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Die
vorliegende Erfindung betrifft modifizierte Mikroorganismen, die
für die
Verwendung als Lebendimpfstoffe geeignet sind. Die vorliegende Erfindung
betrifft auch allgemein die Verwendung modifizierter Mikroorganismen
als biologische Vektoren. Die vorliegende Erfindung betrifft des
Weiteren Impfstoffzusammensetzungen. Insbesondere betrifft die vorliegende
Erfindung Zusammensetzungen, die zum Auslösen einer Immunreaktion gegen
RTX-Toxine geeignet sind.
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Actinobacillus
pleuropneumoniae (APP) ist ein Mitglied der Familie Pasteurellaceae
und der ätiologische
Verursacher der Schweinepleuropneumonie, einer akuten oder chronischen
Infektion von Schweinen, die von hämorrhagischen, fibrösen und
nekrotischen Lungenläsionen
gekennzeichnet ist (Pohl et.al. 1983; Kilian and Biberstein, 1984).
Die Krankheit ist hoch ansteckend und befällt heranwachsende Schweine
aller Altersstufen, was zu schweren wirtschaftlichen Verlusten in
der Schweineindustrie führt.
Der direkte Weg der Übertragung
von APP bedeutet, dass eine Infektion unter intensiven Zuchtbedingungen
prävalenter
ist, wobei der Wirtsbereich von APP glücklicherweise auf Schweine
beschränkt
ist, was die möglichen
Infektionsquellen reduziert. Bislang sind weltweit zwölf Serovare
von APP identifiziert worden (Serovar 1–12), wobei Serovar 1, 7 und
12 etwa 90% der australischen Isolate ausmachen (Kamp and Shope,
1964). Es sind eine Reihe möglicher Virulenzfaktoren
identifiziert worden, einschließlich
Proteine der äußeren Membran
(Mulks and Thacker, 1988; Rapp and Ross, 1988), Lipopolysaccharide
(Udeze et al, 1987; Fenwick and Osburn, 1986), Kapsel- (Inzana et
al., 1988; Rosendale and Macinnes, 1990; Lenser et. al., 1988) und
abgesonderte Toxine (Rycroft et al., 1991; Bhatia et al., 1991;
Fedorka-Crey et al., 1990). Die abgesonderten Toxine oder APX-Toxine
sind Mitglieder der RTX-Toxinfamilie (Frey et al., 1993, 1994).
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RTX-Toxine
werden von einer Reihe gramnegativer Bakterien produziert, einschließlich Actinobacillus spp,
Proteus vulgaris, Morganella morganii, Bordetella pertussis, Pasteurella
haemolytica, und die am besten charakterisierten der Gruppe werden
von E.coli produziert (Welch, 1991). Alle RTX-Toxine arbeiten, indem
sie Poren in den Zielzellen produzieren und damit das osmotische
Gleichgewicht stören,
was zu einer Ruptur der Zielzelle führt.
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Obgleich
der Wirkmechanismus von RTX-Toxinen identisch ist, variieren Typ
und Arten-Kreuzspezifität ihrer
Zielzellen erheblich. Strukturell ist diese Familie von Toxinen
durch das Vorhandensein glycinreicher Wiederholungsstrukturen innerhalb
des Toxins, die Kalzium binden und eine Rolle bei der Zielzellerkennung und
-bindung spielen könnten,
einer Region hydrophober Domänen,
die an der Porenbildung beteiligt sind, die Notwendigkeit posttranslationaler
Aktivierung und die Abhängigkeit
von einer C-terminalen Signalsequenz für die Sekretion charakterisiert
(Übersichtsarbeit:
Coote, 1992).
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Von
APP werden mindesten drei verschiedene APX-Toxine produziert, die
als APX1, APX2 und APX3 bezeichnet werden. APX1 zeigt starke und
APX2 relativ schwache hämolytische
Aktivität,
wobei beide gegen eine größere Bandbreite
von Zellen verschiedener Typen und Arten zytotoxisch und aktiv sind
(Frey and Nicolet, 1988; Rosendale et al., 1988; Kamp et al, 1991).
APX3 ist nicht hämolytisch
aber stark zytotoxisch, mit einem Wirtsspektrum, das alveoläre Makrophagen
des Schweins und neutrophile Leukozyten einschließt (Rycroft
et al., 1991; Kamp et al., 1991). Kein APP-Serovar produziert alle
drei APX-Toxine, die Mehrzahl produziert zwei (APX 1 und 2: Serovar
1, 5, 9 und 11; APX2 und 3: 2, 3, 4, 6 und 11), wobei eine kleine
Anzahl (APX1: 10, APX2: 7 und 12) lediglich ein APX produziert (Frey
and Nicolet, 1990; Frey at al., 1992,1993.1994; Kamp et al., 1991;
Rycroft et al., 1991). Das Muster der APX-Produktion scheint mit
Virulenz assoziiert zu sein, wobei solche Serovare, die APX1 und
2 produzieren, am stärksten
virulent sind (Frey et al., 1994; Komal and Mittal, 1990). Die Produktion
und Absonderung aktiver RTX-Toxine erfordert die Aktivität von mindestens
vier Genen C, A, B und D. Das A-Gen kodiert das strukturelle Toxin,
das C-Gen kodiert den posttranslationalen Aktivator und das B- und
das D-Gen kodieren Proteine, die zur Absonderung des aktivierten
Toxins erforderlich sind (Issartel et al., 1991; Welch, 1991; Felmlee
et al., 1985). APX1 und 3 werden von Operons kodiert, die aus vier kontigen
Genen (CABD) bestehen, während
das APX2-Operon nur die C- und A-Gene und in manchen Fällen Überreste
des B-Gens enthält.
Absonderung von APX2 ist abhängig
von der Aktivität
der APX1B- und -D-Genprodukte (Übersichtsarbeit
von Frey et al., 1994).
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Virulenzanalyse
spontaner und chemisch induzierter nicht hämolytischer Mutanten wies auf
eine Rolle der APX-Toxine bei der Virulenz hin, was vor Kurzem anhand
von Transposon-Mutagenesen
bestätigt
worden ist (Anderson et al., 1991; Gerlach et al., 1992: Inzana
et al., 1991; Rycroft et al., 1991a, b; Tacon et al., 1993, 1994).
Ein kompletter Schutz vor der Krankheit und einem Übertrrägerstatus
lässt sich
mit Impfstoffen, die chemisch inaktivierte Bakterien enthalten,
oder mit Impfstoffen aus gereinigten Untereinheiten, die Proteine
der äußeren Membran,
Lipopolysaccharide oder der Hülle
enthalten, nicht erzielen. Dagegen wurde bei Mäusen nach Impfung mit gereinigten
APX in Kombination mit formalisierten ganzen Zellen ein vollständiger Schutz
vor der Krankheit erhalten, was auf eine Rolle der APX-Toxine bei
der protektiven Immunität
hinweist (Bhatia et al., 1991).
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Bei
der Impfung gegen Pleuropneumonie infolge einer APP-Infektion von
Schweinen wurden bislang Bakterine oder Untereinheiten-Impfstoffe
verwendet, die auf verschiedenen Komponenten der Bakterien basierten.
Die mit inaktiven Impfstoffen erzielten Ergebnisse haben bestenfalls
homologen Schutz gegen den Serovar geboten, der zur Herstellung
des Impfstoffmaterials verwendet wurde. Derzeit sind zwölf Serovare
von APP bekannt, die eine unterschiedliche Virulenz aufweisen und
von denen jeder eine andere Impfstoffzubereitung erfordert. Bislang
wurden handelsübliche
Impfstoffe derart formuliert, dass sie eine Reihe von Serovare enthalten
und Schutz gegen die am häufigsten
beobachteten Serovare an dem jeweiligen geographischen Ort bieten.
Im Gegensatz zu inaktiven Impfstoffen bietet eine natürliche Infektion
mit einem beliebigen Serovar Schutz vor einer erneuten Infektion
mit jedem anderen Serovar, was auf die Möglichkeit hindeutet, dass ein Lebendimpfstoff
möglicherweise
Kreuzschutz („Cross
Protection") gegen
APP-Serovare bieten könnte.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eines oder mehrere
Probleme im Stand der Technik zu lösen.
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Entsprechend
stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt einen genetisch
modifizierten Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) zur Verfügung, umfassend
ein RTX-Toxinoperon,
das ein strukturelles RTX-Gen und ein teilweise oder vollständig inaktiviertes
posttranslationales RTX-Aktivatorgen aufweist, das ein RTX-Toxin
erzeugt, wobei das RTX-Toxin
teilweise oder vollständig
inaktiviert ist.
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Der
Begriff „genetisch
modifiziert" umfasst
Modifikationen durch DNA-Rekombinationstechniken oder andere Techniken,
wie beispielsweise chemische oder strahlungsinduzierte Mutagenese.
Wenn DNA-Rekombinationstechniken die Einführung fremder DNA in Wirtszellen
umfassen, kann die DNA durch jedes geeignete Verfahren eingeführt werden.
Geeignete Verfahren umfassen die Transformation kompetenter Zellen,
Transduktion, Konjugation und Elektroporation.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein modifizierter Mikroorganismus bereitgestellt,
worin ein RTX-Toxingen, einschließlich einem strukturellen RTX-Gen
und/oder einem posttranslationalen Aktivator des Organismus, teilweise
oder vollständig
inaktiviert ist.
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Der
Begriff „RTX-Toxinoperon", wie hier in den
Ansprüchen
und der Beschreibung verwendet, soll solche Gene umfassen, die an
der Expression eines RTX-Toxins beteiligt sind, welches ein Produkt
des RTX-Toxinoperons ist. Die in dem RTX-Toxinoperon enthaltenen
Gene umfassen das posttranslationale Aktivatorgen (C), das strukturelle
Gen (A) und die B- und D-Gene, die Proteine kodieren, welche für die Absonderung
des aktivierten RTX-Toxins erforderlich sind.
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Der
Begriff „teilweise
oder vollständig
inaktiviert", wie
hier in den Ansprüchen
und der Beschreibung verwendet, umfasst die Modifikation eines Gens
durch DNA-Rekombinationstechniken, einschließlich der Einführung und
Deletion von DNA aus dem Gen, einschließlich einfacher oder mehrfacher
Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion, einschließlich vollständige oder
teilweiser Deletion des Gens unter Einsatz eines Zielkonstruktes
oder Plasmidsegregation sowie durch chemisch induzierte, strahlungsinduzierte
oder ortsspezifische Mutagenese.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
induziert der genetisch modifizierte APP in einem Wirt protektive
Immunität
gegen das strukturelle RTX-Polypeptid und gegen eine Infektion durch
Actinobacillus pleuropneumoniae.
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Die
vorliegenden Antragsteller haben festgestellt, dass ein Vorläufer eines
RTX-Toxins verringerte toxische Aktivität aufweist. Überraschenderweise
haben die vorliegenden Antragsteller auch festgestellt, dass der
RTX-Toxinvorläufer
in einem Tier eine Immunreaktion auslösen kann, die Kreuzimmunität („Cross
Protection") gegenüber einem
heterologen Stimulus („Challenge") mit einem Mikroorganismus
bietet, der ein RTX-Toxin produziert.
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Entsprechend
ist in einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung das inaktivierte RTX-Toxin ein Vorläufer eines RTX-Toxins. Bei
dem Vorläufer
kann es sich um ein nicht behandeltes Expressionsprodukt eines strukturellen
RTX-Gens handeln. Das strukturelle RTX-Gen kann ein RTX-A-Gen sein.
Das RTX-Toxin kann ein APX-Toxin sein. Das APX-Toxin kann APX1, Apx2 oder APX3 sein.
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Die
vorliegenden Antragsteller haben festgestellt, dass APP, das natürlicherweise
ein RTX-Toxin produziert,
verändert
werden kann, um einen inaktiven RTX-Toxinvorläufer zu produzieren, indem
der posttranslationale Aktivator des Vorläuferproduktes eliminiert wird.
Entsprechend ist in einer bevorzugten Ausführungsform der genetisch modifizierte
APP nicht in der Lage, einen posttranslationalen Aktivator des RTX-Toxinvorläufers herzustellen,
oder produziert einen inaktivierten posttranslationalen Aktivator
des RTX-Toxinvorläufers. Der
posttranslationale Aktivator kann ein Produkt eines RTX-C-Gens sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das RTX-C-Gen des APP inaktiviert oder teilweise oder vollständig deletiert.
