HU219819B - Izolált polinukleotidok, ezeket tartalmazó Bordetella bronchiseptica törzs, és Bordetella bronchiseptica elleni vakcina - Google Patents
Izolált polinukleotidok, ezeket tartalmazó Bordetella bronchiseptica törzs, és Bordetella bronchiseptica elleni vakcina Download PDFInfo
- Publication number
- HU219819B HU219819B HU9500491A HU9500491A HU219819B HU 219819 B HU219819 B HU 219819B HU 9500491 A HU9500491 A HU 9500491A HU 9500491 A HU9500491 A HU 9500491A HU 219819 B HU219819 B HU 219819B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- thr
- bordetella bronchiseptica
- leu
- gly
- strain
- Prior art date
Links
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 title claims abstract description 88
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 20
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 20
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 20
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 17
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- UTPGRZGMQVAYAA-UHFFFAOYSA-N 4-fluoro-n-methyl-n-[4-[6-(methylamino)pyrimidin-4-yl]-1,3-thiazol-2-yl]benzamide Chemical compound C1=NC(NC)=CC(C=2N=C(SC=2)N(C)C(=O)C=2C=CC(F)=CC=2)=N1 UTPGRZGMQVAYAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 13
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 12
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 12
- 101100120321 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) fimX gene Proteins 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 101150033489 fimX gene Proteins 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 7
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 6
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 6
- 241000588851 Bordetella avium Species 0.000 description 5
- 101100446841 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) fim2 gene Proteins 0.000 description 5
- GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[NH3+])CC1=CC=CC=C1 GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 4
- YBKKLDBBPFIXBQ-MBLNEYKQSA-N Ile-Thr-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)O)N YBKKLDBBPFIXBQ-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 4
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 4
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N Tyr-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 4
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 4
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 description 4
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 3
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N Leu-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 3
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 3
- GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N Pro-Thr-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 3
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 3
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AMXMBCAXAZUCFA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- AUEJLPRZGVVDNU-STQMWFEESA-N Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 108010014614 prolyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- 201000008283 Atrophic Rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 101100446842 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) fim3 gene Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- CBOVGULVQSVMPT-CIUDSAMLSA-N Glu-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CBOVGULVQSVMPT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- CQAHWYDHKUWYIX-YUMQZZPRSA-N Glu-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O CQAHWYDHKUWYIX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- CAQXJMUDOLSBPF-SUSMZKCASA-N Glu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAQXJMUDOLSBPF-SUSMZKCASA-N 0.000 description 2
- DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N Gly-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N Gly-Glu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 2
- GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N Gly-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N Gly-Tyr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 2
- WECYRWOMWSCWNX-XUXIUFHCSA-N Ile-Arg-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WECYRWOMWSCWNX-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- PHIXPNQDGGILMP-YVNDNENWSA-N Ile-Glu-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N PHIXPNQDGGILMP-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- JZNVOBUNTWNZPW-GHCJXIJMSA-N Ile-Ser-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N JZNVOBUNTWNZPW-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- NSPNUMNLZNOPAQ-SJWGOKEGSA-N Ile-Tyr-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N NSPNUMNLZNOPAQ-SJWGOKEGSA-N 0.000 description 2
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- PWPBLZXWFXJFHE-RHYQMDGZSA-N Leu-Pro-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PWPBLZXWFXJFHE-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- YDDDRTIPNTWGIG-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YDDDRTIPNTWGIG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- OBZHNHBAAVEWKI-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OBZHNHBAAVEWKI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 2
- AGYXCMYVTBYGCT-ULQDDVLXSA-N Phe-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AGYXCMYVTBYGCT-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- WGXOKDLDIWSOCV-MELADBBJSA-N Phe-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O WGXOKDLDIWSOCV-MELADBBJSA-N 0.000 description 2
- CSDMCMITJLKBAH-SOUVJXGZSA-N Phe-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O CSDMCMITJLKBAH-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 2
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N Pro-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 206010039088 Rhinitis atrophic Diseases 0.000 description 2
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- DINQYZRMXGWWTG-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DINQYZRMXGWWTG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- TZKPNGDGUVREEB-FOHZUACHSA-N Thr-Asn-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O TZKPNGDGUVREEB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 2
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N Thr-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KBBRNEDOYWMIJP-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 2
- XTCNBOBTROGWMW-RWRJDSDZSA-N Thr-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N XTCNBOBTROGWMW-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 2
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 2
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 2
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 2
- QPOUERMDWKKZEG-HJPIBITLSA-N Tyr-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QPOUERMDWKKZEG-HJPIBITLSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010018691 arginyl-threonyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- VWWKKDNCCLAGRM-GVXVVHGQSA-N (2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VWWKKDNCCLAGRM-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEQBRULPNIVQPP-UHFFFAOYSA-N 2-[3,5-bis(1-phenylbenzimidazol-2-yl)phenyl]-1-phenylbenzimidazole Chemical compound C1=CC=CC=C1N1C2=CC=CC=C2N=C1C1=CC(C=2N(C3=CC=CC=C3N=2)C=2C=CC=CC=2)=CC(C=2N(C3=CC=CC=C3N=2)C=2C=CC=CC=2)=C1 GEQBRULPNIVQPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPOBTYJRKAJERX-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-n-[(3-ethyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)amino]-1,3-benzothiazol-2-imine Chemical compound S1C2=CC=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC=CC=C2N1CC CPOBTYJRKAJERX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPJURNPNPDQYSY-UHFFFAOYSA-N 5-(2-methyloctan-2-yl)-2-(3-methyl-6-prop-1-en-2-ylcyclohex-2-en-1-yl)benzene-1,3-diol Chemical compound OC1=CC(C(C)(C)CCCCCC)=CC(O)=C1C1C(C(C)=C)CCC(C)=C1 MPJURNPNPDQYSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N Arg-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WESHVRNMNFMVBE-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Asp Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)CN=C(N)N WESHVRNMNFMVBE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N Arg-Thr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N Asn-Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XSGBIBGAMKTHMY-WHFBIAKZSA-N Asn-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XSGBIBGAMKTHMY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N Asn-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- MQLZLIYPFDIDMZ-HAFWLYHUSA-N Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- ZMUQQMGITUJQTI-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZMUQQMGITUJQTI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N Asp-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- RQHLMGCXCZUOGT-ZPFDUUQYSA-N Asp-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RQHLMGCXCZUOGT-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- CJUKAWUWBZCTDQ-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-Lys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O CJUKAWUWBZCTDQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N Asp-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- AWPWHMVCSISSQK-QWRGUYRKSA-N Asp-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O AWPWHMVCSISSQK-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000018150 Bordetella infection Diseases 0.000 description 1
- 241000589893 Brachyspira hyodysenteriae Species 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101100426323 Chlorobium chlorochromatii (strain CaD3) trpA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 101710110818 Dermonecrotic toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- OWVURWCRZZMAOZ-XHNCKOQMSA-N Glu-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OWVURWCRZZMAOZ-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- BGVYNAQWHSTTSP-BYULHYEWSA-N Gly-Asn-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BGVYNAQWHSTTSP-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N Gly-Asp-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SCWYHUQOOFRVHP-MBLNEYKQSA-N Gly-Ile-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SCWYHUQOOFRVHP-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N Gly-Thr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HUFUVTYGPOUCBN-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- ATXGFMOBVKSOMK-PEDHHIEDSA-N Ile-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N ATXGFMOBVKSOMK-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 1
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N Ile-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- CUXRXAIAVYLVFD-ULQDDVLXSA-N Leu-Arg-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CUXRXAIAVYLVFD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DBVWMYGBVFCRBE-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DBVWMYGBVFCRBE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- YRRCOJOXAJNSAX-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N YRRCOJOXAJNSAX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- IZJGPPIGYTVXLB-FQUUOJAGSA-N Lys-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IZJGPPIGYTVXLB-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 1
- VUTWYNQUSJWBHO-BZSNNMDCSA-N Lys-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O VUTWYNQUSJWBHO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- SQXZLVXQXWILKW-KKUMJFAQSA-N Lys-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQXZLVXQXWILKW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- YCJCEMKOZOYBEF-OEAJRASXSA-N Lys-Thr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YCJCEMKOZOYBEF-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N Phe-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 JQOHKCDMINQZRV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FEPSEIDIPBMIOS-QXEWZRGKSA-N Pro-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 FEPSEIDIPBMIOS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- WHNJMTHJGCEKGA-ULQDDVLXSA-N Pro-Phe-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WHNJMTHJGCEKGA-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N Ser-Gly-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WGDYNRCOQRERLZ-KKUMJFAQSA-N Ser-Lys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)N WGDYNRCOQRERLZ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 101710089230 Serotype 3 fimbrial subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N Thr-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N Thr-Cys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N Thr-Gly-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- OLFOOYQTTQSSRK-UNQGMJICSA-N Thr-Pro-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OLFOOYQTTQSSRK-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- HUPLKEHTTQBXSC-YJRXYDGGSA-N Thr-Ser-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HUPLKEHTTQBXSC-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- 241000130764 Tinea Species 0.000 description 1
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MNMYOSZWCKYEDI-JRQIVUDYSA-N Tyr-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MNMYOSZWCKYEDI-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N Tyr-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- AUZADXNWQMBZOO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Pro-Arg Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AUZADXNWQMBZOO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- FKNHDDTXBWMZIR-GEMLJDPKSA-N acetic acid;(2s)-1-[(2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(O)=O.SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O FKNHDDTXBWMZIR-GEMLJDPKSA-N 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N barbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=O)N1 HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- -1 fimbriae Proteins 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 108010009932 leucyl-alanyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- DGUKXCVHOUQPPA-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid tungsten Chemical compound [W].OP(O)(O)=O DGUKXCVHOUQPPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- BZQWDGWNCKYCHR-DYNCTKRQSA-M sodium;(6r,7r)-3-[[[5-(dimethylamino)naphthalen-1-yl]sulfonylamino]methyl]-8-oxo-7-[(2-thiophen-2-ylacetyl)amino]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)CNS(=O)(=O)C1=C2C=CC=C(C2=CC=C1)N(C)C)C([O-])=O)C(=O)CC1=CC=CS1 BZQWDGWNCKYCHR-DYNCTKRQSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- MLGCXEBRWGEOQX-UHFFFAOYSA-N tetradifon Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl MLGCXEBRWGEOQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108010071635 tyrosyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Abstract
A találmány tárgya Bordetella bronchiseptica egy rojtfehérjéjénekimmunológiai tulajdonságaival rendelkező poli- peptidet kódoló izoláltpolinukleotid, mely a SEQ. ID. NO. 3 vagy SEQ. ID. NO. 5 szerintinukleotidszekvenciával rendelkezik, továbbá a találmány tárgya egyvektort tartalmazó izolált polinukleotid, transzformált Bordetellabronchiseptica törzs, és Bordetella bronchiseptica fertőzés ellenimmunológiai válasz létrehozására képes vakcina, mely egy semlegeshordozót, valamint egy transzformált Bordetella bronchiseptica törzsettartalmaz. ŕ
Description
(54) Izolált polinukleotidok, ezeket tartalmazó Bordetella bronchiseptica törzs, és Bordetella bronchiseptica elleni vakcina
KIVONAT
A találmány tárgya Bordetella bronchiseptica egy rojtfehéijéjének immunológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptidet kódoló izolált polinukleotid, mely a SEQ. ID. NO. 3 vagy SEQ. ID. NO. 5 szerinti nukleotidszekvenciával rendelkezik, továbbá a találmány tárgya egy vektort tartalmazó izolált polinukleotid, transzformált Bordetella bronchiseptica törzs, és Bordetella bronchiseptica fertőzés ellen immunológiai válasz létrehozására képes vakcina, mely egy semleges hordozót, valamint egy transzformált Bordetella bronchiseptica törzset tartalmaz.
