PT1127137E

PT1127137E - Lps com toxicidade reduzida a partir de bactérias gramnegativas modificadas geneticamente

Info

Publication number: PT1127137E
Application number: PT98954832T
Authority: PT
Inventors: Peter Andre Van Der Ley; Hendrik Jan Hamstra; Liana Juliana Josephine Margriet Steeghs
Original assignee: Staat Nl Verteg Door Min Welzi
Priority date: 1998-11-03
Filing date: 1998-11-03
Publication date: 2007-12-28
Also published as: ES2294821T5; JP3595264B2; DE69838460T3; NZ511438A; EP1127137B1; EP1127137B2; EP1870468A3; ES2294821T3; WO2000026384A1; AU1178299A; EP1127137A1; EP1870468A2; CA2348928C; DE69838460T2; DK1127137T4; JP2002528558A; DK1127137T3; US6482807B1; CA2348928A1; DE69838460D1

Description

DESCRIÇÃO

LPS COM TOXICIDADE REDUZIDA A PARTIR DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS MODIFICADAS GENETICAMENTE

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O objecto da invenção enquadra-se na área das vacinas e mais especificamente provê novos compostos que podem ser utilizados nas vacinas como adjuvantes. Têm sido descritos muitos adjuvantes por exemplo adjuvantes de Freund tipo emulsões de óleo mineral, sais de alumínio, saponinas, muramil dipeptídeo e derivados MPL, MF59 etc. No entanto, na actualidade, somente a alguns foram dadas licenças para que possam ser utilizadas nos seres humanos. Isto é geralmente devido a um rácio desfavorável entre a acção imuno-estimuladora versus toxicidade Uma referência geral relativamente a adjuvantes podem ser encontradas na Teoria e Aplicação Prática de Adjuvantes (D.E.S. Stewart-Tull ed. John wiley & Sons 1995) cuja informação é aqui incorporada a título de referência. A técnica anterior também ensina que determinados organismos para o tratamento enzimático do LPS podem conduzir à toxicidade reduzida. O LPS ilustrado como tendo este tratamento é: Salmonella typhimurium e Salmonella minnesota. Os seguintes são também sugeridos de exibirem o anterior: todas as bactérias Gram negativas e especificamente Salmonella, Escherichia, Haemophilus, Moraxella, Campylobacter e Neisseria. No entanto em nenhum lado são dados pormenores quanto à demonstração da actividade do adjuvante.

Analisando detalhadamente a técnica anterior esta mostra que Munford et al. (no pedido de Patente norte-americana 4,929,604 depositada em 1990) mostraram o LPS de S. typhimurium em que 95% dos grupos acilo secundários foram removidos através do tratamento enzimático. O tratamento de Munford não pode especificamente remover as cadeias de acilo secundário que 1 somente garantem a desacilação parcial. 0 método de Munford não pode prover um produto uniforme em que quase todos os grupos acilo secundários estarão removidos.

Eles sugerem que a actividade do adjuvante poderá estar presente devido ao teste da mitogenecidade da célula B. No entanto, o teste da mitogenecidade da célula B não é um teste fidedigno para indicar a actividade adjuvante. É provável que este produto não exiba actividade adjuvante. De facto o método de Munford apenas mostra a remoção das cadeias de acilo secundárias nas extremidades não reduzidas do LPS. 0 produto resultante não contém qualquer grupo acilo secundário na extremidade de redução do LPS. 0 produto Munford carece de cadeias laterais secundárias de miristoil e de lauroil. 0 método Munford não pode especificamente remover unicamente miristoil ou unicamente lauroil. 0 método Munford não pode unicamente remover a cadeia de acilo secundária numa posição especifica. O método Munford é sugerido que pode ser também aplicável a Escherichia, Haemophilus e Neisseria.

Eles mostram o LPS Salmonella com um grupo de fosfato na extremidade não reduzida e outra na extremidade de redução. 0 LPS Salmonella tem um grupo miristoil e um grupo lauroil na extremidade não reduzida. 0 LPS Salmonella não tem um grupo acilo secundário na extremidade de redução.

Myers et al., no Pedido de Patente norte-americana 4,912,094 utilizou a hidrólise alcalina sob condições controladas para unicamente remover o resíduo de acilo beta-hidroximiristico isto é um éster ligado na extremidade de redução da glucosamina na posição 3. Portanto é descrito um produto em que uma das cadeias de acilo primárias foi quimicamente removida. Nada é mencionado relativamente à remoção da cadeia de acilo secundária. O produto resultante é referido com sendo menos tóxico e que mantém as suas propriedades antigénicas. Isto é

apenas referido com base na reduzida mitogenecidade dos MPLA 2 (ácido hidrolisado) relativamente à proliferação das células para a versão desacetilada. 0 teste da mitogenecidade da célula B no entanto não é um teste fidedigno para indicar a actividade adjuvante. São dados como exemplos o LPS de Echerichia coli e de Salmonella minnesota. No entanto apenas foram dadas referências da actividade biológica do LPS de Salmonella minnesota. Eles sugerem que o método para ser aplicável a todos os LPS mas não oferecem suporte para a sua realização. 0 mesmo tema foi discutido num artigo de Erwin et al., em que Munford é co-autor (1991). Citando o resumo do artigo de Erwin este no próprio resumo assinala que: "Estes estudos indicam que a contribuição das cadeias do acilo secondárias nas bio-actividades dos LPS dadas não podem ser fidedignamente previstas a partir das relações entre estrutura-actividade descritas do lipideo A ou a partir do comportamento de outro LPS desacilado".

