JPH10290695A - アクチノバシラス・プレウロニューモニアの弱毒化生菌 - Google Patents

アクチノバシラス・プレウロニューモニアの弱毒化生菌

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JPH10290695A
JPH10290695A JP10098877A JP9887798A JPH10290695A JP H10290695 A JPH10290695 A JP H10290695A JP 10098877 A JP10098877 A JP 10098877A JP 9887798 A JP9887798 A JP 9887798A JP H10290695 A JPH10290695 A JP H10290695A
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JP10098877A
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Ruund Philip Antoon M Segers
ルード・フイリツプ・アントーン・マリア・シーゲルス
Joachim Frey
ヨアヒム・フレイ
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Akzo Nobel NV
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 全てのアクチノバシラス・プレウロニューモ
ニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型に普遍的な弱毒化部位を
提供し、アクチノバシラス・プレウロニューモニアの弱
毒化生菌及びそれを含有するワクチンを提供する。 【解決手段】 本発明は産生し得る機能的ＡｐｘＩＶ毒
素がないようにａｐｘＩＶ遺伝子に変異を有するアクチ
ノバシラス・プレウロニューモニアの弱毒化生菌に関す
る。また、本発明はそのような細菌の生成方法にも関す
る。また、そのような細菌を含むワクチン及びそのよう
なワクチンの製造方法も本発明の一部である。さらに、
本発明はＡｐｘＩＶ毒素を含むサブユニットワクチン、
そのようなワクチンの製造方法及びアクチノバシラス・
プレウロニューモニアの細菌での感染に対して動物を防
御する方法に関する。加えて、本発明はａｐｘＩＶ遺伝
子のプロモーターに関する。最後に、本発明はアクチノ
バシラス・プレウロニューモニアの選択的診断のための
診断方法及びアクチノバシラス・プレウロニューモニア
野外株とワクチン株とを識別する診断方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、毒素をコードする
遺伝子に変異を有するアクチノバシラス・プレウロニュ
ーモニアの弱毒化生菌、そのような細菌の産生方法、そ
のような細菌を含むワクチン、そのようなワクチンの製
造方法、毒素を含むワクチン、そのようなワクチンの製
造方法及びアクチノバシラス・プレウロニューモニア細
菌の感染に対する動物の防御に関する。
【０００２】
【従来の技術】アクチノバシラス属に属する細菌は全て
いわゆるＲＴＸ−毒素（ＲＴＸは毒素における反復を意
味する）を産生する。
【０００３】これらの細菌の病原性に大きく寄与するの
はこれらのＲＴＸ−毒素の存在である。
【０００４】ＲＴＸ−毒素は、Ｂｒａｕｎら（Ｃｒｉｔ
ｉｃａｌ Ｒｅｖ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８
（２）：１１５−１５８（１９９１））によって広範に
検討されている。グラム陰性株におけるＲＴＸ−毒素も
Ｗｅｌｃｈ，Ｒ．Ａ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ ５／３：５２１−５２８（１９９
１））及びＷｅｌｃｈら（Ｉｎｆ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎ
ｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ４：２５４−２７２（１９９
５））において検討されている。
【０００５】既知のＲＴＸ−毒素は、全てある種の細胞
毒性又は細胞溶解活性を示す。しかしながら、標的細胞
特異性及び宿主特異性は、その毒素及びアシル化の相違
に依存して異なる（ＭｃＷｈｉｎｎｅｙら；Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．１７４：２９１−２９７（１９９２）及びＨａｃｋ
ｅｔｔら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２０２５
０−２０２５３（１９９５））。標的細胞が異なる結
果、ＲＴＸ−毒素群の様々な毒素、例えば、溶血素、細
胞溶解素、細胞毒が知られている。アクチノバシラス属
は多くの異なる種、とりわけ、アクチノバシラス・プレ
ウロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐ
ｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ａ．アクチノミセ
テムコミタンス（Ａ． ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃ
ｏｍｉｔａｎｓ）Ａ．スイス（Ａ． ｓｕｉｓ）、Ａ．
ロシイ（Ａ． ｒｏｓｓｉｉ）、Ａ．エクウリ（Ａ．
ｅｑｕｕｌｉ）及びＡ．リグニエレシイ（Ａ． ｌｉｇ
ｎｉｅｒｅｓｉｉ）を含む。
【０００６】アクチノバシラス・プレウロニューモニア
は血清型依存性ＲＴＸ−毒素を産生し、これはブタ、ウ
マ、ウシ及びヒトの赤血球、ウサギ及びブタの好中球、
並びにブタの肺胞マクロファージに対して細胞毒性／細
胞溶解性である（Ｒｏｓｅｎｄａｌら；Ａｍ．Ｊ．Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｓ．４９：１０５３−１０５８（１９８８）、
Ｍａｕｄｓｌｅｙ Ｊ．Ｒ．及びＫａｄｉｓ Ｓ；Ｃａ
ｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：８０１−８０５
（１９８６）、Ｆｒｅｙ．Ｊ及びＮｉｃｏｌｅｔ．Ｊ；
Ｉｎｆ．＆ Ｉｍｍ．５６：２５７０−２５７５（１９
８８）、Ｂｅｎｄｉｘｏｎら；Ｉｎｆ．＆ Ｉｍｍ．３
３：６７３−６７６（１９８１）、Ｋａｍｐ，Ｅ．Ｍ．
及びｖａｎ Ｌｅｅｎｇｏｅｄ，Ｌ．Ａ．Ｍ．Ｇ．；
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：１１８７−
１１９１（１９８９））。
【０００７】ブタにおけるアクチノバシラスの感染は、
若いブタの深刻な致死率及び高齢の動物の体重増加の減
少のため、ブタ業界にとって深刻な経済的損失の原因で
ある。
【０００８】最近、グラム陰性菌におけるＲＴＸ毒素の
合成、活性化及び移送に関与するオペロンの遺伝的組織
がＣｏｏｔｅ，Ｊ．Ｇ．によって検討されている（ＦＥ
ＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ８
８：１３７−１６２（１９９２）。Ｆｒｅｙは、アクチ
ノバシラス・プレウロニューモニアにおける既知の３種
類のＲＴＸ−毒素をＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｔｏｘｉｎｓ，Ｚｂｌ Ｂａｋｔ．Ｓｕｐｐｌ．２
４，ｐ．３２２−，Ｆｒｅｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄ
ｓ．），Ｇｕｓｔａｆ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓｔｕｔｔｔ
ｇａｒｔ，Ｊｅｎａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４にお
いて詳細に検討している。
【０００９】アクチノバシラス・プレウロニューモニア
において、この種類のＲＴＸ−オペロンは４つの遺伝
子：実際の毒素遺伝子（Ａ）、アクチベーター遺伝子
（Ｃ）、及び周囲の媒体への毒素の分泌に関与するタン
パク質をコードする２つの遺伝子（Ｂ及びＤ）を有す
る。毒素遺伝子（Ａ）の主要翻訳産生物は非毒性タンパ
ク質であり、その毒性活性はアクチベーター遺伝子
（Ｃ）の産生物によって活性化される。
【００１０】最近まで、３種類のＲＴＸ−毒素のみが、
それらの全てが上述の遺伝的組織を有するかもしくは少
なくとも毒素遺伝子（Ａ）及びアクチベーター遺伝子
（Ｃ）を有する、アクチノバシラスの種に存在している
と考えられていた。
【００１１】これらの３種類のＲＴＸ−毒素、Ａｐｘ
Ｉ、Ａｐｘ−ＩＩ及びＡｐｘ−ＩＩＩは、それぞれ、顕
著な溶血活性（ＡｐｘＩ）、穏やかな溶血活性（Ａｐｘ
−ＩＩ）又はマクロファージ−細胞毒性活性（Ａｐｘ−
ＩＩＩ）を有する。
【００１２】様々な毒性活性が血清型全体にわたってか
なり無作為に分かれていて、以下の４つのサブグループ
が存在する。
【００１３】サブグループＡ、血清型１、５、９及び１
１によって表され、ＡｐｘＩ及びＡｐｘ−ＩＩを産生す
る。
【００１４】サブグループＢ、血清型２、３、４、６及
び８によって表され、Ａｐｘ−ＩＩ及びＡｐｘ−ＩＩＩ
を産生する。
【００１５】サブグループＣ、血清型１０によって表さ
れ、ＡｐｘＩのみを産生する。
【００１６】サブグループＤ、血清型７及び１２によっ
て表され、Ａｐｘ−ＩＩのみを産生する。
【００１７】ＡｐｘＩ、−ＩＩ及び−ＩＩＩは全てアク
チノバシラス・プレウロニューモニア感染に対する万能
ワクチンにおいて必須の要素であることが知られてい
る。少なくともＡｐｘＩ、−ＩＩ及び−ＩＩＩを含まな
いワクチンは、全てのアクチノバシラス・プレウロニュ
ーモニア血清型に対する防御を付与することがない。ま
た、少なくとも特定の一つの血清型のＡｐｘ−毒素を含
まないワクチンは、その単一の血清型に対する防御すら
誘発しない。
【００１８】それらの毒性を失ったＡ．プレウロニュー
モニアからイン・ビトロ合成されたＲＴＸ−毒素に基づ
くサブユニットワクチンが従来記述されており、例え
ば、欧州特許ＥＰ０．３５４．６２８号にはＡ．プレウ
ロニューモニアの溶血素及び細胞毒に基づくサブユニッ
トワクチンが、欧州特許ＥＰ０．４５３．０２４号には
溶血素、細胞毒及び外膜タンパク質に基づくＡ．プレウ
ロニューモニアのサブユニットワクチンが開示されてい
る。
【００１９】しかしながら、一般に、サブユニットワク
チンには以下の４つの重要な不都合な点が存在する。
【００２０】・免疫系を適切に誘発させるために多量の
抗原性物質を必要とする。
【００２１】・通常、Ｂ細胞免疫のみが誘発される。
【００２２】・幾つかの防御抗原はイン・ビボでのみ誘
