JP2002532433A - インフルエンザ菌由来の少なくとも2つの抗原を含む、疾病予防のための多成分ワクチン - Google Patents
インフルエンザ菌由来の少なくとも2つの抗原を含む、疾病予防のための多成分ワクチンInfo
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Abstract
Description
に起因する疾病に対する防御に有用な、組換えインフルエンザ菌タンパク質を含
んでなる多成分ワクチンに関する。
の重篤なヒトの疾病の原因である。インフルエンザ菌には、その莢膜多糖によっ
て同定されている、a〜fと称される6種類の血清型がある。b型インフルエン
ザ菌(Hib)は、1980年代にいくつかのHib接合ワクチンの導入がなさ
れるまで、細菌性髄膜炎の主要な原因であった(ref.1. 本出願全体に渡
って、本発明の属する技術分野の現状をより完全に説明するため、様々な参考文
献を括弧内に引用する。各引用に関する完全な文献情報は、請求の範囲の直前、
明細書の末尾に備えられている。これらの参考文献の開示も、参照により本開示
に組み込まれる。)。ジフテリア・トキソイド(ref.2)、破傷風トキソイ
ド(ref.3および米国特許4,496,538)、あるいは、髄膜炎菌外膜
タンパク質(ref.4)と接合された、b型インフルエンザ菌の莢膜多糖に基
づくワクチンは、b型インフルエンザ菌誘発髄膜炎の抑制に有効とされてきた。
他の血清型インフルエンザ菌は、Hib疾患の頻度が下降するに伴って(ref
.5、6)、それらの菌株に起因する疾病の比率に増加が見られるものの、侵襲
性疾患に関連する頻度は低い。無莢膜のまたは型特定不能のインフルエンザ菌(
NTHi)もまた、中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎および気管気管支炎を含む、広範な
ヒトの疾病の原因となる。NTHi誘発疾患の比率は、Hibワクチンの導入に
よっも、影響を受けなかった(ref.7)。
0%に達している(ref.8)、幼児期に最もよくみられる病気である。慢性
中耳炎は、子供において、聴力、発話および認知障害の原因に帰される。インフ
ルエンザ菌感染は、急性中耳炎の症例の約30%、慢性中耳炎の約60%の原因
となっている。米国内だけでも、中耳炎の治療には、抗生物質ならびに、扁桃摘
出術、咽頭扁桃切除術および鼓膜穿孔管の挿入などの外科的処置に、年当たり1
0億〜20億ドルを要している。年間に、言語療法および特殊教育授業などの付
随する治療に対し、追加的な300億ドルが費やされていると推定される。さら
に、中耳炎の病原菌は、抗生物質治療に対して耐性になりつつある。したがって
、中耳炎に対する有効な予防ワクチンが望まれている。
ク質が、殺菌および/または防御抗体に対する、可能性の高い重要な標的であり
、また、したがって、可能性の高いワクチン候補である。Barenkampお
よびBodorは、NTHiによる中耳炎に罹患している子供の回復期血清は、
高分子量(HMW)タンパク質に対する抗体を含むことを明らかにした(ref
.9)。NTHi菌株の約70〜75%は、HMWタンパク質を発現しており、
また、これらの菌株の大部分は、hmw1ABCおよびhmw2ABCと名づけ
られた2つの遺伝子群を含んている(ref.10、11)。HMWAタンパク
質は、ヒト上皮細胞への接着を仲介する接着因子であることが明らかとなった(
ref.12)。天然型のHMW1AおよびHMW2Aタンパク質の混合物によ
る免疫は、中耳炎のチンチラ水疱内攻撃モデルにおいて、部分的防御をもたらし
た(ref.13)。
学とワシントン大学に譲渡されており、また、参照によりその開示をここに組み
込むが、型特定不能のヘモフィルス属菌株12由来のHMW1およびHMW2タ
ンパク質をコードする遺伝子のクローニング、発現および配列決定を記載してい
る。このHMWタンパク質は、型特定不能のヘモフィルス属菌株で見出される、
分子量が約100〜125kDaの型特定不能のヘモフィルス属に由来する、1
群のタンパク質である。HMWタンパク質は、ヘモフィルス属の莢膜保有菌株で
は、存在していない。
、防御的な組換えHMW(rHMW)タンパク質の作製方法が、本出願と同じ譲
受人に譲渡されている、1998年10月7日出願、同時係属中の米国特許出願
第09/167,568号に記載されており、参照によりその開示を本明細書に
組み込む。チンチラ鼻咽頭コロニー形成モデルが、特に接着因子のワクチンとし
ての有効性を立証するために開発され(ref.14)、かつ、前述の同時係属
中の米国特許出願第09/167,568号中に記載されるように、rHMWタ
ンパク質はこのモデルにおいて防御性を示す。rHMW1AおよびrHMW2A
タンパク質は、互いに等価な防御を与えることが示され、以後のワクチン研究に
はrHMW1Aタンパク質が選択された。本出願においては、他のNTHi菌株
由来の対応する組換えHMW1Aタンパク質、ならびにNTHi菌株由来の対応
するrHMW2Aタンパク質も、rHMWとして使用することもできるものの、
rHMWは、NTHi菌株12由来の組換えHMW1Aタンパク質を指す。対応
する、天然に存在するタンパク質を使用することもできる。
ト・ショックタンパク質(hsps)を過剰産生する。細菌性のhspsは、B
細胞とT細胞を共に刺激する、重要な免疫原であることが証明された(ref.