Na técnica são conhecidos os genes envolvidos na aciloxiacilação dos lipídeos A. Recentemente foram identificados mais dois funcionamentos aciltransferases da biossíntese do lipídeo A em Escherichia coli como os produtos dos genes htrB e msbB (Clementz et al., 1996, 1997); o gene htrB foi previamente descrito como necessário para o crescimento em meios ricos acima dos 33°C, e o gene msbB como um supressor multicópia de htrB. Na reacção óptima, htrB transfere laurato a (Kdo)2-lipídeo IVA, depois do qual msbB pode adicionar miristato para completar a acilação do lipídeo A (figurai). Os produtos predominantes formados pelos mutantes htrB e msbB são as espécies tetra-acilo e penta-acilo, respectivamente. Os genes mostraram 27.5% de identidade; um terceiro gene pertencente a esta família está também presente no cromossoma de E. coli, mas ainda está por demonstrar a sua função na biossíntese do lipídeo A. O Pedido de Patente WO9725061 descreve mutantes de bactérias

Gram-negativas lpxF (msbB) em que lhe falta metade do ácido mirístico do lipídeo A como hospedeiro para a produção de 3 proteínas imunogénicas ou de proteínas heterólogas. Hones et al., 1998, J. Hum. Virol. 1: 251-256 mostram que o LPS isolado dos mutante htrB e msbB de E.coli retêm a capacidade para induzir a secreção da beta-quemoquina sem a activação concomitante das citoquinas pirogénicas. A sequência do genoma Haemophílus ínfluenzae contém os homólogos htrB e msbB; a mutação em htrB está associada com a modificação da fosforilação assim como da acilação do LPS (Lee et al., 1995), sugerindo um efeito pleiotrópico da perda das cadeias de aciloxiacilo na decoração da cadeia do oligossacarídeo. Uma mutação combinada no gene htrB H. ínfluenzae mostrou que esta reduziu a toxicidade associada ao LPS (Nichols et al., 1997).

No Pedido de Patente W097/19688 Apicella et al. (Apicella é também autor do documento citado de Lee et al.) descrevem um mutante combinado de htrB. Eles descrevem um mutante de tetra acilo H. ínfluenzae obtido via uma mutação em htrB do dito mutante LPS supostamente com toxicidade substancialmente reduzida ainda que com antigenicidade retida.

Eles utilizaram a homologia da sequência htrB de E. coli para encontrar uma sequência idêntica para Haemophílus. Esta sequência idêntica tinha 56% de identidade e 73% de similitude relativamente à sequência htrB de E. coli. Os mutantes de H.

ínfluenzae foram feitos e deixados a crescer. A análise do LPS mutante Haemophílus revelou uma redução em fosfoetanolaminas, 50% menos com dois no núcleo interno. Sendo as espécies um lipídeo A mono ou difosforilo pentaacilo de H. ínfluenzae a que falta uma das cadeias de acilo secundário (por exemplo metade do ácido mirístico) em aproximadamente 10% foi também revelado por

Apicella. Adicionalmente um tetraacilo foi ilustrado como estando presente em aproximadamente 90%. Assim o método de

Apicella produz uma mistura das estruturas do LPS H. ínfluenzae LPS recombinante em que a maioria do produto não tem cadeias de acilo secundárias. Os ensaios bactericidas das preparações de 4 LPS foram providos por Apicella como se fossem imunizações de modelos de ratazanas bebé e chinchilas utilizando a estirpe H. influenzae mutante. Os testes que utilizaram o LPS per se como imunogénio não ilustraram ou sugeriram algo mais quanto à actividade adjuvante. A resposta imunológica em relação ao LPS per se é mostrada nos testes de Apicella et al. É também descrito um mutante de Salmonella. Este mutante foi obtido seguindo de modo similar o método para H. influenzae. O mutante de Salmonella provê um LPS em que a substituição 3' no N ligado a um ácido gordo C14 é C16 em vez de C12. Esta forma de realização foi dez vezes menos tóxica que o tipo selvagem. Não foram dados pormenores sobre a antigenicidade desta substância.

Eles sugeriram que o método poderá também ser aplicável a Neisseria, Moraxella, e Campylobacter. Por exemplo no exemplo 6 Apicella sugere que fases análogas às da H. influenzae poderão ser realizadas para Neisseria mas não as ilustrou e o método não foi claramente realizado. Até aos nossos dias, relativamente a este gene na síntese do lipídeo A de Neisseria nenhum ensinamento foi descoberto nem foram dados pormenores dos testes do gene envolvido nesta fase da síntese do lipídeo A de

Neisseria. 0 documento da técnica anterior de Apicella revela que a mutação na Salmonella parece induzir outra aciltransferase em vez de resultar na omissão da acilação secundária contrariamente ao resultado provido por H. influenzae. Isto ilustra a imprevisibilidade no resultado quando os genes mutantes associados com a síntese do lipídeo A em vários organismos Gram-negativos e que também está de acordo com os ensinamentos de Erwin e Munford. 0 produto da Salmonella é um heptacilo ou hexaacilo isto é, têm o mesmo número de cadeias acilo secundárias e primárias como a do não mutante. 0 produto H. influenzae na sua maioria (90%) 5 está livre de cadeias de acilo secundárias mas provê também uma mistura das estruturas de pentacilo. Não foi provida ou indicada nenhuma diferença na actividade para quaisquer uma das várias estruturas . A estrutura do lipideo A de Neisseria meningitidis tinha sido previamente analisada por Kulshin et ai., em 1992. No entanto nada é sabido quanto à composição genética de Neisseria relativamente à presença ou ausência de um gene htrB ou quanto à sua identidade. Adicionalmente nada se sabe da influência de qualquer mutação neste gene se ele pudesse ser descoberto estaria incorporado na estirpe mutante resultante ou incorporado no produto ou produtos resultantes.

RESUMO DA INVENÇÃO

Fizemos investigações para identificar uma sequência genética envolvida com a acilação secundária do LPS. No genoma de Neisseria meningitidis descobrimos duas sequências diferentes. Com base nesta informação entre outras pusemos a hipótese da existência de duas transferases aciloxiacilo que poderiam trabalhar de várias maneiras. Uma dessas maneiras poderia ser que somente uma destas transferases poderia catalisar numa adição análoga ao processo de E.coli, isto é htrB (figura 1) . Alternativamente, uma única enzima pode catalisar as duas acilações, se o lipideo A meningococcal tem uma estrutura simétrica. Assim decidimos fazer mutações nos genes de síntese do lipídeo A de Neisseria meningitidis e descobrimos que as estirpes mutantes eram viáveis. Descobrimos ainda que estas estirpes produziam LPS mutado. Este LPS mutado exibia toxicidade reduzida. No entanto a mutação no gene htrB2 resultou num produto que não reteve a actividade imunestimuladora. Ele resultou num produto que não seria útil numa vacina. Ele resultou num produto que não poderia ser utilizado como adjuvante numa vacina. 6

No entanto, surpreendentemente descobrimos que as mutações no gene htrBl de Neisseria meningitidís proviam um produto que era menos tóxico e que tinha também actividade adjuvante. Analisamos a estrutura molecular dos produtos resultantes e chegamos à conclusão que de uma maneira análoga as moléculas correspondentes a partir de outras bactérias Gram-negativas poderiam ser utilizadas. Descobrimos que não só a toxicidade mas que também a actividade adjuvante está estritamente relacionada com a estrutura da molécula. Em particular a composição do acilo secundário foi particularmente relevante. Descobrimos também que o modelo de fosforilação foi relevante.

