DE69633389T2

DE69633389T2 - Type f botulinum toxin und seine verwendung

Info

Publication number: DE69633389T2
Application number: DE69633389T
Authority: DE
Inventors: James Michael Basingstoke ELMORE; Lamble Margaret Shaftesbury MAUCHLINE; Peter Nigel Salisbury MINTON; Artymovich Vladimir Shrewton PASECHNIK; Richard William Titball
Original assignee: Health Protection Agency
Current assignee: Health Protection Agency
Priority date: 1995-06-12
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2016-06-13
Also published as: PT833919E; GB9511909D0; US20020081304A1; EP0833919B1; DE69633389D1; ATE276366T1; JPH11507827A; US7041792B2; CA2224444A1; CA2224444C; ES2224171T3; AU6012196A; JP4005633B2; WO1996041881A1; EP0833919A1; DK0833919T3; AU705944B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Botulinustoxin vom Typ F, ein Fragment des Botulinus-Neurotoxins vom Typ F, die Herstellung des Fragments durch Rekombinationsmittel und ein synthetisches Gen, welches das Fragment codiert. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neuartiges Polypeptidfragment, das dazu in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen, die beim Menschen oder bei Tieren schützend gegen Botulinus-Neurotoxin (BoNT/F) vom Typ F wirkt, sowie einen Impfstoff, der das Fragment enthält.
Botulinus-Neurotoxine (BoNTs) sind Proteine mit hohem Molekulargewicht (etwa 150.000 Da), die starke nervenlähmende Wirkungen auf Vertebraten ausüben. Sie werden von anaeroben, Gram-positiven Bakterien der Gattung Clostridium produziert. Die Mehrzahl der Clostridien, die BoNT produzieren, werden als Clostridium botulinum klassifiziert. In den letzten Jahren wurde jedoch für Isolate, die Clostridium barati und Clostridium butyricum ähneln, gezeigt, dass diese BoNT produzieren. Auf Basis der Antigenität ist BoNT in sieben verschiedene Typen unterteilt worden, die als A bis G bezeichnet werden. Alle sieben Neurotoxine (BoNT/A bis BoNT/G) werden jeweils als einkettiges 150.000 Da Molekül synthetisiert, das im folgenden zu einer wirksameren zweikettigen Form gespalten wird, die sich aus einer schweren H-Kette (etwa 100.000 Da) und einer leichten L-Kette (etwa 50.000 Da), die durch mindestens eine Disulfidbrücke verbunden sind, zusammensetzt.
An der Wirkung von BoNT sind drei voneinander verschiedene Phasen beteiligt. In der ersten Phase binden die Toxine an Akzeptoren auf der äußeren Oberfläche der neuralen Zielzellen. Darauf folgt ein energieabhängiger Internalisierungsschritt (Aufnahmeschritt), bei dem das Toxin oder ein Teil davon in die Zelle gelangt. Darauf bewirkt der aktive Teil des Toxins eine Fehlfunktion der Nervenzelle, indem er die intrazelluläre Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin an der Peripherie der Nerven blockiert, wodurch eine schlaffe Lähmung bewirkt wird. Die L-Kette besitzt die katalytische Aktivität, die für die Zellvergiftung verantwortlich ist, und die H-Kette befördert diesen Teil ins Zytoplasma, indem sie die Bindung des Toxins an die Zelle und die nachfolgende Internalisierung vermittelt.
Die vollständigen Aminosäuresequenzen aller 7 BoNTs sind inzwischen bekannt (Minton, N. P. (1995) Current Topics in Microbiology and Immunology 195: 161–187), was zeigte, dass sie in ihren primären Aminosäuresequenzen überraschend divergent sind. Somit beträgt die Sequenzidentität zwischen den verschiedenen Serotypen im allgemeinen nicht mehr als 40%, wobei die Bereiche der Homologie in voneinander abgegrenzten Domänen lokalisiert sind, zwischen die Aminosäureabschnitte mit geringer allgemeiner Ähnlichkeit eingestreut sind. Zwischen den verschiedenen L-Ketten (Durchschnittsgröße 439) sind 63 Aminosäuren absolut konserviert. Unter den H-Ketten (Durchschnittsgröße 843) sind 97 Aminosäuren identisch. Die bemerkenswertesten Bereiche der Sequenzkonservierung beinhalten: die zwei Cysteinreste, die an der Ausbildung der Disulfidbindung zwischen der L-Kette und der H-Kette beteiligt sind, das histidinreiche Motiv innerhalb der L-Kette, das mit Metalloprotease-Aktivität assoziiert ist; und ein hochgradig konserviertes PYI/VXALN-Motiv, das angrenzend an Regionen gefunden wurde, für die eine potenzielle Befähigung zum Durchspannen von Membranen festgestellt wurde. Der bemerkenswerteste Bereich der Sequenzverschiedenheit zwischen den Toxinen ist am COOH-Terminus ihrer jeweiligen H-Ketten (Aminosäure 1124 und folgende von BoNT/A) lokalisiert. Dies scheint übereinstimmend mit der Vorstellung zu sein, dass diese Domäne an der Neurotoxinbindung beteiligt ist, und dass verschiedene Toxine verschiedene Akzeptoren auf neuralen Zelloberflächen als Ziele besitzen.