16)。細菌性のHtrAあるいはDegPヒート・ショックタンパク質は、ス
トレス条件下で発現され、かつ、インフルエンザ菌のHtrAタンパク質は、中
耳炎の水疱内攻撃モデルにおいて部分的に防御抗原であることが示されている(
ref.17)。HtrAタンパク質は、セリンプロテアーゼであり、そのタン
パク質分解活性は、それ自体を不安定にする。加えて、多成分ワクチンの成分と
した際、野生型HtrAタンパク質は、混合された抗原を失活させる。インフル
エンザ菌htrA遺伝子(hin47と呼ばれる)の部位特異的変異導入、なら
びにその変異体の特性は、本出願と同じ譲受人に譲渡されている、米国特許第5
,506,139号(Loosmore等)にすべて記載されており、また、参
照によりその開示を本明細書に組み込む。非タンパク質分解性のHtrA類似体
;H91A Hin47は、b型インフルエンザ菌により引き起こされる菌血症
、ならびに型特定不能のインフルエンザ菌に起因する中耳炎に対する防御抗原と
なることが判明している(ref.17)。Hin47の他のいかなる非タンパ
ク質分解性類縁体を使用してもよいが、ここでは、かかる類縁体は利用される。
HtrAは、インフルエンザ菌のすべての莢膜保有菌株を含め、被験菌株全てに
おいて見いだされる。
疫原として接着因子を含有することによって、鼻咽頭コロニー形成の確立を予防
することにあるものの、HMWタンパク質は、莢膜保有インフルエンザ菌ならび
に約25%のNTHi菌株中には、存在しない。したがって、少なくとも1個の
接着因子分子、および全てのインフルエンザ菌株中に見いだされる、付加的な防
御抗原を含んでなる混合ワクチンは、疾病に対するより優れた保護および広範な
疾病防御の範囲をもたらすであろう。
んでなる有効な混合ワクチンを提供することが望まれている。
するための、多成分ワクチンの提供を目指している。
よる感染に起因する疾病に対する防御を付与するための、その抗原の少なくとも
1つが接着因子である、インフルエンザ菌の少なくとも2つの異なる抗原を含ん
でなる免疫原性組成物が提供される。
ク質(HMW)、特には、組換えによって製造することもできる、その型特定不
能菌株のHMW1またはHMW2タンパク質であってもよい。
ク質分解性ヒート・ショックタンパク質であってよい。インフルエンザ菌の非タ
ンパク質分解性ヒート・ショックタンパク質は、そのプロテアーゼ活性が、天然
のHin47タンパク質の値の約10%未満に低下している、インフルエンザ菌
のHin47タンパク質の類縁体でもよい。
、インフルエンザ菌に起因する疾病に対する防御を付与するための免疫原性組成
物であって、 そのプロテアーゼ活性が、天然のHin47タンパク質の値の約10%未満に
低下している、インフルエンザ菌のHin47タンパク質の類縁体、および 型特定不能のインフルエンザ菌株の高分子量(HMW)タンパク質を含むもの
が提供される。
ないものの、宿主における、Hin47タンパク質類縁体に対する免疫応答を増
強する量でHMWタンパク質が存在していてもよい。
47タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸が、除去されるか、または、異なる
アミノ酸により置換されており、また、天然のHin47タンパク質と実質的に
同等の免疫原性を有するものであることができる。
、121、および195〜207からなる群より選択することができる。用いる
ことができる、具体的な変異体に、セリン−197のアラニンによる置換、ヒス
チジン−91のアラニン、リジンまたはアルギニンによる置換、ならびに、As
p−121のアラニンによる置換が含まれる。
HMW2タンパク質でよく、また、組換えによって製造されていてもよい。該H
MW1およびHMW2タンパク質は、型特定不能のインフルエンザ菌の各菌株に
由来しており、かつ下記の表Iに示すそれぞれの分子量を有している。
できる。本発明に利用される、かかるアジュバントには、リン酸アルミニウム、
水酸化アルミニウム、QS21、Quil A、その誘導体および成分、ISC
OM マトリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂
質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミル−ジペプチド、ポリホス
ファゼン、ISCOPREP、DC−chol、DDBAおよびリポタンパク質
、ならびに、例えば、本出願と同じ譲受人に譲渡されており、その開示を参照に
より本明細書に組み込む1994年6月10日出願のUSAN08/258,2
28に記載されているように(WO 95/34323)、細菌性毒素、その要
素およびその誘導体を含む、その他のアジュバントが含まれる(なお、これらに
限られるものではない)。特定の環境下においては、Th1応答を誘発するアジ
ュバントが望ましい。アジュバントの有利な組合せは、本出願と同じ譲受人に譲
渡されている、同時係属している、1994年6月16日出願の米国特許出願第
08/261,194号と1995年6月7日出願の第08/483,856号
に記載されており(1995年11月21日発行のWO 95/34308)、
また、その開示を参照により本明細書に組み込む。好ましくは、アジュバントは
、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム(まとめて、アルムとして知ら
れている)を含むことができる。
ことができる。成分は、宿主へのin vivo投与用ワクチンとして、処方す
ることができる。ワクチン組成物は、Hin47タンパク質を約25〜約100
μg、および、HMWタンパク質を約25〜約100μg含有することができる
。
る防御を付与する、多価ワクチンを提供するため、その他の抗原成分を備えた処
方とすることができる。かかる付加的な抗原は、最終的にできるワクチンの成分
個々の免疫原性が、組成物の他の個々の成分によって、損なわれることのないも
ので、且つそのような量で存在しなければならない。かかる付加的な抗原は、成