発され、したがってサブユニットワクチン中に存在する
ことができない。
【００２３】・病原性生菌は外膜タンパク質及びカプセ
ル状多糖のような多くの重要な免疫原性分子を有してい
てその全てが防御に潜在的に重要であり、そのため、効
率的なサブユニットワクチンにはこれらが含まれること
になる。
【００２４】ポイント１及び２で言及される明白な問題
の次に、特に第４ポイントは効率的なサブユニットワク
チンの作製を困難なものにしている。このことは、例え
ば、４つの異なるサブユニット（３つのＲＴＸ−毒素及
び外膜タンパク質）が１つのワクチン中で組み合わされ
ている、上述の欧州特許ＥＰ０．４５３．０２４号に開
示されているＡ．プレウロニューモニアサブユニットワ
クチンによって説明されている。
【００２５】パステウレラセア（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａｓｅａｅ）感染に対するサブユニットワクチンの不都
合な点を解消するために弱毒化生ワクチンが強く望まれ
ることは明らかである。弱毒化生ワクチンは以下の利点
を有する。
【００２６】低用量で投与することができる（それは自
己複製する）。
【００２７】天然／野性型感染に極めて似ている。
【００２８】可能性のある免疫学的に重要な抗原の全て
を一度に提供する。
【００２９】とはいうものの、明らかな利点にもかかわ
らず、本発明以前にはアクチノバシラス・プレウロニュ
ーモニアに基づく生ワクチンは市販されていない。その
理由は、以下のパラドックスにある。前述のように、Ａ
ｐｘＩ、−ＩＩ及び−ＩＩＩは全て感染したアクチノバ
シラス・プレウロニューモニアに対する万能ワクチンの
必須要素である。したがって、生ワクチンはこれらの３
つのＲＴＸ−毒素を産生しなければならない。しかしな
がら、これらの３つのＲＴＸ−毒素は全てのアクチノバ
シラスの種において毒性の強い因子である（例えば、Ｃ
ｏｏｔｅ，Ｊ．Ｇ．；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ８８：１３７−１６２（１９９
２）、Ｔａｓｃｏｎら；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
１４：２０７−２１６（１９９４）、Ｊａｎｓｅｎら；
ｉｎｆ ＆ ｉｍｍ．：２７−３７（１９９５）を参
照）。
【００３０】生Ａｐｐ株の毒性を弱めるためのＲＴＸ−
毒素の除去は技術的に容易であるが、それによってこの
ジレンマが解決することはない。そのようなＲＴＸ−陰
性株は、もはや宿主においてアクチノバシラス・プレウ
ロニューモニア領域の株の溶血／細胞毒性活性に対する
免疫を誘発しないため、弱毒化生ワクチン株としては無
益である。
【００３１】しかしながら、免疫の誘発に重要ではある
もののＡｐｘＩ、−ＩＩ及び−ＩＩＩよりも免疫の構築
における役割が少なく、したがって原理的に除去するこ
とが可能な毒性因子は現在知られていない。
【００３２】したがって、毒性の原因でありそのため変
性された場合に弱毒化Ａｐｐ株をもたらす部位であっ
て、同時に免疫の誘発に有用であるもののワクチンの観
点からは不要である部位を、Ａｐｐのゲノム上に有する
ことが強く望まれる。しかしながら、そのような部位は
現在知られていない。さらに、そのような部位が、特定
の細胞型に制限されるのではなく全てのＡｐｐ株に普遍
的に存在することが強く望まれる。そのような部位は、
その部位を除去することにより、全ての異なる細胞型を
弱毒化することを可能にする。
【００３３】
【発明が解決しようとする課題】全てのアクチノバシラ
ス・プレウロニューモニア株にそれらの血清型に関わり
なく普遍的に存在するそのような弱毒化部位を提供する
ことが本発明の目的の１つである。
【００３４】
【課題を解決するための手段】最近、アクチノバシラス
・プレウロニューモニアの血清型１株において新しい遺
伝子が見出された（Ｔｈｅｓｉｓ Ｔ．Ｊ．Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎ Ｎｏｖ．１９９５）。
【００３５】この遺伝子は既知のアクチノバシラスＡｐ
ｘＩ、−ＩＩ及び−ＩＩＩに似てはいないが、ナイセリ
ア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓ）に属する細菌で知られているＲＴＸ−
毒素遺伝子に類似し、そのためＲＴＸ−遺伝子ａｐｘＩ
Ｖと命名されている。しかしながら、この遺伝子は、上
述のアクチノバシラファミリーの様々な種に存在する３
つの既知のＲＴＸ−毒素遺伝子ａｐｘＩ、−ＩＩ及び−
ＩＩＩとはほとんど全ての側面で異なる。第１に、その
ゲノム組織が全く異なる。第２に、既知のＡｐｘ−毒素
に見出されるアクチベーター機構がない。第３に、その
時点では、この遺伝子又はそれの可能性ある遺伝子産生
物を特定のイン・ビボ溶血もしくは細胞毒性活性の原因
とすることができなかった。
【００３６】驚くべきことに、この遺伝子が、３つの既
知のＲＴＸ−遺伝子とは全く対照的に、アクチノバシラ
ス・プレウロニューモニア種の全ての細菌に、それらの
血清型に関わりなく存在することが見出された。このこ
とは、実施例６及び７に説明されるように、ａｐｘＩＶ
コーディング配列を含むプローブと全ての血清型のアク
チノバシラス・プレウロニューモニアに由来するＤＮＡ
の制限断片とのハイブリダイゼーションにより決定され
た。
【００３７】意外にも、ａｐｘＩＶ欠失変異体は、生存
可能であるが、それらのａｐｘＩＶを有する親株と比較
して少ない毒性で挙動することが見出された。
【００３８】したがって、この遺伝子産生物、ＡｐｘＩ
Ｖ毒素は全てのアクチノバシラス・プレウロニューモニ
ア株における毒性因子であることが決定された。これ
は、現在に至るまで、イン・ビボでその遺伝子産生物
に、単独で毒性に影響を与える可能性があるように作用
する効果を帰属されることが全くできなかったため、予
期せざる結論である。実際、現在に至るまで、イン・ビ
ボ又はイン・ビトロのいずれにおいても、この遺伝子が
アクチノバシラス・プレウロニューモニアにおいて発現
されていたことは立証されていない。したがって、以下
のことが見出されたことは本発明の価値の１つである。
【００３９】・ａｐｘＩＶ遺伝子は全てのＡ．プレウロ
ニューモニア株にその血清型に関わらず存在し、 ・ａｐｘＩＶ遺伝子産生物は全てのＡ．プレウロニュー
モニア血清型における毒性因子であり、 ・ａｐｘＩＶ遺伝子に欠失を有するＡ．プレウロニュー
モニア株は依然として生存可能ではあるが、その株の免
疫原性を大きく損なうことなく毒性が低下している。
【００４０】したがって、本発明は、機能的ＡｐｘＩＶ
毒素を産生することのないアクチノバシラス・プレウロ
ニューモニア種の弱毒化生菌を初めて提供する。
【００４１】機能的ＡｐｘＩＶ毒素は、野性型細菌にお
いて発現した場合にはＡｐｘＩＶ毒素の特徴の全てを有
するタンパク質であると考えられ、野性型のレベルで発
現している。したがって、非機能性ＡｐｘＩＶ毒素は、
野性型細菌において発現した場合にはＡｐｘＩＶ毒素の
特徴の幾らかもしくは全てを欠く毒素であると考えら
れ、及び／又はＡｐｘＩＶ毒素の野性型効果を得るのに
は不十分なレベルで発現している。
【００４２】ＡｐｘＩＶ毒素を産生しないことは、例え
ば、ＡｐｘＩＶ毒素をコードするコーディング配列の修
飾によるものであり得る。また、例えば、プロモーター
領域のようなａｐｘＩＶ遺伝子の転写に関与することが
知られる領域における修飾、又はリボソーム結合部位の
ような翻訳に関与する領域における修飾の結果でもあり
得る。
【００４３】ａｐｘＩＶ遺伝子の全体の構造を図１に示
す。
【００４４】この図において、ＡｐｘＩＶ毒素に特徴的
な直接反復領域が断続するボックスで示され、これに対
してＡｐｘＩＶに特異的なグリシンに富むノナペプチド
領域が黒い矢印で示される。反復はＡｐｘＩＶのＣ−末
端部に見出される。これらの特徴は全てのアクチノバシ
ラス・プレウロニューモニア血清型に存在する。２つの
血清型の核酸配列及びアミノ酸配列が配列番号１−４に
示されている。配列番号１はＡｐｐ血清型１のａｐｘＩ
Ｖ遺伝子の核酸配列を示し、配列番号２は血清型１Ａｐ
ｘＩＶ毒素のそれに相応するアミノ酸配列を示す。配列
番号３はＡｐｐ血清型３のａｐｘＩＶ遺伝子のヌクレオ
チド配列を示し、これに対して配列番号４は血清型３Ａ
ｐｘＩＶ毒素のそれに相応するアミノ酸配列を示す。図
２は、様々なアクチノバシラス・プレウロニューモニア
血清型間のＡｐｘ−毒素の間でのアミノ酸レベルでの、
特にはＮ−末端の６５０アミノ酸の、際立って高い水準
の保存性を示す。これもまたａｐｘＩＶ遺伝子の顕著な
特徴である。血清型に応じて、この毒素のＣ−末端部で
の反復の数が変動し得ることが図１から明らかである。
この変動により、様々な血清型から得られる遺伝子及び
コードされる毒素の大きさの差が説明される。
【００４５】同じ血清型に属するアクチノバシラス・プ
レウロニューモニアの異なる単離体から単離されるａｐ
ｘＩＶ遺伝子の間にさえ核酸配列に多少の変動が存在し
得る。これは、全ての生物に存在することが当該技術分
野において知られている天然での変動によるものであ
る。ａｐｘＩＶ遺伝子によってコードされているＡｐｘ
ＩＶ毒素のアミノ酸の幾つかが、ポリペプチドがその機
能を変えることなく、別の血清型のＡｐｘＩＶ毒素中の
他のものによって置換される可能性がある。例えば、特
定の部位にＡｓｐを有するポリペプチドとそれに匹敵す
る部位にＡｓｎを有するその変種とが依然として同じ特
性を有する。アミノ酸が機能的に類似するアミノ酸によ
って置換されるこのプロセスは、機能的置換と呼ばれ
る。この場合、変種タンパク質は機能的変種と呼ばれ
る。変動の別の原因は、遺伝コードの縮重現象である。
簡潔に述べると、これは、例えば、アミノ酸グルタミン
酸がＧＡＴ及びＧＡＡの両者によってコードされている
ことである。この現象はＭｅｔ及びＴｒｐを除いて全て
のアミノ酸に当てはまる。したがって、例えば、本発明
において提供される血清型１のＡｐｘＩＶ毒素は、配列
番号１に与えられるヌクレオチドによってコードされる
だけではなく、同じ、もしくは機能的に同じポリペプチ
ドを与える多種多様な他の配列によってもコードされ得
ることが明らかである。
【００４６】したがって、ＡｐｘＩＶ毒素に機能的に匹
敵するポリペプチドをコードする変種ａｐｘＩＶ配列
は、本発明の範囲内に入る。
【００４７】本発明による弱毒化生菌は幾つかの方法で
得ることができる。そのような細菌を得る可能性のある
方法の１つは、野性型アクチノバシラス・プレウロニュ
ーモニアを塩基類似体のような変異原で処理したり、紫
外光処理又は温度処理したりするような古典的な方法に
よるものである。機能的ＡｐｘＩＶ毒素を産生しない株
は抗−ＡｐｘＩＶ毒素抗体を誘発しないか、もしくはそ
