DE69231708T2

DE69231708T2 - Von analogen der choleratoxin-untereinheit abgeleitete rekombinante dna

Info

Publication number: DE69231708T2
Application number: DE69231708T
Authority: DE
Inventors: Neal Burnette; R. Kaslow
Original assignee: Amgen Inc; University of Southern California USC
Current assignee: Amgen Inc; University of Southern California USC
Priority date: 1991-05-02
Filing date: 1992-05-04
Publication date: 2001-07-05
Anticipated expiration: 2012-05-05
Also published as: IL101715A0; DK0584284T3; US5874287A; ATE199393T1; EP0584284A4; DE69231708D1; EP0584284A1; NZ242539A; JPH06507551A; GR3035724T3; EP0584284B9; WO1992019265A1; AU2293092A; AR248167A1; AU665013B2; US5770203A; ZA923162B; JP3242106B2; EP0584284B1; IL101715A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die rekombinante Expression von Analogon-Untereinheiten des Cholera-Exotoxins und auf derartigen Analoga basierende Vaccinen. Insbesondere werden durch genetische Veränderung geschaffene Modifikationen des Exotoxins Analoga von Choleratoxin bereitgestellt, die die Fähigkeit besitzen, eine schützende Reaktion mit einer verminderten oder im wesentlichen keiner katalytischen Aktivität hervorzurufen, die an der Reaktogenizität von Choleravaccinen beteiligt sein kann.

Beschreibung des Standes der Technik

Der Begriff "Cholera" betrifft die Krankheit, die durch Infektion mit dem äthiologischen Agens Vibrio cholerae hervorgerufen wird. Diese tritt am häufigsten in geographischen Gebieten auf, wo die hygienischen Bedingungen schlecht sind. Cholera ist die Hauptursache einer Morbidität und Mortalität in vielen Teilen der Welt (1, 2). Eine Zurückdrängung der Krankheit verleiht gewöhnlich einen langandauernden Schutz gegenüber einer darauffolgenden Exposition für das äthiologische Agens (3). Daher wurde intensiv versucht, eine Vaccine zu entwickeln, die ähnlich schützende Wirkung haben könnte. Eine parenterale Choleravaccine einer ganzen Zelle wurde hergestellt, jedoch wurde sie von manchen nicht mehr als hilfreich betrachtet, insbesondere für kleine Kinder, die das größte Risiko für die Erkrankung tragen (1).
Wie im Fall von vielen anderen infektiösen Erkrankungen hat ein biologisches Exotoxin (in diesem Fall "Choleratoxin" oder "CTX"), das von dem Genom des infektiösen Agens kodiert und von ihm sekretiert wird, einen großen Anteil an der Fähigkeit des Mikroorganismus, den infizierten Wirt zu kolonialisieren (4). Außerdem verursacht eine Exposition gegenüber dem Toxin einen schweren Durchfall und Erbrechen, die zu einer Dehydrierung führen, einem lebensbedrohlichen Zustand der Erkrankung (3, 5). Diese Erfahrungen legen nahe, dass eine Vaccine, die eine immunologische Reaktion (z. B. Antikörper) hervorruft, die für die Neutralisierung des Toxins ausreicht, entscheidend bei der Prävention oder Verminderung einer bakteriellen Kolonialisierung und der begleitenden Symptome wie Durchfall und Erbrechen beitragen würde. Somit wurde intensiv versucht, eine Vaccine zu entwickeln, die ein nicht-toxisches Analogon des Toxins, d. h. ein "Toxoid", enthält (1, 3-13). Man weiß, dass Choleratoxin ein Makromolekül aus vielen Untereinheiten ist. Dieses besteht aus einer als "A" bezeichneten Untereinheit mit einer "A1" genannten katalytischen Region, die G-Proteine in Zielzellen ADP-ribosyliert und ein "B"-Oligomer, das das Holotoxin an die Zielzellen bindet (6). Nicht-toxische Analoga von Choleratoxin wurden für den Zweck der Vaccine-Entwicklung auf verschiedene Art und Weise hergestellt. Diese Verfahren umfassen eine chemische Behandlung des Holotoxins oder der Toxin-Untereinheiten, eine Deletion der A- Untereinheit und die Verwendung des verbleibenden B-Oligomers und eine Synthese oder Isolation von Peptidfragmenten von Toxin-Untereinheiten (1, 3-13).
In den vergangenen Jahren wandte man sich der Entwicklung oraler Vaccinen zu, wobei zwei Richtungen scheinbar die größte Aufmerksamkeit erfuhren. Eine Richtung basiert auf der Verwendung von abgetötetem V. cholerae (d. h. chemisch oder Hitze-inaktiviert), alleine oder supplementiert mit dem B-Oligomer von Choleratoxin (1, 11, 12). Dieser Weg brachte einen unvollständigen Schutz, insbesondere bei kleinen Kindern (12). Der andere Weg umfasst die Verwendung lebender, jedoch attenuierter Stämme von V. cholerae, die die A1-Untereinheit des Toxins nicht produzieren (13). Vaccinen dieser Art stellten einen stärkeren Schutz bereit, waren jedoch bis vor kurzem auch mit inakzeptablen intestinalen Nebenwirkungen verbunden. Eine in jüngster Zeit entwickelte Vaccine, basierend auf dem V. cholerae- Stamm CVD 103-HgR, bei dem das für die A-Untereinheit kodierende Gen fehlt, scheint besser verträglich zu sein, wenigstens bei Erwachsenen (13). Jedoch wurde nach unserem Wissen diese Vaccine nicht bei Kindern oder in großen klinischen Studien getestet.
Jüngere Untersuchungen von Choleratoxin schafften Einblick in seine Struktur, die bei der Entwicklung einer Vaccine, basierend auf einem rekombinanten Verfahren, von Bedeutung sein könnte. Man weiß, dass die natürlich auftretende Untereinheit A in V. cholerae als Prä-Protein synthetisiert wird (14), das danach gespalten wird, um proteolytisch eine Signalpeptidsequenz von etwa 2160 Da zu entfernen. Die weitere post-translationelle Prozessierung ergibt ein Amino-terminales Polypeptid von etwa 21 817 Da (Untereinheit A1) und ein Carboxy-terminales Polypeptid von etwa 5398 Da (Untereinheit A2), die durch eine Disulfid-Brücke verbunden sind (6, 15, 16). Eine Reduktion der Disulfid-Brücke ist, so vermutet man, notwendig für die Katalyse der ADP-Ribosyltransferasereaktion (6, 15, 16). In ähnlicher Weise wird die B-Untereinheit als Prä-Protein synthetisiert, das darauf durch eine Protease gespalten wird, um ein Signalpeptid zu entfernen. Die Gene oder cistronischen Elemente für die A1-, A2- und B-Untereinheiten von Choleratoxin wurden alle vollständig sequenziert und in der Literatur beschrieben (16).

