ES2636439T3

ES2636439T3 - Composiciones y métodos para el trasplante de microbiota de colon

Info

Publication number: ES2636439T3
Application number: ES12710616.9T
Authority: ES
Inventors: Michael J. Sadowsky; Alexander KHORUTS; Alexa R. WEINGARDEN; Matthew J. HAMILTON
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 2011-03-09
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2017-10-05
Anticipated expiration: 2032-03-09
Also published as: US20170246214A1; SG193348A1; US20170326181A1; US20180028574A1; JP2014507481A; US10028980B2; EP2683390B1; AU2024201513A1; AU2012225305A1; WO2012122478A1; US20160375063A1; US20220110981A1; US20220339203A1; AU2017203822A1; US10251914B2; AU2019219826B2; US20140147417A1; US20180028573A1; US20170252378A1; EP3610881A1

Abstract

Un método de preparación de una composición que comprende un extracto o una preparación de heces humanas que comprende material fecal humano, comprendiendo el método: mezclar una muestra fecal de un donante fecal con un diluyente, y filtrar la muestra fecal mezclada con un medio de filtro, en donde la muestra fecal mezclada se pasa a través de tamices con tamaños de tamiz progresivamente más pequeños hasta que un pase final a través de un tamiz de 0,25 mm da como resultado una composición que comprende la microbiota intestinal del donante fecal que es capaz de pasar a través de un tamiz de 0,25 mm.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos para el trasplante de microbiota de colon Antecedentes

En 1978 se reconocio por primera vez Clostridium difficile como una causa importante de diarrea y colitis pseudomembranosa asociada con el uso de agentes antimicrobianos. Desde ese momento, la infeccion por C. difficile ha estado en crecimiento constante en incidencia, morbilidad y mortalidad en America del Norte y Europa (Freeman et al. Clin Microbiol Rev 2010;23:529-49, Kelly y LaMont. N Engl J Med 2008;359:1932-40). El analisis de las estadisticas del Estudio Nacional de Altas Hospitalarias de EE.UU. entre 1996 y 2003 revela que se ha duplicado la prevalencia del diagnostico de la infeccion por C. difficile (CDI), hasta 0,61/1.000, entre pacientes hospitalizados (McDonald et al. Emerg Infect Dis 2006;12:409-15). Un estudio de 2008 del 12,5 % de todas las instalaciones de cuidado intensivo de EE.UU. indico una tasa de prevalencia de la CDI de 13,1/1.000, que es al menos un orden de magnitud mas alta que la que se encontro anteriormente (Jarvis et al. Am J Infect Control 2009;37:263-70). Mientras que pacientes mayores tienen tasas desproporcionadamente mas altas de CDI que los individuos mas jovenes, no se prescinde de ningun grupo de edad y la incidencia de las hospitalizaciones relacionadas con CDI ha aumentado incluso en la poblacion pediatrica (Zilberberg et al. Emerg Infect Dis 2010;16:604-9). El aumento en incidencia esta compuesto, ademas, por una frecuencia elevada de las formas mas graves de esta enfermedad, como queda de manifiesto por un aumento de la morbilidad asociada con la CDI y la tasa de letalidad (Ricciardi et al. Arch Surg 2007;142:624-31; discusion 631, Zilberberg et al. Emerg Infect Dis 2008;14:929-31). Esto esta, en parte, relacionado con la emergencia de cepas de C. difficile mas virulentas, tales como el ribotipo de PCR 027/North American Pulsed Field tipo 1 (NAP1), que se caracteriza por un mayor potencial de produccion de toxinas y resistencia a antibioticos que otras cepas clinicamente relevantes (Rupnik et al. Nat Rev Microbiol 2009;7:526-36, Kuijper et al. Euro Surveill 2008;13).

La CDI recurrente es uno de los desafios mas dificiles y cada mas vez comunes asociados con la CDI (Surawicz, Gastroenterology 2009;136:1152-4). Una incidencia inicial de la CDI puede ir seguida de una recaida en el plazo de 30 dias en aproximadamente el 20-30 % de los casos (Kelly y LaMont. N Engl J Med 2008;359:1932-40, Louie et al. N Engl J Med 2011;364:422-31, Pepin et al. Clin Infect Dis 2006;42:758-64), y el riesgo de reaparicion se duplica despues de dos o mas manifestaciones (McDonald et al. Emerg Infect Dis 2006;12:409-15). Mayor edad, uso intercurrente de antibioticos para indicaciones que no son de C. difficile, insuficiencia renal, deficiencia inmune y medicaciones antiacidas son algunos de los factores de riesgo conocidos para CDI recurrente (Surawicz, Gastroenterology 2009;136:1152-4, Garey et al. J Hosp Infect 2008;70:298-304). La presencia de solo tres criterios clinicos: edad > 65 anos, enfermedad grave y uso continuado de antibioticos despues del tratamiento del episodio de CDI inicial, son predictivos de una tasa de recaida de casi el 90 % (Hu et al. Gastroenterology 2009;136:1206-14). La CDI tambien complica comunmente el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que ha sido reconocida recientemente como un factor de riesgo independiente adicional para la infeccion de CDI (Issa et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2007;5:345-51, Rodemann et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2007;5:339-4415). La CDI en pacientes con ElI subyacente se asocia con una mayor gravedad de la colitis y tasas mas altas de reaparicion y colectomia (Issa et al. Inflamm Bowel Dis 2008;14:1432-42).

Se acepta ahora que la presencia de microbiota intestinal sana normal (microorganismos intestinales normales) ofrece proteccion contra la CDI. En cambio, la alteracion grave de la microbiota intestinal normal mediante el uso de antibioticos, que incluyen metronidazol y vancomicina que se usan para tratar la CDI, es probablemente una de las razones principales para su reaparicion. Chang y colaboradores usaron una secuenciacion de ADNr 16S para analizar la microbiota fecal de siete pacientes con CDI inicial y recurrente (Chang et al. J Infect Dis 2008;197:435-8). Informaron que la diversidad de las especies bacterianas se redujo en todos los pacientes en comparacion con sujetos de control normales. La mayor reduccion en la diversidad de especies, sin embargo, se encontro en los tres pacientes con CDI recurrente y la alteracion de su microbiota intestinal fue evidente a nivel del filo, con una reduccion marcada de Bacteriodetes, normalmente uno de los dos filos dominantes en el colon. Por el contrario, la microbiota intestinal en estos pacientes fue dominada por los miembros de los filos de proteobacterias y verrucomicrobios, que normalmente solo son constituyentes menores de la microbiota del colon.

El objetivo general del tratamiento con antibioticos para la CDI recurrente no es la mera supresion de C. difficile, sino tambien la conservacion de la microbiota del colon y la optimization de su restauracion. Se han usado varios regimenes con antibioticos, que incluyen dosificaciones cada vez mas bajas o pulsadas con vancomicina (McFarland et al. Am J Gastroenterol 2002;97:1769-75) y protocolos "perseguidores" de rifaximina (Johnson et al. Clin Infect Dis 2007;44:846-8, Johnson et al. Anaerobe 2009;15:290-1) para lograr este objetivo con exito parcial. Recientemente se mostro que la fidaxomicina, un nuevo antibiotico macrodclico que es de espectro estrecho y no ataca especies de Bacteroides, reduce la tasa de recaida inicial de CDI un 50 % en comparacion con el tratamiento con vancomicina (Louie et al. N Engl J Med 2011;364:422-31). Sin embargo, el tratamiento con fidaxomicina no altero la tasa de reaparicion de CDI provocada por una cepa de PCR 027/NAP1 mas virulenta. Por lo tanto, a pesar de estos avances, parece probable que los desafios en el tratamiento de la CDI recurrente quedaran para un futuro proximo.

El trasplante de microbiota fecal (FMT), tambien comunmente conocido como 'bacterioterapia fecal', representa el

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protocolo terapeutico que permite la reconstitucion mas rapida de una composicion normal de comunidades microbianas de colon. Durante decadas, el FMT ha sido ofrecido por algunos centros en todo el mundo, normalmente como una opcion de ultimo recurso para pacientes con CDI recurrente. El informe mas comunmente citado para FMT fue por Eiseman y colaboradores, que en 1958 describieron el uso de enemas fecales para pacientes que probablemente tenian una forma grave o fulminante de colitis pseudomembranosa (Eiseman et al. Surgery 1958;44:854-9). Desde entonces, se ha informado de mas de 200 casos como casos individuales, o pequenas series de casos, con una tasa de exito acumulada de ~90 % en la elimination de la CDI recurrente, sin que se observara ningun acontecimiento adverso. La historia y metodologia general usadas para el FMT se han descrito en varias revisiones recientes (Bakken. Anaerobe 2009;15:285-9, van Nood et al. Euro Surveill 2009;14, Khoruts y Sadowsky. Mucosal Immunol 2011;4:4-7). Sin embargo, a pesar de una trayectoria larga y exitosa, ademas de la gran necesidad clinica, la disponibilidad del procedimiento para muchos pacientes sigue siendo muy limitada.

La falta de una puesta en practica mas amplia del FMT se debe en gran medida a multiples barreras practicas no triviales y no es debido a una falta de eficacia. Estas incluyen falta de reembolso para la evaluation de donantes, falta de donantes adecuados en el momento apropiado, dificultad en la preparation y administration del material, asi como preocupaciones esteticas sobre la realization del procedimiento en un consultorio de endoscopia o medico. Estas incluyen tambien la perception que el paciente tiene del procedimiento, la voluntad del personal para realizar el procedimiento, problemas de higiene relacionados con la manipulation de materia fecal. Estos factores juntos lo convierten en una opcion desagradable que a menudo se considera como un tratamiento de ultimo recurso y que no esta ampliamente disponible para la gran mayoria de los pacientes que podrian beneficiarse del mismo. Ademas, la industria farmaceutica ha mostrado poco interes en el desarrollo tecnologico de agentes terapeuticos basados en el FMT, debido en gran medida a la amplia disponibilidad de material del donante y su compleja composicion. En lugar de eso, el desarrollo ha sido impulsado principalmente por profesionales clinicos individuales que se ven enfrentados a la necesidad desesperada de sus pacientes.

Sumario de la invencion

La presente invencion es como se define en las reivindicaciones. Especificamente, la invencion proporciona un metodo de preparacion de una composicion que comprende un extracto o preparacion de heces humanas que comprende material fecal humano, comprendiendo el metodo: mezclar una muestra fecal de un donante fecal con un diluyente, y filtrar la muestra fecal mezclada con un medio de filtro, en el que la muestra fecal mezclada se pasa a traves de tamices con tamanos de tamiz progresivamente mas pequenos hasta que un pase final a traves de un tamiz de 0,25 mm produce una composicion que comprende la microbiota intestinal del donante fecal que es capaz de pasar a traves de un tamiz de 0,25 mm. La invencion tambien proporciona una composicion que comprende un extracto o preparacion de heces humanas, siendo dicha composicion obtenible por el metodo de la invencion. La invencion proporciona ademas la composicion de la invencion para su uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por microbiota de colon disfuncional.

