyly a inkubovaly se s ředěním 1:2000 anti-králičí protilátky konjugované s alkalickou fosfatasou po dobu 1,5 hodiny. ELISA plotny se vyvíjely v SIGMA 104® fosfatasovém substrátu v 1 M diethanolaminovém pufru/0,5 mM MgCl₂, pH 9,8. Plotny se odečítaly při 405 nm na čtečce ploten.

Přečištění králičí protilátky proti Ser-peptidu • 4 4 ·« »»·· ··

M t » 4 · ♦ ·· € 4 · ··< 4· ·· 444 4 4··4 mg tetanického toxoidu se rozpustilo v 7 ml 0,2 M NaHCCp/0,5 M NaCl, pH 8,3 a toxoid se navázal na 5 ml HiTrap® NHS-aktivovanou afinitní kolonu (Pharmacia, Piscataway, NJ) recyklováním po dobu 4 hodin při teplotě okolí za použití peristaltické pumpy. Po promytí a deaktivaci, provedené podle doporučení výrobce, se kolona uvedla do rovnováhy v PBS a potom se 20 ml králičího séra k ser-peptidu aplikovalo do kolony. Odebraly se frakce z kolony a testovaly se za použití mimotopových hrotů representujících N- a C-koncové sekvence θβ. Imunoglobuliny G byly přečištěny za použití Immunopure® G kolony (Pierce, Rockford, IL). Frakce eluující z kolony v pufru s nízkým pH se neutralizovaly a odsolily se na 5 ml HiTrap® odsolovací koloně (Pharmacia, Piscataway, NJ) před opětovným testování vazebné specificity protilátky na mimotopových hrotech představujících N- a C-konce θβ.

Baktericidní aktivita protilátky proti Ser-peptidu

Test na protilátkovou a komplementem zprostředkovanou baktericidní aktivitu byl proveden způsobem podle Fusco et al. Bactericidal activity elicited by the beta C protein of Group B streptococci contrasted with capsular polysaccharides, Adv. Exp. Med. and Biol. 418: 841-845 (1997). Srovnání bylo provedeno mezi zabíjením: (1) protilátkou k přirozenému θβ proteinu; (2) protilátkou proti Ser-peptidu přečištěnou tetanickou kolonou; a (3) protilátkou proti Ser-peptidu přečištěnou tetanickou kolonou a potom Protein G kolonou. Peptid PDVPKLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 48) se použil pro inhibici baktericidní aktivity těchto protilátek proti Serpeptidu .

Přenosy GBS kolonií pro sondování vazby protilátky proti Serpeptidu

GBS kolonie byly přeneseny z čokoládového agaru na kulaté nitrocelulosové disky, byly promyty v PBS-Tween® a potom byly inkubovány po dobu 1,5 hodiny buď s protilátkou proti Serpeptidu přečištěnou na tetanické koloně v ředění 1:10000 a 1:20000 nebo s protilátkou proti Ser-peptidu přečištěnou na Protein G koloně v ředění 1:3000 a 1:6000. Po několika promytích v PBS-Tween® se nitrocelulosové disky inkubovaly po dobu 1,5 hodiny s kozí anti-králičí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatasou a potom se vyvíjely za použití NBT/BCIP substrátu (Blake, M.S. et al., A rapid sensitive method for detection of alkaline phosphatase conjugated antiantibodies on western blots, Anal. Biochem., 136: 175-179 (1984)), po promytí v substrátovém pufru (0,1 Tris/Ο,ΙΜ NaCl/1 mM MgCÍ2) .

Výsledky a diskuse

Vazba peptidu na proteinový nosič

Bylo nutné citrakonylovat lysinové zbytky na Ser-peptidu pro zabránění vazby těchto peptidů na sebe navzájem místo na tetanický toxoid. Po dialýze ELISA analýza ukázala, že 52.2 protilátka rozpoznávala konjugát tetanus-Ser-peptid.

Protilátka k Ser-peptidu

Výsledky ELISA testu se Ser-peptidovou protilátkou k 8merovým mimotopovým sekvencím Cp ukázaly, že protilátka rozpoznávala sekvenci PDVPKLPD (SEQ ID NO: 50) pouze na bloku hrotů představujících karboxy-koncovou část θβ. Několik sekvencí umístěných poblíž N-konce θβ také dávalo pozitivní signály v ELISA. Předpokládá se, že protilátky namířené proti tetanickému konjugátu zkříženě reagují s N-koncovou sekvencí θβ a tato reaktivita byla eliminována zpracováním antiséra na

tetanické afinitní koloně.

Přečištění Ser-peptidové protilátky

Vazba protilátky na N-koncové sekvence byla eliminována po zpracování antiséra na tetanické koloně. Protilátka se vázala specificky na sekvenci PDVPKLPD (SEQ ID NO: 50). Další přečištění ser-peptidové protilátky na Protein G koloně dále přečistilo IgG a byla zachována afinita k sekvenci PDVPKLPD (SEQ ID NO: 50).

Baktericidní aktivita ser-peptidové protilátky

50% přežívání bakterií se vyskytuje při ředěních antiséra vyšších než 1:5500 pro 52.2 protilátku k přirozenému Οβ (obr. 12). Podobně se 50% přežívání vyskytuje při ředění serpeptidového ar.riséra přibližně 1:8000, bez ohledu na zpracování v tetanické koloně (obr. 13). Zajímavé je, že antisérum přečištěné na tetanické a protein G kolonách nemá baktericidní aktivitu. Tento fenomén může být způsoben strukturálními změnami protilátky v důsledku acidických podmínek použitých pro eluci těchto proteinů během přečištění na protein G koloně, což v důsledku brání aktivaci komplementu.

GBS přenosy kolonií pro sondování vazby ser-peptidové protilátky

Obr. 14 ukazuje vazbu ser-peptidové protilátky na GBS Ib buňky za použití antiséra přečištěného pouze na tetanické koloně a na tetanické koloně a potom na protein G koloně. V každém případě byla vazba protilátky přítomná u obou přípravků, bez ohledu na výsledky ukazující na neschopnost protilátek přečištěných na proteinu G usmrcovat GBS.

9 9 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 ? 999

Závěr

Syntetická peptidová sekvence z ϋβ proteinu byla navázaná na tetanický toxoid a vyvolala protilátkovou odpověď u králíků vakcinovaných konjugátem. Po přečištění antiséra na tetanické koloně nebo na tetanické a protein G afinitní koloně se protilátka vázala specificky na sekvenci PDVPKLPD (SEQ ID NO: 50), jak bylo zjištěno ELISA na mimotopových hrotech.

Protilátková a komplementem zprostředkovaná baktericidní aktivita tohoto antiséra byla měřena a srovnávána s antisérem namířeným proti Οβ holoproteinu. Antisérum k θβ peptidu přečištěné na tetanické koloně vykazovalo stejnou aktivitu v testech baktericidního účinku jako antisérum k Οβ holoproteinu. Předpokládá se, že protilátky infiltrují peptidoglykanovou vrstvu tohoto Gram-pozitivního organismu během dělení buněk a umožňují aktivaci komplementu, která vede k lýze buněk.

Příklad 13: Vazba Ser-peptidové protilátky

Úvod

Mnoho proteinů vázaných na buněčnou stěnu u Grampozitivnich bakterií má určité společné charakteristiky. Nejvýznamnější je přítomnost LPXTG sekvence poblíž karboxylového konce těchto proteinů. Motiv byl dobře charakterizován a prostřednictvím této sekvence se proteiny buněčné stěny kovalentně váží na buněčnou stěnu, tj. enzym štěpí tuto sekvenci mezi T-G a potom navazuje protein na peptidové složky peptidoglykanu prostřednictvím vazby karboxylové skupiny na threoninový zbytek. Jinou společnou vlastností těchto proteinů buněčné stěny Gram-pozitivních

konci, která obsahuje mnoho prolinových zbytků. Prolinové zbytky, vzhledem ke své jedinečné struktuře, způsobují smyčky na proteinu. Proto se předpokládá, že regiony s vysokým obsahem prolinu v proteinech buněčné stěny vyčnívají z peptidoglykanové vrstvy. Nicméně, nebyly prezentovány žádné přímé důkazy pro tuto teorii. Je to přesně tato oblast na Οβ proteinu, kam se anti-ser-peptidové protilátky váží a kde způsobují buněčnou smrt za přítomnosti komplementu. Jak bylo uvedeno dříve, teoreticky tato aktivita probíhá tak, že protilátka se váže na tento region Οβ během dělení buněk v septální rovině, kde jsou peptidoglykany degradovány a remodelovány. Pro získání dalších důkazů pro tuto teorii se konfokální mikroskopie a FACScan analýza použily pro určení, kde a kdy se protilátky k Ser-peptidu váží na streptokoky exprimující Οβ protein.

Materiály a metody

Analýza konfokálním mikroskopem (CLSM): CLSM se použila pro studium vazby králičí protilátky, anti-Ser-peptidu streptokoku skupiny B, která byla přečištěna na tetanické koloně. Bakterie streptokoků skupiny B, kmene H3 6B, byly kultivovány v ToddHewitově bujónu a vzorky se odebíraly v různých stadiích růstu. Stadium růstu bylo určeno měřením optické density vzorku při 600 nm. Buňky byly potom fixovány ve 2% formaldehydu a podíly se sušily na mikroskopických sklíčkách. Sklíčka se blokovala 5% normálním kozím sérem. Vzorky se inkubovaly s ředěním 1:500 králičí protilátky, anti-serpeptidu po dobu 2 hodin, promyly se a inkubovaly se s FITC konjugovaným kozím antisérem ke králičímu IgG (Molecular Probes, Eugene, OR). Vzorky se kontrastně barvily ethidiumbromidem. Vzorky se překryly krycími sklíčky s Vectashield® mediem (Vector Laboratories, lne., Burlingame,

CA) a vyšetřovaly se laserem s duální vlnovou délkou na BioRad

1024 CLSM.

FACScan analýza: FACScan analýza se provedla na vzorcích bakterií získaných v různých stadiích růstu za použití BectonDickinson FACScan (Research Tringle Park, NC). Bakterie streptokoků skupiny B, kmene H36B, byly kultivovány v ToddHewitově bujónu a vzorky se odebíraly v různých stadiích růstu. Stadium růstu bylo určeno měřením optické density vzorku při 600 nm. Buňky byly potom fixovány ve 2% formaldehydu, promyly se a inkubovaly se buď s anti-serpeptidovým antisérem nebo s sérem absorbovaným na tetanické koloně po dobu 1 hodiny. Buňky se třikrát promyly a inkubovaly se s FITC konjugovaným kozím antisérem ke králičímu IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) po dobu jedné hodiny . Vzorky se kontrastně barvily ethidiumbromidem a rozpustily se v celkovém objemu 1 ml v ředicím pufru 2 (J. and S. Medical Associates, Farmingham, MA). Data se analyzovala za použití Flo-Jo programu (Tree Star Corp., San Carlos, CA).

Výsledky

Analýza konfokálním mikroskopem (CLSM): CLSM analýza prokázala, že anti-Ser-peptidová protilátka se váže na malé oblasti mezi streptokokovými buňkami. Protilátka se váže nejvíce na aktivně se dělící buňky, tj. během log fáze růstu vzorků, a méně na kultury vstupující do stacionární fáze, jak je uvedeno dále. Tato data dále podporují myšlenku, že serpeptidová protilátka se dostává pouze do oblasti θβ proteinu, ve které je peptidoglykan ve stadiu přeměny, tj. v oblasti septální roviny dělení. V žádném poli nebyly pozorovány bakterie zcela pokryté Ser-peptidovou protilátkou.

FACScan analýza: Data pro FACScan analýzu jsou uvedena na obr.

bakterií odebrány. Osa y¹ je OD600 vzorků představující počet bakterií ve vzorku. Osa y² je úroveň zelené fluorescence, tj. vazba Ser-peptidové protilátky, vzhledem k červené fluorescenci, tj. barvení všech bakterií ethidium bromidem. Jak je vidět, na začátku kultivace se velmi málo ser-peptidové protilátky vázalo na buňky. Toto je doba, ve které jsou bakterie ve stacionární fázi z kultury kultivované přes noc ředěny v čerstvém kultivačním mediu. Za 2 hodiny se streptokoky začínají dělit a růst, jak se to projeví ve zvýšení OD600 a ve stejnou dobu se pozoruje zvýšení vazby Serpeptidové protilátky. Pík vazby protilátky koreluje s nejaktivnější částí kultury během log fáze, mezi 4 a 6 hodinami. Po 8 hodinách vstupuje kultura do stacionární fáze, ve které se dělení bakterií zpomaluje a končí. Na bakterie odebrané ve stacionární fázi se neváže Ser-peptidová protilátka a tato situace je podobná, jako pro organismy na počátku kultury. Tato data dále potvrzují, že původní teorie byla správná; že epitop, na který se Ser-peptidová protilátka váže, je přítomen pouze během aktivního dělení buněk a pouze v relativně malých oblastech, tj. v septální rovině dělících se buněk. Takové oblasti septální roviny také zpřístupňují buněčnou membránu Gram-pozitivního organismu, což umožňuje složkám komplementu aktivovaným ser-peptidovými protilátkami nerušený přístup k membránám bakteriálních buněk pro provedení jejích lýzy.

Ačkoliv se uvedený popis týkal výhodných provedení, není vynález omezen na tato provedení. Odborníkům v oboru budou zřejmé mnoho modifikace popsaných provedení a takové modifikace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, který je definován připojenými patentovými nároky. Všechny patenty, přihlášky a publikace zde citované jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti.

Claims

1. Způsob získávání v podstatě čistého Οβ proteinu nebo jeho fragmentu a/nebo mutantu, vyznačující se tím, že zahrnuj e:

(a) získání Οβ proteinu v buněčných extraktech;

(b) zpracování Οβ proteinu iontoměničovou chromatografií a odběr frakcí obsahujících Οβ protein;

(c) sloučení a ředění frakcí obsahujících Οβ protein a (d) zpracování naředěných frakcí obsahujících Οβ protein ligandovou afinitní chromatografií a odběr frakcí;

přičemž se získá v podstatě čistý Οβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že iontoměničová chromatografie se provádí za použití aniontoměničového media zahrnujícího trimethylaminomethylovou skupinu.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že ligandová afinitní chromatografie se provádí za použití ligandového afinitního media zahrnujícího heparinový ligand.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Οβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant se zpracuje chromatografií v pufru obsahujícím asi 5 % detergentního činidla na bázi obojetného iontu.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že sloučené frakce z iontoměničové chromatografie obsahující Οβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant se před provedením ligandové afinitní chromatografie zředí přibližně třikrát pufrem obsahujícím asi 10 % až asi 20 % detergentního činidla na bázi obojetného iontu.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Cp protein nebo jeho fragment a/nebo mutant se eluuje během iontoměničové nebo afinitní chromatografie pomocí eluentu obsahujícího gradient solí.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že eluent zahrnuje asi 0,5 % detergentního činidla na bázi obojetného iontu.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že CP protein nebo jeho fragment a/nebo mutant se získá z bakteriálních buněk, které jsou transfektovány nukleotidovými sekvencemi kódujícími Οβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant, kde uvedené buňky nadměrně exprimují Οβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že Οβ protein nebo jeho fragment a/nebo mutant se získá:

(a) desintegrací buněk;

(b) vysrážením neproteinového materiálu z uvedených buněk přidáním ethanolu/CaC12 do koncentrace asi 20 % (obj./obj.) ethanolu/asi 0,1 M CaC12;

(c) odstraněním vysráženého neproteinového materiálu za zisku roztoku;

(d) vysrážením proteinu z roztoku přidáním ethanolu do koncentrace asi 80 % (obj./obj.) a odebráním vysráženého proteinu a (e) resuspendováním vysráženého proteinu v pufrovacím roztoku obsahujícím od asi 1 % do asi 10 % detergentního činidla na bázi obojetného iontu.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, • · · · · · • · · · · · · · • ··· · · ♦ · že Οβ protein se získá z bakteriálních buněk přirozeně produkujících Οβ protein.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že ϋβ protein se získá:

(a) varem bakteriálních buněk v pufru obsahujícím od asi 1 % do asi 10 % detergentního činidla na bázi obojetného iontu za zisku roztoku;

(b) ochlazením roztoku v ledové lázni;

(c) vysrážením neproteinového materiálu z uvedených buněk přidáním chladného roztoku ethanolu/CaCl₂ do koncentrace asi 20 % ethanolu/asi 0,1 M CaCl₂;

(d) odstraněním vysráženého neproteinového materiálu za zisku roztoku;

(e) vysrážením proteinu z roztoku přidáním ethanolu do koncentrace asi 80 % (obj./obj.) a odebráním vysráženého proteinu a (f) resuspendováním vysráženého proteinu v pufrovacím roztoku obsahujícím od asi 1 % do asi 10 % detergentního činidla na bázi obojetného iontu.

12. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující proteinový fragment nebo peptid zahrnující region bohatý na prolin, ve kterém je alespoň každý třetí zbytek prolin, a kde protilátky namířené proti uvedenému proteinovému fragmentu nebo peptidu jsou baktericidní pro Gram-pozitivní bakterie pouze s komplementem.

13. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 12, kde proteinový fragment nebo peptid zahrnuje kontinuální (opakovanou) aminokyselinovou sekvenci mající vzorec:

-[P-Yi-Y₂-P-Yi-Y₂]_r- nebo -[Yi-Y₂-P-Yi-Y₂-P]_r-, kde Y_x představuje buď kyselý nebo bazický aminokyselinový zbytek, Y₂ představuje neutrální aminokyselinový zbytek a r je celé číslo od 1 do 5.

14. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 12, kde proteinový fragment nebo peptid zahrnuje kontinuální (opakovanou) aminokyselinovou sekvenci mající vzorec: -[P-D-Y₃-P-K-L]_r- nebo -[K-L-P-D-Y₃-P]_r-, kde Y₃ představuje V nebo A a r je celé číslo od 1 do 5.

15. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 12, kde proteinový fragment nebo peptid zahrnuje kontinuální (opakovanou) aminokyselinovou sekvenci mající vzorec: -[S-P-K-Y₄-P-E-A-P-Y₅-V-P-E]_r-, kde Y₄ představuje T nebo A, Y₅ představuje H nebo R a r je celé číslo od 1 do 5.

16. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující proteinový fragment nebo peptid mající vzorec Y-X-Z, kde X znamená alespoň osm kontinuálních aminokyselinových zbytků mezi aminokyselinami 828 a 1027, včetně, sekvence uvedené na obr. 1 (SEQ ID NO: 2), Y znamená vodík nebo N-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2) , která je navázána na X, nebo její N-koncový fragment a/nebo mutant, a Z znamená vodík nebo C-koncovou aminokyselinovou sekvenci podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), která je navázána na X, nebo její C-koncový fragment a/nebo mutant, a kde se uvedený proteinový fragment nebo peptid neváže na Fc region lidského imunoglobulinu IgA, s podmínkou, že protein je alespoň jeden z N-koncového nebo C-koncového fragmentu aminokyselinové sekvence podle obr. 1 (SEQ ID NO: 2), s podmínkou, že uvedený proteinový fragment nebo peptid není přibližně 38 kDa polypeptid secernovaný kmenem HG 806 streptokoků skupiny B, a s další podmínkou, že alespoň jedna z aminokyselin 1-164 obr. 1 (SEQ ID NO: 2), pokud je přítomna v Y, je nepřirozená.

17. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 16, kde Y nezahrnuje alespoň aminokyseliny 1-176 SEQ ID NO: 2.

• · ·· · · · · ·· • · · · · · · • « · · ♦ · · · ·

18. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 16, kde Z zahrnuje alespoň aminokyselinu 901 SEQ ID NO: 2.

19. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 16, kde význam X je vybrán ze skupiny zahrnující: PPKTPDVP (SEQ ID NO: 32), PDVPKLPD (SEQ ID NO: 33), KLPDVPKL (SEQ ID NO: 34), VPKLPDVP (SEQ ID NO: 35), KLPDAPKL (SEQ ID NO: 36), APKLPDGL (SEQ ID NO: 37), ETPDTPKI (SEQ ID NO: 38), RTVRLALG (SEQ ID NO: 39), GGGTVRVF (SEQ ID NO: 40), SPKTPEAPKIPEPPKTPDVP (SEQ ID NO: 41), PEAPKIPEPPKTPDVPKLPD (SEQ ID NO: 42), KIPEPPKTPDVPKLPDVPKL (SEQ ID NO: 43), PPKTPDVPKLPDVPKLPDVP (SEQ ID NO: 44), PDVPKLPDVPKLPDVPKLPD (SEQ ID NO: 45), KLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 46) a PDVPKLPDVPKLPDVPKLPDAPKL (SEQ ID NO: 47).

20. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 16, kde X představuje jakýchkoliv 8 až 21 kontinuálních aminokyselinových zbytků mezi aminokyselinami 828 a 1027, včetně, SEQ ID NO: 2.

21. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 16, kde X představuje aminokyselinovou sekvenci mezi aminokyselinami 828 a 1027, včetně, SEQ ID NO: 2.

22. Vektor, zahrnující polynukleotidovou molekulu podle nároku 12 nebo 16.

23. Hostitelská buňka, transformovaná vektorem podle nároku 22.

24. Proteinový fragment nebo peptid, kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle nároku 12 nebo 16.

25. Proteinový fragment nebo konjugát peptid-polysacharid, zahrnující proteinový fragment nebo peptid podle nároku 24.

26. Vakcína, vyznačující se tím, že zahrnuje • · · · · · · alespoň jeden proteinový fragment nebo peptid podle nároku 24, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

27. Vakcína podle nároku 26, vyznačující se tím, že proteinový fragment nebo peptid je konjugovaný na polysacharid vybraný ze skupiny zahrnující kapsulární polysacharidy typu la, II, III a V streptokoků skupiny B.

28. Kombinovaná vakcína, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň dva proteinové fragmenty nebo konjugáty peptid-polysacharid podle nároku 27.

29. Způsob indukce imunitní odpovědi u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podání vakcíny obsahující alespoň jeden proteinový fragment nebo peptid podle nároku 24, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, v množství dostatečném pro indukci imunitní odpovědi u savce.

• · • · • · · • · ·

1/23 aagcttatgcttgtcaataatcacaaatttgtagatcacttcctttttaggactgtaaagcatcctaatt

ACTTTTTAAATATATTACCAGAACTAGTTGGTTTGGCCCTGGTGAGTCATGCTTATGTGACATTCATCTT

TATTTTTCCTGTCTATGCGGTTATTCTTTATCAAAGAATAGCAGAGGAAGAAAAATTATTGCAGGAAGTT

ATATTCCGAATGGAAGAATGAAAGGTTAAAAATAATATACCCAATTTAATATGCAGTTCATATTGGAAGG

MFKSNYERKMR gtaťačťgtagataaataaaatattggaggatatcgatUtgtttaaatctaattatgaaagaaaaatgcg

---- i—S

Ϊ S 1 R K F S V G V A S V A V A S L F M G S V

TTATTCCATTCGTAAATTTAGTGTAGGAGTAGCTAGTGTAGCGGTAGCTAGTTTGTTCATGGGAAGCGTT

GKREKQLQQWKNNLKNDVDNTIL

GGAAAACGAGAGAAACAATTACAACAATGGAAAAATAATCTAAAAAATGATGTGGATAACACAATTCTAT

ENQFNETNRLLH1K0HEEVEKDK

AGAAAATCAATTTAACGAAACTAATAGACTGTTACACATCAAACAACATGAAGAAGTTGAGAAAGATAAG kakqqktlkqsdtkvdlsnidke aaagctaagcaacagaaaactctgaaacagtcagatacgaaagt/Igatctaagcaatattgacaaagagc

L—— Bgin

Obr. 1A

2/23

MLKK1EDJRK0AQQADKKEDAEV TATGCFGAAAAAAATCGAAGATATTCGTAAACAAGCTCAACAAGCAGATAAAAAAGAAGATGCCGAAGTA

KVREELGKLFSSTKAGLDQEIQE

AAGGTTCGTGAAGAACTAGGTAAACTCTTTAGTTCAACTAAAGCIGGTCTGGATCAAGAAATTCAAGAGC

HVKKETSSEENTQKVDEHYANSLQ

ATGTGAAGAAAGAAACGAGTAGTGAGGAAAATACTCAGAAAGTTGATGAACACTATGCTAATAGCCTTCA

NLAQKSLEELDKATTNEQATQVK GAACCTTGCTCAAAAATCTCTTGAAGAACTAGATAAGGCAACTACCAATGAACAAGCTACACAAGTTAAA

NQFLENAQKLKEIQPLIKETNVK

AATCAATTCTTAGAAAACGCTCAAAAGCTCAAAGAAATACAACCTCTTATCAAAGAAACGAATGTGAAAT

LYKAMSESLEQVEKELKHNSEANL

TGTATAAGGCTATGAGTGAGAGCTTGGAGCAGGTTGAGAAGGAATTAAAACATAATTCGGAAGCTAATTT

EDLVAKSKE1VREYEGKLNQSKN AGAAGATTTGGTTGCGAAATCTAAAGAAATCGTAAGAGAATACGAAGGAAAACTTAATCAATCTAAAAAT

LPELKQLEEEAHSKLKQVVEDFR

CTTCC/GAATTAAAGCAACTAGAAGAGGAAGCTCATTCGAAGTTGAAACAAGTTGTGGAGGAFTTTAGAA

K K F K T S E Q V T P K K R V K R D L A A Ν E N

AAAAATTTAAAACGTCAGAGCAAGTGACACCAAAAAAACGTGTCAAACGAGATTTAGCTGCTAATGAAAA

NQQKIELTVSPEN1TVYEGEDVK

TAATCAACAAAAGATTGAGTlj^ACAGTTTCACCAGAGAATATCACTGTATATGAAGGTGAAGACGTGAAA

FTVTAKSDSKTTLDFSDLLTKYN

TTTACAGTCACAGCTAAAAGTGATTCGAAGACGACGTTGGACTTCAGTGATCTTTTAACAAAATATAATC

PSVSDR1STNYKTNTDNHKJAEIT

CGTCTGTATCAGATAGAATTAGTACAAATTATAAGACTAACACGGATAATCATAAGATTGCCGAAATCAC

IKNLK.LNESQTVTLKAKDDSGNV

TATCAAGAATTTGAAGCTAAATGAAAGTCAAACAGTGACTCTAAAAGCTAAAGATGATTCTGGCAATGTA

VEKTFT1TVQKKEEKQVPKTPEQK

GTTGAAAAAACATTCACTATTACAGTGCAAAAGAAAGAGGA3AAACAAGTTCCTAAAACACCAGAGCAGA

1 Obr. IB ♦ · · · • ·

3/23

OSKTEEKVPQEPKSNDKNQLQEL AAGATTCTAAAACGGAAGAAAAGGTTCCTCAAGAACCAAAATCAAATGACAAGAATCAATTACAAGAGTT

1KSAQQELEKLEKAIKELMEQPE

GATTAAATCAGCTCAACAAGAACTGGAAAAGTTAGAAAAAGCAATAAAAGAATTAATGGAGCAACCAGAG

IPSNPEYGlQKSltfESOKEPlQEA

ATTCCATCCAATCCAGAGTATGGTATTCAAAAATCTATTTGGGAGTCACAAAAAGAGCCTATCCAGGAAG

ÍTSFKKl IGDSSSKYYTEHYFNK

CCATAACAAGTTTTAAGAAGATTATTGGTGATTCATCTTCAAAATACTACACAGAGCACTATTTTAACAA

YKSDFMNYQLHAQMEMLTRKVVQ

ATATAAATCTGATTTTATGAATTATCAACTTCATGCACAAATGGAGATGCTGACTAGAAAAGTGGTTCAG ymnkypdnaejkkifesdmkrtke

TATATGAACAAATATCCTGATAATGCAGAAATTAAAAAGATATTTGAGTCAGATATGAAGAGAACGAAAG dnygslendalkgyfekyfltpf

AAGATAATTACGGAAGTTTAGAAAATGATGCTTTGAAAGGCTATTTTGAGAAATATTTCCTTACACCATT

NKIKQIVDDLDKKVEQDQPAPIP TAATAAAATTAAGCAGATÍGTAGATGATTTGGATAAAAAAGTAGAACAAGATCAGCCAGCACCAATTCCG

E N S E U D Q A K E K A K I A V S K Y M SK V L GAAAATTCAGAAATGGATCAGGCTAAGGAAAAGGCTAAGATTGCTGTATCGAAGTATATGAGTAAGGTTT

DGVHOHLQKKNNSKIVDLFKELE TAGATGGAGTTCATCAACATCTGC/bAAGAAAAATAACAGTAAAATTGTTGATCTTTTTAAGGAACTTGA ^L^'Psl I

AIKQQTIFDIDNAKTEVEIDNLVH

AGCGATTAAACAACAAACTATTTTTGATATTGACAATGCAAAGACTGAAGIAGAGATTGATAACTTAGTA

OAFSKMNATVAKFQKGLETNTPE

CACGATGCATTCTCAAAAATGAATGCTACTGTTGCTAAATTTCAAAAAGGTCTAGAGACAAATACfcCCAG ^L-— Wrl

TPDTPKIPELPQAPDTPQAPDTPH

GAAACTCCAGATACACCGAAGATTCCAGAGCTACCTCAAGCCCCAGATAC/jCCGCAGGCTCCAGACACAC

W_r2

Obr. 1C

4/23

VPESPKAPEAPRVPESPKTPEAP

CGCATGTTCCGGAATCACCAAAGGCCCCAGAAGCACCGCGTGTTCCGGAATCACCAAAGACTCCAGAAGC

HVPESPKAPEAPRVPESPKTPEAH

AtXGCATGTTCCGGAATCACCAAAGGCCCCAGAAGCAbCGCGTGTTCCGGAATCACCAAAGACTCCAGAA

VPESPKTPEAPKIPEPPKTPOVP GCACCGCATGTTCCGGAATCACCAAAGACTCCAGAAGCACCAAAGATTCCGGAACCCCCTAAGACTCCAG

KL.PDVPKLPDVPKLPDAPKLPDGL

ACGTCtCTAAGCTTCCAGACGTCCCTAAGCTTCCAGACGTCCCTAAGCTTCCAGATGCACCGAAGTTACC nkvgqavftstdgntkvtvvfdk

AGAT AAGTTGGACAAGCAGTATTTACATCAACTGATGGAAATACTAAGGTTACGGTTGTA

PTDADKLHLKEVTTKELADKIAH

TTTGATAAACCTACAGATGCTGATAAGTTACATCTCAAGGAAGTAACGACGAAAGAGTTGGCTGATAAAA

KTGGGTVRVFDLSLSKGGKETHVN TTGCTCATAAAACAGGAGGAGGAACAGTTCGTGTGTTTGACTTATCTCTTTCTAAAGGAGGCAAGGAAAC

GERTVRLALGQTGSDVHVYHVKE ACATGTCAATGGAGAACGAACTGTTCGGCTCGCGCTTGGGCAGACTGGCTCAGATGTTCACGTCTATCAC

N. GDLERIPSKVENGQVVFKTNHF

GTAAAGGAAAATGGCGACCTTGAGCGTATTCCTTCTAAAGTTGAAAATGGGCAAGTTGTTTTTAAAACGA slfai ktlskdqnvtppkqtkpst

ACCACTTCAGTTTGTTTGCGATTAAGACACTTTCTAAGGATCAAAATGTIACTCCACCGAAGCAGACTAA

QGSQVE IAESQTGKFQSKAANHK ACCTTCTACCCAAGGCAGTCAAGTAGAGATTGCAGAGAGTCAAACTGGAAAATTCCAGAGTAAAGCAGCT

ALAGNETVAKGNPTSTTEKKEPY AATCATAAAGCACTGGCTACTGGAAATGAAACAGTGGCAAAAGGAAATCCTACATCAACAACGGAAAAGA

TGVASNLVLE 1MGLLGL I G T S F I A

ATATACAGGAGTGGCATCTAATCTAGTTCTTGAAATTATGGGTCTCCTTGGTTTGATTGGAAC ’-Μ. ... . . .

Μ K R R K S

TTCATTCATCGCAATGAAAAGAAGAAAATCATGATTCAGTTTTTTAAAAATATCCACTTFCGATATCTAG

Obr. ID

5/23

CATTTGATTGGTTATCTGTGGATGATTCTAAAGATGHACCTATCGTTGGTATGTAACAATTATAAGTCA tttcatataaaagaggctctttgtcaactgtagttggttgaaacaaggctacaaactagaaaggacgcat TTTGTCCTTICTTTTTGATGTTGAGGGCAATGAAAATACGCTTrTTGAAGTTTTCAAAATTCCGAAAACT AAAGATATTGTATTTGAAAAGTTTAATGAGATGATTAGTTGCTTCCAATTTTGCGTTGGAGTAGGTTTAC TGAAGGACGTTGACGATATTCTCrTTGCTTTTGAGAATGATTTTAAAGATAGTCTGAAAAAGAGGATGAA

Obr. IE • · • · • · · · • ·

Obr

8/23 kolona heparinová kolona θ surový

heparinová kolona 1 o 0.316 35 9.0 (0 · c : 0 O Ή i 0 140 0.408 57 14.6 surový o o lO 0.78 o 07 bO K O O K Krok 1 Objem frakce (pni) Koncentrace (mg/ml) Celk. protein (mg) % výtěžek

Obr

9/23

Obr • · · ·

10/23

Obr. 4A

FIG • ·

11/23 f »«· · ♦·· ·

I · · · · · · • · ····· · ·

Obr

12/23 * >»<

Obr. 6Α

13/25

Obr. 6B

14/23

Obr.

15/23

N- konec

10 20 30 40 50 60

-1 I J -l I 1 I I I I I I I I I I 1 1 1 I I I I I I I I I I I I 1 1 I I > I t .1 I____1-11 1-111111- t I 1 I I I I I I I

MFKSNYERKM RYSIRKFSVG VASVAVASLF MGSVAHASEL VKDOSVKTTE VAAKPYPSMA 60

QTDOGNNSSS SELETTKMEI PTTDIKKAVE PVEKTAGETS ATDTGKREKQ LQQWKNNLKN 120

DVDNTILSHE QKNEFKTK1D ETNDSOALLE LENQFNETNR LLH1KQHEEV EKDKKAKQQK 180

TLKQSDTKVD LSNIDKELNH QKSQVEKMAE OKGITNEDKD SMLKKIEDIR KOAQQADKKE 240

DAEVKVREEL GKLFSSTKAG LDQEIQEHVK KETSSEENTQ KVDEHYANSL QNLAQKSLEE 300

310 320 330 340 350 360

-1 1 1 I I I I I I I______I 1 ! I I I I t I 1 1 I I I I 1 I I I I 1 I I I I I i 1 I I______I 1 1 1 1 I 1 I 1 I I I I I I I I 1 1 I

LDKATTNEQA TQVKNQFLEN AQKLKEIQPL IKETNVKLYK AMSESLEQVE KELKHNSEAN 360

LEDLVAKSKE IVREYEGKLN QSKNLPELKQ LEEEAHSKLK OWEDFRKKF KTSEQVTPKK 420

RVKRDLAANE NNQQKIELTV SPENITVYEG EDVKFTVTAK SDSKTTLDFS DLLTKWSV 480

SDRISTNYKT NTDNHK1AEI T1KNLKLNES QTVTLKAKDO SGNWEKTFT ITVQKKEEKQ 540

VPKTPEQKDS KTEEKVPQEP KSNDKNQLQE LIKSAQQELE KLEKAIKELM EQPEIPSNPE 600

610 620 630 640 650 660

-I i i i I 11 I I I iiiihiiil 111 ι I iii tl 1111 lilii I rntlii iii iittlitiil__

YGIQKSIWES QKEPIQEAIT SFKKIIGOSS SKYYTEHYFN KYKSOFMNYQ LHAQMEMLTR 660

KWQYMNKYP DNAEIKKIFE SDMKRTKEDN YGSLENOALK GYFEKYFLTP FNKIKQ1VDD 720

LDKKVEQOQP APIPENSEMD QAKEKAKIAV SKYMSKVLDG VHQHLQKKNN SKIVDLFKEL 780

EAIKQQTIFD 1DNAKTEVEI DNLVHOAFSK MNATVAKFQK GLETNTPETP DTPK1PELPQ 840

APOTPQAPDT PHVPESPKAP EA^gVPESPK TPEAPHVPES PKAPEARgVP ESPKTPEAPH 900

910 920 930 940 950 960

-1J 1.1 11 I I I 1---1 1J I I I I I I I I I I I J 1 I 1 I I I 1 1 I I 1 1 I 1 1___uuLujjI III lil 1111---VPESPKTPEA PKIPEPPKTP DVPKLPDVPK LPDVPKLPOA PKLPDGLNKV GQAVFTSTDG 960

NTKVTWFDK PTDADKLHLK EVTTKELADK IAHKTGGGTV®/FDLSLSKG GKETHVNGER 1020 TVRLALGQTG SDVHVYHVKE NGDLERIPSK VENGQWFKT NHFSLFAIKT LSKOQNVTPP 1080 KQTKPSTQGS QVE1AESQTG KFQSKAANHK ALATGNETVA KGNPTSTTEK KLPYTGVASN 1140 LVLEIkGLLG LIGTSFIAMK RRKS 1164

Q_konec

W/25

90> V

Obr *

17/23

A 405 (pozadí)

o CL —J Ní £ O CL Ní p_ Ω Ol —J Ní cl. o _____1 CL > CL Ní > Q _____1 CL Q CL Ní > CL 1— Ní £ a CL Ní CL Q —1 CL CL CL Ní > LU CL 1— Ní £ Ω CL n O ______1 Ní CL CL Ní % LU CL I— Ní £ LU ·—< CL Q Q- Ní CL CL

pbr. 9B • · · ♦

18/23

A 405

E2 8-tner

E3 20-mer ----□ (+) kontrola

0.6

0.4

Z71 i; 4 * u 2

—ta SOCL_1Q idO. □__I >ϊχί

Obr. 10| • · · ·

19/23

Obr. 11 ředěni anti-králičiho séra

Obr. 12 • · · · >0) >φ β c ο ο r-Ι Η

Ο Ο Λ4 Λ4

20/23

TUUATZSjd ζ

'Φ ^χΦ Λί Αί 0 υ Η •Η β β Φ φ Ε μ μ φ Φ φ 4-> μ μ β Φ Φ φ Ε β β Φ 1—1 'Φ 'φ & β β Ε Φ φ ο > > Αί 0 0 υ υ Ε Φ φ Ή μ μ β & a > Ν Ν Ή μ Ε Ε Λί Φ Φ <0 μ μ β 'φ 'Φ Η φ φ •Η Η φ μ μ Ε β β φ Ε £ Φ φ μ β β μ μ 'Φ -φ Φ O 'φ > ί> Ε φ φ 0 0 Φ Ή -Η Ό Ό •“Η μ μ -Η -Η Cti β β μ μ Ε Φ Φ &. Λ 0 Φ Φ Α4 Ό) 'Φ & ίλ > > 1 1 Ε 0 0 μ μ Ή Ό Ό φ φ β Η •Η φ φ > 4-> μ •Η ti & Ή Ή μ Φ Φ >υ >υ Α! Λ & Η Η Φ 1 1 ι—1 ι—1 β Μ μ 'Φ 'Φ Η Φ φ μ μ ω ω Φ

I

WO 00/15760

PCT/US99/21643

21/23

1:3000

ANTIBODY PUR1FIED OVER TETANUS EOLLOWED

ANTIBODY PURIFIED OVER TETANUS COLUMN

FIG. 14

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Printed from Mimosa 01/08/29 13:57:45 Page: 94

22/23

Áqgeyrgojd eqzeA %

009 00

Hodiny • ·

23/23________ ^tS£SS:

1999DW

m.<SL ‘'i^S _ (MlldMOJ

EW' ixVvvm

ΗΛ1δ30ΝΛ

H13X99XS

TS303A8A

L ΙΧ0ΥΊ3Χ1

ΛΛ1ΛΧ1Ν9 (OPON 01 03S) (69ΌΝ 01 03S) (Β9ΌΝ Ol 03S) (Ζ9^:0Ν 01 03S) (99-ΟΝ Ol D3S) (99ΌΝ Ol 03S) (f9^:0N Ol 03S) (£9ΌΝ Ol 03S) t_ QLSLJAVO (Ζ9ΌΝ Gl 03S) awnood (19-ΟΝ 01 03S)

DUVOďlX

T i_dAOdDHA (9fΌΝ Ol 03S) (STON Ol 03S)

Ό H 4J

CL Q>

CL co co

L OdlXdAOd (ΚΌΝ Ol 03S) 'Φ β

>

O X)

3 O tn Λ

Π5

LV£&Wg ^FJE7ŠW<?

SWjg

3dAHdV3d (8SON 01 03S) wo.

^έέέέί _ dY3dVXdS (95ΌΝ 01 03S) ^EZ^^S_3dAHdV3d (ζζΌΝ 01 03S)

L iXddldl >1 (09ΌΝ Ol D3S)

LdmXdS (69ON0IO3S) lNdS3dA8 (Ζ9ΌΝ Ol 03S) lMdS3dAa (kfON Ol 03S) ir>

c5 c5

50W *O cS • · · · • ···

-1SEZNAM SEKVENCÍ <110> North Američan Vaccine, lne. Long-Rowe, Karen O.

Blake, Milan S.