Assim agora provemos um método para produzir especificamente derivados menos tóxicos do LPS com actividade adjuvante clara, sendo os ditos derivados de uma natureza que não pode ser previamente deduzida da técnica anterior e exibindo caracteristicas que não são conhecidas nem previsíveis da técnica anterior.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção tem como objectivo novas formas menos tóxicas do LPS que são obtidas através de bactérias Gram-negativas geneticamente modificadas. Estas novas estruturas LPS exibem actividade adjuvante.

As novas estruturas do LPS são definidas como LPS recombinante com um número reduzido de cadeias de acilo secundárias por molécula de LPS em relação à correspondente molécula LPS não modificada, sendo as ditas cadeias de acilo secundárias ligadas às cadeias de acilo primárias, sendo as ditas cadeias de acilo

primárias ligadas à glucosamina da dita molécula do LPS recombinante, sendo o dito LPS recombinante homogéneo no modelo de acilação. Contrariamente à técnica anterior descrita por

Apicella em que foi descrito que os LPS tinham sido quimicamente modificados e os LPS H. influenzae tinha sido geneticamente 7 desenhado. 0 novo lps de acordo com a invenção pode ser obtido de forma a que seja garantida a homogeneidade do modelo de acilação, especificamente também o modelo da acilação secundária. Naturalmente este provê uma base melhor para ser adicionada a uma vacina com o fim da standardização mas também com o fim de analisar a actividade resultante da expressão do produto. Mais especificamente um LPS adequado de acordo com a invenção é uma molécula LPS recombinante com um número reduzido de cadeias de acilo secundárias em relação às correspondentes moléculas de LPS não modificadas, sendo as ditas cadeias de acilo secundárias ligadas às cadeias de acilo primárias, sendo as ditas cadeias de acilo primárias ligadas à glucosamina na dita molécula LPS recombinante, dita molécula LPS recombinante com pelo menos uma cadeia de acilo secundária ligada a uma cadeia de acilo primária fixada à glucosamina na extremidade de redução da dita molécula do LPS recombinante. Um LPS recombinante de acordo com a invenção em qualquer uma das formas de realização providas podem ter o mesmo número de cadeias de acilo primárias como as do LPS não modificado. 0 LPS recombinante de acordo com a invenção pode ter a mesma composição das cadeias de acilo primárias como a dos LPS não modificados. A titulo de exemplo um LPS recombinante de acordo com quaisquer uma das formas de realizar a invenção acima mencionadas tem 2 cadeias de acilo primárias na extremidade de redução fixadas à glucosamina pela molécula do LPS recombinante. Numa forma de realização adequada o LPS de acordo com a invenção terá uma cadeia de acilo primária presente na extremidade de redução na 3a posição da glucosamina pela molécula do LPS recombinante. Mais especificamente a acilação do lauroil é o alvo da rectificação do LPS recombinante em relação ao LPS não modificado. Estes LPS recombinantes podem ter um número reduzido de cadeias de lauroil secundárias para a molécula LPS recombinante em comparação com o LPS não modificado. Adequadamente um LPS recombinante de acordo com a invenção pode ter um número reduzido de cadeias de lauroil secundárias fixadas à extremidade não reduzida da molécula do LPS recombinante para a molécula LPS recombinante em comparação com o LPS não modificado. Numa forma de realização de acordo com a invenção foi descoberto que quaisquer dos tipos acima descritos são adequados desde que o LPS recorribinante tenha pelo menos uma cadeia lauroil secundária fixada a uma cadeia de acilo primária na extremidade da redução da molécula LPS pela molécula LPS recombinante. A titulo de exemplo este recombinante tem uma cadeia lauroil secundária na cadeia acilo primária na extremidade de redução da molécula LPS na 2 posição da glucosamina pela molécula LPS recombinante. Efectivamente foi descoberto que em particular é interessante um LPS recombinante de acordo com quaisquer uma das formas de realização anteriores, tendo o dito LPS recombinante uma cadeia acilo secundária na cadeia acilo primária na 2 posição da glucosamina na extremidade de redução da molécula LPS pela molécula LPS recombinante. Outra forma de realização interessante é a molécula LPS recombinante de acordo com quaisquer uma das definições anteriores da invenção com 5 cadeias de acilo na totalidade da molécula LPS recombinante. Numa forma de realização alternativa adequada o LPS recombinante de acordo com as formas anteriores de realizar a invenção tem um grupo de fosfato fixado à glucosamina na extremidade da redução da molécula do LPS e um grupo de fosfato fixado à glucosamina na extremidade de redução da molécula pela molécula LPS recombinante. Ainda outra forma de realizar a invenção consiste num LPS recombinante com um grupo fosfoetanolamina para a molécula LPS recombinante. Também um LPS fidedigno de acordo com a invenção tem um grupo fosfoetanolamina para a molécula LPS recombinante. É uma forma realização particularmente adequada, um LPS recombinante com um grupo de fosfato fixado à glucosamina na extremidade não reduzida da molécula LPS e um grupo de fosfato fixado à glucosamina na extremidade de redução da molécula, sendo este último grupo de fosfato também fixado à fosfoetanolamina na extremidade de redução da molécula para a molécula LPS recombinante. É de salientar que qualquer combinação dos elementos descritos das 9 várias formas de realizar o LPS devem ser também consideradas abrangidas pelo âmbito da invenção. De acordo com a invenção, qualquer bactéria Gram-negativa pode servir como fonte para um LPS recombinante. Especificamente no que se refere a este aspecto a bactéria foi seleccionada do grupo composto pelas bactérias seguintes Neisseria, Bordetella, Salmonella e Haemophilus que foram consideradas fontes adequadas. Os organismos de Neisseria e Bordetella são particularmente danificados e os derivados LPS das ditas bactérias são os preferidos. Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoae são dois candidatos adequados das bactérias pertencentes ao grupo de bactérias abrangidas pela definição de Neisseria. Nos exemplos utilizamos LPS derivados da estirpe H44/76 de Neisseria meningitidis. Baseados nesta estirpe descobrimos que a estrutura do LPS seguinte era extremamente útil: n OH, ho-p-c^Xío 0 NH o=c c=o HO^ H-CH | HC-H / HO-CH CH, l 2 HÇ-OH CH2 0 1 o=c ch2 I 2 çh2 CH 1 CH, 1 2 çh2 HO-CH 1 ch2 I z çh2 CH 1 CH, l 2 çh2 CH I ch2 I 2 çh2 CH I CH, 1 2 çh2 CH I çh2 çh2 1 ch3 çh2 CH 1 çh2 CH | ch3 CH 1 CH NH i C=0 /

