DE68928933T2

DE68928933T2 - Faser-hemagglutinin von b. pertussis

Info

Publication number: DE68928933T2
Application number: DE68928933T
Authority: DE
Inventors: Mario Domenighini; Stanley Falkow; Rino Rappuoli; David Relman
Original assignee: Sclavo SpA; Leland Stanford Junior University
Current assignee: Sclavo SpA; Leland Stanford Junior University
Priority date: 1988-10-27
Filing date: 1989-10-20
Publication date: 1999-08-26
Anticipated expiration: 2009-10-21
Also published as: ATE176913T1; EP0439542A4; JPH04501506A; WO1990004641A1; AU643190B2; DK76191D0; EP0439542A1; DE68928933D1; CA1341123C; EP0439542B1; FI911973A0; AU4515589A; DK76191A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das für filamentöses Hämagglutinin von B.pertussis kodierende Gen, das Proteinprodukt und die Verwendung des Gens und des Produkts zur Entwicklung von Impfstoffen durch genetisches Engineering.

HINTERGRUND

Bordetella pertussis ist ein kleiner gram-negativer Bacillus, der nur beim Menschen vorkommt. Es handelt sich dabei um den ätiologischen Erreger der Kinderkrankheit Keuchhusten, die auch als Pertussis bezeichnet wird. Bei anfälligen Individuen kann die Krankheit eine schwere paroxysmale Phase erreichen. Es tritt starker und krampfhafter Husten auf, wobei der Patient Folgeverletzung durch die die Hustenkrämpfe begleitende(n) Hypoxie und Krämpfe ausgesetzt ist. Es kann zu Sekundärinfektionen, Hirnschädigung und zum Tod kommen. Die diskrete Molekülgruppe, die mit den schweren Auswirkungen des paroxysmalen Stadiums der Krankheit verbunden ist, ist Pertussis-Toxin (PTX). PTX ist unter verschiedensten Namen bekannt, wie etwa Lymphocytose-Förderungsfaktor, Histamin-Sensitivierungsfaktor und Insel-Aktivierungsprotein.
Ein weiteres Protein, filamentöses Hämagglutinin (FHA) ist ein an der Oberfläche gebundenes Protein, das unter der KontroIle eines trans-agierenden vir-Locus von B.pertussis exprimiert wird. FHA ist zwar nur spärlich charakterisiert, aber es wird angenommen, daß es im Verlauf der Infektion des Menschen als Hauptadhäsions- und immundominantes Antigen fungiert. Dieses Protein erscheint bei Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese als heterogene Sammlung von Polypeptidspezies in einem Bereich von etwa 60 bis 220 kDa (Kilodalton). Es ist wahrscheinlich, daß die meisten der kleineren, normalerweise zu beobachtenden Protein-Gelbanden Abbauprodukte einer vorherrschenden Spezies mit 220 kDa darsteIlen. Elektronenmikroskopie dieses Proteins zeigt eine filamentöse Struktur mit den Abmessungen 2 nm · 40-100 nm.
Es wurde gemutmaßt, daß FHA einer der wichtigsten der die bakteriell-eukaryotische Zellhaftungs-Wechselwirkung vermittelnden Faktoren ist. Weiters stimuliert FHA eine Immunreaktion bei Menschen nach klinischer Erkrankung und wirkt als immunprotekti ves Antigen in einem Modellsystem unter Einsatz von Infektion mittels Aerosol von immunisierten Mäusen. Es ist zwar bei aIleinigem Einsatz weniger wirksam als PTX, aber FHA und PTX gemeinsam zeigen synergistische immunprotektive Wirkung.

RELEVANTE LITERATUR

Eine Beschreibung des B.pertussis-Hämagglutinin-Proteins findet sich bei Irons et al., J. Gen. Microbiol. 129, 2769-2778 (1983); Arai und Sato, Biochem. Biophys. Acta 444, 765-782 (1976); sowie Zhang et al., Infect. Immun. 48, 422-427 (1985). Physiologische Eigenschaften werden von Tuomanen und Weiss, J. Infect. Dis. 152, 118-125 (1985); Lenin et al., FEMS Microbiol. Lett. 37, 89-94 (1986); Urisu et al., Infect. Immun. 52, 695-701 (1986); Redd et al., J. Clin. Microbiol. 26, 1373-1377 (1988); Oda et al., J. Infect. Dis. 150, 823-833 (1984); Robinson und Irons, Infect. Immun. 40, 523-528 (1983); Sato und Sato, ibid. 46, 415-421 (1984); und der Ad Hoc-Arbeitsgruppe zur Untersuchung von Pertussis-Impfstoffen, Lancet i 955-960 (1988), beschrieben.
Das Klonieren eines filamentösen Hämagglutinin-Strukturgens oder Fragments davon wird von Brown und Parker, Infect. Immun. 55, 154-161 (1987); Reiser et al., Dev. Biol. Stand. 61, 265-271 (1985); Mattei et al., FEMS Microbiol. Lett. 36, 73-77 (1986); Stibitzet al., J. Bacteriol. 170, 2904-2913 (1988), sowie in der EP-A-0.235.474 (Institut Pasteur) beschrieben.
Brown und Parker offenbaren das Klonieren eines DNA-Fragments von B.pertussis, von dem beschrieben wird, daß es das gesamte fhaB-Gen enthält, das auf einen 6,5 kb-Bereich eines 8,6 kb-Fragments kartiert wurde. Die Expression des Fragments in E.coli ergab Proteine, die von fhaB-spezifischen Antikörpern erkannt werden.
Mattei et al. offenbaren das Klonieren eines DNA-Fragments mit 2,9 kb von B.pertussis, das exprimiert wird, um ein von Anti-FHA-Antikörpern erkanntes Fusionsprotein zu ergeben. Das Fragment wurde teilweise sequenziert.
Stibitz et al. offenbar das Klonieren eines großen DNA-Fragment, daß das vir- und das fhaB-Gen enthält. Das fhaB-Gen wurde auf einen 6 kb-Bereich unmittelbar stromab vom vir-Gen kartiert.
Die EP-A-0.235.474 offenbart das Klonieren eines großen DNA-Fragments von B.pertussis und die Expression eines Fusionsproteins, das von Anti-FHA-Antikörpern erkannt wird. Ebenfalls erörtert wird die mögliche Verwendung solcher Expressionsprodukte in Impfstoffen und die Wirkung von Anti-FHA-Antikörpern zur Vermeidung von B.pertussis-Bindung an FibroblastenzeIlen.
Die chemische Analyse des filamentösen Hämagglutinins wurde von Sato et al., Infect. Immun. 41, 313-320 (1983), berichtet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

DNA-Sequenzen, die für zumindest einen Abschnitt des B.pertussis-fhaB-Gens kodieren, durch genetisches Engineering erzeugte Produkte, die solche Sequenzen enthalten, die Expressionsprodukte solcher Sequenzen, sowie ZeIlen, die solche durch genetisches Engineering hergestellte Sequenzen enthalten, werden zur Verwendung bei der Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Keuchhusten verwendet.

BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen, die mit dem filamentösen Hämagglutinin-Protein von B. pertussis verbunden sind, sowie deren Verwendung zur Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Keuchhusten oder Pertussis.
Gemäß vorliegender Erfindung wird eine Nukleinsäuresequenz mit weniger als 15 kb, die das 10.788 kb-B.pertussis-fhaB-Gen frei vom fhaA-Gen umfaßt, sowie eine Nukleinsäuresequenz mit weniger als 15 kb bereitgestellt, die eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für das B.pertussis-FHA-Protein mit 3.597 Aminosäuren kodiert. Gemäß einem As pekt besteht die Nukleinsäuresequenz aus den Nukleotiden 253 bis 11.040, wie nachstehend dargelegt.
Die Erfindung stellt weiters ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz nach einem der vorherigen Ansprüche bereit, die für einen Abschnitt des FHA-Proteins mit etwa 230 kDa kodiert, wobei der Abschnitt der N-proximale Abschnitt des Proteins ist. Die Erfindung stellt auch ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz gemäß vorliegender Erfindung bereit, das für ein Peptid mit einer Länge von zumindest 12 Aminosäuren kodiert, vorzugsweise ein Fragment mit 100 bp, wobei das Fragment ein Fragment des offenen Leserahmens des FhaB-Gens ist, das für das Peptid kodiert, für das die nachstehend dargelegte Sequenz kodiert, worin die Nukleotide durch ein Motiv gekennzeichnet sind, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
a) Nukleotide, die für die RGD-ZeIlerkennungssteIlen an den Positionen 1097 oder 2599 des FHA-Polypeptids kodieren;
b) Nukleotide, die für die proteolytische RRARR-SteIle an Position 1069 des FHA- Polypeptids kodieren;
c) Nukleotide, die für direkte Wiederholungen kodieren, die sich zwischen den Nukleotiden 1468 und 1746 des FhaB-Gens befinden;
d) Nukleotide, die für das Motiv EARKDE der Positionen 1211 bis 1216 des FHA- Polypeptids kodieren;
e) Nukleotide, die für das Motiv SKQDER an den Positionen 3075 bis 3080 des FHA-Polypeptids kodieren;
f) Nukleotide, die für die (PK)S-Wiederholung kodieren, die an Rest 3477 des FHA-Polypeptids beginnt; und
g) Nukleotide, die für die Sequenz VEVVPRKVET kodieren, die an den Positionen 3319 und 3350 des FHA-Polypeptids beginnt.
Die Erfindung stellt auch isolierte Polypeptidfragmente von FHA bereit, für die der offene Leserahmen dieser Nukleinsäurefragmente kodiert.
Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Polypeptid mit einer Länge von zumindest 12 Aminosäuren bereit, das ein Fragment des B.pertussis-FHA-Proteins mit 3597 Aminosäuren ist und im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz E-A-R-K-D-E zusammen mit ihren benachbarten Sequenzen von bis zu 100 Aminosäuren in beiden Richtungen besteht.
Andere Merkmale der Erfindung sind Expressionskonstrukte, transfomierte prokaryotische ZeIlen sowie die Verwendung solcher ZeIlen zur Herstellung eines Polypeptids, für das, eine Nukleinsäure gemäß vorliegender Erfindung kodiert. Sie stellt auch einen Impfstoff bereit, der ein Polypeptid umfaßt, das von Antikörpern gegen des filamentöse Hämagglutinin von B.pertussis erkannt wird, sowie die Verwendung von Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung in einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose des Menschen- oder Tierkörpers.
Der offene Leserahmen des B. pertussis-fhaB-Gens hat etwa 10 kbp (im spezieIlen etwa 10.788 bp) als die im experimenteIlen Teil dargelegte Sequenz. Er kodiert für ein Protein mit etwa 368 kDa (etwa 3.597 Aminosäuren), das ein N-proximales Fragment mit 230 kDa umfaßt, wobei das N-proximale Fragment an einer argininreichen Peptidsequenz RRARR durch Proteolyse in zwei Polypeptidfragmente mit etwa 98 und 140 kDa geteilt wird, bei denen es sich um das N-terminale bzw. das C-terminale Fragment handelt. Diese Sequenz kann als proteolytische SpaltsteIle dienen. Das Polypeptid ist insgesamt basisch, weist eine relativ hohe Ladungsdichte, einen pK, von 9,65 und eine Nettoladung von + 19 auf. Alanin und Glycin machen etwa 27% aIler Reste aus, während nur 3 stromaufwärts vorhanden sind. Die letzten 350 Aminosäuren steIlen einen stark basischen Bereich dar (Ladung +32; pK, 11,3), der reich an Prolin ist (17%). An Aminosäureposition 1097 (definiert durch den Translationsbeginn bei 253 bp von der linken EcoRI-SteIle) und wiederum an Position 2599 findet sich die Tripeptidsequenz RGD. Diese Sequenz ist als "ZeIlerkennungssteIle" für die Wechselwirkung von Fibronektin und anderen eukaryotischen extrazellularen Matrixproteinen mit bestimmten eukaryotischen, insbesondere Säugetier-, Zellrezeptoren bekannt, und kann auf ähnliche Weise bei der FHA-vermittelten bakterieIlen Haftung fungieren.
Das Gen scheint in Nachbarschaft des vir-Locus positioniert zu sein. In der durch Transkription definierten Richtung liegt ein scheinbares Regulationsgen fhA etwa 2 bis 5 kb stromab von fhaB, gefolgt vom Gen fhaC, von dem ebenfalls angenommen wird, daß es sich um ein Regulationsgen handelt, wieder in Richtung stromab von fhaA. Der Beginn des offenen Leserahmens ("open reading frame," ORF) ist um etwa 430 bp vom ersten der bvg-Gene, bvgA, getrennt. Das Gen beginnt an Position 253 von links an der pDR1- EcoRI-SteIle und endet an Position 11041 mit einem TAG-Codon.
Das fhaB-Gen ist dadurch gekennzeichnet, daß es einen hohen GC-Gehalt aufweist, nämlich etwa 67,5%. Außerdem gibt eine Serie von direkten Tandern-Nukleotid-Wiederholungen des Musters ABABA im Bereich von Nukleotid 1468 bis Nukleotid 1746, wobei das G der im experimenteIlen Teil angeführten Sequenz Nukleotid 1 ist. Eine ungewöhnliche alternierende Wiederholung (PK)5 beginnt an Rest 3477. Die Sequenz VEVVPRKVET an Position 3319 wird an Position 3350 wiederholt. Transkriptionsinitiation scheint 70 bis 75 bp stromauf vom ORF zu erfolgen.
Fragmente des offenen Leserahmens mit zumindest etwa 15 bp, häufiger zumindest etwa 50 bp, und üblicherweise zumindest etwa 100 bp, können auf eine Vielzahl von Arten Verwendung finden. Die Fragmente können für Diagnosezwecke, als Sonden beim Hybridisieren an DNA oder RNA zum Nachweis der Gegenwart von B. pertussis oder dergleichen Verwendung finden. Es können Southern-, Northern-, Dot-Blot oder andere Techniken eingesetzt werden. Die Fragmente können eingesetzt werden, um für Peptide mit zumindest etwa 9 Aminosäuren (27 bp), üblicherweise zumindest etwa 12 Aminosäuren, zu kodieren.
Die Fragmente können auch in Antisense-Richtung eingesetzt werden, um die Menge des Expressionsprodukts des fhaB-Gens zu modulieren, wenn eine solche Modulation von Interesse ist. Daher kann die Infektivität des Organismus moduliert und/oder abgeschwächt werden, indem das Vorhandensein des filamentösen Hämagglutinin-Proteins an der Oberfläche des Organismus reduziert wird.
Fragmente von Interesse des fhaB-Gens sind jene Fragmente, die mit der Expression des Proteins mit 98 kDa und des Proteins mit 140 kDa verbunden sind. Unter Verwendung der Numerierung, wie in der in diese Anmeldung bereitgestellten Sequenz dargelegt, würde das Fragment für das Protein mit 98 kDa zwischen den Nukleotiden 3402 und 3502, üblicherweise zwischen 3451 und 3474, enden. Das Protein mit 140 kDa beginnt in diesem Bereich und endet etwa bei Nukleotid 9624. Als FHA ursprünglich unter Einsatz von Standardtechniken aus flüssigem B.pertussis-Kulturüberstand isoliert und gereinigt wurde, sind bei SDS-PAGE bei den Polypeptidspezies mit 230, 140, 125 und 98 kDa oft 3 bis 4 Banden zu sehen. Mit zunehmender Lagerdauer treten zwei neue Spezies mit 75 und 58 kDa auf, wobei gleichzeitig die 230 kDa-Bande verblaßt und eine Intensivierung der 125 und 98 kDa-Banden erfolgt. Eine identische N-terminale Sequenz wird für die Fragmente mit 140 und 125 kDa beobachtet: A-L-R-Q-D-F-F-T-P-G-S- V-V-V-R-A-Q-G-N. Für dieses Peptid wird beginnend mit Position 1074 unmittelbar von einer vorgeschlagenen proteolytischen SpaltsteIle R-R-A-R-R und an Position 1131 endend kodiert. Ebenfalls von Interesse ist die Wiederholungssequenz, wobei die Sequenz zumindest zwei Wiederholungen, vorzugsweise drei Wiederholungen, aufweisen sollte und das Fragment zumindest etwa 60 Nukleotide, häufiger etwa 100 Nukleotide, gegebenenfalls 278 Nukleotide oder mehr, aufweist, üblicherweise aber etwa 300 Nukleotide des offenen Leserahmens nicht übersteigt, wobei letzterer den gesamten Wiederholungsbereich umfaßt. Die Wiederholungen weisen keine perfekte Homologie auf, zeigen aber einen hohen Grad an Konservierung.
Regionen von Interesse sind jene, die für die Aminosäuresequenzen 1211 bis 1216 (E-A- R-K-D-E), 1876 bis 1881 (R-K-D-E-H-R) und 3075 bis 3080 (S-K-Q-D-E-R) und benachbarte Aminosäuresequenzen kodieren, die sich bis zu 100 Aminosäuren, üblicherweise bis zu 50 Aminosäuren, in beide Richtungen erstrecken, aber insbesondere zumindest 3 Aminosäuren der oben beschriebenen Sequenzen umfassen. DNA-Sequenzen von Interesse können Fragmente von 3490 bis 3590, 3840 bis 3940, 5840 bis 5940, 9440 bis 9540 und Fragmente davon mit zumindest 15 bp, häufiger zumindest 25 bp, umfassen. Das Fragment von etwa 5625 bis 5780 scheint keine Merkmale von Interesse aufzuweisen und kann ausgeschlossen werden, wenn es nicht an eines der oben angeführten Fragmente gebunden ist.
Gegen das B.pertussis-FHA-Protein hergestelltes Antiserum ist mit der Polypeptidspezies von B.parapertussis und B.bronchispetica kreuzreaktiv. Antiseren, die sich an die Expressionsprodukte der Bereiche 2836-3786 nt, 5212-7294 nt und 6393-8080 nt bindet, banden sich an Peptide von Parapertussis, während sich nur die Antiseren der ersten beiden an Brochispetica-Peptide band.
Das vorliegende Protein oder ein beliebiger Abschnitt davon kann in jedem herkömmlichen, vorzugsweise einem prokaryotischen, Wirt hergestellt werden. Durch Transformation eines geeigneten Wirts mit dem Expressionskonstrukt exprimiert der Wirt das Polypeptid von Interesse, das dann isoliert werden kann, oder gegebenenfalls kann der Wirt, der das erfindungsgemäße Protein oder einen Abschnitt davon enthält, isoliert und als Impfstoff verwendet werden.
Das Expressionskonstrukt oder die Kassette verwendet einen Transkriptionsinitiationsbereich, das Strukturgen für das zu exprimierende Polypeptid und einen Transkriptionsterminationsbereich. Der Transkriptionsinitiationsbereich kann nur die RNA-Polymerase- BindungssteIle enthalten, oder auch einen Verstärker oder Operator, um für erhöhte Expression des erfindungsgemäßen Proteins oder eines Abschnitts davon, oder die induzierbare Expression des erfindungsgemäßen Proteins oder Abschnitts davon zu sorgen.
Es ist eine große Anzahl von Transkriptionsinitationsbereichen bekannt, die in einem oder mehreren prokaryotischen Wirten aktiv sind, wie die linken oder rechten λ-Promotoren, der lac-Promotor, der trp-Promotor, der tac-Promotor, omp-Promotor, Metallothio nein-Promotor usw. Der natürliche Promotor kann ebenfalls Verwendung finden. Der jeweilige Promotor wird so gewählt, daß gemäß der Selektion der Wirtszeli-Linie für effiziente Expression gesorgt wird.
Größtenteils werden prokaryotische Wirtszell-Linien verwendet, um für die effiziente Expression des filamentösen Hämagglutinins oder Abschnitts davon, Integrität des Expressionsprodukts, und in manchen Situation die Fähigkeit zur Verwendung des Wirts ohne Isolierung des Proteins zu sorgen, wobei der transformierte Wirt als Impfstoff verwendet wird. Es können verschiedene Organismen verwendet werden, die für eine Immunreaktion sorgen können, nicht nur auf die erfindungsgemäßen Proteine oder Abschnitte davon, sondern auch andere Pathogene, so daß der Impfstoff zur Immunprotektion, nicht nur gegen den B.pertussis-Organismus, sondern auch gegen durch andere Pathogene verursachte Erkrankungen, führt.
Zu den verschiedenen Wirtsorganismen, die verwendet werden können, zählen verschiedene gram-negative Organismen, wie z. B. E.coli, Salmonella, Yersinia, Pseudomonas, Bordetella, wie die Spezies Avium, Bronchiseptica, Parapertussis und Pertussis, wobei die letzten beiden besonders bevorzugt sind.
Eine zuvor erwähnte Sequenzanalyse des erfindungsgemäßen Proteins weist auf einen Guanin-plus-Cytosin-Gehalt auf, der wesentlich höher als jener des traditioneIlen E.coli- Klonierungswirts (etwa 50%) ist. Daher weist der Wirt wünschenswerterweise größtenteils einen hohen Guanin-plus-Cytosin-Gehalt in seinem Genom auf, vorzugsweise zumindest 60%, mehr bevorzugt 65%. Zur Verwendung in Organismen, denen eine Präferenz für GC fehlt, können jedoch synthetische Abschnitte verwendet werden, um den Anteil von Guanin und Cystosin zu verringern.
Zur Verwendung in den verschiedenen Wirtsspezies sind verschiedene Replikationssysteme verfügbar. Größtenteils umfassen die Vektoren nicht nur ein funktioneIles Replikationssystem, sondern eine Markierung zur Selektion von Transormanten, die das erfin dungsgemäße Strukturgen oder einen Abschnitt davon umfassen. Es ist zwar üblicherweise wünschenswert, entweder ein Plasmid oder ein Virus einzusetzen, das in einem Vektor ohne Lysogenie stabil gehalten wird, um die Effizienz der Expression zu erhöhen, indem ein Mehrfachkopie-Replikationssystem vorliegt, das im Wirt stabil ist, aber das ist nicht notwendig. So kann mit blanker DNA transformiert werden, welche die Expressionskassette in Kombination mit einer Markierung zur Selektion umfaßt, wobei die Markierung an die Expressionskassette angefügt oder im Transformationsmedium unabhängig vorhanden ist. In manchen Situationen wird ein Vektor eingesetzt, der kein stabiles Replikationssystem für den Expressionswirt aufweist. Auf diese Weise kann Selektion durchgeführt werden, um zu gewährleisten, daß Integration stattgefunden hat, indem eine Selektion bezüglich jener ZeIlen erfogt, welche die Markierung enthalten.
Es kann eine große Vielzahl von Markierungen verwendet werden, zu denen Antibiotikaresistenz, Resistenz gegen SchwermetaIle, das Verleihen von Prototrophie an einen auxotrophen Wirt, oder dergleichen gehören. Die jeweilige Wahl der Markierung ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, sondern wird gemäß Selektionseffizienz und Effizienz bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins oder Abschnitts davon ausgewählt.
In Abhängigkeit von der Art der Transformation sowie vom Wirt werden verschiedene andere funktioneIle Fähigkeiten im Vektor bereitgestellt. Beispielsweise kann Transferfähigkeit bereitgestellt werden, welche die Konjugation in Verbindung mit einem Helferplasmid ermöglicht, wobei der Vektor, sobald er in den Rezipientenwirt transferiert ist, nicht mehr zu anderen Wirten transferiert werden kann. Beispielsweise kann die rlx- Sequenz eingesetzt werden, insbesondere von de P-I-Inkompatibilitätsgruppe. Außerdem kann die cos-SteIle von λ-Bakteriophagen eingesetzt werden. Andere Markierungen von Interesse sind gegebenenfalls ein Gen, das einen antibiotikaresistenten Stamm empfindlich macht.
Der Terminationsbereich ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, und es kann jeder geeignete Terminationsbereich verwendet werden. Es kann der native Terminationsbereich verwendet werden, oder ein Terminationsbereich, der normalerweise mit dem Transkriptionsinitiationsbereich eines anderen Bereichs verbunden ist. Es ist eine Tatsache, daß viele Transkriptionsterminationsbereiche eingesetzt worden sind und vorteilhaft verwendet werden können.
Der Wirt kann auf jede geeignete Art transformiert werden. Bei Verwendung blanker DNA kann zur Transformation kalziumphosphatgefällte DNA eingesetzt werden. Alternativ dazu kann Konjugation unter Verwendung eines Helferplasmids eingesetzt werden, wobei ein Transfergen in einem Vektor bereitgestellt wird. In manchen FäIlen kann es wünschenswert sein, einen Bakteriophagenvektor einzusetzen, wobei die WirtszeIle transduziert oder transfiziert wird. Die Technik zum Einbringen der Expressionskassette, die das erfindungsgemäße Gen oder einen Abschnitt davon umfaßt, ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, und verschiedene alternative Vorschriften sind in der Literatur umfassend anhand von Beispielen dokumentiert.
Das erfindungsgemäße Gen kann auch verschiedenen Läsionen oder Mutationen unterliegen. Beispielsweise kann die Sequenz RRARR substituiert, deletiert oder modifiziert werden, um die Peptidase-SpaltsteIle zu entfernen. So würde ds Protein im wesentlichen intakt gehalten werden, wobei die beiden potentieIlen Fragmente miteinander fusioniert sind. Dieses Protein könnte eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten finden. Andere Mutationen sind das Entfernen des stromauf gelegenen Abschnitts des Gens, so daß nur die Sequenz belassen wird, die sich stromab von der RRARR-Sequenz befindet, wobei ein Initiationscodon an der entsprechenden SteIle eingebracht werden kann. Außerdem kann die Mutagenese eines RGD-Bereichs veränderte Wechselwirkungen mit eukaryotischen ZielzeIlen und möglicherweise eine veränderte Immunreaktion des Wirts verursachen, was sich beides für die Krankheitstherapie oder -prophylaxe als nützlich erweisen kann.
Mutation kann auf eine Vielzahl von Arten unter Einsatz von Mutagenese in vitro, Primer-Wiederherstellung, Polymerase-Kettenreaktion, RestriktionssteIlen-Deletionen, Insertionen oder dergleichen erzielt werden. Die jeweilige Art, wie das erfindungsgemäße Gen modifiziert wird, ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, und es kann jede herkömmliche Technik eingesetzt werden, die für die gewünschten Substitutionen, Deletionen oder Insertionen sorgt.
Das erfindungsgemäße Gen kann durch EcoRI-Spaltung von Plasmid pUW21-26 erhalten werden. Das resultierende EcoRI-Fragment mit 10 kb enthält den offenen Leserahmen mit 9375 bp. Dieses Fragment kann an seinem 5'-Terminus auf eine Vielzahl von Arten manipuliert werden. Durch Einsatz von Bal 31-Spaltung kann die Sequenz resektiert werden, um den gesamten oder einen Abschnitt des nicht-kodierenden Bereichs 5' vom Initationscodon zu entfernen. Alternativ dazu kann entweder stromauf oder stromab vom Initationscodon restringiert werden, wobei die durch Restriktion stromab vom Initiationscodon entfernten Nukleotide durch einen geeigneten Adapter ersetzt werden können. Auf diese Weise kann die erfindungsgemäße Sequenz in einen Polylinker stromab von einem Transkriptionsinitationsregulierungsbereich insertiert werden und unter der Transkriptionsinitationsregulierung eines solchen Bereichs stehen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, sowohl Nukleotide als auch Proteine, können sowohl in der Diagnose als auch in der Therapie zum Einsatz kommen. Bei Verwendung zur Diagnose können die Sequenzen, wie bereits angegeben, dazu verwendet werden, die Gegenwart von Nukleinsäuresequenzen nachzuweisen, die mit erfindungsgemäßen Sequenzen duplizieren, was ein Indikator für die Gegenwart von B.pertussis ist. Alternativ dazu kann das Protein oder ein Abschnitt davon in Diagnoseassays als markiertes oder unmarkiertes Reagens zur Detektion von Antikörpern gegen filamentöses Hämagglutinin in einer Blutprobe oder die Gegenwart von filamentösem Hämagglutinin-Protein meiner Blut- oder Gewebeprobe verwendet werden.
Intaktes Protein oder ein Abschnitt davon kann verwendet werden, um Antikörper herzusteIlen, die bei der Diagnose, Prophylaxe oder Therapie verwendet werden. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und sind vorzugsweise monoklonal. Wünschenswerterweise werden neutralisierende Antikörper erhalten. Antikörper können Mäuse-Antikörper, menschliche Antikörper, heterozygote Antikörper, z. B. variabler Mäuse-Bereich und konstanter Human-Bereich oder dergleichen sein. Von besonderem Interesse sind jene konstanten Bereiche, die sich an Komplement binden, wie IgM- und IgG-Isotypen. Die Antikörper können zur passiven Immunisierung oder zur Behandlung auf herkömmliche Weise eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen finden auch als Impfstoffe, als Protein aIlein oder in Kombination mit anderen Proteinen, z. B. azellulären Zusammensetzungen, als zellulare Zusammensetzungen in einem Pertussis- oder Nicht-Pertussis-Wirt, in gereinigter oder halbgereinigter Form oder dergleichen Verwendung. Wünschenswerterweise werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Verbindung mit einem modifizierten Pertussis-Toxin verwendet, wobei das Toxin keine ADP-Ribosyltransferase-Aktivität, insbesondere Subeinheit A, mehr aufweist. Das kann unter Verwendung von ptx3201 erreicht werden, wie von Black et al., Science 240, 656-659 (1980), beschrieben. Durch Einfügen des erfindungsgemäßen Gens unter der Transkriptionsinitiations-RegulierungskontroIle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren. Promotors, der durch die normale Pertussis-Transkriptionsregulierung des filamentösen Hämagglutiningens nicht reguliert wird, kann für verstärktes Vorliegen des erfindungsgemäßen Proteins an der Oberfläche der B.pertussis-ZeIle gesorgt werden. Auf diese Weise kann als Reaktion auf das Impfen lebender oder toter Organismen eine verstärkte Immunreaktion erzielt werden.
Aufgrund der verschiedenen Arten, wie die erfindungsgemäße Zusammensetzung verabreicht weden kann, variiert die verabreichte Menge stark. Außerdem variiert die Menge des Impfstoffs je nach Art der Verabreichung, der Häufigkeit der Verabreichung, des Vorhandenseins oder Fehlens von Antigen, der Art des Antigens oder dergleichen.
Die Verabreichung kann oral, peritoneal, subkutan, intravaskulär oder auf ähnliche Weise erfolgen. Üblicherweise wird ein inerter Träger verwendet, wie z. B. Zucker, Wasser, wäßriges Ethanol, phosphatgepufferte Salzlösung, Salzlösung oder dergleichen. Zu den Adjuvantien zählen Aluminiumhydroxid, Pflanzenöle, bakterieIle Toxine usw. Die Menge des Wirkstoffs liegt üblicherweise im Bereich von etwa 25 bis 75 pg/kg für eine Einzeldosis beim Menschen. Pertussis-Impfstoffe wurden bereits eingesetzt, und die frühere Verwendung kann als Anleitung für die eingesetzte Dosierung herabgezogen werden. Siehe beispielsweise "Developments in Biological Standarization", s. o.

