JP2001314185A - ブドウ球菌表層蛋白質の輸送を阻害する薬剤をスクリーニングする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明の課題は、グラム陽性菌表層蛋白質の輸
送過程、特にsortase・FemABX活性を阻害する薬剤の、
簡便で多検体処理が容易な、スクリーニング方法を開発
することにある。 【解決手段】本発明者らは、測定の容易な酵素を用い、
酵素のN末端にシグナル配列を、C端側にProtein Aの壁
移行シグナルを接続したレポータ遺伝子を、ブドウ球菌
に導入し、培養上清の酵素活性を測るのみでsortaseあ
るいはFemABX阻害剤がスクリーニングできるレポータ系
を作製した。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】本発明は、グラム陽性菌表層
蛋白質の輸送を阻害し、菌の付着を阻害して、菌の病原
性を減弱させる薬剤をスクリーニングする方法に関す
る。

【従来の技術】１．細菌感染症の変貌 めざましい各種抗生物質の進歩は、人類から感染症の脅
威を取り去り、人類の福祉に多大な貢献を果たしてき
た。そのため、先進諸国において、感染症は過去の疾病
と考えられてきている。しかしながら、現在の化学療法
でも治療が困難な細菌感染症として、１）新たな耐性菌
の出現と拡大、２）再燃・新興感染症の出現、３）日和
見感染症の増加が大きな問題となっている。特に問題に
なっているのは、グラム陽性菌における薬剤耐性の進展
である。米国では、MRSA対策にバンコマイシンが汎用さ
れ、MRSAに有効な唯一の薬剤であるバンコマイシンへの
耐性獲得に対する危惧として捉えられて、新たな抗菌剤
が求められる大きな理由となっている。実際、実験室レ
ベルではバンコマイシン耐性が腸球菌から他のグラム陽
性菌に伝播することが確認されており、昨年末以来バン
コマイシン耐性ブドウ球菌が臨床現場から分離されて、
危惧が現実のものとなった。ブドウ球菌等グラム陽性菌
には強毒菌が多く、薬剤耐性菌による感染では抗菌剤の
効果が望めずに、急激に不幸な転帰を迎えることにな
る。このため、薬剤耐性グラム陽性菌に対して効果を示
す薬剤の開発は急務の要請となっている。

【０００１】２．化学療法剤の開発 現在、開発の主流はMRSA、PRSP、腸球菌等のグラム陽性
菌に対する薬剤であり、オキサゾリジノン誘導体（Phar
macia-Upjohn、Bayer）、ストレプトグラミン誘導体（R
hone-Poulenc）、マクロライド誘導体のケトライド群
（HMR、大正、Abbott）、バンコマイシンの属するグリ
コペプチド誘導体（Eli-Lilly）が開発されているが、
新規骨格を有するのは前一者のみであり、後者化合物群
は既存薬剤と一部交差耐性を示す。またベンチャー企業
により、新たな致死的ターゲットに焦点を当てた探索や
細菌の病原性因子（サルモネラ等細胞内寄生菌における
宿主細胞内での生育に必要な因子）の探索が行われてい
る。

【０００２】３．病原性因子阻害剤の開発 致死的ターゲットの探索とは別に、病原性因子を阻害
し、病原体が病原性を発揮できないようにすることによ
り感染症の発症、進展、持続に効果を示すという、新た
なアプローチも、様々に検討が進められている。これま
でに、緑膿菌エラスターゼ欠損株の感染能低下（Pavlov
skis OR, et al., Infect.Immun., 24: 181-187, 197
9）、カンジダプロテアーゼ抑制による感染能低下（Nee
ly AN, et al., Infect.Immun., 58: 1527-1531, 199
0）等が報告されており、必ずしも殺菌的に作用しなく
ても、感染成立において重要な役割を担っている病原性
因子を抑制することにより、感染防御効果が期待できる
ことが明らかとなっている。病原性因子の中でも、微生
物細胞表層に局在する付着因子は、感染症成立の第一段
階である宿主への付着に必須であり、その後のコロニゼ
ーションの進展にも関与しているため、感染の成立・進
展の防止には、付着を阻害することが最も効果的である
と考えられる。これまでに、大腸菌等の線毛を介した付
着の阻止（宿主レセプターのマスク）による感染防御
（Schaeffer AJ, et al., Infect.Immun., 30: 531-53
7, 1980）といった、宿主側のレセプターあるいは付着
因子をブロックする、付着阻害のアプローチが報告され
ている。