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 7 lap ábra)
HU 219 819 B
HU 219 819 Β
A jelen találmány tárgya Bordetella bronchiseptica fertőzés ellen főleg kutyákban védelmet nyújtó vakcina, továbbá új izolált polinukleotidok és ezeket tartalmazó transzformált Bordetella bronchiseptica törzs, mely Bordetella bronchiseptica rojtfehérje tulajdonságaival rendelkező polipeptid expresszálására képes.
A Bordetella nemzetség négy fajból áll: Bordetella pertussis (B. pertussis), Bordetella parapertussis (B. parapertussis), Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) és Bordetella avium (B. avium). A Bordetella-k kisméretű, Gram-negatív kokkobacillusok, obiigát aerobok, gyakran bipolárisan festődnek, és citokróm-oxidáz-pozitívak. A Bordet-Gendu táptalajon szaporodó telepeket hemolíziszóna veszi körül, a Bordetella aviumot kivéve.
A Bordetella bronchiseptica főleg a laboratóriumi, házi- és vadon élő állatokra patogén, emberre csak elvétve. A nyulak, aranyhörcsögök, patkányok, főemlősök (az embert kivéve), kutyák, sertések, macskák, lovak és rókák gyakran járványos fertőzések áldozatai. A Bordetella bronchiseptica leginkább kennelköhögést okoz a kutyáknál, illetve atrófiás rinítiszt a malacoknál. A kutyákban a fertőzés folyamata erősen korlátozódik a légcsőhöz és a hörgőkhöz tartozó részekre, jellemzője a légcső-epitéliumban való szaporodás, a csillószőrökhöz való tapadás után. A betegség legsúlyosabb tünetei a nagy mennyiségű légcsőnyálka felhalmozódása, a hányás, tüdőléziók és súlyveszteség. A kutyák szárazon, erősen, fájdalmasan szaggatóan köhögnek. A malacok Bordetella bronchisepticaval való fertőzésére az οσkagylócsont atrófíája, az orr deformálódása, tüdőgyulladás és csökkent súlynövekedés jellemző. Jóllehet teljesen világosnak tűnt, hogy a Bordetella bronchiseptica az atrófiás rinítisz fertőzés okozója, pillanatnyilag jelentős számú bizonyíték utal arra, hogy a Pasteurella múltoddá a fő kórokozó, és a Bordetella bronchiseptica feltehetőleg indukáló vagy opportunista szerepet játszik csak. A klinikai tünetek nélküli hordozóállapotok száma a jelentések szerint magas a kutyáknál, sertéseknél és nyulaknál.
Számos virulenciafaktort azonosítottak a Bordetella-nál. Ezek közé tartozik: a pertussis toxin, szálas hemagglutinin, fimbriumok, adenilát-cikláz, dermonekrotikus toxin, légcsőtoxin és hemolizin. Ezek a virulenciafaktorok nem expresszálódnak az összes fajban, például a Bordetella pertussis-ban a pertussis toxint kódoló gén csendes génként van jelen a Bordetella parapertussis és a Bordetella bronchiseptica kromoszómáján. Ezek mellett a virulenciafaktorok mellett valószínűleg még más, ez idáig azonosítatlan faktorok is részt vesznek a baktériumok patogenitásának kialakításában.
A Bordetella fertőzések a légzőszerv csillós sejtjeinél indulnak. A baktérium megtapadása előfeltétele a fertőzésnek, mivel másképpen a csillék öblítőhatása eltávolítja a baktériumokat a légcsőből más részecskékkel együtt. A Bordetella-nak a csillós sejtekhez való tapadását szerológiailag eltérő rojtok és fonalas hemagglutinin (FHA) közvetíti (azonban az FHA nem található meg a Bordetella avium-ban). A rojtok hajszálszerű szerkezetek, amelyek azonos fehérjealegységekből épülnek fel, és a baktériumsejt felszínéről nyúlnak ki. Az FHA egy felszínhez kötött fehérje, amely az extracelluláris környezetbe is szekretálódik, és képes számos különböző eritrocitát agglutinálni. Mind a rojtok, mind az FHA expresszióját a bvg-lokusz szabályozza, jóllehet a rojt alegység gének expresszióját a Bordetella pertussis-ban befolyásolja még egy 13-15 citozinból álló szakasz hossza a rojt alegység gének előtt. Petroni et al. [EP 324 124] B. pertussis fimx és fm2 protein alegységek nukleotid- és aminosavszekvenciáit ismerteti, míg Cuzzoni et al. [EP 0419997] a fim3 alegységek ugyanezen szekvenciáit írja le. Mooi et al. [Microbial Pathogenesis, Vol. 2 (1987)] olyan technikákat ismertet, melyek felhasználhatók Bordetella specieszekből származó rojtfehéije-alegységek jellemzésére. Mindegyik virulens Bordetella tapadási faktorokat expresszál a felszínén, míg az avirulens törzsek ezt nem expresszálják. Mivel ezek az adhezinek szükségesek a betegség beindításához, ezért a vakcinakészítéshez vonzó lehetőséget kínálnak.
A jelen találmány célja Bordetella bronchiseptica fertőzés elleni rekombináns DNS-vakcina létrehozása volt. A kutatást az adhéziós faktorokra koncentráltuk, mivel az adhézió megakadályozása az adhéziós faktorok elleni immunválasz eredményeképpen megakadályozzák a fertőzést. A Bordetella bronchiseptica-ban számos szerológiai rojt és FHA felelős a baktériumnak a csillós légcsövi epiteliális sejtekhez való tapadásáért. Ha a gazdaszervezet immunreakcióval válaszol a mikrobiális szervezet adhéziós faktoraival szemben, akkor nem lehetséges a kolonizáció. A baktériumok elpusztulnak, mielőtt akármennyi toxint termelnének, ezért nem fejlődik ki klinikai tünet.
Egy, a találmány szerinti, a Bordetella bronchiseptica kolonizációját megakadályozó vakcina előnyösen annyi komponenst tartalmaz, amennyi a tapadáshoz szükséges. Egy rekombináns vakcinát alegységvakcinaként lehet előállítani. Az azonban nem ismert, hogy mennyi szerológiailag eltérő rojt keletkezik, és a tapadásban mi az egyes faktorok (rojtok és FHA) szerepe. A vakcina kifejlesztéséhez külön meg kell vizsgálni az összes komponens hozzájárulását a tapadáshoz. A számunkra érdekes fehéijék alegységvakcinaként használhatók egy megfelelő mikroorganizmusban nagy mennyiségben való előállítás után.
A jelen találmány szerint a Bordetella bronchiseptica tapadási faktorait kódoló három alegység génjét izoláljuk és jellemezzük.
A Bordetella bronchiseptica rojtfehérje- vagy polipeptidfragmentek lényegében tiszta készítmények (rojtpolipeptidek), a SEQ. ID NO. 2, 4 vagy 6 aminosavszekvenciák közül egynek legalább egy részét tartalmazzák.
A jelen találmány tárgya egy polinukleotid, amely a Bordetella bronchiseptica rojtfehérje immunológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptidet kódol, és amely a SEQ. ID. NO. 3 vagy 5 szerinti nukleotidszekvenciával rendelkezik. Ezekbe a szekvenciákba beleértjük a kódok degeneráltságából származó szekvenciákat is. A találmány tárgya továbbá izolált polinukleotidok, az
HU 219 819 Β ezt tartalmazó B. bronchiseptica törzs és B. bronchiseptica elleni vakcina.
Az ezekből származó rojtfehérjék és polipeptidek képesek immunválaszt kiváltani Bordetella bronchiseptica ellen.
A kis antigének gyakran nem használhatók immunogénekként. Ennélfogva a rojtfehérjéket vagy polipeptideket elő lehet állítani homopolimerek formájában (több azonos rojtfehéqe egymáshoz kapcsolva), illetve heteropolimerek formájában (egy vagy több rojtpolipeptid egy vagy több eltérő rojtpolipeptidhez kapcsolva, illetve egy vagy több különböző, a Bordetella bronchisepticara vagy más patogénre jellemző polipeptidhez kapcsolva), illetve kapcsolhatjuk egy vagy több más vegyülethez, azzal a céllal, hogy fokozzuk az immunogenitásukat.
A jelen találmány szerint a rojtpolipeptid, az előzőkben említett bármely módosítás szerint rekombináns DNS-technikával állítható elő, illetve előállítható szintetikus módszerekkel, azaz például homogén vagy szilárd fázisú polipeptidszintézissel.
Megfelelően immunogén rojtpolipeptidek adott aminosavszekvenciáját származtathatjuk a SEQ. ID. NO. 2,4 vagy 6 aminosavszekvenciákból, és adott esetben a rojtfehérje térszerkezetéből.
Számos különböző eljárást fejlesztettek ki azzal a céllal, hogy lokalizálni lehessen a fehérjéken az immunológiailag fontos epitopokat. A kombinált előrejelzések együttesen jól megjósolják az antigénhelyeket.
Megfelelő rojtpolipeptidek szelektálhatok a rojtfehérje leghidrofilebb részeiből, például Hopp és Woods technikájának alkalmazásával [T. P. Hopp and K. R. Woods, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 3824-3828 (1981)]. Egy másik megfelelő módszert ilyen polipeptidek szelektálására Chou és Fasman írt le [P. C. Chou and G. D. Fasman, Advances in Enzymology, 47, 45-148 (1987)].
Emellett számos további algoritmus használható a Bordetella bronchiseptica rojtfehéije antigéntulajdonságok szempontjából lényeges régióinak végleges megjósolására, ilyen például a polipeptidlánc flexibilitása [P. A. Karplus and G. E. Schultz, Naturwissenschaften, 72, 212-213 (1985)], a Bordetella bronchiseptica rojtfehérje-béta-kanyar valószínűségi profilja P. Y. Chou és G. D. Fasman szerint [Biophys. J., 26, 367-381 (1979)], a Bordetella bronchiseptica rojtfehéijék szekvenciája háromdimenziós konformációinak valószínűségi profiljai Gascuel, O. és J. L. Golmard szerint [CABIOS, 4, 357-365 (1988)], a Bordetella bronchiseptica rojtfehérje-szekvencia szekunder struktúrájának jóslása J. Novotny és C. Auffray szerint [Nucleic Acids Research, 12, 243-255 (1984)].
A megfelelő epitopok lokalizációjára további információ kapható a PEPSCAN módszer alkalmazásával, amelyet Geysen és Meloen fejlesztett ki [Η. M. Geysen, R. H. Meloen and S. J. Barteling, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 37(13), 3998-4002 (1984)]. Ebben a módszerben elég hosszú szintetikus peptideket alkalmaznak arra, hogy enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatban reagáljanak. Ezeket a peptideket egy adott DNS-szekvencia alapján szintetizáljuk. Ezeket az a tény jellemzi, hogy az első peptid az
1- 9-es aminosavakat tartalmazza, a második peptid a
2- 10-es aminosavakat tartalmazza stb. Minden egyes pepiidnek megvizsgálják a reaktivitását antiszérumokkal vagy monoklonális antitestekkel. A reaktív peptideknek azután egy immunogén epitopot kell képviselniük.
