DE3878553T2

DE3878553T2 - Klonierung und sequenzierung des gens, das fuer eine neue pilinische untereinheit von bordetella pertussis kodiert.

Info

Publication number: DE3878553T2
Application number: DE8888120994T
Authority: DE
Inventors: Beatrice Arico; Ferra Francesca De; Guido Grandi; Paola Pedroni; Rino Rappuoli; Barbara Riboli; Salvatore Toma
Original assignee: Sclavo SpA; Eniricerche SpA
Current assignee: Sclavo SpA; Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1993-09-02
Anticipated expiration: 2008-12-16
Also published as: IT1223579B; ES2053694T3; CA1338632C; US5059537A; HK192695A; DE3878553D1; US5622706A; EP0324124A1; JPH022358A; IT8723150A0; EP0324124B1; ATE85811T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Klonierung und Sequenzierung des für eine neue proteinartige Pili-Untereinheit von Bordetella pertussis codierenden Gens.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein rekombinantes Plasmid, das das Gen oder dessen Fragmente enthält, sowie einen mit dem rekombinanten Plasmid transformierten Wirtsmikroorganismus.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf immunologisch-aktive, synthetische Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die mit jener der proteinartigen Untereinheit identisch ist.
Beim Keuchhusten handelt es sich um eine Krankheit der Atemwege, die durch Bordetella pertussis (B. pertussis) verursacht wird, einen Mikroorganismus, der während der Katarrh- und Krampfphase von einem Kranken auf einen anfälligen, gesunden Menschen übertragen wird.
Keuchhusten kann Krämpfe, Gehirnschäden und in manchen Fällen den Tod verursachen, insbesondere bei Kleinkindern und Neugeborenen ohne mütterliche Antikörper gegen Keuchhusten. Eine wirksame Vakzine gegen diese Krankheit ist deshalb besonders wünschenswert.
Gegenwärtig wird ein Vollbakterienimpfstoff gegen Keuchhusten verwendet, der aus mit Merthiolat abgetöteten und bei 56ºC behandelten virulenten Bakterien besteht, und der zwar einen Dauerschutz verleiht, aber unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen kann. Es besteht daher ein Bedarf an der Entwicklung neuer zellfreier Vakzinen gegen Infektion mit B. pertussis, die nicht die obengenannten Nachteile aufweisen.
Ein wesentlicher Schritt in der Pathogenese von Keuchhusten besteht darin, daß sich die Bakterien an die Epithelzellen der oberen Atemwege anheften, was dem Mikroorganismus erlaubt, sich dem Abwehrsystem des Wirts zu entziehen.
Obwohl es noch nicht vollständig geklärt ist, welche Komponenten der Bakterienzelloberfläche an diesem Vorgang beteiligt sind, so scheint es doch, daß diese Anheftung mittels extrazellulärer Proteine geschieht, die aus als Fimbrien oder Pili bekannten polymerisierten Untereinheiten, die sich auf der Bakterienoberfläche befinden, bestehen.
Von Ashworth et al. (1982) (Infect. Immun. 37; 1278-1281) wurde erstmals vorgeschlagen, daß die Fimbrien von B. pertussis serotyp-spezifische Agglutinogene seien, d.h. Oberflächenantigene, die die Produktion von Antikörpern, die die Bakterienzellen agglutinieren, stimulieren.
Irons und Mitarb. (Dev. Biol. Standard, 61, 153- 163 (1985)) isolierten und reinigten B. pertussis-Fimbrien, die als Agglutinogene des Serotyps 2 und 3 klassifiziert wurden. Die Fimbrien schienen aus Untereinheiten mit Molekulargewichten von 21 000, 22 000 und 24 000 Dalton zusammengesetzt zu sein.
Zusätzlich zu den obengenannten Agglutinogenen wurden nun Fimbrien des Serotyps 1, 4, 5 und 6 isoliert und gereinigt. Zahlreiche Forschungsarbeiten befaßten sich mit ihrer Rolle bei der Anheftung an die Epithelzellen (Urisu, T.H. et al. (1986) Infect. Immun. 52: 695- 701), mit ihrer immunogenen Wirkung (Zhang J.M. et al. Dev. Biol. Stand. 61: 173-185 (1985)) und mit ihrer Struktur (Zhang J.M. Infact. Immun. 48: 422-427 (1985)), und zwar im Hinblick auf die Verwendung der Fimbrien oder ihrer Untereinheiten für die Entwicklung einer zellfreien Vakzine, die gegen Keuchhusten schützt. Obwohl beobachtet worden war, daß mit gereinigten B. pertussis-Pili geimpfte Mäuse gegen anschließende intranasale Infektion mit dem virulenten Bakterium geschützt waren (Robinson et al. (1985) Dev. Biol. Stand. 61: 165-172), so muß doch die Entwicklung einer zellfreien Vakzine, der die gereinigten Pili oder ihre aus Pili isolierten Untereinheiten (Piline) zugrunde liegen, die in verschiedenen B. pertussis-Stämmen beobachteten Variationen bezüglich der Antigenwirkung berücksichtigen.
Tatsächlich bewirkt eine Immunisierung mit Fimbrien eines bestimmten Serotyps nicht immer Immunschutz gegen Infektionen, die durch einen Stamm mit einem unterschiedlichen Serotyp verursacht werden.
So agglutinieren Anti-Serotyp-2-Antikörper beispielsweise ausschließlich B. pertussis-Zellen, die Typ-2-Agglutinogen enthalten, und das Gleiche gilt für Anti-Serotyp-6-Antikörper (Cowell J.L. et al. (1987) Inf. and Immun. Vol. 55, N. 4, 916-922).
Weiterhin legt die Beobachtung, daß monoklonale Antikörper vom Anti-Serotyp 2 und 3 die Bindung von B. pertussis an VIRO-Zellen in vitro serotyp-spezifisch inhibieren (Gorrings et al. (1985) FEMS Microbiol. Sect. 26: 5-9) nahe, daß die Fimbrien unterschiedliche Antigenwirkung aufweisen. Um eine vollständig zufriedenstellende polyvalente zellfreie Vakzine entwickeln zu können, scheint es daher von größter Wichtigkeit zu sein, weitere Erkenntnisse bezüglich der verschiedenen Antigentypen von Fimbrien, die von B. pertussis exprimiert werden können, zu erwerben.
Das Gen, das die größere Pili-Untereinheit, die dem Serotyp 2 entspricht, codiert, wurde kürzlich geklont und sequenziert (Livey J. et al. (1987) Molecular Microbiol. 1 (2) 203-209).
Kürzlich wurde mit einer Studie begonnen, in der durch molekulare Klonierung ein drittes, bis dato unbekanntes Gen für Fimbrienuntereinheiten identifiziert werden sollte, das angeblich in Bordetella pertussis vorliegen sollte (Mori et al. Microbiol. Pathog. 2 (1987), 173-184).
Es wurde nun ein neues Gen, das eine neue Pili- Untereinheit von B. pertussis codiert, isoliert und sequenziert. Die amino-terminale Sequenz des reifen Teils der Untereinheit ist ähnlich, aber nicht identisch mit derjenigen der Piline 2, 3 und 6.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Klonierung und Sequenzierung des eine neue Pili- Untereinheit von Bordetella pertussis codierenden Gens.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht aus einem rekombinanten Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es das Gen enthält, das die Untereinheit oder ihre Fragmente codiert, und mit dem rekombinanten Plasmid transformierte Wirtsmikroorganismen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht aus immunologisch-aktiven Peptiden mit einer Aminosäuresequenz, die mit jener der Pili- Untereinheit oder deren Regionen identisch ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Peptide für die Herstellung einer zellfreien Keuchhustenvakzine. Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden durch Lesen des Texts und durch die folgenden Beispiele aufgezeigt.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung folgt nun eine kurze Beschreibung der verwendeten Fachausdrücke.
Unter Genbibliothek oder Genbank versteht man die Gesamtheit der Klone eines Wirtsmikroorganismus, wobei jeder Klon ein DNA-Fragment des Spenderorganismus enthält, von dem eine Genbank hergestellt werden soll.
Eine Genbank wird dann als repräsentativ definiert, wenn die Gruppe der Einzelfragmente in jedem Klon die gesamte chromosomale DNA des Organismus wiedergeben.
Expression bezeichnet den Mechanismus, der es einem Wirtsorganismus erlaubt, das von einem bestimmten Gen codierte Protein zu synthetisieren.
Sie beinhaltet einen Transkriptionsvorgang, d.h. die Weitergabe der genetischen Information von der DNA an die Boten-RNA (mRNA), und einen Translationsvorgang, d.h. die Weitergabe der Information von der mRNA an das Protein nach den Regeln des genetischen Codes, beschrieben von J.D. Watson (Molecular Biology of the Gene, W.A. Benjamin Inc. N.Y., 3. Ausgabe 1976), in welchem die Codons, d.h. die Nukleotidbasentriplette, die eine bestimmte Aminosäure codieren, beschrieben werden. Verschiedene Codons können die gleiche Aminosäure codieren, aber für jede Aminosäure gibt es nur bestimmte Codons und keine anderen.
Restriktionsenzyme sind hydrolytische Enzyme, die ein DNA-Molekül an bestimmten Stellen, den Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme, schneiden können.
Klonierungsvektoren sind DNA-Moleküle, die die gesamte genetische Information enthalten, die ihre Replikation nach Übertragung in einen Wirtsmikroorganismus erlaubt. Beispiele von Klonierungsvektoren sind Plasmide, die DNA einiger Bakteriophagen, und Cosmide.
Plasmid-DNA, welche kreisförmig ist, kann durch geeignete Techniken geschritten werden, ein Fragment einer Fremd-DNA kann insertiert, und der Ring dann geschlossen werden, so daß ein größeres Molekül gebildet wird: ein rekombinantes DNA-Molekül oder Hybridplasmid. Die Vektoren werden dazu verwendet, um die Fremd-DNA- Fragmente zu insertieren, d.h. Fragmente einer DNA, die ein Protein codieren, das üblicherweise nicht von dem mit dem Vektor transformierten Organismus produziert wird.
Ein Primer ist ein Oligonukleotid mit 15-50 Basen, das komplementär zu der Region des Einzelstranges ist, welcher mittels einer enzymatischen Methode sequenziert werden soll.
Kurze Beschreibung der angefügten Abbildungen:

