DE69933237T2

DE69933237T2 - Multikomponentimpfstoff mit mindestens zwei antigenen von haemophilus influenzae

Info

Publication number: DE69933237T2
Application number: DE69933237T
Authority: DE
Inventors: M. Sheena Aurora LOOSMORE; Yan-Ping Willowdale YANG; H. Michel Willowdale KLEIN
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1998-12-15
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2019-12-16
Also published as: EP1140158B1; PT1140158E; DE69933237D1; WO2000035477A3; DE69933237T3; SI1140158T2; DK1140158T4; CA2355466A1; US6974581B1; EP1140158A2; AU1543900A; SI1140158T1; ES2272086T5; JP4105393B2; CY1106252T1; JP2002532433A; ATE339221T1; US20080286303A1; CA2355466C; ES2272086T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Impfstofflehre und insbesondere den Mehrkomponentenimpfstoff, der rekombinante Haemophilus influenzae-Proteine umfasst, welcher beim Schützen vor einer Krankheit, die durch Haemophilus influenzae verursacht wird, einschließlich Otitis media, nützlich ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Haemophilus influenzae ist die Ursache mehrerer ernster Krankheiten des Menschen wie z.B. Meningitis, Epiglottitis, Septikämie und Otitis media. Es gibt sechs Serotypen von H. influenzae, welche mit a bis f bezeichnet werden, die über deren Kapselpolysaccharid identifiziert werden. H. influenzae Typ b (Hib) war bis zu der Einführung mehrerer Hib-Konjugat-Impfstoffe in den 1980ern eine Hauptursache der bakteriellen Meningitis (Ref. 1). Impfstoffe, welche auf H. influenzae Typ b-Kapselpolysaccharid basieren, welches mit Diphtherietoxoid (Ref. 2), Tetanustoxoid (Ref. 3 und US-Patent 4,496,538) oder einem Außenmembranprotein von Neisseria meningitidis (Ref. 4) konjugiert ist, waren darin wirksam, eine von H. influenzae Typ b hervorgerufene Meningitis zu verringern. Die anderen Serotypen von H. influenzae sind mit invasiven Krankheiten mit geringen Häufigkeiten verbunden, auch wenn es eine Zunahme bei dem Vorkommen von Krankheiten zu geben scheint, welche durch diese Stämme verursacht werden, wenn das Vorkommen der Hib-Krankheit abnimmt (Refs. 5, 6). Nicht eingekapselte oder nicht typisierbare H. influenzae (NTHi) sind ebenfalls für einen weiten Bereich menschlicher Krankheiten, einschließlich Otitis media, Epiglottitis, Pneumonie und Tracheobronchitis, verantwortlich. Das Vorkommen einer von NTHi hervorgerufenen Krankheit wurde durch die Einführung der Hib-Impfstoffe nicht beeinflusst (Ref. 7).
Otitis media ist die häufigste Krankheit in der frühen Kindheit, wobei 60 bis 70% aller Kinder mit einem Alter von weniger als 2 Jahren zwischen einer und drei Ohreninfektionen durchmachen (Ref. 8). Chronische Otitis media ist verantwortlich für das Hören betreffende, sprachliche und kognitive Beeinträchtigungen bei Kindern. H. influenzae-Infektionen machen ca. 30% der Fälle von akuter Otitis media und ca. 60% von chronischer Otitis media aus. Allein in den Vereinigten Staaten kostet die Behandlung von Otitis media zwischen 1 und 2 Milliarden Dollar pro Jahr für Antibiotika und chirurgische Eingriffe wie z.B. Tonsillektomien, Adenoidektomien und die Einführung von Tympanostomie-Röhrchen. Es wird geschätzt, dass zusätzliche 30 Milliarden $ pro Jahr für Begleittherapien wie z.B. Sprachtherapie und spezielle Schulungsklassen ausgegeben werden. Weiterhin werden viele der verursachenden Organismen der Otitis media resistent gegenüber einer Antibiotika-Behandlung. Ein wirksamer prophylaktischer Impfstoff gegen Otitis media ist somit wünschenswert.
Während einer natürlichen Infektion durch NTHi sind an der Oberfläche exponierte Außenmembranproteine, welche eine Antikörperantwort stimulieren, potentiell wichtige Targets für bakterizide und/oder schützende Antikörper und daher potentielle Impfstoffkandidaten. Barenkamp und Bodor (Ref. 9) haben gezeigt, dass Rekonvaleszentenseren von Kindern, die an Otitis media aufgrund von NTHi litten, Antikörper gegen Proteine mit hohem Molekulargewicht (HMW) enthielten. Ca. 70 bis 75% der NTHi-Stämme exprimieren die HMW-Proteine, und die meisten dieser Stämme enthalten zwei Gencluster, die hmw1A8C und hmw2A8C genannt werden (Refs. 10, 11). Von den HMWA-Proteinen wurde gezeigt, dass diese Adhäsine sind, welche eine Befestigung an menschlichen Epithelzellen vermitteln (Ref. 12). Eine Immunisierung mit einer Mischung von nativen HMW1A- und HMW2A-Proteinen führte zu einem partiellen Schutz in dem intrabullaren Herausforderungs-Chinchillamodell von Otitis media (Ref. 13).
Das US-Patent Nr. 5,603,938 (Barenkamp), welches der St. Louis University und der Washington University übertragen wurde, beschreibt die Klonierung, Expression und Sequenzierung der Gene, welche die HMW1- und HMW2-Proteine aus dem Stamm 12 des nicht typisierbaren Haemophilus codieren. Die HMW-Proteine sind eine Familie von Proteinen aus nicht typisierbaren Haemophilus mit einem Molekulargewicht von ca. 100 bis 125 kDa, welche in nicht typisierbaren Haemophilus-Stämmen gefunden werden. Die HMW-Proteine fehlen bei eingekapselten Stämmen von Haemophilus.
Die Produktion nativer HMW-Proteine aus H. influenzae-Stämmen ist sehr gering, und eine Methode zur Produktion protektiver rekombinanter HMW (rHMW)-Proteine wurde in der WO 00/20609 beschrieben. Ein Chinchillamodell der nasopharyngealen Kolonisation wurde speziell entwickelt, um die Impfstoffwirksamkeit von Adhäsinen zu zeigen (Ref. 14), und die rHMW-Proteine sind in diesem Modell protektiv, wie in der WO 00/20609 beschrieben wird. Es wurde gezeigt, dass die rHMW1A- und rHMW2A-Proteine einen zueinander gleichwertigen Schutz bieten, und das rHMW1A-Protein wurde fürweitere Impfstoffstudien ausgewählt. In dieser Anmeldung bezieht sich rHMW auf das rekombinante HMW1A-Protein aus dem NTHi-Stamm 12, auch wenn das entsprechende rekombinante HMW1A-Protein aus anderen NTHi-Stämmen und das entsprechende rHMW2A-Protein aus NTHi-Stämmen für das rHMW eingesetzt werden kann. Die entsprechenden natürlich vorkommenden Proteine können ebenfalls eingesetzt werden.
Wenn sie sich unter Umweltstress wie z.B. hoher Temperatur befinden, überproduzieren Organismen Stressantwort- oder Hitzeschockproteine (hsps). Es wurde gezeigt, dass bakterielle hsps wichtige Immunogene sind, welche sowohl B-Zellen als auch T-Zellen stimulieren (Ref. 16). Die bakteriellen HtrA- oder DegP-Hitzeschockproteine werden unter Stressbedingungen exprimiert, und von dem H. influenzae-HtrA-Protein wurde gezeigt, dass es ein partiell protektives Antigen in dem intrabullaren Herausforderungsmodell von Otitis media ist (Ref. 17). Die HtrA-Proteine sind Serinproteasen, und deren proteolytische Aktivität macht sie instabil. Zusätzlich bauen die Wildtyp-HtrA-Proteine als Komponenten eines Mehrkomponentenimpfstoffes beigemischte Antigene ab. Die gezielte Mutagenese des H. influenzae-htrA-Gens (hin47 genannt) und die Eigenschaften der Mutanten sind vollständig in dem US-Patent Nr. 5,506,139 (Loosmore et al.) beschrieben worden, welches dem Rechtsinhaber hiervon übertragen wurde. Von dem nicht proteolytischen HtrA-Analogen, H91A Hin47, wurde gezeigt, dass dieses ein protektives Antigen gegenüber Bakterämie, welche von H. influenzae Typ b verursacht wird, und gegenüber Otitis media, welche von nicht typisierbaren H. influenzae verursacht wird, ist (Ref. 17). Ein solches Analoges wird hierin verwendet, auch wenn jedes andere nicht proteolytische Analoge des Hin47-Proteins eingesetzt werden kann. HtrA wurde in allen untersuchten Stämmen, einschließlich aller eingekapselten Stämme von H. influenzae, gefunden.