分ワクチンを製造するために、規定されている量の精製抗原であることが好まし
い。
らびに、繊維状赤血球凝集素、ペルタクチンおよび/または凝集原を含む百日咳
抗原などの、多価防御ワクチンに伝統的に見いだされる抗原であってよい。
スであってもよい、不活化ポリオウイルスなどの、非毒性ポリオウイルスを含有
してもよい。多成分ワクチンは、さらに、破傷風またはジフテリア・トキソイド
と、インフルエンザ菌の莢膜多糖、好ましくはPRP−Tとの複合体を含むこと
ができる。
とを含んでなる、中耳炎を含む、インフルエンザ菌による感染に起因する疾病に
対して宿主を免疫化する方法にまで及んでいる。
にまで及んでいる。加えて、本発明は、その少なくとも1つが接着因子である、
インフルエンザ菌の少なくとも2つの異なる抗原の、中耳炎を含む、インフルエ
ンザ菌による感染に起因する疾病に対する防御を付与するためのワクチンの製造
における使用も含んでいる。
、安全かつ有効な防護の付与ができる多成分ワクチンが含まれる。
。
ス病原体における疾病発生の第一段階であり、接着因子分子を含有するワクチン
は、疾病進行におけるこの第一段階に対して、防御をするはずである。型特定不
能のインフルエンザ菌の約75%において見いだされる、高分子量(HMW)タ
ンパク質は、ワクチン組成物として投与された際、コロニー形成に対して防御的
である接着因子であることが判明した。該HMWタンパク質は、莢膜保有のイン
フルエンザ菌株あるいは約25%の型特定不能のインフルエンザ菌株には存在し
ておらず、従って、全菌株に対する防御性を有するワクチンとしては、それらの
みでは、十分ではない。
フルエンザ菌株の全てに見いだされる。Hin47は、b型インフルエンザ菌に
起因する菌血症および型特定不能のインフルエンザ菌に起因する中耳炎に対して
防御性であるものの、それ自体はコロニー形成を妨げない。Hin47は、タン
パク質分解性であり、また、それ自体では、タンパク質製剤中で用いることはで
きない。HMWおよび非タンパク質分解性のHin47抗原を含んでなる混合ワ
クチンは、中耳炎を含む、顕著なインフルエンザ菌疾病に対する防御するために
、製剤化することができる。本発明は、このような混合ワクチンを提供する。
ゼ活性が天然のHin47タンパク質の値の約10%未満に低下しており、かつ
好ましくも、天然のHin47タンパク質と実質的に同等な免疫原性を有する、
インフルエンザ菌Hin47タンパク質の類縁体の調製を記載している。この特
許は、また、Hin47類縁体をコードする核酸分子の分離、精製ならびに同定
も記載している。天然のHin47タンパク質は、免疫学的にはインフルエンザ
菌の型特定不能株およびb型分離株中において保持されている。天然Hin47
タンパク質のアミノ酸配列ならびにコードしているhin47遺伝子のヌクレオ
チド配列は、1994年1月6日発行のWO94/00149に記載されており
、参照により本明細書に組み込む。
られているように、天然Hin47タンパク質のプロテアーゼ活性に寄与する少
なくとも1つのアミノ酸を欠失させるか、異なるアミノ酸で置換することにより
、あるいは、天然Hin47タンパク質中に少なくとも1つのアミノ酸を挿入す
ることによって調製される。該少なくとも1つの欠失または置換されるアミノ酸
は、Hin47の195から201のアミノ酸から選択することができ、具体的
にはセリン−197であって、これを欠失させても、アラニンにより置換しても
よい。加えて、少なくとも1つの欠失または置換されるアミノ酸は、His−9
1でもよく、欠失させても、アラニン、リジンまたはアルギニンにより置換して
もよい。さらに、少なくとも1つの欠失または置換されるアミノ酸は、Asp−
121でもよく、欠失させても、アラニンにより置換してもよい。
込む、米国特許第5,869,302号中には、非タンパク質分解性Hin47
類縁体を与えるための、天然Hin47タンパク質の異なるアミノ酸に施された
多重変異が記載されている。
性の低下した他のHin47変異体を利用することもできるものの、ヒスチジン
91のアラニンへの変異(本明細書では、しばしば「H91A」と称する)を、
変異体Hin47タンパク質の例として用いる。
国特許出願第09/167,568号に記載されている。
あらねばならず、また、それらは、抗原性の妨害を避け、可能な何らかの相乗効
果も最適化するため、適当な比率で混合しなければならない。他の既存ワクチン
と共に投与する場合には、該ワクチンによってもたらされる他の疾病に対する防
御を妨害してはならない。
H91A Hin47+rHMWワクチンについて様々な抗原比率が比較されて
いる。抗原性の干渉は、低用量のrHMWと混合した際、H91A Hin47
の量を増加した場合に観察されたが、この影響は、より高用量のrHMWでは消
失した。低用量のH91A Hin47に対する一次抗体応答に対し、rHMW
の量を増加させると、相乗効果が観察され、また、H91A Hin47は、r
HMWが低用量で存在しない場合には、rHMWに対する一次応答を改善させた
。これらの知見は、単一の抗原(H91A Hin47)は、他の抗原(rHM
W)に対して、存在するrHMWの用量に依存して、抑制ならびに増強効果を共
に有するという点で驚くべきことである。また、それ自体は、より弱い免疫原で
あるので、そのrHMWが、H91A Hin47に対する活発な抗体応答を促
進することも驚くべきことであった。
クチンのH91A Hin47に対する免疫応答を説明する。最終採血において
すべてのワクチンの組合せについて高い抗体価が達成されているが、低用量のH
91A Hin47での一次応答には、rHMWの有無によりサンプル間に差が
あるようである。図2を参照すると、0.3μg用量のH91A Hin47に
添加するrHMWの量を増加させた場合、H91A Hin47に対する一次免
疫応答において観察された、相乗効果の統計分析が例示されている。
クチンのrHMW抗原に対する免疫応答を説明する。最低用量のrHMWを含有
するものを除き、すべてのワクチンの組合せにおいて、最終採血では、高い抗体
価に達している。0.3μg用量のrHMWに、増加した量のH91A Hin