Abbild 1:

Dieses zeigt die Nukleotidsequenz des für STX-Pilin codierenden Gens, das aus dem B. pertussis- Stamm SA1 erhalten wurde, sowie die entsprechende Aminosäuresequenz.
Die zur Identifizierung und Sequenzierung des Gens verwendeten synthetischen Oligonukleotide sind durch die Pfeile (--> < --) gekennzeichnet.
Das Methionin am Anfang, die erste Aminosäure des reifen Proteins und sein Stop-Codon werden gezeigt.
Die Schnittstelle zwischen dem reifen Teil des STX-Pilins und der Signalsequenz werden durch den Pfeil ( ) gekennzeichnet. Die BamHI- und EcoRI-Restriktionsstellen sind unterstrichen (-----).

Abbildung 2:

Diese zeigt einen Vergleich zwischen den NH&sub2;-terminalen Sequenzen der reifen Teile der STX-, ST2-, ST3- und ST6-Piline.
Die identischen Aminosäurereste sind eingerahmt.

Abbildung 3:

Homologie zwischen STX-Pilin (obere Reihe) und ST2-Pilin (untere Reihe).
Jüngste Fortschritte in der Klonierung von Genen, die bei der Virulenz von B. pertussis eine Rolle spielen, weisen darauf hin, daß die für deren Identifizierung am besten geeigneten Methoden nicht solche sind, denen die direkte Expression der Gene in E. coli zugrunde liegt (Locht et al. (1986) Nucleic Acid Res. 14: 3251-3261; Nicosia et al. (1986) P.N.A.S. USA 83: 4631-4635), sondern die Identifizierung der klonierten DNA-Fragmente, die die Gene enthalten, mittels spezifischer Proben.
Nach der vorliegenden Erfindung wurde daher die aminoterminale Region der wichtigsten proteinartigen Untereinheit der Fimbrien des B. pertussis-Stamms 165 (Serotyp 1, 2, 3) mittels der Verdauung noch dem Edman- Verfahren sequenziert und nach der von Zhang, J.M. et al. (1985); Dev. Biol. Stand. 61: 173-185) beschriebenen 15 Methode gereinigt.
Die nachfolgende Aminosäuresequenz:
von der anschließend bestätigt wurde, daß sie mit derjenigen der wichtigsten Untereinheit der Fimbrien vom Serotyp 2 identisch war (Livey J. et al. Molecular Microbiol. (1987) 1 (2) 203-209), wurde für die Synthese von Oligonukleotiden verwendet, wobei die relative Degeneriertheit des genetischen Codes berücksichtigt wurde.
Die den Aminosäuren 7-12 entsprechende Region wurde für diesen Zweck ausgewählt, und eine Oligonukleotidfarnilie, die für alle möglichen Triplettkombinationen repräsentativ war, wobei die dritte Base degeneriert war, wurde mittels eines automatischen Systems synthetisiert.
Diese Familie wurde als Probe A bezeichnet und lautet folgendermaßen:
Die nach der Methode von Arrand J.E. (Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, [Hrsg:] Edited by B.D. Hames - S. Higgins, Press Washington DC 1985, S. 34) markierte Probe wurde anschließend dazu verwendet, um in einer B. pertussis-Genbibliothek die Klone mit dem chromosomalen DNA-Fragment, das mit der Probe hybridisiert, zu identifizieren
Nach der vorliegenden Erfindung wurde eine für das B. pertussis-Genom repräsentative Genbibliothek durch Verdauung der chromosomalen DNA des Bakteriums mit geeigneten Restriktionsenzymen hergestellt.
Verschiedene B. pertussis-Stämme können für diesen Zweck verwendet werden.
Insbesondere wurde der im Handel erhältliche B. pertussis-Stamm 165 (Serotyp 1, 2, 3) (SCLAVO) verwendet.
Die chromosomale DNA dieses Stammes wurde von den lysierten Zellen extrahiert, mit dem Restriktionsenzym Sau3A nach der von den Herstellern vorgeschlagenen Methode verdaut und durch Ethanolfällung und Zentrifugieren gewonnen. Die so erhaltenen chromosomalen DNA-Fragmente wurden anschließend in einen Klonierungsvektor übergeführt und nach Hybridisierung mit Probe A nach der Methode von Sanger F. et al. (1977) (P.N.A.S. 74, 5463) sequenziert.
Diese Methode beruht auf einem enzymatischen Sequenzierungssystem und ist besonders für die Bestimmung der Sequenzen langer und wenig bekannter DNA-Fragmente geeignet.
Dafür ist nötig, daß das Fragment, das sequenziert werden soll, in Einzelstrangform vorliegt, und daß ein kurzes Primer-Oligonukleotid (15-50 Basen), das zu der Initialregion des Einzelstrangs komplementär ist, vorliegt. Die DNA-Fragmente wurden entsprechend in einem M13-Phagenvektor kloniert. Die vorzugsweise verwendeten Phagenvektoren waren M13mp8 (Messing J. et al. (1981) Nucleic Acid Reser. 9, 309) und M13mp9 (Messing J. et al. (1982), Gene, 19, 263), in denen die Klonierungsstellen umgekehrt zu den Anheftungsstellen des Primers angeordnet sind, wodurch die Sequenz einer Insertion beginnend von den beiden gegenüberliegenden Enden definiert werden kann. In der Praxis wurden die zuvor mit dem Enzym BamHI verdauten Phagen mit den DNA-Fragmenten in der Gegenwart des Enzyms T4-DNA-Ligase nach allgemein bekannten Methoden ligiert.
Die Ligationsmischung wurde anschließend für die Transformierung von E. coli-Zellen verwendet, die mit CaCl&sub2; nach der von Mandel M. und Higa (1970) (J. Mol. Biol. 53, 154) beschriebenen Methode kompetent gemacht wurden.
Die transformierten Zellen wurden anschließend auf einem geeigneten Kulturmedium bei einer Temperatur von 35º bis 40ºC über Nacht selektiert.
Die so erhaltenen positiven (weißen) Plaques wurden anschließend auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit der nach der Methode von J.E. Arrand markierten Probe hybridisiert.
Von den Plaques mit positivem Hybridisierungssignal wurden anschließend zwei für die Sequenzierung der Einzelstrang-DNA nach der Methode von Sanger verwendet, wobei die Strategie der aufeinanderfolgenden Primer verwendet wurde (Strauss E.C. et al. 1986, Anal. Biochem. 154, 353).
