SK21495A3 - Vaccine against bordetella bronchiseptica on base of recombinant proteine of fimbris of these bacteries - Google Patents

Vaccine against bordetella bronchiseptica on base of recombinant proteine of fimbris of these bacteries Download PDF

Info

Publication number
SK21495A3
SK21495A3 SK214-95A SK21495A SK21495A3 SK 21495 A3 SK21495 A3 SK 21495A3 SK 21495 A SK21495 A SK 21495A SK 21495 A3 SK21495 A3 SK 21495A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ala
thr
gly
leu
bronchiseptica
Prior art date
Application number
SK214-95A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul H M Savelkoue
Willem Gaastra
Original Assignee
Duphar Int Res
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Duphar Int Res filed Critical Duphar Int Res
Publication of SK21495A3 publication Critical patent/SK21495A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Vynález opisuje vakcínu, ktorá ochraňuje proti infekcii psov spôsobenej baktériou Bordetella bronchiseptica, ďalej popisuje polypeptidy charakteristické pre B. bronchiseptica a ich prípravu pomocou technológie rekombinantnej DNA.
Doterajší stav techniky
Rod Bordetellae sa skladá zo štyroch druhov Bordetella pertussis (B. pertussis), Bordetella parapertussis (B. parapertussis), Bordetella bronchiseptica (B.bronchiseptica) a Bordetella avium (B. avium). Bordetelly sú malé, gramnegatívne, obligátne aeróbne kokobacily, často bipolárne farbiteľné a pozitívne na cytochromoxidázovú aktivitu. Kolónie, pestované na médiu Bordet-Gengou, sú okrem B. avium obklopené hemolytickou zónou.
Všetky baktérie rodu Bordetella spôsobujú veľmi podobné ochorenia vzhľadom na ich adhéziu, proliferáciu, klinické symptómy a histopatológiu. Na infekcie, spôsobené baktériami druhu Bordetella sú najviac citlivé nedospelé jedince človeka a zvierat. V týchto prípadoch je choroba najťažšia a úmrtnosť najvyššia.
B. bronchioseptica je primárnym patogénom pre laboratórne, domáce a divoké zvieratá a iba ojedinele pre človeka. Často dochádza k epidemickým infekciám u králikov, morčiat, potkanov, primátov (okrem človeka), psov, prasiat, mačiek, koní a lišiek. Najzávažnejšími ochoreniami spôsobenými baktériou Bordetella bronchiseptica sú psí kašeľ (kennel cough) a atrofický zápal nosnej sliznice prasiatok. U psov sa infekcia prevažne obmedzuje na horné dýchacie cesty a je charakterizovaná proliferáciou baktérií v priedušnicovom epitele. K proliferá cii dochádza po adhézii baktérie na povrch priedušnicových rias (cílií). Najťažšími príznakmi ochorení sú hromadenie prebytočného prieduškového hlienu, zvracanie, pľúcna lézia a úbytky na váhe. U psov sa vyskytuje hrubý prerývaný kašeľ. U prasiatok je infekcia spôsobená baktériou Bordetella bronchiseptica charakterizovaná atrofiou nosných častí lebky, deformáciami rypáku, pneumóniou a znížením váhových prírastkov. Napriek tomu, že sa považovalo za dokázané, že B. bronchiseptica je baktéria zodpovedná za atrofický zápal nosnej sliznice, podstatné dôkazy indikujú, že hlavným patogénom je Pasteurella multocida a B. bronchiseptica má možno len oportunnú úlohu a pri vzniku infekcie. Je opísaných veľmi veľa stavov bez klinických príznakov, kedy infikovaný pes, králik alebo prasa je iba v úlohe prenášača.
V baktériách rodu Bordetellae sa identifikovalo niekoľko virulentných faktorov. Sú to pertussis toxín, filamentárny hemaglutinín, fimbrie, adenylát cykláza, dermonekrotický toxín, tracheálny toxín a hemolyzín. Tieto virulentné faktory nie sú exprimované vo všetkých druhoch, napríklad gén kódujúci pertussis toxín v B. pertussis je v baktériách B. parapertussis a B. bronchiseptica prítomný v chromozóme ako mlčiaci gén. Okrem týchto virulentných faktorov pravdepodobne existuje viac faktorov podieľajúcich sa na patogenicite týchto baktérií, ktoré však zatiaľ neboli identifikované.
Infekcia baktériami Bordetella začína na riasinkových bunkách dýchacieho aparátu. Po iniciácii infekcie je nutná adhézia baktérií k týmto bunkám. Bez tejto adhézie by prúdenie spôsobené kmitaním riasinkových buniek odstránilo baktérie spolu s inými časticami z priedušnice. Adhézia baktérií Bordetella k riasinkovým bunkám je spôsobená sérologicky odlišnými fimbriami a filamentárnym hemaglutinínom (FHA), avšak FHA nebol zistený v B. avium. Fimbrie sú vláknité štruktúry, zložené z identických proteínových podjednotiek, ktoré vychádzajú z povrchu baktérie. FHA je proteín asociovaný k povrchu baktérií, ktorý sa však tiež vylučuje do extracelulárneho prostredia a ktorý je schopný aglutinovať množstvo rôznych erytrocytov. Expresia fimbrií i FHA je regulovaná lokusom bvg. Expre sia génov pre podjednotku fimbrií je v B. pertussis tiež ovplyvnená dĺžkou úseku trinástich až pätnástich cytozínových zvyškov pred génom kódujúcim podjednotku fimbrií. Všetky virulentné baktérie rodu Bordetellae na svojom povrchu exprimujú adhezívne faktory, zatiaľ čo nevirulentné kmene nie. Keďže sú tieto adhezívne faktory nevyhnutné pre iniciáciu ochorení, stávajú sa tak vhodnými zložkami vakcíny.
/
Podstata vynálezu
Účelom vynálezu je pripraviť vakcínu proti infekcii baktériami B. bronchiseptica na báze rekombinantnej DNA. Výskum bol zameraný na adhezívne faktory, pretože prevencia adhézie baktérií na povrch hostiteľa, ako výsledok imunitnej odpovede namierenej proti adhezívnym faktorom, zabráni celkovej infekcii. V baktériách B. bronchiseptica sú za adhéziu baktérie k riasinkovým bunkám priedušnicového epitelu zodpovedné niektoré sérologicky odlišné fimbrie a FHA. Ak má hostiteľ imunitnú odpoveď namierenú proti adhezívnym faktorom mikrobiálneho organizmu, nie je možná kolonizácia hostiteľa. Baktéria je usmrtená ešte predtým než prebehne produkcia toxínov a klinické príznaky sa nevyvinú.
Je výhodné, aby vakcína podľa vynálezu, zabraňujúca kolonizácii baktériami B. bronchiseptica obsahovala čo najväčšie množstvo komponentov nevyhnutných pre adhéziu. Rekombinantná vakcína môže byť vytvorená ako podjednotková vakcína. Nie je však ešte známe, koľko sérologicky odlišných fimbrií je produkovaných a aký je príspevok jednotlivých faktorov (fimbrií a FHA) pre adhéziu baktérie. Pre vývoj vakcíny je nevyhnutné určiť príspevok pre adhéziu baktérie každej zložky zvlášť. Vhodné proteíny sa môžu použiť ako podjednotková vakcína po tom, ako boli vyprodukované vo vhodnom mikrobiálnom organizme.
Vynález opisuje izoláciu a charakterizáciu troch rôznych génov kódujúcich podjednotky adhezívnych faktorov baktérie B. bronchiseptica.
Ďalej vynález opisuje prípravu vysoko čistého fimbriálneho proteínu baktérií B. bronchiseptica alebo polypeptidových fragmentov fimbriálneho proteínu (fimbriálnych polypeptidov), ktoré majú aspoň časť z jednej aminokyselinovej sekvencie, ktoré sú opísané ako Sekvencie id. č. 2, 4 alebo 6.
Ďalej vynález opisuje nielen proteín fimbrií a polypeptidy, ale i DNA podľa Sekvencií id. č. 1 až 3 a ich fragmenty a polynukleotidy, ktoré sú schopné hybridizovať s uvedenými DNA a ich fragmentmi a ktoré kódujú polypeptid s vlastnosťami fimbrinálneho proteínu B. bronchiseptica.
Vynález ďalej opisuje polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid s imunogénnymi vlastnosťami proteínu fimbrií B. bronchiseptica. V tomto polynukleotide je aspoň časť kodónov z DNA podľa Sekvencií id. č. 1, 3 alebo 5, alebo ich fragmentov alebo je vyššie uvedený hybridizujúci polynukleotid nahradený alternatívnymi kodónmi pre tu istú aminokyselinu.
Proteín fimbrií a polypeptidy z nich odvodené sú schopné vyvolať imunitnú odpoveď proti B. bronchiseptica.
Malé antigény sú často nepoužiteľné ako imunogény a preto sa môže proteín fimbrií alebo polypeptidy pripraviť ako homopolyméry (niekoľko kovalentne spojených identických fimbriálnych polypeptidov) alebo ako heteropolyméry (jeden alebo viac fimbriálnych polypeptidov kovalentne spojených s jedným alebo viacerými odlišnými fimbriálnymi polypeptidmi, alebo kovalentne spojené s jedným alebo viacerými polypeptidmi, ktoré sú charakteristické pre B. bronchiseptica alebo pre iný patogén). Fimbriálny proteín alebo polypeptidy môžu byť tiež naviazané na jednu alebo viac zlúčenín za účelom zvýšenia imunogenity.
Fimbriálny polypeptid sa môže podľa vynálezu pripraviť v ľubovoľnej z vyššie uvedených modifikácií pomocou techník rekombinantnej DNA, alebo sa môže pripraviť synteticky, napr. homogénnou syntézou polypeptidov alebo syntézou na pevnej fáVýznamné aminokyselinové sekvencie fimbriálnych polypeptidov s vhodnou imunogenitou môžu byť odvodené od aminokyselinových Sekvencií id. č. 2, 4 alebo 6 a prípadne tiež od priestorovej konfigurácie fimbriálneho proteínu.
Bolo vyvinutých mnoho metód slúžiacich na predikciu umiestnenia imunogénne významných epitopov na proteínoch. Zhrnutie výsledkov jednotlivých predikcií podáva dobrú predpoveď umiestnenia antigénnych miest.