47を組み合わせると、抗HMW抗体応答に劇的な低下が生じている。最高用量
のrHMWに、増加した量のH91A Hin47を組み合わせる際には、明ら
かに、その一次抗体応答に差がある。図4を参照すると、増加した量のH91A
Hin47を混合した際の、10μg用量のrHMWに対する一次免疫応答に
おける、相乗効果の統計分析が例示されている。
ワクチンのH91A Hin47成分に対する免疫応答を説明する。いずれのワ
クチンに対しても、抗H91A Hin47応答に統計学的差はなかった。図6
を参照して、モルモットにおける、H91A Hin47+rHMW混合ワクチ
ンのrHMW成分に対する免疫応答を説明する。いずれのワクチンに対しても抗
HMW応答に統計学的差はなかった。
+rHMW混合ワクチンによってもたらされる防御を、H91A Hin47成
分のみによってもたらされる防御と比較して、説明する。両ワクチンとも、部分
的に防御性である。図8を参照して、鼻咽頭コロニー形成モデルにおける、H9
1A Hin47+rHMW混合ワクチンによってもたらされる防御を、rHM
W成分のみによってもたらされる防御と比較して、説明する。両ワクチンともに
、極めて防御性である。
Wワクチンの安定性プロフィルを説明する。2つの抗原は、後者の時点でも、ア
ルム上に依然として吸着されており、劣化を受けていない。
(ジフテリア・トキソイド+破傷風トキソイド+1型ポリオ+2型ポリオ+3型
ポリオ+PRP−T+百日咳トキソイドからなる無細胞百日咳ワクチン+繊維状
赤血球凝集素+69kDa/ペルタクチン+ふさ状凝集原)と同時投与された際
の、2成分インフルエンザ菌ワクチンのH91A Hin47およびrHMW抗
原に対する、モルモットにおける免疫応答を説明する。単独で、または2成分イ
ンフルエンザ菌ワクチンと同時投与された際の、Pentacel(登録商標)
に対する免疫応答も説明する。同時投与した多成分ワクチンの有意な相乗あるい
は抑制効果はなかった。
、1996年7月2日出願の同時係属中の米国特許出願第08/672,530
号に記載されており(WO98/00167)、その開示を参照により本明細書
に組み込む。
高分子量タンパク質をコードする核酸を含む特定のベクターは、本出願の出願に
先立って、ブダペスト条約に従い、10801 University Bou
levard、Manassas、Virginia20110−2209、米
国に所在するAmerica Type Culture Collection(ATCC)に寄託がなさてい
る。寄託されたベクターのサンプルは、公共に利用可能とし、課されるすべての
制限または寄託物を利用する権利は、この米国特許出願に基づく特許の許可によ
り、受けることとする。加えて、該受託機関による生存可能なサンプルの分配が
できない場合には、寄託物の交換を行うこととする。かかる寄託された態様は、
本発明の例示として、なされたものであり、本明細書に記載および請求する記載
され、また特許請求されている本発明は、該寄託された生物材料によってその技
術的範囲を限定されるものではない。本出願中に記載されたものと、等価または
同様の抗原をコードする核酸を含む、いずれの等価あるいは類似のベクターも本
発明の技術的範囲内である。
体例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、単に例示の
目的で記載されており、従って、本発明の技術的範囲を限定することを意図して
いない。適宜な、また、場合に応じた、形態の変更および等価体の置換は、考え
に入れられている。ここでは具体的な条件を用いてきたが、かかる条件は記述上
の便宜を目的とするもので、限定を目的とするものではない。
本開示ならびにこれらの実施例中に事細かには記述されてはいないが、科学文献
に詳細に報告されてもおり、また、十分に当業者の能力の範囲内のものである。
(実施例1) 本実施例は、H91A Hin47ワクチン成分の調製について記載している
。
同様に調製した。簡単に言うと、Hin47タンパク質中の91位のヒスチジン
残基をアラニンに変える、オリゴヌクレオチド 5’ ATCAATAACAG
CATTATTGGT 3’(配列番号1)を合成した(ref.17)。
遺伝子を含んでいるpUCベースのプラスミドであり、そして、Amersha
mのIn Vitro Site−Directed Mutagenesis
キットによって、部位特異的変異導入用のM13mp18中にhin47遺伝子
をクローニングするため、利用した。プラスミドJB−1276−1−2の調製
は、USP5,506,139に記載されている。His91コドンのAla9
1への変異は、部分的な配列決定によって確認した。H91A変異体hin47
遺伝子を、pT7−7中にサブクローニングし、プラスミドDS−1277−1
9を生成した(図11)。
リン選択を利用する。T7/H91A hin47遺伝子をpBR328中にク
ローニングして、テトラサイクリン選択をも使用できるようにした。従って、ベ
クターDS−1312−12は、pBR328ベースのプラスミドであり、Ec
oRIとClaI部位の間にT7/H91A hin47遺伝子配列を含み、機
能性のアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を有し、pBR328と
pEVvrflの双方に見いだされるHindIII−BamH I配列の繰り
返しを含む。
スミドを構築した。構築スキームを図11に示す。DS−1312−12のプラ
スミドDNAを、HindIIIで消化し、2つのフラグメントを生成した。大
きい方の5.9kbフラグメントは、プロモーターを欠くtetR遺伝子、am
pR遺伝子およびT7/H91A hin47遺伝子を含み、また、それ自体中
で再連結して、ベクターDS−2140−3を生成した。プラスミドDS−21
40−3をPst Iで消化し、そして、プラスミドpUC−4K(P−L B
iochemicals)のkanR遺伝子を、このPst I部位に挿入して
、kanR(カナマイシン耐性)であるが、アンピシリンとテトラサイクリンの
