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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft neu identifizierte chimäre Proteine aus Haemophilus
influenzae und Polynukleotide, die diese Proteine codieren. Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung der chimären Proteine
und eine Impfstoffzusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung
von Infektion mit Haemophilus influenzae.
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Hintergrund der Erfindung
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Haemophilus
influenzae (Hi) ist ein Gram-negativer Coccobacillus und ein strikt
menschlicher Kommensal. Stämme
von Hi sind entweder verkapselt in einer Polysaccharidkapsel oder
sind unverkapselt und werden entsprechend in typisierbare (verkapselte)
und nicht-typisierbare (unverkapselte) Stämme klassifiziert.
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Verkapselte
pathogene Stämme
von Hi verursachen hauptsächlich,
aber nicht ausschließlich,
invasive Erkrankung bei Kindern im Alter unter sechs Jahren. Haemophilus
influenzae Typ b (Hib) ist zum Beispiel eine Hauptursache für Meningitis
und andere invasive Infektionen bei Kindern. Wirksame Impfstoffe
existieren gegen Hib-Infektionen und beruhen auf der Erzeugung von
Antikörpern
gegen die Polysaccharidkapsel und sind deshalb unwirksam gegen nicht-typisierbares
Haemophilus influenzae (ntHi).
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Nicht-typisierbares
Haemophilus influenzae (ntHi) stellt die Mehrheit der besiedelnden
Stämme
dar, und sie sind, obwohl selten invasiv, verantwortlich für einen
signifikanten Anteil von mukosaler Erkrankung, einschließlich Mittelohrentzündung, Sinusitis,
chronischer Konjunktivitis und chronischen oder Verschlimmerung von
Infektionen der unteren Atemwege. Derzeit sind ca. 30% und so viel
wie 62% von ntHI resistent gegen Penicilline. Die Trägerschaft
wird auf 44% bei Kindern und ca. 5% bei Erwachsenen eingeschätzt und
kann für Monate
andauern. Weder die pathogenen Mechanismen noch die immunologische
Wirtsreaktion wurden vollständig
für durch
ntHi verursachte Mittelohrentzündung
definiert.
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Mittelohrentzündung ist
eine übliche
Erkrankung bei Kindern im Alter von weniger als 2 Jahren. Sie wird
durch die Gegenwart von Flüssigkeit
im Mittelohr definiert, begleitet von einem Anzeichen akuter lokaler oder systemischer
Krankheit. Akuten Zeichen schließen Ohrenschmerzen, Ohrendrainage
und Gehörverlust ein,
wohingegen systemische Anzeichen Fieber, Lethargie, Reizbarkeit,
Anorexie, Erbrechen oder Diarrhö einschließen. Streptococcus
pneumoniae und nicht-typisierbares Haemophilus influenzae (ntHi)
sind die am stärksten
vorherrschenden Bakterien, die den Zustand verursachen, wobei sie
für 25–50% bzw.
15–30%
der kultivierten Arten verantwortlich sind. Moraxella catarrhalis
ist eine andere übliche
Ursache für
die Erkrankung. Zusätzlich
ist ntHi für
53% von wiederauftretender Mittelohrentzündung verantwortlich. Ca. 60%
und 80% der Kinder haben wenigstens eine Episode der Erkrankung
im Alter von 1 bzw. 3 Jahren (wobei die Spitze bei ca. 10 Monaten
ist).
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Es
gibt Hinweise, daß Schutzimmunität für ntHi existiert,
jedoch spielt die Antigendrift der natürlich beteiligten Epitope (äußere Membranproteine
P2, P4, P6) eine Hauptrolle in der Fähigkeit von ntHi, der Immunverteidigung
des Wirtes auszuweichen.
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Es
besteht deshalb ein Bedarf an zusätzlichen wirksamen Impfstoffen
gegen Haemophilus influenzae und insbesondere an Impfstoffen gegen
nicht-typisierbares
Haemophilus influenzae, das nicht durch die derzeit verfügbaren Hi-Polysaccharid-Impfstoffe
beeinflußt
wird.
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Das
Hauptaußenmembranprotein
(MOMP) P5 ist ein wärmemodifizierbares äußeres Membranprotein von
H. influenzae. P5 kann eine Rolle in der ntHi-Pathogenese als Adhäsin durch Bindung an respiratorisches Mucin
oder an RSV-infizierte respiratorische Epithelzellen spielen (Reddy
et al. (1996) Infect. Immun. 64: 1477–1479; Jiang et al. (1999)
Infect. Immun. 65: 1351–1356).
Diese Bindungsaktivität
könnte
durch oberflächenexponierte
Regionen des Proteins vermittelt werden. Das Protein hat sich als
Schutzantigen in verschiedenen Modellen erwiesen.
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Es
gibt widersprechende Berichte in bezug auf die Struktur dieses Proteins.
Obwohl angegeben wurde, daß das
Protein eine aus zusammengesetzten geknäuelten Knäueln zusammengesetzte Fimbrienstruktur annimmt,
widerspricht dies der Ähnlichkeit
von Sequenzen, die zwischen P5 und E. coli OmpA beobachtet wird,
welches ein achtsträngiges β-Barrel-bildendes
Protein mit vier an oberflächenexponierten
Loops ist (Munson et al. (1993) Infect Immun. 61: 4017–4020).
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Während beharrlicher
Infektionen mit ntHi in Patienten mit chronischer Bronchitis erscheinen
variante ntHi-Stämme
mit Veränderungen
in ihren OMP P5-Sequenzen. Auch zeigen Isolate aus unterschiedlichen anatomischen
Orten eine solche Variabilität.
Jedoch ist diese Variabilität
weitestgehend auf 4 Regionen beschränkt. Diese Regionen entsprechen
den Regionen, die als an der oberflächenexponiert vorhergesagt
wurden und die als Konsequenz dem Immunsystemdruck ausgesetzt sein
könnten.
Bei Infektion könnte
das Erscheinungsbild von Varianten des P5-Stamms ein Ausweichmechanismus
für ntHi
sein oder könnte
es den Bakterien ermöglichen,
unterschiedliche anatomische Orte zu besiedeln (Webb und Cripps
(1998), J. Med. Microbiol. 47: 1059–1067; Duim et al. (1997) Infect.
Immun. 65: 1351–1356).
Selbst dann wurde gezeigt, daß anti-P5-gereinigte
Antikörper
aus Mäusen
bakterizid für
die homologen und einige wenige heterologe ntHi-Stämme waren
(Quigley-Reape et al. (1995) Abstr. E70, S. 239, in "Abstracts of the
95th ASM General Meeting 1995").