Das RTX-C-Gen kann durch ortsspezifische Mutagenese inaktiviert
sein. Das RTX-C-Gen kann durch einfache oder mehrfache Nukleotidsubstitution,
-addition und/oder -deletion inaktiviert sein. Vorzugsweise ist
das RTX-C-Gen durch homologe Rekombination mit einem Targeting-Konstrukt
inaktiviert. Das Targeting-Konstrukt kann einen selektierbaren Marker
umfassen, der von Sequenzen flankiert ist, welche zu Sequenzen homolog
sind, die die gewünschte
Insertionsstelle flankieren. Der selektionsfähige Marker kann ein Gen sein,
das Resistenz gegen eine toxische Substanz wie beispielsweise Quecksilber
vermittelt oder kann eine Antibiotikaresistenzdeterminante sein.
Die Antibiotikaresistenzdeterminante kann ein Gen sein, das für eine Ampicillinresistenz,
eine Kanamycinresistenz oder eine Streptomycinresistenz kodiert.
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Unter
manchen Umständen
ist es gegebenenfalls nicht wünschenswert,
dass ein funktionelles Antibiotikaresistenzgen in einem modifizierten
Mikroorganismus eingebaut wird. Entsprechend betrifft die vorliegende
Erfindung ein Targeting-Konstrukt, das genetische Elemente wie beispielsweise
Wiederholungssequenzen enthält,
die ein Ausschneiden des Antibiotikaresistenzgens ermöglichen,
sobald das Targeting-Konstrukt eine homologe Rekombination mit dem
Wirtschromoson vorgenommen hat.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Targeting-Konstrukt,
das keinen selektierbaren Marker enthält. Beispielsweise kann das
Targeting-Konstrukt ein Segment des RTX-C-gens enthalten, das eine
Deletion enthält.
Homologe Rekombination des Targeting-Konstruktes mit dem Wirtschromosom kann
zur Einführung
einer Deletion in das chromosomale RTX-C-Gen führen. Die Auswahl von Rekombinanten
kann dann auf der Abwesenheit der Produktion des RTX-Toxins beruhen.
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Das
Targeting-Konstrukt kann in linearer Form direkt in APP eingeführt werden.
Alternativ kann das Targeting-Konstrukt über einen Selbstmord-(„Suicide")-Vektor oder einen
nicht replizierenden Vektor eingeführt werden. Der Selbstmord-(„Suicide")-Vektor kann jedes
Plasmid sein, das sich in APP nicht repliziert. APP, die natürlicherweise
RTX-Toxine produzieren, sind häufig
nicht-tolerante Wirte für
pEP-Vektoren. Entsprechend sind pEP-Vektoren Beispiele für Selbstmord-(„Suicide")-Vektoren, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können.
Der Selbstmord-(„Suicide")-Plasmidvektor kann
pEP-C–Ampr sein.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann eine ortsspezifische Mutagenese mittels der Plasmidsegregationstechnik
erreicht werden. Beispielsweise kann in einen APP ein Plasmid eingeführt werden,
das ein Fragment eines RTX-C-Gens enthält, das von einem selektionsfähigen Markergen
unterbrochen ist. APP kann anschließend mit einem zweiten Plasmid
transformiert werden, das ein zweites selektionsfähiges Markergen
enthält.
APP, der beide Plasmide enthält,
kann dann durch Medien geleitet werden, welche nur auf das zweite Plasmid
hinselektieren. Selektion in Richtung des zweiten Plasmids kann
der Erhaltung des ersten Plasmids entgegenwirken. Daher kann das
erste Plasmid verloren gehen, aber in manchen Fällen kann eine Rekombination
des unterbrochenen RTX-C-Genfragments,
welches den auswählbaren
Marker enthält,
in das Chromosom stattfinden. Dieser Prozess kann daher eine Rekombination
des unterbrochenen RTX-Gens in das chromosomale RTX-C-Gen fördern, wodurch
das chromosomale RTX-C-Gen inaktiviert wird.
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Das
RTX-A-Genprodukt kann von einem chromosomalen RTX-A-Gen exprimiert
werden.
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Das
chromosomale RTX-A-Gen kann sich an seiner natürlichen Position auf dem Chromosom
befinden oder an einer anderen als seiner natürlichen Position in das Chromosom
eingefügt
werden. Darüber
hinaus kann das RTX-Genprodukt von einem RTX-A-Gen exprimiert werden, das sich auf
einem extrachromosomalen Element wie beispielsweise einem Plasmid
befindet. Daher kann ein extrachromosomales Element, das ein RTX-A-Gen
enthält,
in APP eingeführt
werden, die ein funktionelles chromosomales RTX-A-Gen und ein inaktiviertes
chromosomales RTX-C-Gen aufweisen. Das von dem extrachromosomalen
Element exprimierte RTX-A-Produkt kann das RTX-A-Produkt, das von
dem chromosomalen Gen exprimiert wird, ergänzen.
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Alternativ
kann das RTX-A-Genprodukt vollständig
von einem RTX-A-Gen oder RTX-A-Genen exprimiert werden, die sich
auf extrachromosomalen Elementen wie beispielsweise Plasmiden befinden.
Die sich auf extrachromosomalen Elementen befindenden RTX-A-Gene
können
entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit einer Selektion für das extrachromosomale
Element exprimiert werden. Ein extrachromosomales Element, das ein
RTX-A-Gen enthält,
kann daher in einen APP eingeführt
werden, der keine funktionellen chromosomalen RTX-A- und RTX-C-Gene
enthält.
Der Mikroorganismus, der keine funktionellen RTX-A- und RTX-C-Gene
aufweist, kann durch Mutagenese des APP produziert werden. Die Mutagenese
kann zur Deletion der RTX-A- und RTX-C-Gene oder Anteilen davon
führen.
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Das
extrachromosomale Element kann ein rekombinanter Expressionsvektor
sein, der das RTX-A-Gen enthält.
Der rekombinante Expressionsvektor erlaubt die Expression des RTX-A-Gens in APP. Der rekombinante
Expressionsvektor kann aus einem pIG-Plasmid abgeleitet sein. Das
rekombinante Plasmid kann aus pIG3B abgeleitet sein. Bei dem rekombinanten
Plasmid kann es sich um pIG3B-T1K handeln.
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Bakterielle
Vektorsysteme auf der Basis von APP (Ph) bieten ein alternatives
Mittel zum Einbringen von „nackten" DNA-Impfstoffmolekülen in Wirtszellen.
Solche nackten DNA-Impfstoff/-Expressionssysteme würden ein
Plasmid umfassen, welches sich in dem bakteriellen System replizieren
kann, und einen eukaryotischen Promotor, welcher die Expression
des fremden/rekombinanten Gens von Interesse steuert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der genetisch modifizierte APP in der Lage, eines oder mehrere
funktionelle Proteine zu produzieren, welche die Sekretion von RTX-Toxinmolekülen unterstützen. Die
genetisch modifizierten APP können
funktionelle RTX-B-und-/oder
RTX-D-Gene aufweisen. In einer anderen Ausführungsform sind die genetisch
modifizierten APP nicht imstande, mindestens eines der an der Sekretion von
RTX-Toxin-Molekülen beteiligten
Proteine oder mindestens ein an der Sekretion von RTX-Toxin-Molekülen beteiligtes
inaktives Protein zu produzieren. Der Mikroorganismus kann daher
ein inaktives RTX-B- und/oder RTX-D-Gen aufweisen. Der Mikroorganismus
ist daher gegebe nenfalls nicht in der Lage, aktive oder inaktive RTX-Toxin-Moleküle zu sezernieren.
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Zur
Expression heterologer Proteine in APP können rekombinante Plasmidvektoren
verwendet werden. Vorzugsweise ist der rekombinante Plasmidvektor
von einem natürlich
vorkommenden Plasmid in Actinobacillus pleuropneumoniae abgeleitet.
Das rekombinante Plasmid kann eine DNA-Sequenz enthalten, die einen
RTX-Toxinvorläufer
kodiert. Das rekombinante Plasmid kann ein RTX-A-Gen enthalten.
Alternativ kann das rekombinante Plasmid ein RTX-C-Gen oder ein
Fragment davon enthalten. Das RTX-C-Gen oder -Genfragment kann von
einer dazwischen geschalteten DNA-Sequenz unterbrochen sein. Die
dazwischen geschaltete DNA-Sequenz kann einen selektierbaren Marker
kodieren, wie beispielsweise ein Antibiotikaresistenzgen. Bei dem
natürlicherweise
vorkommenden Plasmid kann es sich um pIG3 handeln. Vorzugsweise
umfasst der rekombinante Plasmidvektor des Weiteren Nukleotidsequenzen,
welche den Transfer von DNA in E. coli unterstützen. Die Nukleotidsequenzen
können
mindestens eine multiple Klonierungsstelle und das Lac-Gen oder Anteile
davon enthalten. Der rekombinante Plasmidvektor kann aus pIG317,
pIG38 oder pIG38-T1K ausgewählt
sein.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiter eine Impfstoffzusammensetzung
zum Induzieren einer immunologischen Antwort in einem Wirtstier
bereit, das mit der Impfstoffzusammensetzung beimpft wurde, wobei die
Impfstoffzusammensetzung einen genetisch modifizierten Actinobacillus
pleuropneumoniae (APP) enthält, der
ein RTX-Toxinoperon aufweist, einschließlich ein strukturelles RTX-Gen
und ein teilweise oder vollständig inaktiviertes
posttranslationales RTX-Aktivatorgen, welches ein RTX-Toxin produziert,
wobei das RTX-Toxin teilweise
oder vollständig
inaktiviert ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem inaktivierten
RTX-Toxin um einen Vorläufer
eines RTX-Toxins. Der Vorläufer
kann ein unverarbeitetes Expressionsprodukt eines strukturellen
RTX-Gens ein. Das strukturelle RTX-Gen kann ein RTX-A-Gen sein. Vorzugsweise
ist das RTX-C-Gen des Mikroorganismus inaktiviert oder deletiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Impfstoffzusammensetzung, die einen genetisch
modifizierten APP enthält,
um einen Lebendimpfstoff.
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Eine
Impfstoffzusammensetzung gemäß der vorliegenden
Erfindung kann in jedes beliebige pharmazeutisch annehmbare Vehikel
mit oder ohne zugefügte
Hilfsstoffe oder immunstimulatorische Moleküle eingefügt werden.
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Der
Hilfsstoff kann von einem beliebigen geeigneten Typ sein. Der Hilfsstoff
kann aus Pflanzenölen oder
Emulsionen davon, oberflächenaktiven
Substanzen, z. B. Hexadecylamin, Octadecylaminosäureester, Octadecylamin, Lysolecithin,
Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dicoctadecyl-N'-N'bis(2-hydroxyethylpropandiamin),
Methoxyhexadecylglycerol, und pluronischen Polypolen, Polyaminen,
z. B. Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Carbopol, Peptiden wie beispielsweise
Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin, Immunstimulierenden Komplexen
(ISCOMS), Ölemulsionen
sowie Mineralgelen und -suspensionen ausgewählt sein. Eine Mineralsuspension
wie beispielsweise Alum, d. h. Aluminiumhydroxid (Al(OH)3), Aluminiumphosphat oder Aluminiumsulfat
ist bevorzugt. Der Hilfsstoff kann in Mengen von etwa 1 bis 75 Gew.-%,
beruhend auf dem Gesamtgewicht der Impfstoffzusammensetzung, vorhanden
sein.
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Ein
Impfstoff gemäß der vorliegenden
Erfindung, der einen genetisch modifizierten APP enthält, welcher
einen RTX-Toxinvorläufer
produzieren kann, hat das Potential, Schutz gegen einer Reihe von
Serovaren eines Mikroorganismus bereit zu stellen, der das entsprechende
RTX-Toxin produziert.
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In
einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen biologischen
Vektor, einschließlich
eines genetisch modifizierten Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)
bereit, der ein RTX-Toxinoperon umfasst, einschließlich einem
strukturellen RTX-Gen und einem teilweise oder vollständig inaktivierten
posttranslationalen RTX-Aktivatorgen, welches ein RTX-Toxin produziert,
wobei das RTX-Toxin teilweise oder vollständig inaktiviert ist.
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Bei
dem RTX-Toxin kann es sich um ein APX-Toxin handeln. Das APX-Toxin
kann APX1, APX2 oder APX3 sein. Vorzugsweise ist das inaktive RTX-Toxin
ein Vorläufer
des RTX-Toxins.