Auf diese Weise wurde gefunden, daß die Sequenz des Einzelstrangs eines Plaques eine Nukleotidregion enthielt, die identisch war mit derjenigen, die von der N-terminalen Aminosäuresequenz, die für die Herstellung der Probe verwendet worden war, abgeleitet wurde, und der N-terminalen Region der Pili-Untereinheit vom Serotyp 2 entspricht, die vom ST2-Gen codiert wird.
Der Einzelstrang des anderen Plaques enthielt jedoch eine Region mit einer Nukleotidsequenz, die zwar derjenigen des ST2-Gens ähnlich, aber nicht mit ihr identisch ist, was die Existenz eines anderen Gens vermuten ließ.
Da dieser Klon lediglich einen Teil des Gens enthielt, der mit STX bezeichnet wurde, wurde mittels eines Cosmids als Klonierungsvektor eine Genbibliothek von B. pertussis hergestellt, um das gesamte chromosomale DNA-Fragment mit dem Gen zu erhalten. Cosmide sind bestimmte Plasmide, in die das Cos-Ende des Lambda-Phagen insertiert wurde. Dadurch läßt sich das rekombinante Molekül mit dem Virenprotein umgeben, so daß Viruspartikel erhalten werden. Die DNA des Cosmids wird dann mittels des Viruspartikels in die Bakterien eingeschleust, als ob es sich um Lambda-DNA handeln würde.
Da Lambda-DNA äußerst groß ist und das Cosmid relativ klein, können lange DNA-Fragmente in die Vektoren insertiert werden.
In der Praxis wurden das Cosmid pCH79 (Hohn B. et al. (1980) Gene 11: 291-298) und der B. pertussis-Stamm SA1 (Arico, B. und Rappuoli R. (1987) J. Bacteriol. 169: 2847-2853) verwendet.
Die chromosomale DNA von B. pertussis-SA1 wurde aus den lysierten Zellen abgetrennt und mit dem Enzym SAu3A teilweise verdaut.
Nach Ethanolfällung und Trennung durch Zentrifugieren wurden die chromosomalen DNA-Fragmente mit 35-45 k-Basen isoliert und in der Gegenwart von T4-DNA-Ligase mit dem Cosmid ligiert, das vorher mit dem Enzym BamHI verdaut worden war. Diese Ligationsmischung wurde dann für die Transformierung von E. coli-Zellen verwendet, und die transformierten Zellen wurden auf einem Selektivmedium, dem Ampicillin zugegeben worden war, selektiert.
Die positiven Kolonien wurden anschließend mittels der Hybridisierungsmethode analysiert, wobei zwei Probenpaare verwendet wurden: 1-2 und 3-4, die komplementär zu verschiedenen Abschnitten der vorher bestimmten Region von STX und ST2 sind.
Insbesondere weisen die automatisch synthetisierten Proben folgende Sequenzen auf:
Probe 1 (STX) C C G C C C A T G C C G A A G A C
Probe 2 (STX) G C C G G T A A T G A C A A T G G
Probe 3 (ST2) C C T T C A G C T T G A T G A T
Probe 4 (ST2) G T G A T G A C G A T G G T G
Die Kolonien wurden auf Nitrocellulosefilter übertragen, lysiert und anschließend parallel mit den zwei Probenpaaren hybridisiert.
Beide Probenpaare wurden 6 Stunden bei 65ºC vorhybridisiert, und jede der vier Proben wurde bei verschiedenen Temperaturen hybridisiert. Auf diese Weise wurden positive Klone identifiziert, die mit beiden Proben eines Paares hybridisierten.
Um das Cosmid und/oder die Cosmide zu identifizieren, die das chromosomale DNA-Fragment mit dem STX-Gen enthielten, wurden die Cosmide aus den positiven Klonen durch eine Schnellextraktionsmethode extrahiert (Maniatis et al. (1982) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor N.Y.) und durch Verdauung mit EcoRI analysiert.
Auf diese Weise wurde gefunden, daß eines dieser Cosmide, im folgenden als pSM 280 bezeichnet, eine Sequenz enthielt, die identisch mit dem vorher identifizierten Teil des STX-Gens war. Gemäß der vorliegenden Erfindung und um das Gen zu sequenzieren, wurde aus dem Cosmid pSM 280 ein Fragment der chromosomalen DNA von B. pertussis-SA1 extrahiert, das mit der spezifischen Probe für STX hybridisiert, und in einen E. coli-Vektor subkloniert.
Vektoren, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können aus der Reihe der in der rekombinanten DNA-Technik üblicherweise verwendeten Plasmide, Viren und Bakteriophagen ausgewählt werden.
Insbesondere wurde das Plasmid puC12 (2730 bp), das von Messing J. et al. (1982) (Gene, 19, 259) beschrieben worden war, verwendet, was die schnelle und einfache Identifizierung der Klone, die ein Fremd-DNA- Fragment aufgenommen hatten, erlaubt.
Tatsächlich enthält das Plasmid die Gene für β- Lactamase und β-Galactoxidase, wodurch der E. coli- Wirtsstamm auf ampicillinhältigem Medium wachsen kann. Wird ein Fremdfragment zwischen die besonders für Klonierung geeigneten Restriktionsstellen im β-Galactoxidasegen insertiert, so wird das Gen unterbrochen und kann kein Enzym mehr herstellen.
Durch Verwendung von Substanzen, die eine Ähnlichkeit mit Galactose aufweisen und Moleküle herstellen können, die sogar im gespaltenen Zustand chromogen sind, ist es daher möglich, die rekombinanten Klone (ungefärbt) von plasmidhältigen Klonen zu unterscheiden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde das Cosmid pSM 280 mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und der Verdau wurde in Form einer Doppelbestimmung auf Agarosegel aufgetragen.
Nach der Elektrophorese wurden die DNA-Banden auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit den geeignet gekennzeichneten Proben 1 und 2 hybridisiert.
Jede Probe wurde unter verschiedenen Arbeitsbedingungen vorhybridisiert und hybridisiert. Die Filter wurden anschließend auf geeignete Weise gewaschen und für eine Radiographie verwendet.