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LB1(f)
ist ein Peptid mit 19 Aminosäuren,
das aus der Sequenz von MOMP P5 aus dem Stamm ntHi1128 stammt (und
die Region Arg 117 bis Gly 135 besetzt). Dieses Peptid wurde als
der dritte exponierte Loop von P5 und als ein potentielles B-Zell-Epitop
durch Analyse der Primärsequenz
von P5 definiert. Die Immunisierung von Tieren mit chimären Fimbrinpeptiden
(als LB1-Peptide
bezeichnet), die folgendes umfassen: das LB1(f)-Peptid; ein Linkerpeptid;
und ein T-Zell-Epitop, induziert eine schützende Immunreaktion gegen
das MOMP P5 und reduziert die Besiedelung von ntHi in Tieren nach
Kontakt mit ntHi (siehe
US 5,843,464 ).
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Das
Problem bei der Verwendung von Proteinantigenen aus nur einem Stamm
von H. influenzae in einem Impfstoff besteht darin, daß der verliehene
Schutz dazu neigt, weitgehend auf einen homologen Kontakt beschränkt zu sein
[Bakaletz et al. (1997) Vaccine 15: 955–961; Haase et al. (1991) Infect.
Immun. 59: 1278–1284;
Sirakova et al. (1994) Infect. Immun. 62: 2002–2020]. Die antigene Diversität der ntHi-Außenmembranproteine
bedeutet, daß die
Entwicklung eines breit wirksamen Impfstoffs gegen eine Gruppe von
Organismen, die so heterogen wie ntHi sind, eine neue Strategie
erfordern wird.
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WO
99/64067 offenbart eine effektivere Verwendung des LB1(f)-Peptids
als Impfstoff gegen ein breites Spektrum von heterologen Haemophilus
influenzae-Stämmen,
die das MOMP P5 (oder natürlich
vorkommende Varianten des Proteins) exprimieren. Dies beinhaltete
die Identifizierung der 3 antigenen Gruppen von LB1(f)-Peptiden,
die die Population von LB1(f)-Peptiden definieren, die in heterologen
ntHi MOMP P5-Proteinen vorhanden sind. Chimären dieser Peptide wurden als
Immunogen vorgeschlagen, um eine schützende Immunreaktion gegen
eine große
Vielzahl von ntHi-Stämmen
zu erhalten.
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Ein
bestehendes Problem ist, daß diese
Peptide, damit sie optimal als effektive Immunogene arbeiten, Antikörper erzeugen
müssen,
die die Epitope in ihrer nativen Struktur erkennen und daran binden.
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Entsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der
Wirksamkeit der LB1(f)-Peptide durch ihr Inserieren in oberflächenexponierte
Loops von anderen äußeren Membranproteinen oder
bevorzugt zurück
in MOMP P5 selbst, so daß die
Epitope besser in ihre nativen Konformation durch das Immunsystem
erkannt werden können.
Solche rekombinanten äußeren Membranproteine
der Erfindung haben einen oder mehrere der folgenden Vorteile: der
Zusammenhang der wichtigen LB1(f)B-Epitope ist in einem vorteilhaften Zusammenhang
(mit einer eingeschränkten
Struktur) zur besseren Immunerkennung und Immunogenität; schützende LB1(f)-Epitope können hypervariable,
nicht-schützende
Epitope aus dem äußeren Membranprotein
ersetzen, um die Immunreaktion auf die schützenden LB1(f)-Peptide zu fokussieren;
das rekombinante, modifizierte äußere Membranprotein
hilft dabei, eine bessere schützende
Immunreaktion gegen einen weiten Bereich von ntHi-Stämmen bereitzustellen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, rekombinantes äußeres Membranprotein
bereitzustellen, das einen oder mehrere oberflächenexponierte Loops umfaßt, worin
ein oder mehrere native oberflächenexponierte
Loops des Proteins (diejenige Loops, die auf dem nativen Protein
vom Wildtyp vorhanden sind) durch einen oder mehrere modifizierte
Loops ersetzt wurden, die eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe
ausgewählt
ist, die aus SEQ ID NO: 1–8
(die jeweils ein LB1(f)-Peptid umfassen) besteht, oder antigen verwandte
Varianten der Sequenzen umfassen, die eine Identität von wenigstens
75% haben und immunologisch einen entsprechenden Ort der Antigendeterminante
des MOMP P5 von ntHi nachahmen können.
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Bevorzugt
stammt das rekombinante äußere Membranprotein
aus einem nativen (Wildtyp) äußeren Membranprotein,
das aus nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae oder Moraxella
catarrhalis ist. Dies ist vorteilhaft hinsichtlich der Bereitstellung
von weiteren schützenden
Antigenen gegen H. influenzae in einem einzelnen Molekül oder zur
Bereitstellung eines einzelnen Moleküls, das einem Wirt Schutz gegen
zwei Ursachen von Mittelohrentzündung
liefern kann: ntHi und Moraxella catarrhalis.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird rekombinantes modifiziertes MOMP P5-Protein bereitgestellt.
Solche Proteine sind vorteilhaft dahingehend, daß sie bereits ein Lb1(f)-Peptid
im dritten Loop in einer nativen schützenden Konformation (die bevorzugt
unverändert
sein sollte) enthalten. Natürlich
umfaßt
die Erfindung in dieser Ausführungsform,
in der nur ein (einzelner) nativer Loop durch Ersetzen durch einen
Loop, der ein LB1(f)-Peptid
umfaßt,
modifiziert ist, nicht Ausführungsformen,
in denen der einzelne native Loop der dritte Loop des nativem OMP
ist (das bereits ein LB1(f)-Peptid umfaßt).
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Es
ist eine weitere Aufgabe, Polynukleotide bereitzustellen, die solche
Proteine codieren. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur
Isolierung der Proteine und eine Impfstoffzusammensetzung zur Verwendung
in der Behandlung von Infektion mit Haemophilus influenzae oder
Mittelohrentzündung.
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Die
Erfindung kann vollständiger
durch Verweis auf die folgenden Zeichnungen und die ausführliche Beschreibung
verstanden werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1:
die Aminosäuresequenz
von MOMP P5. Eine konservative Bewertung der Position der 4 externen
Loops ist angegeben. Loop 3 entspricht einem LB1(f)-Peptid der Gruppe
2b.