EXPERIMENTELLER TEIL

Materialien und Verfahren

Bakterien-Stämme und -Plasmide. B.pertussis-Stamm BP536 ist eine spontan auftretende streptomycinresistente Mutante des parenteralen Stamms BP338 der virulenten Phase (I). BP537 ist eine avirulente Phasen-Variante von BP536. Die Isolierung der Tn5-Mutante BP353 wurde bereits beschrieben: Weiss et al., Infect. Immun. 42, 33-41 (1983); die Transposon-InsertionssteIle wurde in jüngerer Vergangenheit kartiert (Stibitzet al., 1988, s. o.), BP338 Tn5-25 trägt eine Tn5-Insertionsmutation innerhalb des 2,4 kb-BamHI-Segments von fhaB (Stibitz et al. 1988, s. o.). BP-TOX6 (erhätlich von R. Rappuoli) ist ein Derivat von BP536 mit einer Deletion des Pertussis-Toxin-Operons und der Substitution einer Kanamycinresistenz-Kassette an dieser SteIle. BP-B52 (erhältlich von F. Mooi) ist ein BP536-Derivat, das Insertionsmutationen trägt, die das fim2- und das fim3-Gen unabhängig voneinander inaktiviert. Die E.coli-Stämme JM101 und SM10 wurden andernorts beschrieben (Messing, Recomb. DNA Tech. Bull. 2, 43-48 (1979); Simon et al., Bio /Technology 1, 784-791 (1983)). Cosmid pUW21-26 ist ein Derivat von pHC79 (Hahn und Collins, Gene 11, 291-298 (1980)) mit einem Insert mit etwa 45 kb, das die klonierten vir- und fha-Loci von BP338 enthält (Stibitz, 1988, s. o.). Die Konstruktion von Plasmidvektor pRTP1 wurde bereits beschrieben (Stibitz et al., Gene 50, 133-140 (1986)).

Klonieren von fhaB und Konstruktion von fhaB-Deletionsmutanten

Das filamentöse Hämagglutinin-(FHA-)Strukturgen, fhaB, wurde auf ein EcoRI-Fragment mit 10 kb von Cosmid pUW21-26 in den Vektor pRTP1 kloniert, wodurch das rekombinante Plasmid pDR1 erzeugt wird. Eine partieIle Deletion von fhaB im Rahmen wurde durch Religieren eines Pools von BamHI-Partialdigesten von pDR1 konstruiert. Die Plasmide wurden auf den Verlust eines inneren BamHI-Fragments gescreent. Das resultierende Plasmid wurde als pDR101 bezeichnet.

BakterieIle Konjugationen und AIlel-Austausch

Die. Technik für den konjugalen Transfer von pRTp1-Derivaten von E.coli zu B.pertussis wurde bereits beschrieben (Stibitz et al., 1986, s. o.). Die teilgelöschte Kopie von fhaB wurde in zwei Schritten gegen die Wildform-AIlele in B.pertussis BP536 ausgetauscht. Zunächst wurde der E.coli-Spender, SM10 (pDR101), mit einem B.pertussis-Rezipienten, BP536 Tn5-25, gepaart, der eine selektierbare Markierung innerhalb des zu löschenden fhaB-Fragments trägt. SmR Apo-Exkonjuganten wurden dann auf Medium plattiert, das nur SM enthält, und auf den Verlust von Km-Resistenz gescreent, was auf ein zweites Kreuzungsereignis und den Erwerb der AIlele-Mutante hinweist.

DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse

Das EcoRI-Fragment mit 10 kb, das fhaB enthält, wurde als drei getrennte BamHI-Fragmente sowie statistische 1-3 kb-Sau3A-Fragmente in M13mp18 und M13mp19 (Yanisch- Perron et al., Gene 33, 103-119 (1985)), pEMBL18 und -19 (Dente et al., Nucleic Acids Res. 11, 1645-1655 (1983)) oder Bluescript-Vektoren (Stratagene, San Diego, CA, USA) subkloniert. DNA-Inserts wurden nach dem Didesoxykettenterminationsverfahren sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463-5467) wobei entweder Klenow-Fragment oder Sequenase verwendet wurden (U. S. Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio, USA). Synthetische Oligonukleotidprimer wurden konstruiert, um die Sequenzablesung über große klonierte Inserts auszudehnen. Das Zusammenstellen der Nukleotidsequenz erfolgte unter Verwendung des Software-Pakets der University of Wisconsin Genetics Computer Group (Madison, WI, USA). Weitere Analyse der ver vollständigten Nukleotid- und vorhergesagten Peptidsequenzen wurde durchgeführt, wobei sowohl dieses Paket als auch PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, CA, USA) eingesetzt wurden.

Hämagglutinierung

Die Fähigkeit von B.pertussis-Stämmen, Schaf-Erythrocyten zu agglutinieren, wurde in konischen Spitzboden-Näpfen von Polystyrol-Mikrotiterplatten (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA, USA) einem Assay unterzogen. Die Stämme wurden zwei bis drei Tage lang auf Bordet-Gengou-Platten gezüchtet, zweimal in phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und auf eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 10 resuspendiert (1,7 · 10¹&sup0; ZeIlen/ml). Der erste Napf einer Mikrotiterplatte erhielt 100 ul dieser Zellsuspension, woraufhin die Bakterien elfmal auf das Doppelte reihenverdünnt wurden. Schaf-Erythrocyten wurden jeden Napf als 50 ul einer 0,5%-igen mit PBS gewaschenen Suspension zugegeben. Die Platten wurden bei Raumtemperatur drei bis vier Stunden lang stehengelassen, währenddessen nicht-agglutinierte Erythrozyten die Napfböden hinunterglitten und ein dunkles PeIlet bildeten. Hämagglutinierende (HA-) Aktivität wurde als Kehrwert der höchsten Verdünnung ohne nennenswerte PeIletbildung ausgedrückt.

Western-Immunblots

Polyacrylamidgel-Elektrophorese erfolgte in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat mit einem 10%-igen Trenngel und 20 ul gekochter (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 10) B.pertussis-Zellsuspension mit Probenpuffer. Der Transfer von Protein auf Nitrozellulosemembran erfolgte nach dem Verfahren von Towbin et al., Proc. Nail. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979). Nicht-spezifische Antikörperbindung an die Membran wurde durch Vorinkubation mit einer Lösung von PBS und 1%-iger fettfreier Trockenmilch blockiert. Die immunologische Detektion von FHA wurde unter Verwendung einer 1 : 1.000 Verdünnung eines Gemisches aus (1-54, 1-199, 31E2, 22F10 und 68A6) monoklonalen Anti-FHA-Antikörpern (erhalten von F. Mooi) durchgeführt, gefolgt von Inkubation mit einer 1 : 250 Verdünnung von an Meerrettichperoxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Mäuse-Antiserum. HRP- Aktivität wurde unter Verwendung eines Tetramethylbenzidin enthaltenden Reaktions gemisches detektiert. Die Produktion von fim2 und fim3 wurde unter Einsatz der gleichen Technik und monoklonaler Antikörper (21E7 und 8E5) detektiert, die für diese beiden Proteine spezifisch sind (erhalten von F. Mooi).

Southern-Hybridisierung

Chromosomale B.pertussis-DNA wurde isoliert, mit Restrihtionsendonuklease gespalten und durch Agarosegel-Elektrophorese nach Standardtechniken aufgetrennt (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA). Transfer von Fragmenten auf Nitrozellulose erfolgte nach dem Verfahren von Smith und Summers (Anal. Biochem. 109, 123-129 (1980)). Die Hybridisierung mit Sonde erfolgte bei 37ºC, mit 50%-igem Formamid und 5 · SSC. Die Membranen wurden zweimal mit 2 · SSC bei 25ºC, zweimal mit 0,1 · SSC bei 25ºC und dann zweimal mit 0,1 · SSC bei 65ºC gewaschen.