双方に感受性を示す、プラスミドDS−2150−1を生成した。
yの手法(ref.18)に基づき、また、フェノールならびにクロロホルムを
用いた抽出を含む、プロトコルを用いて、50mL培養から調製した。大腸菌B
L21(DE3)細胞に、以下のようにエレクトロコンピテントした。簡単に言
うと、10mLの一夜培養物を、YT培地500mLに接種し、A620=0.5
40に達するまで、振盪しながら37℃で細胞を生長させた。培養物を30分間
氷冷し、5Krpm、15分間の遠心し、そして、細胞ペレットを氷冷滅菌水5
00mLに再懸濁した。細胞懸濁液を前と同様に遠心分離し、細胞ペレットを氷
冷滅菌水250mLに再懸濁した。細胞懸濁液を再度遠心し、細胞を10%グリ
セロール10mLに再懸濁した。このグリセロール懸濁液を遠心し、そして、細
胞を10%グリセロール1.5mLに再懸濁し、40μLのサンプルに分液し、
−70℃で保存した。
、DS−2150−1DNA約9ngを加えた。サンプルを氷上で3分間インキ
ュベートし、次いで、−20℃のBioRad Gene Pulser電極キ
ュベットに移し、電気パルスにかけた。SOC培地900μlを加え、混合物を
培養管に移し、そこで、カナマイシン25μg/mLを含むYT寒天上へのプレ
ートに先立ち、37℃で1時間インキュベートした。プレートを37℃で一夜イ
ンキュベートし、単一コロニーを発現検討に使用した。
て、乳糖を1%まで加えて発現を誘導した。細胞を4時間生長させ、次いで集菌
し、SDS PAGEにより分析した。クローンDS−2171−1−1が、高
レベルのH91A Hin47を発現する代表的クローンとして選択された。
/Lを含む、pH6.5)250mLを入れた2×2Lフラスコ中で生長させ、
37℃、250rpmで振盪しながら暗所で、約9時間インキュベートした。培
養液(2×250mL)を10Lの培養槽に接種し、培養物を37℃で生長させ
た。約10時間のインキュベーション後、誘導のために1%乳糖(最終濃度)を
加え、続いてさらに4時間インキュベートした。
CI緩衝液50mMに対するクロスフローろ過によって、濃縮ならびにダイアフ
ィルトレーションを行った。濃縮物中の細胞を高圧ホモジナイザー(15,00
0psiで2通過)で破菌し、H91A Hin47タンパク質を遊離させた。
細胞細片は、15,000rpm、1.5時間の遠心分離により除去した。上清
は、遠心分離によってさらに浄化し、0.22μmのデッド・エンド フィルタ
を通してろ過した。生成物は、さらなる処理まで−70℃で凍結保存した。
を加えた。次いで、100mMNaClを含むpH8.0の50mMTrisで
平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィカラム(TMAE−Fractoge
l)上でサンプルを精製した。H91A Hin47タンパク質が流出画分中に
得られた。
ヒドロキシアパタイト(CHTP−1)カラム上に水層を載せた。次いで、pH
8.0の150mMリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄し、1M NaCl
を含むpH8.0の175mMリン酸ナトリウム緩衝液でH91A Hin47
を溶出した。
ンブランを用い、続いて約10倍量のpH7.5リン酸緩衝食塩水(PBS)に
よるダイアフィルトレーションにより濃縮した。
bind メンブラン吸着膜に通した。溶液の通過後、1.0M KCl/1.
0M NaOHを用い、続いて1M KClで洗浄し、次いでPBSで平衡化す
ることによりメンブランを再生した。このプロセスを2回繰り返した。濃縮とダ
イアフィルトレーションを受けたH91A Hin47タンパク質を、0.22
μmのメンブラン・フィルタを通して滅菌ろ過した。滅菌H91A Hin47
タンパク質は、リン酸アルミニウムによりアジュバントとした。吸着された精製
濃縮物を希釈し、100μg/mLの吸着済みバルクを製造した。
中の米国特許出願第09/167,568号に記載されている。
ーター配列内にXba I部位を、型特定不能のヘモフィルス属菌株12の成熟
HMW1Aタンパク質のコード配列内に単一のBamH I部位を含む。pHM
W1−15の1.8kbのXba I−BamH Iフラグメントを除去し、オ
リゴヌクレオチドから生成する約114bpのXba I−BamH Iフラグ
メントによって置換された。すなわち、得られる11.3kbプラスミド、DS
−1046−1−1は、成熟型125kDaのHMW1Aタンパク質をコードす
るhmw1ABCオペロンと一体に結合されたT7プロモーターを含む(図11
)。
を含み、成熟HMW1A遺伝子のコード領域の外部に単一のBgl II部位を
有する。プラスミドDS−2224−1−4は、BamH Iフラグメント上に
位置する大腸菌cer遺伝子を含む。このフラグメントを単離し、プラスミドD
S−1046−1−1のBgl II部位に連結して、プラスミドBK−35−
4を作製した(図11)。カナマイシン耐性カセットを、Sal I制限酵素に
よってpUC 4Kから切り取り、Sal Iで切断されたBK−35−4プラ
スミド中に連結して、プラスミドBK−76−1−1を作製した。
DE3)細胞中に導入した。吸光度がA578=0.3となるまで、NZCYM培
地中37℃で菌株を成長させ、次いで、1.0%まで乳糖を添加することにより
4時間発現誘導した。サンプルを、SDS−PAGE溶解+添加緩衝液で0.2
OD/μlに調整し、同量のタンパク質サンプルをSDS−PAGEゲル上に載
せた。
した(図12)。500ml培養液からの大腸菌細胞ペレットを、0.1M N
aClを含むpH8.0の50mM Tris−HCl 50mlに再懸濁し、
超音波処理によって破砕した。抽出物を、20,000gで30分間遠心分離し
、得られる上清は捨てた。0.5%Triton X−100および10mM
EDTAを含むpH8.0の50mM Tris−HCl 50ml中でペレッ
トをさらに抽出し、次いで、20,000gで30分間遠心分離し、上清は捨て