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2:
Topologiemodell des in die äußere Membran
integrierten Teils von MOMP P5 aus dem Stamm ntHi1128 (Loop 3 entspricht
einem LB1(f)-Peptid der Gruppe 1). Abzählend von links nach rechts
entlang der äußeren Oberfläche der äußeren Membran
sind die Grenzreste A, F, D, G, A, G, W und C wahrscheinlich mit der äußeren Membran
assoziiert, und deshalb sind eine liberale und genauere Bewertung
der Position der 4 externen Loops die 4 Aminosäuresequenzen außerhalb,
aber nicht einschließlich,
der zuvor genannten Grenzreste.
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Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
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Äußere Membranproteine
der Erfindung
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Das
rekombinante äußere Membranprotein
der Erfindung kann aus jedem nativen (Wildtyp) bakteriellen äußeren Membranprotein
abgeleitet werden, das wenigstens einen oberflächenexponierten Loop aufweist. Bevorzugt
sollte das native äußere Membranprotein
aus einem Gram-negativen Bakterium sein, am meisten bevorzugt aus
Haemophilus influenzae (bevorzugt nicht-typisierbares H. influenzae)
oder Moraxella catarrhalis.
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Die
DNA-Sequenzen von verschiedenen äußeren Membranproteinen
von H. influenzae für
den Zweck dieser Erfindung sind bekannt und werden in Genbank oder
in WO 96/33276 beschrieben. Informationen in solchen Offenbarungen
werden es einem Fachmann erlauben, das native Gen aus ntHi zu klonieren.
Bevorzugte native äußere Membranproteine
von ntHi für
die Zwecke dieser Erfindung sind: P1 (Bolduc et al. 2000 Infect.
Immun. 68: 4505); P2 (Sikkema und Murphy (1992) Infect. Immun. 60:
5204; Kyungcheol und Murphy (1997) Infect. Immun. 65: 150, Neary
et al. (1999) 99th Gen. Meeting of the ASM, Poster E-10; Duim et
al. (1996) Infect. Immun. 64: 4673), P4; P5 (WO 94/26304); D15 (WO
94/12641); Omp26 (WO 97/01638); HMW[1 & 2] (Barenkamp und Leininger (1992),
Infect. Immun. 60: 1302; Loosmore et al., WO 00/20609; Loosmore
et al., WO 00/35477; Barenkamp WO 97/36914A); HMW[3 & 4] (Barenkamp
et al., WO 97/36914-A1); HxuA (Cope et al. (1994) Mol. Microbiol
13: 863; Hanson et al. (1992) PNAS 89: 1973); ..HgpA (Jin et al.
(1996), Infect. Immun. 64: 3134; Hanson et al. (1992), Infect. Immun.
60: 2257; Jin et al. (1999) Microbiology 145: 905); TbpA (Loosmore
et al.,
US 6,008,326 ;
Loosmore et al.,
US 6,015,688 );
Hsf/Hia (Loosmore et al., WO 00/55191; Barenkamp und StGemeIII (1996),
Mol. Microbiol. 19: 1215); Hap (StGeme et al. (1994), Mol. Microbiol.
14: 217); Iomp1681 (
GB 0025998.6 );
D15b (WO 00/47737); HasR (WO 00/50599); YadA; IgAprotease; und VirG
(
GB 0026002.6 ).
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Die
DNA-Sequenzen von verschiedenen äußeren Membranproteinen
von Moraxella catarrhalis für den
Zweck dieser Erfindung sind bekannt und werden in Genbank oder in
WO 00/78968 beschrieben. Informationen in solchen Offenbarungen
werden es einem Fachmann erlauben, das native Gen aus Moraxella
catarrhalis zu klonieren. Bevorzugte äußere Membranproteine von Moraxella
catarrhalis für
die Zwecke dieser Erfindung sind: OmpA; OmpB1/B2 (Chen et al., WO
98/33814); OmpCD (Hsiao et al. (1995), Microb. Pathog. 19: 215);
OmpE (Murphy et al.,
US 5,948,412 );
Omp106 (WO 97/41731 & WO
96/34960); TbpA (WO 97/13785 & WO
97/32980); LbpA (WO 98/55606); CopB (Helminen et al. (1993) Infect.
Immun. 61: 2003–2010);
OmplA1 (WO 00/15802); D15 (WO 99/63093); D15b (WO 00/52042); PilQ
(WO 99/64448); Mip (WO 00/09694); HasR (WO 99/64602); OmpA (WO 00/71724);
AperE (
GB 9912038.8 );
OmpF (
GB 9912674.0 );
OmpS (
GB 9912705.2 );
HutA1/A2 (
GB 9912838.1 /
GB 9913354.8 ); FHA C (
GB 9921693.9 ); PorA (PCT/EP00/09034); CyaE
(
GB 9922829.8 ); UspA1 & UspA2 (WO 93/03761);
und Omp21.
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Rekombinante äußere Membranproteine
der Erfindung
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Der
Fachmann ist leicht in der Lage, die oberflächenexponierten Loops von nativen äußeren Membranproteinen
unter Verwendung allgemein bekannter Methodik und unter Verwendung
bereits bekannter Topologiemodelle für die obigen äußeren Membranproteine
zu bestimmen. Typischerweise würde
ein Fachmann bestimmen, wo diese Loops sind, indem er Vorhersageprogramme
für die
Sekundärstruktur
ablaufen ließe,
die nach β-Strängen suchen
(Sekundärstruktur,
die die äußere Membran
für bakterielle
OMPs durchquert). β-Stränge in OMPs,
die die Membran kreuzen, neigen dazu, ca. 10 Aminosäuren lang
zu sein, und neigen dazu, amphipathisch zu sein. Da OMPs dazu neigen,
auf der inneren Seite der äußeren Membran
zu beginnen und zu enden, wird gewöhnlich nach Paaren von β-Strängen gesucht
(insgesamt wenigstens 2 β-Stränge, aber manchmal
bis zu ca. 20). Häufig
grenzen aromatische Aminosäuren
den Beginn und/oder das Ende eines solchen Strangs. Oberflächenexponierte
Loops finden sich zwischen Paaren von β-Strängen. Weitere Anzeichen, daß ein oberflächenexponierter
Loop identifiziert wurde, sind: a) sie neigen dazu, länger als
Loops auf der internen Oberfläche
der Membran zu sein (5 bis 30 oder mehr Aminosäuren gegenüber 2 bis 6 Aminosäuren) und
b) sie neigen dazu, relativ variabel bei Vergleich der gleichen
Sequenz in unterschiedlichen Stämmen
des gleichen Bakteriums zu sein (wohingegen die Sequenzen des β-Strangs
dazu neigen, konserviert zu sein). Bevorzugt werden oberflächenexponierte
Loops unter Verwendung experimentell getesteter Topologiemodelle (oder
Strukturen) von homologen äußeren Membranproteinen
bestimmt (mit Aminosäureidentität von mehr
als 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90%). Experimentelle Untersuchungen
existieren auch zur Bestimmung von oberflächenexponierten Loops: die
Loops sind die Teile des Proteins, die Antikörper in einem Wirt hervorrufen (und
so gesammelte Antikörper
können
zur Bestimmung verwendet werden, wo auf der Protein-Primärsequenz
die Oberflächenepitope
sind); und Gebiete des Proteins, die für die Verarbeitung durch Proteasen
anfällig
sind.