Emellett ahhoz, hogy azonosítsuk az immunológiailag reagáló epitopokat (és hogy korreláljuk ezeket a reagáló peptideket a rojtfehérje fizikai térképével) a rojtfehérjegénből származó DNS-fragmenteket megfelelő plazmidokban expresszáltathatjuk, ilyenek például a pEX plazmidok [K. Stanley and J. P. Luzio, EMBO J., 3, 1429-1434 (1984); J. G. Kusters, E. J. Jager and B. A. M. Van dér Zeijst, Nucleic Acids Research, 17, 8007 (1989)]. Ebben a rendszerben a heterológ expresszió a cro-p-galaktozidáz hibrid fehérje C-terminális extenziójának szintézisét eredményezi. A rojtfehérje DNS-szekvenciákban levő restrikciós endonukleáz hasítási helyek használhatók a rojtfehérjegén fragmentjeinek előállítására, a pEX plazmidokba való beépítés céljából. A pEX kiónokat, amelyek a rojtfehérje különböző átfedőrégióiból származó átfedőrégiókat szintetizálnak, használjuk a további jellemzéshez. A pEX által kódolt rojtfehérjeffagmenteket tisztítjuk, poliakrilamidgélelektroforézissel frakcionáljuk, majd nitro-cellulózmembránokra blottoljuk. Ezeket a membránokat azután reagáltatjuk Bordetella bronchiseptica ellen immunis sertésekből vagy kutyákból származó szérumokkal reagáltatjuk. Csak az immunreaktív epitopokat tartalmazó ffagmentek reagálnak ezekkel a szérumokkal. Az epitopok minimális hosszának felvázolásához a reaktív kiónok DNS-inszertjeit Exonuclease III emésztéssel progresszíven megrövidíthetjük, illetve a rojtfehérje kis átfedőrészeit kódoló szintetikus oligonukleotidokat klónozhatjuk [J. G. Kusters, E. J. Jager, G. Koch, J. A. Lenstra, W. P. A. Posthumus, R. H. Meloen and B. A. M. Van dér Zeijst, J. Immunoi., 143, 2692-2698 (1989)]. Az epitopokat azután megvizsgálhatjuk, hogy van-e védőhatásuk.
A jelen találmány egy adott megvalósítási módja szerint egy rojtfehérje-specifikus polipeptidet állítunk elő egy olyan polinukleotid expressziójával, amely a SEQ. ID. NO. 1, 3 és 5 polinukleotidoknak legalább egy részét tartalmazza, illetve egy rekombináns polinukleotidnak részét képezi. A rekombináns polinukleotid előnyösen egy olyan vektoron alapulhat, amely egy Bordetella bronchiseptica-specifikus polinukleotidfragmentet tartalmaz. A megfelelő vektorok lehetnek plazmidok, bakteriofágok, kozmidok, vírusok, minikromoszómák vagy stabilan integrálódó vektorok; ez utóbbiak főleg növényi vagy állati sejtek esetében. Ezek a vektorok általában képesek az önálló replikációra, kivéve a stabilan integrálódó vektorokat, amelyek a gazdasejt genetikai anyagába épülnek be, és a gazdasejt genetikai anyagával együtt replikálódnak. A megfelelő gazdasejtek lehetnek prokarióták vagy eukarióták, azaz baktériumok, élesztők, mikoplazmák, algák, növényi sejtek vagy állati sejtek; a növényi sejteket vagy állati sejteket in vitro körülmények között lehet szaporítani,
HU219 819B illetve részét képezhetik egy egész növénynek vagy állatnak. A rekombináns polinukleotid inszertként tartalmazhat egy teljes polinukleotidot, amely a rostfehéijét kódolja, illetve annak egy fragmentjét. Az inszert tartalmazhat egyetlen kódolószekvenciát, illetve ugyanannak a kódolószekvenciának több kópiáját, vagy egy hibrid polinukleotidot, amely legalább egy rostfehéijét kódoló szekvenciát tartalmaz, valamint legalább egy második szekvenciát, azaz például a rojtfehérje-kódoló szekvencia egy másik részét, vagy egy polinukleotidot, amely egy másik patogénre jellemző fehérjét kódol, illetve egy semleges fehérjét, amely hordozóként működik, legalábbis egy kisméretű rojtfehérje esetében.
A fenti megvalósítási mód egy speciális esetében a találmány tárgyai virális vektorokban levő rekombináns polinukleotidok, amelyek közvetlenül felhasználhatók úgynevezett vektorvakcinaként. Az erre a célra használható vírusoknak képeseknek kell lenniük arra, hogy szaporodjanak az immunizálandó állatokban, azaz kutyákban és/vagy sertésekben. Ezeknek a vírusoknak továbbá tartalmazniuk kell egy olyan genomiális régiót, amely alkalmas egy idegen gén beépítésére (azaz például a Bordetella bronchiseptica rojtfehérjét vagy polipeptidet kódoló gén), amelyet szintén expresszálni kell a vakcináit állatban. Az erre a célra megfelelő vírusok például az enterális vírusok, mint például bizonyos adenovírusok.
Amint a fentiekben említettük, a találmány szerinti fehéijék és polipeptidek, valamint rekombináns polinukleotidok jól használhatók vakcinák készítésében. Tehát ezek a vakcinák is részét képezik a találmánynak.
A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyai bakteriális vektorvakcinák. Eszerint kutyákat és/vagy sertéseket kolonizálni képes baktériumokat transzformáljuk azzal a céllal, hogy képessé tegyük őket arra, hogy expresszáljanak egy rojtfehéijét vagy rojtpolipeptidet oly módon, hogy az Bordetella bronchiseptica ellen immunválaszt váltson ki. Az erre a célra megfelelő baktérium például a Salmonella vagy Bordetella.
Egy, a találmány szerinti vakcina tartalmazhat kiegészítő vakcinakomponenseket, azaz például hordozókat, puffereket, stabilizálószereket, oldatba vivő anyagokat, adjuvánsokat és konzerválószereket. Ezek a vakcinák előnyösen fagyasztva szárított termékek, amelyeket felhasználás előtt megfelelő folyadék (víz, puffer) hozzáadásával regenerálni kell.
A vakcina alkalmazható orálisan, intranazálisan vagy intramuszkulárisan.
A vakcina emellett tartalmazhat más immunogéneket az immunizálandó állatok (kutyák és sertések) számára, azaz például a vírusokra (pszeudorabiesz vírus, influenzavírus, átvihető gasztroenteritisz vírus, parvovírus, járványos sertés-hasmenésvírus, sertés-koleravírus) jellemző immunogén anyagokat, illetve a mikoplazmákra (Mycoplasma hyopneumoniae és Mycoplasma lyorhinis) jellemző immunogén anyagot, vagy baktériumokra (Escherichia coli, Leptospira, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcussuis, Treponema hyodysenteriae) jellemző immunogén anyagokat.
Ábrák leírása:
1. ábra bemutat egy konstrukciót, melyet B. bronchisepticaban a génhelyettesítésre használunk.
2. ábra bemutatja, hogy a fimX gén magas szinten expresszálódik a B. bronchisepticaban.
3. ábra bemutatja a B. bronchiseptica emésztett kromoszomális DNS-ének hibridizációját az fxEv próbával.
4. ábra bemutatja a B. b. emésztett kromoszomális
DNS-ének hibridizációját f3SE próbával.
5. ábra bemutatja a kanamicingén ligálását a pIVB3-417 plazmidba, amely a pIVB3-418 kiónt eredményezi és az új plazmid hibridizálását az f2Ev és f2SE próbákkal.
6A. és 6B. ábra bemutatja a rekombináns törzsek hibridizációs mintázatát.
6C. és 6D. ábra a fim3 és fim2 gént tartalmazó DNSfragmentumok hibridizációs jeleit mutatja be.
7A. és 7B. ábra a rekombináns törzsek hibridizációmintázatát mutatja be.
7C. ábra bemutatja, hogy a kanamicingén jelen van az összes izolált fim2 rekombináns törzsben.
7D. ábra bemutatja, hogy a génhelyettesítés csak a BbF2~ törzsben történt.
A találmányt az alábbi példákkal jellemezzük.
1. példa
A FIMX gén jellemzése
Anyagok és módszerek
A használt baktériumtörzseket és növekedési körülményeket az alábbiakban adjuk meg. Az összes használt baktériumtörzset az 1. táblázatban soroljuk fel.
1. táblázat
TÖRZS | EREDET | FORRÁS |
Bordetella bronchiseptica 401. törzs | 685. számú kutya klinikai izolátum | J. M. Musser, New York |
Bordetella bronchiseptica BbfX | fimX negatív törzs, a 401. származéka | P. Η. M. Savelkoul, Utrecht |
Bordetella pertussis | humán klinikai izolátum | F. R. Mooi, Bilthoven |
Bordetella avium 128. törzs | pulyka klinikai izolátum (NSZK) 383 78(10) | K.-H. Hinz, Hannover |
Escherichia coli PC2495 K12 | hsdS, recA, JM101 származék | Netherlands Culture Collections of Microorganisms |
Mindegyik Bordetella törzset Bordet-Gengu agáron szaporítjuk (Difco Laboratories, Detroit, MI), amelyet 1% glicerinnel és 20% fibrinmentesített birkavérrel egészítettünk ki, vagy Tryptose Phosphate Brothban (TPBI) (Difco Laboratories, Detroit, MI). A virulenciagének expressziójának elnyomására a táptalajokat 20 mmol/1 MgSO4-gyel egészítjük ki. A Bordetella
HU 219 819 Β bronchiseptica 401-es törzset használjuk DNS készítésére. Az Escherichia coli PC2495 törzset használjuk a Bluescript vektor (Stratagene) és származékai szaporítására. A PC2495-ÖS törzset Lureano-Bertoni (LB) táplevesen vagy LB-agaron szaporítjuk. A DNS-inszertet tartalmazó plazmidokat hordozó törzsek azonosítására ampicillint (50-100 pg/ml), 50 pg/ml 5-bróm-4-klór3-indolil-P-D-galaktopiranozidot (X-gal) és 20 pg/ml izopropil-p-D-tiogalaktopiranozidot (IPTG) használunk. A baktériumtenyészeteket 16-24 óra hosszat 37 °C-on szaporítjuk.
Rekombináns DNS-módszerek
Kromoszomális DNS-t Bordetella törzsekből izolálunk [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)]. Emésztés után a DNS elektroforézisét 1%-os agarózgélben végezzük TAE-pufferben (40 mmol/1 TRIS-acetát, 2 mmol/1 EDTA), amely 1 pg/ml etidium-bromidot tartalmaz. A Geneclean kitet használjuk a DNS-fragmentek agarózgélből való izolálására (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). Az oligonukleotidok végjelzését [gamma32P]dATP-vel végezzük, T4 polinukleotidkináz alkalmazásával [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)]. A hibridizálást 5xSSPE, 5 χ Denhardt-oldat, 0,1% SDS és 100 pg/ml heringsperma DNS-összetételű oldatban végezzük, 55 °C-on.
Southem-blot-elemzés
A Bordetella bronchiseptica 401 törzs kromoszomális DNS-ét tisztítjuk, majd számos restrikciós enzimmel emésztjük. A fragmenteket elektroforézissel választjuk szét, nejlonmembránra visszük át, majd egy, a Bordetella pertussis fimX rojtalegységgénből származó DNS-próbával hibridizáljuk. A hibridizációs jelek alapján számunkra érdekesnek bizonyult DNS-fragmenteket Gene Clean kittel izoláljuk (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). Bluescript vektorba (Stratagene) való ligálás után a kromoszomális DNS-ffagmenteket Escherichia coli PC2495 törzsbe transzformáljuk a CaCl2-módszer alkalmazásával [Dagert, M. and Ehrlich, S. D., Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells, Gene 6, 23-28 (1979)]. A pozitív telepeket hibridizálás alapján azonosítjuk.
Nukleotidszekvencia-meghatározás
Plazmidot a lúgos hidrolízis módszerével izolálunk [H. C. Bimbóim and J. A. Doly, A rapid alkaline extraction procedure fór screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)]. A klónozott inszertek nukleotidszekvenciáját a didezoxi láncterminációs módszerrel határozzuk meg [F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463-5467 (1977)], a T7 polimerázszekvenáló kit (Amersham) alkalmazásával. A DNS-szekvenciaadatok elemzését a PC/Gene programmal végezzük (6,5-ös verzió, Genofit, Heidelberg S. A., Genf, Svájc).
