DE69838460T3

DE69838460T3 - LPS mit reduzierter Toxizität von genetisch modifizierten Gram-Negativen Bakterien

Info

Publication number: DE69838460T3
Application number: DE69838460.1T
Authority: DE
Inventors: Peter van der Ley; Hendrik HAMSTRA; Liana STEEGHS
Original assignee: Nederlanden Staat; Nederlanden Welzijn Volksgezondheid en Cultuur Minister van
Current assignee: Nederlanden Staat; Nederlanden Welzijn Volksgezondheid en Cultuur Minister van
Priority date: 1998-11-03
Filing date: 1998-11-03
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2018-11-04
Also published as: EP1127137B1; JP3595264B2; EP1127137A1; WO2000026384A1; ES2294821T3; US6482807B1; DE69838460T2; PT1127137E; EP1870468A3; CA2348928A1; DK1127137T3; NZ511438A; ES2294821T5; CA2348928C; DK1127137T4; ATE373714T1; JP2002528558A; DE69838460D1; EP1127137B2; AU762369B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Impfstoffe, insbesondere auf die Bereitstellung neuartiger Verbindungen, die als Hilfsstoffe für Impfstoffe verwendet werden können. Es wurden zahlreiche Hilfsstoffe beschrieben, z. B. Mineralölemulsionen vom Freund-Typ, Aluminiumsalze, Saponine, Muramyldipeptid und dessen Derivate, MPL und MF59 usw. Zur Verabreichung an den Menschen wurden jedoch de facto nur einige wenige zugelassen. Dies ist allgemein Folge eines ungünstigen Verhältnisses von immunstimulierender Wirkung zu Toxizität. The Theory and Practical Application of Adjuvants (D. E. S. Stewart-Tull, Herausgeber John Wiley & Sons, 1995) bezieht sich allgemein auf Hilfsstoffe; auf die darin enthaltenen Informationen wird hierin Bezug genommen. Der Stand der Technik lehrt darüber hinaus für eine Reihe von Organismen, dass die enzymatische Behandlung des LPS zu einer reduzierten Toxizität führen kann. LPS, die laut Darstellung einer solchen Behandlung unterzogen worden sind, sind Salmonella typhimurium und Salmonella minnesota. Dies ist auch bei allen gramnegativen Bakterien und insbesondere Salmonella, Escherichia, Haemophilus, Moraxella, Campylobacter und Neisseria der Fall. Bezüglich des Nachweises einer adjuvanten Aktivität werden jedoch an keiner Stelle nähere Einzelheiten genannt.
Bei Durchsicht des Standes der Technik im Einzelnen wird deutlich, dass Munford et al. ( US-Patent 4,929,604 , erteilt 1990) S. typhimurium-LPS darstellen, bei dem 95% der sekundären Acylgruppen durch enzymatische Behandlung entfernt wurden. Die Munford-Behandlung kann nicht speziell sekundäre Acylketten entfernen, was nur eine teilweise Deacylierung gewährleistet. Das Munford-Verfahren kann kein einheitliches Produkt bereitstellen; bestenfalls werden annähernd alle sekundären Acylgruppen entfernt.
Es wird darauf hingewiesen, dass die adjuvante Aktivität Folge des Tests auf B-Zell-Mitogenität sein könnte. Der Test auf B-Zell-Mitogenität ist jedoch kein zuverlässiger Test für das Vorliegen adjuvanter Aktivität. Wahrscheinlich weist ein solches Produkt keine adjuvante Aktivität auf. Das Munford-Verfahren zeigt eigentlich nur die Entfernung sekundärer Acylketten aus dem nicht-reduzierenden Ende des LPS. Das entstandene Produkt enthält keine sekundäre Acylgruppe am reduzierenden Ende des LPS. Dem Munford-Produkt fehlen die sekundären Myristoyl- und Lauroylseitenketten. Das Munford-Verfahren kann nicht nur Myristoyl oder nur Lauroyl spezifisch entfernen. Das Munford-Verfahren kann nicht nur sekundäre Acylketten an einer speziellen Stelle entfernen. Das Munford-Verfahren kann, so heißt es, auch bei Escherichia, Haemophilus und Neisseria angewandt werden.
Es wird ein Salmonella-LPS mit einer Phosphatgruppe am nicht-reduzierenden Ende und einer am reduzierenden Ende dargestellt. Das Salmonella-LPS besitzt eine Myristoyl- und eine Lauroylgruppe am nicht-reduzierenden Ende. Das Salmonella-LPS besitzt keine sekundäre Acylgruppe am reduzierenden Ende.
Myers et al. ( US-Patent 4,912,094 ) entfernen unter kontrollierten Bedingungen nur den Beta-Hydroxymyristinsäurerest, der am reduzierenden Ende über eine Esterbindung mit dem Glucosamin an Position 3 verbunden ist, mittels alkalischer Hydrolyse. Somit wird ein Produkt beschrieben, bei dem eine der primären Acylketten chemisch entfernt wurde. Die Entfernung sekundärer Acylketten wird nicht erwähnt. Das entstandene Produkt ist angeblich weniger toxisch und behält seine Antigeneigenschaften. Diese Aussage basiert lediglich auf der reduzierten Mitogenität von MPL-A (säurehydrolysiert) im Vergleich zur B-Zell-Proliferation bei der deacylierten Version. Der Test auf B-Zell-Mitogenität ist jedoch kein zuverlässiger Test für das Vorliegen adjuvanter Aktivität. Als Beispiel werden Escherichia coli- und Salmonella minnesota-LPS angeführt. Biologische Aktivitätsdaten werden jedoch nur für das Salmonella minnesota-LPS angeführt. Es wird angegeben, dass das Verfahren für alle LPS anwendbar ist, dies aber nicht belegt.
Derselbe Erfindungsgegenstand wird auch in einem Artikel von Erwin et al. mit Munford als Mitautor diskutiert (1999). Ein Auszug aus dem Abstract des Artikels von Erwin: ”Diese Studien deuten darauf hin, dass der Beitrag sekundärer Acylketten zur Bioaktivität eines LPS nicht mit Gewissheit aus der berichteten Beziehung von Struktur und Aktivität von Lipid A oder aus dem Verhalten anderer deacylierter LPS vorausgesagt werden kann.”
An der Acyloxyacylierung von Lipid A beteiligte Gene sind im Stand der Technik bekannt. Jüngst wurden zwei spät in Funktion tretende Acyltransferasen der Lipid A-Biosynthese in Escherichia coli als Produkte der htrB- und msbB-Gene identifiziert (Clementz et al., 1996, 1997). Zuvor wurde beschrieben, dass das hrtB-Gen für das Wachstum auf reichen Medien bei mehr als 33°C und das msbB-Gen als Multicopy-Suppressor von htrB erforderlich ist. In der optimalen Reaktion wandelt HtrB Laurat in (KDO)2-Lipid-IVA um; danach kann MsbB Myristat addieren, um die Lipid A-Acylierung abzuschließen (1). Die durch die htrB- und msbB-Mutanten gebildeten vorherrschenden Produkte sind Tetra- bzw. Pentaacylspezies. Die Gene sind zu 27,5% identisch. Ein drittes Gen aus dieser Familie liegt ebenfalls in dem E. coli-Chromosom vor, doch seine Funktion in der Lipid A-Biosynthese muss noch geklärt werden.
Die WO97/25061 offenbart 1pxF(msbB)-Mutanten gramnegativer Bakterien ohne die Lipid A-Myristinsäureeinheit als Wirte für die Herstellung von Immunogenen oder heterologen Proteinen. Hones et al., 1998, J. Hum. Virol., 1: 251–256 zeigen, dass aus htrB- und msbB-Mutanten von E. coli isoliertes LPS die Fähigkeit zur Auslösung der Beta-Chemokin-Sezernierung ohne gleichzeitige Aktivierung pyrogener Zytokine beibehält.
Die Genomsequenz von Haemophilus influenzae enthält htrB- und msbB-Homologe. Die Mutation in htrB ist mit einer Modifikation der LPS-Phosphorylierung und -Acylierung assoziiert (Lee et al., 1995), was auf einen pleiotropen Effekt des Verlustes der Acyloxyacylketten auf die Dekoration der Oligosaccharidkette deutet. Eine Knockout-Mutation im htrB-Gen von H. influenzae reduzierte erwiesenermaßen die LPS-assoziierte Toxizität (Nichols et al., 1997).