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Zum
Beispiel sind die vier (extern) oberflächenexponierten Loops von MOMP
P5 (von ntHi) in den 1 (eine konservative Topologie
für ein
Gruppe 2b LB1(f) MOMP P5) und 2 (eine genauere Darstellung der Topologie
der MOMP P5-Loops für
ein Gruppe 1 LB1(f) MOMP P5) angegeben und können leicht durch den Fachmann
für andere
Varianten von MOMP P5 bestimmt werden. Dies liegt daran, daß die mit
der äußeren Membran
assoziierten Regionen (wie in 2 gezeigt)
hoch konserviert unter allen MOMP P5-Proteinen sind. Deshalb sind,
wenn man von links nach rechts entlang der äußeren Oberfläche der äußeren Membran
in 2 läuft,
die Grenzreste A, F, D, G, A, G, W und C wahrscheinlich mit der äußeren Membran
assoziiert, und deshalb sind eine genaue Bewertung der Position
der 4 externen Loops die 4 Aminosäuresequenzen außerhalb, aber
nicht einschließlich,
der zuvor genannten Grenzreste.
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LB1(f)-Peptide
bestehen aus 13 bis ca. 22 Aminosäuren. Die Peptide fallen in
3 immunologische Hauptgruppen: 1, 2 und 3 (wobei Gruppe 2 in 2 geringfügig unterschiedliche
Untergruppen aufgespalten wird: 2a und 2b).
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Ein
großer
Satz von bekannten LB1(f)-Peptiden aus den 3 Gruppen (und Varianten
davon) wird in WO 99/64067 offenbart.
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Ein
(nativer) oberflächenexponierter
Loop wird durch einen modifizierten oberflächenexponierten Loop ersetzt,
falls ein Oberflächenloop
vom Wildtyp in irgendeiner Weise verändert wird, so daß er ein
LB1(f)-Peptid enthält.
Der Begriff umfaßt
deshalb, wenn ein LB1(f)-Peptid inseriert wird (oder eingestellt
wird), den Ziel-Loop in jeder Position auf dem nativen Loop. Bevorzugt
ist die Insertion im zentralen Punkt des Loops. Das Ersetzen eines
Loops kann eine vollständige
Veränderung
der Sequenz des nativen Loops oder eine teilweise Veränderung
sein. Eine teilweise Veränderung
kann mit 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Aminosäuren aus einem Loop sein und
ist bevorzugt eine kontinuierliche Sequenz von Aminosäuren im
Loop. Bevorzugt wird der gesamte Loop ersetzt oder der gesamte Loop
mit Ausnahme von 1 bis 2 Aminosäuren
an einem Ende des Loops. Ein Loop aus X Aminosäuren kann durch ein Peptid
mit X Aminosäuren
für die
optimale Faltung des rekombinanten äußeren Membranproteins ersetzt
werden.
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Die
modifizierten Loops der Erfindung sollten ein Lb1(f)-Peptid umfassen.
Diese Loops sind dahingehend modifiziert, daß sie in einer nicht-nativen Umgebung
im rekombinanten äußeren Membranprotein
der Erfindung sind (der modifizierte Loop kann deshalb eine Wildtyp-Sequenz
von Loop 3 aus MOMP P5 sein). Wie in WO 99/64067 offenbart, enthalten
die Gruppen von LB1(f)-Peptiden eine große Vielzahl von immunologisch verwandten
varianten Sequenzen, die eine Identität von wenigstens 75% mit dem
repräsentativen
Peptid der in SEQ ID NO: 1–4
gezeigten Gruppe haben. Am meisten bevorzugt sollte der native oberflächenexponierte Loop
vollständig
durch einen gesamten Loop 3 (bevorzugt nativ) aus MOMP P5 ersetzt
werden. Solche ersetzten Loops werden am wahrscheinlichsten die
native Konformation des Loop 3 LB1(f)-Epitops innerhalb des veränderten äußeren Membranproteins
annehmen. Beispiele für
gesamte Loops 3 sind in SEQ ID NO: 5–8 gezeigt. Sie können leicht
durch einen Fachmann durch Vergleich einer MOMP P5-Sequenz mit dem
Topologiemodell aus 2 bestimmt werden. Modifizierte
Loops sind bevorzugt 13–75
Aminosäuren
lang, besonders 15–50,
noch mehr bevorzugt 20–40
und am meisten bevorzugt ca. 30 Aminosäuren lang.
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Die
LB1(f)-Peptide betreffen die repräsentativen Peptide der Gruppen
1, 2a, 2b und 3 (SEQ ID NO: 1, 2, 4 bzw. 3, umfaßt innerhalb der gesamten Loop
3-Sequenzen von SEQ ID NO: 5, 6, 8 bzw. 7) und antigen verwandte
Varianten dieser Peptide (oder gesamte Loop 3-Sequenzen). "Antigen verwandte
Varianten" können entweder
natürlich
Varianten (wie durch die in WO 99/64067 offenbarten Peptide exemplarisch
dargestellt) oder künstlich
modifizierte Varianten sein, die immunologisch den Ort der Lb1(f)-Antigendetermiante
des MOMP P5-Proteins nachahmen. Die antigen verwandten Varianten
der Peptide sollten eine Aminosäuresequenzidentität von wenigstens
75% mit einem der in SEQ ID NO: 1–8 bereitgestellt Peptide haben
(und besonders bevorzugt wenigstens 85% und am meisten bevorzugt
wenigstens 95% Identität),
während
sie noch immunologisch den entsprechenden Ort der Antigendeterminante
des MOMP P5 von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae nachahmen
können.