Vorzugsweise ist der Vorläufer
des RTX-Toxins ein Produkt des RTX-A-Gens.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der genetisch modifizierte APP nicht in der Lage, einen posttranslationalen
Aktivator des RTX-Toxinvorläufers
zu produzieren oder er produziert einen inaktivierten posttranslationalen
Aktivator des RTX-Toxinvorläufers.
Der posttranslationale Aktivator kann ein Produkt eines RTX-C-Gens
sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das RTX-C-Gen des genetisch modifizierten APP inaktiviert oder
deletiert. Das RTX-C-Gen kann durch einfache oder mehrfache Nukleotidsubstitution,
-addition und/oder -deletion inaktiviert sein.
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Das
RTX-C-Gen kann durch die Einführen
eines Targetingkonstruktes, das einen selektierbaren Marker enthält, durch
ortsspezifische Rekombination in das chromosomale RTX-Gen inaktiviert sein.
Das Targetingkonstrukt kann genetische Elemente wie beispielsweise
Wiederholungseinheiten enthalten, welches das Ausscheiden des Antibiotikaresistenzgens
ermöglichen,
sobald das Targetingkonstrukt eine homologe Rekombination mit dem
Wirtschromosom durchgeführt
hat. Alternativ kann ein Targetingkonstrukt verwendet werden, das
keinen selektierbaren Marker enthält, um eine Deletion in das
chromosomale RTX-C-Gen
einzuführen.
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Das
RTX-A-Genprodukt kann von einem chromosomalen RTX-A-Gen exprimiert
werden. Das chromosomale RTX-A-Gen kann sich an seiner natürlichen
Position auf dem Chromoson befinden oder kann an einer anderen als
seiner natürlichen
Position in das Chromosom eingesetzt werden. Darüber hinaus kann das RTX-Genprodukt
von einem RTX-A-Gen
exprimiert werden, das sich auf einem extrachromosomalen Element wie
beispielsweise einem Plasmid befindet.
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Alternativ
kann das RTX-A-Genprodukt vollständig
von einem RTX-A-Gen oder -Genen exprimiert werden, die sich auf
extrachromosomalen Elementen wie beispielsweise Plasmiden befinden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der genetisch modifizierte APP in der Lage, eines oder mehrere
funktionelle Proteine herzustellen, welche die Sekretion von RTX-Toxinmolekülen unterstützen. Der
genetisch modifizierte APP kann funktionelle RTX-B- und/oder RTX-D-Gene
enthalten. In einer anderen Ausführungsform
ist der genetisch modifizierte APP nicht in der Lage, mindestens
eines der Proteine zu erzeugen, die an der Sekretion von RTX-Toxingenmolekülen beteiligt
sind, oder produziert mindestens ein inaktives Protein, das an der
Sekretion von RTX-Toxingenmolekülen
beteiligt ist.
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Der
Begriff „biologischer
Vektor" wird in
seinem weitesten Sinne verwendet, um ein biologisches Mittel zu
umfassen, welches sich zur Expression biologisch aktiver Moleküle eignet.
Das biologische Mittel ist vorzugsweise ein lebender Mikroorganismus,
obwohl auch tote Organismen verwendet werden können. Der biologische Vektor
kann nicht-pathogen sein oder avirulent gemacht worden sein oder
kann in nicht-pathogenen oder avirulenten effektiven Mengen gegeben
werden. Der Begriff „biologisch
aktive Moleküle" umfasst funktionelle
Moleküle
wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, Antigene
oder antigene Teile davon, Zytokine wie beispielsweise Interleukine,
Interferone und Tumornekrosefaktoren. Die Moleküle können von dem biologischen Vektor
natürlicherweise
exprimiert werden. Alternativ kann es sich bei den Molekülen um rekombinante
Moleküle
handeln, die exprimiert werden, indem der biologische Vektor mit
einem Plasmid transformiert wird, der ein Gen oder Gene trägt, welche
das biologisch aktive Molekül
kodieren, und welches dann exprimiert wird, oder bei dem das Plasmid
und/oder Gen oder die Gene und/oder Teile davon in das Wirtsgenom
integriert sind, welches das Chromosom und/oder ein beliebiges natürlicherweise
oder nicht natürlicherweise
vorkommendes extrachromosomales Element mit umfasst, wobei das Gen
oder die Gene oder Teile davon exprimiert werden.
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Ein
biologischer Vektor der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden,
um dem Wirtstier eines oder mehrere nützliche Proteine zu verabreichen.
Die derart verabreichten Proteine können synergistisch wirken,
um eine verstärkte
Reaktion in dem Wirtstier herbeizuführen. Beispielsweise kann der
biologische Vektor ein Antigen in Kombination mit einem Molekül produzieren,
welches in dem Wirtstier eine immunogene Antwort auf das Antigen
verstärkt.
Das Molekül,
das die immunogene Antwort verstärkt,
kann ein Zytokin sein.
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Ein
biologischer Vektor der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet
werden, um einen multivalenten Impfstoff bereit zu stellen. Der
Begriff „multivalenter
Impfstoff" wird
in seinem allgemeinsten Sinne verwendet und erstreckt sich auch
auf einen modifizierten Mikroorganismus, der eine Immunantwort gegen
zwei oder mehrere unterschiedliche antigene Epitope, die sich auf
dem modifizierten Mikroorganismus befinden oder von diesem exprimiert
werden, wobei die zwei oder mehrere Epitope dem modifizierten Mikroorganismus eigen
sind. Allgemeiner jedoch umfasst ein multivalenter Impfstoff einen
modifizierten Mikroorganismus, der eine Immunantwort gegen virulente
Formen des Mikroorganismus sowie gegen heterologe Antigene induzieren
kann, die von dem Mikroorganismus exprimiert werden (wie beispielsweise
rekombinante Antigene oder solche, die durch Transduktion, Konjugation
oder Transformation eingeführt
wurden) und die dem Mikroorganismus nicht eigen sind. Diesbezüglich kann
ein multivalenter Impfstoff gegen zwei oder mehrere Krankheitserreger
gerichtet sein. Bevorzugte multivalente Impfstoffe sind solche,
die eine Immunantwort gegen ein RTX-Toxin und gegen mindestens ein
antigenes Epitop eines oder mehrerer Krankheitserreger induzieren kann.
Die Krankheitserreger können
aus Bakterienkrankheitserregern ausgewählt sind, wie beispielsweise Haemophilus
spp, Serpulina hyodysenteriae, Pasteurella spp, Bordetella bronchiseptica,
Leptospira spp, Streptococcus spp, Salmonella spp, Escherichia coli,
Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae. Alternativ
können
die Krankheitserregner aus Viruskeimerregern einschließlich HVC,
PRRSV, PRV, TGEV oder PPV ausgewählt
sein.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erzeugung
eines genetisch modifizierten Actinobacillus pleuropneumoniae bereit,
der ein RTX-Toxin produziert, wobei das RTX-Toxin teilweise oder
vollständig
inaktiviert ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellen
eines Actinobacillus pleuropneumoniae und partielle oder vollständige Inaktivierung
eines posttranslationalen RTX-Aktivatorgens in dem RTX-Toxinoperon
des Actinobacillus pleuropneumoniae.
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Die
Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Impfen
eines Tieres gegen einen ein RTX-Toxin produzierenden Mikroorganismus
bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung einer immunologisch
wirksamen Menge eines Impfstoffes gemäß der vorliegenden Erfindung
an das Tier umfasst.
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Das
Impfverfahren kann bei der Behandlung von Nutztieren wie Schweinen,
Rindern, Schafen und Ziegen verwendet werden. Das Impfverfahren
kann auch bei der Behandlung von Haustieren wie Pferden, Hunden
und Katzen verwendet werden. Das Impfverfahren kann auch bei der
Behandlung von Menschen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Impfverfahren bei der Behandlung von Schweinen verwendet.
Vorzugsweise wird das Impfverfahren bei der Behandlung von Schweinepleuropneumonie verwendet.
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Die
Verabreichung eines Impfstoffes oder Impfstoffvektors gemäß der vorliegenden
Erfindung kann auf jedem geeigneten Weg, beispielsweise durch orale
oder parenterale Verabreichung, erfolgen. Die Verabreichung kann über Schleimhäute wie
nasal oder vaginal erfolgen. Alternativ kann die Verabreichung intramuskulär, intradermal,
subkutan oder intraperitoneal erfolgen. Die Zubereitung kann in
trockener oder flüssiger Form
sein. Der gewählte
Verabreichungsweg kann auch zusätzliche
Komponenten wie beispielsweise Proteaseinhibitoren, Entzündungshemmer
und dergleichen erforderlich machen.
-
Die
Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Impfen
eines Tieres gegen einen pathogenen Organismus bereit, wobei das
Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Impfstoffvektors
gemäß der vorliegenden
Erfindung an das Tier umfasst, wobei der Impfstoffvektor eine immunologisch wirksame
Menge eines Antigens des pathogenen Organismus synthetisiert.
-
Ein
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Herstellen eines inaktiven RTX-Toxins bereit, wobei das Verfahren
die Kultivierung eines genetisch modifizierten APP-Mikroorganismus
gemäß der vorliegenden
Erfindung und die Wiedergewinnung des von dem Mikroorganismus hergestellten
inaktiven Toxins umfasst. Das mit diesem Verfahren hergestellte
inaktive RTX-Toxin kann beispielsweise als das aktive Immunogen
in einem Impfstoff verwendet werden, um eine protektive Immunantwort
gegen ein RTX-Toxin zu stimulieren.
-
In
der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen dieser Patentschrift soll
das Wort „umfassen" und Varianten des
Wortes, wie beispielsweise „umfassend" und „umfasst", andere Zusätze, Komponenten,
Ganzzahlen oder Schritte nicht ausschließen.
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Damit
die Erfindung einfacher verständlich
ist, stellen wir die folgenden nicht einschränkenden Beispiele bereit.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
1 Partielle Restriktionsenzymkarte von
pIG3 (1A), einem 4,2-kb-Plasmid, das
eine Streptomycinresistenz kodiert, isoliert von einem australischen
Stamm von APP. Ein PstI-Fragment mit 2,3 kb (pIG317; 1B)
erwies sich als ausreichend, um eine Plasmidreplikation zu kodieren
und eine Streptomycinresistenz zu vermitteln, wenn es durch Selbstligation
verbunden und in E. coli von APP transformiert wird. Der Plasmidvektor
pIG3B, der eine multiple Klonierungsstelle (Multiple Cloning Site,
MCS) und einen Anteil des Lac-Gens aufweist, wurde konstruiert,
indem das HaeII-Fragment von pIC19R in die einzige EcoRI-Stelle
von pIG317 kloniert wurde (1C). Für pIG3B
sind einzigartige Restriktionsenzymschnittstellen (1C)
angegeben, mit Ausnahme von PstI, welches in der MCS und dem Plasmid-Gerüst schneidet.
-
2 Konstruktion
einer APX1A-Expressionskassette zur Verwendung in APP. Die APX1A-Expressionskassette,
verknüpft
mit dem Kanamycinresistenzgen von pQE-T1K, wurde als ein SalI-Restriktionsenzym-Fragment
isoliert und in die einzige SalI-Schnittstelle von pIG3B kloniert.
Es sind nicht alle einzigartigen Restriktionsenzymschnittstellen
in der multiplen Klonierungsstelle von pIG3B angezeigt.
-
3 Konstruktion
der APX1-Expressionskassette für
E.coli. Es wurde ein vollständiges
APX1A-Gen erzeugt, indem aus einer PCR erhaltenes (∎) Material
und ein genomischer Klon
an
einer einmalig vorhandenen HindIII-Schnittstelle fusioniert wurden.
Das komplette Gen wurde in pQE im Leseraster der Poly-His-Leadersequenz kloniert,
um eine Reinigung von APX1A zu ermöglichen. Das Kanamycinresistenzgen von
pUC4K wurde in eine einmalig vorhandene Xhol-Restriktionsschnittstelle
5' von den pQE-T1K-Promotor-Regulator-Sequenzen
kloniert. Das resultierende Plasmid, pQE-T1K enthält das APX1A-Gen
unter kontrollierter Expression, verknüpft mit dem Kanamycinresistenzgen.