Apicella (Mitautor des zitierten Dokuments von Lee et al.) et al. beschreiben in der WO97/19688 ebenfalls eine htrB-Knockout-Mutante. Sie beschrieben eine durch htrB-Mutation gewonnene Tetreaacylmutante von H. influenzae, wobei das mutierte LPS die Toxizität angeblich erheblich reduzierte, seine Antigenität jedoch beibehielt.
Um eine ähnliche Sequenz für Haemophilus zu finden, bediente man sich der Homologie der htrB-Sequenz von E. coli. Diese ähnliche Sequenz war zu 56% mit der htrB-Sequenz von E. coli identisch und ihr zu 73% ähnlich. Es wurden Mutanten von H. influenzae hergestellt und gezüchtet. Eine Analyse des mutierten Haemophilus-LPS zeigte eine Reduktion der Phosphoethanolamine (50% weniger, zwei im inneren Kern). Apicella zeigte außerdem eine Spezies – ein Mono- oder Diphosphorylpentaacyl-Lipid A von H. influenzae – der in etwa 10% eine der sekundären Acylketten (z. B. die Myristinsäureeinheit) fehlt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass in etwa 90% ein Tetraacyl vorlag. Daher entsteht bei dem Verfahren von Apicella ein Gemisch aus rekombinanten LPS-Strukturen von H. influenzae, bei dem der Großteil des Produkts keine sekundären Acylketten besitzt. In den Bakterizidtests von Apicella mit LOS-Präparaten wurden z. B. Rattenbabys und Chinchillas mit dem mutierten H. influenzae-Stamm immunisiert. Bei den Tests wurde LPS selbst als Immunogen eingesetzt; sie stellen eine adjuvante Aktivität weder dar noch weisen sie darauf hin. In den Tests von Apicella et al. wird die Immunreaktion auf LPS selbst dargestellt.
Darüber hinaus wird eine Salmonella-Mutante offenbart. Diese Mutante wurde analog zu dem Verfahren für H. influenzae gewonnen. Die Salmonella-Mutante stellt ein LPS bereit, bei dem die 3'-Substitution auf dem N-gebundenen C14 eine C16- und keine C12-Fettsäure ist. Diese Ausführungsform war um das Zehnfache weniger toxisch als der Wildtyp. Nähere Einzelheiten zur Antigenität dieser Substanz werden nicht angegeben.
Das Verfahren ist angeblich auch bei Neisseria, Moraxella und Campylobacter anwendbar. In Beispiel 6 schlägt Apicella z. B. die Durchführung analoger Schritte (wie bei H. influenzae) für Neisseria vor, stellt diese aber nicht dar; das Verfahren wurde eindeutig nicht durchgeführt. Bislang wurden weder Lehren bezüglich eines solchen Gens bei der Lipid A-Synthese von Neisseria noch Einzelheiten zu Tests, bei denen das Gen in diesem Stadium der Lipid A-Synthese von Neisseria beteiligt ist, bereitgestellt.
Das Dokument von Apicella aus dem Stand der Technik zeigt, dass eine Salmonella-Mutation im Gegensatz zu den Ergebnissen bei H. influenzae eine weitere Acyltransferase zu induzieren scheint und nicht zu einem Wegfall der sekundären Acylierung führt. Dies illustriert die Unvorhersagbarkeit der Ergebnisse bei der Mutation von Genen bei der Lipid A-Synthese verschiedener gramnegativer Organismen und stimmt mit der Lehre von Erwin und Munford überein.
Das Salmonella-Produkt ist ein Hepta- oder Hexaacyl, d. h. es besitzt dieselbe Anzahl sekundärer und primärer Acylketten wie die Nichtmutante. Das H. influenzae-Produkt ist zum Großteil (90%) frei von sekundären Acylketten, stellt aber ein Gemisch von Pentaacylstrukturen dar. Aktivitätsunterschiede bei den verschiedenen Strukturen lagen nicht vor bzw. wurden nicht angedeutet.
Die Lipid A-Struktur von Neisseria meningitidis wurde bereits 1992 von Kulshin et al. analysiert. Über den genetischen Aufbau von Neisseria bezüglich des Vorliegens oder Nichtvorliegens eines htrB-Gens oder dessen Identität ist jedoch nichts bekannt. Auch ist nicht bekannt, welchen Einfluss Mutationen eines solchen Gens, sollte ein solches gefunden werden, auf den entstandenen Mutantenstamm oder das entstandene Produkt haben könnten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben nach einer genetischen Sequenz gesucht, die an der sekundären Acylierung von LPS beteiligt ist, und sie identifiziert. Wir haben zwei unterschiedliche Sequenzen im Genom von Neisseria meningitidis gefunden. Auf der Basis u. a. dieser Informationen haben wir die Hypothese aufgestellt, dass zwei Acyloxyacyltransferasen existieren, die auf verschiedene Weise arbeiten können. Es könnte z. B. nur eine dieser Transferasen eine Addition analog zu dem Verfahren bei E. coli katalysieren, d. h. HtrB (1). Alternativ könnte ein einzelnes Enzym beide Acylierungen katalysieren, da Meningokokken-Lipid A eine symmetrische Struktur besitzt.
Wir nahmen daher Mutationen bei den Genen der Lipid A-Synthese von Neisseria meningitidis vor und stellten fest, dass die Mutantenstämme lebensfähig waren. Wir stellten außerdem fest, dass diese Stämme mutiertes LPS erzeugten. Dieses mutierte LPS wies eine reduzierte Toxizität auf. Eine Mutation des htrB2-Gens führte jedoch zu einem Produkt, das keine immunstimulatorische Aktivität mehr besaß. Sie führte zu einem Produkt, das in einem Impfstoff nicht nützlich wäre und nicht als Hilfsstoff in einem Impfstoff eingesetzt werden könnte.
Überraschenderweise stellten wir jedoch fest, dass Mutationen in dem htrB1-Gen von Neisseria meningitidis zu einem Produkt führten, dass sowohl weniger toxisch war als auch eine adjuvante Aktivität aufwies. Wir analysierten die Molekülstruktur der entstandenen Produkte und kamen zu dem Schluss, dass entsprechende Moleküle anderer gramnegativer Bakterien in analoger Weise nützlich sein könnten. Wir stellten fest, dass nicht nur die Toxizität, sondern auch die adjuvante Aktivität eng mit der Molekülstruktur im Zusammenhang stand. Die Zusammensetzung der sekundären Acyle war besonders relevant. Wir stellten darüber hinaus fest, dass das Phosphorylierungsmuster relevant war.
Daher stellen wir nun ein Verfahren zur spezifischen Herstellung weniger toxischer LPS-Derivate mit eindeutiger adjuvanter Aktivität bereit, wobei die Derivate eine Beschaffenheit, die aus dem Stand der Technik zuvor nicht erkennbar war, sowie Eigenschaften, die im Stand der Technik weder bekannt noch vorhersagbar waren, aufweisen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf neuartige, weniger toxische LPS-Formen, die durch genetisch modifizierte Neisseria erzeugt werden. Diese neuartigen LPS-Strukturen weisen eine adjuvante Aktivität auf.
