PT1140158E - Vacina de multicomponentes compreendendo pelo menos dois antigénios de haemophilus influenzae - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Vacina de multicomponentes compreendendo pelo menos dois antigénios de Haemophilus influenzae"

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se ao campo da vacinologia e, em particular, à vacina de multicomponentes compreendendo proteínas recombinantes de Haemophilus influenzae que é útil na protecção contra doença causada por Haemophilus influenzae, incluindo otite média.

ANTECEDENTES DO INVENTO A Haemophilus influenzae é a causa de diversas doenças humanas graves, tais como meningite, epiglotite, septicemia e otite média. Existem seis serótipos de H. influenzae, designados de a a f, que são identificados através do seu polissacárido capsular. A H. influenzae de tipo b (Hib) era a causa principal de meningite bacteriana até à introdução de diversas vacinas conjugadas de Hib na década de 1980 (ref. 1). As vacinas baseadas no polissacárido capsular de H. influenzae de tipo b conjugado com o toxóide da difteria (ref. 2), o toxóide do tétano (ref. 3 e Patente U.S. 4496538) ou a proteína da membrana externa de Neisseria meningitidis (ref. 4) foram eficazes na redução da meningite induzida por H. influenzae de tipo b. Os outros serótipos de H. influenzae estão associados a doença invasiva em frequências baixas, embora pareça haver um aumento na incidência de doença causada por estas estirpes à medida que a incidência de doença por Hib diminui (refs. 5, 6). As H. influenzae não encapsuladas ou não tipificáveis (NTHi) são também responsáveis por uma ampla variedade de doenças humanas incluindo otite média, epiglotite, pneumonia e traqueobronquite. A incidência de doença induzida por NTHi não foi afectada pela introdução das vacinas de Hib (ref. 7) . A otite média é a doença mais comum da primeira infância, com 60 a 70% de todas as crianças, com menos de 2 anos de idade, a passar por entre uma e três infecções do ouvido (ref. 8). A otite média crónica é responsável por deficiências 2

ΕΡ 1 140 158 /PT auditivas, da fala e cognitivas nas crianças. As infecções por H. influenzae contribuem para cerca de 30% dos casos de otite média aguda e cerca de 60% de otite média crónica. Só nos Estados Unidos, o tratamento da otite média custa entre 1 e 2 biliões de dólares por ano para antibióticos e procedimentos cirúrgicos, tais como amigdalectomias, adenoidectomias e inserção de tubos de timpanostomia. Estima-se que sejam gastos mais 30 biliões de dólares por ano em terapias adjuntas, tais como terapia da fala e classes de educação especial. Para além disso, muitos dos organismos causadores de otite média estão a tornar-se resistentes ao tratamento antibiótico. É assim desejável uma vacina profiláctica eficaz contra a otite média.

Durante a infecção natural por NTHi, as proteínas da membrana externa expostas à superfície que estimulam uma resposta de anticorpos são alvos potencialmente importantes para anticorpos bactericidas e/ou protectores e consequentemente potenciais candidatos a vacinas. Barenkamp e Bodor (ref. 9) demonstraram que os soros convalescentes de crianças que sofrem de otite média devido a NTHi continham anticorpos para as proteínas de elevado peso molecular (HMW). Cerca de 70 a 75% das estirpes de NTHi expressam as proteínas HMW e a maioria destas estirpes contém dois conjuntos de genes denominados hmwlABC e hmw2ABC (refs. 10, 11). Foi demonstrado que as proteínas HMWA são adesinas que medeiam a ligação às células epiteliais humanas (ref. 12). A imunização com uma mistura de proteínas HMW1A e HMW2A nativas resultou em protecção parcial no modelo de provocação intra-bolha de chinchila de otite média (ref. 13). A Patente U.S. N° 5603938 (Barenkamp), concedida a St. Louis University e Washington University, descreve a clonagem, expressão e sequenciação dos genes que codificam as proteínas HMW1 e HMW2 da estirpe 12 de Haemophilus não tipificável. As proteínas HMW são uma família de proteínas de Haemophilus não tipificável de peso molecular de cerca de 100 a 125 kDa que se verificam em estirpes de Haemophilus não tipificáveis. As proteínas HMW estão ausentes das estirpes encapsuladas de Haemophilus. A produção de proteínas HMW nativas de estirpes de H. influenzae é muito baixa e um método para produzir 3

ΕΡ 1 140 158 /PT proteínas HMW recombinantes (rHMW) protectoras foi descrito em WO 00/20609. Um modelo de colonização nasofaríngica de chinchila foi desenvolvido especificamente para demonstrar a eficácia em vacinas das adesinas (ref. 14) e as proteínas rHMW são protectores neste modelo tal como descrito em WO 00/20609. Foi mostrado que as proteínas rHMWlA e rHMW2A conferem uma protecção equivalente uma à outra e a proteína rHMWlA foi escolhida para mais estudos de vacinas. Neste pedido, rHMW refere-se à proteína HMW1A recombinante da estirpe 12 de NTHi, embora possam ser empregues a proteína HMW1A recombinante correspondente de outras estirpes de NTHi e a proteína rHMW2A correspondente de estirpes de NTHi para a rHMW. As proteínas de ocorrência natural correspondentes podem também ser empregues.

Quando sob stress ambiental, tal como temperatura elevada, os organismos sobre-produzem proteínas de resposta ao stress ou de choque térmico (hsp) . Foi mostrado que as hsp bacterianas são imunogénios importantes, estimulando tanto as células B como as células T (ref. 16) . As proteínas de choque térmico HtrA ou DegP bacterianas são expressas sob condições de stress e foi mostrado que a proteína HtrA de H. influenzae é um antigénio parcialmente protector no modelo de provocação intra-bolha de otite média (ref. 17). As proteínas HtrA são serina-proteases e a sua actividade proteolítica torna-as instáveis. Adicionalmente, como componentes de uma vacina de multicomponentes, a proteína HtrA de tipo selvagem degrada antigénios misturados. A mutagénese dirigida ao local do gene htrA de H. influenzae (denominado hin47) e as propriedades dos mutantes foram inteiramente descritos na Patente U.S. N° 5506139 (Loosmore et al.), concedida ao cessionário desta. Mostrou-se que o análogo de HtrA não proteolítico, H91A Hin47, é um antigénio protector contra bacteremia causada por H. influenzae de tipo b e contra otite média causada por H. influenzae não tipificável (ref. 17) . Tal análogo é aqui utilizado, embora possa ser empregue qualquer outro análogo não proteolítico da proteína Hin47. A HtrA foi verificada em todas as estirpes examinadas, incluindo todas as estirpes encapsuladas de H. influenzae.

Embora o objectivo principal de uma vacina profiláctica contra doença de H. influenzae, incluindo otite média, seja 4

ΕΡ 1 140 158 /PT impedir o estabelecimento da colonização nasofaringica através da inclusão de uma adesina como imunogénio, as proteínas HMW não estão presentes em H. influenzae encapsulada nem em cerca de 25% das estirpes de NTHi. Consequentemente, uma vacina de combinação constituída por pelo menos uma molécula de adesina e um antigénio protector adicional verificado em todas as estirpes de H. influenzae, proporcionará uma melhor cobertura contra doença e uma protecção de largo espectro contra doenças.