Las composiciones de la invencion como se define en las reivindicaciones incluyen un extracto o una preparacion de heces humanas. En una realizacion, la composicion incluye no mas del 0,05 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % en peso de material no vivo/peso de material biologico. Opcionalmente, el material biologico incluye microbios fecales del ciego, colon o intestino humanos y opcionalmente el material biologico incluye bacterias del ciego, colon o intestino humanos. Opcionalmente, la composicion incluye un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Opcionalmente, la composicion es una formulation para administracion por via oral.

En una divulgation, una composicion consiste en, o consiste esencialmente en, particulas de material no vivo y/o particulas de material biologico que pasaran a traves de un tamiz que tiene un tamano de tamiz de 2,0 mm, 1,0 mm, 0,5 mm, 0,25 mm, 0,212 mm, 0,180 mm, 0,150 mm, 0,125 mm, 0,106 mm, 0,090 mm, 0,075 mm, 0,063 mm, 0,053 mm, 0,045 mm, 0,038 mm, 0,032 mm, 0,025 mm, 0,020 mm, 0,01 mm o 0,2 mm. En el metodo de la invencion, la muestra fecal mezclada se pasa a traves de tamices con tamanos de tamiz progresivamente mas pequenos, hasta que un pase final a traves de un tamiz de 0,25 mm produce una composicion que comprende la microbiota intestinal del donante fecal que es capaz de pasar a traves de un tamiz de 0,25 mm. Opcionalmente, la composicion incluye un vehiculo farmaceuticamente aceptable y opcionalmente la composicion es una formulacion para administracion por via oral.

En una realizacion, la composicion incluye al menos 4 filos diferentes de bacterias de ciego, colon o intestino extraidas o preparadas a partir del ciego, colon o intestino, en la que los filos incluyen un miembro del filo Bacteroidetes, miembro del filo Firmicutes, miembro del filo Proteobacteria, un miembro del filo Tenericutes, o una combination de los mismos. Opcionalmente, los filos se eligen de Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria y Tenericutes. La composicion incluye no mas del 0,05 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 % 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % en peso de material no vivo/peso de material biologico. Opcionalmente, el material biologico incluye flora del ciego, colon o intestino. Opcionalmente, el material biologico incluye bacterias del ciego, colon o intestino. Opcionalmente, la composicion incluye un vehiculo farmaceuticamente aceptable, y opcionalmente la composicion es una formulacion para administracion por via oral.

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En una realizacion, la composicion incluye un extracto de heces humanas en la que la composition es sustancialmente inodora, opcionalmente incluye material biologico y opcionalmente en la que el material biologico incluye bacterias. Opcionalmente, la composicion incluye un vehiculo farmaceuticamente aceptable, y opcionalmente la composicion es una formulation para administration por v^a oral.

Una composicion de la presente invention puede incluir no mas de 0,1 % en peso de material no vivo/peso de material biologico. En una realizacion, una composicion puede consistir en, o consistir esencialmente en, particulas que pasaran a traves de un tamiz de 0,25 mm o equivalente. En una realizacion, una composicion puede incluir no mas del 0,05 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % en peso de material no vivo/peso de material biologico. Una composicion de la presente invencion puede incluir ademas un crioprotector, tal como glicerol. En una realizacion, una composicion puede estar a una temperatura de menos de 0 °C. En una realizacion, una composicion es un solido, tal como un polvo. Una composicion de la presente invencion puede incluir al menos 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010 o 5 x 1010 bacterias. En una realizacion, el material biologico de una composicion puede incluir una pluralidad de celulas procariotas, celulas eucariotas o virus; o una poblacion de celulas procariotas, celulas eucariotas y virus, que es sustancialmente identica a o representativa de o equivalente a una poblacion de celulas procariotas, celulas eucariotas y virus presentes en las heces de un ser humano sano normal. En una realizacion, el material biologico de una composicion puede incluir una poblacion de celulas procariotas y virus que es sustancialmente identica o representativa de o equivalente a una poblacion de celulas procariotas y virus presentes en las heces de un ser humano sano normal. En una realizacion, el material biologico de una composicion incluye una poblacion de celulas procariotas, celulas eucariotas o virus que es sustancialmente identica o representativa de o equivalente a una poblacion de celulas procariotas, celulas eucariotas y virus presentes en las heces de un ser humano sano normal.

La presente invencion tambien proporciona una composicion preparada mediante un proceso como se define en las reivindicaciones. En una realizacion, un proceso incluye someter una muestra fecal a una condition o condiciones que eliminen al menos el 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de material no vivo presente en la muestra fecal. En una divulgation, un proceso incluye filtrar una muestra fecal con un medio de filtro, en la que el medio de filtro incluye un tamano de tamiz de no mas de 2,0 mm, 1,0 mm, 0,5 mm, 0,25 mm, 0,212 mm, 0,180 mm, 0,150 mm, 0,125 mm, 0,106 mm, 0,090 mm, 0,075 mm, 0,063 mm, 0,053 mm, 0,045 mm, 0,038 mm, 0,032 mm, 0,025 mm, 0,020 mm, 0,01 mm o 0,2 mm para producir o generar un filtrado. En el proceso de la invencion, la muestra fecal mezclada se pasa a traves de tamices con tamanos de tamiz progresivamente mas pequenos hasta que un pase final a traves de un tamiz de 0,25 mm produce la composicion que comprende la microbiota intestinal del donante fecal que es capaz de pasar a traves de un tamiz de 0,25 mm. Opcionalmente, una composicion incluye un material biologico, y opcionalmente el material biologico incluye bacterias. Opcionalmente, una composicion incluye un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Opcionalmente, una composicion es una formulacion para administracion por via oral. Opcionalmente, el proceso puede producirse a una temperatura no superior a 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C o 34 °C.

La composicion puede incluir al menos 4 filos de bacterias diferentes, en la que se incluye un miembro del filo Bacteroidetes, un miembro del filo Firmicutes, un miembro del filo Proteobacteria, un miembro del filo Tenericutes, o una combination de los mismos. Opcionalmente, los filos se eligen de Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria y Tenericutes. En una realizacion, la composicion incluye ademas al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 clases de bacterias diferentes elegidas de Actinobacteria, Bacteroidia, Bacilli, Clostridia, Erysipelotrichi, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Mollicutes y Verrucomicrobiae.

El proceso puede incluir ademas agregar un crioprotector, por ejemplo, glicerol, a la composicion. El proceso puede incluir ademas congelar la composicion. La composicion puede ser para su uso como un agente terapeutico y puede ser para su uso en el tratamiento de una enfermedad o una afeccion patologica o iatrogenica del colon. La enfermedad puede ser una enfermedad o afeccion caracterizada por una composicion disfuncional o patologica de la microbiota del colon, por ejemplo, una colitis por Clostridium difficile.

La presente divulgacion tambien proporciona un metodo de reemplazo o complementation o modification de la microbiota de colon de un sujeto. El metodo puede incluir administrar al sujeto una composicion descrita en el presente documento. La presente invencion tambien proporciona un metodo de tratamiento de un sujeto. El metodo puede incluir administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una composicion descrita en el presente documento. Los metodos pueden incluir ademas la elimination de parte, la mayor parte o sustancialmente toda la microbiota del colon, el ciego o los intestinos del sujeto antes de la administracion. El sujeto puede tener o estar en riesgo de tener una colitis. La colitis puede ser una colitis autoinmune, tal como una enfermedad inflamatoria del intestino, una colitis ulcerosa, una enfermedad de Crohn o un sindrome del intestino irritable. La colitis puede ser una colitis infecciosa, tal como una colitis por Clostridium difficile o una colitis enterohemorragica. La colitis por Clostridium difficile puede ser una colitis aguda por Clostridium difficile, una colitis por Clostridium difficile recidivante y una colitis por Clostridium difficile grave. La colitis enterohemorragica puede ser causada por Shigella spp. o E. coli. El sujeto puede tener o estar en riesgo de tener diarrea cronica o estrenimiento cronico.

La presente divulgacion tambien proporciona el uso de una composicion descrita en el presente documento para la fabrication de un medicamento, o para la fabrication de un medicamento para tratar o mejorar o prevenir una

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enfermedad o una afeccion patologica o iatrogenica del colon. Opcionalmente, la enfermedad es una enfermedad o afeccion caracterizada por una afeccion disfuncional o patologica de la microbiota de colon, o la enfermedad es una colitis por Clostridium difficile, o la enfermedad o afeccion es una colitis, una colitis autoinmune, una colitis infecciosa o una colitis enterohemorragica. La presente invention proporciona la composition descrita en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por microbiota de colon disfuncional.

El termino "y/o" significa uno o todos de los elementos enumerados o una combination de de dos cualesquiera o mas de los elementos enumerados.

Las palabras "preferido" y "preferentemente" se refieren a realizaciones de la invencion que pueden proporcionar ciertos beneficios, en determinadas circunstancias. Sin embargo, otras realizaciones tambien pueden ser preferidas, en las mismas u otras circunstancias. Asimismo, la enumeration de una o mas realizaciones preferidas no implica que otras realizaciones no sean utiles, y no pretende excluir otras realizaciones del alcance de la invencion.

Los terminos "comprende" y variaciones del mismo no tienen un significado limitante cuando estos terminos aparecen en la description y reivindicaciones.

A menos que se especifique lo contrario, "un", "una", "el", "la" y "al menos uno" se usan indistintamente y significan uno o mas de uno.

Tambien en el presente documento, las enumeraciones de intervalos numericos por puntos finales incluyen todos los numeros incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

Para cualquier metodo desvelado en el presente documento que incluye etapas discretas, las etapas pueden realizarse en cualquier orden posible. Y, segun convenga, pueden realizarse simultaneamente cualquier combinacion de dos o mas etapas.

El sumario anterior de la presente invencion no pretende describir cada realization desvelada o cada implementacion de la presente invencion. La descripcion que sigue ejemplifica mas particularmente realizaciones ilustrativas. En varios lugares a lo largo de la solicitud se proporciona una guia a traves de listas de ejemplos, ejemplos que pueden usarse en diversas combinaciones. En cada caso, la lista citada sirve solo como grupo representativo y no deber interpretarse como una lista exclusiva.

Descripcion detallada de realizaciones ilustrativas

Antes de la presente invencion, las practicas estandar sugerian hacer coincidir cada receptor de bacterioterapia fecal con un donante separado, normalmente un miembro de la familia cercana, o el uso de las propias heces almacenadas del receptor para uso posterior. El fundamento de estas practicas fue la idea de que los miembros de la familia cercana ya habian compartido sus patogenos, y que estos tipos de microbiota intestinal serian de alguna forma mejor tolerados por el sistema inmunitario del receptor debido a la exposition previa. Sin embargo, esto resulto en una evaluation duplicativa, cargando a los pacientes ya debilitados con la tarea de encontrar un donante adecuado, presion sobre el donante para proporcionar el material y potencialmente retener information medica importante, presion para reducir los costes, ya que estos normalmente corrian por cuenta del paciente, demoras asociadas con la evaluacion y presion de aceptar donantes con un estado de salud inferior al optimo durante la selection de donantes. Las composiciones presentadas en el presente documento resultan de un proceso de fabrication mas normalizado con evaluacion de donantes rigurosa, multiples etapas de filtration que concentran la microbiota y eliminan la acumulacion de material no vivo, y opcionalmente lo congela/descongela de forma que se preserve su viabilidad. Las composiciones presentadas en el presente documento proporcionan una ventaja significativa, haciendo utiles las composiciones de microflora de colon facilmente disponibles para su uso por un medico para tratar a un paciente. Asimismo, es mucho mas aceptable desde el punto de vista estetico, dado que las composiciones son casi inodoras, estan en forma concentrada y son facilmente manipuladas usando practicas de laboratorio estandar.

