KR20060112674A - 로소니아 인트라셀룰라리스 26 ｋｄ 서브유닛 백신 - Google Patents
로소니아 인트라셀룰라리스 26 ｋｄ 서브유닛 백신 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 핵산 서열을 포함하는 DNA 단편, 재조합 DNA 분자 및 생 재조합 운반체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 핵산, DNA 단편, 재조합 DNA 분자 및 생 재조합 운반체를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질 및 백신 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 예방하기 위한 백신 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 항원의 검출 및 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 검출을 위한 진단 테스트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산 서열을 포함하는 DNA 단편, 재조합 DNA 분자 및 생 재조합 운반체, 상기 핵산, DNA 단편, 재조합 DNA 분자 및 생 재조합 운반체를 포함하는 숙주 세포, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질 및 백신 제조를 위한 이의 용도, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 예방하기 위한 백신 및 이의 제조 방법, 및 로소니아 인트라셀룰라리스 항원의 검출 및 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 검출을 위한 진단 테스트에 관한 것이다.
돼지 증식성 회장염(porcine proliferative enteropathy: PPE 또는 PE)은 현재 전세계의 돼지 산업에서 중요한 질환이 되었다. 성장 중인 가축의 15∼50%와 성장이 끝난 가축 중 최대 30%가 이 질환에 감염되고 있다. 현재, 감염된 돼지 1마리 당 추가 사료 및 설비 시간 비용으로 약 US$ 5∼10 정도의 연간 경제적 손실이 발생하고 있다. PPE는 전세계적으로 상이한 임상 징후(사망, 허약하고 빈혈에 걸린 동물, 수양성 설사, 암적색 또는 선홍색 설사, 우울증, 식욕 감퇴 및 움직임 둔화, 성장 지연 및 증가된 FCR)를 보이는 만성 및 급성 질환이다. 그러나 여기에는 2가 지 일치되는 특성이 있다. 첫째로, 부검 시에만 볼 수 있는 병리적 변화인 소장 및 결장 점막의 비후증이다. 둘째로, 감염된 장의 장세포에서 발견되는, 세포질 내에서 기생하는 작은 만곡형 박테리아이다. 현재, 이들 박테리아는 PPE의 병인체(etiological agent)로 밝혀졌으며, 로소니아 인트라셀룰라리스라 불린다.
여러 해에 걸쳐, 로소니아 인트라셀룰라리스는 원숭이, 토끼, 흰족제비, 햄스터, 여우, 말, 및 타조와 에뮤와 같은 다양한 기타 동물을 비롯하여 실질적으로 모든 동물에 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌다. 로소니아 인트라셀룰라리스는 진핵생물 장세포에서만 증식하는 그람 음성의 편모형 박테리아이며, 무세포 배양에 대해서는 설명된 바가 없다. 세포에서 살아남고 증식하기 위해, 로소니아 인트라셀룰라리스는 분열하는 선와 세포(crypt cell)에 침투해야 한다. 박테리아는 세포막과 회합한 뒤, 유입 액포(entry vacuole)를 통해 빠르게 장세포로 들어간다. 그 뒤 장세포는 (3시간 내에) 빠르게 파괴되며, 박테리아는 세포질에서 생장하여 다량으로 증식한다. 박테리아가 감염된 세포의 성숙을 저해하고 유사 분열이 계속 일어나게 하여, 형성부전성 선와 세포를 형성하는 메커니즘은 아직 이해되지 않았다.
현재 로소니아 인트라셀룰라리스의 감염, 치료 및 이 질환의 조절에 대한 이해는, 로소니아 인트라셀룰라리스가 무세포 배지에서 배양될 수 없다는 사실로 인해 제한되어 왔다. 래트 장세포에서 로소니아 인트라셀룰라리스를 성공적으로 공배양했다는 보고서가 있었지만, 로소니아 인트라셀룰라리스와 싸우기 위한 비활성화된 백신에 대한 개발을 이끌어내지는 못했다. 그러나 이러한 백신에 대한 요구는 명백하게 존재한다.
본 발명의 목적은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 예방하기 위한 백신을 제공하는 것에 있다.
놀랍게도, 로소니아 인트라셀룰라리스는 로소니아 인트라셀룰라리스에 대해 보호 면역성을 유도할 수 있는 신규한 단백질을 생산하는 것이 발견되었다.
이 신규한 단백질을 26 kD 단백질이라 부를 것이다.
상기 신규한 단백질의 아미노산은 서열 번호 2로 서열 식별자에 나타나 있다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열화된 바 있으며, 이의 핵산 서열은 서열 식별자에서 서열 번호 1로 나타나 있다. 상기 유전자는 또한 실시예에서는 "유전자 5608"로 언급될 것이다.
다수의 상이한 핵산 서열이 한 단백질 및 동일한 단백질을 코딩할 수 있음은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이 현상은 대개 아미노산을 코딩하는 각 트리플릿의 2번째 염기, 특히 3번째 염기의 워블(wobble)로서 알려져 있다. 이 현상으로 인해 동일한 단백질을 코딩하는 2개의 핵산 서열에 대한 이종성이 약 30%가 될 수 있다. 따라서, 서열 상동성이 약 70%인 2개의 핵산 서열은 한 단백질 및 동일한 단백질을 코딩할 수 있다.
따라서, 한 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 및 이 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산의 일부에 관한 것으로서, 상기 핵산 또는 이의 일부는 서열번호 1의 서열을 가지는 핵산과 적어도 90%의 상동성 수준을 보인다.
바람직하게는, 상기 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 또는 이 핵산의 일부는 서열 번호 1의 서열을 가지는 핵산과 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 96%의 상동성을 보인다. 더 바람직한 상동성 수준은 98% 또는 100%이다.
뉴클레오티드 상동성 수준은 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html 에서 찾을 수 있는 하위프로그램인 "BLASTN"을 선택하여 컴퓨터 프로그램 "BLAST 2 SEQUENCES"를 사용하여 측정할 수 있다.
이 프로그램은 문헌 [Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250(1999)]을 참조한다. 사용된 파라미터는 디폴트 파라미터이다: 일치도 가산점(Reward for a match): + 1. 불일치도 감산점(Penalty for a mismatch): -2. 오픈 갭(Open gap): 5. 익스텐션 갭(Extension gap): 2. 갭 x_드롭오프(Gap x_dropoff): 50.