BakterieIle Haftung in vitro

B.pertussis-Stämme wurden zwei Tage lang auf Platten gezüchtet und dann zweimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen: 20 ul Bakterien-Suspension (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 10) wurde Gewebekulturplatten-Näpfen zugegeben, die 200 ul MEM und ein Deckplättchen enthielten, worauf etwa 5 · 10&sup4; China-Hamster-EierstockzeIlen geimpft worden waren, und über Nacht vermehren gelassen. Nach Inkubieren bei 37ºC, 5% CO&sub2; für 4 Stunden wurde jeder Napf heftig dreimal mit PBS gewaschen. Jegliche verbleibende Bakterien und CHO-ZeIlen wurden mit Methanol fixiert und dann mit Giemsa gefärbt. AIle Bakterien-Stämme wurden in jeweils zweifacher Ausführung untersucht, und aIle Versuche zumindest zweimal wiederholt. Bakterien, die an einer einzlnen CHO-ZeIle anhafteten, wurden visuell gezählt und der Mittelwert zusammen mit der Standardabweichung für jeden Stamm bestimmt. Zugehörige 95%-Vertrauensbereiche wurden auf Basis von Zentralgrenzen-Theorem-Annäherungen und Bonferoni-Verfahren computerberechnet.

Ergebnisse

Identifizierung und Klonierung des FHA-Strukturgens

Frühere Arbeiten hatten zum Isolieren eines Cosmidklons, pUW21-26, geführt, der sowohl mit vir- als auch mit fha-DNA-Sonden hybridisierte (Stibitz et al. 1988, s. o.). Die Analyse von Tn5-Insertionsmutationen innerhalb dieses Cosmids unter Verwendung von FHA-Kolonie- und Western-Immunblots hatte darauf hingewiesen, daß sich das FHA- Strukturgen, fhaB, auf einem EcoRI-Fragment mit 10 kb unmittelbar rechts vom vir-Locus befand. Weiters wurde angenommen, daß die fha-Transkription nahe der linken EcoRI- SteIle beginnt und von links nach rechts geht, auf Basis der Korrelation der Größe abgestumpfter FHA-Produkte mit der Position der entsprechenden Tn5-InsertionssteIle.
Deletion des inneren 2,4 kb-BamHI-Fragments von fhaB erfolgte wie oben beschrieben, und die Mutation wurde zum B.pertussis-Chromosom zurückgeführt, was Stamm BP101 ergab. Die Struktur des resultierenden fhaB-Mutantenlocus in diesem Stamm wurde durch Southern-Blot-Analyse bestätigt. Das größte von BP101 produzierte FHA-kreuzreaktive Polypeptid mißt etwa 150 kDa, wie durch Western-Blot-Technik bestimmt. Dieses abgestumpfte FHA-Produkt weist keine Hämagglutinierungsaktivität auf.
Diese Daten bestätigten, daß das Struktur-Gen für FHA auf dem EcoRI-Insert mit 10 kb von pDR1 enthalten sein muß. Dieses Fragment wurde daher für einstrangige Didesoxy- DNA-Sequenzierung subkloniert.

Konstruktion von fhaB-Fusionsproteinen

Sieben Teilmengen des fhaB-ORF wurden jeweils in den Expressionsvektor pEX34 kloniert. Das Ergebnis war in jedem Fall eine translationale Fusion mit den ersten 98 Aminosäuren der Phagen-MS2-RNA-Polymerase. Fusionsproteine wurden in einem E.coli- Wirt exprimiert und dann unter Einsatz präparativer SDS-PAGE gereinigt. Ein Grund für die Konstruktion dieser Fusionsproteine bestand darin, das Fehlen eines Translations- Stopcodons in verschiedenen Bereichen des ORF zu bestätigen. Dieses Ziel wurde durch Vergleich der gemessen Molekulargewichte des Fusionsproteins mit den von translationalem Durchlesen der gesamten klonierten fhaB-Inserts erwarteten angestrebt. TabeIle 1 führt die Fusionsproteine mit den Nukleotidkoordinaten der jeweiligen fhaB- Inserts an: diese Daten bestätigen das Fehlen eines Stopcodons in aIlen diesen fhaB- Fragmenten. TabeIle 1

Western-Immunblot-Analyse unter Einsatz von Fusionsprotein-Antiseren

Antiseren für jedes der sieben Fusionsproteine wurden durch intraperitoneale Immunisierung von Mäusen erzeugt und für zwei Zwecke verwendet: um jede der FHA-SDS- PAGE-Banden mit einem Bereich des fhaB-ORF zu korrelieren und um zu bestimmen, welche Abschnitte des durch ORF kodierten Polypeptids in ganzen Bordetella sp.-Extrakten vorhanden sind. TabeIle 2 zeigt die Ergebnisse von Western-Immunblots unter Verwendung jedes der sieben Fusionsprotein-Antiseren und eines FHA-Protein-Gelmusters.
Die Kombination dieser Daten mit den Ergebnissen N-terminaler Aminosäure-Sequenzierung weist auf einen Ursprung für die verschiedenen FHA-Polypeptidspezies hin. Die Stimulierung einer polyklonalen Reaktion bei Mäusen durch jedes der fhaB-Fusionsproteine spricht auch dafür, daß FHA zahlreiche immunogene Domänen enthält. TabeIle 2