の程度が劣り、したがって動物試験で容易に選択するこ
とができる。必要とされる抗血清は以下に実施例３で説
明されるように得ることができる。
【００４８】別の可能性は、組換えＤＮＡ技術を用い
て、ＡｐｘＩＶ毒素をコードする遺伝子に十分に定義さ
れた変異を意図的に導入することである。このような変
異は、その変異遺伝子がもはや機能的ＡｐｘＩＶ毒素を
コードしないという条件で、挿入、欠失、１個のヌクレ
オチドの別のものによる置換又はそれらの組み合わせで
あり得る。とりわけ、オープンリーディングフレームに
終止コドンを導入する変異、又はオープンリーディング
フレームにフレームシフトを起こす変異がもはや機能的
ＡｐｘＩＶ毒素をコードしない株を得るのに非常に適す
ることが容易に分かる。このような変異は、例えば、ク
ロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって販売されるト
ランスフォーマーR（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒR）キット
を用いるイン・ビトロ部位特異的変異生成によって作製
することができる。制限酵素での遺伝子の消化とそれに
続くエンドヌクレアーゼ処理及び再ライゲーションのよ
うな多くの他の標準組換えＤＮＡ技術も等しく適用する
ことができる。
【００４９】したがって、好ましい形態において、本発
明のこの態様は、ＡｐｘＩＶ毒素をコードする遺伝子が
変異を有する弱毒化生菌に関する。
【００５０】ａｐｘＩＶ遺伝子の断片もしくは全遺伝子
の欠失又は異種ＤＮＡ断片の挿入を含む十分に定義され
た変異は、古典的に導入された変異と比較した場合、そ
れらが野性型の状況に戻ることはないという利点を有す
る。
【００５１】したがって、より好ましい形態において、
本発明のこの態様は、ＡｐｘＩＶ毒素をコードする遺伝
子が挿入及び／又は欠失を含む弱毒化生菌に関する。
【００５２】今日、大量のワクチンがブタに与えられて
いることを考えると、ワクチン接種のコストを下げるた
めだけに、幾つかのワクチンの投与を組み合わせること
が望ましいことは明らかである。したがって、弱毒化生
ワクチンを他の病原性微生物又はウイルスから選択され
る抗原をコードする異種遺伝子の組換え担体として用い
ることは非常に魅力的である。そのような組換え担体の
投与には、そのような担体の投与の後、同時に２つ以上
の疾患に対して免疫が誘発されるという利点がある。本
発明による弱毒化生菌は、ＡｐｘＩＶ毒素をコードする
遺伝子を異種遺伝子の挿入部位として用いることができ
るため、異種遺伝子に非常に適する担体を提供する。ａ
ｐｘＩＶ遺伝子を挿入部位として用いることは、同時に
ＡｐｘＩＶ遺伝子を不活性化し、かつ新たに導入された
異種遺伝子を同種アクチノバシラス・プレウロニューモ
ニア遺伝子によって発現させることができるという利点
がある。このような組換え担体の構築は、相同組換えの
ような標準的な分子生物学技術を用いて、定常的に行う
ことが可能である。したがって、より好ましい態様にお
いて、本発明は、機能的ＡｐｘＩＶ毒素を産生すること
がなく、かつａｐｘＩＶ遺伝子に異種遺伝子が挿入され
ているアクチノバシラス・プレウロニューモニアの弱毒
化生菌に関する。そのような異種遺伝子は、上述のよう
に、例えば、他の病原性微生物又はウイルスから選択さ
れる抗原をコードする遺伝子であり得る。別の可能性
は、インターロイキン又はインターフェロンのような免
疫系の誘発に関与するタンパク質をコードする遺伝子を
挿入することである。
【００５３】本発明のさらに好ましい形態において、こ
の異種遺伝子は、ブタ増殖性呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）
ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウ
イルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイル
ス、ロタウイルス、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エリシペロスリックス・リュ
ーシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕ
ｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ
ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ボルデ
テラ・ブロンチセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒ
ｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ヘモフィルス・パラスイ
ス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）及び
ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｓｕｉｓ）からなる群より選択される抗原の１種
以上をコードする。
【００５４】しかしながら、組換え担体における異種遺
伝子の発現には深刻な落とし穴がある。幾つかのタンパ
ク質は、それらが異種細菌において発現する場合毒性で
あることが知られている。したがって、成功した組換え
体が特定の量の異種遺伝子の発現の結果として結局は死
んでしまうため、そのようなタンパク質をコードする遺
伝子を導入することはできないでいた。一例としてだけ
挙げると、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｐ
ｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のＰ２−プロテ
インはエシェリヒア・コリで単純に発現させることはで
きない（Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．
＆ Ｉｍｍｕｎ．５７：８８−９４（１９８９））。こ
の欠点を持たない組換え生担体を提供することが本発明
の目的の１つである。ａｐｘＩＶ遺伝子はイン・ビボで
効率的に発現する（実施例５を参照）ものの、イン・ビ
トロでは発現しない（実施例４を参照）ことが予期せず
に見出された。これは、イン・ビトロで成長させたＡ．
プレウロニューモニア培養物においてＡｐｘＩＶ毒素の
存在を示すことができないことから結論付けられた。こ
れは、Ａ．プレウロニューモニアを成長させる環境に応
じてＡｐｘＩＶの発現がオンもしくはオフに切り替わる
ことを意味する。この特徴は、既知の組換え生担体を上
回る予期せざる利点を提供する。ａｐｘＩＶプロモータ
ーの制御の下で異種遺伝子が発現した場合、本発明によ
る弱毒化Ｐ．プレウロニューモニア生担体は挿入された
異種遺伝子に関わらずイン・ビトロにおいて高い密度で
成長することができる。これは、その外来遺伝子がこれ
らの条件の下では発現しないためである。多数の細菌を
宿主に投与した後、異種遺伝子の発現が始まり、しばし
ば複製の間にあるいはその細菌が死んだ後に、それが宿
主の免疫系に利用可能となる。発現させようとする異種
遺伝子は、例えばａｐｘＩＶ遺伝子のコーディング配列
をその異種遺伝子のコーディング領域で置換することに
より、ａｐｘＩＶプロモーターに機能的に連結させるこ
とができる。全てのａｐｘＩＶ遺伝子を置き換える必要
はない。ＡｐｘＩＶのＡＴＧ−コドンを異種遺伝子の停
止コドンを含むコーディング領域で置換すれば十分であ
る。また、融合構築体を作製することにより、ａｐｘＩ
Ｖプロモーターの影響の下で異種遺伝子を発現させるこ
とも可能である。これは、ａｐｘＩＶ ＡＴＧコドンの
下流のａｐｘＩＶリーディングフレームを含むフレーム
に異種遺伝子を挿入することにより行うことができる。
【００５５】“ａｐｘＩＶプロモーターに機能的に連結
する”という表現は、異種遺伝子の転写がａｐｘＩＶプ
ロモーターで開始されることを意味する。
【００５６】挿入された異種遺伝子がａｐｘＩＶプロモ
ーターと機能的に連結する位置の各々が本発明の範囲内
にあることは言うまでもないことである。
【００５７】したがって、本発明の最も好ましい形態
は、ａｐｘＩＶ遺伝子のプロモーター領域に機能的に連
結する異種遺伝子を坦持する本発明による弱毒化生菌に
関する。
【００５８】未変性のａｐｘＩＶプロモーターがイン・
ビトロでオフに切り替わり、かつイン・ビボでオンに切
り替わる切替え可能なプロモーターであるという驚くべ
き発見は、このプロモーターをその天然の宿主におい
て、及び他の細菌における異種プロモーターとして非常
に融通の効く発現ツールとする。他の細菌における異種
プロモーターとして用いる場合、このプロモーターを含
むＤＮＡをその宿主から単離し、アクチノバシラス・プ
レウロニューモニア以外の細菌に移すことができる。現
在実現可能な別の選択は、各々が別の遺伝子の発現を制
御するａｐｘＩＶプロモーターの幾つかのコピーのクロ
ーン化である。これは宿主細菌であるアクチノバシラス
・プレウロニューモニアで可能であるが、この多重コピ
ーの原理は他の細菌にも等しく適用可能である。上述の
ように、このプロモーターは、他の病原性微生物又はウ
イルスから選択される抗原をコードする１つ以上の異種
遺伝子の選択的イン・ビボ発現に用いることができる。
また、このプロモーターは、インターロイキン、腫瘍壊
死因子又はインターフェロンのようなサイトカインをコ
ードする異種ＤＮＡ配列の発現に用いることも可能であ
る。幾つかのサイトカイン、例えばインターフェロン
は、免疫修飾因子として重要な役割を果たすことが知ら
れている。このため、これは、そのような遺伝情報をａ
ｐｘＩＶプロモーターの制御の下で発現させるのに有利
であり得る。
【００５９】したがって、本発明の別の態様は、ａｐｘ
ＩＶ遺伝子の発現を制御するプロモーターを含むヌクレ
オチド配列に関する。
【００６０】天然の状況においてａｐｘＩＶ遺伝子の発
現を制御する切替え可能なプロモーターは、配列番号５
の４５１ないし１１３２位のＤＮＡ断片に位置すること
が見出された。このＤＮＡ断片のプロモーターの必須要
素ではない部分は、必ずしもこの断片に存在する必要が
ないことは明らかである。そのため、プロモーター活性
を保持するこのＤＮＡ断片のより短い断片が異種遺伝子
の発現に等しく適する。したがって、この態様のより好
ましい形態は、配列番号５の４５１ないし１１３２位の
ＤＮＡ断片又は依然としてプロモーター活性を有するそ
れらのサブフラグメントを含むヌクレオチド配列に関す
る。
【００６１】細菌のプロモーターは、全て２つのコンセ
ンサス領域、いわゆる−１０及び−３５領域を共有す
る。これらのコンセンサス領域の隣接配列はある程度プ
ロモーターの効率に影響を及ぼすことがあるが、−３５