Die Wirksamkeit moderner Verfahren der Lebensmittelkonservierung in westlichen Ländern hat dazu geführt, dass Ausbrüche von Botulismus extrem selten sind. Die häufige Verwendung von C. botulinum als ein Testorganismus in der Lebensmittelindustrie und die wachsende Verwendung des Toxins durch Neurobiochemiker haben aber dennoch die Notwendigkeit von Humanimpfstoffen erhöht. Die Herstellung dieser Impfstoffe hat sich seit den frühen 1950ern wenig verändert: partiell gereinigte Präparationen der Neurotoxine werden durch Behandlung mit Formaldehyd in die Toxoid-Form umgewandelt und auf präzipitierten Aluminiumsalzen absorbiert. Unter Verwendung einer solchen Methodik sind derzeit polyvalente Seren (gegen ABCDE oder ABEF) für die Humanimmunisierung erhältlich. Derartige Impfstoffe haben den Nachteil einer geringen Immunantwort und erheblicher Unterschiede zwischen den Chargen infolge des hohen Anteils (60–90%) an kontaminierenden Proteinen in den Toxoid-Präparationen. Der jüngste Ansatz hat sich deshalb auf die Entwicklung von Verfahren zur Reinigung der Toxine nahezu auf Homogenität konzentriert. Die Verwendung gereinigter Toxine zur Herstellung von Impfstoffen ist jedoch mit den Nachteilen verbunden, diese erstens unter strikten Sicherheitsvorkehrungen herzustellen, und, zweitens, der Notwendigkeit der Gegenwart geringer Mengen an Formaldehyd, um eine mögliche Rückkehr des Toxoids in den aktiven Zustand zu verhindern.
Die Herstellung von auf Untereinheiten basierenden Impfstoffen gegen andere Organismen und Toxine ist von einer Reihe von Labors erforscht worden. Diese Arbeit hat sich auf die am besten erforschten Toxin-Subtypen, nämlich A und B konzentriert und führte zu neuen Impfstoffen, die spezifische Immunität gegen Toxine der Typen A oder B verleihen. Jeder neue Impfstoff wird jedoch möglicherweise keinen Schutz gegen andere Subtypen des Toxins verleihen.
Die rekombinante Herstellung von Impfstoffkomponenten hat große Fortschritte für die Impfstoffreinheit und das Produktionsvolumen mit sich gebracht. A. J. Makoff et al. in Bio/Technology, Vol. 7, Oktober 1989, S. 1043–1046, beschreiben die Expression eines Tetanustoxin-Fragments in E. coli, sowie dessen Reinigung und potentielle Verwendung als Impfstoff. Die beschriebene Technik erfordert nichtsdestoweniger eine große Anzahl an Schritten, um gereinigte Impfstoffkomponenten aus den Wirtszellen zu gewinnen. WO-A-94/03615 beschreibt Fusionsproteine und deren Anwendung als Impfstoffe.
Es ist ein Ziel dieser Erfindung, einen Impfstoff gegen ein Botulinustoxin des Typs F herzustellen. Es ist ein weiteres Ziel, die Herstellung von Impfstoffen zu vereinfachen. Ein weiteres Ziel liegt darin, die Herstellung von Botulinustoxin-Impfstoffen zu verbessern. Wiederum ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Probleme und/oder Einschränkungen bei bestehenden Impfstoffen und Herstellungsverfahren zu überwinden oder wenigstens zu mildern.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es (a) frei von Botulinustoxin-Aktivität ist, (b) frei von Toxoid ist, (c) dazu in der Lage ist, in einem Säuger eine Immunantwort auszulösen, die schützend gegen Botulinustoxin vom Typ F wirkt, und dass es (d) ein Fragment oder ein Derivat einer schweren Kette eines Botulinus-Neurotoxins vom Typ F umfasst.
Das Polypeptid ist nützlich für die Herstellung eines Impfstoffs gegen Toxin vom Typ F und ist – im Gegensatz zu Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik wie etwa polyvalenten Impfstoffen – kein Toxoid und erfordert keine Vorbehandlung mit Formaldehyd. Ebenfalls im Gegensatz zu Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik ist das Polypeptid im allgemeinen von geringerer Größe als das Toxin selbst.
Der Begriff „schützend", der im Zusammenhang mit „Immunität" und „Immunantwort" verwendet wird, wird benutzt, um eine gesteigerte Befähigung dazu anzuzeigen, einen Angriff durch aktives Botulinustoxin F zu überleben. Diese Steigerung wird typischer Weise durch einen erhöhten Antikörpertiter gegenüber dem Toxin oder einer erhöhten Fähigkeit, bei Exposition gegenüber dem Toxin Antikörper gegen dieses zu produzieren, vermittelt. Der Begriff ist nicht dazu gedacht, einen absoluten Schutz gegenüber beliebigen Mengen des Toxins zu bezeichnen.