Vhodné fimbriálne polypeptidy môžu byť vybrané z najviac hydrofiIných častí proteínu fimbrií, napr. pomocou techniky opísanej v práci Hopp a Woods (T. P. Hopp a K. R. Woods (1981): Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78, 3824 až 3828). Iný spôsob vhodný pre výber takýchto polypeptidov opisuje Chou a Fasman (P. Y. Chou a G. D. Fasman (1987), Advances in Enzymology 47, 45 až 148). Pre konečnú predikciu antigénne významných častí fimbriálneho proteínu baktérie B. bronchisep- tica sa môžu použiť ďalšie postupy, ako je napr. predpoveď pružnosti polypeptidového reťazca (P. A. Karplus a G. E. Schultz, 1985, Naturwissenschaften 72, 212 až 213) a pravdepo- dobnostný profil výskytu β-štruktúry v proteíne fimbrií baktérie B. bronchíseptica, podľa práce P. Y. Chou a G. D. Fasman, 1979, Biophys. J. 26, 367 až 385 a pravdepodobnostné profily v troch konformáciách pre sekvenciu proteínu fimbrií B. bronchíseptica podľa práce O. Gascuel a J. L. Golmard, 1988, CABIOS 4, 357 až 385, predikciu sekundárnej štruktúry sekvencie proteínu fimbrií baktérie B. bronchíseptica podľa práce J. Novotný a C. Auffray, 1984, (Nucleic acid research 12, 243 až 255.
Óalšie informácie o umiestnení dôležitých epitopov sa môžu získať pomocou metódy PEPSCAN, ktorú vyvinul Geysen a Meloen (H. M. Geysen a R. H. Meloen, S. J. Barteling, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81 (13) 3998 až 4002). V tejto metóde sa používajú syntetické peptidy s dostatočnou dĺžkou na reakciu v imunoenzymatickom teste ELISA. Tieto peptidy sa syntetizujú podľa danej sekvencie DNA. Peptidy sú určené podľa skutočnosti, že prvý peptid zahrňuje aminokyseliny č. 1 až 9, druhý peptid aminokyseliny č. 2 až 10 atď. Každý peptid sa testuje na schopnosť reagovať s antisérom alebo s monoklonálnymi protilátkami. Reaktívne peptidy tak musia predstavovať imunogénny epitop.
Za účelom identifikácie imunoreaktívnych epitopov (a za účelom korelácie tejto reaktivity s fyzickou mapou fimbriálneho proteínu) sa môžu vo vhodných plazmidoch,. ako sú plazmidy pEX, exprimovať fragmenty DNA z génu kódujúceho proteín fimbrií (K. Stanley a J. P. Luzio, 1984, EMBO J.. 3, 1429 až 1434 a J. G. Kusters, E. J. Jáger a B. A. M. Van der Zeijst, 1989, Nucl. Acid Res., 17, 8007). V tomto systéme vedie heterológna expresia k syntéze C-koncového úseku hybridného proteínu croβ-galaktozidázy. Na získanie fragmentov génu fimbriálneho proteínu, vhodných pre inzerciu do plazmidov pEX, sa môžu využiť miesta pre reštrikčné endonukleázy, ktoré sa nachádzajú v sekvencii génu pre proteín fimbrií. Pre ďalšiu charakterizáciu sa používajú klony plazmidov pEX syntetizujúcich fúzne proteíny odvodené z rôznych, navzájom sa prekrývajúcich častí fimbriálneho proteínu. Plazmidy pEX kódujúce fragmenty fimbriálneho proteínu sa purifikujú, rozdelia elektroforézou na polyakrylovom géli a blotujú na nitrocelulózové membrány. Tieto membrány sa nechajú reagovať so sérom ošípaných alebo psov imunných proti B. bronchiseptica. S týmito sérami reagujú iba fragmenty, ktoré obsahujú imunoreaktívne epitopy. Na určenie minimálnej dĺžky epitopu sa môžu inserty DNA v reaktívnych klonoch postupne skracovať štiepením Exonukleázou III, alebo klonovaním syntetických oligonukleotidov kódujúcich krátke, navzájom prekrývajúce sa časti fimbriálneho proteínu (J. G. Kusters, G. Koch, J. A. Lenstra, W. P. A. Posthums, R. H. Meloen a B. A. M. Van der Zeijst, 1989, J. Immunol., 143, 2692 až 2698). Tieto epitopy sa potom môžu testovať na ich ochranný efekt.
Podľa významného uskutočnenia vynálezu sa polypeptid špecifický pre proteín fimbrií produkuje expresiou polynukleotidu, ktorý obsahuje aspoň časť polynukleotidov podľa Sekvencii id. č. 1, 3 alebo 5. Je výhodné, ak je rekombinantný polynukleotid skonštruovaný na báze vektoru, do ktorého bol vložený polynukleotidový fragment špecifický pre baktériu B. bronchi septica. Vhodnými vektormi sú plazmidy, bakteriofágy, kozmidy, vírusy, minichromozómy alebo stabilné integrujúce sa vektory. Posledné menované sú vhodné pre rastlinné alebo živočíšne bunky. Tieto vektory sú schopné samostatnej aplikácie, okrem stabilných integrujúcich sa vektorov, ktoré sa sami uložili do genetického materiálu hostiteľské bunky a replikujú sa spolu s hostiteľským genetickým materiálom. Vhodné hostiteľské bunky môžu byť buď prokaryotické, alebo eukaryotické, ako sú baktérie, kvasinky, mykoplazmy, riasy, rastlinné alebo živočíšne bunky. Rastlinné alebo živočíšne bunky sa môžu kultivovať in vitro alebo môžu byť súčasťou intaktnej rastliny respektíve živočícha. Rekombinantný polynukleotid môže ako inzert obsahovať úplný nukleotid kódujúci proteín fimbrií alebo jeho fragment. Inzertom môže byť jediná kódujúca sekvencia, alebo niekoľko kópií tej istej kódujúcej sekvencie, alebo hybridný polynukleotid, ktorý obsahuje aspoň jednu sekvenciu kódujúcu fimbriálny proteín a aspoň jednu ďalšiu sekvenciu ako je iná časť sekvencie kódujúcej fimbriálny proteín alebo polynukleotid kódujúci proteín charakteristický pre iný patogén a/alebo pre inertný proteín, ktorý funguje ako nosič aspoň jedného malého fimbriálneho polypeptidu.
Špecifickým uskutočnením vynálezu sú rekombinantné polynukleotidy s vírusovými vektormi, ktoré sú priamo použiteľné ako tzv. vektorové vakcíny. Vírusy vhodné pre tento účel by mali mať schopnosť replikovať sa v zvieratách určených na imunizáciu, t.j. v psoch a/alebo prasatách. Tieto vírusy by mali ďalej obsahovať oblasť genómu vhodnú pre inzerciu cudzieho génu (napr. kódujúci proteín alebo polypeptid fimbrií B. bronchiseptica), ktorý bude tiež exprimovaný v očkovanom zvierati. Vírusami vhodnými pre tento účel sú napríklad črevné vírusy, ako sú určité adenovírusy.
Proteíny a polypeptidy a rekombinantné polynukleotidy podľa vynálezu sú vhodné na prípravu vakcín. Tieto vakcíny sú tiež súčasťou vynálezu.
Významné uskutočnenie vynálezu sa zaoberá bakteriálnymi vektorovými vakcínami. Baktérie schopné kolonizovať psi a/alebo prasatá sa transformujú tak, aby boli schopné exprimovať proteín alebo polypeptid fimbrií, a to takým spôsobom, ktorý vedie k imunitnej odpovedi proti B. bronchiseptica. Baktérie vhodné na tento účel sú napr. baktérie Salmonela.
Vakcína podľa vynálezu môže tiež obsahovať pomocné zložky ako sú nosiče, pufry, stabilizátory, solubilizátory, adjuvans a konzervačné látky. Výhodne možno tieto vakcíny vysušiť vymrazením a pred vlastnou aplikáciou rekonštruovať pridaním vhodnej tekutiny (voda, pufer).
Vakcína sa môže aplikovať napríklad orálne, intranazálne alebo intramuskulárne.
Vakcína môže naviac obsahovať ďalšie imunogény pre zvieratá, ktoré sú určené na imunizáciu (psi a prasatá). Takýmto imunogénnym materiálom môžu byť vírusy ako napr. pseudovírus besnoty, influenza vírus, vírus prenosnej gastro-enterititídy, parvo vírus a vírus endemickej hnačky prasiat, vírus cholery prasiat alebo imunogénny materiál charakteristický pre mykoplazmy, ako sú napríklad coplasma hyopneumoniae a Mycoplasma lyorhinis alebo imunogénny materiál charakteristický pre baktérie, ako sú napríklad Escheriachia coli, Leptospira, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteruella multocida, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteriae.
Vynález je ďalej charakterizovaný v nasledujúcich príkladoch.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Opis obrázkov:
Obr. 1: Na obrázku je schéma náhrady časti génu fimX génom pre rezistenciu na kanamycín. Vyznačené sú cieľové miesta pre reštrikčné endonukleázy, fimX označuje gén pre podjednotku fimbrií fimX, KR znamená gén pre rezistenciu na kanamycín.
Obr. 2: Na obrázku je SDS-PAGE purifikovaných fimbrií z baktérie B. bronchiseptica kmeňa 401 a mutantného kmeňa BbfX-. Na osi y sú uvedené relatívne molekulové hmotnosti použitých štandardov.
Obr. 3: V hornej časti obrázku je schéma umiestnenia génu fimX v plazmide pIVB3-426. Vyznačené sú cieľové miesta pre reštrikčné endonukleázy, šípkami a symbolom fXEv je označená sonda fXEv. V dolnej časti obrázku je schéma plazmidu pIVB
3-427, v ktorom bola časť génu pre podjednotku fimbrií nahradená génom pre rezistenciu na kanamycín (KR).
Obr. 4: Na obrázku je schéma umiestnenia génu fim3 v plazmide pIVB3-43O. Vyznačené sú cieľové miesta pre reštrikčné endonukleázy, šípkami a symbolom f3SE je označená sonda f 3SE.
Obr. 5: V hornej časti obrázku je schéma umiestnenia génu fim2 v plazmide pIVB3-417. Vyznačené sú cieľové miesta pre reštrikčné endonukleázy, šípkami a symbolmi f2SE respektíve f2Ev sú označené sondy f2SE respektíve f2Ev. V dolnej časti obrázku je schéma plazmidu pIVB 3-418, v ktorom bola časť génu pre podjednotku fimbrií nahradená génom pre rezistenciu na kanamycín (KR). Symbol kan označuje rozsah sondy kan.
Obr. 6a 7: Obrázky ukazujú výsledky hybridizácie DNA izolovanej z jednotlivých mutantných kmeňov s použitými sondami (viď príklad 3).
Príklad 1: Charakterizácia génu fimX
Materiál a metódy
Bakteriálne kmene, médiá a rastové podmienky.
Všetky použité bakteriálne kmene sú opísané v tabuľke 1.
1 1 |Kmeň baktérie | i 1 1 ; Zdroj | 1 Získané od | t