とＡＴＧコドンとの間のＤＮＡ断片を含む部分のプロモ
ーター領域のみを用いることが有利であり得る。このＤ
ＮＡ断片は配列番号５の６１７位ないし６４１位に位置
する。したがって、この態様のより好ましい形態におい
て、本発明は配列番号５の６１７ないし６４１位のＤＮ
Ａ断片を含むヌクレオチド配列に関する。
【００６２】また、本発明はサブユニットワクチンの成
分としてのＡｐｘＩＶ毒素に関する。サブユニットワク
チンは３つの既知Ａｐｘ−毒素を含む公算が最も大き
い。これについては上述した。しかしながら、上述のよ
うに全てのＡ．プレウロニューモニア血清型にＡｐｘＩ
Ｖ毒素が存在することが予期せずに見出されたため、そ
れはサブユニットワクチンの望ましい追加成分である。
ＡｐｘＩＶ毒素に対して生じる中和抗体は、血清型に関
わらず各々の、かつ全てのアクチノバシラス・プレウロ
ニューモニア株によって産生されるＡｐｘＩＶ毒素に対
する防御を付与する。したがって、本発明の別の態様
は、純粋なＡｐｘＩＶ毒素を含む、アクチノバシラス・
プレウロニューモニア細菌の感染に対して動物を防御す
るためのサブユニットワクチンに関する。このＡｐｘＩ
Ｖ毒素は単独で、又は上述の毒素ＡｐｘＩ、−ＩＩ及び
−ＩＩＩのいずれかもしくは全てと組み合わせて、及び
／又は、例えば、アクチノバシラス・プレウロニューモ
ニアの外膜タンパク質（ＯＭＰ）と組み合わせて投与す
ることが可能である。このようなワクチンは、免疫応答
を誘発するのに十分な量のＡｐｘＩＶ毒素と薬学的に許
容し得る担体とを混合することにより、容易に調製する
ことができる。ＡｐｘＩＶ毒素は、適切な発現ベクター
へのａｐｘＩＶ遺伝子の導入、その遺伝子の発現及び毒
素の単離により生産することが可能である。細菌発現
系、バキュロウイルス発現系及び哺乳類動物細胞発現系
のような多くの万能発現系が当該技術分野において公知
である。実施例３において、エシェリヒア・コリ内での
遺伝子の発現によりいかにしてＡｐｘＩＶ毒素を得るの
かが説明されている。
【００６３】本発明のさらに別の態様は、アクチノバシ
ラス・プレウロニューモニア細菌の感染に対して動物を
防御するための上述の弱毒化生菌を含む弱毒化生ワクチ
ンに関する。このようなワクチンは、弱毒化生菌を薬学
的に許容し得る担体と混合することにより得ることがで
きる。これらのワクチンは、少なくとも免疫学的に有効
な量の本発明による弱毒化産生生菌を含む。免疫学的に
有効とは、ワクチン接種の際に投与される弱毒化生菌の
量がその宿主において毒性形態のＲＴＸ−毒素産生細菌
に対して有効な免疫応答を誘発するのに十分であること
を意味する。投与に有用な投与量は、年齢、体重及びワ
クチン接種される動物、投与様式及びワクチン接種の対
象となる病原体の型に応じて変化する。このワクチン
は、免疫応答を惹起するのに十分なあらゆる用量の細菌
を含むことができる。例えば、１０3ないし１０10個細
菌の範囲の用量が非常に適切な用量である。
【００６４】薬学的に許容し得る担体は水のように単純
なものでもよいが、例えば、その細菌が培養された培養
液を含んでいてもよい。他の適切な担体は、例えば、生
理学的塩濃度の溶液である。本発明において有用な薬学
的に許容し得る担体又は希釈剤の他の例には、ＳＰＧ
Ａ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、
デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）のよう
な安定化剤、アルブミンもしくはカゼインのようなタン
パク質、ウシ血清もしくは脱脂乳のようなタンパク質含
有剤及び緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液）が含まれる。
【００６５】任意に、アジュバント活性を有する１種以
上の化合物をワクチンに添加することができる。アジュ
バントは免疫系の非特異的な刺激因子である。これら
は、侵入する病原体に対する宿主の免疫応答を高める。
当該技術分野において公知のアジュバントの例はフロイ
ントの完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イ
オン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣ
ＯＭ（免疫刺激複合体、例えば、欧州特許ＥＰ１０９９
４２号を参照）、サポニン、鉱物油、植物油、及びカル
ボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（ホモポリマー）であ
る。粘膜適用に特に適するアジュバントは、例えば、エ
シェリヒア・コリ熱不安定性毒素（ＬＴ）又はコレラ毒
（ＣＴ）である。
【００６６】他の適切なアジュバントは、例えば、アル
ミニウム水酸化物、リン酸塩もしくは酸化物、油性エマ
ルジョン（例えば、ベイオール（Ｂａｙｏｌ）Ｆ(R)も
しくはマルコール（Ｍａｒｃｏｌ）５２(R)）、サポニ
ン又はビタミンＥ可溶化物である。
【００６７】したがって、好ましい形態において、本発
明によるワクチンはアジュバントを含む。
【００６８】動物への投与について、本開示によるワク
チンは、とりわけ、鼻腔内、皮内、皮下、エアロゾルに
より、又は筋肉内に投与することができる。
【００６９】サブユニット及び生きている生物の両者を
貯蔵するのには幾つかの方法がある。例えば、冷蔵庫内
での保存が公知の方法である。グリセロールを含むバッ
ファ中での−７０℃での貯蔵もしばしば用いられる。ま
た、細菌は液体窒素中に保持することも可能である。凍
結乾燥が保存の他の方法である。凍結乾燥した細菌は長
年生存したままで貯蔵することができる。凍結乾燥した
細菌の貯蔵温度は、生存能力を損なうことなく０°を上
回る温度にすることができる。凍結乾燥はサブユニット
に等しく適用することができる。
【００７０】凍結乾燥は、公知の標準凍結乾燥手順に従
って行うことができる。任意の有益な添加物、例えば、
脱脂乳、トレハロース、ゼラチンもしくはウシ血清アル
ブミンを凍結乾燥プロセスに加えることが可能である。
【００７１】したがって、より好ましい態様において、
本発明によるワクチンは凍結乾燥形態にある。
【００７２】この態様のより好ましい形態において、こ
のワクチンは他の病原性微生物又はウイルスから選択さ
れる１種以上の抗原をさらに含む。このようなワクチン
は、他の病原性微生物又はウイルスから選択される１種
以上の抗原を本発明による弱毒化生菌及び上述の薬学的
に許容し得る担体に添加することにより得ることができ
る。
【００７３】もちろん、１種以上の抗原だけではなく、
病原体全体の１種以上を不活性化もしくは生存する形態
で添加することも可能である。
【００７４】あるいは、他の病原性微生物又はウイルス
から選択される１種以上の抗原をコードする遺伝情報を
上述の既知の組換えＤＮＡ技術を用いて弱毒化生菌にク
ローン化することにより得ることも可能である。もちろ
ん、このようなワクチンは、医学的及び生理的な観点の
両者から、それらの病原体の各々での別々のワクチン接
種よりもワクチン接種を受ける動物に対するストレスが
少ない。
【００７５】さらに好ましい形態において、これらの抗
原は、ブタ増殖性呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、
仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブ
タパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウ
イルス、エシェリヒア・コリ、エリシペロスリックス・
リューシオパシエ、パスツレラ・ムルトシダ、ボルデテ
ラ・ブロンチセプチカ、ヘモフィルス・パラスイス及び
ストレプトコッカス・スイスからなる群より選択され
る。
【００７６】また、本発明は、機能的ＡｐｘＩＶ毒素を
産生することが不可能なアクチノバシラス・プレウロニ
ューモニア種の弱毒化生菌の調製方法にも関する。これ
らの方法は、ａｐｘＩＶタンパク質をコードする遺伝子
に変異を導入することを包含する。ａｐｘＩＶ遺伝子へ
の遺伝情報の挿入、置換又は欠失のための、変異原を用
いる古典的な変異生成技術及び当該技術分野において公
知の組換えＤＮＡ技術の両者が利用可能である。
【００７７】好ましい形態においては、欠失の導入に上
述の方法が用いられる。
【００７８】本発明による細菌を薬学的に許容し得る担
体と混合することを包含する本発明による弱毒化生ワク
チンの調製方法も本発明の一部である。
【００７９】サブユニットワクチンの調製方法も本発明
の範囲内に入る。このような方法は、精製ＡｐｘＩＶ毒
素を薬学的に許容し得る担体と混合することを包含す
る。
【００８０】生ワクチンでのワクチン接種の分野におい
て一般的に認められる別の問題は、宿主動物の血清中の
特定の病原体に対する抗体の存在がその宿主が毒性もし
くは弱毒化形態の病原体に感染していることを示すこと
である。しかしながら、自然に感染した動物と生ワクチ
ン株でワクチン接種した動物とを区別することは不可能
である。本発明による弱毒化生アクチノバシラス・プレ
ウロニューモニアはこの問題に対する解決法を以下のよ
うに提供する。
【００８１】実施例３に説明されているように、アクチ
ノバシラス・プレウロニューモニア血清型１のａｐｘＩ
Ｖ遺伝子が単離され、異種宿主細胞において発現されて
いる。この発現産生物をＰＡＡＧＥ−ゲル電気泳動にか
けた後、ウェスタンブロッティングに用いた。このブロ
ットを意図的にアクチノバシラス・プレウロニューモニ
アに感染させたブタから得た回復期の血清及び野外株か
らの血清と共にインキュベートした。試験した全てのア
クチノバシラス・プレウロニューモニア野外株において
ａｐｘＩＶ遺伝子がイン・ビボで発現することが見出さ
れた。これは、アクチノバシラス・プレウロニューモニ
アに感染したブタが、その感染株の血清型に関わりな
く、それらが感染した株に対する抗原を常に有すること
を意味する。
【００８２】本発明による弱毒化生菌は、ａｐｘＩＶ遺
伝子の欠失のため、もはやＡｐｘＩＶ毒素を作製するこ
とができない。したがって、本発明による弱毒化生アク
チノバシラス・プレウロニューモニア株でワクチン接種
された動物はそれらの血清中にＡｐｘＩＶ毒素に対する
抗体を持たない。
【００８３】したがって、比較試験、例えばＥＬＩＳＡ
試験において、このような血清は全ての免疫原性アクチ
ノバシラス・プレウロニューモニアタンパク質、例えば
ＡｐｘＩ、ＩＩ及び／又はＩＩＩと反応するが、Ａｐｘ
ＩＶとは反応しない。しかしながら、アクチノバシラス
・プレウロニューモニア野外株に感染したブタからの血
清はＡｐｘＩＶを含む全ての免疫原性アクチノバシラス
・プレウロニューモニアタンパク質と反応する。したが
って、本発明による弱毒化生アクチノバシラス・プレウ
ロニューモニアが非常に適切なマーカーワクチン、すな
