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Die vorliegende Erfindung betrifft
genetisch modifizierte Pasteurella-haemolytica-Mikroorganismen, die für eine Verwendung
als Lebendimpfstoffe geeignet sind. Die vorliegende Erfindung betrifft
auch die Verwendung modifizierter Mikroorganismen als biologische
Vektoren. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Impfstoffzusammensetzungeri.
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Der Bovine Respiratorische Krankheitskomplex
(„bovine
respiratory disease complex",
BRD), die Rinderseuche oder Lungenpasteurellose ist eine multifaktorielle
Erkrankung, bei der eine Kombination aus einer Virusinfektion, ungünstigen
Umgebungsbedingungen und einem schlechten Immunstatus dazu führen kann, dass
Tiere für
bakterielle Infektionen prädisponiert
sind. Der BRD ist eine Hauptursache für wirtschaftliche Verluste
in der Rinder-Mastweidenindustrie.
Der prinzipielle Mikroorganismus, der mit der Krankheit assoziiert
ist, ist das Bakterium Pasteurella haemolytica mit dem Serotyp 1
(Schiefer et al., 1978). Unter normalen Bedingungen ist P. haemolytica
eine Komponente der normalen Flora des oberen Atemtraktes, und nur,
wenn die Mechanismen der Lungenclearance beeinträchtigt sind, kommt es zu einer
Besiedelung der Lunge, was zur Krankheit führt (Frank und Smith, 1983).
Es sind verschiedene Virulenzfaktoren mit P. haemolytica assoziiert worden,
einschließlich
von Oberflächenstrukturen
wie dem kapsulären
Polysaccharid (Adam et al. 1984) und eines sekretierten Exotoxins,
das hitzelabil und spezifisch für
Wiederkäuer-Leukozyten
ist (Shewen und Wilkie, 1982).
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Das Exotoxin oder Leukotoxin (Lkt)
kann zur Krankheitsentstehung beitragen, indem es die primären Abwehrmechanismen
der Lunge und sich anschließende
Immunreaktionen beeinträchtigt,
oder indem es als Ergebnis einer Leukozytenlyse eine Entzündung verursacht.
Die Charakterisierung des Lkt hat gezeigt, dass es ein Mitglied
der RTX-Familie von Toxinen ist (Strathdee und Lo, 1989), die von
verschiedenen Bakterien erzeugt werden, einschließlich von
Actinobacillus spp, Proteus vulgaris, Morganella morganii und Bordetella pertussis,
und die am besten charakterisierten werden von E. coli erzeugt.
Alle RTX-Toxine wirken, indem sie Poren in den Zielzellen erzeugen,
wodurch sie das osmotische Gleichgewicht stören und zu einem Platzen der Zielzelle
führen.
Der Wirkungsmechanismus der RTX-Toxine ist zwar identisch, aber
ihre Zielzellen unterscheiden sich bezüglich des Typs und der Spezifität hinsichtlich
der verschiedenen Spezies beträchtlich.
Bezüglich ihrer
Struktur ist diese Familie von Toxinen durch das Vorliegen von glycinreichen
Repeat-Strukturen innerhalb des Toxins, die Calcium binden und eine
Rolle bei der Erkennung der Zielzelle und der Bindung spielen könnten, einen
Bereich hydrophober Domänen,
die in die Porenbildung involviert sind, die Abhängigkeit von einer posttranslationalen
Aktivierung und die Abhängigkeit
von einer C-terminalen Signalsequenz für die Sekretion charakterisiert.
Die Produktion und Sekretion eines aktiven RTX-Toxins erfordert
die Aktivität
von wenigstens vier Genen, C, A, B und D. Das A-Gen codiert für die Toxinstruktur,
das C-Gen codiert für
einen posttranslationalen Aktivator, und die B- und D-Gene codieren
für Proteine,
die für
die Sekretion des aktiven Toxins erforderlich sind. Das Lkt wird
von einem Operon codiert, das aus den vier zusammenhängenden
Genen (CABD) besteht, die von nur einem Promotor transkribiert werden.
Das Lkt unterscheidet sich von einer Anzahl anderer RTX-Toxine,
die eine breite Wirfszellspezifität zeigen, dadurch, dass es
eine Zielzellspezifität
aufweist, die auf Wiederkäuer-Leukozyten
beschränkt
ist (Übersicht
siehe Coote, 1992).
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Das Lkt wurde auch mit einer schützenden
Immunität
in Verbindung gebracht, mit Antikörpern gegen das Toxin auf dem
Gebiet der Resistenz gegenüber
der Krankheit und mit einem kommerziellen Impfstoff aus einem Kulturüberstand
(Presponse, Langford Inc., Guelph, Ontario, Kanada), der Lkt enthält und eine
Wirksamkeit bezüglich
der Verminderung der Inzidenz und der Schwere der Lungenentzündung nach
einem experimentellen Challenge und auf der Mastweide (Gentry et
al., 1985; Mosier et al., 1986, 1989; Shewen und Wilkie, 1987; Shewen
et al., 1988). Dieser Impfstoff aus dem Kulturüberstand induziert nicht nur
Antikörper
gegen Lkt, sondern stimuliert auch eine Immunreaktion gegen andere
lösliche
Antigene, die im Kulturüberstand
vorhanden sind, und deshalb kann eine direkte Korrelation zwischen
den Antikörpern
gegen Lkt und einem Schutz nicht beansprucht werden.
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Der Einsatz von Pasteurella-Bacterinen
(inaktiven Impfstoffen) im Feld hatte bezüglich der Kontrolle der Lungenpasteurellose
nur einen begrenzten Erfolg; in verschiedenen Feldversuchen hat
die Verabreichung eines Impfstoffes auf Bacterin-Basis nicht gegen
die Erkrankung geschützt,
oder sie hat in einigen Fällen
zu einer Verstärkung
der Erkrankung geführt
(Bennett, 1982; Morter of al., 1982). Bacterin-Impfstoffe haben
auch die Nachteile, dass Adjuvanzien benötigt werden, dass sie zu Nebenwirkungen
führen
können
und dass in einigen Fällen
eine Mehrfachdosierung erforderlich ist, damit ein Schutz erhalten
wird.
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Cruz et al. (Molecular Microbiology
4, 1933–1939
(1990)) beschreiben die Wirkung von Deletionen im klonierten Lkt-A-Gen
von Pasteurella haemolytica auf die Funktion des Pasteurella-Leukotoxins.
Guthmiller et al. (Microbial Pathogenesis 18, 307–321 (1995))
beschreiben die Wirkung von Mutationen in den Lkt-B- und Lkt-D-Toxin-Genen
auf das Leukotoxin von Actinobacillus actinomycetemcomitans.
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Es ist ein Ziel der vorliegenden
Erfindung, ein Problem oder mehrere Probleme des derzeitigen Standes
der Technik zu verkleinern.
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Dementsprechend stellt die vorliegende
Erfindung einen modifizierten Mikroorganismus bereit, der ein Lkt-Toxin
erzeugt, wobei das genannte Lkt-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert
ist.
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Der Begriff „modifiziert" schließt eine
Modifikation über
gentechnologische Verfahren oder über andere Techniken ein, wie
eine chemisch oder mittels Strahlung induzierte Mutagenese. Wenn
die gentechnologischen Verfahren die Einführung fremder DNA in Wirtszellen
beinhalten, dann kann die DNA mittels jedes beliebigen geeigneten
Verfahrens eingeführt
werden. Zu geeigneten Verfahren gehören die Transformation kompetenter
Zellen, die Transduktion, die Konjugation und die Elektroporation.
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In der vorliegenden Erfindung wird
ein modifizierter Mikroorganismus mit einem Lkt-Toxin-Operon bereit gestellt,
das ein Lkt-Strukturgen enthält,
wobei der posttranslationale Aktivator teilweise oder vollständig inaktiviert
ist.