Auch wenn es das Hauptziel eines prophylaktischen Impfstoffes gegen eine H. influenzae-Krankheit, einschließlich Otitis media, ist, die Etablierung einer nasopharyngealen Kolonisation durch Einschließen eines Adhäsins als Immunogen zu verhindern, sind die HMW-Proteine in eingekapselten H. influenzae oder in ca. 25% der NTHi-Stämme nicht vorhanden. Daher wird ein Kombinationsimpfstoff, welcher aus wenigstens einem Adhäsinmolekül und einem zusätzlichen protektiven Antigen, das in allen H. influenzae-Stämmen gefunden wird, zusammengesetzt ist, eine bessere Absicherung gegenüber der Krankheit und ein breites Spektrum an Schutz vor der Krankheit liefern.
Es wäre wünschenswert, wirksame Kombinationsimpfstoffe bereit zu stellen, welche H. influenzae-Komponenten umfassen, die ausgewählte relative Mengen an ausgewählten Antigenen enthalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die Bereitstellung eines Mehrkomponentenimpfstoffes gerichtet, um gegenüber einer Krankheit, welche durch Infektion mit Haemophilus influenzae verursacht wird, einschließlich Otitis media, zu schützen.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine immunogene Zusammensetzung zum Verleihen von Schutz in einem Wirt gegenüber einer Krankheit, welche durch Infektion mit Haemophilus influenzae verursacht wird, einschließlich Otitis media, bereitgestellt, welche wenigstens zwei verschiedene Antigene von Haemophilus influenzae umfasst, wobei wenigstens eines dieser Antigene ein Adhäsin ist und das andere dieser Antigene kein Adhäsin ist.
Das Antigen, welches ein Adhäsin ist, kann ein Protein mit hohem Molekulargewicht (HMW) eines nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus, insbesondere ein HMW1- oder HMW2-Protein des nicht typisierbaren Stammes sein, welches rekombinant erzeugt werden kann.
Das Antigen von Haemophilus influenzae, welches kein Adhäsin ist, kann ein nicht proteolytisches Hitzeschockprotein eines Stammes von Haemophilus influenzae sein. Das nicht proteolytische Hitzeschockprotein eines Stammes von Haemophilus influenzae kann ein Analoges des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins mit einer verminderten Proteaseaktivität, welche weniger als ca. 10% von der des Wildtyp-Hin47-Proteins beträgt, sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung wird eine immunogene Zusammensetzung zum Verleihen von Schutz in einem Wirt gegenüber einer Krankheit, welche durch Haemophilus influenzae verursacht wird, einschließlich Otitis media, bereitgestellt, welche umfasst:
ein Analoges des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins mit einer verminderten Proteaseaktivität, welche weniger als ca. 10% von der des Wildtyp-Hin47-Proteins beträgt, und
ein Protein mit hohem Molekulargewicht (HMW) eines Stammes eines nicht typisierbaren Haemophilus influenzae.
In einer solchen Zusammensetzung kann das HMW-Protein in einer Menge vorliegen, welche die Immunantwort in dem Wirt auf das Hin47-Proteinanaloge verstärkt, während es keine Störung zwischen den Komponenten in Bezug auf denen individuelle Immunogenitäten gibt.
Das Analoge des Hin47-Proteins kann ein solches sein, bei welchem wenigstens eine Aminosäure des Wildtyp-Hin47-Proteins, die zu der Proteaseaktivität beiträgt, entfernt wurde oder durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde, und welches im Wesentlichen dieselben immunogenen Eigenschaften wie das Wildtyp-Hin47-Protein aufweist.
Eine solche wenigstens eine Aminosäure kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus den Aminosäuren 91, 121 und 195 bis 207 des Wildtyp-Hin47-Proteins. Spezielle Mutanten, die verwendet werden können, beinhalten Serin-197, ersetzt durch Alanin, Histidin-91, ersetzt durch Alanin, Lysin oder Arginin, und Asp-121, ersetzt durch Alanin.
Das HMW-Protein des nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus influenzae kann ein HMW1- oder HMW2-Protein sein und kann rekombinant erzeugt werden. Die HMW1- und HMW2-Proteine werden von den entsprechenden Stämmen des nicht typisierbaren Haemophilus influenzae abgeleitet und besitzen die entsprechenden Molekulargewichte, wie sie in der folgenden Tabelle I angegeben sind: TABELLE I
Die immunogene Zusammensetzung der Erfindung kann weiterhin mit einem Hilfsmittel formuliert werden. Ein solches Hilfsmittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann beinhalten (ist aber nicht beschränkt auf): Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, QS21, Quil A, Derivate und Komponenten von diesen, ISCOM-Matrix, Calciumphosphat, Calciumhydroxid, Zinkhydroxid, ein Glycolipid-Analoges, einen Octadecylester einer Aminosäure, ein Muramyldipeptid, Polyphosphazen, ISCOPREP, DC-chol, DDBA und ein Lipoprotein und andere Hilfsmittel, einschließlich bakterieller Toxine, Komponenten und Derivate von diesen, wie beispielsweise in der WO 95/34323 beschrieben wird. Unter besonderen Umständen sind Hilfsmittel, welche eine Th1-Antwort hervorrufen, wünschenswert. Vorteilhafte Kombinationen von Hilfsmitteln werden in der WO 95/34308 beschrieben. Das Hilfsmittel kann vorzugsweise Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid (zusammen als Alaun bekannt) umfassen.
Die Komponenten der immunogenen Zusammensetzung können in geeigneten Mengen, um die gewünschte Immunantwort zu liefern, vorliegen. Die Komponenten kön nen als ein Impfstoff zur in vivo-Verabreichung an den Wirt formuliert sein. Die Impfstoffzusammensetzung kann ca. 25 bis ca. 100 μg der Hin47-Proteins und ca. 25 bis ca. 100 μg des HMW-Proteins enthalten.
Die immunogenen Zusammensetzungen können mit anderen antigenen Komponenten formuliert sein, um einen multivalenten Impfstoff bereit zu stellen, bei welchem die zusätzliche(n) antigene(n) Komponente(n) Schutz gegenüber einer Krankheit verleihen, welche durch ein anderes Pathogen(e) verursacht wird. Solche zusätzlichen Antigene sollten derart sein und sollten in Mengen vorliegen, dass die Immunogenität der einzelnen Komponenten des resultierenden Impfstoffes durch die anderen individuellen Komponenten der Zusammensetzung nicht beeinträchtigt wird. Solche zusätzlichen Antigene sind vorzugsweise gereinigte Antigene in definierten Mengen, um einen Komponentenimpfstoff zu erzeugen.
Solche zusätzlichen Antigene können jene sein, die traditionell in multivalenten Schutzimpfstoffen gefunden werden, wie z.B. Diphtherietoxoid, Tetanustoxoid und Pertussisantigene, einschließlich Pertussistoxoid, filamentösem Hämagglutinin, Pertaktin und/oder Agglutinogenen.