-
4 Western-Blot-Analyse
von APP-Rekombinanten. Proben des APP Tox–-Stammes
mit (Tox–/317-QET1)
und ohne (HS93Tox–) der APXA-Expressionskassette
wurden durch Western Blotting neben den Elternstämmen HS93 untersucht. Der Blot
wurde mit Kaninchen-Antiserum, welches in unserem Labor hergestellt
wurde, gegen die APX-Toxine inkubiert. Aus der Fig. ist ersichtlich,
dass der Tox– Stamm
mit Anti-APX-Seren nicht reagiert, während sowohl der Elterstamm
HS93 als auch der Tox– Stamm, die die APXA-Expressionskassette
enthalten, einzelne Polypeptide produzieren, die spezifisch mit
dem Serum reagieren.
-
5 Konstruktion von Rekombinationskassetten,
die zur Manipulation des APP-Chromosoms
verwendet werden.
-
5A Das
APX1B-Gen wurde auf dem APP-Chromosom anhand des Plasmids pIG-BKr inaktiviert. Ein EcoRI-Restriktionsfragment,
welches einen Anteil der APX1B- und -D-Gene enthält, wurde aus dem APP-Chromosom
isoliert und in pIC19R kloniert. Das Kanamycingen wurde in die BamHI-Schnittstellen
des APX1B-Gens eingefügt.
Das APX1B-Gen mit dem internen Kanamycingen wurde als ein EcoRI-Fragment in pIG317
subkloniert, um die Rekombinationskassette pIG-BKr zu
bilden. Die Bindungsstellen der Oligonukleotide, die verwendet wurden,
um die absonderungsdefekten Mutanten zu charakterisieren, sind angezeigt
(B5 und B3). Es
wird darauf hingewiesen, dass beide dieser Oligonukleotide außerhalb
des in der Rekombinationskassette verwendeten EcoRI-Fragmentes binden.
-
5B Das
APX2C-Gen wurde auf dem Chromosom anhand des Plasmidvektors pEP2C–-Ampr inaktiviert.
Ein PCR-Fragment, welches das APX2C-Gen und einen Anteil des APX2A-Gens
enthält,
wurde kloniert und das Ampr-Gen in eine
einmalig vorhandene XbaI-Schnittstelle innerhalb des APX2C-Gen kloniert.
Das resultierende EcoRI-Fragment wurde in pEP2 subkloniert, um die
Selbstmord („Suicide")-Kassette pEP2C-Ampr zu bilden.
-
6 Eine Polymerasekettenreaktion (PCR)
wurde verwendet, um die chromosomalen Mutanten HS22B–Kanr (6A) und
HS93C–Ampr (6B) zu
charakterisieren. Von jeder der Mutanten wurde genomische DNA isoliert
und als Template für
die PCR Reaktion verwendet. Oligonukleotide, welche die Insertionsstelle überspannten
(5), produzierten einzelne Banden,
welche mit der vorhergesagten Größe jedes
Elternstammes und der genomischen Mutanten übereinstimmten. Jede Mutante
produzierte ein PCR-Produkt, das größer war als das des Elternstammes
und dessen Größe einer
Vergrößerung entsprechend
dem eingesetzten Antibiotikaresistenzgen entsprach. Die erhaltenen
PCR-Produkts wurden auf einen Southern Blot aufgetragen und entweder
mit dem APX-Gen, das das Ziel der Insertion war, oder dem zur Selektion
verwendeten Antibiotikaresistenzgen inkubiert.
-
7 Abgesonderte
Proteine (sup) und Gesamtkulturproteine (son) des APP-Tox–-Stammes (HS93C–A–)
und der HS93C–Ampr-Mutante wurden durch Western Blotting neben
dem Elternstamm HS93 untersucht. Der Blot wurde mit Kaninchern-Antiserum, das in
unserem Labor hergestellt worden ist, gegen die APX-Toxine inkubiert.
Aus dieser Fig. ist ersichtlich, dass der Tox–Stamm
nicht mit Anti-APX-Serum
reagiert, während
sowohl der Elternstamm HA93 als auch die HS93CAmpr-Rekombinante einzelne
Polypeptide produzieren, die abgesondert werden und spezifisch mit
dem Serum reagieren.
-
8 pIG-basierte Kassetten für die Expression
von Fremdproteinen in APP. Für
die Expression von Fremdproteinen von APP wurde eine Reihe pIG-basierter
Expressionskassetten konstruiert. Die Gene, die Fremdproteine IL6
(8A) und CAT (8B) kodierten,
wurden samt geeigneten Promotoren in pIG-basierte Plasmide kloniert,
um eine Expression in APP zu ermöglichen.
-
9 Expression
von Schweine-IL6 von APP.IL6 wurde in einen geeigneten Plasmidvektor
(pIG-IL6) kloniert, um eine Expression in E. coli (E.coli/pIG3-IL6)
und APP (HS93/pIG-IL6) zu erhalten. Proben von Übernachtkulturen von APP HS93(1),
APP HS93/pIG-IL6 (2), E.coli/pIG3-IL6 (3 und 4), gereinigtes IL6
(5 und 6), zusammen mit einer negativen E. coli-Kontrolle (7) wurden
durch Western Blotting anhand von monoklonalen IL-6-spezifischen
Antikörpern
analysiert.
-
BEISPIEL 1
-
MATERIALIEN
UND METHODEN
-
Bakterienstämme und
Wachstumsbedingungen
-
Die
in dieser Studie verwendeten APP-Bakterienstämme wurden freundlicherweise
von Dr. Pat Blackall (Animal Research Institute, Moorooka, QLD,
Austr.) zur Verfügung
gestellt. APP-Stämme
wurden bei 37°C
unter kontinuierlichem Schütteln
in Hirn-Herz-Medium (brain heart infusion broth) gezüchtet, das
mit Nikotinamidadenindinukleotid in einer Endkonzentration von 10 μg/ml (Sigma
Chemical Co., St. Louis, M.O., USA) angereichert war. Blutagar wurde
hergestellt, indem 5% sterile entfibrinierte Pferdeerythrozyten
zu dem BHI-Agar gegeben wurden. Antibiotika wurde in einer Endkonzentration
von 25 μg/ml
Kanamycin, 50 μg/ml Streptomycin
oder 5 μg/ml
Ampicillin verwendet, sofern im Text nicht anders angegeben. In
der gesamten Studie wurde der E.coli-Stamm DH5☐ unter Anwendung
von Standardtechniken wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben
verwendet.
-
Isolierung
von genomischer APP DNA
-
Die
in einem ml einer in BHI-Medium, ergänzt mit NAD (10 μg/ml), gezüchteten Übernachtkultur
von APP-HS25 vorhandenen Bakterien wurden durch Zentrifugation gesammelt
und der Überstand
verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml TE (10 mM Tris-HCl pH 8,5/1
mM EDTA), enthaltende Lysozym (7,5 mg/ml), resuspendiert und bei
37°C für 2 Std.
inkubiert, wobei anschließend
die Lösung
auf eine Endkonzentration von 0,1 M NaCl, 1% SDS und 2,5 μg/ml Proteinase
K eingestellt und die Inkubation über Nacht bei 50°C fortgesetzt
wurde. Am nächsten
Tag wurde die Zubereitung auf 0,5 M NaCl eingestellt und zweimal
mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (100:99:1, Vol./Vol./Vol.)
extrahiert. Anschließend
wurde die genomische DNA durch Zugabe von 0,6 Volumen Isopropanol
ausgefällt.
-
Isolierung und Klonierung
des APX1A-Gens
-
Amplifikation
des APX1A-Gens erfolgte anhand der Polymerasekettenreaktion (Polymerase
Chain Reaction, PCR). Die Reaktionen erfolgten in 50-μl-Volumen,
umfassend 50 ☐g genomische APP-DNA (HS25), 3 ☐g
Oligonukleotidprimer, 50 mM KCL, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM
MgCl2, 200 mg/ml BSA, je 200 mM dATP, dCTP,
dGTP und dTTP plus 1 Einheit einer Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer
Cetus, USA). Die Reaktionen wurden mit dem gleichen Volumen Paraffinöl überschichtet
und 1 Min. auf 94°C
erhitzt, 2 Min. auf 55°C
ab gekühlt
und 5 Min. auf 72°C
erhitzt. Dieser Zyklus wurde 35 Mal mit einem DNA-Thermocycler von Perkin-Elmer-Cetus
wiederholt. Ausgehend von der veröffentlichten Sequenz des APX1-Gens
(Frey et al., 1991) wurden spezifische Oligonukleotide entworfen.
Die Sequenz der beiden Oligonukleotide war 5'-GGA GGA TCC ATG GCT AAC TCT-3' und 5'-ACC TAC CCG GGA
TAG GAT TGC TAT TT-3',
und war entworfen, um ein PCR-Produkt mit einer BamHI-Schnittstelle
am 5'-Ende und einer
SmaI-Schnittstelle am 3'-Ende
zu produzieren, um die Klonierung zu erleichtern. Die Oligonukleotide
wurden mit einem Gene Assembler Plus DNA Synthesizer (Pharmacia,
Schweden) synthetisiert. Produkte der PCR-Reaktionen, die dem vorhergesagten
Molekulargewicht des APX1-Gens entsprachen, wurden durch Genreinigung
(BRESATech, Australien) aus den Agarosegelen isoliert, mit den Restriktionsenzymen
BamHI und SmaI verdaut und in die BamHI- und SmaI-Schnittstellen
von pUC18 (Yanish-Perron et al., 1985) kloniert. Die Bestätigung von
Klonen, die das APX1-Gen enthielten, erfolgte durch Doppelstrangsequenzierung
(Ergebnisse nicht gezeigt).
-
Isolierung des APX1A-Gens
aus dem APP-Chromosom
-
Ausgehend
von den veröffentlichten
Daten sind die 3' liegenden
2 kb des APX1A-Gens auf einem HindIII-Fragment von etwa 5 kb kodiert
(Frey et al., 1993). Um dieses Fragment zu isolieren, wurde die
genomische APP-HS25-DNA vollständig
mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und auf einem Agarosegel
nach Fragmentgröße aufgetrennt.
Verdaute DNA wurde durch Färbung
mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht, und die Region, die etwa 5
kb entsprach, wie mittels DNA-Molekulargewichtsstandards (Progen,
Australien) geschätzt,
ausgeschnitten und die DNA mit Gene Clean (BRESATech, Australien)
gereinigt. Die nach Größe selektierte
genomische DNA wurde in pUC18 kloniert und in E.coli transformiert.
Die resultierende E.coli-Bibliothek wurde mit dem APX1A-PCR-Fragment
als Sonde inkubiert, und positive Klone wurden ausgewählt. Die Authentizität der durch
Hybridisierung identifizierten Klone erfolgte mittels Restriktionsenzymverdau.
-
Transformation
von APP mit Plasmidvektoren
-
Die
Erzeugung elektrokompetenter APP und die Bedingungen zum Einführen von
Plasmid-DNA in diese
Zellen durch Elektroporation (0,2-cm-Küvetten, 400 SL, 1,25 kV und
25 μF) erfolgte,
wie von Frey (1992) beschrieben, mit der Ausnahme, dass 200-μl-Aliquots
kompetenter Zellen für
die Elektroporation verwendet wurden. Aus Übernacht-Kulturen die unter
Selektionsbedingungen mit Antibiotikagewachsen waren, wurde mittels
Magic Minipreps (Promega) Plasmid-DNA von APP isoliert.
-
Isolation
von Regionen des APP-Chromosoms mittels PCR
-
Amplifikation
von Regionen des APP-Chromosoms erfolgte mittels der Polymerasekettenreaktion
(Polymerase Chain Reaction, PCR). Die Reaktionen wurden in 50-μl-Volumen,
um fassend 50 ☐g genomische DNA, 3 ☐g Oligonukleotidprimer,
50 mM KCL, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2,
200 mg/ml BSA, je 200 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP plus 1 Einheit
Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA), durchgeführt. Die
Präparation
von genomischer APP-DNA war wie in Prideaux et al. (1995) beschrieben,
wobei SDS und Proteinase K verwendet wurden. Die Reaktionen wurden
mit dem gleichen Volumen Paraffinöl überschichtet und 1 Min. auf
94°C erhitzt,
2 Min. auf 55°C
abgekühlt
und 5 Min. auf 72°C
erhitzt. Spezifische Oligonukleotide wurde mit einem Gene Assembler
Plus DNA Synthesizer (Pharmacia, Schweden) synthetisiert. Produkte der
PCR-Reaktionen wurden auf Agarosegelen aufgetrennt und durch Anfärben mit
Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
-
Mutagenese des APP-Chromosoms
innerhalb des APX1B-Gens
-
Das
Rekombinationsplasmid pIG3-BKr, das zur
Inaktivierung des APX1B-Gens konzipiert war, wurde durch Elektroporation
in APP HS22 eingebracht, wie von Prideaux et al. (1997) beschrieben,
und Transformanden wurden auf BHI/NAD-Agar, der Kanamycin enthielt,
selektiert. In APP-Transformanden, welche das Rekombinationsplasmid
enthielten, wurde dann pIG3-Ampr, isoliert
aus APP, durch Elektroporation eingeführt, und die Transformanden
wurden auf BHI/NAD-Agar, der Kanamycin und Ampicillin enthielt,
selektiert. Das Vorhandensein beider Plasmide wurde durch erneute
Isolierung von Plasmiden bestätigt,
indem Magic-Miniprep-Protokolle (Promega) verwendet und Restriktionsenzymanalyse
durchgeführt
wurde. Ein Transformand, der beide Plasmide enthielt, wurde über Nacht
durch Schütteln
in Ampicillin- und Kanamycin-haltigem BHI/NAD gezüchtet. Die
Kultur wurde 1:100 in 10 ml BHI/NAD enthaltend Ampicillin (50 μg/ml) verdünnt und über Nacht
geschüttelt.