O II NH i ÇH O CH " i 2 2 2 O-P—O-P—ó OH Òh 2 HC-HH9-ox 2 ch2 ç-o 2 CH, CH, I 2 I 2 2 ÇHa ÇHa 2 ch2 çh2 2 çh2 çh2 2 çh2 çh2 2 CH, CH, I 2 I 2 2 ÇH? çh2 3 çh2 çh2 CH, CH, I 2 I 2 CH3 çh2 ch3 10

Como o referido o LPS recombinante de acordo com a invenção exibe toxicidade reduzida. A toxicidade reduzida pode ser determinada com a utilização de ensaios comuns para a toxicidade de alguns deles são providos nos exemplos mas que para os técnicos especializados outros tantos serão evidentes. Um LPS recombinante de acordo com qualquer uma das formas de realizar a invenção exibe toxicidade reduzida relativamente ao

correspondente LPS não modificado. Outra substância contra a qual a toxicidade reduzida pode ser testada é o MPL quando testado com a utilização dos ensaios correspondentes. Um LPS

recombinante de acordo com qualquer uma das formas de realizar a invenção exibe actividade adjuvante. Uma substância contra a qual a actividade adjuvante pode ser comparada é o MPL quando testado com a utilização dos ensaios correspondentes. Um LPS recombinante de acordo com a invenção exibe actividade adjuvante superior à do MPL quando testado com a utilização dos ensaios correspondentes. Alternativamente a actividade adjuvante pode ser comparada com o LPS de Rhodobacter sphaeroides e quando testado com a utilização dos ensaios correspondentes o LPS de acordo com a invenção mostrou uma actividade adjuvante maior. Outro modo de testar a actividade adjuvante de um LPS recombinante de acordo com a invenção é em relação a um LPS meningococcal hidrolisado alcalino. Um LPS recombinante de acordo com a invenção exibirá actividade adjuvante maior do que a de um LPS meningococcal hidrolisado alcalino quando testado com a utilização dos ensaios correspondentes. A actividade adjuvante pode ser avaliada com um antigénio dirigido contra o mesmo grupo bacteriano a partir do qual o LPS não modificado foi derivado. A actividade adjuvante pode ainda ser avaliada com um antigénio dirigido contra um organismo diferente de um pertencente ao grupo bacteriano a partir do qual o LPS não modificado foi derivado. Os exemplos provêm a ilustração do teste da actividade adjuvante. 0 LPS recombinante de acordo com a invenção pode ser substancialmente isolado e purificado com a utilização de metodologias Standard para isolar o LPS a partir das culturas bacterianas. 0 objecto da invenção não é somente 11 dirigido ao LPS per se como o definido em quaisquer das formas de realizar o LPS recombinante acima referidas de acordo com a invenção mas também a uma composição que compreenda este LPS recombinante. Esta composição pode ser uma composição para estimular a reacção imune. Mais especificamente esta composição pode ser uma vacina com o LPS recombinante como o componente activo em combinação com um portador aceite na Indústria Farmacêutica. Uma composição de acordo com a invenção e especificamente uma vacina de acordo com a invenção compreende o LPS recombinante como adjuvante. A composição é preferencialmente para estimular a reacção imune contra uma bactéria Gram-negativa. A composição pode ser utilizada para combater infecções provocadas por outros organismos além dos organismos correspondentes a partir do qual o LPS foi derivado correspondente a esse LPS recombinante. No entanto ele pode ser mais adequadamente utilizado para combater o mesmo tipo de organismo. 0 LPS de Neisseria pode ser utilizado numa vacina para combater uma infecção de Neisseria mas também para combater um infecção Bordetella. É ainda previsto que uma vacina contra sarampo poderá compreender de acordo com a invenção um LPS recombinante como adjuvante. Uma composição de acordo com a invenção pode ser livre de outros adjuvantes. Especificamente uma composição de acordo com a invenção, preferencialmente uma vacina é livre de qualquer dos adjuvantes habitualmente utilizados nas vacinas comerciais. Adequadamente uma composição de acordo com a invenção é livre dos seguintes adjuvantes Freund emulsões do tipo óleo mineral, sais de alumínio, saponinas, muramil dipeptídeo e derivados MPL e MF59. Alternativamente uma vacina de acordo com a invenção compreende os adjuvantes comerciais habitualmente utilizados em doses inferiores às habitualmente utilizadas na prática nas preparações das vacinas comerciais exibindo assim uma toxicidade inferior à da vacina correspondente sem o LPS de acordo com a invenção e a composição e quantidade do adjuvante normal. Para uma composição de acordo com a invenção tenha uma acção estimuladora imune e seja útil 12 como uma vacina é preferível que a composição compreenda um antigénio adicional ao adjuvante para a estimulação de uma reacção imune. Adequadamente o antigénio é específico para a obtenção da estimulação da reacção imune contra um organismo que não seja o organismo correspondente a partir do qual o LPS correspondente foi derivado a partir do LPS recombinante. É ainda uma forma de realização que a composição de acordo com a invenção compreenda um antigénio adicional ao adjuvante para estimular a reacção imune, sendo o dito antigénio específico para a obtenção da estimulação da reacção imune em relação a um organismo correspondente ao grupo de organismos a partir do qual o LPS correspondente foi derivado do LPS recombinante. A título de exemplo um antigénio de Neisseria e um LPS de Neisseria recombinante de acordo com a invenção. Podem ser as mesmas espécies, mas estas necessariamente não têm de ser as mesmas espécies. Assim um LPS recombinante de Neisseria meningitidis pode ser apresentado juntamente com um antigénio de Neisseria meningitidis. No entanto o LPS pode ser ainda derivado a partir das espécies Neisseria gonorrhoeae ou Bordetella. Adequadamente uma composição de acordo com a invenção estará numa forma de dose medicinal. Por exemplo uma forma de dose injectável. Preferencialmente a composição de acordo com a invenção dar-se-á numa forma sistemicamente aceitável. 