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Der Begriff „Lkt-Toxin-Operon" soll, so wie er
hier in den Ansprüchen
und in der Beschreibung verwendet wird, diejenigen Gene einschließen, die
in die Expression eines Lkt-Toxins, das ein Produkt des Lkt-Toxin-Operons
ist, involviert sind. Die Gene, die im Lkt-Toxin-Operon enthalten
sind, umfassen das Gen des posttranslationalen Aktivators (C) das
Strukturgen (A) und die B- und
D-Gene, die für
Proteine codieren, die für
die Sekretion des aktivierten Lkt-Toxins erforderlich sind.
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Der Begriff „teilweise oder vollständig inaktiviert" schließt, so wie
er hier in den Ansprüchen
und in der Beschreibung verwendet wird, die Modifikation eines Gens über gentechnologische
Verfahren ein, einschließlich
einer Einführung
und einer Deletion von DNA des Gens, einschließlich einfacher oder mehrfacher
Nucleotidsubstitutionen, -additionen und/oder -deletionen, einschließlich einer
vollständigen
oder teilweisen Deletion des Gens unter Einsatz eines Zielkonstrukts
oder einer Plasmidsegregation sowie einer chemisch induzierten oder
durch Strahlung induzierten oder ortsgerichteten Mutagenese.
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Die Anmelder der vorliegenden Erfindung
haben gefunden, dass ein Vorläufer
des Lkt-Toxins eine verminderte toxische Aktivität aufweist. Überraschenderweise
haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung auch gefunden, dass
der Vorläufer
des Lkt-Toxins imstande ist, in einem Tier eine Immunreaktion zu
induzieren, die einen Schutz vor einem heterologen Challenge mit
einem Mikroorganismus bietet, der das Lkt-Toxin bildet.
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Dementsprechend ist bei einer bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung das inaktivierte Lkt-Toxin ein Vorläufer des Lkt-Toxins. Der Vorläufer kann
ein nichtprozessiertes Expressionsprodukt des Lkt-Strukturgens sein.
Das Lkt-Strukturgen kann das Lkt-A-Gen sein.
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Die Anmelder der vorliegenden Erfindung
haben gefunden, dass ein Mikroorganismus, der natürlicherweise
ein Lkt-Toxin erzeugt, genetisch so verändert werden kann, dass er
einen inaktiven Vorläufer
des Lkt-Toxins erzeugt, indem der posttranslationale Aktivator des
Vorläuferprodukts
eliminiert wird. Dementsprechend ist der Mikroorganismus nicht imstande,
einen posttranslationalen Aktivator des Vorläufers des Lkt-Toxins zu erzeugen,
oder er erzeugt einen inaktivierten posttranslationalen Aktivator
des Vorläufers
des Lkt-Toxins. Der posttranslationale Aktivator kann ein Produkt
des Lkt-C-Gens sein.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Lkt-C-Gen des Mikroorganismus inaktiviert oder teilweise
oder vollständig
deletiert. Das Lkt-C-Gen kann über
eine ortsgerichtete Mutagenese inaktiviert sein. Das Lkt-C-Gen kann über eine
beliebige einfache oder mehrfache Nucleotidsubstitution, -addition
und/oder -deletion inaktiviert sein. Vorzugsweise ist das Lkt-C-Gen über eine
homologe Rekombination unter Verwendung eines Zielkonstruktes inaktiviert.
Das Zielkonstrukt kann einen selektierbaren Marker einschließen, der
von Sequenzen flankiert wird, die homolog zu Sequenzen sind, die
die gewünschte
Insertionsstelle flankieren. Der selektierbare Marker kann ein Gen
sein, das eine Resistenz gegenüber
einer toxischen Substanz wie Quecksilber bewirkt, oder er kann eine
Determinante für
eine Resistenz gegenüber
einem Antibiotikum sein. Die Determinante für die Resistenz gegenüber einem
Antibiotikum kann ein Gen sein, das für eine Ampicillin-Resistenz,
Kanamycin-Resistenz oder Streptomycin-Resistenz codiert.
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In einigen Fällen kann es unerwünscht sein,
ein funktionelles Gen für
eine Antibiotikumresistenz in einem modifizierten Mikroorganismus
inkorporiert vorliegen zu haben. Demgemäß stellt man sich bei der vorliegenden
Erfindung ein Zielkonstrukt vor, das genetische Elemente wie Repeat-Sequenzen einschließt, die
das Herausschneiden des Gens für
die Antibiotikumresistenz erleichtern, sobald das Zielkonstrukt
die homologe Rekombination mit dem Wirtschromosom durchlaufen hat.
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Bei der vorliegende Erfindung stellt
man sich auch ein Zielkonstrukt vor, das keinen selektierbaren Marker
einschließt.
Zum Beispiel kann das Zielkonstrukt einen Abschnitt des Lkt- C-Gens einschließen, der eine
Deletion enthält.
Die homologe Rekombination des Zielkonstrukts mit dem Wirtschromosom
kann zur Einführung
einer Deletion in das chromosomale Lkt-C-Gen führen. Die Selektion von Rekombinanten
kann dann auf einer fehlenden Bildung des Lkt-Toxins basieren.
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Das Zielkonstrukt kann in linearer
Form direkt in die Wirtszelle eingeführt werden. Alternativ kann
das Zielkonstrukt über
einen Suizid- oder nicht-replizierenden Vektor eingeführt werden.
Der Suizid-Vektor kann jedes beliebige Plasmid sein, das im Wirtsmikroorganismus
nicht repliziert. Mikroorganismen, die natürlicherweise Lkt-Toxine erzeugen,
sind oft nicht-permissive Wirte für pEP-Vektoren. Demgemäß sind pEP-Vektoren Beispiele
für Suizid-Vektoren,
die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
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Bei einer weiteren Ausführungsform
kann eine ortsgerichtete Mutagenese über die Technik der Plasmidsegregation
erreicht werden. Zum Beispiel kann ein Plasmid, das ein Fragment
eines Lkt-C-Gens enthält, das
durch das Gen eines selektierbaren Markers unterbrochen ist, in
einen Mikroorganismus eingeführt
werden. Der Mikroorganismus kann anschließend mit einem zweiten Plasmid
transformiert werden, das ein Gen eines zweiten selektierbaren Markers
enthält.
Wirtszellen, die beide Plasmide enthalten, können dann in einem Medium passagiert
werden, das nur für
das zweite Plasmid selektiert. Die Selektion für das zweite Plasmid kann gegen
eine Beibehaltung des ersten Plasmids wirken. Das erste Plasmid
kann deshalb verloren gehen, aber in einigen Fällen kann eine Rekombination
des unterbrochenen Fragments des Lkt-C-Gens, das den selektierbaren
Marker enthält,
in das Chromosom folgen. Dieser Prozess kann deshalb die Rekombination
des unterbrochenen Lkt-C-Gens in das chromosomale Lkt-C-Gen fördern, wodurch
das chromosomale Lkt-C-Gen inaktiviert wird.
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Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird ein Expressionsvektor bereit gestellt, der für ein Lkt-Toxin
codiert, wobei das genannte Lkt-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert
ist, und der genannte Vektor für
ein Gen eines Lkt-Toxins, einschließlich eines Lkt-Strukturgens und
eines Gens eines posttranslationalen Aktivators, codiert, wobei
das genannte Gen des posttranslationalen Lkt-Aktivators teilweise
oder vollständig
inaktiviert ist.
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Der Begriff „Expressionsvektor" schließt, so wie
er hier in den Ansprüchen
und in der Beschreibung verwendet wird, ein chromosomales oder extrachromosomales
Element ein, das imstande ist, eine DNA-Sequenz einschließlich einer
fremden DNA-Sequenz zu exprimieren.
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Das Produkt des Lkt-A-Gens kann von
einem chromosomalen Lkt-A-Gen exprimiert werden. Das chromosomale
Lkt-A-Gen kann in seiner natürlichen
Position auf dem Chromosom lokalisiert sein, oder es kann in einer
Position in das Chromosom insertiert sein, die sich von seiner natürlichen
Lokalisation unterscheidet. Außerdem
kann das Produkt des Lkt-Gens von einem Lkt-A-Gen exprimiert werden,
das auf einem extrachromosomalen Element, wie einem Plasmid, lokalisiert
ist. Bei einer Ausführungsform
kann deshalb ein extrachromosomales Element, das ein Lkt-A-Gen enthält, in einen
Mikroorganismus eingeführt
werden, der ein funktionelles chromosomales Lkt-A-Gen und ein inaktiviertes
chromosomales Lkt-C-Gen aufweist. Das vom extrachromosomalen Element
exprimierte Produkt des Lkt-A-Gens kann das Lkt-A-Produkt, das vom
chromosomalen Gen exprimiert wird, supplementieren.