<120> Antigeny proti Gram-pozitivním bakteriím a způsoby čištění streptokokového proteinu Cbeta

<130> 1438.022PC03 <140> <141> <150> 60/144,324 <151> 1999-07-19 <150> 60/100,859 <151> 1998-09-17 <160> 70 <170> Patentln Ver. 2 .0 <210> 1 <211> 4200 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <220> <221> CDS ’ <222> (320)..(3814) <400> 1 aagcttatgc ttgtcaataa tcacaaattt gtagatcact tcctttttag gactgtaaag 60 catcctaatt actttttaaa tatattacca gaactagttg gtttggccct ggtgagtcat 120 gcttatgtga cattcatctt tatttttcct gtctatgcgg ttattcttta tcaaagaata 180 gcagaggaag eaaaattatt gcaggaagtt attattccga atggaagaat gaaaggttaa 240 aaataatata cccaatttaa tatgcagttc atattggaag ggtatactgt agataaataa 300 aatattggag gatatcgat atg ttt aaa tet aat tat gaa aga aaa atg cgt 352 Met Phe Lys Ser Asn Tyr Glu Arg Lys Met Arg 1 5 10

tat tcc att cgt aaa ttt agt gta gga gta gct agt gta gcg gta gct 400 Tyr Ser Ile Arg Lys Phe Ser Val Gly Val Ala Ser Val Ala Val Ala 15 20 25

agt ttg ttc atg gga agc gtt gct cat gca agt gag ctt gta aag gac

448 • · ·

Ser Leu . Phe Met Gly ' Ser Val Ala i His ; Ala Ser Glu Leu Val Lys Asp 30 35 40 gat agt gtc aag act acc gag gtt gca gct aag í ccc : tat cca i agt : atg 496 Asp Ser Val Lys Thr Thr Glu Val Ala Ala Lys Pro Tyr Pro i Ser Met 45 50 55 - gct caa aca gat caa gga aat aat tea tea tcc tcg gaa ctt gag aca 544 Ala Gin Thr Asp Gin Gly Asn Asn Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Thr 60 65 70 75 aca aag atg gaa att cct aca aca gac ata aaa aaa gct gtt gaa ccg 592 Thr Lys Met Glu Ile Pro Thr Thr Asp Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro 80 85 90 gtc gag aaa aca gct ggg gaa aca tet gcc act gat act gga aaa ega 640 Val Glu Lys Thr Ala Gly Glu Thr Ser Ala Thr Asp Thr Gly Lys Arg 95 100 105 gag aaa caa tta caa caa tgg aaa aat aat cta aaa aat gat gtg gat 688 Glu Lys Gin Leu Gin Gin Trp Lys Asn Asn Leu Lys Asn Asp Val Asp 110 115 120 aac aca att cta tet cat gaa cag aaa aat gag ttt aaa aca aaa att 736 Asn Thr Ile Leu Ser His Glu Gin Lys Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile 125 130 135 gat gaa aca aat gat tet gat gca tta tta gaa tta gaa aat caa ttt 784 Asp Glu Thr.Asn Asp Ser Asp Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe 140 145 150 155 aac gaa act aat aga ctg tta cac atc aaa caa cat gaa gaa gtt gag 832 Asn Glu Thr Asn Arg Leu Leu His Ile Lys Gin His Glu Glu Val Glu 160 165 170 aaa gat aag aaa gct aag caa cag aaa act ctg aaa cag tea gat acg 880 Lys Asp Lys Lys Ala Lys Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr 175 180 185 aaa gta gat cca agc aat att gac aaa gag ctt aat cat caa aaa agt 928 Lys Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser 190 195 200 caa gtt gaa aaa atg gca gag caa aag gga atc aca aat gaa gat aaa 976 Gin Val Glu Lys Met Ala Glu Gin Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys 205 210 215 gat tet atg ccg aaa aaa acc gaa gat att cgt aaa caa gct caa caa 1024 Asp Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin 220 225 230 235 gca gat c S3 gaa gat ccc gaa gta aag gtt cgt gaa gaa cta ggt 1072

Ala Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly 240 245 250 aaa ctc ttt agt tea act aaa i gct ggt . ctg i gat caa i gaa att : caa gag 1120 Lys Leu Phe Ser Ser Thr Lys ; Ala Gly Leu . Asp > Gin Glu Ile t Gin Glu 255 260 265 cat gtg aag aaa gaa acg agt agt gag gaa aat act cag [ aaa gtt : gat 1168 His Val Lys Lys Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin : Lys Val . Asp 270 275 280 gaa cac tat gct aat agc ctt cag aac ctt gct caa aaa tet ctt gaa 1216 Glu His Tyr Ala Asn Ser Leu Gin Asn Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu 285 290 295 gaa cta gat aag gca act acc aat gaa caa gct aca caa gtt aaa aat 1264 Glu Leu Asp Lys Ala Thr Thr Asn Glu Gin Ala Thr Gin Val Lys Asn 300 305 310 315 caa ttc tta gaa aac gct caa aag ctc aaa gaa ata caa cct ctt atc 1312 Gin Phe Leu Glu Asn Ala Gin Lys Leu Lys Glu Ile Gin Pro Leu Ile 320 325 330 aaa gaa acg aat gtg aaa ttg tat aag gct atg agt gag agc ttg gag 1360 Lys Glu Thr Asn Val Lys Leu Tyr Lys Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu 335 340 345 cag gtt gag aag gaa tta aaa cat aat tcg gaa gct aat tta gaa gat 1408 Gin Val Glu Lys Glu Leu Lys His Asn Ser Glu Ala Asn Leu Glu Asp 350' 355 360 ttg gtt gcg aaa tet aaa gaa atc gta aga gaa tac gaa gga aaa ctt 1456 Leu Val Ala Lys Ser Lys Glu Ile Val Arg Glu Tyr Glu Gly Lys Leu 365 370 375 aat caa tet aaa aat ctt cca gaa tta aag caa cta gaa gag gaa gct 1504 Asn Gin Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Lys Gin Leu Glu Glu Glu Ala 380 385 390 395 cat tcg aag ttg aaa caa gtt gtg gag gat ttt aga aaa aaa ttt aaa 1552 His Ser Lys Leu Lys Gin Val Val Glu Asp Phe Arg Lys Lys Phe Lys 400 405 410 acg tea gag caa gtg aca cca aaa aaa cgt gtc aaa ega gat tta gct 1600 Thr Ser Glu Gin Val Thr Pro Lys Lys Arg Val Lys Arg Asp Leu Ala 415 420 425 gct aat gaa aat aat caa caa aag att gag tta aca gtt tea cca gag 1648 Ala Asn Glu Asn Asn Gin Gin Lys Ile Glu Leu Thr Val Ser Pro Glu 430 435 440 aat atc act gta tat gaa ggt gaa gac gtg aaa ttt aca gtc aca gct 1696

*

-44 4 4 4«

Asn Ile Thr Val Tyr Glu Gly ' Glu . Asp Val Lys ; Phe ; Thr Val . Thr Ala 445 450 455 aaa agt gat tcg aag acg acg ttg gac ttc agt gat ctt tta aca . aaa 1744 Lys Ser Asp Ser Lys Thr Thr Leu Asp Phe Ser Asp Leu Leu Thr Lys 460 4 65 470 475 tat aat ccg tet gta tea gat aga att agt aca aat tat aag act aac 1792 Tyr Asn Pro Ser Val Ser Asp Arg Ile Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Asn 480 485 4 90 acg gat aat cat aag att gcc gaa atc act atc aag aat ttg aag cta 1840 Thr Asp Asn His Lys Ile Ala Glu Ile Thr Ile Lys Asn Leu Lys Leu 4 95 500 505 aat gaa agt caa aca gtg act cta aaa get aaa gat gat tet ggc aat 1888 Asn Glu Ser Gin Thr Val Thr Leu Lys Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn 510 515 520 gta gtt gaa aaa aca ttc act att aca gtg caa aag aaa gag gag aaa 1936 Val Val Glu Lys Thr Phe Thr Ile Thr Val Gin Lys Lys Glu Glu Lys 525 530 535 caa gtt cct aaa aca cca gag cag aaa gat tet aaa acg gaa gaa aag 1984 Gin Val Pro Lys Thr Pro Glu Gin Lys Asp Ser Lys Thr Glu Glu Lys 540 545 550 555 gtt cct caa gaa cca aaa tea aat gac aag aat caa tta caa gag ttg 2032 Val Pro Gin Glu Pro Lys Ser Asn Asp Lys Asn Gin Leu Gin Glu Leu 560 565 570 att aaa tea get caa caa gaa ctg gaa aag tta gaa aaa gca ata aaa 2080 Ile Lys Ser Ala Gin Gin Glu Leu Glu Lys Leu Glu Lys Ala Ile Lys 575 580 585 gaa tta atg gag caa cca gag att cca tcc aat cca gag tat ggt att 2128 Glu Leu Met Glu Gin Pro Glu Ile Pro Ser Asn Pro Glu Tyr Gly Ile 590 595 600 caa aaa tet att tgg gag tea caa aaa gag cct atc cag gaa gcc ata 2176 Gin Lys Ser Ile Trp Glu Ser Gin Lys Glu Pro Ile Gin Glu Ala Ile 605 610 615 aca agt ttt aag aag att att ggt gat tea tet tea aaa tac tac aca 2224 Thr Ser Phe Lys Lys Ile Ile Gly Asp Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Thr 620 625 630 635 gag cac tat ttt aac aaa tat aaa tet gat ttt atg aat tat caa ctt 2272 Glu His Tyr lne Asn Lys Tyr Lys Ser Asp Phe Met Asn Tyr Gin Leu 640 645 650 cat gca caa atg gag atg ctg act aga aaa gtg gtt cag tat atg aac 2320

His Ala Gin Met 655 Glu Met Leu Thr Arg 660 Lys Val Val Gin Tyr Met 665 Asn aaa tat cct gat aat gca gaa att aaa aag ata ttt gag tca gat atg 2368 Lys Tyr Pro Asp Asn Ala Glu Ile Lys Lys Ile Phe Glu Ser Asp Met 670 675 680 aag aga acg aaa gaa gat aat tac gga agt tta gaa aat gat gct ttg 2416 Lys Arg Thr Lys Glu Asp Asn Tyr Gly Ser Leu Glu Asn Asp Ala Leu 685 690 695 aaa ggc tat ttt gag aaa tat ttc ctt aca cca ttt aat aaa att aag 2464 Lys Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr Phe Leu Thr Pro Phe Asn Lys Ile Lys 700 705 710 715 cag att gta gat gat ttg gat aaa aaa gta gaa caa gat cag cca gca 2512 Gin Ile Val Asp Asp Leu Asp Lys Lys Val Glu Gin Asp Gin Pro Ala 720 725 730 cca att ccg gaa aat tca gaa atg gat cag gct aag gaa aag gct aag 2560 Pro Ile Pro Glu Asn Ser Glu Met Asp Gin Ala Lys Glu Lys Ala Lys 735 740 745 att gct gta tcg aag tat atg agt aag gtt tta gat gga gtt cat caa 2608 Ile Ala Val Ser Lys Tyr Met Ser Lys Val Leu Asp Gly Val His Gin 750 755 760 cat ctg cag aag aaa aat aac agt aaa att gtt gat ctt ttt aag gaa 2656 His Leu Gin Lys Lys Asn Asn Ser Lys Ile Val Asp Leu Phe Lys Glu 765 770 775 ctt gaa gcg att aaa caa caa act att ttt gat att gac aat gca aag 2704 Leu Glu Ala Ile Lys Gin Gin Thr Ile Phe Asp Ile Asp Asn Ala Lys 780 785 790 795 act gaa gta gag att gat aac tta gta cac gat gca ttc tca aaa atg 2752 Thr Glu Val Glu Ile Asp Asn Leu Val His Asp Ala Phe Ser Lys Met 800 805 810 aat gct act gtt gct aaa ttt caa aaa ggt cta gag aca aat acg cca 2800 Asn Ala Thr Val Ala Lys Phe Gin Lys Gly Leu Glu Thr Asn Thr Pro 815 820 825 gaa act cca gat aca ccg aag att cca gag cta cct caa gcc cca gat 2848 Glu Thr Pro Asp Thr Pro Lys Ile Pro Glu Leu Pro Gin Ala Pro Asp 830 835 840 aca ccg cag gct cca gac aca ccg cat gtt ccg gaa tca cca aag gcc 2896 Thr Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala 845 850 855 cca gaa gca ccg cgt gtt ccg gaa tca cca aag act cca gaa gca ccg 2944

φφ «

φ

Pro Glu 860 Ala Pro Arg Val 865 Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro 870 875 cat gtt ccg gaa tca cca aag gcc cca . gaa gca ccg i cgt gtt ccg gaa 2992 His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro > Glu Ala Pro ’ Arg ! Val Prc . Glu 880 885 890 tca cca aag act cca gaa gca ccg cat gtt ccg gaa tca cca aag act 3040 Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr 895 900 905 cca gaa gca cca aag att ccg aaa ccc cct aag act cca gac gtc cct 3088 Pro Glu Ala Pro Lys Ile Pro Lys Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro 910 915 920 aag ctt cca gac gtc cct aag ctt cca gac gtc cct aag ctt cca gat 3136 Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp 925 930 935 gca ccg aag tta cca gat ggg tta aat aaa gtt gga caa gca gta ttt 3184 Ala Pro Lys Leu Pro Asp Gly Leu Asn Lys Val Gly Gin Ala Val Phe 940 945 950 955 aca tca act gat gga aat act aag gtt acg gtt gta ttt gat aaa cct 3232 Thr Ser Thr Asp Gly Asn Thr Lys Val Thr Val Val Phe Asp Lys Pro 960 965 970 aca gat gct gat aag tta cat ctc aag gaa gta acg acg aaa gag ttg 3280 Thr Asp Ala Asp Lys Leu His Leu Lys Glu Val Thr Thr Lys Glu Leu '975 980 985 gct gat aaa att gct cat aaa aca gga gga gga aca gtt cgt gtg ttt 3328 Ala Asp Lys Ile Ala His Lys Thr Gly Gly Gly Thr Val Arg Val Phe 990 995 1000 gac tta tet ctt tet aaa gga ggc aag gaa aca cat gtc aat gga gaa 3376 Asp Leu Ser Leu Ser Lys Gly Gly Lys Glu Thr His Val Asn Gly Glu 1005 1010 1015 ega act gtt cgg ctc gcg ctt ggg cag act ggc tca gat gtt cac gtc 3424 Arg Thr Val Arg Leu Ala Leu Gly Gin Thr Gly Ser Asp Val His Val 1020 1025 1030 1035 tat cac gta aag gaa aat ggc gac ctt gag cgt att cct tet aaa gtt 3472 Tyr His Val Lys Glu Asn Gly Asp Leu Glu Arg Ile Pro Ser Lys Val 1040 1045 1050 gaa aat ggg caa gtt gtt ttt aaa acg aac cac ttc agt ttg ttt gcg 3520 Glu Asn Gly Gin Val Val Phe Lys Thr Asn His Phe Ser Leu Phe Ala 1 055 1060 1065 att aag aca C7t tet aag gat caa aat gtt act cca ccg aag cag act 3568

·· ···· ··

Ile Lys Thr 1070 Leu Ser Lys Asp Gin 1075 Asn Val Thr Pro Pro 1080 Lys Gin Thr aaa cct tet acc caa ggc agt caa gta gag att gca gag agt caa act 3616 Lys Pro Ser Thr Gin Gly Ser Gin Val Glu Ile Ala Glu Ser Gin Thr 1085 1090 1095 gga aaa ttc cag agt aaa gca gct aat cat aaa gca ctg gct act gga 3664 Gly Lys Phe Gin Ser Lys Ala Ala Asn His Lys Ala Leu Ala Thr Gly 1100 1105 1110 1115 aat gaa aca gtg gca aaa gga aat cct aca tca aca acg gaa aag aaa 3712 Asn Glu Thr Val Ala Lys Gly Asn Pro Thr Ser Thr Thr Glu Lys Lys 1120 1125 1130 ttg cca tat aca gga gtg gca tet aat cta gtt ctt gaa att atg ggt 3760 Leu Pro Tyr Thr Gly Val Ala Ser Asn Leu Val Leu Glu Ile Met Gly 1135 1140 1145 ctc ctt ggt ttg att gga act tca ttc atc gca atg aaa aga aga aaa 3808 Leu Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ser Phe Ile Ala Met Lys Arg Arg Lys

1150 1155 1160 tca tga ttcagttttt taaaaatatc cactttcgat atctagcatt tgattggtta 3864 Ser

1165

tctgtggatg attctaaaga tgttacctat cgttggtatg taacaattat aagtcatttc 3924 atataaaaga ggctctttgt caactgtagt tggttgaaac aaggctacaa actagaaagg 3984 acgcattttg tcctttcttt ttgatgttga gggcaatgaa aatacgcttt ttgaagtttt 4044 caaaattccg aaaactaaag atattgtatt tgaaaagttt aatgagatga ttagttgctt 4104 ccaattttgc gttggagtag gtttactgaa ggacgttgac gatattetet ttgcttttga 4164 gaatgatttt aaagatagtc tgaaaaagag gatgaa 4200

<210> 2 <211> 1164 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 2

Met Phe Lys Ser Asn Tyr Glu Arg Lys Met Arg Tyr Ser Ile Arg Lys

1 5 10 15

Phe Ser Val Gly Val Ala Ser Val Ala Val Ala Ser Leu Phe Met Gly

20 25 30 • · • · · · • ·

Ser Val Ala 35 His Ala Ser Glu Leu Val 40 Lys Asp Asp Ser 45 Val Lys Thr Thr Glu Val Ala Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin Thr Asp Gin 50 55 60 Gly Asn Asn Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Lys Met Glu Ile 65 70 75 80 Pro Thr Thr Asp Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro Val Glu Lys Thr Ala 85 90 95 Gly Glu Thr Ser Ala Thr Asp Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin 100 105 110 Gin Trp Lys Asn Asn Leu Lys Asn Asp Val Asp Asn Thr Ile Leu Ser 115 120 125 His Glu Gin. Lys Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp 130 135 140 Ser Asp Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr Asn Arg 145 150 155 160 Leu Leu His Ile Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys Asp Lys Lys Ala 165 170 175 Lys Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser

180 185 190

Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys 195 200

Ser Gin Val Glu Lys Met

205

Ala Glu 210 Gin Lys Gly Ile Thr 215 Asn Lys 225 Ile Glu Asp Ile Arg 230 Lys Gin Asp Ala Glu Val Lys 245 Val Arg Glu Thr Lys Ala Gly 260 Leu Asp Gin Glu

Glu Asp Lys Asp 220 Ser Met Leu Lys Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu 235 240 Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser Ser 250 255 Ile Gin Glu His Val Lys Lys Glu 265 270

Thr Ser Ser Glu Glu

275

Ser Leu Gin Asn Leu

290

Asn Thr Gin Lys Val Asp

280

Ala Gin Lys Ser Leu Glu

295

Glu His Tyr Ala Asn

285

Glu Leu Asp Lys Ala

300

Thr Thr Asn

Glu Gin Ala Thr Gin Val

Lys Asn Gin Phe Leu Glu Asn • · • · ·

305 310 315 320 Ala Gin Lys Leu Lys Glu Ile Gin Pro Leu Ile Lys Glu i Thr Asn Val 325 330 335 Lys Leu Tyr Lys Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu Gin Val Glu Lys Glu 340 345 350 Leu Lys His Asn Ser Glu Ala Asn Leu Glu Asp Leu Val Ala Lys Ser 355 360 365 Lys Glu Ile Val Arg Glu Tyr Glu Gly Lys Leu Asn Gin Ser Lys Asn 370 375 380 Leu Pro Glu Leu Lys Gin Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys 385 390 395 400 Gin Val Val Glu Asp Phe Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val 405 410 415 Thr Pro Lys Lys Arg Val Lys Arg Asp Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn 420 425 430 Gin Gin Lys Ile Glu Leu Thr Val Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr 435 440 445 Glu Gly Glu Asp Val Lys Phe Thr Val Thr Ala Lys Ser Asp Ser Lys 4 50 455 4 60 Thr Thr Leu Asp Phe Ser Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val 465 470 475 480 Ser Asp Arg Ile Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys 485 4 90 495 Ile Ala Glu Ile Thr Ile Lys Asn Leu Lys Leu Asn Glu Ser Gin Thr 500 505 510 Val Thr Leu Lys Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Phe Thr Ile Thr Val Gin Lys Lys Glu Glu Lys Gin Val Pro Lys Thr 530 535 540 Pro Glu Gin Lys Asp Ser Lys Thr Glu Glu Lys Val Pro Gin Glu Pro 545 550 555 560 Lys Ser Asn Asp Lys Asn Gin Leu Gin Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gin 565 570 575 Gin Glu Leu Slu Lys Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin 580 585 590