Die Subkultivierung wurde insgesamt 6 Mal wiederholt, wonach Verdünnungen
der Kultur auf Kanamycin-haltigen BHI/NAD-Blutagarplatten ausgestrichen
wurden. Kolonien, die keine Nämolysezonen
auf Blutagarplatten produzierten, wurden identifiziert und zur weiteren
Charakterisierung isoliert.
-
Southern-Blot-Analyse
von PCR-Produkten
-
Produkte
von PCR-Reaktionen wurden auf 1 %igen Agarosegelen neben DNA-Molekulargewichtsmarkern
(Progen, Australien) aufgetrennt, damit nach Anfärben mit Ethidiumbromid eine
Größenschätzung durchgeführt werden
konnte. Die aufgetrennte DNA wurde mit einem Vakuum-Blot-System
(Pharmacia) entsprechend den Anleitungen des Herstellers auf Hybond-N-Membranen
(Amersham) übertragen.
Membranen wurden über
Nacht bei 65°C
in Puffer mit 5x SSPE (1xSSPE: 0,18 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat,
1 mM EDTA, pH 7,7), 5 × Denhardt's-Lösung (1 × Denhardt's: 0,02 % BSA, 0,02
% Ficoll und 0,02 % Polyvinylpyrrolidon) und 0,5 % SDS hybridisiert.
Die Hybridisierungssonden wurden mit dem Random-Hexamer-Primer-System (BRESATech, Adelaide,
Australien) nach den Anleitungen des Herstellers markiert. Nach
der Hybridisierung wurden die Membranen mit einer abschließenden Stringenz
von 0,1 % SDS/0,1 × SSPE
bei 65°C
für 10 Min.
gewaschen und einem Röntgenfilm
(Fuji RX) ausgesetzt.
-
Produktion
von Antiseren
-
Übernachtkulturen
von APP HS25 wurden 1 zu 20 verdünnt
und bei 37°C
unter Schütteln
gezüchtet, bis
ein OD600 von 0,8 erreicht war. Zu diesem
Zeitpunkt wurden die Kulturen bei 12.000 Umdrehungen pro Minute
12 Min. lang bei 4°C
zentrifugiert und die Proteine im Überstand mit dem Verfahren
von Fedorka-Cray et al. (1990) gereinigt. Kaninchen erhielten insgesamt
drei Dosen gereinigten Proteins (100 μg) in Abständen von zwei Wochen, von denen
die erste in komplettem Freund-Adjuvans erfolgte und anschließende Impfungen
in inkomplettem Freund-Adjuvans. Zwei Wochen lang nach der letzten
Verstärkungsimpfung
(Boost) wurde Serum abgenommen.
-
Western-Blot-Analyse
-
Eine
Western-Blot-(Immunblot)-Analyse wurde nach dem Verfahren von Sambrook
et al. (1989) durchgeführt.
Zum Nachweis von APX-Proteinen wurde Kaninchenserum in einer Verdünnung von
1:50 verwendet, das gegen APP-HS25-Proteine aus Kulturüberstand
hergestellt worden ist. Das Kaninchenserum wurde gegen APP Tox– voradsorbiert,
um Kreuzreaktionen und nicht gegen APX gerichtete Antikörper vor
dem Gebrauch zu entfernen. Das in einer Verdünnung von 1:1000 verwendete
Konjugat war Schaf-Anti-Kaninchen-Ig-Antiserum, konjugiert mit affinitätsgereinigter
HRP (Silenus), mit Tetramethylbenzidin (McKimm-Breschkin, 1990)
als Substrat. Bakterienproben für
die Western-Blot-Analyse wurden hergestellt, indem Übernachtkulturen
1 zu 20 in dem geeigneten Wachstumsmedium verdünnt und bei 37°C unter kräftigem Schütteln inkubiert
wurden, bis ein OD600 von 0,8 erreicht war.
Zu diesem Zeitpunkt wurden Proben, die 20 μl Gesamtkultur enthielten, durch SDS-PAGE
analysiert, und Proteine wurden mit einer Bio-Rad Transblot Cell
wie in den Spezifikationen des Herstellers beschrieben, auf Nitrocellulose
(Bio-Rad) übertragen.
-
Impfung und
Challenge-Infektion von Mäusen
-
Sechs
Wochen alte weibliche Balb/C-Mäuse,
erhalten vom Walter and Elisa Hall Institute of Medical Research
(Parkville, Vic, Australien), wurden in der CSIRO Division of Animal
Health (Parkville, Vic, Australien) in PC2-Einrichtungen mit Wasser
und Futter ad libitum gehalten. Den Mäusen wurde am Tag 0 und 14
intraperitoneal (IP) eine 200 μl
APP-Zubereitung injiziert und sie erhielten an Tag 28 eine Challenge-Infektion
IP. Kontrollmäuse
erhielten 200 μl
BHI-Bouillon IP. Die Anzahl der Mäuse, die 24 Stunden nach der
Challenge-Infektion überlebten,
wurde protokolliert und wurden als geschützt vor einer Challenge-Infektion
oder mit einer subletalen Dosis geimpft betrachtet.
-
Antikörperassay
-
Allen
Mäusen
wurde vor der Impfung und vor der Verstärkungsimpfung (Boost) oder
der Challenge-Infektion Blut aus der Schwanzvene abgenommen. Die
Antikörperantwort
auf APX1A oder 2A wurde durch einen ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant
Assay) mit 0,5 μg
Poly-His-gereinigtem APX je Well, wie von Prideaux et al. (1995)
beschrieben, durchgeführt.
Titer sind ausgedrückt
als die höchste
Verdünnung,
die noch optische Dichten über
denen von Seren von unbehandelten Mäusen ergaben.
-
BEISPIEL 2
-
ENTWICKLUNG
EINES PLASMIDVEKTORS FÜR
APP
-
Eine Übersicht über 14 APP-Stämme (zur
Verfügung
gestellt von Dr. Pat Blackall; Animal Research Institute, Moorooka,
QLD, Aust.) identifizierte zwei Stämme, die Plasmide aufwiesen,
welche durch Magic-Miniprep-Plasmidisolierung (Promega) kombiniert
mit Agarosegel/Ethidiumbromidnachweis detektiert werden konnten
(Ergebnisse nicht gezeigt). Einer dieser Stämme, HS205, erwies sich als
resistent gegen Streptomycin. Plasmid-DNA, die aus diesen Bakterien
isoliert wurde, konnte sowohl E. coli als auch APP eine Streptomycinresistenz
vermitteln, wenn sie durch Elektroporation eingeführt wurde.
-
Restriktionsenzymanalyse
von Plasmid-DNA, die aus E. coli isoliert wurde, welche mit Plasmid-DNA, isoliert
aus HS205, transformiert und auf Streptomycin selektiert wurden,
identifizierte ein 4,2-kb-Plasmid (pIG3), das seine eigene Replikation
und eine Streptomycinresistenz kodiert (1A). Für pIG3 wurde
eine Restriktionsenzymkarte erstellt, und durch einen Prozess des
Restriktionsenzymverdaus und Ligation wurde festgestellt, dass,
wenn ein 2,3-kb-PstI-0-Subfragment
von pIG3 selbst-ligiert (pIG317) und in E. coli transformiert wurde,
die resultierenden Transformanden streptomycinresistent waren (1B).
-
Um
die Einsatzflexibilität
dieses Plasmids zur Übertragung
von Fremd-DNA in E. coli und APP zu erhöhen, wurde das 450-bp-HaeII-Fragment
von pIC19R, welches die multiple Klonierungsstelle und das Lac-Gen
enthält
(Marsh et al., 1984), in die einzige EcoRI-Schnittstelle von pIG317
subkloniert, die sich 300 bp nachgeschaltet (downstream) zur PstI-Schnittstelle
befindet (pIG3B, 1B). Das resultierende Plasmid pIG38
(Abbildung 1C) weist eine multiple Klonierungsstelle auf, die sich
für das
Einsetzen von Fremd-DNA in das Plasmid eignet, und ein Lac-Gen zur
schnellen Selektion von Plasmiden, die Fremd-DNA tragen, basierend
auf der Blau/Weiß-Selektion
in Gegenwart von X-gal in E. coli.
-
BEISPIEL 3
-
EXPRESSION DES APX1A-GENS
in E. COLI
-
Um
etwaige Fehler zu minimieren, die während der PCR in das offene
Leseraster (ORF) von APX1A eingeführt worden sein könnten, und
um eine korrekte Ausrichtung des ORF in dem Expressionsvektor zu
ermöglichen,
wurde das genomische Fragment in Verbindung mit dem PCR-Fragment
verwendet, um das Expressionsplasmid pQE-T1 zu konstruieren, wie
in 2 skizziert. Diese Strategie ermöglichte,
dass der APX1A-ORF im Leseraster mit dem Poly-His-Reinigungssignal in pQE30 (QIAGEN
Inc., Chatsworth, CA, USA) eingeführt werden konnte und überwiegend
aus genomischer DNA bestand.
-
Die
Expression von APX1A von pQE-T1 stand unter der Kontrolle eines
regulierbaren Promotor-/Operatorelementes, bestehend aus dem Promotor
des E. coli-Phagen T5 und zwei Lac-Operatorsequenzen. Optimale Expression
von APX1A von pQE-T1 wurde erreicht, indem eine Übernachtkultur von E. coli,
die den Expressionsvektor enthielt, in Gegenwart von Ampicillin
(100 μg/ml)
gezüchtet
wurde. Am folgenden Tag wurde die Kultur 1 zu 50 verdünnt und
bei 37°C
unter starkem Schütteln
inkubiert, bis eine OD600 von 0,8 erreicht
war. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Induktion des Toxins erreicht,
indem IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben wurde
und die Kultur für
weitere 5 Stunden gezüchtet
wurde, wobei E. coli anschließend durch
Zentrifugation bei 8.000 Umdrehungen pro Minute für 12 Minuten
gesammelt wurden.
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Die
Reinigung von APX1A wurde durch immobilisierte Ni-Chelat-Affinitätschromatographie
unter denaturierenden Bedingungen nach Anleitung des Herstellers
(QIAGEN Inc. Kalifornien, USA) erreicht. Dieses System nutzt den
6-His-Marker, der auf Proteinen vorhanden ist, die mit dem pQE-System
exprimiert werden.
-
BEISPIEL 4
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KONSTRUKTION EINER APX1A-EXPRESSIONSKASSETTE
FÜR APP
-
Um
die Konstruktion von pIG-basierten APX1-Expressionskassetten zu
erleichtern, wurde das Kanamycinresistenzgen aus pUC4K (Pharmacia)
isoliert und über
pIC20R in pQE-T1 kloniert, wie in 3 gezeigt. Das
resultierende Plasmid, pQET1K, enthielt das Kanamycinresistenzgen
und das APX1A-Gen, verknüpft
mit dem T5-Promotor, beide flankiert von SalI-Restriktionsenzymschnittstellen. Das
SalI-Fragment wurde isoliert und mit pIG3B, welches zuvor mit SalI
verdaut wurde, ligiert und in E. coli transformiert. Der gewünschte Klon wurde
identifiziert, indem Transformanden ausgewählt wurden, die kanamycinresistent
waren und in Gegenwart von X-Gal weiße Kolonien produzierten. Plasmid-DNA
wurde isoliert und anhand einer Restriktionsenzymanalyse wurde das
vorhergesagte Profil von pIG3B-T1K bestätigt (3).