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Alternativ kann das Produkt des Lkt-A-Gens
vollständig
von einem Lkt-A-Gen oder -Genen exprimiert werden, die auf extrachromosomalen
Elementen, wie Plasmiden, lokalisiert sind. Die Lkt-A-Gene, die
auf extrachromosomalen Elementen lokalisiert sind, können entweder
in Anwesenheit oder in Abwesenheit einer Selektion für das extrachromosomale
Element exprimiert werden. So kann bei einer Ausführungsform
ein extrachromosomales Element, das ein Lkt-A-Gen enthält, in einen
Mikroorganismus eingeführt
werden, dem funktionelle chromosomale Lkt-A- und Lkt-C-Gene fehlen.
Der Mikroorganismus, dem funktionelle Lkt-A- und Lkt-C-Gene fehlen, kann über eine
Mutagenese des Mikroorganismus erzeugt werden. Die Mutagenese kann zur
Deletion der Lkt-A- und Lkt-C-Gene oder von Teilen von diesen führen.
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Das extrachromosomale Element kann
ein rekombinanter Expressionsvektor sein, der das Lkt-A-Gen enthält. Vorzugsweise
ermöglicht
der rekombinante Expressionsvektor die Expression des Lkt-A-Gens
in Mikroorganismen, die natürlicherweise
Lkt-Toxine erzeugen. Der rekombinante Expressionsvektor kann die
Expression des Lkt-A-Gens in P. haemolytica ermöglichen. Der rekombinante Expressionsvektor
kann von einem pIG-Plasmid abgeleitet sein. Das rekombinante Plasmid
kann von pIG3B abgeleitet sein. Das rekombinante Plasmid kann pIG3B-Lkt
sein.
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Bakterielle Vektorsysteme auf der
Basis von APP (Ph) stellen ein alternatives Mittel für die Einführung von
Impfstoffmolekülen
aus „nackter
DNA" in Wirtszellen
bereit. Solche Impfstoff-/Expressionssysteme mit nackter DNA würden ein
Plasmid einschließen,
das imstande ist, in bakteriellen System zu replizieren, und einen
eukaryotischen Promotor, der die Expression des interessierenden
fremden/rekombinanten Gens steuert.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Mikroorganismus imstande, ein oder mehrere funktionelles)
Proteine) zu erzeugen, das bzw. die die Sekretion der Moleküle des Lkt-Toxins
erleichtert bzw. erleichtern. Der Mikroorganismus kann funktionelle
Lkt-B- und/oder Lkt-D-Gene aufweisen. Bei einer anderen Ausführungsform
ist der Mikroorganismus nicht fähig
zur Erzeugung wenigstens eines der Proteine, die in die Sekretion
der Moleküle
des Lkt-Toxins involviert sind, oder er erzeugt wenigstens ein inaktives
Protein, das in die Sekretion der Moleküle des Lkt-Toxins involviert
ist. Der Mikroorganismus kann ein inaktives Lkt-B- und/oder Lkt-D-Gen
aufweisen. Somit kann der Mikroorganismus unfähig zur Sekretion aktiver oder
inaktiver Moleküle des
Lkt-Toxins sein.
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In einem weiteren Aspekt stellt die
vorliegende Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung für die Auslösung einer
Immunreaktion in einem Wirtstier bereit, das mit der genannten Impfstoffzusammensetzung
inokuliert wurde, wobei die genannte Impfstoffzusammensetzung einen
Vorläufer
des Lkt-Toxins einschließt.
Der Vorläufer
des Lkt-Toxins kann ein nichtprozessiertes Expressionsprodukt eines
Lkt-Strukturgens sein. Das Lkt-Strukturgen kann ein Lkt-A-Gen sein.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ferner eine Impfstoffzusammensetzung für die Auslösung einer Immunreaktion in
einem Wirtstier bereit, das mit der genannten Impfstoffzusammensetzung
inokuliert wurde, wobei die genannte Impfstoffzusammensetzung den
modifizierten Mikroorganismus einschließt, der ein Lkt-Toxin erzeugt,
wobei das genannte Lkt-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert
ist. Vorzugsweise ist das inaktivierte Lkt-Toxin ein Vorläufer eines
Lkt-Toxins. Der Vorläufer
kann ein nicht-prozessiertes Expressionsprodukt eines Lkt-Strukturgens sein.
Das Lkt-Strukturgen kann ein Lkt-A-Gen sein. Der Mikroorganismus
ist Pasteurella haemolytica. Vorzugsweise ist das Lkt-C-Gen des
Mikroorganismus inaktiviert oder deletiert.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Impfstoffzusammensetzung, die einen modifizierten Mikroorganismus
einschließt,
ein Lebendimpfstoff.
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Eine Impfstoffzusammensetzung der
vorliegenden Erfindung kann in einen beliebigen pharmazeutisch annehmbaren
Träger
mit oder ohne zugesetzte(n) Adjuvanzien oder immunstimulatorische(n)
Moleküle(n)
eingearbeitet sein.
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Das Adjuvans kann von jedem beliebigen
geeigneten Typ sein. Das Adjuvans kann ausgewählt sein aus Pflanzenölen oder
Emulsionen von diesen, oberflächenaktiven
Substanzen, z. B. Hexadecylamin, Octadecylaminosäureestern, Octadecylamin, Lysolecithin,
Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxyethylpropandiamin),
Methoxyhexadecylglycerin und Pluronpolyolen; Polyaminen, z. B. Pyran,
Dextransulfat, Poly-IC, Carbopol; Peptiden, z. B. Muramyldipeptid,
Dimethylglycin, Tuftsin; immunstimulierenden Komplexen (ISCOMS); Öl-Emulsionen;
und Mineralgelen und -suspensionen. Eine Mineralsuspension wie Alum,
d. h. Aluminiumhydroxid (Al(OH)3), Aluminiumphosphat
oder Aluminiumsulfat wird bevorzugt. Das Adjuvans kann in Mengen
von ungefähr
1 bis 75 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Impfstoffzusammensetzung,
vorliegen.
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Es dürfte klar sein, dass ein Impfstoff
gemäß er vorliegenden
Erfindung, der einen Vorläufer
für ein Lkt-Toxin
oder einen Mikroorganismus enthält,
der fähig
ist, einen Vorläufer
für ein
Lkt-Toxin zu erzeugen, das Potential besitzt, einen Schutz gegen
verschiedene Serovare von Mikroorganismen bereit zu stellen, die
das entsprechende Lkt-Toxin erzeugen.
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In einem weiteren Aspekt stellt die
vorliegende Erfindung einen biologischen Vektor bereit, der ein
Pasteurella-haemolytica-Bakterium einschließt, wobei das genannte Bakterium
so modifiziert wurde, dass es nicht zur Erzeugung eines aktiven
Lkt-Toxins fähig
ist.
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Das modifizierte Bakterium ist unfähig, einen
posttranslationalen Aktivator des Vorläufers des Lkt-Toxins zu erzeugen,
oder es erzeugt einen inaktivierten posttranslationalen Aktivator
des Vorläufers
des Lkt-Toxins. Der posttranslationale Aktivator kann ein Produkt
eines Lkt-C-Gens sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Lkt-C-Gen des modifizierten Bakteriums inaktiviert oder
deletiert. Das Lkt-C-Gen kann über eine
oder mehrere beliebige Nucleotid-Substitution(en),
-Additionen) und/oder -Deletion(en) inaktiviert sein.