특정 핵산이 본 발명에 따른 핵산인지 아닌지를 결정하기 위한 다른 접근법은, 특정 핵산이 엄중한 조건 하에 서열 번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산에 하이브리드하는지에 관한 것이다.
핵산이 엄중한 조건 하에 서열 번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열에 하이브리드하는 경우, 본 발명에 따른 핵산인 것으로 간주한다.
엄중한 조건의 정의는 하기 Meinkoth 및 Wahl의 화학식에 따른다(1984. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. Anal. Biochem. 138: 267-284).
Tm = [81.5℃ + 16.6(log M) + 0.41(GC(%)) - 0.61(포름아미드(%)) - 500/L] - 1℃/1% 불일치도
상기 화학식에서, M은 1가 양이온의 몰 농도이고; GC(%)는 DNA 중 구아노신 및 사이토신 뉴클레오티드의 백분율이며; L은 염기쌍에서 하이브리드의 길이이다.
엄중한 조건이란, 핵산 또는 이의 단편이 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 핵산과 많아야 10%의 불일치도를 보이는 경우에도, 상기 핵산 또는 이의 단편이 여전히 하이브리드하고 있는 조건을 말한다.
본 발명은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산을 개시하기 때문에, 처음으로 상기 단백질을 충분한 양으로 얻을 수 있다. 이는 예컨대 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 발현 시스템을 사용하여 수행할 수 있다.
따라서, 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 DNA 단편에 관한 것이다. 상기 DNA 단편은, 예컨대 본 발명에 따른 핵산을 클로닝하는 플라스미드일 수 있다. 상기 DNA 단편은, 예컨대 후술되는 바와 같이 프라이머로 사용하기 위한 DNA의 양을 증가시키는 데 유용하다.
핵산의 발현을 위해서는, 적절한 프로모터를 핵산에 기능적으로 연결시켜, 이 핵산이 프로모터의 조절 하에 있는 것이 반드시 필요하다. 이 프로모터는 단백질 발현을 위해 숙주 세포로서 사용되는 세포에서 유전자를 전사시킬 수 있는, 임의의 진핵 생물, 원핵 생물 또는 바이러스 프로모터에 이르는 범위 중에서 선택된다는 사실은 당업자에게 명백한 것이다.
따라서, 본 구체예의 더 바람직한 형태는 기능적으로 연결된 프로모터의 조절 하에 있는, 본 발명에 따른 DNA 단편 또는 핵산을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 이는, 예컨대, 표준 분자 생물학 기법(Sambrook, J. and Russell, D.W., Molecular cloning: a laboratory manual, 2001. ISBN 0-87969-577-3)을 사용하여 이룰 수 있다. 기능적으로 연결된 프로모터는 이들이 연결되어 있는 핵산의 전사를 조절할 수 있는 프로모터이다.
이러한 프로모터는 로소니아 프로모터, 예컨대 26 kD 유전자를 코딩하는 유전자의 생체내 발현과 관련된 프로모터일 수 있으나, 단, 이 프로모터는 발현에 사용되는 세포에서 기능성이다. 또한, 상기 프로모터는 이종성 프로모터일 수 있다. 숙주 세포가 박테리아인 경우, 사용될 수 있는 유용한 발현 조절 서열은 Trp 프로모터 및 오퍼레이터(Goeddel, et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); lac 프로모터 및 오퍼레이터(Chang, et al., Nature, 275, 615, 1978); 외막 단백질 프로모터(Nakamura, K. and Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775, 1982); 박테리오파지 람다 프로모터 및 오퍼레이터(Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688, 1983); α-아밀라제(B. subtilis) 프로모터 및 오퍼레이터, 종결 서열, 및 선별된 숙주 세포와 융화성이 있는 기타 발현 증강 및 조절 서열을 포함한다.
숙주 세포가 효모인 경우, 유용한 발현 조절 서열은, 예컨대, α- 교배 인자를 포함한다. 곤충 세포의 경우, 배큘로바이러스의 p10 프로모터 또는 폴리헤드린을 사용할 수 있다(Smith, G. E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). 숙주 세포가 포유류 세포인 경우, 예시적으로 유용한 발현 조절 서열은 SV-40 프로모터(Berman, P. W. et al., Science, 222, 524-527, 1983) 또는 메탈로티오네인 프로모터(Brinster, R. L., Nature, 296, 39-42, 1982) 또는 열 충격 프로모터(Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985)를 포함한다.
박테리아, 효모, 진균류, 곤충 및 포유류 세포 발현 시스템은 매우 흔하게 사용되는 시스템이다. 이 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 일반적으로 예컨대 Invitrogen(www.invitrogen.com), Novagen(www.merckbiosciences.de) 또는 Clontech Laboratories Inc.(미국 캘리포니아주 94303-4607 팔로 알토 파비안 웨이 4030에 소재)를 통해 시판되고 있다. 상기 발현 시스템 다음으로는 기생충계 발현 시스템이 매우 매력적인 발현 시스템이다. 이 시스템은, 예컨대 프랑스 특허 출원 번호 제2,714,074호, 및 US NTIS 공개 번호 US 08/043109(Hoffman, S. and Rogers, W.: Public. Date 1 December 1993)에 기재되어 있다.
본 발명의 본 구체예의 좀 더 바람직한 형태는, 본 발명에 따른 26 kD 단백질을 코딩하는 핵산 또는 이의 면역원성 단편, 본 발명에 따른 DNA 단편 또는 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 생 재조합 운반체(LRC)에 관한 것이다. 상기 운반체는, 예컨대, 박테리아 및 바이러스이다. 이들 LRC는 추가 유전 정보, 이 경우에는 본 발명에 따른 26 kD 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산을 클로닝하는 미생물 또는 바이러스이다. 상기 LRC로 감염된 동물은 운반체의 면역원에 대해서뿐 아니라, 유전자 코드를 LRC, 예컨대 26 kD 단백질로 추가 클로닝하기 위한 단백질(들)의 면역원성 부분에 대해 면역원성 반응을 생성할 것이다.
박테리아 LRC의 예로는, 당업자에게 공지되어 있는 감독된(attenuated) 살모넬라 균주를 사용할 수 있다.
생 재조합 운반체 기생충은 문헌 [Vermeulen, A. N. (Int. Journ. Parasitol. 28: 1121-1130(1998))]에 기재되어 있다.