Beide Proben wiesen eine einzige positive Bande von 1,2 Kilobasen (Kb) als Resultat auf.
Das der Bande entsprechende chromosomale DNA- Fragment wurde mittels Elektroelution isoliert und mit dem Plasmid pUC 12, das zuvor mit EcoRI verdaut worden war, ligiert.
Die Ligationsreaktion wurde in einer Puffermischung in der Gegenwart von T4-DNA-Ligase durchgeführt, wobei das Plasmid/DNA-Fragment-Verhältnis zugunsten des Fragments verschoben wird und vorzugsweise 1:3 beträgt.
Nach Beendigung der Ligationsreaktion wurden kompetente E. coli-Zellen mit der Mischung transformiert, und die transformierten Zellen wurden auf einem Kulturmedium, dem Ampicillin zugesetzt worden war, selektiert.
Einige der erhaltenen positiven Klone mit den benötigten rekombinanten Plasmiden wurden isoliert.
Einer davon, der als pSM 281 bezeichnet wurde, wurde für die Isolierung und Sequenzierung des 1,2 kb chromosomalen DNA-Fragments verwendet.
Die Sequenzierung wurde nach der Methode von Sanger durchgeführt, wobei die Strategie der aufeinanderfolgenden Primer angewandt wurde.
Die Sequenzierungsreaktionen wurden an den denaturierten Plasmiden nach dem Boehringer Standardprotokoll mit einem "pUC-Sequenzierungsbesteck" und mit ATP als α[P³²]-Tracer durchgeführt.
Mit dem obengenannten Arbeitsvorgang ließ sich feststellen, daß das 1,2 kb Fragment sich aus einer 375 Basen umfassenden Region des Cosmids pHC79 und einer 844 Basen umfassenden Region des STX-Gens zusammensetzt, wobei die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen wie in Abb. 1 angegeben sind.
In der sich vom 5'-Ende der 844 Basen umfassenden Region bis zum 628 Basen stromabwärts liegenden Stop- Codon erstreckenden Sequenz wurde ein offener Leseraster identifiziert. Weiterhin wurden die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des reifen Proteins, das vom STX-Gen codiert wird, aufgrund der Ähnlichkeit mit der aminoterminalen Sequenz der ST2-Untereinheit identifiziert.
Dieser durch die N-terminalen Aminosäuren NH-Glu-Asp-Gly-Thr-Ile-Val-Ile-Thr-Gly dargestellten Sequenz geht das Ala-Ala-His-Ala-Tetrapeptid voraus, das mit demjenigen zwischen dem reifen Protein der Pili- Untereinheit ST2 und seinem Sekretionssignal (Leitsequenz) identisch ist. Dem Tetrapeptid, das die präzise Schnittstelle für eine Membran-Leitpeptidase darstellt, geht eine Aminosäuresequenz von 29 Aminosäuren mit einer zentralen hydrophoben Domäne (Aminosäuren -6 bis -16) voraus, was charakteristisch für Leitsequenzen ist, sowie ein Methionin in der Position -21.
Das Met in Position -21 codierende ATG ist höchstwahrscheinlich das Translationscodon. Tatsächlich codiert die Sequenz stromabwärts vom Codon bis zum Beginn des reifen Proteins (GAA) ein Polypeptid, das die Länge und Eigenschaften besitzt, die typisch für eine Signalsequenz sind (Perlman, D. et al. (1983), J. Mol. Biol. 167, 391-409).
Die aus der Nukleotidsequenz des STX-Genprodukts abgeleitete Aminosäuresequenz weist eine beachtliche Ähnlichkeit mit dem ST2-Genprodukt auf. Große Ähnlichkeit zwischen den beiden Proteinen zeigte sich in der aminoterminalen Region und der carboxyterminalen Region bei 12 Aminosäuren, bei denen es sich, wie für andere Pili-Proteine gezeigt wurde, um die konservativsten Proteine handelt (Livey et al. (1987) Molecular Microbiol., 1 (2), 203-209).
Der gesamte Ähnlichkeitsgrad des reifen Proteins wird auf 66% auf dem Aminosäureniveau und auf 61% auf dem Nukleotidniveau geschätzt.
Die Ähnlichkeit der vermutlichen Signalsequenz von STX mit der Signalsequenz von Untereinheit ST2 liegt etwas unterhalb (52%) des restlichen Proteins. Zudem weist das von den Sequenzen von ST2 und STX prognostizierte Hydrophobizitäts-/Hydrophilizitätsmodell eine große Ähnlichkeit auf.
Daraus läßt sich schließen, daß das STX-Gen von B. pertussis ein pilinartiges reifes Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 20 kd codiert, was möglicherweise einem serotypisch unterschiedlichen Pilin 2, 3 oder 6, oder einem neuartigen Pilin, entspricht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung und um die Beziehungen, die zwischen den beiden Genen ST2 und STX in der chromosomalen DNA von B. pertussis existieren, zu identifizieren, wurde eine Genomanalyse durchgeführt.
Insbesondere wurde die chromosomale DNA von B. pertussis 165 mit einer Reihe von Restriktionsenzymen verdaut, und der Enzymverdau wurde mit für die Gene STX und ST2 spezifischen Proben hybridisiert.
In keinem Fall wurde eine Bande identifiziert, die zur Hybridisierung mit beiden Proben befähigt war.
Dies zeigte, daß diese beiden Gene sich nicht in einem einzigen Operon befanden oder in der Nähe voneinander lagen, sondern daß sich zwischen ihnen ein Minimalabstand von einigen Kilobasen befand.
Diese Beobachtung wurde auch durch die Abwesenheit eines Cosmids bestätigt, das beide Gene aus der Genbibliothek von B. pertussis SA1 enthielt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die mit derjenigen des vom STX-Gen codierten reifen Proteins oder mit immunologischaktiven Regionen dieses Proteins identisch ist, besonders nützlich für die Herstellung von zellfreien polyvalenten Vakzinen gegen Pertussis. Das Plasmid pSM 281 wurde am 7.12.1987 unter der Bezeichnung E. coli JM 103 (pSM 281) beim American Type Culture Center als ATCC 67572 hinterlegt.
Die folgenden experimentellen Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu begrenzen.

