JP2000509243A - パスツレラ・ヘモリチカ白血球毒素に対する免疫 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ウシ呼吸器系疾患（ＢＲＤ）コンプレックス、輸送熱または肺炎パスツレラ症は、ウイルス感染、有害環境および貧免疫状態が併合することにより動物が細菌感染しやすくなる多因性疾患である。この外毒素または白血球毒素（Ｌｋｔ）は、一次的な肺の防御や続く免疫応答を害したり、白血球溶解の結果炎症を引き起こすことにより病原性に関与し得る。本発明は、部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒素を産生する修飾微生物を提供する。本発明の更なる実施態様では、生物体のＬｋｔ構造遺伝子および／または翻訳後アクチベーターを含むＬｋｔ毒素オペロンが部分的にまたは完全に不活性化されている修飾微生物が提供される。本出願人は、Ｌｋｔ毒素前駆体が有毒活性を低減することを見いだした。意外にも、Ｌｋｔ毒素前駆体は、Ｌｋｔ毒素を産生する微生物による異種攻撃に対する交差防御を表す動物の免疫応答を誘発する能力がある。Ｌｋｔ毒素を天然に産生する微生物は、前駆体産物の翻訳後アクチベーターを除去することにより、不活性Ｌｋｔ毒素前駆体を産生するように操作できる。従って、好ましい実施態様では、この微生物はＬｋｔ毒素前駆体の翻訳後アクチベーターを産生できないか、またはＬｋｔ毒素前駆体の不活性化された翻訳後アクチベーターを産生する。翻訳後アクチベーターは、ＬｋｔＣ遺伝子産物であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】 パスツレラ・ヘモリチカ白血球毒素に対する免疫 本発明は、生ワクチンとしての使用に適した修飾微生物に関する。本発明はま た、生物ベクターとしての修飾微生物の使用に関する。本発明は、更に、ワクチ ン組成物に関する。 ウシ呼吸器系疾患（ＢＲＤ）コンプレックス、輸送熱または肺炎パスツレラ症 は、ウイルス感染、有害環境および貧免疫状態が併合することにより動物が細菌 感染しやすくなる多因性疾患である。ＢＲＤは、ウシフィードロット産業におけ る経済的損失の主たる原因である。この疾患に関連する主要な微生物は、細菌パ スツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella harmolytica）血清型１である。(Schiefer et al.,1978)。正常条件下では、Ｐ.ヘモリチカは上気道の正常フローラの１種 であり、肺クリアランス機構が害された場合のみ肺のコロニー形成が起こって疾 病に至る(Frank and Smith，1983)。菌力因子（virulence factors）の多くは、 Ｐ.ヘモリチカに関連しており、夾膜ポリサッカライドなどの表面構造(Adam et al.,1984)および熱不安定性の反御動物白血球に特異的な分泌化外毒素（Shewen and Wilkie,1982）を含む。 この外毒素または白血球毒素（Ｌｋｔ）は、主な肺の防御や続く免疫応答を害 したり、白血球溶解の結果炎症を引き起こすことにより病原性に関与し得る。Ｌ ｋｔの特性対比により、それが、アクチノバシラス種、プロテウス・ブルガリス 、モルガネラ・モルガニイ、ボルデテラ・ペルツシスを含む種々の細菌により産 生されるＲＴＸファミリー毒素の一員であること、それらの殆どがE.coliにより 産生されるものであることが示されている(Strathdee and Lo,1989)。全てのＲ ＴＸ毒素は、標的細胞内に小孔を開けることによって、浸透圧バランスを妨害し 、標的細胞の破壊を導くという働きをする。作用様式はＲＴＸ毒素と同一である が、その標的細胞は、タイプや交差種特異性の点で大きく変わる。この毒素ファ ミリーは、構造的に、毒素内にグリシン豊富反復構造があることを特徴とし、こ れはカルシウムに結合し、標的細胞における認識および結合の役割、小孔形成に かかわる疎水性ドメインの領域、翻訳後活性化のための必要条件、および分泌の ため のＣ−末端シグナル配列への依存関係を持つ。活性ＲＴＸ毒素の産生および分泌 は、少なくとも４つの遺伝子、Ｃ、Ａ、ＢおよびＤの活性を必要とする。Ａ遺伝 子は、構造毒素をコードし、Ｃ遺伝子は翻訳後アクチベーターをコードし、Ｂお よびＤ遺伝子は、活性毒素の分泌に必要なタンパク質をコードする。Ｌｋｔは、 一つのプロモーターにより転写される４つの隣接遺伝子（ＣＡＢＤ）からなるオ ペロンによりコードされている。Ｌｋｔは、広い宿主細胞特異性を持つその他多 くのＲＴＸ毒素とは異なり、反御動物の白血球に限定される標的細胞特異性を持 つ(概説：Coote,1992)。 Ｌｋｔは、実験的攻撃後のフィードロットにおける肺炎の発病率と重篤度を減 少する効果を示すＬｋｔ（Gentry et al.,1985；Mosier et al.,1986；Shewen a nd Wilkie,1987；Shewen et al.,1988）を含有する疾病耐性に関する分野の抗毒 素抗体および市販の培養上清ワクチンによる防御免疫にも関連している(Prespon se；Langford Inc.,Guelph,Ontario,Canada)。この培養上清ワクチンは、抗Ｌｋ ｔ抗体を含む以外に、培養上清に存在するその他の可溶性抗原に対する免疫応答 も刺激するので、抗Ｌｋｔと防御との間に直接的な相関関係は要求されないこと もある。 この分野でのパスツレラ細菌ワクチン（不活性ワクチン）の使用は、肺炎性パ スツレラ症を制御するという限られた成功しか収めておらず、数回の実地試験で は、細菌ワクチンベースのワクチンを投与しても疾病を防御せず、または疾病の 増大を導く場合もあった(Bennett,1982;Morter et al.,1982)。細菌ワクチンに は、部位反応をもらたし得るアジュバントの使用が必要であるという不利点もあ り、防御のためには多くの場合で多回用量を必要とする。 本発明の目的は、従来技術のもつ課題を１つ以上解決することである。 従って、一態様では、本発明は、部分的にまたは完全に不活性化されているＬ ｋｔ毒素を産生する修飾微生物を提供する。 “修飾”という用語は、組換えＤＮＡ技術またはその他の技術、例えば、化学 的にまたは放射能により引き起こされる突然変異誘発、による修飾を含む。組換 えＤＮＡ技術は、外来ＤＮＡの宿主細胞への導入に関連し、そのＤＮＡはあらゆ る適切な方法により導入できる。適切な方法には、コンピーテント細胞の形質転 換、形質導入、接合および電気穿孔がある。 本発明の更なる実施態様では、微生物のＬｋｔ構造遺伝子および／または翻訳 後アクチベーターを含むＬｋｔ毒素オペロンが部分的にまたは完全に不活性化さ れている修飾微生物が提供される。 請求の範囲および説明で使用した“Ｌｋｔ毒素オペロン”という用語は、Ｌｋ ｔ毒素オペロン産物であるＬｋｔ毒素の発現にかかわるような遺伝子を含むこと を意図する。Ｌｋｔ毒素オペロンに含まれる遺伝子には、翻訳後アクチベーター 遺伝子（Ｃ）、構造遺伝子（Ａ）および活性化Ｌｋｔ毒素の分泌に必要なタンパ ク質をコードするＢおよびＤ遺伝子がある。 