わち、野外株と区別することができるワクチン株である
ことが分かる。
【００８４】ワクチン株と野外株とを識別するための診
断試験は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル壁に精製Ａｐｘ
ＩＶ毒素がコートされている単純なＥＬＩＳＡ試験であ
ればよい。試験しようとするブタからの血清と共にイン
キュベートし、次いで、例えば、標識抗ブタ抗体と共に
インキュベートすることにより、ＡｐｘＩＶ毒素に対す
る抗体の有無が明らかになる。
【００８５】他の診断試験系の例は、例えば、精製Ａｐ
ｘＩＶ毒素を含むウェスタンブロットを試験しようとす
るブタの血清と共にインキュベートし、次いで特異的抗
−ＡｐｘＩＶ抗体を検出するものである。
【００８６】したがって、アクチノバシラス・プレウロ
ニューモニア野外株に感染したブタからの血清と本発明
による弱毒化生ワクチンアクチノバシラス・プレウロニ
ューモニア株を含むワクチンでワクチン接種されたブタ
からの血清とを区別するための、精製ＡｐｘＩＶ毒素を
含む診断試験も本発明の範囲内に入る。
【００８７】ブタの健康管理において見られるさらに別
の問題は、ブタがアクチノバシラス・プレウロニューモ
ニアに感染しているか、もしくはＡ．スイスに感染して
いるのか、あるいはその両者の組み合わせなのかを迅速
かつ明確な方法で決定することが困難なことである。
Ａ．スイスを明確に検出するための診断試験は現在利用
することはできない。これは、主として、Ａ．プレウロ
ニューモニアとＡ．スイスとが非常に多くの抗原を共有
するという事実のためである。目的に適い得る例とし
て、２つの非常に抗原性の高いＡｐｘ−毒素、ＡｐｘＩ
及びＡｐｘＩＩは、例えばＡ．スイスにおいて、相同性
が高度に保存されている（Ｖａｎ Ｏｓｔａａｙｅｎ
ら、発表のために提出されている）。
【００８８】ＡｐｘＩ、−ＩＩ及び−ＩＩＩ毒素をコー
ドする既知のＲＴＸ−遺伝子又はその相同体が事実上全
てのアクチノバシラス属の構成メンバー、例えば、Ａ．
プレウロニューモニア、Ａ．スイス、Ａ．ロシイ及び
Ａ．エクウリに見出される。したがって、最初、本発明
者らは、新規のＲＴＸ−毒素ＡｐｘＩＶもアクチノバシ
ラス属の全ての構成メンバーに共通であるものと仮定し
た。しかしながら、ブタ病原性アクチノバシラスを試験
した後、これも驚くべきことに既知の３つのＲＴＸ−遺
伝子とは対照的に、この新規ＲＴＸ−遺伝子ａｐｘＩＶ
はブタ病原性アクチノバシラス・プレウロニューモニア
にのみ存在することが見出された。これは他の一般的な
ブタ病原性アクチノバシラス種には存在せず、したがっ
て、アクチノバシラス・スイスにも存在しない。実施例
６及び７を参照のこと。
【００８９】したがって、驚くべきことに、ブタの血清
中のＡｐｘＩＶに対する抗体の存在は、そのブタがＡ．
プレウロニューモニアに感染しており、Ａ．スイス又は
他のいかなるブタ病原性アクチノバシラス種にも感染し
ていないことの迅速かつ明確な証拠であることが注目さ
れた。
【００９０】このように、本発明は、ＡｐｘＩＶに対す
る抗体の有無に基づく診断試験を提供し、したがって、
Ａ．プレウロニューモニアでの感染とＡ．スイスでの感
染とを明確に区別するための識別試験を提供する。この
ような試験は、例えば、別々のウェル内にＡ．プレウロ
ニューモニア及びＡ．スイスの両者に存在するＡｐｘＩ
及び−ＩＩ毒素並びに精製ＡｐｘＩＶ毒素を有するＥＬ
ＩＳＡ試験であり得る。Ａ．スイス感染動物からの血清
はＡｐｘＩ及び−ＩＩを収容するウェルとのみ反応し、
これに対して、Ａ．プレウロニューモニア感染動物は精
製ＡｐｘＩＶ毒素を収容するウェルとも反応する。
【００９１】
【発明の実施の形態】
【００９２】
【実施例】
実施例１：Ａ．プレウロニューモニア血清型１のａｐｘＩＶ遺伝子
のクローン化及び分析 標準的な分子生物学的手順（プラスミドＤＮＡ挿入、制
限消化、アガロースゲル電気泳動、サザンブロッティン
グ、ライゲーション、形質転換、エレクトロポレーショ
ン）は、他に述べない限り、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ
ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）又はＡｕｓｕ
ｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８７）に記述
されている通りに行った。ＰＣＲは本質的にＩｎｎｉｓ
ら（ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ ｇｕｉｄｅ ｔ
ｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，１９９０）に記述されている通りに行っ
た。染色体ＤＮＡ挿入はＰｉｔｃｈｅｒら（Ｌｅｔｔ．
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８：１５１−１５
６，１９８９）に従って行った。全てのＡ．プレウロニ
ューモニア参照株（血清型１：４０７４株；血清型２：
Ｓ１５３６株；血清型３：Ｓ１４２１；血清型４：Ｍ６
２；血清型５ａ：Ｋ１７；血清型５ｂ：Ｌ２０；血清型
６：ｆｅｍφ；血清型７：ＷＦ８３；血清型８：４０
５；血清型９：ＣＶＩ１３２６１；血清型１０：１３０
３９；血清型１１：５６１５３及び血清型１２：８３２
９）の起源はＦｒｅｙ及びＮｉｃｏｌｅｔ（Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２３２−２３６，１
９９０）に記述されている。Ａ．プレウロニューモニア
血清型３ ＨＶ１１４株は野外単離体（すなわち、Ｂｅ
ｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，３２：２７４９−２７５４，１９９４において試
験された血清型３の株の１つ）である。用いられた他の
アクチノバシラス株は、Ａ．ロシイ：ＡＴＣＣ２７０７
２；Ａ．エクウリ：ＡＴＣＣ１９３９２；Ａ．スイス；
ＡＴＣＣ１５５５８である。パスツレラ・ヘモリチカ
（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）
１型株ＡＴＣＣ１４００３を用いた。
【００９３】用いられたエシェリヒア・コリ宿主株はＸ
Ｌ１−ｂｌｕｅ（ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）、ラヨラ、ＣＡ；遺伝子型：ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ
１ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ−１ ｈｓｄＲ１７ ｓｕｐＥ
４４ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ［Ｆ′ｐｒｏＡＢ ｌａｃｌ
qＺＤＭ１５ Ｔｎ１０（Ｔｅｔr）］）及びＨＭＳ１７
４（ＤＥ３）（ＡＭＳバイオテクノロジー社（ＡＭＳ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ）、スイス；遺伝
子型：Ｆ-ｒｅｃＡ（ｒK12-ｍK12+）ｒｉｆrＩＤＥ３）
である。
【００９４】Ｔ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎの論文（ゲルフ
大学、１９９５）から得られる予備配列データに基づい
て、ＡＰＸＩＶＡ−１Ｌ（５′−ＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣ
ＧＧＴＧＡＴＧＡ−３′）及びＡＰＸＩＶＡ−１Ｒ
（５′−ＧＧＣＣＡＴＣＧＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴ−
３′）と命名された２つのプライマーを合成した。これ
らのプライマーを、ＰＣＲ増幅において、テンプレート
としてのＡ．プレウロニューモニア血清型３ ＨＶ１１
４株及び血清型１参照株４０７４に由来する染色体ＤＮ
Ａと共に用いた。両者の株で４４２ｂｐの断片が増幅し
た。血清型３染色体ＤＮＡから誘導された断片を、製造
者のプロトコルに従ってジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴ
Ｐ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ））で標識した（この断片をプローブ
ＡＰＸＩＶＡと命名した。図４を参照）。続いて、この
標識プローブを４０７４株からのＣｌａＩ消化染色体Ｄ
ＮＡを含むサザンブロットのハイブリダイズに用いた。
このプローブは約８．０ｋｂの断片とハイブリダイズし
た。ＣｌａＩ消化染色体ＤＮＡをＣｌａＩ消化ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ-（ストラタジェンＵＳＡ）
にライゲートすることにより、血清型１ ４０７４株か
らのａｐｘＩＶ遺伝子を単離した。このライゲートした
ＤＮＡでエシェリヒア・コリＸＬ１−ｂｌｕｅ株を形質
転換し、形質転換体を１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＬＢプレート上で選択した。ａｐｘＩＶを有する
クローンを、このプレートのニトロセルロースレプリカ
のＡＰＸＩＶＡプローブでのコロニーハイブリダイゼー
ションにより選択した。このようにしてｐＲＯＫ７と命
名されたプラスミドを単離し、これが約８ｋｂのＣｌａ
Ｉインサートを有することが示された。このＣｌａＩイ
ンサートの最初の６７３６ｂｐの配列決定を行い（配列
番号１）、４９７１ヌクレオチドのオープンリーディン
グフレームが約１８６ｋＤの予想される大きさを有する
１６５７アミノ酸残基のタンパク質（配列番号２）をコ
ードすることが同定された。この遺伝子をａｐｘＩＶ＿
ｖａｒ１と命名した（図３を参照）。
【００９５】実施例２：Ａ．プレウロニューモニア血清型３のａｐｘＩＶ遺伝子
のクローン化及び分析 標識プローブＡＰＸＩＶＡ（実施例１に記述）を、ＨＶ
１１４株からのＣｌａＩ消化染色体ＤＮＡを含むサザン
ブロットのハイブリダイズに用いた。このプローブは約
７．０ｋｂの断片とハイブリダイズした。ＨＶ１１４か
らの単離染色体ＤＮＡをＣｌａＩで消化し、ＣｌａＩ消
化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ-（ストラタジェ
ンＵＳＡ）にライゲートした。このライゲートしたＤＮ
Ａでエシェリヒア・コリＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換
し、形質転換体を１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含