0 adjuvante e qualquer antigénio adicional serão apresentados em quantidades adequadas para prover num humano ou animal uma reacção estimuladora imune. Ele será apresentado numa quantidade não tóxica ou numa quantidade tóxica tolerável. É preferido que a aplicação da vacina não provoque efeitos secundários perigosos. A invenção compreende ainda a utilização de um LPS recombinante como adjuvante de acordo com quaisquer uma das formas de realizar a invenção numa composição para a estimulação da reacção imune especificamente numa formulação de vacina. A invenção abarca ainda um método de tratamento para a estimulação do sistema imunológico de um humano ou animal com a administração de um LPS recombinante ou composição que o compreende em quaisquer das formas de realização descritas para uma composição de acordo com 13 a invenção numa dose suficiente para prover a estimulação imunológica, um técnico especializado em vacinas será capaz de verificar com base no objecto e/ou doença ou infecção a combater quais as formulações e quais os regimes de doses que podem ser aplicados. Os antigénios habitualmente disponíveis e os portadores de vacina podem ser analogamente utilizados como nas vacinas conhecidas. Uma solução tampão é um exemplo adequado de um portador. 0 método de administração pode ser mediante qualquer método habitual por exemplo parenteral (por exemplo intravenoso ou intramuscular) ou oral (por exemplo utilizando as células bacterianas da febre tifoide para encapsular a administração das substâncias activas. 0 objecto da invenção provê ainda um método para produzir um LPS recombinante de acordo com a invenção. 0 método compreende a cultura de uma bactéria Gram-negativa recombinante, compreendendo a dita bactéria Gram-negativa recombinante uma mutação no trajecto de síntese do lipídeo A ao nível de adição das cadeias de acilo secundárias às cadeias de acilo primárias fixadas à glucosamina da molécula LPS e opcionalmente seguida do isolamento e purificação do LPS resultante. Especificamente a mutação é uma mutação num gene que codifica a enzima associada com a adição do acilo secundário. Como o acima descrito um número de trajectos de síntese estão disponíveis na técnica para várias bactérias Gram-negativas. Utilizando os dados existentes na técnica anterior em combinação com o objecto descrito neste documento podemos chegar a vários métodos para vários organismos Gram-negativos para prover um LPS recombinante de acordo com a invenção. Utilizando os dados de sequência providos pela estirpe H44/76 Neisseria meningitidis para htrB podemos chegar a sequências correspondentes a outros organismos por exemplo outra Neisseria. A introdução da mutação que elimina a expressão de um produto de expressão htrBl activo nesse organismo garantirá a produção do LPS recombinante desejado. A posição e identificação do gene htrBl é mais detalhadamente provida nos exemplos da 14 estirpe H44/76 de Neisseria meningitidis. Os dados da sequência gerados podem ser extrapolados a outras estirpes. Utilizando os dados da sequência disponível e a homologia da sonda utilizada no exemplo ou tomando outra sonda com base na codificação parcial ou inteira da sequência da estirpe H44/76 htrBlde Neisseria meningitidis pode conduzir à indicação de sequências htrB alternativas noutros organismos. Adicionalmente ao acima dito foi descoberto que os organismos htrBlde Neisseria estão localizados a jusante do gene ruvC assim como qualquer sequência de genes que codifica htr a jusante de uma sequência ruvC é uma posição adequada para a introdução de uma mutação. Qualquer sequência de genes que exiba mais do que 60% de homologia relativamente à sequência de codificação da figura 2 num organismo Gram-negativo, organismo do género Neisseria ou Bordetella, é uma posição potencial para que a mutação proveja um LPS recombinante de acordo com a invenção. Quanto mais próxima esteja a homologia de 100% sobre um segmento de pelo menos 500 bp de bases e mais preferencialmente sobre a totalidade do comprimento da sequência de codificação melhor. Alternativamente ou em combinação podemos procurar para uma sequência de codificação a mesma ou a sequência de aminoácidos mais próxima e mutar a sequência correspondente de maneira a que não seja produzido o produto da expressão activa. Mais adequadamente a sequência está localizada a jusante de uma sequência ruvC. Preferencialmente a mutação escolhida é uma mutação num gene que codifica uma enzima associada ao acilo secundário adicionado às cadeias de acilo primárias na extremidade de redução do LPS. Como é evidente dos exemplos estes podem adequadamente ser uma mutação num gene que codifica uma enzima associada com a adição de lauroil secundário. Uma mutação adequada especifica é a de um gene que codifica uma enzima associada com uma cadeia de acilo secundário adicionada à cadeia do acilo primário presente na posição 2' da glucosamina na extremidade não reduzida da molécula LPS. 15