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1A stellt die DNA-Sequenz des cistronischen Elements dar, das für die A- Untereinheit von CTX aus dem Stand der Technik kodiert. Die Aminosäuresequenz im Ein-Buchstaben-Code unterhalb der DNA-Sequenz zeigt den vorgeschlagenen offenen Leserahmen für das A-Polypeptid. Subregionen sind ebenfalls angedeutet und zeigen den Start des Signalpeptids (prä-A), A1, zwei vorgeschlagene Stellen für eine Carboxy-terminale Prozessierung von A 1 und den vorgeschlagenen Start und die Terminierung von A2. Es ist anzumerken, dass die Literatur unschlüssig in Bezug auf die genaue Lokalisierung des Carboxy-Terminus von A1 ist (16, 17).
Fig. 1B zeigt die DNA-Sequenz des cistronischen Elements, das für die B-Untereinheit von CTX kodiert. Initiations- und Terminationskodons und vorgeschlagene Spaltstellen sind ebenfalls gezeigt. Interessanterweise überlappt der Bereich der DNA in dem Operon, der für die Termination von A 1 und die Initiation von B kodiert. Diese beiden Proteine befinden sich jedoch in verschiedenen Leserahmen.
Fig. 2 zeigt schematische Strukturen für das Prä-Protein und die prozessierten Proteinformen der A- und B-Untereinheiten von nativem CTX und die Formen der rekombinanten Untereinheiten. Das "Zickzack" an den Amino-Termini der Prä- Protein-Spezies stellt das Signalpeptid dar, das von V. cholerae entfernt wird. "M" deutet einen Amino-terminalen Methioninrest an. "(M)" deutet an, dass dies ein heterologer (nicht-nativer) Rest ist, der am Amino-Terminus der reifen, rekombinanten CTXA- und CTXA1-Untereinheiten und Analoga davon liegt. Aminosäuresequenzdaten zeigen, dass der heterologe Methioninrest nicht wesentlich von dem rekombinanten Polypeptid durch die zelluläre Methionin-Aminopeptidase abgespalten wird. "S" deutet den Schwefelrest an, der an einer Disulfid-Brücke zwischen Cysteinresten beteiligt ist. Andere ausgewählte Aminosäuren sind durch ihren Standard-Ein-Buchstaben-Code dargestellt, wobei ihre Position innerhalb des Polypeptids angegeben ist. Ausgewählte Restriktionsenzym-Spaltstellen für die kodierenden DNA-Sequenzen sind auf dem kodierten Polypeptid in ihren Standard- Drei-Buchstaben-Codes gezeigt. Natives ("n") CTXA wird, so vermutet man, in V. cholerae als Prä-Protein ("prä-A") mit einer Amino-terminalen Signalsequenz synthetisiert. Post-translationelle Prozessierung führt zur Abspaltung des Signals und ergibt reifes CTXA. Möglicherweise wird ein kleiner Teil des Carboxy-Terminus zugleich ebenfalls proteolytisch abgespalten. Das größere A-Fragment (CTXA1) und das kleinere Carboxy-terminale A-Fragment (CTXA2) werden nach der Spaltung durch eine Disulfid-Brücke zwischen dem einzelnen Cysteinrest in jedem Fragment zusammengehalten. Die Literatur enthält unterschiedliche Angaben in Bezug auf die Lage des Terminus von CTXA1 (entweder Arg¹&sup9;² oder Ser¹&sup9;&sup4;). CTXA2 beginnt vermutlich mit Met¹&sup9;&sup5;. Natives ("n") CTXB wird ebenfalls mit einer Amino-terminalen Signalsequenz synthetisiert, die sodann durch eine Protease prozessiert wird. Interessanterweise überlappt die Region des CTXB-cistronischen Elements, die für den Amino-Terminus kodiert, mit dem CTXA-cistronischen Element, das für den Carboxy-Terminus kodiert. Die kodierenden Sequenzen beinden sich jedoch in verschiedenen Leserastern (16). Rekombinantes ("r") CTXA wurde in E. coli unter der Kontrolle eines optimierten Expressionsvektors synthetisiert. Ein Oligonukleotid-Linker (NdeI-XbaI) wurde für die Klonierung des linken Endes des DNA-Elements verwendet, wobei die Sequenz für das Signalpeptid gegen ein Methionin-Initiationskodon ersetzt wurde. Die A2-Region wurde nicht von A1 in dem rekombinanten E. coli entfernt. Eine ähnliche linksseitige Klonierungsstrategie wurde für CTXB eingesetzt, mit der Ausnahme, dass ein NdeI-AccI-Fragment für die Substitution der Signalpeptid-kodierenden Sequenz gegen das Methionin-Initiationskodon verwendet wurde. Rekombinantes CTXA 1 wurde synthetisiert, um natives, reduziertes CTXA1 nachzuahmen. Dabei wurde ein Oligonukleotid-Linker am rechten Ende für die Substitution der A2-Sequenz gegen ein Terminationskodon verwendet, so dass A1 bei Ser¹&sup9;&sup4; abbricht, eine der beiden vorgeschlagenen Spaltstellen in nativem CTXA1. Eine Termination bei Arg¹&sup9;² kann ebenfalls leicht durch Verwendung der gleichen Linker-Strategie erreicht werden. Wie zuvor erwähnt, werden die Amino-terminalen Methioninreste der rekombinanten CTXA- und CTXA1-Moleküle und ihre Analoga vermutlich nicht wesentlich durch E. coli- Methionin-Aminopeptidase entfernt.
Fig. 3 zeigt das SDS-PAGE von nativen und rekombinanten CTX-Untereinheiten. Rekombinantes CTXA, CTXA1, die Arg7→Lys-Analoga von rekombinantem CTXA und CTXA1 und rekombinantes CTXB wurden in E. coli synthetisiert und Einschlusskörper, wie im Text beschrieben, hergestellt. Die Einschlusskörper-Präparationen sowie gereinigtes natives CTX, CTXA und CTXB in handelsüblicher Reinheit wurden solubilisiert und unter reduzierenden Bedingungen einem SDS-PAGE unterzogen, Spur 1, natives CTX; Spur 2, rCTXA/A7; Spur 3, rCTXA Arg7→Lys- Analogon (rCTXA/L7); Spur 4, rCTXA1/A7; Spur 5, rCTXA1 Arg7→Lys-Analogon (rCTXA1/L7); Spur 6, rCTXB; Spur 7, natives CTXB; Spur 8, natives CTXA (nur CTXA1 ist zu sehen). Nach einer Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brilliant Blue R250 gefärbt und sodann entfärbt, um die Polypeptide zu zeigen, die den Farbstoff zurückhalten.
Fig. 4 zeigt das SDS-PAGE und die autoradiographische Analyse der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität von rCTXA1 und des CTXA1-Analogons. Im Bild A wurden natives CTXA, rekombinantes CTXA1 und verschiedene Stellen-spezifische Analoga oder Präparationen von rCTXA1 einem SDS-PAGE unterzogen und mit Coomassie Blue gefärbt. Die gleichen Präparationen wurden als Enzym-Quellen für die ADP- Ribosylierung von Membran-assoziiertem G-Protein mit Hilfe von [³²P]NAD unter den im Text beschriebenen Testbedingungen verwendet. Nach dem Abstoppen der Reaktionen wurde das gesamte Reaktionsgemisch aus jeder Präparation einem SDS-PAGE unterzogen und das Gel getrocknet und autoradiographisch ausgewertet, um Proteine sichtbar zu machen, die kovalent durch das Anfügen von [³²P] markierter ADP-Ribose modifiziert waren. Bild B zeigt das Ergebnis der Tests ohne Zugabe von G-Protein-Substrat und verdeutlicht die Fähigkeit von rekombinantem CTXA 1 zur Autoribosylierung. Interessanterweise hat das Analogon CTXA1/L7 diese Reaktivität verloren. Bild C zeigt die ADP-Ribosylierung von G-Protein-Substrat, das in menschlichen Erythrozytenmembranen vorkommt. Die Zugabe dieses Substrats verändert die Reaktivität des Enzyms wesentlich von einer Eigenreaktivität (Autoribosylierung) zu einer Reaktivität mit dem Ziel-G-Protein (in dem Autoradiogramm als ribosylierte α-Untereinheit zu erkennen). Dem rCTXA1-Analogon L7 fehlt wiederum diese Reaktivität.
Fig. 5 zeigt das SDS-PAGE und die autoradiographische Analyse der ADP-Ribosyltransferase-Aktivitäten von rCTXA und dem rCTXA-Analogon, ähnlich zu den in Fig. 4 für rCTXA1 gezeigten. Da die rCTXA-Präparation signifikant weniger Aktivität als rCTXA1 besitzt (vgl. Fig. 6), vermutlich da das Erstere immer noch den nicht-gespaltenen A2-"Schwanz" an seinem Carboxy-Terminus enthält, wurden diese Autoradiogramme durch eine längere Exposition des Gels (Bild A) gegenüber dem Röntgenfilm erhalten. Bild A zeigt das gefärbte SDS-Polyacrylamidgel der rCTXA-Proteine. Im Vergleich mit Fig. 4, Bild A, wird deutlich, dass die rekombinante Expression dieser Proteine im allgemeinen geringer als die der rCTXA1-Proteine ist. Die rekombinante CTXA-Präparation war zur Auto-Ribosylierung (Bild B) und ADP-Ribosylierung des G-Proteinsubstrats in menschlichen Erythrozytenmembranen (Bild C) fähig. Diese Aktivitäten sind wesentlich geringer als bei rCTXA 1. Nichtsdestotrotz zeigen die CTXA-Präparationen das gleiche allgemeine Muster einer Inaktivierung wie die CTXA1-Gegenstücke. Wiederum besitzt das L7- Analogon (Arg7→Lys) keine ADP-Ribosylierungs-Aktivität.
Fig. 6 zeigt das SDS-PAGE und einen autoradiographischen Vergleich der ADP- Ribosyltransferase-Aktivität von rCTXA und rCTXA/L7 mit der von rCTXA1 und rCTXA1/L7. Bild A zeigt die Reaktivität ohne Substrat und Bild B mit menschlichen Erythrozytenmembranen als Substrat. Die Spuren enthalten: Spur 1: Leerwert (keine Probe in der Reaktion); Spur 2: natives CTXA ohne Harnstoff-Behandlung; Spur 3: natives CTXA mit Harnstoff-Behandlung; Spur 4: rCTXA; Spur 5: rCTXA/L7; Spur 6: rCTXA/L7 mit nativem CTXA; Spur 7: rCTXA1; Spur 8: rCTXA1/L7; Spur 9: rCTXA 1 /L7 mit nativem CTXA. Dieses Experiment zeigt, dass die rCTXA-Präparation viel weniger aktiv als rCTXA1 in Bezug auf die ADP-Ribosylierung von G-Proteinen ist (vgl. Spuren 4 und 7). Sie zeigt jedoch wesentliche Auto-Ribosylierungs-Aktivität. Die in den Fig. 4 und 5 gezeigten Daten werden dadurch bestätigt, dass eine Substitution von Arginin-7 gegen Lysin in rCTXA und rCTXA 1 ihre Ribosylierungs-Aktivitäten beseitigt, sowohl für eine Autokatalyse als auch für das G-Protein. Eine Beibehaltung der Aktivität bei Zugabe von nativem CTXA zu den Analogon-Präparationen (Spuren 6 und 9) zeigt zusätzlich, dass nicht eine Kontamination der rekombinanten Präparationen diese Aktivität unterdrückt.
Fig. 7 zeigt die ADP-Ribosylierung von H27 Fibroblasten- und Erythrozytenmembranen durch CTXA und CTXA1-Analoga. Natürlicherweise auftretendes CTXA oder rekombinante CTXA1-Analoga wurden mit [³²P]NAD und menschlichen Erythrozyten- oder H27 Fibroblastenmembranen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Gemische gefällt, zentrifugiert und die resultierenden Niederschläge einem SDS-PAGE unterzogen. Die Gele wurden mit Coomassie Blue gefärbt, getrocknet und sodann gegenüber einem Röntgenfilm für die Anfertigung von Autoradiogrammen exponiert. B: ohne CTXA oder CTXA1-Analogon; A: natürlicherweise auftretendes CTXA, A+u: natürlicherweise auftretendes, mit Harnstoff behandeltes CTXA; rA1: rekombinantes CTXA1 ohne Substitution von Resten; RBC: menschliche Erythrozytenmembranen.
Fig. 8 zeigt die ADP-Ribosylierung von H&sub2;&sub7; Fibroblasten und Membranen durch CTXA und CTXA1-Analoga. Natürlicherweise auftretendes CTXA oder rekombinante CTXA1-Analoga wurden mit [³²P]NAD in Gegenwart von menschlichen Erythrozytenmembranen, H27 Fibroblastenmembranen oder ohne Substrat-enthaltende Membranen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Gemische gefällt, zentrifugiert und die Niederschläge einem SDS-PAGE unterzogen. Die Gele wurden mit Coomassie Blue gefärbt, gewaschen und getrocknet. Das obere linke Bild ist eine Fotografie eines gefärbten Gels mit Proben, die ohne Substrat-enthaltende Membrane inkubiert wurden. Das obere rechte Bild ist ein Autoradiogramm dieses Gels. Die unteren linken und rechten Bilder sind Autoradiogramme von Gelen mit Proben, die mit Erythrozyten- bzw. H&sub2;&sub7; Membranen inkubiert wurden. B: ohne CTXA oder CTXA1-Analogon; A: natürlicherweise auftretendes CTXA; A+u: natürlicherweise auftretendes, mit Harnstoff behandeltes CTXA; rA1: rekombinantes CTXA1 ohne Substitution von Resten; RBC: menschliche Erythrozytenmembranen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein rekombinantes DNA-Molekül bereit, von dem wenigstens ein Teil ein Analogon der Region A oder der Subregion A 1 von Choleratoxin kodiert, wobei das Analogon eine Stellen-spezifische Mutation an einer oder mehreren Stellen der Region oder Subregion, ausgewählt aus Arginin-7, Arginin- 11, Asparaginsäure-9, Histidin-44, Histidin-70 und Glutaminsäure-112 oder eine Verkürzung des Carboxy-terminalen Teils, beginnend bei Tryptophan-179, umfasst, und wobei das Analogon eine verminderte oder keine katalytische Aktivität besitzt, die mit einer Reaktogenizität von Choleratoxin in Verbindung steht, wie bestimmt durch einen Test der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität. Das Analogon besitzt eine verminderte enzymatische Aktivität, wobei eine derartige Aktivität im allgemeinen mit der Reaktogenizität einer Vaccine in Verbindung steht. Insbesondere führt eine Stellen-spezifische Mutagenese wie hier beschrieben zu Analoga der A- und A1-Untereinheiten, die im Vergleich zu den nativen Toxin-Gegenstücken eine signifikante Verminderung der katalytischen Funktion aufweisen, wie bestimmt durch die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität.
Der Begriff "katalytische Untereinheit von Choleratoxin" betrifft erfindungsgemäß die A-Region von Choleratoxin und die A 1-Subregion, wie in den Fig. 1A und 2 gezeigt. Diese Regionen des Choleratoxin-Makromoleküls besitzen bekanntlich katalytische ADP-Ribosyltransferase-Aktivität (6). Dieses Enzym ist ein Komplex von zwei Unter-Aktivitäten: eine NAD-Glykohydrolase-Aktivität, die NAD in Nikotinamid und ADP-Ribose spaltet, und eine Transferase-Aktivität, die ADP-Ribose auf das G-Protein-Substrat überträgt. Messungen der ADP-Ribosyltransferase- Aktivität stellt hier eine Summierung beider Aktivitäten dar. Die vorliegende Erfindung umfasst mutagenisierfe Versionen dieser A- und A1-Polypeptide und Analoga oder Derivate derartiger Polypeptide, die in ihren nativen Formen Quellen der katalytischen Aktivität des Choleratoxin-Multimers sind.
Die genetisch veränderten Analoga von Choleratoxin, die ein erfindungsgemäßes Produkt darstellen, stellen rekombinante, von DNA abgeleitete Materialien dar, die für eine Verwendung in Vaccinen für die Prävention der Choleraerkrankung geeignet sind. Die A- und A1-Untereinheiten-Analoga können alleine oder in Kombination mit dem B-Oligomer in einer auf dem Toxoid basierenden Vaccine oder in einer phänotypischen Expression durch Varianten von V. cholerae oder ein einer phänotypischen Expression unter der genetischen Kontrolle anderer immunisierender Faktoren verwendet werden. Die erfindungsgemäßen analogen A- und A1-Untereinheiten sind selbst als antigene Stoffe in einer Vaccine verwendbar, da sie wichtige schützende Epitope enthalten können. Jedoch kann die Verwendung dieser Analoga in Verbindung mit B-Untereinheiten eher gewünscht sein. Das B-Oligomer enthält neutralisierende Epitope, die für die Erzeugung einer Immunoprotektion nützlich sind (1, 3, 5). Eine Assoziierung der A-Untereinheit mit dem B-Oligomer kann zu einer wirksameren immunogenen Reaktion gegen das B-Oligomer führen. Das B-Oligomer kann aus V. cholerae gereinigt werden oder alternativ, ähnlich zu den A- und A 1-Untereinheiten, rekombinant durch Expression in E. coli oder anderen rekombinanten Wirten, einschließlich anderen bakteriellen Organismen (z. B. Salmonella typhimurium oder typhi, Bacillus sp.), Hefe (z. B. S. cerevisiae) und Viren (z. B. Vaccinia- und Adenoviren) abgeleitet werden.
Eine Mutagenese gemäß dieser Beschreibung ermöglicht die Produktion von Mutanten, die sich durch eine geringere katalytische Aktivität unterscheiden. Dabei besitzen die Varianten eine geringere Aktivität bis hin zu im wesentlichen keiner Aktivität (d. h. weniger als 5%). Diese Flexibilität ist gewünscht, da eine Verringerung der katalytischen Aktivität eher als eine Beseitigung hilfreich bei der Bereitstellung einer stärkeren und/oder länger dauernden schützenden Reaktion sein kann. Außerdem sind die Analogon-Untereinheiten, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden, erwartungsgemäß weniger reaktogen, aufgrund ihrer geringeren enzymatischen Aktivität.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung stellt eine direkte rekombinante Expression bei großen Mengen von allen CTX-Untereinheiten, die für die Herstellung einer Vaccine notwendig sind, bereit. Ferner bieten die Analoga der katalytischen Untereinheit eine biologische Aktivität, bei der die katalytische ADP-Ribosyltransferase-Aktivität vermindert oder im wesentlichen beseitigt ist. Die erfindungsgemäßen Analoga, die alleine oder in Kombination mit dem B-Oligomer des Toxins (entweder abgeleitet von natürlichen Quellen oder durch rekombinante Verfahren) verwendet werden, können Produkte bereitstellen, die in einer Vaccine verwendbar sind und stark die Möglichkeit von Nebenwirkungen verringern, die im allgemeinen mit der katalytischen Aktivität des nativen Toxins assoziiert sind. Die erfindungsgemäßen Toxin- Analoga können in Vaccine-Zusammensetzungen formuliert oder in Kombination mit anderen immunogenen Stoffen in einer Multikomponenten-Vaccine verwendet werden.
Die einzelnen cistronischen Elemente oder Teile davon, die die α- und β-Untereinheiten des V. cholerae-Toxins kodieren, wurden subkloniert und direkt einzeln in einem rekombinanten Wirtszellsystem (d. h. E. coli) exprimiert. Bei Fehlen eines nativen Signalpeptids (durch einen Methioninrest ersetzt, um eine Translation zu initiieren) wurden hohe Expressionsmengen im Bereich von 2% bis 80% des zellulären Gesamtproteins erhalten. Die Fermentation von exprimierenden Zellen führte zu reifen Spezies von rCTXA, rCTXA1 und rCTXB, wie in Fig. 3 gezeigt. rCTXA wird in E. coli nicht zu rCTXA1 und rCTXA2 prozessiert, vermutlich aufgrund des Fehlens des spezifischen Enzyms oder des Versagens von rCTXA, gemeinsam mit diesem Enzym in einem Kompartiment eingeschlossen zu werden. Somit ist bei rCTXA die A1-Sequenz kovalent mit der A2-Sequenz verbunden.
Eine Aminosäure-Analyse ausgewählter rekombinanter Moleküle zeigte, dass der heterologe (nicht-native) Methioninrest im wesentlichen nicht von den verschiedenen rCTX- und rCTXA1-Untereinheit-Spezies durch zelluläre Methionin-Aminopeptidase entfernt wird. Somit sind diese auch reife Methionin-Analoga. Alle rekombinanten Proteine wurden als Einschlusskörper aus lysierten Zellen gewonnen. Die Untereinheiten besaßen Laufeigenschaften in einem reduzierenden SDS- PAGE, die im wesentlichen identisch zu denen der authentischen, nativen Untereinheiten waren, mit der Ausnahme von rCTXA, das in E. coli nicht prozessiert wird, um die A2-Region von A1 abzuspalten. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde eine rekombinante Expression der Untereinheiten CTXA, CTXA1 und CTXB in großen Mengen in E. coli durch direkte Verfahren ohne Fusion erreicht.
Obwohl alternative Verfahren und Materialien für die Durchführung der Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben.

