KR100249888B1 - 재조합 dna-유도성 콜레라 독소 소단위체의 유사체 및 그를 암호하는 dna 분자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 DNA 기술에 의한 콜레라 외독소의 소단위체 및 소단위체의 유사체의 개발에 관한 것이다.
또한, 생물학적 활성도 및 면역원성을 유지시킬 수 있으며, 질병의 항원투여에 대항하는 방어를 제공할 수 있는 백신 생성물에 관한 것이다.
본 발명의 소단위체의 유전공학 처리된 변형체는 결과적으로 면역원성이 유지되나, 독소 반응발생성과 관련된 감소되거나 근본적으로 결여된 효소활성도를 지닌 생성물이다.
Description
[발명의 명칭]
재조합 DNA-유도성 콜레라 독소 소단위체의 유사체 및 그를 암호하는 DNA 분자
[발명의 배경]
[발명의 분야]
본 발명은 콜레라 외독소의 소단위체 유사체의 재조합 발현과 상기 유사체를 기제로 하는 백신에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 외독소를 유전공학적으로 변이시킴으로써 콜레라 백신 반응 발생에 영향을 미칠 수 있는 감소되거나 실질적으로 소실된 촉매 활성도를 갖는, 방어 반응을 유도하는 능력을 지닌 콜레라 독소의 유사체를 제공한다.
[본 분야의 설명]
“콜레라”라는 용어는 대부분 비위생적인 상태가 널리 퍼져있는 지역에서 가장 일반적으로 발생하는, 병원인자 콜레라균(Vibrio cholerae)에 의한 감염으로 나타나는 질병을 언급하는 것이다. 콜레라는 여전히 세계의 많은 지역에서 이병률 및 사망률의 주요 원인이다(문헌 1, 2 참조). 경험에 비추어 보면, 질병에 걸린 이후에 그 질병 인자에 다시 노출되었을 때 이에 대하여 영구적인 방어가 제공되었음을 알 수 있었다(3). 따라서, 유사하게 방어하는 백신이 개발을 위해 상당한 노력을 기울여 왔다. 비경구적인 전체 세포 콜레라 백신이 제조되어 왔지만, 특히 질병으로 가장 위험한 상태에 있는 어린 아이들에 대하여 그것은 더 이상 유용하지 않은 것으로 여겨진다(1).
다른 많은 감염성 질병에 관한 한, 강염 인자의 게놈에 의해 암호화되고 그것에 의해 분비된 생물학적 외독소(이 경우에는, “콜레라 독소” 또는 “CTX”)는 미생물이 감염된 숙주를 전이증식시키는 데에 상당한 영향을 미친다(4).
또한, 독소에의 노출은 질병의 생명 위협 상태인 탈수를 초래하는 심한 설사 및 구토의 원인이 된다(3, 5). 이러한 경험은 독소를 중화시키기에 충분한 면역 반응을 유도하는 백신(예를들어, 항체)이 박테리아의 전이증식 및 설사와 구토 같은 부수적인 증상을 억제하거나 감소시키기에 상당한 도움이 될 것임을 시사한다. 따라서 독소의 무독성 유사체, 즉 “톡소이드”를 함유하는 백신을 개발하기 위해 실질적인 노력을 가하여 왔다(1, 3-13). 콜레라 독소는 “A” 소단위체와 “B” 올리고머로 이루어진 다중-소단위체 거대분자로 알려져 있는데, 여기에서 “A” 소단위체는 표적 세포내 G-단백질을 ADP-리보실화하는 촉매 부위인 “A1”을 함유하며 “B” 올리고머는 표적 세포에 완적독소를 결합시킨다(6). 콜레라 독소의 무독성 유사체는 여러가지 수단에 의해 백신 개발을 목적으로 제조되어 왔다. 이와 같은 방법은 완적독소 또는 독소 소단위체의 화학적 처리, A 소단위체의 삭제와 남아 있는 B 올리고머의 이용 및 독소 소단위체의 펩티드 단편의 합성 또는 분리를 포함한다(1,3-13).
최근에는, 가장 주목받는 두가지 연구법에 의한 경구용 백신의 개발쪽으로 노력을 기울여 왔다. 이들 연구법 중의 하나는 죽은 콜레라균(즉, 화학적 또는 열적으로 불활성화된)을 단독으로 또는 콜레라 독소의 B 올리고머로 보충된 것을 사용하는 것에 기초한 것이다(1, 11, 12). 이 연구법은 특히 어린 아이에게서 불완전한 방어를 일으키는 것으로 밝혀졌다(12). 다른 연구법은 살아 있으나 약독화된, 독소의 A1 소단위체를 생성하지 못하는 콜레라균 균주를 사용하는 것이다(13). 이런 종류의 백신은 최근까지 고도의 방어를 제공하였으나 근래에 용인 불가능한 장의 부작용과 관계가 있는 것으로 밝혀졌다. A 소단위체를 암호화하는 유전자가 제거된 콜레라균 균주 CVC 103-HgR을 기초로 하여 최근에 개발된 백신은 적어도 어른에게는 더 내성인 것으로 나타났다(13), 그러나 우리가 알고 있는 바로는, 이 백신은 어린이에 대해서나 대규모의 임상 실험에서는 실험되지 않았다.
콜레라 독소의 특성에 대한 최근의 연구는, 재조합 연구법을 기초로 한 백신 개발에 적용할 수도 있는 그것의 구조에 관한 통찰을 제공하여 왔다. 자연발생적인 소단위체 A는 단백질원(preprotein)으로서 콜레라균 내에서 합성되는 것으로 알려져 있으며(14), 이후에 약 2,160kDa의 신호 펩티드 서열이 가수분해적으로 절단되어 제거된다. 또한 번역후 프로세싱으로 약 21,817kDa의 아미노-말단 폴리펩티드(소단위체 A1) 및 약 5,398kDa의 카르복실-말단 폴리펩티드(소단위체 A2)가 생기며, 이는 이황화물 다리에 의해 결합된다(6, 15, 16) ; 이황화물 결합의 감소는 ADP-리보실전이효소 반응의 촉매작용을 위해 필요하다고 여겨진다(6, 15, 16). 또한 B 소단위체도 단백질원으로 합성된 이후에 단백질 분해 효소에 의해 절단되어 신호 펩티드가 제거된다. 콜레라 독소의 A1, A2 및 B 소단위체에 대한 유전자 또는 시스트론성 요소의 모든 서열이 완전히 결정되었으며 문헌(16)에 기술되어 있다.
[도면의 간단한 설명]
제1(a)도는 선행 기술의 CTX A 소단위체를 암호화하는 시스트론성 요소에 대한 DNA 서열이다. DNA 서열 바로 아래에 있는 단일 문자 아미노산 서열은 A 폴리펩티드에 대하여 제안된 전사 해독 프레임을 나타낸 것이다. 신호 펩티드의 출발(프리-A) 부위, A1, A1의 카르복실-말단 프로세싱에 대하여 제안된 두 부위 및 A2의 제안된 출발 부위 및 종결 부위를 표시한 소구역(subregion) 또한 나타나 있다. A1의 카르복실 말단에 대한 정확한 위치에 관하여 불확정된 증거가 문헌에 제공되어 있음을 주의해야 한다(16, 17).
제1(b)도는 CTX의 B 소단위체를 암호화하는 시스트론성 요소에 대한 DNA 서열이다. 마찬가지로, 개시 코돈과 종결 코돈 및 제안된 절단 부위가 나타나 있다. 흥미롭게도, A2의 종결 및 B의 개시를 암호화하는 오페론내의 DNA 부위가 중복된다 ; 그러나 이들 두 단백질은 다른 해독 프레임에 존재한다.