Seria desejável proporcionar vacinas de combinação eficazes compreendendo componentes de H. influenzae contendo quantidades relativas seleccionadas de antigénios seleccionados.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento é dirigido à provisão de uma vacina de multicomponentes para proteger contra doença causada por infecção com Haemophilus influenzae, incluindo otite média.

De acordo com um aspecto do presente invento, é proporcionada uma composição imunogénica para conferir protecção num hospedeiro contra doença causada por infecção por Haemophilus influenzae, incluindo otite média, compreendendo pelo menos dois antigénios diferentes de Haemophilus influenzae, pelo menos um dos quais é uma adesina e o outro não é uma adesina. O antigénio que é uma adesina pode ser uma proteína de elevado peso molecular (HMW) de uma estirpe não tipificável de Haemophilus, particularmente uma proteína HMW1 ou HMW2 da estirpe não tipificável, que pode ser produzida de forma recombinante. O antigénio de Haemophilus influenzae que não é uma adesina pode ser uma proteína de choque térmico não proteolítica de uma estirpe de Haemophilus influenzae. A proteína de choque térmico não proteolítica de uma estirpe de Haemophilus influenzae pode ser um análogo da proteína Hin47 de Haemophilus influenzae possuindo uma menor actividade 5

ΕΡ 1 140 158 /PT proteásica que é menos de cerca de 10% da da proteína Hin47 de tipo selvagem.

De acordo com uma concretização preferida deste aspecto do presente invento, é proporcionada uma composição imunogénica para conferir protecção num hospedeiro contra uma doença causada por Haemophilus influenzae, incluindo otite média, que compreende: um análogo da proteína Hin47 de Haemophilus influenzae possuindo uma menor actividade proteásica que é menos de cerca de 10% da da proteína Hin47 de tipo selvaqem, e uma proteína de elevado peso molecular (HMW) de uma estirpe não tipificável de Haemophilus influenzae.

Em tal composição, a proteína HMW pode estar presente numa quantidade que estimule a resposta imunitária no hospedeiro ao análogo da proteína Hin47 enquanto não houver nenhuma interferência entre os componentes em relação às suas imunogenicidades individuais. 0 análogo da proteína Hin47 pode ser um em que pelo menos um aminoácido da proteína Hin47 de tipo selvagem que contribui para a actividade proteásica foi suprimido ou substituído por um aminoácido diferente e que possui substancialmente as mesmas propriedades imunogénicas que a proteína Hin47 de tipo selvagem.

Tal pelo menos um aminoácido pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste nos aminoácidos 91, 121 e 195 a 207 da proteína Hin47 de tipo selvagem. Mutantes específicos que podem ser utilizados incluem serina-197 substituída por alanina, Histidina-91 substituída por alanina, lisina ou arginina e Asp-121 substituída por alanina. A proteína HMW da estirpe não tipificável de Haemophilus influenzae pode ser uma proteína HMW1 ou HMW 2 e pode ser produzida de forma recombinante. As proteínas HMW1 e HMW2 são derivadas das respectivas estirpes de Haemophilus influenzae não tipificáveis e possuem pesos moleculares respectivos tal como expostos na seguinte Tabela I: 6

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TABELA I

Peso Molecular (kDa) Estirpe de Haemophilus influenzae Não Tipificável 12 JoyC K21 LCDC2 PMH1 15 Proteína Madura: HMW1 125 125,9 104, 4 114, 0 102,4 103,5 HMW 2 120 100,9 111,7 103,9 121,9 A composição imunogénica do presente invento pode ainda ser formulada com um adjuvante. Tal adjuvante para utilização no presente invento pode incluir (mas não se limita a) fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, QS21, Quil A, derivados e componentes destes, matriz ISCOM, fosfato de cálcio, hidróxido de cálcio, hidróxido de zinco, um análogo de glicolípidos, um éster octadecílico de um aminoácido, um dipéptido de muramilo, polifosfazeno, ISCOPREP, DC-col, DDBA e uma lipoproteína e outros adjuvantes, incluindo toxinas bacterianas, seus componentes e derivados, tal como descrito, por exemplo, em WO 95/34323. Em determinadas circunstâncias, são desejáveis adjuvantes que induzem uma resposta de Thl. Combinações vantajosas de adjuvantes são descritas em WO 95/34308. O adjuvante pode compreender de preferência fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio (conhecido colectivamente como alúmen).

Os componentes da composição imunogénica podem estar presentes em quantidades apropriadas para proporcionar a resposta imunitária desejada. Os componentes podem ser formulados como uma vacina para administração in vivo ao hospedeiro. A composição de vacina pode conter cerca de 25 a cerca de 100 μg da proteína Hin47 e cerca de 25 a cerca de 100 μg da proteína HMW.

As composições imunogénicas podem ser formuladas com outros componentes antigénicos para proporcionar uma vacina multivalente em que o componente ou os componentes antigénicos adicionais conferem protecção contra doença causada por outro ou outros patogénios. Tais antigénios adicionais devem ser tais e devem estar presentes em quantidades em que a imunogenicidade dos componentes individuais da vacina resultante não seja prejudicada pelos outros componentes individuais da composição. Tais antigénios adicionais são 7 ΕΡ 1 140 158 /PT preferivelmente antigénios purificados em quantidades definidas para produzir uma vacina de componentes.

Tais antigénios adicionais podem ser os verificados tradicionalmente em vacinas protectoras multivalentes, tais como o toxóide da difteria, o toxóide do tétano e antigénios da tosse convulsa, incluindo o toxóide da tosse convulsa, a hemaglutinina filamentosa, a pertactina e/ou aglutinogénios. A vacina multivalente resultante pode também conter poliovirus não virulentos, tais como poliovirus inactivados, que pode ser o poliovirus de tipo 1, tipo 2 e/ou tipo 3. A vacina de multicomponentes pode ainda compreender um conjugado de um toxóide do tétano ou da difteria e um polissacárido capsular de Haemophilus influenzae, de preferência PRP-T. O presente invento estende-se ainda à composição imunogénica do presente invento quando utilizada como vacina. Adicionalmente, o presente invento inclui a utilização de pelo menos dois antigénios diferentes de Haemophilus influenzae, pelo menos um dos quais é uma adesina e o outro não é uma adesina, no fabrico de uma vacina para conferir protecção contra doença causada por infecção com Haemophilus influenzae, incluindo otite média.