Materialien und Verfahren für eine rekombinante Expression der CTXA-, CTXA1- und CTXB-Untereinheiten

Materialien. DNA-Modifikationsenzyme wurden von New England Biolabs (Beverly, MA), Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD), Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN) und International Biotechnologies, Inc. (New Haven, CT) erworben. Die Enzyme wurden gemäß den Herstellerempfehlungen eingesetzt. Alle Chemikalien und Biochemikalien waren von analytischer Reinheit. Gereinigtes, natürlicherweise vorkommendes Choleratoxin und Toxin-Untereinheiten wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) und List Biologicals (Campbell, CA) gekauft. Synthetische Oligonukleotide wurden basierend auf Verfahren synthetisiert, die ausgehend von dem chemischen Verfahren von Matteucci und Caruthers (18) entwickelt worden waren.
Plasmide und Bakterienstämme. Die Plasmide pRIT10810 und pRIT10841 (ATCC 39051 bzw. ATCC 39053) mit Teilen des CTX-Operons wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, erhalten. Expressionsplasmide pCFM 1036, pCFM 1146 und pCFM 1156 wurden bei Amgen abgeleitet.
Eine Beschreibung des hier verwendeten Expressionsvektorsystems findet sich in der US-PS Nr. 4,710,473. Solche Plasmide enthalten einen induzierbaren Promotor, eine synthetische Ribosomen-Bindestelle, eine Gruppe von Klonierungsstellen, einen Plasmid-Replikationsursprung, einen Transkriptions-Terminator, Gene für die Regulation der Kopienzahl des Plasmids und ein Kanamycin-Resistenzgen. Die abgeleiteten Plasmide unterscheiden sich voneinander in einer Reihe von Merkmalen. Das Plasmid pCFM 1036 kann von pCFM836 (vgl. US-PS 4,710,473) durch Substitution der DNA-Sequenz zwischen den einzelnen AstII- und EcoRI-Restriktionsstellen mit dem synthetischen PL-Promotor durch das nachstehende Oligonukleotid abgeleitet werden:
Dieses Plasmid enthält keinen induzierbaren Promotor, der der Gruppe von Restriktionsstellen vorausgeht. Das Plasmid pCFM 1146 kann von pCFM836 durch Substitution der kleinen DNA-Sequenz zwischen den einzelnen Clal- und XbaI- Restriktionsstellen durch das nachstehende Oligonukleotid
und Zerstörung der zwei endogenen NdeI-Restriktionsstellen durch Auffüllen der Enden mit T4-Polymerase-Enzym, gefolgt von Ligation der stumpfen Enden, abgeleitet werden. Das Plasmid enthält keine synthetische Ribosomen-Bindestelle unmittelbar vor der Gruppe von Restriktionsstellen. Das Plasmid pCFM 1156 kann von pCFM 1146 durch Substitution der kleinen DNA-Sequenz zwischen den einzelnen XbaI- und KpnI-Restriktionsstellen durch das nachstehende Oligonukleotid, das eine optimierte synthetische Ribosomen-Bindestelle einbringt, abgeleitet werden:
Die Plasmide pBR322, pUC 18, pUC 19 und die Phagen-DNA M13mp 18 und M13mp 19 wurden von Bethesda Research Laboratories gekauft. E. codi FM5-Zellen wurden bei Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, von dem E. coli-Stainm K-12 (19) von C. F. Morris abgeleitet und sie enthalten das integrierte lambda-Phagen-Repressorgen, CI&sub8;&sub5;&sub7; (20). Eine Konstruktion der Expressionsplasmide für die einzelnen Untereinheiten ist hier beschrieben. Die Herstellung der Vektoren, Zelltransformation und Selektion von Kolonien erfolgte in an sich bekannter Weise (21).
Analytische Verfahren. DNA-Sequenzierung erfolgte durch Modifizierung des Primer-Verlängerungs-, Ketten-Terminationsverfahrens (22, 23). Proteinsequenzanalysen erfolgten durch automatischen Edman-Abbau in einem ABI 470A- Gasphasen-Mikrosequenziergerät (24, 25) und durch enzymatische Standardverfahren, wobei die letzteren zur Schaffung carboxy-terminaler Sequenzen ausgewählter Proteine dienten. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) erfolgte im wesentlichen wie von Lämmli (26) beschrieben und die Elution von Polypeptiden aus Polyacrylamidgelen war ähnlich zu Hunkapillar et al. (27). Das Verhältnis von rekombinantem Protein zu zellulärem Gesamtprotein oder Gesamt- Einschlusskörperprotein wurde durch SDS-PAGE von Gesamtzelllysaten, gefolgt durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue R250 und darauffolgendes Gel-Scanning durch integrative Densitometrie bewertet.
Tests einer Messung der katalytischen ADP-Ribosyltransferase-Aktivität wurden wie folgt durchgeführt: natives CTXA und rekombinante Untereinheiten wurden in einem Solubilisierungspuffer mit 8 M Harnstoff, 25 mM Natriumphosphat (pH 7,0) und 10 mM Dithiothreit (DTT) 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und bei 10 000 Upm 15 Minuten ohne Kühlung zentrifugiert. Die Zugabe des Solubilisierungspuffers erfolgte bis zu 1 ug nativem oder rekombinantem A1 pro 4 ul und wurde sodann zu 60 ul eines Reaktionsgemisches (vgl. nachstehend) hinzugegeben und 1 Stunde auf Eis inkubiert. Reaktionsgemisch
*Die Reagenzien waren käuflich erhältlich. Natürlicherweise vorkommendes CTXA wurde von List Laboratories bezogen. Als Kontrolle wurde auch natives CTXA durch Inkubation für 15 Minuten bei 37ºC in dem gleichen Puffer wie vorstehend beschrieben, jedoch ohne Harnstoff, getestet und sodann auf Eis bis zu einem Testen der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität gelagert.
36 ul Wasser oder Puffer mit menschlichen Erythrozytenmembranen (28) wurden hinzugegeben, um ein Endvolumen von 100 ul in jeder Probe zu ergeben und die Proben wurden bei 30ºC inkubiert. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 5 mM NAD und 0,03% Natriumdesoxycholat zu jeder Probe gestoppt und das Reaktionsgemisch 10 Minuten auf Eis abgekühlt. 50 ul 40% Trichloressigsäure (TCA) wurden sodann hinzugegeben, die Proben wenigstens 15 Minuten auf Eis gestellt, 2 ml Wasser sogleich zu jeder Probe hinzugegeben und das präzipitierte Protein durch Zentrifugation gefällt. Die Überstände wurden entfernt und das gefällte Protein eingefroren. Am darauffolgenden Tag wurde das gefällte Protein einem SDS-PAGE unterzogen (26, 29). Das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt, entfärbt, getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen, um den Gehalt an kovalent gebundener [³²P]-markierter ADP-Ribose in den Proteinen der verschiedenen Banden zu messen. Eine Annäherung der spezifischen Aktivitäten des rekombinanten CTXA1 und der rekombinanten analogen CTXA1- Proteine (im Vergleich zur Aktivität von nativem CTXA1) wurde durch densitometrisches Scanning der Gele und Autoradiogramme erhalten. Die gefärbten Gele wurden gescannt, um die Menge des jeweiligen Proteins abzuschätzen, das zu jedem Reaktionsgemisch hinzugegeben wurde. Die Autoradiogramme wurden gescannt, um als Funktion der Dichte des autoradiographischen Bilds die Menge von [³²P] ADP-Ribose abzuschätzen, die auf das G-Protein-Substrat übertragen wurde.
Herstellung von Expressionsplasmiden. Alle Expressionsplasmide wurden aus einer Serie von allgemeinen E. coli-Expressionsvektoren konstruiert, die sich wie zuvor beschrieben unterscheiden. Die einzelnen Choleratoxin-Untereinheiten-Gensegmente wurden mit Hilfe der in den Fig. 1 und 2 gezeigten Restriktionsstellen isoliert. Die stromaufwärts gelegene Restriktionsstelle lag gerade innerhalb des Kodons für den Amino-terminalen Rest der reifen, prozessierten Form der Untereinheit (d. h. ohne die Signalsequenz). Für eine rekombinante Expression in E. coli wurde der Teil der CTX-Gene, der für ihre nativen Signalpeptide kodiert, entfernt und anstelle dessen durch ein Methionin-Initiationskodon für eine Expression der "reifen Methionin-Form" der Untereinheit-Analoga ersetzt. Synthetische Oligonukleotid-Linker wurden für eine Insertion der Gensegmente in die Expressionsplasmide bei einer optimalen Entfernung stromabwärts des synthetischen Promotors und der Ribosomen-Bindestelle eingesetzt. Die stromaufwärts gelegenen Linker stellten den Leserahmen eines jeden Gens in Bezug auf das erste Kodon des reifen Amino-Terminus wieder her. Die Oligonukleotide enthielten ein Methionin-Initiationskodon.
Nach der Transformation von E. coli FM5-Zellen mit den verschiedenen Plasmid- Konstrukten und Ausplattieren auf Kanamycin-enthaltendem Agar wurde eine geeignete Anzahl von Kolonien ausgewählt, Replika-plattiert, als kleine Flüssigkulturen ("Minipreps") vermehrt und 4 Stunden bei 42ºC induziert. Die Minipreps wurden sodann mit Hilfe eines Lichtmikroskops in Bezug auf das Auftreten von Einschlusskörperchen in den Bakterienzellen gescreent. Präparationen mit Einschlüssen wurden identifiziert und die dazupassenden Kolonien von den Replikaplatten in Flaschen bei der Induktionstemperatur fermentiert. Proben wurden aus der Fermentation zu verschiedenen Zeiten nach der Induktion entfernt und in Bezug auf das Auftreten der richtigen CTX-Untereinheit durch SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie Brilliant Blue-Färbung untersucht. Die Struktur des Plasmids eines jeden Expressionsklons wurde durch Restriktionskartierung des isolierten Plasmids bestätigt und durch DNA-Sequenzierung der Verbindungsregionen verifiziert.
Expression von rekombinantem CTX, CTXA1 und CTXB. Falls E. coli-Zellen mit dem getrennt enthaltenen CTXA-Expressionsplasmid (pCTXA/A7/ 1156), dem CTXA1-Expressionsplasmid (pCTXA1/A7/1156) und dem pCTXB-Expressionsplasmid (pCTXB/ 1156) bei 37ºC und 42ºC fermentiert wurden, produzierten sie hauptsächlich intrazelluläre Proteine bei etwa 27 215 Dalton, 21 817 Dalton bzw. 11 600 Dalton (Fig. 3). Rekombinantes CTXA1 und CTXB wanderte auf der gleichen Höhe mit authentischem (nativem) CTXA1 bzw. CTXB in einem SDS-PAGE.
Unser rekombinantes CTXA besitzt kein natives Gegenstück, da natürliches CTXA zu CTXA1 und CTXA2 durch V. cholerae-Protease vor Sekretion aus dem Organismus gespalten wird. A1 und A2 werden durch eine Disulfid-Brücke, die durch die in dem SDS-PAGE verwendeten Puffer reduziert wird, zusammengehalten. Eine partielle Aminosäuresequenz-Analyse zeigte, dass die rekombinanten Polypeptide CTXA1/A7 und CTXA1/L7 (vgl. nachstehende Beschreibung) die für die native CTXA1-Untereinheit vorhergesagte Amino-terminale Sequenz besaßen und dass jedoch der heterologe Methionin-Initiationsrest nicht wesentlich entfernt wird.