제2도는 단백질원 및 천연 CTX의 A와 B 소단위체의 프로세싱 단백질형 및 재조합 소단위체의 단백질형에 대한 구조의 개략도이다. 단백질원의 아미노 말단에 있는 “파형선(squiggle)”은 콜레라균에 의해 제거된 신호 펩티드를 나타낸다. “M”은 아미노 말단에 메티오닌 잔기를 가리킨다 : “(M)”은 이것이 성숙한 재조합 CTXA 및 CTXA1 소단위체와 그 유사체의 아미노 말단에 존재하는 이종(천연이 아닌) 잔기임을 나타낸다 ; 아미노산 서열 데이터는 이종 메티오닌 잔기가 실질적으로 세포성 메티오닌 아미노-펩티다제에 의해 재조합 폴리펩티드로부터 절단된 것이 아님을 보여준다. “S”는 시스테인 잔기 사이의 이황화물 결합에 포함된 황 성분을 가리킨다. 다른 선택된 아미노산은 도시된 폴리펩티드 내부에 그것의 위치와 함께 표준 단일 문자 코드로 나타나 있다. 암호화 DNA 서열에 대하여 선택된 제한효소의 절단 부위는 그것의 3개의 표준 문자 코드와 함께 암호화된 폴리펩티드 상에 나타나 있다. 천연(“n”) CTXA는 아미노-말단의 신호 서열을 포함하는 단백질원(“프리-A”)으로서 콜레라균에서 합성된 것으로 여겨진다. 번역후 프로세싱으로 신호 서열이 절단되어 성숙한 CTXA가 된다. 아마도 동시에, 카르복실 말단의 작은 부분도 단백질 가수분해로 절단될 것이다. 더 큰 A 단편(CTXA1)과 더 작은 카르복실-말단 A 단편(CTXA2)은 절단된 후에 각 단편내의 단일 시스테인 잔기 사이의 이황화물다리에 의해서 결합된다. 문헌에는 CTXA1 말단의 위치에 대하여 상반되게 보고되어 있다(Arg192또는 Ser194) ; CTXA2는 Met195에서 시작된다고 여겨진다. 또한 천연(“n”) CTXB는 이후에 단백질분해효소에 의해 프로세싱되는 아미노-말단 신호 서열과 함께 합성된다. 흥미롭게도, 그것의 아미노 말단을 암호하는 CTXB 시스트론성 요소 부위는 그것의 카르복실 말단을 암호하는 CTXA 시스트론성 요소와 중복된다 ; 그러나, 암호화 서열은 다른 해독 프레임에 존재한다(16). 재조합(“r”) CTXA는 최적의 발현 벡터 조절하의 E. coli에서 합성하였다. DNA 요소의 좌측 말단 클로닝에 올리고뉴클레오티드 링커(Ndel-Xbal)를 사용하여 신호 펩티드-암호화 서열을 개시 메티오닌 코돈으로 치환시켰다. 재조합 E. coli에서 A1으로부터 A2 부위가 제거되지는 않았다. 신호 펩티드-암호화 서열을 메티오닌 개시 코돈으로 치환하기 위해 Ndel-Accl 단편을 사용한 것을 제외하고는, CTXB에 대하여 유사한 좌측 클로닝 전략(left-hand cloning strategy)을 이용하였다. 재조합 CTXA1은 천연 CTXA1 보다 짧은 CTXA1으로 합성되었다. 이 경우에는, 우측 말단에서 올리고뉴클레오티드 링커를 이용하여 A2 서열을 종결 코돈으로 치환시킴으로써 A1이 천연 CTXA1에서 제안된 2개의 절단 부위중 하나인 Set194에서 종결된다. Arg192에서의 종결도 동일한 링커 전략을 이용하여 쉽게 수행할 수 있다. 예기한 바와 같이, 재조합 CTXA와 CTXA1 분자 및 그의 유사체의 아미노 말단 메티오닌은 발생기의 E. coli 메티오닌 아미노펩티다제에 의해 실질적으로 제거될 수 있다고 여겨지지 않는다.
제3도는 천연 및 재조합 CTX 소단위체에 대한 SDS-PAGE이다. 재조합 CTXA, CTXA1, 재조합 CTXA와 CTXA1의 Arg7→Lys 유사체 및 재조합 CTXB를 E. coli에서 합성하고 본원에 기술된 바와 같이 세포 봉입체를 제조하였다. 세포 봉입체 시료 뿐만 아니라 정제된 상업용 등급의 천연 CTX, CTXA 및 CTXB를 가용화시킨 다음 환원 조건하에서 SDS-PAGE를 실시하였다. 레인 1, 천연 CTX ; 레인 2, rCTXA/A7 ; 레인 3, rCTXA Arg7→Lys 유사체(rCTXA/L7) ; 레인 4, ,rCTXA/A7 ; 레인 5, rCTXA1 Arg7→Lys 유사체(rCTXA1/L7) ; 레인 6, rCTXB ; 레인 7, 천연 CTXB ; 레인 8, 천연 CTXA(단지 CTXA1 만이 가시화되어 있다). 전기영동 후에, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R250으로 염색한 다음 염색된 폴리펩티드를 나타내기 위하여 탈색시켰다.
제4도는 rCTXA1 및 CTXA1 유사체의 ADP-리보실전이효소 활성도에 대한 SDS-PAGE 및 오토래디오그래피 분석이다. 패널 A에서, 천연 CTXA, 재조합 CTXA1 및 다양한 부위-특이 유사체 또는 rCTXA1의 시료를 SDS-PAGE하고 쿠마시 블루로 염색하였다. 본원에 기술된 측정조건하에서 [32P] NAD를 사용하여 막-결합 G 단백질을 ADP-리보실화하기 위한 효소원으로 이 시료를 사용하였다. 반응을 켄칭(quenching) 시킨 후에, 각 시료로부터의 반응 혼합물 전체를 SDS-PAGE 한 다음, 겔을 건조시키고 [32P]로 표지된 ADP-리보스를 부가함으로써 공유결합적으로 변이된 단백질을 가시화하기 위하여 오토래디오그래피를 행하였다. 패널 B는 G-단백질 기질이 부가되지 않았을 때, 오토리보실화하는 재조합 CTXA1의 능력을 나타내는 검정 결과를 보여준다 ; 흠이있게도, 유사체 CTXA1/L7은 이러한 반응성을 상실하였다. 패널 C는 인체 적혈구막에서 발견된 기질 G 단백질에 대한 ADP-리보실화를 나타낸 것이다. 이러한 기질의 부가로 표적 G 단백질(그것의 리보실화된 α-소단위체로서-오토래디오그램에 나타난)에 대한 그 자체의 효소 반응성(오토리보실화)이 상당히 변화된다. 한편, rCTXA1 유사체 L7은 이러한 반응성도 결여되어 있다.
제5도는 제4도에서 rCTXA1에 대하여 나타낸 것과 유사한, rCTXA 및 rCTXA 유사체의 ADP-리보실전이효소 활성도에 대한 SDS-PAGE 및 오토래디오그래피 분석이다. rCTXA 시료가 여전히 그의 카르복실 말단에 절단되지 않은 A2 “꼬리(tail)”를 포함하고 있음으로 인해 rCTXA1 보다 상당히 낮은 활성도를 지니고 있기 때문에(제6도 참조), X-레이 필름에 겔(패널 A)을 더 오래 노출시킴으로써 이러한 오토래디오그램을 이룰 수 있었다. 패널 A는 rCTXA 단백질의 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔이다 ; 제4도의 패널 A와 비교하여, 이들 단백질의 재조합 발현이 상대이 rCTXA1 단백질의 발현보다 일반적으로 더 적다는 것은 분명하다. 재조합 CTXA 시료는 오토리보실화되었으며(패널 B) 인체 적혈구 막에서 G 단백질 기??을 ADP-리보실화할 수 있다(패널 C) ; 이들 활성도는 rCTXA1에 비해 실질적으로 감소된다. 그럼에도 불구하고, CTXA 시료는 그것의 CTXA1 상대물(counterparts)에서 처럼 활성도에 대하여 일반적으로 동일한 양상을 나타낸다. 한편, L7 유사체(Arg7→Lys)는 ADP-리보실화 활성도가 결여되어 있다.
제6도는 rCTXA1 및 rCTXA1/L7의 ADP-리보실전이효소 활성도와 rCTXA 및 rCTXA7의 그것에 대한 SDS-PAGE 및 오토래디오그래피 비교이다. 패널 A는 부가된 기질이 없는 반응성을, 패널 B는 기질로서 부가된 인체 적혈구 막을 수반한 반응성을 나타낸다. 각 레인은 다음을 포함한다 : 레인 1) 블랭크(반응을 위한 시료를 첨가하지 않음) ; 레인 2) 요소 처리를 하지 않은 천연 CTXA ; 레인 3) 요소 처리를 한 천연 CTXA ; 레인 4) rCTXA ; 레인 5) rCTXA/L7 ; 레인 6) rCTXA/L7 + 천연 CTXA ; 레인 7) rCTXA1 ; 레인 8) rCTXA1/L7 ; 레인 9) rCTXA1/L7 + 천연 CTXA. 이러한 실험은 rCTXA 시료가 G 단백질의 ADP-리보실화에 대하여 rCTXA1 보다 훨씬 덜 활성적이지만(레인 4와 7을 비교), 상당한 오토리보실화 활성도를 나타냄을 입증한다. 제4도와 5도에 나타난 데이터를 확인하면, rCTXA 및 rCTXA1에서 아르기닌-7에 대한 리신이 치환으로 자체촉매와 G 단백질 둘다에 대하여 그것의 리보실화 활성도가 제거됨을 알 수 있다. 천연 CTX를 유사체 시료에 부가하였을 때 활성도가 유지되는 것으로 보아(레인 6 및 9), 이천연 CTX가 재조합 시료에 있어서 활성도를 억제하는 불순물은 아님을 알 수 있다.