| | 1 1 |Bordetella bronchiseptica j kmeň č.401 1 1 i i | klinický izolát | zo psa (USA) č. 685 1 1 J.M.Musser, | New York | 1
ľ 1 i |Bordetella bronchiseptica] |kmeň BbfX- 1 1 1 1 |fimX negatívny kmeň | |odvodený od kmeňa 401 1 1 P.H.M.Savel- | koul | Utrecht | 1 1
I ' |Bordetella pertussis j kmeň Welcome 28 1 1 1 1 |klinický izolát j z človeka j I I 1 1 | F.R.Mooi, I j Bilthoven j 1 1
1 \Bordetella avium j kmeň č. 18 2 1 1 1 j klinický izolát |z moriaka 1 1 1 1 | K.H. Hinz, j Hannover | I I
1 1 \Escherichia coli |kmeň PC 2495 K12 !_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 1 \hsd S, reg A derivát |kmeňa JM 101 1 1 1 1 1 1 |Holandská | |zbierka kul- j |túr mikroorg. | 1 1
Všetky kmene baktérií Bordetella sa pestovali na Bordet-Gengou agare (Difco Laboratories, Detroit, MI), ktorý sa doplnil 1 % glycerolu a 20 % defibrinovanej ovčej krvi, alebo na médiu TPB (trypose phosphate broth - tryptický mäsový vývar pufrovaný fosfátom, Difco Laboratories, Detroit, MI). Aby sa potlačila expresia virulentných génov, boli médiá obohatené 20 mmol/1 MgSO^. Na prípravu DNA B. bronchiseptica sa použil kmeň 401. Escherichia coli kmeň PC 2495 sa použil na propagáciu vektoru Bluescript (Stratagene) a jeho derivátov. Kmeň PC 2495 sa pestoval na bujóne Lureano-Bertoni (LB) alebo na LB agare. Na identifikáciu kmeňov, ktoré obsahujú plazmid s požadovaným DNA inzertom sa použil ampicilín (50 až 100 μg/ml, 50 ^g/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-0-D-galaktopyranozidu (X-gal) a 20 jjg/ml izopropyl-0-D-tiogalaktopyranozidu (IPTG). Všetky bakteriálne kultúry sa pestovali pri teplote 37 °C 16 až 24 hodín.
Metódy rekombinantnej DNA
Chromozomálna DNA bola izolovaná z kmeňov baktérie Bordetella spôsobom opísaným v práci T. Maniatis, E.F. Fritsch a J. Sambrook 1982, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Po naštiepení sa uskutoční elektroforéza DNA na 1 % agarázovom gélu v pufre TAE (40 mmol/1 Tris-acetát, 2 mmol/1 etylén-diamín-tetraacetát sodný (EDTA)), ktorý obsahoval 1 pg/ml etidium bromidu. Na izoláciu fragmentov DNA z agarázového gélu sa použila súprava Geneclean (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). Na koncové značenie oligonukleotidov sa použil [γ-32Ρ]άΑΤΡ, ktorý bol naviazaný pomocou T4 polynukleotid kinázy (Maniatis a kol.). Hybridizácia sa uskutočňovala v 5 x SSPE (Saline sodium phosphate EDTA buffer - fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanom sodným s prídavkom EDTA), 5 x Denhardtovom roztoku, 0,1 % SDS (dodecyl sulfát sodný) a 10 pg/ml DNA zo spermií sleďa pri teplote 55 °C. Blotovacia membrána sa premyla 5 x SSPE a 0,1 % SDS pri teplote 55 °C.
Analýza pomocou Southern blotu
Chromozomálna DNA kmeňov baktérií B. bronchiseptica kmeňa 401 sa purifikuje a štiepi rôznymi reštrikčnými enzýmami. Fragmenty sa elektroforeticky rozdelia, prenesú na nylonovú membránu a hybridizujú sa so sondou DNA odvodenou od génu pre proteín pod jednotky fimbrií fimX z baktérie B., pertussis. Hľadané fragmenty DNA, identifikované hybridizačným signálom sa izolujú pomocou súpravy Gene Clean (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). Na ligáciu do vektoru Bluescript (Strategene) sa fragmenty chromozomálnej DNA transformujú do Escherichia coli, kmeň PC2495 pomocou CaCl2 metódy (Dagert M., Ehrlich S.D. 1979, Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells, Gene 6, str. 23 až 28. Po hybridizácii sa identifikujú pozitívne kolónie.
Určenie nukleotidovej sekvencie
Plazmidy sa izolujú metódou alkalickej lýzy (H.C. Birnboim a J.A. Doly 1979, A rapid alkaline extraction procedúre for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res. 7, 1513 až 1523). Nukleotidová sekvencia klonovaných inzertov sa stanoví pomocou metódy ukončenia reťazca dideoxynukleotidmi (F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson 1977, DNA sequencing with chain-terminating inhibotor, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74: 5463 až 5467) pri použití súpravy s polymerázou T7 (Amersham). Analýza sekvenčných dát DNA sa uskutočňuje pomocou software PC/Gene (verzia 6.5, Genofit, Heidelberg S. A. Ženeva, Švajčiarsko) .
Čiastočná purifikácia fimbrií
Kmeň 401 B. bronchiseptica sa pestuje na Tryptoza-fosfátovom agare (Difco Laboratories, Detroit, MI). Baktérie sa premyjú vo fosfátovom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Peleta obsahujúca baktérie sa suspenduje v 15 ml PBS doplnenom mol/1 močoviny. Táto suspenzia sa na 30 minút umiestni do °C. Baktérie sa oddelia od suspenzie
10000 otáčkach/min (Beckman, rotor JA 20, sa izolujú zo supernatantu centrifugáciou centrifugáciou pri minút). Fimbrie pri 40 000 ot/min (Beckman, Rotor Ti 60, 16 hodín). Potom sa peleta suspenduje v 5 ml PBS. Koncentrácia proteinu sa stanoví pomocou kyseliny bicínchoninínovej (BCA, Pierce Chemical Company, USA). Proteínová analýza sa uskutoční elektroforézou na 15 % polyakrylamidovom géle v SDS.
Výsledky
Sekvenčná analýza a umiestnenie inzertov
Ako sonda na identifikáciu chromozomálnych fragmentov DNA z B. bronchiseptica obsahujúcich gény fim sa použil fragment DNA BamHI - EcoRI odvodený od génu fimX z baktérie B. pertussis. Po štiepení genómu B. bronchiseptica enzýmom PstI bol izolovaný a sekvenovaný fragment DNA s dĺžkou 1,3 kb, ktorý hybridizoval s DNA sondou fimX. V tomto fragmente sa nachádza kompletný gén fimX vrátane promótorových sekvencii pred vlastným génom (Sekvencia id. č.l).
Pod depozitným číslom CBS 364.92 bola 13. augusta 1992 v Centraalbureau voor Schimelcultures at Baarn v Holandsku uložaná baktéria E. coli PC 2495 obsahujúca plazmid pIVB 3-420, ktorý obsahuje úplný gén fimX.
Expresia génu fimX v baktériách B. bronchiseptica
Za účelom identifikácie produktu génu fimX bol skonštruovaný kmeň baktérií, ktoré vďaka delečnej mutácii neboli schopné exprimovať gén fimX. Tento mutantný kmeň bol skonštruovaný prenosom génov. Centrálny EcoRV fragment génu fimX baktérie B. bronchiseptica bol nahradený génom pre rezistenciu na kanamycín a klonovaný vo vektore Bluescript. Tento konštrukt sa potom použil na náhradu génov v B. bronchiseptica (obr. 1). Potom sa identifikovali mutantné kmene rezistentné na kanamycín. Tieto kmene už nehybridizovali s EcoRV fragmentom. Z týchto mutantných kmeňov sa pripravili čiastočne purifikované fimbrie. Purifikácia fimbrií z fimX negatívnych kmeňov v porovnaní s divokými kmeňmi jasne dokazujú, že gén fimX je exprimovaný v baktériách B. bronchiseptica veľmi silne (obr. 2).
Príklad 2: Charakterizácia génov fim2 a fim3 kódujúcich podjednotky fimbrií Bordetella bronchiseptica
Materiál a metódy
Bakteriálne kmene, plazmidy a kultivačné podmienky
Divoký kmeň baktérií B. bronchiseptica sa izoloval zo psov, ktoré trpeli na psí kašeľ. Tento kmeň sa získal od dr. J. M. Mussera (kmeň č. -685) a bol označený č. 401. Tento kmeň sa kultivoval na Tryptózo-fosfátovom vývare alebo agare (Difco Laboratories, Detroit, MI). Kmeň baktérie B. pertussis Wellcome 28 (A. Robinson, L.A.E. Asworth, A. Baskerville a L.I. Irons 1085, Proceedings of the 4th International Symposium on pertussis, Ženeva, 1984, Dev. Biol. Stand. 61:165 až 172) sa kultivoval na agare Bordet-Gengou (Difco Laboratories - Detroit, MU). Médiá pre kultiváciu nevirulentných. kmeňov B. bronchiseptica boli obohatené 20 mmol/1 MgSO^. Baktérie E. coli K12 kmeňa PC 2495 boli použité ako hostiteľ pre klonovanie vektoru pBliescript. Baktérie E. coli boli kul- tivované na LB agare alebo LB bujóne obohatenom 100 pg/ml ampicilínu, 50 pg/ml X-gel a 20 ug/ml IPTG pre identifikáciu rekombinatných kmeňov obsahujúcich klonovaný fragment DNA. Všetky bakteriálne kultúry sa kultivovali 16 až 48 hodín pri teplote 37 °c.
Izolácia DNA a stanovenie nukleotidovej sekvencie
Izolácia chromozornáInej DNA sa uskutočnila podľa Maniatisa a kol. Izolácia plazmidov sa uskutočnila podľa metódy Birnboima a Dolyho. Fragmenty chromozomálnej DNA sa izolovali z TAE agarozových gélov (40 mmol/1 Tris-acetát, 2 mmol/1 EDTA) pomocou súpravy Gene Clean (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). Fragmenty DNA sa ligovali do plazmidov pBluescript KSM 13+ a M13+ (Stratagene, La Jolla, CA) pre všetky ďalšie účely klonovania. Nukleotidová sekvencía klonovaných inzertov sa stanovila pomocou metódy ukončenia reťazca dideoxynukleotidmi (F. Sanger a kol.) pri použití súpravy s polymerázou T7 (Amersham). Analýza sekvenčných dát DNA sa uskutočňuje pomocou software PC/Gene (verzia 6.5, Genofit, Heildelberg S.A., Ženeva, Švajčiarsko). Reštrikčné enzýmy a T4 DNA ligáza sa získali od firmy Pharmacia a používali sa podľa inštrukcií výrobcu. Plazmidy sa transformovali do baktérií E. coli kmeňa PC 2495 pri použití CaCl2 metódy podľa Dagerta a Ehrlicha.
Southernblot
Southernblot sa uskutočnil podľa Maniatisa a kol.
Elektroforéza v SDS v polyakrylamidovom géli a imunologické techniky