請求の範囲および説明で使用した“部分的にまたは完全に不活性化”という用 語は、組換えＤＮＡ技術および化学的にまたは放射能により引き起こした突然変 異誘発または部位特異的突然変異誘発による遺伝子の修飾を含み、組換えＤＮＡ 技術には、標的構築物またはプラスミド分離を用いる、ＤＮＡの導入およびＤＮ Ａの遺伝子からの欠失があり、単一または複数ヌクレオチド置換、付加および／ または欠失を含み、その欠失には遺伝子の完全または部分的欠失がある。 本出願人は、Ｌｋｔ毒素前駆体が有毒活性を低減することを見いだした。意外 にも、本出願人は、Ｌｋｔ毒素前駆体が、Ｌｋｔ毒素を産生する微生物による異 種攻撃に対する交差防御を表す動物の免疫応答を誘発できることも見いだした。 従って、本発明の好ましい実施態様では、不活性化Ｌｋｔ毒素は、Ｌｋｔ毒素 前駆体である。前駆体は、Ｌｋｔ構造遺伝子のプロセッシングされない発現産物 であり得る。Ｌｋｔ構造遺伝子は、Ｌｋｔ Ａ遺伝子であり得る。 微生物は、天然にはＬｋｔ毒素を産生しないものであってもよい。その微生物 は、その中にＬｋｔ Ａ遺伝子などのＬｋｔ構造遺伝子が導入されている、細菌 、ウイルスまたはカビであり得る。 しかしながら、好ましい実施態様では、微生物はＬｋｔ毒素を天然に産生する ものである。Ｌｋｔ毒素を天然に産生する微生物は、パスツレラ・ヘモリチカで あり得る。 本出願人は、Ｌｋｔ毒素を天然に産生する微生物は、前駆体産物の翻訳後アク チ ベーターを除去することにより、不活性Ｌｋｔ毒素前駆体を産生するように操作 できることを見いだした。従って、好ましい実施態様では、この微生物はＬｋｔ 毒素前駆体の翻訳後アクチベーターを産生できないか、または不活性化された、 Ｌｋｔ毒素前駆体の翻訳後アクチベーターを産生する。翻訳後アクチベーターは 、Ｌｋｔ Ｃ遺伝子産物であり得る。 好ましい実施態様では、微生物のＬｋｔ Ｃ遺伝子は、不活性化されているか 、または部分的または完全に欠失している。Ｌｋｔ Ｃ遺伝子は、部位特異的突 然変異誘発により不活性化することができる。Ｌｋｔ Ｃ遺伝子は、どのような 単一または複数ヌクレオチド置換、付加および／または欠失によっても不活性化 できる。好ましくは、Ｌｋｔ Ｃ遺伝子は、標的構築物を用いる相同的組換えに より不活性化する。標的構築物は、所望の挿入部位のフランキング配列に相同な 配列によりフランクされた選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、水銀など の有毒物質に対する耐性を与える遺伝子であることができ、または抗生物質耐性 決定子であってもよい。抗生物質耐性決定子は、アンピシリン耐性、カナマイシ ン耐性またはストレプトマイシン耐性をコードする遺伝子であり得る。 ある環境では、修飾微生物内に取り込まれた機能性抗生物質耐性遺伝子を持つ のは望ましくない場合もある。従って、本発明は、反復配列などの遺伝子エレメ ントを含む標的構築物を包含し、この遺伝子エレメントは、標的構築物が一旦、 宿主染色体による相同的組換えを受けると、抗生物質耐性遺伝子の削除を容易に するものである。 本発明は、選択マーカーを含まない標的構築物も包含する。例えば、標的構築 物は、欠失のあるＬｋｔ Ｃ遺伝子のセグメントを含むこともある。宿主染色体 と共に標的構築物が相同的組換えを受けた結果、欠失箇所が染色体Ｌｋｔ Ｃ遺 伝子へ導入されることになる。この場合、Ｌｋｔ毒素の産生がないことに基づい て組換え体を選択できる。 標的構築物は、宿主細胞へ鎖状形態で直接導入できる。あるいは、標的構築物 は自殺（スイサイド）または非複製ベクターを介して導入することもできる。自 殺ベクターは、宿主微生物中で複製できないどのようなプラスミドであってもよ い。天然にＬｋｔ毒素を産生する微生物は、ｐＥＰベクターに対して非許容宿主 であることが多い。従って、ｐＥＰベクターは、本発明で使用できる自殺ベクタ ーの例である。 その他の実施態様では、部位特異的突然変異誘発は、プラスミド分離の技術に より達成できる。例えば、選択マーカー遺伝子で分断されたＬｋｔ Ｃ遺伝子の フラグメントを含有するプラスミドを微生物へ導入することができる。続いて、 その微生物は、第２の選択マーカー遺伝子を含有する第２のプラスミドで形質転 換させることができる。その後、両方のプラスミドを含む宿主細胞は、第１のプ ラスミドに対してのみ選抜する培地により継代できる。そのため、第１のプラス ミドは失われるが、選択マーカーを含む分断Ｌｋｔ Ｃ遺伝子フラグメントの染 色体への組換えが起こる場合もある。そのため、このプロセスは、分断Ｌｋｔ Ｃ遺伝子の染色体Ｌｋｔ Ｃ遺伝子への組換えを促進でき、そうして染色体Ｌｋ ｔ Ｃ遺伝子を不活性化する。 本発明の更なる態様では、部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒 素をコードする発現ベクターを提供し、該ベクターはＬｋｔ構造および／または 翻訳後アクチベーター遺伝子を含むＬｋｔ毒素遺伝子をコードしており、該Ｌｋ ｔ毒素オペロンは部分的または完全に不活性化されている。 請求の範囲および説明で使用した“発現ベクター”という用語は、外来ＤＮＡ 配列を含むＤＮＡ配列を発現する染色体または染色体外エレメントを含む。 Ｌｋｔ Ａ遺伝子産物は、染色体Ｌｋｔ Ａ遺伝子から発現させることができる 。染色体Ｌｋｔ Ａ遺伝子は、その本来の位置で染色体上にあることができ、ま たその本来の配置以外の位置で染色体へ挿入することもできる。更に、Ｌｋｔ遺 伝子産物は、プラスミドなどの染色体外エレメント上にあるＬｋｔ Ａ遺伝子か ら発現させることができる。そのため、一実施態様では、Ｌｋｔ Ａ遺伝子を含 有する染色体外エレメントは、機能的染色体Ｌｋｔ Ａ遺伝子と不活性化染色体 Ｌｋｔ Ｃ遺伝子をもつ微生物へ導入できる。染色体外エレメントから発現され るＬｋｔ Ａ産物は、染色体遺伝子から発現されるＬｋｔ Ａ産物を補うことがで きる。 あるいは、Ｌｋｔ Ａ遺伝子産物は、全体的にプラスミドなどの染色体外エレ メ ント上にあるＬｋｔ Ａ遺伝子または遺伝子群から発現させることができる。染 色体外エレメント上にあるＬｋｔ Ａ遺伝子は、染色体外エレメントに対する選 択の存在下または不在下のいずれかで発現させることができる。そのため、一実 施態様では、Ｌｋｔ Ａ遺伝子を含有する染色体外エレメントを、機能的染色体 Ｌｋｔ ＡおよびＬｋｔ Ｃ遺伝子を欠く微生物に導入することができる。機能的 Ｌｋｔ ＡおよびＬｋｔ Ｃ遺伝子を欠く微生物は、微生物の突然変異誘発により 製造できる。突然変異誘発は、Ｌｋｔ ＡおよびＬｋｔ Ｃ遺伝子またはその部分 の欠失をもたらすものであり得る。 この染色体外エレメントは、Ｌｋｔ Ａ遺伝子を含む組換え発現ベクターであ ってもよい。好ましくは、組換え発現ベクターは、天然にＬｋｔ毒素を産生する 微生物においてＬｋｔ Ａ遺伝子を発現させるものである。この組換え発現ベク ターは、Ｐ．ヘモリチカにおいてＬｋｔ Ａ遺伝子を発現させることができる。 組換え発現ベクターは、ｐＩＧプラスミドから得ることができる。組換えプラス ミドは、ｐＩＧ３Ｂから得ることができる。組換えプラスミドは、ｐＩＧ３Ｂ− Ｌｋｔであり得る。 ＡＰＰ（Ｐｈ）に基づく細菌ベクター系は、宿主細胞へ“裸の（naked）ＤＮ Ａ”ワクチン分子を送達する別の手段を提供する。このような裸のＤＮＡワクチ ン／発現系は、細菌系で複製可能なプラスミドと、対象の外来／組換え遺伝子の 発現を制御する真核生物プロモーターを含む。 