As vantagens do presente invento incluem uma vacina de multicomponentes que pode conferir protecção contra doenças por Haemophilus influenzae encapsulado e não encapsulado de um modo seguro e eficaz.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS O presente invento será melhor compreendido a partir da seguinte descrição com referência aos desenhos, nos quais: A Figura 1, possuindo os Painéis A a E, mostra as respostas imunitárias anti-H91A Hin47 para vacinas de combinação H91A Hin47 + rHMW em ratinhos. Painel A, sem rHMW adicionada; Painel B, 0,3 pg de rHMW adicionados; Painel C, 1,0 pg de rHMW adicionados; Painel D, 3,0 pg de rHMW adicionados; Painel E, 10 pg 10 de rHMW adicionados. As setas indicam o momento das imunizações; 8

ΕΡ 1 140 158 /PT A Figura 2 é um gráfico de barras que mostra o efeito sinergistico na resposta imunitária primária a uma dose baixa (0,3 yg) de H91A Hin47 através da adição de rHMW; A Figura 3, possuindo os Painéis A a D, mostra as respostas imunitárias anti-rHMW para vacinas de combinação H91A Hin47 + rHMW em ratinhos. Painel A, sem H91A Hin47 adicionada; Painel B, 0,3 yg de H91A Hin47 adicionados; Painel C, 1,0 yg de H91A Hin47 adicionados; Painel D, 3,0 yg de H91A Hin47 adicionados. As setas indicam o momento das imunizações; A Figura 4 é um gráfico de barras que mostra o efeito sinergistico na resposta imunitária primária em ratinhos a uma dose elevada (10 yg) de rHMW através da adição de H91A Hin47; A Figura 5, possuindo os Painéis A a D, mostra as respostas imunitárias anti-H91A Hin47 para vacinas de combinação H91A Hin47 + rHMW em cobaias. Painel A, sem rHMW adicionada; Painel B, 25 yg de rHMW adicionados; Painel C, 50 yg de rHMW adicionados; Painel D, 100 yg de rHMW adicionados. As setas indicam o momento das imunizações; A Figura 6, possuindo os Painéis A a D, mostra as respostas imunitárias anti-rHMW para vacinas de combinação H91A Hin47 + rHMW em cobaias. Painel A, sem H91A Hin47 adicionada; Painel B, 25 yg 25 de H91A Hin47 adicionados;

Painel C, 50 yg de H91A Hin47 adicionados; Painel D, 100 yg de H91A Hin47 adicionados. As setas indicam o momento das imunizações; A Figura 7 mostra a protecção da vacina de combinação H91A Hin47 + rHMW no modelo de chinchila de otite média; A Figura 8 mostra a protecção da vacina de combinação H91A Hin47 + rHMW no modelo de chinchila de colonização nasofaríngica; A Figura 9, possuindo os Painéis A e B, é análises de SDS-PAGE que mostram o perfil de estabilidade da vacina de combinação H91A Hin47 + rHMW no dia 0 (Painel A) e 14 (Painel B) em comparação com os componentes individuais; 9

ΕΡ 1 140 158 /PT A Figura 10A é um gráfico de barras da resposta imunitária a H91A e rHMW na presença e na ausência de Pentacel®; A Figura 10B, possuindo os painéis A e B, contém um gráfico de barras da resposta imunitária ao toxóide da tosse convulsa (PT), à hemaglutinina filamentosa (FHA), à pertactina (69 kDa) , a aglutinogénios fimbriais (Painel A), ao toxóide do tétano (TT) , ao toxóide da difteria (DT), a polio de tipo 1, polio de tipo 2 e PRP-T (Painel B) em Pentacel® quando o Pentacel® é administrado sozinho ou com a vacina de H. influenzae de dois componentes H91A + rHMW; A Figura 11 mostra um esquema de construção para a preparação do plasmídeo DS-2150-1 contendo o gene hin47 mutante em H91A sob o controlo de um promotor de T7; e A Figura 12 mostra um esquema de construção para a preparação do plasmídeo BK-76-1-1 contendo o gene hmwlABC sob o controlo do promotor de T7.

DESCRIÇÃO GERAL DO INVENTO A colonização da nasofaringe é o primeiro passo no desenvolvimento de doença para muitos patogénios bacterianos ou virais, incluindo Haemophilus influenzae, e vacinas contendo moléculas de adesina devem proteger contra este primeiro passo na progressão da doença. Mostrou-se que as proteínas de elevado peso molecular (HMW), verificadas em aproximadamente 75% de H. influenzae não tipificável, eram adesinas que são protectoras contra a colonização quando administradas numa composição de vacina. As proteínas HMW não estão presentes em estirpes de H. influenzae encapsuladas nem em cerca de 25% das estirpes de H. influenzae não tipificáveis e não são assim suficientes sozinhas para uma vacina possuindo capacidade de protecção de muitas estirpes. A proteína HtrA ou Hin47 verifica-se em todas as estirpes encapsuladas e não tipificáveis de H. influenzae. Hin47 é protectora contra bacteremia causada por H. influenzae de tipo b e otite média causada por H. influenzae não tipificável, mas não impede por si própria a colonização. Hin47 é proteolítica 10 ΕΡ 1 140 158 /PT e não pode ser ela própria utilizada em formulações proteicas. Uma vacina de combinação compreendendo HMW e antigénios de Hin47 não proteoliticos pode ser formulada para proteger contra doença significativa de H. influenzae, incluindo otite média. O presente invento proporciona tal vacina de combinação. A Patente U.S. N° 5506139 (Loosmore et al.) descreve a preparação de análogos da proteina Hin47 de Haemophilus influenzae que possuem uma menor actividade proteásica que é menos que cerca de 10% da da proteina Hin47 natural e que tem de preferência substancialmente as mesmas propriedades imunogénicas que a proteina Hin47 natural. A patente descreve também o isolamento, a purificação e a caracterização de moléculas de ácido nucleico codificando os análogos de Hin47. A proteina Hin47 natural é conservada imunologicamente entre os isolados não tipificáveis e de tipo b de H. influenzae. A sequência de aminoácidos da proteina Hin47 natural e a sequência nucleotidica do gene hin47 que a codifica são descritas em WO 94/00149 publicada a 6 de Janeiro de 1994.

Os análogos de Hin47 da Patente U.S. N° 5506139 são preparados suprimindo, ou substituindo por um aminoácido diferente, pelo menos um aminoácido da Hin47 natural que contribui para a actividade proteásica ou inserindo pelo menos um aminoácido na proteina Hin47 natural, tal como aqui descrito especificamente. Pelo menos um aminoácido suprimido ou substituído pode ser seleccionado de entre os aminoácidos 195 a 201 de Hin47 e pode ser especificamente Serina-197, que pode ser suprimido ou substituído por alanina. Adicionalmente, pelo menos um aminoácido suprimido ou substituído pode ser His-91 e pode ser suprimido ou substituído por alanina, lisina ou arginina. Para além disso pelo menos um aminoácido suprimido ou substituído pode ser Asp-121 e pode ser suprimido ou substituído por alanina.

Na Patente dos Estados Unidos N° 5869302, concedida ao cessionário desta, estão descritas múltiplas mutações efectuadas em diferentes aminoácidos da proteína Hin47 natural para proporcionar o análogo de Hin47 não proteolítico. 11

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No presente invento, a mutação da histidina 91 para alanina (por vezes aqui denominada "H91A") é empregue como ilustração da proteína Hin47 mutante, embora possam ser utilizados outros mutantes de Hin47 com actividade proteásica reduzida tal como descrito na patente e no pedido acima mencionados. A preparação da proteína HMW recombinante (rHMW) é descrita no WO 00/20609 acima mencionado. A composição de vacinas de multicomponentes é crítica. Os componentes da vacina devem ser compatíveis e devem ser combinados em razões apropriadas para evitar interferência antigénica e optimizar todas as sinergias possíveis. Se administrada com outras vacinas estabelecidas, estas não devem interferir com a protecção conferida pela vacina contra outra(s) doença(s).