제7도는 CTXA 및 CTXA1 유사체에 의한 H27 섬유아세포 막 및 적혈구 막의 ADP-리보실화를 도시한 것이다. 자연발생적인 CTXA 또는 재조합 CTXA1 유사체를 인체 적혈구 막이나 H27 섬유아세포 막 둘 중 어느 하나 및 [32P] NAD와 함께 항온하였다. 항온 후에, 혼합물을 침전시켜 원심분리한 다음, 그 결과 생성된 펠릿을 SDS-PAGE하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 건조시킨 다음 X-레이 필름에 노출시켜서 오토래디오그램을 얻었다. B는 CTXA 또는 CTXA1 유사체를 부가하지 않은 건 ; A는 자연발생적인 CTXA, A + u는 요소로 처리한 자연발생적인 CTXA : rA1은 잔기를 치환하지 않은 재조합 CTXA1 ; RBC는 인체적혈구 막이다.
제8도는 CTXA 및 CTXA1 유사체에 의한 H27 섬유아세포 막 및 적혈구 막의 ADP-리보실화를 도시한 것이다. 자연발생적인 CTXA 또는 재조합 CTXA1 유사체를 인체 적혈구 막이나 H27 섬유아세포 막 중 어느 하나의 존재하에서 [32P] NAD와 함께 항온하거나 또는 기질을 함유한 막을 가하지 않는 채로 항온하였다. 항온 후에, 혼합물을 침전시켜 원심분리한 다음 그 결과 생성된 펠릿을 SDS-PAGE하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색한 다음 세척하여 건조시켰다. 제8(a)도는 기질을 함유한 막의 부재시에 항온한 시료에 대하여 염색된 겔의 사진이다 ; 제8(b)도는 이 겔에 대한 오토래디오그램이다. 제8(c)도 및 제8(d)도는 각각 적혈구 막 및 H27 섬유아세포 막과 함께 항온한 시료에 대한 겔의 오토래디오그램이다. B는 CTXA 또는 CTXA1 유사체를 가하지 않은 것 ; A는 자연발생적인 CTXA ; A+u는 요소로 처리한 자연발생적인 CTXA ; rA1은 잔기를 치환하지 않은 재조합 CTXA1 ; RBC는 인체 적혈구 막이다.
[발명의 요약]
본 발명은 백신 반응 발생과 관련이 있을 것이라고 일반적으로 용인되는, 감소된 효소 활성도를 갖는 콜레라 독소의 촉매성 소단위체의 유사체를 암호하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 특히 본원에서 기술한 바와 같이 부위-특이 돌연변이유발은, ADP-리보실전이효소 활성도에 의해 측정한 바와 같이 촉매 기능에 있어서 천연 독소의 상대물에 비해 상당한 감소를 나타내는 A 및 A1 소단위체의 유사체를 생성시킨다.
본 명세서에서 사용된 용어 “콜레라 독소의 촉매성 소단위체”는 제1(a)도 및 제2도에 나타난 바와 같이 콜레라 독소의 A와 A1 소구역 둘다를 뜻한다. 콜레라 독소 거대분자의 이들 부위는 ADP-리보실전이효소의 촉매 활성도를 갖는 것으로 알려져 있다(6). 이 효소는 두 개의 아활성도를 갖는 복합체이다 : NAD를 니코틴아미드와 ADP-리보스로 절단하는 NAD 당가수분해효소 활성도 및 ADP-리보스를 G 단백질 기질로 전이시키는 전이효소 활성도. 본 명세서에 나타낸 ADP-리보실전이효소 활성도의 값은 두 활성도의 합계이다. 또한 본 발명은 A 및 A1 폴리 펩티드의 돌연변이유발된 변형체 및 그러한 폴리펩티드의 유사체 또는 유도체를 포함하는데, 그들의 천연형은 콜레라 독소 중합체 내부의 촉매 활성도의 원천(source)이다.
본 발명의 생성물인 유전공학 처리된 콜레라 독소의 유사체는 콜레라 질병의 예방을 위한 백신으로 이용하기에 적합한 재조합 DNA-유도성 물질을 제공한다. A 및 A1 소단위체의 유사체는 단독으로 또는 B 올리고머와 함께 톡소이드-기제 백신으로 사용될 수 있으며, 콜레라균의 변이체에 의해 표현형으로 발현되거나 다른 면역 벡터의 유전적 조절하에서 표현형으로 발현될 수 있다. 본 발명의 A 및 A1 소단위체의 유사체는 중요한 방어 에피토프를 포함할 수도 있기 때문에 백신내의 항원 인자로서 단독으로 사용할 수 있음을 주목해야 한다. 그러나 이들 유사체를 B 소단위체와 화합하여 사용하는 것이 더 바람직할 것이다. B 올리고머는 면역 방어를 유도하기에 유용한 중화 에피토프를 포함하고 있다(1, 3, 5). A 소단위체와 B 올리고머를 화합함으로써, B 올리고머에 의해 보다 현저한 면역원성 반응이 유도될 것이다. B 올리고머는 콜레라균으로부터 정제할 수 있으며, 택일적으로 그외의 박테리아 미생물 [예를들어, 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium) 또는 티푸스균(typhi), 바실러스(Bacillus)속 sp.], 효모 [예를들어, 사카로마이시즈 세레비시에(S. cerevisiae)] 및 바이러스 [예를들어, 종두 바이러스(Vaccinia virus) 및 아데노바이러스(adenovirus)]를 포함하는 다른 재조합 숙주 또는 E. coli 내에서의 발현에 의해 A 및 A1 소단위체와 유사한 방법으로 재조합적으로 유도할 수 있다.
본 기술에 따른 돌연변이유발로, 약독화된 활성도를 나타내는 변이체에서부터 그러한 활성도가 실질적으로 소실된 변이체에까지(즉, 5% 미만) 다양하게 감소된 촉매 활성도를 지닌 돌연변이체를 생산할 수 있다. 촉매 활성도의 소실보다는 감소가 오히려 더 큰 정도의 방어반응 및/또는 더 오래 지속되는 방어반응을 제공하는 데 유용하므로, 연구법에 있어서의 이러한 융통성이 바람직하다. 또한, 본 발명에 의해 제공된 소단위체의 유사체는 그것의 감소된 효소 활성도 때문에 반응 발생 정도가 더 낮을 것으로 예측된다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 백신 생성에 필요한 모든 CTX 소단위체를 고수준으로 직접 재조합 발현시킨다. 또한, 촉매성 소단위체의 유사체는 ADP-리보실전이효소의 촉매 활성도에 있어서 감소되거나 실질적으로 소실된 생물학적 활성도를 제공한다. 단독으로 또는 독소의 B 올리고머와 함께 사용되는 본 유사체(천연원이건 재조합 수단에 의해 유도한 것이건 간에)는 백신으로서 유용하며 천연 독소의 촉매 활성도와 관련이 있을 것이라고 일반적으로 용인되는 부작용의 가능성을 크게 감소시킨 산물을 제공할 수 있다. 본 발명의 독소 유사체는 백신 조성물로 제형화되거나 다성분 백신에 있어서 다른 면역원성 인자와 함게 사용될 수 있다.