또한, LRC 바이러스는 핵산을 표적 세포로 전달하는 방식으로 사용될 수 있다. 생 재조합 운반체 바이러스는 벡터 바이러스라고도 불린다. 종종 벡터로 사용되는 바이러스는 백시니아 바이러스(Panicali et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927(1982)), 헤르페스바이러스(E.P.A. 0473210 A2) 및 레트로바이러스(Valerio, D. et al; in Baum, S.J., Dicke, K.A., Lotzova, E. and Pluznik, D.H.(Eds.), Experimental Haematology today - 1988. Springer Verlag, New York: pp. 92-99(1989))이다.
당업자에게 잘 알려져 있는 생체내 상동 재조합 기법을 사용하여, 숙주 동물에서 본 발명에 따른 삽입된 핵산의 발현을 유도할 수 있는 소정의 박테리아, 기생충 또는 바이러스의 게놈으로 재조합 핵산을 도입시킬 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 본 구체예의 다른 형태는 기능적으로 연결된 프로모터의 조절 하에 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 DNA 단편, 또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 이 형태는 또한 본 발명에 따른 26 kD 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 단편을 포함하는 생 재조합 운반체를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대, pBR322와 같은 박테리아계 플라스미드, 또는 pGEX와 같은 박테리아 발현 벡터, 또는 박테리오파지와 결합된, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 락토바실러스(Lactobacillus) 종일 수 있다. 또한 숙주 세포는 진핵 생물의 세포일 수 있는데, 예를 들어, 효모-특이적 벡터 분자와 결합된 효모 세포, 또는 벡터 또는 재조합 배큘로바이러스와 결합된 곤충 세포와 같은 고등 진핵 생물의 세포(Luckow et al; Bio-technology 6: 47-55(1988)), 예컨대, Ti-플라스미드계 벡터 또는 식물 바이러스 벡터와 결합된 식물 세포(Barton, K.A. et al; Cell 32: 1033(1983)), 또한 적절한 벡터 또는 재조합 바이러스와 결합된 Hela 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 Crandell Feline 신장 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 본 발명에 따른 신규한 단백질 및 이의 면역원성 단편에 관한 것이다.
면역원성 단편의 개념은 하기에서 정의될 것이다.
본 구체예의 한 형태는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 가지는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다.
바람직한 형태에서, 본 구체예는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96% 상동성의 서열 상동성을 보이는 상기 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 상기 상동성 수준은 98% 또는 100%인 것이 더 바람직하다.
단백질 상동성 수준은 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html 에서 찾을 수 있는 하위프로그램인 "BLASTP"를 선택하여 컴퓨터 프로그램 "BLAST 2 SEQUENCES"를 사용하여 측정할 수 있다.
상기 프로그램은 문헌 [Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250(1999)]을 참조한다. 사용된 매트릭스: "blosum62". 사용된 파라미터는 디폴트 파라미터이다: 오픈 갭: 11. 익스텐션 갭: 1. 갭 x_드롭오프: 50.
본원에 포함된 특정 단백질에 대해, 개별 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 사이에 자연 변이가 존재할 수 있음은 이해될 것이다. 이들 변이는 전체 서열에서 아미노산 차이(들)에 의해, 또는 상기 서열에서 아미노산(들)의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 부가에 의해 입증될 수 있다. 실질적으로 생물학적 활성 및 면역학적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환은 Neurath 등의 문헌 ["The Proteins" Academic Press New York(1979)]에 기재된 바 있다. 그 중에서도 특히, 관련된 아미노산 간의 아미노산 치환 또는 진화 중에 흔히 발생하는 치환은 Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val이다(문헌 [Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3] 참조). 다른 아미노산 치환은 Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val 및 Ala/Glu를 포함한다. 이 정보에 기초하여, Lipman 및 Pearson은 상동성 단백질 간의 기능적 유사성을 결정하는, 빠르고 감수성이 있는 단백질 비교법을 개발하였다(Science, 227, 1435-1441, 1985). 생성된 단백질이 이의 면역 반응성을 보유하고 있는 한, 본 발명의 예시적인 구체예의 상기 아미노산 치환뿐 아니라 결실 및/또는 삽입을 비롯한 변이는 본 발명의 범위에 속한다. 이는 본 발명에 따른 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질이 상이한 장 분리체(field isolate)로부터 분리되는 경우, 이의 상동성 수준은 약 90%이지만, 여전히 동일한 면역 특성이 있는 동일한 단백질을 나타내는 지에 대한 이유를 설명하는 것이다. 로소니아 인트라셀룰라리스에 의한 감염에 대해, 또는 적어도 임상적인 감염 징후에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질을 제공하는, 본 발명에 따른 특정 단백질의 아미노산 서열 중의 이러한 변이는 "실질적으로 면역원성에 영향을 주지 않는 것"으로 간주된다.
그러나, 예컨대, 단백질을 백신 접종의 목적 또는 항체를 배양할 목적으로 사용할 경우, 전체 단백질을 사용할 필요는 없다. 또한, 상기한 바와 같거나 또는 운반체(예, KLH)에 커플링시킨, 소위 면역원성 단편이라 불리는 단백질에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질의 단편을 사용할 수도 있다. "면역원성 단편"은 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 보유하고 있는, 즉, B 세포 또는 T 세포 에피토프를 포함하는 전장 단백질의 단편이라고 이해된다. 이 경우, 다양한 기법을 사용하여 항원 단편(결정소)을 코딩하는 DNA 단편을 쉽게 확인할 수 있다. 소위 PEPSCAN 방법이라 불리는, Geysen 등에 의해 설명된 방법(특허 출원 WO 84/03564, 특허 출원 WO 86/06487, US 특허 NR. 4,833,092, Proc. Natl Acad. Sci. 81: 3998-4002(1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274(1987))이 수행하기 쉬운 방법으로서, 이는 에피토프(면역학적으로 중요한 단백질의 영역)를 검출하기 위한 빠르고 잘 확립되어 있는 방법이다. 이 방법은 전세계적으로 사용되고 있으며, 당업자에게도 잘 알려져 있다. 특히 이 (실험) 방법은 B 세포 에피토프를 검출하는 데 적합하다. 또한, 임의의 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 경우, 현재 공지되어 있는 에피토프와의 서열적 및/또는 구조적 일치성에 기초하여 컴퓨터 알고리즘으로 특이적인 단백질 단편을 면역적으로 중요한 에피토프로서 지정할 수 있다. 이들 영역은 Hopp 및 Woods(Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248-3828(1981))에 따른 친수성 기준, 및 Chou 및 Fasman(Advances in Enzymology 47: 45-148(1987) 및 US 특허 4,554,101)에 따른 2차 구조 양상을 조합한 것에 기초하여 결정한다. 이와 유사하게, T 세포 에피토프는 Berzofsky의 양친매성 기준(Science 235, 1059-1062(1987) 및 US 특허 출원 NTIS US 07/005,885)의 도움으로 컴퓨터에 의한 서열로부터 예측할 수 있다. 요약된 개요는 문헌 [Shan Lu on common principles: Tibtech 9: 238-242(1991), Good et al on Malaria epitopes; Science 235: 1059-1062(1987), Lu for a review; Vaccine 10: 3-7(1992), Berzowsky for HIV-epitopes; The FASEB Journal 5: 2412-2418(1991)]에서 찾을 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 구체예의 한 형태는, 상술한 바와 같이 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 함께 약학적 허용 담체를 포함하는, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대해 돼지를 보호할 수 있는 백신에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예는 백신에 사용하기 위한 본 발명에 따른 단백질에 관한 것이다.