Részleges rosttisztítás
A Bordetella bronchiseptica 401-es törzset Tryptose Phosphate Agáron (Difco Laboratories, Detroit, MI) szaporítjuk. A baktériumokat foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS) mossuk. A baktériumüledéket 15 ml, 4 mol/1 ureával kiegészített, foszfáttal puffereit sóoldatban szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót 30 percre 40 °C-ra tesszük. A baktériumokat centrifugálással (10 perc, 20 000/perc, Beckman JA20 rotor) távolítjuk el a szuszpenzióból. A rojtokat a felülúszóból centrifugálással izoláljuk (16 óra, 40 000/perc, Beckman ultracentrifuga, Ti60 rotor). Az üledéket azután 5 ml foszfáttal puffereit sóoldatban szuszpendáljuk. A fehérje koncentrációját Bicinchonic acid (BCA) vizsgálattal (Pierce Chemical Company, USA) határozzuk meg. A fehérjeelemzést 15%-os SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis rendszerben végezzük.
Eredmények
Szekvenciaelemzés és -illesztés
A Bordetella pertussis fimX génjéből származó BamHI-EcoRI DNS-ffagmentet használjuk próbaként a Bordetella bronchiseptica fim géneket tartalmazó kromoszomális DNS-ffagmentjeinek azonosítására. A Bordetella bronchiseptica egy 1,3 kb méretű PstI DNSfragmentjét, amely hibridizál a fimX próbával, izoláljuk és szekvenáljuk. Ezen a fragmenten megtalálható a teljes fimX gén, beleértve a promoterszekvenciákat is a gén előtt (SEQ. ID. NO. 1).
A teljes fimX gént tartalmazó pIVB 3-420 plazmidot hordozó Escherichia coli PC 2495 baktériumokat Hollandiában, a Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baam-nál helyeztük letétbe, 1992. augusztus 13-án, CBS 364.92 letéti szám alatt.
A Bordetella bronchiseptica fimX gén expressziója
A fimX termékének azonosítására a fimX gén expresszálására képtelen deléciós mutánst készítettünk. Ezt a mutáns törzset génhelyettesítéssel állítjuk elő. Ebből a célból a Bordetella bronchiseptica fimX génjének központi EcoRV fragmentjét egy kanamicingénnel helyettesítjük, és a Bluescript vektorba klónozzuk. Ezt a konstrukciót használjuk Bordetella bronchisepticaban génhelyettesítésre (1. ábra). Egy kanamicinrezisztens törzset azonosítottunk. A törzs nem hibridizál többé az EcoRV fragmenttel. Ebből a mutáns törzsből részlegesen tisztított rojtokat állítottunk elő. A rojtoknak ez a fimX-negatív törzsből való előállítása, összehasonlítva a vad típusú törzsből való előállítással, világosan mutatja, hogy a fimX gén magas szinten expresszálódik a Bordetella bronchisepticaban (2. ábra).
2. példa
A Bordetella bronchiseptica fim2 és fim3 rojtalegység génjeinek jellemzése Anyagok és módszerek
Baktériumtörzsek, plazmidok és szaporítási körülmények
A vad típusú Bordetella bronchiseptica törzset kennelköhögésben szenvedő kutyákból izolálták. Ezt a Dr. J. M. Musser-től kaptuk (685-ös számú törzs) és nálunk a 401-es számot kapta. Ezt a törzset Tryptose
HU 219 819 Β phosphate broth-ban vagy agaron (Difco Laboratories, Detroit, MI) szaporítjuk. A Bordetella pertussis Wellcome 28 törzset [A. Robinson, L. A. E. Ashworth, A. Baskerville, and L. I. Irons, Proceedings of the 4th International Symposium on pertussis, Genf, 1984, Dev. Bioi. Stand., 61, 165-172 (1985)] Bordet-Gengu agaron (Difco Laboratories, Detroit, MI) szaporítjuk. Az avirulens Bordetella bronchiseptica törzs szaporítására használt táptalajt 20 mmol/1 MgSO4-gyel egészítjük ki. Az Escherichia coli KI 2 PC2495 törzset használjuk gazdaszervezetként a pBluescript klónozóvektorhoz. Az Escherichia coli törzset LB agaron vagy LB táplevesen szaporítjuk, 100 pg/ml ampicillinnel, 50 pg/ml X-Gallal és 20 pg/ml IPTG-vel kiegészítve, a klónozott DNSfragmentet tartalmazó rekombináns törzsek azonosítása céljából. Minden baktériumtörzset 16-48 óra hosszat tenyésztünk 37 °C-on.
DNS-izolálás és a nukleotidszekvencia meghatározása
A kromoszomális DNS izolálását Maniatis és munkatársai módszerével végezzük [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)]. A plazmid izolálását Doly és Bimbóim módszerével végezzük [H. C. Bimbóim and J. A. Doly, A rapid alkaline extraction procedure fór screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)]. A kromoszomális DNS-fragmenteket TAE (40 mmol/1 TRIS-acetát, 2 mmol/1 EDTA) agarózgélből izoláljuk, a Gene Clean kit (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla) felhasználásával. A DNS-ífagmenteket pBluescript KSM13+ésM13- (Stratagene, La Jolla, CA) plazmidokba ligáljuk minden klónozási munkához. A nukleotidszekvencia meghatározását T7 polimerázszekvenáló kittel (Amersham) végezzük, Sanger és munkatársai didezoxi terminációs módszerének alkalmazásával [F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson, DNA sequencing with chainterminating inhibitors, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463 - 5467 (1977)]. A DNS-szekvenciaadatok elemzését a PC/Gene programmal végezzük (6.5-ös verzió, Genofit, Heidelberg S. A., Genf, Svájc). A restrikciós enzimeket és a T4 DNS-ligázt a Pharmaciatól vásároljuk, és a gyártó előírásai szerint alkalmazzuk. A plazmidokat az Escherichia coli PC2495 törzsbe Dagert és Ehrlich CaCl2-módszerével transzformáljuk [Dagert, M. and Ehrlich, S. D., Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells, Gene 6, 23-28 (1979)].
Southem-blottolás
A Southem-blottolást Maniatis és munkatársai leírása szerint végezzük [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)].
SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis és immunológiai technikák
Az SDS-PAGE- és Westem-blot-elemzésekhez azonos mennyiségű baktériumot használunk. A baktériumokat foszfáttal pufferelt sóoldatban (PBS) gyűjtjük össze, majd ODjo^l.O-ra hígítjuk. Ebből a szuszpenzióból 50 pl-t lizálunk 20 pl Laemmli-pufferben, majd 15%-os poliakrilamidgélen elektroforetizáljuk Laemmli leírása szerint [Laemmli, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Natúré, 227, 680-685 (1970)]. A fehérjék nitro-cellulózra való átvitelét lényegében van Embden és munkatársai leírása szerint végezzük [J. D. A. van Embden, H. J. van dér Dónk, H. J. van Eijk, H. G. van dér Heide, J. A. de Jong, M. F. van Olderen, A. D. Osterhaus, L. M. Schouls, Molecular cloning and expression of Treponema pallidum DNA in Escherichia coli K12, Infect. Immun., 42, 187-196 (1983)]. Bordetella pertussisból származó, SDS-sel denaturált 2-es és 3-as típusú rojtalegység-fehérjék elleni poliklonális antitesteket használunk a Bordetella bronchiseptica rojtalegység-fehérjék kimutatására.
A Bordetella pertussis ellen készített fim2 és fim3 specifikus monoklonális antitesteket használjuk egy ELISA-ban, lapos fenekű mikrotiterlemezeken, amelyeket teljes baktériumokkal borítottunk (OD600 = 0,1, 1:10 arányban hígítva 15 mmol/1 Na2CO3-ban, pH=9,6). A megkötött kecske-antiegér-IgG-peroxidázkonjugátumot (Nordic) 2,2’-azino-bisz(3-etil-benztiazolin)-6-szulfonsavval (ABTS) (Sigma) határozzuk meg. Az abszorbanciát 405 nm-en mérjük.
Elektronmikroszkópia
Az elektronmikroszkópiás vizsgálatokhoz egy Bordetella bronchiseptica tenyészetet hígítunk PBS-pufferben. Pilioformmal borított rézszitákat teszünk 50 pl-es baktériumszuszpenzióba 5 percre. A szitákat kétszer mossuk vízzel. A festést 2 percig végezzük 1%-os TPA-val (volffám-foszforsav, Merck). A szitákat egy Philips EM 201 elektronmikroszkóppal vizsgáljuk.
Eredmények
A fim2 és fim3 rojtalegységgének nukleotidszekvenciája
A Bordetella bronchiseptica fim2 és fim3 alegységgéneket azon az alapon lehet azonosítani, hogy homológiát mutatnak a Bordetella pertussis fim2 és fim3 génekkel. Egy 1000 bp méretű AccI-PstI DNS-fragmentet használunk próbaként a fim2 génhez [I. Livey, C. J. Duggleby and A. Robinson, Cloning and nucleotide sequence analysis of the serotype 2 fimbrial subunit gene of Bordetella pertussis, Mól. Microb., 1, 203-209 (1987)]. Egy 900 bp méretű Sáli DNS-fragmentet használunk próbaként a fim3 génhez [Mooi, F. R., A. tér Avest and H. G. J. van dér Heide, Structure of the Bordetella pertussis gene coding fór the serotype 3 fimbrial subunit, FEMS Microb. Lett., 65, 327-332 (1990)]. A Bordetella bronchiseptica-ból származó, Pstl restrukciós enzimmel emésztett kromoszomális DNS hibridizációja számos pozitív jelet eredményezett mindkét próbával, ami a két próba közötti homológia következménye. A DNS-fragmentek két régióját izoláljuk a Bordetella bronchiseptica kromoszomális DNS-ből, amelyek a legerősebb jelet adták a fim2 vagy a fim3 próbával. Ezeket a körülbelül 2,3 kb, illetve 2,8 kb méretű Pstl DNSfragmenteket Bluescript-vektorba klónozzuk. Transzformálás és telepátvitel után két kiónt lehetett azonosítani akármelyik fim próbával végzett hibridizálással. Egy
HU 219 819 Β klón, amely egy 2,3 kb méretű inszertet tartalmaz, a fim2 gént kódolja (pIVB3-402). A másik klón, amely egy 2,8 kb méretű inszertet tartalmaz, a Bordetella bronchiseptica fim3 génjét kódolja (pVIB3-430). A két gén nukleotidszekvenciáját meghatároztuk, és a SEQ. ID. NO. 3-ban (fim2), illetve a SEQ. ID. NO. 5-ben (fim3) mutatjuk be. Az Escherichia coli PC2495 (pIVB3-402) és Escherichia coli PC2495 (pIVB3-430) törzseket Hollandiában, a Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baamnál helyeztük letétbe 1992. augusztus 13-án, CBS 362.92 és CBS 361.92 szám alatt.
3. példa
Két olyan Bordetella bronchiseptica törzs készítése, amelyek az egyik típusú rojt termelésére képtelenek Olyan Bordetella bronchiseptica törzseket készítünk, amelyek nem képesek a FimX rojtokat (BbfX), illetve a Fim2 rojtokat (Bbf2 ) előállítani. Ezeket géncserével, az elroncsolt génekkel való homológ rekombináció módszerével állítjuk elő. Az elroncsolt géneket elektroporációval juttatjuk a Bordetella bronchiseptica sejtekbe. A rojtalegységben a deléciót úgy hajtjuk végre, hogy a vad típusú génekben egy EcoRV fragmentet egy kanamicinrezisztencia-génre cserélünk ki.
Anyagok és módszerek
Baktériumtörzsek, plazmidok és szaporítási körülmények
Mindegyik kísérletben a vad típusú Bordetella bronchiseptica 401 törzset használjuk. A baktériumot Dr. J. M. Mussertől kaptuk (685-ös törzs). Ezt a törzset tryptose phosphate agaron (TPA) (Difco Laboratories) szaporítjuk, amelyet 15% friss birkaeritrocitával egészítettünk ki, 37 °C-on, 24-48 óra hosszat. Klónozási célokra Escherichia coli KI 2 PC2495 törzset használunk, a Bluescript KS és SK plazmidokkal (Stratagene). Az Escherichia coli PC2495 törzset a megfelelő antibiotikumokkal kiegészített Luria-Bertoni agaron szaporítjuk 16 óra hosszat 37 °C-on. Az ampicillin és/vagy a kanamicin koncentrációja 100 pg/ml.