Pre SDS-PAGE a analýzu pomocou Westernblotu sa použili zhodné množstvá baktérií. Baktérie sa prenesú do pufru PBS a nariedia sa tak, aby 0Deoo sa rovnala 1,0. 50 1 tejto suspenzie sa lýzuje v Laemliho pufre a podrobí sa elektroforéze na 15 % polyakrylamidovom géli podľa Laemmliho (Laemmli U.K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Náture 227, 680 až 685). Prenos proteínov na nitrocelulózovú membránu sa uskutočnil podľa práce J.D.A. van Emben, H.J. van der Donk, H.J. van Eijk, H.G. van der Heide, J.A. de Jong, M.F. van Olderen, A.D. Ostrehaus,
L.M. Schouls, 1983, Molecular cloning and expression of Treponema pallidum in Escherichia coli K12, Infect. Immun, 42:187 až 196. Pre detekciu podjednotkového proteínu fimbrií B. bronchiseptica sa použijú polyklonálne protilátky pripravené proti serotypom 2 alebo 3 podjednotkového proteínu fimbrií z B. pertussis, ktorý sa denaturoval SDS.
Monoklonálne protilátky špecifické k fim2 a fim3, produkované proti B. bertusis sa použili v teste ELISA na mikrotitračných doskách s plochým dnom, potiahnutých celými baktériami (0D6oo=0.1, riedené 1:10 v pufre 15 mmol/1 mmol/1 NaHC03, pH 9.6). Naviazaný konjugát kozí IgG/peroxidáza (Nordic) sa stanovil kyselinou
Na CO , 35 anti-myšia 2,2-azinobis(3-etylbenztialzolín)-6-sulfdnovou (ABTS, Sigma). Absorbancia sa merala pri vlnovej dĺžke 305 nm.
Elektrónová mikroskopia
Pre účely elektrónovej mikroskopie sa kultúra B. bronchiseptica nariedi v pufre PBS. Medené sieťky s vláknitým povrchom sa umiestnia na 5 minút na 50 μΐ bakteriálnej suspenzie. Sieťky sa premyjú dvakrát vo vode. Potom sa sieťky 2 minúty farbia v 1 % TPA (kyselina wolframátofosforečná, Merck). Sieťky sa pozorovali v elektrónovom mikroskope Philips 201.
Výsledky
Gény fim2 a fim3 kódujúce podjednotku fimbrií baktérií B. bronchiseptica sa môžu identifikovať na základe ich homológie s gémni fim2 a fim3 baktérie B. pertussis. Accl PstI fragment DNA s dĺžkou 1000 bp sa použil ako sonda (próba) pre gén fim2 (I. Livey, C.J. Duggleby a A. Robinson, 1987, Cloning and nucleotide sequence analysis of the serotype 2 fimbrial subunit gene of the bordetella pertussis, Mol. Microb. 1, 203 až 209). Sali fragment DNA s dĺžkou 900 bp sa použil ako sonda pre gén fim3 (F.R.Mooi, A. der Avest a H.G.J. van der Heide, 1990, Structure of the Bordetella pertussis gene coding for the serotype 3 fimbrial subunit, FEMS Microb. Lett. 66, 327 až 332). Hybridizácia chromozomálnej DNA z baktérie B. bronchi16 septica rozštiepenej pomocou reštrikčnej endonukleázy PstI poskytla s obomi sondami niekoľko pozitívnych signálov vďaka sekvenčnej homológii, ktorá medzi sondami existuje. Z chromozomálnej DNA baktérie B. bronchiseptica sa podarilo izolovať dve oblasti fragmentov, ktoré dávajú silný signál buď so sondou fim2, alebo so sondou fim3. Tieto PstI fragmenty DNA s dĺžkou približne 2,3 kb a 2,8 kb sa naklonovali do vektoru pBluescript. Po transformácii a vypestovaní kolónií boli identifikované dva klony hybridižujúce s niektorou fim sondou. Jeden kloň, obsahujúci inzert s dĺžkou 2,3 kb, kóduje gén fim2 (pIVB 3-402). Druhý kloň s inzertom s dĺžkou 2,8 kb kóduje gén fim3 baktérie B. bronchiseptica (pIVB 3-430). Nukleotidová sekvencia oboch génov bola určená a je opísaná ako Sekvencia id. č. 3 (fim2) respektíve Sekvencia id. č. 5 (fim3). Pod depozitnými číslami CBS 362. 92 a CBS 361.92 boli 13. augusta 1992 v Centraalbureau voor Schimelcultures at Baarn v Holandsku uložené baktérie E. coli PC 2495 (pIVB 3-402) a PC 2495 (pIVB-3-430).
Príklad 3: Konštrukcia dvoch kmeňov baktérie .8. bronchiseptica deficitných v produkcii jedného typu fimbrií
Boli skonštruované dva kmene baktérií Bordetella bronchiseptica deficientných v produkcii fombrií FimX (BbfX-) alebo fimbrií Fim2 (Bbf2-). To sa dosiahlo pomocou náhrady pôvodných génov génmi poškodenými po homológnej rekombinácii. Poškodené gény sa transformovali do baktérií B. bronchiseptica elektroporáciou. Delécia génov pre podjednotku fimbrií sa dosiahla nahradením EcoRV fragmentu v génoch divokého kmeňa baktérií génom pre rezistenciu na kanamycín.
Materiál a metódy
Bakteriálne kmene, plazmidy a kultivačné podmienky
Vo všetkých experimentoch sa používal divoký kmeň baktérie B. bronchiseptica č. 401. Baktéria sa získala od Dr. J.M. Mussera (kmeň č. 685). Tento kmeň sa kultivoval na Tryptoza17 fosfátovom agare (TPA, Difco Laboratories) alebo na agare Bordet-Gengou (BG, Difco Laboratories), ktorý bol obohatený 15 % čerstvých ovčích erytrocytov. Kultivácia prebiehala pri teplote 37 °C 43 až 48 hodín. Pre účely klonovania sa použila baktéria Escherichia coli K12 kmeň PC 2495 spolu s plazmidmi Bluescript KS a SK (Strategene). E. coli PC 2495 sa kultivovala na agare Luriano Bertoni s vhodnými antibiotikami pri teplote 37 °C 16 hodín. Pre experimenty sa použili koncentrácie ampicilínu a/alebo kanamycínu 100 pg/ml.
Techniky rekombinantnej DNA
Klonovanie sa uskutočnilo podľa Maniatisa a kol. Každý gén pre podjednotku fimbrií, vrátane priľahlých sekvencií sa naklonuje do vektoru pBluescript. Tieto vektory sa potom izolujú metódou alkalickej extrakcie Birnboima a Dolyho. Fragment DNA z génov pre podjednotku fimbrií sa nahradil génom pre rezistenciu na kanamycín (A. Labigne-Roussel, J. Harel a L. Tompkins, 1987, Gene transfer from Escherichia coli to Campylobacter species: Development of shuttle vectors for genetic analysis of Campylobacter jejúni, J. Bacteriol. 169, 5390 až 5323). Tento posledný menovaný konštrukt sa použil v elektroporačných experimentoch.
Elektroporačné experimenty
Elektroporácia sa uskutočnila tak, ako bola opísaná Millerom a kol. (J.F. Miller, W.J. Dover či L.S. Tompkins, 1988, High voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Campylobacter jejúni with plasmid DNA, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 856 až 850). Baktérie B. bronchiseptica divokého kmeňa 401 sa kultivujú na BG agare 16 hodín. Bunky sa zbierajú v 1 ml 15 % glycerolu v 272 mmol/1 roztoku sacharózy (GlySuc) pri teplote 0 °C. Potom sa baktérie premyjú a resuspendujú v 400 pi GlySuc. 500 μΐ alikvoty tejto zmesi sa odoberú a zmrazia na teplotu -80 °C. Tieto alikvoty sa potom použijú v elektroporačných experimentoch na transformáciu baktérie B. bronchiseptica jedným až tromi g DNA, rozpustené v destilovanej vode. Používajú sa tieto elektroporačné pod18 mienky: 0,7 kV, 25 μ F a 600 42. (v zariadení Biomat Gene Pulser) používajú sa kyvety s medzerou 0,56 mm od firmy Biotechnologies and Experimental Research Inc, San Diego CA). Namerané časové konštanty boli v rozmedzí 3,5 až 7 ms. Bunky sa potom inkubujú v 1 ml Tryptosa-fosfátového vývaru (Difco Laboratories) pri teplote 37 °C 90 minút a potom sa umiestnia TPA (Difco Laboratories) s obsahom 100 pg/ml kanamycínu. Vyhľadávanie rekombinantných kmeňov sa uskutočňuje pomocou Southernovho prenosu a hybridizáciou s prípravkami z chromozomálnej DNA.
Purifikácia chromozomálnej DNA a analýza pomocou Southernblotu
Chromozomálna DNA sa purifikuje podľa Maniatisa a kol. Southernblot sa uskutočňuje tak, ako bolo opísané predtým.
Značená DNA používaná v hybridizačných experimentoch
Pre hybridizačné experimenty s génom fimX sa používali dve sondy DNA označené ako fXEv a f3SE. Fragment DNA s dĺžkou 450 bp, ktorý sa použil ako sonda fXEv sa izoloval štiepením plazmidu pIVB 3-426 reštrikčnou endonukleázou EcoRV (obr. 3). 580 bp dlhý fragment DNA, ktorý slúžil ako sonda f3SE, sa získal štiepením plazmidov pIVB 3-430 reštrikčnými endonukleázami Sphl a EcoRI (obr. 4). Pre hybridizačné experimenty s génom fim2 sa použili tri DNA sondy označené ako f2Ev, kána a f2PE (obr. 5). Fragment DNA s dĺžkou 900 bp, ktorý sa použil ako sonda f2Ev sa izoloval štiepením plazmidu pIVB 3-417 reštrikčnou endonukleázou EcoRV, sonda kána je 900 bp dlhý EcoRV štep a sonda f2PE je 610 bp dlhý fragment DNA plazmidu pIVB 3-417, ktorý vznikol jeho štiepením nukleázami PstI a EcoRVI.
Výsledky
Dva plazmidy s fragmentárni DNA obséLhujúcimi gény pre podjednotky fimbrií fimX alebo fim2 sa použili pre elektroporačnú transformáciu divokého kmeňa baktérie B. bronchiseptica. Gény oboch podjednotiek boli poškodené nahradením EcoRV DNA fragmentu génom pre rezistenciu na kanamycín. Pred touto ope19 ráciou je najprv nutné odstrániť cieľové miesto pre nukleázu EcoRV, ktoré sa nachádzajú v polylinkéri vektora Bluescript. To sa dosiahlo subklonovaním fragmentov DNA do vektora Bluescript štiepeného pomocou EcoRV, čím vznikli plazmidy pIVB 3-426 pre gén Fim X a pIVB 3-417 pre gén fim2 (obr. 3 a 5). Oba klony sa potom naštiepili reštrikčnou endonukleázou EcoRV. Týmto štiepením sa odstránil fragment s dĺžkou 450 bp z klonu pre gén fim X (pIVB 3-426) vrátane 5 promótorových sekvencií (obr. 3). Potom ako sa odstránil EcoRV fragment sa vektor so zvyšnými sekvenciami DNA izoloval a do miest EcoRV sa naklonoval 1,4 kb dlhý Smal - HinCII fragment DNA obsahujúci gén pre rezistenciu na kanamycín. kmeňa PC 2495, nasledovaná dok vznik klonu pIVB 3-427