好ましい実施態様では、微生物は、Ｌｋｔ毒素分子の分泌を促進する１種以上 の機能性タンパク質を産生できる。この微生物は、機能性Ｌｋｔ Ｂおよび／ま たはＬｋｔ Ｄ遺伝子を持つことができる。その他の実施態様では、微生物は、 Ｌｋｔ毒素分子の分泌にかかわる少なくとも１種のタンパク質を産生できないか 、またはＬｋｔ毒素分子の分泌にかかわる少なくとも１種の不活性タンパク質を 産生する。この微生物は、不活性Ｌｋｔ Ｂおよび／またはＬｋｔ Ｄ遺伝子を持 つことができる。従って、この微生物は、活性なまたは不活性なＬｋｔ毒素分子 を分泌できないこともある。 その他の態様では、本発明は、Ｌｋｔ毒素前駆体を含むワクチン組成物を接種 し た宿主動物において免疫学的応答を誘発するためのワクチン組成物を提供する。 Ｌｋｔ毒素前駆体は、Ｌｋｔ構造遺伝子のプロセッシングされていない発現産物 であり得る。Ｌｋｔ構造遺伝子は、Ｌｋｔ Ａ遺伝子であり得る。 本発明は、更に、部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒素を産生 する修飾微生物を含むワクチン組成物を提供する。好ましくは、不活性化Ｌｋｔ 毒素は、Ｌｋｔ毒素の前駆体である。この前駆体は、Ｌｋｔ構造遺伝子のプロセ ッシングされていない発現産物であり得る。Ｌｋｔ構造遺伝子は、ＬｋｔＡ遺伝 子であり得る。好ましくは、微生物はパスツレラ・ヘモリチカである。好ましく は、微生物のＬｋｔ Ｃ遺伝子は不活性化されているか、または欠失している。 好ましい実施態様では、修飾微生物を含むワクチン組成物は、生ワクチンであ る。 本発明のワクチン組成物は、アジュバントまたは免疫刺激分子を追加しても、 または追加しなくても医薬的に許容できるどのような媒体にも組み込むことがで きる。 そのアジュバントは適切な種類のものならどれでもよい。アジュバントは、植 物油またはそのエマルション、界面活性物質、例えば、ヘキサデシルアミン、オ クタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチル− ジオクタデシル−アンモニウムブロミド、Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ'−Ｎ'ビ ス(２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン)、メトキシヘキサデシルグリセロ ール、およびプルロニック・ポリポル(pluronic polypols)；ポリアミン、例え ば、ピラン、デキストランスルフェート、ポリＩＣ、カルボポル；ペプチド、例 えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、ツフシン(tuftsin)；免疫刺激 複合体(ＩＳＣＯＭＳ)；油状エマルション；および鉱物ゲルおよび懸濁物から選 択することができる。アルミなどの鉱物懸濁物、即ち、水酸化アルミニウム(Ａ1 (ＯＨ)₃)、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムが好ましい。アジュバン トは、ワクチン組成物の総重量に対しおよそ１から７５重量％の量で存在し得る 。 Ｌｋｔ毒素前駆体またはＬｋｔ毒素前駆体を産生する能力のある微生物を含む 本発 明のワクチンが、対応するＬｋｔ毒素を産生するある範囲の血清型の微生物に対 する防御を提供する可能性を持つことは評価されるであろう。 その他の態様では、本発明は、活性なＬｋｔ毒素を産生できないように修飾し たパスツレラ・ヘモリチカ細菌を含む生物ベクターを提供する。 好ましい実施態様では、この修飾細菌は、Ｌｋｔ毒素前駆体の翻訳後アクチベ ーターを産生できないか、またはLkt毒素前駆体の不活性化翻訳後アクチベータ ーを産生する。翻訳後アクチベーターは、Ｌｋｔ Ｃ遺伝子産物であり得る。好 ましい実施態様では、修飾細菌のＬｋｔ Ｃ遺伝子は、不活性化されているかま たは欠失している。Ｌｋｔ Ｃ遺伝子は、単一または複数ヌクレオチド置換、付 加および／または欠失により不活性化できる。 Ｌｋｔ Ｃ遺伝子は、選択マーカーを含有する標的構築物を部位特異的組換え を経てＬｋｔＣ染色体遺伝子へ導入することにより、不活性化できる。標的構築 物は、遺伝子エレメント、例えば反復単位を含むことができ、この遺伝子エレメ ントは、標的構築物が一旦、宿主染色体による相同的組換えを受けると、抗生物 質耐性遺伝子の削除を容易にするものである。あるいは、選択マーカーを含有し ない標的構築物を用いてＬｋｔ Ｃ染色体遺伝子内に欠失を導入することもでき る。 Ｌｋｔ Ａ遺伝子産物は、染色体Ｌｋｔ Ａ遺伝子から発現させることができる 。染色体Ｌｋｔ Ａ遺伝子は、その本来の位置で染色体上にあることができ、ま たその本来の配置以外の位置で染色体へ挿入することもできる。更に、Ｌｋｔ遺 伝子産物は、プラスミドなどの染色体外エレメント上にあるＬｋｔ Ａ遺伝子か ら発現させることもできる。あるいは、Ｌｋｔ Ａ遺伝子産物は、全体的に、プ ラスミドなどの染色体外エレメント上にあるＬｋｔ Ａ遺伝子または遺伝子群か ら発現させることもできる。 好ましい実施態様では、微生物は、Ｌｋｔ毒素分子の分泌を促進する１種以上 の機能性タンパク質を産生できる。この微生物は、機能性Ｌｋｔ Ｂおよび／ま たはＬｋｔ Ｄ遺伝子を持つことができる。その他の実施態様では、微生物は、 Ｌｋｔ毒素分子の分泌にかかわる少なくとも１種のタンパク質を産生できないか 、またはＬｋｔ毒素分子の分泌にかかわる少なくとも１種の不活性タンパク質を 産生する。 “生物ベクター”という用語は、生物学的に活性な分子の発現に適した生物学 的手段を含むその最も広義で用いている。生物学的手段は、好ましくは生存能の ある微生物であるが、死滅微生物を採用してもよい。生物ベクターは、非病原性 であるか、または無毒化してもよく、または非病原性または無毒性の有効量で与 えることもできる。“生物学的に活性な分子”という用語は、成長因子、ホルモ ン、酵素、抗原またはその抗原性部分、インターロイキンなどのサイトカイン、 インターフェロンおよび腫瘍壊死因子などの機能性分子を含む。あるいは、この 分子は、生物学的に活性な分子をコードする遺伝子または遺伝子群を持つプラス ミドで生物ベクターを形質転換させ、その後それを発現させることにより；また は、プラスミドおよび／または遺伝子または遺伝子群および／またはその部分を 、その遺伝子または遺伝子群またはその部分が発現される染色体および／または 天然または非天然の染色体外エレメントを含む宿主ゲノムへ組込んだ場合に、発 現される組換え分子であってもよい。 本発明の生物ベクターを用いて１種以上の有用なタンパク質を宿主動物へ提供 できることは評価されるであろう。そうして提供されるタンパク質は、協動的に 作用して宿主動物において反応の増強を引き起こすことができる。例えば、生物 ベクターは、宿主動物中で抗原に対する免疫原性応答を高める分子と共に抗原を 産生できる。免疫原性応答を高める分子は、サイトカインであり得る。 本発明の生物ベクターを使用して多価ワクチンを提供できることは評価される であろう。“多価ワクチン”という用語は、最も一般的な意味で用いており、修 飾微生物上の、または修飾微生物によって発現される２つ以上の別個の抗原エピ トープに対する免疫応答を誘発する能力があり、その２つ以上のエピトープがそ の修飾微生物に固有のものである、修飾微生物にまで及ぶものてする。