Für diese
Erfindung wird das "immunologische
Nachahmen des entsprechenden Orts der Antigendeterminante des MOMP
P5 von ntHi" als
ein (variantes) Peptid (oder ein gesamter Loop 3) definiert, das
in einen Loop eines äußeren Membranproteins
inseriert ist oder diesen ersetzt, das Antikörper induzieren kann, die spezifisch
eine der LB1(f)-Sequenzen
vom Wildtyp (aufgeführt
in Tabellen 2, 3 und 4 aus WO 99/64067) im Zusammenhang ihrer natürlichen
Umgebung innerhalb von MOMP P5 erkennen können, UND/ODER als ein (variantes)
Peptid (oder ein gesamter Loop 3) definiert, das in einen Loop eines äußeren Membranproteins
inseriert ist oder diesen ersetzt, das durch den gleichen immunspezifischen
Antikörper
erkannt werden kann, der eine der LB1(f)-Sequenzen vom Wildtyp (aufgeführt in Tabellen
2, 3 und 4 aus WO 99/64067) in seinem natürlichen Zusammenhang innerhalb
des M0MP-P5-Proteins erkennt. Bevorzugt ist der oben verwendete
Erkennungstest derart, daß eine
Sequenz (Wildtyp oder Variante) mehr als 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90% der Avidität
der anderen Sequenz (Variante bzw. Wildtyp) in einem ELISA-Test
unter Verwendung der Antikörper
wie oben definiert hat. Am meisten bevorzugt ist die variante Sequenz
ungefähr äquivalent
zur Sequenz vom Wildtyp hinsichtlich der Fähigkeit zum Schutz eines Wirtes
gegen nicht-typisierbares H. influenzae.
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Antigen
verwandte Varianten können
Aminosäuren
addiert, inseriert, substituiert oder deletiert aufweisen. Bevorzugte
Varianten sind diejenigen, die sich von der Bezugsgröße durch
konservative (bevorzugt einzelne) Aminosäuresubstitutionen unterscheiden.
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Solche
Peptidinsertionen und -ersetzungen können durch den Fachmann unter
Verwendung von allgemein bekannten Standardtechniken der Molekularbiologie
erreicht werden (siehe zum Beispiel das Standardlehrbuch Sambrook
et al., "Molecular
Cloning, a Laboratory Manual" (1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press). Insbesondere können bei
Bekanntheit der DNA-Sequenz des nativen äußeren Membranprotein-Ziels
Primer geradeheraus durch PCR konstruiert werden, um eine Nukleotidsequenz,
die eine native Loopsequenz codiert, durch eine Nukleotidsequenz
zu ersetzen, die eine modifizierte Loopsequenz codiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das native äußere Membranprotein
MOMP P5 selbst. Die Sequenzen der Loops 1, 2, 3 und 4 sind in 2 ersichtlich. Überraschend
haben die modifizierten MOMP P5-Proteine der Erfindung einen oder
mehrere der folgenden Vorteile: die LB1(f)-Peptide befinden sich
in einer vorteilhafteren Lage zum Annehmen einer natürlichen
Konformation für
eine optimale Immunreaktion, die wirksam gegen das Peptid in seiner
natürlichen
Umgebung ist; hochvariable, nicht-schützende Loopstrukturen (innerhalb
der Loops 1, 2 und 4) können
entfernt werden, um die Immunreaktion weg von diesen Epitopen zu fokussieren;
ein einzelnes immunogenes MOMP P5-Molekül kann hergestellt werden,
das einem Wirt Schutzimmunität
gegen ein weites Spektrum von ntHi-Stämmen verleihen kann; die Anhäufung der
LB1(f)-Peptide auf unterschiedlichen Loops eines einzelnen Moleküls liefert
eine synergistische Verbesserung der Immunreaktion eines Wirtes
gegen ein weites Spektrum von ntHi-Stämmen.
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Bevorzugt
wird der dritte Loop des Proteins unverändert belassen. Dies ist vorteilhaft,
da dieser Loop bereits ein LB1(f)-Peptid in einer nativen Konformation
trägt.
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Bevorzugt
sind in dem modifizierten MOMP P5-Protein ein oder mehrere (bevorzugt
alle) Loops 1, 2 und 4 durch einen modifizierten Loop ersetzt, der
ein unterschiedliches LB1(f)-Peptid der Gruppe 1, 2a, 2b oder 3
(in beliebiger Reihenfolge) umfaßt, das auch aus einer unterschiedlichen
Gruppe gegenüber
dem auf Loop 3 bewahrten LB1(f)-Peptid ist. Falls zum Beispiel das
Loop 3-Peptid aus Gruppe 3 ist, können native Loops 1, 2 und
4 durch einen modifizierten Loop ersetzt werden, der ein Peptid
aus Gruppe 1, 2a bzw. 2b (oder tatsächlich in beliebige Reihenfolge)
oder antigen verwandte Varianten davon umfaßt. Bevorzugt werden die LB1(f)-Peptide
aus der Gruppe SEQ ID NO: 1–4
ausgewählt
(die einen Vertreter aus jeder Gruppe von Peptiden umfassen). Falls
ein gesamter nativer Loop durch eine gesamte Loop 3-Sequenz ersetzt wird,
werden bevorzugt die Loop 3-Sequenzen aus der Gruppe SEQ ID NO:
5–8 ausgewählt (die
einen Vertreter aus jeder LB1(f)-Gruppe enthält).
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Alternativ
sind im modifizierten MOMP P5-Protein ein oder mehrere (bevorzugt
beide) Loops 1 und 2 durch einen modifizierten Loop ersetzt, der
ein unterschiedliches LB1(f)-Peptid der Gruppe 1, 2a, 2b oder 3
(in jeder Reihenfolge) umfaßt,
das auch aus einer unterschiedlichen Gruppe gegenüber dem
auf Loop 3 bewahrten LB1(f)-Peptid ist, und Loop 4 ist durch einen modifizierten
Loop ersetzt, der ein weiteres H. influenzae-Schutzepitop umfaßt. Ein
solches weiteres Epitop ist bevorzugt das Peptid aus Loop 5 oder
6 von MOMP P2 aus ntHi. Bevorzugt ist der gesamte Loop 4 durch einen
modifizierten Loop ersetzt, der der gesamte Loop 5 oder 6 der MOMP
P2-Peptidsequenz
ist (Topologiemodelle für
MOMP P2, die deutlich die Loopregionen definieren, sind fachbekannt:
Kyungcheol und Murphy (1997), Infect. Immun. 65: 150; Neary et al.