다른 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 예방하기 위한 백신을 제조하기 위한, 본 발명에 따른 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 백신의 제조 방법 중 하나는 감염된 장벽으로부터의 점막 스크랩핑(mucosal scraping)을 통해 얻은 박테리아로부터 유래된, 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 생화학적으로 정제하는 것이다. 그러나, 이 방법은 백신 제조에 많은 시간이 걸린다.
따라서, 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 유전자의 발현 생성물을 백신에 사용하는 것이 더 편리하다. 26 kD 단백질을 코딩하는 유전자의 핵산이 본 발명에 의해 제공된다.
이들 유전자의 발현 생성물에 기초한 상기 백신은 본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 이의 면역원성 단편과 후술되는 약학적 허용 담체를 혼합하여 쉽게 제조할 수 있다.
또는, 본 발명에 따른 백신은 본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 이의 면역원성 단편을 발현할 수 있는, 상기한 생 재조합 운반체를 포함할 수 있다. 예컨대 장 상피 또는 예컨대 호흡 상피에 감염되는 살모넬라 운반체 또는 바이러스 운반체에 기초한 상기 백신은 서브유닛 백신에 대해 로소니아 인트라셀룰라리스의 자연 감염 경로를 더 잘 모방한다는 장점을 가진다. 또한, 소량의 재조합 운반체만이 면역화에 필요한데, 이러한 점에서 상기 백신은 자가 증식한다는 장점을 가진다.
상기한 백신은 모두 백신 접종을 활성화시키는 데, 즉, 숙주의 면역 시스템을 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단백질에 의해 유발시켜, 이들 단백질에 대한 항체를 만드는 데 기여한다.
또는, 상기 항체를 토끼 등에서 생산할 수 있거나, 또는 후술되는 항체-생성 세포주로부터 수득할 수 있다. 그 뒤, 상기 항체는 숙주 세포에 투여할 수 있다. 이 백신 접종 방법, 즉 수동 백신 접종 방법은 동물이 이미 감염되어 자연 면역 반응을 유발할 수 있는 시간이 없는 경우에 선택할 수 있는 백신 접종 방법이다. 또한, 이는 면역 반응이 제대로 일어나지 않는 동물을 백신 접종하기에 바람직한 방법이다. 이 경우, 로소니아 인트라셀룰라리스에 대해 투여되는 항체는 박테리아에 직접 결합할 수 있다. 이는 로소니아 인트라셀룰라리스의 성장을 즉시 감소시키거나 정지시킨다는 장점을 가진다.
따라서, 본 발명의 본 구체예의 다른 형태는 본 발명에 따른 26 kD 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질에 대한 항체를 포함하는 백신에 관한 것이다.
또한 백신은 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 숙주 세포에 기초할 수 있다.
백신 접종의 대안으로 효율적인 방법은 적절한 항원을 코딩하는 DNA로 직접 백신 접종하는 것이다. 단백질을 코딩하는 DNA로 직접 백신 접종하는 것은 다수의 상이한 단백질에 대해 성공적이어 왔다(예, Donnelly 등의 문헌 [The Immunologist 2: 20-26(1993)]에서 리뷰된 바와 같음).
이 백신 접종 방법은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대해 돼지를 백신 접종시킬 경우에 매우 매력적인 방법이다.
따라서, 본 발명의 본 구체예의 다른 형태는 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 핵산 또는 본 발명에 따른 이의 면역원성 단편을 포함하는 백신, 및 상기 핵산을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 구체예의 다른 형태는 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 백신에 관한 것이다.
DNA 백신은, 예컨대, 무침 주사기를 사용하여 피내를 통해 쉽게 투여될 수 있다. 이러한 투여 방법으로 백신 접종할 동물의 세포에 DNA를 직접 전달한다. 1∼100 ㎍ 범위의 DNA 양을 투여할 경우 매우 좋은 결과를 얻을 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명에 따른 백신은 기타 돼지 병원성 유기체 및 바이러스로부터 유래된 하나 이상의 항원, 또는 상기 항원을 코딩하는 유전 정보를 더 포함한다.
상기 유기체 및 바이러스는 슈도라비스 바이러스(Pseudorabies virus), 돼지 인플루엔자 바이러스(Porcine influenza virus), 돼지 파르보 바이러스(Porcine parvo virus), 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastro-enteritis virus), 로타바이러스(Rotavirus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로트릭스 류시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), 해모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 마이코플라즈마 히오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae), 브라키스피라 히오디센테리애(Brachyspira hyodysenteriae) 및 악티노바실러스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 모든 백신은 약학적 허용 담체를 포함한다. 약학적 허용 담체는, 예컨대, 멸균수 또는 멸균 생리식염수일 수 있다. 더 복잡한 형태로 담체는, 예컨대, 완충액일 수 있다.
백신의 제조 방법은 본 발명에 따른 단백질, 또는 이의 면역원성 단편 및 약학적 허용 담체를 혼합하는 단계를 포함한다.
또한 바람직하게 본 발명에 따른 백신은 면역보조제(adjuvant)를 함유할 수 있다. 일반적으로 면역보조제는 비특이적인 방식으로 숙주의 면역 반응을 증가시키는 성분을 포함한다. 다수의 상이한 면역보조제가 당업자에게 공지되어 있다. 예시적인 면역보조제로는 프로인트 완전 면역보조제, 프로인트 불완전 면역보조제, 비타민 E, 비이온성 블록 공중합체, 뮤라밀디펩티드, Quill A(R), 광유(예, Bayol(R) 또는 Markol(R)), 식물성 유지, 및 Carbopol(R)(단독 중합체) 또는 Diluvac(R) Forte가 있다. 또한 백신은 소위 "비히클"을 포함할 수도 있다. 비히클은 폴리펩티드에 공유 결합된 것이 아니라 부착되어 있는 화합물이다. 종종 사용되는 비히클 화합물은, 예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알루미늄, 실리카, 카올린 및 벤토나이트이다.