Eigenschaften der rekombinanten CTX-Untereinheiten

Nur geringe Mengen, falls überhaupt, der CTX-Untereinheiten scheinen von den E. coli-Zellen sekretiert zu werden. Das Meiste einer jeden Untereinheit wurde in Form von Einschlusskörperchen aufgefunden und stellte 2% bis 80% des zellulären Gesamtproteins dar. Eine Zelllyse durch French-Press und Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit führte zu Niederschlagsfraktionen, die bis zu 80% der einzelnen Untereinheiten als Protein enthielten. Alle rCTX-Untereinheiten waren in den mit Coomassie Brilliant Blue-gefärbten Gelen nachweisbar (Fig. 3).

CTXA- und CTXA1-Analoga

Mit Hilfe von Protein-Engineering-Verfahren und Stellen-spezifischer Mutagenese (19, 30) wurden die CTXA- und CTXA1-Analoga hergestellt. Unter den bis zur Einreichung hergestellten und getesteten Analoga stellte sich heraus, dass eine Mutagenese der Aminosäurereste an den Positionen Arginin-7, Histidin-44, Histidin-70, Glutaminsäure-112 und Asparaginsäure-9 und eine Verkürzung des Carboxy-Terminus (bei Tryptophan-179 der reifen, nativen CTXA-Sequenz) zu einer verringerten oder im wesentlichen fehlenden ADP-Ribosyltransferase-Aktivität führte.

Herstellung des CTXA-Expressionsplasmids

Das Plasmid pRIT10841 (ATCC 39053) wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und ClaI gespalten und ein 552 bp-DNA-Fragment, das das linksseitige Ende des CTXA-Gens bis zu der Region, die für den Protease-sensitiven Teil kodiert, der zu einer Spaltung von CTXA zu CTXA1 und CTXA2 führt, durch Gelelektrophorese isoliert. Das Plasmid pRIT10810 (ATCC 39051) wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI und HindII (das Letztere ist ein Isoschizomer von HincII) gespalten und ein 368 bp-DNA-Fragment, das einen Teil der CTXA-Untereinheit von der Protease-sensitiven Stelle (kodiert bei der ClaI-Stelle) (16, 17) über die CTXA2-Region, über das Terminationskodon von CTXA hinaus und in den alternativen offenen Leserahmen der CTXB-Untereinheit kodiert, wurde isoliert.
Ein synthetischer Oligonukleotid-Linker wurde hergestellt, um den offenen Leserahmen von CTXA, von der Stelle, die die erste Aminosäure der reifen Proteinsequenz (Asparagin) kodiert, bis zur XbaI-Stelle, wiederherzustellen. Dieser Linker besaß NdeI-Kohäsivität an seinem links gelegenen Ende für die Herstellung eines Methionin-Initiationskodons, das die für das Signalpeptid kodierende Sequenz ersetzt, und um eine Insertion des Genkonstrukts in den Expressionsvektor zu erleichtern. Das rechts gelegene Ende des Linkers enthielt eine XbaI-Überlappung. Dieser Linker besaß die folgende Sequenz:
Das Plasmid pUC19 wurde mit NdeI und XbaI verdaut und der vorstehende Linker inseriert. Nach Ligation und Transformation wurde ein pUC-Plasmid mit dem Namen p2A/pUC19 isoliert, das die Linker-Sequenz anstelle der normalen NdeI- Xbal-Sequenz von pUC 19 enthielt.
Das Plasmid p2A/pUC19 wurde mit XbaI und HincII verdaut. Das große Fragment dieses Verdaus wurde mit dem 552 bp-XbaI-ClaI-DNA-Fragment, das das links gelegene Ende des CTXA-Gens enthält, und dem 368 bp-ClaII-HindII-DNA-Fragment, das das rechts gelegene Ende des CTXA-Gens (nach dem Terminationskodon und in den alternativen offenen Leserahmen der CTXB-Untereinheit) enthält; ligiert. Dies schufein neues Plasmid mit dem gesamten reifen CTXA-Gen und wurde pCTXA/A7/pUC19 genannt.
Das E. coli-Expressionsplasmid pCFM I 156 wurde mit NdeI und HindIII gespalten, um einen kleinen Teil seiner Klonierungsstelle zu entfernen. Das Plasmid pCTXA/A7/pUC19 wurde ebenfalls mit NdeI und HindIII gespalten und ein DNA- Fragment (772 bp) mit der gesamten Region des CTXA-Gens isoliert. Dieses Fragment wurde darauf in das gespaltene pCFM1156-Plasmid ligiert, um das CTXA- Expressionsplasmid pCTXA/A7/1156 herzustellen. Dieses NdeI-NdeI-Fragment könnte in pCFM 1156 in einer von zwei Richtungen inseriert werden, von denen nur eine zu einem offenen Leserahmen führen würde, der bei einer Expression ein großes Protein bildet. Dieser Klon wurde selektiert (durch Analyse von induzierten Klonen durch SDS-PAGE, um das rekombinante CTXA-Protein zu identifizieren) und die richtige Orientierung durch DNA-Sequenzierung der stromaufwärts gelegenen NdeI-Verbindungsregion bestätigt.