Transformácia do baktérií E. coli izoláciou plazmidov mala za násle(obr. 3). Rovnaký postup sa použil i pre gén fimbriálnej podjednotky fim2. Štiepením klonu pIVB
3-417 reštrikčnou endonukleázou EcoRV (obr. 5) sa podarilo od strániť fragment DNA dlhý 900 bp z 3. konca génu spolu s priľahlými sekvenciami. Po ligácii génu pre existenciu na kanamycín do tohoto konštruktu vznikol kloň pIVB 3-418 (obr. 5).
Oba plazmidy (pIVB 3-427 a pIVB 3-418) sa oddelene použili pre elektroporačné experimenty slúžiace na transformáciu B. bronchiseptica. Po každom elektroporačnom experimente sa pozorovalo až 102 kolónií B. bronchiseptica rezistentných na kanamycín. Po elektroporácii plazmidom pIVB 3-427 (čiastočný gén pre fimbriálnu podjednotku FimX) boli analyzované 4 kolónie (fX I až IV). Po elektroporácii plazmidom pIVB 3-418 (čiastočný gén fimbriálnej podjednotky fim2) bolo analyzovaných 7 kolónií (f2 I až IV). Chromozomálna DNA z týchto kanamycín-rezistentných kmeňov B. bronchiseptica sa izolovala a štiepila pomocou reštrikčných endonukleáz PstI respektíve EcoRV. Southernova hybridizácia sa uskutočnila naštiepenou chromozomálnou DNA, izolovanou z kmeňov rezistentných na kanamycín a z divokého kmeňa B. bronchiseptica. Naštiepená chromozomálna DNA izolovaná zo 4 kmeňov, ktoré boli elektoporované plazmidom pIVB 3-427 bola hybridizovaná so sondami fXEv respektíve s f3Ev (obr. 3,4). Naštiepená chromozomálna DNA izolovaná zo 7 kmeňov, ktoré boli elektroporované plazmidom pIVB 3-418 bola hybridizovaná so sondami f2Ev, kaňa respektíve s f3SE (obr. 5). Z výsledkov hybridizácie so sondami fXEv a f2Ev vyplýva, že sa izolovali rekombinantné kmene, ktoré nemali buď časť génu fimX (obr. 6A a 6B), alebo génu fim2 (obr. 7A a 7B). Z hybridizačných experimentov, v ktorých sa gén pre rezistenciu na kanamycín použil ako sonda, vyplýva pre gén fim2, že všetky izolované kmene (F2 I až VII) obsahujú gén pre rezistenciu na kanamycín (obr. 7C).
Zatiaľ čo gén pre rezistenciu na kanamycín bol prítomný vo všetkých rekombinantných kmeňoch, mohlo dôjsť k zámene časti génu pre fimbriálne podjednotky s génom pre inú podjednotku vďaka ich sekvenčnej homológii. Ci došlo k takejto zámene, sa určilo tak, že hybridizačné experimenty sa uskutočňovali pri mierne nepriaznivých podmienkach, pri ktorých môže byť pozorovaná krížová hybridizácia pomocou sond odvodených od iných podjednotkových génov. Z hybridizačných experimentov s kmeňmi fimX rezistentnými na kanamycín (fX I až IV) so sondou f3SE (odvodená ,od génu podjednotky fim3) vyplýva, že k zámene časti génu pre fimbriálnu podjednotku došlo iba v rámci kmeňa BbFX~. V tomto kmeni, ako aj v ďalších rekombinantných kmeňoch (fXII až IV) sa vyskytujú hybridizačné signály s fragmentmi DNA génov fim3 a fim2 (obr. 6C). Pretože tieto signály sú totožné so signálmi divokého kmeňa B. bronchiseptica, možno povedať, že nedošlo k rekombinácii v žiadnom ďalšom podjednotkovom géne (obr. 6C). Hybridizácia mutantných kmeňov fim2 so sondou f2PE dokazuje, že ku génovej zámene v géne fim2 došlo iba v rámci BbF2~ (obr. 7D). Táto sonda dala hybridizačný signál so všetkými tromi podjednotkovými génmi. Pretože fragment Pstl-EcoRV sa nachádza v plazmide pIVB 3-418, ktorý sa použil pri elektroporácii, môže byť v rekombinantných kmeňoch (f2 II až VII) pozorovaný štvrtý hybridizačný signál. To naznačuje, že v kmeňoch rezistentných na kanamycín sa môže stále» vyskytovať plazmid pIVB 3-418. Ku rekombinácii došlo pravdepodobne na inom mieste chromozómu v neidentifikovanej lokácii mimo génu fimbriálne j podjednotky.
Príklad 4: Vakcinácia myší mutantnými kmeňmi BbfX“ a Bbf2“ baktérie Bordetella bronchiseptica
Materiál metódy
Tri skupiny myší (6 týždňov starých samičiek BALB/c) po 80 jedincov sa intranazálne infikovali divokým kmeňom B. bronchiseptica, respektíve kmeňmi BbfX“ a Bbf2“ (ktoré sa pripravili podľa príkladu 2). Infekčná dávka tvorila 2 x 10v cfu (colony forming unit - živá baktéria schopná vytvoriť kolóniu). Množstvo živých baktérií v dýchacom aparáte 8 myší bolo stanovené v daných časových intervaloch (0, 1, 3, 7, 11 a 36 dní). Na prítomnosť živých baktérií B. bronchiseptica sa podrobili skúmaniu nosohltany, pľúca, priedušky a nosné dutiny každej myši. Myši testované v deň 0 boli usmrtené injekciou barbiturátu približne 1 hodinu po injekcii a ostatné rovnakým spôsobom v stanovených dňoch. Pľúca a priedušky boli odobrané a homogenizované v PBS pomocou tkaninového homogenizátora. Výtery nosnej sliznice boli odobrané pomocou mačacieho čreva. Črevá sa potom umiestnia do 0.5 ml PBS a vortexujú sa 5 minút. Nosohltan infikovaných myší sa vypláchne 5 kvapkami PBS (asi 0.5 ml). Jednotlivé zriedenia všetkých homogenátov a výplachov z nosohlata sa prenesú na Tryptóza-fosfátový vývar a po dvojdňovej inkubácii sa spočítajú CFU.
dní po vakcinácii sa skupiny myší vakcinovaných BbfX a Bbf2“ a nevakcinovaná kontrolná skupina exponovali virulentnému kmeňu B. bronchiseptica. Kolonizácia dýchacích ciest sa merala v dňoch O, 1, 4 a 14 po expozícii.
Výsledky
Porovnali sa výsledky experimentov s kolonizáciou horných dýchacích ciest mutantnými kmeňmi a divokým kmeňom. Z výsledkov vyplýva, že nie je rozdiel v kolonizácii jednotlivých orgánov horných dýchacích ciest po vystavení účinkom mutantných kmeňov BbfX“ alebo Bbf2- v porovnaní s divokým kmeňom.
36. deň sa myši zo skupiny vystavenej kmeňom BbfX~ a Bbf2“ testovali na prítomnosť baktérií Bordetella. V pľúcach a v prieduškách sa nedetekovali žiadne baktérie rodu Bordetella, zatiaľ čo malé množstvá baktérií Bordetella boli stále prítomné v nose a v nosohltane.
dní po vakcinácii sa myši vakcinované mutantnými kmeňmi BbfX~ a Bbf2~ a kontrolná skupina vystavili virulentnému kmeňu B. bronchiseptica. V oboch vakcinovaných skupinách sa nezabránilo kolonizácii nosohltanu virulentným kmeňom B. bronchiseptica .
Kolonizácia virulentným kmeňom B. bronchiseptica v pľúcach a nosohltane u myší patriacich do skupiny, ktorá bola vakcinovaná divokým kmeňom, sa mohla preukázať iba 1 hodinu po expozícii, zatiaľ čo kontrolné skupiny boli veľmi silne kolonizované. Kolonizácia ústnej dutiny myší vakcinovaných mutantným génom sa mohla detekovať iba v deň 0 au niektorých myší v deň 1, zatiaľ čo ústne dutiny myší z kontrolnej skupiny boli silne kolonizované.
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1315 párov základní (B) TYP: kyselina nukleová (C) POČET VLÁKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iii) ANTI-SENZIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Bordetella bronchiseptica (B) KMEŇ: 401 (vii) KONKRÉTNY ZDROJ:
(B) KLOŇ: E. coli PC 2495 (pIVB 3-420) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: nekódujúca oblasť (B) UMIESTNENIE: 1 až 539 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS fimX (B) UMIESTNENIE: 540 až 1142 (xi) POPIS SEKVENCIE ID. Č. 1:
CIGCAGGTCA ACGGATCCAG TAITCGTCGA GCGATCCCAA GACCCAGACG GCGCAGATCT
COGGCGCGAC CGA2ACCACC GGCGTGCAGA TACGCCICTC CAACCTGAAC GACAGCAÄGA
120
TCACCATGGG CGCGAAOGAG CAGAIGCAGC ACGCACAGGG CITOGACCCG GTOGCCCAGG
180
CAIOGGGCGG CAAGAAGAGC CTGACCCTGA GCTACCITGC TTOGTATCTG OGCAAGAGCA240
GCGGCOGAOG TGGACAGOGG CTCGATTACC ACCTACCTGG CTTCTCTCTG CTCĽACCCCT300
AGOGGGGCGA AIGCAGOGGA TATCGAOGTC AGCTIGGGCC AAATCCTATA GGÄTGACGAA360
C5AGCCTCTC GATGGCGGGC OGATTGCTTA CCACCTAAGT GCTTCCOGCC CTOCTCICTG420
CCTGATATGG OGAAGGCGGG CCAAATTCCT AGATACCCAT GAGGCCCCCC CCCCCCCCTG430
AGGCCTCCAA TAATCTTGCA. CACACATTCT CCCTGGATCC CTTCTTTACT CCAGCCTCT539
ATG CAA GCC AAA ACG TTC CTC CTG GGC GCG GOG CTC GCC GGC CTC GCG537 tfet Gin Ala Lys Ihr Phe Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala Gly Val Ala
5 1015
CTC GCC GCC CAT GCC GAA GAC GGC ACC ΑΊΤ GTC ATT ACC GGC ACG ATC635
Leu Ala Ala His Ala Glu Asp Gly Ihr íle Val íle Ihr Gly Ihríle
2530
ACC GAC CAG ACC TCC ACG ATC GAG GAC CCG AGC CCC GCT TAC ATC AAG633
Ihr Asp Gin Thr Cys Thr íle Glu Asp Pro Ser Pro Gly Tyr íleLys
4045
GTC CTG GAC CTG CCC AOG ATC TCC AAG AGC GCG CTG AAG AAC GCC GC-C731
Val Val His Leu Pro Thr íle Ser Lys Ser Ala Leu Lys Jksn AlaGly
5560
GAC CTG GCG GGG CGC ACT CGC TTC GAT ATC AAG CTG AAG GAC TCC CCG779
Asp Val Ala Gly Arg Ihr Arg Phe Asp íle Lys Leu Lys Asp CysPro
-70 7580
ACC ACC CTC AAC ACT CTC AAG CTG TAC TTC GAG CCC GGC CCC ACC ACG827
Thr Thr Val Asn Thr Leu Lys Leu Tyr Phe Glu Pro Gly Pro Thr Thr
GAT TAC GGC ACC AAG GAT CTC AAA GCC TAT AAG CAG GCT TCG TAC GTC
875
Asp Tyr Gly Thr Lys Asp Leu Lys Ala Tyr Lys
Gin Ala Trp Tyr Val
100
105
110
GAC GCC GCA ACG CIG CTC AAA Lys TCG CCG CCC ACT CTG ACC GAA GCC AAG 923
Asp Ala Ala 115 Thr Leu Leu Ser Pro 120 Pro Ser Val Thr Glu Ala Lys 125
GGG GTC CAG ATC CGG CTC ATG AAC CTG AAC GGC AAG CAG ATT CCC ATG 971
Gly Val Gin íle Arg Leu Met Asn Leu Asn Gly Lys Gin íle Pro Met
130 135 140
GC-C GAG ACC GAG CCC AAC CAG CAT C-CC GCG GCA TTT TCC GGC ACC ATG 1019
Gly G1U Thr Glu Pro Asn Gin Eiis Ala Ala Ala Phe Ser Gly Thr Met
145 150 155 160
CAA GCC GGC CAG GCG AAG AAA TCG TTC ACC TTC CAC TAC CTC GCC GGC 1067
Gin Ala Gly Gin Ala Lys Lys Ser Phe Thr Leu His Tyr Leu Ala Gly