항원이 부분적으로 포매되어 있는 이러한 비히클의 특수 형태는 소위 ISCOM이라 불린다(EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).
또한, 백신은 하나 이상의 적합한 표면-활성 화합물 또는 유화제(예, Span 또는 Tween)를 포함할 수 있다.
종종 백신은, 예컨대, 분해되기 쉬운 폴리펩티드가 분해되는 것을 막고, 백신의 저장 수명을 연장시키거나, 또는 동결 건조 효율을 개선하기 위해 안정화제와 혼합시킨다. 유용한 안정화제로는 SPGA(Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509(1950)), 탄수화물(예, 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 전분, 수크로스, 덱스트란 또는 글루코스), 단백질(예, 알부민 또는 카세인) 또는 이의 분해 산물, 및 완충액(예, 알칼리 금속 인산염)이 있다.
또한, 백신은 생리적 허용 희석제에 현탁시킬 수 있다.
면역 보조화시키고, 비히클 화합물 또는 희석제를 첨가하며, 폴리펩티드를 유화시키거나 안정화시키는 다른 방법들도 본 발명에 포함된다는 것은 말할 필요도 없다.
본 발명에 따른 백신은 1∼100 ㎍ 범위의 양으로 투여하는 것이 매우 적합하지만, 원칙적으로 더 적은 양을 사용할 수도 있다. 면역학적으로 매우 적합하다 하더라도, 100 ㎍을 초과하는 투여량은 상업적 이유로 매력적이지 않을 것이다.
감독된 생 재조합 운반체(예, 상술한 LRC-바이러스 및 박테리아)에 기초한 백신은 훨씬 더 적은 양으로 투여될 수 있는데, 이는 상기 백신이 감염 도중 스스로 증식하기 때문이다. 따라서, 각각의 박테리아 및 바이러스에 대해 매우 적합한 양은 103∼109 CFU/PFU일 것이다.
다양한 투여 방법을 적용할 수 있다. 경구 투여가 매우 매력적인 투여 방법인데, 이는 상기한 감염이 소화관 감염이기 때문이다. 바람직한 경구 투여 방법은, 당업자에게 공지되어 흔히 사용되고 있는 캡슐 내에 백신을 패키징하는 방법으로서, 이는 산도가 높은 위를 통과한 후에만 분해된다. 또한, 위의 pH를 일시적으로 높이기 위해, 당업자에게 공지되어 있는 화합물과 백신을 혼합할 수 있다.
전신 투여, 예컨대, 백신의 근내 투여도 적합하다. 이 경로를 따를 경우, 전신 투여에 대해 당업자에게 알려져 있는 표준 절차가 매우 적절하다.
질환에 대한 보호라는 관점에서, 로소니아 인트라셀룰라리스의 감염을 빠르고 정확하게 진단하는 것이 중요하다.
따라서 본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 검출하는 데 적합한 진단 도구(diagnostic tool)를 제공하는 것을 또다른 목적으로 한다.
혈청 내 로소니아 인트라셀룰라리스 항체를 검출하기 위한 진단 테스트는, 예컨대, 본 발명에 따른 26 kD 단백질 또는 이의 항원성 단편을 ELISA-플레이트의 웰 벽에 코팅시킨 간단한 표준 샌드위치-ELISA-테스트일 수 있다. 상기 항체의 검출 방법은, 예컨대, 테스트할 포유동물로부터 얻은 혈청과 26 kD 단백질 또는 이의 항원성 단편을 항온처리한 뒤, 예컨대, 적절한 포유동물 항체에 대해 표지된 항체를 항온처리하는 것이다. 항온처리 후, 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 존재 또는 부재가 색 반응으로 드러날 수 있다. 진단 테스트 시스템의 다른 예로는, 예컨대, 테스트할 포유동물의 혈청과, 본 발명에 따른 26 kD 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하는 웨스턴 블롯을 항온처리한 뒤, 이 블롯을 분석하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명의 다른 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출하기 위한 진단 테스트에 관한 것이다. 이 진단 테스트는 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.
로소니아 인트라셀룰라리스 항원의 특이적인 26 kD 단백질의 항원성 물질의 검출에 기초하며, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 검출하는 데 적합한 진단 테스트는, 예컨대, 표준 ELISA 테스트일 수도 있다. 상기 테스트의 한 예로서, ELISA 플레이트의 웰 벽을 26 kD 단백질에 대한 항체로 코팅할 수 있다. 테스트할 물질과 항온처리한 뒤, 표지된 항-로소니아 인트라셀룰라리스 항체를 웰에 첨가한다. 그 뒤, 로소니아 인트라셀룰라리스로부터의 항원성 물질의 존재는 색 반응으로 드러난다.
따라서, 본 발명의 다른 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스의 항원성 물질을 검출하기 위한 진단 테스트에 관한 것이다. 이 진단 테스트는 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편에 대한 항체를 포함한다.
상술한 바와 같이 발현된 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편을 사용하여, 폴리클로날, 모노클로날 특이적이거나, 또는 모노클로날(또는 이의 유도체)일 수 있는 항체를 생산할 수 있다. 폴리클로날 항체가 바람직한 경우, 폴리클로날 혈청을 생산하고 처리하기 위한 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예, 문헌 [Mayer and Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987] 참조).