• ·

Pro Glu Ile 595 Pro Ser Asn Pro Glu 600 Tyr Gly Ile Gin Lys 605 Ser Ile Trp Glu Ser Gin Lys Glu Pro Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Lys Lys 610 615 620 Ile Ile Gly Asp Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu His Tyr Phe Asn 625 630 635 640 Lys Tyr Lys Ser Asp Phe Met Asn Tyr Gin Leu His Ala Gin Met Glu 645 650 655 Met Leu Thr Arg Lys Val Val Gin Tyr Met Asn Lys Tyr Pro Asp Asn 660 665 670 Ala Glu Ile Lys Lys Ile Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu 675 680 685 Asp Asn Tyr Gly Ser Leu Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu 690 695 700 Lys Tyr Phe Leu Thr Pro Phe Asn Lys Ile Lys Gin Ile Val Asp Asp 705 710 715 720 Leu Asp Lys Lys Val Glu Gin Asp Gin Pro Ala Pro Ile Pro Glu Asn 725 730 735 Ser Glu Met Asp Gin Ala Lys Glu Lys Ala Lys Ile Ala Val Ser Lys 740 745 750 Tyr Met Ser Lys Val Leu Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys 755 760 765 Asn Asn Ser Lys Ile Val A.sp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys 770 775 780 Gin Gin Thr Ile Phe Asp Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile 785 790 795 800 Asp Asn Leu Val His Asp Ala Phe Ser Lys Met Asn Ala Thr Val Ala 805 810 815 Lys Phe Gin Lys Gly Leu Glu Thr Asn Thr Pro Glu Thr Pro Asp Thr 820 825 830 Pro Lys Ile Pro Glu Leu Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro 835 840 845 Asp Thr Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg 850 855 860

-11 - Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro > Glu i Ala i Pro His : Val Pro Glu Ser 865 870 875 880 Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg Val Pro ' Glu Ser Pro Lys Thr Pro 885 890 895 Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys 900 905 910 Ile Pro Lys Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val 915 920 925 Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro 930 935 940 Asp Gly Leu Asn Lys Val Gly Gin Ala Val Phe Thr Ser Thr Asp Gly 945 950 955 960 Asn Thr Lys Val Thr Val Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys 965 970 975 Leu His Leu Lys Glu Val Thr Thr Lys Glu Leu Ala Asp Lys Ile Ala 980 985 990 His Lys Thr Gly Gly Gly Thr Val Arg Val Phe Asp Leu Ser Leu Ser 995 1000 1005 Lys Gly Gly Lys Glu Thr His Val Asn Gly Glu Arg Thr Val Arg Leu 1010 1015 1020 Ala Leu Gly Gin Thr Gly Ser Asp Val His Val Tyr His Val Lys Glu 025 1030 1035 1040 Asn Gly Asp Leu Glu Arg Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val 1045 1050 1055 Val Phe Lys Thr Asn His Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser 1060 1065 1070 Lys Asp Gin Asn Val Thr Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin 1075 1080 1085 Gly Ser Gin Val Glu Ile Ala Glu Ser Gin Thr Gly Lys Phe Gin Ser 1090 1095 1100 Lys Ala Ala A.sn His Lys Ala Leu Ala Thr Gly Asn Glu Thr Val Ala 105 1110 1115 1120 Lys Gly Asn Pro Thr Ser Thr Thr Glu Lys Lys Leu Pro Tyr Thr Gly 1125 1130 1135

Val Ala Ser Asn Leu Val Leu Glu Ile Met Gly Leu Leu Gly Leu Ile • · · · • · • * • · • · •· •· •· •· • ·

-12- 1140 1145 1150 Gly Thr Ser Phe Ile Ala Met Lys Arg Arg Lys Ser 1155 1160

<210> 3 <211> 3405 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <220>

<221> CDS <222> (1)..(3405) <400> 3

aga Arg 1 tet Ser ega Arg tcc Ser cgc Arg 5 gaa Glu att Ile aat Asn acg Thr act Thr 10 cac His tat Tyr agg gga Arg Gly att Ile 15 gtg Val 48 agc gga taa caa ttc ccc tet aga aat aat ttt gtt taa ctt taa gaa 96 Ser Gly OCH Gin Phe Pro Ser Arg Asn Asn Phe Val OCH Leu OCH Glu 20 25 30 gga gat ata cat atg agt gag ctt gta aag gac gat agt gtg aag act 144 Gly Asp Ile His Met Ser Glu Leu Val Lys Asp Asp Ser Val Lys Thr 35 40 45 acc gag gtt gca gct aag ccc tat cca agt atg gct caa aca gat caa 192 Thr Glu Val Ala Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin Thr Asp Gin 50 55 60 gga aat aat tca tca tcc tcg gaa ctt gag aca aca agg atg gaa att 240 Gly Asn Asn Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Arg Met Glu Ile 65 70 75 80 cct aca aca cac ata aaa aaa gct gtt gaa ccg gtc gag aaa aca gct 288 Pro Thr Thr His Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro Val Glu Lys Thr Ala 85 90 95 ggg gaa aca tet gcc act gat act gga aaa ega gag aaa caa tta caa 336 Gly Glu Thr Ser Ala Thr Asp Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin 100 105 110 caa tgg aaa aat aat cta aaa aat gat gtg gat aac aca att cta tet 384 Gin Trp Lys Asn Asn Leu Lys Asn Asp Val Asp Asn Thr Ile Leu Ser 115 120 125 cat gaa cag 3 3 3 aat gag ttt aaa aca aaa att gat gaa aca aat gat 432 His Glu Gin Lys Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp 130 135 140

• · • · *

9 ·

tet gat gca tta tta gaa tta gaa i aat caa . ttt aac : gaa i act aat aga 480 Ser Asp Ala Leu Leu Glu Leu Glu i Asn Gin Phe Asn Glu 1 Thr Asn Arg 145 150 155 160 ctg tta cac atc aaa caa cat gaa gaa gtt gag aaa cat aac aaa cct 528 Leu Leu His Ile Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys His Asn Lys Pro 165 170 175 aac caa cag aaa act ctg aaa cag tea gat acg aaa gta gat cta agc 576 Asn Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser 180 185 190 aat att gac aaa gag ctt aat cat caa aaa agt caa gtt gaa gca atg 624 Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin Val Glu Ala Met 195 200 205 gca gag caa gcg gga atc aca aat gaa gat aaa gat tet atc ctg aaa 672 Ala Glu Gin Ala Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Ile Leu Lys 210 215 220 aaa atc gaa gat att cgt aaa caa get caa caa gca gat aaa aaa gaa 720 Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu 225 230 235 240 gat gcc gaa gta aag gtt cgt gaa gaa cta ggt aaa ctc ttt agt tea 768 Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser Ser 245 250 255 act aaa get. ggt ctg gat caa caa att caa gag cat gtg aag aaa gaa 816 Thr Lys Ála Gly Leu Asp Gin Gin Ile Gin Glu His Val Lys Lys Glu 260 265 270 acg agt agt gag gaa aat act cag aaa gtt gat gaa cac tat get aat 864 Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu His Tyr Ala Asn 275 280 265 agc ctt cag aac ctt get caa aaa tet ctt gaa gaa cta gat aag gca 912 Ser Leu Gin Asn Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu Glu Leu Asp Lys Ala 290 295 300 act acc aat gaa caa get aca caa gtt aaa aat caa ttc tta gaa aac 960 Thr Thr Asn Glu Gin Ala Thr Gin Val Lys Asn Gin Phe Leu Glu Asn 305 310 315 320 get caa aag ctc aaa gaa ata caa cct ctt atc aaa gaa acg aat gtg 1008 Ala Gin Lys Leu Lys Glu Ile Gin Pro Leu Ile Lys Glu Thr Asn Val 325 330 335 aaa ttg tat aag get atg agt gag agc ttg gag cag gtt gag aag gaa 1056 Lys Leu Tyr Lys Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu Gin Val Glu Lys Glu 340 345 350

tta Leu aaa Lys cat His 355 aat Asn tcg gaa gct aat tta caa gat ttg gtt gcg aaa tet 1104 Ser Glu Ala Asn Leu Gin Asp Leu Val Ala Lys Ser 360 365 aaa gaa atc gta aga gaa tac gaa gga aaa ctt aat caa tet aaa aat 1152 Lys Glu Ile Val Arg Glu Tyr Glu Gly Lys Leu Asn Gin Ser Lys Asn 370 375 380 ctt cca gaa tta aag caa cta gaa gag gaa gct cat tcg aag ttg aaa 1200 Leu Pro Glu Leu Lys Gin Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys 385 390 395 400 caa gtt gtg gag cat ttt aga aaa aaa ttt aaa acg tca gag caa gtg 1248 Gin Val Val Glu His Phe Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val 405 410 415 aca cca aaa aaa cgt gtc aaa ega gat tta gct gct aat gaa aat aat 1296 Thr Pro Lys Lys Arg Val Lys Arg Asp Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn 420 425 430 caa caa aag att gag tta aca gtt tca cca gag aat atc act gta tat 1344 Gin Gin Lys Ile Glu Leu Thr Val Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr 435 440 445 gaa ggt gaa gac gtg aaa ttt aca gtc aca gct aaa agt gat tcg aag 1392 Glu Gly Glu Asp Val Lys Phe Thr Val Thr Ala Lys Ser Asp Ser Lys 450 455 4 60 acg acg ttg gac ttc agt gat ctt tta aca aaa tat aat ccg tet gta 1440 Thr Thr Leu Asp Phe Ser Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val 465 470 475 480 tca gat aga att agt aca aat tat aag act aac acg gat aat cat aag 1488 Ser Asp Arg Ile Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys 485 490 4 95 att gcc gaa atc act atc aag aat ttg aag cta aat caa agt caa aca 1536 Ile Ala Glu Ile Thr Ile Lys Asn Leu Lys Leu Asn Gin Ser Gin Thr 500 505 510 gtg act cta aaa gct aaa gat gat tet ggc aat gta gtt gaa aaa aca 1584 Val Thr Leu Lys Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 ttc act att aca gtc Caa aag aaa gag gag aaa caa gtt cct aaa aca 1632 Phe Thr Ile Thr Val Gin Lys Lys Glu Glu Lys Gin Val Pro Lys Thr 530 535 540 cca gag cag aaa cat tet Čl3čL acg gaa caa aac gtt cct caa gaa cca 1680 Pro Glu Gin Lys His Ser Lys Thr Glu Gin Asn Val Pro Gin Glu Pro 545 550 555 560

··

aaa Lys tca Ser aat Asn gac aag Asp Lys 565 aat Asn caa Gin tta caa gag ttg att aaa tca gct caa 1728 Leu Gin Glu 570 Leu Ile Lys Ser Ala Gin 575 caa gaa ctc gaa aag tta gaa aaa gca ata aaa gaa tta atg gag caa 1776 Gin Glu Leu Glu Lys Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin 580 585 590 cca gag att cca tcc aat cca gag tat ggt att caa aaa tet att tgg 1824 Pro Glu Ile Pro Ser Asn Pro Glu Tyr Gly Ile Gin Lys Ser Ile Trp 595 600 605 gag tca caa aaa gag cct atc cag gaa gcc ata aca agt ttt aac aag 1872 Glu Ser Gin Lys Glu Pro Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Asn Lys 610 615 620 att att ggt gat tca tet tca aaa tac tac aca gag cac tat ttt aac 1920 Ile Ile Gly Asp Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu His Tyr Phe Asn 625 630 635 640 aaa tat aaa tet cat ttt atg aat tat caa ctt cat gca caa atg gag 1968 Lys Tyr Lys Ser His Phe Met Asn Tyr Gin Leu His Ala Gin Met Glu 645 650 655 atc ctg act aga aaa gtg gtt cag tat atg aac aaa tat cct gat aat 2016 Ile Leu Thr Arg Lys Val Val Gin Tyr Met Asn Lys Tyr Pro Asp Asn 660 665 670 gca gaa att aaa aag ata ttt gag tca gat atg aag aga acg aaa gaa 2064 Ala Glu Ile Lys Lys Ile Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu 675 680 685 gat aat tac gga agt tta gaa aat gat gct ttg aaa ggc tat ttt gag 2112 Asp Asn Tyr Gly Ser Leu Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu 690 695 700 aaa tat ttc ctt aca cca ttt aat aaa att aag cag att gta gat gat 2160 Lys Tyr Phe Leu Thr Pro Phe Asn Lys Ile Lys Gin Ile Val Asp Asp 705 710 715 720 ttg gat aaa aaa gta gaa caa gat cag cca gca cca att ccg gaa aat 2208 Leu Asp Lys Lys Val Glu Gin Asp Gin Pro Ala Pro Ile Pro Glu Asn 725 730 735 tca gaa atg gat cag gct aag gaa aag gct aag att gct gta tcg aag 2256 Ser Glu Met Asp Gin Ala Lys Glu Lys Ala Lys Ile Ala Val Ser Lys 740 745 750 tat atg agt aag gtt tta gat gga gtt cat caa cat ctg cag aag aaa 2304 Tyr Met Ser Lys Val Leu Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys 755 760 765

aat cac agt aaa att gtt gat ctt ttt aag gaa ctt gaa gcg att aaa Asn His Ser Lys Ile Val Asp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys 770 775 780

2352

caa caa act att ttt gat att gac aat gca aag act gaa gta gag att 2400 Gin Gin Thr Ile Phe Asp Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile 785 7 90 795 800

gat Asp aac Asn tta gta Leu Val cac His 805 gat Asp gca Ala ttc Phe tca Ser aaa Lys 810 atg Met aat get act Asn Ala Thr gtt Val 815 get Ala 2448 aaa ttt caa aaa ggt cta gag aca aat acg cca gaa act cca gat aca 2496 Lys Phe Gin Lys Gly Leu Glu Thr Asn Thr Pro Glu Thr Pro Asp Thr 820 825 830 ccg aag att cca gag cta cct caa gcc cca gat aca ccg cag get cca 2544 Pro Lys Ile Pro Glu Leu Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro 835 840 845 gac aca ccg cat gtt ccg gaa tca cca aag gcc cca gaa gca ccg cgt 2592 Asp Thr Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg 850 855 860 gtt ccg gaa tca cca aac act cca gaa gca ccg cat gtt ccg gaa tca 2640 Val Pro Glu Ser Pro Asn Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser 865 870 875 880 cca aag gcc.cca gaa cca ccg cgt gtt ccg gaa tca cca aac act cca 2688 Pro Lys Ala Pro Glu Pro Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Asn Thr Pro 885 890 895 gaa gca ccg cat gtt ccg gaa tca cca aag act cca gaa gca cca aag 2736 Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys 900 905 910 att ccg gaa ccc cct aag act cca gac gtc cct aag ctt cca gac gtc 2784 Ile Pro Glu Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val 915 920 925 cct aag ctt cca cac gtc cct aag ctt cca gat gca ccg aag tta cca 2832 Pro Lys Leu Pro His Val Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro 930 935 940 gat ggg tta aac aaa gtt gga caa gca gta ttt aca tca act gat gga 2880 Asp Gly Leu Aa.n Lys Val Gly Gin Ala Val Phe Thr Ser Thr Asp Gly 945 950 955 960 aat act aag cct acg gtt gta ttt gat aaa cct aca gat get gat aag 2928 Asn Thr Lys Vsi Thr Val Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys 965 970 975

tta Leu cat His ctc Leu aag Lys 980 gaa Glu cta Leu acg Thr acg Thr aaa Lys 985 gag Glu ttg Leu gct Ala gat Asp aaa Lys 990 att Ile gct Ala 2976 cat aaa aca gga gga gga aca gtt cgt gtg ttt gac tta tet ctt tet 3024 His Lys Thr Gly Gly Gly Thr Val Arg Val Phe Asp Leu Ser Leu Ser 995 1000 1005 aaa gga ggc aag gaa aca cat gtc aat gga gaa ega act gtt cgg ctc 3072 Lys Gly Gly Lys Glu Thr His Val Asn Gly Glu Arg Thr Val Arg Leu 1010 1015 1020 gcg Ctt ggg cag act ggc tca gat gtt cac gtc tat cac gta aag gaa 3120 Ala Leu Gly Gin Thr Gly Ser Asp Val His Val Tyr His Val Lys Glu 1025 1030 1035 1040 aat ggc gac ctt gag cgt att cct tet aaa gtt gaa aat ggg caa gtt 3168 Asn Gly Asp Leu Glu Arg Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val 1045 1050 1055 gtt ttt aaa acg aac cac ttc agt ttg ttt gcg att aag aca ctt tet 3216 Val Phe Lys Thr Asn His Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser 1060 1065 1070 aag gat caa aat gtt act cca ccg aag cag act aaa cct tet acc caa 3264 Lys Asp Gin Asn Val Thr Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin 1075 1080 1085 ggc agt caa gta gag att gca gag agt caa act gga aaa ttc cag agt 3312 Gly Ser Gin' Val Glu Ile Ala Glu Ser Gin Thr Gly Lys Phe Gin Ser 1090 1095 1100 aaa gca gct aat cat aaa gca ctg gct act gga aat gaa aca gtg gca 3360 Lys Ala Ala Asn His Lys Ala Leu Ala Thr Gly Asn Glu Thr Val Ala 1105 1110 1115 1120 aaa gga aat cct aca tca aca acg gaa aag aaa ctc gag cac cac 3405 Lys Gly Asn Pro Thr Ser Thr Thr Glu Lys Lys Leu Glu His His 1125 1130 1135

<210> 4 <211> 1135 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 4

Arg 1 Ser Arg Ser Arg 5 Glu Ile Asn Thr Thr 10 His Tyr Arg Gly Ile 15 Val Ser Gly OCH Gin Phe Pro Ser Arg Asn Asn Phe Val OCH Leu OCH Glu

20 25 30

Gly Asp Ile His Met Ser Glu Leu Val Lys Asp > Asp i Ser Val . Lys Thr 35 40 45 Thr Glu Val Ala Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin . Thr Asp Gin 50 55 60 Gly Asn Asn Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Arg Met Glu : Ile 65 70 75 80 Pro Thr Thr His Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro Val Glu Lys Thr Ala 85 90 95 Gly Glu Thr Ser Ala Thr Asp Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin 100 105 110 Gin Trp Lys Asn Asn Leu Lys Asn Asp Val Asp Asn Thr Ile Leu Ser 115 120 125 His Glu Gin Lys Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp 130 135 140 Ser Asp Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr Asn Arg 145 150 155 160 Leu Leu His Ile Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys His Asn Lys Pro 165 170 175 Asn Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser 180 185 190 Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin Val Glu Ala Met 195 . 200 205 Ala Glu Gin Ala Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Ile Leu Lys 210 215 220 Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu 225 230 235 240 Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser Ser 245 250 255 Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Gin Ile Gin Glu His Val Lys Lys Glu 260 265 270 Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu His Tyr Ala Asn 275 280 285 Ser Leu Gin Asn Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu Glu Leu Asp Lys Ala 290 295 300 Thr Thr Asn Glu Gin Ala Thr Gin Val Lys Asn Gin Phe Leu Glu Asn 305 310 315 320 Ala Gin Lys Leu Lys Glu Ile Gin Pro Leu Ile Lys Glu Thr Asn Val 325 330 335

Lys Leu Tyr Lvs Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu Gin Val Glu Lys Glu

340 345 350

Leu Lys His 355 Asn Ser Glu Ala Asn Leu Gin Asp Leu 360 i Val Ala Lys Ser 365 Lys Glu Ile Val Arg Glu Tyr Glu : Gly Lys Leu Asn . Gin Ser ' Lys ; Asn 370 375 380 Leu Pro Glu Leu Lys Gin Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys 385 390 395 400 Gin Val Val Glu His Phe Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val 405 410 415 Thr Pro Lys Lys Arg Val Lys Arg Asp Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn 420 425 430 Gin Gin Lys Ile Glu Leu Thr Val Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr 435 440 445 Glu Gly Glu Asp Val Lys Phe Thr Val Thr Ala Lys Ser Asp Ser Lys 450 455 460 Thr Thr Leu Asp Phe Ser Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val 465 470 475 480 Ser Asp Arg Ile Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys 485 4 90 4 95 Ile Ala Glu Ile Thr Ile Lys Asn Leu Lys Leu Asn Gin Ser Gin Thr 500 505 510 Val Thr Leu Lys Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Phe Thr Ile Thr Val Gin Lys Lys Glu Glu Lys Gin Val Pro Lys Thr 530 535 540 Pro Glu Gin Lys His Ser Lys Thr Glu Gin Asn Val Pro Gin Glu Pro 545 550 555 560 Lys Ser Asn Asp Lys Asn Gin Leu Gin Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gin 565 570 575 Gin Glu Leu Glu Lys Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin 580 585 590 Pro Glu Ile Pro Ser Asn Pro Glu Tyr Gly Ile Gin Lys Ser Ile Trp 595 600 605 Glu Ser Gin Lys Glu Pro Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Asn Lys 610 615 620 Ile Ile Gly Asp Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu His Tyr Phe Asn 625 630 635 640 Lys Tyr Lys Ser His Phe Met Asn Tyr Gin Leu His Ala Gin Met Glu 645 650 655 Ile Leu Thr Arg Lys Val Val Gin Tyr Met Asn Lys Tyr Pro Asp Asn 660 665 670 Ala Glu Ile Lys Lys Ile Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu 675 680 685