Die neuartigen LPS-Strukturen sind definitionsgemäß rekombinante LPS mit einer reduzierten Anzahl sekundärer Acylketten pro LPS-Molekül im Vergleich zu dem entsprechenden nicht-modifizierten LPS-Molekül, wobei die sekundären Acylketten an die primären Acylketten gebunden sind, die primären Acylketten an das Glucosamin des rekombinanten LPS-Moleküls gebunden sind und das rekombinante LPS im Acylierungsmuster homogen ist. Im Gegensatz zum Stand der Technik, in dem chemisch modifiziertes LPS beschrieben ist, und dem gentechnisch hergestellten H. influenzae-LPS gemäß Apicella kann das erfindungsgemäße neuartige LPS so gewonnen werden, dass die Homogenität des Acylierungsmusters, insbesondere des sekundären Acylierungsmusters garantiert ist. Natürlich stellt dies bezüglich der Standardisierung, aber auch im Hinblick auf die Aktivitätsanalyse des entstandenen Expressionsproduktes eine bessere Basis für die Zugabe zu einem Impfstoff dar. Insbesondere ist ein erfindungsgemäßes geeignetes LP ein rekombinantes LPS-Molekül mit einem Lipid A, das die wie in Anspruch 1 dargestellte molekulare Struktur hat.
In einer alternativen geeigneten Ausführungsform besitzt das rekombinante LPS gemäß den zuvor genannten Ausführungsformen der Erfindung eine Phosphatgruppe an dem Glucosamin am nicht-reduzierenden Ende des LPS-Moleküls und eine Phosphatgruppe am Glucosamin am reduzierenden Endes des Moleküls pro rekombinantem LPS-Molekül. Neben der zuvor genannten Ausführungsform besteht eine weitere Ausführungsform der Erfindung aus einem rekombinanten LPS mit einer Phosphoethanolamingruppe pro rekombinantem LPS-Molekül. Ein mögliches erfindungsgemäßes LPS weist außerdem eine Phosphoethanolamingruppe pro rekombinantem LPS-Molekül auf. Ein rekombinantes LPS mit einer Phosphatgruppe am Glucosamin am nicht-reduzierenden Ende des LPS-Moleküls und einer Phosphatgruppe am Glucosamin am reduzierenden Ende des Moleküls pro rekombinantem LPS-Molekül, bei dem letztere Phosphatgruppe weiterhin an Phosphoethanolamin am reduzierenden Ende des Moleküls gebunden ist, stellt eine besonders geeignete Ausführungsform dar. Neisseria kann als Quelle für ein erfindungsgemäßes rekombinantes LPS dienen. Die Neisseria-Organismen sind besonders schädlich, und LPS aus solchen Bakterien sind bevorzugt. Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae sind zwei geeignete Kandidaten unter den Bakterien, die zur Gruppe der Bakterien gehören, die unter die Definition Neisseria fallen. In den Beispielen haben wir LPS des Neisseria meningitidis-Stammes H44/76 verwendet. Auf der Basis dieses Stammes hat sich die folgende LPS-Struktur als außerordentlich nützlich erwiesen:
Wie angegeben weist das erfindungsgemäße rekombinante LPS eine reduzierte Toxizität auf. Die reduzierte Toxizität lässt sich mittels herkömmlicher Toxizitätstests bestimmen; einige davon kommen in den Beispielen zum Einsatz, andere sind dem Fachmann bekannt. Ein rekombinantes LPS gemäß einer der Ausführungsformen der Erfindung weist im Vergleich zu dem entsprechenden nicht-modifizierten LPS eine reduzierte Toxizität auf. Eine andere Substanz, gegen die die reduzierte Toxizität getestet werden kann, ist MPL (sofern mit den entsprechenden Ansätzen getestet). Ein rekombinantes LPS gemäß einer der Ausführungsformen der Erfindung weist eine adjuvante Aktivität auf. Eine Substanz, mit der die adjuvante Aktivität verglichen werden kann, ist MPL (sofern mit den entsprechenden Ansätzen getestet). Die adjuvante Aktivität des erfindungsgemäßen rekombinanten LPS ist höher als die von MPL (sofern mit den entsprechenden Ansätzen getestet). Alternativ lässt sich die adjuvante Aktivität mit der von Rhodobacter sphaeroides-LPS vergleichen; sofern mit den entsprechenden Ansätzen getestet, weist das erfindungsgemäße LPS eine höhere adjuvante Aktivität auf. Eine weitere Möglichkeit, die adjuvante Aktivität des erfindungsgemäßen rekombinanten LPS zu testen, ist der Vergleich mit alkalisch hydrolysiertem Meningokokken-LPS. Die adjuvante Aktivität eines geeigneten erfindungsgemäßen rekombinanten LPS ist höher als die von alkalisch hydrolysiertem Meningokokken-LPS (sofern mit den entsprechenden Ansätzen getestet). Die adjuvante Aktivität lässt sich mit einem Antigen bestimmen, das gegen dieselbe Bakteriengruppe gerichtet ist, aus der das nicht-modifizierte LPS stammt. Die adjuvante Aktivität lässt sich auch mit einem Antigen bestimmen, das gegen einen Organismus gerichtet ist, der nicht zu der Bakteriengruppe, aus der das nicht-modifizierte LPS stammt, gehört. Die Beispiele stellen einen Test der adjuvanten Aktivität dar. Das erfindungsgemäße rekombinante LPS kann im Wesentlichen mittels Standardverfahren zur Isolierung von LPS aus Bakterienkulturen isoliert und gereinigt werden.
Der Gegenstand der Erfindung bezieht sich nicht nur auf das LPS selbst, wie es in den zuvor genannten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen rekombinanten LPS definiert ist, sondern auch auf eine Zusammensetzung aus einem solchen rekombinanten LPS. Eine solche Zusammensetzung kann eine Zusammensetzung zur Stimulation einer Immunreaktion sein. Insbesondere kann eine solche Zusammensetzung ein Impfstoff mit dem rekombinanten LPS als Wirkstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger sein. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung und insbesondere ein erfindungsgemäßer Impfstoff umfasst das rekombinante LPS als Hilfsstoff. Die Zusammensetzung dient vorzugsweise der Stimulation einer Immunreaktion auf ein gramnegatives Bakterium. Die Zusammensetzung kann zur Bekämpfung von Infektionen eingesetzt werden, die durch Organismen verursacht werden, die nicht denen entsprechen, aus denen das LPS, das dem rekombinanten LPS entspricht, stammt. Sie kann jedoch in geeigneter Weise zur Bekämpfung derselben Art von Organismen eingesetzt werden. Ein Neisseria-LPS kann in einem Impfstoff zum Einsatz kommen, der eine Neisseria-Infektion bekämpft, aber auch eine Bordetella-Infektion bekämpfen. Man geht auch davon aus, dass ein Impfstoff gegen Masern ein erfindungsgemäßes rekombinantes LPS als Hilfsstoff umfassen könnte. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann frei von anderen Hilfsstoffen sein. Insbesondere ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung, vorzugsweise ein Impfstoff, frei von den üblicherweise eingesetzten Hilfsstoffen im Handel erhältlicher Impfstoffe. Geeigneterweise ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung frei von folgenden Hilfsstoffen: Mineralölemulsionen vom Freund-Typ, Aluminiumsalzen, Saponinen, Muramyldipeptid und dessen Derivaten, MPL und MF59. Alternativ umfasst der erfindungsgemäße Impfstoff die üblicherweise verwendeten, im Handel erhältlichen Hilfsstoffe in geringerer Dosierung als derzeit bei im Handel erhältlichen Impfpräparaten üblich und weist daher eine geringere Toxizität als der entsprechende Impfstoff ohne das erfindungsgemäße LPS bei normaler Zusammensetzung und Menge an Hilfsstoff auf. Damit die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine immunstimulierende Wirkung besitzt und als Impfstoff nützlich ist, umfasst die Zusammensetzung zur Stimulation einer Immunreaktion zusätzlich zu dem Hilfsstoff vorzugsweise ein Antigen. Das Antigen ist geeigneterweise