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Das Lkt-C-Gen kann über die
Einführung
eines Zielkonstruktes, das einen selektierbaren Marker enthält, in das
chromosomale Lkt-C-Gen über
eine ortsgerichtete Rekombination inaktiviert werden. Das Zielkonstrukt
kann genetische Elemente wie Repeat-Einheiten einschließen, die
das Herausschneiden des Gens für die
Antibiotikumresistenz erleichtern, sobald das Zielkonstrukt ein
homologe Rekombination mit dem Wirtschromosom durchlaufen hat. Alternativ
kann ein Zielkonstrukt, das keinen selektierbaren Marker enthält, zur Einführung einer
Deletion in das chromosomale Lkt-C-Gen verwendet werden.
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Das Produkt des Lkt-A-Gens kann von
einem chromosomalen Lkt-A-Gen exprimiert werden. Das chromosomale
Lkt-A-Gen kann in seiner natürlichen
Position auf dem Chromosom lokalisiert sein, oder es kann in das
Chromosom in einer Position insertiert sein, die sich von seiner
natürlichen
Lokalisation unterscheidet. Außerdem
kann das Produkt des Lkt-Gens von einem Lkt-Gen exprimiert werden,
das auf einem extrachromosomalen Element, z. B. einem Plasmid, lokalisiert
ist. Alternativ kann das Produkt des Lkt-A-Gens vollständig von einem
Lkt-A-Gen oder von
Genen exprimiert werden, die auf extrachromosomalen Elementen wie
Plasmiden lokalisiert sind.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Mikroorganismus imstande, ein oder mehrere funktionelles)
Proteine) zu erzeugen, das bzw. die die Sekretion der Moleküle des Lkt-Toxins
erleichtert bzw. erleichtern. Der Mikroorganismus kann funktionelle
Lkt-B- und/oder Lkt-D-Gene aufweisen. Bei einer anderen Ausführungsform
ist der Mikroorganismus nicht fähig
zur Erzeugung wenigstens eines der Proteine, die in die Sekretion
der Moleküle
des Lkt-Toxins involviert sind, oder er erzeugt wenigstens ein inaktives
Protein, das in die Sekretion der Moleküle des Lkt-Toxins involviert
ist.
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Der Begriff „biologischer Vektor" wird in seinem weitesten
Sinne verwendet und soll biologische Mittel einschließen, die
für die
Expression biologisch aktiver Moleküle geeignet sind. Das biologische
Mittel ist vorzugsweise ein lebender Mikroorganismus, obwohl tote
Organismen eingesetzt werden könnten.
Der biologische Vektor kann nicht pathogen sein, oder er kann avirulent
gemacht worden sein, oder er kann in nicht-pathogenen oder avirulenten
wirksamen Mengen verabreicht werden. Der Begriff „biologisch
aktive Moleküle" schließt funktionelle
Moleküle
ein, wie Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, Antigene oder antigene
Teile von diesen, Cytokine wie Interleukine, Interferone und Tumornekrosefaktoren.
Die Moleküle
können
vom biologischen Vektor in der natürlichen Form exprimiert werden.
Alternativ können
die Moleküle
rekombinante Moleküle
sein, die exprimiert werden, indem der biologische Vektor mit einem
Plasmid transformiert wird, das ein Gen oder Gene trägt, das
bzw. die für
das biologisch aktive Molekül
codiert bzw. codieren, das dann exprimiert wird; oder wobei das
Plasmid und/oder das Gen oder die Gene und/oder Teile davon in das
Wirtsgenom integriert werden, das das Chromosom und/oder das beliebige
natürlich
oder nicht natürlich
vorkommende extrachromosomale Element einschließt, wobei das Gen oder die
Gene oder Teile davon exprimiert werden.
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Es dürfte klar sein, dass ein biologischer
Vektor der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden kann, dem
Wirtstier ein nützliches
Protein oder mehrere nützliche
Proteine bereit zu stellen. Die so bereit gestellten Proteine können synergistisch
wirken, um eine verstärkte
Reaktion im Wirtstier zu bewirken. Zum Beispiel kann der biologische
Vektor ein Antigen zusammen mit einem Molekül erzeugen, das im Wirtstier
eine immunogene Reaktion auf das Antigen verstärkt. Das Molekül, das die
immunogene Reaktion verstärkt,
kann ein Cytokin sein.
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Es dürfte auch klar sein, dass ein
erfindungsgemäßer biologischer
Vektor dazu verwendet werden kann, einen multivalenten Impfstoff
bereit zu stellen. Der Begriff „multivalenter Impfstoff" wird in seinem allgemeinsten
Sinne verwendet und beinhaltet auch einen modifizierten Mikroorganismus,
der imstande ist, eine Immunreaktion auf zwei oder mehr verschiedene
antigene Epitope, die sich auf dem modifizierten Mikroorganismus
befinden oder vom modifizierten Mikroorganismus exprimiert werden,
zu induzieren, wobei die zwei oder mehr Epitope von Haus aus im
modifizierten Mikroorganismus vorhanden sind. Im allgemeineren Sinne schließt ein multivalenter
Impfstoff jedoch einen modifizierten Mikroorganismus ein, der imstande
ist, eine Immunreaktion gegen virulente Formen des genannten Mikroorganismus
sowie gegen heterologe Antigene, die vom genannten Mikroorganismus
exprimiert werden (beispielsweise rekombinante Antigene oder diejenigen, die über eine
Transduktion, Konjugation oder Transformation eingeführt wurden)
und nicht von Haus aus im Mikroorganismus vorhanden sind, zu induzieren.
Diesbezüglich
kann ein multivalenter Impfstoff gegen zwei oder mehrere pathogene
Agenzien gerichtet sein. Bevorzugte multivalente Impfstoffe sind
diejenigen, die imstande sind, eine Immunreaktion gegen ein Lkt-Toxin
und wenigstens ein antigenes Epitop eines pathogenen Agens oder
mehrerer pathogener Agenzien zu induzieren. Die pathogenen Agenzien
können
aus bakteriellen Pathogenen, wie Pasteurella spp., Haemophilus spp.,
Moraxella spp., Leptospira spp., Streptococcus spp., Salmonella
spp., E. coli, Fusobacterium spp., Clostridium spp. und Mycobacterium
spp., ausgewählt
sein. Die pathogenen Agenzien können
auch aus Endoparasiten, wie Haemonchus spp. Und Trichostrongylus
spp., oder aus Ectoparasiten, wie Boophilus spp., ausgewählt sein.
Alternativ können
die pathogenen Agenzien aus viralen Pathogenen, wie dem Virus der
Bovinen Virus-Diarrhoe
(BVDV), dem Parainfluenza-Virus (PI3), der Infektiösen bovinen
Rhinotracheitis (IBR), dem Coronavirus und dem Rotavirus, ausgewählt sein.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ferner ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten P. haemolytica,
das ein Lkt-Toxin erzeugt, das teilweise oder vollständig inaktiviert
ist, bereit, wobei das Verfahren einschließt das Bereitstellen eines
Mikroorganismus, der ein aktives Lkt-Toxin erzeugt; und das Inaktivieren
oder Deletieren des Lkt-C-Gens.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ferner ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten P. haemolytica,
das ein Lkt-Toxin erzeugt, das teilweise oder vollständig inaktiviert
ist, bereit, wobei das Verfahren einschließt das Bereitstellen eines
Mikroorganismus, der nicht zur Erzeugung eines aktiven Lkt-Toxins
fähig ist; und
das Einführen
eines funktionellen Lkt-A-Gens in den genannten Mikroorganismus.
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Die Erfindung stellt außerdem in
einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Impfung eines Tieres gegen einen
Mikroorganismus, der ein Lkt-Toxin erzeugt, bereit, wobei das genannte
Verfahren das Verabreichen einer immunologisch wirksamen Menge eines
Impfstoffes gemäß der vorliegenden
Erfindung an das genannte Tier einschließt.
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Das Impfverfahren kann für die Behandlung
von Nutztieren, wie Schweinen, Rindern, Schafen und Ziegen, eingesetzt
werden. Das Impfverfahren kann auch zur Behandlung von Haustieren, wie
Pferden, Hunden oder Katzen, eingesetzt werden. Das Impfverfahren
kann auch zur Behandlung von Menschen eingesetzt werden. Bei einer
bevorzugten Ausführungsform
wird das Impfverfahren zur Behandlung von Rindern eingesetzt. Vorzugsweise
wird das Impfverfahren für
die Behandlung des Bovinen Respiratorischen Krankheitskomplexes
(BRD) eingesetzt.