Nukleotidsequenz des FHA-Strukturgens

Die oben beschriebene Sequenzierungsstrategie ergab eine 10.036 bp lange Nukleotidsequenz für das EcoRI-Fragment. Computeranalyse identifizierte einen ORF mit einer Länge von 1078 bp, beginnend an einem ATG-Translations-Startcodon 253 bp von der EcoRI-SteIle links. Zwei andere ATG-Codons im Rahmen befinden sich 45 und 174 bp nach dem Beginn des ORF; etwa an der Position des dritten ATG-Codons beginnt der Einsatz von Codons, die von B.pertussis stark bevorzugt werden (definiert durch B.pertussis-Pertussis-Toxin-Operoncodon-Einsatz und das UWGCG-Codonpräferenz-Programm; Gribskov et al., Nucleic Acids Res. 12, 539-549 (1984)). Der ORF und der bevorzugte Codoneinsatz enden am TAG-Stopcodon 11.041 bp von der EcoRI-SteIle links. Dieser ORF umfaßt das FHA-Strukturgen fhaB; die Sequenz des ORF ist nachstehend angegeben.
GAATTCCTGCGCTGGCACCCGCGGCGGGCCGGGGAGCGGGTTGTCGGCGCA 51
CGCCTATACGTGCCGGACAGGGTTTGATGGTTTGACTAAGAAATTTCCTAC 102
AAGTCTTGTATAAATATCCATTGATGGACGGGATCATTACTGACTGACGAA 153
GTGCTGAGGTTTATCCAGACTATGGCACTGGATTTCAAAACCTAAAACGAG 204
CAGGCCGATAACGGATTCTGCCGATTACTTCACTTCGCTGGTCGGAATATG 255
Met
AACACGAACCTGTACAGGCTGGTCTTCAGCCATGTTCGCGGCATGCTTGTT 306
AsnThrAsnLeuTyrArgLeuValPheSerHisValArgGlyMetLeuVal
CCCGTGAGCGAGCATTGCACCGTCGGAAACACCTTCTGTGGGCGCACGCGT 357
ProValSerGluHisCysThzValGlyAsnThrPheCysGlyArgThrArg
GGTCAAGCGCGAAGTGGGGCCCGCGCCACGAGCCTGTCCGTAGCGCCCAAT 408
GlyGlnAlaArgSerGlyAlaArgAlaThrSerLeuSerValAlaProAsn
GCGCTGGCCTGGGCCCTGATGTTGGCGTGTACGGGTCTTCCGTTAGTAACG 459
AlaLeuAlaTrpAlaLeuMetLeuMaCysThrGlyLeuProLeuValThr
CACGCCCAGGGCTTGGTTCCTCAGGGGCAGACACAGGTGCTGCAGGGCGGG 510
HisAlaGlnGlyLeuValProGlnGlyGlnThrGlnValLeuGlnGlyGly
AACAAGGTTCCCGTTGTCAATATCGCCGACCCAAATTCCGGCGGCGTCTCG 561
AsnLysVaIProValValAsnIleAlaAspProAsnSerGlyGlyValSer
CACAACAAGTTCCAGCAGTTCAACGTCGCCAACCCTGGCGTGGTCTTCAAC 612
HisAsnLysPheGlnGlnPheAsnValAlaAsnFroGlyValValPheAsn
AACGGCCTGACCGACGGCGTGTCCAGGATCGGCGGGGCGCTGACCAAGAAC 663
AsnGlyLeuThrAspGlyValSerArgl leGlyGlyAlaLeuThrLysAsn
CCCAACCTGACTCGCCAGGCCTCGGCCATTCTTGCCGAAGTCACGGACACT 714
ProAsnLeuThrArgGlnAlaSerAlaIleLeuAlaGluValThrAspThr
TCGCCCAGTCGCCTGGCCGGTACGCTCGAAGTCTATGGCAAGGGCGCCGAC 765
SerProSerArgLeuAlaGlyThrLeuGluValTyrGlyLysGlyAlaAsp
CTCATCATCGCCAACCCCAACGGCATCAGCGTCAACGGCCTGAGCACGCTC 816
LeuIleIleAlaAsnProAsnGlylleSerValAsnGlyLeuSerThrLeu
AACGCGAGCAACCTGACGCTCACGACGGGGCGTCCCAGCGTCAACGGCGGC 867
AsnAlaSerAsnLeuThrLeuThrThrGlyArgProSerValAsnGlyGly
CGCATCGGCCTTGATGTCCAACAGGGCACCGTCACGATCGAACGAGGCGGC 918
ArgIleGlyLeuAspValGlnGlnGlyThrValThrIleGluArgGlyGly
GTCAATGCCACCGGCCTGGGCTATTTCGACGTGGTGGCGCGCCTGGTCAAG 969
ValAsnAlaThrGlyLeuGlyTyrPheAspValValAlaArgLeuValLys
CTGCAGGGTGCCGTGTCGAGCAAGCAGGGCAAGCCCCTGGCCGACATCGCG 1020
LeuGlnGlyAlaValSerSerLysGlnGlyLysProLeuAlaAspIleAla
GTGGTCGCCGGCGCCAACCGGTACGACCACGCAACCCGCCGCGCCACGCCG 1071
ValValAlaGlyAlaAsnArgTyrAspHisAlaThrArgArgAlaThrPro
ATCGCCGCAGGCGCGCGCGGCGCCGCCGCGGGCGCCTACGCGATTGACGGC 1122
IleAlaAlaGlyAlaArgGlyAlaAlaAlaGlyAlaTyrAlaIleAspGly
ACGGCGGCGGGCGCCATGTACGGCAAGCACATCACGCTGGTGTCCAGCGAT 1173
ThrAlaAlaGlyAlaMetTyrGlyLysEisIleThrLeuValSerSerAsp
TCAGGCCTGGGCGTGCGCCAGCTCGGCAGCCTGTCCTCGCCATCGGCCATC 1224
SerGlyLeuGlyValArgGlnLeuGlySerLeuSerSerProSerAlaIle
ACCGTGTCGTCGCAGGGCGAAATCGCGCTGGGCGACGCCACGGTCCAGCGC 1275
ThrValSerSerGlnGlyGluIleAlaLeuGlyAspAlaThrValGlnArg
GGCCCGCTCAGCCTCAAGGGCGCGGGGGTCGTGTCGGCCGGCAAACTGGCC 1326
GlyProLeuSerLeuLysGlyAlaGlyValValSerAlaGlyLysLeuAla
TCCGGGGGGGGGGCGGTGAACGTCGCGGGCGGCGGGGCGGTGAAGATCGCG 1377
SerGlyGlyGlyAlaValAsnValAlaGlyGlyGlyAlaValLysIleAla
TCGGCCAGCAGCGTTGGAAACCTCGCGGTGCAAGGCGGCGGCAAGGTACAG I428
SerAlaSerSerValGlyAsnLeuAlaValGlnGlyGlyGlyLysValGln
GCCACGCTGTTGAATGCCGGGGGGACGTTGCTGGTGTCGGGCCGCCAGGCC 1479
AlaThrLeuLeuAsnAlaGlyGlyThrLeuLeuValSerGlyArgGlnAla
GTCCAGCTTGGCGCGGCGAGCAGCCGTCAGGCGCTGTCCGTGAACGCGGGC I530
ValGlnLeuGlyAlaAlaSerSerArgGlnAlaLeuSerValAsnAlaGly
GGCGCCCTCAAGGCGGACAAGCTGTCGGCGACGCGACGGGTCGACGTGGAT 1581
GlyAlaLeuLysAlaAspLysLeuSerAlaThrArgArgValAspValAsp
GGCAAGCAGGCCGTCGCGCTGGGGTCGGCCAGCAGCAATGCGCTGTCGGTG 1632
GlyLysGlnAlaValAlaLeuGlySerAlaSerSerAsnAlaleuSerVal
CGTGCCGGCGGCGCCCTCAAGGCGGGCAAGCTGTCGGCGACGGGGCGACTG 1683
ArgAlaGlyGlyAlaLeuLysAlaGlyLysLeuSerAlaThrGlyArgLeu
GACGTGGACGGCAAGCAGGCCGTCACGCTGGGTTCGGTTGCGAGCGACGGT 1734
AspvalAspGlyLysGlnAlaValThrLeuGlySerValAlaSerAspGly
GCGCTGTCGGTAAGCGCTGGCGGAAACCTGCGGGCGAACGAATTGGTCTCC 1785
AlaLeuSerValSerAlaGlyGlyAsnLeuArgAlaAsnGluLeuValSer
AGTGCCCAACTTGAGGTGCGTGGGCAGCGGGAGGTCGCGCTGGATGACGCT 1836
SerAlaGlnLeuGluValArgGlyGlnArgGluValAlaLeuAspAspAla
TCGAGCGCACGCGGCATGACCGTGGTTGCCGCAGGAGCGCTGGCGGCCCGC 1887
SerSerAlaArgGlyMetThrValValAlaAlaGlyAlaLeuAlaAlaArg
AACCTGCAGTCCAAGGGCGCCATCGGCGTACAGGGTGGAGAGGCGGTCAGC 1938
AsnLeuGlnSerLysGlyAlaIleGlyValGlnGlyGlyGluAlaValSer
GTGGCCAACGCGAACAGCGACGCGGAATTGCGCGTGCGCGGGCGCGGCCAG 1989
ValAlaAsnAlaAsnSerAspAlaGluLeuArgValArgGlyArgGlyGln
GTGGATCTGCACGACCTGAGCGCAGCGCGCGGCGCGGATATCTCCGGCGAG 2040
ValAspLeuHisAspLeuSerAlaAlaArgGlyAlaAspl ieSerGlyGlu
GGGCGCGTCAATATCGGCCGTGCGCGCAGCGATAGCGATGTGAAGGTCTCC 2091
GlyArgValAsnIleGlyArgAlaArgSerAspSerAspValLysValSer
GCGCACGGCGCCTTGTCGATCGATAGCATGACGGCCCTCGGTGCGATCGGC 2142
AlaHisGlyAlaLeuSerIleAspSerMetThrAlaLeuGlyAlaIleGly
GTCCAGGCAGGCGGCAGCGTGTCGGCCAAGGATATGCGCAGCCGTGGCGCC 2193
ValGlnAlaGlyGlySerValSerAlaLysAspMetArgSerArgGlyAla
GTCACCGTCAGCGGCGGCGGCGCCGTCAACCTGGGCGATGTCCAGTCGGAT 2244
ValThrValSerGlyGlyGlyAlaValAsnLeuGlyAspValGlnSerAsp
GGGCAGGTCCGCGCCACCAGCGCGGGCGCCATGACGGTGCGAGACGTCGCG 2295
GlyGlnValArgAlaThrSerAlaGlyAlaMetThrValArgAspValAla
GCTGCCGCCGACCTTGCGCTGCAGGCGGGCGACGCGTTGCAGGCCGGGTTC 2346
AlaAlaAlaAspLeuAlaLeuGlnAlaGlyAspAlaLeuGlnAlaGlyPhe
CTGAAATCGGCCGGTGCCATGACCGTGAACGGCCGCGATGCCGTGCGACTG 2397
LeuLysSerAlaGlyAlaMetThrValAsnGlyArgAspAlaValArgLeu
GATGGCGCGCACGCGGGCGGGCAATTGCGGGTTTCCAGCGACGGGCAGGCT 2448
AspGlyAlaHisAlaGlyGlyGlnLeuArgValSerSerAspGlyGlnAla
GCGTTGGGCAGTCTCGCGGCCAAGGGCGAGCTGACGGTATCGGCCGCGCGC 2499
AlaLeuGlySerLeuAlaAlaLysGlyGluLeuThrValSerAlaAlaArg
GCGGCGACCGTGGCCGAGTTGAAGTCGCTGGACAACATCTCCGTGACGGGC 2550
AlaAlaThrValAlaGluLeuLysSerLeuAspAsnIleSerValThrGly
GGCGAACGCGTGTCGGTTCAGAGCGTCAACAGCGCGTCCAGGGTCGCCATT 2601
GlyGluArgValSerValGlnSerValAsnSerAlaSerArgValAlaIle
TCGGCGCACGGCGCGCTGGATGTAGGCAAGGTTTCCGCCAAGAGCGGTATC 2652
SerAlaHisGlyAlaLeuAspValGlyLysValSerAlaLysSerGlyIle
GGGCTCGAAGGCTGGGGCGCGGTCGGAGCGGACTCCCTCGGTTCCGACGGC 2703
GlyLeuGluGlyTrpGlyAlaValGlyAlaAspSerLeuGlySerAspGly
GCGATCAGCGTGTCCGGGCGCGATGCGGTCAGGGTCGATCAAGCCCGCAGT 2754
AlaIleSerValSerGlyArgAspAlaValArgValAspGlnAlaArgSer
CTTGCCGACATTTCGCTGGGGGCGGAAGGCGGCGCCACGCTGGGCGCGGTG 2805
LeuAlaAspIleSerLeuGlyAlaGluGlyGlyAlaThrLeuGlyAlaVal
GAGGCCGCCGGTTCGATCGACGTGCGCGGCGGATCCACGGTGGCGGCGAAC 2856
GluAlaAlaGlySerIleAspValArgGlyGlySerThrValAlaAlaAsn
TCGCTGCACGCCAATCGCGACGTTCGGGTCAGCGGCAAGGATGCGGTGCGC 2907
SerLeuHisAlaAsnArgAspValArgValSerGlyLysAspAlaValArg
GTAACGGCCGCCACCAGCGGGGGCGGTCTGCATGTGTCGAGCGGCCGCCAG 2958
ValThrAlaAlaThrSerGlyGlyGlyLeuHisValSerSerGlyArgGln
CTCGATCTGGGCGCCGTGCAGGCGCGCGGCGCGCTGGCCCTGGACGGAGGC 3009
LeuAspLeuGlyAlaVaIGlnAlaArgGlyAlaLeuAlaLeuAspGlyGly
GCCGGCGTGGCGCTGCAATCGGCCAAGGCTAGCGGCACGCTGCATGTGCAG 3060
AlaGlyValAlaLeuGlnSerAlaLysAlaSerGlyThrLeuHisValGln
GGCGGCGAGCACCTGGACCTGGGCACGTTGGCCGCCGTAGGGGCGGTGGAC 3111
GlyGlyGluHisLeuAspLeuGlyThrLeuAlaAlaValGlyAlaValAsp
GTCAATGGCACGGGAGACGTGCGCGTTGCGAAGCTGGTGAGCGATGCAGGC 3162
ValAsnGlyThrGlyAspValAtgValAlaLysLeuValSerAspAlaGly
GCCGATCTGCAAGCGGGGCGCTCCATGACGCTGGGTATCGTCGACACGACC 3213
AlaAspLeuGlnAlaGlyArgSerMetThrLeuGlyIleValAspThrThr
GGCGATCTGCAGGCGCGCGCGCAGCAGAAGCTGGAGCTCGGGTCGGTTAAG 3264
GlyAspLeuGlnAlaArgAlaGlnGlnLysLeuGluLeuGlySerValLys
AGCGATGGCGGCCTTCAGGCGGCCGCCGGCGGGGCCCTCAGCCTGGCGGCG 3315
SerAspGlyGlyLeuGlnAlaAlaAlaGlyGlyAlaLeuSerLeuAlaAla
GCGGAAGTCGCAGGGGCGCTGGAGCTCTCGGGCCAGGGCGTCACCGTGGAC 3366
AlaGluValAlaGlyAlaLeuGluLeuSerGlyGlnGlyValThrValAsp
AGAGCCAGCGCTAGCCGGGCACGCATCGACAGCACCGGTTCGGTCGGCATC 3417
ArgAlaSerAlaSerArgAlaArglleAspSerThrGlySerValGlyIle
GGCGCGCTGAAGGCAGGCGCTGTCGAGGCCGCCTCGCCACGGCGGGCGCGC 3468
GlyAlaLeuLysAlaGlyAlaValGluAlaMaSerProArgArgAlaArg
CGCGCGCTGCGGCAGGATTTCTTCACGCCCGGCAGCGTGGTGGTCCGCGCC 3519
ArgAlaLeuArgGlnAspPhePheThrProGlySerValValValArgAla
CAGGGCAATGTCACGGTCGGGCGCGGCGATCCGCATCAGGGCGTGCTGGCC 3570
GlnGlyAsnValThrValGlyArgGlyAspProHisGlnGlyValLeuAla
CAGGGCGACATCATCATGGATGCGAAGGGCGGCACCTTGCTGTTGCGCAAC 3621
GlnGlyAspIleIleMetAspAlaLysGlyGlyThrLeuLeuLeuArgAsn
GATGCCTTGACCGAGAACGGGACGGTCACCATATCGGCCGATTCGGCCGTG 3672
AspAlaLeuThrGluAsnGlyThrValThrIleSerAlaAspSerAlaVal
CTCGAGCATTCCACCATCGAGAGCAAGATCAGCCAGAGCGTGCTGGCTGCC 3723
LeuGluHisSerThrIleGluSerLysIleSerGlnSerValLeuAlaAla
AAAGGGGACAAGGGCAAGCCGGCGGTGTCGGTGAAGGTCGCGAAGAAGCTG 3774
LysGlyAspLysGlyLysProAlaValSerValLysValAlaLysLysLeu