Em experimentação específica aqui efectuada, várias razões de antigénio foram comparadas para uma vacina de dois componentes H91A Hin47 + rHMW, em duas espécies animais. Foi observada interferência antigénica para quantidades crescentes de H91A Hin47 quando combinadas com uma dose baixa de rHMW, no entanto este efeito desapareceu a doses mais elevadas de rHMW. Houve um efeito sinergístico observado para quantidades crescentes de rHMW na resposta primária de anticorpos a uma dose baixa de H91A Hin47 e H91A Hin47 melhorou a resposta primária a rHMW, se a rHMW não estivesse presente em doses baixas. Estas descobertas são surpreendentes por um único antigénio (H91A Hin47) poder ter um efeito supressor e um efeito estimulador noutro antigénio (rHMW) dependendo da dose de rHMW presente. Foi também surpreendente que rHMW tivesse estimulado a resposta vigorosa de anticorpos a H91A Hin47, uma vez que é um imunogénio mais fraco.

Em relação à Fig. 1, é ilustrada a resposta imunitária em ratinhos, ao antigénio H91A Hin47 de uma vacina de dois componentes H91A Hin47 + rHMW. São alcançados títulos elevados de anticorpos com todas as combinações de vacina na sangria final, mas para a resposta primária a uma dose baixa de H91A Hin47, parece haver uma diferença entre amostras com ou sem rHMW. Em relação à Fig. 2, é ilustrada a análise estatística 12

ΕΡ 1 140 158 /PT do efeito sinergístico observado na resposta imunitária primária a H91A Hin47, quando são adicionadas quantidades crescentes de rHMW a una dose de 0,3 yg de H91A Hin47.

Em relação à Fig. 3, é ilustrada a resposta imunitária em ratinhos, ao antigénio rHMW da vacina de dois componentes H91A Hin47 + rHMW. São alcançados títulos elevados de anticorpos na sangria final com todas as combinações de vacina excepto as que contêm a dose mais baixa de rHMW. Há uma diminuição dramática na resposta de anticorpos anti-HMW quando a dose de 0,3 yg de rHMW é combinada com quantidades crescentes de H91A Hin47. Parece haver uma diferença na resposta primária de anticorpos quando a dose mais elevada de rHMW é combinada com quantidades crescentes de H91A Hin47. Em relação à Fig. 4, é ilustrada a análise estatística do efeito sinergístico na resposta imunitária primária a uma dose de 10 yg de rHMW combinada com quantidades crescentes de H91A Hin47.

Em relação à Fig. 5, é ilustrada a resposta imunitária em cobaias ao componente H91A Hin47 de vacinas de combinação H91A Hin47 + rHMW. Não há nenhuma diferença estatística na resposta anti-H91A Hin47 a qualquer uma das vacinas. Em relação à Fig. 6, é ilustrada a resposta imunitária em cobaias ao componente rHMW de vacinas de combinação H91A Hin47 + rHMW. Não há nenhuma diferença estatística na resposta anti-HMW a qualquer uma das vacinas.

Em relação à Fig. 7, é ilustrada a protecção conferida por uma vacina de combinação H91A Hin47 + rHMW no modelo de provocação intra-bolha de otite média, comparada com a protecção conferida pelo componente H91A Hin47 sozinho. Ambas as vacinas são parcialmente protectoras. Em relação à Fig. 8, é ilustrada a protecção conferida por uma vacina de combinação H91A Hin47 + rHMW no modelo de colonização nasofaríngica, comparada com a protecção pelo componente rHMW sozinho. Ambas as vacinas são altamente protectoras.

Em relação à Fig. 9, é ilustrado o perfil de estabilidade de uma vacina H91A Hin47 + rHMW nos dias 0 e 14. Os dois antigénios permanecem adsorvidos no alúmen no último ponto temporal e não são degradados. 13

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Em relação às Figs. 10A e 10B, é ilustrada a resposta imunitária em cobaias, aos antigénios H91A Hin47 e rHMW da vacina de dois componentes de H. influenzae dada sozinha ou co-administrada com Pentacel® (toxóide da difteria + toxóide do tétano + polio de tipo 1 + polio de tipo 2 + polio de tipo 3 + PRP-T + vacina acelular da tosse convulsa constituída por toxóide da tosse convulsa + hemaglutinina filamentosa + 69 kDa/pertactina + aglutinogénios fimbriais). É também ilustrada a resposta imunitária aos antigénios de Pentacel® dados sozinhos ou co-administrados com a vacina de dois componentes de H. influenzae. Não há nenhum efeito sinergístico ou supressor significativo das vacinas de multicomponentes co-administradas.

As formulações de Pentacel® são descritas em WO 98/00167, concedida ao cessionário desta.

Depósitos Biológicos

Certos vectores que contêm ácido nucleico codificando para uma proteína de elevado peso molecular de uma estirpe não tipificável de Haemophilus que são aqui descritos e referidos foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC) situada em 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, EUA, de acordo com o Tratado de Budapeste e antes da apresentação deste pedido. As amostras dos vectores depositados tornar-se-ão disponíveis ao público e todas as limitações impostas ou o acesso aos depósitos serão recebidos após a concessão de uma patente baseada neste pedido de patente dos Estados Unidos. Adicionalmente, o depósito será substituído se não puderem ser dispensadas amostras viáveis pelo Depositário.

Sumário do Depósito

Data do Depósito

Plasmídeo ATCC BK-76-1-1 203261 25 de Setembro de 1998 14

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EXEMPLOS A divulgação acima descreve geralmente o presente invento. Uma compreensão mais completa pode ser obtida através de referência aos seguintes Exemplos específicos.

Os métodos de genética molecular, bioquímica de proteínas, imunologia e tecnologia de fermentação utilizados, mas não explicitamente descritos nesta divulgação e nestes Exemplos, estão amplamente relatados na literatura científica e estão bem dentro das capacidades dos peritos na arte.

Exemplo 1

Este exemplo descreve a preparação do componente de vacina H91A Hin47. O mutante H91A Hin47 foi preparado tal como descrito na Patente U.S. N° 5506139. Resumidamente, foi sintetizado um oligonucleótido 5' ATCAATAACAGCATTATTGGT 3' (SEQ ID NO: 1) que mudaria o resíduo de Histidina na posição 91 na proteína Hin47 para uma Alanina (ref. 17). O plasmídeo JB-1276-1-2 é um plasmídeo baseado em pUC contendo o gene de T7/hin47 num fragmento EcoRI e foi utilizado para clonar o gene hin47 em M13mpl8 para mutagénese dirigida ao local com o estojo In Vitro Site-Directed Mutagenesis de Amersham. A preparação do plasmídeo JB-1276-1-2 está descrita em USP 5506139. A mutação do codão His91 para Ala91 foi confirmada através de sequenciação local. O gene hin47 mutante em H91A foi subclonado em pT7-7 para gerar o plasmídeo DS-1277-19 (Fig. 11). O plasmídeo de expressão de H91A Hin47 (DS-1277-19) utiliza selecção de ampicilina. O gene de T7/H91A hln47 foi clonado em pBR328 de modo a que pudesse ser utilizada selecção de tetraciclina. O vector DS-1312-12 era assim um plasmídeo baseado em pBR328 que continha as sequências do gene de T7/H91A hin47 entre os locais EcoRI e Ciai, possuindo genes funcionais de resistência a ampicilina e tetraciclina e contendo uma repetição das sequências HindIII-BamRI que se verificam tanto em pBR328 como em pEVvrfl. 15