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Die Verabreichung eines Impfstoffes
oder eines Impfstoffvektors gemäß der vorliegenden
Erfindung kann über
jeden beliebigen geeigneten Weg erfolgen, z. B. über eine orale oder parenterale
Verabreichung. Die Verabreichung kann über die Schleimhaut erfolgen,
z. B. nasal oder vaginal. Alternativ kann die Verabreichung intramuskulär, intradermal,
subkutan oder intraperitoneal erfolgen. Die Präparation kann in trockener oder
flüssiger
Form vorliegen. Der gewählte
Verabreichungsweg kann auch weitere Komponenten erforderlich machen,
z. B. Protease-Inhibitoren, entzündungshemmende
Mittel und dergleichen.
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Die Erfindung stellt in noch einem
weiteren Aspekt ein Verfahren zur Impfung eines Tieres gegen einen pathogenen
Organismus bereit, wobei das genannte Verfahren das Verabreichen
einer wirksamen Menge eines Impfstoffvektors gemäß der vorliegenden Erfindung
an das genannte Tier einschließt,
wobei der genannte Impfstoffvektor eine immunologisch wirksame Menge
eines Antigens des genannten pathogenen Organismus erzeugt.
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In noch einem weiteren Aspekt stellt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines inaktiven
Lkt-Toxins bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren eines modifizierten
Mikroorganismus gemäß der vorliegenden
Erfindung und das Gewinnen des vom genannten Mikroorganismus erzeugten
inaktiven Toxins einschließt.
Das mittels dieses Verfahrens erzeugte inaktive Lkt-Toxin kann beispielsweise
als das aktive Immunogen in einem Impfstoff zur Stimulierung einer
schützenden
Immunreaktion gegen ein Lkt-Toxin eingesetzt werden.
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In der gesamten Beschreibung und
in den Ansprüchen
dieser Beschreibung sollen das Wort „umfassen" und Variationen dieses Wortes, wie „umfassend" oder „umfasst", nicht andere Zusätze, Komponenten, ganzen
Zahlen oder Schritte ausschließen.
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Damit die Erfindung besser verstanden
werden kann, stellen wir die folgenden nichteinschränkenden Beispiele
bereit.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
1.
Konstruktion einer Lkt-Expressionskassette für E. coli. Das Lkt-Gen wurde
in pQE kloniert, und zwar im Leserahmen mit der Poly-HIS-Leadersequenz,
um die Lkt-Expression zu ermöglichen.
Das Gen für die
Kanamycin-Resistenz aus pUC4K wurde in eine nur einmal vorhandene
XhoI-Restriktionsstelle 5' der pQE-Lkt-Promotor/Regulator-Sequenzen
kloniert. Das resultierende Plasmid, pQE-LktK, enthält das Lkt-Gen unter
regulierter Expression, verknüpft
mit dem Gen für
die Kanamycin-Resistenz.
-
2.
Partielle Restriktionskarte von pIG3 (2A),
einem Plasmid von 4,2 kb, das für
die Streptomycin-Resistenz codiert, isoliert aus einem australischen
Stamm von Actinobacillus pleuropneumoniae. Für ein PstI-Fragment von 2,3
kb (pIG317) wurde gefunden, dass es ausreichte, um nach einer Zirkularisierung
für die
Replikation des Plasmids zu codieren und eine Streptomycin-Resistenz
zu übertragen,
und es wurde in E. coli oder P. haemolytica transformiert. Der Plasmidvektor
pIG3B, der eine multiple Klonierungsstelle (MCS) und einen Teil
des Lac-Gens enthält,
wurde über
das Einführen
des Haell-Fragments von pIC19R in die nur einmal vorhandene EcoRI-Stelle
von pIG317 (2B) konstruiert.
Einmal vorhandene Restriktionsstellen sind für pIG3B angegeben (C), mit
Ausnahme von PstI, das in der MCS und im Plasmid-Rückgrat schneidet
(2C).
-
3.
Konstruktion einer Lkt-Expressionskassette für die Verwendung in P. haemolytica.
Die Lkt-Expressionskassette, verknüpft mit dem Gen für die Kanamycin-Resistenz,
von pQE-LktK wurde als ein SphII-Restriktionsfragment isoliert,
mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, und in
die einmal vorhandene EcoRV-Stelle von pIG3B kloniert. Es sind nicht
alle einmal vorhandenen Restriktionsstellen in der multiplen Klonierungsstelle
von pIG3B angegeben.
-
4.
Western-Blot-Analyse des Ph : Lkt–-Stammes,
der die Lkt-Expressionskassette enthält. Es wurden Proben von exponentiell
wachsenden Kulturen von P. haemolytica EMAI, Ph : Lkt– und
dem Ph : Lkt–-Stamm,
der die Lkt-Expressionskassette (pIG3B-Lkt) enthielt, mittels Western
Blot untersucht. Toxinbanden wurden mittels eines Kaninchenantiserums
gegen das Lkt nachgewiesen. Das Antiserum gegen Lkt band an ein
Polypeptid, das bezüglich
seiner Größe demjenigen
des Lkt in Präparationen
von P.-haemolytica-Stämmen
EMAI und Ph : Lkt–/pIG3B-Lkt entsprach, aber
es erkannte nicht eine Bande ähnlicher
Größe im Lkt-defizienten
Stamm Ph : Lkt–.
-
5.
Kassetten auf der Basis von pIG für die Expression von CAT in
Ph. Es wurde eine Reihe von Expressionskassetten auf der Basis von
pIG für
die Expression des CAT-Gens in Ph Konstruiert. Jedes Plasmid hatte
die gleiche Struktur, bei der der Promotor 5' des CAT-Gens ausgerichtet war. Die
in dieser Untersuchung eingesetzten Promotoren waren: der Ph-Lkt-Promotor, der DNT-Promotor,
der aus dem dermonekrotischen Toxin von Pasteurella multocida isoliert
worden war, und der APX1-Promotor, der aus dem APX1-Toxin von Actinobacillus
pleuropneumoniae isoliert worden war.
-
MATERIALIEN UND METHODEN
-
Bakterienstämme und
Wachstumsbedingungen
-
Die in dieser Untersuchung verwendeten
P.-haemolytica-Stämme
wurden vom NSW Dept. Agriculture, Elizabeth Macarthur Institute,
Menangle (EMAI; Australien) oder von der American Type Culture Collection (ATCC)
bezogen. Die P.-haemolytica-Stämme
wurden in Gehirn-Herz-Infusionslösung (brain
heart infusion broth, BHI) bei 37°C
unter kontinuierlichem Schütteln
gezüchtet.
Blutagar wurde hergestellt, indem 5% sterile defibrinierte rote
Blutzellen vom Schaf dem BHI-Agar zugegeben wurden. Antibiotika
wurden in einer Endkonzentration des Kanamycins von 25 μg/ml eingesetzt.
Der E.-coli-Stamm DH5α wurde
in der gesamten Studie eingesetzt, und zwar unter Verwendung von
Standardtechniken, wie sie bei Sambrook et al. (1989) umrissen werden.
-
Isolierung von genomischer
DNA aus P. haemolytica
-
Die in 1 ml einer Übernachtkultur
von P. haemolytica EMAI, die in BHI gezüchtet worden war, vorhandenen
Bakterien wurden durch Zentrifugation gesammelt, und der Überstand
wurde verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml TE (10 mM Tris-HCl, pH
8,5/1 mM EDTA), das Lysozym (7,5 mg/ml) enthielt, resuspendiert
und 2 Stunden bei 37°C
inkubiert. Danach wurde die Lösung
auf eine Endkonzentration von 0,1 M NaCl, 1% SDS und 2,5 μg/ml Proteinase
K eingestellt, und die Inkubation wurde über Nacht bei 50°C fortgesetzt.
Am folgenden Tag wurde die Präparation
auf 0,5 M NaCl eingestellt und zweimal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (100
: 99 : 1, Vol./Vol./Vol.) extrahiert, und die genomische DNA wurde
dann durch Zugabe von 0,6 Volumina Isopropanol ausgefällt.