Beispiel 1

Extraktion der chromosomalen DNA aus B. pertussis 165

100 ml Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung:
Beta-Casaminosäuren (DIFCO) 14 g
KCl 0,2 g
MgCl&sub2;.6H&sub2;O 0,1 g
K&sub2;PO&sub4; 0,5 g
Nikotinsäure 0,02 g
Glutathion 0,01 g
Stärke 1,00 g
H&sub2;O 1 l
pH 6,8
das zuvor bei 120ºC 15 Minuten lang sterilisiert worden war, wurde mit B. pertussis Stamm 165 (Serotyp 1, 2, 3) beimpft und unter Schütteln (200 Umdrehungen pro Minute, U/min) 3 Tage lang bei 37ºC aufbewahrt.
Nach diesem Zeitraum wurden die Zellen vom flüssigen Überstand durch Zentrifugieren (10 Minuten bei 5000 U/min) in einem Sorvall-RC5B-Rotor Modell SS34 bei 4ºC getrennt und mit einer Lösung, die 100 mM NaCl und 50 mM Tris-NCl bei pH 7,5 enthielt, gewaschen (2x120 ml).
Die erhaltene Suspension wurde nochmals wie oben beschrieben zentrifugiert und die Zellen wurden geerntet und in 10 ml Pufferlösung (100 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2,5% Saccharose, pH 6,9), die 1 mg/ml Lysozym (SIGMA) enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde geschüttelt, 30 Minuten bei 37ºC aufbewahrt, SDS (Natriumdodecylsulfat) wurde anschließend zugegeben, so daß die Endkonzentration 1% betrug, und der Ansatz wurde 30 Minuten lang bei 60ºC aufbewahrt.
1 mg/ml Proteinase K, die vorher 30 Minuten in 1xSSC (1xSSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat) bei 37ºC inkubiert worden war, wurde anschließend zu der Lösung zugegeben, und 2 Stunden bei 37ºC reagieren gelassen. Nachdem soviel NaCl zugegeben worden war, daß eine Endkonzentration von 1M erhalten wurde, wurde die Mischung 30 Minuten lang auf Eis aufbewahrt und anschließend zentrifugiert. Die DNA im flüssigen Überstand wurde mit 2-3 Volumsteilen kaltem Ethanol (-20ºC) gefällt, mit einem Glasstab gewonnen und in 10 ml 0,1xSSC suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur (20- 25ºC) unter leichtem Schütteln über Nacht aufbewahrt und nach dem Zusatz von RNase (10 γ/ml) 30 Minuten lang bei 37ºC stehen gelassen.
Die Salzkonzentration der Lösung wurde anschließend auf 1xSSC gebracht, der Ansatz wurde mit Phenol extrahiert (1 Volumsteil), und die DNA durch tropfenweise Zugabe von Isopropanol gefällt, wobei die Lösung bei Raumtemperatur leicht geschüttelt wurde.
Die DNA wurde anschließend durch Zentrifugieren und Suspendieren in 1 ml 0,1xSSC erhalten.
0,645 mg/ml chromosomale DNA wurden erhalten; die Auswertung erfolgte durch spektralphotometrische Messung bei OD260 mittels eines Perkin-Elmer Spektralphotometers, Modell 515.

Beispiel 2

Isolierung und Sequenzierung des Gens, das eine Pili- Untereinheit codiert.