Herstellung des CTXB-Expressionsplasmids

Das Plasmid pRIT10810 (ATCC 39051) wurde mit ClaI und BstXI gespalten und ein 538 bp-DNA-Fragment isoliert. Dieses enthielt die A2-kodierende Region von CTXA, die gesamte CTXB-kodierende Region und eine kurze DNA-Sequenz rechts vom Terminationskodon von CTXB.
Ein synthetischer Oligonukleotid-Linker wurde hergestellt, der die Klonierung des rechts gelegenen Endes der vorstehenden DNA-Sequenz in pUC 19 ermöglichte. Dieser Linker besaß BstXI- und HindIII-kohäsive Enden und die folgende Sequenz:
Das Plasmid pUC 19 wurde mit HindIII und AccI gespalten (das Letztere schufein kohäsives Ende, das kompatibel mit dem durch ClaI geschaffenen war). Das große pUC 19-Fragment wurde mit dem 538 bp-ClaI-BstXl-DNA-Fragment, das CTXB enthielt, und dem BstXI-HindIII-Linker ligiert, um das als pCTXB/pUC19 bezeichnete Plasmid herzustellen. Dieses Plasmid wurde sodann mit HindIII und SspI gespalten (das Letztere spaltet gerade innerhalb des Initiationskodons für CTXB und stromabwärts von der ClaI-Stelle), um ein 345 bp-SspI-HindIII-Fragment zu isolieren.
Ein synthetischer Oligonukleotid-Linker wurde hergestellt, der NdeI- und SspIkohäsive Enden und die folgende Sequenz besaß:
Das Plasmid pCFM1156 wurde mit NdeI und HindIII gespalten, um diesen Teil seiner Klonierungsstelle zu entfernen. Das große pCFM1156-DNA-Fragment wurde sodann mit dem 345 bp-SspI-HindIII-Fragment, das einen Teil des CTXB-Gens enthielt, und dem NdeI-SspI-Linker ligiert, der die links gelegene kodierende Region wiederherstellte und ein Methionin-Kodon am linken Ende dieser kodierenden Region einbrachte, um eine Proteinsynthese zu initiieren. Das geschaffene Expressionplasmid mit dem gesamten CTXB-Gen und einem Methionin-Initiationskodon wurde pCTXB/1156 genannt.
Linker-Mutagenese. Ein Oligonukleotid-Linker, genannt L7, wurde synthetisiert, um das Kodon für Arginin-7 in CTXA gegen ein Lysin-Kodon auszutauschen. Die Sequenz dieses Linkers mit NdeI- und XbaI-kohäsiven Enden ist in Tabelle 1 gezeigt. Der L7-Linker wurde in die NdeI-XbaI-Stelle von pUC 19 kloniert, um ein als pL7/pUC19 bezeichnetes Plasmid herzustellen. Das Plasmid pL7/pUC19 wurde sodann mit XbaI und HindIII gespalten, um diesen Teil der Klonierungsstelle von pUC 19 zu entfernen und er wurde durch Ligation mit dem 552 bp-XbaI-ClaI-DNA-Fragment, das das links gelegene Ende des CTXA-Gens enthält (vgl. oben), und dem 368 bp-ClaI-HindII-DNA-Fragment, das das rechts gelegene Ende dieses Gens enthält (vgl. oben), ersetzt. Dieses Plasmid, genannt pCTXA/L7/pUC 19, wurde mit NdeI gespalten und ein 772 bp-DNA-Fragment isoliert, das das gesamte reife CTXA-Gen mit einer Substitution des Kodons für Arginin-7 durch ein Lysin-Kodon enthielt. Das Plasmid pCFM 1156 wurde mit NdeI gespalten und mit dem NdeI-DNA-Fragment aus pCTXA/L7/pUC 19 ligiert. Diese Ligation schufein als pCTXA/L7/ 1156 bezeichnetes Plasmid für die Expression der reifen Form eines Arg7→Lys-Analogons von CTXA in E. coli. Wie im Falle von pCTXA/A7/ 1156 (vgl. oben) war es notwendig, einen Klon zu selektieren, der dieses Plasmid mit dem DNA-Insert in dem richtigen offenen Leserahmen für eine Synthese von rCTXA/L7 enthielt.
Die Oligonukleotid-Linker 1E und 1F wurden synthetisiert, um jeweils das Kodon für Tyrosin-6 gegen ein Phenylalanin-Kodon bzw. das Kodon für Asparaginsäure-9 gegen ein Glutaminsäure-Kodon zu ersetzen. Diese Linker enthielten NdeI- und XbaI-kohäsive Enden und besaßen die in Tabelle 1 gezeigten Sequenzen. Das Plasmid pCTXA/A7/pUC19 (siehe oben) wurde mit Xbal und HindIII gespalten und ein 938 bp-DNA-Fragment mit dem rechts gelegenen Teil des CTXA-Gens isoliert. Das Plasmid pCFM 1156 wurde mit NdeI und HindIII gespalten, um diese kurze Region seiner Klonierungsstelle zu entfernen. Dieses Segment wurde durch Ligation mit dem NdeI-XbaI-Linker, der die Tyr6→Phe oder die Asp9→Glu-Kodonmutation (Linker 1E bzw. 1F) enthielt, und dem 938 bp-DNA-Fragment des CTXA-Gens ersetzt. Dadurch wurden zwei Plasmide, pCTXA/1E/1156 und pCTXA/1F/1156, für die Expression der reifen Formen der CTXA-Analoga Tyr6-> Phe bzw. Asp9-*Glu in E. coli hergestellt.
Die Substitutionen von Sequenzen, die Mutationen von Prolin-185 gegen Glutamin und Cystein-187 gegen Alanin kodierten, führten zu CTXA-Genfragmenten, die nur den CTXA1-Teil der CTXA-Untereinheit kodierten (vgl. unten für die Herstellung des CTXA1-Gens mit der nativen Sequenz und die L7-, 1E- und 1F-Substitutions- Analoga von CTXA1 aus dem CTXA-Gen bzw. seiner Substitutions-Analoga). Die Oligonukleotid-Linker 1G und 1H wurden synthetisiert, um jeweils Prolin-185 gegen Glutamin und Cystein-187 gegen Alanin zu ersetzen. Diese Linker besaßen DsaI- und HindIII-kohäsive Enden und die in Tabelle 1 gezeigten Sequenzen. Für die Herstellung der für die analogen Proteine kodierenden Expressionsplasmide wurde in 537 bp-NdeI-DsaI-DNA-Fragment aus dem Plasmid pCTXA/A7/pUC 19 isoliert. Das Plasmid pCFM 1156 wurde sodann mit NdeI und HindIII gespalten, um dieses kurze Segment aus seiner Klonierungsstelle zu entfernen. Dieses Segment wurde durch Ligation mit dem 537 bp-DNA-Fragment aus pCTXA/A7/pUC19 und mit dem 1G- oder 1H-synthetischen Oligonukleotid ersetzt. Die Linker beseitigen zusätzlich dazu, dass sie die spezifischen Aminosäure-Substitutionen kodieren, den Teil aus dem CTXA-Gen, der für die A2-Region der CTXA-Untereinheit kodiert. Somit befinden sich diese Mutationen ausschließlich in CTXA1-Versionen der Untereinheit. Die resultierenden Plasmide für die Expression der Pro185→Gln und Cys187→Ala-Analoga von CTXA1 wurden pCTXA1/1G/1156 bzw. pCTXA1/1H/1156 genannt.
Ein Plasmid wurde konstruiert, das eine carboxy-terminal verkürzte Version von CTXA1 exprimierte, die bei Trp179 abbrach. Dazu wurde zuerst das Plasmid pCFM 1156 mit NdeI und Hindlil gespalten, um dieses kurze DNA-Fragment zu entfernen. In diese Stelle von pGFM 1156 wurde das 537 bp-NdeI-Dsal-Fragment aus pCTXA/A7/pUC19 (vgl. oben) und ein synthetisches DNA-Fragment mit DsaI- und HindIII-kohäsiven Enden mit der folgenden Sequenz ligiert:
Dieses Plasmid für die Expression an Trp¹&sup7;&sup9; verkürzten CTXA1 wurde pCTXA1/T1/1156 genannt.