【０００３】４．グラム陽性菌の付着因子 付着因子として、ブドウ球菌ではfibronectin-binding
protein A/B (FnBPA/B), collagen-binding protein (C
na)やclumping factor (ClfA) 等が、レンサ球菌では各
種M蛋白質が同定されている。これに関係する宿主細胞
側の因子（レセプター）として、fibronection, fibrin
ogen, collagen, elastin, laminin, prothrombin, thr
ombospondin, bone sialoprotein, vitronectin等の細
胞外マトリクスが知られている。ブドウ球菌の細胞外マ
トリクスに対する結合蛋白質のうち、付着においてmajo
rな機能をになうのが、FnBPA/BとCnaであり、これら蛋
白質の欠損株や低産生株では、細胞に対する結合能が低
下することによりvirulenceが低下することが認められ
ている (R. A. Proctor, et al., Infect.Immun., 57:
2306-2312, 1989、P. Vaudaux, et al., Infect.Immu
n., 63: 4738-4743, 1995、M. Hook, et al., Infect.I
mmun., 62: 152-161, 1994、S. A. Hienz, et al., J.
Infect. Dis., 174: 83-88, 1996）。レンサ球菌におい
ても、M蛋白質欠損株はvirulenceの低下が認められてい
る（D. L. Hasty, et al., Infect. Immun., 60: 2147-
2152, 1992）。

【０００４】５．Sortaseについて 付着に重要な働きをするこれら付着因子は、共通してN
末端にsignal配列を、C端側にLPXTGというmotif、続い
て疎水性領域、正電荷を有する荷電末端から成るsortin
g signalを有しており、 LPXTG motif 中のThr残基を介
して、細胞壁ペプチドグリカンの架橋ペプチドのアミノ
末端に結合していることが最近明らかになった（W. W.
Nararre and O. Schneewind, Mol. Microbiol., 14: 11
5-121, 1994）。この細胞壁蛋白質の転移反応をつかさ
どる酵素がsortase（O. Schneewind,et al., Science,
268: 103-106, 1995、Hong Ton-That,et al., Proc. Na
tl.Acad. Sci. USA, 96: 12424-12429, 1999）である
（図１）。付着因子以外でも、IgGのFc部分に結合し、
オプソニン効果を妨げることにより病原体を食細胞から
守っていると言われているブドウ球菌のprotein Aも、
同様の構造を有し、ペプチドグリカンに結合している。
従って、このsortaseの働きを抑えることにより、付着
因子やprotein A等の外層蛋白質のassemblyを抑制し、
ブドウ球菌のコロニゼーションが妨げられると考えられ
る。また、一つの結合蛋白質の欠損株よりも複数の結合
蛋白質の欠損株の方が、virulenceの低下は著しいこと
（近藤勇、臨床と微生物、24: 213-214, 1997）から、
複数の蛋白質の表層での発現を抑制することが可能なso
rtaseの阻害は、大きなvirulence低下を招くと考えられ
る。更に、LPXTG motifを有する表層蛋白質はグラム陽
性菌にあまねく存在している（表１）ことから、この転
移反応は他のグラム陽性菌でも共通であると考えられ、
sortaseはグラム陽性菌感染症全般に対する新しい創薬
のターゲットになると考えられる。ブドウ球菌のentero
toxin B（SEB）のC端にprotein Aのsorting signalを結
合し、SEBを電気泳動で解析してSEBのprocessingを追っ
た報告がなされ（Sarkis K. et. al., Science, 285: 7
60-763, 1999）、sortase阻害剤も報告されている（Hon
g Ton-That, et. al., J. Biol. Chem.274: 24316-2432
0, 1999）。しかし、新たなsortase阻害剤につながる、
多検体アッセイに適したsortase阻害剤のスクリーニン
グ系は未開発であった。