Der resultierende multivalente Impfstoff kann ebenfalls nicht virulenten Poliovirus wie z.B. inaktivierten Poliovirus enthalten, welcher Poliovirus vom Typ 1, Typ 2 und/oder Typ 3 sein kann. Der Mehrkomponentenimpfstoff kann weiterhin ein Konjugat eines Tetanus- oder Diphtherietoxoids und eines Kapselpolysaccharids von Haemophilus influenzae, vorzugsweise PRP-T, umfassen.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich weiterhin auf die immunogene Zusammensetzung der Erfindung, wenn diese als ein Impfstoff verwendet wird. Zusätzlich umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von wenigstens zwei verschiedenen Antigenen von Haemophilus influenzae, von denen wenigstens eines ein Adhäsin ist und von denen das andere dieser Antigene kein Adhäsin ist, bei der Herstellung eines Impfstoffs zum Verleihen von Schutz gegenüber einer Krankheit, einschließlich Otitis media, die durch eine Infektion mit Haemophilus influenzae hervorgerufen wird.
Vorteile der vorliegenden Erfindung beinhalten einen Mehrkomponentenimpfstoff, welcher in einer sicheren und wirksamen Weise Schutz gegenüber Krankheiten durch eingekapselte und nicht eingekapselte Haemophilus influenzae verleihen kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird besser verstanden werden anhand der folgenden Beschreibung in Bezug auf die Zeichnungen, in welchen:
1, welche die Felder A bis E aufweist, die anti-H91A Hin47-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoffe in Mäusen zeigt. Feld A, kein zugegebenes rHMW; Feld B, 0,3 μg zugegebenes rHMW; Feld C, 1,0 μg zugegebenes rHMW; Feld D, 3,0 μg zugegebenes rHMW; Feld E, 10 μg zugegebenes rHMW. Die Pfeile zeigen die zeitliche Einteilung der Immunisierungen an;
2 ein Balkendiagramm ist, welches die synergistische Wirkung auf die primäre Immunantwort auf eine niedrige Dosis von (0,3 μg) von H91A Hin47 durch die Zugabe von rHMW zeigt;
3, welche die Felder A bis D aufweist, die anti-rHMW-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoffe in Mäusen zeigt. Feld A, kein zugegebenes H91A Hin47; Feld B, 0,3 μg zugegebenes H91A Hin47; Feld C, 1,0 μg zugegebenes H91A Hin47; Feld D, 3,0 μg zugegebenes H91A Hin47. Die Pfeile zeigen die zeitliche Einteilung der Immunisierungen an;
4 ein Balkendiagramm ist, welches die synergistische Wirkung auf die primäre Immunantwort in Mäusen auf eine hohe Dosis (10 μg) von rHMW durch die Zugabe von H91A Hin47 zeigt;
5, welche die Felder A bis D aufweist, die anti-H91A Hin47-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoffe in Meerschweinchen zeigt. Feld A, kein zugegebenes rHMW; Feld B, 25 μg zugegebenes rHMW; Feld C, 50 μg zugegebenes rHMW; Feld D, 100 μg zugegebenes rHMW. Die Pfeile zeigen die zeitliche Einteilung der Immunisierungen an;
6, welche die Felder A bis D aufweist, die anti-rHMW-Immunantworten für H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoffe in Meerschweinchen zeigt. Feld A, kein zugegebenes H91A Hin47; Feld B, 25 μg zugegebenes H91A Hin47; Feld C, 50 μg zugegebenes H91A Hin47; Feld D, 100 μg zugegebenes H91A Hin47. Die Pfeile zeigen die zeitliche Einteilung der Immunisierungen an;
7 den Schutz des H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoffes in dem Chinchillamodell von Otitis media zeigt;
8 den Schutz des H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoffes in dem Chinchillamodell der nasopharyngealen Kolonisation zeigt;
9, welche die Felder A und B aufweist, SDS-PAGE-Analysen sind, welche das Stabilitätsprofil des H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoffes am Tag 0 (Feld A) und 14 (Feld B) im Vergleich zu den einzelnen Komponenten zeigen;
10A ein Balkendiagramm der Immunantwort auf H91A und rHMW in der Gegenwart und Abwesenheit von Pentacel^® ist;
10B, welche die Felder A und B aufweist, Balkendiagramme der Immunantwort auf Pertussistoxoid (PT), filamentöses Hämagglutinin (FHA), Pertaktin (69 kDa), Fimbrien-Agglutinogene (Feld A), Tetanustoxoid (TT), Diphtherietoxoid (DT), Polio Typ 1, Polio Typ 2 und PRP-T (Feld B) in Pentacel^® enthält, wenn das Pentacel^® allein oder mit dem Zweikomponenten-H91A + rHMW-H. influenzae-Impfstoff verabreicht wird;
11 ein Konstruktionsschema für die Herstellung des Plasmids DS-2150-1 zeigt, welches das Mutanten-H91A hin47-Gen unter der Kontrolle eines T7-Promoters enthält; und
12 ein Konstruktionsschema für die Herstellung des Plasmids BK-76-1-1 zeigt, welches das hmw1ABC-Gen unter der Kontrolle des T7-Promoters enthält.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Kolonisation des Nasopharynx ist der erste Schritt in der Krankheitsentwicklung für viele bakterielle oder virale Pathogene, einschließlich Haemophilus influenzae, und Impfstoffe, welche Adhäsinmoleküle enthalten, sollten gegen diesen ersten Schritt im Krankheitsverlauf schützen. Von den Proteinen mit hohem Molekulargewicht (HMW), welche in ungefähr 75% der nicht typisierbaren H. influenzae gefunden werden, wurde gezeigt, dass diese Adhäsine sind, welche gegen eine Kolonisation schützen, wenn sie in einer Impfstoffzusammensetzung verabreicht werden. Die HMW-Proteine liegen in eingekapselten H. influenzae-Stämmen oder in ca. 25% der nicht typisierbaren H. influenzae-Stämme nicht vor, und somit sind sie allein nicht ausreichend für einen Impfstoff, der einen Schutz vor allen Stämmen bietet.
Das HtrA-Protein oder Hin47 wird in allen eingekapselten und nicht typisierbaren H. influenzae-Stämmen gefunden. Hin47 schützt gegen Bakterämie, welche von H. influenzae Typ b verursacht wird, und Otitis media, welche von nicht typisierbaren H. influenzae verursacht wird, aber es verhindert selbst nicht die Kolonisation. Hin47 ist proteolytisch und kann selbst nicht in Proteinformulierungen verwendet werden. Ein Kombinationsimpfstoff, welcher HMW und nicht proteolytische Hin47-Antigene umfasst, kann formuliert werden, um gegen wesentliche H. influenzae Krankheiten, einschließlich Otitis media, zu schützen. Die vorliegende Erfindung stellt einen solchen Kombinationsimpfstoff bereit.
Das US-Patent Nr. 5,506,139 (Loosmore et al.) beschreibt die Herstellung von Analogen des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins, welche eine verringerte Proteaseaktivität aufweisen, welche weniger als ca. 10% von der des natürlichen Hin47-Proteins beträgt und welche vorzugsweise im Wesentlichen dieselben immunogenen Eigenschaften wie natürliches Hin47-Protein aufweisen. Das Patent beschreibt ebenfalls die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Nukleinsäuremolekülen, welche die Hin47-Analogen codieren. Das natürliche Hin47-Protein ist immunologisch bei den nicht typisierbaren und Typ b-Isolaten von H. influenzae konserviert. Die Aminosäuresequenz des natürlichen Hin47-Proteins und die Nukleotidsequenz des codierenden hin47-Gens werden in der WO 94/00149, welche am 6. Januar 1994 veröffentlicht wurde, beschrieben.
Die Hin47-Analogen des US-Patents Nr. 5,506,139 werden hergestellt, indem wenigstens eine Aminosäure des natürlichen Hin47, die zu der Proteaseaktivität beiträgt, entfernt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt wird oder indem wenigstens eine Aminosäure in das natürliche Hin47-Protein eingefügt wird, wie hierin speziell beschrieben wird. Die wenigstens eine entfernte oder ersetzte Aminosäure kann aus den Aminosäuren 195 bis 201 von Hin47 ausgewählt werden und kann insbesondere Ser-197 sein, welches entfernt oder durch Alanin ersetzt werden kann. Zusätzlich kann die wenigstens eine entfernte oder ersetzte Aminosäure His-91 sein und kann entfernt oder durch Alanin, Lysin oder Arginin ersetzt werden. Weiterhin kann die wenigstens eine entfernte oder ersetzte Aminosäure Asp-121 sein und kann entfernt oder durch Alanin ersetzt werden.