Megjegyezzük, hogy bármely más, deponált B. bronchiseptica törzs alkalmazható ugyanarra a célra, mint a 401 törzsből létrehozott rekombináns B. bronchiseptica törzs.
Rekombináns DNS-technikák
A klónozási eljárásokat Maniatis és munkatársai leírásai szerint végezzük [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)]. Mindegyik rojtalegységgént, beleértve a szomszédos szekvenciákat is, a Bluescript-vektorba klónozzuk. Ezeket a vektorokat Bimbóim és Doly lúgos extrakciós módszerével [H. C. Bimbóim and J. A. Doly, A rapid alkaline extraction procedure fór screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)] izoláljuk. Egy, egy alegységgént tartalmazó DNS-fragmentet egy kanamicinrezisztencia-génnel helyettesítünk [Labigne-Roussel, J. Harel and L. Tompkins, Gene transfer írom Escherichia coli to Campylobacter species: Development of shuttle vactors fór genetic analysis of Campylobacter jejuni, Journal of Bacteriology, 169, 5320-5323 (1987)]. Ez utóbbi konstrukciót használjuk az elektroporációs kísérletekben.
Elektroporációs kísérletek
Az elektroporációs kísérleteket lényegében Miller és munkatársai leírása alapján végezzük [J. F. Miller, W. J. Dower and L. S. Tompkins, High-voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Campylobacter jejuni with plasmid DNA, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 856-860 (1988)]. A vad típusú Bordetella bronchiseptica 401-es törzset BG agaron szaporítjuk 16 óra hosszat. A sejteket 1 ml 15%-os glicerin, 272 mmol/1 szacharóz összetételű oldattal (GlySuc) gyűjtjük össze 0 °C-on, majd mossuk és 400 μΐ GlySuc-oldatban szuszpendáljuk. Ebből a szuszpenzióból 50 μΐ-es aliquot részeket fagyasztunk le -80 °C-on. Ezeket az aliquot részeket használjuk az elektroporációs kísérletekben a Bordetella bronchiseptica transzformálására 1-3 pg, desztillált vízben oldott DNS felhasználásával. Az alkalmazott elektroporációs körülmények: 0,7 kV, 25 pF és 600 Ω (Biorad Gene Pulser, 0,56 mm-es rézküvetták a Biotechnologies and Experimental Research Inc.-től, San Diego, CA). A mért időállandók értéke 3,5-7 s. A sejteket 1 ml tryptose phosphate brothban (Difco Laboratories) hagyjuk regenerálódni (90 perc, 37 °C), majd 100 pg/ml kanamicint tartalmazó TPA táptalajra (Difco Laboratories) szélesztjük. A rekombináns törzsek átvizsgálását Southem-blottolással végezzük kromoszomális DNS-preparátumokon.
Kromoszomális DNS-tisztítás és Southern-blotelemzés
A kromoszomális DNS-t Maniatis és munkatársai leírása szerint tisztítjuk [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)]. A Southem-blot-elemzést az előzőkben ismertetett módon végezzük.
A hibridizációs kísérletekben használt DNS-próbák
A fimX génnel végzett hibridizációs kísérletekben két próbát használunk, jelük fXEv és Í3SE. Egy 450 bp méretű DNS-fragmentet, amelyet fXEv próbaként használunk, a pIVB3-426 plazmid EcoRV restrikciós enzimmel való emésztésével izoláljuk (3. ábra). Az f3SE próba 580 bp méretű DNS-fragmentjét a pIVB3-430 plazmid Sphl és EcoRI restrikciós endonukleázokkal való emésztésével izoláljuk (4. ábra). A fim2 génnel végzett hibridizációs kísérletekben három próbát használunk, jelük f2EV, kana és f2PE (5. ábra). Az f2EV próba egy 900 bp méretű EcoRV DNS-fragment, amelyet a pIVB3-427 plazmidból izolálunk, a kanapróba a kanamicinrezisztencia-génnek egy 900 bp méretű EcoRV DNS-fragmentje, az Í2PE próba pedig a pIVB3-417 plazmidnak egy 610 bp méretű PstI-EcoRV DNSfragmentje.
Eredmények
Két plazmidot, amelyek vagy a fimX vagy a fim2 rojtalegységgént tartalmazzák, használjuk a vad típusú Bordetella bronchiseptica baktériumok elektroporációval való transzformálására. Mindkét alegységnek a génjeit elroncsoljuk oly módon, hogy egy EcoRV frag7
HU 219 819 Β mentet egy kanamicinrezisztencia-génnel helyettesítünk. Mielőtt ezt megtesszük, egy harmadik EcoRV hasítási helyet, amely a Bluescript-vektor polilinkerében található, el kell távolítani. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a DNS-ffagmenteket egy EcoRV Bluescript-vektorba szubklónozzuk, így kapjuk a pIVB3-426 plazmidot a fimX esetében, illetve a pIVB3-417 plazmidot a fim2 esetében (3. és 5. ábrák). Mindkét kiónt azután az EcoRV restrikciós endonukleázzal emésztjük. Ezzel az emésztéssel egy 450 bp méretű fragmentet eltávolítunk a fimX gén klónjából (pIVB3-426), az 5’-promoterszekvenciákkal együtt (3. ábra). Miután az EcoRV fragmentet eltávolítottuk, a vektort a megmaradt DNSszekvenciákkal izoláljuk, majd egy 1,4 kb méretű Smal-HincII DNS-fragmentet, amely egy kanamicinrezisztencia-gént tartalmaz, az EcoRV hasítási helyre klónozzuk. Izoláljuk a plazmidot, majd az Escherichia coli PC2495 törzset transzformáljuk vele, így kapjuk a pIVB3-427 kiónt (3. ábra). Ugyanezt a stratégiát használjuk a fim2 rojtalegységgén esetében is. A pIVB3-417 klón EcoRV restrikciós endonukleázzal való emésztésével egy 900 bp méretű fragmentet távolítunk el a gén 3’-végéről a szomszédos szekvenciákkal együtt. A kanamicinrezisztencia-gént ebbe a konstrukcióba ligáivá kapjuk a pIVB3-418 kiónt (5. ábra).
Mindkét plazmidot (pIVB3-427 és pIVB3-418) izoláljuk, és külön használjuk elektroporációs kísérletekben Bordetella bronchiseptica transzformálására. Mindegyik elektroporációs kísérlet után maximum 100 körüli számú kanamicinrezisztens Bordetella bronchiseptica telepeket figyeltünk meg. A pIVB3-427 plazmiddal (részleges fimX rojtalegységgén) végzett elektroporációs kísérlet után 4 telepet elemzünk (fX I-IV). A pIVB3-418 plazmiddal végzett elektroporáció után (részleges fim2 rojtalegységgén) 7 telepet elemzünk (£2 I—VII). Ezekből a kanamicinrezisztens Bordetella bronchiseptica törzsekből kromoszomális DNS-t izolálunk, majd PstI, illetve EcoRV restrikciós endonukleázokkal emésztjük. Southem-hibridizációt végzünk az emésztett, kanamicinrezisztens, illetve vad típusú Bordetella bronchiseptica törzsekből izolált kromoszomális DNS-sel. A pIVB3-427 plazmiddal végzett elektroporáció után izolált 4 törzs kromoszomális DNS-ét az fXEv és f3SE próbákkal hibridizáljuk (3. és
4. ábra). A pIVB3-418 plazmiddal végzett elektroporáció után izolált 7 törzs kromoszomális DNS-ét az £2Ev, kan és f2SE próbákkal hibridizáltatjuk. Az fXEv és f2Ev próbákkal végzett hibridizálás mintázataiból világos, hogy rekombináns törzseket izoláltunk, amelyekből vagy a fimX (6A. és 6B. ábrák) vagy a fim2 (7A. és 7B. ábrák) rojtalegységgén hiányzik. A kanamicinrezisztencia-génnel mint próbával végzett hibridizációs kísérletekből kiderült a fim2 génről, hogy mindegyik izolált törzs (f2 I—VII) tartalmazza a kanamicinrezisztencia-gént (7C. ábra).
Mivel a kanamicinrezisztencia-gén mindegyik fim2 rekombináns törzsben jelen volt, a génhelyettesítés a többi rojtalegységgén egyikében történhetett az alegységgének közötti homológia következtében. Annak meghatározására, hogy valóban ez-e a helyzet, hibridizációs kísérleteket végzünk alacsony szigorúságú körülmények között, amikor is kereszthibridizáció figyelhető meg a többi alegységgénből származó próbákkal. A fimX kanamicinrezisztens Bordetella bronchiseptica törzsekkel (fX I—IV) az f3 SE próbával (fim3 alegységgén) végzett hibridizációs kísérletekkel ki lehetett mutatni, hogy a rojtalegységgénben a génhelyettesítés csak a BbFX- törzsben fordul elő. Ebben a törzsben, valamint a többi rekombináns törzsben (fX II—IV) megtalálhatók a fim3 és fim2 géneket tartalmazó DNS-fragmentekkel képzett hibridizációs jelek (6C. ábra). Mivel ezek az utóbbi jelek ugyanazok, mint a vad típusú Bordetella bronchisepticaban, az egyik vagy a többi alegységgénben nem fordul elő rekombináció (6C. ábra). A fim2 mutáns törzseknek az £2PE próbával való hibridizálása azt mutatja, hogy a fim2 génben a génhelyettesítés csak a BbF2~ törzsben játszódik le (7D. ábra). Ennek a próbának a használatával mindhárom alegységgénnel meg lehet figyelni a hibridizációs jeleket. Mivel a Pstl-EcoRV fragmentpróba (f2PE próba) jelen van az elektroporációban alkalmazott pIVB3-418 plazmidban, egy negyedik hibridizációs jel figyelhető meg a rekombináns törzsekben (f2 II—VII). Ez azt mutatja, hogy a pIVB3-418 plazmid még jelen lehet a kanamicinrezisztens törzsekben. A rekombináció a kromoszómán valószínűleg máshol játszódik le, egy azonosítatlan pozícióban, a rojtalegységen kívül.
4. példa
Vakcinálási kísérletek a BbfX~ és Bbf2~ Bordetella bronchiseptica mutánsokkal egérben Anyagok és módszerek
Három 80 egyedből álló egércsoportot (hathetes nőstény BALB/C egerek) intranazálisan fertőzünk vad típusú Bordetella bronchisepticaval és BbfX- és Bb£2mutánsokkal (az utóbbi kettőt a 3. példában leírtak alapján állítjuk elő) (mindegyikből 2xl07 cfu-t használunk). 8 egérnek a légzőszerveiben található életképes baktériumok számát megadott időpontokban meghatározzuk (0, 1, 3, 7, 11 és 36 nap elteltével). Mindegyik egérnél a garat felső, orri szakaszát, az orrot, a légcsövet és a tüdőket vizsgáljuk, hogy található-e bennük életképes Bordetella bronchiseptica. Az egereket a fertőzés után körülbelül 1 órával barbiturátinjekcióval elaltatjuk (ez a 0. nap), illetve az előzőkben említett különböző napokon. A tüdőket és a légcsövet eltávolítjuk és PBS-ben szövethomogenizálóval homogenizáljuk. Orrkeneteket bélhúrral veszünk. A bélhúrt 0,5 ml PBS-be tesszük, majd 5 percig vortexeljük. A garat felső, orri szakaszát PBS-sel öblítjük, ameddig 5 cseppet (körülbelül 0,5 ml) összegyűjtünk. Mindegyik homogenizátumból és a garat felső, orri részéből származó cseppekből hígításokat készítünk, majd Tryptose Phosphate Agárrá szélesztjük és a CFU számot kétnapos inkubálás után meghatározzuk.
nappal a vakcinálás után BbfX vagy Bbf2~ törzsekkel vakcináit, illetve a nem vakcináit csoportokat virulens Bordetella bronchiseptica törzzsel fertőzzük. A légutak kolonizációját a fertőzés utáni 0., 1., 4. és 14. napon vizsgáljuk.