콜레라균 독소의 A 및 B 소단위체를 암호화하는 개개의 시스트론성 요소 또는 그의 일부를 서브클로닝시킨 다음 재조합 숙주 세포계(즉, E. coli)에서 개별적으로 직접 발현시켰다. 천연 신호 펩티드 부재시(번역을 개시하기 위하여 메티오닌으로 치환), 총 세포 단백질의 2% 내지 80% 범위에서 고수주의 발현물을 수득하였다. 발현자(expressor) 세포를 발효시킨 결과 제3도에 나타난 바와 같이 성숙한 종의 rCTXA, rCTXA1 및 rCTXB를 수득하였다. 아마도 특이 효소의 결여나 이 효소로 구분되는 rCTXA의 부족으로 인하여, rCTXA가 E. coli에서 rCTXA1 및 rCTXA2로 프로세싱되지 않음을 주목해야 한다. 따라서, rCTXA는 A2 서열과 공유결합된 A1 서열을 지니고 있다.
선택된 재조합 분자에 대한 아미노산 분석을 통해 이종(천연이 아님) 메티오닐 잔기가 세포성 메티오닌 아미노펩티다제에 의해 다양한 rCTX 및 rCTXA1 소단위체로부터 실질적으로 제거되지 않는 것으로 나타났다 ; 따라서, 이들 역시 메티오닐-성숙 유사체이다. 모든 재조합 단백질을 용균 세포로부터 세포 봉입체로서 회수하였다. rCTXA가 E. Coli에서 A1 및 A2 부위로 프로세싱되지 않는 것을 제외하고는, 소단위체와 천연 소단위체는 환원 SDS-PAGE에서 실질적으로 동일한 이동양식을 갖는 것으로 밝혀졌다. 제3도에 나타난 바와 같이, E. coli에서 소단위체 CTXA, CTXA1 및 CTXB에 대한 고수준의 재조합 발현은 직접적인 비융합 방법에 의해 이루어졌다.
택일적인 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있기는 하나, 바람직한 방법 및 물질을 아래에 기술한다. 하기에 인용된 모든 참고문헌은 본원의 참고자료에 포함된다.
[CTXA, CTXA1 및 CTXB 소단위체의 재조합]
[발현에 사용하는 물질 및 방법]
[물질]
DNA 수식 효소(modifying enzyme)는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(미국 메사츄세츠 베버리 소재), 베데스다 리서치 라보라토리스(미국 매릴랜드 게터스버그 소재), 뵈링거 맨하임 바이오케미컬스(미국 인디애나 인디애나폴리스 소재) 및 인터내쇼날 바이오테크날러지스 인코포레이티드(미국 코네티컷 뉴 해븐 소재)에서 구입하였다 ; 효소는 제조자의 권고에 따라 사용하였다. 모든 화학약품 및 생화학약품은 분석시약 등급이었다. 정제된 자연발생적 콜레라 독소 및 독소 소단위체들은 시그마 케미컬 캄파니(미국 미주리 세인트루이스 소재) 및 리스트 바이올로지컬스(미국 캘리포니아 캠벨 소재)에서 구입하였다. 합성 올리고뉴클레오티드는 매튜시 및 카루더스의 화학방법으로부터 개발된 방법을 기초로 하여 합성하였다(18).
[플라스미드 및 박테리아 균주]
CTX 오페론의 일부를 포함하는 플라스미드 pRIT 10810 및 pRIT 10841(각각 ATCC 39051 및 ATCC 39053)은 미국 매릴랜드 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 수득하였다. 발현 플라스미드 pCFM1036, pCFM1146 및 pCFM1156은 암젠에서 유도하였다. 본원에 이용된 발현 벡터 시스템의 설명은 미국 특허번호 제4,710,473호(Morris)에 기술되어 있으며 본원에서 참고문헌으로 인용한다. 그러한 플라스미드는 유도 프로모터, 합성 리보좀 결합부위, 클로닝 집락(Cloning Cluster), 복제에 관한 플라스미드 기원, 전사 종결자, 플라스미드 복제수를 조절하는 유전자 및 카나마이신 내성 유전자를 포함한다. 유도된 플라스미드는 여러면에서 서로 다르다. 플라스미드 pCFM1036은 다음의 올리고뉴클레오티드 :
로 합성 PL프로모터를 함유하는 유일한 Aatll 및 EcoRl 제한부위 사이의 DNA 서열을 치환함으로써 pCFM836(미국 특허 번호 제4,710,473호 참조)으로부터 유도할 수 있다. 플라스미드는 제한 집락(restriction cluster)에 앞서는 유도 프로모터를 포함하지 않는다. 플라스미드 pCFM1146은 다음의 올리고뉴클레오티드 :
로 유일한 Clal 및 Xbal 제한부위 사이의 짧은 DNA 서열을 치환하고, 두개의 내인성 Ndel 제한 부위를 절단하여 T4 폴리머라제 효소로 말단을 채운 다음 블런트-말단 결합시킴으로써 pCFM836으로부터 유도할 수 있다. 플라스미드는 제한 집락에 바로 앞서는 합성 리보좀 결합 부위를 포함하지 않는다. 플라스미드 pCFM1156은 최적화된 합성 리보좀 결합부위를 정착시키는 다음의 올리고뉴클레오티드 :
로 유일한 Xbal 및 Kpnl 제한부위 사이의 짧은 DNA 서열을 치환함으로써 pCFM1146으로부터 유도할 수 있다. 플라스미드 pBR322, pUC18, pUC19 및 파아지 M13mp18 및 M13mp19 DNA는 베데스다 리서치 라보라토리스에서 구입하였다. E. coli FM5 세포는 C. F. Morris에게서 수득한 E. coli K-12 균주(19)로부터 캘리포니아 사우전드 오크스 암젠 인코포레이티드에서 유도하였으며 이는 삽입된 람다 파아지의 억제 유전자, Cl857을 포함한다(20). 개개의 소단위체 발현 플라스미드의 구성은 본원에 기술되어 있다. 벡터 제조, 세포 형질 전환 및 콜로니 선택은 표준 방법에 의해 수행하였다(21).
[분석방법]
DNA 서열결정은 프라이머-연장, 사슬-종결 방법을 변형시켜서 행하였다(22, 23). 단백질의 서열은 AB1 470A 가스상 마이크로시쿼네이터(microsequenator)에서 에드만 분해에 자동적으로 분석되며(24, 25), 선택-단백질의 카르복실 말단 서열을 수득하기 위해 표준 효소 방법(standard enzymatic means)을 실시하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)은 실질적으로 Laemmli에 기술된 바와 같이 실시하고(26), 폴리아크릴아미드 겔로부터의 폴리펩티드 용리는 Hunkapiller 등의 방법과 유사하게 실시하였다(27). 총 세포성 단백질 또는 총 세포 봉입체 단백질에 대한 재조합 단백질의 비율은 전체 세포 용해질을 SDS-PAGE 하고 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색한 다음 적분 밀도계측에 의해 겔 스캐닝을 하여 측정하였다.
ADP-리보실전이효소의 촉매 활성도를 측정하기 위한 검정을 다음과 같이 행하였다 : 천연 CTXA 및 재조합 소단위체들을 8M요소, 25mM 인사나트륨(pH 7.0) 및 10mM 디티올트레이톨(DTT)의 가용화 완충 용액에서 37℃로 1시간 동안 항온한 다음 냉각시키지 않고 15분 동안 10,000rpm에서 원심분리하였다. 가용화 완충용액을 부가하여 4μL 당 1㎕의 천연 또는 재조합 A1이 생성되도록 조절한 다음, 60㎕의 반응 혼합물에 부가하여(하기 참조) 얼음위에서 1시간 동안 항온하였다.
[반응 혼합물]
＊시약들은 상업원으로부터 수득하였다. 자연발생적인 CTXA는 리스트 라보라토리스(List Laboratories)로부터 얻었다. 대조로서, 요소의 결여를 제외하고는 상기와 동일한 완충용액에서 37℃로 15분간 항온하여 천연 CTXA를 분석한 다음, ADP-리보실전이효소의 활성도를 측정할 때까지 얼음 위에 놓아 두었다.