(1999), 99. Gen. Meeting of the ASM, Poster E-10; Duim et al. (1996),
Infect. Immun. 64: 4673). Bevorzugt sind die LB1(f)-Peptide aus
der Gruppe SEQ ID NO: 1–4
ausgewählt.
Falls ein gesamter nativer Loop durch eine gesamte Loop 3-Sequenz
ersetzt ist, werden bevorzugt die Loop 3-Sequenzen aus der Gruppe
SEQ ID NO: 5–8 ausgewählt (die
einen Repräsentanten
aus jeder LB1(f)-Gruppe enthält).
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Außerdem werden
Trunkierungen der MOMP P5-Proteine der Erfindung, die noch alle
4 Loop-Regionen intakt aufweisen, auch als Proteine der Erfindung
betrachtet.
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Polynukleotide
der Erfindung
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein DNA- oder RNA-Molekül, das ein
rekombinantes äußeres Membranprotein
der Erfindung codiert. Bei dieser Feststellung ist die Entartung
der Codonverwendung relevant. Bevorzugte Codonen, die als optimal
für die
Expression in unterschiedlichen Expressionswirten allgemein bekannt
sind, sollten verwendet werden. Bevorzugt haben die das LB1(f)-Peptid
codierenden Nukleotide die gleiche Sequenz wie die in den Tabellen
6–8 aus
WO 99/64067 bereitgestellten Sequenzen vom Wildtyp.
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Die
Erfindung stellt auch Polynukleotide bereit, die komplementär zu allen
oben beschriebenen Polynukleotiden sind.
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Wenn
die Polynukleotide der Erfindung für die rekombinante Produktion
von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann
das Polynukleotid die codierende Sequenz für das reife Polypeptid als
solche einschließen;
oder die codierende Sequenz für
das reife Polypeptid im Leseraster mit anderen codierenden Sequenzen,
wie zum Beispiel mit denjenigen, die eine Leit- oder sekretorische
Sequenz, eine Prä- oder
Pro- oder Präpro-Proteinsequenz oder
andere Fusionspeptidanteile codiert. Zum Beispiel kann eine Markersequenz,
die die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert, codiert
werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts
der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexahistidinpeptid, wie es
im pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt und in Gentz et al.
beschrieben wird, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 86: 821–824, oder
es ist ein HA- Marker
oder Glutathion-s-Transferase. Das Polynukleotid kann auch nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenzen enthalten,
wie zum Beispiel transkribierte nicht-translatierte Sequenzen, Spleiß- und Polyadenylierungssignale,
Ribosom-Bindungsorte und Sequenzen, die mRNA stabilisieren.
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Vektoren, Wirtszellen,
Expression
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Noch
weitere Aspekte der Erfindung sind ein Expressionsvektor, der das
DNA- oder RNA-Molekül
der Erfindung umfaßt,
worin der Expressionsvektor ein rekombinantes äußeres Membranprotein der Erfindung
bei Vorhandensein in einer kompatiblen Wirtszelle exprimieren kann,
und eine Wirtszelle, die diesen Expressionsvektor umfaßt.
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Eine
alternative Ausführungsform
ist ein rekombinanter Wirt, der das DNA- oder RNA-Molekül der Erfindung
in seinem Chromosom enthält
(das leicht durch allgemein bekannte Techniken wie die homologe
Rekombination unter Verwendung einer bekannten Nukleotidsequenz
auf dem Genom integriert werden kann), worin das Molekül in einem
zur Expression eines rekombinanten äußeren Membranproteins der Erfindung
geeigneten Zusammenhang ist.
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Für die rekombinante
Herstellung können
Wirtszellen genetisch manipuliert werden, um Expressionssysteme
oder Teile daraus für
Polynukleotide der vorliegenden Erfindung aufzunehmen. Die Einführung von Polynukleotiden
in Wirtszellen kann durch in vielen Standardlaborhandbüchern beschriebene
Verfahren bewirkt werden, wie zum Beispiel Davis et al., BASIC METHODS
IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING:
A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), wie zum Beispiel Calciumphosphat-Transfektion,
DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion,
durch kationisches Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation,
Transduktion, "Scrape
Loading", ballistische
Einführung
oder Infektion.
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Repräsentative
Beispiele für
geeignete Wirte schließen
bakterielle Zellen wie Menigococcen, Streptococcen, Staphylococcen,
E. coli, Streptomyces- und Bacillus subtilis-Zellen; pilzliche Zellen
wie Hefezellen und Aspergillus-Zellen; Insektenzellen wie Drosophila
S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; Tierzellen wie CHO-, COS-, HeLa,
C127, 3T3, BHK, HEK 293 und Bowes-Melanomzellen; und Pflanzenzellen
ein. Wenn das DNA-Molekül der
Erfindung in das Genom der Wirtszelle integriert ist, ist der Wirt
bevorzugt ntHI oder Moraxella catarrhalis.
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Eine
große
Vielzahl von Expressionssystemen kann verwendet werden. Solche Systeme
schließen u.a.
chromosomale, episomale und aus Virus stammende Systeme ein, z.B.
Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, aus Bakteriophagen, aus
Transposonen, aus Hefeepisomen, aus Insertionselementen, aus chromosomalen
Hefeelementen, aus Viren wie Baculoviren, Papovaviren, wie zum Beispiel
SV40, Vakziniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabies-Viren
stammen, und Vektoren, die aus Kombinationen daraus stammen, wie
zum Beispiel diejenigen, die aus genetischen Plasmid- und Bakteriophagenelementen
wie Cosmiden und Phagemiden stammen. Die Expressionssysteme können Kontrollregionen
enthalten, die die Expression regulieren sowie erzeugen. Allgemein
kann jedes System oder jeder Vektor verwendet werden, das/der zur
Aufrechterhaltung, Vervielfältigung
oder Expression von Polynukleotiden zur Erzeugung eines Polypeptids
in einem Wirt geeignet ist. Die angemessene Nukleotidsequenz kann
in ein Expressionssystem durch jede einer Vielzahl von allgemein
bekannten und routinemäßigen Techniken
wie zum Beispiel diejenigen inseriert werden, die dargestellt werden
in Sambrook et al, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (s.o.).