Mutagenese durch Stellen-spezifisches Priming

Mutagenese durch Stellen-spezifisches Priming erfolgte mit Kits des "Altered SitesTM in vitro Mutagenesis System", die von Promega Corporation (Madison, WI) erworben wurden. Details der experimentellen Vorgehensweise bei diesen Verfahren finden sich in der von Promega Corporation verfügbaren technischen Anleitung (gedruckt 1/90).
Für die Ermöglichung der Mutagenese wurde ein 938 bp-XbaI-HindIII-DNA-Fragment, das für einen Teil der CTXA-Untereinheit kodiert, aus dem Plasmid pCTXA/A7/pUC19 (vgl. oben) isoliert. Dieses Fragment wurde in den pSELECT1- Phagemid-Vektor von Promega kloniert. Nach Verpackung in Helfer-Phagen enthielt dieser Vektor eine Kopie des CTXA-Fragments in negativer Orientierung. Eine Serie von einzelsträngigen DNA-Primern in positiver Orientierung wurden für die Mutagenese synthetisiert. Die Sequenzen dieser Primer (1B, 1C, 1D und 1I) sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Primer wurden jeweils mit dem einzelsträngigen Phagemid mit dem CTXA-Genfragment hybridisiert. Doppelsträngige Phagemide wurden sodann hergestellt, die das Genfragment und die einzelnen Kodon-Substitutionen, die von den Primern kodiert werden, enthielten.
Für die Herstellung von Plasmiden, die zur Expression der CTXA- und CTXA1- Untereinheiten-Analoga mit einer Substitution von Arginin-146 gegen Lysin fähig sind, wurde ein 207 bp-BstXI-ClaI-DNA-Fragment aus dem doppelsträngigen Phagemid mit der Arg146→Lys-Kodonmutation (11) isoliert. Ein 375 bp-NdeI-BstXI-DNA- Fragment und ein 386 bp-ClaI-HindIII-Fragment (für die CTXA-Version) mit einem Teil des CTXA-Gens wurden aus dem Plasmid pCTXA/A7/pUC19 isoliert. Das Plasmid pCFM1156 wurde mit NdeI und HindIII gespalten, um diesen kleinen Teil aus seiner Klonierungsstelle zu entfernen. Für die Konstruktion der CTXA-Version der Arg146→Lys-Mutation wurde das gespaltene pCFM1156-Plasmid mit dem 375 bp-NdeI-BstXI-Fragment aus pCTXA/A7/pUC19, dem 209 bp-BstXI-ClaI-Fragment aus dem doppelsträngigen Phagemid und dem 386 bp-ClaI-HindIII-DNA-Fragment aus pCTXA/A7/pUC19 ligiert. Dies führte zu einem als pGTXA/1I/1156 bezeichneten Plasmid für die Expression des Arg146→Lys-Analogons der CTXA-Untereinheit in E. coli. Für die Herstellung dieser Mutation in der CTXA1-Version der Untereinheit wurde das gespaltene pCFM1156-Plasmid mit dem 375 bp-NdeI-BstXI-Fragment aus pCTXA/A7/pUC19, dem 209 bp-BsIXI-ClaI-Fragment, das aus dem doppelsträngigen Phagemid isoliert worden war, und einem synthetischen Oligonukleotid-Linker ligiert, der eine Region von CTXA, die für den A2-Teil von CTXA kodiert, durch eine DNA-Sequenz ersetzt, die für das Ende der A1-Region kodiert und die ein Kodon enthält, das die Polypeptidsynthese am Ende von CTXA1 terminiert.
Dieser Linker besaß ClaI- und HindIII-kohäsive Enden und die folgende Sequenz:
Das resultierende Plasmid für die Expression des Arg146→Lys-Analogons von CTXA1 in E.coli wurde pCTXA1/1I/1156 genannt.
Die Herstellung von Plasmiden, die zur Expression einzelner Analoga von CTXA mit His44→Asn-, His70→Asn- oder Glu112→Gln-Substitutionen wurde mit den Primern ermöglicht, deren Sequenzen in Tabelle 1 gezeigt sind (1B, 1C bzw. 1D). Nach der jeweiligen Hybridisierung der Primer an das pSELECTl-Phagemid mit dem 938 bp- XbaI-HindIII-CTXA-Fragment aus pCTXA/A7/pUC19 (vgl. oben) und Wiedergewinnung von doppelsträngigem Plasmid wurden die Regionen mit den Stellen-spezifischen Mutationen aus dem Plasmid durch Spaltung mit XbaI und HindIII herausgeschnitten und ein 938 bp-DNA-Fragment in jedem Fall wiedergewonnen. Das Plasmid p2A/pUC19 (mit einem NdeI-XbaI-Linker, der für das linksseitige Ende des reifen CTXA kodiert; vgl. oben) wurde mit XbaI und HindIII gespalten, um diese kurze Region aus der Klonierungsstelle von pUC 19 bis zum rechten Ende des Linker-Inserts zu entfernen. Diese Region wurde durch Ligation mit dem 938 bp-Xbal- HindIII-Fragment aus dem Plasmid mit einem Austausch eines einzigen Kodons ersetzt. Diese Serien von pUC-abgeleiteten Plasmiden wurden als pCTXA/1B/pUC 19, pCTXA/1C/pUC 19 und pCTXA/1D/pUC 19 bezeichnet, abhängig von dem darin enthaltenen Kodon-Austausch. Ein DNA-Fragment mit dem Kodon-Austausch wurde sodann aus einem jeden dieser Plasmide herausgeschnitten. Das Plasmid CTXA/A7/pUC19 wurde mit BstXI und HindIII gespalten und ein 593 bp-DNA-Fragment isoliert. Das Plasmid pCFM 1156 wurde mit NdeI und HindIII gespalten, um diese kurze Region seiner Klonierungsstelle, wie zuvor beschrieben, zu entfernen und dieses durch Ligation mit den jeweiligen CTXA- Analogon-Gen-Inserts, die aus den vorstehenden pUC-Trransitionsplasmiden gewonnen worden waren, und dem 593 bp-BstXI-HindIII-DNA-Fragment aus pCTX/A7/pUC19 ersetzt. Nach einer Isolation wurden diese neuen Plasmide für die Expression der Stellen-spezifischen Analoga His44→Asn, His70→Asn und Glu112→Gln von CTXA in E, coli als pCTXA/1B/1156, pCTXA/1C/1156 bzw. pCTXA/1D/1156 bezeichnet.
Umwandlung von CTXA- und CTXA-Analogon-Genen zu CTXA1- und CTXA1-Analogon-Genen. Mit Ausnahme des Plasmids mit der 1I-Kodon-Substitution (pCTXA1/1I/1156), das während der Mutagenese so konstruiert worden war, dass die A2-kodierende Region fehlte, war es hilfreich, die das CTXA-Gen enthaltenden und die ausgewählten, das jeweilige analoge Gen enthaltenden Expressionsplasmide zu CTXA1-Expressionsplasmiden umzuwandeln, um die A1-verkürzte Version von CTXA zu exprimieren, die die native Spezies dieser Untereinheit in reduzierten Holotoxin-Präparationen nachahmte. Für diese Umwandlung war eine Deletion eines Teils der Gensequenz des CTXA-Gens (und der analogen Gene) bis rechts der einzigen ClaI-Stelle notwendig. Obwohl die genaue Polypeptid-Spaltstelle zwischen den A1- und A2-Regionen im Stand der Technik nicht geklärt ist (16, 17), entschied man, anfänglich den Carboxy-Terminus von A1 bei Serin-194 zu schaffen. Jedoch soll angemerkt sein, dass die Schaffung des Terminus bei Arginin-192 (der andere in der Literatur vorgeschlagene Terminus) nur eine Sache der Insertion eines neuen Linkers ist, um ein Terminationskodon unmittelbar rechts des Arginin-192-Kodons zu ersetzen.
Für unsere Zwecke wurde jede der analogen CTXA-Sequenzen (und die native CTXA-Sequenz), die wir in CTXA1-Versionen umwandeln wollten, aus ihrem pUC 19-Transitionsplasmid (d. h. pCTXA/A7/pUC19, pCTXA/1B/pUC19, pCTXA/1C/pUC19, pCTXA/1D/pUC19, pCTXA/ 1E/pUC19, pCTXA/1F/pUC19, pCTXA/1G/pUC19, pCTXA/1H/pUC19) mit den Restriktionsenzymen NdeI (bei der für das Methionin-Initiationskodon kodierenden Sequenz) und ClaI (bei der Stelle, die für das Anfügen eines Terminationskodons unmittelbar rechts des Serin-194- Kodons ausgewählt worden war) herausgeschnitten. Dieses DNA-Fragment war in jedem Fall 585 bp lang. Für die Substitution der A2-kodierenden Region gegen ein Terminationskodon und die darauffolgende Ligation der Gensegmente in das Plasmid pCFM 1156 wurde ein Oligonukleotid-Linker synthetisiert, der ClaI- und HindIII-kohäsive Enden und die nachstehende Sequenz besaß:
Das Plasmid pCFM 1156 wurde mit NdeI und HindIII gespalten, um diesen Teil aus seiner Klonierungsstelle zu entfernen. Diese Region wurde durch Ligation mit dem ClaI-HindIII-Linker und mit einem einzelnen 585 bp-DNA-Fragment aus einem der vorstehend beschriebenen pUC-Transitionsplasmide ersetzt. Isolierung von Plasmid-DNA nach Ligation führte zu einer Serie von Plasmiden, die zur Expression von CTXA1- und CTXA1-Analogon-Polypeptiden in E. coli fähig sind. Die in dieser Weise hergestellten Plasmide umfassen pCTXA1/1B/ 1156, pCTXA1/1C/1156, pCTXA1/1D/ 1156, pCTXA1/1E/ 1156 und pCTXA1/1F/ 1156.
Expression und Analyse von CTXA und rekombinanten Analoga. Nach der Herstellung wurde jedes Plasmid für die Transformation einer getrennten Präparation von frischen, kompetenten FM5-Zellen verwendet. Transformanten wurden gepickt, als Minipreps vermehrt, für die Produktion von rekombinantem Protein induziert und in Bezug auf Einschlusskörper positive Proben mit Hilfe eines Lichtmikroskops identifiziert. Diese Proben wurden in einem größeren Maßstab (1 Liter) bei der Induktionstemperatur fermentiert, um größere Mengen eines jeden rekombinanten analogen Proteins herzustellen. Isolierte Zellpasten wurden in einer French-Presse nach Resuspendierung in destilliertem H&sub2;O mit 1 mM DTT lysiert. Einschlusskörper wurden aus diesen Lysaten durch einfache Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit isoliert. Diese Einschlusskörper-Proteinpräparationen enthielten 2% bis 80% rekombinantes Protein. Die Proben wurden in Bezug auf die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität wie zuvor beschrieben getestet. Die Ergebnisse sind in den Fig. 4, 5 und 6 und in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 1 HERSTELLUNG VON S1-ANALOGA TABELLE 2 ADP-RIBOSYLTRANSFERASE-AKTIVITÄTEN VON REKOMBINANTEN CTXA-1-ANALOGA¹
¹ Die absolute Menge eines jeden in jedem ADP-Ribosyltransferase-Test verwendeten Proteins (vgl. Fig. 4) wurde durch densitometrisches Scanning eines gefärbten SDS-Polyacrylamidgels (Fig. 4, Bild A) mit identischen Mengen eines jeden in dem Test verwendeten Proteins geschätzt. Das Autoradiogramm des Gels mit den menschlichen Erythrozytenmembranen (Fig. 4, Bild C) wurde sodann gescannt, um die radiographische Dichte der G-Protein-α-Untereinheit zu bestimmen, die durch jede CTXA1-Proteinpräparation ribosyliert worden war. Die Dichte der G- Protein-Bande aus der ADP-Ribosylierung mit käuflich erhältlichem CTXA1 ohne Harnstoff wurde auf 1,00 gesetzt und die Dichte der Banden aus der Ribosylierung durch die anderen CTXA1-Proteine wurde zu dieser Präparation als Prozentsatz seiner Dichte in Bezug gesetzt. Diese Fraktionen wurden sodann auf 1,00 ug hinzugegebenes CTXA1-Protein normalisiert, basierend auf der densitometrischen Messung des gefärbten Gels, um eine ungefähre, relative spezifische Aktivität zu erhalten.
² Die Menge an käuflich erhältlichem CTXA1 (ohne Harnstoff) wurde in diesem Test auf 1,00 ug gesetzt.
³ Die radiographische Dichte der durch das käuflich erhältliche CTXA 1 (ohne Harnstoff) ADP-ribosylierten G-Protein-α-Untereinheit wurde auf 1,00 gesetzt.
Fig. 4 zeigt ein gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel (Bild A) von Einschlusskörper- Präparationen von rCTXA 1 und seiner Stellen-spezifischen Analoga. Eine zu der in diesem Gel gezeigten identischen Menge des Proteins wurde für die Katalyse der einzelnen ADP-Ribosyltransferase-Reaktionen eingesetzt. Trichloressigsäure (TCA) - Präzipitate aus diesen Reaktionen wurden ebenfalls auf einem SDS-PAGE aufgetrennt und die Gele einer Autoradiographie unterzogen, um die [³²P]ADP-Ribosemarkierten Substrate sichtbar zu machen. Bild B zeigt die Ergebnisse der Reaktionen ohne G-Protein-enthaltende menschliche Erythrozytenmembran-Präparationen und Bild C zeigt die Reaktionen mit diesem Substrat.
Die wichtigste Erkenntnis dieser Experimente findet sich in Fig. 4, Bild C (und ist in Bild B bestätigt): bestimmte Stellen-spezifische Aminosäuresubstitutionen führen zu einer Verringerung und in manchen Fällen zu einem vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität, wie in diesem Test gemessen. Im Hinblick darauf scheinen die rCTXA1/L7(Arg9→Lys)-, rCTXA1/1B (His144→Asn)- und rCTXA1/1D (Glu112→Gln)-Analogon-Untereinheiten keine enzymatische Aktivität zu besitzen, während die Analoga rCTXA1/1C(His70→Asn) und rCTXA1/1F(Asp9→Glu) eine geringere Aktivität im Vergleich zu nativem CTXA (mit Harnstoff) und rCTX1/A7 (keine Mutation außer dem Methioninrest am Amino-Terminus) zu besitzen scheinen. Eine Verkürzung bei Trp¹&sup7;&sup9; (rCTXA1/T1/1156) führt auch zu einer analogen A-Untereinheit mit einer stark verringerten enzymatischen Aktivität.