165 170 175
TAC GTG AAG AAG GCC AGT GGA GAG GTC GAG GCG ACC ATG CTC ACC ACC 1115
Tyr Val Lys Lys Ala Ser Gly Glu Val Glu Ala Thr Met Leu Thr Thr
180 185 190
TAC GTG GGC ΊΤΤ TCG CTC CTC TAC CCC TGA AAC GCA C AGGCCATGGC 1162
Tyr Val Gly Phe Ser Val Val Tyr Pro
195 200
GGCCGGOCTT GO3CCCTGCG AACCCCGGCG AICAGCTCGG COGdTGTOG ATGA.CGOGCC
GCGCCTIGCC CCTCAGGGTA CGCTCGACGA AGCCCGTCTC GGCAACCIGC ACGOGGGOCT
GACGCOGATG TATGACITGA CCGCATGCIG CAG
1222
1282
1315 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 201 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE ID. Č. 2:
Met Gin Ala Lys Thr Phe Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala Gly Val Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala His Ala Glu Asp Gly Thr íle Val íle Thr Gly Thr íle
C igná Iný’ 20 25 30
F epti d <
Thr Asp Gin Thr Cys Thr íle Glu Asp Pro Ser Pro Gly Tyr íle Lys
35 40 45
Val Val His Leu Pro Thr íle Ser Lys Ser Ala Leu Lys Asn Ala Gly
50 55 60
Asp Val Ala Gly Arg Thr Arg Phe Asp íle Lys Leu Lys Asp Cys Pro
65 70 75 80
Thr Thr Val .Asn Thr Leu Lys Leu Tyr Phe Glu Pro Gly Pro Thr Thr
85 90 95
Asp Tyr Gly Thr Lys Asp Leu Lys Ala Tyr Lys Gin Ala Trp Tyr Val
100 105 110
Asp Ala Ala Thr Leu Leu Lys Ser Pro Pro Ser Val Thr Glu Ala Lys
115 120 125
Gly Val Gin íle Arg Leu Met Asn Leu Asn Gly Lys Gin íle Pro Met
130 ’ 135 140
Gly Glu Thr Glu Pro Asn Gin His Ala Ala Ala Phe Ser Gly Thr Met
145 150 155 160
Gin Ala Gly Gin Ala Lys Lys Ser Phe Thr Leu His Tyr Leu Ala Gly
165 170 175
Tyr Val Lys Lys Ala Ser Gly Glu Val G1U Ala Thr Met Leu Thr Thr
180 185 190
Tyr Val Gly Phe Ser Val Val Tyr Pro
195 200
INFORMÁCIE O SEKVENCII ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 624 párov základní (B) TYP: kyselina nukleová (C) POČET VLÄKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iii) ANTI-SENZIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Bordetella bronchiseptica (B) KMEŇ: 401 (vil) KONKRÉTNY ZDROJ:
(B) KLOŇ: E. coli PC 2495 (pIVB 3-402) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS fim2 (B) UMIESTNENIE: 1 až 624 (Xl) POPIS SEKVENCIE ID. Č. 3:
ATC CAA CTC CCT TTC CAA CGC GCC CTG CCG CTG TGC TTG CGG GCC GCT 48
Met Gin Val Pro Phe Gin Arg Ala Leu Pro Leu Cys Leu Arg Ala Ala
1 5 10 15
CTG GCG GCC ΑΊΤ GCG TCC GCG GCG CAC GCC GAC GAC GGC ACC ATC CT. 96
Leu Ala Ala íle Ala Ser Ala Ala His Ala Asp Asp Gly Thr íle V
25
ATC ACC GGC ACC ATC ACC GAC ACC ACC TGC GTC ATC GAG GAC CCG GCC 144
íle ( Ihr Gly Ihr íle Ihr Asp Ihr Ihr Cys Val íle G1U Asp Pro Ala
35 40 45
GGC CCC AOG CAC ACC AAG GTC GTC CAA TTC CCC AAG ATA TCC AAG AGC 192
Gly Pro Thr His Ihr Lys Val Val Gin Leu Pro Lys íle Ser Lys Ser
50 55 60
GCG CTG GCC AAG GAT GGA GAC GAA GCT GGC CCT ACG CCC TTC CTG ATC 240
Ala Leu Ala Lys Asp Gly Asp G1U Ala Gly Arg Ihr Pro Phe Leu íle
65 70 75 80
ACG CTC AAG GAC TGC CCC TCG TCC CTC AAC AAT GGC CTC AAA. GCG TAC 288
Ihr Leu Lys Asp Cys Pro Ser Ser Leu Asn Asn Gly Val Lys Ala Tyr
85 90 95
TTC GAG CCT GC-G CCG ACC ACC GAC TAC GCT ACC GGC GAC CLA AAG /“•/“v-· 336
Phe Glu Pro Gly Pro Thr Thr Asp Tyr Ala Ihr Gly Asp Leu Lys Ala
100 105 110
TAT TCG ATC GCC TAC AAC AAC AAC CCC GCC ACC ACC CAA AAT GCG ATC 384
Tyr Ser íle Ala Tyr Asn Asn Asn Pro Ala Thr Ihr Gin Asn Ala íle
115 120 125
ATC GCT GCA AGC GAA GCG CAG GGC GTC CAA ATC CGC .ATC TCC AAC CAG 432
íle Ala Ala Ser Glu Ala Gin Gly Val Gin íle Arg íle Ser Asn Gin
130 135 140
AAC GGC ACC AAG ATC CCC ATG GGC CTG GA.C GCC GCC GCC CAG AAC GCC 480
Asn Gly ‘ Ihr Lys íle Pro Met Gly Val Asp Ala Ala Ala Gin . Asn Ala
145 150 155 160
CAG : GCC : ttc ! AAC CCC GTC ACC : GAC ACC GCC GAC AAC GCC AAG AAG AAG 528
Gin i Ala . Phe ! Asn Pro ' Val . Ihr Asp Thr • Ala Asp i Asn . Ala . Lys Lys Lvs
165 170 175
GTC ACG TIG CGC TAC CTG GCA TOG TAC GTA AAG AAA TľC GGC AAC ATT
Val Ihr Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Tyr Val Lys Lys Ser Gly Asn íle
180 185 190
ACT GCC GGG CAA CTC ACG ACA TAC GTC GGT ΊΊΤ TCC A!IG ATC TAT CCG
Thr Ala Gly Gin Leu Thr Ihr Tyr Val Gly Phe Ser Met íle Tyr Pro
195
200
205
576
624
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID. C 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE 4:
(A) DĹŽKA: 208 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (íi) TYP MOLEKULY: proteín (xí) POPIS SEKVENCIE ID. Č. 4:
Met Gin 1 Val Pro Phe Gin Arg Ala Leu Pro Leu Cys Leu Arg Ala 15 Ala
5 10
Leu Ala Ala íle Ala Ser Ala Ala His Ala Asp Asp Gly Thr íle Val
20 25 30
signálny peptid
íle Thr Gly Thr íle Thr Asp Thr Thr Cys Val íle Glu Asp Pro Ala
35 40 45
Gly Pro Thr His Thr Lys Val Val Gin Leu Pro Lys íle Ser Lys Ser
50 55 60
Ala Leu Ala Lys Asp Gly Asp Glu Ala Gly Arg Thr Pro Phe Leu íle
65 70 75 80
Thr Leu.Lys .Asp Cys Pro Ser Ser Leu Asn Asn Gly Val Lys Ala Tyr
85 90 95
Phe Glu Pro Gly Pro Thr Thr Asp Tyr Ala Thr Gly Asp Leu Lys Ala
100 105 110
Tyr Ser íle Ala Tyr Asn Asn Asn Pro Ala Thr Thr Gin Asn Ala íle
115 120 125
íle Ala Ala Ser Glu Ala Gin Gly Val Gin íle Arg íle Ser Asn Gin
130 135 140
Asn Gly Thr Lys íle Pro Met Gly Val Asp Ala Ala Ala Gin Asn Ala
145 150 155 160
Gin Ala Phe Asn Pro Val Thr Asp Thr Ala Asp Asn Ala Lys Lys Lys
165 170 175
Val Thr Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Tyr Val Lys Lys Ser Gly Asn íle
180 185 190
Thr Ala Gly Gin Leu Thr Thr Tyr Val Gly Phe Ser Met íle Tyr Pro
195 200 205
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÉZKA: 621 párov základní (B) TYP: kyselina nukleová (C) POČET VLAKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iii) ANTI-SENZIA: nie (Vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Bordetella bronchiseptica (B) KMEŇ: 401 (vii) KONKRÉTNY ZDROJ:
(B) KLOŇ: E. coli PC 2495 (pIVB 3-430) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS fim3 (B) UMIESTNENIE: 1 až 621 (xi) POPIS SEKVENCIE ID. Č. 5:
ATG TCC AAG ΤΓΤ TCA TAC CCC c-cc TTG CGC ACC GCG en A2TC CIT 43
Met Ser Lys Phe QpY » Tyr Pro Ala Leu Arg Thr Ala Iäu íle Leu Ala
1 5 10 15
GCC TCG CCC GTG CIG CCG GCG CAT GCC AAC Gr 3GC ACC ATC GTC ATC 96
Ala Ser Pro Val Leu Pro Ala His Ala Asn As~ Gly Thr íle Val íle
20 25 30
ACC GGC AGC Thr Gly Ser ATC íle TCC GAC CAG ACC TGC GľC ATC GAA CJAG CCC AGC GCC 144
Ser Asp Gin Thr 40 Cys Val íle Glu Glu 45 Pro Ser Ala
35
ccc AAC CAT ATC AAG CTC CTG CAA CTG CCC AAG ΑΓΓ TCC AAG AAC GCG 192
Pro Asn His íle Lys Val Val Gin Leu Pro Lys íle í>er Lys Asn Ala
50 55 60
CTC AGG AAC GAC GGC GAC ACC GCC GGC GCC ACG CCC TTC GAC ATC AGG 240
Leu Arg Asn Asp Gly Asp Thr Ala Gly Ala Thr Pro Phe Asp íle Arg
65 70 75 80
CIG AAG GAA TGC CCC CAG CTG GGC GCG CTC AAG CIG TAT TTC GAG CCC 288
Leu Lys G1U Cys Pro Gin Leu Gly Ala Leu Lys Leu Tyr Phe Glu Pro
85 90 95
GGC ATC ACC ACC AAC TA.C GAC ACC GGC GAT CIG ATC GCC TAC AAG CAG 336
Glv íle Thr Thr Asn Tyr Asp Ihr Gly Asp Leu íle Ala Tyr Lys Gin
100 105 110
GCC Ala TAC AAC GCA TCC GGC AAC GGC AA.C CTG AGC ACC CTG TCG TCC GCC 384
Tyr Asn 115 Ala Ser Gly Asn Glv 120 Asn Leu Ser Thr Val 125 Ser Ser Ala
ACC AAG GCC AAG GGC CTG GAA TTC ose CTG GCC AAC CTC AAC GC-C CAG 432
Thr .Lys Ala Lys Gly Val Glu Phe Arg Leu Ala Asn Leu Asn Gly Gin
130 135 140
CA.C ATC CTC AIG GGC ACC GAC GAA ACC ACG CAA GCC GOG CAA ACC TTC 480
His íle Arg Met Gly Thr Asp Glu Thr Thr Gin Ala Ma Gin Ihr Phe
145 150 155 160
ACG GGC act GAT GTC ACC AAC GGC GGC AAC ACC ACC AAA AGC TAT ACC 528
Thr Gly Thr Asp Val Thr Asn Gly Gly Asn Thr Thr lys Ser Tyr Thr
165 170 175
CIG CGC ΊΆΤ CTC GCC TOG TAC GIG AAG AAA CCC AAC GAA GAT GTC GAC 576
Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Tyr Val Lys Lys Pro Asn Glu Asp Val Asp
180 185 190
GCG GOG CAG ATG ACC AGC TAC GTC GGC ΊΊΤ TCC GTC CTC TAI CCC 621
Ala Ala Gin Met Thr Ser Tyr Val Gly Phe Ser Val Val Tyr Pro
195 200 205
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. ď. 6:
CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 207 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE ID. Č. 6:
Met Ser Lys Phe Ser Tyr Pro Ala Leu Arg Thr Ala Leu íle Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Val Leu Pro Ala His Ala Asn Asp Gly Thr íle Val íle
20 25 30
signálny peptid
Thr Gly Ser íle Ser Asp Gin Thr Cys Val íle Glu Glu Pro Ser Ala
35 40 45
Pro Asn His íle Lys Val Val Gin Leu Pro Lys íle Ser Lys Asn Ala
50 55 60
Leu Arg Asn. Asp Gly Asp Thr Ala Gly Ala Thr Pro Phe Asp íle Arg
65 70 75 80
Leu Lys Glu Cys Pro Gin Leu Gly Ala Leu Lys Leu Tyr Phe Glu Pro
85 90 95
Gly íle Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Gly Asp Leu íle Ala Tyr Lvs Gin
100 105 110
Ala Tyr Asn Ala Ser Gly Asn Gly Asn Leu Ser Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Lys Ala Lys Gly Val Glu Phe Arg Leu Ala Asn Leu Asn Gly Gin 130 135 14Q
His íle Arg Met Gly Thr Asp Glu Thr Thr Gin Ala Ala Gin Thr Phe
145 150 155 160
Thr Gly Thr Asp Val Thr Asn Gly Gly Asn Thr Thr Lys Ser Tyr Thr
165 170 175
Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Tyr Val Lys Lys Pro A.sn Glu Asp Val Asp
180 185 190
Ala Ala Gin Met Thr Ser Tyr Val Gly Phe Ser Val Val Tyr Pro
195 200 205