In dem Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,869,302, welches dem Rechtsinhaber hiervon übertragen wurde, werden mehrfache Mutationen beschrieben, welche an verschiedenen Aminosäuren des natürlichen Hin47-Proteins ausgeführt wurden, um das nicht proteolytische Hin47-Analoge bereit zu stellen.
In der vorliegenden Erfindung wird die Mutation von Histidin 91 zu Alanin (manchmal hierin als „H91A" bezeichnet) zur Veranschaulichung des mutierten Hin47-Proteins eingesetzt, auch wenn andere Hin47-Mutanten mit verringerter Proteaseaktivität, wie sie in dem vorstehend erwähnten Patent und der Anmeldung beschrieben werden, verwendet werden können.
Die Herstellung des HMW-Proteins in rekombinanter Weise (rHMW) wird in der vorstehend erwähnten WO 00/20609 beschrieben.
Die Zusammensetzung der Mehrkomponentenimpfstoffe ist kritisch. Die Impfstoffkomponenten müssen kompatibel sein und sie müssen in geeigneten Verhältnissen kombiniert werden, um eine antigene Störung zu vermeiden und jegliche möglichen Synergien zu optimieren. Wenn sie mit anderen etablierten Impfstoffen verabreicht werden, dürfen sie den Schutz nicht behindern, der von dem Impfstoff gegenüber einer anderen Krankheit(en) geboten wird.
In speziellen Experimenten, die hierin durchgeführt werden, wurden verschiedene Antigenverhältnisse für einen Zweikomponenten-H91A Hin47 + rHMW-Impfstoff in zwei Tierarten verglichen. Eine antigene Störung wurde für steigende Mengen von H91A Hin47 beobachtet, wenn sie mit einer niedrigen Dosis von rHMW kombiniert wurden, jedoch verschwand diese Wirkung bei höheren Dosen von rHMW. Es wurde eine synergistische Wirkung beobachtet für steigende Mengen von rHMW auf die primäre Antikörperantwort auf eine niedrige Dosis von H91A Hin47, und H91A Hin47 verbesserte die primäre Antwort auf rHMW, wenn das rHMW nicht in niedrigen Dosen vorlag. Diese Funde sind darin überraschend, dass ein einzelnes Antigen (H91A Hin47) sowohl eine unterdrückende als auch eine verstärkende Wirkung auf ein anderes Antigen (rHMW) in Abhängigkeit von der vorliegenden Dosis des rHMW haben kann. Es war ebenfalls überraschend, dass rHMW die heftige Antikörperantwort auf H91A Hin47 verstärkte, da es ein schwächeres Immunogen ist.
Was 1 betrifft, so wird dort die Immunantwort in Mäusen auf das H91A Hin47-Antigen eines Zweikomponenten-H91A Hin47 + rHMW-Impfstoffes dargestellt. Hohe Antikörpertiter werden mit allen Impfstoffkombinationen bei der letzten Blutentnahme erreicht, aber für die primäre Antwort bei einer niedrigen Dosis von H91A Hin47 scheint es einen Unterschied zwischen den Proben mit oder ohne rHMW zu geben. Was 2 betrifft, so wird dort die statistische Analyse der synergistischen Wirkung, welche bei der primären Immunantwort auf H91A Hin47 beobachtet wurde, wenn steigende Mengen an rHMW zu einer 0,3 μg-Dosis von H91A Hin47 zugegeben werden, dargestellt.
Was 3 betrifft, so wird dort die Immunantwort in Mäusen auf das rHMW-Antigen des Zweikomponenten-H91A Hin47 + rHMW-Impfstoffes dargestellt. Hohe Antikörpertiter werden mit allen Impfstoffkombinationen außer jenen, welche die niedrigste Dosis von rHMW enthalten, bei der letzten Blutentnahme erreicht. Es gibt eine dramatische Abnahme bei der anti-HMW-Antikörperantwort, wenn die 0,3 μg-Dosis von rHMW mit steigenden Mengen von H91A Hin47 kombiniert wird. Es scheint einen Unterschied zu geben bei der primären Antikörperantwort, wenn die höchste Dosis von rHMW mit steigenden Mengen von H91A Hin47 kombiniert wird. Was 4 betrifft, so wird dort die statistische Analyse der synergistischen Wirkung auf die pri märe Immunantwort auf eine 10 μg-Dosis von rHMW, kombiniert mit steigenden Mengen von H91A Hin47, dargestellt.
Was 5 betrifft, so wird dort die Immunantwort in Meerschweinchen auf die H91A Hin47-Komponente von H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoffen dargestellt. Es gibt keinen statistischen Unterschied bei der anti-H91A Hin47-Antwort auf irgendeinen der Impfstoffe. Was 6 betrifft, so wird dort die Immunantwort in Meerschweinchen auf die rHMW-Komponente von H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoffen dargestellt. Es gibt keinen statistischen Unterschied bei der anti-HMW-Antwort auf irgendeinen der Impfstoffe.
Was 7 betrifft, so wird dort der Schutz, welcher von einem H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoff in dem intrabullaren Herausforderungsmodell von Otitis media geboten wird, im Vergleich zu dem Schutz, welcher durch die H91A Hin47-Komponente allein geboten wird, dargestellt. Beide Impfstoffe sind partiell protektiv. Was 8 betrifft, so wird dort der Schutz, welcher von einem H91A Hin47 + rHMW-Kombinationsimpfstoff in dem nasopharyngealen Kolonisationsmodell geboten wird, im Vergleich zu dem Schutz durch die rHMW-Komponente allein dargestellt. Beide Impfstoffe sind in hohem Maße protektiv.
Was 9 betrifft, so wird dort das Stabilitätsprofil eines H91A Hin47 + rHMW-Impfstoffes an den Tagen 0 und 14 dargestellt. Die zwei Antigene bleiben an dem letzteren Zeitpunkt an dem Alaun adsorbiert und werden nicht abgebaut.
Was die 10A und 10B betrifft, so wird dort die Immunantwort in Meerschweinchen auf die H91A Hin47- und rHMW-Antigene des Zweikomponenten-H. influenzae-Impfstoffes, welcher allein oder zusammen mit Pentacel^® (Diphtherietoxoid + Tetanustoxoid + Polio Typ 1 + Polio Typ 2 + Polio Typ 3 + PRP-T + azellulärer Pertussisimpfstoff, der aus Pertussistoxoid + filamentösem Hämagglutinin + 69 kDa/Pertaktin + Fimbrien-Agglutinogenen zusammengesetzt ist) verabreicht wird, dargestellt. Es wird ebenfalls die Immunantwort auf die Pentacel^®-Antigene, welche allein gegeben oder zusammen mit dem Zweikomponenten-H. influenzae-Impfstoff verabreicht werden, dargestellt. Es gibt keine signifikante synergistische oder suppressive Wirkung der zusammen verabreichten Mehrkomponentenimpfstoffe.
Pentacel^®-Formulierungen werden in der WO 98/00167 beschrieben, welche dem Rechtsinhaber hiervon übertragen wurde.
Biologische Hinterlegungen
Gewisse Vektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, welche für ein Protein mit hohem Molekulargewicht eines nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus codiert, die hierin beschrieben werden und auf welche Bezug genommen wird, wurden bei der America Type Culture Collection (ATCC), welche am University Boulevard 10801, Manassas, Virginia 20110-2209, USA, ansässig ist, gemäß dem Budapester Vertrag und vor der Einreichung dieser Anmeldung hinterlegt. Proben der hinterlegten Vektoren werden der Öffentlichkeit zur Verfügung stehen und alle verhängten Restriktionen oder der Zugang zu den Hinterlegungen werden bei der Erteilung eines Patents auf der Basis dieser US-Patentanmeldung erhalten werden. Zusätzlich wird die Hinterlegung ausgetauscht werden, wenn lebensfähige Proben von der Hinterlegungsstelle nicht abgegeben werden können.