しかしな がら、より一般的には、多価ワクチンは、該微生物の有毒形態並びに該微生物に より発現される、微生物に固有のものではない、異種抗原（例えば、組換え抗原 または形質導入、接合または形質転換により導入されるもの）に対する免疫応答 を誘発する能力のある修飾微生物を含む。この点で、多価ワクチンは、２種以上 の病原体に対するものであって良い。好ましい多価ワクチンは、Ｌｋｔ毒素に対 す る、また１種以上の病原体由来の少なくとも１種の抗原性エピトープに対する免 疫応答を誘発する能力のあるものである。病原体は、パスツレラ種、ヘモフィラ ス種、モラキセラ種、レプトスピラ種、ストレプトコッカス種、サルモネラ種、 Ｅ.コリ、フソバクテリウム種、クロストリジウム種、マイコバクテリウム種な どの細菌病原体から選択できる。病原体は、ヘモカス種、トリコストロンジラス 種などの内部寄生体、またはブーフィラス種などの外部寄生体からも選択できる 。あるいは、病原体は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、パラインフ ルエンザウイルス（ＰＩ３）、感染性ウシ鼻腔気管炎（ＩＢＲ）、コロナウイル ス、ロタウイルスなどのウイルス病原体から選択してもよい。 本発明は、更に、活性Ｌｋｔ毒素を産生する微生物を提供し、そしてＬｋｔ Ｃ遺伝子を不活性化または欠失することを含む、部分的にまたは完全に不活性化 されているＬｋｔ毒素を産生する修飾生物体の製法を提供する。 本発明は、更に、活性Ｌｋｔ毒素を産生する能力のない微生物を提供し、そし て機能性Ｌｋｔ Ａ遺伝子を該微生物内へ導入することを含む、部分的にまたは 完全に不活性化されているＬｋｔ毒素を産生する修飾生物体の製法を提供する。 本発明は、更なる態様において、Ｌｋｔ毒素産生微生物に対する動物のワクチ ン接種法を提供し、該方法は、本発明のワクチンの免疫学的有効量を該動物に投 与することを含む。 このワクチン接種法は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどの家畜の処置に有用で ある。このワクチン接種法は、ウマ、イヌやネコなどの伴侶動物の処置に使用す ることもできる。ワクチン接種法は、ヒトの処置に使用することもできる。好ま しい実施態様では、ワクチン接種法は、ウシの処置に利用する。好ましくは、こ のワクチン接種法は、ウシ呼吸器系疾患(ＢＲＤ)コンプレックスの処置に利用す る。 本発明によるワクチンまたはワクチンベクターの投与は、経口または非経口投 与などの適切な経路によるものである。この投与は、経鼻または経膣などの粘膜 投与であることもできる。あるいは、筋肉内、経皮、皮下または腹膜内投与であ ってもよい。製剤は、乾燥または液体形態であり得る。選択した投与経路によっ て は、プロテアーゼ阻害剤、抗炎症剤などの付加成分を必要とする場合もある。 本発明は、更なる態様において、病原体に対する動物のワクチン接種法を提供 し、該方法は、該病原体の免疫学的有効量の抗原を合成する本発明のワクチンベ クターの有効量を該動物に投与することを含む。 更に別の態様では、本発明は、本発明の修飾微生物を培養し、該微生物によっ て産生された不活性毒素を回収することを含む、不活性Ｌｋｔ毒素の製法を提供 する。本方法により産生された不活性Ｌｋｔ毒素は、例えばワクチン中の活性免 疫原としてＬｋｔ毒素に対する防御免疫応答を刺激するために使用することがで きる。 本明細書の説明および請求の範囲全般にみられる、“含む”という用語やその 変形の“含んでなる”という用語は、他の添加物、成分、集合体または工程の排 除を意図するものではない。 本発明を一層容易に理解できるよう、下記に実施例を非限定的に提供する。 図面の簡単な説明 図１。Ｅ.コリのＬｋｔ発現カセットの構築。Ｌｋｔ遺伝子は、Ｌｋｔを発現 させるためのポリＨＩＳリーダー配列をフレーム内に持つｐＱＥ中にクローン化 した。ｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性遺伝子は、ｐＱＥ−Ｌｋｔプロモータ ー／レギュレーター配列の５'のユニーク（唯一の）ＸｈｏＩ制限部位にクロー ン化した。得られたプラスミド、ｐＱＥ−ＬｋｔＫは、カナマイシン耐性遺伝子 に連結させた制御発現下のＬｋｔ遺伝子を含有する。 図２。アクチノバシラス・プルロニューモニアエのオーストラリア株から単離 した、ストレプトマイシン耐性をコードする４.２kbプラスミドであるｐＩＧ３ の部分的制限酵素地図(図２Ａ)。２.３kbのＰｓｔＩフラグメント（ｐＩＧ３１ ７）は、プラスミド複製をコードし、自己ライゲーションした場合にストレプト マイシン耐性を与えるのに十分であることが分かっているので、これをＥ.コリ またはＰ.ヘモリチカへ形質転換した。マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）とl ac遺伝子の一部を含有するプラスミドベクターｐＩＧ３Ｂは、ｐＩＣ１９ＲのＨ ａｅＩＩフラグメントをｐＩＧ３１７のユニークＥｃｏＲＩ部位へ導入すること により構築した(図２Ｂ)。ＭＣＳとプラスミド主幹にて切断するＰｓｔＩを除く ユニーク制限 酵素部位は、ｐＩＧ３Ｂ（Ｃ）で示す(図２Ｃ)。 図３。Ｐ.ヘモリチカで使用するＬｋｔ発現カセットの構築。カナマイシン耐 性遺伝子と連結させた、ｐＱＥ−ＬｋｔＫ由来のこのＬｋｔ発現カセットは、Ｓ ｐｈｌＩ制限酵素フラグメントとして単離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し て、平滑末端を作り、ｐＩＧ３ＢのユニークＥｃｏＲＶにクローン化した。ｐＩ Ｇ３Ｂのマルチクローニングサイトのユニーク制限酵素部位が全て示されている わけではない。 図４。Ｌｋｔ発現カセットを含有するＰｈ：Ｌｋｔ^-株のウエスタン・ブロッ ト解析。Ｐ.ヘモリチカＥＭＡＩ、Ｐｈ：Ｌｋｔ^-およびＬｋｔ発現カセット（ｐ ＩＧ３Ｂ−Ｌｋｔ）を含有するＰｈ：Ｌｋｔ^-株の指数増殖培養物由来のサンプ ルをウエスタン・ブロッティングにより試験した。毒素バンドは、Ｌｋｔに対し て生じたウサギ抗血清を用いて検出した。抗Ｌｋｔ血清は、Ｐ.ヘモリチカ株Ｅ ＭＡＩの調製の際にＬｋｔに相当するサイズのポリペプチドとＰｈ：Ｌｋｔ^-／ ｐＩＧ３Ｂ−Ｌｋｔには結合したが、Ｌｋｔ欠損株Ｐｈ：Ｌｋｔ^-の類似サイズ のバンドは認識しなかった。 図５。Ｐｈ中のｐＩＧベースのＣＡＴ発現カセット。一連のｐＩＧベースの発 現カセットをＰｈ中でＣＡＴ遺伝子を発現させるために構築した。各プラスミド は、ＣＡＴ遺伝子の５'側に並ぶプロモーターを持つ同じ構造であった。この研 究に使用したプロモーターは、Pｈ Ｌｋｔプロモーター；パスツレラ・マルト シダの皮膚壊死性毒素から単離したＤＮＴプロモーター；アクチノバシラス・プ ルロニューモニアエのＡＰＸ１毒素から単離したＡＰＸ１プロモーターであった 。 材料および方法 細菌株および生育条件 この研究に使用したＰ.ヘモリチカ株は、NSW Dept.Agriculture,Elizabeth Ma carthur Institute,Menangle(EMAI；オーストラリア)またはAmerican Type Cult ure Collection(ＡＴＣＣ)から入手した。