für die Stimulation einer Immunreaktion auf einen anderen Organismus als den, aus dem das LPS, das dem rekombinanten LPS entspricht, stammt, spezifisch. In einer Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Stimulation einer Immunreaktion zusätzlich zu dem Hilfsstoff ein Antigen, wobei das Antigen für die Stimulation einer Immunreaktion auf einen Organismus, der der Gruppe von Organismen entspricht, aus der das LPS, das dem rekombinanten LPS entspricht, stammt, spezifisch ist. Beispiele sind ein Neisseria-Antigen und ein erfindungsgemäßes rekombinantes Neisseria-LPS. Diese müssen nicht notwendigerweise, können aber die gleiche Spezies sein. Rekombinantes Neisseria meningitidis-LPS kann z. B. zusammen mit einem Neisseria meningitidis-Antigen vorliegen. Das LPS kann aber auch von Neissseria gonorrhoeae stammen. Geeigneterweise liegt die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einer medizinischen Dosierungsform, z. B. einer injizierbaren Dosierungsform vor. Vorzugsweise liegt die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einer systemisch akzeptablen Form vor. Der Hilfsstoff und weitere Antigene liegen in Mengen vor, die sich dazu eignen, eine immun-stimulatorische Reaktion beim Menschen oder Tier auszulösen. Sie liegen in einer nicht-toxischen oder tolerierbar toxischen Menge vor. Die Applikation des Impfstoffes führt vorzugsweise nicht zu Besorgnis erregenden Nebenwirkungen. Die Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines rekombinanten LPS gemäß einer der Ausführungsformen der Erfindung als Hilfsstoff in einer Zusammensetzung zur Stimulation einer Immunreaktion, insbesondere in einer Impfstoff-Formulierung. Die Erfindung deckt darüber hinaus ein Behandlungsverfahren zur Stimulation des Immunsystems eines Menschen oder Tieres durch Verabreichung von rekombinantem LPS oder einer dieses enthaltenden Zusammensetzung nach einer der Ausführungsformen, wie sie für eine erfindungsgemäße Zusammensetzung beschrieben wurden, in einer für eine Immunstimulation ausreichenden Dosis ab. Der Fachmann kann auf der Basis des Patienten und/oder der zu bekämpfenden Erkrankung oder Infektion entscheiden, welche Formulierungen und Dosierungen anzuwenden sind. Üblicherweise erhältliche Antigene und Impfstoffträger können analog wie bei bekannten Impfstoffen verwendet werden. Ein geeignetes Beispiel für einen Träger ist eine Pufferlösung. Das Verabreichungsverfahren kann jedes gängige Verfahren sein und z. B. parenteral (z. B. intravenös oder intramuskulär) oder oral (z. B. mit Hilfe von Typhusbakterienzellen zur Verkapselung der aktiven Substanz(en)) erfolgen.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßem rekombinantem LPS bereit. Das Verfahren umfasst die Kultivierung eines rekombinanten Neisseria-Bakteriums, wobei das rekombinante gramnegative Bakterium eine Mutation des Lipid A-Synthesewegs auf der Ebene der Addition sekundärer Acylketten an die primären Acylketten am Glucosamin des LPS-Moleküls und der anschließenden wahlweisen Isolierung und Reinigung des entstandenen LPS umfasst. Die Mutation ist insbesondere eine Mutation in einem Gen, das ein Enzym codiert, das mit der Addition des sekundären Acyls assoziiert ist. Wie zuvor offenbart steht eine Reihe von Synthesewegen für verschiedene gramnegative Bakterien im Stand der Technik zur Verfügung. Unter Verwendung der Daten aus dem Stand der Technik in Kombination mit dem hierin offenbarten Gegenstand der Erfindung lassen sich bei verschiedenen gramnegativen Organismen verschiedene Verfahren zur Bereitstellung eines erfindungsgemäßen rekombinanten LPS ermitteln. Unter Verwendung der Sequenzdaten für htrB für den Neisseria meningitidis-Stamm H44/76 lassen sich die entsprechenden Sequenzen in anderen Organismen, z. B. anderen Neisseria ermitteln. Die Einschleusung einer Mutation, die die Expression eines aktiven htrB1-Expressionsproduktes in einem solchen Organismus zum Erliegen bringt, gewährleistet die Erzeugung des gewünschten rekombinanten LPS. Lokalisation und Identifikation des htrB1-Gens sind im Detail in den Beispielen für den Neisseria meningitidis-Stamm H44/76 angegeben. Die erzeugten Sequenzdaten können auf andere Stämme extrapoliert werden. Bei Verwendung der verfügbaren Sequenzdaten und der Homologie der in dem Beispiel eingesetzten Sonde oder bei Verwendung einer anderen Sonde auf der Basis der gesamten oder teilweisen htrB1-Codiersequenz des Neisseria meningitidis-Stammes H44/76 können sich Hinweise auf alternative htrB-Sequenzen in anderen Organismen ergeben. Darüber hinaus hat sich herausgestellt, dass htrB1 bei den Neisseria-Organismen dem ruvc-Gen nachgeschaltet ist, so dass sich jede Gensequenz, die einer ruvc-Sequenz nachgeschaltetes htr codiert, als Ort für die Einschleusung einer Mutation eignet. Jede Gensequenz, die eine mehr als 60% Homologie mit der Codiersequenz von 2 in einem gramnegativen Organismus der Gattung Neisseria aufweist, ist ein potentieller Ort für die Mutation zur Erzeugung des erfindungsgemäßen rekombinanten LPS. Je näher die Homologie über einen Abschnitt von mindestens 500 bp und vorzugsweise über die gesamte Länge der Codiersequenz 100% kommt, umso besser. Alternativ oder in Kombination kann man eine Codiersequenz derselben oder einer ähnlichen Aminosäuresequenz suchen und die entsprechende Sequenz mutieren, so dass kein aktives Expressionsprodukt erzeugt wird. Geeigneterweise ist die Sequenz einer ruvc-Sequenz nachgeschaltet. Vorzugsweise ist die Mutation der Wahl eine Mutation in einem Gen, das ein Enzym codiert, das mit der Addition von sekundärem Acyl an primäre Acylketten am reduzierenden Ende des LPS assoziiert ist. Wie aus den Beispielen hervorgeht, kann es sich dabei geeigneterweise um eine Mutation in einem Gen handeln, das ein Enzym codiert, das mit der Addition von sekundärem Lauroyl assoziiert ist. Eine spezielle geeignete Mutation liegt in einem Gen vor, das ein Enzym codiert, das mit der Addition sekundärer Acylketten an die primäre Acylkette an der 2'-Position des Glucosamins am nicht-reduzierenden Ende des LPS-Moleküls assoziiert ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das rekombinante LPS so isoliert und gereinigt, dass es frei von jeglicher anderen LPS-Form ist. Bei einem Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffes wird das LPS für die exakte Formulierung des Impfstoffes vorzugsweise zunächst isoliert. Geeigneterweise besteht ein erfindungsgemäßes Verfahren in der Bereitstellung eines rekombinanten LPS mit einer reduzierten Anzahl sekundärer Lauroylketten pro rekombinantem LPS-Molekül im Vergleich zu dem nicht-modifizierten LPS, wobei das rekombinante LPS so isoliert und gereinigt wird, dass es frei von jeglicher anderen LPS-Form ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein rekombinantes LPS mit einer reduzierten Anzahl sekundärer