Zusammenfassung der Hinterlegung
BEISPIELE
Die obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezug auf die folgenden speziellen Beispiele erhalten werden.
Methoden der molekularen Genetik, Proteinbiochemie, Immunologie und Fermentationstechnologie, die verwendet werden, aber in dieser Offenbarung und diesen Beispielen nicht explizit beschrieben werden, sind in der wissenschaftlichen Literatur reichlich beschrieben und liegen ganz innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute auf dem Gebiet.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung der H91A Hin47-Impfsstoffkomponente.
Die H91A Hin47-Mutante wurde wie in dem US-Patent Nr. 5,506,139 beschrieben hergestellt. Kurz gesagt wurde ein Oligonukleotid 5' ATCAATAACAGCATTATTGGT 3' (SEQ ID NO: 1) synthetisiert, welches den Histidinrest an Position 91 in dem Hin47-Protein zu Alanin ändern würde (Ref. 17).
Das Plasmid JB-1276-1-2 ist ein auf pUC basierendes Plasmid, welches das T7/hin47-Gen auf einem EcoR I-Fragment enthält und verwendet wurde, um das hin47-Gen zur gezielten Mutagenese mit dem In Vitro Site-Directed Mutagenesis Kit von Amersham in M13mp18 zu klonieren. Die Herstellung des Plasmids JB-1276-1-2 wird in dem USP 5,506,139 beschrieben. Die Mutation des His91-Codons zu Ala91 wurde durch lokale Sequenzierung bestätigt. Das H91A-Mutanten-hin47-Gen wurde in pT7-7 subkloniert, um das Plasmid DS-1277-19 zu erzeugen (11).
Das H91A Hin47-Expressionsplasmid (DS-1277-19) benutzt eine Ampicillin-Selektion. Das T7/H91A hin47-Gen wurde in pBR328 kloniert, so dass eine Tetracyclin-Selektion verwendet werden konnte. Der Vector DS-1312-12 war somit ein auf pBR328 basierendes Plasmid, welches die T7/H91A hin47-Gensequenzen zwischen EcoR I- und Cla I-Stellen enthielt, funktionale Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenzgene aufwies und eine Wiederholung der Hind III – BamH I-Sequenzen, welche sowohl in pBR328 als auch pEVvrfl gefunden werden, enthielt.
Ein neues Plasmid, welches auf DS-1312-12 basierte, wurde konstruiert, welches eine Kanamycin-Selektion benutzt. Das Konstruktionsschema ist in 11 gezeigt. Plasmid-DNA von DS-1312-12 wurde mit Hind III verdaut, was zwei Fragmente erzeugte. Das größere 5,9 kb-Fragment enthielt ein promoterloses tetR-Gen, das ampR-Gen und das T7/H91A hin47-Gen und wurde wieder mit sich selbst ligiert, was den Vektor DS-2140-3 erzeugte. Das Plasmid DS-2140-3 wurde mit Pst I verdaut, und das kanR-Gen aus dem Plasmid pUC-4K (P-L Biochemicals) wurde in die Pst I-Stelle eingefügt, was das DS-2150-1 erzeugte, welches kanR und empfindlich gegenüber sowohl Ampicillin als auch Tetracyclin ist.
Plasmid-DNA von DS-2150-1 wurde aus einer 50 ml-Kultur präpariert, wobei eine Vorschrift verwendet wurde, die auf dem Verfahren von Holmes und Quigley (Ref. 18) basierte und Extraktionen mit Phenol und Chloroform einschloss. E. coli BL21(DE3)-Zellen wurden wie folgt elektrokompetent gemacht. Kurz gesagt wurden 10 ml einer Übernachtkultur in 500 ml YT-Medium inokuliert, und die Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln wachsen gelassen, bis sie ein A₆₂₀ = 0,540 erreichten. Die Kultur wurde für 30 min auf Eis abgeschreckt, für 15 min bei 5 K Upm abzentrifugiert und das Zellpellet in 500 ml eiskaltem sterilen Wasser resuspendiert. Die Zellsuspension wurde wie vorher zentrifugiert und das Zellpellet in 250 ml eiskaltem sterilen Wasser resuspendiert. Die Zellsuspension wurde wieder abzentrifugiert, und die Zellen wurden in 10 ml 10% Glycerol resuspendiert. Die Glycerolsuspension wurde abzentrifugiert, und die Zellen wurden in 1,5 ml 10% Glycerol resuspendiert, als 40 μl-Proben aliquotiert und bei –70°C gelagert.
Ein Aliquot elektrokompetenter BL21(DE3)-Zellen wurde auf Eis aufgetaut und ungefähr 9 ng DS-2150-1-DNA wurden zugegeben. Die Proben wurden für 3 min auf Eis inkubiert, dann in eine –20°C BioRad Gene Pulser-Elektrodenküvette überführt und einem elektrischen Impuls ausgesetzt. 900 μl SOC-Medium wurden zugegeben und die Mischung auf ein Kulturröhrchen überführt, wo sie bei 37°C für 1 Stunde inkubiert wurde, bevor sie auf YT-Agar, welcher 25 μg/ml Kanamycin enthielt, plattiert wurde. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C inkubiert, und einzelne Kolonien wurden für Expressionsstudien verwendet.
Einzelne Klone wurden in NZCYM-Medium bis zu einem A_600nm von ungefähr 0,3 wachsen gelassen, und Lactose wurde bis auf 1 % zugegeben, um die Expression zu induzieren. Die Zellen wurden für 4 Stunden wachsen gelassen, dann geerntet und durch SDS-PAGE analysiert. Der Klon DS-2171-1-1 wurde als ein repräsentativer Klon ausgewählt, welcher hohe Spiegel von H91A Hin47 exprimierte.
Der E. coli, welcher DS-2171-1-1 enthielt, wurde in 2 X 2 I-Kolben, welche 250 ml ECGM (enthaltend 8 g/l Glucose, pH 6,5) enthielten, wachsen gelassen und durch Schütteln bei 37°C für ungefähr 9 Stunden im Dunkeln bei 250 Upm inkubiert. Die Kulturflüssigkeit (2 × 250 ml) wurde in einem 10 I-Fermenter inokuliert und die Kultur bei 37°C wachsen gelassen. Nach ungefähr 10 Stunden Inkubation wird 1 % Lactose (Endkonzentration) zur Induktion zugegeben, worauf weitere 4 Stunden Inkubation folgten.
Die Kulturflüssigkeit wurde in sterilen Transferflaschen geerntet und durch Querstromfiltration gegen 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0, konzentriert und dialysiert. Die Zellen in dem Konzentrat werden lysiert, indem ein Hochdruckhomogenisator verwendet wird (2 Durchläufe bei 15.000 psi), um das H91A Hin47-Protein freizusetzen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 15.000 Upm für 1,5 Stunden entfernt. Der Überstand wurde weiter durch Zentrifugation aufgeklart und durch einen 0,22 μm Dead-End-Filter filtriert. Die Produkte können bis zur Weiterverarbeitung eingefroren bei –70°C gelagert werden.
Natriumchlorid (NaCl) wurde zu der aufgeklarten Probe bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben. Die Probe wurde dann auf einer Anionenaustauscherchromatographiesäule (TMAE-Fraktogel), welche mit 50 mM Tris, pH 8,0, welcher 100 mM NaCl enthielt, äquilibriert war, gereinigt. Das H91A Hin47-Protein wurde in dem Durchfluss erhalten.
Die wässrige Schicht wurde auf eine keramische Hydroxylapatit Typ 1 (CHTP-1)-Säule, welche mit 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, äquilibriert war, geladen. Die Säule wurde dann mit 150 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen, und H91A Hin47 wurde mit 175 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, welcher 1 M NaCl enthielt, eluiert.
Das gereinigte H91A Hin47-Protein wurde konzentriert, indem eine Membran mit einem Molekulargewichtscutoff von 10 kDa verwendet wurde, worauf eine Diafiltration mit ungefähr 10 Volumina an phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,5, folgte.