100μL의 최종 부피를 수득하기 위하여 인체 적혈구 막을 포함하는 36μL의 물 또는 완충용액(28)을 각 시료에 부가한 다음 시료들을 30℃에서 항온시켰다. 30분 후, 50μL의 5mM NAD 및 0.03% 디옥시콜산 나트륨 각 시료에 부가함으로써 반응을 종결지은 다음 반응 혼합물을 얻음 위에서 10분간 냉각시켰다. 그리고 나서 40% 트리클로로아세트산(TCA) 50μL를 부가하고, 시료들을 적어도 15분간 얼음위에 놓아 두었다 ; 이후에 물 2mL를 각 시료에 부가한 다음 침전된 단백질을 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 상청액은 제거하고 펠릿화된 단백질을 냉동시켰다. 다음날, 펠릿화된 단백질을 SDS-PAGE 하였다(26, 29). 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하고 나서 재염색하여 건조시킨 후 여러 밴드의 단백질내에 공유결합된 [32P] 표지 ADP-리보스의 함량을 측정하기 위해 오토래디오그래피를 실시하였다. 겔의 밀도계측 스캐닝(densitometric scanning) 및 오토래디오그램을 실시하여 재조합 CTXA1 및 재조합 유사체 CTXA1 단백질에 대한 고유활성도의 근사치(천연 CTXA1의 활성도에 대해 상대적임)를 수득하였다. 염색된 겔을 스캐닝하여 각 반응 혼합물에 부가된 각 단백질의 양을 어림잡았다. 오토래디오그램을 스캐닝하여 오토래디오그래피 상(image)에 대한 밀도 함수로 G 단백질 기질에 전이된 [32P] ADP-리보스의 양을 개산(槪算)하였다.
[발현 플라스미드의 구성]
전술한 바와는 달리, 보편적인 일련의 E. coli 발현 벡터로부터 모든 발현 플라스미드를 구성하였다. 제1도 및 제2도에 나타낸 제한부위를 이용하여, 개개의 콜레라 독소소단위체 유전자 단편을 분리하였다. 상류 제한부위는 소단위체의 성숙하고 프로세싱된 형(즉, 신호 서열 없음)의 아미노-말단 잔기에 대한 코돈 바로 안쪽에 있다. E. coli에서의 재조합 발현을 목적으로, 소단위체 유사체의 “메티오닐-성숙”형을 발현시키기 위하여 천연 신호 펩티드를 암호화하는 CTX 유전자의 일부를 삭제하고 메티오닌 개시 코돈으로 치환시켰다. 합성 프로모터 및 리보좀 결합부위 하류 최적 거리에서 발현 플라스미드내로 유전자 단편을 삽입시키기 위해 합성 올리고뉴클레오티드 링커를 이용하였다. 상류 링커들은 각 유전자의 해독 프레임을 성숙한 아미노 말단의 첫째 코돈 안쪽을 복귀시켰다. 올리고뉴클레오티드는 메티오닐 개시 코돈을 함유하였다.
각각의 플라스미드 구성물로 E. Coli FM5 세포를 형질전환시키고 카나 마이신을 함유한 한천상에 평판화시킨 다음, 적당한 수의 콜로니를 선택하여 레플리카-평판화시키고, 소량의 액체 배양액(미니플렙)으로 배양한 후 4시간 동안 42℃에서 유도하였다. 그런 다음 박테리아 세포내세포 봉입체의 존재여부를 알아보기 위해 광학 현미경으로 미니플렙을 선별하였다. 뚜렷한 봉입을 나타내는 시료를 확인하고 레플리카 평판에서 그에 해당하는 콜로니를 취해 유도 온도에서 플라스크-규모의 실험실 발효를 실시하였다. 유도후 여러 회에 걸쳐 발효물을 취하여 SDS-PAGE하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 적당한 CTX 소단위체의 양상에 대해 관찰하였다. 각 발현 클론으로부터의 플라스미드 구조는 분리된 플라스미드의 제한 지도화에 의해 확인하고 결합부위(junction region)의 DNA 서열결정에 의해 입증하였다.
[재조합 CTX, CTXA1 및 CTXB의 발현]
CTXT 발현 플라스미드(pCTXA/A7/1156), CTXA1 발현 플라스미드(pCTXA1/A7/1156) 및 pCTXB 발현 플라스미드(pCTXB/1156)를 포함하는 E. coli 세포를 37℃ 및 42℃에서 발효시키면, 각기 약 27,215달톤, 21,817달톤 및 11,600달톤의 주요 세포내 단백질(제3도)이 생성되었다 ; 재조합 CTXA1 및 CTXB는 SDS-PAGE에서 각기 원래의 (천연) CTXA1 및 CTXB와 함께 이동하였다. 본 재조합 CTXA는 천연 CTXA가 유기체로부터 분비되기 이전 몇몇 시점에서 콜레라균 단백질 분해효소에 의해 CTXA1 및 CTXA2로 절단되기 때문에 천연 상대물이 없다 ; A1 및 A2는 SDS-PAGE에 사용한 완충용액에 의해 환원되는 이황화물 결합에 의해 결합되어 있다. 아미노산 서열을 부분적으로 분석하여 재조합 폴리펩티드 CTXA1/A7 및 CTXA1/L7(하기 참조)이 천연 CTXA1 소단위체에 대하여 예측한 아미노 말단 서열은 지니고 있으나, 이종 개시 메티오닌 잔기는 실질적으로 제거되지 않았음을 입증하였다.
[재조합 CTX 소단위체의 특성]
가령 존재한다 해도, 매우 적은 양의 CTX 소단위체들이 E. coli 세포로부터 분비되는 것처럼 보인다. 각 소단위체의 대부분은 세포 봉입체의 형태로 발견되었으며 총 세포성 단백질의 2% 내지 80%를 차지한다. 프렌치 프레스(French press) 및 저속 원심분리에 의한 세포 용해로 각각의 소단위체로서 그들 단백질의 80% 까지를 포함하는 펠릿 분획을 수득했다. 모든 rCTX 소단위체는 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 겔에서 검출 가능하였다(제3도 참조).
[CTXA 및 CTXA1 유사체]
단백질 공학과 부위-특이 돌연변이 유발(19, 30) 기술을 이용하여 CTXA 및 CTXA1 유사체를 제조하였다. 이러한 중재 시간에 의해 시험되고 제조된 상기 유사체로부터 아르기닌-7, 히스티딘-44, 히스티딘-70, 글루타민산-112 및 아스파르트산-9의 위치에 있는 아미노산 잔기의 돌연변이유발 및 카르복실 말단(성숙한 천연 CTXA 서열의 트립토판-179)의 절단결과 ADP-리보실전이효소의 활성도가 감소하거나 실질적으로 소실된다는 사실을 알았다.
[CTXA 발현 플라스미드의 구성]
플라스미드 pRlT10841(ATCC 39053)을 제한효소 Xbal과 Clal으로 절단하여 552-bp DNA 단편을 겔 전기 영동으로 분리하였는데, 이 단편은 CTXA 절단시 CTXA1과 CTXA2가 되는 단백질분해효소-민감 부분을 암호하는 부위와 일치하는 CTXA 유전자의 좌측 말단을 포함한다. 플라스미드 pRlT10810(ATCC 39051)을 제한효소 Clal과 Hindll[후자는 Hinc ll의 이소스키조머(isoschizomer)임]로 절단하여 368-bp DNA 단편을 분리하였는데, 이 단편은 단백질분해효소-민감 부위(Clal 부위에 암호됨)(16, 17)에서 CTXA의 종결 코돈을 지나 CTXA2 부분까지의 CTXA 소단위체 부분을 암호하며 CTXB 소단위체의 택일적인 전사 해독 프레임까지 암호된다.
성숙한 단백질 서열의 제1 아미노산(아스파라긴)을 암호하는 부위로 부터 Xbal 부위까지의 CTXA의 전사 해독 프레임을 재구성하기 위하여 합성 올리고뉴클레오티드 링커를 제조하였다. 상기 링커는 신호 펩티드를 암호하는 서열을 치환하는 메티오닌 개시 코돈을 생산하고 발현 벡터내로 유전자 구조물이 용이하게 삽입될 수 있도록 그의 좌측 말단이 Ndel 점착성을 갖는다. 상기 링커의 우측 말단은 Xbal 중북부를 포함한다. 또한 이 링커는 다음과 같은 서열을 포함한다 :
플라스미드 pUC19(ATCC 37254)를 Ndel과 Xbal으로 절단한 후 상기 링커를 삽입하였다. 결합 및 형질전환 후, 정상적인 pUC19 Ndel-Xbal 서열 대신 링커 서열을 포함하는 pUC 플라스미드를 분리하여 p2A/pUC19로 명령하였다.