Ｐ.ヘモリチカ株は、ブレイン・ハ− ト・インフュージョン培地（ＢＨＩ）中３７℃で連続振盪しながら生育させた。 血液寒天は、５％滅菌脱繊維素ヒツジ赤血球をＢＨＩ寒天に添加することにより 、調製した。抗生物質は、カナマイシンを最終濃度２５μｇ／mlで使用した。Sa mbrook等（1989）に概説されている標準技術を用いて、Ｅ.コリ株ＤＨ５αを本 研究 に使用した。 Ｐ.ヘモリチカ ゲノムＤＮＡの単離 ＢＨＩで生育させたＰ.ヘモリチカＥＭＡＩの一晩培養物１ml中に存在する細 菌を遠心にて集め、上清を捨てた。ペレットをリソチーム（７.５mg/ml）含有Ｔ Ｅ(１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５／１ｍＭ ＥＤＴＡ)１mlに再懸濁し、３ ７℃で２時間インキュベートした。溶液を０.１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび ２.５μｇ／mlプロテイナーゼＫの最終濃度に調整した後、インキュベーション を５０℃で一晩続けた。翌日、調製物を０.５Ｍ ＮａＣｌに調整し、フェノール ／クロロホルム／イソアミルアルコール（１００：９９：１、Ｖ／Ｖ／Ｖ）で２ 回抽出し、次いで、０.６容量のイソプロパノールを添加してゲノムＤＮＡを沈 澱させた。 Ｌｋｔ遺伝子の単離およびクローニング Ｌｋｔ遺伝子の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施した。 反応は、ゲノムＤＮＡ（ＥＭＡＩ）５０ng、オリゴヌクレオチドプライマー３ng 、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.３、２.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２００mg／ml ＢＳＡ、２００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄ ＴＴＰそれぞれ、更にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus,USA） １単位を含んでなる５０μｌ容量中で実施した。 反応物を、等容量のパラフィン油で覆い、９４℃まで１分間加熱し、５５℃ま で２分間冷まし、７２℃まで５分間加熱した。このサイクルをPerkin-Elmer-Cet usのＤＮＡ熱循環を用いて３５回繰り返した。特異的オリゴヌクレオチドは、公 開されたＬｋｔ遺伝子の配列に基づき設計した(Lo et al.,1987；Highlander et al.,1989)。２つのオリゴヌクレオチドの配列は、５'ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧ ＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＣＴＡＧＡＣＴＴＡＣＡＡＣＣ３'と５'ＣＧＣＧＡＡＴ ＴＣＴＴＡＡＧＣＴＧＣＴＣＴＡＧＣ３'であり、クローニングが容易なように ５'末端にＢａｍＨＩ部位および３'末端にＥｃｏＲＩ部位を持つＰＣＲ産物を産 生するように設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、遺伝子アセンブラー・ プラスＤＮＡ合成機(gene Assembler Plus DNA Synthesiser)(Pharmacia,Sweden )を用いて合成した。Ｌｋｔ遺伝子の予想分子量に相当するＰＣＲ反応産物を遺 伝子ク リーニング（gene cleaning）(BRESATech,Australia)によりアガロースゲルから 単離し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで制限酵素消化し、ｐＵＣ１８（Yanish-P erron et al.,1985）の対応する部位にクローン化して、プラスミドｐＵＣ−Ｌ ｋｔを形成した。二本鎖塩基配列決定によりＬｋｔ遺伝子を含有するクローンを 確認した（結果表示せず）。 プラスミドＤＮＡによるＰ.ヘモリチカの形質転換 電気コンピーテントなＰ.ヘモリチカは、ＢＨＩ培地に単一コロニーを接種し 、ＢＨＩ／血液寒天プレートで一晩培養することにより調製した。培養物はＯＤ₆₀₀ が０.８になるまで生育させ、その時点で培養物は中間対数増殖中であった（ データ表示せず）。遠心により細菌を回収し、１５％グリセロールで３回洗浄し 、元の容量の１／５０に再懸濁した。電気コンピーテントなＰ.ヘモリチカのア リコート（５０μ１）を次の条件を用い、プラスミドＤＮＡで形質転換した：１ ０００Ω、２.２５ｋＶおよび２５μＦ、０.２cmキュベット中。その後、適切な 抗生物質選択を含有するＢＨＩ寒天上にまく前に、電気穿孔により形質転換した 細胞を抗生物質選択なしに３７℃で４時間振盪しながらＢＨＩ培地で生育させた 。 抗血清の製造 ＰＣＲにより得られたＬｋｔ転写解読枠（オープン・リーディング・フレーム ）をｐＵＣ−Ｌｋｔから発現ベクターｐＧＥＸ２Ｔへサブクローン化し、フレー ム内にＧＳＴ遺伝子があるようにした。ＧＳＴ−Ｌｋｔ融合タンパク質を製造元 使用説明書（Pharmacia,Sweden）に従いＧＳＴアフィニティー・クロマトグラフ ィーにより精製した。 ウサギに精製タンパク質（１００μｇ）を２週間間隔で計３用量与え、最初は 完全フロイントアジュバント中で、続くワクチン接種は不完全フロイントアジュ バント中であった。 ウエスタン・ブロット解析 ウエスタン・ブロット（イムノブロット）解析は、Sambrook et al.(1989)の 方法により実施した。ＧＳＴ−Ｌｋｔ融合タンパク質に対して製造したウサギ血 清を５０分の１希釈でＬｋｔの検出に使用した。１０００分の１希釈で使用した コン ジュゲートは、基質としてテトラメチルベンジジン（McKimm-Breschkin 1990） を持つヒツジ抗血清ウサギＩgアファニティー単離ＨＲＰコンジュゲート化抗血 清（sienus）であった。ウエスタン・ブロット解析用の細菌サンプルは、一晩培 養物を適切な生育培地で２０分の１に希釈し、３７℃で勢いよく振盪しながらＯ Ｄ６００が０.８になるまでインキュベートすることにより、調製した。この点 で全培養物２０μｌを含有するサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、バイオ− ラド・トランスブロット・セル（Bio-Rad Transblot Cell）を用いて製造元説明 書に記載のようにタンパク質をニトロセルロース（Bio-Rad）に移した。 Ｐ.ヘモリチカのＬｋｔ発現カセットの構築 Ｌｋｔ転写解読枠（ＯＲＦ）をｐＵＣ−Ｌｋｔから、図１に概説したようにフ レーム内にポリＨｉｓ精製シグナルを持つ発現ベクターｐＱＥ３０（IQAGEN Inc .,Chats worth,CA,USA）へサブクローンした。Ｌｋｔ遺伝子のｐＱＥ３０からの 発現（ｐＱＥ３０−Ｌｋｔ）は、Ｅ.コリファージＴ５プロモーターおよび２つ のlacオペレーター配列の制御下であった。ｐＱＥ−Ｌｋｔ由来のこの発現エレ メントを別のプラスミドへ容易にサブクローニングするために、図１に概説した ようにｐＱＥ−Ｌｋｔへクローニングする前にカナマイシン耐性遺伝子をｐＵＣ ４Ｋ（Pharmacia）から単離し、ｐＩＣ２０Ｒを介してシャトルさせた。