【０００５】６．FemABXについて fem (factor essential for methicillin-resistance)
遺伝子は、MRSAにおいて竅|ラクタム剤耐性発現に必須
の因子として、femAからfemFまでの6種類が同定された
が、現在では通常の生育に必要な因子と考えられてい
る。この中でFemA及びFemBはブドウ球菌ペプチドグリカ
ンの架橋ペプチド−ペンタグリシンの形成に関与し、Fe
mAは2番目3番目のGlyの、FemBは4番目5番目のGlyの架橋
反応に関与している（図２）ことが最近明らかになった
（A. M. Strand饅ochn, et al., J. Bacteriol., 179:
9-16, 1997）。1番目のGlyの架橋反応に関わる遺伝子は
まだ同定されていないが、それらしき変異株は単離され
（femXが想定されている）、この変異株はほとんど通常
では生育できないと報告されている（U. Kopp, et al.,
Mol. Drug Resist., 2: 29-41, 1996、H. Labischinsk
i, 26th Inter. Symp. Drug Resist., 1997）。FemABX
の阻害剤は、ペプチドグリカンの架橋ペプチド−ペンタ
グリシンの形成を阻害し、単剤であるいは既存の竅|ラ
クタム剤（ブドウ球菌の産生する竅|ラクタマーゼに安
定な竅|ラクタム剤）と併用することにより、MRSA感染
症に対し効果を示すと考えられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、グラ
ム陽性菌表層蛋白質の輸送過程、特にsortase・FemABX
活性を阻害する薬剤の、簡便で多検体処理が容易な、ス
クリーニング方法を開発することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】Sortase・Fem蛋白質に関
する上記の知見より、発明者らは、付着因子自体の微生
物表層での発現を阻害するというアプローチを考えた。
そして「N末端にシグナル配列を、C端側にsorting sign
alを有するペプチドグリカン結合性表層蛋白質は、sort
aseを阻害すれば細胞壁に結合せず、またFemABXを阻害
してペプチドグリカン架橋グリシンを欠損させても表層
蛋白質は細胞壁に結合せず、培地中に放出される」とい
う仮説をたてた。この仮説にもとづけば、培地中へ遊離
されるペプチドグリカン結合性表層蛋白質を検出するこ
とにより、1) 表層蛋白質の細胞壁への転移反応阻害（s
ortaseの阻害）と 2) グリシン架橋の形成阻害（FemABX
の阻害）のいずれかを検出することが可能であると考え
た。本発明者らは、測定の容易な酵素として竅|ラクタ
マーゼを用い、竅|ラクタマーゼのN末端にシグナル配列
を、C端側にProtein Aの壁移行シグナルを接続したレポ
ータ遺伝子を、ブドウ球菌に導入し、sortaseあるいはF
emABXが阻害されると竅|ラクタマーゼが培地中に放出さ
れるレポータ系を作製した。そして、壁移行シグナルを
欠失させた場合には、竅|ラクタマーゼが培地中に遊離
してくることを確認して本発明を完成するに到った。す
なわち本発明は、 (1)以下の工程： 1)グラム陽性菌に、N末端にシグナル配列を有し、C末端
にsorting signalを有する酵素をコードする遺伝子を導
入し、 2)該グラム陽性菌を被検物質の存在下で培養し、 3)培地中の該酵素の活性を測定する、 から成る、グラム陽性菌表層蛋白質の輸送過程を阻害す
る物質をスクリーニングする方法、 (2)グラム陽性菌表層蛋白質の輸送過程のsortaseを阻害
する物質をスクリーニングする請求項１に記載の方法、 (3)グラム陽性菌表層蛋白質の輸送過程のFemABXを阻害
する物質をスクリーニングする請求項１に記載の方法、 (4)sorting signalがプロテインＡのsorting signalで
ある、請求項１に記載の方法、 (5)酵素が竅|ラクタマーゼである、請求項１に記載の方
法、 (6)グラム陽性菌がブドウ球菌である、請求項１に記載
の方法、 (7)N末端にシグナル配列を有し、C末端にsorting signa
lを有する酵素をコードする遺伝子を導入したグラム陽
性菌、 (8)酵素が竅|ラクタマーゼである請求項６に記載のグラ
ム陽性菌、 (9)N末端にシグナル配列を有し、C末端にsorting signa
lを有する酵素をコードする遺伝子を導入したブドウ球
菌、に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態につい
て、１．レポータ遺伝子の構築、２．レポータ遺伝子の
ブドウ球菌への導入、３．薬剤のスクリーニング法の順
に詳細に説明する。 １．レポータ遺伝子の構築 レポータ遺伝子は、promoter、signal配列、酵素、sort
ing signal、terminatorの順に構成される。それぞれの
配列は、グラム陽性菌表層蛋白質の輸送過程を反映した
レポータとして機能するのであれば、いかなる配列も許
される。signal配列から酵素、sorting signalに到る配
列は、コドンの読み枠が同じになるように連結する。ま
た、promoterからsignal配列に到る配列転写・翻訳の効
率を考慮して連結する。好ましくは同一遺伝子の連続し
た配列を用いることが望ましい。sorting signalからte
rminatorに到る配列も同様に、転写・翻訳の効率を考慮
して連結し、好ましくは同一遺伝子の連続した配列を用
いることが望ましい。 promoter：遺伝子を導入するブドウ球菌で働くpromoter
なら如何なるpromoterも許される。例えば、SEB promot
er・Protein A(SPA）promoterが挙げられるが、好まし
くはSEB promoterが望ましい。 signal配列：遺伝子を導入するブドウ球菌で、分泌sign
alとして働くsignal配列なら如何なるsignal配列も許さ
れる。例えば、SEB signal配列・Protein A(SPA）signa
l配列が挙げられるが、好ましくはSEB signal配列が望
ましい。 酵素：活性の測定が容易な酵素であれば、いかなる酵素
も許される。例えば、bla (cepharosporinase)・GFP(gr
een fluorescent protein)が挙げられるが、好ましくは
bla (cepharosporinase)が望ましい。 sorting signal：遺伝子を導入するブドウ球菌で、膜に
輸送されるsorting signalとして働き、LPXTG motifを
含むsorting signalなら如何なるsorting signalも許さ
れる。例えば、Protein A(SPA）C端のsorting signa・F
nBPA/B又はCna、ClfA C端のsorting signalが挙げられ
るが、好ましくはSPA C端のsorting signalが望まし
い。 terminator：遺伝子を導入するブドウ球菌で働くtermin
atorなら如何なるterminatorも許される。例えば、Prot
ein A(SPA）terminator・FnBPA/B又はCna、ClfAのtermi
natorが挙げられるが、好ましくはSPA terminatorが望
ましい。 これらの配列は、genomic DNAあるいはc-DNAライブラリ
ーより、当該クローンを選択し、適当な制限酵素siteが
無ければを制限酵素site導入して、連結をすることが可
能である。別法としては、genomic DNAを鋳型とし、増
幅したい塩基配列を挟む15〜30 bpの塩基配列に、制限
酵素site及びコドンの読み枠を調整する介在配列を付加
してプライマーを設定し、PCRによって増幅して、適当
なベクター、例えばpBluescript・pUC・pBR322等に挿入
してサブクローニングした後、制限酵素で切断して連結
することにより、容易に設計通りの配列を得ることがで
きる。構築したDNAは、E.coliとS.aureusのシャトルベ
クター、例えばpHY300PLK vector（宝酒造）のマルチク
ローニングサイトに組み込み、reporter plasmidとす
る。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、例えば、文献
（Sambruck, J., Fritsch,E. F., and Maniatis, T. (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY）
に記載の方法により行うことができる。