La presente invencion proporciona composiciones como se define en las reivindicaciones que incluyen microbios fecales. Como se usa en el presente documento, la expresion "microbios fecales" se refiere a microorganismos que estan presentes en el ciego, intestino o colon, preferentemente el colon, de un ser humano adulto sano normal. Tal composicion puede prepararse mediante el procesamiento del material fecal. Como se usa en el presente documento, la expresion "material fecal" se refiere a heces humanas. El material fecal sin procesar contiene material no vivo y material biologico. El "material no vivo" puede incluir, pero no se limita a, bacterias muertas, celulas hospedadoras eliminadas, proteinas, hidratos de carbono, grasas, minerales, moco, bilis, fibra y otros alimentos no digeridos, y otros compuestos que resultan de alimentos y productos de desecho metabolicos y digestion parcial o completa de materiales de alimentos. "Material biologico" se refiere al material vivo en material fecal e incluye microbios que incluyen celulas procariotas tales como bacterias y arqueas (por ejemplo, celulas procariotas vivas y esporas que pueden esporular hasta convertirse en celulas procariotas vivas), celulas eucariotas tales como protozoos y hongos, y virus. En una realizacion, el "material biologico" se refiere al material vivo, por ejemplo, los microbios, celulas eucariotas y virus, que estan presentes en el colon de un ser humano sano normal.

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Ejemplos de celulas procariotas que pueden estar presentes en una composicion de la presente invencion incluyen celulas que son miembros de la clase Actinobacteria, tal como la subclase Actinobacteridae o Coriobacteridae, tal como el orden Bifidobacteriales o Coriobacteriales y/o tal como la familia Bifidobacteriaceae o Coriobacteriaceae; miembros del filo Bacteroidetes, tal como la clase Bacteroidia, tal como una clase Bacteroidales y/o tal como la familia Bacteroidaceae o Rikenellaceae; miembros del filo Firmicutes, tal como la clase Bacilli, Clostridia o Erysipelotrichi, tal como el orden Bacillales o Lactobacillales o Clostridales o Erysipelotrichales y/o tal como la familia Paenibacillaceae o Aeroccaceae o Lactobacillaceae o Streptococcaceae o Catabacteriaceae o Peptococcaceae o Peptostreptococcaceae o Ruminococcaceae o Clostridiaceae o Eubacteriaceae o Lachnospiraceae o Erysipelotrichaceae; miembros del filo Proteobacteria, tal como la clase Alphaproteobacteria o Betaproteobacteria o Gammaproteobacteria, tal como el orden Rhizobiales o Burkholderiales o Alteromonadales o Enterobacteriales, y/o tal como la familia Rhodobiaceae o Burkholderiaceae o Shewanellaceae o Enterobacteriaceae; miembros del filo Tenericutes, tal como la clase Mollicutes, tal como el orden Entomoplasmatales y/o tal como la familia Spiroplasmataceae; y/o miembros de la clase Verrucomicrobiae, tal como el orden Verrucomicrobiales y/o tal como la familia Verrucomicrobiaceae.

En una realization, una composicion de la presente invencion puede incluir bacterias procariotas que son miembros de al menos 1 filo, al menos 2 filos, al menos 3 filos, al menos 4 filos, al menos 5 filos, al menos 6 filos, al menos 7 filos, al menos 8 filos, al menos 9 filos o al menos 10 filos. En una realizacion, una composicion de la presente invencion puede incluir bacterias procariotas que son miembros de al menos 1 clase, al menos 2 clases, al menos 3 clases, al menos 4 clases, al menos 5 clases, al menos 6 clases o al menos 7 clases. En una realizacion, una composicion de la presente invencion puede incluir bacterias procariotas que son miembros de al menos 1 orden, al menos 2 ordenes, al menos 3 ordenes, al menos 4 ordenes, al menos 5 ordenes, al menos 6 ordenes o al menos 7 ordenes. En una realizacion, una composicion de la presente invencion puede incluir bacterias procariotas que son miembros de al menos 1 familia, al menos 2 familias, al menos 3 familias, al menos 4 familias, al menos 5 familias, al menos 6 familias o al menos 7 familias. En una realizacion, una composicion de la presente invencion puede incluir al menos 5, al menos 10, al menos 20, o al menos 30 generos diferentes de bacterias procariotas. En una realizacion, una composicion de la presente invencion puede incluir al menos 10, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300 o al menos 400 especies diferentes de bacterias procariotas.

En una realizacion, una composicion de la presente invencion incluye no mas del 5 % en peso de material no vivo/peso de material biologico (p/p), no mas del 2,5 % (p/p), no mas del 1 % (p/p), no mas del 0,1 % (p/p), no mas del 0,01 % (p/p) o no mas del 0,001 % (p/p) de material no vivo. En una realizacion, la cantidad de material no vivo en una composicion de la presente invencion es indetectable usando las tecnicas actualmente disponibles. Por ejemplo, el material vivo puede tenirse para actividad biologica, transporte de electrones, ADN y ARN para genes especificos.

En una divulgation, el material fecal presente en una composicion no incluye particulas (por ejemplo, particulas de material no vivo y/o particulas de material biologico) que tengan un tamano superior a 2,0 milimetros (mm), superior a 1,0 mm, superior a 0,5 mm, superior a 0,25 mm, superior a 0,212 mm, superior a 0,180 mm, superior a 0,150 mm, superior a 0,125 mm, superior a 0,106 mm, superior a 0,090 mm, superior a 0,075 mm, superior a 0,063 mm, superior a 0,053 mm, superior a 0,045 mm, superior a 0,038 mm, superior a 0,032 mm, superior a 0,025 mm, superior a 0,020 mm, superior a 0,01 mm, o superior a 0,2 mm. La composicion de la presente invencion no incluye particulas (por ejemplo, particulas de material no vivo y/o particulas de material biologico) que tengan un tamano superior a 0,25 mm. El material no fecal presente en una composicion puede incluir particulas que tienen un tamano superior a 2,0 mm, superior a 1,0 mm, superior a 0,5 mm, superior a 0,25 mm, superior a 0,212 mm, superior a 0,180 mm, superior a 0,150 mm, superior a 0,125 mm, superior a 0,106 mm, superior a 0,090 mm, superior a 0,075 mm, superior a 0,063 mm, superior a 0,053 mm, superior a 0,045 mm, superior a 0,038 mm, superior a 0,032 mm, superior a 0,025 mm, superior a 0,020 mm, superior a 0,01 mm, o superior a 0,2 mm. En una divulgacion, el material fecal presente en una composicion consiste en, o consiste esencialmente en, particulas de material no vivo y/o material biologico que tienen un tamano que pasara a traves de un tamiz que tiene un tamano de tamiz de 2,0 mm, 1,0 mm, 0,5 mm, 0,25 mm, 0,212 mm, 0,180 mm, 0,150 mm, 0,125 mm, 0,106 mm, 0,090 mm, 0,075 mm, 0,063 mm, 0,053 mm, 0,045 mm, 0,038 mm, 0,032 mm, 0,025 mm, 0,020 mm, 0,01 mm, o 0,2 mm. Asi, en una divulgacion tal, el material fecal presente en una composicion tiene un tamano que es inferior o igual a 2,0 mm, inferior o igual a 1,0 mm, inferior o igual a 0,5 mm, inferior o igual a 0,25 mm, inferior o igual a 0,212 mm, inferior o igual a 0,180 mm,

inferior o igual a 0,150 mm, inferior o igual a 0,125 mm, inferior o igual a 0,106 mm, inferior o igual a 0,090 mm,

inferior o igual a 0,075 mm, inferior o igual a 0,063 mm, inferior o igual a 0,053 mm, inferior o igual a 0,045 mm,

inferior o igual a 0,038 mm, inferior o igual a 0,032 mm, inferior o igual a 0,025 mm, inferior o igual a 0,020 mm,

inferior o igual a 0,01 mm, o inferior o igual a 0,2 mm. El tamano de tamiz puede basarse en los tamanos de tamiz de las normas de EE.UU. de, por ejemplo, 10, 18, 35, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 170, 200, 230, 270, 325 o 400.

Una composicion de la presente invencion puede incluir opcionalmente un crioprotector. Un crioprotector es un compuesto que mantiene la viabilidad de los microbios fecales cuando se congelan. Los crioprotectores son conocidos en la tecnica y se usan rutinariamente para proteger microbios cuando se exponen a condiciones de congelation. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos tales como alanina, glicina, prolina; azucares simples tales como sacarosa, glucosa, lactosa, ribosa y trehalosa; y otros compuestos tales como sulfoxido de dimetilo (DMSO) y glicerol. La cantidad de crioprotector presente en una composicion descrita en el presente

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documento puede variar dependiendo del crioprotector usado y la temperatura que va a usarse para congelacion (por ejemplo, -20 °C, -80 °C o a temperatura diferente). La cantidad de crioprotector que puede usarse es conocida para el experto o puede ser facilmente determinada usando experimentacion rutinaria. En una realization, una composition de la presente invention puede incluir glicerol a una concentration del 10 %.

En una realizacion, una composicion de la presente invencion no incluye material biologico patogeno. En una realizacion, el material fecal es de una persona que se ha sometido a examen de los antecedentes medicos, fisico y pruebas de laboratorio. La evaluation de los antecedentes medicos puede incluir, pero no se limita a, riesgo de agentes infecciosos, presencia de comorbilidades gastrointestinales, factores que pueden afectar o afectan la composicion de la microbiota intestinal y afecciones medicas sistemicas. Los criterios de exclusion con respecto al riesgo de agentes infecciosos pueden incluir, pero no se limitan a, infection viral conocida con hepatitis B, C o VIH; exposition conocida al VIH o hepatitis viral en cualquier momento; comportamientos de alto riesgo que incluyen sexo por drogas o dinero, hombres que tienen sexo con otros hombres, mas de un companero sexual en los ultimos 12 meses, cualquier uso pasado de drogas intravenosas o cocaina intranasal, antecedentes de encarcelamiento; tatuaje o perforation en el cuerpo en los ultimos 12 meses; viajes a areas del mundo donde el riesgo de diarrea del viajero es mayor que en EE.UU.; y enfermedad actual trasmisible, por ejemplo, infeccion viral de las vias respiratorias superiores.