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Foi construído um novo plasmídeo baseado em DS-1312-12 que utiliza selecção de canamicina. O esquema de construção é mostrado na Figura 11. O ADN plasmídico de DS-1312-12 foi digerido com o HindiII gerando dois fragmentos. O fragmento maior de 5,9 kb continha um gene tetR sem promotor, o gene ampR e o gene de T7/H91A hin47 e foi religado nele próprio criando o vector DS-2140-3. O plasmídeo DS-2140-3 foi digerido com PstI e o gene kanR do plasmídeo pUC-4K (P-L Biochemicals) foi inserido no local PstI, gerando o plasmídeo DS-2150-1 que é kanR e sensível tanto a ampicilina como a tetraciclina. O ADN plasmídico de DS-2150-1 foi preparado a partir de uma cultura de 50 ml utilizando um protocolo baseado no procedimento de Holmes e Quigley (ref. 18) e incluindo extracções com fenol e clorofórmio. Células de E. coli BL21(DE3) foram tornadas electrocompetentes como se segue. Resumidamente, foram inoculados 10 ml de cultura de um dia para o outro em 500 ml de meio YT e as células foram criadas a 37°C com agitação até alcançarem uma A62o=0,540. A cultura foi arrefecida em gelo durante 30 min., centrifugada a 5000 rpm durante 15 min., e o sedimento celular ressuspenso em 500 ml de água estéril gelada. A suspensão celular foi centrifugada como anteriormente e o sedimento celular ressuspenso em 250 ml de água estéril gelada. A suspensão celular foi centrifugada novamente, e as células foram ressuspensas em 10 ml de glicerol a 10%. A suspensão de glicerol foi centrifugada e as células foram ressuspensas em 1,5 ml de glicerol a 10%, divididas em alíquotas como amostras de 40 μΐ e armazenadas a -70 °C.

Uma alíquota de células BL21(DE3) electrocompetentes foi descongelada em gelo e foram adicionados aproximadamente 9 ng de ADN de DS-2150-1. As amostras foram incubadas em gelo durante 3 min., depois transferidas para uma cuvete de eléctrodo do Gene Pulser de BioRad de -20°C e sujeitas a um pulso eléctrico. Foram adicionados 900 μΐ de meio SOC e a mistura foi transferida para um tubo de cultura onde foi incubada a 37°C durante 1 hora antes de ser plaqueada em YT-ágar contendo 25 pg/mL de canamicina. A placa foi incubada de um dia para o outro a 37°C e foram utilizadas colónias individuais para estudos de expressão. 16

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Os clones individuais foram criados em meio NZCYM até uma A60o nm de aproximadamente 0,3 e foi adicionada lactose a 1% para induzir a expressão. As células foram criadas durante 4 horas, depois colhidas e analisadas através de SDS-PAGE. O clone DS-2171-1-1 foi escolhido como clone representativo que expressava níveis elevados de H91A Hin47. A E. coli contendo DS-2171-1-1 foi criada em 2 balões de 2 1 contendo 250 ml de ECGM (contendo 8 g/1 de glicose, pH 6,5) e incubada agitando a 37°C durante aproximadamente 9 horas no escuro a 250 rpm. O líquido da cultura (2 x 250 ml) foi inoculado num fermentador de 10 litros e a cultura criada a 37°C. Após aproximadamente 10 horas de incubação, é adicionada lactose a 1% (concentração final) para indução, seguida de uma incubação adicional de 4 horas. 0 líquido da cultura foi colhido para frascos de transferência estéreis e concentrado e diafiltrado através de filtração de fluxo cruzado contra tampão Tris/HCl 50 mM, pH 8,0. As células no concentrado são lisadas utilizando um homogeneizador de alta pressão (2 passagens a 15000 psi) para libertar a proteína H91A Hin47. Os restos celulares foram removidos através de centrifugação a 15000 rpm durante 1,5 horas. O sobrenadante foi ainda clarificado através de centrifugação e filtrado através de um filtro sem saída de 0,22 pm. Os produtos podem ser armazenados congelados a -70°C até mais processamento.

Foi adicionado cloreto de sódio (NaCl) à amostra clarificada até uma concentração final de 100 mM. A amostra foi então purificada numa coluna de cromatografia de permuta aniónica (TMAE-Fractogel) equilibrada com Tris 50 mM pH 8,0 contendo NaCl 100 mM. A proteína H91A Hin47 foi obtida na passagem. A camada aquosa foi carregada numa coluna cerâmica de hidroxiapatite de tipo 1 (CHTP-1) equilibrada com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 8,0. A coluna foi então lavada com tampão fosfato de sódio 150 mM, pH 8,0 e H91A Hin47 foi eluída com tampão fosfato de sódio 175 mM, pH 8,0 contendo NaCl 1 M. 17

ΕΡ 1 140 158 /PT A proteína H91A Hin47 purificada foi concentrada utilizando uma membrana de separação de peso molecular de 10 kDa seguida de diafiltração com aproximadamente 10 volumes de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,5. A proteína H91A Hin47 purificada em PBS foi passada através de uma membrana adsorvente Sartobind Q600. Após a passagem da solução, a membrana foi regenerada utilizando KC1 1,0 M/NaOH 1,0 M seguido de lavagem com KC1 1 M e depois equilibrada com PBS. O processo foi repetido duas vezes. A proteína H91A Hin47 diafiltrada concentrada foi esterilizada por filtração através de um filtro de membrana de 0,22 pm. A proteína H91A Hin47 estéril foi adjuvada com fosfato de alumínio. O concentrado purificado adsorvido foi diluído para produzir o produto bruto adsorvido a 100 pg/mL.

Exemplo 2

Este Exemplo descreve a preparação do componente de vacina rHMW. A produção e purificação da proteína HMW foram descritas no Pedido de Patente dos Estados Unidos co-pendente N° 09/167568 apresentado a 7 de Outubro de 1998.

Resumidamente, o plasmídeo pHMWl-15 (ref. 10) contém um local Xbal dentro da sequência do promotor de T7 e um local BamHl único dentro da sequência de codificação da proteína HMW1A madura da estirpe 12 não tipificável de Haemophilus. O fragmento Xbal-BamRI de 1,8 kb de pHMWl-15 foi suprimido e substituído por um fragmento Xbal-BamRl de aproximadamente 114 pb gerado a partir de oligonucleótidos. O plasmídeo resultante de 11,3 kb, DS-1046-1-1, contém assim o promotor de T7 unido enquadrado com o operão hmwlABC que codifica a proteína HMW1A madura de 125 kDa (Fig. 11)·

O plasmídeo DS-1046-1-1 contém a cassete génica de T7 hmwlABC e possui um local Bglll único fora da região de codificação do gene da HMW1A madura. O plasmídeo DS-2224-1-4 contém o gene cer de E. coli situado num fragmento BamEl. Este fragmento foi isolado e ligado no local Bglll do plasmídeo DS-1046-1-1 para produzir o plasmídeo BK-35-4 (Fig. 11) . A 18 ΕΡ 1 140 158 /PT cassete de resistência à canamicina foi excisada de pUC 4K através de restrição com SalI e ligada no plasmideo BK-35-4 restringido com SalI para produzir o plasmideo BK-76-1-1.