-
Isolierung und Klonierung
des Lkt-Gens
-
Die Amplifizierung des Lkt-Gens erfolgte
mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Reaktionen wurden
in Volumina von 50 μl
durchgeführt,
die 50 ng genomische DNA (EMAI), 3 ηg Oligonucleotidprimer, 50
mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2,
200 mg/ml BSA, 200 mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP plus
1 Einheit Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA) enthielt.
Die Reaktionsmischungen wurden mit dem gleichen Volumen Paraffinöl überschichtet
und 1 min auf 94°C
erhitzt, 2 min auf 55°C
abgekühlt
und 5 min auf 72°C
erhitzt. Dieser Zyklus wurde 35-mal unter Verwendung eines DNA-Thermocyclers von Perkin-Elmer-Cetus
wiederholt. Spezifische Oligonucleotide wurden auf der Basis der
veröffentlichten
Sequenz des Lkt-Gens (Lo et al., 1987; Highlander et al., 1989) konstruiert.
Die Sequenz der beiden Oligonucleotide war 5' CGCGGATCCCGGGCCATGGGAACTAGACTTACAACC
3' und 5' CGCGAATTCTTAAGCTGCTCTAGC
3', und sie war
so konstruiert, dass ein PCR-Produkt mit einer BamHI-Stelle am 5'-Ende und einer EcoRI-Stelle
am 3'-Ende erzeugt
wurde, um die Klonierung zu erleichtern. Die Oligonucleotide wurden
mittels des Gene Assembler Plus Synthesiser (Pharmacia, Schweden)
synthetisiert. Produkte der PCR-Reaktionen, die dem vorhergesagten
Molekulargewicht des Lkt-Gens entsprachen, wurden aus Agarosegelen
mittels Gene-Cleaning (BRESATech, Australien) isoliert, mit BamHI
und EcoRI restriktionsverdaut und in die entsprechenden Stellen
von pUC18 (Yanish-Perron et al., 1985) kloniert, um das Plasmid
pUC-Lkt zu erzeugen. Die Bestätigung,
dass Klone das Lkt-Gen enthielten, wurde über eine Doppelstrang-Sequenzierung
erhalten (Ergebnisse nicht gezeigt).
-
Transformation von P.
haemolytica mit Plasmid-DNA
-
Elektrokompetente P. haemolytica
wurden durch das Inokulieren von BHI-Nährmedium mit einer einzigen
Kolonie aus einer über
Nacht inkubierten BHI/Blutagar-Platte präpariert. Man ließ die Kultur
wachsen, bis ein OD600-Wert von 0,8 erreicht
wurde, wobei sich die Kultur zu dieser Zeit in der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase
befand (Daten nicht gezeigt). Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren
geerntet, dreimal mit 15% Glycerin gewaschen und in 1/50 des ursprünglichen
Volumens resuspendiert. Aliquots (50 μl) von elektrokompetenten P.
haemolytica wurden mit Plasmid-DNA unter Einsatz der folgenden Bedingungen
transformiert: 1000 Ω,
2,25 kV und 25 μF
in 0,2-cm-Küvetten.
Nach der Elektroporation ließ man
die transformierten Zellen in BHI-Nährmedium wachsen, wobei 4 Stunden
bei 37°C
geschüttelt
wurde, und zwar ohne Antibiotikumselektion, ehe sie auf BHI-Agar,
der das entsprechende Antibiotikum für die Selektion enthielt, ausplattiert wurden.
-
Herstellung von Antiseren
-
Der mittels PCR erhaltene offene
Leserahmen des Lkt wurde aus pUC-Lkt so in den Expressionsvektor
pGEX2T subkloniert, dass er sich im Leserahmen mit dem GST-Gen befand.
Das GST-Lkt-Fusionsprotein wurde über eine GST-Affinitätschromatographie
gereinigt, wie es in der Anleitung des Herstellers (Pharmacia, Schweden)
angegeben ist.
-
Kaninchen erhielten insgesamt drei
Dosen an gereinigtem Protein (100 μg) in Abständen von zwei Wochen, wobei
die erste in Freunds komplettem Adjuvans gegeben wurde und die nachfolgenden
Impfungen in Freunds unvollständigem
Adjuvans erfolgten. Seren wurden zwei Wochen nach der letzten Boosterung
gewonnen.
-
Western-Blot-Analyse
-
Die Western-Blot-Analyse (Immunoblot-Analyse)
wurde mittels des Verfahrens von Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Kaninchenseren
gegen das GST-Lkt-Fusionsprotein wurden zum Nachweis des Lkt in
einer Verdünnung
von 1 : 50 eingesetzt. Beim Konjugat, das in einer 1 : 1000-Verdünnung eingesetzt
wurde, handelte es sich um HRP-konjugiertes Schaf-Antiserum gegen
affinitätsgereinigtes
Kaninchen-Ig (Sienus), wobei Tetramethylbenzidin (McKimm-Breschkin 1990) als
Substrat eingesetzt wurde. Bakterienproben für die Western-Blot-Analyse
wurden durch das 1 : 20-Verdünnen
von Übernacht-Kulturen
im geeigneten Wachstumsmedium und das Inkubieren bei 37°C unter heftigem
Schütteln,
bis ein OD600-Wert von 0,8 erreicht wurde, präpariert.
An diesem Punkt wurden Proben, die 20 μl der Gesamtkultur enthielten,
mittels SDS-PAGE analysiert, und die Proteine wurden mittels einer
Bio-Rad Transblot Cell auf Nitrocellulose (Bio-Rad) transferiert,
wie es in den Beschreibungen des Herstellers beschrieben wird.
-
Konstruktion einer Lkt-Expressionskassette
für P.
haemolytica
-
Der offene Leserahmen (open reading
frame, ORF) des Lkt wurde von pUC-Lkt in den Expressionsvektor pQE30
(QIAGEN Inc., Chatsworth, Kalifornien, USA) im Leserahmen mit dem
Signal für
die Poly-His-Reinigung kloniert, wie es in der 1 skizziert ist. Die Expression des Lkt-Gens
von pQE30 (qQE-Lkt) stand unter der Kontrolle des Promotors des
E.-coli-Phagen T5
und von zwei Lac-Operator-Sequenzen. Zur Erleichterung der Subklonierung
dieses Expressionselements von pQE-Lkt in alternative Plasmide wurde
das Gen für
die Kanamycin-Resistenz
aus pUC4K (Pharmacia) isoliert und einem Shuttling durch pIC20R
unterzogen, ehe es in pQE-Lkt kloniert wurde, wie es in der 1 skizziert ist. Das resultierende
Plasmid, pQE-LktK, enthält das Gen
für die
Kanamycin-Resistenz und das Lkt-Gen, verknüpft mit dem T5-Promotor, und beide
werden von einmal vorhandenen SphI-Restriktionsstellen flankiert
(1).
-
Ein Plasmid, das für die Transformation
von P. haemolytica geeignet ist, ist in unserem Labor entwickelt
worden. Das Ausgangsplasmid wurde aus einem australischen Stamm
von Actinobacillus pleuropneumoniae isoliert, und es wurde zu dem
Plasmidvektor pIG3B weiter entwickelt, wie es in den 2A, 2B und 2C skizziert
ist. Das SphI-Restriktionsfragment, das das Lkt-Gen enthielt, sowie
die Steuerungssignale für
die Transkription wurden aus pQE-T1K
isoliert und in die EcoRV-Stelle von pIG3B subkloniert, um den Expressionsvektor
pIG3B-Lkt für das P.-haemolytica-Gen
Lkt A zu erzeugen, wie es in der 3 umrissen
ist.
-
Konstruktion eines P.-haemolytica-Impfstammes
-
Während
eines Verfahrens einer ortsgerichteten Mutagenese des Chromosoms
von P. haemolytica (Stamm EMAI), das so ausgelegt war, dass ein
kleiner Teil des Lkt-C-Gens deletiert wurde, wurde ein Isolat erhalten,
das auf Blutagarplatten keine Hämolysezone
erzeugte. Eine weitere Charakterisierung dieses Stammes (Ph : Lkt–)
zeigte, dass er unfähig
zur Herstellung sowohl von Lkt C als auch von Lkt A war.