Die Erfindung bietet somit spezifischen Schutz gegen Botulinustoxin vom Typ F, und zwar einen Schutz, der bislang nicht erzielbar war.
In einer bestimmten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid oder ein Peptidkonjugat bereit, das die Aminosäuresequenz von BoNT/F des C. botulinum Stammes Langeland von Aminosäure 848 bis 1278 (SEQ ID NO: 1) beinhaltet, dem jedoch die Aminosäuresequenzen der L-Kette und die H_N-Epitope, die für die Metalloproteaseaktivität und die zelluläre Toxinaufnahme notwendig sind (befindlich zwischen den Aminosäuren 1 bis 439, bzw. 440 bis 847) fehlen. Das Peptid kann eine Immunantwort auslösen, die schützend gegen BoNT/F wirkt, wenn es Menschen und anderen tierischen Organismen verabreicht wird.
Bei einer spezielleren Ausführungsform bestehen die Peptide der Erfindung im wesentlichen nur aus der Aminosäuresequenz von 848 bis 1278 (SEQ ID NO: 1) aus der Aminosäuresequenz von BoNT/F des Clostridium botulinum Stammes Langeland, oder aus dieser Sequenz in Form eines Fusionspeptids mit einer anderen Aminosäuresequenz, die nicht den Aminosäuren 1 bis 847 von BoNT/F entspricht. Der Begriff „andere Aminosäuresequenz" wird von einem Fachmann so verstanden, dass dieser Begriff vollständige Proteine ebenso wie relativ kurze Aminosäuresequenzen, je nach Eignung für die Bedürfnisse des Benutzers, einschließt. Optional ist die andere Aminosäuresequenz ein nicht aus C. botulinum stammendes, antigenes Protein, das in Fusion mit der vorgenannten Sequenz einbezogen wird, um eine andere Immunität oder eine Markierung zu bewirken, bzw. bereitzustellen, oder um die Expression des Polypeptids in einer Wirtszelle zu modifizieren.
Bei einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung beinhaltet das Polypeptid ein Fragment, das eine Länge von weniger als 700 Aminosäuren, bevorzugt von weniger als 600 Aminosäuren und noch bevorzugter von weniger als 500 Aminosäuren aufweist.
In weiteren, spezifischen Ausführungsformen der Erfindung ist das Fragment ausgewählt aus:

(a) den Aminosäuren 848–1278 eines Botulinustoxins vom Typ F (SEQ ID NO: 1)
(b) den Aminosäuren 848–991 eines Botulinustoxins vom Typ F (SEQ ID NO: 2)
(c) den Aminosäuren 992–1135 eines Botulinustoxins vom Typ F (SEQ ID NO: 3) und
(d) den Aminosäuren 1136–1278 eines Botulinustoxins vom Typ F (SEQ ID NO: 4).

Das Polypeptid kann ein Toxinderivat enthalten, bzw. ein synthetisches Polypeptid sein, das eine Mehrzahl an Fragmenten eines Botulinustoxins vom Typ F enthält, die in Form von wiederholten Abschnitten aneinander gefügt sind. Das Derivat kann ein Dimer der oben spezifizierten Fragmente beinhalten.
Die oben beschriebenen Polypeptide können in einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, wobei die Zusammensetzung so angepasst ist, dass sie deren Verarbeitung erleichtert. Dies ist von Vorteil bei der Herstellung von Impfstoffen, da die Polypeptide aus einer Mischung sämtlicher Komponenten, die in einem endgültigen Impfstoff unerwünscht sind, abgetrennt werden müssen.
Eine solche angepasste Zusammensetzung enthält:

(1) ein Polypeptid gemäß obiger Beschreibung; und
(2) ein Polypeptid, das zur Reinigung der Zusammensetzung ausgerichtet ist.

Die Komponente (2) ist darauf ausgerichtet, um z. B. die Reinigung der Zusammensetzung aus wässriger Lösung zu erleichtern; sie enthält optional einen Antikörper, eine Binderegion eines Antikörpers, ein Polypeptid, das an eine Ionenaustauschersäule binden kann, ein Polypeptid, das an eine Affinitätschromatographiesäule oder einen Liganden zur Reinigung binden kann.
Geeigneter Weise wird das Polypeptid mit einem „Reinigungs-Anteil" fusioniert, welcher der Komponente (2) entspricht.
Bei der Verwendung solcher Zusammensetzungen wird deren Extraktion aus einem Gemisch, wie etwa dem Überstand aus lysierten Zellen, die die Zusammensetzung exprimieren, zu einem einfachen und schnellen Verfahren gemacht. Es ist besonders vorteilhaft, wenn in der Zusammensetzung die Impfstoffeigenschaften von Komponente (1) im wesentlichen erhalten bleiben, was bedeutet, dass die Zusammensetzung nach deren Reinigung in einem Impfstoff verwendet werden kann, ohne dass die Notwendigkeit weiterer Modifikation besteht, insbesondere keine Notwendigkeit, die Komponente (2) zu entfernen. Als Kandidaten für Komponente (1) der Zusammensetzung sind alle zuvor beschriebenen Polypeptide gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung geeignet. Weiterhin sind Fragmente von Tetanustoxin ohne Toxinaktivität geeignet.