Os plasmideos foram introduzidos em células de E. coli BL21(DE3) através de electroporação utilizando um aparelho BioRad. As estirpes foram criadas a 37°C em meio NZCYM até uma densidade óptica de A578=0,3, depois induzidas através da adição de lactose a 1,0% durante 4 horas. As amostras foram ajustadas a uma DO de 0,2/μ1 com tampão de lise de SDS-PAGE + carregamento e foi carregada a mesma quantidade de amostra de proteína em géis de SDS-PAGE. A proteína HMW recombinante foi expressa como corpos de inclusão em E. coli, e foi purificada através do mesmo procedimento (Fig. 12). Os sedimentos celulares de E. coli de uma cultura de 500 ml foram ressuspensos em 50 ml de Tris-HCl 5 0 mM, pH 8,0, contendo NaCl 0,1 M e rompidos através de ultra-sons. O extracto foi centrifugado a 20000 g durante 30 min. e o sobrenadante resultante foi descartado. O sedimento foi novamente extraído em 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 contendo Triton X-100 a 0,5% e EDTA 10 mM, depois centrifugado a 20000 g durante 30 min. e o sobrenadante foi descartado. O sedimento foi extraído novamente em 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, contendo oct ilglucósido a 1%, centrifugado depois a 20000 g durante 30 min. e o sobrenadante foi descartado. O sedimento resultante, obtido após as extracções de cima, contém os corpos de inclusão. O sedimento foi solubilizado em 6 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, contendo guanidina 6 M e DTT 5 mM. Foram adicionados a esta solução 12 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 e a mistura foi centrifugada a 20000 g durante 30 min. O sobrenadante foi precipitado com polietilenoglicol (PEG) 4000 a uma concentração final de 7%. O sedimento resultante foi removido através de centrifugação a 20000 g durante 30 min. e o sobrenadante foi precipitado através de (NH4)2S04 a 50% de saturação. Após a adição de (NH4)2S04 a solução foi submetida a separação de fases com a proteína a ir para a fase superior, que foi então sujeita a centrifugação a 20000 g durante 30 min. O sedimento resultante foi dissolvido em 2 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, contendo 19 ΕΡ 1 140 158 /PT guanidina-HCl 6 M e DTT 5 mM e a solução transparente foi purificada numa coluna de filtração em gel Superdex 200 equilibrada em Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, contendo guanidina-HCl 2 M. As fracções foram analisadas através de SDS-PAGE e as que continham a rHMWl purificada foram reunidas e dialisadas de um dia para o outro a 4°C contra PBS, depois centrifugadas a 20000 g durante 30 min. A proteína permaneceu solúvel sob estas condições e foi adicionado à preparação de rHMWl glicerol a uma concentração final de 20% para armazenamento a -20 °C. A concentração do componente de vacina rHMW foi ajustada a 400 pg ml-1 em PBS (pH 7.3) e foi adjuvada com fosfato de alumínio até uma concentração final de 3 mg ml-1. Foram preparadas diferentes doses através da diluição da reserva com 3 mg ml-1 de fosfato de alumínio em PBS.

Exemplo 3

Este exemplo descreve a combinação de H91A Hin47 e rHMW como uma vacina de dois componentes.

Foram preparadas vacinas que compreenderam combinações de H91A Hin47 e rHMW tal como expostas na seguinte Tabela II:

TABELA II pg rHMW-> pg H91Ai 0 0,3 O \—1 3,0 10 25 50 100 0 r r r r c c c 0,3 r r r r r 1,0 r r r r r 3, 0 r r r r r 25 c c c c 50 c c c c 100 c c c c

Notas: r indica que a vacina foi utilizada para imunizar ratinhos. c indica que a vacina foi utilizada para imunizar cobaias.

Os componentes da vacina foram combinados no dia 0, misturados de um dia para o outro a 4°C e divididos em alíquotas no dia 1. As vacinas combinadas foram armazenadas a 4°C durante todo o período de imunização. 20

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Exemplo 4

Este exemplo descreve a análise da imunogenicidade das vacinas de multicomponentes em animais.

Grupos de cinco ratinhos BALB/c (Charles River, Quebec) foram imunizados subcutaneamente (s.c.) nos dias 1, 29 e 43 com uma das vacinas de ratinho descritas no Exemplo 3. Foram tomadas amostras de sangue nos dias 0, 14, 28, 42 e 56.

Grupos de 5 cobaias Hartley cruzadas (Charles River, Quebec) foram imunizados intramuscularmente (i.m.) nos dias 1, 29 e 43 com uma das vacinas de cobaia descritas no Exemplo 3. Foram tomadas amostras de sangue nos dias 0, 14, 28, 42, e 56.

Os títulos de anticorpos IgG anti-H91A Hin47 e anti-rHMW foram determinados através de imunoensaios enzimáticos (ELISA) específicos do antigénio. Poços de microtítulo (NuncMAXISORB, Nunc, Dinamarca) foram revestidos com 50 μΐ de solução de proteína (0,4 pg ml-1 para H91A Hin47 ou 0,4 pg ml-1 para rHMW) . Os anticorpos secundários utilizados foram fragmentos F(ab')2 purificados por afinidade, de cabra, anti-IgG de ratinho (específicos do Fc) ou anticorpos anti-IgG de cobaia (específicos do Fc) conjugados com peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch Labs, Mississauga, Ontário). As reacções foram reveladas utilizando tetrametilbenzidina (TMB/H2O2, ADI, Mississauga, Ontário) e as absorvâncias foram medidas a 450 nm (utilizando 540 nm como comprimento de onda de referência) num leitor de microplacas Flow Multiskan MCC (ICN Biomedicals, Mississauga, Ontário). O título reactivo de um anti-soro foi definido como o recíproco da diluição que mostra consistentemente um aumento de duas vezes na absorvância sobre a obtida com a amostra de soro pré-sangria.

Os resultados dos estudos de imunogenicidade são ilustrados nas Figuras 1 a 6. Tal como mostrado na Figura 1, os soros da sangria final obtidos de ratinhos imunizados com 0,3, 1,0 ou 3,0 pg de H91A Hin47 tiveram todos títulos de anticorpo elevados para H91A Hin47, independentemente da quantidade de rHMW presente (de 0 a 10 pg). No entanto, há uma diferença estatisticamente significativa nas respostas primárias anti-H91A Hin47. Tal como mostrado na Figura 2, há 21

ΕΡ 1 140 158 /PT uma maior resposta primária a H91A Hin47 na presença de quantidades crescentes de rHMW. Estas descobertas são surpreendentes e indicam que a rHMW está a exibir um efeito sinergistico na resposta imunitária primária a H91A Hin47.

Tal como mostrado na Figura 3, os soros da sangria final obtidos de ratinhos imunizados com 1, 3 ou 10 pg de rHMW tiveram todos um titulo de anticorpo elevado para rHMW, independentemente da quantidade de H91A Hin47 presente (0 a 3 pg) . No entanto, na dose mais baixa de rHMW (0,3 pg), há uma inibição estatisticamente significativa da resposta imunitária a rHMW com quantidades crescentes de H91A Hin47 adicionadas. Esta descoberta é surpreendente e sugere que H91A Hin47 actua como um supressor imunitário para doses baixas de rHMW. Pelo contrário, na dose mais elevada de rHMW (10 pg) a adição de H91A Hin47 aumenta significativamente a resposta imunitária a rHMW (Fig. 4) . Estas descobertas em ratinhos, indicam que as quantidades relativas dos dois componentes, H91A Hin47 e rHMW, são criticas para se obter uma boa resposta imunitária a ambos os antigénios.