HU 219 819 Β
Eredmények
A felső légútnak a két mutáns törzzsel, valamint a vad típusú törzzsel való kolonizációjának az eredményeit hasonlítjuk össze. Nincs különbség a felső légüt különböző szervei kolonizációjában a BbfX~ vagy 5 Bbf2~ mutáns törzsek és a vad típusú törzs között.
A 36. napon a BbfX- és a Bbf2~ csoportokba tartozó egereket megvizsgáljuk, hogy van-e bennük Bordetella bronchiseptica. A tüdők és a légcső mentes volt a Bordetella bronchisepticatól, míg kis mennyiségű Bor- 10 detella bronchiseptica még jelen volt az orrban és a garat felső, orri részében.
A vakcinálás után 52 nappal azokat az egereket, amelyeket BbfX- és Bbf2~ mutánsokkal vakcináltunk, illetve a kontrollcsoportot virulens Bordetella bronchisep- 15 tica törzzsel fertőztük. A garat felső, orri részének a Bordetella bronchiseptica törzzsel való kolonizációját nem lehetett megelőzni egyik vakcináit csoportban sem.
A vad típusú törzs kolonizációját a vakcináit csoportok tüdejében és légcsövében csak egy órával a fertőzés 20 után lehet kimutatni, míg a kontrollcsoport erősen kolonizálódik.
A mutáns törzzsel vakcináit egerek orrban való kolonizációja csak a 0. napon, illetve néhány egérnél az 1. napon mutatható ki, míg a kontrollcsoportba tartozó 25 egerek orra erősen kolonizálódik.
Az alábbiakban ismertetjük a találmány leírásában szereplő szekvenciákat.
(1) Általános információk:
(i) Benyújtó:
(A) Név: Duphar International Research Β. V.
(B) Utca: C. J. van Houtenlaan 36 (C) Város: Weesp (E) Ország: Hollandia (F) Irányítószám: 1381 CP (G) Telefon: (0)2940-77352 (H) Telefax: (0)2940-80253 (ii) A találmány címe: Bordetella bronchiseptica vakcina (iii) A szekvenciák száma: 6 (iv) Számítógéppel olvasható forma:
(A) A hordozó típusa: Floppy lemez (B) Számítógép: IBM PC kompatibilis (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Szoftver: Patentin Release #1.0, Version #1.25(EPO) (2) Információ a SEQ. ID. NO. 1-ről (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1315 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Szervezet: Bordetella bronchiseptica (B) Törzs: 401 (vii) Közvetlen forrás:
(B) Klón: E. coli PC2495 (pIVB3-420) (ix) Tulajdonságok:
(A) Név/kulcs: nem kódoló régió (B) Helye: 1...539 (ix) Tulajdonságok:
(A) Név/kulcs: CDS fimX (B)Helye: 540...1142 (ix) Tulajdonságok:
(A) Név/kulcs: nem kódoló régió (B) Hely: 1143...1315 (xi) A SEQ. ID. NO. 1 szekvencia leírása:
CTGCAGGTCA ACGGATCCAG TATTCGTCGA GCGATCCCAA GACCCAGACG GCGCAGATCT 60
CCGGCGCGAC CGAGACCACC GGCGTGCAGA TACGCCTGTC CAACCTGAAC GACAGCAAGA 120
TCACCATGGG CGCGAACGAG CAGATGCAGC ACGCACAGGG CTTCGACCCG GTCGCCCAGG 180
CATCGGGCGG CAAGAAGAGC GTGACCCTGA GCTACCTTGC TTCGTATGTG CGCAAGAGCA 240
GCGGCCGACG TGGACAGCGG CTCGATTACC ACCTACGTGG CTTCTCTGTG GTCTACCCCT 300
AGCGGGGCGA ATGCAGCGGA TATCGACGTC AGCTTGGGCC AAATCCTATA GGATGACGAA 360
CAAGCCTCTC GATGGCGGGC CGATTGCTTA CCACGTAAGT GGTTCCCGCC GTCGTCTGTG 420
CCTGATATGG CGAAGGCGGG CCAAATTCCT AGATACCCAT GAGGCCCCCC CCCCCCCCTG 480
AGGCGTCCAA TAATCTTGCA CACACATTGT CCCTGGATCC CTTCTTTACT CCAGCCTGT 539
ATG CAA GCC AAA ACG TTC CTC CTG GGC GCG GCG CTC GCC GGC GTC GCG 587
Met Gin Alá Lys Thr Phe Leu Leu Gly Alá Alá Leu Alá Gly Val Alá
10 15
HU 219 819 Β
CTC Leu | GCC GCC Alá Alá | CAT GCC | GAA GAC GGC ACC | ATT Ile | GTC Val | ATT Ile | ACC GGC | ACG ATC | 635 | |||||||
Hi s 20 | Al a | Glu | As p | Gly | Thr 25 | Thr | Gly 30 | Thr | Ile | |||||||
ACC | GAC | CAG | ACC | TGC | ACG | ATC | GAG | GAC | CCG | AGC | CCC | GGT | TAC | ATC | AAG | 683 |
Thr | As p | Gin | Thr | Cy s | Thr | Ile | Glu | As p | Pro | Ser | Pro | Gly | Tyr | Ile | Ly s | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
GTC | GTG | CAC | CTG | CCC | ACG | ATC | TCC | AAG | AGC | GCG | CTG | AAG | AAC | GCC | GGC | 731 |
Val | Val | Hi s | Leu | Pro | Thr | Ile | Ser | Ly s | Ser | Al a | Leu | Ly s | Asn | Al a | Gly | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
GAC | GTG | GCG | GGG | CGC | ACT | CGC | TTC | GAT | ATC | AAG | CTG | AAG | GAC | TGC | CCG | 779 |
Asp | Val | Al a | G1 y | Arg | Thr | Arg | Phe | As p | Ile | Ly s | Leu | Lys | Asp | Cy s | Pro | |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
ACC | ACC | GTC | AAC | ACT | CTC | AAG | CTG | TAC | TTC | GAG | CCC | GGC | CCC | ACC | ACG | 827 |
Thr | Thr | Val | Asn | Thr | Leu | Ly s | Leu | Tyr | Phe | Glu | Pro | Gly | Pro | Thr | Thr | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
GAT | TAC | GGC | ACC | AAG | GAT | CTG | AAA | GCC | TAT | AAG | CAG | GCT | TGG | TAC | GTC | 875 |
As p | Tyr | Gly | Thr | Ly s | Asp | Leu | Lys | Al a | Tyr | Ly s | Gin | Al a | Trp | Tyr | Val | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
GAC | GCC | GCA | ACG | CTG | CTC | AAA | TCG | CCG | CCC | AGT | GTG | ACC | GAA | GCC | AAG | 923 |
As p | Al a | Al a | Thr | Leu | Leu | Ly s | Ser | Pro | Pro | Ser | Val | Thr | Glu | Al a | Lys | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
GGG | GTG | CAG | ATC | CGG | CTG | ATG | AAC | CTG | AAC | GGC | AAG | CAG | ATT | CCC | ATG | 971 |
G1 y | Val | Gin | Ile | Arg | Leu | Me t | As n | Leu | Asn | Gly | Ly s | Gin | Ile | Pro | Me t | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
GGC | GAG | ACC | GAG | CCC | AAC | CAG | CAT | GCC | GCG | GCA | TTT | TCC | GGC | ACC | ATG | 1019 |
Gly | Glu | Thr | Glu | Pro | Asn | Gin | Hi s | Al a | Al a | Al a | Phe | Ser | Gly | Thr | Me t | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
CAA | GCC | GGC | CAG | GCG | AAG | AAA | TCG | TTC | ACC | TTG | CAC | TAC | CTG | GCC | GGC | 1067 |
Gin | Al a | Gly | Gin | Al a | Lys | Lys | Ser | Phe | Thr | Leu | Hi s | Tyr | Leu | Al a | Gly | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
TAC | GTG | AAG | AAG | GCC | AGT | GGA | GAG | GTC | GAG | GCG | ACC | ATG | CTG | ACC | ACC | 1115 |
Tyr | Val | Ly s | Lys | Al a | Ser | Gly | G1 u | Va 1 | Glu | Al a | Thr | Me t | Leu | Thr | Thr | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
TAC | GTG | GGC | TTT | TCG | GTC | GTC | TAC | CCC | TGA | AAC | GCA | C AGGCCATGGC | 1162 | |||
Tyr | Val | Gly | Phe | Ser | Val | Val | Tyr | Pro |
195 200
GGCCGGCGTT GCGCCCTGCG AACCCCGGCG ATCAGCGCGG CCGCTTGTCG ATGACGCGCC 1222
GCGCCTTGCC CGTCAGGGTA CGCTCGACGA AGCCCGTGTC GGCAACCTGC ACGCGGGCGT 1282
GACGCCGATG TATGACTTGA CCGCATGCTG CAG 1315 (2) Információ a SEQ. ID. NO. 2-ről:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 201 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris
HU 219 819 Β (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) a SEQ. ID. NO. 2 szekvencia leírása:
Me t 1 | Gin | Alá | Lys | Thr 5 | Phe | Leu | Leu | Gly | Al a 10 | Al a | Leu | Al a | Gly | Val 15 | Al a |
Leu | Al a | Al a | Hi s | Al a | Glu | As p | Gly | Thr | Ile | Val | Ile | Thr | Gly | Thr | Ile |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Thr | As p | Gin | Thr | Cy s | Thr | Ile | Glu | As p | Pro | Ser | Pro | Gly | Tyr | Ile | Lys |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Val | Val | Hi s | Leu | Pro | Thr | Ile | Ser | Ly s | Ser | Al a | Leu | Lys | As n | Al a | Gly |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Asp | Val | Al a | Gly | Arg | Thr | Arg | Phe | As p | Ile | Ly s | Leu | Ly s | As p | Cys | Pro |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Thr | Thr | Val | Asn | Thr | Leu | Ly s | Leu | Tyr | Phe | Glu | Pro | Gly | Pro | Thr | Thr |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Asp | Tyr | Gly | Thr | Ly s | As p | Leu | Ly s | Al a | Tyr | Ly s | Gin | Al a | Trp | Tyr | Va 1 |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Asp | Al a | Al a | Thr | Leu | Leu | Ly s | Ser | Pro | Pro | Ser | Va 1 | Thr | Glu | Al a | Ly s |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Gly | Va 1 | Gin | Ile | Arg | Leu | Me t | Asn | Leu | Asn | Gly | Lys | Gl n | Ile | Pro | Me t |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Glu | Thr | Glu | Pro | Asn | Gin | Hi s | Al a | Al a | Al a | Phe | Ser | Gl y | Thr | Me t |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Gin | Al a | Gly | Gin | Al a | Ly s | Lys | Ser | Phe | Thr | Leu | Hi s | Tyr | Leu | Al a | Gly |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Tyr | Va 1 | Ly s | Ly s | Al a | Ser | Gly | Glu | Val | Glu | Al a | Thr | Me t | Leu | Thr | Thr |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Tyr | Val | Gly | Phe | Ser | Val | Val | Tyr | Pro | |||||||
195 | 200 |
(2) Információ a SEQ. ID. NO. 3-ról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 624 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Szervezet: Bordetella bronchiseptica (B) Törzs: 401 (vii) Közvetlen forrás:
(B) Klón: E. coli PC2495 (pIVB3-402) (ix) Tulajdonságok:
(A) Név/kulcs: nem kódoló régió (B) Helye: 1...539
HU 219 819 Β (ix) Tulajdonságok:
(A) Név/kulcs: CDS fim2 (B) Helye: 1...624 (xi) A SEQ. ID. NO. 3 szekvencia leírása:
ATG CAA GTC CCT | TTC Phe 5 | CAA CGC Gin Arg | GCC CTG CCG CTG TGC TTG CGG GCC GCT | 48 | ||||||||||||
Me t 1 | Gl n | Val | Pro | Al a | Leu | Pro 10 | Leu | Cy s | Leu | Arg | Al a 15 | Al a | ||||
CTG | GCG | GCC | ATT | GCG | TCC | GCG | GCG | CAC | GCC | GAC | GAC | GGC | ACC | ATC | GTT | 96 |
Leu | Al a | Al a | Ile | Al a | Ser | Al a | Al a | Hi s | Al a | As p | Asp | Gly | Thr | Ile | Val | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
ATC | ACC | GGC | ACC | ATC | ACC | GAC | ACC | ACC | TGC | GTC | ATC | GAG | GAC | CCG | GCC | 144 |