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Reinigung von rekombinanten
exprimierten Peptiden/Polypeptiden
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Noch
ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
eines rekombinanten äußeren Membranproteins
der Erfindung, das das Kultivieren der Wirtszelle (entweder das
DNA-Molekül
der Erfindung in einem Expressionsvektor enthaltend oder in ihr
Chromosom integriert) unter Bedingungen, die ausreichend zur Erzeugung
des Proteins sind, und das Gewinnen des rekombinanten äußeren Membranproteins
umfaßt. Das
Protein kann als gereinigtes Produkt gewonnen werden. Das Protein
kann auch innerhalb einer Bläschenzubereitung
(äußeres Membranvesikel)
gewonnen werden, die aus der Wirtszelle (insbesondere wenn es ein Gram-negatives
Bakterium ist – bevorzugt
ntHi oder M. catarrhalis) unter Verwendung bekannter Techniken erzeugt
werden kann. Das Protein kann innerhalb einer Ghost-Zubereitung
(äußere Membran)
gewonnen werden, die aus der Wirtszelle (insbesondere wenn es ein
Gram-negatives Bakterium ist – bevorzugt
ntHi) unter Verwendung bekannter Techniken erzeugt werden kann (siehe
WO 92/01791). Schließlich
kann das Protein innerhalb einer abgetöteten, lebenden oder lebend-abgeschwächten Vollzellzubereitung
aus dem Wirtsbakterium gewonnen werden.
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Es
ist im üblichen
allgemeinen Wissen des Fachmanns, wie äußere Membranvesikel oder Ghosts
aus einem Wirt zu isolieren sind, der das Protein der Erfindung
enthalten würde.
Der Vorteil solcher Techniken besteht darin, daß das rekombinante äußere Membranprotein
der Erfindung innerhalb der Vesikel angemessen gefaltet bleibt und
somit seine native Konformation dem Immunsystem zeigt, falls es
als Immunogen verwendet wird.
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Proteine
der Erfindung können
aus rekombinanten Zellkulturen durch allgemein bekannte Verfahren gewonnen
und gereinigt werden, die Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion,
Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie,
hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie,
Hydroxylapatit-Chromatographie
und Lectinchromatographie einschließen. Allgemein bekannte Techniken
zur Neufaltung von Proteinen können
eingesetzt werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn
das Polypeptid während
der Isolierung und/oder Reinigung denaturiert wird.
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Obwohl
die Gensequenz des chimären
LB1(f)-Polypeptids im Vektor mit einer Histidin-Markersequenz markiert
werden kann, die bei Reinigung des Polypeptids hilft, ist dies nicht
ein wesentliches Element für
die Erfindung, da Polypeptide ohne den Histidin-Marker noch immer
durch eine der oben genannten Techniken gereinigt werden können.
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Impfstoffe
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Impfstoffzusammensetzung
(oder eine immunogene Zusammensetzung), die eine immunogene Menge
(bevorzugt eine wirksame oder schützende Menge) des rekombinanten äußeren Membranproteins
der Erfindung (entweder isoliert oder gereinigt oder in einem äußeren Membranvesikel,
Ghost oder einer abgetöteten,
lebenden oder lebend-abgeschwächten
Vollzellzubereitung vorhanden) in einem pharmazeutisch akzeptablen
Exzipienten und einen optionalen Hilfsstoff umfaßt. In diesem Zusammenhang
wird eine immunogene Menge als eine ausreichende Menge Protein zum
Hervorrufen einer Antikörperreaktion
in einem Wirtimpfling definiert.
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Noch
weitere Aspekte der Erfindung sind: die Verwendung einer immunogenen
Menge des rekombinanten äußeren Membranproteins
der Erfindung in einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und
einem optionalen Hilfsstoff, um Erkrankung mit Haemophilus influenzae
vorzubeugen oder zu behandeln (bevorzugt Mittelohrentzündung, Sinusitis,
Konjunktivitis oder Infektion der unteren Atemwege); ein Verfahren
zur Induzierung einer Immunreaktion in einem Säugetier, das für eine Infektion
mit Haemophilus influenzae anfällig
ist, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge des zuvor
genannten Impfstoffs an das Säugetier
(wobei eine wirksame Menge eine Menge ist, die einen Wirt [zum Beispiel
Chinchilla] in einem gewissen Maß gegen eine ntHi-Infektion
schützen
kann); und ein Verfahren zur Prävention
einer Haemophilus influenzae-Infektion, die die Verabreichung einer
wirksamen Menge eines Impfstoffs der Erfindung an ein Säugetier
umfaßt.
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Impfstoffe
der Erfindung können
eine Präimmunisierungsreaktion
("Crossprotection-Immunreaktion") gegen eine große Vielzahl
von ntHi-Stämmen hervorrufen
(insbesondere wenn ein oder mehrere modifizierte Loops in ein äußeres Membranprotein
von ntHi integriert sind).
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Ein
bevorzugter Impfstoff der Erfindung umfaßt ein modifiziertes äußeres Membranprotein
von M. catarrhalis, das eine oder mehrere modifizierte Loop-Regionen
umfaßt,
da solche Zubereitungen einen Wirt wirksamer gegen Mittelohrentzündung durch
Immunisierung mit einem einzelnen Molekül schützen mögen.
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Die
Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in "Vaccine Design" ("The subunit and adjuvant approach" (Hrsg. M. F. Powell
und M. J. Newman), (1995) Plenum Press New York).
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Zusätzlich werden
die Proteine der vorliegenden Erfindung bevorzugt in der Impfstofformulierung
der Erfindung mit Hilfsstoff versetzt. Geeignete Hilfsstoffe schließen ein
Aluminiumsalz wie Aluminiumhydroxidgel (Alaun) oder Aluminiumphosphat
ein, aber können
auch ein Salz von Calcium, Eisen oder Zink sein oder können eine
unlösliche
Suspension von acyliertem Tyrosin oder acylierten Zuckern, kationisch
oder anionisch derivatisierten Polysacchariden oder Polyphosphazenen
sein. Andere bekannte Hilfsstoffe schließen CpG-haltige Oligonukleotide
ein. Die Oligonukleotide sind dadurch gekennzeichnet, daß das CpG-Dinukleotid
unmethyliert ist. Solche Oligonukleotide sind allgemein bekannt
und werden zum Beispiel in WO 96/02555 beschrieben.
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Weitere
bevorzugte Hilfsstoffe sind diejenigen, die eine Immunreaktion vorzugsweise
vom TH1-Typ induzieren. Hohe Spiegel von Cytokinen vom Th1-Typ neigen
dazu, die Induzierung von zellvermittelten Immunreaktionen gegen
das gegebene Antigen zu begünstigen,
während
hohe Spiegel von Cytokinen vom Th2-Typ dazu neigen, die Induzierung
von humoralen Immunreaktionen gegen das Antigen zu begünstigen.