た。1%オクチルグリコシドを含むpH8.0の50mM Tris−HCl
50ml中でペレットをさらに抽出し、次いで、20,000gで30分間遠心
分離し、上清は捨てた。
mM DTTを含むpH8.0の50mM Tris−HCl 6ml中でペレ
ットを可溶化した。pH8.0の50mM Tris−HCl 12mlをこの
溶液に加え、混合物を20,000gで30分間遠心分離した。上清を、最終濃
度7%のポリエチレングリコール(PEG)4000で沈澱させた。20,00
0gで30分間の遠心分離により得られるペレットを除去し、そして、50%飽
和の(NH4)2SO4により上清を析出させた。(NH4)2SO4の添加後、溶液
を相分離するとタンパク質は上層に移行し、次いで20,000gで30分間遠
心分離した。6MグアニジンHClおよび5mM DTTを含むpH8.0の5
0mM Tris−HCl 2mlに得られたペレットを溶かし、透明溶液を、
2MグアニジンHClを含むpH8.0の50mM Tris−HCl中で平衡
化したSuperdex 200ゲルろ過カラム上で精製した。SDS−PAG
Eによって画分を分析し、精製rHMW1を含むものをプールし、PBSに対し
て4℃で一夜透析し、次いで、20,000gで30分間遠心分離した。これら
の条件下では、該タンパク質は溶けたままであり、−20℃での保存のため、最
終濃度20%で、グリセロールをrHMW1調製物に加えた。
した。原液を、PBS中の3mgml-1のリン酸アルミニウムで希釈することに
より、様々な用量を調製した。
せについて記載している。
るワクチンを調製した。
クチンは、免疫化期間を通し4℃で保存した。
ている。
らなる群を、実施例3に記載のマウスワクチンの1つで、1、29および43日
目に皮下(s.c.)で免疫化した。血液サンプルは、0、14、28、42お
よび56日目に採取した。
Quebec)からなる群を、実施例3に記載のモルモットワクチンの1つで、
1、29および43日目に筋肉内(i.m.)で免疫化した。血液サンプルは、
0、14、28、42および56日目に採取した。
結合免疫吸着検定法(ELISA)により測定した。マイクロタイターウエル(
NuncMAXISORB、Nunc、Demmark)をタンパク質溶液(H
91A Hin47の場合、0.4μgml-1、またはrHMWの場合、0.4
μgml-1)でコーティングした。用いる二次抗体は、西洋わさびペルオキシダ
ーゼ(Jackson ImmunoResearch Labs、Missi
ssauga、Ontario)と接合した、ヤギの抗マウスIgG(Fc特異
的)または抗モルモットIgG(Fc特異的)のアフィニティー精製F(ab’
)2フラグメントとした。テトラメチルベンジジン(TMB/H2O2、ADI、
Mississauga、Ontario)を用いて反応を起こさせ、Flow
Multiskan MCCマイクロプレートリーダー(ICN Biome
dicals、Mississauga、Ontario)において、450n
m(対照波長として540nmを用いる)で吸光度を測定した。抗血清の反応価
は、予め採血しておいた血清サンプルで得られた吸光度に対して、2倍の吸光度
の増加を確実に示す希釈度の逆数と定義する。
n47 0.3、1.0または3.0μgで免疫化されたマウスから得られる最
終採血血清はすべて、存在するrHMWの量(0から10μg)とは関係なく、
H91A Hin47に対する高い抗体価を有していた。しかしながら、抗H9
1A Hin47 一次応答には統計学的に有意差がある。図2に示すように、
増加した量のrHMWの存在下では、H91A Hin47に対する一次応答は
増強されている。これらの知見は驚くべきことで、H91A Hin47に対す
る一次免疫応答に対してrHMWが相乗効果を示すことを示唆している。
ら得られる最終採血血清はすべて、存在するH91A Hin47の量(0から
3μg)とは関係なく、rHMWに対する高い抗体価を有していた。しかしなが
ら、最低用量のrHMW(0.3μg)では、添加されている、増加した量のH
91A Hin47によって、rHMWに対する免疫応答の統計学的に有意な阻
害がある。この知見は驚くべきことで、低用量のrHMWに対しては、H91A
Hin47が免疫サプレッサーとして作用することを暗示している。これに対
して、最高用量のrHMW(10μg)では、H91A Hin47の添加は、
rHMWに対する免疫応答を明確に増強する(図4)。マウスにおけるこれらの
知見は、H91A Hin47とrHMWの2成分の相対量が、両抗原に対する
良好な免疫応答を得るために重要であることを示している。
は約10μgは、H91A Hin47 約1から約3μgとすると、増強効果
を示すと思われる。
Wの添加は、抗H91A Hin47抗体価に影響しなかった。同様に、H91
A Hin47の添加は、モルモットにおける抗rHMW抗体価に影響しなかっ
た(図6)。
記載している。
n47は、中耳炎のチンチラモデルで部分的に防御性がある。このモデルでは、
1から2歳のチンチラ(Moulton Chinchilla Ranch、
Rochester、Minnesota)を、アルムに吸着させたH91A
Hin47 30μgで0、14および28日目に筋肉内で免疫化し、鼓室上胞
を経由して中耳空間に注入した、50から350cfuの生きた微生物で44日
目にチャレンジする(ref.11)。鼓膜聴力検査により動物をモニターし、
チャレンジ後4日間中耳液を集め、BHI培地200μlと混ぜ、希釈液をチョ
コレート寒天プレート上にプレートし、37℃で24時間インキュベートする。
回復期動物またはアルムのみで模擬免疫化した動物を対照として用いる。多成分
ワクチンの検討では、実施例3に記載のようにH91A Hin47 50μg
をrHMW 50μgと混ぜ、記載したようにチンチラを免疫化した。防御性検
討の結果を図7に示すが、H91A Hin47+rHMWの組合せによる水疱
内攻撃モデルにおいても、やはり部分的防御性のあることを示している。
が中耳炎につながることが明らかにされている(ref.14)。前述の米国特