-
BEISPIEL 5
-
KONSTRUKTION
DES APP-IMPFSTOFFSTAMMES
-
Während der
Durchführung
einer ortsspezifischen Mutagenese des Chromosoms von HS93 APP (Serovar
7; nur Produktion von APX2), darauf ausgerichtet, einen kleinen
Abschnitt des APX2C-Gens zu deletieren, wurde ein Isolat erhalten,
dass auf Blutagarplatten keine Hämolysezone
produzierte. Die weitere Charakterisierung dieses Isolates (APP
Tox–)
zeigte, dass ihm ein großer
Abschnitt des Chromosoms in der Umgebung der vorgesehenen Deletionsstelle
fehlte. Der resultierende Stamm APP Tox– enthält keine
strukturellen oder aktivierenden APX-Gene, obgleich er noch die
zur APX-Sekretion erforderlichen Proteine produziert, da diese Gene
sich an anderer Stelle auf dem APP-Chromosom befinden.
-
Der
Stamm APP Tox– wurde
mit pIG3B-T1K wie im Abschnitt „Materialien und Methoden" beschrieben unter
Verwendung einer Kanamycin-Selektion transformiert. Aus kanamycinresistenten
Kolonien wurde Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsenzymverdau
analysiert, um die vorhergesagten Profile von pIG3B-T1K zu bestätigen.
-
BEISPIEL 6
-
CHARAKTERISIERUNG
DES APP-IMPFSTOFFSTAMMES
-
Übernachtkulturen
des Stammes APP Tox–, der pIG3B-T1K enthielt,
sowie der Stamm APP Tox– und HS93 wurde durch
Western Blotting untersucht, wobei Antiseren verwendet wurden, die
in Kaninchen gegen die abgesonderten Proteine von HS25 (d. h. APX1
und 2) hergestellt wurden. Aus dem Western Blot (4) ist
ersichtlich, dass der Stamm APP Tox– die
in dem Serum vorhandenen Antikörper
nicht bindet, während
sowohl Wildtyp-HS93 als auch APP Tox–/pIG3B-T1K
eine einzelne Bande aufwiesen. Die mit Tox–/pIG3B-T1K
detektierte Bande ist größer als
die mit dessen Elternstamm HS93 erhaltene, da der Elternstamm APX2
(offensichtliches MW von 103–105
kDa) exprimiert, während
Tox–/pIG3B-T1K
APX1 produziert (offensichtliches MW von 105–110 kDa).
-
BEISPIEL 7
-
VERGLEICH
DER VIRULENZ VON APP-STÄMMEN
BEI MÄUSEN
-
Übernachtkulturen
von APP HS93, HS25 und Tox
– wurden unter kräftigem Schütteln bei
37°C in BHI-Bouillon,
ergänzt
mit NAD (10 μg/ml),
gezogen. Am folgenden Tag wurden die Kulturen 1:20 verdünnt und die
neuen Kulturen inkubiert, bis ein OD
600 von
0,8 erreicht war. Bei diesem OD
600-Wert
beträgt
die Anzahl der lebenden APP 1 × 10
9 je ml (Daten nicht gezeigt). In mit NAD
(10μg/ml)
versetzter BHI-Bouillon wurden verschiedene Verdünnungen der Kulturen hergestellt
und 200 μl
den Mäusen
IP verabreicht. Die Mäuse
wurden nach der Challenge-Infektion beobachtet und die Gesamtanzahl
der verstorbenen Mäuse
nach 24 Stunden notiert. Unter unseren Bedingungen starben in diesem
Zeitraum keine Mäuse
an der APP-Infektion, wobei die erhaltenen Ergebnisse in Tabelle
1 präsentiert
sind. Ein Vergleich der mit jedem Serovar erhaltenen toten Mäuse würde anzeigen,
dass HS25, der zu Serovar 1 gehört
und sowohl APX1 als auch APX2 produziert, der virulenteste APP-Stamm
ist (100% Todesfälle
bei 1 × 10
7), gefolgt von HS93 (100% Todesfälle bei
1 × 10
8), der zu Serovar 7 gehört und nur APX2 produziert,
während
der Stamm Tox
– (Serovar
7) selbst bei der höchsten verwendeten
Dosis keine Mäuse
tötete.
Dieses Ergebnis stimmt mit Beobachtungen aus Pleuropneumonie-Ausbrüchen bei
Schweinen überein,
in denen die schwersten Ausbrüche
mit APP-Serovaren verbunden waren, die APX1 und 2 produzieren. Tabelle
1: Virulenz von APP-Stämmen
bei Mäusen PROZENTUALE
TODESFÄLLE
-
Tabelle
1: Mäusen
wurden 200 μl
einer Bakteriensuspension injiziert, die verschiedene Mengen von APP-Stämmen, d.
h. der Stämme
HS25, HS93 oder Tox–, enthielt. Nach 24
Stunden wurde die Anzahl der verstorbenen Tiere notiert und als
Prozentanteil der Gesamtpopulation ausgedrückt.
-
BEISPIEL 8
-
SCHUTZ DER MÄUSE VOR
EINER TÖDLICHEN
APP-CHALLENGE-INFEKTION
-
Es
wurden Übernachtkulturen
von HS93 und Tox– hergestellt; am nächsten Tag
wurde eine Verdünnung
von 1:20 hergestellt und bis zu einem OD600 von
0,8 gezüchtet.
Es wurden Verdünnungen
aller Bakterien hergestellt, so dass eine Impfung mit 200 μl entweder
2 × 107 HS93 oder 2 × 108 Tox– enthielt.
Diese Werte wurden gewählt,
um die Impfdosis zu maximieren, aber noch eine subletale Challenge-Infektion
aufrecht zu erhalten. Kontrollmäuse
erhielten 200 μl
BHI-Bouillon. Die Mäuse
wurden IP an Tag 0 und 14 geimpft und erhielten an Tag 28 als Challenge-Infektion
entweder 2 × 108 HS25 oder 5 × 108 HS93,
wobei nach 24 Stunden die Zahl der verstorbenen Mäuse notiert
wurde (Tabelle 2). Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass
sowohl HS93 als auch Tox– vollständigen Schutz
vor einer homologen Challenge-Infektion boten, während HS93 einen gewissen Schutz
vor einer heterologen Challenge-Infektion lieferte. Der Tox–-Stamm
bot keinen Schutz vor einer heterologen Challenge-Infektion, was
auch bei Bakterin-basierten inaktivierten Impfstoffen beobachtet
wird und auf eine Rolle von APX-Toxinen als Serotyp-kreuzprotektive
Antigene hinweist.
-
Um
die Fähigkeit
von APP Tox– zu
untersuchen, die eine inaktivierte Form von APX1 von einem Plasmid
exprimieren, Mäuse
vor einer letalen heterologen Challenge-Infektion mit APP, wurden
Mäuse mit
APP Tox– oder
mit APP Tox–/pIG3B-T1K
nach folgendem Schema geimpft. Am Tag 1 wurde den Mäusen aus
der Schwanzvene Blut entnommen und anschließend wurden die Tiere IP mit
200 μl BHI
geimpft, das 2 × 108 Tox– oder Tox–/pIG3B-T1K
enthielt. Der Vorgang wurde am Tag 14 wiederholt, und am Tag 28
wurde den Mäusen aus
der Schwanzvene Blut entnommen, und den Tieren wurde 5 × 108 oder 1 × 108 APP
HS25 als Challenge-Infektion injiziert. Die von den Mäusen abgenommenen
Seren wurden in einem ELISA verwendet, um gegen APX1 gerichtete
Antikörper
zu bestimmen, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden" beschrieben ist. Kontrollseren
stammten von Mäusen,
die zwei Dosen von HS93 (2 × 108) oder HS25 (2 × 106)
IP in zweiwöchigen
Abständen
erhalten hatten.
-
Die
in Tabelle 3 präsentierten
ELISA-Ergebnisse zeigen, dass eine einzige Dosis von Tox–/pIG3B-T1K ausreicht,
um bei Mäusen
eine gute Antikörperantwort
zu induzieren, die auf einer niedrigeren Ebene äquivalent zu der Antwort ist,
die nach zwei Dosen von HS25 erreicht wird. Die Anti-APX1-Antwort
war nach einer zweiten Impfung mit Tox/pIG3B-T1K erheblich stärker, während Mehrfachimpfungen
mit HS93 oder Tox– keine Antikörperwerte über dem
Hintergrund produzierten. Die Unfähigkeit, Antikörper zu
detektieren, die nach Mehrfachimpfungen mit HS93, der APX2 produziert,
APX1 erkennen, würde
darauf hinweisen, dass gegen APX2 gerichtete Antikörper nicht
mit APX1 kreuzreagieren können.
Dies widerspricht der Fähigkeit
von HS93, welcher APX2 exprimiert, einen gewissen Schutz vor einer
heterologen Challenge-Infektion zu bieten und könnte den Unterschied zwischen
einem von E. coli exprimierten Antigen und einem von APP stammenden widerspiegeln.
-
Mäuse, die
als Challenge-Infektion 10 ID50 von HS25
erhalten haben, zeigten keinen Schutz nach Impfung mit Tox–,
während
solche, die mit Tox–/pIG3B-T1K geimpft wurden,
einen Schutz von 60% zeigten. Wenn das Niveau der Challenge-Infektion
auf 5 ID50 von HS25 reduziert wurde, wurde
wiederum kein Schutz mit Tox– alleine beobachtet,
während
Tox–,
welcher das APX1A-Gen von einem Plasmid exprimierte (Tox–/pIG3B-T1K), einen
Schutz von 100% zeigte (Tabelle 4).
-
TABELLE
2: Impfung von Mäusen
mit APP Tox
– PROZENTUALE
TODESFÄLLE
-
Tabelle
2. Mäuse
wurden zweimal in zweiwöchigen
Abständen
intraperitoneal mit 2 × 108 APP Tox– oder
2 × 107 des Elternstammes HS93 geimpft und erhielten
anschließend
zwei Wochen später
eine Challenge-Infektion mit HS93 (homolog) oder HS25 (heterolog).
Kontrollmäuse
erhielten 200 ml BHI-Bouillon. Die nach der Challenge-Infektion
auftretenden Todesfälle
wurden notiert als Prozentanteil von Mäusen in jeder Gruppe, die innerhalb
von 24 Stunden verstarben.
-
Tabelle
3. Induktion von APX1A-spezifischen Antikörpern in geimpften Mäusen
-
Tabelle
3. Mäuse
wurden zweimal in zweiwöchigen
Abständen
intraperitoneal mit 2 × 108 Tox– oder Tox–/pIG3B-T1K
geimpft, und vor und zwei Wochen nach dem Boosting wurde Serum abgenommen.
Kontrollmäuse
erhielten zwei Dosen mit 2 × 107 HS93 oder 2 × 106 HS25.
APX1A-spezifische Antikörper
wurden in einem ELISA gemessen und der Titer ausgedrückt als
Kehrwert der letzten Verdünnung,
die Absorptionswerte über
dem Hintergrund ergab.
-
Tabelle
4. Schutz von Mäusen
gegen eine heterologe Challenge-Infektion mit APP nach Impfung mit Tox
–/pIG3B-T1K
-
Tabelle
4. Mäuse
wurden zweimal in zweiwöchigen
Abständen
intraperitoneal mit dem Tox– Stamm von APP mit und
ohne Plasmid pIG3B-T1K geimpft, welches die Expression des APX1A-Proteins
kodiert. Kontrollmäuse
erhielten zwei Dosen vmn BHI-Medium. Zwei Wochen nach der letzten
Impfung erhielten die Mäuse eine
heterologe Challenge-Infektion mit APP HS25.
-
BEISPIEL 9
-
MUTAGENESE DES APX18-GENS
-
Konstruktion von Rekombinationsplasmiden
-
Es
wurde eine Rekombinationskassette, die eine ortsspezifische Mutagenese
des APX1 B-Gens
ermöglicht,
konstruiert, in dem ein 2,4-kb-EcoRI-Fragment, das das APXB-Gen
trägt (Frey
et al., 1993), in pIC19R (Marsh et al., 1984) kloniert wurde. In
das APX1B-Gen, das mit BamHI deletiert war, wurde ein 1,2-kb-BamHI-Fragment
kloniert, welches das Kanamycin-Resistenzgen
(Kanr) von pUC4K (Pharmacia) trägt (5A).