Numa forma de realização de acordo com a invenção o lps recombinante é isolado e purificado de forma a que seja livre de quaisquer outras formas de LPS. Num método para formular uma vacina é preferível isolar primeiro o LPS para que a formulação exacta da vacina seja obtida. Adequadamente um método de acordo com a invenção consiste em prover um LPS recombinante com um número reduzido de cadeias de lauroil secundárias para a molécula LPS recombinante em comparação com o LPS não modificado em que o LPS recombinante é isolado e purificado de forma a que seja livre em quaisquer outras formas de LPS. Numa forma de realização preferida o LPS recombinante é provido para que tenha um número reduzido cadeias de lauroil secundárias fixadas à extremidade não reduzida da molécula do LPS recombinante pela molécula LPS recombinante em comparação com o LPS não modificado. Numa forma de realização preferida o LPS recombinante é provido para que pelo menos tenha uma cadeia de lauroil secundária fixada a uma cadeia acilo primária na extremidade de redução da molécula LPS para a molécula LPS recombinante. Adequadamente neste método a mutação pode ser de maneira a que o LPS recombinante tenha uma cadeia de acilo secundária na cadeia de acilo primária na posição 2 da glucosamina na extremidade de redução da molécula LPS pela molécula LPS recombinante. Adequadamente a cadeia de acilo secundária é uma cadeia de lauroil secundária. Um método preferido envolve um processo de mutação resultante de um LPS recombinante de acordo com a invenção com um total de 5 cadeias de acilo por molécula de LPS recombinante. Um método alternativo da invenção consiste na produção de um LPS recombinante com um grupo de fosfato fixado à glucosamina na extremidade não reduzida da molécula do LPS e um grupo de fosfato fixado à glucosamina na extremidade de redução da molécula pela molécula LPS recombinante. Adequadamente o produto LPS é isolado e purificado de forma a que ele seja livre de quaisquer outras formas de LPS. Alternativamente o método pode compreender a produção de um LPS recombinante com um grupo de fosfoetanolamina 16 por molécula LPS recombinante que adequadamente foi isolada e purificada de forma a que ela esteja livre de quaisquer outras formas de LPS. A invenção provê um método em que o LPS recombinante com um grupo de fosfato fixado à glucosamina na extremidade não reduzida da molécula do LPS e um grupo de fosfato fixado à glucosamina na extremidade de redução da molécula, estando este último ainda fixado à fosfoetanolamina na extremidade de redução da molécula para que a molécula do LPS recombinante seja produzida e preferencialmente seja isolada e purificada de forma a que ela seja livre de quaisquer outras formas de LPS. A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos que não devem ser considerados limitativos do âmbito da invenção. As numerosas variantes do LPS e a sua utilização de acordo com a invenção serão evidentes para um técnico especializado com base na informação provida nas reivindicações, descrição e figuras em combinação com os seus conhecimentos gerais comuns na área da engenharia genética, especificamente das bactérias Gram-negativas e na produção de vacinas. Especificamente as referências citadas e a informação nas bases de dados de ADN acessíveis ao público com sequências genómicas Gram-negativas acessíveis antes da data de depósito e que aqui são incorporadas a titulo de referência. Quando os métodos ou processos de isolamento, purificação são mencionados estes deverão ser considerados os habituais na técnica e análogos a outros procedimentos conhecidos. 0 mesmo comentário é válido para introduzir uma mutação no gene htrBl. Este pode dar-se via inserção, eliminação ou substituição de maneira conhecida per se desde que a sequência de ADN escolhida para ser mutada tenha sido localizada num organismo. 0 método de formulação de uma vacina e a sua administração são também procedimentos habituais que não necessitam de nenhuma outra explicação. Os termos utilizados são termos que um técnico especializado conhece que podem ser deduzidos a partir da literatura genérica relativa à 17 área de engenharia genética, bactérias Gram-negativas e imunologia e/ou das referências citadas. EXEMPLO 1

Construção do mutante htrBl de Neisseria meningitidis com o lipídeo A alterado

Utilizando as sequências dos genes htrB/msbB de Escherichia coli e Haemophilus influenzae, realizamos uma investigação BLAST nas sequências do genoma gonococcal que a universidade de Oklahoma pôs à disposição na Internet. Várias sequências contíguas com uma homologia significativa foram identificadas, e os iniciadores PCR foram desenhados com base nestas sequências. Com o ADN cromossómico meningococcal como molde, foi descoberto que os iniciadores pr447-2 e pr670-l deram um ca. 500 bp do produto PCR que sobre clonação no vector pCRII e sequenciação eram homólogos às sequências htrB/msbB de diferentes espécies bacter anas (33% e 31% respectivamente para os genes de E. coli. Este fragmento foi utilizado como sonda para o isolamento de um fragmento cromossómico maior contendo o gene htrBl inteiro de Neisseria meningitidis (figura.2). Imediatamente a montante deste gene foi encontrado um marco de leitura aberta com homologia ao gene ruvC de E. coli, que supostamente está envolvido na reparação do ADN e recombinação e não na biossíntese do LPS.

Uma cassete de canamicina resistente foi introduzida no sítio

Bgll localizado dentro do produto PCR htrBl clonado, e a construção resultante (plasmídeo pBSNK6, que continha também a sequência neisserial aqui estudada) foi utilizada para transformar a estirpe H44/76 meningococcal em canamicina resistente. O PCR foi utilizado para verificar que se deu a mudança correcta do alélico com o gene htrBlcromossómico. Todos os transformantes assim obtidos mostraram uma mobilidade

aumentada dos seus LPS quando analisados por Tricina SDS-PAGE 18 seguida de coloração com prata (figura 3). A ligação dos anticorpos monoclonais específicos para a parte do oligossacarídeo do LPS meningococcal não foi afectada pela mutação, sugerindo que apenas parte do lipídeo A deve ser alterada. EXEMPLO 2

Análise estrutural do mutante htrBl do lipídeo A A análise do ácido gordo por cromatografia de gás/espectrometria de massa das células inteiras mostraram um rácio reduzido de C12:0/C12:0 3-OH no mutante htrBl em comparação com a estirpe original tipo selvagem, indicando uma perda (parcial) da(s) cadeia (s) de acilo secundária C12:0. 0 LPS deste mutante foi purificado através de fenol quente/extracção água, e a fracção do lipídeo A foi obtida após a hidrólise ácida e a extracção de clorofórmio/metanol. Seguidamente a sua estrutura foi investigada utilizando a espectrometria de massas em tandem. A análise revelou uma espécie penta-acilo principal em que faltava a cadeia aciloxiacilo C12:0 a partir da extremidade não reduzida da molécula (figura 4).