Asp Asn 690 Tyr Gly Ser Leu Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu 695 700 Lys Tyr Phe Leu Thr Pro Phe Asn Lys Ile Lys Gin Ile _; Val Asp ' Asp 705 710 715 720 Leu Asp Lys Lys Val Glu Gin Asp Gin Pro Ala Pro Ile Pro Glu Asn 725 730 735 Ser Glu Met Asp Gin Ala Lys Glu Lys Ala Lys Ile Ala Val Ser Lys 740 745 750 Tyr Met Ser Lys Val Leu Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys 755 7 60 765 Asn His Ser Lys Ile Val Asp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys 770 775 780 Gin Gin Thr Ile Phe Asp Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile 785 790 795 800 Asp Asn Leu Val His Asp Ala Phe Ser Lys Met Asn Ala Thr Val Ala 805 810 815 Lys Phe Gin Lys Gly Leu Glu Thr Asn Thr Pro Glu Thr Pro Asp Thr 820 825 830 Pro Lys Ile Pro Glu Leu Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro 835 840 845 J Asp Thr Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg 850 855 860 Val Pro Glu Ser Pro Asn Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser 865 870 875 880 Pro Lys Ala Pro Glu Pro Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Asn Thr Pro 885 890 895 Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys 900 905 910 Ile Pro Glu Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val 915 920 925 Pro Lys Leu Pro His Val Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro 930 935 940 Asp Gly Leu Asn Lys Val Gly Gin Ala Val Phe Thr Ser Thr Asp Gly 94 5 950 955 960 Asn Thr Lys Val Thr Val Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys 965 970 975 Leu His Leu Lys Glu Leu Thr Thr Lys Glu Leu Ala Asp Lys Ile Ala 9É0 985 990 His Lys Thr Gly Gly Gly Thr Val Arg Val Phe Asp Leu Ser Leu Ser 995 1000 1005 Lys Gly Gly Lys Glu Thr His Val Asn Gly Glu Arg Thr Val Arg Leu 1010 1015 1020

• · · ·

Ala Leu Gly Gin Thr Gly Ser Asp Val His Val Tyr 1035 His Val Lys Glu 1040 1025 1030 Asn Gly Asp Leu Glu Arg Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val 1045 1050 1055 Val Phe Lys Thr Asn His Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser 1060 1065 1070 Lys Asp Gin Asn Val Thr Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin 1075 1080 1085 Gly Ser Gin Val Glu Ile Ala Glu Ser Gin Thr Gly Lys Phe Gin Ser 1090 1095 1100 Lys Ala Ala Asn His Lys A.la Leu Ala Thr Gly Asn Glu Thr Val Ala 1105 1110 1115 1120 Lys Gly Asn Pro Thr Ser Thr Thr Glu Lys Lys Leu Glu His His 1125 1130 1135

<210> 5 <211> 3384 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <220>

<221> CDS <222> (1)..(3384) <400> 5

atg Met 1 agt Ser gag Glu ctt Leu gta Val 5 aag Lys gac gat agt Ser gtg Val 10 aag Lys act Thr acc Thr gag Glu gtt Val 15 gca Ala 48 fi.sp Asp gct aag ccc tat cca agt atg gct caa aca gat caa gga aat aat tea 96 Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin Thr Asp Gin Gly Asn Asn Ser 20 25 30 tea tcc tcg gaa ctt gag aca aca agg atg gaa att cct aca aca gac 144 Ser Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Arg Met Glu Ile Pro Thr Thr Asp 35 40 45 ata aaa aaa gct gtt gaa ccg gtc gag aaa aca gct ggg gaa aca tet 192 Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro Val Glu Lys Thr Ala Gly Glu Thr Ser 50 55 60 gcc act gat act gga aaa ega gag aaa caa tta caa caa tgg aaa aat 240 Ala Thr Asp Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin Gin Trp Lys Asn 65 70 75 80 aat cta aaa aat gat gtg g=t aac aca att cta tet cat gaa cag aaa 288

Asn Leu Lys Asn Asp Val Asp Asn Thr Ile Leu Ser His Glu Gin Lys 85 90 95 aat gag ttt = aa aca aaa att gat gaa aca aat gat tet gat gca i tta 336 Asn Glu Phe lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp Ser Asp ' Ala . Leu 100 105 110 tta gaa tta gaa aat caa ttt aac gaa act aat aga ctg tta cac atc 384 Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr Asn Arg Leu Leu His Ile 115 120 125 aaa caa cat gaa gaa gtt gag aaa gat aag aaa get aag caa cag aaa 432 Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys Asp Lys Lys Ala Lys Gin Gin Lys 130 135 140 act ctg aaa cag tea gat acg aaa gta gat cta age aat att gac aaa 480 Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys 145 150 155 160 gag ctt aat cat caa aaa agt cca gtt gaa aaa atg gca gag cca aag 528 Glu Leu Asn Eis Gin Lys Ser Pro Val Glu Lys Met Ala Glu Pro Lys 165 170 175 gga atc aca aat gaa gat aaa gat tet atg ctg aaa aaa atc gaa gat 576 Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp 180 185 190 att cgt aaa caa get caa caa gca gat aaa aaa gaa gat gcc gaa gta 624 Ile Arg Lys .Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val 195 200 205 aag gtt cgt caa gaa cta ggt aaa ctc ttt agt tea act aaa get ggt 672 Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly 210 215 220 ctg gat caa gaa att cat gag cat gtg aag aaa gaa acg agt agt gag 720 Leu Asp Gin Glu Ile His Glu His Val Lys Lys Glu Thr Ser Ser Glu 225 230 235 240 gaa aat act cag aaa gtt gat gaa cac tat get aat age ctt cag aac 768 Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu His Tyr Ala Asn Ser Leu Gin Asn 245 250 255 ctt get caa aaa tet ctt gaa gaa cta gat aag gca act acc aat gaa 816 Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu Glu Leu Asp Lys Ala Thr Thr Asn Glu 2Í0 265 270 caa get aca caa gtt aaa aat caa ttc tta gaa aac get caa aag ctc 864 Gin Ala Thr Gin Val Lys Asn Gin Phe Leu Glu Asn Ala Gin Lys Leu 275 280 285 aaa gaa atg caa cct ctt atc aaa gaa acg aat gtg aaa ttg tat aag 912

····

Lys Glu 290 Met Gin Pro Leu Ile Lys Glu Thr Asn Val Lys Leu Tyr Lys 295 300 gct atg agt gag agc ttg gag cag gtt gag aag gaa tta aaa cat aat 960 Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu Gin Val Glu Lys Glu Leu Lys His Asn 305 310 315 320 tcg gaa gct aat tta gaa gat ttg gtt gcg aaa tet aaa gaa atc gta 1008 Ser Glu Ala Asn Leu Glu Asp Leu Val Ala Lys Ser Lys Glu Ile Val 325 330 335 aga gaa tac gaa gga aaa ctt aat caa tet aaa aat ctt cca gaa tta 1056 Arg Glu Tyr Glu Gly Lys Leu Asn Gin Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu 340 345 350 aag caa cta gaa gag gaa gct cat tcg aag ttg aaa caa gtt gtg gag 1104 Lys Gin Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys Gin Val Val Glu 355 360 365 gat ttt aga aaa aaa ttt aaa acg tea gag caa gtg aca cca aaa aaa 1152 Asp Phe Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val Thr Pro Lys Lys 370 375 380 cgt gtc aaa ega gat tta gct gct aat gaa aat aat caa caa aag att 1200 Arg Val Lys Arg Asp Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn Gin Gin Lys Ile 385 390 395 400 gag tta aca gtt tea cca gag aat atc act gta tat gaa ggt gaa gac 1248 Glu Leu Thr. Val Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Glu Gly Glu Asp 405 410 415 gtg aaa ttt aca gtc aca gct aaa agt gat tcg aag acg acg ttg gac 1296 Val Lys Phe Thr Val Thr Ala Lys Ser Asp Ser Lys Thr Thr Leu Asp 420 425 430 ttc agt gat ctt tta aca aaa tat aat ccg tet gta tea gat aga att 1344 Phe Ser Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val Ser Asp Arg Ile 435 440 445 agt aca aat tat aag act aac acg gat aat cat aag att gcc gaa atc 1392 Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys Ile Ala Glu Ile 450 455 4 60 act atc aag aat ttg aag cta aat gaa agt caa aca gtg act cta aaa 1440 Thr Ile Lys Asn Leu Lys Leu Asn Glu Ser Gin Thr Val Thr Leu Lys 465 470 475 480 gct aaa gat gat tet ggc aat gta gtt gaa aaa aca ttc act att aca 14 88 Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Glu Lys Thr Phe Thr Ile Thr 485 490 495 gtg caa aag c33 gag gag aaa caa gtt cct aaa aca cca gag cag 33č 1536

Val Gin Lys Lys 500 Glu Glu Lys Gin Val Pro Lys Thr Pro Glu Gin Lys 505 510 gat tet aaa acg gaa gaa aag gtt cct caa . gaa . cca . aaa , tea aat : gac 1584 Asp Ser Lys Thr Glu Glu Lys Val Pro Gin . Glu . Pro Lys Ser Asn i Asp 515 520 525 aag aat caa tta caa gag ttg att aaa tea gct caa caa gaa ctg gaa 1632 Lys Asn Gin Leu Gin Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gin Gin Glu Leu Glu 530 535 540 aag tta gaa saa gca ata aaa gaa tta atg gag caa cca gag att cca 1680 Lys Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin Pro Glu Ile Pro 545 550 555 560 tcc aat cca gag tat ggt att caa aaa tet att tgg gag tea caa aaa 1728 Ser Asn Pro Glu Tyr Gly Ile Gin Lys Ser Ile Trp Glu Ser GÍn Lys 565 570 575 gag cct atc cag gaa gcc ata aca agt ttt aag aag att att ggt gat 1776 Glu Pro Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Lys Lys Ile Ile Gly Asp 580 585 590 tea tet tea aaa tac tac aca gag cac tat ttt aac aaa tat aaa tet 1824 Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu His Tyr Phe Asn Lys Tyr Lys Ser 595 600 605 gat ttt atg aat tat caa ctt cat gca caa atg gag atg ctg act aga 1872 Asp Phe Met .Asn Tyr Gin Leu His Ala Gin Met Glu Met Leu Thr Arg 610 615 620 aaa gtg gtt cag tat atg aac aaa tat cct gat aat gca gaa att aaa 1920 Lys Val Val Gin Tyr Met Asn Lys Tyr Pro Asp Asn Ala Glu Ile Lys 625 630 635 640 aag ata ttt gag tea gat atg aag aga acg aaa gaa gat aat tac gga 1968 Lys Ile Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu Asp Asn Tyr Gly 645 650 655 agt tta gaa aat gat gct ttg aaa ggc tat ttt gag aaa tat ttc ctt 2016 Ser Leu Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr Phe Leu 650 665 670 aca cca ttt aat aaa att aag cag att gta gat gat ttg gat aaa aaa 2064 Thr Pro Phe Asn Lys Ile Lys Gin Ile Val Asp Asp Leu Asp Lys Lys 675 680 685 gta gaa caa gat cag cca gca cca att ccg gaa aat tea gaa atg gat 2112 Val Glu Gin Asp Gin Pro A.la Pro Ile Pro Glu Asn Ser Glu Met Asp 690 695 700 cag gct aag caa aag gct aag att gct gta tcg aag tat atg agt aag 2160

« · • · · ·

Gin 705 Ala Lys Glu Lys Ala 710 Lys Ile Ala Val Ser Lys 715 Tyr Met Ser Lys 720 gtt tta gat gga gtt cat caa cat ctg cag aag aaa aat cac agt aaa 2208 Val Leu Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys Asn His Ser Lys 725 730 735 att gtt gat ctt ttt aag gaa ctt gaa gcg att aaa caa caa act att 2256 Ile Val Asp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys Gin Gin Thr Ile 740 745 750 ttt gat att gac aat gca aag act gaa gta gag att gat aac tta gta 2304 Phe Asp Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile Asp Asn Leu Val 755 760 765 cac gat gca ttc tca aaa atg aat gct act gtt gct aaa ttt caa aaa 2352 His Asp Ala Phe Ser Lys Met Asn Ala Thr Val Ala Lys Phe Gin Lys 770 775 780 ggt cta gag aca aat acg cca gaa act cca gat aca ccg aag att cca 2400 Gly Leu Glu Thr Asn Thr Pro Glu Thr Pro Asp Thr Pro Lys Ile Pro 785 790 795 800 gag cta cct caa gcc cca gat aca ccg cag gct cca gac aca ccg cat 2448 Glu Leu Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro His 805 810 815 gtt ccg gaa tca cca aag gcc cca gaa gca ccg cgt gtt ccg gaa tca 2496 Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser 820 825 830 cca aag act cca gaa gca ccg cat gtt ccg gaa tca cca aag gcc cca 2544 Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro 835 840 845 gaa gca ccg cgt gtt ccg gaa tca cca aag act cca gaa gca ccg cat 2592 Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro His 850 855 860 gtt ccg gaa tca cca aag act cca gaa gca cca aag att ccg gaa ccc 2640 Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys Ile Pro Glu Pro 865 870 875 880 cct aag act ccg gac gtc cct aag ctt cca gac gtc cct aag ctt cca 2688 Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro 885 890 895 gac gtc cct aag ctt cca gat gca ccg aag tta cca gat ggg tta aat 2736 Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro Asp Gly Leu Asn 900 905 910

aaa gtt gga caa gca gta ttt aca tca act gat gga aat act aag gtt 2784

Lys Val Gly Gin Ala Val 915 Phe Thr 920 Ser Thr Asp Gly Asn 925 Thr Lys Val acg gtt gta ttt gat aaa cct aca gat get gat aag tta cat ctc aag 2832 Thr Val Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys Leu His Leu Lys 930 935 940 gaa gta acg acg aaa gag ttg get gat aaa att get cat aaa aca gga 2880 Glu Val Thr Thr Lys Glu Leu Ala Asp Lys Ile Ala His Lys Thr Gly 945 950 955 960 gga gga aca gtt cgt gtg ttt gac tta tet ctt tet aaa gga ggc aag 2928 Gly Gly Thr Val Arg Val Phe Asp Leu Ser Leu Ser Lys Gly Gly Lys 965 970 975 gaa aca cat gtc aat gga gaa ega act gtt cgg ctc gcg ctt ggg cag 2976 Glu Thr His Val Asn Gly Glu Arg Thr Val Arg Leu Ala Leu Gly Gin 980 985 990 act ggc tea gat gtt cac gtc tat cac gta aag gaa aat ggc gac ctt 3024 Thr Gly Ser Asp Val His Val Tyr His Val Lys Glu Asn Gly Asp Leu 995 1000 1005 gag cgt att cct tet aaa gtt gaa aat ggg caa gtt gtt ttt aaa acg 3072 Glu Arg Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val Val Phe Lys Thr 1010 1015 1020 t aac cac ttc agt ttg ttt gcg att aag aca Ctt tet aag gat caa aat 3120 Asn His Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser Lys Asp Gin Asn 1025 1030 1035 1040

gtt act cca ccg aag cag act aaa cct tet acc caa ggc agt caa gta 3168 Val Thr Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin Gly Ser Gin Val 1045 1050 1055 gag att gca gag agt caa act gga aaa ttc cag agt aaa gca get aat 3216 Glu Ile Ala Glu Ser Gin Thr Gly Lys Phe Gin Ser Lys Ala Ala Asn 1060 1065 1070 cat aaa gca ctg get act gga aat gaa aca gtg gca aaa gga aat cct 3264 His Lys Ala Leu Ala Thr Gly Asn Glu Thr Val Ala Lys Gly Asn Pro 1075 1080 1085 aca tea aca acg gaa aag aaa ttg cca tat aca gga gtg gca tet aat 3312 Thr Ser Thr Thr Glu Lys Lys Leu Pro Tyr Thr Gly Val Ala Ser Asn 1090 1095 1100 cta gtt ctt gaa att atg ggt ctc ctt ggt ttg att gga act tea ttc 3360 Leu Val Leu Glu Ile Met Gly Leu Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ser Phe

1105 1110 1115 1120 atc gca atg aaa aga aga aaa tea

3384

-27Ile Ala Met Lys Arg Arg Lys Ser

1125 <210> 6 <211> 1128 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae

<400> 6 Val 5 Lys Asp Asp Ser Val Lys 10 Thr Thr Glu Val 15 Ala Met 1 Ser Glu Leu Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin Thr Asp Gin Gly Asn Asn Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Arg Met Glu Ile Pro Thr Thr Asp 35 40 45 Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro Val Glu Lys Thr Ala Gly Glu Thr Ser 50 55 60 Ala Thr Asp Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin Gin Trp Lys Asn 65 70 75 80 Asn Leu Lys Asn Asp Val Asp Asn Thr Ile Leu Ser His Glu Gin Lys 85 90 95 Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp Ser Asp Ala Leu '100 105 110 Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr Asn Arg Leu Leu His Ile 115 120 125 Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys Asp Lys Lys Ala Lys Gin Gin Lys 130 135 140 Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys 145 150 155 160 Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Pro Val Glu Lys Met Ala Glu Pro Lys 165 170 175 Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp 180 185 190 Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val 195 200 205 Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly

210 215 220 • · · · • ·

Leu Asp - Gin Glu i Ile : HÍS : Git i His Val Lys i Lys ; Glu Thr Ser Ser Glu 225 230 235 240 Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp ' Glu i His Tyr Ala Asn i Ser Leu i Gin i Asn 245 250 255 Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu Glu Leu Asp Lys Ala Thr Thr Asn Glu 260 265 270 Gin Ala Thr Gin Val Lys Asn Gin Phe Leu Glu Asn Ala Gin Lys Leu 275 280 285 Lys Glu Met Gin Pro Leu Ile Lys Glu Thr Asn Val Lys Leu Tyr Lys 290 295 300 Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu Gin Val Glu Lys Glu Leu Lys His Asn 305 310 315 320 Ser Glu Ala Asn Leu Glu Asp Leu Val Ala Lys Ser Lys Glu Ile Val 325 330 335 Arg Glu Tyr Glu Gly Lys Leu Asn Gin Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu 340 34 5 350 Lys Gin Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys Gin Val Val Glu 355 360 365 Asp Phe Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val Thr Pro Lys Lys 370 375 380 Arg Val Lys Arg Asp Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn Gin Gin Lys Ile 385 390 395 400 Glu Leu Thr Val Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Glu Gly Glu Asp 405 410 415 Val Lys Phe Thr Val Thr Ala Lys Ser Asp Ser Lys Thr Thr Leu Asp 420 425 430 Phe Ser Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val Ser Asp Arg Ile 435 440 445 Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys Ile Ala Glu Ile 450 455 460 Thr Ile Lys Asn Leu Lys Leu Asn Glu Ser Gin Thr Val Thr Leu Lys 465 470 475 480 Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Glu Lys Thr Phe Thr Ile Thr 485 4 90 4 95

Val Gin Lys Lys Glu Glu Lys Gin Val Pro Lys Thr Pro Glu Gin Lys

-29500 505 510

Asp Ser Lys Thr Glu Glu Lys Val 520 Pro Gin Glu Pro Lys 525 Ser Asn Asp 515 Lys Asn Gin Leu Gin Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gin Gin Glu Leu Glu 530 535 540 Lys Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin Pro Glu Ile Pro 545 550 555 560 Ser Asn Pro Glu Tyr Gly Ile Gin Lys Ser Ile Trp Glu Ser Gin Lys 565 570 575 Glu Pro Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Lys Lys Ile Ile Gly Asp 580 585 590 Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu His Tyr Phe Asn Lys Tyr Lys Ser 595 600 605 Asp Phe Met Asn Tyr Gin Leu His Ala Gin Met Glu Met Leu Thr Arg 610 615 620 Lys Val Val Gin Tyr Met Asn Lys Tyr Pro Asp Asn Ala Glu Ile Lys 625 630 635 640 Lys Ile Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu Asp Asn Tyr Gly 645 650 655 Ser Leu Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr Phe Leu 660 665 670 Thr Pro Phe Asn Lys Ile Lys Gin Ile Val Asp Asp Leu Asp Lys Lys 675 680 685 Val Glu Gin Asp Gin Pro Ala Pro Ile Pro Glu Asn Ser Glu Met Asp 690 695 700 Gin Ala Lys Glu Lys Ala Lys Ile Ala Val Ser Lys Tyr Met Ser Lys 705 710 715 720 Val Leu Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys Asn His Ser Lys 725 730 735 Ile Val Asp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys Gin Gin Thr Ile 740 745 750 Phe Asp Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile Asp Asn Leu Val 755 760 765 His Asp Ala Phe Ser Lys Met Asn Ala Thr Val Ala Lys Phe Gin Lys 770 775 780