Obwohl diese autoradiographischen Tests der Enzymaktivität nicht genau quantitativ sind, versuchten wir, eine quantitative Bewertung aus den GelenXind Autoradiogrammen von Fig. 4 abzuleiten, um zahlenmäßig darzustellen, was optisch festgestellt werden kann. Diese Auswertung ist in Tabelle 2 gezeigt. Hier unterzogen wir das gefärbte SDS-Polyacrylamidgel (Fig. 4, Bild A), das rCTXA1 und jedes der zuvor beschriebenen Analoga enthielt, einer integrativen Scanning-Densitometrie, um genauer die relative Menge eines jeden zu dem Test hinzugefügten Proteins zu bewerten. Diese wurden zu der Menge der zu dem Test hinzugegebenen A1-Untereinheit in nativem CTXA (ohne Harnstoff) in Bezug gesetzt, die auf 1,00 ug festgesetzt wurde. Obwohl versucht wurde, gleiche Mengen eines jeden Proteins zu den Tests hinzuzugeben (geschätzt auf der Basis des Prozentsatzes von Untereinheit-Protein in jeder Einschlusskörper-Präparation), kann man sehen, dass diese Schätzung möglicherweise ungenau war. Das Autoradiogramm der darauffolgenden enzymatischen Reaktionen mit G-Protein-Substrat (Fig. 4; Bild C) wurde auch einer densitometrischen Messung unterzogen, um die relative Dichte der Bande der radiomarkierten G-Protein-α-Untereinheit auf dem radiographischen Bild zu bestimmen, wobei die durch natives CTXA (ohne Harnstoff) markierte auf 100% gesetzt wurde. Eine ungefähre, relative spezifische Aktivität wurde sodann durch Teilung der Bilddichte durch die Menge von hinzugefügtem Enzym berechnet, wobei die spezifische Aktivität von nativem CTX (ohne Harnstoff) auf 1,00 gesetzt wurde. Es soll angemerkt werden, dass die Ergebnisse dieser Quantifizierung bestimmten experimentellen Grenzen unterliegen (z. B. der Schätzung einer gleichen Färbung einer jeden der Untereinheit-Präparationen, Bandenselektion und Umschreibung für die digitalisierte Densitometrie, Reaktionscharakteristika des Densitometers und Schätzung einer linearen Beziehung zwischen [³²P]ADP-Ribose- Markierung und radiographischer Dichte). Nichtsdestotrotz zeigen die Ergebnisse (Tabelle 2) in einer numerischen Art und Weise, was optisch in den Autoradiogrammen zu erkennen ist: eine starke Verringerung der enzymatischen Aktivität bei den Analoga rCTXA1/1C (His70→Asn), rCTXA1/1F(Asp9→Glu) und rCTXA1/T1 (Trp¹&sup7;&sup9;-Verkürzung) und scheinbar einen Verlust der Aktivität bei den Analoga rCTXA1/L7 (Arg9→Lys), rCTXA1/1B (His44→Asn) und rCTXA1/1D (GLu112→Gln).
In dem Fall ohne Zugabe von exogenem Substrat (Fig. 4, Bild B) sind das native CTXA und die enzymatisch aktiven CTXA1-Proteine autokatalytisch, d. h. sie katalysieren die Hydrolyse von NAD und den Transfer von ADP-Ribose auf das Enzym selbst (entweder in cis, in trans oder beides). Viele Banden in dem Autoradiogramm können auf kontaminierenden Proteinen von E. coli beruhen, die ADP-ribosyliert werden können. Alternativ, jedoch unwahrscheinlich, stellen sie kleinere Varianten der Untereinheit-Proteine dar (z. B. proteolytisch gespalten oder möglicherweise Varianten mit etwas Sekundärstruktur im SDS-Gel). Rekombinante CTXA1-Präparationen scheinen viel stärker zur Autokatalyse fähig zu sein, als die A-Untereinheit von nativem CTX. Der Grund für diese erhöhte Autoribosylierung ist ungeklärt, jedoch kann sie auf einem Fehlen der Substratspezifität des zu renaturierenden rekombinanten Proteins, der Exposition einer sensitiven Ribosylierungsstelle in dem rekombinanten Protein als Ergebnis einer unrichtigen Sekundärstruktur (es wurde in diesem speziellen Experiment nicht versucht, die native Konfirmation zu erreichen) oder auf dem Auftreten von ARFs (ADP-Ribosylierungsfaktoren) (31-37) in den Rohpräparationen der Rekombinanten beruhen, die eine Autokatalyse stabilisieren. Jedoch fokussiert sich die ADP-Ribosyltransferase-Reaktion bei der Zugabe von G-Protein-Substrat in Form von menschlichen Erythrozytenmembranen (Bild C) auf dieses Substrat, wobei die Autoribosylierung ausgelöscht wird.
Fig. 5 zeigt, dass das gleiche allgemeine Muster einer verringerten oder fehlenden enzymatischen Aktivität, das mit den rCTXA1-Analoga erhalten wird, auch beobachtet wird, falls die Substitutionen der gleichen Reste in rCTXA-Versionen der rekombinanten Untereinheit (d. h. Versionen mit dem immer noch kovalent gebundenen A2-"Schwanz") erfolgen. Jedoch scheint die Anwesenheit der A2-Region signifikant die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität der enzymatisch aktiven Proteine zu verringern. Diese Verringerung wird in Fig. 6 deutlicher, wo identische Mengen von rCTXA und rCTXA 1 in dem enzymatischen Test (Bild A) getestet, die radiomarkierten Produkte auf dem gleichen Gel aufgetrennt und sodann gleichen autoradiographischen Expositionszeiten unterzogen wurden (Bild B). Wie zu erkennen, scheint rCTXA1 eine größere Aktivität als rCTXA zu besitzen (vgl. Spuren 7 und 4). Erneut zeigt keine Untereinheit mit der Arg9→Lys-Substitution (Spuren 5 und 8) eine messbare ADP-Ribosyltransferase-Aktivität für das G-Protein-Substrat. Dass dieser Verlust der enzymatischen Aktivität in den Analoga nicht das Resultat von E. coli-Kontaminationen ist, die eine Katalyse unterdrücken, wird deutlich durch die Fähigkeit von nativem CTXA, G-Protein in Gegenwart von E. coli-produzierten, Analogon-enthaltenden Präparationen zu ribosylieren (Spuren 6 und 9).
Aufgrund ihrer Verminderung oder im wesentlichen Fehlens eines Hauptmarkers der toxischen Aktivität (ADP-Ribosyltransferase-Aktivität) besitzen die rekombinanten CTXA1-Analogon-Moleküle, die von den Klonen pCTXA1/L7/1156, pCTXA1/1B/1156, pCTXA1/1C/1156, pCTXA1/1D/1156, pCTXA1/1F/1156 und pCTXA1/T1/ 1156 produziert werden sowie ihre rCTXA-Analogon-Gegenstücke eine Bedeutung, alleine oder in Kombination mit CTXB, für sicherere Vaccinen. Man würde nicht erwarten, dass die beschriebenen Mutationen die normalen, schützenden immunogenen Eigenschaften der nativen CTX-Untereinheiten verringern. Die erfindungsgemäßen CTXA- und CTXA1-Analoga ünden somit Anwendung für eine Kombination mit CTXB-Untereinheiten in Form eines Holotoxoids. Die CTXB- Untereinheiten können die Immunreaktion gegenüber CTXA und CTXA 1 verstärken und umgekehrt, und jede kann schützende Epitope aufweisen. Die CTXB-Untereinheiten können von V. cholerae abgeleitet werden oder können genetisch veränderte Untereinheiten und Analoga davon sein. Genetisch veränderte Untereinheiten-Produkte können Fusionsproteine und nicht-fusionierte Proteine umfassen.
Strategien, die identisch zu den vorstehend beschriebenen sind, wurden für die Herstellung zusätzlicher rekombinanter Analoga der CTXA-Untereinheit von Choleratoxin eingesetzt. Die synthetischen Oligonukleotide für die Substitution von Kodons, entweder durch Linker-Mutagenese oder Mutagenese mittels Stellen-spezifischem Priming, sind in Tabelle 3 gezeigt. Das Analogon CTXA1/1J(Asp9→Tyr) wurde durch Linker-Mutagenese wie für das Analogon CTXA1/1F (Asp9→Glu) beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, dass das synthetische Oligonukleotid die geeignete Kodon-Substitution enthielt. Für die Konstruktion der Analoga CTXA1/1K (Ser10→Gly), CTXA1/1L (Arg11→Lys) und CTXA1/1M (Arg11→His) wurde eine neue DraII (auch bekannt als Eco0109I)-Restriktionsstelle in das CTXA1-Gen durch Stellen-spezifisches Priming unter Verwendung des nachstehenden synthetischen Oligonukleotid-Primers eingebracht:
Das Einbringen dieser Stelle ermöglichte die Linker-Mutagenese in dieser Region des Gens (unter Verwendung der zuvor beschriebenen NdeI-Stelle, links von der Insertionsstelle und der neu geschaffenen DraII-Stelle rechts von der Insertionsstelle), um Kodon-Veränderungen zu schaffen, die zu diesen drei Analoga führten. Stellen-spezifisches Priming wurde eingesetzt, um die Kodon-Veränderungen zu schaffen, die zu den Analoga CTXA1/1N (HIS44→Tyr), CTXA1/1"O" (His44→Gln), CTXA1/1P (His44→Val), CTXA1/1Q (His70→Tyr), CTXA1/1R (His70→Gln) und CTXA1/1S (His70→Val) führten.
Mit zwei Ausnahmen wurde ein jedes dieser Analoga in einem rekombinanten E. coli exprimiert und die isolierten Einschlusskörper auf die enzymatische Fähigkeit getestet, Gsα in menschlichen Erythrozytenmembran-Präparationen ADP-ribosylieren zu können oder, insbesondere im Fall der His&sup4;&sup4;- und His&sup7;&sup0;-Analoga, auf ihre Fähigkeit, Gsα und/oder Tubulin in Membranpräparationen von H27 kultivierten menschlichen Vorhaut-Fibroblasten ADP-ribosylieren zu können (bereitgestellt von der University of California, San Fransisco). Das Analogon CTXA1/1J (Asp9→Tyr), das rekombinant exprimiert, jedoch nicht auf eine Aktivität getestet wurde, und das Analogon CTXA1/1L (Arg11→Lys), für das ein Linker synthetisiert und die Klonierung durchgeführt worden war, jedoch ein Klon mit einer richtigen Sequenz nicht isoliert wurde, stellten die Ausnahmen dar.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Fig. 4 und 7 gezeigt und in Tabelle 4 zusammengefasst. Fig. 4 zeigt vergleichende Daten für die in Tabelle 1 beschriebenen Analoga. Unter den zusätzlichen, in Fig. 7 und Tabelle 4 beschriebenen Analoga befinden sich drei mit verschiedenen Substitutionen an His&sup4;&sup4; (CTXA1/1N, CTXA1/1"O", CTXA1/1P). Das Fehlen einer messbaren enzymatischen Aktivität bei diesen Analoga, zusätzlich zu einem Fehlen von Aktivität bei dem zuvor beschriebenen Analogon CTXA1/1B (His44→Asn), zeigt, dass diese spezifischen Substitutionen an His&sup4;&sup4; zu einer Inaktivierung der Choleratoxin-Untereinheit führen, die die intrinsische toxische Aktivität des multimeren Moleküls besitzt. Basierend auf diesen Ergebnissen ist es wahrscheinlich, dass eine jede Substitution an diesem Rest eine derartige Inaktivierung ergibt.
Drei Analoga (CTXA1/ 1Q, CTXA1/ 1R, CTXA1/ 15) mit Substitutionen von Hi570 befinden sich auch unter den beschriebenen. Diese Analoga sind zusätzlich zu dem Analogon CTXA1/1C (His70→Asn) der Tabelle 1. Wie in Fig. 7 gezeigt, weisen alle vier His&sup7;&sup0;-Analoga eine verminderte Fähigkeit zur ADP-Ribosylierung des Gsα-Substrats auf, obwohl sie deutlich die Fähigkeit beibehalten, andere Nicht-Gsα-Proteinsubstrate (z. B. Tubulin in H27-Fibroblasten) zu ADP-ribosylieren. Somit führen Substitutionen von His&sup7;&sup0; zu einer offensichtlichen Verringerung der Aktivität von CTXA1 für das spezifische Gsα-Substrat, von dem man glaubt, dass es an der pathognomonischen zytotoxischen Reaktion gegenüber Choleratoxin beteiligt ist. Derartige Substitutionen in CTXA1, das an einem gebildeten Holotoxin-Multimer beteiligt ist, würden daher wahrscheinlich zu einem attenuierten Choleratoxin- Molekül führen, im Gegensatz zu einem Molekül ohne irgendwelche toxischen Eigenschaften.
Eine Analyse der zwei zusätzlichen Analoga ist in Fig. 8 gezeigt. CTXA1/1K (Ser10→Gly) zeigt die katalytische Aktivität des nativen CTXA-Moleküls. Eine Substitution von Arg/l gegen His (CTXA1/1M) führt zu einem Analogon mit geringer oder keiner messbaren enzymatischen Aktivität. Man würde annehmen, dass das Analogon CTXA1/1L (Arg11→Lys) auch eine signifikant verringerte Aktivität bei einer Isolierung und einem Test aufweisen würde. Diese Folgerung wird durch die Erkenntnisse der Tabelle 1 gestützt (vgl. Arg7→Lys). Tabelle 3 Herstellung von CTXA1-Analoga Tabelle 4 ADP-Ribosyltransferase-Aktivitäten von CTXA1-Analoga
[1] Wie durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht: [+], vollständige Aktivität; [±], verringerte Aktivität; [-], keine nachweisbare Aktivität; N. B., nicht bestimmt.