Lauroylketten am nicht-reduzierenden Ende des rekombinanten LPS-Moleküls pro rekombinantem LPS-Molekül im Vergleich zu dem nicht-modifizierten LPS bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein rekombinantes LPS mit mindestens einer sekundären Lauroylkette an der primären Acylkette am nicht-reduzierenden Ende des LPS-Moleküls pro rekombinantem LPS-Molekül bereitgestellt. Geeigneterweise kann die Mutation in einem solchen Verfahren dergestalt sein, dass das rekombinante LPS eine sekundäre Acylkette an der primären Acylkette an der 2-Position des Glucosamins am reduzierenden Ende des LPS-Moleküls pro rekombinantem LPS besitzt. Geeigneterweise ist die sekundäre Acylkette eine sekundäre Lauroylkette. Bei einem bevorzugten Verfahren führt ein Mutationsprozess zu einem erfindungsgemäßen rekombinanten LPS mit insgesamt 5 Acylketten pro rekombinantem LPS-Molekül. Ein alternatives erfindungsgemäßes Verfahren besteht in der Erzeugung eines rekombinanten LPS mit einer Phosphatgruppe am Glucosamin am nicht-reduzierenden Ende des LPS-Moleküls und einer Phosphatgruppe am Glucosamin am reduzierenden Ende des Moleküls pro rekombinantem LPS-Molekül. Geeigneterweise wird das LPS-Produkt so isoliert und gereinigt, dass es frei von jeglicher anderen LPS-Form ist. Alternativ kann das Verfahren die Erzeugung eines rekombinanten LPS mit einer Phosphoethanolamingruppe pro rekombinantem LPS-Molekül umfassen, das geeigneterweise so isoliert und gereinigt wird, dass es frei von jeglicher anderen LPS-Form ist.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, bei dem ein rekombinantes LPS mit einer Phosphatgruppe am Glucosamin am nicht-reduzierenden Ende des LPS-Moleküls und einer Phosphatgruppe am Glucosamin am reduzierenden Ende des Moleküls pro rekombinantem LPS-Molekül – wobei letztere weiterhin an das Phosphoethanolamin am reduzierenden Ende des Moleküls gebunden ist – erzeugt und vorzugsweise so isoliert und gereinigt wird, dass es frei von jeglicher anderen LPS-Form ist.
Die Erfindung wird weiterhin mittels der Beispiele veranschaulicht, die nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung gelten sollen. Das LPS und seine erfindungsgemäßen Verwendungszwecke sind für den Fachmann auf der Basis der in den Ansprüchen, der Beschreibung und den Figuren dargelegten Informationen in Kombination mit gängigem Allgemeinwissen auf dem Gebiet der Gentechnik, insbesondere dem Gebiet der gramnegativen Bakterien und der Impfstoffproduktion offensichtlich. Werden Verfahren oder Prozesse zur Isolierung und Reinigung erwähnt, handelt es sich dabei um im Stand der Technik übliche Verfahren, die zu anderen bekannten Verfahren analog sind. Dasselbe gilt für die Einschleusung einer Mutation in das htrB1-Gen. Diese kann mittels Insertion, Deletion oder Substitution auf eine an sich bekannte Weise erfolgen, sobald eine zu mutierende DNA-Sequenz der Wahl in einem Organismus lokalisiert worden ist. Das Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffes und seiner Verabreichung umfasst ebenfalls gängige Vorgehensweisen und bedarf keiner weiteren Erläuterung.
Die verwendeten Begriffe sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt und stammen aus allgemeinen Lehrbüchern über Gentechnik, gramnegative Bakterien und Immunologie und/oder aus den zitierten Literaturstellen.
BEISPIEL 1
Erzeugung der Neisseria meningitidis-htrB1-Mutante mit verändertem Lipid A
Unter Verwendung der htrB/msbB-Gensequenzen von Escherichia coli und Haemophilus influenzae führten wir eine BLAST-Suche nach den von der Universität von Oklahoma im Internet bereitgestellten Gonokokkengenomsequenzen durch. Es wurden verschiedene Contigs mit signifikanter Homologie identifiziert und basierend auf diesen Sequenzen PCR-Primer entwickelt. Die Primer pr447-2 und pr670-1 ergaben unter Verwendung von chromosomaler Meningokokken-DNA als Matrize ein ca. 500 bp großes PCR-Produkt, das sich bei der Klonierung in dem Vektor pCRII und der Sequenzierung als homolog zu den htrB/msbB-Sequenzen verschiedener Bakterienspezies (33% bzw. 31% für die E. coli-Gene) erwies. Dieses Fragment wurde als Sonde zur Isolierung eines größeren Chromosomenfragmentes mit dem vollständigen htrB1-Gen von Neisseria meningitidis verwendet (2). Diesem Gen unmittelbar vorgeschaltet wurde ein offenes Leseraster mit Homologie zum ruvC-Gen aus E. coli gefunden, das wahrscheinlich an der DNA-Reparatur und -Rekombination, nicht aber der LPS-Biosynthese beteiligt ist.
In die BblI-Site in dem klonierten htrB1-PCR-Produkt wurde eine Kanamycinresistenzkassette inseriert und das entstandene Konstrukt (Plasmid pBSNK6, das ebenfalls die Neisseria-Aufnahmesequenz enthält) verwendet, um den Meningokokkenstamm H44/76 kanamycinresistent zu machen. Mittels PCR wurde verifiziert, dass ein korrekter Allelaustausch mit dem chromosomalen htrB1-Gen erfolgt war. Alle so erhaltenen Transformanten wiesen bei Analyse mittels Tricin-SDS-PAGE und anschließender Silberfärbung eine erhöhte Mobilität ihres LPS auf (3).
Die Bindung monoklonaler, für den Oligosaccharidanteil des Meningokokken-LPS spezifischer Antikörper war durch die Mutation nicht beeinträchtigt, was darauf deutet, dass wohl nur der Lipid A-Anteil verändert worden ist.
BEISPIEL 2
Strukturanalyse von htrB1-mutiertem Lipid A
Die Fettsäureanalyse mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie ganzer Zellen zeigte ein reduziertes Verhältnis von C12:0/C12:0 3-OH in der htrB1-Mutante im Vergleich zu dem Wildtyp-Elternstamm, was auf einen (teilweisen) Verlust der sekundären C12:0-Acylkette(n) deutet. LPS aus dieser Mutante wurde mittels Extraktion mit heißem Phenol/Wasser gereinigt und die Lipid A-Fraktion nach Säurehydrolyse und Extraktion mit Chloroform/Methanol gewonnen. Seine Struktur wurde anschließend mittels Tandem-Massenspektrometrie untersucht.
Die Analyse zeigte eine größere Pentaacylspezies, in der die C12:0-Acyloxyacylkette am nicht-reduzierenden Ende des Moleküls fehlte (4).
Ein weiterer Unterschied zum Elternstamm findet sich im Phosphorylierungsmuster am reduzierenden Ende des Disaccharids, in dem eine zusätzliche Phosphatgruppe vorliegt. Dieses mutierte Lipid A-Molekül besitzt eine einzigartige Struktur, die sich in keiner der zuvor für andere gramnegative Bakterien beschriebenen Mutanten findet.
BEISPIEL 3
Biologische Aktivität des htrB1-mutierten LPS
Ganze Zellen aus dem htrB1-Mutantenstamm wurden mittels LAL- und TNFα-Induktionstests (LAL = Limulus-Amöbozytenlysat, TNFα = Tumornekrosefaktor-α) auf ihre LPS-assoziierte biologische Aktivität hin getestet. In dem LAL-Test wurde eine um das 7-Fache reduzierte Aktivität bei ganzen Zellen aus der Mutante im Vergleich zu dem Wildtyp beobachtet. Bei der TNFα-Induktion durch MM6-Zellen zeigten htrB1-Bakterienzellen eine um mindestens das 100-Fache reduzierte Aktivität im Vergleich zu dem Wildtyp, ähnlich der zuvor bei ganzen Zellen einer vollständig LPS-freien Mutante gefundenen Reduktion (5) (L. Steeghs et al., 1998).