【０００９】２．レポータ遺伝子のブドウ球菌への導入 レポータ遺伝子のブドウ球菌への導入は、例えばelectr
oporationにより行うが、本発明はこの方法に限られな
い。遺伝子は適当なブドウ球菌、例えばS.aureus RN422
0株（New York UniversityMedical CenterのProf. Rich
ard P. Novickより供与された）に導入する。対数増殖
期にあるブドウ球菌の菌体を遠心分離により回収し、例
えば1.1 M sucroseに懸濁して、導入するDNAを加え、氷
上でincubation後、適当な条件（Bio Rad社製 Gene Pul
serにて25・, 100ル, 2.5 kV）でelectroporationを行
う。electroporationした菌体は、適当な培地中で培養
した後、ベクターの耐性遺伝子（例えば tetracycline
耐性遺伝子）に対応した選択薬剤（この場合 tetracycl
ine）を含む寒天培地上にまき、一晩培養してtransfrom
antを得る。

【００１０】３．薬剤のスクリーニング法 本発明のスクリーニング法は、薬剤により表層蛋白質の
輸送過程、特にsortaseあるいはFemABXが阻害される
と、ブドウ球菌表層に留まる筈のレポータ蛋白質が、培
養上清中に放出されてしまうことを基本とする。以下に
具体的な例を述べるが、本発明はこの例に限定されるも
のではない。Transformantを選択培地、例えば4・/ml t
etracyclineを含むTSB に植え、適当な条件、例えば37
℃で一晩静置培養する。培養した菌液の適量、例えば1/
20量をTSBに接種し、アッセイ用の菌液を作製する。接
種する菌量は、菌体が産生する酵素の活性・量により適
宜調節するが、予め予備実験を行って、その条件で培養
が可能で、かつ培養後に酵素活性の測定が可能な量に設
定する。９６穴プレート上で、アッセイ用の菌液75・に
薬剤希釈液25・（controlには滅菌水25・）を加える。
これらの量は、培養条件に応じて適宜変更することが許
される。適当な条件、例えば37℃で一晩静置培養した
後、遠心(4,000 rpmラ15 min)し、培養上清を回収してm
edium画分とする。残りの沈殿は再懸濁して、lysostaph
inを最終5・/mlとなるように加える。その後、適当な条
件、例えば37℃で２時間インキュベートし、これを遠心
(4,000 rpmラ15 min)して、上清を回収し、cell wall画
分とする。上清を一部を残して回収し、上清を含む状態
で菌体を破砕した後、計算で上清分の酵素活性を差し引
いて、cell wall画分の酵素活性とすることも許され
る。上清画分及びCell wall画分に含まれる酵素活性
は、該酵素に適した方法により測定することができる。
以下に酵素がblaである場合の例を説明するが、本発明
はこの例に限定されるものではない。medium画分あるい
はCell wall画分の試料25・に、50 mM phosphate buffe
r pH7.0に溶解した120・ニトロセフィン溶液75 ・を加
え、適当な条件、例えば室温で25から30分間インキュベ
ートする。その後、0.5M Na citrate buffer(pH 3.7)50
・を加えて反応を停止し、490 nmの吸光度を測定する。
medium画分中の酵素活性が上昇し、cell wall画分中の
酵素活性が低下するという濃度が捕らえられた化合物
を、sortase阻害剤あるいはFemABX阻害剤の候補化合物
とする。

【００１１】

【発明の効果】簡便で多検体処理が可能な、sortase阻
害剤及びFemABX阻害剤のスクリーニング系が開発され、
グラム陽性菌表層蛋白質の輸送を阻害する薬剤のスクリ
ーニングが可能となった。