Ein Polypeptid gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung beinhaltet somit ein Fusionsprotein bestehend aus:

(a) den Aminosäuren 848 bis 1278 (SEQ ID NO: 1) eines Botulinus-Neurotoxins des Typs F, zusammen mit
(b) einem Reinigungsrest.

Es ist bevorzugt, wenn der Reinigungsrest darauf ausgerichtet ist, an eine Affinitätschromatographiesäule zu binden. Ein typischer Reinigungsrest beinhaltet etwa 50 bis 500 Aminosäuren. Bei einer bestimmten Ausführungsform beinhaltet das Fusionsprotein Maltosebindendes Protein als den Reinigungsrest. Dieses Fusionsprotein ist besonders geeignet zur Reinigung unter Verwendung einer Affinitätschromatographiesäule, wobei für dieses Fusionsprotein, wie unten beschrieben, gute Impfstoffeigenschaften festgestellt wurden.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung und einen pharmazeutischen geeigneten Träger beinhaltet.
Geeignete Träger sind dem Fachmann für die Impfstoffherstellung bekannt. In einer hier im folgenden beschriebenen Ausführungsform beinhaltet der Träger Freund's Adjuvans. Eine andere geeignete Trägerkomponente stellen präzipitierte Alaunsalze dar.
In einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine rekombinante DNA bereitgestellt, die Polypeptide der Erfindung codiert. Eine solche rekombinante DNA wird praktischer Weise durch PCR-Amplifikation der für die gewünschte Sequenz (z. B. BoNT/F_848–1278) codierenden DNA erhalten, wobei Primer verwendet werden, die auf die jeweiligen Enden der doppelsträngigen Sequenz ausgerichtet sind. Optional kann die bei der PCR verwendete Matrizen-Sequenz dem natürlichen Gen aus Clostridium entsprechen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die verwendete Sequenz jedoch eine synthetische Sequenz, welche die selben Aminosäuren wie in dem natürlichen Clostridien-Protein codiert, in der jedoch die Verwendung der Codons (codon usage) verändert wurde. Es ist bevorzugt, dass das synthetische Gen einen GC-Gehalt von mindestens 40%, bevorzugt von mindestens 45% und am bevorzugtesten von mindestens 50% aufweist.
Im Fall einer solchen synthetischen Sequenz wird bei einer Ausführungsform der Erfindung durch die Verwendung geeigneter, bei der Konstruktion eingebauter Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, die sich in den äußeren Bereichen des DNA-Fragments befinden, die Insertion in das gewählte Expressionsplasmid erreicht.
Unabhängig davon, auf welche Weise die rekombinante DNA, die das BoNT/F-Peptid codiert, erzeugt wurde, wird diese in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert, wobei in dieser Stufe, wenn gewünscht, die genetische Fusion zu einer ein gewünschtes Fusionspeptid codieren den Sequenz erfolgt, und wobei der resultierende Vektor dann in eine geeignete Zelllinie, z. B. E. coli oder eine Hefe wie etwa Pichia pastoris eingebracht wird. Eine Zelllinie, die das gewünschte Produkt produziert, wird mittels etablierter Verfahren, z. B. Western Blot oder ELISA, selektiert.
Ein vierter und ein fünfter Aspekt der Erfindung stellen jeweils einen Plasmidvektor, der die DNA gemäß dem dritten Aspekt aufnimmt, bzw. eine Zelllinie, die das Plasmid enthält und die DNA exprimiert, bereit.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, um einen Toxinimpfstoff herzustellen, bei dem die Reinigung der aktiven Impfsubstanz durch deren Expression im Verbund mit einer für die Reinigung ausgerichteten Polypeptidsequenz erleichtert wird. Entsprechend stellt ein sechster Aspekt der Erfindung ein Verfahren bereit, um ein Polypeptid gemäß obiger Beschreibung herzustellen, wobei das Verfahren beinhaltet: (a) Expression einer DNA-Sequenz, die ein Fusionsprotein codiert, in einer Wirtszelle, wobei das Fusionsprotein ein immunisierendes Polypeptid gemäß obiger Beschreibung und einen Reinigungsrest beinhaltet, (b) Erhalten eines Extrakts aus der Wirtszelle, der das Fusionsprotein beinhaltet, und (c) Reinigung des Fusionsproteins aus diesem Extrakt.
Insbesondere ist der Reinigungsrest darauf ausgerichtet, an eine Affinitätschromatographie-Säule zu binden, wobei das Fusionsprotein dann in Schritt (c) unter Verwendung einer Affinitätschromatographiesäule gereinigt wird.