むＬＢプレートで選択した。ａｐｘＩＶを有するクロー
ンを、このプレートのニトロセルロースレプリカのＡＰ
ＸＩＶＡプローブでのコロニーハイブリダイゼーション
によって選択した。このようにしてｐＲＯＫ５と命名さ
れたプラスミドを単離し、これが約７ｋｂのＣｌａＩイ
ンサートを有することが示された。このインサートを配
列分析により分析した（配列番号３）。４１４６ｂｐの
オープンリーディングフレームが約１５４ｋＤの予想さ
れる大きさを有する１３８２アミノ酸残基のタンパク質
（配列番号４）をコードすることが同定された。この遺
伝子をａｐｘＩＶ＿ｖａｒ３と命名した（図３を参
照）。
【００９６】実施例３：エシェリヒア・コリにおけるＡｐｘＩＶ＿ｖａｒ３−ポ
リヒスチジン融合タンパク質の発現 プラスミドｐＲＯＫ５から、ＢａｍＨＩ部位（配列番号
３におけるヌクレオチド２７４７）から始りａｐｘＩＶ
遺伝子の下流のインサートの末端のＣｌａＩ部位まで
の、ａｐｘＩＶ遺伝子の３′末端を含む欠失クローンを
作製した。このプラスミドをｐＲＯＫ１と命名した。オ
リゴヌクレオチドＡＰＸＩＶＡＨＩＳ１−Ｌ（５′−Ａ
ＧＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＣＡＧ
−３′）及びＡＰＸＩＶＡＨＩＳ１−Ｒ（５′−ＴＡＴ
ＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣ−３′）
並びにテンプレートとしてのプラスミドｐＲＯＫ１から
のＤＮＡを用いて、それぞれ５′及び３′末端のＮｄｅ
Ｉ及びＢａｍＨＩ制限部位に隣接するａｐｘＩＶ＿ｖａ
ｒ３のｂｐ３５２０ないし５６４３の領域（配列番号
３）を含む２．１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図４を
参照）。このＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ消化ＰＣＲ断片を同
じ酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＨＩＳ−１にクロ
ーン化した後、ｐＪＦＦａｐｘＩＶ６／１０ｈｉｓ−１
と命名されたプラスミドを得た。プラスミドｐＥＴＨＩ
Ｓ−１は、多重クローニング部位が拡張され、ヒスチジ
ン１０量体をコードする領域が挿入されているｐＥＴ１
４ｂ（ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）、マデ
ィスン、Ｗｉ）の誘導体である。その結果、ｐＪＦＦａ
ｐｘＩＶ６／１０ｈｉｓ−１プラスミドは、Ｔ７プロモ
ーターの制御の下でヒスチジン６量体、続いて配列番号
４のアミノ酸６５３ないし１３６０、続いてヒスチジン
１０量体をコードする翻訳融合体を有する。このプラス
ミドを、安定性を増加させるためのＴ７リゾザイム遺伝
子に加えてＩＰＴＧ誘発性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を含むｐＬｙｓＳを有するエシェリヒア・コリＨＭＳ
１７４（ＤＥ３）株に移入した。この株を、２５ｍｇ／
ｍｌのクロラムフェニコール及び１００ｍｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬＢ培地においてＯＤ650 ０．５ま
で成長させ、１０ｍＭの濃度のイソプロピル−ｂ−Ｄ−
チオガラクトピラノシドで誘発した。ＩＰＴＧを添加し
た後、細胞を３７℃で２．５時間インキュベートし、遠
心によって細胞を回収して８０ｋＤの予想される大きさ
を有する融合タンパク質を封入体の形態で単離した。こ
の封入体をｐＨ８．０の６Ｍ塩酸グアニジン、３００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4の溶液に溶解
し、Ｎｉ2+キレートカラム（キアゲンＡＧ（Ｑｉａｇｅ
ｎ ＡＧ）、バーセル）を用いる固相金属親和性クロマ
トグラフィー（ＩＭＡＣ）（Ｓｃｈｍｉｔｔｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ １８：２２３−２３０、１９９３）により８０
ｋＤ融合タンパク質をさらに精製した。純粋なタンパク
質はｐＨ５．０でカラムから溶出した。プールした画分
をｐＨ８．０の３００ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ Ｎ
ａＨ2ＰＯ4の溶液に対して透析した。１容積の完全フロ
イントアジュバント（ディフコ・ラブス（ＤｉｆｃｏＬ
ａｂｓ）、デトロイト、ＭＩ）と混合したこのポリヒス
チジン融合産生物５００ｍｇでウサギを免疫した。３週
間後に、不完全フロイントアジュバントと混合した同じ
量の追加免疫用量を投与した。追加免疫の４週間後、ウ
サギを瀉血させて抗−ＡｐｘＩＶ毒素抗体を含む過免疫
血清を得、これを血清５２２−４０９と命名した。
【００９７】実施例４：イン・ビトロ成長Ａ．プレウロニューモニアにおけるａ
ｐｘＩＶ遺伝子の発現 血清型１に由来するＡ．プレウロニューモニア参照株を
１０ｍｇ／ｍｌのｂ−ＮＡＤを補足したＣｏｌｕｍｂｉ
ａブロスで成長させ、記述される通りに回収した（Ｂｅ
ｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，３２：２７４９−２７５４，１９９４）。Ａｐｘ
ＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ及びＡｐｘＩＶＡ−ポリヒスチジン
融合タンパク質を含むレーンに隣接した濃縮培養上清を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５，
１９７０）、ウェスタンブロット法（Ｔｏｗｂｉｎ ｅ
ｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７６：４３５０−４３５４）にかけた。このウェ
スタンブロットをＢｅｃｋら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，３２：２７４９−２７５４，１９９４）
に記述される抗−ＡｐｘＩａ−及び抗−ＡｐｃＩＩＡモ
ノクローナル抗体並びに抗−ＡｐｘＩＶ血清５２２−４
０９（実施例３を参照）と反応させた。血清型１の単離
ＲＴＸ毒素画分は明らかにＡｐｘＩＡ及びＡｐｘＩＩＡ
を含んでいる。ＡｐｘＩＶＡの存在を示すことはできな
かった。（図５参照） 実施例５：感染の間のイン・ビボでのＡ．プレウロニューモニアに
おけるａｐｘＩＶ遺伝子の発現 ８０ｋＤポリヒスチジン−ＡｐｘＩＶ＿ｖａｒ３融合タ
ンパク質（実施例３を参照）を含むポリアクリルアミド
ゲルをニトロセルロース膜に移行した。この膜を細片に
分割し、それらを血清型１に対する回復期野外血清又は
血清型１参照株に実験的に感染させたブタからの血清
（の１００倍希釈液）と反応させた（Ｆｒｅｙ ａｎｄ
Ｎｉｃｏｌｅｔ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２
８：６１−７３，１９９１）。この反応を、ウサギＩｇ
Ｇに対するアルカリホスファターゼ標識結合体（カーク
ガード・ペリー社（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ Ｐｅｒｒｙ
Ｉｎｃ．）、ガイサースバーグ、Ｍｄ．）及びＮＢＴ
（４−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド）及びＢ
ＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホス
フェート）発色を用いて可視化した（図６を参照）。実
験的に感染させたブタからの血清に加えて血清型１野外
血清が８０ｋＤポリヒスチジン−ＡｐｘＩＶ＿ｖａｒ３
タンパク質と反応する。これは、ブタにおけるＡ．プレ
ウロニューモニア感染の間にＡｐｘＩＶタンパク質が実
際に発現し、それが抗原性であって抗−ＡｐｘＩＶ毒素
抗体を誘発することを示す。
【００９８】実施例６：サザンブロッティングを用いる、全てのＡ．プレウロニ
ューモニア血清型におけるａｐｘＩＶ遺伝子の存在及び
アクチノバシラスの非プレウロニューモニア株における
それらの非存在 様々なＡ．プレウロニューモニア血清型及び関連細菌に
おけるａｐｘＩＶ遺伝子の存在を調べるため、３種類の
プローブを作製した（図４を参照）。プローブＡＰＸＩ
ＶＡは実施例１に説明されている。プローブＡＰＸＩＶ
Ａ２はＢａｍＨＩ部位とＮｒｕＩ部位との間の２０１５
ｂｐのＤＮＡ断片を含む。７５８ｂｐプローブＡＰＸＩ
ＶＡ１は、オリゴＡＰＰＩＶ１−Ｌ（５′−ＧＧＧＡＣ
ＡＧＴＧＧＣＴＣＡＡＴＴＡＡＧ−３′）及びＡＰＰＩ
Ｖ１−Ｒ（５′−ＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡ
ＡＣＧ−３′）を用いてＰＣＲ増幅によって作製した。
全てのプローブを製造者のプロトコルに従ってジゴキシ
ゲニン−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガーマンハイム）で
標識し、全てのＡ．プレウロニューモニア参照株及びＨ
Ｖ１１４野外株、アクチノバシラス・スイス（ＡＴＣＣ
１５５５８）、アクチノバシラス・ロシイ（ＡＴＣＣ２
７０７２）及びアクチノバシラス・エクウリ（ＡＴＣＣ
１９３９２）のＣｌａＩ消化染色体ＤＮＡを含むサザン
ブロットとハイブリダイズさせた。３種類のプローブは
全て同様に反応する（ＡＰＸＩＶＡ２プローブでの結果
については図７を参照）。Ａ．スイス、Ａ．エクウリ及
びＡ．ロシイ株ではハイブリダイゼーションは観察され
ないのに対して、全てのＡ．プレウロニューモニア株は
反応する。
【００９９】実施例７：ＰＣＲ増幅を用いる、Ａ．プレウロニューモニア及び関
連株におけるａｐｘＩＶ遺伝子の存在 様々なＡ．プレウロニューモニア血清型に由来する染色
体ＤＮＡ ５０ｎｇ、テンプレートとしての他のアクチ
ノバシラスの種及びＰ．ヘモリチカ（Ｐ．ｈａｅｍｏｌ
ｙｔｉｃａ）、並びにプライマーＡＰＸＩＶＡ−１Ｌ
（５′−ＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡ−
３′）及びＡＰＸＩＶＡ−１Ｒ（５′−ＧＧＣＣＡＴＣ
ＧＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴ−３′）を用いて、ＰＣＲ増幅
を行った。それらの産生物をアガロースゲルで分析した
ところ、４４２ｂｐの予想される大きさを有する産生物
は、Ａ．プレウロニューモニア試料では全て観察された
が、他のアクチノバシラス種では観察されなかった（図
８）。これは、実施例６の結果に加えて、ＰＣＲも他の
アクチノバシラスの種からのＡ．プレウロニューモニア
の識別に用いることが可能であることを示している。