許出願第09/167,568号に記載されるように、チンチラ鼻咽頭コロニー
形成チャレンジモデルにおいて、rHMWは部分的に防御性がある。このモデル
では、アルムに吸着させたrHMW 25、50または100μgで0、14お
よび28日目に筋肉内で動物を免疫化し、鼻腔内に送り込んだ生きた細菌108
cfu(鼻孔あたり50μl)で44日目にチャレンジする。
。洗浄液25μlをmストレプトマイシン存在下でチョコレート寒天上にプレー
トし、プレートを37℃で24時間インキュベートする(なお、ストレプトマイ
シンによって殺される自然細菌叢の存在下で、回収細菌の定量を容易にするため
に、連続継代培養によってストレプトマイシン耐性のチャレンジ菌株を作成した
)。回復期動物またはアルムのみで模擬免疫化した動物を対照として用いる。多
成分ワクチンの検討には、実施例3に記載のようにrHMW 50μgをH91
A Hin47 50μgと混ぜ、記載したようにチンチラを免疫化した。防御
性検討の結果を図8に示すが、H91A Hin47+rHMWの組合せによる
鼻咽頭コロニー形成チャレンジモデルにおいても、やはり優れた防御性のあるこ
とを示している。
酸アルミニウム3mg)およびrHMW(1ml当たりタンパク質400μg+
リン酸アルミニウム3mg)を実施例3に記載のように1:1で混ぜ、最終濃度
を1ml当たり各タンパク質100μg+リン酸アルミニウム3mgとした。個
々に吸着されたH91A Hin47およびrHMWタンパク質も、タンパク質
100μg+リン酸アルミニウム3mg/mlの最終濃度に調整した。サンプル
を4℃で保存し、SDS−PAGEによる分析のために0日目および2週間毎に
0.5mlの分液を採取する。この分液を、10,000rpmで10分間微量
遠心し、アルムペレットから上清を分離した。ペレットを、SDS−PAGEサ
ンプル緩衝液に溶かし、上清をまずアセトンで沈澱させ、次いで、SDS−PA
GEサンプル緩衝液に溶かした。上清とペレットの等量を、タンパク質が100
%吸着されているか吸着されていないと仮定して分析した。安定性検討の結果を
図9に示すが、2週間後でもタンパク質の分解はなく、アルム上になお完全に吸
着していることを示している。
)との同時投与に対する免疫応答について記載している。
c)からなる群を、H91A Hin47+rHMW2成分ワクチン、Pent
acelワクチン(PT+FHA+69kDa+Aggsを重量で20:20:
5:3μg;ジフテリア・トキソイド15Lf;破傷風トキソイド5Lf;1、
2および3型不活化ポリオウイルスをそれぞれ40、8および32D−抗原単位
含むIPV;破傷風トキソイド20μgと接合したB型インフルエンザ菌多糖の
PRP−T複合体10μgを含有するConnaught Laborator
ies Limitedの市販ワクチン)、またはH91A Hin47+rH
MW2成分ワクチン+Pentacelの1つで、1および21日目に筋肉内で
免疫化した。2成分ワクチンは、H91A Hin47およびrHMWをそれぞ
れ50μgを含んでいた。2成分+Pentacelワクチンを投与される動物
は、それぞれ両脇腹に注射した。血液サンプルは、注射に先立つ1日目と、次い
で28日目に採取した。
のようにELISAで測定した。抗Pentacel成分IgG抗体価は、本質
的に実施例4に記載されているような、ELISAによって測定した。マイクロ
タイタープレートは、PT、FHA、69kDa、Aggs、およびPRPの場
合は、5μgml-1の抗原;ジフテリア・トキソイドの場合は、2.5Lfml -1 の1/20希釈液;破傷風トキソイドの場合には、1.3Lfml-1;1型ポ
リオの場合には、25.6EUml-1の1/50希釈液;ならびに2型ポリオの
場合には、15.1EUml-1の1/50希釈液で、それぞれコーティングした
。3型ポリオについては、信号雑音比は、確認できなかった。用いる二次抗体は
、西洋わさびペルオキシダーゼ(Jackson ImmunoResearc
h Labs)と接合した、ロバの抗モルモットIgG(H+L)のF(ab)
’2フラグメントとした。陰性対照は、予め採血しておいた血清、または、RS
V由来の関連のない抗原に対する抗血清とした。結果を図10Aおよび10Bに
示す。
の2つの異なる抗原を含み、その抗原の1つが接着因子である多成分ワクチンを
提供する。本発明の技術的範囲内で、形態の変更も可能である。 (参照文献)
W混合ワクチンに対する抗H91A Hin47免疫応答を示す図である。パネ
ルA、rHMW無添加;パネルB、rHMW 0.3μg添加;パネルC、rH
MW 1.0μg添加;パネルD、rHMW 3.0μg添加;パネルE、rH
MW 10μg添加。矢印は、免疫のタイミングを示す。
、rHMWの添加による相乗効果を示す棒グラフである。
W混合ワクチンに対する抗rHMW免疫応答を示す図である。パネルA、H91
A Hin47無添加;パネルB、H91A Hin47 0.3μg添加;パ
ネルC、H91A Hin47 1.0μg添加;パネルD、H91A Hin
47 3.0μg添加。矢印は、免疫のタイミングを示す。
91A Hin47の添加による相乗効果を示す棒グラフである。
HMW混合ワクチンに対する抗H91A Hin47免疫応答を示す図である。
パネルA、rHMW無添加;パネルB、rHMW 25μg添加;パネルC、r
HMW 50μg添加;パネルD、rHMW 100μg添加。矢印は、免疫の
タイミングを示す。
HMW混合ワクチンに対する抗rHMW免疫応答を示す図である。パネルA、H
91A Hin47無添加;パネルB、H91A Hin47 25μg添加;
パネルC、H91A Hin47 50μg添加;パネルD、H91A Hin
47 100μg添加。矢印は、免疫のタイミングを示す。
チンの防御を示す図である。
MW混合ワクチンの防御を示す図である。
rHMW混合ワクチンの0日目(パネルA)および14日目(パネルB)の安定
性プロフィルを示すSDS−PAGE分析である。