Das Fusionsprotein wird in geeigneter Weise durch Elution mit einem Substrat von der Säule gelöst. Das Verfahren beinhaltet die optionale Möglichkeit, das Fusionsprotein zu spalten und das Toxinfragment zurück zu behalten. Das Verfahren ist speziell mit Toxin vom Typ F angewendet worden, bezieht sich jedoch auch auf alle anderen Botulinustoxine und auf Tetanustoxin.
Durch dieses Verfahren ermöglicht die Erfindung eine Präparation des Botulinustoxin-Typ F-Fragments, die frei von Verunreinigungen durch andere Clostridien-Proteine ist, die oft aus Kulturen von Clostridium-Bakterien gewonnene Präparationen aus dem Stand der Technik verunreinigen.
Das erhaltene Fusionsprotein oder Toxinfragment liegt typischer Weise in weitgehend reiner Form vor und ist somit geeignet, in wenigen einfachen Schritten in einen Impfstoff oder eine andere pharmazeutische Zusammensetzung eingebracht zu werden.
Es ist anzumerken, dass die Erzeugung bestimmter Fusionsproteine, die das von BoNT/F stammende Peptid enthalten, nutzbringend im Bezug auf die zunächst stattfindende Isolierung von BoNT/F sein kann, dessen nachfolgende Spaltung optional verwendet werden kann, um das von BoNT/F abgeleitete Peptid zu reinigen. Dort, wo Codons am 5'-Ende der BoNT/F-codierenden DNA angefügt werden, um die Translation zu unterstützen, können diese Aminosäuren optional am NH₂-Terminus des endgültigen Peptids belassen werden, z. B. solche Aminosäurebereiche, die verwendet werden, um eine Sekretion des Peptids zu bewirken, oder, im einfacheren Fall, die Anfügung eines NH₂-terminalen Methionins, um die Translation zu initiieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können beispielsweise hergestellt werden, indem:

(a) eine DNA, die ein Fusionsprotein codiert, in einer Wirtszelle exprimiert wird, wobei dieses Protein eine Fusion darstellt aus (i) einem Botulinustoxin oder einem Fragment hiervon, das frei von Toxinaktivität ist und eine schützende Immunität gegen Botulinustoxin induzieren kann, und (ii) einem Reinigungsrest, der an eine Affinitätschromatographiesäule binden kann,
(b) ein Extrakt, der das Fusionsprotein enthält, aus dieser Wirtszelle erhalten wird,
(c) das Fusionsprotein unter Verwendung einer Affinitätschromatographiesäule gereinigt wird,
(d) das gereinigte Fusionsprotein in eine pharmazeutische Zusammensetzung eingebracht wird.

Der Reinigungsrest umfasst typischer Weise 50 bis 500 Aminosäuren, ist wasserlöslich und bindet an eine Affinitätschromatographiesäule.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass ein Fusionsprotein, das den Reinigungsrest behält, von Vorteil für die Herstellung eines Impfstoffs gegen ein Botulinustoxin vom Typ F ist. Die immunisierende Aktivität findet sich im Fusionsprotein, so dass das Reinigungs-Protein nicht vor der Impfstoffherstellung entfernt werden muss, was folglich den Herstellungsprozess vereinfacht. Es ist bevorzugt, dass das Reinigungs-Protein ein globuläres, wasserlösliches Protein ist, das an eine Affinitätschromatographiesäule bindet und unter Verwendung einer solchen Säule gereinigt werden kann. Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Reinigungsprotein hochgradig immunogen ist. Somit beinhaltet ein besonders bevorzugtes Fusionsprotein ein Fragment eines Botulinustoxins, das frei von Toxinaktivität ist, eine immunogene Region und eine Reinigungsregion, die darauf ausgerichtet ist, an eine Affinitätschromatographiesäule zu binden.
Der Begriff „immunogene Region" wird oben verwendet, um eine Aminosäuresequenz in einem Protein zu beschreiben, von der bekannt ist, dass sie eine Stimulation des Immunsystems bei Menschen oder Tieren auslöst. Beispiele für eine derartige immunogene Region beinhalten Lochschnecken-Hämocyanin (keyhole limpet haemocyanin).
Weitere Aspekte der Erfindung stellen Polypeptide oder Polypeptid-Zusammensetzungen gemäß obiger Beschreibung zur Verwendung als Impfstoffe bereit, sowie die Verwendung dieser Substanzen bei der Herstellung von Impfstoffen zur Erzeugung protektiver Immunität gegen ein Botulinustoxin vom Typ F.
Es folgt nun eine Beschreibung spezifischer Ausführungsformen der Erfindung, illustriert durch Zeichnungen, bei denen:
1: die drei Hauptdomänen eines BoNT-Toxins zeigt. Die Zahlen beziehen sich auf die Positionen der Aminosäuren, die diese drei Domänen im BoNT/F des C. botulinum-Stammes Langeland flankieren;
2: zeigt eine schematische Darstellung davon, wie synthetische Genblöcke durch PCR zusammengefügt werden;
3: zeigt ein Beispiel eines konstruierten rekombinanten Plasmids (pFHC206), bei dem das synthetische DNA-Fragment aus 5 in das Expressionsplasmid pMal-C2 inseriert wurde; und
4: zeigt Antikörpertiter gegen BoNT/F, die in Mäusen erhalten wurden, welche mit rekombinantem MBP-BoNT/F_848–1278 Protein immunisiert wurden.