Foi descoberta uma diferença adicional da estirpe original no modelo de fosforilação na extremidade de redução do dissacarídeo, em que um grupo fosfato adicional está presente. A molécula deste lipídeo A mutante tem uma estrutura única que não se encontra em quaisquer um dos mutantes previamente descritos para outras bactérias Gram-negativas. EXEMPLO 3

Actividade biológica do LPS mutante de htrBl 19

As células inteiras da estirpe mutante htrBl foram testadas para a sua actividade biológica associada de LPS nos ensaios de indução do Limulus amebocite lisado (LAL) e da necrose tumoral factor-α) (TNF-a). No ensaio LAL, foi observado uma redução na actividade de 7 vezes para as células inteiras a partir do mutante quando comparadas com as do tipo selvagem. Para a indução TNF-α por células MM6, as células bacterianas htrBl mostraram uma redução de actividade de pelo menos 100 vezes quando comparadas com o tipo selvagem, idêntica à descoberta anterior para as células inteiras de um mutante completamente deficiente de LPS (figura 5) (L. Steeghs et al., 1998). A imunização de ratos com complexos de membrana externa isolados a partir do mutante LPS meningococcal deficiente foi utilizada para comparar a actividade adjuvante das preparações LPS. As respostas dos anticorpos foram medidas na célula inteira por ELISA e ensaio bactericida em relação à estirpe original H44/76. A imunogenicidade das proteínas da membrana externa principal foi restaurada aos níveis normais pelo tipo selvagem e também pelo LPS mutante htrBl, mas menos do que pelas espécies LPS atóxicas do lipídeo A monofosforilo (MPL), LPS Rhodobacter sphaeroides e LPS meningococcal hidrolisado alcalino (figura 6) (Nakano M. & Matsuura M.). Assim, o LPS mutante htrBl retém a actividade adjuvante apesar da toxicidade diminuída. EXEMPLO 4

Propriedades do mutante do lipídeo A htrB2

Outro gene com homologia a htrB/msbB de E. coli e H. influenzae foi identificado e inactivado de mesmas forma que a dos exemplos anteriores para htrBl. No entanto contrariamente ao htrBl, o LPS deste mutante (denominado htrB2) tem uma actividade adjuvante fortemente reduzida assim como toxicidade reduzida (figura 6). 20

Também contrariamente ao htrBl, esta mutação poderá não ser introduzida na estirpe H44/76 com o LPS tipo selvagem mas somente num derivado galE com uma galactose deficiente, de uma cadeia de oligossacarídeo truncada.

MÉTODOS

Estirpes bacterianas e plasmídeos

As estirpes de E. coli NM522 e INVaF' cresceram num meio LB a 37°C. A estirpe H44/76 N. meningitidis e os seus derivados cresceram a 37°C num meio base (Difco) GC completado com IsoVitaleX (Becton Dickinson) numa atmosfera húmida contendo 5% de C02, ou num meio liquido como o previamente descrito (van der Ley et al., 1993). Para a selecção dos transformantes meningococcal (van der Ley et al., 1996) a canamicina foi utilizada numa concentração de 75-100 microgramas/ml. Com E. coli, os antibióticos foram utilizados com as seguintes concentrações: ampicilina, 100 microgramas/ml; canamicina, 100 microgramas/ml.

Para a clonação dos fragmentos PCR, foi utilizado o kit de clonação TA com o vector pCRII (Invitrogen). Técnicas de ADN recombinante A maioria das técnicas de ADN recombinantes foram como as descritas por Sambrook et al. (1989). O plasmídeo de ADN foi isolado utilizando o kit pLASmix (Talent). A reacção em cadeia da polipolimerase (PCR) foi realizada num Perkin Elmer GeneAmp sistema 9600 com Taq polimerase. A análise das sequências foi realizada com Applied Biosystems automatic sequencer nos moldes do plasmídeo de ADN bicatenário (isolados com colunas Qiagen) e com um protocolo de sequenciação do ciclo. 21

Análise do LPS

A electroforese em gel de sulfato polipoliacrilamida foi realizada em Tricine-sódio dodecil numa concentração de 4% e 16% de géis de separação como o descrito por Lesse et al. (1990) . Como amostras foram utilizadas as células bacterianas cozidas da proteinase K-tratadas. Os géis actuaram durante 17 h a uma corrente constante de 20 mA, e a coloração com prata foi executada pelo método de Tsai & Frasch (1982) . O ensaio LAL cromogénico para a actividade da endotoxina foi realizado utilizando o Kit QCL-1000 de BioWhittaker Inc. (Walkersville, MD, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Durante 24 horas as culturas foram diluídas num meio meningococcal para um OD em 620 nm de 0.1, e diluições em série destes stocks foram utilizadas como amostras no ensaio LAL. A indução TNF-α por suspensões bacterianas foi testada com o macrófago humano linha de célula MM6 e quantificados a partir dos sobrenadantes da cultura utilizando TNF-α linha celular sensível WEHI 164 (Espevik & Nissen, 1986). Para a análise do ácido gordo por GC-MS, as amostras OMC foram acetiladas durante 3 h a 900°C em piridina e anidrido do ácido acético para completamente dissolver o LPS. As amostras foram subsequentemente aquecidas durante 3 h a 650°C em tetrahidrofurano na presença de LÍA1H4 para reduzir os ácidos gordos O-ligados aos alcoóis livres. Estes foram derivados em TMS-éteres durante lha 600°C com BSTFA + 1% TMCS em piridina, e analisados por GC-MS num Autospec (Micromass, Manchester, UK) no modo impacto de electrões. A quantidade de 3-OH C12 nas amostras foi quantificada utilizando como Standard interno 2-OH C12. O LPS foi isolado pelo método de extracção fenol-água quente (Westphal & Jann, 1965). Para o isolamento do lipídeo A, o LPS foi submetido a uma hidrólise com um ácido suave (1% ácido acético, 2.5 h 1000°C), seguida de precipitação e fraccionamento final em clorofórmio-metanol-água. A análise estrutural do lipídeo A purificado foi realizada com espectrometria de massas tandem por electrospray. A 22 espectrometria de massas foi efectuada num instrumento de armadilha de iões armadilha quadropolo (LCQ Finnigan Corp. San Jose USA) ajustado com uma fonte de iões nanoelectrospray accionada a 600 V. A temperatura da entrada capilar foi fixada em 200°C, o número máximo de iões na armadilha a 1,0 X 107 e o tempo máximo de injecção a 150 ms. As agulhas de nanoelectrospray foram cheias com 2 microlitros da solução da amostra. A totalidade dos espectros MS foram registados na faixa de 150-1850 amu. A totalidade dos espectros MS(n) estiveram sempre precedidos por um zoom scan do ião original para determinar mais exactamente o rácio m/z dos originais como também para determinar o seu estado de carga. Os espectros MS/MS foram registados num painel para a selecção iónica original de 3 amu. A energia de excitação foi ajustada até que o rácio de intensidade do pico base dos originais estivesse entre 5 e 20. Exceptuando os espectros zoom scans os outros foram registados no modo centróide.