る、H91AおよびrHMWに対する免疫応答の棒グラフである。 図10Bは、パネルAおよびBがあって、Pentacel(登録商標)を単
独に、または2成分H91A+rHMWインフルエンザ菌ワクチンと共に投与し
た際の、Pentacel(登録商標)中の百日咳トキソイド(PT)、繊維状
赤血球凝集素(FHA)、ペルタクチン(69kDa)、ふさ状凝集素(パネル
A)、破傷風トキソイド(TT)、ジフテリア・トキソイド(DT)、1型ポリ
オ、2型ポリオおよびPRP−T(パネルB)に対する免疫応答の棒グラフを含
む図である。
プラスミドDS−2150−1を調製するための構築スキームを示す図である。
K−76−1−1を調製するための構築スキームを示す図である。
成物。
Claims (26)
- 【請求項1】 宿主において、インフルエンザ菌に起因する疾病に対する防
御を付与するための免疫原性組成物であって、 インフルエンザ菌の少なくとも2つの異なる抗原を含み、その抗原の少なくと
も1つは接着因子である組成物。 - 【請求項2】 接着因子である前記抗原は、インフルエンザ菌の型特定不能
菌株の高分子量(HMW)タンパク質である、請求項1に記載の免疫原性組成物
。 - 【請求項3】 前記HMWタンパク質は、インフルエンザ菌の型特定不能菌
株のHMW1またはHMW2である、請求項2に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項4】 接着因子ではないインフルエンザ菌の抗原が、インフルエン
ザ菌株の非タンパク質分解性のヒート・ショックタンパク質である、請求項1に
記載の免疫原性組成物。 - 【請求項5】 インフルエンザ菌株の非タンパク質分解性のヒート・ショッ
クタンパク質は、そのプロテアーゼ活性が天然Hin47タンパク質の値の約1
0%未満まで低下しているインフルエンザ菌Hin47タンパク質の類縁体であ
る、請求項4に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項6】 宿主において、インフルエンザ菌に起因する疾病に対する防
御を付与するための免疫原性組成物であって、 そのプロテアーゼ活性が天然Hin47タンパク質の値の約10%未満まで低
下しているインフルエンザ菌Hin47タンパク質の類縁体、および 型特定不能のインフルエンザ菌株の高分子量(HMW)タンパク質を含む組成
物。 - 【請求項7】 前記組成物中に、前記HMWタンパク質が、Hin47タン
パク質に対する宿主における免疫応答を増強する量で存在する、請求項6に記載
の組成物。 - 【請求項8】 前記HMWタンパク質は、前記量で存在するものの、その組
成物中のタンパク質の個々の免疫原性は減じていない、請求項7に記載の組成物
。 - 【請求項9】 Hin47タンパク質の前記類縁体は、天然Hin47タン
パク質のプロテアーゼ活性に寄与する、少なくとも1つのアミノ酸が、除去また
は、異なるアミノ酸による置換がなされ、且つ天然のHin47タンパク質と実
質的に同等な免疫原性を有しているものである、請求項6に記載の組成物。 - 【請求項10】 前記の少なくとも1つのアミノ酸は、天然Hin47タン
パク質のアミノ酸91、121および195〜201からなる群から選択される
、請求項9に記載の組成物。 - 【請求項11】 セリン−197がアラニンにより置換されている、請求項
10に記載の組成物。 - 【請求項12】 ヒスチジン−91がアラニン、リジンまたはアルギニンに
より置換されている、請求項10に記載の組成物。 - 【請求項13】 ヒスチジン−91がアラニンにより置換されている、請求
項12に記載の組成物。 - 【請求項14】 アスパラギン酸−121がアラニンにより置換されている
、請求項10に記載の組成物。 - 【請求項15】 前記HMWタンパク質は、インフルエンザ菌の型特定不能
菌株のHMW1またはHMW2タンパク質である、請求項8に記載の免疫原性組
成物。 - 【請求項16】 HMW1およびHMW2タンパク質は、組換え製造されて
いる、請求項15に記載の組成物。 - 【請求項17】 前記HMW1およびHMW2タンパク質は、型特定不能の
インフルエンザ菌の各菌株に由来しており、且つ、下記の表 【表1】 に示すそれぞれの分子量を有している、請求項15に記載の組成物。 - 【請求項18】 さらにアジュバントを含む、請求項6に記載の組成物。
- 【請求項19】 前記アジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリン酸ア
ルミニウムである、請求項18に記載の組成物。 - 【請求項20】 Hin47タンパク質類縁体を約25〜約100μg、お
よび HMWタンパク質を約25〜約100μg含む、請求項6に記載の組成物。 - 【請求項21】 別の病原体に起因する疾病に対する防御をも付与するため
の、少なくとも1つの付加的な抗原成分をさらに含む、請求項6に記載の組成物
。 - 【請求項22】 前記少なくとも1つの付加的な抗原成分が、ジフテリア・
トキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、非毒性ポリオウイルスおよびPR
P−Tからなる群より選択されている、請求項6に記載の組成物。 - 【請求項23】 前記百日咳抗原が、百日咳トキソイド、繊維状赤血球凝集
素、ペルタクチンおよび凝集原からなる群より選択される、請求項22に記載の
組成物。 - 【請求項24】 ワクチンとして使用される、請求項1または6に記載の免
疫原性組成物。 - 【請求項25】 中耳炎を含む、インフルエンザ菌による感染に起因する疾
病に対して、宿主を免疫化する方法であって、 免疫有効量の請求項1または6に記載の組成物を宿主に投与することを含む方法
。 - 【請求項26】 その少なくとも1つが接着因子である、インフルエンザ菌
の少なくとも2つの異なる抗原の使用であって、 中耳炎を含む、インフルエンザ菌による感染に起因する疾病に対する防御を付与
するためのワクチンの製造における使用法。
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