SEQ ID NO: 5 zeigt die Nukleotidsequenz derjenigen Region des BoNT/F-Gens aus Clostridium botulinum Typ F, Stamm Langeland, die das H_C-Fragment codiert;
SEQ ID NO: 6 zeigt eine synthetische DNA-Sequenz, codierend für das BoNT/F H_C-Fragment, die solche Codons benutzt, die am häufigsten in hochgradig exprimierten Genen von E. coli verwendet werden. Das Codon, das BoNT/F Sers₈₄₈ entspricht, beginnt an Nukleotidposition 12. Ihm vorgeschaltet sind ein Codon, welches ein NH₂-terminales Methionin-Codon spezifiziert, sowie Restriktionsstellen für NdeI und BamHI. Das Codon für Asn₁₂₇₈ beginnt an der Nukleotidposition 1302; ihm folgen ein translationales Stopcodon (Nt 1305–1308) und eine Restriktionsstelle für XbaI.
BEISPIELE
Erzeugung eines synthetischen DNA-Fragments, das H_C von BoNT/F codiert, wobei dieses Codons benutzt, die in hochgradig exprimierten E. coli-Genen verwendet werden
Es wurde eine synthetische Sequenz, die BoNT/F_848–1278 codiert, durch reverse Translation der Aminosäuresequenz von BoNT/F unter Verwendung des Programms REVTRANS der DNASTAR Inc. (Madison, USA) erstellt. Der verwendete Code der Codons war der „stark exprimierte E. coli Rücktranslations-Code" („strongly expressed E. coli backtranslation code" (SECOLI.RTC)). Um die Konstruktion zu erleichtern, wurde dann eine Anzahl von Veränderungen vorgenommen, um Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme an strategischen Punkten entlang der Länge des Fragments einzuführen, einschließlich singulärer, proximal flankierender Stellen für BamHI und NdeI und einer distal flankierenden Stelle für XbaI, sowie interner Stellen für HpaI, MluI und SplI. Das Gen wurde dann aus überlap penden 100mer-Oligonukleotiden mittels eines Verfahrens konstruiert, das im wesentlichen einem anderweitig beschriebenen Verfahren entspricht [Sandhu et al. (1992) Biotechniques 12: 14–16].
Kurz gesagt, wurde das Gen in Form von 4 individuellen Blöcken (A, B, C und D) konstruiert, jeder mit einer Größe von etwa 350 bp. Jeder Block wurde aus 4 × 100-mer alternierenden Oligonukleotiden zusammengebaut, die einander an jeweils 20 Nukleotiden überlappen. Diese 4 Oligonukleotide wurden in einer PCR verwendet, um ein zusammengesetztes, etwa 350 bp großes, doppelsträngiges DNA-Fragment zu erzeugen, das anschließend unter Verwendung flankierender 20mer-Primer amplifiziert wurde. Die amplifizierten Fragmente jedes Blocks wurden dann direkt in das Plasmid pCRII (Invitrogen Corp.) kloniert. Die flankierenden Primer aller 4 Blöcke wurden derart gestaltet, dass sie Stellen für Restriktionsenzyme beinhalten, welche eine nachfolgende Zusammensetzung zu einem zusammenhängenden Fragment erlauben. Somit wurde Block A von BamHI (5') und HpaI (3') flankiert, Block B von HpaI (5') und MluI (3'), Block C von MluI (5') und Sp1L (3') und Block D von Sp1I (5') und XbaI (3'). Folglich wurde jeder Block aus seinem jeweiligen rekombinanten, von pCRII abgeleiteten Plasmid durch Spaltung mit den entsprechenden Enzymen herausgelöst und die isolierten Fragmente mit der Plasmid-DNA von pMTL23 [Chambers et al. (1988), Gene 68: 139–149] ligiert, die mit BamHI und XbaI geschnitten worden war. Es wurde dann ein Klon selektiert, bei dem alle 4 Blöcke in der erwarteten Reihenfolge inseriert worden waren. Dies wurde durch Nukleotidsequenzierung unter Verwendung von Routineverfahren [Maniatis et al. (1989). Molecular Cloning – A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press] bestätigt und das erhaltene Plasmid als pFHC23 bezeichnet.