Dos dados aqui apresentados, pareceria que cerca de 3 a cerca de 10 pg de rHMW, de preferência cerca de 10 pg, mostram o efeito aumentado com cerca de 1 a cerca de 3 pg de H91A Hin4 7. A Figura 5 mostra os títulos de anticorpo anti-H91A Hin47 obtidos em cobaias. A adição de rHMW não teve qualquer efeito nos títulos do anticorpo anti-H91A Hin47. Semelhantemente, a adição de H91A Hin47 não teve qualquer efeito nos títulos do anticorpo anti-rHMW em cobaias (Fig. 6).

Exemplo 5

Este exemplo descreve a capacidade protectora de uma vacina de multicomponentes em modelos animais de doença. H91A Hin47 é parcialmente protectora no modelo de chinchila de otite média, tal como descrito na Patente U.S. N° 5506139 acima mencionada. Neste modelo, chinchilas com 1 a 2 anos de idade (Moulton Chinchilla Ranch, Rochester, Minnesota) são imunizadas i.m. nos dias 0, 14 e 28 com 30 pg 22 ΕΡ 1 140 158 /PT de H91A Hin47 adsorvida a alúmen, e provocadas no dia 44 com o 50 a 350 cfu de organismos vivos distribuídos no espaço do ouvido médio através da bolha epitimpânica (ref. 11). Os animais são monitorizados através de timpanometria e fluído do ouvido médio é recolhido 4 dias após a provocação, misturado com 200 μΐ de meio BHI e são plaqueadas diluições sobre placas de chocolate-ágar que são incubadas durante 24 h a 37°C. Os animais convalescentes ou os que foram falsamente imunizados apenas com alúmen, são utilizados como controlos. Para o estudo da vacina de multicomponentes, foram misturados 50 pg de H91A Hin47 com 50 pg de rHMW tal como descrito no Exemplo 3 e foram imunizadas chinchilas tal como descrito. Os resultados do estudo de protecção são mostrados na Figura 7 que indica que existe ainda uma protecção parcial conferida no modelo de provocação intra-bolha através da combinação de H91A Hin47 -rHMW.

Em chinchilas jovens, demonstrou-se que a colonização nasofaríngica com H. influenzae não tipificável conduz a otite média (ref. 14). rHMW é parcialmente protectora num modelo de provocação de colonização nasofaríngica de chinchila, tal como descrito no WO 00/20609 acima mencionado. Neste modelo, os animais são imunizados i.m. nos dias 0, 14 e 28 com 25, 50 ou 100 pg de rHMW adsorvidos a alúmen e provocados no dia 44 com 108 cfu de bactérias vivas distribuídas intranasalmente (50 pl por narina). É efectuada lavagem nasofaríngica 4 dias após a provocação utilizando 1 ml de solução salina estéril como líquido de lavagem. São plaqueados 25 pl da lavagem sobre chocolate-ágar na presença de estreptomicina e as placas são incubadas a 37°C durante 24 h (a estirpe de provocação foi tornada resistente a estreptomicina através de passagens em série, para facilitar a quantificação das bactérias recuperadas na presença da flora natural que são mortas pela estreptomicina). Os animais convalescentes ou falsamente imunizados apenas com alúmen, são utilizados como controlos. Para o estudo da vacina de multicomponentes, foram misturados 50 pg de rHMW com 50 pg de H91A Hin47 tal como descrito no Exemplo 3 e foram imunizadas chinchilas tal como descrito. Os resultados do estudo de protecção são mostrados na Figura 8 que indica que existe ainda uma excelente protecção conferida 23 ΕΡ 1 140 158 /PT no modelo de provocação da colonização nasofaríngica pela combinação de H91A Hin47 + rHMW.

Exemplo 6

Este exemplo descreve a análise da estabilidade da vacina de dois componentes. A H91A Hin47 (400 pg de proteína + 3 mg de fosfato de alumínio por ml) e a rHMW (400 pg de proteína + 3 mg de fosfato de alumínio por ml) adsorvidas foram misturadas 1:1 a uma concentração final de 100 pg de cada proteína + 3 mg de fosfato de alumínio por ml tal como descrito no Exemplo 3. As proteínas H91A Hin47 e rHMW individualmente adsorvidas foram também ajustadas a uma concentração final de 100 pg de proteína + 3 mg de fosfato de alumínio/ml. As amostras foram armazenadas a 4°C e foram tomadas alíquotas de 0,5 ml no dia 0 e cada duas semanas para análise através de SDS-PAGE. As alíquotas foram microcentrifugadas a 10000 rpm durante 10 min para separar o sobrenadante do sedimento de alúmen. O sedimento foi dissolvido em tampão de amostra de SDS-PAGE e o sobrenadante foi primeiro precipitado com acetona, depois dissolvido em tampão de amostra de SDS-PAGE. Foram analisadas quantidades equivalentes de sobrenadante e de sedimento assumindo que a proteína estava 100% adsorvida ou não adsorvida. Os resultados do estudo de estabilidade são mostrados na Fig. 9 que indica que após duas semanas não há qualquer degradação das proteínas e ambas estão ainda inteiramente adsorvidas ao alúmen.

Exemplo 7

Este exemplo ilustra a resposta imunitária à co-administração da vacina de dois componentes de H. influenzae com Pentacel®.

Grupos de 5 cobaias Hartley (Charles River, Quebec) foram imunizados i.m. nos dias 1 e 21 com uma de vacina de dois componentes H91A Hin47 + rHMW, vacina Pentacel (uma vacina comercial de Connaught Laboratories Limited contendo PT + FHA + 69 kDa + Ag a pesos de 20:20:5:3 pg; toxóide da difteria a 15 Lf; toxóide do tétano a 5 Lf; IPV contendo poliovírus 24

ΕΡ 1 140 158 /PT inactivados de tipos 1, 2 e 3 a 40, 8 e 32 unidades de antigénio D, respectivamente; 10 pg de conjugado PRP-T de polissacárido de H. influenzae de tipo B conjugado com toxóide do tétano a 20 pg) ou vacina de dois componentes H91A Hin47 + rHMW + Pentacel. A vacina de dois componentes continha 50 pg de cada um de H91A Hin47 e rHMW. Os animais que receberam as vacinas de dois componentes + Pentacel tiveram uma injecção em ambos os flancos. Amostras de sangue foram tomadas no dia 1, antes da injecção e depois no dia 28.

Os títulos dos anticorpos IgG anti-H91A Hin47 e anti-rHMW foram determinados através de ELISA tal como descrito no Exemplo 4. Os títulos de anticorpos IgG anti-componentes de Pentacel foram determinados através de ELISA, essencialmente tal como descrito no Exemplo 4. Placas de microtítulo foram revestidas com 5 pg ml-1 de antigénio para PT, FHA 69 kDa, Agg e PRP; diluição 1/20 de 2,5 Lf ml-1 para o toxóide da difteria; 1,3 Lf ml-1 para o toxóide do tétano; diluição 1/50 de 25,6 EU ml-1 para polio de tipo 1; ou diluição 1/50 de 15,1 EU ml-1 para polio de tipo 2. Não pôde ser estabelecida uma razão sinal/ruído para o polio de tipo 3. O anticorpo secundário utilizado foram fragmentos F(ab)'2 de burro anti-IgG de cobaia (H+L) conjugados com peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch Labs). Os controlos negativos foram soros pré-sangria ou anti-soro para um antigénio irrelevante de RSV. Os resultados são observados nas Figuras 10A e 10B.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

Em resumo desta divulgação, o presente invento proporciona uma vacina de multicomponentes contra Haemophilus influenzae possuindo um largo espectro de eficácia e compreendendo dois antigénios diferentes de Haemophilus influenzae, um desses antigénios é uma adesina e o outro antigénio não é uma adesina.