【００１２】

【実施例】以下の実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００１３】［実施例１］レポータ遺伝子の構築 SEB promoter及びその後ろに接続したsignal配列は、S.
aureus #377株のgenomic DNAより、配列番号１及び配
列番号２のDNAをプライマーとしてPCRにより増幅した。
レポーター遺伝子bla (cepharosporinase:CSase遺伝子)
は、Citrobacter freundii GN346株のgenomic DNAよ
り、配列番号３及び配列番号４のDNAをプライマーとし
てPCRにより増幅した。壁移行シグナルSPA C末(LPXTG m
otifから後ろ側の36アミノ酸)及びterminator配列はS.a
ureus RN450株のgenomic DNAより配列番号５及び配列番
号６のDNAをプライマーとしてPCRにより増幅した。SEB
promoterとsignal配列の後ろに、レポーター遺伝子bl
a、壁移行シグナルSPA C末、SPA terminatorを順に、コ
ドンの読み枠が同じになるように連結した。連結部は、
PCR primerに制限酵素サイトを付加し、PCRにより制限
酵素サイトを組み込んで連結した。また、分泌型の局在
を示す比較対照として、bla遺伝子の後ろにSPA termina
torのみをつなげたものも構築した。これらの遺伝子断
片を、E.coliとS.aureusのシャトルベクターであるpHY3
00PLK vector（宝酒造）のマルチクローニングサイトに
組み込み、reporter plasmidとした。

【００１４】［実施例2］レポータ遺伝子のブドウ球菌
への導入 S.aureus RN4220株（New York University Medical Cen
terのProf. Richard P. Novickより供与された）をTSB
100 mlに植え、37℃で一晩振とう培養した。翌日、この
うち1 mlをTSB 100 mlに加え(1%接種)、37℃で3時間振
とう培養した。その後、菌体を遠心(3,000gラ10min,4
℃)で回収し、1.1 M sucrose 10mlで2回洗った。菌体を
再び1.1 M sucrose 10 mlに懸濁し、1 mlずつ10本に分
注した。遠心(15,000 rpmラ1 min)で菌体を回収後、1.1
M sucrose 40・に懸濁し、DNA 100 ngを加えて氷上で2
5分間incubation後、Bio Rad社製 Gene Pulserにて25
・, 100ル,2.5 kVでelectroporationを行った。TSB 0.5
mlを加えて37℃で1時間incubation後、このうち100・
を2・/ml tetracyclineを含むTSA上にまいた。37℃、一
晩培養し、transformantを得た。

【００１５】［実施例３］レポーター活性の測定 ＜試料調整法＞Transformantを2・/ml tetracyclineを
含むTSB 10 mlに植え、37℃で一晩振とう培養後、遠心
(3,000 rpmラ15 min)し、培養上清を回収した。菌体は1
ラSMMで洗い、1ラSMM 5 mlに懸濁する。これに10 mg/ml
lysostaphine溶液を25・加え、37℃で30分インキュベ
ーション後、そのうちの1mlを回収した。これに、20 mM
Maleate bufferを4 ml加えて、超音波処理を行い、cel
l wall＋protoplast画分とした。また、1 mlを回収した
残りのサンプル4 mlは、遠心(3,000 rpmラ15 min)し、
上清を回収してcell wall画分とした。 ＜CSase活性測定法＞試料0.5 mlに、50 mM phosphate b
uffer pH 7.0に溶解した120・ニトロセフィン溶液2.5 m
lを加え、すぐに混和し、482 nmの吸光度を経時的に測
定した。150秒間に起こる吸光度の変化より、CSase活性
を算出した。Cytosol画分の活性は、cell wall+protopl
ast画分の活性からcell wall画分の活性を差し引いて計
算した。 ＜結果＞SEB promoter+signal配列-bla-SPA C terminal
-SPA terminator遺伝子を含むプラスミドをtransfectす
ることにより、全レポーター活性の約80%が壁画分に局
在するブドウ球菌を得ることが出来た。SPA C末を欠い
たSEB-promoter+signal配列-bla-SPA C terminatorで
は、トータルの約90%のレポーター活性が培地中に放出
されたことから、前者のレポーター活性の壁画分への局
在はSPA C末のシグナルに依存していることが確認され
た。よって、ここで得られた細胞壁へのレポーター蛋白
の局在は、標的であるsortaseによって起こっていると
考えられる。