Erzeugung eines H_C-Peptids (848 bis 1278) von BoNT/F des C. botulinum-Stammes Langeland
Ein Impfstoff-Kandidat gegen BoNT/F von C. botulinum wurde hergestellt, indem das Fragment des synthetischen Gens, welches das H_C-Fragment (Aminosäuren 848 bis 1278) codiert, exprimiert wurde. Dieses DNA-Fragment wurde aus dem Plasmid pFHC23 als ein etwa 1,3 kb BamHI-XhoI Restriktionsfragment isoliert und zwischen die singulären BamHI- und SalI-Stellen von pUC9 [Vieira und Messing (1982), Gene 19: 259–268] inseriert, was Plasmid pFHC29 ergab. Das Insert wurde dann erneut als ein EcoRI-XbaI Fragment aus pFHC29 isoliert und zwischen die entsprechenden Stellen des kommerziell erhältlichen Expressionsvektors pMal-c2 (New England Biolabs) inseriert, um das endgültige Plasmid pFHC206 zu erhalten. Das resultierende Plasmid exprimierte BoNT/F_848–1278 als ein Fusionsprotein mit dem vom Vektor codierten Maltosebindenden Protein (MBP).
Das Fusionsproteinprodukt (MBP-BoNT/F_848–1278) wurde aus der Zelllinie, die pFHC206 enthielt, auf folgende Weise isoliert. E. coli, enthaltend pFHC206, wurde in 1 Liter Medium (M9, supplementiert mit 0,8 M Sorbit, 0,5% Casaminosäuren, 50 μg/ml Ampicillin) unter Schütteln (200 rpm) bei 37°C kultiviert, bis eine OD₆₀₀ von 1,0 erreicht war. An diesem Punkt wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und das Schütteln bei 27°C für weitere 4 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (5000 × g) und in 20 ml Lysepuffer (Protein Fusion and Purification System, New England Biolabs) resuspendiert und die Zellen dann durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Das Lysat wurde auf eine GPC-Säule, enthaltend 180 ml an Sephacel S100, geladen, und das Protein in der aufgehobenen Fraktion gesammelt. Man ließ das MBP-BoNT/F H_848–1278-Fusionsprotein in dieser Fraktion dann über eine Zeitspanne von 3 Stunden unter sanftem Schütteln (10 rpm) bei Raumtemperatur an ein 4–6 ml Volumen an Amyloseharz (New England Laboratories) adsorbieren. Das rekombinante Fusionsprotein wurde dann in Puffer (0,01 M Tris HCl, pH 7,0) eluiert, der 5 mM Maltose enthielt. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung eines Amicon PM30 Membranfilters konzentriert.
Toxizität des Impfstoff-Kandidaten
Die Toxizität des Impfstoff-Kandidaten-Fusionspeptids wurde durch intraperitoneale Impfübertragung von 25 μg-Mengen des vollständigen rekombinanten MBP-BoNT/F_848–1278 Proteins bei Gruppen von 4 Mäusen getestet. Der Impfstoff-Kandidat wurde gut vertragen und die Mäuse zeigten bis zu 2 Wochen nach der Impfung keine Anzeichen akuter oder chronischer Toxizität.
Antikörperantworten auf Impfstoff-Kandidaten
Der Impfstoff-Kandidat wurde durch intraperitoneale Impfung in komplettem Freund's Adjuvans an Gruppen von 4 Mäusen verabreicht und bei 3 weiteren Gelegenheiten jeweils eine Auffrischungsimpfung in zweiwöchigen Intervallen verabreicht. Die Antikörperantwort gegenüber gereinigtem BoNT/F aus dem C. botulinum-Stamm Langeland wurde mittels ELISA überwacht (4).
Schutz gegen die Bedrohung durch das Toxin
Tiere, die mit MBP-BoNT/F_848–1278-Fusionsprotein immunisiert worden waren, wurden auf intraperitonealem Weg einem Belastungstest mit verschiedenen Dosen des gereinigten BoNT/F aus dem C. botulinum-Stamm Langeland unterzogen. Bei Dosen von 12 LD₅₀ und mehr starben alle nicht-immunisierten Kontrollmäuse innerhalb von 24 Stunden. Alle immunisierten Gruppen von Mäusen überlebten Belastungen von bis zu 2,4 × 10⁴ LD₅₀. Für eine der immunisierten Mäuse, die eine anfängliche Belastung von 1,8 LD₅₀ überlebt hatte, wurde nachfolgend gezeigt, dass diese gegenüber einer weiteren Belastung mit 10⁶ LD₅₀ immun war.
TABELLE 1: Schutz gegen die Bedrohung durch BoNT/F aus dem C. botulinum-Stamm Langeland, verliehen durch den MBP-BoNT/F_848–1278-Fusionsprotein-Impfstoff. Es wurde eine Gesamtheit von 4 × 25 μg großen intraperitonealer Dosen an Antigen, gemischt mit Adjuvans, bei Gruppen von 4 Mäusen in Intervallen von 14 Tagen verabreicht. Nach 50 Tagen wurden die Mäuse auf intraperitonealem Weg Belastungstests mit verschiedenen Mengen an gereinigtem BoNT/F (isoliert aus dem C. botulinum-Stamm Langeland) unterzogen und tödliche Ausgänge bis zu 4 Tage lang aufgezeichnet.