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ΕΡ 1 140 158 /PT 2. Berkowitζ et al., J. Pediatr. 110: 509, 1987. 3. Claesson et al., J. Pediatr. 114: 97, 1989. 4. Black, S.B., H.R. Shinefield, B. Fireman, R. Iliatt, M.

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St. Geme III, J.W., V.V. Kumar, D. Cutter e S.J. Barenkamp, "Prevalence and distribution of the hmw and 11. 26

ΕΡ 1 140 158 /PT hia genes and the HMW and Hia adesines among genetically diverse strains of non-typeable Haemophilus influenzae", Infect. Immun. 66: 364-368, 1998. 12. St. Geme III, J.W., S. Falkow e S.J. Barenkamp, "High-molecular-weight proteins of non-typeable Haemophilus influenzae mediate attachment to human epithelial cells", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2875-2879, 1993. 13. Barenkamp, S.J., "Immunization with high-molecular-weight adhesion proteins of non-typeable Haemophilus influenzae modifies experimental otitis media in chinchillas", Infect. Immun. 64: 1246-1251, 1996. 14. Yang, Y.P., S.M. Loosmore, B. Underdown e M.H. Klein, "Nasopharyngeal colonization with non-typeable H. influenzae, in chinchillas", Infect. Immun. 66: 1973-1980, 1998. 15. Young e Davis, Gene 38: 31 a 38, 1985. 16. Retzlaff, C., Y. Yamamoto, P.S. Hoffman, H. Friedman e T.W. Klein, "Bacterial heat shock proteins directly induce cytokine MRNA and interleukin-1 secretion in macrophage cultures", Infect. Immun. 62: 5689-5693, 1994. 17. Loosmore, S.M., Y-P. Yang, R. Oomen, J.M. Shortreed, D.C. Coleman e M.H. Klein, "The Haemophilus influenzae HtrA protein is a protective antigen", Infect. Immun. 66: 899— 906, 1998. 18. Holmes, D.S. e Quigley, Μ., "A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids", Anal. Biochem. 114: 193-197, 1981.

Lisboa

Claims (16)

1. ΕΡ 1 140 158 /PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica para conferir protecção num hospedeiro contra doença causada por Haemophilus influenzae, compreendendo: pelo menos dois antigénios diferentes de Haemophilus influenzae, em que pelo menos destes antigénios é uma adesina e o outro desses antigénios não é uma adesina.
2. 2. Composição tal como reivindicado na Reivindicação 1, em que referido antigénio que é uma adesina, é uma proteína de elevado peso molecular (HMW) de uma estirpe não tipificável de Haemophilus influenzae.
3. 3. Composição tal como reivindicada na reivindicação 2 em que a referida proteína de HMW é uma proteína HMW1 ou HMW2 da estirpe não tipificável de Haemophilus influenzae.
4. 4. Composição reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 1 a 3 em que o antigénio de Haemophilus influenzae que não é uma adesina é uma proteína de choque térmico não proteolítica de uma estirpe de Haemophilus influenzae.
5. 5. Composição tal como reivindicada na Reivindicação 4 em que a referida proteína de choque térmico não proteolítica é um análogo da proteína Hin47 de Haemophilus influenzae possuindo uma menor actividade proteásica que é menos de cerca de 10% da da proteína Hin47 de tipo selvagem.
6. 6. Composição tal como reivindicada na Reivindicação 1, que compreende: um análogo da proteína Hin47 de Haemophilus influenzae possuindo uma menor actividade proteásica que é menos de cerca de 10% da da proteína Hin47 de tipo selvagem, e uma proteína de elevado peso molecular (HMW) de uma estirpe não tipificável de Haemophilus influenzae.
7. 7. Composição tal como reivindicada na Reivindicação 6 em que o referido análogo da proteína Hin47 é um em que pelo menos um aminoácido da proteína Hin47 de tipo selvagem que ΕΡ 1 140 158 /PT 2/3 contribui para a actividade proteásica foi suprimido ou substituído por um aminoácido diferente e que possui substancialmente as mesmas propriedades imunogénicas que a proteína Hin47 de tipo selvagem.
8. 8. Composição tal como reivindicada na Reivindicação 7 em que o referido pelo menos um aminoácido é seleccionado entre os aminoácidos 91, 121 e 195 a 201 da proteína Hin47 de tipo selvagem.
9. 9. Composição tal como reivindicada na Reivindicação 7 em que o referido análogo da proteína Hin47 é um em que a Serina-197 é substituída por alanina; a Histidina-91 é substituída por alanina ou por lisina ou arginina; ou a Asp-121 é substituída por alanina.
10. 10. Composição tal como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 6 a 8, em que a referida proteína HMW é uma proteína HMW1 ou HMW 2 de uma estirpe não tipificável de Haemophilus influenzae, sendo a referida proteína HMW produzida de forma recombinante ou de outro modo.
11. 11. Composição tal como reivindicada na Reivindicação 10, em que as referidas proteínas HMW1 e HMW2 são derivadas da respectiva estirpe não tipificável de Haemophilus influenzae e possuem os respectivos pesos moleculares tal como exposto abaixo: Estirpe não tipificável 12 JoyC K21 LCDC2 FMH1 15 de H. influenzae Proteína Madura: HMW1 125kDa 125,9kDa 104,4kDa 114, OkDa 102,4kDa 103,5kDa HMW2 12OkDa 100,9kDa 111,7kDa 103,9kDa 121,9kDa
12. 12. Composição tal como reivindicada em qualquer uma das Reivindicações 6 a 11 e compreendendo: 25 a 100 pg do análogo da proteína Hin47, e 25 a 100 pg da proteína HMW.
13. 13. Composição tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações anteriores e compreendendo hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio ou outro adjuvante. ΕΡ 1 140 158 /PT 3/3
14. 14. Composição tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações anteriores e compreendendo pelo menos um componente antigénico adicional para conferir protecção contra infecção causada por outro patogénio, (i) toxóide da difteria, (ii) toxóide do tétano, (iii) toxóide da tosse convulsa, hemaglutinina filamentosa, pertactina e aglutinogénios; (iv) poliovírus não virulentos; (v) PRP-T ou (vi) um ou mais outros compostos antigénicos para conferir tal protecção.
15. 15. Composição imunogénica tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações anteriores para utilizar como vacina.
16. 16. Utilização de pelo menos dois antigénios diferentes de Haemophilus influenzae, em que pelo menos um deles é uma adesina e o outro antigénio não é uma adesina, no fabrico de uma vacina para conferir protecção contra doença causada por infecção com Haemophilus influenzae, incluindo otite média. Lisboa,