-
Der Ph : Lkt–-Stamm
wurde mit pIG3B-Lkt transformiert, wie es in Materialien und Methoden
beschrieben wurde, und DNA wurde aus Kanamycin-resistenten Kolonien
isoliert und über
einen Restriktionsverdau analysiert, um die vorhergesagten Profile
von pIG3B-Lkt zu bestätigen.
-
Charakterisierung des
P.-haemolytica-Impfstammes
-
Übernachtkulturen
des Ph : Lkt–-Stammes,
der pIG3B-Lkt enthielt, sowie der P.-haemolytica-Stämme Ph
: Lkt– und
von ATCC-Stämmen
wurden mittels Western Blotting unter Verwendung von Antiseren,
die in Kaninchen gegen das mittels einer GST-Affinitätschromatographie
gereinigte Lkt-Protein, gewonnen wurden, untersucht. Aus dem Western
Blot (4) geht hervor,
dass der Ph : Lkt–-Stamm keine in den
Seren vorhandenen Antikörper
spezifisch band, während
sowohl der Wildtyp-ATCC-Stamm als auch der Ph : Lkt–-Stamm,
der pIG3B-Lkt enthielt, Proteine mit dem vorhergesagten . Molekulargewicht
des Lkt, die mit dem Lkt-Antiserum reagierten, erzeugten.
-
BEISPIEL 1
-
TESTUNG DES
PH-TOX–-IMPFSTAMMES
AN RINDERN
-
Rindern, die ungefähr ein Jahr
alt waren, wurde vor ihrer Verwendung Blut entnommen, um die Abwesenheit
bereits vorhandener Antikörper
gegen Ph zu bestätigen,
und anschließend
wurden sie in zwei Zufallsgruppen aus jeweils drei Tieren eingeteilt.
Am Tage 0 erhielt eine Gruppe von drei Tieren 50 ml einer exponentiell
wachsenden Kultur von Ph-Lkt (entsprechend 5 × 1010 CFU) über eine
intratracheale Inokulation verabreicht. Vor dem Impfexperiment waren
Experimente durchgeführt
worden, in denen Rindern Dosierungen des pH-Lkt–-Impfstammes,
die von 5 × 1010 bis 2 × 1011 reichten,
verabreicht wurden, die Tiere bezüglich klinischer Zeichen überwacht
und eine Woche nach dem Challenge einer Autopsie unterzogen wurden,
um zu bestimmen, ob sich Lungenschäden entwickelt hatten. Bei
allen getesteten Dosierungen waren keine Lungenschäden gefunden
worden, und die Rinder hatten keine Körpertemperaturen, die außerhalb
des Normalbereiches lagen. Die zweite Gruppe diente als nicht geimpfte
Kontrollen. Am Tage 14 wurden die Rinder erneut wie am Tage 0 geimpft.
Am Tage 28 wurden alle Ringer mit 100 ml einer exponentiell wachsenden
Kultur von Wiltyp-Ph (entsprechend 1 × 1011 CFU) über eine
direkte Inokulation in die Trachea provoziert. Klinische Zeichen
wurden über
die nächsten
8 Tage verfolgt, und zu diesem Zeitpunkt wurden alle Tiere getötet und
auf Lungenschäden untersucht.
-
Die Zahl und die Schwere der in jedem
Tier bei der Autopsie 8 Tage nach dem Challenge gefundenen Lungenschäden sind
in der Tabelle 1 dargestellt. Das Challenge der nichtgeimpften Kontrollen
mit Ph führte bei
zwei der drei provozierten Rinder zu einer akuten Lungenentzündung. Das
dritte Tier zeigte bei der Autopsie keine Zeichen einer Ph-Infektion,
möglicherweise
als Folge eines Fehlers bei der Verabreichung des Challenge über die
Trachea oder, alternativ, da Ph bei einer großen Zahl von Rindern kommensal
vorliegt, könnte dieses
Tier vor dem Challenge eine Immunität gegen Ph entwickelt haben.
Innerhalb der geimpften Gruppe von Tieren entwickelte nur eines
Anzeichen einer Ph-Infektion. Diese bestanden aus mehreren verdichteten Läppchen (mit
einer Größe von unter
1 cm) im rechten apikalen Flügel.
-
Dieses Experiment zeigt eindeutig
das Potential von Ph-Lkt– für eine Verwendung als Lebendimpfstoff für den Schutz
von Rindern gegen eine Ph-induzierte BRD an. Es wurde gefunden,
dass ein Challenge mit dem Ph-Lkt–-Stamm
keine Schäden
in den Lungen von Rindern induziert (bis zu einer Dosis von 1011 CFU), und somit beeinflusst der Impfstamm
Rinder nicht nachteilig. In Experimenten, die durchgeführt wurden,
um die geeignetste Challengedosis zu bestimmen, führte ein
Challenge mit Wildtyp-Ph mit der dreifachen Dosis, die in diesem
Experiment eingesetzt wurde, zum Tod der Tiere (3 von 3 Tieren)
in weniger als 48 Stunden. Sogar bei einem extremen Challenge mit
1 × 1011 CFU zeigte nur eines der geimpften Tiere
ein Zeichen einer Ph-Infektion, und das in erheblich geringerem
Ausmaß,
als es bei zwei von drei nicht-geimpften Kontrollen gesehen wurde.
Eine weitere Charakterisierung der Schäden in diesem Tier zeigte,
dass sie eine chronische Form hatten und älter als 8 Tage waren (d. h.
vor dem Challenge vorhanden waren). Es zeigte sich, dass die Ph,
die aus diesem Schaden isoliert wurden, Lkt produzierten, und somit
handelte es sich bei ihnen nicht um den Impfstamm. Möglicherweise
resultierte dieser Schaden aus der Etablierung einer opportunistischen
Infektion mit dem Ph-Wildtyp während
der Impfung. Ein Tier entwickelte zwar schwache Anzeichen einer
Infektion mit dem Ph-Lkt–-Stamm, aber die Annahme
erscheint vernünftig,
dass die Expression einer inaktiven Form von Lkt, von der bekannt
ist, dass sie eine Rolle bei der schützenden Immunität spielt,
das Ausmaß des
erhaltenen Schutzes erhöhen
würde.
Das Potential zur Expression inaktiver Formen des Lkt aus diesem
Stamm wurde an anderer Stelle in diesem Dokument demonstriert (4).
-
Expression
fremder Proteine über
Ph-Vektoren
-
Das Potential zur Expression rekombinanter
Gene von Ph wurde an früherer
Stelle in diesem Dokument demonstriert, wobei das Lkt-Gen von einem
Plasmid im Ph-Tox–-Stamm exprimiert wurde.
Für das
von dem Plasmid exprimierte Lkt zeigte sich in Western Blots, dass
es mit Antiseren, die gegen Lkt gewonnen worden waren, reagierte
(4). Zusätzlich zur
Expression des Lkt aus Ph ist es auch möglich, dass weitere Antigene
von einem Ph-Stamm, der zuvor über
eine Modifikation des Lkt-Operons avirulent gemacht wurde, exprimiert
werden könnten,
um multivalente Impfstoffe zu erzeugen.
-
Um das Potential von Ph zur Wirkung
als bakterieller Vektor weiter zu demonstrieren, wurde eine Reihe
von Expressionskassetten auf der Basis von pIG (5) konstruiert, bei denen verschiedene
Promotoren verwendet wurden, um die Expression des Chloramphenicolacetyltransferase-Gens
(CAT-Gens) anzutreiben. Das CAT-Gen codiert für ein Enzym, das eine Resistenz
gegen das Antibiotikum Chloramphenicol bewirkt, und das leicht über Enzymreaktionen
quantifiziert werden kann. Die Promotoren, die für das Antreiben der Expression
des CAT-Gens in Ph verwendet wurden, wurden in unserem Labor aus
verschiedenen Bakterien isoliert, die zur Pasteurellaceae-Familie
gehören.