【０１００】実施例８：ＡｐｘＩＶ−ｖａｒ１ポリヒスチジン融合タンパク質の
過剰発現 テンプレートしてのプラスミドｐＲＯＫ−７（実施例１
を参照）並びにＰＣＲプライマーとしてのオリゴヌクレ
オチドＡＰＸ４／ＩＩ５−Ｌ（５′−ＣＧＣＣＡＴＡＴ
ＧＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＡＡＧ）及びＡＰ
Ｘ４ＩＩ６−Ｒ（５′−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡ
ＣＡＣＡＡＧＡＧＡＴＡＴ）から開始してＰＣＲ断片を
増幅した。次いで、十分な量のこの断片を制限酵素Ｎｄ
ｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、実施例３に説明されるよ
うに同じ酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＨＩＳ−１
にクローン化した。ｐＪＦＦＡｐｘＩＶＡ１Ｈｉｓ１と
命名された、得られたプラスミドから、実施例３に説明
されているように、１８４１アミノ酸残基を有する２０
６ｋＤのポリヒスチジン融合タンパク質（ＰＡＧＥで決
定したＭＷ）をエシェリヒア・コリ中で過剰発現させ
た。このタンパク質は、配列番号５に示されている核酸
１１３２ないし６５４６にわたるコーディング領域にコ
ード化されている。このタンパク質のアミノ酸配列を配
列番号６に示す。ウェスタンブロットにおいて、このタ
ンパク質は特定の抗−ＡｐｘＩＶ血清５２２−４０９
（実施例３に説明されている抗血清）と反応することが
示された。
【０１０１】実施例９：ＡｐｘＩＶでのワクチン接種によるＡＰＰ感作に対する
マウスの防御 共に血清型１参照株４０７４ゲノム材料から誘導され
る、実施例８に説明されている２０６ｋＤポリヒスチジ
ン−ＡｐｘＩＶ融合タンパク質及びこれにと比較するた
めの１０８ｋＤポリヒスチジン−ＡｐｘＩＡ融合タンパ
ク質を、実施例３に説明されている通りに過剰発現させ
た。その誘発されたエシェリヒア・コリ細胞の細胞ペレ
ットをＰＢＳ緩衝液に再懸濁し（６ｍｌ中に１ｇの細胞
ペレット）、細胞を溶解させるため氷上で４５秒間、２
回超音波処理した。２２，０００×ｇ、４℃で２０分間
遠心した後、上清を捨てて得られたペレットを３Ｍ尿素
の溶液（ｐＨ６．３）で洗浄した。２２，０００×ｇで
２０分間遠心して尿素を除去し、得られたペレットを６
ＭグアニジニウムＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。Ｐ
ＡＧＥゲルの濃度測定の後、特定のタンパク質の含量を
基準にしてタンパク質試料を標準化した。これらの試料
をＰＢＳで希釈し、油性アジュバントと共に処方した。
【０１０２】各々１５匹のマウスの３つの群を、Ａｐｘ
ＩＶ抗原（３６．３μｇ）、ＡｐｘＩＡ抗原（３６．３
μｇ）、又はアジュバント単独を腹腔内投与することに
より免疫した。ワクチンを０．４ｍｌの容量で投与し
た。最初のワクチン接種の２４日後、各群を７及び８匹
のマウスの２つの群にわけ、それらを半量の抗原で追加
免疫した。７匹のマウスの群は０．２ｍｌの容量で腹腔
内投与することにより追加免疫し、８匹のマウスの群は
後肢の各々に０．１ｍｌを筋肉内投与することによりワ
クチン接種した。追加免疫の１３日後、これらのマウス
に１．５ １０8ｃｆｕの毒性血清型１株を腹腔内投与
により抗原投与した。
【０１０３】実施例１０：ＡｐｘＩＶの細孔形成能力 ＡｐｘＩＶを発現する新たに誘発したエシェリヒア・コ
リ細胞を、Ｍａｉｅｒｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ
ｍｍｕｎ．，６４：４４１５−４４２３（１９９６）に
記述されている人工脂質二重層における細孔（ｐｏｒ
ｅ）形成を試験するためのタンパク質源として用いた。
黒色脂質二重層実験に用いられる方法は従来説明されて
いる（Ｂｅｎｚ ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５１１：３０５−３１９（１９
７８））。ｎ−デカン中のアソレクチン（シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ）、セントルイス、ＭＯからの大豆レクチンＩＶ
−Ｓ型）の１％溶液から膜を形成した。膜を横切る１０
倍塩勾配を確立した後、ケイスレー（Ｋｅｉｔｈｌｅ
ｙ）６１０Ｃ電位計を用いてゼロ電流膜電位を５−１０
分測定した（Ｂｅｎｚ ｅｔ ａｌ．；Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５１：２３８−２４
７（１９７９））。ＡｐｘＩＶが存在することにより、
０．５％コレステロールの存在下において、４ｎＳの平
均単一チャンネルコンダクタンスで、高頻度の細孔形成
が生じた。
【０１０４】これらの結果は、ＡｐｘＩＶが人工二重層
に細孔を誘発し、したがって、真核細胞にとって毒性で
あり、Ａ．プレウロニューモニアの毒性因子であること
を示している。
【０１０５】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：６７３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：アクチノバシラス・プレウロニューモニア 株名：４０７４（血清型１参照株） 直接の起源 クローン名：ｐＲＯＫ７ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１５７６．．６５４９ 他の情報：／開始コドン＝１５７６ ／機能＝“ＲＴＸ毒素” ／産生物＝“ＡｐｘＩＶ＿ｖａｒ１” ／遺伝子＝“ａｐｘＩＶ＿ｖａｒ１” ／数＝１ 配列
【０１０６】
【化１】
【０１０７】
【化２】
【０１０８】
【化３】
【０１０９】
【化４】
【０１１０】
【化５】
【０１１１】
【化６】
【０１１２】
【化７】
【０１１３】
【化８】
【０１１４】配列番号：２ 配列の長さ：１６５８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１１５】
【化９】
【０１１６】
【化１０】
【０１１７】
【化１１】
【０１１８】
【化１２】
【０１１９】
【化１３】
【０１２０】配列番号：３ 配列の長さ：７００４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：アクチノバシラス・プレウロニューモニア 株名：ＨＶ１１４（血清型３野外株） 直接の起源 クローン名：ｐＲＯＫ５ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１５６６．．５７１４ 他の情報：／開始コドン＝１５６６ ／機能＝“ＲＴＸ毒素” ／産生物＝“ＡｐｘＩＶ＿ｖａｒ３” ／遺伝子＝“ａｐｘＩＶ＿ｖａｒ３” ／数＝１ 配列
【０１２１】
【化１４】
【０１２２】
【化１５】
【０１２３】
【化１６】
【０１２４】
【化１７】
【０１２５】
【化１８】
【０１２６】
【化１９】
【０１２７】
【化２０】
【０１２８】配列番号：４ 配列の長さ：１３８３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１２９】
【化２１】
【０１３０】
【化２２】
【０１３１】
【化２３】
【０１３２】
【化２４】
【０１３３】配列番号：５ 配列の長さ：６７３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：アクチノバシラス・プレウロニューモニア 株名：４０７４（血清型１参照株） 直接の起源 クローン名：ｐＲＯＫ７ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１１３２．．６５４９ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：／開始コドン＝１１３２ ／機能＝“ＲＴＸ毒素” ／産生物＝“ＡｐｘＩＶ” ／立証＝実験 ／遺伝子＝“ＡｐｘＩＶ＿ｖ１” 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６３９．．１１７８ 他の情報：／開始コドン＝６３９ ／機能＝“未知” ／産生物＝“ＯＲＦ１” ／遺伝子＝“ｏｒｆ１” 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．４５３ 他の情報：／部分的 ／産生物＝“Ｍｅｔ−Ｇ” ／遺伝子＝“ｍｒｐ” ／標準名＝“ｍｒｐ” ／ラベル＝ｍｒｐ 配列の特徴 特徴を表す記号：−１０ ｓｉｇｎａｌ 存在位置：６１７．．６２３ 他の情報：／標準名＝“−１０” ／ラベル＝−１０ ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：−３５ ｓｉｇｎａｌ 存在位置：５９４．．５９９ 他の情報：／標準名＝“−３５ ｓ” ／ラベル＝−３５ ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：プロモーター 存在位置：４５４．．１１３１ 他の情報：／機能＝“プロモーター” ／標準名＝“プロモーターＡｐｘＩＶ” ／ラベル＝プロモーター 配列
【０１３４】
【化２５】
【０１３５】
【化２６】
【０１３６】
【化２７】
【０１３７】
【化２８】
【０１３８】
【化２９】
【０１３９】
【化３０】
【０１４０】
【化３１】
【０１４１】配列番号：６ 配列の長さ：１５１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１４２】
【化３２】
【０１４３】配列番号：７ 配列の長さ：１８０６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１４４】
【化３３】
【０１４５】
【化３４】
【０１４６】
【化３５】
【０１４７】
【化３６】
【０１４８】
【化３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡｐｘＩＶＡｖａｒ１とＡｐｘＩＶＡｖａｒ３
との比較（ｖａｒは血清型を表す）。Ｃ−末端に見出さ
れる異なる特徴の図式的描写。断続するボックスはＡｐ
ｘＩＶＡにおける直接反復を表す。ボールド体の垂直バ
ーはグリシンに富むノナペプチドを示し、ＤＮＡポリメ
ラーゼ群Ｂ記号が黒い三角で示される。アミノ酸配列Ｙ
ＳＤＳＡＮＳＫＫはＡｐｘＩＶＡｖａｒ３遺伝子のスペ
ーサー配列を表す。ＡｐｘＩＶＡｖａｒ３では欠失して
いるＡｐｘＩＶＡｖａｒ１の配列セグメントも図に示さ
れている。
【図２】ＡｐｘＩＶＡｖａｒ１及びＡｐｘＩＶＡｖａｒ
３の直接反復１（Ａ）、直接反復２（Ｂ）及び直接反復
３（Ｃ）のアミノ酸配列の整列化。配列の比較のため、
直接反復１、２及び３の各々のコピーには文字を付して