본 발명에 따른 폴리펩티드, 또는 본 발명에 따른 이의 변이체 또는 단편에 대해 반응성이 있는 모노클로날 항체는 당업자에게 공지되어 있는 기법으로 동종 번식된 마우스에 면역성을 부여하여 제조할 수 있다(Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
본 발명에 따른 항체를 대량 생산하기 위한 방법 역시 당업자에게 알려져 있다. 이러한 방법은 파지 디스플레이용 필라멘트형 파지에서 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 유전 정보(의 단편)의 클로닝에 의존적이다. 이러한 기법은 "http://aximt1.imt.unimarburg.de/~rek/aepphage.html."에서 "필라멘트성 파지 디스플레이"라는 제목 하의 "항체 공학 페이지"에 기재되어 있으며, 문헌 [Trends Biotechn. 12: 262-267(1994)]에서 Cortese, R. 등에 의한 리뷰 논문, 문헌 [Trends Biotechn. 12: 173-183(1994)]에서 Clackson, T. 및 Wells, J.A.에 의한 리뷰 논문, 문헌 [J. Biol. Chem. 267: 16007-16010(1992)]에서 Marks, J.D. 등에 의한 리뷰 논문, 문헌 [Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455(1994)]에서 Winter, G. 등에 의한 리뷰 논문, 및 문헌 [Biotechn. Adv. 12: 539-555(1994)]에서 Little, M. 등에 의한 리뷰 논문에 기재되어 있다. 그 뒤 낙타과(camelid) 중쇄 항체를 발현하는 낙타과 발현 라이브러리를 스크리닝하는 데 파지를 사용한다(문헌 [Muyldermans, S. and Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn. 12: 131-140(1999)] 및 [Ghahroudi, M.A. et al., FEBS Letters 414: 512-526(1997)]). 소정의 항체를 발현하는 라이브러리로부터 얻은 세포는 복제한 뒤, 항체를 대량으로 발현시키는 데 사용할 수 있다.
실시예 1
감염된 돼지 회장으로부터 로소니아 인트라셀룰라리스의 분리
조직 병리학 및 항산성(acid-fast)의 Ziehl-Neelsen 염색법으로 확인되는 로소니아 인트라셀룰라리스에 감염된 회장은 PE로 죽은 돼지로부터 수거하여, -80℃에서 저장하였다. 로소니아 인트라셀룰라리스를 해동시킨 뒤, 감염된 소장벽으로부터 얻은 점막 스크래핑에서 박테리아를 분리하였다. 회장 스크래핑은 옴니믹서(omnimixer)에서 PBS로 반복적으로 균질화시켜, Lawson 등에 의한 문헌 [Vet. Microbiol. 10: 303-323(1985)]에 기재된 바와 같이 세포내 박테리아를 배출시켰다. 세포 잔해를 제거하기 위해 저속 원심 분리를 수행한 뒤 얻은 상청액은 5.0 ㎛, 3.0 ㎛, 1.2 ㎛ 및 0.8 ㎛ 여과기(Millipore)를 통해 여과시켰다. 그 뒤, 여과액은 30분간 8,000 g에서 원심분리하여, 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아의 소형 펠릿을 얻었다. 이들 박테리아는 Percoll 구배를 사용하여 더 정제하였다. 정제된 박테리아는 PCR로 평가하여 확인하는 반면(Jones et al., J. Clin. Microbiol. 31: 2611-2615(1993)), 존재하는 임의의 오염된 박테리아 또는 장 잔해물을 확인하기 위해서는 위상차 현미경으로 분리된 박테리아의 순도(> 95%)를 평가하였다.
박테리아 균주 및 플라스미드
로소니아 인트라셀룰라리스 세포는 상기한 바와 같이 감염된 회장 물질로부터 분리하였다. 벡터 pLysSrare 및 플라스미드 pET22b를 포함하는 이. 콜라이(E. coli) 숙주 균주 BL21star(DE3)는 Novagen사(미국 위스콘신주 매디슨)로부터 구입하였다. 이. 콜라이 균주 TOP1OF'는 Invitrogen사(네덜란드 그로닝겐)로부터 구입하였다. 30% 글리세롤을 함유하는 모든 박테리아 균주의 저장물(stock)은 -70℃에서 저장하였다. Luria Bertani(LB) 배양액 및 LB 플레이트는 표준 절차에 따라 제 조하였다.
DNA 분리
고도로 정제된 로소니아 인트라셀룰라리스 염색체 DNA를 얻기 위해, Biorad사의 염색체 DNA 분리 키트(네덜란드 베넨달 Biorad사)를 사용하여 박테리아 세포로부터 DNA를 제조하였다. 플라스미드 DNA는 Qiagen 제품을 사용하여 분리하였다.
PCR 증폭
PCR 증폭은 Expand High Fidelity 효소 믹스 52 U/㎖, MgCl2 2.5 mM과 Expand HF 완충액, dNTP 16 mM(미국 위스콘신주 Promega사), 프라이머 20 pmole, 및 주형으로서의 로소니아 인트라셀룰라리스 염색체 DNA 15 ng을 사용하여 수행하였다.
표준 사용(즉, 콜로니 PCR)을 위한 PCR 혼합물은 Supertaq 20 U/㎖, 및 dNTP 8 mM(미국 위스콘신주 Promega사), 프라이머 10 pmole 및 주형 15 ng을 함유하는 Supertaq 완충액(영국 캠브리지 HT Biotechnology Ltd)을 함유하였다.
결찰 및 형질변환
결찰은 밤새 16℃에서 결찰 효소(미국 Gibco BRL Life Technologies사) 1 유니트가 있는 1 x 결찰 완충액 중에서 수행하였다. 결찰 반응액 1 ㎕는 이. 콜라이 반응능 세포(competent cell)를 열 충격에 의해 형질변환시켰다. BL21star(DE3) 이. 콜라이 반응능 세포 및 TOP1OF' 이. 콜라이 반응능 세포는 표준 방법을 사용하여 항체 반응 능력이 있도록 만들었다.
10 × HIS 융합 단백질의 발현
발현 벡터의 DNA 서열을 확인한 뒤, 발현 벡터를 pLysSrare를 함유하는 BL21star(DE3)로 형질변환시켰다. 생성된 균주는 암피실린 100 ㎍/㎖가 있는 LB 5 ㎖에서 200 rpm으로 37℃에서 밤새 생장시켰다. 밤새 생장시킨 상기 배양물은 암피실린 100 ㎍/㎖가 있는 LB 50 ㎖에서 1:100으로 희석시켰다. 상기 배양물은 OD600이 0.5가 될 때까지 동일한 조건 하에서 생장시켰다. 이 배양물은 최종 농도가 1 mM가 되도록 IPTG로 유도하고, 3시간 더 계속해서 생장시켰다. 분석을 위해 샘플 100 ㎕를 취하였다. pLysSrare를 함유하는 이. 콜라이 균주 BL21star(DE3)를 동일한 조건 하에서 생장 및 유도시키고, 음성 대조구로서 샘플을 취하였다. 이 샘플은 SDS PAGE로 분석하였다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅
NuPAGE 전기영동 시스템(Invitrogen, www.invitrogen.com)으로부터의 4∼12% Bis-Tris 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 웨스턴 블롯팅은 반건조 블로팅법을 사용하여 수행하였다. 웨스턴 블롯은 물:오일 = 45:55인 에멀션 중에서 전체 세포 제조물에 대해 생장시킨 닭 항-로소니아 폴리클로날 혈청을 사용하여 전개시키거나, 또는 정제된 로소니아 인트라셀룰라리스 세포로 경구 감염시킨 동물로부터 수득한 돼지 혈청 및 통상적으로 로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대한 임상 징후 및 사후 상해를 보이는 돼지 혈청을 사용하여 전개시켰다. 혈청은 벡터 pLysSrare를 포함하는 BL21star(DE3)로부터의 등부피 미정질 세포 추출물을 사용하 여 4℃에서 4시간 동안 사전 흡착시켰다.