Claims (4)

1. Polypeptid vyznačený tým, že má imunogénne vlastnosti proteínu fimbrií Bordetella bronchiseptica a má aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcu jednej zo Sekvencií id. č. 2, 4 alebo 6.
2. Rekombinantný polynukleotid schopný vyvolať expresiu polýpeptidu podľa nároku 1 vyznačený tým, že obsahuje vhodný vektor a polynukleotid, ktorý má nukleotidovú sekvenciu vybranú z DNA, ktorej nukleotidová sekvencia zodpovedá jednej zo sekvencií opísaných ako Sekvencie id. č. 1, 3 alebo 5 alebo ich funkčným ekvivalentom.
3. Vakcína proti infekcii baktériami Bordetella bronchiseptica vyznačená tým, že obsahuje inertný nosič, ako aj efektívne množstvo polypeptidu podľa nároku 1 alebo rekombinantného polynukleotidu podľa nároku 2.
4. Použitie vakcíny podľa nároku 3 v boji s infekciami spôsobenými baktériami Bordetella bronchiseptica.
SK214-95A 1992-08-18 1995-02-16 Vaccine against bordetella bronchiseptica on base of recombinant proteine of fimbris of these bacteries SK21495A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP92202525 1992-08-18
PCT/NL1993/000161 WO1994004683A1 (en) 1992-08-18 1993-07-28 Bordetella bronchiseptica vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK21495A3 true SK21495A3 (en) 1995-07-11