A) Herstellung der Genbibliothek von B. pertussis 165 in Sau3A

10 ug einer wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltenen chromosomalen DNA wurden in 200 ul Reaktionspuffer (6 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;) mit 100 Einheiten (E) des Restriktionsenzyms Sau3A (Boehringer) bei 37ºC 1,5 Stunden lang verdaut.
Die so verdaute DNA wurde durch einen Zusatz von 3M Natriumacetat und Ethanol zum Ansatz gefällt, durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 4ºC und 12 000 U/min in einer Eppendorf-Zentrifuge abgetrennt und anschließend in 100 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) suspendiert. Gleichzeitig wurden die Phagen M13mp8 (5 ug) und M13mp9 (5 ug) getrennt mit 20 E des Enzyms BamHI (Boehringer) in 50 ul Reaktionspuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl) bei 37ºC 1,5 Stunden lang verdaut.
Die Phagen-DNA wurde anschließend aus dem Enzymverdau gefällt, durch Zentrifugieren abgetrennt und wie oben beschrieben in TE-Puffer suspendiert.
15 ul der Lösung, die die chromosomalen DNA- Fragmente (1,5 ug) enthielt, wurden anschließend mit 12,5 ul der Phagen-DNA-Lösung (1,25 ug) in 1,25 ml Ligationspuffer (66 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol) in der Gegenwart von 1 E T4-DNA-Ligase 18 Stunden lang bei 14ºC ligiert.
Anschließend wurden jeweils 125 ul der Ligationsmischung für die Transformierung von E. coli 71/18- Zellen verwendet (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. New York), die durch Behandlung mit 50 mM CaCl&sub2; (Mandel M. und Higa (1970) J. Mol. Biol. 53, 154) kompetent gemacht worden waren. Die transformierten Zellen wurden anschließend dadurch selektiert, daß die Zellen auf Platten mit 1xYT- Medium übertragen wurden (8 g/l Bacto-Trypton (DIFCO), 5 g/l Bacto-Hefeextrakt (DIFCO) und 5 g/l NaCl) übertragen wurden, das durch einen Zusatz von 50 ug/ml Ampicillin, 0,03 mM IPTG (Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid), 0,05% X-Gal (5-Brom-4-chlor-3- indolyl-D-galactopyranosid) selektiv gemacht worden war, und 12 Stunden lang bei 37ºC in einem Brutschrank inkubiert wurden.
Dies ergab 14 000 positive Plaques (weiß).

B) Konstruktion der spezifischen Probe

Der N-terminale Teil der größeren proteinartigen Untereinheit (2) der Pili von B. pertussis 165 wurde durch Verdauung nach dem Edman-Verfahren analysiert und wies die folgende Sequenz auf:
Die aus der Aminosäuresequenz abgeleitete Nukleotidseguenz wurde anschließend für die Synthese von als Proben zu verwendenden Oligonukleotiden benützt, wobei die relative Degeneriertheit des genetischen Codes berücksichtigt wurde. Insbesondere wurde ein automatisches System mit der Bezeichnung System 1 Plus DNA Synthesiser (Beckman) für die Synthese einer Oligonukleotidfamilie mit der folgenden Sequenz verwendet:
0,9 ug Oligonukleotide wurde am 5' OH-Ende mit 500 uCi γ(P³²) ATP (3000 Ci/mMol) nach der Methode von Arrand J.E. (Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, [Nukleinsäurehybridisierung: Ein praktischer Ansatz], Hrsg. B.D. Hames - S. Higging, Press Washington DC 1985, S. 34) markiert. Die berechnete spezifische Aktivität (Beckman-Szintillator der Marke LS 7500) war 8,3 x 10&sup8; cpm/ug DNA.

C) Screeninq unter Verwendung der spezifischen Probe

Die Plaques der Genbibliothek in M13 wurden auf Nitrocellulosefilter übertragen (Schleicher & Schuell 0,45 um), und die Filter wurden anschließend mit der spezifischen Probe nach der Methode von P.J. Mason und J. Williams (Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach [Nukleinsäurehybridisierung: Ein praktischer Ansatz] S. 123) hybridisiert. Die Vorhybridisierung wurde 6 Stunden bei 39ºC vorgenommen, während 18 Stunden bei 39ºC hybridisiert wurde. Zum Schluß wurden die Filter bei 25ºC mit 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 6xSSC (0,9 M NaCl, 0,09 M Natriumcitrat) 1 Stunde lang gewaschen und mit Kodak-Radiographieplatten der Bezeichnung X-Omat AR in Kontakt gebracht.
Auf diese Weise wurden 5 Plaques mit positivem Signal identifiziert. Zwei davon wurden anschließend bestimmt.

D) Sequenzierung der aus den positiven Plaques erhaltenen Einzelstränge

Die Einzelstränge der zwei positiven Plaques wurden nach der Methode von Messing J. (1983) (Methods of Enzymol, V.101) extrahiert und nach der von Strauss E.C. et al. (1986) (Analytical Biochem. 154, 353) beschriebenen Strategie der aufeinanderfolgenden Primer sequenziert. Die Sequenz eines dieser Einzelstränge enthielt eine Region, die mit der des ST2-Gens identisch war, während der andere eine ähnliche, aber nicht identische Sequenz enthielt, was die Anwesenheit eines unterschiedlichen Gens, das nachfolgend als STX bezeichnet wird, nahelegte.