得られ たプラスミド、ｐＱＥ−ＬｋｔＫは、カナマイシン耐性遺伝子と、Ｔ５プロモー ターに連結させたＬｋｔ遺伝子とを含有し、両方ともユニークＳｐｈＩ制限酵素 部位にフランクされている（図１）。 Ｐ.ヘモリチカを形質転換するのに適したプラスミドは、我々の実験室にて開 発した。親プラスミドをアクチノバシラス・プルロニューモニアエのオーストラ リア株から単離し、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに概説したプラスミドベクターｐＩ Ｇ３Ｂへと発展させた。Ｌｋｔ遺伝子含有ＳｐｈＩ制限酵素フラグメントおよび 転写調節シグナルをｐＱＥ−Ｔ１Ｋから単離し、ｐＩＧ３ＢのＥｃｏＲＶ部位に サブクローン化して、図３に概説したＰ.ヘモリチカＬｋｔ Ａ遺伝子発現ベクタ ーｐＩＧ３Ｂ−Ｌｋｔを製造した。 Ｐ.ヘモリチカワクチン株の構築 Ｌｋｔ Ｃ遺伝子の小部位を欠失するよう設計したＰ.ヘモリチカ（ＥＭＡＩ株 ）染色体の部位突然変異誘発プロセス中、血液寒天プレート上で溶血ゾーンを作 ることのできない単離物を得た。この株（Ｐｈ：Ｌｋｔ^-）を更に特性化したと ころ、ＬｋｔＣとＡの両方の生産について欠陥のあることが示された。 Ｐｈ：Ｌｋｔ^-株は、材料および方法のところで記載のようにｐＩＧ３Ｂ−Ｌ ｋｔにより形質転換させ、ＤＮＡをカナマイシン耐性コロニーから単離し、制限 酵素消化により解析して、ｐＩＧ３Ｂ−Ｌｋｔの予想プロフィールを確認した。 Ｐ.ヘモリチカワクチン株の特性化 ｐＩＧ３Ｂ−Ｌｋｔ含有Ｐｈ：Ｌｋｔ^-株、並びにＰ.ヘモリチカＰｈ：Ｌｋｔ^- およびＡＴＣＣ株の一晩培養物を、ＧＳＴアフィニティー精製Ｌｋｔタンパク 質に対して生じるウサギの抗血清を用いてウエスタン・ブロッティングにより試 験した。ウエスタン・ブロット（図4)から、Ｐｈ−Ｌｋｔ^-株は血清中に存在す るどの抗体とも特異的に結合しないが、野生型ＡＴＣＣ株とｐＩＧ３Ｂ−Ｌｋｔ 含有Ｐｈ：Ｌｋｔ-株の両方は、Ｌｋｔ抗血清と反応する、Ｌｋｔの予想分子量 のタンパク質を産生することが理解できる。 実施例１ ウシでのＰｈ毒素^- _-ワクチンの評価 およそ１年齢のウシを使用前に採血して、Ｐｈに対する抗体が予め存在しない ことを確認し、その後、それらを３匹ずつ２つの無作為グループに分けた。０日 目に、１グループの３匹にＰｈ−Ｌｋｔの指数増殖培養物５０ml（５×１０¹⁰c. f.u.に等しい）を気管内接種により与えた。ワクチン接種実験に先立ち、ウシに ５×１０¹⁰から２×１０¹¹の範囲のＰｈ−Ｌｋｔ-ワクチン株用量を与えるとい う実験を実施し、臨床兆候について監視し、肺病変が発症したかどうかを測定す るため攻撃後１週間で解剖した。試験した全ての用量で肺病変は現れず、またウ シも正常範囲外の体温を示さなかった。第２グループは非ワクチン接種対照とし た。１４日目にウシに０日目のように再度ワクチン接種した。２８日目に、全て のウシを野生型Ｐｈの指数増殖培養物１００mlで気管内直接接種により攻撃した 。臨床兆候を次の８日間監視し、その時点で全てのウシを安楽死させ、肺病変を スコアし た。 攻撃後８日目の解剖時点で各動物に存在する肺病変の数および重篤度は表１に 表す。非ワクチン接種対照をＰｈで攻撃すると、攻撃を受けたウシ３匹のうち２ 匹で急性肺炎が起こった。３番目のウシは、解剖時にＰｈ感染のなんの兆候も示 さなかったが、恐らく、気管を介し攻撃を送達する際のエラーによるか、あるい は、Ｐｈが多くのウシでは共生物であるので、このウシでは攻撃前にＰｈに対す る免疫が発生したのかもしれない。ワクチン接種した動物グループの中で、１匹 だけＰｈ感染の兆候を発症した。それは、右先端葉における幾つかの小葉が硬化 （１cm以下のサイズ）した形であった。 この実験は、明らかに、Ｐｈ誘導ＢＲＤからウシを防御するための生ワクチン としてＰｈ−Ｌｋｔ^-を使用できる可能性を示している。Ｐｈ−Ｌｋｔ^-株による 攻撃はウシ肺において病変を誘導しない（１０¹¹c.f.u.の用量まで）ことが分か っているので、ワクチン株はウシに悪影響を及ぼさないであろう。最も適切な攻 撃用量を測定するために実施した実験では、野生型Ｐｈによりこの実験に使用し た用量で３回攻撃した結果、４８時間以内に動物（３匹中３匹）を死に至らしめ た。最高の１×１０¹¹c.f.u.で攻撃した場合でさえ、たった１回のワクチン接種 でＰｈ感染の兆候を示し、これは、３匹の非ワクチン接種対照のうち２匹で観測 されたレベルよりもかなり低いレベルであった。この動物における病変を更に特 性化したところ、それが８日齢以上の慢性形態である（即ち、攻撃前に存在する ）ことが示された。この病変から単離したＰｈは、Ｌｋｔを産生することが分か っているので、ワクチン株ではない。恐らく、この病変はワクチン接種の際の日 和見的な野生型Ｐｈ感染の定着から生じたと思われる。１匹は、Ｐｈ−Ｌｋｔ^- 株のＰｈ感染の軽い兆候を発症したが、防御免疫においてある役割を持つことが 知られている不活性形態のＬｋｔがこの株から発現することにより、得られる防 御レベルが増大すると結論付けるのが妥当である。この株からＬｋｔの不活性形 態が発現する可能性は、この明細書の他の部分にも示している（図４）。 外来タンパク質のＰｈベクターからの発現 Ｐｈから組換え遺伝子が発現される可能性は、本明細書の前述部分のＬｋｔ遺 伝子がＰｈ Ｔｏｘ^-株内でプラスミドから発現されるところで示した。このプラ スミドから発現されるＬｋｔは、ウェスタンブロットにおいてＬｋｔに対して産 生される抗血清と反応することが分かった（図４）。ＬｋｔをＰｈから発現させ る以外に、別の抗原をＬｋｔオペロンの修飾により最初に無毒化しておいたＰｈ 株から発現させて、多価ワクチンを作ることも可能である。 更に、Ｐｈが細菌性ベクターとして働く可能性を示すため、クロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の発現を支配する多くのプロ モーターを使用した一連のｐＩＧベースの発現カセット（図５）を構築した。Ｃ ＡＴ遺伝子は、抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を与え、かつ酵素反 応において容易に定量される酵素をコードする。我々の研究室では、Ｐｈにおけ るＣＡＴ遺伝子の発現を支配するために使用したプロモーターをパスツレラ科フ ァミリーに属する様々な細菌から単離した。様々なプロモーター／ＣＡＴカセッ ト（ｐＩＧ−ＣＡＴ）をＥ.コリにて構築し、次いでこれを材料および方法のと ころで記載のようにＰｈへ形質転換した。プラスミドＤＮＡを抗生物質耐性コロ ニーから単離し、制限酵素消化により解析して、予想プロフィールを確認した。 ＣＡＴ発現カセットで形質転換した全てのＰｈ株は、抗生物質クロラムフェニコ ールに対して耐性であることが分かった。各構築物により発現されるＣＡＴ活性 のレベルは酵素アッセイにより定量した。 Ｐｈ／ｐＩＧ−ＣＡＴの指数増殖培養物のサンプルをペレット化し、細菌をト リスｐＨ８.０に再懸濁した。可溶性タンパク質を超音波および遠心により細菌 から単離して、抽出物をＣＡＴアッセイに使用したが、ＣＡＴ酵素アッセイは、 反応緩衝液（クロラムフェニコール１mg／ml、³Ｈ−ＣｏＡ０.