Ile | Thr | Gly | Thr | Ile | Thr | Asp | Thr | Thr | Cys | Val | Ile | Glu | As p | Pro | Al a | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
GGC | CCC | ACG | CAC | ACC | AAG | GTG | GTG | CAA | TTG | CCC | AAG | ATA | TCC | AAG | AGC | 192 |
Gly | Pro | Thr | Hi s | Thr | Ly s | Va 1 | Va 1 | Gin | Leu | Pro | Lys | Ile | Ser | Lys | Ser | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
GCG | CTG | GCC | AAG | GAT | GGA | GAC | GAA | GCT | GGC | CGT | ACG | CCC | TTC | CTG | ATC | 240 |
Al a | Leu | Al a | Ly s | As p | Gly | Asp | Glu | Al a | Gly | Arg | Thr | Pro | Phe | Leu | Ile | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
ACG | CTC | AAG | GAC | TGC | CCC | TCG | TCC | CTG | AAC | AAT | GGC | GTG | AAA | GCG | TAC | 288 |
Thr | Leu | Lys | As p | Cy s | Pro | Ser | Ser | Leu | Asn | Asn | Gly | Val | Ly s | Al a | Tyr | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
TTC | GAG | CCT | GGG | CCG | ACC | ACC | GAC | TAC | GCT | ACC | GGC | GAC | CTA | AAG | GCG | 336 |
Phe | Glu | Pro | Gly | Pro | Thr | Thr | As p | Tyr | Alá | Thr | Gly | Asp | Leu | Ly s | Al a | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
TAT | TCG | ATC | GCC | TAC | AAC | AAC | AAC | CCC | GCC | ACC | ACC | CAA | AAT | GCG | ATC | 384 |
Tyr | Ser | Ile | Al a | Tyr | Asn | As n | As n | Pro | Al a | Thr | Thr | Gin | As n | Al a | I le | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
ATC | GCT | GCA | AGC | GAA | GCG | CAG | GGC | GTG | CAA | ATC | CGC | ATC | TCC | AAC | CAG | 432 |
Ile | Al a | Al a | Ser | Glu | Al a | Gin | Gly | Val | Gin | Ile | Arg | Ile | Ser | Asn | Gin | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
AAC | GGC | ACC | AAG | ATC | CCC | ATG | GGC | GTG | GAC | GCC | GCC | GCC | CAG | AAC | GCC | 480 |
Asn | Gly | Thr | Lys | Ile | Pro | Me t | Gly | Val | Asp | Al a | Al a | Al a | Gin | As n | Al a | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
CAG | GCC | TTC | AAC | CCC | GTC | ACC | GAC | ACC | GCC | GAC | AAC | GCC | AAG | AAG | AAG | 528 |
Gin | Al a | Phe | Asn | Pro | Val | Thr | Asp | Thr | Al a | Asp | Asn | Al a | Lys | Ly s | Lys | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
GTC | ACG | TTG | CGC | TAC | CTG | GCA | TCG | TAC | GTA | AAG | AAA | TCC | GGC | AAC | ATT | 576 |
Va 1 | Thr | Leu | Arg | Tyr | Leu | Al a | Ser | Tyr | Val | Lys | Lys | Ser | Gly | Asn | Ile | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
ACT | GCC | GGG | CAA | CTC | ACG | ACA | TAC | GTC | GGT | TTT | TCC | ATG | ATC | TAT | CCG | 624 |
Thr | Al a | Gly | Gin | Leu | Thr | Thr | Tyr | Va 1 | Gly | Phe | Ser | Me t | Ile | Tyr | Pro |
195 200 205 (2) Információ a SEQ. ID. NO. 4-ről:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 208 aminosav
HU 219 819 Β (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A SEQ. ID. NO. 4 szekvencia leírása:
Me t 1 | Gin | Val | Pro | Phe 5 | Gin | Arg | Al a |
Leu | Al a | Al a | Ile 20 | Al a | Ser | Al a | Al a |
Ile | Thr | Gly 35 | Thr | Ile | Thr | As p | Thr 40 |
Gly | Pro 50 | Thr | Hi s | Thr | Ly s | Val 55 | Val |
Al a 65 | Leu | Al a | Ly s | As p | Gly 70 | As p | Glu |
Thr | Leu | Lys | Asp | Cy s 85 | Pro | Ser | Ser |
Phe | Glu | Pro | Gly 100 | Pro | Thr | Thr | As p |
Tyr | Ser | Ile 115 | Al a | Tyr | Asn | Asn | Asn 120 |
Ile | Al a 130 | Al a | Ser | Glu | Al a | Gin 135 | Gly |
Asn 145 | Gly | Thr | Lys | Ile | Pro 150 | Me t | Gly |
Gin | Al a | Phe | Asn | Pro 165 | Val | Thr | As p |
Val | Thr | Leu | Arg 180 | Tyr | Leu | Al a | Ser |
Thr | Al a | Gly 195 | Gin | Leu | Thr | Thr | Tyr 200 |
Leu | Pro 10 | Leu | Cys | Leu | Arg | Al a 15 | Al a |
Hi s 25 | Al a | As p | As p | Gly | Thr 30 | Ile | Val |
Thr | Cys | Va 1 | Ile | Glu 45 | Asp | Pro | Al a |
Gin | Leu | Pro | Ly s 60 | Ile | Ser | Ly s | Ser |
Alá | Gly | Arg 75 | Thr | Pro | Phe | Leu | Ile 80 |
Leu | Asn 90 | Asn | Gly | Val | Ly s | Al a 95 | Tyr |
Tyr 105 | Al a | Thr | Gly | As p | Leu 110 | Ly s | Al a |
Pro | Al a | Thr | Thr | G1 n 125 | As n | Al a | Ile |
Val | Gin | I le | Arg 140 | Ile | Ser | Asn | Gin |
Val | As p | Al a 155 | Al a | Al a | Gin | Asn | Al a 160 |
Thr | Al a 170 | As p | Asn | Al a | Ly s | Lys 175 | Lys |
Tyr 185 | Va 1 | Ly s | Ly s | Ser | Gly 190 | Asn | Ile |
Val | Gly | Phe | Ser | Me t | Ile | Tyr | Pro |
205 (2) Információ a SEQ. ID. NO. 5-ről:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 621 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Szervezet: Bordetella bronchiseptica (B) Törzs: 401 (vii) Közvetlen forrás:
(B) Klón: E. coli PC2495 (pIVB3-430)
HU 219 819 Β (ix) Tulajdonságok:
(A) Név/kulcs: nem kódoló régió (B) Helye: 1...539 (ix) Tulajdonságok:
(A) Név/kulcs: CDS fím3 (B) Helye: 1...621 (xi) A SEQ. ID. NO. 5 szekvencia leírása:
ATG TCC | AAG Lys | TTT Phe | TCA TAC CCC | GCC Al a | TTG Leu | CGC ACC GCG CTT ATC CTT GCC | 48 | |||||||||
Me t 1 | Ser | Ser 5 | Tyr | Pro | Arg 10 | Thr | Al a | Leu | Ile | Leu 15 | Alá | |||||
GCC | TCG | CCC | GTG | CTG | CCG | GCG | CAT | GCC | AAC | GAC | GGC | ACC | ATC | GTC | ATC | 96 |
Al a | Ser | Pro | Val 20 | Leu | Pro | Al a | Hi s | Al a 25 | Asn | Asn | Gly | Thr | Ile 30 | Val | Ile | |
ACC | GGC | AGC | ATC | TCC | GAC | CAG | ACC | TGC | GTC | ATC | GAA | GAG | CCC | AGC | GCC | 144 |
Thr | Gly | Ser 35 | Ile | Ser | Asp | Gin | Thr 40 | Cys | Val | Ile | Glu | Glu 45 | Pro | Ser | Al a | |
CCC | AAC | CAT | ATC | AAG | GTC | GTG | CAA | CTG | CCC | AAG | ATT | TCC | AAG | AAC | GCG | 192 |
Pro | Asn 50 | Hi s | Ile | Ly s | Val | Val 55 | Gin | Leu | Pro | Ly s | Ile 60 | Ser | Ly s | Asn | Al a | |
CTC | AGG | AAC | GAC | GGC | GAC | ACC | GCC | GGC | GCC | ACG | CCC | TTC | GAC | ATC | AGG | 240 |
Leu 65 | Arg | Asn | As p | Gly | As p 70 | Thr | Al a | Gly | Al a | Thr 75 | Pro | Phe | As p | Ile | Ang 80 | |
CTG | AAG | GAA | TGC | CCC | CAG | CTG | GGC | GCG | CTC | AAG | CTG | TAT | TTC | GAG | CCC | 288 |
Leu | Ly s | Glu | Cys | Pro 85 | Gin | Leu | Gly | Alá | Leu 90 | Lys | Leu | Tyr | Phe | Glu 95 | Pro | |
GGC | ATC | ACC | ACC | AAC | TAC | GAC | ACC | GGC | GAT | CTG | ATC | GCC | TAC | AAG | CAG | 336 |
Gly | Ile | Thr | Thr 100 | As n | Tyr | Asp | Thr | Gly 105 | Asp | Leu | Ile | Al a | Tyr 110 | Lys | Gin | |
GCC | TAC | AAC | GCA | TCC | GGC | AAC | GGC | AAC | CTG | AGC | ACC | GTG | TCG | TCC | GCC | 384 |
Al a | Tyr | Asn 115 | Al a | Ser | Gly | Asn | Gly 120 | Asn | Leu | Ser | Thr | Va 1 125 | Ser | Ser | Al a | |
ACC | AAG | GCC | AAG | GGC | GTG | GAA | TTC | CGC | CTG | GCC | AAC | CTC | AAC | GGC | CAG | 432 |
Thr | Ly s 130 | Al a | Ly s | Gly | Va 1 | Glu 135 | Phe | Arg | Leu | Al a | Asn 140 | Leu | As n | Gly | Gin | |
CAC | ATC | CGC | ATG | GGC | ACC | GAC | GAA | ACC | ACG | CAA | GCC | GCG | CAA | ACC | TTC | 480 |
Hi s 145 | Ile | Arg | Me t | Gly | Thr 150 | As p | Glu | Thr | Thr | Gin 155 | Al a | Al a | Gin | Thr | Phe 160 | |
ACG | GGC | ACT | GAT | GTC | ACC | AAC | GGC | GGC | AAC | ACC | ACC | AAA | AGC | TAT | ACC | 528 |
Thr | Gly | Thr | As p | Va 1 165 | Thr | Asn | Gly | Gly | Asn 170 | Thr | Thr | Lys | Ser | Tyr 175 | Thr | |
CTG | CGC | TAT | CTC | GCC | TCG | TAC | GTG | AAG | AAA | CCC | AAC | GAA | GAT | GTC | GAC | 576 |
Leu | Arg | Tyr | Leu 180 | Al a | Ser | Tyr | Val | Ly s 185 | Lys | Pro | Asn | Glu | Asp 190 | Va 1 | As p | |
GCG Alá | GCG Al a | CAG Gin 195 | ATG Me t | ACC Thr | AGC Ser | TAC Tyr | GTC Va 1 200 | GGC Gly | TTT Phe | TCC Ser | GTC Val | GTC Va 1 205 | TAT Tyr | CCC Pro | 621 |
HU 219 819 Β (2) Információ a SEQ. ID. NO. 6-ról:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 207 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A SEQ. ID. NO. 6 szekvencia leírása:
Me t 1 | Ser | Lys | Phe | Ser 5 | Tyr | Pro | Al a | Leu | Arg 10 | Thr | Al a | Leu | Ile | Leu 15 | Al a |
Al a | Ser | Pro | Val 20 | Leu | Pro | Alá | Hi s | Alá 25 | Asn | Asp | Gly | Thr | Ile 30 | Val | Ile |
Thr | Gly | Ser 35 | Ile | Ser | Asp | Gin | Thr 40 | Cys | Val | Ile | Glu | Glu 45 | Pro | Ser | Al a |
Pro | As n 50 | Hi s | Ile | Ly s | Va 1 | Val 55 | Gin | Leu | Pro | Ly s | Ile 60 | Ser | Ly s | Asn | Al a |
Leu 65 | Arg | Asn | Asp | Gly | As p 70 | Thr | Al a | Gly | Al a | Thr 75 | Pro | Phe | As p | Ile | Arg 80 |
Leu | Ly s | Glu | Cy s | Pro 85 | Gin | Leu | Gly | Al a | Leu 90 | Ly s | Leu | Tyr | Phe | Glu 95 | Pro |
Gly | Ile | Thr | Thr 100 | Asn | Tyr | Asp | Thr | Gly 105 | Asp | Le u | Ile | Al a | Tyr 110 | Ly s | Gin |
Al a | Tyr | Asn 115 | Al a | Ser | Gly | Asn | Gly 120 | Asn | Leu | Ser | Thr | Val 125 | Ser | Ser | Al a |
Thr | Ly s 130 | Al a | Lys | Gly | Val | Glu 135 | Phe | Arg | Leu | Al a | Asn 140 | Leu | Asn | Gly | Gin |
Hi s 145 | Ile | Arg | Me t | Gly | Thr 150 | As p | Glu | Thr | Thr | Gin 155 | Al a | Al a | Gin | Thr | Phe 160 |
Thr | Gly | Thr | As p | Val 165 | Thr | Asn | Gly | Gly | Asn 170 | Thr | Thr | Ly s | Ser | Tyr 175 | Thr |
Leu | Arg | Tyr | Leu 180 | Al a | Ser | Tyr | Va 1 | Lys 185 | Lys | Pro | Asn | Glu | As p 190 | Val | Asp |
Al a | Al a | Gin 195 | Me t | Thr | Ser | Tyr | Val 200 | Gly | Phe | Ser | Val | Val 205 | Tyr | Pro |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (4)
1. Bordetella bronchiseptica egy rojtfehérjéjének immunológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptidet kódoló izolált polinukleotid, mely a SEQ. ID. NO. 3 vagy SEQ. ID. NO. 5 szerinti nukleotidszekvenciával rendelkezik.