Los criterios de exclusion relativos a las comorbilidades gastrointestinales incluyen, pero no se limitan a, antecedentes de sindrome del intestino irritable, en los que los sintomas especificos pueden incluir calambres abdominales frecuentes, exceso de gases, hinchazon, distension abdominal, urgencia fecal, diarrea, estrenimiento; antecedentes de enfermedad inflamatoria del intestino tal como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis microscopica; diarrea cronica; estrenimiento cronico o uso de laxantes; antecedentes de tumor maligno gastrointestinal o poliposis de colon conocida; antecedentes de cualquier cirugia abdominal, por ejemplo, derivation gastrica, resection intestinal, apendectomia, colecistectomia y similares; uso de probioticos o cualquier otro auxiliar de venta libre usado por el posible donante a efectos de regular la digestion, pero se pueden permitir yogur y productos de kefir si se toman simplemente como alimentos en vez de como complementos nutricionales.

Los criterios de exclusion relativos a factores que pueden afectar o afectan la composicion de la microbiota intestinal incluyen, pero no se limitan a, antibioticos para cualquier indication en los ultimos 6 meses; cualquier medicamento inmunosupresor o antineoplasico prescrito.

Los criterios de exclusion relativos a afecciones medicas sistemicas incluyen, pero no se limitan a, sindrome metabolico establecido o emergente, donde los criterios utilizados para definition aqui son mas estrictos que los criterios establecidos, incluidos antecedentes de tension arterial elevada, antecedentes de diabetes o intolerancia a la glucosa; autoinmunidad sistemica conocida, por ejemplo, enfermedad de tejido conjuntivo, esclerosis multiple; enfermedades atopicas conocidas, que incluye asma o eccema; sindromes de dolor cronico que incluyen fibromialgia, sindrome de fatiga cronica; uso continuado (aunque sea intermitente) de cualquier medication prescrita, incluidos inhaladores o cremas y pomadas topicas; trastornos neurologicos, del neurodesarrollo y neurodegenerativos, incluidos autismo, enfermedad de Parkinson.

Los criterios de exclusion del examen fisico pueden incluir, pero no se limitan a, generales tal como indice de masa corporal > 26 kg/m2, obesidad central definida por la relation cintura : cadera > 0,85 (hombre) y > 0,80 (mujer); tension arterial > 135 mmHg sistolica y > 85 mmHg diastolica; piel - presencia de irritation, tatuajes o perforaciones en el cuerpo realizados en el ultimo ano, ictericia; ganglios linfaticos agrandados; sibilancia en la auscultation; hepatomegalia o estigmas de enfermedad hepatica; articulaciones inflamadas o dolorosas con la palpation; debilidad muscular; examen neurologico anormal.

Los criterios de exclusion de las pruebas de laboratorio pueden incluir, pero no se limitan a, heces positivas para la toxina B de Clostridium difficile probada por PCR; cultivos de heces positivas para cualquiera de los patogenos rutinarios que incluyen Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, E. coli O157:H7; examen anormal de huevos y parasitos; anfigenos positivos de Giardia, Cryptosporidium o Helicobacter pylori; evaluacion positiva para cualquier enfermedad viral, incluidas VIH 1 y 2, IgM de hepatitis viral A, anfigeno de superficie de la hepatitis y Ab de nucleo; RPR anormal (detection de sifilis); cualquier prueba de funcion hepatica anormal que incluye fosfatasa alcalina, aspartato aminotransaminasa, alanina aminotransferasa; trigliceridos en suero elevados > 150 mg/dl; colesterol HDL < 40 mg/dl (hombres) y < 50 mg/dl (mujeres); CRP de alta sensibilidad > 2,4 mg/l; glucosa de plasma en ayunas elevada (> 100 mg/dl).

Las composiciones de la presente invencion pueden incluirse en diversas formulaciones farmaceuticamente aceptables. En una realizacion, una formulation puede ser una composicion fluida. Las composiciones fluidas incluyen, pero no se limitan a, soluciones, suspensiones, dispersiones y similares. En una realizacion, una formulacion puede ser una composicion solida. Las composiciones solidas incluyen, pero no se limitan a, polvo, granulo, comprimido por compresion, pildora, capsula, chicle, oblea y similares. Tales formulaciones pueden incluir un vehiculo farmaceuticamente aceptable para hacer que la composicion sea apropiada para su administration a un sujeto. Como se usa en el presente documento, "vehiculo farmaceuticamente aceptable" incluye compuestos farmacologicamente inactivos compatibles con la administracion farmaceutica. Las composiciones de la presente

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invention pueden formularse para ser compatibles con su via de administration deseada. Una composition de la presente invencion puede administrarse cualquier metodo adecuado para deposito en el tubo gastrointestinal, preferentemente el colon, de un sujeto. Ejemplos de v^as de administracion incluyen administracion rectal (por ejemplo, por supositorio, enema, endoscopia superior, enteroscopia por empuje superior o colonoscopia), intubation a traves de la nariz o la boca (por ejemplo, mediante un tubo nasogastrico, tubo nasoenterico o tubo yeyunal nasal) o administracion por via oral (por ejemplo, mediante un solido tal como una pildora, comprimido o capsula, o mediante un liquido).

Para uso terapeutico en el metodo de la presente invencion, una composicion puede administrarse de forma conveniente en una forma que contiene uno o mas vehiculos farmaceuticamente aceptables. Vehiculos adecuados son muy conocidos en la tecnica y varian en la forma y modo deseado de administracion de la composicion. Por ejemplo, pueden incluir diluyentes o excipientes tales como cargas, aglutinantes, agentes humectantes, disgregantes, agentes tensioactivos, deslizantes, lubricantes y similares. Normalmente, el vehiculo puede ser un solido (incluido polvo), liquido, o combinaciones de los mismos. Cada vehiculo es preferentemente "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la composicion y no nocivo para al sujeto. El vehiculo es preferentemente biologicamente aceptable e inerte, es decir, permite que la composicion mantenga la viabilidad del material biologico hasta que se administre al sitio apropiado.

Las composiciones orales pueden incluir un diluyente inerte o un vehiculo comestible. Con el fin de la administracion terapeutica por via oral, el compuesto activo puede incorporarse con los excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o capsulas, por ejemplo, capsulas de gelatina. Las composiciones orales tambien pueden prepararse combinando una composicion de la presente invencion con un alimento. En una realization, un alimento usado para administracion se enfria, por ejemplo, helado. Aglutinantes farmaceuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composicion. Los comprimidos, pildoras, capsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes componentes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente disgregante tal como acido alginico, Primogel o almidon de maiz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dioxido de silicio coloidal; un edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja.

Los compuestos activos tambien pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retention para administracion rectal.

Los compuestos activos pueden prepararse con vehiculos que protegeran al compuesto contra la rapida elimination del cuerpo, tal como una formulation de liberation controlada, que incluye implantes. Pueden usarse polimeros biodegradables biocompatibles tales como etileno-acetato vinilo, polianhidridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Tales formulaciones pueden prepararse usando tecnicas convencionales. Los materiales tambien pueden obtenerse comercialmente de, por ejemplo, en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Tambien pueden usarse suspensiones liposomales como vehiculos farmaceuticamente aceptables. Estas pueden prepararse segun metodos conocidos para los expertos en la tecnica.

En una realizacion, una composicion puede ser encapsulada. Por ejemplo, cuando la composicion va a ser administrada por via oral, la forma de dosificacion se formula de forma que la composicion no se exponga a las condiciones prevalentes en el tubo gastrointestinal antes del colon, por ejemplo, acidez alta y enzimas digestivas presentes en el estomago y/o intestino. La encapsulation de composiciones para uso terapeutico es rutinaria en la tecnica. La encapsulacion puede incluir capsulas de cubierta dura, que pueden usarse para componentes secos en polvo, y capsulas de cubierta blanda. Las capsulas pueden prepararse a partir de soluciones acuosas de gelificantes tales como proteina animal (por ejemplo, gelatina), polisacaridos vegetales o derivados como carrageninas y formas modificadas de almidon y celulosa. Pueden anadirse otros componentes a una solution de gelificante tales como plastificantes (por ejemplo, glicerina y/o sorbitol), agentes colorantes, conservantes, disgregantes, lubricantes y tratamiento superficial.

Puede prepararse una composicion obteniendo una muestra fecal de un donante apropiado y mezclado con un diluyente. Diluyentes utiles incluyen soluciones acuosas que son rutinariamente usadas para manipular microbios, celulas eucariotas y/o virus. Diluyentes utiles pueden incluir constituyentes para mantener el tamponamiento fisiologico, osmolaridad y similares. El diluyente es preferentemente esteril y/ no alergenico. Un ejemplo de un diluyente incluye, pero no se limitan a, solucion salina tamponada con fosfato a pH 7. En una realizacion, 1 parte de heces de donante puede combinarse con 5 partes de diluyente (por ejemplo, pueden combinarse 50 gramos de heces de donante con 250 ml de diluyente) y mezclarse. En una realizacion, el oxigeno en la camara de mezcla puede reducirse o quitarse purgando con un gas inerte tal como nitrogeno o argon antes de la mezcla. Tales condiciones anaerobias pueden ser utiles para mantener la viabilidad de la mayoria de las bacterias anaerobias presentes en un colon. La muestra puede mezclarse multiples veces y/o puede anadirse mas diluyente hasta que se logre una consistencia que permita que ocurran las siguientes etapas. En una realizacion, las condiciones anaerobias no se usan en las etapas posteriores a la mezcla. Se encontro que las condiciones anaerobias no eran necesarias en las etapas posteriores a la mezcla, y este fue inesperado y sorprendente dado que un porcentaje sustancial de celulas procariotas en el material fecal son anaerobias estrictas y la exposition al oxigeno las destruye.

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Despues de la mezcla, las soluciones usadas para el lavado y la resuspension no necesitaron ser purgadas de oxigeno, y no se necesito la manipulacion de la microbiota en una vitrina o camara sellada con guantes libre de oxigeno.

No todos los microbios y celulas eucariotas presentes en el colon de un individuo pueden cultivarse, por lo tanto, en una realizacion las condiciones para preparar una composicion incluyen el uso de temperaturas que reducen la replicacion de los microbios y celulas eucariotas. En una realizacion, las condiciones usadas para la preparacion se mantienen por debajo de 37 °C. Por ejemplo, las condiciones usadas para la preparacion se mantienen a una temperatura no superior a 30 °C, no superior a 20 °C, no superior a 10 °C o no superior a 5 °C. En una realizacion, se usan condiciones de forma que la replicacion de los microbios y las celulas eucariotas no ocurra. Cuando las condiciones usadas para preparar una composicion de la presente invencion incluyen temperaturas mas bajas para minimizar la replicacion y muerte celular, el material biologico presente en una composicion incluye una poblacion de microbios, celulas eucariotas y virus que es esencialmente identica a una poblacion de microbios, celulas eucariotas y virus presentes en el colon o heces de un ser humano sano normal, por ejemplo, el donante del que se obtuvo la muestra fecal.