Gly Leu Glu Thr Asn Thr Prc i Glu Thr Pro Asp • Thr Pro Lys : Ile Pro 785 790 795 800 Glu Leu Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro > Asp > Thr Pra i His 805 810 815 Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser 820 825 830 Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro 835 840 845 Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro His 850 855 860 Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys Ile Pro Glu Pro 865 870 875 880 Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro 885 890 895 Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro Asp Gly Leu Asn 900 905 910 Lys Val Gly Gin Ala Val Phe Thr Ser Thr Asp Gly Asn Thr Lys Val 915 920 925 Thr Val Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys Leu His Leu Lys 930 935 940 Glu Val Thr Thr Lys Glu Leu Ala Asp Lys Ile Ala His Lys Thr Gly 945 950 955 960 Gly Gly Thr Val Arg Val Phe Asp Leu Ser Leu Ser Lys Gly Gly Lys 965 970 975 Glu Thr His Val Asn Gly Glu Arg Thr Val Arg Leu Ala Leu Gly Gin 330 985 990 Thr Gly Ser Asp Val His Val Tyr His Val Lys Glu Asn Gly Asp Leu 995 1000 1005 Glu Arg Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val Val Phe Lys Thr 1010 1015 1020 Asn His Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser Lys Asp Gin Asn 1025 1030 1035 1040

Val Thr Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin Gly Ser Gin Val

1045 1050 1055 • φ · · « · ·

Glu Ile Ala Glu 1060 Ser Gin Thr Gly Lys 1065 Phe Gin Ser Lys Ala 1070 Ala Asn His Lys Ala 1075 Leu Ala Thr Gly Asn 1080 Glu Thr Val Ala Lys 1085 Gly Asn Pro Thr Ser 1090 Thr Thr Glu Lys Lys 1095 Leu Pro Tyr Thr Gly 1100 Val Ala Ser Asn Leu Val Leu Glu Ile Met Gly Leu Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ser Phe

1105 1110 1115 1120 Ile Ala Met Lys Arg Arg Lys Ser 1125

<210> 7 <211> 3387 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <220>

<221> CDS <222> (1). . (3387) <400> 7

aga Arg 1 tet Ser ega Arg tcc Ser cgc Arg 5 gaa Glu att Ile aat Asn acg Thr act Thr 10 cac His tat Tyr agg Arg gga Gly att Ile 15 gtg Val 48 agc gga taa caa ttc ccc tet aga aat aat ttt gtt taa ctt taa gaa 96 Ser Gly OCH Gin Phe Pro Ser Arg Asn Asn Phe Val OCH Leu OCH Glu 20 25 30 gga gat ata cat atg agt gag ctt gta aag gac gat agt gtg aag act 144 Gly Asp Ile His Met Ser Glu Leu Val Lys Asp Asp Ser Val Lys Thr 35 40 45 acc gag gtt gca get aag ccc tat cca agt atg get caa aca gat caa 192 Thr Glu Val Ala Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin Thr Asp Gin 50 55 60 gga aat aat tea tea tcc tcg gaa ctt gag aca aca agg atg gaa att 240 Gly Asn Asn Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Arg Met Glu Ile 65 70 75 80 cct aca aca gac ata aaa aaa get gtt gaa ccg gtc gag aaa aca get 288 Pro Thr Thr Asp Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro Val Glu Lys Thr Ala 85 90 95 ggg gaa aca tet gcc act cat act gga aaa ega gag aaa caa tta caa 336 Gly Glu Thr Ser Ala Thr His Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin

-32100 105 110

caa Gin tgg Trp aaa Lys 115 aat Asn aat Asn cta Leu aaa Lys aat gat gtg gat Asn Asp Val Asp 120 aac Asn aca att cta tet Thr Ile Leu Ser 125 384 cat gaa cag aaa aat gag ttt aaa aca aaa att gat gaa aca aat gat 432 His Glu 'Gin Lys Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp 130 135 140 tet gat gca tta tta gaa tta gaa aat caa ttt aac gaa act aat aga 480 Ser Asp Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr Asn Arg 145 150 155 160 ctg tta cac atc aaa caa cat gaa gaa gtt gag aaa gat aag aaa get 528 Leu Leu His Ile Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys Asp Lys Lys Ala 165 170 175 aag caa cag aaa act ctg aaa cag tca gat acg aaa gta gat cta age 576 Lys Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser 180 185 190 aat att gac aaa gag ctt aat cat caa aaa agt caa gaa gcg gga atc 624 Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin Glu Ala Gly Ile 195 200 205 aca aat gaa gat aaa gat tet atg ctg aaa aaa atc gaa gat att cgt 672 Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg 210 - 215 220 aaa caa get caa caa cca gat aaa aaa gaa gat gcc gaa gta aag gtt 720 Lys Gin Ala Gin Gin Pro Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val 225 230 235 240 cgt gaa gaa cta ggt aaa ctc ttt agt tca act aaa get ggt ctg gat 768 Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp 245 250 255 caa gaa att caa gag cat gtg aag aaa gaa acg agt agt gag gaa aat 816 Gin Glu Ile Gin Glu His Val Lys Lys Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn 260 265 270 act cag aaa gtt gat gaa cac tat get aat age ctt cag aac ctt get 864 Thr Gin Lys Val Asp Glu His Tyr Ala Asn Ser Leu Gin Asn Leu Ala 275 280 285 caa aaa tet ctt gaa gaa cta gat aag gca act acc aat gaa caa get 912 Gin Lys Ser Leu Glu Glu Leu Asp Lys Ala Thr Thr Asn Glu Gin Ala 290 295 300 aca caa gtt aaa aat caa ttc tta gaa aac get caa aag ctc aaa gaa 960 Thr Gin Val Lys Asn Gin Phe Leu Glu Asn Ala Gin Lys Leu Lys Glu

WO 00/15760

PCT/US99/21643

305

310

315

-33320

ata Ile caa Gin cct Pro ctt Leu atc Ile 325 aaa Lys gaa Glu acg Thr aat Asn gtg aaa ttg Leu tat Tyr aag Lys gct Ala 335 atg Met 1008 Val 330 Lys agt gag agc ttg gag cag gtt gag aag gaa tta aaa cat aat tcg gaa 1056 Ser Glu Ser Leu Glu Gin Val Glu Lys Glu Leu Lys His Asn Ser Glu 340 345 350 gct aat tta gaa gat ttg gtt gcg aaa tet aaa gaa atc gta aga gaa 1104 Ala Asn Leu Glu Asp Leu Val Ala Lys Ser Lys Glu Ile Val Arg Glu 355 360 365 tac gaa gga aaa ctt aat caa tet aaa aat ctt cca gaa tta aag caa 1152 Tyr Glu Gly Lys Leu Asn Gin Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Lys Gin 370 375 380 cta gaa gag gaa gct cat tcg aag ttg aaa caa gtt gtg gag gat ttt 1200 Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys Gin Val Val Glu Asp Phe 385 390 395 400 aga aaa aaa ttt aaa acg tea gag caa gtg aca cca aaa aaa cgt ctc 1248 Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val Thr Pro Lys Lys Arg Leu 405 410 415 aaa ega gat tta gct gct aat gaa aat aat caa caa aag att gag tta 1296 Lys Arg Asp Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn Gin Gin Lys Ile Glu Leu 420 425 430 aca gtt tea cca gag aat atc act gta tat gaa ggt gaa gac gtg aaa 1344 Thr Val Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Glu Gly Glu Asp Val Lys 435 440 445 ttt aca gtc aca gct aaa agt gat tcg aag acg acg ttg gac ttc agt 1392 Phe Thr Val Thr Ala Lys Ser Asp Ser Lys Thr Thr Leu Asp Phe Ser 450 455 460 gat ctt tta aca aaa tat aat ccg tet gta tea gat aga att agt aca 1440 Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val Ser Asp Arg Ile Ser Thr 465 470 475 480 aat tat aag act aac acg gat aat cat aag att gcc gaa atc act atc 1488 Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys Ile Ala Glu Ile Thr Ile 485 490 495 aag aat ttg aag cta aat gaa agt caa aca gtg act cta aaa gct aaa 1536 Lys Asn Leu Lys Leu Asn Glu Ser Gin Thr Val Thr Leu Lys Ala Lys 500 505 510 gat gat tet ggc aat gta gtt gaa aaa aca ttc act att aca gtg caa 1584 Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Glu Lys Thr Phe Thr Ile Thr Val Gin

Printed from Mimosa 01/08/29 14:00:01 Page: 129 • · · · · • · • · · · v

515

520

525

aag aaa gag gag Glu Glu aaa Lys caa Gin gtt Val 535 cct aaa Pro Lys aca cca gag cag aaa Thr Pro Glu Gin Lys 540 gat tet Asp Ser 1632 Lys Lys 530 aaa acg gaa gaa aag gtt cct caa gaa cca aaa tea aat gac aag aat 1680 Lys Thr Glu Glu Lys Val Pro Gin Glu Pro Lys Ser Asn Asp Lys Asn 545 550 555 560 caa tta caa gag ttg att aaa tea gct caa caa gaa ctg gaa aag tta 1728 Gin Leu Gin Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gin Gin Glu Leu Glu Lys Leu 565 570 575 gaa aaa gca ata aaa gaa tta atg gag caá cca gag att cca tcc aat 1776 Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin Pro Glu Ile Pro Ser Asn 580 585 590 cca gag tat ggt att caa aaa tet att tgg gag tea caa aaa gag cct 1824 Pro Glu Tyr Gly Ile Gin Lys Ser Ile Trp Glu Ser Gin Lys Glu Pro 595 600 605 atc cag gaa gcc ata aca agt ttt aag aag att att ggt gat tea tet 1872 Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Lys Lys Ile Ile Gly Asp Ser Ser 610 615 620 tea aaa tac tac aca gag cac tat ttt aac aaa tat aaa tet cat ttt 1920 Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu His Tyr Phe Asn Lys Tyr Lys Ser His Phe 625 630 635 640 atg aat- tat caa ctt cat gca caa atg gag atg ctg act aga aaa gtg 1968 Met Asn Tyr Gin Leu His Ala Gin Met Glu Met Leu Thr Arg Lys Val 645 650 655 gtt cag tat atg aac aaa tat cct gat aat gca gaa att aaa aag ata 2016 Val Gin Tyr Met Asn Lys Tyr Pro Asp Asn Ala Glu Ile Lys Lys Ile 660 665 670 ttt gag tea gat atg aag aga acg aaa gaa gat aat tac gga agt tta 2064 Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu Asp Asn Tyr Gly Ser Leu 675 680 685 gaa aat gat gct ttg aaa ggc tat ttt gag aaa tat ttc ctt aca cca 2112 Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr Phe Leu Thr Pro 690 695 700 ttt aat aaa att aag cag att gta gat gat ttc gat aaa aaa gta gaa 2160 Phe Asn Lys Ile Lys Gin Ile Val Asp Asp Phe Asp Lys Lys Val Glu 705 710 715 720 caa gat cag cca gca cca att ccg gaa aat tea gaa atg gat cag gct 2208 Gin Asp Gin Pro Ala Pro Ile Pro Glu Asn Ser Glu Met Asp Gin Ala

-35725

730

735

aag Lys gaa Glu aag Lys gct Ala 740 aag Lys att Ile gct Ala gta Val tcg Ser 745 aag Lys tat Tyr atg Met agt Ser aag Lys 750 gtt Val tta Leu 2256 gat gga gtt cat caa cat ctg cag aag aaa aat cac agt aaa att gtt 2304 Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys Asn His Ser Lys Ile Val 755 760 765 gat ctt ttt aag gaa ctt gaa gcg att aaa caa caa act att ttt gat 2352 Asp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys Gin Gin Thr Ile Phe Asp 770 775 780 att gac aat gca aag act gaa gta gag att gat aac tta gta cac gat 2400 Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile Asp Asn Leu Val His Asp 785 790 795 800 gca ttc tca aaa atg aat gct act gtt gct aaa ttt caa aaa ggt cta 2448 Ala Phe Ser Lys Met Asn Ala Thr Val Ala Lys Phe Gin Lys Gly Leu 805 810 815 gag aca aat acg cca gaa act cca gat aca ccg aag att cca gag cta 2496 Glu Thr Asn Thr Pro Glu Thr Pro Asp Thr Pro Lys Ile Pro Glu Leu 820 825 830 cct caa gcc cca gat aca ccg cag gct cca gac aca ccg cat gtt ccg 2544 Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro His Val Pro 835 840 845 caa tca cca aag gcc cca gaa gca ccg cgt gtt ccg gaa tca cca aag 2592 Gin Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Lys 850 855 8 60 act cca gaa gca ccc cat gtt ccg gaa tca cca aag gcc cca gaa gca 2640 Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala 865 870 875 880 ccg cgt gtt ccg gaa tca cca aag act cca gaa gca ccg cat gtt ccg 2688 Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro 885 890 895 gaa tca cca aag act cca gaa gca cca aag att ccg gaa ccc cct aag 2736 Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys Ile Pro Glu Pro Pro Lys 900 905 910 act cca gac gtc cct aac ctt cca gac gtc cct aag ctt cca gac gtc 2784 Thr Pro Asp Val Pro Asn Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val 915 920 925 cct aag ctt cca gat gca ccg aag tta cca cat ggg tta aat aaa gtt 2832 Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro His Gly Leu Asn Lys Val

t « « · « t>·

-36930

935

940

gga Gly 945 caa Gin gca Ala gta ttt Val Phe aca Thr 950 tea act gat gga aat Ser Thr Asp Gly Asn 955 act aag gtt Thr Lys Val acg gtt Thr Val 960 2880 gta ttt gat aaa cct aca gat get gat aag tta cat ctc aag gaa gta 2928 Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys Leu His Leu Lys Glu Val 965 970 975 acg acg aaa gag ttg get gat aaa att get cat aaa aca gga gga gga 2976 Thr Thr Lys Glu Leu Ala Asp Lys Ile Ala His Lys Thr Gly Gly Gly 980 985 990 aca gtt cgt gtg ttt gac tta tet ctt tet aaa gga ggc aag gaa aca 3024 Thr Val Arg Val Phe Asp Leu Ser Leu Ser Lys Gly Gly Lys Glu Thr 995 1000 1005 cat gtc aat gga gaa ega act gtt cgg ctc gcg Ctt ggg cag act ggc 3072 His Val Asn Gly Glu Arg Thr Val Arg Leu Ala Leu Gly Gin Thr Gly 1010 1015 1020 tea gat gtt cac gtc tat cac gta aag gaa aat ggc gac ctt gag cgt 3120 Ser Asp Val His Val Tyr His Val Lys Glu Asn Gly Asp Leu Glu Arg 1025 1030 1035 1040 att cct tet aaa gtt gaa aat ggg caa gtt gtt ttt aaa acg aac cac 3168 Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val Val Phe Lys Thr Asn His 1045 1050 1055 ttc agt ttg ttt gcg att aag aca Ctt tet aag gat caa aat gtt act 3216 Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser Lys Asp Gin Asn Val Thr 1060 1065 1070 cca ccg aag cag act aaa cct tet acc caa ggc agt caa gta gag att 3264 Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin Gly Ser Gin Val Glu Ile 1075 1080 1085 gca gag agt caa act gga aaa ttc cag act aaa gca get aat cat aaa 3312 Ala Glu Ser Gin Thr Gly Lys Phe Gin Thr Lys Ala Ala Asn His Lys 1090 1095 1100 cca ctg get act gga aat gaa aca gtg gca aaa gga aat cct aca tea 3360 Pro Leu Ala Thr Gly Asn Glu Thr Val Ala Lys Gly Asn Pro Thr Ser 1105 1110 1115 1120 aca acg gaa aag aaa ctc gag cac cac 3387 Thr Thr Glu Lys Lys Leu Glu His His

1125 <210> 8 «♦ ·· ···· ·· • · · · · ··· • · · ···· · I»

-37<211> 1129 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 8

Arg 1 Ser Arg Ser Arg 5 Glu Ile Asn Thr Thr 10 His Tyr Arg Gly Ile Val 15 Ser Gly OCH Gin Phe Pro Ser Arg Asn Asn Phe Val OCH Leu OCH Glu 20 25 30 Gly Asp Ile His Met Ser Glu Leu Val Lys Asp Asp Ser Val Lys Thr 35 40 45 Thr Glu Val Ala Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin Thr Asp Gin 50 55 60 Gly Asn Asn Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Arg Met Glu Ile 65 70 75 80 Pro Thr Thr Asp Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro Val Glu Lys Thr Ala 85 90 95 Gly Glu Thr Ser Ala Thr His Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin 100 105 110 Gin Trp Lys Asn Asn Leu Lys Asn Asp Val Asp Asn Thr Ile Leu Ser 115 120 125 His Glu Gin Lys Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp 130 135 140 Ser Asp Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr Asn Arg 145 150 155 160 Leu Leu His Ile Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys Asp Lys Lys Ala 165 170 175 Lys Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser 180 185 190 Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin Glu Ala Gly Ile 195 200 205 Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg 210 215 220 Lys Gin Ala Gin Gin Pro Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val 225 230 235 240 Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp 245 250 255 Gin Glu Ile Gin Glu His Val Lys Lys Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn 260 265 270 Thr Gin Lys Val Asp Glu His Tyr Ala Asn Ser Leu Gin Asn Leu Ala 275 280 285 Gin Lys Ser Leu Glu Glu Leu Asp Lys Ala Thr Thr Asn Glu Gin Ala 290 295 300

Thr 305 Gin Val Lys Asn Gin Phe Leu Glu Asn Ala Gin Lys Leu Lys Glu 310 315 320 Ile Gin Pro Leu Ile Lys Glu Thr Asn , Val Lys Leu Tyr Lys ; Ala l Met 325 330 335 Ser Glu Ser Leu Glu Gin Val Glu Lys Glu Leu Lys His Asn Ser Glu 340 345 350 Ala Asn Leu Glu Asp Leu Val Ala Lys Ser Lys Glu Ile Val Arg Glu 355 360 365 Tyr Glu Gly Lys Leu Asn Gin Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Lys Gin 370 375 380 Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys Gin Val Val Glu Asp Phe 385 390 395 400 Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val Thr Pro Lys Lys Arg Leu 405 410 415 Lys Arg Asp Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn Gin Gin Lys Ile Glu Leu 420 425 430 Thr Val Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Glu Gly Glu Asp Val Lys 435 440 445 Phe Thr Val Thr Ala Lys Ser Asp Ser Lys Thr Thr Leu Asp Phe Ser 450 455 460 Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val Ser Asp Arg Ile Ser Thr 465 470 475 480 Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys Ile Ala Glu Ile Thr Ile 485 490 4 95 Lys Asn Leu Lys Leu Asn Glu Ser Gin Thr Val Thr Leu Lys Ala Lys 500 505 510 Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Glu Lys Thr Phe Thr Ile Thr Val Gin 515 520 525 Lys Lys Glu Glu Lys Gin Val Pro Lys Thr Pro Glu Gin Lys Asp Ser 530 535 540 Lys Thr Glu Glu Lys Val Pro Gin Glu Pro Lys Ser Asn Asp Lys Asn 545 550 555 560 Gin Leu Gin Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gin Gin Glu Leu Glu Lys Leu 565 570 575 Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin Pro Glu Ile Pro Ser Asn 580 585 590 Pro Glu Tyr Gly Ile Gin Lys Ser Ile Trp Glu Ser Gin Lys Glu Pro 595 600 605 Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Lys Lys Ile Ile Gly Asp Ser Ser 610 615 620 Ser Lys Tyr Tvr Thr Glu His Tyr Phe Asn Lys Tyr Lys Ser His Phe 625 630 635 640

Met Asn Tyr Gin Leu 645 His Ala Gin Met Glu Met 650 Leu Thr Arg Lys Val 655 Val Gin Tyr Met Asn Lys Tyr Pro Asp Asn Ala Glu Ile Lys Lys Ile 660 665 670 Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu Asp Asn Tyr Gly Ser Leu 675 680 685 Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr Phe Leu Thr Pro 690 695 700 Phe Asn Lys Ile Lys Gin Ile Val Asp Asp Phe Asp Lys Lys Val Glu 705 710 715 720 Gin Asp Gin Pro Ala Pro Ile Pro Glu Asn Ser Glu Met Asp Gin Ala 725 730 735 Lys Glu Lys Ala Lys Ile Ala Val Ser Lys Tyr Met Ser Lys Val Leu 740 745 750 Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys Asn His Ser Lys Ile Val 755 760 765 Asp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys Gin Gin Thr Ile Phe Asp 770 775 780 Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile Asp Asn Leu Val His Asp 785 790 795 800 Ala Phe Ser Lys Met Asn Ala Thr Val Ala Lys Phe Gin Lys Gly Leu 805 810 815 Glu Thr Asn. Thr Pro Glu Thr Pro Asp Thr Pro Lys Ile Pro Glu Leu 820 825 830 Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro His Val Pro 835 840 845 Gin Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Lys 850 855 860 Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala 865 870 875 880 Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro 885 890 895 Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys Ile Pro Glu Pro Pro Lys 900 905 910 Thr Pro Asp Val Pro Asn Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val 915 920 925 Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro His Gly Leu Asn Lys Val 930 935 940 Gly Gin Ala Val Phe Thr Ser Thr Asp Gly Asn Thr Lys Val Thr Val 945 950 955 960 Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys Leu His Leu Lys Glu Val 965 970 975