TTTCTCAATGGTACGTTGCGGGCCGTCAACGACAACAACGAAACCATGTCC 3825
PheLeuAsnGlyThrLeuArgAlaValAsnAspAsnAsnGluThrMetSer
GGGCGCCAGATCGACGTCGTGGACGGACGTCCGCAGATCACCGACGCGGTC 3876
GlyArgGlnIleAspValValAspGlyArgProGlnIleThrAspAlaVal
ACGGGCGAAGCGCGTAAGGACGAATCGGTTGTGTCCGACGCCGCGCTCGTG 3927
ThrGlyGluAlaArgLysAspGluSerValValSerAspAlaAlaLeuVal
GCCGATGGCGGTCCGATCGTGGTCGAGGCCGGCGAGCTGGTCAGCCATGCC 3978
AlaAspGlyGlyProIleValValGluAlaGlyGluLeuValSerHisAla
GGCGGTATCGGCAACGGCCGCAACAAGGAGAATGGCGCCAGCGTCACCGTG 4029
GlyGlyIleGlyAsnGlyArgAsnLysGluAsnGlyAlaSerValThrVal
CGCACGACTGGCAACCTGGTCAACAAGGGCTACATCTCGGCCGGCAAGCAG 4080
ArgThrThrGlyAsnLeuValAsnLysGlyTyrIleSerAlaGlyLysGln
GGCGTGCTCGAGGTGGGCGGCGCCTTGACGAACGAGTTCCTGGTCGGCTCG 4131
GlyValLeuGluValGlyGlyAlaLeuThrAsnGluPheLeuValGlySer
GACGGCACCCAGCGCATCGAGGCGCAGCGCATCGAGAACAGGGGCACCTTC 4182
AspGlyThrGlnArgIleGluAlaGlnArgIleGluAsnArgGlyThrPhe
CAGAGCCAGGCTCCGGCGGGCACGGCCGGCGCCCTGGTGGTCAAGGCTGCC 4233
GlnSerGlnAlaProAlaGlyThrAlaGlyAlaLeuValValLysAlaAla
GAGGCCATCGTGCACGACGGCGTCATGGCCACCAAAGGCGAGATGCAGATC 4284
GluAlaIleValHisAspGlyValMetAlaThrLysGlyGluMetGlnIle
GCCGGCAAGGGCGGCGGGTCTCCGACCGTCACCGCCGGCGCAAAGGCGACG 4335
AlaGlyLysGlyGlyGlySerProThrValThrAlaGlyAlaLysAlaThr
ACCAGCGCGAACAAGCTGAGCGTCGACGTGGCAAGGTGGGACAACGCGGGA 4386
ThrSerAlaAsnLysLeuSerValAspValAlaSerTrpAspAsnAlaGly
AGCCTGGATATCAAGAAGGGCGGCGCGCAGGTCACGGTGGCCGGGCGCTAT 4437
SerLeuAspIleLysLysGlyGlyAlaGlnValThrValAlaGlyArgTyr
GCCGAGCACGGCGAGGTTTCGATACAGGGCGATTACACCGTCTCGGCCGAC 4488
AlaGluHisGlyGluValSerIleGlnGlyAspTyrThrValSerAlaAsp
GCCATCGCGCTGGCGGCGCAGGTCACCCAGCGCGGAGGCGCCGCGAACCTG 4539
AlaIleAlaLeuAlaAlaGlnValThrGlnArgGlyGlyAlaAlaAsnLeu
ACCTCGCGGCACGACACCCGTTTCTCCAACAAGATTCGCCTGATGGGGCCG 4590
ThrSerArgHisAspThrArgPheSerAsnLysIleArgLeuMetGlyPro
TTGCAGGTCAACGCCGGCGGGCCGGTGTCCAATACCGGCAATCTGAAAGTG 4641
LeuGlnValAsnAlaGlyGlyProValSerAsnThrGlyAsnLeuLysVal
CGCGAGGGCGTGACCGTAACGGCGGCGTCGTTCGACAACGAGACCGGGGCC 4692
ArgGluGlyValThrValThrAlaAlaSerPheAspAsnGluThrGlyAla
GAGGTCATGGCCAAGAGCGCCACGCTGACGACTTCCGGGGCCGCGCGCAAC 4743
GluValMetAlaLysSerAlaThrLeuThrThrSerGlyAlaAlaArgAsn
GCGGGCAAGATGCAGGTCAAGGAGGCCGCCACGATCGTTGCCGCCAGCGTT 4794
AlaGlyLysMetGlnValLysGluAlaAlaThrIleValAlaAlaSerVal
TCCAATCCCGGCACGTTCACGGCCGGCAAGGATATCACTGTTACCTCGCGC 4845
SerAsnProGlyThrPheThrAlaGlyLysAspIleThrValThrSerArg
GGAGGATTCGATAACGAAGGCAAGATGGAGTCCAACAAGGACATCGTCATC 4896
GlyGlyPheAspAsnGluGlyLysMetGluSerAsnLysAspIleValIle
AAGACGGAACAGTTCAGCAATGGCAGGGTTCTCGACGCCAAGCATGATCTG 4947
LysThrGluGlnPheSerAsnGlyArgValLeuAspAlaLysHi sAspLeu
ACGGTCACGGCGAGCGGGCAGGCGGACAACCGGGGCAGCCTGAAGGCAGGC 4998
ThrValThrAlaSerGlyGlnAlaAspAsnArgGlySerLeuLysAlaGly
CACGATTTCACGGTGCAGGCCCAGCGTATCGACAATAGCGGAACCATGGCC 5049
HisAspPheThrValGlnAlaGlnArgIleAspAsnSerGlyThrMetAla
GCCGGCCACGACGCCACGCTGAAGGCGCCGCACCTGCGCAATACGGGCCAG 5100
AlaGlyHisAspAlaThrLeuLysAlaProHisLeuArgAsnThrGlyGln
GTCGTAGCCGGGCACGACATCCATATCATCAACAGCGCCAAGCTGGAGAAC 5151
ValValAlaGlyHisAspIleHisIleIleAsnSerAlaLysLeuGluAsn
ACCGGGCGCGTGGATGCGCGCAACGACATCGCTCTGGATGTGGCGGATTTC 5202
ThrGlyArgValAspAlaArgAsnAspIleAlaLeuAspValAlaAspPhe
ACCAACACGGGATCCCTCTACGCCGAGCATGACGCGACGCTGACGCTTGCG 5253
ThrAsnThrGlySerLeuTyrAlaGluHisAspAlaThrLeuThrLeuAla
CAAGGCACGCAGCGCGATCTGGTGGTGGACCAGGATCATATCCTGCCGGTG 5304
GlnGlyThrGlnArgAspLeuValValAspGlnAspHisIleLeuProVal
GCGGAGGGGACGTTACGCGTCAAGGCCAAGTCGCTGACCACCGAAATCGAG 5355
AlaGluGlyThrLeuArgValLysAlaLysSerLeuThrThrGluIleGlu
ACCGGCAATCCCGGCAGCCTGATCGCCGAGGTGCAGGAAAATATCGACAAC 5406
ThrGlyAsnProGlySerLeuIleAlaGluValGlnGluAsnIleAspAsn
AAGCAGGCCATCGTCGTCGGCAAGGACCTGACGCTGAGTTCGGCGCACGGC 5457
LysGlnAlaIleValValGlyLysAspLeuThrLeuSerSerAlaHisGly
AACGTGGCCAACGAAGCGAACGCGCTGCTGTGGGCCGCCGGGGAGCTGACC 5508
AsnValAlaAsnGluAlaAsnAlaLeuLeuTrpAlaAlaGlyGluLeuThr
GTCAAGGCGCAGAACATCACCAATAAACGGGCCGCGCTGATCGAGGCGGGC 5559
ValLysAlaGlriAsnIleThrAsnLysArgAlaAlaLeuIleGluAlaGly
GGCAACGCCCGGCTGACGGCGGCCGTTGCCTTGCTCAACAAGCTGGGCCGC 5610
GlyAsnAlaArgLeuThrAlaAlaValAlaLeuLeuAsnLysLeuGlyArg
ATTCGCGCGGGCGAGGACATGCACCTGGATGCGCCGCGCATCGAGAACACC 5661
IleArgAlaGlyGluAspMetHisLeuAspAlaProArgIleGluAsnThr
GCGAAACTGAGCGGCGAGGTGCAACGCAAAGGCGTGCAGGACGTCGGGGGA 5712
AlaLysLeuSerGlyGluValGlnArgLysGlyValGlnAspValGlyGly
GGCGAGCACGGCCGCTGGAGCGGTATCGGCTATGTCAACTACTGGTTGCGC 5563
GlyGluHisGlyArgTrpSerGlyIleGlyTyrValAsnTyrTrpLeuArg
GCCGGCAATGGGAAGAAGGCGGGAACCATCGCCGCGCCGTGGTATGGCGGT 5814
AlaGlyAsnGlyLysLysAlaGlyThrIleAlaAlaProTrpTyrGlyGly
GATCTGACGGCGGAGCAGTCGCTCATCGAGGTCGGCAAGGATCTCTATCTG 5865
AspLeuThrAlaGluGlnSerLeulleGluValGlyLysAspLeuTyrLeu
AATGCCGGAGCGCGCAAGGACGAACATCGCCATCTGCTCAATGAAGGCGTG 5916
AsnAlaGlyAlaArgLysAspGluHisArgHisLeuLeuAsnGluGlyVal
ATCCAGGCGGGCGGCCATGGCCACATCGGCGGCGACGTGGACAACCGGTCG 5967
IleGlnAlaGlyGlyHisGlyHisIleGlyGlyAspValAspAsnArgSer
GTGGTGCGCACCGTGTCCGCCATGGAGTATTTCAAGACGCCTCTTCCGGTG 6018
ValValArgThrValSerAlaMetGluTyrPheLysThrProLeuProVal
AGCCTGACTGCCCTGGACAATCGTGCCGGCTTGTCTCCGGCGACCTGGAAC 6069
SerLeuThrAlaLeuAspAsnArgAlaGlyLeuSerProAlaThrTrpAsn
TTCCAGTCCACGTATGAACTCCTGGATTATCTGCTGGACCAGAATCGCTAC 6120
PheGlnSerThrTyrGluLeuLeuAspTyrLeuLeuAspGlnAsnArgTyr
GAGTACATTTGGGGGCTGTATCCGACCTACACCGAATGGTCGGTGAATACG 6171
GluTyrIleTrpGlyLeuTyrProThrTyrThrGluTrpSerValAsnThr
CTGAAGAACCTCGACCTGGGCTACCAGGCCAAGCCGGCTCCCACTGCGCCG 6222
LeuLysAsnLeuAspLeuGlyTyrGlnAlaLysProAlaProThrAlaPro
CCGATGCCCAAGGCTCCCGAACTCGACCTGCGTGGCCATACGCTGGAGTCG 6273
ProMetProLysAlaProGluLeuAspLeuArgGlyHisThrLeuGluSer
GCCGAAGGCCGGAAGATCTTTGGCGAGTACAAGAAGCTGCAAGGCGAGTAC 6324
AlaGluGlyArgLysIlePheGlyGluTyrLysLysLeuGlnGlyGluTyr
GAGAAGGCGAAGATGGCCGTCCAGGCCGTGGAGGCTTACGGCGAGGCTACT 6375
GluLysAlaLysMetAlaValGlnAlaValGluAlaTyrGlyGluAlaThr
CGGCGCGTCCATGATCAGCTGGGCCAACGTTATGGTAAGGCCCTGGGCGGC 6426
ArgArgValHisAspGlnLeuGlyGlnArgTyrGlyLysAlaLeuGlyGly
ATGGATGCCGAGACCAAGGAGGTCGACGGCATCATCCAGGAGTTCGCCGCG 6477
MetAspAlaGluThrLysGluValAspGlyIleIleGlnGluPheAlaAla
GATCTGCGAACGGTCTATGCGAAGCAGGCCGACCAGGCGACCATCGACGCA 6528
AspLeuArgThrValTyrAlaLysGlnAlaAspGlnAlaThrIleAspAla
GAGACGGACAAGGTCGCCCAGCGCTACAAGTCGGAGATGGACGCGGTGCGG 6579
GluThrAspLysValAlaGlnArgTyrLysSerGlnIleAspAlaValArg
CTGCAGGCGATCCAGCCTGGCCGGGTCACGCTGGCCAAGGCGCTGTCGGCG 6630
LeuGlnAlaIleGlnProGlyArgValThrLeuAlaLysAlaLeuSerAla
GCGCTGGGCGCCGACTGGCGCGCGCTGGGTCACTCCCAATTGATGCAGCGC 6681
AlaLeuGlyAlaAspTrpArgAlaLeuGlyHisSerGlnLeuMetGlnArg
TGGAAGGATTTCAAGGCGGGCAAGCGCGGCGCGGAAATCGCGTTCTATCCC 6732
TrpLysAspPheLysAlaGlyLysArgGlyAlaGluIleAlaPheTyrPro
AAGGAACAAACCGTGCTGGCCGCCGGCGCCGGTTTGACCCTGTCCAACGGG 6783
LysGluGlnThrValLeuAlaAlaGlyAlaGlyLeuThrLeuSerAsnGly
GCGATCCACAACGGCGAGAACGCCGCGCAGAATCGCGGCCGGCCGGAAGGC 6834
AlaIleHisAsnGlyGluAsnAlaAlaGlnAsrArgGlyArgProGluGly
CTGAAAATCGGCGCACATTCGGCGACTTCGGTGAGCGGCTCGTTCGACGCC 6885
LeuLysIleGlyAlaHisSerAlaThrSerValSerGlySerPheAspAla
TTGCGCGACGTGGGGCTGGAAAAGCGGCTGGATATCGACGATGCGCTGGCT 6936
LeuArgAspValGlyLeuGluLysArgLeuAspIleAspAspAlaLeuAla
GCCGTGCTCGTGAATCCGCATATTTTCACGCGGATCGGGGCGGCTCAGACA 6987
AlaValLeuValAsnProHisIlePheThrArgIleGlyAlaAlaGlnThr
TCCCTTGCCGACGGCGCCGCCGGGCCGGCGCTGGCGCGCCAGGCCAGGCAA 7038
SerLeuAlaAspGlyAlaAlaGlyProAlaLeuAlaArgGlnAlaArgGln
GCGCCGGAGACCGACGGCATGGTGGATGCGCGAGGGCTGGGCAGCGCCGAT 7089
AlaProGluThrAspGlyMetValAspAlaArgGlyLeuGlySerAlaAsp
GCGCTCGCTTCCCTGGCCAGCTTGGACGCGGCGCAAGGGCTGGAGGTATCC 7140
AlaLeuAlaSerLeuAlaSerLeuAspAlaAlaGlnGLyLeuGluValSer
GGCAGGCGCAATGCGCAGGTGGCCGACGCCGGGCTCGCCGGGCCGAGCGCC 7191
GlyArgArgAsnAlaGlnValAlaAspAlaGlyLeuAlaGlyProSerAla
GTCGCGGCGCCGGCCGTCGGGGCGGCCGATGTCGGCGTGGAGCCTGTCACG 7242
ValAlaAlaProAlaValGlyAlaAlaAspValGlyVaIGluProValThr
GGGGACCAGGTCGACCAGCCTGTCGTGGCGGTCGGGCTCGAGCAGCCTGTC 7293
GlyAspGlnValAspGlnProValValAlaValGlyLeuGluGlnProVal
GCGACGGTCCGGGTCGCGCCGCCAGCCGTCGCGTTGCCGCGGCCGCTGTTC 7344
AlaThrValArgValAlaProProAlaValAlaLeuProArgProLeuPhe
GAAACCCGCATCAAGTTTATCGACCAGAGCAAATTCTACGGCTCGCGTTAT 7395
GluThrArgIleLysPheIleAspGlnSerLysPheTyrGlySerArgTyr
TTCTTCGAGCAGATCGGCTACAAGCCCGATCGCGCCGCGCGGGTGGCGGGC 7446
PhePheGluGlnIleGlyTyrLysProAspArgAlaAlaArgValAlaGly
GACAACTATTTCGATACCACGCTGGTGCGCGAGCAGGTGCGGCGCGCCCTG 7497
AspAsnTyrPheAspThrThrLeuValArgGluGlnValArgArgAlaLeu
GGCGGCTATGAAAGCCGCCTGCCCGTGCGCGGTGTCGCGTTGGTGGCCAAG 7548
GlyGlyTyrGluSerArgLeuProValArgGlyValAlaLeuValAlaLys
CTGATGGATTCGGCCGGGACGGTCGGCAAGGCGCTGGGCCTGAAGGTGGGT 7599
LeuMetAspSerAlaGlyThrValGlyLysAlaLeuGlyLeuLysValGly
GTCGCGCCGACCGCGCAGCAGCTCAAGCAGGCCGACCGCGATTTCGTCTGG 7650
ValAlaProThrAlaGlnGlnLeuLysGlnAlaAspArgAspPheValTrp
TACGTGGATACCGTGATCGACGGCCAGAAGGTTCTCGCTCCCCGGCTGTAC 7701
TyrValAspThrValIleAspGlyGlnLysValLeuAlaProArgLeuTyr
CTGACCGAGGCGACGCGCCAGGGCATCACGGATCAGTACGCCGGCGGCGGG 7752
LeuThrGluAlaThrArgGlnGlyIleThrAspGlnTyrAlaGlyGlyGly
GCGCTGATTGCCTCCGGCGGCGACGTAACTGTCAATACGGACGGCCATGAC 7803
AlaLeuIleAlaSerGlyGlyAspValThrValAsnThrAspGlyHisAsp
GTCAGTTCGGTCAACGGGCTGATCCAGGGCAGGAGCGTCAAGGTGGACGCG 7854