La eliminacion del material no vivo puede lograrse pasando la muestra mezclada a traves de un tamiz con un tamano de tamiz no superior a 2,0 mm, no superior a 1,0 mm, no superior a 0,5 mm, no superior a 0,25 mm, no superior a 0,212 mm, no superior a 0,180 mm, no superior a 0,150 mm, no superior a 0,125 mm, no superior a 0,106 mm, no superior a 0,090 mm, no superior a 0,075 mm, no superior a 0,063 mm, no superior a 0,053 mm, no superior a 0,045 mm, no superior a 0,038 mm, no superior a 0,032 mm, no superior a 0,025 mm, no superior a 0,020 mm, no superior a 0,01 mm, o no superior a 0,2 mm. En una divulgacion, la muestra mezclada se prepara pasandola a traves de un tamiz con un tamano de tamiz de 0,25 mm y recolectando el filtrado. La composicion de la presente invencion se prepara por un metodo en el que la muestra mezclada se pasa a traves de tamices con un tamano de tamiz progresivamente mas pequenos hasta el pase final a traves de un tamano de tamiz de 0,25 mm. Por ejemplo, si se usa un total de cuatro tamices, el tamano de tamiz del primer tamiz puede ser 2 mm, seguido de 1 mm, seguido de 0,5 mm y luego seguido de 0,25 mm. El filtrado final puede recogerse en un tubo de centrifugadora, y centrifugarse a una velocidad suficiente para sedimentar el material biologico, por ejemplo, 10.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se elimina, las celulas se resuspenden en diluyente, opcionalmente se centrifugan nuevamente, por ejemplo, a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante final se desecha y las celulas se resuspenden en una solucion acuosa (por ejemplo, diluyente, crioprotector y similares, o una combination de los mismos). En una realizacion, el volumen de la mezcla combinada se reduce a traves de las etapas de tamizado y lavado. Por ejemplo, en una realizacion, el volumen se reduce al 14 % del volumen usado en la mezcla (por ejemplo, de 250 ml a 35 ml). En una realizacion, el volumen de la mezcla se reduce a traves de las etapas de tamizado y lavado para producir entre 1 x 1010 y 5 x 1010 celulas en un volumen que posteriormente se administra a un sujeto. Este proceso produce un extracto de heces que esta altamente enriquecido en toda la microbiota de colon que es capaz de pasar a traves de un tamiz como se describio anteriormente, y puede centrifugarse a 10.000 x g durante 10 minutos. Como se usa en el presente documento, "enriquecido" se refiere a aumentar la abundancia del material biologico con respecto al material no vivo, de forma tal que el material biologico constituya una proportion significativamente mas alta en comparacion con el material fecal antes del enriquecimiento. El termino "enriquecido" se refiere a aquellas situaciones en las que una persona ha intervenido para elevar la proporcion de material biologico.

La cantidad de solucion acuosa anadida puede ser una cantidad que produzca una unica dosificacion que tenga un numero apropiado de celulas. En una realizacion, una unica dosificacion puede incluir entre 1 x 1010 y 5 x 1010 celulas, por ejemplo, 3 x 1010 celulas. Como la mayoria del material biologico es dificil o imposible de cultivar, puede usarse un hemocitometro para determinar el numero de celulas.

En una realizacion, el sedimento resultante puede suspenderse en la mitad del volumen original de diluyente que contiene 10 % de glicerol. La muestra puede usarse inmediatamente, o puede congelarse, por ejemplo, a -80 °C, para uso posterior. Cuando se congela, la muestra puede dejarse en un tubo de centrifugadora, o pueden estar en un recipiente diferente. En una realizacion, el recipiente es uno que aumenta el area superficial de la muestra. Por ejemplo, la muestra puede colocarse en una bolsa IV. Cuando la muestra congelada deba usarse, puede descongelarse sobre hielo y luego trasplantarse al receptor. Se encontro que la congelation de las composiciones descritas en el presente documento no produjo la destruction de su potencial curativo. En una realizacion, la muestra que resulta de la centrifugation puede procesarse para almacenamiento a largo plazo de 1 ano o mas. La capacidad de almacenamiento de una muestra tal proporciona un nivel de flexibilidad que no fue posible con otros metodos. Por ejemplo, fue necesario identificar rapidamente un donante, procesar rapidamente una muestra fecal del donante y usarla inmediatamente. Ejemplos de metodos de procesamiento utiles incluyen, pero no se limitan a, congelacion, liofilizacion, secado por pulverization, secado al vacio, secado con aire, u otras formas de secado evaporativo. El procesamiento de una composicion de la presente invencion puede incluir la production de un polvo tras cualquier procedimiento de secado.

El uso de tamices para extraer el material biologico del material fecal produjo inesperadamente una composicion que era casi inodora. Esto no estaba previsto debido a que las heces normalmente tienen un olor distintivo y fue sorprendente que se eliminara por la minima manipulacion usada. Esto es una ventaja significativa porque toma un

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metodo que es poco estetico y tan desagradable que algunos pacientes y personal rehusan a realizarlo, y lo cambia en un metodo que se pone en practica facilmente en un contexto clmico normal o en el hogar. Como se usa en el presente documento, "inodoro" significa que hay una cantidad reducida de moleculas organicas volatiles presentes, y la cantidad reducida de moleculas organicas volatiles presentes puede ser facilmente detectada por una persona comparando el material antes del procesamiento con el material despues del procesamiento.

La composicion de la presente invencion puede usarse en diversos metodos descritos en el presente documento. Un metodo incluye administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una composicion descrita en el presente documento. La administracion es en condiciones adecuadas para la deposicion de la composicion en una region del intestino grueso o delgado de forma que el material biologico en la composicion colonice el colon. Por ejemplo, la administracion puede ser en el tubo gastrointestinal superior, asi como el tubo gastrointestinal inferior, por ejemplo, el ileon terminal, ciego, areas colonicas que contienen diverticulosis y el recto. La administracion puede ser oral, tal como mediante un comprimido. La administracion puede ser por intubacion, tal como mediante tubo nasogastrico. La administracion puede ser rectal, por ejemplo, mediante colonoscopia, enema o supositorio. Condiciones que son "adecuadas" para que ocurra un acontecimiento, o condiciones "adecuadas" son condiciones que no previenen que se produzcan tales acontecimientos. Asi, estas condiciones permiten, mejoran, facilitan y/o contribuyen al acontecimiento. Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad suficiente de una composicion descrita en el presente documento para proporcionar el efecto deseado. Por ejemplo, una "cantidad eficaz" es una cantidad eficaz para aliviar uno o mas sintomas y/o signos de la enfermedad como se describe en el presente documento. Una cantidad eficaz puede ser una cantidad que es suficiente para efectuar una reduccion de un sintoma y/o signo asociado con una enfermedad, tal como diarrea o C. difficile. Una reduccion de un sintoma y/o signo es, por ejemplo, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 100 % de un signo medido en comparacion con un control, un sujeto sin tratar, o el sujeto antes de la administracion de la composicion. Una cantidad eficaz puede ser una cantidad suficiente para producir al menos 1 x 1010, al menos 3 x 1010 o al menos 5 x 1010 celulas administradas al colon. Se entendera, sin embargo, que la dosificacion total de las composiciones como se desvela en el presente documento sera decidida por el medico adjunto dentro del alcance de criterio medico sensato. La cantidad exacta requerida variara dependiendo de factores tales como el tipo y alcance de la enfermedad que esta tratandose.

Un metodo de la presente divulgacion incluye tratar ciertas enfermedades en un sujeto en necesidad de tratamiento. El sujeto puede ser un mamifero, tal como un ser humano. Pueden usarse modelos animales, tales como un mamifero, que incluyen una rata, un raton, un hamster, un jerbo o un primate. Como se usa en el presente documento, el termino "enfermedad" se refiere a cualquier desviacion de o interrupcion de la estructura o funcion normal de una parte, organo, o sistema, o combinacion de los mismos, de un sujeto que se manifiesta mediante un sintoma caracteristico o signo clinico. Enfermedades incluyen aquellas caracterizadas por composicion disfuncional de la microbiota de colon. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, colitis, que incluye colitis autoinmune (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, sindrome del intestino irritable) y colitis infecciosa. Ejemplos de colitis infecciosa incluyen, pero no se limitan a, colitis por Clostridium difficile (por ejemplo, colitis por C. difficile aguda, colitis por C. difficile recidivante o colitis por C. difficile grave) y colitis enterohemorragica (por ejemplo, una colitis causada por Shigella spp. o E. coli). Otros ejemplos de enfermedad incluyen, pero no se limitan a, diarrea cronica; estrenimiento cronico, sindrome metabolico y obesidad, enfermedad atopicas que incluyen asma, eccema, trastornos eosinofilicos del tubo Gl, autoinmunidad sistemica que incluye artritis reumatoide, lupus sistemico eritematoso, esclerosis multiple, etc., trastornos de dolor cronico tales como fibromialgia, sindrome de fatiga cronica, trastornos neurodegenerativos, trastornos de la alimentacion y desnutricion.

Como se usa en el presente documento, el termino "srntoma" se refiere a pruebas subjetivas de enfermedad o afeccion experimentadas por el paciente y causadas por enfermedad. Como se usa en el presente documento, el termino "signo clinico" o simplemente "signo" se refiere a pruebas objetivas de una enfermedad presente en un sujeto. Los sintomas y/o signos asociados con las enfermedades a las que se hace referencia en el presente documento y la evaluacion de tales signos son rutinarios y conocidos en la tecnica. Normalmente, puede determinarse si un sujeto tiene una enfermedad y si un sujeto esta respondiendo al tratamiento evaluando los signos asociados con la enfermedad.

El tratamiento de una enfermedad puede ser profilactico o, alternativamente, puede ser iniciado despues del desarrollo de una enfermedad. El tratamiento que es profilactico, por ejemplo, iniciado antes de que un sujeto manifieste los signos de una enfermedad, se denomina en el presente documento tratamiento de un sujeto que esta "en riesgo" de desarrollar una enfermedad. Un ejemplo de un sujeto que esta en riesgo de desarrollar una enfermedad es una persona que tiene un factor de riesgo. Un ejemplo de un factor de riesgo para colitis por Clostridium difficile es la terapia con antibioticos del tubo gastrointestinal. El tratamiento puede realizarse antes, durante o despues de la aparicion de las enfermedades descritas en el presente documento. El tratamiento iniciado despues del desarrollo de una enfermedad puede producir una disminucion de la gravedad de los signos de la enfermedad, o eliminar completamente los signos.

Un metodo de la presente divulgacion incluye trasplantar una microbiota de un donante a un receptor.

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Un metodo de la presente divulgacion incluye aumentar la abundancia relativa de miembros del filo Firmicutes, tal como un miembro no patogeno de la clase Clostridia, y/o miembros del filo Bacteriodetes, en el colon de un receptor. La expresion "abundancia relativa" se refiere al numero de miembros de un filo o clase en comparacion con el numero de miembros de todos los otros taxones en el colon de un receptor. Una comparacion tal puede expresarse como un porcentaje. La abundancia relativa de miembros no patogenos de la clase de Clostridia en el colon de un receptor despues de la administration puede aumentarse al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 % o al menos el 50 %, en comparacion con el colon de un receptor antes de la administracion. La abundancia relativa de miembros del filo Firmicutes en el colon de un receptor despues de la administracion puede aumentarse al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 % o al menos el 50 %, en comparacion con el colon de un receptor antes de la administracion. El cambio en la abundancia puede determinarse, por ejemplo, 3 dias, 10 dias, 15 dias o 25 dias despues de la administracion de la microbiota fecal.