Das gereinigte H91A Hin47-Protein in PBS wurde durch einen Q600 Sartobind-Membranadsorber geleitet. Nach Durchleiten der Lösung wurde die Membran unter Verwendung von 1,0 M KCl/1,0 M NaOH regeneriert, worauf Waschen mit 1 M KCl, dann Äquilibrieren mit PBS folgten. Der Prozess wurde zweimal wiederholt. Das konzentrierte diafiltrierte H91A Hin47-Protein wurde durch einen 0,22 μm-Membranfilter sterilfiltriert. Sterilem H91A Hin47-Protein wurde Aluminiumphosphat als Hilfsmittel zugesetzt. Das adsorbierte gereinigte Konzentrat wurde verdünnt, um die adsorbierte Rohmenge (bulk) mit 100 μg/ml zu erzeugen.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung der rHMW-Impfstoffkomponente.
Die Produktion und Reinigung des HMW-Proteins wurde in der parallelen US-Patentanmeldung Nr. 09/167,568 beschrieben, welche am 7. Oktober 1998 eingereicht wurde.
Kurz gesagt enthält das Plasmid pHMW1-15 (Ref. 10) eine Xba I-Stelle innerhalb der T7-Promotersequenz und eine einzige BamH I-Stelle innerhalb der Codierungssequenz des reifen HMW1A-Proteins des nicht typisierbaren Haemophilus-Stammes 12. Das 1,8 kb-Xba I-BamH I-Fragment von pHMW1-15 wurde entfernt und durch ein Xba I-BamH I-Fragment mit ungefähr 114 kb, das aus Oligonukleotiden erzeugt wurde, ersetzt. Das resultierende 11,3 kb-Plasmid, DS-1046-1-1, enthält somit den T7-Promoter im Raster verbunden mit dem hmw1A8C-Operon, welches das reife HMW1A-Protein mit 125 kDa codiert (11).
Das Plasmid DS-1046-1-1 enthält die T7-hmw1A8C-Genkassette und weist eine einzige Bgl II-Stelle außerhalb des Codierungsbereichs des reifen HMW1A-Gens auf. Das Plasmid DS-2224-1-4 enthält das E. coli cer-Gen, welches auf einem BamH I-Fragment lokalisiert ist. Dieses Fragment wurde isoliert und in die Bgl II-Stelle des Plasmids DS-1046-1-1 ligiert, um das Plasmid BK-35-4 zu erzeugen (11). Die Kanamycinresistenz-Kassette wurde aus pUC 4K durch Sal I-Restriktion ausgeschnitten und in das mit Sal I geschnittene BK-45-4-Plasmid ligiert, um das Plasmid BK-76-1-1 zu erzeugen.
Die Plasmide wurden durch Elektroporation unter Verwendung eines BioRad-Geräts in E. coli BL21(DE3)-Zellen eingeführt. Stämme wurden bei 37°C in NZCYM-Medium bis zu einer optischen Dichte von A₅₇₈ = 0,3 wachsen gelassen, dann durch die Zugabe von Lactose bis auf 1,0% für 4 Stunden induziert. Proben wurden mit SDS-PAGE Lyse + Beladungspuffer auf 0,2 OD/μl eingestellt, und dieselbe Menge an Proteinprobe wurde auf SDS-PAGE-Gele geladen.
Rekombinantes HMW-Protein wurde in Form von Einschlusskörpern in E. coli exprimiert, und diese wurden durch dasselbe Verfahren gereinigt (12). E. coli-Zellpellets von einer 500 ml-Kultur wurden in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, welcher 0,1 M NaCl enthielt, resuspendiert und durch Beschallung aufgebrochen. Der Extrakt wurde bei 20.000 g für 30 min zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde weiter in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, welcher 0,5% Triton X-100 und 10 mM EDTA enthielt, extrahiert, dann bei 20.000 g für 30 min zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde weiter in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, welcher 1 % Octylglucosid enthielt, extrahiert, dann bei 20.000 g für 30 min zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen.
Das resultierende Pellet, das nach den obigen Extraktionen erhalten wurde, enthält die Einschlusskörper. Das Pellet wurde in 6 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, welcher 6 M Guanidin und 5 mM DTT enthielt, solubilisiert. Zwölf ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, wurden zu dieser Lösung zugegeben, und die Mischung wurde bei 20.000 g für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Polyethylenglycol (PEG) 4000 bei einer Endkonzentration von 7% ausgefällt. Das resultierende Pellet wurde durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 min entfernt, und der Überstand wurde durch (NH₄)₂SO₄ bei 50% Sättigung ausgefällt. Nach der Zugabe von (NH₄)₂SO₄ machte die Lösung eine Phasentrennung durch, wobei das Protein in die obere Phase ging, welche dann einer Zentrifugation bei 20.000 g für 30 min unterzogen wurde. Das resultierende Pellet wurde in 2 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, welcher 6 M Guanidin HCl und 5 mM DTT enthielt, gelöst, und die klare Lösung wurde auf einer Superdex 200-Gelfiltrationssäule, die in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, welcher 2 M Guanidin HCl enthielt, äquilibriert war, gereinigt. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und jene, welche das gereinigte rHMW1 enthielten, wurden gepoolt und über Nacht bei 4°C gegen PBS dialysiert, dann bei 20.000 g für 30 min zentrifugiert. Das Protein blieb unter diesen Bedingungen löslich, und Glycerol wurde zu der rHMW1-Präparation bei einer Endkonzentration von 20% für eine Lagerung bei –20°C zugegeben.
Die Konzentration der rHMW-Impfstoffkomponente wurde in PBS (pH 7,3) auf 400 μg ml^–1 eingestellt und wurde mit dem Hilfsmittel Aluminiumphosphat bis zu einer Endkonzentration von 3 mg ml^–1 versetzt. Unterschiedliche Dosen wurden hergestellt, indem die Stammlösung mit 3 mg ml^–1 Aluminiumphosphat in PBS verdünnt wurde. Beispiel 3 Dieses Beispiel beschreibt die Kombination von H91A Hin47 und rHMW zu einem Zweikomponentenimpfstoff.
Impfstoffe wurden hergestellt, welche Kombinationen von H91A Hin47 und rHMW umfassten, wie in der folgenden Tabelle II angegeben ist: TABELLE II

Anmerkungen:
m zeigt an, dass der Impfstoff verwendet wurde, um Mäuse zu immunisieren.
gp zeigt an, dass der Impfstoff verwendet wurde, um Meerschweinchen zu immunisieren.

Die Impfstoffkomponenten wurden am Tag 0 kombiniert, über Nacht bei 4°C gemischt und am Tag 1 aliquotiert. Die kombinierten Impfstoffe wurden über den gesamten Immunisierungszeitraum hinweg bei 4°C gelagert.
Beispiel 4
Dieses Beispiel beschreibt die Analyse der Immunogenität der Mehrkomponentenimpfstoffe in Tieren.
Gruppen von fünf BALB/c-Mäusen (Charles River, Quebec) wurden subkutan (s.c.) an den Tagen 1, 29 und 43 mit einem der in Beispiel 3 beschriebenen Mäuseimpfstoffe immunisiert. Blutproben wurden an den Tagen 0, 14, 28, 42 und 56 entnommen.
Gruppen von 5 Hartley Outbred Meerschweinchen (Charles River, Quebec) wurden intramuskulär (i.m.) an den Tagen 1, 29 und 43 mit einem der in Beispiel 3 beschriebenen Meerschweinchenimpfstoffe immunisiert. Blutproben wurden an den Tagen 0, 14, 28, 42 und 56 entnommen.