【００１６】［実施例４］薬剤のスクリーニング ＜試料調整法＞Transformantを4・/ml tetracyclineを
含むTSB 3 mlに植え、37℃で一晩静置培養した。これ
を、5.3・/ml tetracyclineを含む1.3倍濃度のTSBに5%
接種し、菌液を作製した。薬剤は、imipenem、cefoxiti
n、piperacillin、bacitracin、kanamycin、vancomyci
n、fosfomycin、chloramphenicolを用いた。それぞれMI
C(最小生育阻止濃度)を含むよう濃度を設定し、７段階
２倍希釈を行った。９６穴プレート上で、菌液75・に薬
剤希釈液25・（controlには滅菌水25・）を加え、37℃
で一晩静置培養した後、遠心(4,000 rpmラ15 min)し、
培養上清を25・回収した。残りの沈殿と培養上清は再懸
濁し、10ug/mlのlysostaphinを含む2ラSMM 75ulを加
え、37℃で２時間インキュベートした。これを遠心(4,0
00 rpmラ15 min)し、上清25・を回収してmedium＋cell
wall画分とした。 ＜活性測定法＞試料25・に、50 mM phosphate buffer p
H 7.0に溶解した120・ニトロセフィン溶液75 ・を加
え、medium画分は30分、medium+cell wall画分は25分、
室温でインキュベートした。0.5M Na citrate buffer(p
H 3.7) 50・を加えて反応を停止し、490nmの吸光度を測
定した。Cell wall画分の活性は、medium+cell wall画
分の活性からmedium画分の活性を差し引いて計算した。 ＜結果＞8薬剤のうち、cefoxitinとpiperacillinの２薬
剤で、medium画分中の活性上昇とcell wall画分中の活
性低下という、sortase阻害時に期待されるパターンを
示す濃度が捕らえられた（図３）。その他の薬剤では、
medium画分とcell wall画分の活性は平行して変化して
いた。

【００１７】

【配列表】 <110> Eisai Co., Ltd. <120> S. aureus reporter system <130> EP00TH0201 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <210> 1 cccgaattcg aactaggtag aaaaataatt atgagaaaac 40 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <210> 2 gggcagatct ggttgactct ctgctaaaac gttggg 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <210> 3 gggccagatc tggaacaaca aattgccgat atcgtt 36 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <210> 4 gggaagcttg cagtttttca agaatgcgcc aggccgcc 38 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <210> 5 gggaagcttt accagaaact ggtgaagaaa atccattc 38 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <210> 6 ggggctgcag ctgttaaaaa agttggtgaa gaatctgc 38