Die verschiedenen Promotor/CAT-Kassetten (pIG-CAT) wurden in E. coli
konstruiert und dann, wie es in Materialien und Methoden beschrieben
wird, in Ph transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Antibiotikum-resistenten
Kolonien isoliert und über
einen Restriktionsverdau analysiert, um die vorhergesagten Profile
zu bestätigen.
Für alle
mit den CAT-Expressionskassetten transformierten Ph-Stämme wurde
gefunden, dass sie gegen das Antibiotikum Chloramphenicol resistent
waren. Das Ausmaß der
CAT-Aktivität,
das von jedem Konstrukt exprimiert wurde, wurde mittels Enzymtests
bestimmt.
-
Eine Probe einer exponentiell wachsenden
Kultur von Ph/pIG-CAT wurde abzentrifugiert, und die Bakterien wurden
in Tris, pH 8,0, resuspendiert. Die löslichen Proteine wurden aus
den Bakterien über
eine Ultraschallbehandlung und Zentrifugation isoliert, und der
Extrakt wurde in CAT-Tests eingesetzt, wobei die CAT-Enzymtests
150 μl Reaktionspuffer
(Chloramphenicol 1 mg/ml, 3H-CoA 0,1 μl/150 μl (Amersham
International), Tris pH 8,0) und 50 μl Proteinextrakt enthielten.
Man ließ die
Reaktionen 30 Minuten lang ablaufen, und das Ausmaß der CAT-Enzymaktivität wurde
mittels Szintillationszählung
unter Verwendung von Econoflur-Szintillationsflüssigkeit
(Dupont) bestimmt. Die CAT-Enzymreaktionen basieren auf der Übertragung
der 3H-Gruppe von einem Substrat, das in
organischen Lösemitteln
(Szintillationsflüssigkeit)
unlöslich
ist, auf ein in organischen Lösemitteln
lösliches
Produkt durch das CAT-Enzym. Für
alle überprüften Promotoren
wurde gefunden, dass sie für
eine Erzielung der Expression des fremden Gens in Ph geeignet sind,
wobei die erhaltenen CAT-Spiegel für alle Ph/pIG-CAT-Konstrukte
signifikant über
den Background-Werten lagen (Tabelle 2).
-
Die Entwicklung von Ph als bakterielles
Vektorsystem wird es ermöglichen,
fremde Proteine von kommerzieller Bedeutung der Mukosa von Rindern
zu verabreichen. Zu den Proteintypen, die verabreicht werden könnten, gehören Cytokine,
die das Immunsystem steuern und regulieren, und die dazu dienen
würden,
das Immunsystem unspezifisch hochzuregulieren. Das bzw. die über den
Vektor übertragene(n)
Moleküle)
könnte(n)
auch schützende
Antigene anderer pathogener Bakterien sein, wodurch das Potential
für die
Konstruktion multivalenter Impfstoffe bereit gestellt wird. Derartige
Impfstoffe hätten
das Potential, nach einer einzigen Impfung einen Schutz vor mehr
als einer Krankheit bereit zu stellen.
-
Tabelle 1
-
Bei der Autopsie
von Rindern gefundene Lungenschäden
-
Rinder wurden zweimal in einem Abstand
von zwei Wochen mit Ph-Lkt
– geimpft und zwei Wochen nach
der letzten Impfung mit Wildtyp-Ph provoziert. Die Autopsien wurden
8 Tage nach dem Challenge durchgeführt, wobei die Lungenschäden bestimmt
wurden.
Gruppe
1 | Nicht
geimpft und provoziert |
1. | Kein
Zeichen einer Ph-Infektion |
2 & 3 | Akute
Lungenentzündung
und Verdichtung im rechten apikalen Lungenflügel. Akute adhäsive Pleuritis.
Ein Tier hatte auch eine lokalisierte Adhäsion zwischen dem rechten diaphragmatischen
Flügel
und dem Perikard. |
Gruppe
2 | Geimpft
und provoziert |
1 & 2 | Kein
Anzeichen einer Ph-Infektion |
3. | Verschiedene
Läppchen
von weniger als 1 cm im rechten apikalen Flügel. (Schäden chronisch, älter als 8
Tage) |
-
Tabelle 2
-
Expression
des CAT-Gens in Ph
-
Ph wurde mit verschiedenen Promotor/CAT-Konstrukten
transformiert, und es wurde das Ausmaß der CAT-Genexpression über Enzymreaktionen
bestimmt. Die Ergebnisse sind als Zählereignisse pro 30 Sekunden
ausgedrückt.
Tris diente als Negativkontrolle zur Messung des spontanen Zerfalls
des CAT-Substrats zu messen.
Promotor | CAT-Aktivität |
kein
Promotor | 200 |
Lkt | 29
300 |
APX1 | 40
000 |
DNT | 44
500 |
-
LITERATURSTELLEN
-
Adam, C., Knights, J. M., Mudridge,
A., Lindon, J. C., Baker, P. R. W., Beesley, J. E., Spacey, B.,
Carig, G. R. and Nagy, L. K. (1984) Purification, characterization,
and immunological properties of serotype-specific polysaccharide
of Pasteurella haemolytica (serotype A1) organisms. J. Gen. Microbiol.
130: 2415–2426.
-
Bennett, B. W. (1982) Efficacy of
Pasteurella bacterins for yearling feedlot heifers. Bovine Pract.
3: 26–30.
-
Coote, J. G. (1992) Structural relationships
among the RTX determinants of Gram-negative bacteria. FEMS Micro.
Rev. 88: 137–162.
-
Frank, G. H. and Smith, P. C. (1983)
Prevalence of Pasteurella haemolytica in transported calves. Am J.
Vet. Res. 44: 981–985.
-
Gentry, M. J., Confer, A. W. and
Panceirta, R. J. (1982) Serum neutralization of cytotoxin from Pasteurella
haemolytica leukotoxin gene cluster. DNA 8: 15–28.
-
Lo, R. Y. C. Strathdee, C. A. and
Shewen, P. E. (1987) Nucleotide sequence of the leukotoxin genes of
Pasteurella haemolytica A1. Infection and Immunity 55: 1987–1996.
-
Morter, R. L., Amstutz, H. E., Crandell.
R. A. (1982) Clinical evaluation of prophylactic regimens for bovine
respiratory disease. Bovine Prac. 17: 56–58.
-
McKimm-Breschkin, J. L. (1990) The
use of tetramethylbenzidine for solid phase immunoassays. J. Immunol.
Methods 135: 277–280.
-
Mosier, D. A., Confer, A. W., Hall,
S. M., Gentry, M. J. and Panciera, R. J. (1986) Enzymelinked immunosorbant
assay for the detection of serum antibodies to Pasteurella haemolytica
cytotoxin (leukotoxin) in cattle. J Clin. Microbiol. 24: 218–222.
-
Mosier, D. A. Simons, K. R., Confer,
A. W., Panciera, R. J. and Clinkenbeard, K. D. (1989) Pasteurella haemolytica
antigens associated with resistance to pneumoic pasteurellosis.
Infect. Immun. 57: 711–716.
-
Sambrook, J., Fritsch, E. F. und
Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Auflage, Cold
Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York.
-
Schiefer, B., Ward, G. E. und Moffatt,
R. E. (1978) Correlation of microbiological and histological findings
in bovine fibrinous pneumonia. Vet. Pathol. 15: 313–321.
-
Shewen P. E. und Wilkie B. N. (1982)
Cytotoxin of Pasteurella haemolytica acting on bovine leukocytes.
Infect. Immun. 35: 91–94.
-
Shewen, P. E. und Wilkie B. N. (1987)
Vaccination of calves with leukotoxic culture supernatant from Pasteurella
haemolytica. Can. J. Vet. Res. 52: 30–36.
-
Strathdee, A. A. und Lo, R. Y. C.
(1989) Cloning, nucleotide sequence, and characterisation of genes encoding
the Pasteurella haemolytica leukotoxin determinant. J. Bact 171:
916–928.
-
Yanisch-Perron, C., Viejra, J. und
Messing, J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains;
nucleotide sequence of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33: 103–119.