결과
T7계 발현 벡터에서 로소니아 인트라셀룰라리스 유전자 5608의 클로닝
유전자 5608은 프라이머 2179(CATGCCATGGATTTGATGGAACAGGATTAAAG) 및 프라이머 2180(CCGCTCGAGCCATAACCCCTTTTCGATAC)을 사용하여 증폭시켰다. 이 과정에서, 5' NcoI 및 3' XhoI 부위를 PCR 산물에 도입시켰다. 수득한 PCR 산물은 제한 효소 NcoI 및 XhoI를 사용하여 침지시켰다. 그 뒤 침지된 PCR 산물은 동일한 2개의 제한 효소로 절단된 pET22b에 결찰시켰다. 결찰 혼합물은 이. 콜라이 TOP1OF로 형질 변환시키고, 밤새 37℃에서 항온처리시켰다. 추정되는 형질변환체가 올바른 플라스미드인지는 콜로니 PCR을 사용하여 확인하였다. 콜로니 PCR 포지티브 형질변환체의 플라스미드 삽입물은 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인하였다. 클로닝 방법에 기초하여 예상되는 서열을 포함하는 클론 중 하나를 선택하여 pET5608로 지정하였다.
이. 콜라이에서 T7 프로모터로부터 로소니아 인트라셀룰라리스 유전자 5608의 발현
플라스미드 pET5608은 BL21Star(DE3) pLysSrare로 형질변환시켰다. 생성된 균주는 상기한 바와 같이 재조합 단백질 생산에 대해 테스트하였다. 유도된 배양물의 샘플 및 대조군 샘플은 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 분석하였다(도 1A). 유도되지 않은 샘플과 비교했을 때(도 1A, 레인 2), 유도한 지 3시간 후에 취한 샘플(도 1A, 레인 3)에서는 대략 26 kDa의 확실한 단백질 밴드가 관찰되었다.
또한 동일한 샘플을 돼지 혈청 및 닭 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 정제된 로소니아 인트라셀룰라리스 세포로 경구 감염된 돼지로부터의 혈청(도 1B, 레인 3), 및 닭 항-로소니아 인트라셀룰라리스 혈청으로 경구 감염된 돼지로부터의 혈청(도 1C, 레인 3)을 사용하여 단백질 5608과의 반응을 관찰하였다.
결론 : 26 kD 백신 성분은 성공적으로 다량 발현될 수 있으며, 실제로 경구 감염시킨 돼지 항-로소니아 인트라셀룰라리스 혈청 및 닭 항-로소니아 인트라셀룰라리스 혈청 모두에 의해 명백하게 인지된다.
도 1.
(A) SDS-PAGE에 의한 이. 콜라이 BL21STAR/pLysSRARE 중 로소니아 인트라셀룰라리스 유전자 5608의 과발현 분석, 및 (B) 폴리클로날 돼지 혈청 및 (C) 폴리클로날 닭 혈청을 이용한 웨스턴 블로팅.
레인 1, 분자량 마커;
레인 2, pET5608 T=0;
레인 3, pET5608 T=3.
화살표는 발현 생성물의 위치를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> AKZO Nobel N.V.
<120> Lawsonia intracellularis 26 kD subunit vaccine
<130> 2003.023
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 856
<212> DNA
<213> Lawsonia intracellularis
<220>
<221> CDS
<222> (80)..(823)
<400> 1
atggctataa gcgattgaat aacagaaaat aacacctatg cctgaaattt tcgacgcgtc 60
gaaattttta gaggaaacc atg aaa aaa cta ctc ctt ttg tta tct att ctg 112
Met Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10
ttt cta acc cca agt att acc ttg gcg gaa ggt aat act ttc aat gat 160
Phe Leu Thr Pro Ser Ile Thr Leu Ala Glu Gly Asn Thr Phe Asn Asp
15 20 25
agt ttc aac aag gct aag cgc ata ctg caa gat gag gtg tat tac gac 208
Ser Phe Asn Lys Ala Lys Arg Ile Leu Gln Asp Glu Val Tyr Tyr Asp
30 35 40
cac caa gtt aca cta tac tgc gga tat gaa tat gat gac caa aaa agg 256
His Gln Val Thr Leu Tyr Cys Gly Tyr Glu Tyr Asp Asp Gln Lys Arg
45 50 55
ata tgt ctc cct gat gga ttt ata gca gag aaa cat caa aaa aga tca 304
Ile Cys Leu Pro Asp Gly Phe Ile Ala Glu Lys His Gln Lys Arg Ser
60 65 70 75
tat aaa att gag tgg gaa cat agt gtg cct gct gag aat ttt ggc aga 352
Tyr Lys Ile Glu Trp Glu His Ser Val Pro Ala Glu Asn Phe Gly Arg
80 85 90
gct ttt act gaa tgg cgc gaa ggt cat cct ctt tgt gta gat aat aaa 400
Ala Phe Thr Glu Trp Arg Glu Gly His Pro Leu Cys Val Asp Asn Lys
95 100 105
ggt aaa agt ttc aaa gga cga aaa tgt gca gaa aaa gta aat aaa aca 448
Gly Lys Ser Phe Lys Gly Arg Lys Cys Ala Glu Lys Val Asn Lys Thr
110 115 120
tat aga tat atg cag tct gat atg tac aat ttg ttt cca gca gtc ggg 496
Tyr Arg Tyr Met Gln Ser Asp Met Tyr Asn Leu Phe Pro Ala Val Gly
125 130 135
tct gtc aat gct gcg aga agc aat aag caa tac tca gag tta ctt gga 544
Ser Val Asn Ala Ala Arg Ser Asn Lys Gln Tyr Ser Glu Leu Leu Gly
140 145 150 155
gtt caa tct gct ttt gga acg tgt gag gca aaa ata gat ggg aat aga 592
Val Gln Ser Ala Phe Gly Thr Cys Glu Ala Lys Ile Asp Gly Asn Arg
160 165 170
ttc gaa cca ccg gat aga gct aaa ggt caa gta gcc cgt gct gct ctt 640
Phe Glu Pro Pro Asp Arg Ala Lys Gly Gln Val Ala Arg Ala Ala Leu
175 180 185
tat atg gat aaa gag tac aag gaa tac aat cta agt cgt cag caa aga 688
Tyr Met Asp Lys Glu Tyr Lys Glu Tyr Asn Leu Ser Arg Gln Gln Arg
190 195 200
aga ctt ttt gag gct tgg agt aat atg tat cca gtc gat gaa tgg gag 736
Arg Leu Phe Glu Ala Trp Ser Asn Met Tyr Pro Val Asp Glu Trp Glu
205 210 215
tgt aca cga gcc aaa cga atc gaa tct ata cag gga aat gaa aat att 784
Cys Thr Arg Ala Lys Arg Ile Glu Ser Ile Gln Gly Asn Glu Asn Ile
220 225 230 235