１μｌ／１５０μ ｌ(Amersham International)、トリスｐＨ８.０)１５０μｌおよびタンパク質抽 出物５０μｌを含有した。反応を３０分間進行させ、Econoflur（Dupont）シン チレーション液を用いるシンチレーションカウンティングによりＣＡＴ酵素活性 レベルを見積もった。ＣＡＴ酵素反応は、ＣＡＴ酵素により³Ｈ基が有機溶媒（ シンチレーショ ン液）に不溶性の基質から有機可溶性産物へ転移することに基づく。評価した全 てのプロモーターからは、全てのＰｈ／ｐＩＧ−ＣＡＴ構築物のバックグラウン ドレベルを有意に越える（表２）ＣＡＴレベルが得られ、Ｐｈ内での外来遺伝子 発現を達成するのに適していることが分かった。 細菌ベクターシステムとしてのＰｈの開発により、商業的に重要な外来タンパ ク質をウシ粘膜に送達することが可能になるであろう。送達できるタンパク質種 には、免疫系を制御および調節するサイトカンがあり、免疫系を非特異的にアッ プレギュレーションするのに役立つであろう。ベクター化分子は、その他の病原 性細菌からの防御抗原でもあり、多価ワクチンを構築する可能性を提供する。こ のようなワクチンは、単回ワクチン接種後に１種以上の疾病から防御することが 可能である。 表１ 解剖の際にウシにあった肺病変 ウシにＰｈ−Ｌｋｔ-を２回２週間隔でワクチン接種し、最終ワクチン接種後 ２週間目に野生型Ｐｈで攻撃した。攻撃後８日目に検死を行い、肺病変を記録し た。 グループ１ ワクチン接種せず、攻撃したもの １． Ｐｈ感染の兆候なし ２＆３． 急性肺炎と右先端肺葉の硬化、急性癒着性胸膜炎。１匹は、右 横隔膜葉と心膜との間に局部癒着があった。 グループ２ ワクチン接種して攻撃したもの １＆２． Ｐｈ感染の兆候なし ３． 右先端葉に１cm以下の小葉が数箇所（８日齢以上の慢性的病変 ） 表２ Ｐｈ内でのＣＡＴ遺伝子の発現 Ｐｈを様々なプロモーター／ＣＡＴ構築物で形質転換させ、酵素反応を用いて ＣＡＴ遺伝子発現レベルを評価した。結果は、３０秒当たりのカウントとして表 す。トリスはＣＡＴ基質の自発分解を測定するための陰性対照として利用した。 プロモータ− ＣＡＴ活性 プロモーターなし ２００ Ｌｋｔ ２９，３００ ＡＰＸ１ ４０，０００ ＤＮＴ ４４，５００ 最後に、様々な変形、修飾および／または追加が、本発明の精神または範囲か ら逸脱することなく、既に記載した部分の構造および配置に導入できると理解さ れる。 文献 Adam,C.,Knights,J.M.,Mudridge,A.,Lindon,J.C.,Baker,P.R.W.,Beesley,J.E. ,Spacey,B.,Carig,G.R.,and Nagy,L.K.(1984)Purification，characterization, and 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (71)出願人 ザ・ステイト・オブ・ニュー・サウス・ウ ェールズ・スルー・イッツ・デパートメン ト・オブ・アグリカルチャー オーストラリア2800ニュー・サウス・ウェ ールズ州 オレンジ、カイト・ストリート 161番 (71)出願人 ザ・ユニバーシティ・オブ・ニュー・イン グランド オーストラリア2351ニュー・サウス・ウェ ールズ州 アーミデイル (72)発明者 プライドー，クリストファー・トーマス オーストラリア3058ビクトリア州コバー グ・ノース、トンキン・アベニュー27エイ 番 (72)発明者 ホッジソン，エイドリアン・レスリー・マ ーク オーストラリア3145ビクトリア州イース ト・マルバーン、アルバート・ストリート 22番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒素を産生する修飾微生 物。 ２．該微生物のＬｋｔ構造遺伝子および／または翻訳後アクチベーターを含む Ｌｋｔ毒素オペロンが部分的にまたは完全に不活性化されている、請求の範囲第 １項に記載の修飾微生物。 ３．部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒素がＬｋｔ毒素前駆体 である、請求の範囲第１項または第２項に記載の修飾微生物。 ４．部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒素がＬｋｔ構造遺伝子 のプロセッシングされない発現産物である、請求の範囲第２項または第３項に記 載の修飾微生物。 ５．構造遺伝子がＬｋｔ Ａ遺伝子である、請求の範囲第４項に記載の修飾微 生物。 ６．翻訳後アクチベーターが部分的にまたは完全に欠失している、請求の範囲 第２項ないし第５項のいずれか１項に記載の修飾微生物。 ７．翻訳後アクチベーターがＬｋｔ Ｃ遺伝子産物である、請求の範囲第２項 ないし第６項のいずれか１項に記載の修飾微生物。 ８．翻訳後アクチベーターおよび／または構造遺伝子が、単一または複数のヌ クレオチド置換、付加および／または遺伝子の完全または部分欠失を含む欠失を 含む、翻訳後アクチベーターおよび／または構造遺伝子をコードする遺伝子由来 のＤＮＡの導入および欠失を含む組換えＤＮＡ技術、標的構築物またはプラスミ ド分離を用いる相同的組換え、および化学的にまたは放射能により引き起こす突 然変異誘発または部位特異的突然変異誘発により、部分的にまたは完全に不活性 化されている、請求の範囲第２項ないし第７項のいずれか１項に記載の修飾微生 物。 ９．微生物が、天然にＬｋｔ毒素を産生する生物体である、請求の範囲第１項 ないし第８項のいすれか１項に記載の修飾微生物。 10．微生物が、天然にはＬｋｔ毒素を産生しない生物体であるが、部分的にま たは完全に不活性化されたＬｋｔ毒素遺伝子が導入されているものである、請求 の範 囲第１項ないし第８項のいずれか１項に記載の修飾微生物。 11．アクチノバシラス種、プロテウス・ブルガリス、モルガネラ・モルガニイ 、ボルデテラ・ペルツシス、エシェリシア・コリ、パスツレラ種を含む群から選 択される、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の修飾微生物 。 12．微生物がパスツレラ種である、請求の範囲第１１項に記載の修飾微生物。 13．パスツレラ種がパスツレラ・ヘモリチカである、請求の範囲第１２項に記 載の修飾微生物。 14．微生物が、Ｌｋｔ毒素遺伝子産物の分泌にかかわる少なくとも１種のタン パク質を産生できないものである、請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれか １項に記載の修飾微生物。 15．微生物が、部分的にまたは完全に不活性されたＬｋｔ Ｂおよび／または 部分的にまたは完全に不活性化されたＬｋｔ Ｄ遺伝子を持つものである、請求 の範囲第１４項に記載の修飾微生物。 16．部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒素をコードする発現ベ クターであって、該ベクターがＬｋｔ構造および／または翻訳後アクチベーター 遺伝子を含むＬｋｔ毒素遺伝子をコードしており、該Ｌｋｔ毒素オペロンが完全 にまたは部分的に不活性化されているものである、ベクター。 17．Ｌｋｔ毒素オペロンが、Ｌｋｔ毒素前駆体をコードするものである、請求 の範囲第１６項に記載の発現ベクター。 