Thr Thr Lys Glu 980 Leu Ala Asp Lys Ile Ala 985 His Lys Thr Gly 990 Gly Gly Thr Val Arg Val Phe Asp Leu Ser Leu Ser Lys Gly Gly Lys Glu Thr 995 1000 1005 His Val Asn Gly Glu Arg Thr Val Arg Leu Ala Leu Gly Gin Thr Gly 1010 1015 1020 Ser Asp Val His Val Tyr His Val Lys Glu Asn Gly Asp Leu Glu Arg 1025 1030 1035 1040 Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val Val Phe Lys Thr Asn His 1045 1050 1055 Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser Lys Asp Gin Asn Val Thr 1060 1065 1070 Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin Gly Ser Gin Val Glu Ile 1075 1080 1085 Ala Glu Ser Gin Thr Gly Lys Phe Gin Thr Lys Ala Ala Asn His Lys 1090 1095 1100 Pro Leu Ala Thr Gly Asn Glu Thr Val Ala Lys Gly Asn Pro Thr Ser 1105 1110 1115 1120 Thr Thr Glu Lys Lys 1125 Leu Glu His His

<210> 9 <211> 3492 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <220>

<221> CDS <222> (1) . . (3492) <400> 9

atg Met 1 ttt Phe aaa Lys tet Ser aat Asn 5 tat Tyr gaa Glu aga Arg aaa Lys atg Met 10 cgt Arg tat Tyr tcc Ser att Ile cgt Arg 15 aaa Lys 48 ttt agt gta aga gta gct agt gta gcg gta gct agt ttg ttc atg gga 96 Phe Ser Val Gly Val Ala Ser Val Ala Val Ala Ser Leu Phe Met Gly 20 25 30 agc gtt gct cat gca agt gag ctt gta aag cac gat agt gtg aag act 144 Ser Val Ala His Ala Ser Glu Leu Val Lys His Asp Ser Val Lys Thr 35 40 45 acc gag gtt gca gct aag ccc tat cca agt atg gct caa aca gat caa 192 Thr Glu Val Ala Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin Thr Asp Gin

50 55 60 • ·

9 9

gga Gly 65 aat Asn cat Asn tca Ser tca Ser tcc Ser 70 tcg Ser gaa Glu ctt Leu gag Glu aca Thr 75 aca Thr aag Lys atc Ile gaa Glu att Ile 80 240 cct aca aca gac ata aaa aaa get gtt gaa ccg ctc gag aaa aca get 288 Pro Thr Thr Asp Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro Leu Glu Lys Thr Ala 85 90 95 ggg gaa aca tet gcc act gat act gga aaa ega gag aaa caa tta caa 336 Gly Glu Thr Ser Ala Thr Asp Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin 100 105 110 caa tgg aaa aat aat cta aaa aat gat gtg cat aac aca att cta tet 384 Gin Trp Lys Asn Asn Leu Lys Asn Asp Val His Asn Thr Ile Leu Ser 115 120 125 cat gaa cag aaa aat gag ttt aaa aca aaa att gat gaa aca aat gat 432 His Glu Gin Lys Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp 130 135 140 tet gat gca tta tta gaa tta gaa aat caa ttt aac gaa act aat aga 480 Ser Asp Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr Asn Arg 145 150 155 160 ctg tta cac atc aaa caa cat gaa gaa gtt gag aaa gat aag aaa get 528 Leu Leu His Ile Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys Asp Lys Lys Ala 165 170 175 aag caa cag aaa act ctg aaa cag tca gat acc aaa gta gat cta agc 576 Lys Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser 180 185 190 aat att gac aaa gag ctt aat cat caa aaa agt caa gtt gaa acc atg 624 Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin Val Glu Thr Met 195 200 205 gca gag caa ctc ggg atc aca aat gaa gat aaa gat tet atg ctg aaa 672 Ala Glu Gin Leu Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu Lys 210 215 220 aaa atc gaa gat att cgt aaa caa get caa caa gca gat aaa aaa gaa 720 Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu 225 230 235 240 gat gcc gaa gta aag gtt cgt gaa gaa cta ggt aaa ctc ttt act tca 7 68 Asp Ala Glu Val Lys Val ř.rg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Thr Ser 245 250 255 act aaa get ggt ctg gat Ca 3 gaa att caa gag cat gtg aag aaa gaa 816 Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin Glu His Val Lys Lys Glu 260 265 270

acg act agt gag gaa aat act cag aaa gtt gat gaa cac tat cct aat Thr Thr Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu His Tyr Pro Asn 864 275 280 285 age ctt cag aac ctt gct caa aaa tet ctt gaa gaa cta í gat aag gca 912 Ser Leu Gin Asn Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu Glu Leu : Asp i Lys : Ala 290 295 300 act acc aat gaa caa gct aca caa gtt aaa aat caa ttc tta gaa aac 960 Thr Thr Asn Glu Gin Ala Thr Gin Val Lys Asn Gin Phe Leu Glu Asn 305 310 315 320 gct caa aag ctc aaa gaa ata caa cct ctt atc aaa gaa acg aat gtg 1008 Ala Gin Lys Leu Lys Glu Ile Gin Pro Leu Ile Lys Glu Thr Asn Val 325 330 335 aaa ttg tat aag gct atg agt gag age ttg gag cag gtt gag aag caa 1056 Lys Leu Tyr Lys Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu Gin Val Glu Lys Gin 340 345 350 tta aaa cat aat tcg caa gct aat tta gaa gat ttg gtt gcg aaa tet 1104 Leu Lys His Asn Ser Gin Ala Asn Leu Glu Asp Leu Val Ala Lys Ser 355 360 365 aaa gaa atc gta aga gaa tac gaa gga aaa ctt aat caa tet aaa aat 1152 Lys Glu Ile Val Arg Glu Tyr Glu Gly Lys Leu Asn Gin Ser Lys Asn 370 375 380 ctt cca gaa . .tta aag caa cta gaa gag gaa gct cat tcg aag ttg aaa 1200 Leu Pro Glu Leu Lys Gin Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys 385 390 395 400 caa gtt gtg gag gat ttt aga aaa aaa ttt aaa acc tca gag caa gtg 1248 Gin Val Val Glu Asp Phe Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val 405 410 415 aca cca aaa aaa cgt gtc aaa ega gat tta gct gct aat gaa aat aat 1296 Thr Pro Lys Lys Arg Val Lys Arg Asp Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn 420 425 430 caa caa aag att gag tta aca gtt tca cca gag áat atc act gta tat 1344 Gin Gin Lys Ile Glu Leu Thr Val Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr 435 440 445 gaa ggt gaa gac ctg aaa ttt aca ctc aca gct aaa agt gat tcg aag 1392 Glu Gly Glu Asp Leu Lys Phe Thr Leu Thr Ala Lys Ser Asp Ser Lys 450 455 4 60 acg acg ttg gac ttc agt gat ctt tta aca aaa tat aat ccg tet gta 1440 Thr Thr Leu Asp Phe Ser Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val 465 470 475 480

tca gat aga att agt aca aat tat aag act aac acg gat aat cat aag 1488 Ser Asp Arg Ile Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys 485 490 4 95

att Ile gcc Ala gaa Glu atc Ile 500 act Thr atc Ile aag Lys aat Asn ttg Leu 505 aag Lys cta Leu aat Asn gaa Glu agt Ser 510 caa aca Gin Thr 1536 gtg act cta aaa gct aaa gat gat tet ggc aat gta gtt caa aaa aca 1584 Val Thr Leu Lys Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Gin Lys Thr 515 520 525 ttc act att aca gtg caa aag aaa gag gag aaa caa gtt cct aaa aca 1632 Phe Thr Ile Thr Val Gin Lys Lys Glu Glu Lys Gin Val Pro Lys Thr 530 535 540 cca gag cag aaa gat tet aaa acg gaa gaa aag gtt cct caa gaa cca 1680 Pro Glu Gin Lys Asp Ser Lys Thr Glu Glu Lys Val Pro Gin Glu Pro 545 550 555 560 aaa tca aat gac aag aat caa tta caa gag ttg att aaa tca gct caa 1728 Lys Ser Asn Asp Lys Asn Gin Leu Gin Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gin 565 570 575 caa caa ctg gaa aag tta gaa aaa gca ata aaa gaa tta atg gag caa 1776 Gin Gin Leu Glu Lys Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin 580 585 590 cca gag att .cca tcc aat cca gag tat ggt att caa aaa tet att tgg 1824 Pro Glu íle Pro Ser Asn Pro Glu Tyr Gly Ile Gin Lys Ser Ile Trp 595 600 605 gag tca caa aaa gag cct atc cag gaa gcc ata aca agt ttt aag aag 1872 Glu Ser Gin Lys Glu Pro Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Lys Lys 610 615 620 att att ggt gat tca tet tca aaa tac tac aca gag cac tat ttt aac 1920 Ile Ile Gly Asp Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu His Tyr Phe Asn 625 630 635 640 aaa tat aaa tet gat ttt atg aat tat caa ctt cat gca caa atg gag 1968 Lys Tyr Lys Ser Asp Phe Met Asn Tyr Gin Leu His Ala Gin Met Glu 645 650 655 atg ctg act aga aaa gtg gtt cag tat atc aac aaa tat cct gat aat 2016 Met Leu Thr Arg Lys Val Val Gin Tyr Ile Asn Lys Tyr Pro Asp Asn 660 665 670 gca gaa att aaa aag ata ttt gag tca gat atg aag aga acg aaa gaa 2064 Ala Glu Ile Lys Lys Ile Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu 675 680 685

gat Asp aat Asn 690 tac gga agt tta gaa aat gat gct ttg aaa ggc tat ttt gag Tyr Gly Ser Leu Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu 2112 695 700 aaa tat ttc ctt aca cca ttt aat aaa att aag cag att gta gat gat 2160 Lys Tyr Phe Leu Thr Pro Phe Asn Lys Ile Lys Gin Ile Val Asp , Asp 705 710 715 720 ttg gat aaa aaa gta gaa caa gat cag cca gca cca att ccg gaa aat 2208 Leu Asp Lys Lys Val Glu Gin Asp Gin Pro Ala Pro Ile Pro Glu Asn 725 730 735 tca gaa atg gat cag gct aag gaa aag gct aag att gct gta tcg aag 2256 Ser Glu Met Asp Gin Ala Lys Glu Lys Ala Lys Ile Ala Val Ser Lys 740 745 750 tat atg agt aag gtt tta gat gga gtt cat caa cat ctg cag aag aaa 2304 Tyr Met Ser Lys Val Leu Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys 755 760 765 aat aac act aaa att gtt gat ctt ttt aag gaa ctt gaa gcg att aaa 2352 Asn Asn Thr Lys Ile Val Asp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys 770 775 780 caa caa act att ttt gat att gac aat gca aag act gaa gta gag att 2400 Gin Gin Thr Ile Phe Asp Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile 785 790 795 800 gat aac tta gta cac gat gca ttc tca aaa atg aat gct act gtt gct 2448 Asp Asn Leu Val His Asp Ala Phe Ser Lys Met Asn Ala Thr Val Ala 805 810 815 aaa ttt caa aaa ggt cta gag aca aat acg cca gaa act cca cat aca 2496 Lys Phe Gin Lys Gly Leu Glu Thr Asn Thr Pro Glu Thr Pro His Thr 820 825 830 ccc aag att cca gag cta cct caa gcc cca gat aca ccg cag gct cca 2544 Pro Lys Ile Pro Glu Leu Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro 835 840 845 gac aca ccg cat gtt ccg gaa tca cca aag gcc cca gaa gca ccc cgt 2592 Asp Thr Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg 850 855 860 gtt ccg gaa tca cca aac act cca gaa gca ccg cat gtt ccc caa tca 2640 Val Pro Glu Ser Pro Asn Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro Gin Ser 865 870 875 880 cca aag gcc cca gaa gca ccg cgt gtt ccg gaa tca cca aac act cca 2688 Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Asn Thr Pro 885 890 895

• « «···

S · <*

gaa gca ccg cat gtt ccg gaa tea cca aag ( act cca i gaa i gca cca i aag 2736 Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro • Lys Thr Prc > Glu i Ala Pro Lys 900 905 910 att ccg gaa ccc cct aag act cca gac gtc cct aag Ctt cca gac : gtc 2784 Ile Pro Glu Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val 915 920 925 cct aag ctt cca gac gtc cct aag ctt cca gat gca ccc aag tta cca 2832 Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro 930 935 940 gat ggg tta aat aaa gtt gga caa gca gta ttt aca tea act gat gga 2880 Asp Gly Leu Asn Lys Val Gly Gin Ala Val Phe Thr Ser Thr Asp Gly 945 950 955 960 aat act aag gtt acg gtt gta ttt gat aaa cct aca gat gct gat aag 2928 Asn Thr Lys Val Thr Val Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys 965 970 975 tta cat ctc aag gaa cta acg acg aaa gag ttg gct gat aaa att gct 2976 Leu His Leu Lys Glu Leu Thr Thr Lys Glu Leu Ala Asp Lys Ile Ala 980 985 990 cat aaa aca gga gga gga aca gtt cgt gtg ttt gac tta tet ctt tet 3024 His Lys Thr Gly Gly Gly Thr Val Arg Val Phe Asp Leu Ser Leu Ser 995 1000 1005 aaa gga ggc aag gaa aca cat gtc aat gga caa ega act gtt cgg ctc 3072 Lys Gly Gly Lys Glu Thr His Val Asn Gly Gin Arg Thr Val Arg Leu 1010 1015 1020 gcg Ctt ggg cag act ggc tea gat gtt cac gtc tat cac gta aag gaa 3120 Ala Leu Gly Gin Thr Gly Ser Asp Val His Val Tyr His Val Lys Glu 1025 1030 1035 1040 aat ggc gac ctt gag cgt att cct tet aaa gtt gaa aat ggg caa gtt 3168 Asn Gly Asp Leu Glu Arg Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val 1045 1050 1055 gtt ttt aaa acg aac cac rte agt ttg ttt gcg att aag aca ctt tet 3216 Val Phe Lys Thr Asn His Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser 1060 1065 1070 aag gat caa aat gtt act cca ccg aag cag act aaa cct tet acc caa 3264 Lys Asp Gin Asn Val Thr Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin 1075 1080 1085 ggc agt caa gta gag att gca gag agt caa act gga aaa ttc cag agt 3312 Gly Ser Gin 'J a 1 Glu Ile Ala Glu Ser Gin Thr Gly Lys Phe Gin Ser 1090 1095 1100

• ·« ·· ···· ·· • · · · · · ’ · · • · · · · · · * « · • · · « · « ·· V • · * · · ··» • k · 99 ·· · 4 · * « • ♦

aaa gca Lys Ala 1105 get Ala aat Asn cat His aaa Lys 1110 gca Ala ctc Leu get Ala act Thr gga Gly 1115 aat Asn gaa Glu aca Thr gtg gca Val Ala 1120 3360 aaa gga aat cct aca tea aca acg caa aag aaa ttg cca tat aca gg^a 3408 Lys Gly Asn Pro Thr Ser Thr Thr Gin Lys Lys Leu Pro Tyr Thr Gly 1125 1130 1135 gtg gca tet aat cta gtt ctt gaa att atg ggt ctc ctt ggt ttg att 3456 Val Ala Ser Asn Leu Val Leu Glu Ile Met Gly Leu Leu Gly Leu Ile 1140 1145 1150 gga act tea ttc atc gca atg aaa aga aga aaa tea 3492 Gly Thr Ser Phe Ile Ala Met Lys Arg Arg Lys Ser 1155 1160

<210> 10 <211> 1164 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae

<400> 10 Met 1 Phe Lys Ser Asn Tyr 5 Glu Arg Lys Met 10 Arg Tyr Ser Ile Arg 15 Lys Phe Ser Val Gly Val Ala Ser Val Ala Val Ala Ser Leu Phe Met Gly 20 25 30 Ser Val Ala His Ala Ser Glu Leu Val Lys His Asp Ser Val Lys Thr 35 40 45 Thr Glu Val Ala Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin Thr Asp Gin 50 55 60 Gly Asn Asn Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Lys Ile Glu Ile 65 70 75 80 Pro Thr Thr Asp Ile Lys Lys Ala Val Glu Pro Leu Glu Lys Thr Ala 85 90 95 Gly Glu Thr Ser Ala Thr Asp Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin 100 105 110 Gin Trp Lys Asn Asn Leu Lys Asn Asp Val His Asn Thr Ile Leu Ser 115 120 125 His Glu Gin Lys Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp 130 135 140 Ser Asp Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr Asn Arg 145 150 155 160

• Φ • Φ φφφφ

Leu Leu His Ile Lys 165 Gin His Glu Glu Val 170 Glu Lys Asp Lys Lys 175 Ala Lys Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser 180 185 190 Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin Val Glu Thr Met 195 200 205 Ala Glu Gin Leu Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu Lys 210 215 220 Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu 225 230 235 240 Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Thr Ser 245 250 255 Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin Glu His Val Lys Lys Glu 260 265 270 Thr Thr Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu His Tyr Pro Asn 275 280 285 Ser Leu Gin Asn Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu Glu Leu Asp Lys Ala 290 295 300 Thr Thr Asn Glu Gin Ala Thr Gin Val Lys Asn Gin Phe Leu Glu Asn 305 310 315 320 Ala Gin Lys Leu Lys Glu Ile Gin Pro Leu Ile Lys Glu Thr Asn Val 325 330 335 Lys Leu Tyr Lys Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu Gin Val Glu Lys Gin 340 345 350 Leu Lys His Asn Ser Gin Ala Asn Leu Glu Asp Leu Val Ala Lys Ser 355 360 365 Lys Glu Ile Val Arg Glu Tyr Glu Gly Lys Leu Asn Gin Ser Lys Asn 370 375 380 Leu Pro Glu Leu Lys Gin Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys 385 390 395 400 Gin Val Val Glu Asp Phe Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val 405 410 415 Thr Pro Lys Lys Arg Val Lys Arg Asp Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn 420 425 430

Gin Gin Lys 435 Ile Glu Leu Thr Val 440 Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr 445 Glu Gly Glu Asp Leu Lys Phe Thr Leu Thr Ala Lys Ser Asp Ser ' Lys 450 455 460 Thr Thr Leu Asp Phe Ser Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val 465 470 475 480 Ser Asp Arg Ile Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys 485 4 90 495 Ile Ala Glu Ile Thr Ile Lys Asn Leu Lys Leu Asn Glu Ser Gin Thr 500 505 510 Val Thr Leu Lys Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Gin Lys Thr 515 520 525 Phe Thr Ile Thr Val Gin Lys Lys Glu Glu Lys Gin Val Pro Lys Thr 530 535 540 Pro Glu Gin Lys Asp Ser Lys Thr Glu Glu Lys Val Pro Gin Glu Pro 545 550 555 560 Lys Ser Asn Asp Lys Asn Gin Leu Gin Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gin 565 570 575 Gin Gin Leu Glu Lys Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin .580 585 590 Pro Glu Ile Pro Ser Asn Pro Glu Tyr Gly Ile Gin Lys Ser Ile Trp 595 600 605 Glu Ser Gin Lys Glu Pro Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Lys Lys 610 615 620 Ile Ile Gly Asp Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu His Tyr Phe Asn 625 630 635 640 Lys Tyr Lys Ser Asp Phe Met Asn Tyr Gin Leu His Ala Gin Met Glu 64 5 650 655 Met Leu Thr Arg Lys Val Val Gin Tyr Ile Asn Lys Tyr Pro Asp Asn 660 665 670 Ala Glu Ile Lys Lys Ile Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu 675 680 685 Asp Asn Tyr Gly Ser Leu Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu 690 695 700

Lys Tyr Phe Leu Thr Pro Pne Asn Lys Ile Lys Gin Ile Val Asp Asp « · • · • · · ·

-49705 710 715 720

Leu Asp Lys Lys Val 725 Glu Gin Asp Gin Pro 730 Ala Pro Ile Pro Glu 735 Asn Ser Glu Met Asp Gin Ala Lys Glu Lys Ala Lys Ile Ala Val Ser Lys 740 745 750 Tyr Met Ser Lys Val Leu Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys 755 760 765 Asn Asn Thr Lys Ile Val Asp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys 770 775 780 Gin Gin Thr Ile Phe Asp Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile 785 790 795 800 Asp Asn Leu Val His Asp Ala Phe Ser Lys Met Asn Ala Thr Val Ala 805 810 815 Lys Phe Gin Lys Gly Leu Glu Thr Asn Thr Pro Glu Thr Pro His Thr 820 825 830 Pro Lys Ile Pro Glu Leu Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro 835 840 845 Asp Thr Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg 850 855 860 Val Pro Glu Ser Pro Asn Thr Pro Glu Ala Pro His Val Pro Gin Ser 865 870 875 880 Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Asn Thr Pro 885 890 895 Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys 900 905 910 Ile Pro Glu Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val 915 920 925 Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro 930 935 940 Asp Gly Leu Asn Lys Val Gly Gin Ala Val Phe Thr Ser Thr Asp Gly 945 950 955 960 Asn Thr Lys Val Thr Val Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys 965 970 975 Leu His Leu Lys Glu Leu Thr Thr Lys Glu Leu Ala Asp Lys Ile Ala 930 985 990