Das APX1B-Gen mit dem internen Kanr-Gen
wurde als ein EcoRI-Fragment isoliert und in die EcoRI-Stelle des
APP-Plasmidvektors pIG317 (Prideaux et al., 1995) kloniert, um die
Rekombinationskassette pIG3-BKr zu bilden.
-
Für die Plasmidsegregation
wurde das Plasmid pIG3-AMPr verwendet, um
die Rekombination zwischen pIG3-BKr und
dem APP-Chromosom zu erleichtern. Dieses Plasmid wurde konstruiert,
indem das Ampicillin-Resistenzgen (AMPr)
(Murphy et al.) in die multiple Klonierungsstelle von pIG317 kloniert
wurde.
-
Zur
Mutagenese des APX1B-Gens wurde die Rekombinationskassette pIG3-BKr, die ein EcoRI-Fragment des APX1B-Gens,
unterbrochen von einem Kanr-Genmarker, umfasste,
in dem APP-Plasmidvektor pIG317 verwendet (5A). Wildtyp-APP-HS22
(Serovar 1: APX1 und APX2) wurde mit pIG3-BKr und
anschließend
mit einem Ampicillin-resistenten Derivat von pIG317 (pIG3-Ampr) transformiert. Mit beiden Plasmiden transformierte
Zellen wurden auf Medium selektiert, das sowohl Ampicillin und Kanamycin
enthielt. Zur Erhaltung von pIG3-AMPr und
zur Förderung
des Verlustes von pIG3-BKr durch Plasmidsegregation
wurden Zellen, die beide Plasmide enthielten, durch ein Medium geführt, das
nur Ampicillin enthielt. Zur Identifizierung von Zellen, bei denen
eine Rekombination zwischen pIG3-BKr und
dem APP-Chromosom stattgefunden hatte, wurden Kulturen auf BHI/NAD-Blutagarplatten
ausgestrichen, die Kanamycin enthielten. Jede Bakterienkolonie,
die keine Hämolysezonen
auf Blutagarplatten produzierte, wurde auf eine frische Blutagarplatte
aufgetragen, die Kanamycin enthielt. Es wurde eine einzige Kolonie
identifiziert (HS22B–), die sowohl gegen
Kanamycin resistent war, als auch keine Hämolysezone produzierte. Diese
Kolonie wurde in Kanamycin-haltiger BHI/NAD-Bouillon gezüchtet und
genomische DNA wurde wie zuvor beschrieben gewonnen (Prideaux at
al., 1997).
-
Aus
HS22B– und
dem Wirtsstamm HS22, der pIG3-BKr enthielt,
wurde genomische DNA isoliert und durch PCR mit Oligonukleotiden
(B5'-GCATTTTGGAACAAG;
B3'-CGGTGATCAAATAGC)
untersucht, die so gestaltet waren, dass sie sich an das APP-Genom
außerhalb
der Region innerhalb der Rekombinationskassette anlagern (5A).
Die Produkte der PCR wurden durch Southern-Blot-Analyse, wie unter „Materialien und
Methoden" beschrieben,
analysiert, indem die isolierten Gene Kanr oder
APX1B als Sonden verwendet wurden (6A). Aus 6A ist
ersichtlich, dass die Region des APP-Chromosoms, die das APX1B-Gen
enthält
und in der PCR amplifiziert wurde, in dem nicht-hämolytischen/Kanamycin-resistenten
rekombinanten HS22B– etwa 1,2 kb größer ist
(äquivalent
zur Größe des Kanr-Gens) als im Elternstamm HS22. Die Analyse der
PCR-Produkte durch Southern-Blot-Analyse bestätigte, dass die amplifizierten
Produkte die Region des APP-Chromosoms
wiedergeben, welche das APX1B-Gen enthält, und im Falle von HS22B– hybridisierte
diese vergrößerte Region
außerdem
spezifisch mit dem Kanr-Gen. Diese Ergebnisse
bestätigen,
dass zwischen dem APP-Chromosom und pIG3-BKr eine
homologe Rekombination stattgefunden hat, die in einem ortsspezifischen
Transfer des Kanr-Gens auf das APP-Chromosom resultierte.
-
BEISPIEL 10
-
MUTAGENESE DES APX2C-GENS
-
Zur
Verwendung bei einer ortsspezifischen Mutagenese des APP-APX2C-Gens
wurde das Plasmid pEC-C–Ampr (5B)
konstruiert. Ein 3,4-kb-Fragment, welches das APX2C-Gen enthielt,
die ersten 700 bp des APX2A-Gens, sowie die Region unmittelbar 5' zum APX2-Operon wurden mittels
PCR isoliert, und mit einem Pharmacia Gene Assembler Plus DNA Synthesizer
wurden Oligos (5'-CGCACCATGGTCGGGC, 3'-ACGTGATCGACAATC)
ausgehend von veröffentlichten
Sequenzen (Frey et al., 1991) synthetisiert. Das PCR-Fragment wurde
in den Mycobacterium/E.coli-Shuttlevektor pEP2 (Radford and Hodgson,
1991) kloniert. Das resultierende Plasmid pEP2-CA enthält eine
einmalig vorhandene XbaI-Restriktionsschnittstelle, die sich etwa
in der Mitte des offenen Leserasters von APXC befindet, in den das
Ampicillin-Resistenzgen eingesetzt wurde, um das Rekombinationsplasmid
pEP-C– Ampr zu erzeugen.
-
Ortsspezifische
Mutagenese des APX2C-Gens nutzte die Rekombinationskassette pEP-C–Ampr (5B). Diese
Kassette beruht auf dem Corynebacterium-E. coli-Shuttlevektor pEP2.
In unserem Labor schlug eine Reihe von Versuchen der Transformation
von APP mit pEP2 fehl, was uns zu der Schlussfolgerung veranlasste,
dass APP ein nicht-zulässiger
Wirt für
diesen Plasmidvektor und daher ein geeigneter Selbstmord-(„Suicide")-Vektor zur Verwendung
in APP ist. DNA von aus E. coli isolierten und mit Cäsiumchlorid
gereinigtem pEP-C-Ampr wurde mit ClaI linearisiert. Nach dem Verdau
wurde die DNA durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt und mit Ethanol
ausgefällt.
Insgesamt 3 μg
der linearisierten DNA wurde durch Elektroporation in APP HS93 (Serovar
7: APX2) mit dem zuvor von Prideaux et al. (1997) beschriebenen
Protokoll eingebracht, und die Produkte der Elektroporation auf
BHI/NAD-Blutagarplatten ausgestrichen, die Ampicillin in einer Konzentration
von 1 μg/ml
enthielten. Es wurde eine einzige Kolonie isoliert, die sowohl Ampicillin-resistent
war als auch keine Hämolysezone
auf Blutagarplatten produzierte.
-
Aus
der keine Zonen bildenden/Ampicillin-resistenten Mutante HS93C–Ar und dem Elternstamm HS93 wurde genomische
DNA extrahiert. Mittels Polymerasekettenreaktion wurde die Region
des APP-Chromosoms untersucht, welche das APX2C-Gen enthielt, indem
Oligonukleotide (5'-TACAGAACGTTGGTA, 3'-ACGTGATCGACAATC)
verwendet wurden, die an das APX2-Operon an den in 5B gezeigten
Stellen binden. Produkte der PCR-Reaktionen wurden durch Southern-Blot-Hybridisierung,
wie in „Materialien
und Methoden" beschrieben,
charakterisiert, indem das isolierte Ampr– oder
APX2C-Gen als Sonde verwendet wurde (6).
Die in 6B gezeigten Ergebnisse zeigen,
dass die Mutante HS93C–Ar ein
PCR-Produkt produziert, das etwa 1,5 kb (die Größe des Ampr-Gens)
größer ist
als im Elternstamm HS93. Produkte der PCR von beiden Bakterien hybridisierten
mit dem APX2C-Gen, aber nur die des Mutantenstammes hybridisierten mit
dem Ampr-Gen. Diese Ergebnisse zeigten an,
dass zwischen dem APP-HS93-Chromosom und dem Selbstmord-(„Suicide")-Plasmidvektor pEP-C-Ar homologe Rekombination stattgefunden hat,
die zum ortsspezifischen Transfer des Ampr-Gens auf das APP-Chromosom
führte.
-
Logarithmische
Kulturen eines jeden Mutantenstammes und deren Elternstämme wurden
unter Verwendung von in Kaninchen gegen die Absonderungsproteine
von APP HS25 (d. h. Serovar 1: APX1 und 2) erzeugten Antiseren durch
Western Blotting untersucht, wie unter „Materialien und Methoden" beschrieben.
-
BEISPIEL 11
-
VERGLEICH
DER VIRULENZ VON APP-STÄMMEN
BEI MÄUSEN
-
Übernachtkulturen
von APP HS93, HS22 und den beiden Mutantenstämmen wurden über Nacht
unter kräftigem
Schütteln
bei 37°C
in BHI-Bouillon, ergänzt
mit NAD (10 μg/ml),
ge züchtet.
Am folgenden Tag wurden die Kulturen 1:20 verdünnt, und die neuen Kulturen
inkubiert, bis eine OD
600 von 0,8 erreicht
war. Bei diesem OD
600-Wert beträgt die Anzahl
an lebendigen APP 1 × 10
9 Kolonie bildende Einheiten/ml (Daten nicht
gezeigt). In BHI-Bouillon wurden verschiedene Verdünnungen
der Kulturen hergestellt, und 200 μl 6 Wochen alten Mäusen intraperitoneal
an verabreicht. Die Mäuse
wurden anschließend
24 Stunden lang beobachtet, wonach der prozentuale Anteil der verstorbenen
Mäuse notiert
wurde. Unter unseren Bedingungen war nach diesem Zeitraum keine
Maus an der APP-Infektion verstorben. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE
5: Virulenz von APP-Eltern- und -Mutantenstämmen bei Mäusen PROZENTUALE
TODESFÄLLE
-
Mäuse wurden
intraperitoneal mit verschiedenen Mengen von APP-Eltern – und -Mutantenstämmen inokuliert.
Bei Mäusen,
die nicht innerhalb von 24 Stunden an der Infektion verstarben,
wurden davon ausgegangen, dass sie eine subletale Dosis erhalten
hatten. Die Ergebnisse sind notiert als Prozentanteil der Population,
der nicht an der Infektion verstarb.
-
BEISPIEL 12
-
SCHUTZ VON SCHWEINEN GEGEN
EINE HETEROLOGE CHALLENGE-INFEKTION MIT APP
-
Sechs
Wochen alten Schweinen wurde im Voraus Blut abgenommen, um auf vorhandene
Antikörper gegen
APP HS83 (Serovar 7) und APX2 zu testen, bevor die Tiere in experimentelle
Gruppen aufgenommen wurden. Neun 6 Wochen alte Schweine erhielten
1 × 109 Kolonie bildende Einheiten von APP HS93C–Ar in 1 ml Wachstumsmedium über intranasale
Inokulierung am Tag 0. Der Impfstoff wurde hergestellt, indem 10
ml BHI/NAD (10 μg/ml)
mit einer einzelnen Kolonie von NS93C–Ar inokuliert und unter kräftigem Schütteln bei 37°C gezüchtet wurde,
bis ein OD600 von 0,8 erreicht war. Das
Impfschema wurde am Tag 14 entsprechend Tag 0 wiederholt.
-
Am
Tag 28 wurden die Schweine in zwei Gruppen aufgeteilt (wie oben
beschrieben) und erhielten entweder 2 × 109 APP
HS25 (Serovar 1) in 2 ml Wachstumsmedium intranasal oder 2 ml BHI-Bouillon
auf die gleiche Weise. Der Challenge-Stamm wurde hergestellt, indem
eine einzelne Kolonie von HS25 in BHI/NAD (10 μg/ml)-Bouillon inokuliert wurden,
bis ein OD600 von 0,8 erreicht war. Zu diesem
Zeitpunkt lag die Anzahl der lebenden Bakterien bei 1 × 109 Kolonie bildenden Einheiten/ml.