Geeignete Hilfsstoffsysteme schließen zum Beispiel Monophosphoryllipid
A, bevorzugt 3-des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL),
oder eine Kombination aus 3D-MPL zusammen mit einem Aluminiumsalz
ein. CpG-Oligonukleotide induzieren auch vorzugsweise eine TH1-Reaktion.
Ein gesteigertes System beinhaltet die Kombination eines Monophosphoryllipids
A und eines Saponin-Derivats, insbesondere die Kombination aus QS21 und
3D-MPL, wie sie in WO 94/00153 offenbart wird, oder eine weniger
reaktogene Zusammensetzung, in der das QS21 mit Cholesterin abgemildert
ist, wie in WO 96/33739 offenbart. Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung,
die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet,
wird in WO 95/17210 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung.
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Die
Impfstoffzusammensetzung der Erfindung wird bevorzugt oral, intranasal
oder parenteral verabreicht (einschließlich einer subkutanen, intramuskulären, intravenösen, intradermalen,
transdermalen Injektion). Zur parenteralen Verabreichung geeignete
Formulierungen schließen
wäßrige und
nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen ein,
die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe
enthalten können,
die die Formulierung isotonisch zum Blut des Empfängers machen;
und wäßrige und
nicht-wäßrige sterile
Suspensionen, die Suspendiermittel oder Verdickungsmittel einschließen können. Die
Formulierungen können
in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern angeboten werden, zum
Beispiel versiegelten Ampullen und Fläschchen, und können in
einem gefriergetrockneten Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe
des sterilen flüssigen
Trägers
unmittelbar vor der Verwendung erfordert. Die Impfstofformulierung
kann auch einen Hilfsstoff wie oben beschrieben einschließen. Die
Dosierung wird von der spezifischen Aktivität des Impfstoffs abhängen und
kann leicht durch routinemäßige Experimente
bestimmt werden. Sie sollte eine Menge sein, die eine Immunschutzreaktion
ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen in typischen Impflingen
induziert (typischerweise 1–100 μg Proteinantigen,
bevorzugt 5–50 μg und besonders
typisch im Bereich von 5–25 μg).
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Noch
ein anderer Aspekt betrifft eine immunologische/Impfstoff-Formulierung,
die das Polynukleotid der Erfindung umfaßt. Solche Techniken sind fachbekannt,
siehe zum Beispiel Wolff et al., Science, (1990) 247: 1465–8.
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Die
Proteine dieser Erfindung können
als multivalente Untereinheit-Impfstoffe
in Kombination mit Antigenen aus anderen Proteinen von H. influenzae
verabreicht werden, um eine gesteigerte bakterizide Aktivität zu erreichen.
Sie können
auch in Kombination mit Polysaccharidantigenen verabreicht werden,
zum Beispiel mit dem PRP-Kapselpolysaccharid (bevorzugt konjugiert
an ein Protein wie Tetanustoxoid) von H. influenzae b. Zur kombinierten
Verabreichung mit Epitopen von anderen Proteinen wird das Protein
der Erfindung entweder separat, als Mischung (zum Beispiel innerhalb
einer äußeren Membranvesikelzubereitung)
oder als konjugiertes oder genetisches Fusionspolypeptid verabreicht.
Das Konjugat wird durch Standardtechniken zur Kupplung proteinhaltiger
Materialien gebildet. Die Proteine der Erfindung können in
Verbindung mit Antigenen aus anderen Organismen (zum Beispiel verkapselt
oder unverkapselt, Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten) verwendet
werden. Zum Beispiel sind die Proteine der Erfindung nützlich in
Verbindung mit Antigenen aus anderen Mikroorganismen, die mit Mittelohrentzündung oder
anderen Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Diese schließen Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus pyogenes Gruppe A, Staphylococcus aureus,
RS-Virus und Moraxella catarrhalis ein.
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Die
Auswertung der Proteine der Erfindung als potentielle Impfstoffe
gegen durch ntHi verursachte Mittelohrentzündung kann in einem Chinchilla-Tiermodell vorgenommen
werden (WO 99/64067). Dieses Modell ahmt die Entwicklung von Mittelohrentzündung in
Kindern nach und beruht auf den schrittweisen intranasalen Verabreichungen
von Adenovirus und ntHi im Wochenabstand. Unter diesen Bedingungen
kann das Bakterium nach der Besiedelung des Nasenrachenraums das
Mittelohr über
die eustachische Röhre
besiedeln. Dort wird sich ntHi vermehren und einen entzündlichen
Prozeß ähnlich demjenigen
induzieren, der in Kindern beobachtet wird.
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Für die Impfstoffauswertung
sind die Chinchillas zu dem Zeitpunkt, an dem sie aktiv immunisiert
sind, zu alt zum Expositionszeitpunkt zur Beimpfung über den
intranasalen Weg mit ntHi: selbst mit einer Vorinfektion mit Adenovirus
wird fast keines von ihnen Mittelohrentzündung entwickeln. Als alternativer
Expositionsweg wird eine direkte Beimpfung der Bakterien in das
Mittelohr (Bullae) durch den Schädel
verwendet. Passive Übertragungs/Expositionsprotokolle
können
auch verwendet werden, um die Notwendigkeit zur Exposition über die
Bulla zu vermeiden.
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Bei
all diesen Expositionstypen kann die Schwere der Erkrankung durch
otoskopische Beobachtung (durch das Außenohr) oder Tympanometrie
bewertet werden, die das Entzündungsniveau
im Mittelohr oder Veränderungen
im Mittelohrdruck bzw. die Gegenwart von Flüssigkeit im Mittelohr auswerten.
Die Wirksamkeit eines Impfstoffs wird durch die Reduzierung der
Schwere und/oder Dauer der Entzündung
und durch die Reduzierung der Besiedelung im Ohr und Nasenrachenraum
bestimmt.
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Die
Impfstoffe der Erfindung können
weiter durch Untersuchung ausgewertet werden, ob die Proteine der
Erfindung das Anhaften von ntHi an Epithelzellen des Rachens von
Chinchilla inhibieren und ob sie der Besiedelung des Nasenrachenraums
durch ntHi in vivo vorbeugen können.
Die Besiedelung des Nasenrachenraums ist ein für die Entwicklung von Mittelohrentzündung erforderlicher
Anfangsschritt, so daß diese
Inhibierung der Besiedelung auch die Inhibierung der Entwicklung
von Mittelentzündung
unterstützen
wird.
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