Un metodo de la presente divulgacion incluye reducir la abundancia relativa de miembros del filo Proteobacteria en el colon de un receptor. La abundancia relativa de miembros del filo Proteobacteria en el colon de un receptor despues de la administracion puede reducirse al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 % o al menos el 40 %, en comparacion con el colon de un receptor antes de la administracion. El cambio en la abundancia de los miembros del filo Proteobacteria puede determinarse, por ejemplo, 3 dias, 10 dias, 15 dias o 25 dias despues de la administracion.

La microbiota existente no necesita ser eliminada antes de la administracion de una composition de la presente invention. La elimination de la microbiota puede ser necesaria. Los metodos para la elimination de la microbiota existente son conocidos y rutinarios. En un ejemplo, la eliminacion puede llevarse a cabo administrando una mezcla de antibioticos durante una semana hasta un dia antes del trasplante. Un ejemplo de una mezcla util es metronidazol (1000 mg dos veces al dia), rifaximina (550 mg dos veces al dia), vancomicina (500 mg dos veces al dia) y neomicina (1000 mg dos veces al dia).

La presente invencion se ilustra por los siguientes ejemplos.

Hasta el punto que los ejemplos contienen materia que se encuentra fuera del alcance de la presente invencion, estan incluidos simplemente para fines de referencia.

Ejemplo 1

La enfermedad asociada con Clostridium difficile es un complication conocida importante de la terapia con antibioticos. El patogeno normalmente se mantiene bajo control mediante la microbiota del colon nativa, pero este nivel de protection puede perderse cuando estas comunidades microbianas son suprimidas por los antibioticos. Los antibioticos usados para tratar la infection por C. difficile tambien pueden perpetuar su reaparicion mediante la supresion continuada de la microbiota normal. Por lo tanto, una fraction significativa de pacientes sufre infeccion por C. difficile persistente y la infeccion por C. difficile persistente esta asociada con una morbilidad significativa. La bacterioterapia fecal es un metodo cada vez mas usado para romper el ciclo de reaparicion de la infeccion por C. difficile supuestamente a traves de la restauracion de las comunidades microbianas intestinales normales. Los presentes inventores informaron previamente, en un caso clinico, que la bacterioterapia de microbiota del colon produjo el reemplazo de una microbiota del hospedador por la del donante (Khorats, et al., 2010, J. Clin. Gastroenterol., 44(5):354). Con el fin de obtener una mayor comprension de la composicion y estabilidad de las comunidades microbianas antes y despues de la bacterioterapia, los presentes inventores han analizado regiones de ARNr 16S amplificadas de ADN fecal (V5 y V6) usando una tecnologia de pirosecuenciamiento (Illumina HiSeq2000 u otras plataformas Illumina). Actualmente estan siendo procesados y analizados individuos adicionales.

Introduccion

• Clostridium difficile es un patogeno emergente y la causa mas comun de diarrea intrahospitalaria.

• Las infecciones estan frecuentemente asociadas con la terapia con antibioticos, donde esta alterado el efecto protector proporcionado por la flora intestinal normal.

• La infeccion por C. difficile se controla frecuentemente mediante una terapia antimicrobiana adicional, pero aproximadamente el 20 % de los pacientes desarrolla una enfermedad refractaria que resulta en diarrea recurrente.

• Se ha mostrado que la bacterioterapia, en forma de un trasplante fecal, trata satisfactoriamente la infeccion por C. difficile refractaria.

• Las tecnologias de secuenciacion de ultima generation han permitido un interrogatorio mas profundo de la microflora intestinal y se uso en el estudio de los presentes inventores para examinar cambios en la estructura de la comunidad microbiana despues del trasplante.

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Se obtuvo material fecal del donante del hijo del paciente, que se probo para enfermedad infecciosa, que incluye C. difficile, virus de la hepatitis A, B o C, virus de VIH, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, Shigella, E. coli O157:H7, Helicobacter pylori, Treponema pallidum, Giardia y Cryptosporidium.

Se infundio el paciente con material fecal del donante mediante colonoscopia, que revelo diverticulosis extensa grave en el colon sigmoideo. El material fecal del donante se deposito en el ciego. Los sintomas segun la infeccion por C. difficile se resolvieron en un plazo de dias desde la bacterioterapia.

Metodos

• Se recogieron muestras fecales del paciente el dia -31 antes de la bacterioterapia de trasplante fecal y en los dias 5, 21,46, 95, 132, 159, 188 y 227 despues del trasplante. Se recogio una muestra fecal del donante el dia del procedimiento y se deposito en el ciego del receptor.

• Se extrajo ADN de los materiales fecales usando un kit de ADN fecal MOBIO Ultra-clean (MOBIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) segun las indicaciones del fabricante. Se extrajeron y agruparon muestras por triplicado.

• Se amplifico la region hipervariable V6 del gen ARNr 16S de las bacterias usando 50 ng de ADN extraido como molde. Se usaron cebadores con codigo de barra para una secuenciacion multiplex (Kysela et al., 2005, Environmental Microbiology 7:356- 64 y Claesson et al., Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, No. 22 e200 doi:10.1093/nar/gkq873). Se prepararon y agruparon muestras por triplicado.

• Se mezclaron muestras amplificadas en relaciones equimolares y se secuenciaron en el Centro Nacional de Investigacion Genomica (NCGR) usando la plataforma de secuenciacion Illumina.

• Se analizaron datos de secuencia usando MOTHUR y la base de datos de referencia SILVA (Scholss, 2009, Appl. Environ. Microbiol., 75 (23) :7537-7541). La taxonomia de unidades taxonomicas operacionales (OTU) se asignaron al 97 % de similitud usando los archivos de referencia GreenGenes.

• Se hizo el analisis de los componentes principales usando el calculo theta de Yue y Clayton (Yue y Clayton, 2005, Commun. Stat. Theor. Methods, 34:2123-2131). Las curvas de acumulacion se calcularon basandose en el 97 % de similitudes de OTU.

Resultados y analisis

• Mas del 40 % de las secuencias obtenidas de la muestra pre- trasplante del receptor (dia -31) pertenecio a cepas de Mollicutes sin clasificar o Gammaproteobacteria.

• Por el contrario, las muestras post-trasplante del donante y del receptor estuvieron dominadas por Firmicutes. Los miembros sin clasificar de la familia de los Clostridiales y los Ruminococcaceae fueron abundantes.

• El analisis de la comunidad hecho usando el indice theta de Yue y Clayton mostro que las muestras post- trasplante se agruparon mas estrechamente entre si y con la muestra del donante, en comparacion con la de la muestra pre-trasplante del receptor.

• El analisis de secuencia indico que los taxones presentes en las muestras fecales pre- y post-trasplante del receptor difirieron considerablemente, sugiriendo que la bacterioterapia fecal fue satisfactoria en alterar la microflora intestinal del paciente.

• La comunidad microbiana trasplantada en el intestino del receptor permanecio bastante estable despues de 7,5 meses post- trasplante.

Sorprendentemente, las secuencias que representan los Bacteroidales se encontraron en abundancia bastante baja en todas las muestras analizadas.

Ejemplo 2

Evaluacion de donantes para la preparacion de material de microbiota fecal

El donante se somete a un examen completo de los antecedentes medicos y fisico. Ademas, se completa un cuestionario completo sobre los antecedentes del donante segun recomienda la FDA para donantes de sangre y se excluyen posibles donantes que dicen si a cualquiera de las preguntas (
http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBL As/BloodDonorScreening/UCM213552.pdf). Sin embargo, como la microbiota intestinal se ha asociado o se ha

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supuesto que se relaciona con afecciones medicas multiples, el proceso de selection es mas riguroso que el de los donantes de sangre e incluye practicamente cualquier enfermedad sistemica.

Criterios de inclusion

1. Edad >18

2. Capacidad de proporcionar consentimiento informado.

Criterios de exclusion

I. Antecedentes medicos

A. Riesgo de agente infeccioso.

1. Infection viral conocida con hepatitis B, C o VIH

2. Exposition conocida a VIH o hepatitis viral en cualquier momento.

3. Comportamientos de alto riesgo incluyendo sexo por drogas o dinero, hombres que han tenido sexo con hombres, mas de un companero sexual en los ultimos 12 meses, cualquier uso pasado de drogas intravenosas o cocaina intranasal, antecedentes de encarcelamiento.

4. Tatuaje o perforation en el cuerpo en los ultimos 12 meses.

5. Viaje a areas del mundo donde el riesgo de diarrea del viajero es mayor que en EE.UU.

6. Enfermedad transmisible actual, por ejemplo, infeccion viral de las vias respiratorias superiores.

B. Comorbilidades gastrointestinales.

1. Antecedentes de sindrome del intestino irritable. Sintomas especificos pueden incluir calambres abdominales frecuentes, exceso de gases, hinchazon, distension abdominal, urgencia fecal, diarrea, estrenimiento.

2. Antecedentes de enfermedad inflamatoria del intestino, tal como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis microscopica.

3. Diarrea cronica.

4. Estrenimiento cronico o uso de laxantes.

5. Antecedentes de tumor maligno gastrointestinal o poliposis de colon conocida.

6. Antecedentes de cualquier cirugia abdominal, por ejemplo, derivation gastrica, resection intestinal, apendectomia, colecistectomia, etc.

7. Uso de probioticos o cualquier otro auxiliar de venta libre usado por el posible donante a efectos de regular la digestion. Yogurt y productos de kefir son permitidos si se consumen simplemente como alimentos en vez de como complementos nutricionales.

C. Factores que pueden afectar o afectan la composition de la microbiota intestinal.

1. Antibioticos para cualquier indication en los ultimos 6 meses.

2. Cualquier medicamento inmunosupresor o antineoplasico prescrito.

D. Afecciones medicas sistemicas.

1. Sindrome metabolico, establecido o emergente. Los criterios usados para la definition aqui son mas estrictos que cualquier criterio establecido. Estos incluyen antecedentes de tension arterial elevada, antecedentes de diabetes o intolerancia a la glucosa.

2. Autoinmunidad sistemica conocida, por ejemplo, enfermedad de tejido conjuntivo, esclerosis multiple.

3. Enfermedades atopicas conocidas, incluyendo asma o eccema.

7. Sindromes de dolor cronico, incluyendo fibromialgia, sindrome de fatiga cronica.

4. Uso continuo (aunque sea intermitente) de cualquier medication prescrita, incluyendo inhaladores o cremas y pomadas topicas.