-
Die
Anzahl der Schweine in jeder Gruppe und das Impf-/Challenge-Profil
waren:
Gruppe
1 | |
Nicht
geimpft und ohne Challenge-Infektion | 3
Schweine |
Gruppe
2 | |
Geimpft
und ohne Challenge-Infektion | 3
Schweine |
Gruppe
3 | |
Nicht
geimpft und mit Challenge-Infektion | 6
Schweine |
Gruppe
4 | |
Geimpft
und mit Challenge-Infektion | 6
Schweine |
-
Anzahl
und Schweregrad der Lungenläsionen,
die bei der Autopsie 5 Tage nach der Challenge-Infektion in jeder
Gruppe vorhanden waren, sind in Tabelle 6 gezeigt. Diese Ergebnisse
zeigen deutlich, dass eine Impfung mit HS93C–Ar Schweine vor einer Challenge-Infektion
mit dem heterologen Stamm von APP HS25 schützte. Die drei Schweine, die
weder geimpft noch infiziert wurden, hatte bei der Autopsie keine
feststellbaren Lungenläsionen,
was anzeigt, dass die in anderen Schweinegruppen zum Zeitpunkt der
Autopsie vorhandenen Lungenläsionen
aus der Behandlung nach Beginn der Impfstoffstudie resultierten.
Die drei Schweine, die geimpft und nicht infiziert wurden, hatten
bei der Autopsie ebenfalls keine Lungenläsionen, was anzeigt, dass der
Impfstoffstamm keine Lungenläsionen
in Schweinen induziert, die 2 Wochen nach der Inokulierung nachweisbar
sind. Zuvor hatten wir toxindefiziente APP-Stämme in den gleichen Dosen wie
bei der in diesem Experiment verwendeten Challenge-Infektion an
Schweine verabreicht, die Schweine an Tag 5 einer Autopsie unterzogen
und keine Läsionen
beobachtet. Die sechs nicht geimpften Schweine, die eine Challenge-Infektion mit
HS25 erhielten, zeigten alle bei der Autopsie zahlreiche Lungenläsionen,
was anzeigt, dass das in diesen Versuchen verwendete Challenge-Niveau
ausreichend war, um in ungeschützten
Tieren Läsionen
zu induzieren. Im Gegensatz zu den sechs nicht geimpften Kontrollen
zeigte nur ein Schwein der sechs Schweine, die vor der Challenge-Infektion
mit HS93C–Ar geimpft wurden, bei der Autopsie Anzeichen
einer Läsion.
Diese hatte die Form einer einzelnen Adhäsion zwischen Lunge und Rippenkäfig in dem
einen Schwein, wobei die Adhäsion
bei näherer
Untersuchung älter
erschien als die fünf
Tag seit der Challenge-Infektion. Aus dieser Adhäsion wurden Bakterien isoliert,
die sich als Nicht-APP erwiesen (d. h. kein NAD zum Wachstum benötigten). Unabhängig davon,
ob diese Läsion
aus der Challenge-Infektion mit APP HS25 resultierte, zeigt dieses
Ergebnis klar das Potential von HS93C–Ar, Schweine vor einer heterologen Challenge-Infektion
mit virulentem APP zu schützen.
-
DISKUSSION
-
Der
Serovar-7-APP-Stamm HS93 wurde durch ortsspezifische Mutagenese
modifiziert, um das APXC-Gen durch Insertion des Ampr-Gens
zu inaktivieren, ohne die Expression der APX-A, -B- oder -D-Gene zu
unterbrechen, wodurch der Impfstoffstamm HS93C–Ar erzeugt wurde. Prüfung des Impfstoffstammes in Mäusen zeigte,
dass er gegenüber
dem Elternstamm HS93 reduzierte Virulenz aufweist (Tabelle 5). Die
einzige wahre Evaluierung eines Impfstoffes ist seine Fähigkeit,
die Zielart vor einer Krankheit zu schützen. Um dies zu zeigen, impften
wir Schweine intranasal mit BS93C–Ar und verabreichten eine Serovar-übergreifende
Challenge-Infektion. Der für
die Challenge-Infektion verwendete Stamm war HS25, welcher zu Serovar
1 gehört und
sowohl APX 1 als auch APX 2 produziert. Diese Kombination der APX-Produktion
ist bekannterweise mit den schwersten Ausbrüchen einer Pleuropneumonie
verbunden. Ungeimpfte Schweine hatten zahlreiche Anzeichen einer
APP-Infektion bei der Autopsie, wobei sowohl Lungenadhäsionen als
auch -läsionen
vorhanden waren (Tabelle 6). Dagegen zeigte nur eines der sechs
geimpften Schweine ein Anzeichen einer Infektion, wobei es sich
dabei um eine einzelne Lungenadhäsion
handelte, die wahrscheinlich nicht das Ergebnis der Challenge-Infektion
war. Dieses Ergebnis zeigt deutlich die Eignung des Stammes HS93C–Ar zur Verwendung als Lebendimpfstoff gegen
Schweine-Pleuropneumonie. Es wurde auch gezeigt, dass der Impfstoff
intranasal verabreicht werden kann und dieser die Fähigkeit
hat, Schweine vor einer Serovar-übergreifenden
Challenge-Infektion zu schützen.
Dies ist der erste Bericht eines Lebendimpfstoffstammes von APP,
der zur Verwendung bei Schweinen geeignet ist, um Serovar-übergreifenden
Schutz zu bieten.
-
BEISPIEL 13
-
EXPRESSION
VON FREMDPROTEINEN VON APP-VEKTOREN
-
Das
Potential zur Expression von Fremdgenen von APP wurde oben in diesem
Dokument gezeigt, als das APX1-Gen aus einem Serovar-1-Stamm von
APP HS25 isoliert und aus einem Plasmid in dem modifizierten Serovar-7-Stamm
von APP HS93-Toxin– exprimiert wurde. Serovar-7-Stämme von
APP kodieren keine APX1-Gene und die Konstruktion des Tox–/pIG3B-T1K-Stammes
und anschließende
Evaluierung gibt die Fremdgenexpression von APP wieder (4).
Dieser Stamm wurde weiter charakterisiert und es erwies sich, im
Vergleich zu Wildtyp HS93 oder dem modifizierten HS93 Toxin– (Tabelle
3), als fähig,
in Mäusen
Anti-APX1-Antikörper
zu induzieren. Die Expression des APX1-Gens von dem Tox–-Stamm
produzierte außerdem
einen Lebendimpfstoff, der sich als in der Lage erwies, Mäuse vor
einer heterologen Challenge-Infektion mit APP zu schützen, wiederum
im Gegensatz zu dem Tox–-Elternstamm.
-
Um
das Potential von APP als Bakterienvektor weiter aufzuzeigen, wurde
eine Reihe von pIG-basierten Expressionskassetten für die Expression
einer Reihe von Fremdproteinen von APP konstruiert, wie in 8 gezeigt. Die Gene, die Fremdproteine
kodierten, wurden zusammen mit geeigneten Promotoren in pIG-basierte
Plasmide kloniert, um eine Expression in APP zu ermöglichen.
Nach Konstruktion und Charakterisierung in E. coli wurden die Expressionsplasmide
in APP transformiert, wie unter „Materialien und Methoden" beschrieben. Aus
antibiotikaresistenten Kolonien wurde Plasmid-DNA isoliert und durch
Restriktionsenzymverdau analysiert, um die vorhergesagten Profile
zu bestätigen.
-
Zytokine
sind die Hormone des Immunsystems, die die Wirkung von Immunantworten
nach Infektion und Impfung kontrollieren und festlegen. Zytokine
können
verwendet werden, um die Immunantwort auf ein bestimmtes Antigen
zu erhöhen
und die Immunantwort in die angemessenste Richtung (humoral oder
zellulär) zu
lenken, um protektive Immunität
zu induzieren. Die Expression von Zytokinen von APP-Vektoren könnte sich
als Mittel erweisen, die Immunantwort gegen APP und etwaiger zusätzlicher
koexprimierter Fremdantigene zu optimieren. Das IL-Gen des Schweins
wurde von Dr. David Strom, CSIRO Division of Animal Health erhalten
und in einen geeigneten Plasmidvektor kloniert (8,
pIG-IL6), um eine Expression in APP zu erhalten (HS93/pIG-IL6).
Im Falle von Schweine-IL6, wurde die Expression von APP-Vektoren
mithilfe eines monoklonalen Antikörpers festgestellt (zur Verfügung gestellt
von Dr. David Strom, CSIRO Division of Animal Health). Aus 9 ist
ersichtlich, dass der monoklonale Antikörper mit einem einzelnen Protein
in APP/3B-IL6 der erwarteten Größe (22 kDalton)
und identischer Größe wie das
aus E. coli stammende Material reagiert. HS93 ohne die Expressionskassette
reagiert dagegen nicht mit dem monoklonalen Antikörper.
-
Das
Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT)-Gen kodiert ein Enzym, das
Resistenz gegen das Antibiotikum Chloramphenicol bietet und in Enzymreaktionen
leicht quantifiziert werden kann. Es wurde ein Plasmid konstruiert,
um eine höhere
Expression von CAT aus APP zu erreichen (8),
und APP-Stämmen
angeboten, welche diese Plasmidresistenz gegen Chloramphenicol trugen.
-
Die
Entwicklung von APP als Bakterienvektor stellt ein Mittel bereit,
um kommerziell signifikante Moleküle in den Respirationstrakt
von Schweinen abzugeben. Zu diesen Molekülen gehören Zytokine, um das Immunsystem
zu regulieren, und protektive Antigene von anderen krankheitserregenden
Bakterien, wodurch Möglichkeiten
geschaffen werden, multivalente Impfstoffe herzustellen. Solche
Impfstoffe könnten
nach einer einzigen Impfung Schutz vor mehr als einer Krankheit
bieten.
-
Tabelle 6. Lungenläsionen in
Schweinen bei der Autopsie
-
Schweine
wurden zweimal in Abständen
von zwei Wochen mit APP HS93C–Ar geimpft,
und erhielten anschließend
zwei Wochen nach der letzten Impfung eine Serovar-übergreifende
Challenge-Infektion mit APP HS25. Fünf Tage nach der Challenge-Infektion
wurden Post- Mortem-Untersuchungen
durchgeführt
und die Lungenläsionen
notiert.
-
In Schweinen
bei der Autopsie vorhandene Lungenläsionen
-
Gruppe
1 Nicht geimpft und ohne Challenge-Infektion
- 1.
Keine Läsionen
zu erkennen
- 2. Keine Läsionen
zu erkennen
- 3. Keine Läsionen
zu erkennen
-
Gruppe
2 Geimpft und ohne Challenge-Infektion
- 1. Keine
Läsionen
zu erkennen
- 2. Keine Läsionen
zu erkennen
- 3. Keine Läsionen
zu erkennen
-
Gruppe
3 Nicht geimpft und mit Challenge-Infektion
- 1.
Keine Läsionen
zu erkennen
- 2. Keine Läsionen
zu erkennen
- 3. Keine Läsionen
zu erkennen
- 4. Keine Läsionen
zu erkennen
- 5. Keine Läsionen
zu erkennen
- 6. Kleine Adhäsion
auf der linken Lungenseite, erschien älter zu sein als 5 Tage, abgegrenzt
(es wurden Bakterien isoliert und festgestellt, dass es keine APP
waren)
-
Gruppe
4 Ungeimpft und mit Challenge-Infektion
- 1.
Adhäsion
am rechten Zwerchfelllappen, Läsion
mit 5 cm Durchmesser am linken Herzlappen.
- 2. Zwei Adhäsionen
am rechten Zwerchfelllappen, lokalisierte Läsion (Abszess) am rechten Zwerchfelllappen,
Läsion
am rechten ventralen Zwerchfelllappen, Adhäsion am linken dorsalen Zwerchfelllappen,
zwei Läsionen
(0,5 cm) am dorsalen Herzlappen, Läsionen am mittleren linken
Zwerchfelllappen.
- 3. Kleine Adhäsion
am rechten hinteren Apikallappen, Pleuritis im gesamten linken dorsalen
Zwerchfelllappen.
- 4. Kleine Adhäsion
am rechten Apikallappen, Läsion
(4 cm) am rechten dorsalen Zwerchfelllappen, Abszess (1 cm) am rechten
Herzlappen, Läsionen
(7 × 1
cm) auf der gesamten linken Lungenseite.
- 5. Exsudative Pleuritis und Entzündung des Herzbeutels (diffuse
Perikarditis), Adhäsion
am rechten Zwerchfelllappen.
- 6. Adhäsive
Pleuritis am rechten Zwerchfelllappen, Läsion (1 cm) am linken ventralen
Zwerchfelllappen.
-
Schließlich wird
darauf hingewiesen, dass verschiedene Änderungen, Modifikationen und/oder
Ergänzungen
in die Konstruktionen und Anordnungen der zuvor beschriebenen Inhalte
eingeführt
werden können, ohne
vom Geist oder Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.
-
BEZUGSVERWEISE
-
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