Die Immunisierung von Mäusen mit aus der LPS-freien Meningokokkenmutante isolierten Außenmembrankomplexen diente dem Vergleich der adjuvanten Aktivität verschiedener LPS-Präparate. Die Antikörperreaktion wurde mittels Ganzzell-ELISA und Bakterizidtests gegen den Elternstamm H44/76 gemessen.
Die Immunogenität der wichtigsten Außenmembranproteine wurde mittels Wildtyp- und htrB1-mutierter LPS, jedoch weniger durch die atoxischen LPS-Spezies Monophosphoryl-Lipid A (MPL), Rhodobacter sphaeroides-LPS und alkalisch hydrolysiertes Meningokokken-LPS wieder auf ein normales Maß gebracht (6) (Nakano M. und Matsuura M.). Daher behielt das htrB1-mutierte LPS seine adjuvante Aktivität trotz reduzierter Toxizität bei.
BEISPIEL 4
Eigenschaften des htrB2-mutierten Lipid A
Es wurde in ähnlicher Weise wie in den vorangegangenen Beispielen bei htrB1 ein weiteres Gen mit Homologie zu htrB/msbB von E. coli und H. influenzae identifiziert und deaktiviert. Im Gegensatz zu htrB1 besitzt das LPS dieser Mutante (htrB2) jedoch eine stark reduzierte adjuvante Aktivität sowie eine reduzierte Toxizität (6).
Ebenfalls im Gegensatz zu htrB1 konnte diese Mutation nicht in den Stamm H44/76 mit Wildtyp-LPS eingeschleust werden, sondern nur in ein galE-Derivat mit einer galactosefreien, trunkierten Oligosaccharidkette.
VERFAHREN
Bakterienstämme und Plasmide
Die E. coli-Stämme NM522 und INVaF' wurden auf einem LB-Medium bei 37°C gezüchtet. Der N. meningitidis-Stamm H44/76 und seine Derivate wurden bei 37°C auf einem GC-Basismedium (Difco), ergänzt mit IsoVitaleX (Becton Dickinson), in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO₂ oder in einem flüssigen Medium wie zuvor beschrieben (van der Ley et al., 1993) gezüchtet. Zur Selektion von Meningokokken-Transformanten (van der Ley et al., 1996) wurde Kanamycin in einer Konzentration von 75–100 mg/ml verwendet. Bei E. coli wurden Antibiotika in den folgenden Konzentrationen verwendet: Ampicillin 100 mg/ml, Kanamycin 100 mg/ml.
Zur Klonierung der PCR-Fragmente wurde das TA-Klonier-Kit mit dem Vektor pCRII (Invitrogen) verwendet.
Rekombinante DNA-Techniken
Die meisten rekombinanten DNA-Techniken entsprachen der Beschreibung in Sambrook et al. (1989). Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des pLASmix-Kits (Talent) isoliert. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgte auf einem GeneAmp-PCR-System 9600 von Perkin Elmer mit Taq-Polymerase. Die Sequenzanalyse erfolgte mit Hilfe einer automatischen Sequenziervorrichtung von Applied Biosystems auf doppelsträngigen Plasmid-DNA-Matrizen (mit Qiagen-Säulen isoliert) nach einem Cycle-Sequencing-Protocol.
LPS-Analyse
Die Gelelektrophorese mit Tricin-Natriumdodecylsulphatpolyacrylamid erfolgte in 4% Sammelgel und 16% Trenngel wie von Lesse et al. (1990) beschrieben. Als Proben dienten mit Proteinase K behandelte, gekochte Bakterienzellen. Die Gele ließ man 17 Stunden lang bei einem konstanten Strom von 20 mA laufen; sie wurden nach dem Verfahren von Tsai und Frasch (1982) silber-gefärbt. Der chromogene LAL-Test auf Endotoxinaktivität erfolgte mittels des QCL-Kits von BioWhittaker Inc. (Walkersville, MD, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Übernacht-Kulturen wurden in Meningokokken-Medium auf eine optische Dichte (OD) von 0,1 bei 620 nm verdünnt; als Proben wurden in dem LAL-Test Serienverdünnungen dieser Stammlösungen verwendet. Die TNFα-Induktion durch Bakteriensuspensionen wurde mit der Humanmakrophagen-Zelllinie MM6 getestet und mittels der TNFα-empfindlichen Zelllinie WEHI 164 (Espevik und Nissen, 1986) aus Kulturüberständen quantifiziert. Für die Fettsäureanalyse mittels GC-MS wurden OMC-Proben 3 Stunden lang bei 900°C in Pyridin und Essigsäureanhydrid acetyliert, um das LPS vollständig aufzulösen. Anschließend wurden die Proben 3 Stunden lang bei 650°C in Tetrahydrofuran in Gegenwart von LiAlH₄ erwärmt, um die O-gebundenen Fettsäuren zu freien Alkoholen zu reduzieren. Diese wurden 1 Stunde lang bei 600°C mit BSTFA + 1% TMCS in Pyridin zu TMS-Ethern derivatisiert und mittels GC-MS auf einem Autospec (Micromass, Manchester, UK) im Elektronenstoßmodus analysiert. Die Menge von 3-OH C12 in den Proben wurde mittels 2-OH C12 als internem Standard quantifiziert. Das LPS wurde nach dem Extraktionsverfahren mit heißem Phenol/Wasser isoliert (Westphal und Jann, 1965). Zur Isolierung von Lipid A wurde das LPS einer leichten Säurehydrolyse (1% Essigsäure, 2,5 Stunden, 1000°C) und anschließend einer Ausfällung und abschließenden Fraktionierung in Chloroform-Methanol-Wasser unterzogen. Die Strukturanalyse des gereinigten Lipid A erfolgte mittels Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie. Die Massenspektrometrie wurde auf einer Quadrupol-Ionenfalle (LCQ Finnigan Corp., San Jose, USA) mit einer Nanoelektrospray-Ionenquelle (600 V) durchgeführt. Die Temperatur der Einlasskapillare war auf 200°C eingestellt, die Höchstanzahl Ionen in der Falle auf 1,0 × 10⁷ und die maximale Injektionsdauer auf 150 ms. Die Nanoelektrospray-Nadeln wurden mit 2 Mikrolitern Probenlösung gefüllt. Über einen Bereich von 150–1850 amu wurden vollständige MS-Spektren aufgezeichnet. Den vollständigen MS(n)-Spektren ging stets ein Zoom-Scan des Mutterions zur genaueren Bestimmung des m/z-Verhältnisses des Mutterions sowie zur Ermittlung seines Ladungsstatus voraus. Die MS/MS-Spektren wurden mit einem Fenster für die Mutterionenauswahl von 3 amu aufgezeichnet. Die Anregungsenergie wurde so eingestellt, dass das Intensitätsverhältnis des Basispeaks zu dem Mutterion zwischen 5 und 20 lag. Abgesehen von den Zoom-Scans wurden die Spektren im Massenmittelpunkt-Modus aufgezeichnet.
Charakterisierung der OMC-Zusammensetzung
Die Bindung von mAbs, die für OMP der Klasse 1, 3 und 4 sowie den Oligosaccharidanteil des Immunotyp L3-LPS spezifisch sind, wurden in einem Ganzzell-ELISA (van der Ley et al., 1995, 1996) getestet. Die Isolierung von OMC mittels Sarkosylextraktion sowie die Analyse mittels SDS-PAGE erfolgten wie zuvor beschrieben (van der Ley et al., 1993).
Immunisierung von Mäusen
Sechs bis acht Wochen alte BalB/C-Mäuse – jeweils fünf pro Gruppe – wurden an Tag 0 mit 20 Mikrogramm LPS-freiem, mit Hilfsstoff ergänztem und in 0,5 ml PBS gelöstem H44/76-OMC subkutan immunisiert. An den Tagen 14 und 28 wurde die Immunisierung wiederholt; an Tag 42 wurde den Mäusen Blut abgenommen. Die Seren wurden gesammelt und bei 4°C aufbewahrt. Die Bakterizidaktivität des Serums gegen den Stamm H44/76 wurde mittels einer Endkonzentration von 20% Kaninchenkomplement wie bei Hoogerhout et al. (1995) beschrieben getestet. Der Bakterizidtiter wurde als reziproke Serumverdünnung gemessen und zeigte eine Abtötung von mehr als 90%.
LITERATUR