Caracterização da composição OMC

Foi testada a ligação especifica de mAbs para a classe 1, 3 e 4 OMPs e para a parte do oligossacarideo do LPS imunotipo L3 numa célula inteira ELISA (van der Ley et al., 1995, 1996). O isolamento de OMCs pela extracção sarcosil e a sua análise por SDS-PAGE foi feita como o previamente descrito (van der Ley et al., 1993) .

Imunização dos ratos

Os ratos BalB/C com entre seis e oito semanas, cinco animais de cada grupo, foram imunizados subcutaneamente no dia 0 com 20 microgramas de LPS-deficiente H44/76 OMCs completado com adjuvante e dissolvido em 0.5 ml PBS. No dia 14 e no dia 28 a imunização foi repetida e a recolha do sangue foi efectuada no dia 42. Os soros foram colhidos e guardados a 4°C. A actividade bactericida do soro relativamente à estirpe H44/76 foi avaliada 23 como o descrito por Hoogerhout et al. (1995), com a utilização de uma concentração final de 20% de complemento de coelho. O titulo bactericida foi medido como a diluição do soro reciproco mostrando mais do que 90% mortos.

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Legendas das figuras

Figura 1. O papel dos produtos genéticos htrB e msbB na biossíntese do lipídeo A de Escherichia coli.

Figura 2. Organização (A) e sequência (B) do gene htrBl de Neisseria meningitidis.

Figura 3. Análise Tricine-SDS-PAGE do LPS a partir do tipo selvagem de H44/76 e transformantes canamicina-resistentes obtidas com o plasmídeo pBSNK6.

Figura 4. Análise estrutural por espectrometria de massas do lipídeo A do tipo selvagem de H44/76 (A) e o mutante htrBl (B) 26

Figura 5. Indução TNF-oc nas células MM6 pela bactéria inteira da estirpe H44/76, mutante htrBl e estirpe LPS-deficiente de pLAK33.

Figura 6. Comparação da actividade adjuvante de várias preparações LPS quando este é utilizado na imunização dos ratos juntamente com LPS-deficiente de OMCs.

Lisboa, 14 de Dezembro de 2007. 27

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração foi tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a este respeito a EPO declina qualquer responsabilidade.

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. LPS com um lipídeo A com um número reduzido de cadeias de acilo secundário para molécula do LPS comparada com a molécula não modificada do LPS correspondente e com pelo menos uma cadeia de acilo secundária fixada a uma cadeia de acilo primária na extremidade de redução do dissacarídeo de glucosamina.
2. LPS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o lipídeo A ter o mesmo número de cadeias de acilo primárias como a molécula LPS não modificada.
3. LPS de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o lipídeo A ter uma cadeia de acilo secundária na cadeia de acilo primária na posição 2 da glucosamina na extremidade de redução do dissacarídeo de glucosamina.
4. LPS de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a cadeia de acilo secundária ser uma cadeia de lauroil.
5. LPS de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por este conter um lipídeo A com uma fosfoetanolamina fixada a um grupo de fosfato na extremidade de redução.
6. LPS de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por o lipídeo A ter a seguinte estrutura molecular: 1 2 2 OH -CH. 0 NH 1 i 0=C C=0 H_9H HÇ-H HO-ÇH hc-OH

Çh2 hc-h I 2 2 OH n CH2 HO-P-O-t^JLÍO CH, i 2 CH, i 2 CH, t 2 CH, i 2 CH, i 2 CH, i z CH- i 2 CH, i 2 CH, NH ÇH / O O CH / II II I r—*-0-P—O-P-O \ OH Òh CH- i 2 CH- i 2 ch2 HO-CH 1 H<r—o 9=° çh2 CHp 1 2 <?h2 çh2 çh2 çh2 9H2 çh2 CH, 1 2 ch2 çh2 çh2 ch2 I 2 çh2 9H2 -ο χ rsí ch2 çh2 çh2 CH, ch2 I 2 çh2 9Hj ÇH, CH, 1 2 9H2 çh2 ch3 CH, 1 ‘ ch2 ch2 ch3 çh2 9H2 CH, 1 * çh2 ch3 ch2 ch3
7. Uma composição caracterizada por esta compreender o LPS como o definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.
8. Uma composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o LPS compreender adicionalmente um antigénio.
9. Um método para produzir LPS como o definido em quaisquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por este método compreender a cultura de uma bactéria do género Neisseria ou Bordetella, em que a bactéria compreende uma mutação que elimina a expressão de um gene com mais do que 60% de homologia com a sequência que codifica o gene htrBl da figura 2.
10. Um método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a bactéria ser da espécie Neisseria meningitidis ou da espécie Neisseria gonorrhoae. 2
11. Um método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por a bactéria ser a estirpe H44/76 de Neisseria meningitidis e o gene ter a sequência de codificação da figura 2.
12. Um método de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 9 a 11, caracterizado por este adicionalmente compreender o isolamento e a purificação do lps. Lisboa, 14 de Dezembro de 2007. 3