Anti-H91A Hin47- und anti-rHMW-IgG-Antikörpertiter wurden durch antigenspezifische enzymverknüpfte Immunsorbenstests (ELISAs) bestimmt. Mikrotitervertiefungen (NuncMAXISORB, Nunc, Dänemark) wurden mit 50 μl Proteinlösung (0,4 μg ml^–1 für H91A Hin47 oder 0,4 μg ml^–1 für rHMW) beschichtet. Die verwendeten sekundären Antikörper waren affinitätsgereinigte F(ab')₂-Fragmente von Ziegen-anti-Maus-IgG (Fc-spezifischen)- oder anti-Meerschweinchen-IgG (Fc-spezifischen)-Antikörpern, die mit Meerrettichoxidase konjugiert waren (Jackson ImmunoResearch Labs, Mississauga, Ontario). Die Reaktionen wurden unter Verwendung von Tetramethylbenzidin (TMB/H2O2, ADI, Mississauga, Ontario) entwickelt, und Extinktionen wurden bei 450 nm (unter Verwendung von 540 nm als einer Referenzwellenlänge) in einem Flow Multiskan MCC-Mikroplattenlesegerät (ICN Biomedicals, Mississauga, Ontario) gemessen. Der reaktive Titer eines Antiserums wurde definiert als der reziproke Wert der Verdünnung, welche beständig eine zweifache Zunahme in der Extink tion gegenüber der zeigte, die mit der Serumprobe vor der Blutentnahme (pre-bleed) erhalten wurde.
Die Ergebnisse der Immunogenitätsstudien sind in den 1 bis 6 dargestellt. Wie in 1 gezeigt ist, wiesen die Seren der letzen Blutentnahme, die von Mäusen erhalten wurden, welche mit 0,3, 1,0 oder 3,0 μg H91A Hin47 immunisiert wurden, alle hohe Antikörpertiter für H91A Hin47 auf, unabhängig von der vorliegenden Menge an rHMW (0 bis 10 μg). Jedoch gibt es einen statistisch signifikanten Unterschied bei den primären anti-H91A Hin47-Antworten. Wie in 2 gezeigt ist, gibt es eine verstärkte primäre Antwort auf H91A Hin47 bei dem Vorliegen steigender Mengen an rHMW. Diese Funde sind überraschend und zeigen, dass rHMW eine synergistische Wirkung auf die primäre Immunantwort auf H91A Hin47 zeigt.
Wie in 3 gezeigt ist, wiesen die Seren der letzen Blutentnahme, die von Mäusen erhalten wurden, welche mit 1, 3 oder 10 μg rHMW immunisiert wurden, alle hohe Antikörpertiter für rHMW auf, unabhängig von der vorliegenden Menge an H91A Hin47 (0 bis 3 μg). Jedoch gibt es bei der niedrigsten Dosis an rHMW (0,3 μg) eine statistisch signifikante Hemmung der Immunantwort auf rHMW bei steigenden Mengen an zugegebenem H91A Hin47. Dieser Fund ist überraschend und legt nahe, dass H91A Hin47 als ein Immunsuppressor für niedrige Dosen von rHMW wirkt. Im Gegensatz dazu verstärkt die Zugabe von H91A Hin47 bei der höchsten Dosis von rHMW (10 μg) signifikant die Immunantwort auf rHMW (4). Diese Funde in Mäusen zeigen, dass die relativen Mengen der zwei Komponenten, H91A Hin47 und rHMW, kritisch sind, um eine gute Immunantwort auf beide Antigene zu erhalten.
Anhand der hierin angegebenen Daten scheint es, dass ca. 3 bis ca. 10 μg an rHMW, am meisten bevorzugt ca. 10 μg, die verstärkte Wirkung mit ca. 1 bis ca. 3 μg H91A Hin47 zeigen.
5 zeigt die anti-H91A Hin47-Antikörpertiter, welche in Meerschweinchen erhalten wurden. Die Zugabe von rHMW wies keine Auswirkung auf die anti-H91A Hin47-Antikörpertiter auf. In ähnlicher Weise wies die Zugabe von H91A Hin47 keine Auswirkung auf die anti-rHMW-Antikörpertiter in Meerschweinchen auf (6).
Beispiel 5
Dieses Beispiel beschreibt das Schutzvermögen eines Mehrkomponentenimpfstoffes in Tiermodellen von Krankheiten.
H91A Hin47 ist in dem Chinchillamodell von Otitis media partiell protektiv, wie in dem vorstehend erwähnten U.S.-Patent Nr. 5,506,139 beschrieben wird. In diesem Modell werden 1 bis 2 Jahre alte Chinchillas (Moulton Chinchilla Ranch, Rochester, Minnesota) an den Tagen 0, 14 und 28 mit 30 μg H91A Hin47, adsorbiert auf Alaun, i.m. immunisiert, und am Tag 44 mit 50 bis 350 cfu lebenden Organismen herausgefordert, welche über die epitympanische Bulla in den Mittelohrraum befördert werden (Ref. 11). Die Tiere werden durch Tympanometrie überwacht, und 4 Tage nach der Herausforderung wird Mittelohrflüssigkeit gesammelt, mit 200 μl BHI-Medium gemischt, und Verdünnungen werden auf Schokoladenagarplatten plattiert, welche für 24 h bei 37°C inkubiert werden. Rekonvaleszente Tiere oder jene, die nur mit Alaun allein scheinimmunisiert wurden, werden als Kontrollen verwendet. Für die Studie des Mehrkomponentenimpfstoffes wurden 50 μg H91A Hin47 mit 50 μg rHMW wie in Beispiel 3 beschrieben gemischt, und Chinchillas wurden wie beschrieben immunisiert. Die Ergebnisse der Schutzstudie sind in 7 gezeigt, welche anzeigt, dass in dem intrabullaren Herausforderungsmodell durch die Kombination von H91A Hin47 -rHMW immer noch ein partieller Schutz geboten wird.
Bei jungen Chinchillas wurde gezeigt, dass eine nasopharyngeale Kolonisation mit nicht typisierbaren H. influenzae zu Otitis media führt (Ref. 14). rHMW ist in einem Chinchilla-Herausforderungsmodell der nasopharyngealen Kolonisation partiell protektiv, wie in der vorstehend erwähnten WO 00/20609 beschrieben wird. In diesem Modell werden Tiere an den Tagen 0, 14 und 28 mit 25, 50 oder 100 μg rHMW, adsorbiert auf Alaun, i.m. immunisiert und am Tag 44 mit 10⁸ cfu lebenden Bakterien herausgefordert, welche intranasal abgegeben werden (50 μl per nares).
Eine nasopharyngeale Spülung wird 4 Tage nach der Herausforderung unter Verwendung von 1 ml steriler Salzlösung als Waschlösung durchgeführt. 25 μl der Waschlösung werden in der Gegenwart von Streptomycin auf Schokoladenagar plattiert, und die Platten werden bei 37°C für 24 h inkubiert. (Der Herausforderungs stamm wurde durch serielle Passage streptomycinresistent gemacht, um die Quantifizierung der zurück gewonnenen Bakterien in der Gegenwart einer natürlichen Flora, welche durch das Streptomycin getötet wird, zu erleichtern). Rekonvaleszente Tiere oder jene, die mit Alaun allein scheinimmunisiert wurden, werden als Kontrollen verwendet. Für die Mehrkomponentenimpfstoffstudie wurden 50 μg rHMW mit 50 μg H91A Hin47 wie in Beispiel 3 beschrieben gemischt, und Chinchillas wurden wie beschrieben immunisiert. Die Ergebnisse der Schutzstudie sind in 8 gezeigt, welche anzeigt, dass in dem Herausforderungsmodell der nasopharyngealen Kolonisation durch die Kombination von H91A Hin47 + rHMW immer noch ein ausgezeichneter Schutz geboten wird.
Beispiel 6
Dieses Beispiel beschreibt die Analyse der Stabilität des Zweikomponentenimpfstoffes.