2. Izolált polinukleotid, mely képes egy Bordetella bronchiseptica rojtfehéije immunológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptid expresszálására, és amely tartalmaz egy 1. igénypont szerinti polinukleotidot és egy alkalmas vektort működőképesen összekapcsolva a polinukleotiddal.
3. Transzformált Bordetella bronchiseptica törzs, amely egy, a 2. igénypont szerinti izolált polinukleotidot tartalmaz, és képes Bordetella bronchiseptica rojtfehérje immunológiai tulajdonságaival rendelkező po55 lipeptid kifejezésére.
4. Bordetella bronchiseptica fertőzés ellen immunológiai válasz létrehozására képes vakcina, mely egy semleges hordozót, valamint egy, a 3. igénypont szerinti Bordella bronchiseptica törzset tartalmaz.
HU 219 819 Β
Int. Cl.7: C 12 N 15/31
HU 219 819 Β
Int. Cl.7: C 12 N 15/31
2. ÁBRA
BbfX' 401 törzs törzs
94 kD 67 kD
43 kD
30 kD
20 kD
14 kD
HU 219 819 Β
Int. Cl.7: C 12N 15/31 (0 uí £
-o
S.
Ό C<
TT eA CQ >
q, m
-O
J«í m
CZ3 o
<n au (O ca >
C4 cza o
co
Ax,
HU 219 819 Β Int Cl.7: C 12 N 15/31
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP92202525 | 1992-08-18 | ||
PCT/NL1993/000161 WO1994004683A1 (en) | 1992-08-18 | 1993-07-28 | Bordetella bronchiseptica vaccine |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9500491D0 HU9500491D0 (en) | 1995-04-28 |
HUT70984A HUT70984A (en) | 1995-11-28 |
HU219819B true HU219819B (hu) | 2001-08-28 |
Family
ID=8210860
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9500491A HU219819B (hu) | 1992-08-18 | 1993-07-28 | Izolált polinukleotidok, ezeket tartalmazó Bordetella bronchiseptica törzs, és Bordetella bronchiseptica elleni vakcina |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5939064A (hu) |
EP (1) | EP0656948B1 (hu) |
JP (1) | JPH08500734A (hu) |
AT (1) | ATE263244T1 (hu) |
CA (1) | CA2142712C (hu) |
CZ (1) | CZ285307B6 (hu) |
DE (1) | DE69333467T2 (hu) |
FI (1) | FI113242B (hu) |
HU (1) | HU219819B (hu) |
NO (1) | NO319988B1 (hu) |
PL (1) | PL307505A1 (hu) |
RU (1) | RU2129611C1 (hu) |
SK (1) | SK21495A3 (hu) |
WO (1) | WO1994004683A1 (hu) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2646776B1 (fr) * | 1989-05-12 | 1994-06-03 | Pasteur Institut | Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella |
FR2728170A1 (fr) * | 1994-12-15 | 1996-06-21 | Pasteur Institut | Vaccin de type acellulaire anti-bordetella |
US6475754B1 (en) * | 1999-05-14 | 2002-11-05 | University Of Tennessee Research Corporation | Polynucleotides encoding Bordatella bronchiseptica fimbrial proteins (FimN), vectors, and expression systems therefor |
JP2007517888A (ja) * | 2004-01-15 | 2007-07-05 | インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー | 非動物由来安定剤およびその製造方法 |
US7521059B2 (en) * | 2004-06-14 | 2009-04-21 | Fenwick Bradley W | Kennel cough vaccine |
PL1828378T3 (pl) * | 2004-12-17 | 2014-10-31 | De Staat Der Nederlanden Vert Door De Mini Van Vws Mini Van Volksgezondheid Welzijn En Sport | Deacylacja lps w bakteriach gram ujemnych |
CN112375127B (zh) * | 2020-11-25 | 2022-09-09 | 江苏省农业科学院 | 一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU575086B2 (en) * | 1983-11-07 | 1988-07-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Bordetella bronchiseptica pili subunit protein and vaccine |
DK594084A (da) * | 1984-12-12 | 1986-06-13 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning |
IT1223579B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Clonaggio e sequenziamento del gene codificante per una nuova subunita' pilinica di bordetella pertussis |
IT1231961B (it) * | 1989-09-22 | 1992-01-16 | Eniricerche Spa | Clonaggio del gene codificante la subunita' pilinica fim3 di bordetella pertussis. |
-
1993
- 1993-07-28 EP EP93919704A patent/EP0656948B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 JP JP6506121A patent/JPH08500734A/ja active Pending
- 1993-07-28 CZ CZ95410A patent/CZ285307B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-07-28 PL PL93307505A patent/PL307505A1/xx unknown
- 1993-07-28 WO PCT/NL1993/000161 patent/WO1994004683A1/en active IP Right Grant
- 1993-07-28 US US08/381,881 patent/US5939064A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 CA CA002142712A patent/CA2142712C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 HU HU9500491A patent/HU219819B/hu unknown
- 1993-07-28 RU RU95107705A patent/RU2129611C1/ru active
- 1993-07-28 DE DE69333467T patent/DE69333467T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 AT AT93919704T patent/ATE263244T1/de not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-02-16 NO NO19950582A patent/NO319988B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-02-16 SK SK214-95A patent/SK21495A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-02-17 FI FI950740A patent/FI113242B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-30 US US09/281,221 patent/US6284256B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO950582D0 (no) | 1995-02-16 |
US6284256B1 (en) | 2001-09-04 |
CA2142712A1 (en) | 1994-03-03 |
FI113242B (fi) | 2004-03-31 |
DE69333467T2 (de) | 2005-01-20 |
SK21495A3 (en) | 1995-07-11 |
JPH08500734A (ja) | 1996-01-30 |
NO950582L (no) | 1995-02-16 |
EP0656948B1 (en) | 2004-03-31 |
ATE263244T1 (de) | 2004-04-15 |
WO1994004683A1 (en) | 1994-03-03 |
EP0656948A1 (en) | 1995-06-14 |
PL307505A1 (en) | 1995-05-29 |
HU9500491D0 (en) | 1995-04-28 |
HUT70984A (en) | 1995-11-28 |
CZ41095A3 (en) | 1995-08-16 |
RU2129611C1 (ru) | 1999-04-27 |
NO319988B1 (no) | 2005-10-10 |
CA2142712C (en) | 2004-01-06 |
RU95107705A (ru) | 1997-03-27 |
FI950740A0 (fi) | 1995-02-17 |
FI950740A (fi) | 1995-02-17 |
US5939064A (en) | 1999-08-17 |
DE69333467D1 (de) | 2004-05-06 |
CZ285307B6 (cs) | 1999-07-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU648251B2 (en) | Vaccines for nontypable haemophilus influenzae | |
Luo et al. | Cloning and characterization of the major outer membrane protein gene (ompH) of Pasteurella multocida X-73 | |
JP2907552B2 (ja) | ヘモフィルス外膜タンパク質 | |
US5856447A (en) | Hybridomas producing antibodies specific for lyme disease antigens OspA and OspB | |
Ruffolo et al. | Cloning, sequencing, expression, and protective capacity of the oma87 gene encoding the Pasteurella multocida 87-kilodalton outer membrane antigen | |
HU211031B (en) | Method for preparation of actinobacillus pleuropneumoniae vaccine | |
AU669360B2 (en) | High molecular weight surface proteines of non-typeable haemophilus | |
HU220116B (hu) | A Neisseria meningitidis transzferin-receptorának Tbp2-fragmentumai | |
JP3236610B2 (ja) | 豚胸膜肺炎用ワクチン | |
AU718392B2 (en) | Haemophilus adhesion proteins | |
KR19990087436A (ko) | 치주염의 진단 및 치료용 포르피로모나스 긴기발리스 항원 | |
HU219819B (hu) | Izolált polinukleotidok, ezeket tartalmazó Bordetella bronchiseptica törzs, és Bordetella bronchiseptica elleni vakcina | |
Chanyangam et al. | Contribution of a 28-kilodalton membrane protein to the virulence of Haemophilus influenzae | |
WO1993024646A1 (en) | Fowl mycoplasma antigen, gene thereof, recombinant vector containing said gene, and vaccine prepared by utilizing the same | |
CA2133441C (en) | Haemophilus somnus immunogenic proteins | |
JP2002538169A (ja) | インフルエンザ菌に起因する疾患を防御するための、少なくとも3つの抗原を含む多成分系ワクチン | |
KR100216390B1 (ko) | 헤모필루스 외부막 단백질 | |
CA2172443A1 (en) | Transferrin-binding protein 1 (tbp1) gene of actinobacillus pleuropneumoniae, its use to prepare products for the utilization in vaccines for pleuropneumonia and as diagnostic reagents | |
US20030219454A1 (en) | Haemagglutinin antigen | |
AU2001270348A1 (en) | Haemagglutinin antigen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: DIMMINACO AG/SA/LTD., CH |
|
GB9A | Succession in title |
Owner name: PFIZER AG, CH Free format text: FORMER OWNER(S): DIMMINACO AG/SA/LTD., CH; DUPHAR INTERNATIONAL RESEARCH B.V., NL |