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Hoogerhout, P., Donders, E. M. L. M., van Gaans-van den Brink, J. A. M., Kuipers, B., Brugghe, H. F., van Unen, L. M. A., Timmermans, H. A. M., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M., Peeters, C. C. A. M., Wiertz, E. J. H. J. und Poolman, J. T. Conjugates of synthetic cyclic peptides elicit bactericidal antibodies against a conformational epitope on a class 1 outer membrane protein of Neisseria menigitidis. Infect. Immun. 63 (1995) 3473–3478.
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Westphal, O. und Jann, J. K.: Bacterial lipopolysaccharide extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5 (1965) 83–91.

LEGENDEN DER FIGUREN
1. Rolle der htrB- und msbB-Genprodukte in der Lipid A-Biosynthese bei Escherichia coli
2. Organisation (A) und Sequenz (B) des htrB1-Gens von Neisseria meningitidis
3. Tricin-SDS-PAGE-Analyse des LPS des H44/76-Wildtyps und kanamycinresistenter, mit Plasmid pBSNK6 gewonnener Transformanten
4. Strukturanalyse von Lipid A des H44/76-Wildtyps (A) und der htrB1-Mutante (B) mittels Massenspektrometrie
5. TNFα-Induktion in MM6-Zellen durch ganze Bakterien des Stammes H44/76, die htrB1-Mutante und den LPS-freien Stamm pLAK33
6. Vergleich der adjuvanten Aktivität verschiedener LPS-Präparate bei Verwendung zur Immunisierung von Mäusen zusammen mit LPS-freien OMCs
Fig. 1:

UDP-GlcNac + R-3-Hydroxymyristoyl-ACP
7 Enzyme
HtrB (schnell)
MsbB (langsam)
rfa- und rfb-Genprodukte

Fig. 2a:

PCR-Produkt

Fig. 2b(1):

htrB1-Sequenz, Primer 670-1, Ende ruvC-Gen, Beginn htrB1-Gen

Fig. 2b(2):

Primer 447-2, Ende htrB1-Gen

Fig. 5:

Durch ganze Zellen induzierte TNFα-Produktion

Fig. 6:

Mittlerer ELISA-Titer und Bakterizidtesttiter, Log-Titer, Hilfsstoff

Claims

LPS mit einem Lipid A, das die folgende molekulare Struktur besitzt:
Zusammensetzung, die ein wie in Anspruch 1 definiertes LPS umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die zusätzlich zum LPS ein Antigen enthält.
Verfahren zum Herstellen eines wie in Anspruch 1 definierten LPS, wobei das Verfahren umfasst, ein Bakterium der Gattung Neisseria zu züchten, wobei das Bakterium eine Mutation umfasst, welche die Expression eines Gens ausschaltet, das mehr als 60% Homologie mit der Codiersequenz des htrB1-Gens von 2 besitzt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Bakterium von der Art Neisseria meningitidis oder Neisseria gonorrhoeae ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Bakterium der Neisseria meningitidis-Stamm H44/76 ist und wobei das Gen die Codiersequenz von 2 hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4–6, das darüber hinaus eine Isolierung und Reinigung des LPS umfasst.