【００１８】 <210> 7 <211> 1987 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <221> CDS <222> (247)..(1527) <400> 7 ttcgaactag gtagaaaaat aattatgaga aaacactatg ttgttaaaga tgttttcgta 60 tataagttta ggtgatgtat agttacttaa ttttaaaagc ataacttaat taatataaat 120 aacatgagat tattaaatat aattaagttt cttttaatgt ttttttaatt gaatatttaa 180 gattataaca tatatttaaa gtgtatctag atactttttg ggaatgttgg ataaaggaga 240 taaaaa atg tat aag aga tta ttt att tca cat gta att ttg ata ttc 288 Met Tyr Lys Arg Leu Phe Ile Ser His Val Ile Leu Ile Phe 1 5 10 gca ctg ata tta gtt att tct aca ccc aac gtt tta gca gag agt caa 336 Ala Leu Ile Leu Val Ile Ser Thr Pro Asn Val Leu Ala Glu Ser Gln 15 20 25 30 cca gat ctg gaa caa caa att gcc gat atc gtt aac cgc acc atc aca 384 Pro Asp Leu Glu Gln Gln Ile Ala Asp Ile Val Asn Arg Thr Ile Thr 35 40 45 cca ctg atg cag gag cag gct att ccg ggt atg gcc gtg gcg att atc 432 Pro Leu Met Gln Glu Gln Ala Ile Pro Gly Met Ala Val Ala Ile Ile 50 55 60 tac gag ggg aaa cct tat tac ttt acc tgg ggt aaa gcc gat atc gcc 480 Tyr Glu Gly Lys Pro Tyr Tyr Phe Thr Trp Gly Lys Ala Asp Ile Ala 65 70 75 aat aac cac cca gtc acg cag caa acg ctg ttt gag cta ggg tcg gtc 528 Asn Asn His Pro Val Thr Gln Gln Thr Leu Phe Glu Leu Gly Ser Val 80 85 90 agt aag acg ttt aac ggc gtg ttg ggc ggc gac gct atc gcc cgc ggc 576 Ser Lys Thr Phe Asn Gly Val Leu Gly Gly Asp Ala Ile Ala Arg Gly 95 100 105 110 gaa att aag ctc agc gat ccg gtc acg aaa tac tgg cca gaa ctg aca 624 Glu Ile Lys Leu Ser Asp Pro Val Thr Lys Tyr Trp Pro Glu Leu Thr 115 120 125 ggc aaa cag tgg cgg ggt atc agc ctg ctg cac tta gcc acc tat aca 672 Gly Lys Gln Trp Arg Gly Ile Ser Leu Leu His Leu Ala Thr Tyr Thr 130 135 140 gcg ggt ggc ctg ccg ctg cag atc ccc gat gac att acg gat aaa gcc 720 Ala Gly Gly Leu Pro Leu Gln Ile Pro Asp Asp Ile Thr Asp Lys Ala 145 150 155 gca tta ctg cgc ttt tat caa aac tgg caa cca caa tgg act ccg ggc 768 Ala Leu Leu Arg Phe Tyr Gln Asn Trp Gln Pro Gln Trp Thr Pro Gly 160 165 170 gct aag cgt ctt tac gct aac tcc agc att ggt ctg ttt ggt gcg cta 816 Ala Lys Arg Leu Tyr Ala Asn Ser Ser Ile Gly Leu Phe Gly Ala Leu 175 180 185 190 gcg gtg aaa cct tca ggt atg agc tac gaa gag gca atg acc aga cgc 864 Ala Val Lys Pro Ser Gly Met Ser Tyr Glu Glu Ala Met Thr Arg Arg 195 200 205 gtc ctg caa cca tta aaa ctg gcg cat acc tgg att acg gtt ccg caa 912 Val Leu Gln Pro Leu Lys Leu Ala His Thr Trp Ile Thr Val Pro Gln 210 215 220 agc gaa caa aaa aac tat gcc tgg ggc tat cgc gaa ggg aag cct gtg 960 Ser Glu Gln Lys Asn Tyr Ala Trp Gly Tyr Arg Glu Gly Lys Pro Val 225 230 235 cac gtt tct ccg gga caa ctt gac gcc gaa gcc tat ggc ctg aaa tcc 1008 His Val Ser Pro Gly Gln Leu Asp Ala Glu Ala Tyr Gly Leu Lys Ser 240 245 250 agc gtt atc gat atg gcc cgc tgg gtt cag gcc aac atg gac gcc agc 1056 Ser Val Ile Asp Met Ala Arg Trp Val Gln Ala Asn Met Asp Ala Ser 255 260 265 270 cac gtt cag gag aaa acg ctc cag cag ggc att gag ctt gcg cag tct 1104 His Val Gln Glu Lys Thr Leu Gln Gln Gly Ile Glu Leu Ala Gln Ser 275 280 285 cgc tac tgg cgt att ggt gat atg tac cag gga tta ggc tgg gag atg 1152 Arg Tyr Trp Arg Ile Gly Asp Met Tyr Gln Gly Leu Gly Trp Glu Met 290 295 300 ctg aac tgg ccg ctg aaa gct gat tcg atc atc aac ggc agc gac agc 1200 Leu Asn Trp Pro Leu Lys Ala Asp Ser Ile Ile Asn Gly Ser Asp Ser 305 310 315 aaa gtg gca ttg gca gcg ctt ccc gcc gtt gag gta aac ccg cca gta 1248 Lys Val Ala Leu Ala Ala Leu Pro Ala Val Glu Val Asn Pro Pro Val 320 325 330 cct gcc gtg aaa gcc tca tgg gtg cat aaa acg gga tcc aca ggt gga 1296 Pro Ala Val Lys Ala Ser Trp Val His Lys Thr Gly Ser Thr Gly Gly 335 340 345 350 ttt ggc agc tac gtt gcc ttc gtt cca gaa aaa aac ctt ggc ata gtg 1344 Phe Gly Ser Tyr Val Ala Phe Val Pro Glu Lys Asn Leu Gly Ile Val 355 360 365 atg ctg gca aac aaa agc tat cct aac cct gtc cgc gtc gag gcg gcc 1392 Met Leu Ala Asn Lys Ser Tyr Pro Asn Pro Val Arg Val Glu Ala Ala 370 375 380 tgg cgc att ctt gaa aaa ctg caa gct tta cca gaa act ggt gaa gaa 1440 Trp Arg Ile Leu Glu Lys Leu Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu 385 390 395 aat cca ttc atc ggt aca act gta ttt ggt gga tta tca tta gcg tta 1488 Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu 400 405 410 ggt gca gcg tta tta gct gga cgt cgt cgc gaa cta taa aaacaaacaa 1537 Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu 415 420 425 tacacaacga tagatatcat tttatccaaa ccaattttaa cttatatacg ttgattaaca 1597 cattcttatt tgaaatgata agaatcatct aaatgcacga gcaacatctt ttgttgctca 1657 gtgcattttt tattttactt acttttctaa acaacttctg aaacgcctca acactttcta 1717 ctctgattac atatacgaca tttttagaca ttaaaaaatc gaactagaca agatgctcat 1777 tgcatttcgt actagtttcg attcatgaat aattagattt aaaatgtcat ttgaatccaa 1837 gtgacaacat tatttatatt tagaatatta acgttagtat aaacgtccaa acacaaataa 1897 aggcaacaaa tataatactg tattttaacg tcatttttaa taatgcagat tcttcaccaa 1957 cttttttaac agctgcaggc atgcaagctt 1987