Family

ID=8210860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK214-95A SK21495A3 (en) 1992-08-18 1995-02-16 Vaccine against bordetella bronchiseptica on base of recombinant proteine of fimbris of these bacteries

Country Status (14)

Country Link
US (2) US5939064A (sk)
EP (1) EP0656948B1 (sk)
JP (1) JPH08500734A (sk)
AT (1) ATE263244T1 (sk)
CA (1) CA2142712C (sk)
CZ (1) CZ285307B6 (sk)
DE (1) DE69333467T2 (sk)
FI (1) FI113242B (sk)
HU (1) HU219819B (sk)
NO (1) NO319988B1 (sk)
PL (1) PL307505A1 (sk)
RU (1) RU2129611C1 (sk)
SK (1) SK21495A3 (sk)
WO (1) WO1994004683A1 (sk)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2646776B1 (fr) 1989-05-12 1994-06-03 Pasteur Institut Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella
FR2728170A1 (fr) * 1994-12-15 1996-06-21 Pasteur Institut Vaccin de type acellulaire anti-bordetella
US6475754B1 (en) * 1999-05-14 2002-11-05 University Of Tennessee Research Corporation Polynucleotides encoding Bordatella bronchiseptica fimbrial proteins (FimN), vectors, and expression systems therefor
WO2005071067A2 (en) * 2004-01-15 2005-08-04 Intervet International B.V. Non-animal origin stabilizers and processes for producing the same
US7521059B2 (en) * 2004-06-14 2009-04-21 Fenwick Bradley W Kennel cough vaccine
AU2005317304B2 (en) * 2004-12-17 2011-06-23 De Staat Der Nederlanden, Vert. Door De Minister Van Vws Deacylation of LPS in Gram negative bacteria
CN112375127B (zh) * 2020-11-25 2022-09-09 江苏省农业科学院 一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU575086B2 (en) * 1983-11-07 1988-07-21 Syntex (U.S.A.) Inc. Bordetella bronchiseptica pili subunit protein and vaccine
DK594084A (da) * 1984-12-12 1986-06-13 Novo Industri As Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning
IT1223579B (it) * 1987-12-22 1990-09-19 Eniricerche Spa Clonaggio e sequenziamento del gene codificante per una nuova subunita' pilinica di bordetella pertussis
IT1231961B (it) * 1989-09-22 1992-01-16 Eniricerche Spa Clonaggio del gene codificante la subunita' pilinica fim3 di bordetella pertussis.

Also Published As

Publication number Publication date
HU9500491D0 (en) 1995-04-28
WO1994004683A1 (en) 1994-03-03
FI950740A0 (fi) 1995-02-17
ATE263244T1 (de) 2004-04-15
NO950582L (no) 1995-02-16
HUT70984A (en) 1995-11-28
FI950740A (fi) 1995-02-17
HU219819B (hu) 2001-08-28
US6284256B1 (en) 2001-09-04
NO319988B1 (no) 2005-10-10
DE69333467D1 (de) 2004-05-06
FI113242B (fi) 2004-03-31
CA2142712C (en) 2004-01-06
EP0656948B1 (en) 2004-03-31
PL307505A1 (en) 1995-05-29
RU2129611C1 (ru) 1999-04-27
CZ41095A3 (en) 1995-08-16
NO950582D0 (no) 1995-02-16
CZ285307B6 (cs) 1999-07-14
CA2142712A1 (en) 1994-03-03
JPH08500734A (ja) 1996-01-30
EP0656948A1 (en) 1995-06-14
RU95107705A (ru) 1997-03-27
US5939064A (en) 1999-08-17
DE69333467T2 (de) 2005-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6562349B1 (en) Otitis media vaccine
Gerlach et al. Molecular characterization of a protective outer membrane lipoprotein (OmlA) from Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1
JP3380559B2 (ja) ヘリコバクター・ピロリ抗原及びワクチン組成物
JP2907552B2 (ja) ヘモフィルス外膜タンパク質
WO1994026304A9 (en) Otitis media vaccine
CA2040544C (en) Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine
CA2365915C (en) Recombinant toxin a/toxin b vaccine against clostridium difficile
US6939548B2 (en) Methods to produce high levels of C. difficile toxins
JP3236610B2 (ja) 豚胸膜肺炎用ワクチン
WO1990012086A1 (en) Bordetella vaccines
AU718392B2 (en) Haemophilus adhesion proteins
SK21495A3 (en) Vaccine against bordetella bronchiseptica on base of recombinant proteine of fimbris of these bacteries
JPH10290695A (ja) アクチノバシラス・プレウロニューモニアの弱毒化生菌
PT1914239E (pt) BACTéRIAS GRAM-NEGATIVAS ATENUADAS
KR20060112674A (ko) 로소니아 인트라셀룰라리스 26 ｋｄ 서브유닛 백신
CA2172443A1 (en) Transferrin-binding protein 1 (tbp1) gene of actinobacillus pleuropneumoniae, its use to prepare products for the utilization in vaccines for pleuropneumonia and as diagnostic reagents
AU4716200A (en) Haemophilus adhesion proteins
CA2013571A1 (en) Bordetella vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Assignment and transfer of rights

Owner name: PFIZER AG, ZUERICH, CH

Free format text: FORMER OWNER: DIMMINACO AG/SA/LTD., BAAR, CH

Effective date: 20101015

TE4A Change of owner's address

Owner name: DIMMINACO AG/SA/LTD., BAAR, CH

Effective date: 20101220

MK4A Patent expired

Expiry date: 20130728