플라스미드 p2A/pUC19를 Xbal과 Hinc ll로 절단하였다. 절단으로 생긴 긴 단편을 CTXA 유전자의 좌측 말단을 포함하는 552-bp Xbal-Clal DNA 단편 및 CTXA 유전자의 우측 말단을 포함하는 368-bp Clal-Hind ll DNA 단편(종결 코돈을 지나 CTXB 소단위체의 택일적인 전사 해독 프레임까지도 포함됨)과 함께 결합시켰다. 위와 같이 생산되고 전반적으로 성숙한 CTXA 유전자를 포함하는 신규한 플라스미드를 pCTA/A7/pUC19라 명명하였다.
E. coli 발현 플라스미드인 pCFM1156을 Ndel과 Hind lll로 절단시켜 상기 플라스미드의 클로닝 집락의 짧은 부분을 제거하였다. 또한 플라스미드 pCTXA/A7/pUC19를 Ndel과 Hind lll로 절단하고, CTXA 유전자의 전부위를 포함하는 DNA 단편(772-bp)을 분리하였다. 그후 이 단편을 절단된 pCFM1156 플라스미드 내로 결합시켜 CTXA 발현 플라스미드인 pCTXA/A7/1156을 제조하였다. 이 Ndel-Ndel 단편을 두 방향 중 하나로 pCFM1156 내로 삽입할 수 있는데, 그 중 단 하나만이 발현시 거대 단백질을 발현하는 전사 해독 프레임을 생산해낼 수 있다. 이 클론을(제조합 CTXA 단백질을 확인하기 위해 SDS-PAGE로 유도된 클론을 분석함으로써) 선별한 후 Ndel 접합 부위의 상류에서 DNA 서열결정을 통해 적합한 방향을 확인하였다.
[CTXB 발현 플라스미드의 구성]
플라스미드 pRlT10810(ATCC 39051)을 Clal과 BstXl으로 절단한 후 538-bp의 DNA 단편을 분리하였다 ; 이 단편은 CTXA의 A2의 암호 부분, CTXB 암호 부분 전체 및 CTXB의 종결 코돈 오른쪽의 짧은 DNA 서열을 포함한다.
pUC19 내의 상기 DNA 서열의 우측 말단 클로닝을 가능케하는 합성 올리고뉴클레오티드 링커를 제조하였다. 이 링커는 BstXl과 Hind lll 코히시브 말단을 가지며 다음과 같은 서열을 갖는다 ;
플라스미드 pUC19를 Hind lll와 Accl(후자는 Clal에 의해 생산된 것과 양립하는 코히시브 말단을 생산함)으로 절단하였다. CTXB를 함유하는 538-bp의 Clal-BstXl DNA 단편 및 BstXl-Hind lll 링커를 긴 pUC19 단편과 결합시켜 pCTXB/pUC19이라 명명한 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드를 Hind lll와 Sspl(후자는 CTXB의 개시코돈 내부와 Clal 부위로부터 상류에 위치함)으로 절단하였다.
Ndel과 Sspl의 코히시브 말단과 다음 서열을 갖는 합성 올리고 뉴클레오티드 링커를 제조하였다 :
플라스미드 pCFM1156를 Ndel과 Hind lll로 절단하여 이 플라스미드의 클로닝 집락 부분을 제거하였다. 그런 다음 CTXB 유전자 부분을 함유하는 345-bp의 Sspl-Hind lll 단편 및 Ndel-Sspl 링커를 긴 pCFM1156 DNA 단편과 결합시켜 단백질 합성을 개시하기 위해 그의 좌측 암호 부위를 복원하고 이 암호 부위의 왼쪽에 메티오닌 코돈을 삽입하였다. 메티오닌 개시 코돈과 CTXB 유전자 전체를 포함하는 이 후속 발현 플라스미드를 pCTXB/1156이라 명명하였다.
[링커 돌연변이유발]
CTXA 내의 아르기닌-7을 리신 코돈으로 치환하기 위해 L7 이라 불리는 올리고뉴클레오티드 링커를 합성하였다. Ndel과 Xbal의 코히시브 말단을 갖는 상기 링커의 서열을 표 1에 나타냈다. L7 링커를 pUC19의 Ndel-Xbal 부위내로 클로닝하여 pL7/pUC19 이라 불리는 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 pL7/pUC19를 Xbal과 Hind lll로 절단하여 pUC19의 클로닝 집락 부분을 제거하고 CTXA 유전자의 좌측 말단을 포함하는 552-bp의 Xbal-Clal DNA 단편(상기 참조) 및 이 유전자의 우측 말단을 포함하는 368-bp의 Clal-Hind ll DNA 단편(상기 참조)과의 결합을 통해 치환시켰다. pCTXA/pUC19이라 명명한 이 플라스미드를 Ndel으로 절단하고 아르기닌-7 코돈이 리신 코돈으로 치환된 성숙한 CTXA 유전자 전체를 포함하는 772-bp의 DNA 단편을 분리하였다. 플라스미드 pCFM1156를 Ndel으로 절단하고 pCTXA/L7/pUC19의 Ndel DNA 단편과 결합시켰다. 이러한 결합으로, E. coli 내에서 CTXA의 Arg7-Lys 유사체 성숙형의 발현에 사용하는 pCTXA/L7/1156 플라스미드를 제조하였다. pCTXA/A7/1156(상기 참조)의 경우처럼, 상기 플라스미드는 rCTXA/L7의 합성에 적합한 전사 해독 프레임내에 DNA 삽입물을 함유하고 있는 이러한 플라스미드를 포함하는 클론을 선택하기 위해 필수적이다.
각각 티로신-6 대신 페닐알라닌 코돈, 아스파테이트-9 대신 글루타민산 코돈으로 개별적으로 치환시키기 위해 올리고뉴클레오티드 링커 1E와 1F를 합성하였다. 이 링커는 Nde l과 Xbal의 점착성 말단을 포함하고 서열은 표 1에 나타냈다. 플라스미드 pCTXA/A7/pUC19(상기 참조)를 Xbal과 Hind lll로 절단하여 CTXA 유전자의 우측 부분을 포함하는 938-bp의 DNA 단편을 분리하였다. 플라스미드 pCFM1156를 Nde l과 Hind lll로 절단하여 그의 클로닝 집락의 짧은 부분을 제거하였다. Tyr6→Phe 또는 Asp9→Glu 코돈 돌연변이체(각각, 링커 1E와 1F) 중의 하나와 CTXA 유전자의 938-bp DNA 단편을 포함하는 Nde 1-Xba l 링커와 이 단편을 결합시킴으로써 치환하였다. 그 결과 Tyr6→Phe 또는 Asp9→Glu CTXA 유사체의 성숙형을, E. coli에서 발현시키기에 적합한 2개의 플라스미드 pCTXA/1E/1156과 pCTXA/1F/1156이 제조되었다.
프롤린-185 대신에 글루타민을 암호하고 시스테인-187 대신에 알라닌을 암호하는 돌연변이 서열로 치환한 결과 CTXA 소단위체의 CTXA1 부분만을 암호하는 CTXA 유전자 단편이 생성되었다(CTXA 유전자와 그것의 치환 유사체로 부터 천연-서열 CTXA1 유전자 및 CTXA1의 L7, 1E 및 1F 치환 유사체를 각각 구성하기 위해서는 하기를 참조하라), 프롤린-185 대신 글루타민을, 시스테인-187 대신 알라닌을 각각 개별적으로 귀환시키기 위해 올리고뉴클레오티드 링커 1G와 1H를 합성하였다. 이 링커는 Dsal과 Hind lll 코히시브 말단을 가지며 표 1에 기술된 서열을 갖는다. 유사체 단백질을 암호하는 발현 플라스미드를 구성하기 위해 537-bp Ndel-Dsal DNA 단편을 플라스미드 pCTXA/A7/pUC19으로부터 분리하였다. 그런 다음 플라스미드 pCFM 1156을 Ndel과 Hind lll로 절단하여 그의 클로닝 지락의 짧은 단편을 제거하였다. 이 단편을 pCTXA/A7/pUC19의 537-bp DNA단편 및 1G 또는 1H 합성 올리고뉴클레오티드 중의 하나와 결합함으로써 치환된다. 또한 특이 아미노산 치환체를 암호화하는 상기 링커를, CTXA 소단위체의 A2 부위를 암호하는 부분인 CTXA 유전자로부터 제거한다; 따라서 돌연변이는 주로 소단위체의 CTXA1 변형체내에 존재한다. CTXA1의 Pro185→Gln 및 Cys187→Ala 유사체의 발현을 위해 결과적으로 생성된 플라스미드를 각각 pCTXA1/1G/1156 및 pCTXA1/1H/1156이라 명령하였다.