【００１９】 <210> 8 <211> 426 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 8 Met Tyr Lys Arg Leu Phe Ile Ser His Val Ile Leu Ile Phe Ala Leu 1 5 10 15 Ile Leu Val Ile Ser Thr Pro Asn Val Leu Ala Glu Ser Gln Pro Asp 20 25 30 Leu Glu Gln Gln Ile Ala Asp Ile Val Asn Arg Thr Ile Thr Pro Leu 35 40 45 Met Gln Glu Gln Ala Ile Pro Gly Met Ala Val Ala Ile Ile Tyr Glu 50 55 60 Gly Lys Pro Tyr Tyr Phe Thr Trp Gly Lys Ala Asp Ile Ala Asn Asn 65 70 75 80 His Pro Val Thr Gln Gln Thr Leu Phe Glu Leu Gly Ser Val Ser Lys 85 90 95 Thr Phe Asn Gly Val Leu Gly Gly Asp Ala Ile Ala Arg Gly Glu Ile 100 105 110 Lys Leu Ser Asp Pro Val Thr Lys Tyr Trp Pro Glu Leu Thr Gly Lys 115 120 125 Gln Trp Arg Gly Ile Ser Leu Leu His Leu Ala Thr Tyr Thr Ala Gly 130 135 140 Gly Leu Pro Leu Gln Ile Pro Asp Asp Ile Thr Asp Lys Ala Ala Leu 145 150 155 160 Leu Arg Phe Tyr Gln Asn Trp Gln Pro Gln Trp Thr Pro Gly Ala Lys 165 170 175 Arg Leu Tyr Ala Asn Ser Ser Ile Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Val 180 185 190 Lys Pro Ser Gly Met Ser Tyr Glu Glu Ala Met Thr Arg Arg Val Leu 195 200 205 Gln Pro Leu Lys Leu Ala His Thr Trp Ile Thr Val Pro Gln Ser Glu 210 215 220 Gln Lys Asn Tyr Ala Trp Gly Tyr Arg Glu Gly Lys Pro Val His Val 225 230 235 240 Ser Pro Gly Gln Leu Asp Ala Glu Ala Tyr Gly Leu Lys Ser Ser Val 245 250 255 Ile Asp Met Ala Arg Trp Val Gln Ala Asn Met Asp Ala Ser His Val 260 265 270 Gln Glu Lys Thr Leu Gln Gln Gly Ile Glu Leu Ala Gln Ser Arg Tyr 275 280 285 Trp Arg Ile Gly Asp Met Tyr Gln Gly Leu Gly Trp Glu Met Leu Asn 290 295 300 Trp Pro Leu Lys Ala Asp Ser Ile Ile Asn Gly Ser Asp Ser Lys Val 305 310 315 320 Ala Leu Ala Ala Leu Pro Ala Val Glu Val Asn Pro Pro Val Pro Ala 325 330 335 Val Lys Ala Ser Trp Val His Lys Thr Gly Ser Thr Gly Gly Phe Gly 340 345 350 Ser Tyr Val Ala Phe Val Pro Glu Lys Asn Leu Gly Ile Val Met Leu 355 360 365 Ala Asn Lys Ser Tyr Pro Asn Pro Val Arg Val Glu Ala Ala Trp Arg 370 375 380 Ile Leu Glu Lys Leu Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro 385 390 395 400 Phe Ile Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala 405 410 415 Ala Leu Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu 420 425

【００２０】

【図面の簡単な説明】

【図１】sortaseの働き。

【図２】FemABXの働き。

【図３】ブドウ球菌に導入したレポータ蛋白質の輸送過
程に対するPIPC・CFXの作用。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年７月１０日（２００１．７．１
０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２０】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】sortaseの働き。

【図２】FemABXの働き。

【図３】ブドウ球菌に導入したレポータ蛋白質の輸送過
程に対するPIPC・CFXの作用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:44） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA13 BA07 CA04 DA05 EA04 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QQ06 QQ91 QR23 QR75 QS08 QS31 4B065 AA53X AA53Y AB01 BA02 CA27 CA46

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の工程： 1)グラム陽性菌に、N末端にシグナル配列を有し、C末端
   にsorting signalを有する酵素をコードする遺伝子を導
   入し、 2)該グラム陽性菌を被検物質の存在下で培養し、 3)培地中の該酵素の活性を測定する、 から成る、グラム陽性菌表層蛋白質の輸送過程を阻害す
   る物質をスクリーニングする方法。
2. 【請求項２】グラム陽性菌表層蛋白質の輸送過程のsort
   aseを阻害する物質をスクリーニングする請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】グラム陽性菌表層蛋白質の輸送過程のFemA
   BXを阻害する物質をスクリーニングする請求項１に記載
   の方法。
4. 【請求項４】sorting signalがプロテインＡのsorting
   signalである、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】酵素が竅|ラクタマーゼである、請求項１
   に記載の方法。
6. 【請求項６】グラム陽性菌がブドウ球菌である、請求項
   １に記載の方法。
7. 【請求項７】N末端にシグナル配列を有し、C末端にsort
   ing signalを有する酵素をコードする遺伝子を導入した
   グラム陽性菌。
8. 【請求項８】酵素が竅|ラクタマーゼである請求項６に
   記載のグラム陽性菌。
9. 【請求項９】N末端にシグナル配列を有し、C末端にsort
   ing signalを有する酵素をコードする遺伝子を導入した
   ブドウ球菌。