Beispiel 3

Sequenzierung des Gens STX

A. Konstruktion einer Genbank von B. pertussis SA1

Um die gesamte codierende Sequenz des als STX bezeichneten Gens zu erhalten, wurde eine Genbank von B. pertussis SA1 unter Verwendung des Cosmids pHC79 konstruiert.
500 ug der chromosomalen DNA von B. pertussis SA1, die wie in Beispiel 1 extrahiert worden waren, wurden mit 5 E des Restriktionsenzyms Sau3A bei 37ºC 15 Minuten lang teilverdaut.
Die so verdaute DNA wurde durch Zusatz von Ethanol zur Lösung gefällt, abgetrennt, und anschließend in einem Puffer bestehend aus 0,5 ml 10 mM Tris und 1 mM EDTA wieder suspendiert.
Die Lösung wurde auf einen Saccharosegradienten von 10% bis 40% aufgetragen, der in 35 ml eines Puffers (pH 7,5) bestehend aus 1 mM NaCl, 10 mM Tris und 1 mM EDTA aufgelöst wurde.
Dieser Gradient wurde anschließend bei 26 000 U/min 16 Stunden lang in einem Beckman-SW28-Rotor zentrifugiert.
Fraktionen von jeweils 1 ml wurden anschließend gesammelt, und das Molekulargewicht der DNA in jeder Fraktion wurde durch Agarose-Elektrophorese bestimmt (Maniatis T. et al. "Molecular Cloning A Laboratory Manual." Cold Spring Harbor N.Y. (1982)). Die Fraktionen, die DNA-Fragmente von 35-45 kb enthielten, wurden anschließend dialysiert und die DNA wie oben beschrieben mit Ethanol gefällt.
Die DNA wurde anschließend durch Zentrifugieren abgetrennt und in einem Puffer (pH 7,5) bestehend aus 10 mM Tris und 1 mM EDTA bei einer DNA-Konzentration von 1 ug/ul suspendiert.
Die chromosomalen DNA-Fragmente wurden anschließend kloniert.
20 ug des Cosmids pHC79 wurden mit 40 E des Enzyms BamHI 1 Stunde lang bei 37ºC in 200 ul Verdauungsmischung verdaut.
2 ug chromosomale DNA wurden anschließend mit 0,5 ug der Cosmid-DNA in 10 ul Ligationsmischung in der Anwesenheit von 1 E T4-DNA-Ligase bei 14ºC 18 Stunden lang ligiert.
Nach Ablauf dieser Zeit wurden 2,5 ul der Ligationsmischung in vitro zusammen mit einem Stratagene Packagene Kit verwendet.
Die so erhaltenen rekombinanten Cosmide wurden für die Infektion des E. coli-Stamms JM109 verwendet, und die Transformanten wurden auf LB-Medium (Bacto-Trypton 10 g, Bacto-Hefeextrakt 5 g, NaCl 10 g, H&sub2;O 1 l, pH 7,5) selektiert.
Dies ergab ungefähr 15 000 positive Kolonien.
Davon wurden 1500 Kolonien mit zwei Probenpaaren mit den folgenden Sequenzen gescreent:
Probe 1 (STX) C C G C C C A T G C C G A A G A C
Probe 2 (STX) G C C G G T A A T G A C A A T G G
Probe 3 (ST2) C C T T C A G C T T G A T G A T
Probe 4 (ST2) G T G A T G A C G A T G G T G
Die Oligonukleotide wurden mit dem von Beckman hergestellten automatischen System synthetisiert und am 5' OH-Ende mit 105 uCi γ(P³²) ATP nach der folgenden Methode markiert.
200 ng Oligonukleotide wurden in 30 ul einer aus 3 ul Kinasepuffer (Boehringer), 21 ul ATP, T4- Polynukleotidkinase 10 E x ul (1 ul) bestehenden wäßrigen Lösung suspendiert.
Die Mischung wurde 45 Minuten bei 37ºC aufbewahrt, und das Enzym wurde 10 Minuten lang bei 65ºC desaktiviert.
Die markierten Proben wurden anschließend in TE- Puffer pH 8 in einer Sephadex G-50 Säule gereinigt, um die nicht eingebauten Marker abzutrennen.
13 Fraktionen von je 150 ul wurden erhalten.
2 ul jeder Fraktion wurden in 4 ml Szintillationsflüssigkeit übertragen und im Szintillationszähler ausgewertet.
Die sich in Cosmiden befindenden Kolonien der Genbank wurden auf Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schuell 0,45 um) übertragen und mit NaOH lysiert, und ihre DNA wurde anschließend nach der Southern-Methode (Maniatis 1982) immobilisiert; die Filter wurden parallel zu den zwei wie oben beschrieben markierten Probenpaaren hybridisiert.
Die Vorhybridisierung wurde 6 Stunden lang bei 65ºC durchgeführt, während
Probe 1 bei 53ºC,
Probe 2 bei 47ºC,
Probe 3 bei 41ºC, und
Probe 4 bei 45ºC
18 Stunden lang hybridisiert wurde.
Die Filter wurden anschließend gewaschen und mit Radiographieplatten, wie in Beispiel 2 Punkt C) beschrieben, in Kontakt gebracht.
5 Klone, die mit den vier Proben hybridisierten, wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren isoliert.
Die aus den Klonen extrahierten Cosmide wurden durch Verdauung mit EcoRI analysiert, und es zeigte sich, daß: 3 davon Sequenzen enthielten, die denen der Proben 3 und 4 ähnlich, aber nicht identisch mit ihnen waren, eines eine Sequenz enthielt, die mit der vorher isolierten Region des STX-Gens identisch war, und schließlich eines, das mit den Proben 1 und 3 hybridisierte, eine Sequenz enthielt, die nicht identisch mit der des STX-Gens war.
Der Klon, der das Cosmid mit dem STX-Gen enthielt, wurde mit pSM 280 bezeichnet.

B) Subklonierung des das STX-Gen enthaltenden DNA-Fragments

Das Cosmid pSM 280 wurde durch Schnellextraktion extrahiert, und 250 ng wurden anschließend in 10 ul einer Verdauungsmischung bestehend aus 100 mM Tris-HCl pH 7,5 50 mM NaCl und 10 mM MgCl&sub2; mit 5 E EcoRI (Boehringer) 1 Stunde lang bei 37ºC verdaut.
Die Enzymreaktion wurde anschließend 10 Minuten lang bei 65ºC gestoppt, und der Ansatz wurde parallel auf zwei 0,8 prozentige Agarosegele aufgetragen, und, nach 3-stündiger Elektrophorese bei 80 Volt, wurden die DNA- Banden auf 2 Nitrocellulosefilter übertragen (Mikrofiltrationssystem 0,45 um) und anschließend mit den Proben 1 und 2 nach dem in Punkt C) beschriebenen Verfahren hybridisiert.
Die Vorhybridisierung erfolgte in 10 ml 6xSSC (1xSSC = 150 mM NaCl, 25 mM Natriumcitrat), 10 x Denhardts (1 x Denhardts = 1% Ficoll, 1% PVP, 1% BSA Pentax Fraktion V) und 50 ug/ml denaturiertem Lachssperma, wobei Filter Nr. 1 4 Stunden lang bei 53ºC und Filter Nr. 2 4 Stunden lang bei 47ºC behandelt wurden.
Die Hybridisierung wurde in 10 ml der oben beschriebenen Mischung durchgeführt, wobei bei Filter Nr. 1 600 ul Probe 1 (6x10&sup8; cpm/ γ DNA) und bei Filter Nr. 2 5600 ul Probe 2 (8,4x10&sup8; cpm/ γ DNA) zugesetzt wurden.
Filter 1 und 2 wurden anschließend über Nacht bei 53ºC bzw. 47ºC inkubiert. Schließlich wurden die Filter viermal 15 Minuten lang mit jeweils 100 ml 6xSSC mit einem Zusatz von 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) gewaschen und eine Nacht bei -80ºC mit Radiographieplatten der Bezeichnung Kodak X-Omat AR in Kontakt gebracht.
Beide Proben ergaben eine einzelne positive Bande mit 1,2 kb.