Trp179에서 종결되는 CTXA1의 카르복실-말단이 절단된 변형체를 발현하는 플라스미드를 구성하였다. 우선 Nde 1과 Hind lll로 플라스미드 pCFM1156을 절단하여 그의 짧은 DNA 단편을 제거하였다. pCFM1156 내의 이 부위 내로 pCTXA/A7/pUC19의 537-bp Ndel-Dsal 단편(상기 참조) 및 다음과 같은 서열을 갖는 Dsal과 Hind lll 코히시브 말단을 갖는 합성 DNA 단편을 결합시켰다 :
Trp179위치가 절단된 CTXA1의 발현을 위한 이 플라스미드를 pCTXA1/T1/1156이라 명명하였다.
[부위 특이 프라이밍(priming)에 의한 돌연변이유발]
프로메가코포레이션(미국 위스콘신 매디슨 소재)으로부터 구입한 “Altered SitesTM시험관내 돌연변이유발 시스템”키드로 부위 특이 프라이밍에 의한 돌연변이 유발을 수행하였다 ; 이 방법에 대한 실험 프로토콜의 상세한 설명은 프로메가 코포레이션(인쇄물 1/90)으로부터 구입가능한 기술 안내서에 기재되어 있다. 돌연변이유발을 촉진시키기 위하여, CTXA 소단위체 부분을 암호하는 938-bp의 Xba l-Hind lll DNA 단편을 플라스미드 pCTXA/A7/pUC19(상가 참조)에서 분리하였다. 이 단편을 프로메가 코포레이션(미국 위스콘신 매디슨 소재)으로부터 구입한 pSELECT1 파아지미드(phagemid) 벡터내로 클로닝시켰다. 헬퍼 파아지로 채워넣은 후 이 벡터는 CTXA 단편의 음성-센스 복제물을 포함하였다. 돌연변이유발을 일으키기 위해 일련의 단일-가닥 양성-센스 DNA 프라이머를 합성하였다 ; 이 프라이머(1B, 1C, 1D 및 1l)의 서열은 표 1에 나타냈다. 개별적으로 CTXA 유전자 단편을 포함하는 단일-가닥 파아지미드와 이 프라이머를 어닐링시켰다 ; 결과적으로 상기 유전자 단편을 포함하고 프라이머에 의해 암호되는 각각의 코돈 치환체를 포함하는 이중-가닥 파아지미드가 생산되었다.
아르기닌-146이 리신으로 치환된 CTXA1 소단위체 유사체와 CTXA를 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조하기 위하여 Arg146→Lys코돈 돌연변이(1l)를 포함하는 이중-가닥 파아지미드로부터 207-bp의 BstXl-Cla DNA 단편을 분리하였다. CTXA 유전자 부분을 포함하는 375-bp의 Ndel-BstXl DNA 단편과 386-bp의 Clal-Hind lll 단편(CTXA 변형체)를 플라스미드 pCTXA/A7/pUC19으로부터 분리하였다. 플라스미드 pCFM1156를 Ndel과 Hind lll로 절단하여 그의 클로닝 집락의 짧은 부분을 제거하였다. Arg146→Lys 돌연변이의 CTXA 변형체를 구성하기 위하여, 절단된 pCFM1156 플라스미드를 pCTXA/A7/pUC19으로부터의 375-bp의 Ndel-BstXl 단편, 이중-가닥 파아지미드로부터 분리된 209-bp의 BstXl-Clal 단편 및 pCTXA/A7/pUC19으로부터의 386-bp의 Clal-Hind lll DNA 단편과 결합시켰다. 그 결과 E. coli 내에서 CTXA 소단위체의 Arg145→Lys 유사체의 발현을 가능케하는 pCTXA/11/1156이라 명명한 플라스미드를 제조하였다. 소단위체의 CTXA1 변형체 내에서 이러한 돌연변이를 구성하기 위해, pCTXA/A7/pUC19으로부터의 375-bp의 Ndel-BstXl 단편, 이중-가닥 파아지미드로부터 분리된 209-bp의 BstXl-Clal 단편 및 A1 부위의 말단을 암호하고 CTXA1의 말단에서 폴리펩티드 합성을 종결하는 코돈을 포함하는 DNA 서열로 CTXA의 A2 부위를 암호하는 CTXA 부위를 치환한 합성 올리고뉴클레오티드 링커와 절단된 pCFM1156 플라스미드를 결합시켰다. 이 링커는 Clal과 Hind lll의 코히시브 말단을 가지며 다음과 같은 서열을 갖는다 :
E. coli 내에서 CTXA1의 Arg146→Lys 유사체를 발현시키기 위해 결과적으로 생성시킨 플라스미드를 pCTXA1/11/1156이라 명명하였다.
His44→Asn, His70→Asn 또는 Glu112→Gln의 치환체를 포함하는 CTXA 유사체 각각을 발현시킬 수 있는 플라스미드는 표 1에 나타낸 서열을 갖는 프라이머(각각 1B, 1C, 및 1D)로 용이하게 제조하였다. pCTXA/A7/pUC19으로부터의 938-bp의 Xbal-Hind lll CTXA 단편(상기 참조)을 포함하고 이중-가닥 플라스미드를 재생시키는 pSELECT1 파아지미드에 대해 개별적으로 상기 프라이머를 어닐링한 후 부위-특이 돌연변이를 포함하는 부위를 Xbal과 Hind lll로 절단하여 플라스미드로부터 제거함으로써, 각각의 경우 938-b의 DNA 단편을 회수하였다. 플라스미드 p2A/pUC19(성숙한 CTXA의 좌측 말단을 암호하는 Ndel-Xbal링커 포함 ; 상기 참조)를 Xbal과 Hind lll로 절단하여 링커 삽입물의 오른쪽 pUC19 클로닝 집락의 짧은 부위를 제거하였다 ; 단일 코돈을 치환한 플라스미드로부터의 938-b의 Xbal-Hind lll 단편과 이 부위를 결합시킴으로써 치환한다. 일련의 pUC-유도 플라스미드를 pCTXA/1B/pUC19, pCTXA/1C/pUC19 및 pCTXA/1D/pUC19이라 명명하였는데, 이러한 명명은 그들이 포함하는 코돈 치환체에 의해 이루어진다. 코돈 치환체를 포함하는 DNA 단편은 이후에 이러한 각각의 플라스미드로부터 제거된다. 플라스미드 CTXA/A7/pUC19를 BstX1과 Hind lll로 절단하여 593-bp의 DNA 단편을 분리하였다. 플라스미드 pCFM1156를 Nde 1과 Hind lll로 절단하여 상기 기술한 바와 같이 그의 클로닝 집락의 짧은 부위를 제거하였고 이 부분은 상기 pUC 전이 플라스미드로부터 회수된 각각의 CTXA 유사체 유전자 삽입물 및 pCTXA/A7/pUC19으로부터 분리된 593-bp의 BstX1-Hind lll DNA 단편과 결합함으로써 치환된다. 분리시, E. coli 내에서 CTXA의 His44→Asn, His70→Asn 및 Glu112→Gln의 부위-특이 유사체 발현을 가능케하는 이러한 신규한 플라스미드를 각각 pCTXA/1B/1156, pCTXA/1C/1156 및 pCTXA/1D/1156이라 명명하였다.
[CTXA와 CTXA 유사체 유전자의 CTXA1과 CTXA1 유사체 유전자로의 전환]
A2-암호 부위를 결실시키기 위한 돌연변이유발 과정중에 구성된 1l 코돈 삽입물을 포함하는 플라스미드(pCTXA1/1l/1156)를 제외하고는, 감소된 완전독소 제제내의 이러한 소단위체 천연종들과 흡사한 A1 절단 CTXA 변형체를 발현시키기 위해 CTXA 유전자-함유 및 선택된 개별 유사체 유전자-함유 발현 플라스미드를 CTXA1 발현 플라스미드로 전환시키는 데 유용하였다. 이와 같이 전환시키기 위해 유일한 Clal 부위의 오른쪽에 있는 CTXA 유전자(및 유사체 유전자)의 유전자 서열 부분을 삭제하는 것이 필수적이다. A1과 A2 부위 사이의 실제 폴리펩티드 절단 부위가 선행기술 문헌(16, 17)에서 확정되지는 않았으나, 처음으로 세린-194에서 A1의 카르복실 말단을 확인하였다 ; 그러나, 아르기닌-192(상기 문헌에 제안된 다른 말단)에 있는 말단을 확인하는 일은 아르기닌-192 코돈의 바로 오른쪽 종결 코돈을 치환하기 위해 신규한 링커를 삽입하는 문제에 불과함을 명심해야 한다.