5. Trastornos neurologicos, del neurodesarrollo y neurodegenerativos que incluyen autismo, enfermedad de Parkinson.

II. Criterios de exclusion del examen fisico.

1. Generales. tadice de masa corporal >26 kg/m2, obesidad central definida por la relation cintura : cadera > 0,85 (hombre) y > 0,80 (mujer).

2. Presion sanguinea > 135 mmHg sistolica y >85 mmHg diastolica.

3. Piel - presencia de una irritation, tatuajes o perforaciones en el cuerpo realizados en el ultimo ano, ictericia.

4. Ganglios linfaticos agrandados.

5. Sibilancia en la auscultation.

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6. Hepatomegalia o estigma de enfermedad hepatica.

7. Articulaciones inflamadas o dolorosas con la palpacion. Debilidad muscular.

8. Examen neurologico anormal.

III. Criterios de exclusion en las pruebas de laboratorio.

1. Heces positivas para la toxina B de Clostridium difficile probada por PCR.

2. Cultivos de heces positivas para cualquiera de los patogenos rutinarios que incluyen Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, E. coli O157:H7.

3. Examen anormal de huevos y parasitos.

4. Antigenos de Giardia, Cryptosporidium o Helicobacter pylori positivos.

5. Evaluacion positiva para cualquier enfermedad viral, incluyendo VIH 1 y 2, IgM de hepatitis viral A, antigeno de superficie de hepatitis y Ab de nucleo.

6. RPR anormal (deteccion de sifilis).

7. Cualquier prueba de funcion hepatica anormal incluyendo fosfatasa alcalina, aspartato aminotransaminasa, alanina aminotransferasa.

8. Trigliceridos en suero elevados > 150 mg/dl

9. Colesterol HDL < 40 mg/dl (hombres) y < 50 mg/dl (mujeres)

10. CRP de alta sensibilidad >2,4 mg/l

11. Glucosa en plasma en ayunas elevada (> 100 mg/dl)

Ejemplo 3

Procesamiento de muestras fecales

El material fecal del donante se enfria inmediatamente sobre hielo para el transporte al laboratorio. Las muestras se procesan en el plazo de una hora despues de la recogida.

Las muestras fecales se homogeneizan mezclando 50 g de heces del donante y 250 ml de solucion salina tamponada con fosfato esteril, pH 7, (PBS) en una mezcladora Waring. La camara de mezcla se purga con gas nitrogeno durante varios minutos para eliminar el oxigeno antes de la homogenizacion. Las muestras se mezclan tres veces en la configuracion mas baja durante 20 segundos. Pueden anadirse PBS adicional o ciclos de mezcla dependiendo de la consistencia de la suspension fecal. Las muestras mezcladas se pasan a traves de una serie de cuatro tamices con tamanos de poro de 2,0 mm, 1,0 mm, 0,5 mm y 0,25 mm (W.S. Tyler Industrial Group, Mentor, OH). Los tamices se basaron en tamanos de tamiz de la norma de EE.UU. de 10, 18, 35, y 60 durante 2,0 mm, 1,0 mm, 0,5 mm y 0,25 mm, respectivamente. El filtrado final que pasa a traves de los tamices (fraccion inferior a 0,25 mm) se recoge en tubos conicos de centrifugadora de 50 ml y se centrifuga a 4.000 rpm (aproximadamente 4.000 x g) durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se descarta y el sedimento se suspende en la mitad del volumen original de PBS (por ejemplo, 125 ml) que contiene 10 % de glicerol. Las muestras se usan inmediatamente o se almacenan congeladas a -80 °C y se descongelan sobre hielo antes del trasplante.

Ejemplo 4

Este ejemplo informa de la experiencia clinica con 43 pacientes consecutivos que se trataron para una infeccion por C. difficile recurrente (CDI). Durante este tiempo se simplifico la identificacion y evaluacion de donantes moviendose de donantes individuales identificados como pacientes a donantes voluntarios estandar. La preparacion del material cambio de la sala de endoscopia a un proceso normalizado en el laboratorio y finalmente al almacenamiento en banco de material fecal procesado congelado que esta listo para uso cuando se necesite. La normalization de la preparacion del material simplifico significativamente los aspectos practicos del tratamiento sin la perdida de eficacia aparente en eliminar la CDI recurrente. Aproximadamente el 30 % de los pacientes tenian la enfermedad inflamatoria del intestino subyacente y el tratamiento fue igualmente de eficaz en este grupo. Varias etapas clave en la normalizacion de la preparacion del material del donante simplificaron significativamente la practica clinica del tratamiento de CDI recurrente en pacientes que fallaron en la terapia con antibioticos. Esto tambien se informa en Hamilton et al., Am. J. Gastroenterol., 2012, doi:10.1038/ajg.2011.482.

Metodos

Pacientes

Este informe incluye los primeros 43 pacientes que recibieron el trasplante de microbiota fecal (FMT) para CDI recurrente. Todos los pacientes fueron identificados por referencia directa de profesionales clinicos en enfermedad infecciosa y practicas de gastroenterologia en el area metropolitana de Minneapolis y St. Paul. Los criterios de inclusion para FMT incluyeron antecedentes de infeccion sintomatica, positiva para toxina, por C. difficile y al menos dos reapariciones posteriores documentadas a pesar del uso de terapia con antibioticos estandar. Al menos un regimen de antibioticos fallido tenia que incluir un minimo de un ciclo de 6 semanas de dosificacion de vancomicina cada vez mas baja o pulsada, o al menos un ciclo de vancomicina de un mes seguido de un "perseguidor" de

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rifaximina de un mmimo de dos semanas. Los unicos criterios de exclusion en el protocolo fueron edad < 18 y fragilidad medica de problemas no por C. difficile que resultaron en una esperanza de vida de < 1 ano. En la ultima situacion los presentes inventores aconsejaron a los pacientes que la mejor opcion terapeutica era un ciclo indefinido de vancomicina. Todos los pacientes dieron consentimiento informado para el FMT a traves de colonoscopia, reconociendo una experiencia relativamente limitada con este enfoque del tratamiento y las incognitas intrinsecas asociadas con su uso. El Comite de etica medica en la Universidad de Minnesota aprobo la recogida prospectiva de datos de resultados clmicos, mientras que reconocio que esta experiencia no constituia un ensayo clinico, y como tal no se diseno para probar la eficacia del FMT en comparacion con cualquier otra opcion terapeutica.

Identificacion y cribado de donantes

Al comienzo del programa se les pidio a los pacientes que auto-identificaran posibles donantes. Estos inclman madres (n=2), hijas (n=1), hijos (n=3), esposas (n=1), maridos (n=1) y amigos (n=2). Antes del reclutamiento, se solicito a los donantes que presentaran historias medicas disponibles y que tuvieran una entrevista sobre los antecedentes medicos por separado lejos del paciente receptor. La historia incluyo: evaluacion del riesgo infeccioso, incluyendo la identificacion de factores de riesgo conocidos para VIH y hepatitis, enfermedades transmisibles actuales y viaje reciente a areas del mundo con una prevalencia mas alta de enfermedades diarreicas. Los criterios de exclusion de los donantes adicionales absolutos incluyeron comorbilidades gastrointestinales y el uso de antibioticos en el plazo de los tres meses precedentes. Como es probable que la microbiota intestinal este implicada en diversos aspectos del metabolismo de la energia y el funcionamiento del sistema inmunitario, la presencia de caracteristicas del sindrome metabolico, autoinmunidad o enfermedades alergicas fueron tratadas como criterios de exclusion relativos. Los donantes proporcionaron consentimiento informado por separado para participar en el protocolo, que incluyo riesgos asociados con la evaluacion de laboratorio. Los donantes se sometieron a una prueba serologica para VlH y hepatitis B y C, y la prueba de heces que incluyo la evaluacion de patogenos entericos rutinarios, toxina B de C. difficile y examen de huevos y parasitos y antigenos de Giardia y Cryptosporidium.

Dadas las dificultades logisticas variables en el reclutamiento de donantes identificados como pacientes individuales, la falta de disponibilidad de materiales de donantes cuando se necesitan, y que ninguna evidencia sugiera una ventaja terapeutica clara de uso de un donante relacionado frente a uno no relacionado (por ejemplo, hijo o hija frente a amigo o companero), se reclutaron donantes voluntarios en el programa de FMT. Las ventajas de este cambio incluyeron retirar la carga de la identificacion del donante del paciente, mejorar la eficiencia y los costes relacionados con la evaluacion de los donantes, un suministro mas consistente de la microbiota fecal del donante y la capacidad de imponer criterios de exclusion extensivos y rigurosos en la seleccion de donantes (Tabla 1). Durante este periodo se reclutaron dos voluntarios no remunerados y uno de ellos proporciono la mayor parte del material fecal donado. Se revisaron los antecedentes medicos de los donantes antes de cada donacion y se realizo la evaluacion de laboratorio completa, como se ha descrito anteriormente, cada 6 meses.

Tabla 1. Criterios de exclusion de donantes.

Criterios de exclusion de donantes: Examen de antecedentes y fisico Evaluacion de laboratorio

Riesgo de agente infeccioso: 1. Infeccion por VIH o hepatitis B, C conocida. 2. Exposicion conocida a VIH o hepatitis viral en cualquier momento. 3. Comportamientos de alto riesgo incluyendo sexo por drogas o dinero, hombres que han tenido sexo con hombres, mas de un companero sexual en los ultimos 12 meses, antecedentes de encarcelamiento, cualquier uso pasado de drogas intravenosas o cocaina intranasal. 4. Tatuaje o perforation en el cuerpo en los ultimos 12 meses. 5. Viaje a areas del mundo con riesgo elevado de diarrea del viajero. 6. Enfermedad transmisible actual, por ejemplo, infeccion viral de las vias respiratorias superiores. 1. Ab para VIH 1 y 2. 2. IgM de hepatitis viral A. 3. Ag de superficie de hepatitis B y Ab de nucleo. 4. Ab de VHC. 5. RPR. 6. Cultivos de heces para patogenos entericos que incluyen Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, E. coli O157:H7. 7. Examen de huevos y parasitos. 8. Antigenos de Giardia, Cryptosporidium o Helicobacter pylori de heces positivos. 9. PCR de toxina B de Clostridium difficile 10. Pruebas de funcion hepatica incluyendo fosfatasa alcalina, AST, ALT.

Comorbilidades gastrointestinales: 1. Antecedentes de sindrome del intestino irritable o cualquiera de los smtomas asociados, incluyendo calambres abdominales frecuentes, exceso de gases, hinchazon, distension abdominal, urgencia fecal, diarrea o estrenimiento. 2. Antecedentes de enfermedad inflamatoria del intestino tal como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis linfocitica. 3. Diarrea cronica. 4. Estrenimiento cronico o uso de laxantes. 5. Antecedentes de tumor maligno gastrointestinal o poliposis de colon conocida. 6. Antecedentes de cualquier cirugia abdominal, por ejemplo, derivation gastrica, resection intestinal, apendectomia, colecistectomia, etc. 7. Uso de probioticos o cualquier otra ayuda de venta libre para fines especificos de regular la digestion.