それらを区別している。変異残基はボールド体の文字で
示されている。
【図３】ｐＢＬａｃ７（Ｔ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎの論
文、ゲルフ大学、１９９５）、ｐＲＯＫ７及びｐＲＯＫ
５の部分的な制限酵素地図。異なるオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）が矢印で示されている。ｐＲＯＫ
７中のｌａｃＺの断続する矢印はその遺伝子の部分的な
配列決定を示す。潜在的なｒｈｏ非依存性転写ターミネ
ーターが示されている（Ω）。潜在的な転写開始部位は
三角で示されている。制限酵素部位：Ａ＝Ａｓｐ７０
０；Ｂ＝ＢａｍＨＩ；Ｃ＝ＣｌａＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＶ；
Ｅｃ＝ＥｃｏＲＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｎ＝Ｎｒｕ
Ｉ；Ｎｄ＝ＮｄｅＩ；Ｎｈ＝ＮｈｅＩ；Ｐ＝ＰｓｔＩ；
Ｓ＝ＳｐｅＩ；Ｓｍ＝ＳｍａＩ。
【図４】ａｐｘＩＶｖａｒ３遺伝子の地図上での様々な
オリゴヌクレオチド及びプローブの位置。
【図５】イン・ビトロ培養した血清型１参照株４０７４
におけるＡｐｘＩＶの発現。パネルＡは抗−ＡｐｘＩＡ
モノクローナル抗体と反応させ、パネルＢは抗−Ａｐｘ
ＩＩＡと反応させ、パネルＣは抗−ＡｐｘＩＶＡ血清５
２２−４０９と反応させた。レーン１はＡｐｘＩＡ−ポ
リヒスチジン融合タンパク質を含み、レーン２はＡｐｘ
ＩＩＡ−ポリヒスチジン融合タンパク質を含み、レーン
３は４０７４株濃縮培養上清を含み、レーン４はＡｐｘ
ＩＶＡポリヒスチジン融合タンパク質を含む。
【図６】血清型１の参照株に実験的に感染させたブタか
らの血清（レーン１）又は血清型１野外感染体からのブ
タ血清（レーン２−４）の８０ｋＤポリヒスチジン−Ａ
ｐｘＩＶ融合タンパク質との反応性を示す免疫ブロッ
ト。陽性対照（＋）として血清５２２−４０９を用い、
陰性対照（−）としてＡｐｘＩ及びＡｐｘＩＩに対する
ポリクローナルウサギ血清（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５７；２０５０−２０５
６，１９８９）を１０００倍希釈液として用いた。
【図７】プローブＡＰＸＩＶＡ２とハイブリダイズした
ＣｌａＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット。レーン１
−１３：Ａ．プレウロニューモニア参照株；１：血清型
１；２：血清型２；３：血清型３；４：血清型４；５：
血清型５ａ；６：血清型５ｂ；７：血清型６；８：血清
型７；９：血清型８；１０：血清型９；１１：血清型１
０；１２：血清型１１；１３：血清型１２；１４：ＨＶ
１１４野外型；１５：Ａ．スイス（ＡＴＣＣ１５５５
８）；１６：Ａ．ロシイ（ＡＴＣＣ２７０７２）；１
７：Ａ．エクウリ（ＡＴＣＣ１９３９２）。分子サイズ
マーカーは左に（キロ塩基対で）示されている。
【図８】プライマーＡＰＸＩＶＡ−１ｌ及びＡＰＸＩＶ
Ａ−１Ｒを用いたａｐｘＩＶのＰＣＲ増幅。レーンの割
り当て：レーン１ないし１３は、ぞれぞれ、血清型１、
２、３、４、５ａ、５ｂ、６、７、８、９、１０、１１
及び１２に由来するＡ．プレウロニューモニア参照株を
含む；レーン１４：ＨＶ１１４株；レーン１５：Ａ．ス
イス ＡＴＣＣ１５５５８；レーン１６：Ａ．ロシイ
ＡＴＣＣ２７０７２；レーン１７：Ａ．エクウリ ＡＴ
ＣＣ１９３９２；レーン１８：Ａ．リグニエレシイ
（Ａ． ｌｉｇｎｉｅｒｅｓｉｉ）ＡＴＣＣ４９２３
６；レーン１９：Ｐ．ヘモリチカ１型 ＡＴＣＣ１４０
０３。（キロ塩基対の）分子サイズマーカーが左に示さ
れている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/295 Ａ６１Ｋ 39/295 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ 1/21 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アクチノバシラス・プレウロニューモニ
    ア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎ
    ｅｕｍｏｎｉａｅ）の弱毒化生菌であって、該菌が機能
    的ＡｐｘＩＶ毒素を産生しないことを特徴とする弱毒化
    生菌。
  2. 【請求項２】 ＡｐｘＩＶ毒素をコードする遺伝子が変
    異を有することを特徴とする請求項１記載の弱毒化生
    菌。
  3. 【請求項３】 前記変異が挿入及び／又は欠失であるこ
    とを特徴とする請求項２記載の弱毒化生菌。
  4. 【請求項４】 挿入が異種遺伝子を含むことを特徴とす
    る請求項３記載の弱毒化生菌。
  5. 【請求項５】 前記異種遺伝子がブタ増殖性呼吸器症候
    群（ＰＲＲＳ）ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタイ
    ンフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染
    性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、エシェリヒア・コリ
    (Escherichiacoli）、エリシペロスリックス・リューシ
    オパシエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）、パスツレ
    ラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ボルデテラ
    ・ブロンチセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、ヘ
    モフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)及びス
    トレプトコッカス・スイス(Streptococcuss suis)から
    なる群より選択される抗原の１種以上をコードすること
    を特徴とする請求項４記載の弱毒化生菌。
  6. 【請求項６】 前記異種遺伝子がａｐｘＩＶ遺伝子のプ
    ロモーター領域に機能的に結合していることを特徴とす
    る請求項４又は５記載の弱毒化生菌。
  7. 【請求項７】 ａｐｘＩＶ遺伝子の発現を制御するプロ
    モーターを有するヌクレオチド配列。
  8. 【請求項８】 配列番号５の４５１ないし１１３２位の
    ＤＮＡ断片又は依然としてプロモーター活性を有するそ
    れらのサブフラグメントを含むことを特徴とする請求項
    ７記載のヌクレオチド配列。
  9. 【請求項９】 配列番号５の６１７ないし６４１位のＤ
    ＮＡ断片を含むことを特徴とする請求項７記載のヌクレ
    オチド配列。
  10. 【請求項１０】 動物をアクチノバシラス・プレウロニ
    ューモニア細菌の感染に対して防御するためのサブユニ
    ットワクチンであって、該ワクチンが精製ＡｐｘＩＶ毒
    素及び薬学的に許容し得る担体を含むことを特徴とする
    サブユニットワクチン。
  11. 【請求項１１】 動物をアクチノバシラス・プレウロニ
    ューモニア細菌の感染に対して防御するための弱毒化生
    ワクチンであって、該ワクチンが請求項１から６記載の
    弱毒化生菌及び薬学的に許容し得る担体を含むことを特
    徴とする弱毒化生ワクチン。
  12. 【請求項１２】 アジュバントを含むことを特徴とする
    請求項１０又は１１記載のワクチン。
  13. 【請求項１３】 凍結乾燥形態にあることを特徴とする
    請求項１０から１２記載のワクチン。
  14. 【請求項１４】 ブタ病原性微生物又はウイルスに由来
    する１種以上の抗原をさらに含むことを特徴とする請求
    項１０から１３記載のワクチン。
  15. 【請求項１５】 ブタ増殖性呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）
    ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウ
    イルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイル
    ス、ロタウイルス、エシェリヒア・コリ、エリシペロス
    リックス・リューシオパシエ、パスツレラ・ムルトシ
    ダ、ボルデテラ・ブロンチセプチカ、ヘモフィルス・パ
    ラスイス及びストレプトコッカス・スイスからなる群よ
    り選択される抗原の１種以上をさらに含むことを特徴と
    する請求項１４記載のワクチン。
  16. 【請求項１６】 アクチノバシラス・プレウロニューモ
    ニア感染に対して感染し易い動物を防御する方法であっ
    て、請求項１０記載のワクチンを投与することを包含す
    る方法。
  17. 【請求項１７】 機能性ＡｐｘＩＶ毒素を産生しないア
    クチノバシラス・プレウロニューモニアの弱毒化生菌を
    調製する方法であって、ａｐｘＩＶタンパク質をコード
    する遺伝子に変異を導入することを包含する方法。
  18. 【請求項１８】 前記変異が欠失を導入することにより
    得られることを特徴とする請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１１から１５記載の弱毒化生ワ
    クチンを調製する方法であって、請求項１から６記載の
    細菌を薬学的に許容し得る担体と混合することを特徴と
    する方法。
  20. 【請求項２０】 精製ＡｐｘＩＶ毒素を薬学的に許容し
    得る担体と混合することを包含する請求項１０記載のワ
    クチンの調製方法。
  21. 【請求項２１】 アクチノバシラス・プレウロニューモ
    ニア野外株に感染したブタに由来する血清と請求項１に
    記載の弱毒化生ワクチンのアクチノバシラス・プレウロ
    ニューモニア株を用いてワクチン接種されたブタに由来
    する血清とを識別するための診断試験であって、該試験
    が精製ＡｐｘＩＶ毒素を包含することを特徴とする診断
    試験。
  22. 【請求項２２】 ブタにおけるアクチノバシラス・プレ
    ウロニューモニア感染とブタにおけるＡ．スイス感染と
    を区別するための診断試験であって、該試験が精製Ａｐ
    ｘＩＶ毒素を包含することを特徴とする診断試験。
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