18．Ｌｋｔ毒素遺伝子が、Ｌｋｔ構造遺伝子のプロセッシングされない発現産 物の前駆体をコードするものである、請求の範囲第１６項または第１７項に記載 の発現ベクター。 19．構造遺伝子がＬｋｔ Ａ遺伝子である、請求の範囲第１８項に記載の発現 ベクター。 20．翻訳後アクチベーターが部分的にまたは完全に欠失している、請求の範囲 第１６項ないし第１９項のいずれか１項に記載の発現ベクター。 21．翻訳後アクチベーターがＬｋｔ Ｃ遺伝子である、請求の範囲第１６項な いし第１９項のいずれか１項に記載の発現ベクター。 22．翻訳後アクチベーターおよび／または構造遺伝子が、単一または複数のヌ クレオチド置換、付加および／または遺伝子の完全または部分欠失を含む欠失を 含む、翻訳後アクチベーターおよび／または構造遺伝子をコードする遺伝子由来 のＤＮＡの導入および欠失を含む組換えＤＮＡ技術、標的構築物またはプラスミ ド分離を用いる相同的組換え、および化学的にまたは放射能により引き起こす然 変異誘発または部位特異的突然変異誘発により、部分的にまたは完全に不活性化 されている、請求の範囲第１６項ないし第２１項のいずれか１項に記載の発現ベ クター。 23．天然にＬｋｔ毒素を産生する微生物に由来する染色体または染色体外エレ メントである、請求の範囲第１６項ないし第２２項のいずれか１項に記載の発現 ベクター。 24．該染色体または染色体外エレメントがプラスミドである、請求の範囲第２ ３項に記載の発現ベクター。 25．アクチノバシラス種、プロテウス・ブルガリス、モルガネラ・モルガニイ 、ボルデテラ・ペルツシス、エシェリシア・コリおよびパスツレラ種を含む群か ら選択される微生物に由来する、請求の範囲第２３項または第２４項に記載の発 現ベクター。 26．パスツレラ由来のプラスミドベクターである、請求の範囲第２４項または 第２５項に記載の発現ベクター。 27．パスツレラ・ヘモリチカ由来のプラスミドベクターである、請求の範囲第 ２６項に記載の発現ベクター。 28．更に、Ｅ.コリへのＤＮＡ導入を容易にする、マルチクローニングサイト 、lac遺伝子またはその部分の少なくとも１つを含むヌクレオチド配列を含む、 請求の範囲第１６項ないし第２７項のいずれか１項に記載の発現ベクター。 29．請求の範囲第１６項ないし第２８項のいずれか１項に記載の発現ベクター によりコードされるＬｋｔ毒素オペロン産物。 30．請求の範囲第２９項に記載のＬｋｔ毒素遺伝子産物を含む、宿主動物にお いてＬｋｔ毒素に対する免疫学的応答を誘発するためのワクチン組成物。 31．部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒素を産生する修飾微生 物を含む、宿主動物においてＬｋｔ毒素に対する免疫学的応答を誘発するための ワクチン組成物。 32．請求の範囲第１項ないし第１５項のいずれか１項に記載の修飾微生物を含 む、請求の範囲第３０項に記載のワクチン組成物。 33．対応するＬｋｔ毒素を産生するある範囲の血清型の微生物に対する免疫応 答を誘発するための、請求の範囲第３１項ないし第３２項のいずれか１項に記載 のワクチン組成物。 34．Ｌｋｔ毒素がパスツレラ種から産生される毒素である、請求の範囲第３３ 項に記載のワクチン組成物。 35．Ｌｋｔ毒素がパスツレラ・ヘモリチカから産生される、請求の範囲第３３ 項または３４項に記載のワクチン組成物。 36．請求の範囲第１項ないし第１５項のいずれか１項に記載の修飾微生物を含 む生物ベクター。 37．更に、宿主細胞において応答を増強する能力のある生物学的に活性な分子 を提供する、請求の範囲第３６項に記載の生物ベクター。 38．該生物学的に活性な分子が、成長因子、ホルモン、酵素、抗原またはその 抗原性部分、インターロイキンなどのサイトカイン、インターフェロンおよび腫 瘍壊死因子などの機能性分子含む群から選択される、請求の範囲第３７項に記載 の生物ベクター。 39．該生物学的に活性な分子が、生物学的に活性な分子をコードする遺伝子を 持つプラスミドを伴う生物ベクターにより発現される、請求の範囲第３７項また は第３８項に記載の生物ベクター。 40．該微生物が、微生物に固有の２種以上の抗原エピトープに対する免疫応答 を誘発する能力がある、請求の範囲第３６項ないし３９項のいずれか１項に記載 の生物ベクター。 41．該免疫応答が、該微生物の有毒形態および該微生物により発現される異種 抗原に対して誘導される、請求の範囲第４０項に記載の生物ベクター。 42．該免疫応答が、Ｌｋｔ毒素と、パスツレラ種、ヘモフィラス種、モラキセ ラ種、レプトスピラ種、ストレプトコッカス種、サルモネラ種、Ｅ.コリ、フソ バクテリウム種、クロストリジウム種、マイコバクテリウム種を含む細菌病原体 ；ヘモカス種、トリコストロンジラス種を含む内部寄生体；ブーフィラス種を含 む外部寄生体；ウシウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)、パラインフルエンザウ イルス（ＰＩ３）、感染性ウシ鼻腔気管炎（ＩＢＲ）、コロナウイルス、および ロタウイルスを含むウイルス病原体から選択される１種以上の病原体の少なくと も１つの抗原エビトープに対して誘導される、請求の範囲第４０項または第４１ 項に記載の生物ベクター。 43．活性Ｌｋｔ毒素を産生する微生物を提供すること；および、 Ｌｋｔ構造遺伝子および／または翻訳後アクチベーターを部分的にまたは 完全に不活性化すること、 を含んでなる、部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒素を産生する 修飾微生物の製法。 44．該構造遺伝子がＬｋｔ Ａ遺伝子である、請求の範囲第４３項に記載の修 飾微生物の製法。 45．該翻訳後アクチベーター遺伝子がＬｋｔ Ｃ遺伝子である、請求の範囲第 ４３項または第４４項に記載の修飾微生物の製法。 46．該構造遺伝子および／または該翻訳後アクチベーターが、単一または複数 のヌクレオチド置換、付加および／または遺伝子の完全または部分欠失を含む欠 失を含む、翻訳後アクチベーターおよび／または構造遺伝子をコードする遺伝子 由来のＤＮＡの導入および欠失を含む組換えＤＮＡ技術、標的構築物またはプラ スミド分離を用いる相同的組換え、および化学的にまたは放射能により引き起こ す突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発により、部分的にまたは完全に不 活性化されている、請求の範囲第４３項ないし第４５項のいずれか１項に記載の 方法。 47．請求の範囲第４３項ないし第４６項のいずれか１項に従い調製された修飾 微生物。 48．生物ベクターを提供すること、および 請求の範囲第１６項ないし第２８項のいずれか１項に記載の発現ベクター を該生物ベクターへ導入すること、 を含んでなる、部分的にまたは完全に不活性化されているＬｋｔ毒素を産生する 修飾微生物の製法。 49．請求の範囲第３０項ないし第３５項のいずれか１項に記載のワクチン組成 物の免疫学的有効量を動物に投与することを含む、Ｌｋｔ毒素産生微生物に対す る動物のワクチン接種法。 50．請求の範囲第１項ないし第15項のいずれか１項に記載の修飾微生物を培養 し、該微生物によって産生された部分的にまたは完全に不活性な毒素を回収する ことを含む、不活性Ｌｋｔ毒素の製法。