ttt gta aaa aat atg tgt atc gaa aag ggg tta tgg taa acaaacgagg 833
Phe Val Lys Asn Met Cys Ile Glu Lys Gly Leu Trp
240 245
acaatataaa tactacctaa gta 856
<210> 2
<211> 247
<212> PRT
<213> Lawsonia intracellularis
<400> 2
Met Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile Leu Phe Leu Thr Pro Ser
1 5 10 15
Ile Thr Leu Ala Glu Gly Asn Thr Phe Asn Asp Ser Phe Asn Lys Ala
20 25 30
Lys Arg Ile Leu Gln Asp Glu Val Tyr Tyr Asp His Gln Val Thr Leu
35 40 45
Tyr Cys Gly Tyr Glu Tyr Asp Asp Gln Lys Arg Ile Cys Leu Pro Asp
50 55 60
Gly Phe Ile Ala Glu Lys His Gln Lys Arg Ser Tyr Lys Ile Glu Trp
65 70 75 80
Glu His Ser Val Pro Ala Glu Asn Phe Gly Arg Ala Phe Thr Glu Trp
85 90 95
Arg Glu Gly His Pro Leu Cys Val Asp Asn Lys Gly Lys Ser Phe Lys
100 105 110
Gly Arg Lys Cys Ala Glu Lys Val Asn Lys Thr Tyr Arg Tyr Met Gln
115 120 125
Ser Asp Met Tyr Asn Leu Phe Pro Ala Val Gly Ser Val Asn Ala Ala
130 135 140
Arg Ser Asn Lys Gln Tyr Ser Glu Leu Leu Gly Val Gln Ser Ala Phe
145 150 155 160
Gly Thr Cys Glu Ala Lys Ile Asp Gly Asn Arg Phe Glu Pro Pro Asp
165 170 175
Arg Ala Lys Gly Gln Val Ala Arg Ala Ala Leu Tyr Met Asp Lys Glu
180 185 190
Tyr Lys Glu Tyr Asn Leu Ser Arg Gln Gln Arg Arg Leu Phe Glu Ala
195 200 205
Trp Ser Asn Met Tyr Pro Val Asp Glu Trp Glu Cys Thr Arg Ala Lys
210 215 220
Arg Ile Glu Ser Ile Gln Gly Asn Glu Asn Ile Phe Val Lys Asn Met
225 230 235 240
Cys Ile Glu Lys Gly Leu Trp
245
Claims (16)
- 26 kD 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 단백질을 코딩하는 핵산 또는 상기 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 상기 핵산의 일부로서, 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지는 핵산과 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96%의 상동성을 보이는 핵산 또는 이의 일부.
- 제1항에 따른 핵산을 포함하는 DNA 단편.
- 기능적으로 연결된 프로모터의 조절 하에, 제1항에 따른 핵산 또는 제2항에 따른 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 따른 핵산, 제2항에 따른 DNA 단편 또는 제3항에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 생 재조합 운반체(live recombinant carrier).
- 제1항에 따른 핵산, 제2항에 따른 DNA 단편, 제3항에 따른 재조합 DNA 분자 또는 제4항에 따른 생 재조합 운반체를 포함하는 숙주 세포.
- 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96%의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 포 함하는, 26 kD 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 또는 이의 면역원성 단편.
- 백신에서 사용하기 위한, 제6항에 따른 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질.
- 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 예방하기 위한 백신의 제조를 위한, 제6항에 따른 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질의 용도.
- 제1항에 따른 핵산, 제2항에 따른 DNA 단편, 제3항에 따른 재조합 DNA 분자, 제4항에 따른 생 재조합 운반체, 제5항에 따른 숙주 세포, 또는 제6항에 따른 단백질, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 예방하기 위한 백신.
- 제9항에 있어서, 면역보조제(adjuvant)를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 돼지에 대한 병원성 미생물 또는 바이러스로부터 유래된 추가 항원, 또는 상기 항원을 코딩하는 유전 정보 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제11항에 있어서, 돼지에 대한 병원성 미생물 또는 바이러스는 슈도라비스 바이러스(Pseudorabies virus), 돼지 인플루엔자 바이러스(Porcine influenza virus), 돼지 파르보 바이러스(Porcine parvo virus), 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastro-enteritis virus), 로타바이러스(Rotavirus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로트릭스 류시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), 해모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 마이코플라즈마 히오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae), 브라키스피라 히오디센테리애(Brachyspira hyodysenteriae) 및 악티노바실러스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제6항에 기재된 단백질에 대한 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 예방하기 위한 백신.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 백신의 제조 방법으로서, 제1항에 따른 핵산, 제2항에 따른 DNA 단편, 제3항에 따른 재조합 DNA 분자, 제4항에 따른 생 재조합 운반체, 제5항에 따른 숙주 세포, 제6항에 따른 단백질, 또는 제6항에 따른 단백질에 대한 항체, 및 약학적 허용 담체를 혼합하는 것을 포함하는 제조 방법.
- 제6항에 기재된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출하기 위한 진단 테스트.
- 제6항에 기재된 단백질 또는 이의 단편에 대한 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스의 항원성 물질을 검출하기 위한 진단 테스트.
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