Diese Erfindung stellt ein Fragment (wie etwa die Aminosäuren 848–1278) von BoNT/F, isoliert aus dem C. botulinum-Stamm Langeland, zur Anwendung als Impfstoff bereit. Das Fragment behält seine immunogenen Eigenschaften bei, auch wenn es weiterhin mit MBP fusioniert ist, was die Notwendigkeit eines weiteren Reinigungsschrittes aufhebt. Das rekombinante Fusionsprotein scheint in Mäusen bei Dosen von bis zu 25 μg nicht toxisch zu sein. Wiederholte Dosen erzeugten eine signifikante Antikörperantwort, welche die Tiere vor der Bedrohung durch BoNT/F schützt. Als Impfstoff bietet es verschiedene Vorteile gegenüber durch Formaldehyd-Behandlung erzeugten Neurotoxin-Toxoiden. Am bemerkenswertesten ist, dass es leichter hergestellt werden kann und, aufgrund der Abwesenheit von aktivem Toxin, mit einem geringeren Grad an Kontamination. Die Abwesenheit anderer, kontaminierender C. botulinum-Proteine und die Abwesenheit von nur teilweise in die Toxoidform umgewandelten Materialien macht es ferner in naturgegebener Weise sicherer für die Impfstoffanwendung und außerdem weniger reaktionsauslösend.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es (a) frei von Botulinustoxin-Aktivität ist, (b) frei von Toxoid ist, (c) dazu in der Lage ist, in einem Säuger eine Immunantwort auszulösen, die gegen Botulinustoxin vom Typ F schützt, und (d) ein Fragment oder ein Derivat einer schweren Kette eines Botulinus-Neurotoxins vom Typ F umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von BoNT/F des C.-botulinum-Stammes Langeland von den Aminosäuren 848 bis 1278 umfasst, und dem die Aminosäuresequenzen der L-Kette und der H_n-Epitope fehlen, die notwendig für die Metalloproteaseaktivität und die Toxinaufnahme sind und sich zwischen den Aminosäuren 1 bis 439 bzw. 440–847 befinden.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das betreffende Fragment oder Derivat bis zu 700 Aminosäuren lang ist.
Polypeptid nach Anspruch 3, welches bis zu 600 Aminosäuren lang ist.
Polypeptid nach einem der vorigen Ansprüche, wobei das betreffende Fragment ausgewählt ist unter: (a) den Aminosäuren 848–1278 eines Botulinustoxins vom Typ F (SEQ ID NO: 1) (b) den Aminosäuren 848–991 eines Botulinustoxins vom Typ F (SEQ ID NO: 2) (c) den Aminosäuren 992–1135 eines Botulinustoxins vom Typ F (SEQ ID NO: 3) und (d) den Aminosäuren 1136–1278 eines Botulinustoxins vom Typ F (SEQ ID NO: 4).
Polypeptid nach Anspruch 5, welches die Aminosäuren 848–1278 eines Botulinus-Neurotoxins vom Typ F umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das ein Derivat einer schweren Kette eines Botulinus-Neurotoxins vom Typ F umfasst und bei dem das Derivat ein Dimer eines Fragments nach einem der Punkte (a)–(d) des Anspruchs 3 umfasst.
Polypeptid nach einem der vorigen Ansprüche, welches mit einem Reinigungsrest fusioniert ist.
Polypeptid nach Anspruch 8, bei dem der Reinigungsrest ein Polypeptid ist, das an eine Chromatographiesäule binden kann.
Polypeptid nach Anspruch 9, bei dem die Chromatographiesäule eine Affinitätschromatographiesäule ist.
Polypeptidzusammensetzung, die (1) ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und (2) ein Polypeptid, das die Reinigung der Zusammensetzung erleichtern oder beschleunigen kann, umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch geeigneten Träger und ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eine Polypeptidzusammensetzung nach Anspruch 11 umfasst.
Rekombinante DNA, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 codiert.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 8, wobei dieses Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Exprimieren einer DNA-Sequenz, die ein Fusionsprotein nach Anspruch 8 codiert, in einer Wirtszelle, (b) Erhalten eines Extrakts aus der Wirtszelle, der das Fusionsprotein enthält, und (c) Reinigen des Fusionsproteins aus diesem Extrakt.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Polypeptid nach Anspruch 8 ein Polypeptid nach Anspruch 9 ist und bei dem das Fusionsprotein in Schritt (c) unter Verwendung einer Affinitätschromatographiesäule gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Fusionsprotein durch Elution mit einem Substrat von der Säule gelöst wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, das weiterhin das Spalten des Fusionsproteins und das Zurückbehalten des Fragments eines Derivats einer schweren Kette eines Botulinus-Neurotoxins vom Typ F umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung als Impfstoff.
Polypeptid-Zusammensetzung nach Anspruch 11 zur Verwendung als Impfstoff.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einer Polypeptid-Zusammensetzung nach Anspruch 11 für die Herstellung eines Impfstoffs zur Erzeugung schützender Immunität gegen ein Botulinustoxin vom Typ F.
Plasmid-Vektor, der eine rekombinante DNA nach Anspruch 13 aufweist.
Zelllinie, die einen Plasmid-Vektor nach Anspruch 21 aufweist und DNA nach Anspruch 13 exprimiert.