Criterios de exclusion de donantes: Examen de antecedentes y fisico Evaluation de laboratorio

Afecciones medicas sistemicas: 1. Sindrome metabolico establecido o cualquier caracteristica temprana que sugiere su aparicion. tadice de masa corporal > 26 kg/m2, relation cintura : cadera > 0,85 (hombre) y > 0,80 (mujer); TA > 135 mmHg sistolica y > 85 mmHg diastolica. 2. Autoinmunidad sistemica conocida, por ejemplo, enfermedad de tejido conjuntivo, esclerosis multiple, etc. 3. Enfermedades atopicas conocidas incluyendo asma o eccema. 4. Sindromes de dolor cronico incluyendo fibromialgia, sindrome de fatiga cronica. 5. Uso continuo (aunque sea intermitente) de cualquier medicacion prescrita, incluyendo inhaladores o cremas y pomadas topicas. 6. Trastornos neurologicos, del neurodesarrollo y neurodegenerativos incluyendo autismo, enfermedad de Parkinson, etc. 7. Presencia de una irritacion de piel, sibilancia en la auscultacion, iinfadenopatia, hepatomegalia o cualquier estigma de enfermedad hepatica, articulaciones inflamadas o dolorosas con la palpacion, debilidad muscular, examen neurologico anormal. 1. Trigliceridos en suero (> 150 mg/dl). 2. Colesterol HDL < 40 mg/dl (hombres) y < 50 mg/dl (mujeres). 3. CRP de alta sensibilidad > 2,4 mg/l 4. Glucosa en plasma en ayunas > 100 mg/dl. 5. Pruebas de funcion hepatica incluyendo fosfatasa alcalina, AST, ALT. 6. FANA.

Factores adicionales que se sabe: 1. Antibioticos para cualquier

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que afectan la composicion de la microbiota intestinal

indicacion en los ultimos 6 meses.

Preparacion del material de donantes

Los donantes identificados como pacientes individuales usados en la fase temprana del programa ingresaron al centro de endoscopia ambulatoria 1-2 h antes del procedimiento programado. El material fecal se recogio en un recolector de muestras de tipo sombrero y se proceso en un bano con tales fines separado de la sala de procedimiento. Se dispusieron aproximadamente 50 gm de material fecal en una mezcladora comercial estandar (Oster, Subeam Corp, Rye, NY) y homogeneizo en 250 ml de solucion salina normal no bacteriostatica esteril. La suspension se paso entonces a traves de filtros de te de acero inoxidable para eliminar particulas grandes que pudieran interferir con la carga de las jeringas.

El material obtenido de los donantes "universales" voluntarios se transporto sobre hielo al laboratorio, donde se proceso en el plazo de dos horas desde la recogida. El material se peso y se homogeneizo en una mezcladora comercial en una vitrina biologica con tales fines. La suspension se paso entonces a traves de tamices de laboratorio de acero inoxidable de 2,0 mm, 1,0 mm, 0,5 mm y 0,25 mm (W. S. Tyler, Inc., Mentor, OH) para eliminar los alimentos sin digerir y el material en particulas mas pequeno. El material resultante que paso a traves del tamiz de 0,25 mm se centrifugo a 6.000 x g durante 15 min en un rotor Sorvall SS-34 y se resuspendio a la mitad del volumen original en solucion salina normal no bacteriostatica. La suspension de bacterias fecales concentradas resultante se administro al paciente inmediatamente o se corrigio con glicerol de calidad farmaceutica esteril (Sigma, St. Louis, MO) a una concentracion final del 10 % y se almaceno congelada a -80 °C durante una a ocho semanas hasta que se uso. La descongelacion se hizo durante 2-4 horas en un bano de hielo antes del procedimiento de FMT. La preparacion congelada se diluyo a 250 ml con solucion salina normal no bacteriostatica antes de la infusion en el donante. Este extracto de material fecal, ya fuera fresco o congelado, era casi inodoro y de viscosidad reducida, color y textura con respecto al material temprano preparado en el centro de endoscopia. La filtracion del material del donante permitio una carga sin esfuerzo de jeringas de punta larga de 60 ml sin el riesgo de obstruirse. Todos los recipientes, botellas y tamices usados en la preparacion del material fueron esterilizados antes de su uso. El material fecal de los donantes universales se trato del mismo modo que el obtenido de los donantes identificados como pacientes.

Procedimiento de trasplante

Los pacientes se mantuvieron en una dosis completa de vancomicina (125 mg, 4 veces diarias, por la boca) hasta dos dias antes del procedimiento de FMT. El dia antes del procedimiento, los pacientes se prepararon usando una purga de polietilenglicol de dosificacion fraccionada (GoLYTELY o MoviPrep), que es estandar en la unidad de endoscopia de los presentes inventores, antes de las colonoscopias para lavar el antibiotico residual y el material fecal. Los pacientes se sometieron a una colonoscopia completa con sedacion consciente. Se tomaron biopsias de mucosa para descartar colitis linfocitica en ausencia de enfermedad inflamatoria del intestino obvia. La mayoria del material del donante preparado (220-240 ml) se administro a traves del canal de biopsia del colonoscopio en el ileon y ciego terminal del paciente. Sin embargo, en algunos casos, tambien se infundio una pequena porcion (50 ml) en areas colonicas que contenian diverticulosis maxima. El procedimiento de recuperacion fue identico al rutinariamente usado para los pacientes de colonoscopia estandar. Se pidio que todos los pacientes se pusieran en contacto con el endoscopista en caso de reaparicion del sintoma, se siguieron formalmente en el consultorio 1-2 meses despues del procedimiento. La eliminacion de CDI se definio mediante la resolucion de diarrea y prueba de heces negativa para la deteccion de C. difficile 2 meses despues del FMT. Todos los pacientes en este protocolo tambien participaron en un estudio que examinaba la estructura de la comunidad bacteriana fecal, que implico la recogida de especimenes fecales en los dias 3, 7, 14 y 1, 3, 6 y 12 meses despues del procedimiento. El personal de investigacion recogio estos especimenes de los lugares de residencia del paciente, proporcionando oportunidades adicionales para el seguimiento de los sintomas.

Analisis estadisticos

Se compararon datos no categoricos usando la prueba de la t de Student para datos independientes. Los datos categoricos se compararon usando la prueba exacta de Fisher. Se uso el programa informatico GraphPad Prism para calcular los valores de p de dos colas y dos lados que se calcularon con cada prueba, respectivamente.

Resultados

Datos demograficos

El grupo de pacientes con CDI recurrente descrito en este informe claramente tenia una enfermedad refractaria como se demostro mediante el numero promedio de recaidas secuenciales y la duracion de la afeccion (Tabla 2). Ademas, muchos pacientes tuvieron multiples factores de riesgo para alta probabilidad de reaparicion, tal como los antecedentes de CDI grave como se demostro por la hospitalizacion, uso frecuente de antibioticos intercurrentes que no eran para C. difficile y edad avanzada (Hu et al. Gastroenterology 2009;136:1206-14). Todos los pacientes

fracasaron en un regimen cada vez mas bajo o pulsado de vancomicina y el 40 % de los pacientes tambien fracaso en un ciclo largo adicional de vancomicina seguido de un regimen "perseguidor" de rifaximina de dos semanas. Uno de estos pacientes tambien fracaso en un ciclo de 4 semanas de rifaximina. Varios pacientes (3/43) tomaron un ciclo de 2-4 semanas de nitazoxanida, que tambien fracaso en eliminar la infeccion. Los pacientes con enfermedad 5 inflamatoria del intestino no se excluyeron del protocolo. El treinta y cinco por ciento de los pacientes de los presentes inventores (14 de 40) tuvieron EII subyacente, incluyendo enfermedad de Crohn (6/14), colitis ulcerosa (4/14) y colitis linfocitica (4/14). Los pacientes con EII eran generalmente mas jovenes (Tabla 3), pero esto no difirio en la naturaleza refractaria de la CDI o la gravedad de la presentacion de los pacientes mayores. Sin embargo, la mayoria de los pacientes sin EII subyacente tenia diverticulosis moderada a severa.

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo de preparacion de una composicion que comprende un extracto o una preparacion de heces humanas que comprende material fecal humano, comprendiendo el metodo:

mezclar una muestra fecal de un donante fecal con un diluyente, y

filtrar la muestra fecal mezclada con un medio de filtro, en donde la muestra fecal mezclada se pasa a traves de tamices con tamanos de tamiz progresivamente mas pequenos hasta que un pase final a traves de un tamiz de 0,25 mm da como resultado una composicion que comprende la microbiota intestinal del donante fecal que es capaz de pasar a traves de un tamiz de 0,25 mm.
2. Un metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas centrifugar un filtrado de la etapa de fi ltracion.
3. Un metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, que comprende ademas congelar o liofilizar la composicion.
4. Una composicion que comprende un extracto o una preparacion de heces humanas, siendo dicha composicion obtenible por el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. La composicion de la reivindicacion 4 para su uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por microbiota de colon disfuncional.
6. La composicion para su uso segun la reivindicacion 5, en donde la enfermedad esta seleccionada del grupo que consiste en una colitis por Clostridium difficile, un sindrome metabolico, obesidad, asma, eccema, un trastorno eosinofilico del tubo Gl, enfermedad inflamatoria del intestino, sindrome del intestino irritable, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, colitis enterohemorragica, diarrea cronica, estrenimiento cronico, un trastorno de la alimentacion, desnutricion, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, fibromialgia, sindrome de fatiga cronica y un trastorno neurodegenerativo
7. La composicion para su uso segun la reivindicacion 5, la enfermedad es un infeccion por Clostridium difficile.
8. La composicion segun la reivindicacion 4 o la composicion para su uso segun las reivindicaciones 5 a 7, en donde la composicion comprende al menos 5 clases diferentes de bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Actinobacteria, Bacteroidia, Bacilli, Clostridia, Erysipelotrichi, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Mollicutes y Verrucomicrobiae.
9. La composicion segun la reivindicacion 4 o la composicion para su uso segun las reivindicaciones 5 a 8, en donde la composicion comprende no mas de aproximadamente el 5 % en peso de material no vivo/peso de material biologico.
10. La composicion segun la reivindicacion 4 o la composicion para su uso segun las reivindicaciones 5 a 8, en donde la composicion comprende no mas de aproximadamente el 1 % en peso de material no vivo/peso de material biologico.
11. La composicion segun la reivindicacion 4 o la composicion para su uso segun las reivindicaciones 5 a 10, en donde la composicion es una formulacion para administracion por via oral, administracion por tubo nasogastrico o administracion por colonoscopia.
12. La composicion segun la reivindicacion 4 o la composicion para su uso segun las reivindicaciones 5 a 11, en donde la composicion se congela.
13. La composicion segun la reivindicacion 4 o la composicion para su uso segun las reivindicaciones 5 a 11, en donde la composicion es un solido.
14. La composicion segun la reivindicacion 4 o la composicion para su uso segun las reivindicaciones 5 a 13, en donde la composicion se formula para administracion por via oral.
15. La composicion para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en donde la composicion se administra en una unica dosificacion de entre 1x1010 celulas y 5x1010 celulas.