ValSerSerValAsnGlyLeuIleGlnGlyArgSerValLysValAspAla
GGCAAGGGCAAGGTCGTGGTGGCCGACAGCAAGGGGGCGGGCGGCGGCATC 7905
GlyLysGlyLysValValValAlaAspSerLysGlyAlaGlyGlyGlyIle
GAGGCCGATGACGAGGTCGACGTCTCAGGCCGGGATATCGGCATCGAGGGC 7956
GluAlaAspAspGluValAspValSerGlyArgAspIleGlyIleGluGly
GGCAAGCTGCGCGGCAAGGATGTCAGGCTCAAGGCCGACACGGTCAAGGTC 8007
GlyLysLeuArgGlyLysAspValArgLeuLysAlaAspThrValLysVal
GCGACCTCGATGCGTTACGACGACAAGGGCAGGCTGGCGGCGCGCGGCGAC 8058
AlaThrSerMetArgTyrAspAspLysGlyArgLeuAlaAlaArgGlyAsp
GGCGCCCTGGATGCGCAAGGCGGCCAGCTGCATATCGAGGCCAAGCGCCTG 8109
GlyAlaLeuAspAlaGlnGlyGlyGlnLeuHisIleGluAlaLysArgLeu
GAGACGGCCGGCGCGACGCTCAAGGGCGGCAAGGTGAAGCTGGATGTCGAT 8160
GluThrAlaGlyAlaThrLeuLysGlyGlyLysValLysLeuAspValAsp
GACGTCAAGTTGGGCGGCGTGTACGAGGCGGGGTCCAGCTACGAGAACAAG 8211
AspValLysLeuGlyGlyValTyrGluAlaGlySerSerTyrGluAsnLys
AGCTCGACGCCGCTGGGCAGCCTGTTCGCCATCCTGTCGTCGACGACGGAA 8262
SerSerThrProLeuGlySerLeuPheAlaIleLeuSerSerThrThrGlu
ACCAACCAGTCGGCACACGCGAACCATTACGGTACGCGCATCGAAGCCGGT 8313
ThrAsnGlnSerAlaHisAlaAsnHisTyrGlyThrArgIleGluAlaGly
ACGCTGGAAGGAAAGATGCAGAACCTGGAGATCGAAGGCGGTTCGGTCGAT 8364
ThrLeuGluGlyLysMetGlnAsnLeuGluIleGluGlyGlySerValAsp
GCCGCGCATACGGACCTGTCCGTGGCCCGCGACGCGAGGTTCAAGGCCGCC 8415
AlaAlaHisThrAspLeuSerValAlaArgAspAlaArgPheLysAlaAla
GCGGATTTCGCGCACGCCGAGCATGAGAAGGATGTGCGCCAACTGTCCCTG 8466
AlaAspPheAlaHisAlaGluHisGluLysAspValArgGlnLeuSerLeu
GGTGCCAAGGTGGGGGCGGGCGGCTACGAGGCGGGCTTCAGCCTGGGCAGC 8517
GlyAlaLysValGlyAlaGlyGlyTyrGluAlaGlyPheSerLeuGlySer
GAAAGCGGTCTGGAAGCGCACGCCGGCCGCGGTATGACCGCGGGCGCTGAA 8568
GluSerGlyLeuGluAlaHisAlaGlyArgGlyMetThrAlaGlyAlaGlu
GTCAAGGTAGGTTATCGGGCATCGCACGAACAGTCCTCGGAAACCGAAAAG 8619
ValLysValGlyTyrArgAlaSerHisGluGlnSerSerGluThrGluLys
TCCTATCGCAACGCGAACCTCAATTTCGGTGGAGGCTCCGTCGAGGCTGGC 8670
SerTyrArgAsnAlaAsnLeuAsnPheGlyGlyGlySerValGluAlaGly
AATGTCCTGGATATCGGCGGCGCCGACATCAACCGGAACCGGTACGGCGGC 8721
AsnValLeuAspIleGlyGlyAlaAspIleAsraArgAsnArgTyrGlyGly
GCCGCGAAGGGGAACGCCGGGACCGAGGAGGCCTTGCGCATGCGCGCCAAG 8772
AlaAlaLysGlyAsnAlaGlyThrGluGluAlaLeuArgMetArgAlaLys
AAGGTCGAGTCCACCAAGTACGTCAGCGAGCAGACGAGCCAGAGCTCCGGC 8823
LysValGluSerThrLysTyrValSerGluGlnThrSerGlnSerSerGly
TGGAGCGTGGAGGTGGCATCGACGGCCAGTGCCCGTTCCAGCCTGCTGACG 8874
TrpSerValGluValAlaSerThrAlaSerAlaArgSerSerLeuLeuThr
GCCGCCACGCGCCTGGGCGACAGCGTGGCGCAGAATGTCGAGGACGGCCGC 8925
AlaAlaThrArgLeuGlyAspSerValAlaGlnAsnValGluAspGlyArg
GAGATCCGCGGCGAGCTGATGGCTGCGCAAGTCGCCGCGGAGGCCACGCAA 8976
GluIleArgGlyGluLeuMetAlaAlaGlnValAlaAlaGluAlaThrGln
CTGGTAACCGCCGACACGGCGGCGGTGGCACTGAGTGCCGGAATCAGCGCC 9027
LeuValThrAlaAspThrAlaAlaValAlaLeuSerAlaGlyIleSerAla
GACTTCGACAGCAGCCACAGCCGCTCCACCTCGCAGAATACCCAATATCTG 9078
AspPheAspSerSerHisSerArgSerThrSerGlrAsnThrGlnTyrLeu
GGCGGAAACTTGTCCATCGAGGCCACCGAGGGCGATGCGACGCTGGTGGGC 9129
GlyGlyAsnLeuSerIleGluAlaThrGluGlyAspAlaThrLeuValGly
GCGAAGTTCGGCGGTGGCGACCAGGTCAGCTTGAAGGCAGCGAAGAGCGTG 9180
AlaLysPheGlyGlyGlyAspGlnValSerLeuLysAlaAlaLysSerVal
AACCTCATGGCGGCCGAATCGACCTTCGAATCGTACTCGGAGAGCCACAAC 9231
AsnLeuMetAlaAlaGluSerThrPheGluSerTyrSerGluSerHisAsn
TTCCACGCCTCCGCCGACGCGAACCTTGGCGCCAACGCCGTGCAGGGCGCC 9282
PheHisAlaSerAlaAspAlaAsnLeuGlyAlaAsnAlaValGlnGlyAla
GTTGGCCTGGGGTTGACTGCGGGTATGGGGACGTCGCATCAGATTACCAAC 9333
ValGlyLeuGlyLeuThrAlaGlyMetGlyThrSerHisGlnIleThrAsn
GAAACCGGCAAGACCTATGCCGGAACCTCGGTGGATGCGGCGAACGTGTCG 9384
GluThrGlyLysThrTyrAlaGlyThrSerValAspAlaAlaAsnValSer
ATCGATGCAGGCAAGGATCTGAACCTTTCCGGGTCCCGCGTGCGGGGTAAG 9435
IleAspAlaGlyLysAspLeuAsnLeuSerGlySerArgValArgGlyLys
CATGTTGTCCTGGATGTCGAGGGCGATATCAATGCGACCAGCAAGCAGGAT 9486
HisValValLeuAspValGluGlyAspIleAsnAlaThrSerLysGlnAsp
GAACGCAACTACAACTCCAGCGGTGGCGGTTGGGACGCCTCGGCAGGGGTG 9537
GluArgAsnTyrAsnSerSerGlyGlyGlyTrpAspAlaSerAlaGlyVal
GCGATTCAGAACCGCACGTTGGTTGCGCCCGTGGGGTCTGCCGGCTTCAAT 9588
AlaIleGlnAsnArgThrLeuValAlaProValGlySerAlaGlvPheAsn
TTCAATACGGAACACGACAATTCGCGCCTGACCAATGACGGGGCGGCGGGT 9639
PheAsnThrGluHisAspAsnSerArgLeuThrAsnAspGlyAlaAlaGly
GTCGTTGCCAGCGACGGGTTGACGGGCCATGTGAAAGGCGACGCCAACCTG 9690
ValValAlaSerAspGlyLeuThrGlyHisValLysGlyAspAlaAsnLeu
ACCGGCGCGACCATTGCCGATTTGTCGGGCAAGGGCAATCTCAAGGTCGAC 9741
ThrGlyAlaThrIleAlaAspLeuSerGlyLysGlyAsnLeuLysValAsp
GGCGCGGTCAACGCGCAGAACCTGAAAGACTACCGCGACAAGGACGGCGGC 9792
GlyAlaValAsnAlaGlnAsnLeuLysAspTyrArgAspLysAspGlyGly
AGCGGCGGCCTGAACGTGGGCATCTCGTCGACCACGCTGGCGCCCACCGTG 9843
SerGlyGlyLeuAsnValGlyIleSerSerThrThrheuAlaProThrVal
GGCGTGGCGTTCGGCAGGGTGGCCGGAGAGGATTATCAGGCCGAGCAGCGC 9894
GlyValAlaPheGlyArgValAlaGlyGluAspTyrGlnAlaGluGlnArg
GCCACGATTGACGTCGGTCAAACCAAGGATCCCGCGCGCCTGCAGGTCGGC 9945
AlaThrIleAspValGlyGlnThrLysAspProAlaArgLeuGlnValGly
GGCGGCGTCAAGGGTACCCTCAATCAGGACGCCGCGCAGGCCACGGTCGTT 9996
GlyGlyValLysGlyThrLeuAsnGlnAspAlaAlaGlnAlaThrValVal
CAGCGCAACAAGCACTGGGCCGGAGGCGGGTCGGAATTCTCGGTGGCTGGC 10047
GlnArgAsnLysHisTrpAlaGlyGlyGlySerGluPheSerValAlaGly
AAGTCACTGAAGAAGAAGAACCAGGTCCGCCCGGTGGAGACGCCGACGCCG 10098
LysSerLeuLysLysLysAsnGlnValArgProValGluThrProThrPro
GATGTCGTGGATGGACCGCCTAGCCGTCCCACCACGCCGCCCGCGTCGCCG 10149
AspValValAspGlyProProSerArgProThrThrProProAlaSerPro
CAGCCGATCCGCGCGACGGTCGAGGTCAGTTCGCCGCCGCCGGTGTCCGTG 10200
GlnProIleArgAlaThrValGluValSerSerProProProValSerVal
GCCACGGTCGAAGTCGTGCCGCGGCCGAAGGTCGAAACCGGCTCAGCCGCT 10251
AlaThrValGluValValProArgProLysValGluThrGlySerAlaAla
TCCGCCTCGGCCGGTGGCGCCCAGGTCGTGCCGGTGACGCCTCCCAAGGTG 102302
SerAlaSerAlaGlyGlyAlaGlnValValProValThrProProLysVal
GAGGTCGCCAAGGTGGAGGTCGCCAAGGTGGAAGTCGTGCCGCGGCCGAAG 10353
GluValAlaLysValGluValAlaLysValGluValValProArgProLys
GTTGAAACGGCTCAGCCGCTTCCGCCCCGGCCGGTGGTGGCCGAGAAGGTG 10404
ValGluThrAlaGlnProLeuProProArgProValValAlaGluLysVal
ACGACGCCGGCGGTCCAGCCCCAGCTTGCCAAGGTGGAGACGGTGCAGCCG 10455
ThrThrProAlaValGlnProGlnLeuAlaLysValGluThrValGlnPro
GTGAAGCCCGAAACCACCAAGCCGTTGCCCAAGCCGCTGCCGGTGGCGAAG 10506
ValLysProGluThrThrLysProLeuProLysProLeuProValAlaLys
GTGACGAAAGCGCCGCCGCCGGTTGTGGAGACCGCCCAGCCGCTGCCGCCG 10557
ValThrLysAlaProProProValValGluThrAlaGlnProLeuProPro
GTCAAGCCACAGAAGGCGACCCCCGGCCCCGTGGCTGAGGTGGGCAAGGCT 10608
ValLysProGlnLysAlaThrProGlyProValAlaGluValGlyLysAla
ACGGTCACGACGGTGCAGGTGCAGAGTGCGCCGCCCAAGCCGGCCCCGGTG 10659
ThrValThrThrValGlnValGlnSerAlaProProLysProAlaProVal
GCCAAGCAGCCCGCGCCTGCACCGAAGCCCAAGCCCAAGCCCAAGCCCAAG 10710
AlaLysGlnProAlaProAlaProLysProLysProLysProLysProLysProLys
GCCGAGCGTCCGAAGCCGGGCAAAACGACGCCCTTGAGCGGGCGCCACGTG 10761
AlaGluArgProLysProGlyLysThrThrProLeuSerGlyArgHisVal
GTGCAACAGCAGGTGCAGGTCTTGCAGCGGCAAGCGAGTGACATCAACAAC 10812
ValGlnGlnGlnValGlnValLeuGlnArgGlnAlaSerAspIleAsnAsn
ACCAAGAGCCTGCCTGGCGGGAAGCTGCCCAAGCCGGTCACCGTGAAGCTG 10863
ThrLysSerLeuProGlyGlyLysLeuProLysProValThrValLysLeu
ACCGACGAGAACGGCAAGCCGCAGACGTATACGATCAACCGGCGCGAGGAT 10914
ThrAspGluAsnGlyLysProGlnThrTyrThrIleAsnArgArgGluAsp
CTGATGAAGCTCAACGGCAAGGTGCTGTCCACCAAGACGACACTGGGCCTG 10965
LeuMetLysLeuAsnGlyLysValLeuSerThrLysThrThrLeuGlyLeu
GAGCAGACCTTCCGCCTGCGGTCGAGGATATCGGCGGCAAGAACTACCGGG 11016
GluGlnThrPheArgLeuArgSerArgIleSerAlaAlaArgThrThrGly
TCTTCTATGAAACCAACAAATAGGTAGTCGCGGCCTGCCGCGGCTCGGCGC 11067
SerSerMetLysProThrAsnArg
ATGGGGATTCGCAGGGTTCTCATGCGCCGGCCAATGCCGGATAGCGGTGCA 11118
ATTGCCGACCATTTCGCGCACCGCGCTCAAGGACGTAGGGTCGACGGCAGG 11169
CGGGACAGTTTTTGACGTGAAACTGACCGAGTGTCCGCAGGCATTGAATGG 11220
TCAGCAAGTGGGATTGTTCTTCGAATCTGGTGGCACGGTTGACTATACGTC 11271
GGGAAACCTGTTTGCGTATCGGGCCGATAGTCAGGGCGTCGAACAGGCTAC 11322
CGCAGAGCGAAAGCCGACAACGTGCAAGCCAATCTGGATGGTTCCGCTATT 11373
CATTTGGGCCGCAACAAGGGTGCGCAGGCTGCTCAGACGTTTCTGGTATCG 11424
CAGACGGCTGGGTCGTCGACGTACGGGGCGACCCTGCGCTATCTGGCATGC 11475
TACATCCGTTCGGGCGCTGGTTCCATTGTTGCGGGGAATCTCCGCAGTCAG 11526
GTGGGGTTCTCCGTGATGTATCCGTAGCCCGTGAAAGAGGGGTCACCCACT 11577
GCGGGGGGCCCCGGTACGGGATGGTCGGCTTGTCAGAGATTCTTGTTTTC 11628
CATTTCTTTCTTTTCACTCGGTCGCAGCGCCGGCTTGATGCATGCAAAGCA 11679
TCGATAGCTACGAACGGCCGCGATTCTTGAATCATGAATACATACGCTTGT 11730
GACGGGGCGCTCGCGAGAGCCGGCCCCAGGGATGGTTTACGCCTGCATTTA 11781
CGGTAAAGCGGCAAGGCGGCATGGCGCGCTGGCGGCGGCTGGGCGTCGCGG 11832
CGCTGGGCCATGCTGGCGAGCCTGGCGCCGGCCGCnCGGGCAGCTyGTnAT 11883
Der relative GC-Gehalt des FHA-ORF beträgt 67,5%. Untersuchung dieser Nukleotidsequenz auf Transkriptions-Startsignale ergibt mögliche -35 und -10 Konsensbereiche, TGGTTTGAC und TATAAAT, die durch 23 Basen paare getrennt sind und sich 174 und 142 bp stromauf vom Beginn des ORF befinden, wobei die Transkriptionsinitiation offensichtlich 30 bis 75 bp vom Initiationscodon beginnt. Eine mögliche Ribosom-BindungssteIle, GAGG, liegt 90 bp stromauf vom ORF. Eine weitere mögliche Ribosom- BindungssteIle, CTGG, liegt 11 bp vor dem dritten ATG. Weitere Analyse der Nukleotidsequenz zeigt einen Bereich alternierender direkter Wiederholungen des Musters ABABA zwischen 1468 und 1746 bp von der EcoRI-SteIle links. Ähnliche Wiederholungen finden sich in der vorhergesagten Aminosäuresequenz, die diesem gleichen Bereich entspricht.