In vitro-Assoziierung von rCTX-Untereinheiten

Eine Reihe von Verfahren, durch die natives Choleratoxin dissoziiert werden kann und die einzelnen Untereinheit in vitro für die erneute Bildung der Holotoxin-Moleküle reassoziiert werden können, wurden im Stand der Technik beschrieben (36, 37). Eine in vitro-Reassoziierung der Untereinheit von Pertussistoxin wurde auch im Stand der Technik für native Untereinheiten beschrieben (38-40). Mit Hilfe eines ähnlichen Verfahrens können rekombinante CTX-Untereinheiten isoliert, in vitro für die Bildung von Holotoxin-ähnlichen Spezies assoziiert und gereinigt werden. Im allgemeinen werden die einzelnen Untereinheiten nach Expression und Gewinnung in stöchiometrischen Verhältnissen kombiniert (basierend auf ihrem relativen Gehalt des spezifischen Untereinheiten-Proteins, falls sie in Form von Einschlusskörper-Präparationen vorliegen), wodurch man sich dem Verhältnis der Untereinheiten nähert, das bei dem nativen CTX-Holotoxin vorliegt. Die Präparation wird in einer wässrigen Lösung mit einem chaotropen Stoff oder einem Detergenz oder beidem solubilisiert. Die Präparation wird reduzierenden Bedingungen ausgesetzt (im allgemeinen einem Reduktionsmittel oder einer Wasserstoffatmosphäre oder beidem) und sodann oxidiert (mit einem Oxidationsmittel oder unter einer sauerstoffreichen Atmosphäre oder beidem), um die notwendigen intramolekularen Disulfid- Brücken zu bilden. Eine Assoziierung der Untereinheiten in Holotoxin-ähnliche Spezies erfolgt durch Verringerung oder Entfernung des chaotropen Stoffs oder des Detergenzes. Dies kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen, einschließlich durch Filtrieren und Pufferaustausch durch Dialysechromatographie. Die Holotoxin-ahnlichen Spezies werden sodann in an sich bekannter Weise gereinigt, z. B. durch Ionenaustausch-, Größenausschluss- und Affinitätschromatographie. Es soll angemerkt werden, dass B-multimere Spezies ohne die A-Untereinheit durch ähnliche Verfahren gewonnen werden können, falls Präparationen der Einschlusskörper der letzteren Untereinheit nicht hinzugefügt werden.
Die genetisch veränderten Analogon-Untereinheiten der Erfindung können in an sich bekannter Weise in eine Toxoid-Choleravaccine formuliert werden. In diesem Fall eines Toxins, das "genetisch" inaktiviert worden ist, wie erfindungsgemäß das Choleratoxin, sollten weitere Inaktivierungsschritte (wie eine chemische Behandlung oder eine Hitzebehandlung) gewöhnlich nicht erforderlich sein, da diese Produkte in nicht-pathogenen Organismen produziert werden und inhärent frei von den enzymatischen Aktivitäten sind, die im allgemeinen die gegenteiligen Reaktionen gegenüber Choleravaccinen mit ganzen Zellen hervorrufen. Nichtsdestotrotz ist eine Kontrolle der Reinheit des rekombinanten Produkts notwendig, insbesondere im Hinblick auf den Gehalt an Endotoxin. Im allgemeinen würden das rekombinante Holotoxoid, rekombinante Holotoxoid-ähnliche Makromoleküle, rekombinante Makromoleküle der B-Untereinheit, die rekombinante B-Untereinheit alleine oder möglicherweise rekombinante Analoga der B-Untereinheit und sogar Analoga der A-Untereinheit alleine, die erfindungsgemäß beschrieben sind, als mögliche Vaccinierungsmittel zu 90% Homogenität gereinigt werden. Die Art und geschätzte Menge von Kontaminationen, falls vorhanden, würde bewertet werden, um sicherzustellen, dass der Gehalt der Endotoxin-Kontamination den Standards der einzelnen Regulierungsbehörden entspricht.
Für eine parenterale Verabreichung würden die Vaccinematerialien normalerweise auf Aluminium-Adjuvanzien adsorbiert werden. Dies kann durch mindestens zwei verschiedene Verfahren erfolgen: Präzipitation mit vorgeformtem Alaun und Präzipitation mit Aluminiumsalzen. Die adsorbierten Präzipitate werden sodann in einem Exzipiens resuspendiert, um eine Dosiskonzentration des Vaccine-Antigens im allgemeinen in einem Bereich von 5-100 ug pro Dosis und einer Alaun-Menge, gewöhnlich nicht mehr als 1,5 mg/Dosis zu erhalten. Das Volumen pro Dosis befindet sich in einem Bereich von 0,1-1,0 ml. Das suspendierende Exzipiens ist gewöhnlich eine gepufferte Lösung (z. B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,0), es kann Stabilisierungsmittel (wie Glycerin) enthalten und wird wahrscheinlich ein Konservierungsmittel (wie 0,01% Thimerosol) enthalten, um eine mikrobielle Kontaminierung zu vermeiden und die Haltbarkeitsdauer zu erhöhen.
Die Formulierung und Bereitstellung von rekombinantem Choleratoxoid oder Subkomponenten davon mit Hilfe von Vektorsystemen, wie ebenfalls erfindungsgemäß umfasst, wird von der Gestalt des Systems abhängen. Zum Beispiel kann eine orale Verabreichung von rekombinanten (mutanten) V. cholerae, Salmonella sp., Vacciniavirus oder Adenovirus, die Gene für die A- oder A- und B-Untereinheiten tragen, in enterisch-beschichteten Verabreichungsvehikeln für eine Passagierung zum Darm oder in Form eines Aerosols (z. B. mit Liposomen) für eine Steuerung zum Respirationstrakt vorliegen, um sekretorische Immunoglobulin A-Antikörper für einen Schutz an Mukosa-Oberflächen zu erzeugen. Alternativ können andere orale Formen der Vaccine gemäß an sich bekannten Verfahren hergestellt werden, die in geeigneter Weise angepasst werden, um die erfindungsgemäßen antigenen Stoffe zu beherbergen. Zum Beispiel kann ein rekombinanter V. cholerae-Stamm lyophilisiert und mit einem Hydrogencarbonat-Puffer für die Neutralisierung der Magensäure vermischt werden (41). Alternativ kann ein Holotoxoid erfindungsgemäß in Form einer Brausetablette eingesetzt werden, die in geeigneter Weise gepuffert wird, um eine abgetötete, Gesamtzell-Vaccine zu supplementieren (1).
Obwohl die Erfindung spezifisch in Bezug auf die rekombinante Herstellung in E. coli beschrieben wurde, wird der Fachmann verstehen, dass die Prinzipien für eine Mutagenese der Analogon-Untereinheiten, wie hier beschrieben, auch bei anderen rekombinanten Wirten und Expressionssystemen und für die Produktion anderer inaktivierter Analoga des Toxins eingesetzt werden können. Weiterhin soll klar sein, dass ein Zusammenbau mutanter Analoga in einen Holotoxoid in intakten Zellen mit Hilfe von homologer Rekombination, z. B. in V. cholerae, stattfinden kann, im Vergleich zu in vitro. Die Erfindung soll alle Modifikationen und Verbesserungen umfassen, die im Umfang der Ansprüche liegen.
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Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, von dem wenigstens ein Teil ein Analogon der Region A oder der Subregion A1 von Choleratoxin kodiert, wobei das Analogon eine Stellen-spezifische Mutation an einer oder mehreren Stellen der Region oder Subregion, ausgewählt aus Arginin-7, Arginin-11, Asparaginsäure-9, Histidin-44, Histidin-70 und Glutaminsäure-112 oder eine Verkürzung des Carboxy-terminalen Teils, beginnend bei Tryptophan-179, umfasst, und wobei das Analogon eine verminderte oder keine katalytische Aktivität besitzt, die mit einer Reaktogenizität von Choleratoxin in Verbindung steht, wie bestimmt durch einen Test der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität.

2. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, wobei das Analogon zur Erzeugung einer Choleratoxinneutralisierenden Immunreaktion fähig ist.

3. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, erhältlich durch Stellenspezifische Mutagenese, die in einem Analogon der Region A oder der Subregion A1 von Choleratoxin resultiert, das weniger aktiv oder im wesentlichen inaktiv ist, wie bestimmt durch einen Test der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität.

4. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, das ebenfalls für die Untereinheit B von Choleraton kodiert.

5. Genetisch verändertes Analogon der Region A oder der Subregion A 1 von Choleraton, umfassend eine Stellen-spezifische Mutation an einer oder mehreren Stellen der Untereinheiten, ausgewählt aus Arginin-7, Arginin-11, Asparaginsäure- 9, Histidin-44, Histidin-70 und Glutaminsäure-112 oder eine Verkürzung des Carboxy-terminalen Teils, beginnend bei Tryptophan-179, wobei das Analogon eine verminderte oder im wesentlichen keine katalytische Aktivität besitzt, die mit der Reaktogenizität von Choleratoxin in Verbindung steht, wie bestimmt durch einen Test der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität.

6. Analogon gemäß Anspruch 5, das zur Erzeugung einer Choleratoxinneutralisierenden Immunreaktion fähig ist.

7. Analogon gemäß Anspruch 5, erhältlich durch in einer Mutation der Region A oder der Subregion A 1 resultierende Stellen-spezifische Mutagenese, das weniger aktiv oder im wesentlichen inaktiv ist, wie bestimmt durch einen Test der ADP- Ribosyltransferase-Aktivität.

8. Verbesserte Anti-Cholera-Vaccine, umfassend eine wirksame Menge eines Analogons der Region A oder der Subregion A 1 von Choleratoxin, wobei das Analogon eine Stellen-spezifische Mutation an einer oder mehreren Stellen der Region A oder Subregion A1, ausgewählt aus Arginin-7, Arginin-11, Asparaginsäure-9, Histidin-44, Histidin-70 und Glutaminsäure-112 oder eine Verkürzung des Carboxyterminalen Teils, beginnend bei Tryptophan-179, umfasst, wobei das Toxin eine biologische Aktivität besitzt, die (a) eine Choleratoxin-neutralisierende Immunreaktion hervorrufen kann und (b) eine verminderte oder im wesentlichen keine katalytische Aktivität besitzt, die mit einer Reaktogenizität von Choleratoxin in Verbindung steht, wie bestimmt durch einen Test der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität.

9. Verbesserte Vaccine gemäß Anspruch 8, wobei die Toxin-neutralisierende Immunreaktion für eine Immunoprotektion gegen eine Choleraerkrankung sorgt.

10. Verbesserte Vaccine gemäß Anspruch 8, wobei das Analogon durch Stellenspezifische Mutagenese abgeleitet wurde, die in einer Mutation der Region A oder der Subregion A1 von Choleratoxin resultiert, das weniger oder im wesentlichen keine ADP-Ribosyltransferase-Aktivität besitzt.

11. Verbesserte Vaccine gemäß Anspruch 8, wobei das Analogon der Region A oder Subregion A 1 mit dem B-Oligomer assoziiert ist.

12. Verbesserte Vaccine gemäß Anspruch 11, wobei das B-Oligomer in der nativen Form vorliegt.

13. Verbesserte Vaccine gemäß Anspruch 11, wobei das B-Oligomer genetisch verändert wurde.

14. Prokaryontische oder eukaryontische Zelle, die mit einem DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 transformiert wurde und zur Expression des von dem DNA- Molekül kodierten Polypeptid-Produkts oder der kodierten Polypeptid-Produkte fähig ist.

15. E. coli-Wirtszelle gemäß Anspruch 14.

16. Vibrio cholerae-Wirtszelle gemäß Anspruch 14.