Das adsorbierte H91A Hin47 (400 μg Protein + 3 mg Aluminiumphosphat pro ml) und rHMW (400 μg Protein + 3 mg Aluminiumphosphat pro ml) wurden 1:1 bis zu einer Endkonzentration von 100 μg jedes Proteins + 3 mg Aluminiumphosphat pro ml wie in Beispiel 3 beschrieben gemischt. Die einzeln adsorbierten H91A Hin47- und rHMW-Proteine wurden ebenfalls auf eine Endkonzentration von 100 μg Protein + 3 mg Aluminiumphosphat/ml eingestellt. Die Proben wurden bei 4°C gelagert, und 0,5 ml-Aliquots wurden am Tag 0 und alle zwei Wochen zur Analyse durch SDS-PAGE entnommen. Die Aliquots wurden bei 10.000 Upm für 10 min mikrozentrifugiert, um den Überstand von dem Alaunpellet zu trennen. Das Pellet wurde in SDS-PAGE-Probenpuffer gelöst, und der Überstand wurde zuerst mit Aceton ausgefällt, dann in SDS-PAGE-Probenpuffer gelöst. Äquivalente Mengen an Überstand und Pellet wurden analysiert, wobei angenommen wurde, dass das Protein entweder zu 100% adsorbiert oder nicht adsorbiert war. Die Ergebnisse der Stabilitätsstudie sind in 9 gezeigt, welche anzeigt, dass es nach zwei Wochen keinen Abbau der Proteine gibt und dass beide immer noch vollständig an dem Alaun adsorbiert sind.
Beispiel 7
Dieses Beispiel stellt die Immunantwort auf eine gemeinsame Verabreichung des Zweikomponenten-H. influenzae-Impfstoffes mit Pentacel^® dar.
Gruppen von 5 Hartley-Meerschweinchen (Charles River, Quebec) wurden an den Tagen 1 und 21 mit einem von H91A Hin47 + rHMW-Zweikomponentenimpfstoff, Pentacel-Impfstoff (ein kommerzieller Impfstoff der Connaught Laboratories Limited, welcher PT + FHA + 69 kDa + Aggs in Gewichten von 20 : 20 : 5 : 3 μg; Diphtherietoxoid mit 15 Lf; Tetanustoxoid mit 5 Lf; IPV, welcher inaktivierten Poliovirus der Typen 1, 2 und 3 mit 40, 8 bzw. 32 D-Antigeneinheiten enthält; 10 μg PRP-T-Konjugat von H. influenzae-Typ B-Polysaccharid, konjugiert mit Tetanustoxoid mit 20 μg, enthält) oder H91A Hin47 + rHMW-Zweikomonentenimpfstoff + Pentacel i.m. immunisiert. Der Zweikomponentenimpfstoff enthielt jeweils 50 μg von H91A Hin47 und rHMW. Die Tiere, welche die Zweikomponenten + Pentacel-Impfstoffe erhielten, bekamen eine Injektion an beiden Flanken. Blutproben wurden am Tag 1, vor der Injektion und dann am Tag 28 entnommen.
Anti-H91A Hin47- und anti-rHMW-IgG-Antikörpertiter wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durch ELISA bestimmt. Anti-Pentacel-Komponenten-IgG-Antikörpertiter wurden durch ELISA, im Wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben, bestimmt. Mikrotiterplatten wurden mit 5 μg ml^–1 Antigen für PT, FHA, 69 kDa, Aggs und PRP; 1/20-Verdünnung von 2,5 Lf ml^–1 für Diphtherietoxoid; 1,3 Lf ml^–1 für Tetanustoxoid; 1/50-Verdünnung von 25,6 EU ml^–1 für Polio Typ 1; oder 1/50-Verdünnung von 15,1 EU ml^–1 für Polio Typ 2 beschichtet. Ein Signal-zu-Rauschen-Verhältnis für Polio Typ 3 konnte nicht ermittelt werden. Die verwendeten sekundären Antikörper waren F(ab)'₂-Fragmente von Esel-anti-Meerschweinchen-IgG (H + L), konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Jackson ImmunoResearch Labs). Negative Kontrollen waren Seren vor der Blutentnahme oder Antiserum gegen ein irrelevantes Antigen aus RSV. Die Ergebnisse sieht man in den 10A und 10B.
ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG
In der Zusammenfassung dieser Offenbarung stellt die vorliegende Erfindung einen Mehrkomponentenimpfstoff gegen Haemophilus influenzae mit einem breiten Wirkungsspektrum und umfassend zwei verschiedene Antigene von Haemophilus influenzae, wobei eines dieser Antigene ein Adhäsin ist und das andere dieser Antigene kein Adhäsin ist, bereit.
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Claims

Eine immunogene Zusammensetzung zum Verleihen von Schutz in einem Wirt gegenüber einer Krankheit, welche durch Haemophilus influenzae verursacht wird, umfassend: wenigstens zwei verschiedene Antigene von Haemophilus influenzae, wobei wenigstens eines dieser Antigene ein Adhäsin ist und das andere dieser Antigene kein Adhäsin ist.
Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Antigen, welches ein Adhäsin ist, ein Protein mit hohem Molekulargewicht (HMW) eines nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus influenzae ist.
Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei das HMW-Protein ein HMW1- oder HMW2-Protein des nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus influenzae ist.
Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei das Antigen von Haemophilus influenzae, welches kein Adhäsin ist, ein nicht proteolytisches Hitzeschockprotein eines Stammes von Haemophilus influenzae ist.
Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei das nicht proteolytische Hitzeschockprotein ein Analoges des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins mit einer verminderten Proteaseaktivität ist, welche weniger als ca. 10% von der des Wildtyp-Hin47-Proteins beträgt.
Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, welche umfasst: ein Analoges des Haemophilus influenzae Hin47-Proteins mit einer verminderten Proteaseaktivität, welche weniger als ca. 10% von der des Wildtyp-Hin47-Proteins beträgt, und ein Protein mit hohem Molekulargewicht (HMW) eines Stammes eines nicht typisierbaren Haemophilus influenzae.
Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei das Analoge des Hin47-Proteins ein solches ist, bei welchem wenigstens eine Aminosäure des Wildtyp-Hin47-Proteins, die zu der Proteaseaktivität beiträgt, entfernt wurde oder durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde, und welches im Wesentlichen dieselben immunogenen Eigenschaften wie das Wildtyp-Hin47-Protein aufweist.
Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die wenigstens eine Aminosäure aus den Aminosäuren 91, 121 und 195 bis 201 des WildtypHin47-Proteins ausgewählt ist.
Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei das Hin47-Proteinanaloge ein solches ist, in welchem Serin-197 durch Alanin ersetzt ist; Histidin-91 durch Alanin oder durch Lysin oder Arginin ersetzt ist; oder Asp-121 durch Alanin ersetzt ist.
Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem der Ansprüche 6 bis 8 beansprucht, wobei das HMW-Protein ein HMW1- oder HMW2-Protein eines nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus influenzae ist, wobei das HMW-Protein rekombinant oder auf andere Weise erzeugt wurde.
Eine Zusammensetzung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei die HMW1- und HMW2-Proteine von dem entsprechenden Stamm des nicht typisierbaren Haemophilus influenzae abgeleitet sind und die entsprechenden Molekulargewichte besitzen, wie sie nachstehend angegeben sind:
Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem der Ansprüche 6 bis 11 beansprucht und umfassend: 25 bis 100 μg des Hin47-Proteinanalogen und 25 bis 100 μg des HMW-Proteins.
Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht und umfassend Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder ein anderes Hilfsmittel.
Eine Zusammensetzung wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht und umfassend als wenigstens eine zusätzliche antigene Komponente zum Verleihen von Schutz gegenüber einer Infektion, die durch ein anderes Pathogen verursacht wird, (i) Diphtherietoxoid, (ii) Tetanustoxoid, (iii) Pertussistoxoid, filamentöses Hämagglutinin, Pertaktin und Agglutinogene; (iv) nicht virulenten Poliovirus; (v) PRP-T oder (vi) eine oder mehrere andere antigene Verbindungen zum Verleihen eines solchen Schutzes.
Eine immunogene Zusammensetzung wie in irgendeinem vorhergehenden Anspruch beansprucht zur Verwendung als einem Impfstoff.
Die Verwendung von wenigstens zwei verschiedenen Antigenen von Haemophilus influenzae, von denen wenigstens eines ein Adhäsin ist und von denen das andere Antigen kein Adhäsin ist, bei der Herstellung eines Impfstoffs zum Verleihen von Schutz gegenüber einer Krankheit, einschließlich Otitis media, die durch eine Infektion mit Haemophilus influenzae hervorgerufen wird.