Vorhergesagte Peptidsequenz

Die vorhergesagte Peptidsequenz des FHA-ORF ist 3597 Reste lang, mit einem berechneten MG von 368 kDa. Das ist wesentlich länger als die veröffentlichten gemessenen Werte. Die Zusammensetzung dieser Sequenz ist reich an Alanin und Glycin (27,0%) und beinahe identisch mit der bereits veröffentlichten chemischen Analyse der FHA- Aminosäurezusammensetzung (Sato et al., 1983, s. o.). Der computerberechnete isoelektrische Punkt des gesamten Polypeptids liegt bei 6,79.
Die Konzentration geladener Reste in der FHA-Polypeptidkette ist zwischen den Positionen 2.000 und 2.7000 am höchsten. Die Hydrophobie ist in den N-terminalen 300 Resten und wieder an spezifischen SteIlen hae den Resten 1800-2000 und 2400-2500 am höchsten. Es gibt eine vielfach vorhergesagte Transmembran-Helix zwischen den Aminosäurepositionen 44 und 69 mit ihrem Transmembransegment zwischen den Resten 52 und 69.
Ein interessantes Merkmal des vorhergesagten Aminosäurepolypeptids ist die Sequenz RRARR an Aminosäureposition 1069. Diese stark argininreiche Seuqenz ist eine wahrscheinliche SteIle für trypsinartige proteolytische Spaltung. N-terminale Aminosäuresequenz-Bestimmungen mehrerer der SDS-PAGE-FHA-Peptidbanden durch andere Forscher bestätigt, daß Spaltung tatsächlich an dieser SteIle erfolgt. Die Analyse der resultierenden beiden Teile der FHA-Peptidsequenz zeigt auffällige Unterschiede in den chemischen Eigenschaften. Das N-terminale Fragment mit 98 kDa ist in hohem Maße basisch mit einem positiven Hydropathie-Ergebnis, während der C-terminale Abschnitt mit 140 kDa ein negativ geladenes, saures Polypeptid ist, das eine stärker hydrophile Gesamtzusammensetzung aufweist. Polypeptid dieser beiden Größen sind vorherrschende Spezies bei FHA-Western-Immunblots.

ZeIlerkennungssteIle

An Aminosäureposition 1097 und wieder an Position 2599 befindet sich die Tripeptidsequenz RGD. Diese Sequenz ist als "ZeIlerkennungssteIle" für die Wechselwirkung von Fibronectin und anderen eukaryotischen extrazellularen Matrixproteinen mit der Integrin-Rezeptorfamilie auf einer Vielzahl eukaryotischer Zelloberflächen bekannt (Pierschbacher und Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5985-5988 (1984), Ruoslahti und Pierschbacher, Science 238, 491-497 (1987)). Sekundärstrukturanalyse der Polypeptidsequenz, die an diese beiden FHA RGD-SteIlen angrenzt, zeigt, daß die erste davon in hohem Maße als an der Oberfläche freiliegend, hydrophil und antigenisch vorhergesagt wird. Vergleich der FHA-Peptidsequenz, die an diese RGD-SteIle angrenzt, und der das RGD in Fibronectin umgebenden Sequenz zeigt Identität an 7 der 9 Reste. Spaltung an der RRARR-VerarbeitungssteIle würde diese erste RGD-Sequenz nahe dem N-Terminus des Polypeptidprodukts mit 214 kDa belassen.

Zellhaftung in vitro

Die RoIle mehrerer Virulenzfaktoren bei der Vermittlung der Haftung von B.pertussis an China-Hamster-EierstockzeIlen wurde bewertet. TabeIle 3 zeigt die Ergebnisse: TabeIle 3 HAFTUNG VON B.pertussis-STÄMMEN AN CHO-ZELLEN Mittelwert anhaftender Bakterien
Die im obigen Abschnitt beschriebenen Ergebnisse zeigen, daß das für filamentöses Hämagglutinin von B.pertussis kodierende Gen und das exprimierte Genprodukt nun in intakter und modifizierter Form zur Verwendung bei der Diagnose, Prophylaxe und Therapie von Pertussis verfügbar sind. Von besonderem Interesse ist die Verwendung des Gens zur Herstellung von Impfstoffen, wobei das Protein als solches, als Fragment, als intaktes Expressionsprodukt des Gens oder das physiologisch aktive Fragment davon oder in Kombination mit anderen Pertussis-Proteinen, insbesondere mit modifiziertem Pertussis-Toxin, oder mit Proteinen anderer Pathogene eingesetzt werden kann. Das erfindungsgemäße Gen kann verwendet werden, um die Menge des in einem lebenden oder toten B.pertussis-Organismus vorhandene filamentösem Hämagglutinin zu erhöhen oder für das Vorliegen der erfindungsgemäßen Proteine in anderen Organismen zu sorgen, wo Immunreaktion auf mehr als ein Antigen erwünscht ist.

Claims

1. Nukleinsäuresequenz mit weniger als 15 kb, die das 10.788 kb B.pertussis-fhaB-Gen frei vom fhaA-Gen umfaßt.

2. Nukleinsäuresequenz mit weniger als 15 kb, die eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, die für das B.pertussis-FHA-Protein mit 3597 Aminosäuren kodiert.

3. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2, worin die Sequenz die Nukleotide 253 bis 11.040 umfaßt, wie in der beiliegenden Beschreibung dargelegt.

4. Fragment einer Nukleinsäuresequenz nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das für einen Abschnitt mit etwa 230 kDa des FHA-Proteins kodiert, wobei der Abschnitt der N-proximale Abschnitt des Proteins ist.

5. Fragment einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches für ein Peptid mit einer Länge von zumindest 12 Aminosäuren kodiert, wobei das Fragment ein Fragment des offenen Leserahmens des FhaB-Gens ist, das für das Peptid kodiert, für das die Sequenz nach Anspruch 3 kodiert, worin die Nukleotide durch ein Motiv gekennzeichnet sind, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

a) Nukleotide, die für die RGD-ZeIlerkennungssteIlen an den Positionen 1097 oder 2599 des FHA-Polypeptids kodieren;

b) Nukleotide, die für das proteolytische RRARR-SteIle an Position 1069 des FHA- Polypeptids kodieren;

c) Nukleotide, die für direkte Wiederholungen kodieren, die sich zwischen den Nukleotiden 1468 und 1746 des FhaB-Gens befinden;

d) Nukleotide, die für das Motiv EARKDE der Positionen 1211 bis 1216 des FHA- Polypeptids kodieren;

e) Nukleotide, die für das Motiv SKQDER an den Positionen 3075 bis 3080 des FHA- Polypeptids kodieren;

f) Nukleotide, die für die (PK)&sub5;-Wiederholung kodieren, welche Wiederholung an Rest 3477 des FHA-Polypeptids beginnt; und

g) Nukleotide, die für die Sequenz VEVVPRKVET kodieren, die an den Positionen 3319 und 3350 des FHA-Polypeptids beginnt.

6. Fragment nach Anspruch 5, das zumindest 100 Basenpaare umfaßt.

7. Fragment nach Anspruch 5 oder 6, das für die RGD-SteIle an Position 1097 kodiert.

8. Isoliertes Polypeptidfragment von FHA, für das der offene Leserahmen des Nukleinsäurefragments nach einem der Ansprüche 5 bis 7 kodiert.

9. Fragment einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das für ein Peptid mit einer Länge von zumindest 12 Aminosäuren kodiert, wobei das Peptid im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz E-A-R-K-D-E gemeinsam mit ihren benachbarten Sequenzen von bis zu 100 Aminosäuren in beide Richtungen besteht.

10. Isoliertes Polypeptid mit einer Länge von zumindest 12 Aminosäuren, das ein Fragment des B.pertussis-FHA-Proteins mit 3597 Aminosäuren ist und im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz E-A-R-K-D-E gemeinsam mit ihren angrenzenden Sequenzen von bis zu 100 Aminosäuren in beiden Richtungen besteht.

11. Expressionskonstrukt, das die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder das Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 7 oder 9 umfaßt, wobei die Nukleinsäure oder das Fragment operabel mit einem Transkriptionsinitiationsbereich und einem Transkriptionsterminationsbereich verbunden ist.

12. Prokaryotische ZeIle, die transformiert ist mit:

(a) einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Fragment davon nach einem der Ansprüche 4 bis 7 oder 9, wobei die Nukleinsäure oder das Fragment an eine andere DNA-Sequenz angefügt ist als die Nukleinsäuresequenz von B.pertussis;

(b) einem Expressionskonstrukt nach Anspruch 11.

13. Prokaryotische ZeIle nach Anspruch 12, die B.pertussis ist.

14. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, für das eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 4 bis 7 oder 9 kodiert, wobei das Verfahren umfaßt: das Kultivieren einer WirtszeIle nach Anspruch 12 oder 13 unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids führen; sowie das Gewinnen des Polypeptids.

15. Impfstoff, der ein Polypeptid umfaßt, das von Antikörpern gegen das filamentöse Hemagglutinin von B.pertussis erkannt wird, das nach dem Verfahren von Anspruch 14 erhalten wird oder erhältich ist.

16. Verwendung eines Polypeptids, das nach dem Verfahren von Anspruch 14 erhalten wird oder erhältlich ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose des Körpers eines Menschen oder Tiers.