His Lys Thr 995 Gly Gly Gly Thr Val 1000 Arg Val Phe Asp Leu 1005 Ser Leu Ser Lys Gly Gly Lys Glu Thr His Val Asn Gly Gin Arg Thr Val Arg Leu 1010 1015 1020 Ala Leu Gly Gin Thr Gly Ser Asp Val His Val Tyr His Val Lys Glu 1025 1030 1035 1040 Asn Gly Asp Leu Glu Arg Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val 1045 1050 1055 Val Phe Lys Thr Asn His Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser 1060 1065 1070 Lys Asp Gin Asn Val Thr Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin 1075 1080 1085 Gly Ser Gin Val Glu Ile Ala Glu Ser Gin Thr Gly Lys Phe Gin Ser 1090 1095 1100 Lys Ala Ala Asn His Lys Ala Leu Ala Thr Gly Asn Glu Thr Val Ala 1105 1110 1115 1120 Lys Gly Asn Pro Thr Ser Thr Thr Gin Lys Lys Leu Pro Tyr Thr Gly 1125 1130 1135 Val Ala Ser Asn Leu Val Leu Glu Ile Met Gly Leu Leu Gly Leu Ile 1140 1145 1150 Gly Thr Ser Phe Ile Ala Met Lys Arg Arg Lys Ser

1155 1160 <210> 11 <211> 106 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 11

Leu 1 Leu His Ile Lys 5 Gin His Glu Glu Val 10 Glu Lys Asp Lys Lys 15 Ala Lys Gin Gin Lys 20 Thr Leu Lys Gin Ser 25 Asp Thr Lys Val Asp 30 Leu Ser Asn Ile Asp 35 Lys Glu Leu Asn His 40 Gin Lys Ser Gin Val 45 Glu Lys Met Ala Glu Gin Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu Lys

50 55 60

Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu 65 70 75 80 Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser Ser 85 90 95 Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin

100 105 <210> 12 <211> 147 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 12

Asp Ser 1 Asp Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr 15 Asn 5 10 Arg Leu Leu His Ile Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys Asp Lys Lys 20 25 30 Ala Lys Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu 35 40 45 Ser Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin Val Glu Lys 50 55 60 Met Ala Glu Gin Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu 65 70 75 80 Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys 85 90 95 Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser 100 105 110 Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin Glu His Val Lys Lys 115 120 125 Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu His Tyr Ala 130 135 140 Asn Ser Leu 145

<210> 13 <211> 147 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae • · • · · ·

<400> 13 Asp Ser 1 Asp Ala Leu Leu Glu 5 Leu Glu Asn 10 Gin Phe Asn Glu Thr Asn 15 Arg Leu Leu His Ile Lys Gin His Glu Glu Val Glu Lys Asp Lys Lys 20 25 30 Ala Lys Gin Gin Lys Thr Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu 35 40 45 Ser Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin Val Glu Lys 50 55 60 Met Ala Glu Gin Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu 65 70 75 80 Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys 85 90 95 Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ser 100 105 110 Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin Glu His Val Lys Lys 115 120 125 Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu His Tyr Ala 130 135 140 Asn Ser Leu 145 <210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 14 > Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin 1 5 10 15 Val Glu Lys Met Ala Glu Gin Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp 20 25 30 Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala 35 40 45 Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys 50 55 60 Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin Glu His

• · * ·

65 70 75 80 Val Lys Lys Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu 85 90 95 His Tyr Ala Asn Ser Leu Gin Asn Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu

100 105 110 <210> 15 <211> 111 <212> PRT

<213> Streptococcus agalactiae <400> 15 Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin 1 5 10 15 Val Glu Lys Met Ala Glu Gin Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp 20 25 30 Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala 35 40 45 Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys 50 55 60 Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin Glu His 65 70 75 80 Val Lys Lys Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu 85 90 95 His Tyr Ala Asn Ser Leu Gin Asn Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu 100 105 110

<210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae

<400> 16 Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin 1 5 10 15 Val Glu Lys Met Ala Glu Gin Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp 20 25 30

Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala

35 40 45

I

-54Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys

50 55 60

Leu 65 Phe Ser Ser Thr Lys 70 Ala Gly Leu Asp Gin 75 Glu Ile Gin Glu His 80 Val Lys Lys Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu 85 90 95 His Tyr Ala Asn Ser Leu Gin Asn Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu Glu 100 105 110 Leu Asp Lys Ala Thr Thr Asn Glu

115 120 <210> 17 <211> 120 <212> PRT

<213> Streptococcus agalactiae <400> 17 Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin 1 5 10 15 Val Glu Lys Met Ala Glu Gin Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp 20 25 30 Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala 35 40 45 Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys 50 55 60 Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin Glu His 65 70 75 80 Val Lys Lys Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu 85 90 95 His Tyr Ala Asn Ser Leu Gin Asn Leu Ala Gin Lys Ser Leu Glu Glu 100 105 110 Leu Asp Lys Ala Thr Thr Asn Glu 115 120

<210> 18 <211> 58 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae • *

-55<400> 18

Val 1 Asp Leu Ser Asn 5 Ile Asp Lys Glu Leu 10 Asn His Gin Lys Ser 15 Gin Val Glu Lys Met 20 Ala Glu Gin Lys Gly 25 Ile Thr Asn Glu Asp 30 Lys Asp Ser Met Leu 35 Lys Lys Ile Glu Asp 40 Ile Arg Lys Gin Ala 45 Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val

50 55 <210> 19 <211> 58 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 19

50 55 <210> 20 <211> 102 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae

<400> 20 Glu Leu Asn 10 His Gin Lys Ser 15 Gin Val 1 Asp Leu Ser Asn 5 Ile Asp Lys Val Glu Lys Met Ala Glu Gin Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp 20 25 30 Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala 35 40 45 Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys 50 55 60

Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin Glu His

-5665 70 75 80

Val Lys Lys Glu Thr Ser Ser Glu Glu Asn Thr Gin Lys Val Asp Glu

85 90 95

His Tyr Ala Asn Ser Leu

100 <210> 21 <211> 78 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 21

Val Asp 1 Leu Ser Asn 5 Ile Asp Lys Glu Leu Asn 10 His Gin Lys Ser 15 Pro Val Glu Lys Met Ala Glu Pro Lys Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp 20 25 30 Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala 35 40 45 Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys 50 55 60 Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin

65 . 70 75 <210> 22 <211> 78 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae

<400> 22 Ile Asp Lys Glu Leu Asn 10 His Gin Lys Ser 15 Gin Val 1 Asp Leu Ser Asn 5 Val Glu Ala Met Ala Glu Gin Ala Gly Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp 20 25 30 Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala 35 40 45 Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val Lys Val Arg Glu Glu Leu Gly Lys 50 55 60 Leu Phe Ser Ser Thr Lys Ala Gly Leu Asp Gin Glu Ile Gin 65 70 75

<210> 23 <211> 72 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 23

Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys

1 5 Glu Ala Gly Ile 20 Thr Asn Glu Asp Glu Asp Ile 35 Arg Lys Gin Ala Gin 40 Glu Val 50 Lys Val Arg Glu Glu 55 Leu Ala 65 Gly Leu Asp Gin Glu 70 Ile Gin

Glu Leu 10 Asn His Gin Lys Ser 15 Gin Lys 25 Asp Ser Met Leu Lys 30 Lys Ile Gin Ala Asp Lys Lys 45 Glu Asp Ala Gly Lys Leu Phe 60 Ser Ser Thr Lys

<210> 24 <211> 78 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 24

Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys

1 5 Val Glu Thr Met 20 Ala Glu Gin Leu Ser Met Leu 35 Lys Lys Ile Glu Asp 40 Asp Lys 50 Lys Glu Asp Ala Glu 55 Val Leu 65 Phe Ser Ser Thr Lys 70 Ala Gly

Glu Leu Asn His Gin Lys Ser Gin

10 15 Gly 25 Ile Thr Asn Glu Asp 30 Lys Asp Ile Arg Lys Gin Ala 45 Gin Gin Ala Lys Val Arg Glu 60 Glu Leu Gly Lys Leu Asp Gin 75 Glu Ile Gin

<210> 25 <211> 9 <212> PRT

<213> Streptococcus agalactiae <400> 25 Glu Leu Ile Lvs Ser Ala Gin Gl

• · · ·

-581 5 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <400> 26 gttgaagcaa tggcagagca agcgggaatc acaaatgaag 40 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <400> 27 gattcccgct tgctctgcca ttgcttcaac ttgacttttt tg <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Streptococcus agalactiae <400> 28 aaggatccaa gtgagcttgt aaaggacgat

<210> 29 <211> <212> <213> 32 DNA Streptococcus agalactiae <400> 29 aaaactcgag tttcttttcc gttgttgatg ta 32

<210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 30 His Gin Lys Ser Gin Val Glu Lys Met Ala Glu Gin Lys Gly 1 5 10

<210> 31 <211> 984 <212> PRT

-59<213> Streptococcus agalactiae <400> 31

Ser Glu 1 Leu Val Lys Asp Asp Ser 5 Val Lys 10 Thr Thr Glu Val Ala 15 Ala Lys Pro Tyr Pro Ser Met Ala Gin Thr Asp Gin Gly Asn Asn Ser Ser 20 25 30 Ser Ser Glu Leu Glu Thr Thr Lys Met Glu Ile Pro Thr Thr Asp Ile 35 40 45 Lys Lys Ala Val Glu Pro Val Glu Lys Thr Ala Gly Glu Thr Ser Ala 50 55 60 Thr Asp Thr Gly Lys Arg Glu Lys Gin Leu Gin Gin Trp Lys Asn Asn 65 70 75 80 Leu Lys Asn Asp Val Asp Asn Thr Ile Leu Ser His Glu Gin Lys Asn 85 90 95 Glu Phe Lys Thr Lys Ile Asp Glu Thr Asn Asp Ser Asp Ala Leu Leu 100 105 110 Glu Leu Glu Asn Gin Phe Asn Glu Thr Asn Arg Leu Leu His Ile Lys 115 120 125 Gin His Glu Glu Val Glu Lys Asp Lys Lys Ala Lys Gin Gin Lys Thr 130 135 140 Leu Lys Gin Ser Asp Thr Lys Val Asp Leu Ser Asn Ile Asp Lys Glu 145 150 155 160 Leu Asn His Gin Lys Ser Gin Val Glu Lys Met Ala Glu Gin Lys Gly 165 170 175 Ile Thr Asn Glu Asp Lys Asp Ser Met Leu Lys Lys Ile Glu Asp Ile 180 185 190 Arg Lys Gin Ala Gin Gin Ala Asp Lys Lys Glu Asp Ala Glu Val· Lys 195 200 205 Val Gin Leu Glu Glu Glu Ala His Ser Lys Leu Lys Gin Val Val Glu 210 215 220 Asp Phe Arg Lys Lys Phe Lys Thr Ser Glu Gin Val Thr Pro Lys Lys 225 230 235 240 Arg Val Lys Arg Asp Leu A.la Ala Asn Glu Asn Asn Gin Gin Lys Ile 245 250 255

Glu Leu Thr Val Ser Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Glu Gly Glu Asp

-60260 265 270

Val Lys Phe 275 Thr Val Thr Ala Lys 280 Ser Asp Ser Lys Thr Thr Leu Asp 285 Phe Ser Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Val Ser Asp Arg Ile 290 295 300 Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Asn Thr Asp Asn His Lys Ile Ala Glu Ile 305 310 315 320 Thr Ile Lys Asn Leu Lys Leu Asn Glu Ser Gin Thr Val Thr Leu Lys 325 330 335 Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Val Val Glu Lys Thr Phe Thr Ile Thr 340 345 350 Val Gin Lys Lys Glu Glu Lys Gin Val Pro Lys Thr Pro Glu Gin Lys 355 360 365 Asp Ser Lys Thr Glu Glu Lys Val Pro Gin Glu Pro Lys Ser Asn Asp 370 375 380 Lys Asn Gin Leu Gin Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gin Gin Glu Leu Glu 385 390 395 400 Lys Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Leu Met Glu Gin Pro Glu Ile Pro 405 410 415 Ser Asn Pro Glu Tyr Gly Ile Gin Lys Ser Ile Trp Glu Ser Gin Lys 420 425 430 Glu Pro Ile Gin Glu Ala Ile Thr Ser Phe Lys Lys Ile Ile Gly Asp 435 440 445 Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu His Tyr Phe Asn Lys Tyr Lys Ser 450 455 460 Asp Phe Met Asn Tyr Gin Leu His Ala Gin Met Glu Met Leu Thr Arg 465 470 475 480 Lys Val Val Gin Tyr Met Asn Lys Tyr Pro Asp Asn Ala Glu Ile Lys 485 490 495 Lys Ile Phe Glu Ser Asp Met Lys Arg Thr Lys Glu Asp Asn Tyr Gly 500 505 510 Ser Leu Glu Asn Asp Ala Leu Lys Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr Phe Leu 515 520 525 Thr Pro Phe Asn Lys Ile Lys Gin Ile Val Asp Asp Leu Asp Lys Lys 530 535 540

• ·

Val 545 Glu Gin Asp Gin Pro 550 Ala Pro Ile Pro Glu 555 Asn Ser Glu Met Asp 560 Gin Ala Lys Glu Lys Ala Lys Ile Ala Val Ser Lys Tyr Met Ser Lys 565 570 575 Val Leu Asp Gly Val His Gin His Leu Gin Lys Lys Asn Asn Ser Lys 580 585 590 Ile Val Asp Leu Phe Lys Glu Leu Glu Ala Ile Lys Gin Gin Thr Ile 595 600 605 Phe Asp Ile Asp Asn Ala Lys Thr Glu Val Glu Ile Asp Asn Leu Val 610 615 620 His Asp Ala Phe Ser Lys Met Asn Ala Thr Val Ala Lys Phe Gin Lys 625 630 635 640 Gly Leu Glu Thr Asn Thr Pro Glu Thr Pro Asp Thr Pro Lys Ile Pro 645 650 655 Glu Leu Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro Gin Ala Pro Asp Thr Pro His 660 665 670 Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser 675 680 685 Pro Lys Thr. Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu Ser Pro Lys Ala Pro 690 695 700 Glu Ala Pro Arg Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro His 705 710 715 720 Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys Ile Pro Lys Pro 725 730 735 Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro 740 745 750 Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu Pro Asp Gly Leu Asn 755 760 765 Lys Val Gly Gin Ala Val Phe Thr Ser Thr Asp Gly Asn Thr Lys Val 770 775 780 Thr Val Val Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp Lys Leu His Leu Lys 785 790 795 800 Glu Val Thr Thr Lys Glu Leu Ala Asp Lys Ile Ala His Lys Thr Gly 805 810 815

• · · ·

-62• ·

Gly Gly Thr Val 820 Arg Val Phe Asp Leu Ser 825 Leu Ser Lys Gly 830 Gly Lys Glu Thr His Val Asn Gly Glu Arg Thr Val Arg Leu Ala Leu Gly Gin 835 840 845 Thr Gly Ser Asp Val His Val Tyr His Val Lys Glu Asn Gly Asp Leu 850 855 860 Glu Arg Ile Pro Ser Lys Val Glu Asn Gly Gin Val Val Phe Lys Thr 865 870 875 880 Asn His Phe Ser Leu Phe Ala Ile Lys Thr Leu Ser Lys Asp Gin Asn 885 890 895 Val Thr Pro Pro Lys Gin Thr Lys Pro Ser Thr Gin Gly Ser Gin Val 900 905 910 Glu Ile Ala Glu Ser Gin Thr Gly Lys Phe Gin Ser Lys Ala Ala Asn 915 920 925 His Lys Ala Leu Ala Thr Gly Asn Glu Thr Val Ala Lys Gly Asn Pro 930 935 940 Thr Ser Thr Thr Glu Lys Lys Leu Pro Tyr Thr Gly Val Ala Ser Asn 945 950 955 960 Leu Val Leu Glu Ile Met Gly Leu Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ser Phe 965 970 975 Ile Ala Met Lys Arg Arg Lys Ser

980

<210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 32 Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro 1 5

<210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 33 Pro Asp Val Fro Lys Leu Pro Asp 1 5

-63<210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 34

Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu

1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 35

Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro

1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 36

Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu

1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 37

Ala Pro Lys Leu Pro Asp Gly Leu

1 5 <210> 38 <211> 8 <2L2> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 38

Glu Thr Pro .-.sp Thr Pro Lys Ile

1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 39

Arg Thr Val Arg Leu Ala Leu Gly

1 5

<210> <211> <212> <213> 40 8 PRT Streptococcus agalactiae <400> 40

Gly Gly Gly Thr Val Arg Val Phe

1 5 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 41

Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro Lys Ile Pro Glu Pro Pro Lys Thr 15 10 ¹⁵

Pro Asp Val Pro <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae

<400> 42 Pro Glu Ala Pro Lys Ile Pro Glu Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro 15 1 5 10 Lys Leu Pro Asp 20

<210> 43 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 43

Lys 1 Ile Pro Glu Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp 15 5 10 Val Pro Lys Leu 20

<210> 44 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 44

Pro Pro Lys Thr Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu

15 10 15

Pro Asp Val Pro <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 45

Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro 15 10 15

Lys Leu Pro Asp <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 46

Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp 15 10 15

Ala Pro Lys Leu <210> 47 <211> 24 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 47

Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro 15 10 15

Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu <210> 48 <211> 24 <212> PRT <213> Streptococcus sp.

<400> 48

Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro 15 10 15

Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu <210> 49 <211> 25 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223>Popis umělé sekvence: Syntetický peptid

<400> 49 . Ser Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp Val 1 5 10 15 Pro Lys Leu Pro Asp Ala Pro Lys Leu 20 25

<210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Streptococcus sp.

<400> 50

Pro Asp Val Pro Lys Leu Pro Asp

1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Streptococcus sp.

<400> 51 • ·

<210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 52 Val Glu Gin Asp Gin Pro Ala Pro Ile Pro Glu Asn Ser Glu 1 5 10

<210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 53 Leu Ala Ala Asn Glu Asn Asn Gin Gin Lys Ile Glu Leu Thr Val 1 5 10 15

<210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<223> Popis neznámého organismu: fragment peptidu <400> 54

Arg Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr

1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<223> Popis neznámého organismu: fragment peptidu <400> 55

Pro Glu Ala Pro His Val

1 5

Pro Glu <210> 56 <211> 8 <212> PRT «« ·· ··»· • · · · * *

1 · » · ··· ·

<213> Neznámý

<220> <223: Popis neznámého organismu: fragment peptidu <400> 56

Ser Pro Lys Ala Pro Glu Ala Pro

1 5 <210> <211> <212> <213> 57 8 PRT Neznámý <220> <223> Popis neznámého organismu: fragment peptidu

<400> 57

Arg Val Pro Glu Ser Pro Lys Thr

1 5 <210> <211> <212> <213> 58 8 PRT Neznámý <220> <223> Popis neznámého organismu: fragment peptidu

<400> 58

Pro Glu Ala Pro His Val Pro Glu

1 5 <210> <211> <212> <213> 59 8 PRT Neznámý

<220> <223> Popis neznámého organismu: fragment peptidu

<400> 59

Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ala Pro

1 5 <210> <211> <212> 60 8 PRT

<213> Neznámý <220> <223> Popis neznámého organismu: fragment peptidů <400> 60 Lys Ile Pro Glu Pro Pro Lys Thr 1 5

<210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<223> Popis neznámého organismu: fragment pepidu .

<400> 61

Pro Asp Gly Leu Asn Lys Val Gly

1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Neznámý <220>

<223> Popis neznámého organismu: fragment peptidů <400> 62

Gin Ala Val Phe Thr Ser Thr Asp

1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> ' Neznámý <220>

<223> Popis neznámého organismu:..fragmen-t peptidů <400> 63

Gly Asn Thr Lys Val Thr Val Val

1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT • · ·· «···

-70- <213> Neznámý <220> <223> Popis neznámého ořganismu: fragment peptidu <400> 64 Phe Asp Lys Pro Thr Asp Ala Asp 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Neznámý <220> <223> Popis neznámého organismu: fragment' peptidu <400> 65 Lys Leu His Leu Lys Glu Val Thr 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Néznámý <220> <223> Popis neznámého organismu: fragment peptidu <400> 66 Thr Lys Glu Leu Ala Asp Lys Ile 1 5 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Neznámý <220> <223> Popis neznámého organismu: fragment peptidu <400> 67 Ala His Lys Thr Gly Gly Gly Thr 1 5 <210> 68 <211> 8 <212> PRT

·· ···· <213>

Neznámý

-71<220>

<223> Popis neznámého organismu: fragment peptidu

<400> 68 Val Arg Val Phe Asp Leu Ser Leu 1 5 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Neznámý <220> <223> Popis neznámého organisinu: fragment peptidu <400> 69 Ser Lys Gly Gly Lys Glu Thr His 1 5

<210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Neznámý <223> Popis neznámého organismu: fragment peptidu <400> 70

Val Asn Gly Glu Arg Thr Val Arg

1 5