B) Subklonierung des 1,2 kb EcoRI-Fragments in PUC12

1 ug Vektor pUC12 wurde in 10 ul Verdauungs mischung mit 5 E EcoRI eine Stunde lang bei 37ºC verdaut.
Die Enzymreaktion wurde 10 Minuten lang bei 65ºC desaktiviert und die DNA wurde mit Ethanol gefällt und durch Zentrifugieren abgetrennt.
50 ng der verdauten Plasmid-DNA wurden dann mit 66 ng des 1,2 kb EcoRI-DNA-Fragments in 25 ul der Ligationsmischung in der Anwesenheit von 1 E T4-DNA-Ligase eine Nacht lang bei 12ºC ligiert.
20 ul der Ligationsmischung wurden für die Transformierung von 200 ul kompetenter E. coli JM103- Zellen (Maniatis, 1982) verwendet. Die Transformanten wurden anschließend auf LB-Agarplatten mit einem Zusatz von 50 γ/ul Ampicillin, 40 γ/ml X-Gel und 125 γ/ml IPTG 18 Stunden lang bei 37ºC selektiert.
Dies ergab 24 positive Klone, von denen 17 die erwünschten rekombinanten Plasmide enthielten.
Eines dieser Plasmide, das mit pSM 281 bezeichnet wurde, wurde anschließend aus den positiven Klonen mittels einer Schnellextraktion extrahiert.

C) Sequenzierung von pSM 281

Das rekombinante Plasmid pSM 281 wurde nach der Methode von Sanger et al. (1977) (P.N.A.S. 74, 5463) mittels der von Strauss et al. (Anal. Biochem. 154, 553 (1986)) beschriebenen Strategie der aufeinanderfolgenden Primer sequenziert. Die als Primer verwendeten Oligonukleotide wurden mittels eines automatischen 1 Plus DNA Synthesiser-Systems (Beckman) synthetisiert.
Die Sequenzierungsreaktionen wurden nach dem Standard-Protokoll von Boehringer anhand des denaturierten Plasmids unter Verwendung eines pUC-Sequenzierungsbestecks mit α [P³²] dATP als Tracer durchgeführt.
Für die Trennung mittels Elektrophorese wurde ein Macrophor-Sequenzierungssystem (LKB) verwendet.
Das auf diese Weise sequenzierte gesamte 1,2 kb Fragment bestand aus 375 Basen des Cosmids pHC79 und 844 Basen des STX-Gens (Abbildung 1).
Wie in Abbildung 3 dargestellt, weist die Aminosäuresequenz des STX-Genprodukts eine beachtliche Ähnlichkeit zum Produkt des ST2-Gens auf.

Genomanalyse

Die chromosomale DNA von B. pertussis 165 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert und die DNA- Abschnitte wurden getrennt mit einer Reihe von Enzymen verdaut.
In der Praxis wurden 1,5 ug chromosomale DNA mit jeweils 15 E der Enzyme Stul, SphI, SmaI, PvuII, PstI, EcoRI und BamHI in 20 ml Verdauungsmischung 3 Stunden lang bei 37ºC behandelt.
Die Mischungen wurden anschließend auf 0,8 prozentiges Agarosegel aufgetragen und 3-4 Stunden bei 100 V laufen gelassen.
Die Banden der chromosomalen DNA wurden anschließend auf Nitrocellulosefilter übertragen und getrennt, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit den Proben 1 und 4 hybridisiert.
Es wurde keine einzige Bande identifiziert, die zur Hybridisierung mit beiden Proben befähigt war.
Dies zeigt, daß diese beiden Gene sich nicht in einem einzigen Operon befanden oder nahe aneinander angeordnet waren, sondern daß sich zwischen ihnen ein Mindestabstand von einigen Kilobasen befinden muß.
Diese Beobachtung wird dadurch bestätigt, daß in der Genbibliothek von B. pertussis kein Cosmid existiert, das beide Gene enthält.

Claims

1. Ein aus der chromosomalen DNA eines Stammes von Bordetella pertussis isoliertes und für eine neue Pili-Untereinheit codierendes Gen mit der nachstehenden Nukleotidsequenz (I):

2. Gen nach Anspruch 1, worin die Pili-Untereinheit durch die nachfolgende Aminosäuresequenz (II) codiert ist:

3. Strukturgen, das für die reife, in dem Gen nach Anspruch 1 enthaltene Pili-Untereinheit codiert, mit nachstehender Nukleotidsequenz (III):

4. Strukturgen nach Anspruch 3, worin die reife Pili-Untereinheit die nachfolgende Aminosauresequenz (IV) aufweist:

5. Chromosomales, aus einem Stamm von Bordetella pertussis isoliertes, das Gen nach Anspruch 1 enthaltendes DNA-Fragment.

6. Chromosomales DNA-Fragment nach Anspruch 5 mit der in Figur 1 gezeigten Nukleotidsequenz.

7. Rekombinantes, durch Verbindung eines Klonierungsvektors mit dem Gen nach Anspruch 1 oder 2 produziertes DNA-Molekül.

8. Rekombinantes, durch Verbindung eines Klonierungsvektors mit dem Strukturgen nach Anspruch 3 oder 4 produziertes DNA-Molekül.

9. Rekombinantes, durch Verbindung eines Klonierungsvektors mit dem chromosomalen DNA-Fragment nach Anspruch 5 oder 6 produziertes DNA-Molekül.

10. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 7-9, worin der Vektor ein Expressionsplasmid für Bakterien oder Hefe ist.

11. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 10, worin das Plasmid pUC12 ist.

12. Rekombinantes DNA-Molekül pSM 281 nach Anspruch 11, worin das Plasmid an das chromosomale DNA-Fragment nach Anspruch 5 oder 6 gebunden ist.

13. Ein durch ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 7-12 transformierter, aus E.coli, Bacillus und Hefen ausgewählter Mikroorganismus.

14. Mikroorganismus Escherichia coli JM 103 (pSM 281) ATCC 67572 nach Anspruch 13.

15. Verwendung von immunoiogisch-aktiven, synthetischen Peptiden mit einer Aminosäuresequenz, die mit jener der durch das Gen nach Anspruch 2 codierten Pili-Untereinheit von Bordetella pertussis identisch ist, zur Herstellung einer zellfreien Vakzine gegen durch Bordetella pertussis beim Menschen verursachte Infektionen.