CTXA 유사체 서열(및 천연 CTXA 서열) 각각이 CTXA1 변형체로 전환되도록 하기 위해 제한 효소 Ndel(메티오닌 개시 코돈을 암호하는 서열에서 절단됨)과 Clal(세린-194 코돈의 바로 오른쪽에 있는 종결 코돈의 부가용으로 선택한 부위에서 절단됨)으로 그들의 pUC19 전이 플라스미드(예를 들면, pCTXA/A7/pUCl9, pCTXA/1B/pUC19, pCTXA/1C/pUC19, pCTXA/1D/pUC19, pCTXA/1E/pUC19, pCTXA/1F/pUC19, pCTXA/1G/pUC19, pCTXA/1H/pUC19)를 절단하였다 ; 이 DNA 단편은 각각의 경우 585-bp이다. A2-암호 부위를 종결 코돈으로 치환한 다음 플라스미드 pCFM1156 내로 유전자 단편을 결합시킬 목적으로 Clal과 Hind lll 코히시브 말단을 포함하는 올리고뉴클레오티드 링커를 합성하였고 그 서열은 다음과 같다 :
플라스미드 pCFM1156을 Ndel과 Hind lll로 절단하여 그의 클로닝 집락 부분을 제거하였다 ; Clal-Hind lll 링커 및 상기 기술한 pUC 전이 플라스미드 중의 하나로부터 분리한 각각의 585-bp DNA 단편과 상기 부분을 결합시킴으로써 치환하였다. 이러한 결합 후 플라스미드 DNA를 분리하면, E. coli 내에서 CTXA1과 CTXA1 유사체 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 일련의 플라스미드가 수득된다 ; 이러한 방법으로 제조된 플라스미드는 pCTXA1/1B/1156, pCTXA1/1C/1156, pCTXA1/1D/1156, pCTXA1/1E/1156 및 pCTXA1/1F/1156 등을 포함한다.
[CTXA와 제조합 유사체의 발현 및 분석]
제조 후, 각각의 플라스미드는 신선한 각각의 제제, FM5 감응 세포를 형질전환시키는 데 사용된다. 형질전환체를 취하여 미니프렙으로 성장시키고 유도하여 재조합 단백질을 생산하고, 세포 봉입체-양성 시료를 광학 현미경으로 확인하였다. 유도 온도에서 이 시료를 대규모(≥1ℓ)로 발효시켜 대량의 각각의 재조합 유사체 단백질을 제조하였다. 1mM DTT를 함유하는 증류 H2O에 분리된 세포 페이스트를 재혁탁시킨 후 프렌치 프레스(French Press)로 용균하였다. 간단한 저속 원심분리를 통해 상기 용균액으로 부터 세포 봉입체를 분리하였다. 이 세포 봉입체 단백질 제제는 재조합 단백질의 최소한 2%, 최대한 80%를 포함한다. 앞서 기술한 바와 같이 이 시료의 ADP-리보실전이효소 활성도를 측정하였다. 수득된 결과는 제4, 5, 6도 및 표 2에 나타나 있다.
[표 1]
[표 2]
1각각의 ADP-리보실전이효소 분석(제4도 참조)에 사용된 각각의 단백질 절대량을 상기 분석에 사용된 각각의 단백질의 동량을 포함하는 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔(제4도, 패널 A)의 밀도계측 스캐닝으로 측정하였다. 각각의 CTXA1 단백질 제제에 의해 리보실화된 G 단백질 알파 소단위체의 방사성 사진 밀도를 측정하기 위해 후속적으로 인체 적혈구막을 포함하는 겔의 오토래디오그램(제4도, 패널 G)을 스캐닝하였다. 요소가 첨가되지 않은 시판용 CTXA1에 의한 ADP-리보실화로 생기 G 단백질 밴드 밀도를 1.00으로 정한 다음, 다른 CTXA1 단백질에 의한 리보실화로 생긴 밴드 밀도를 그의 밀도 백분율로 이 제제와 결부시켰다. 그런 다음 염색된 겔의 밀도계측 스캐닝을 기초로, 부가된 CTXA1 단백질 1.00㎍에 대해 이 분획을 표준화하였다.
2분석시 시판용 CTXA1(요소 비첨가)의 양은 1.00㎍을 취하였다.
3시판용 CTXA1(요소 비첨가)에 의해 ADP-리보실화된 G 단백질 알파 소단위체의 방사성 사진 밀도를 1.00으로 정하였다.
제4도는 rCTXA1의 세포 봉입체 제제와 그의 부위-특이 유사체의 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔(패널 A)을 도시한 것이다. 이 겔에 나타난 것과 동량의 단백질을 각각의 ADP-리보실전이효소 반응을 촉매하는 데 이용하였다. 상기 반응으로부터 얻은 트리클로로아세트산(TCA) 침전물을 SDS-PAGE에 런닝시키고 [32P] ADP-리보스-표지된 기질을 확인하기 위해 겔을 오토래디오그래피하였다. 패널 B는 G 단백질이 첨가되지 않은 반응물을 함유하는 인체 적혈구막 제제에 대한 결과를 나타낸 것이고 패널 C는 이러한 부가 기질과의 반응을 나타낸다.
이 실험에서 발견한 가장 중요한 것은 제4도의 패널 C에 밝혔다(또한 패널 B에서 입증함) : 특정한 부위-특이 아미노산 잔기 치환으로 본 분석에서 측정된 효소 활성도는 감소되거나 때때로 완전히 소실된다. 이러한 관점에서, rCTXA1/L7(Arg7→ys), rCTXA1/1B(His44→Asn)과 rCTXA1/1D(Glu112→Gln) 유사체 소단위체가 실질적으로 효소 활성도를 갖지 않는 것으로 나타난 반면 유사체 rCTXA1/1C(His70→Asn)과 rCTXA1/1F(Asp9→Glu)는 천연 CTXA(요소 참가)와 rCTXA1/A7(아미노 말단에 메티오닌 잔기를 갖는 것 이외에는 돌연변이되지 않음)에 비해 감소된 활성도를 갖는 것으로 나타났다. 또한 Trp179에서 절단된 유사체 A 소단위체(rCTXA1/T1/1156)는 효소 활성도가 상당히 감소하였다.
이러한 오토래디오그래피 분석으로 효소 활성도를 정확히 정량할 수는 없으나, 제4도의 겔과 오토래디오그램의 숫자적 의미를 가시적으로 관찰할 수 있도록 하였다. 이러한 수치는 표 2에 밝혔다.
이때 분석시 첨가된 각각의 단백질의 상대량을 좀더 정확하게 산출하기 위해, rCTXA1과 앞서 기술한 각각의 유사체를 포함하는 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔(제4도, 패널 A)에 대하여 적분 스캐닝 밀도를 계측하였다 ; 이 양은 분석시 첨가되는 천연 CTXA(요소 비첨가)내에 있는 Al 소단위체의 양(1.00㎍을 취함)에 대하여 산출되었다. 각각의 단백질 동량(각각의 세포 봉입체 제제내에 있는 소단위체 단백질의 백분율을 기초로 산정)을 상기 분석에 사용하였음에도 불구하고, 이 측정값은 정확성이 떨어진다. G 단백질 기질과 효소 반응의 오토래디오그램(제4도, 패널 C)에 대한 밀도를 계측하여 100%로 정한 천연 CTXA(요소 비첨가)에 의해 표지된 것과 비교함으로써, 방사성표지된 G 단백질 α 소단위체 밴드의 방사성사진 상(image)의 상대 밀도를 결정하였다. 대략적인-상대적 고유 활성도는 참가된 효소량으로 상의 밀도를 나눠서 산출하며, 천연 CTX(요소 비첨가)의 고유 활성도를 1.00으로 하였다. 이러한 정량 결과는 특정한 실험적 한계, 예를 들어 각각의 소단위체 제제가 동일한 염료에 의해 염색되고 동일한 밴드를 선택하며 밀도 계측시 동일한 구역에 대하여 계수화하였고 동일한 밀도계 반응 특성을 갖는다는 가정 및 [32P] ADP-리보스 표지화와 방사성 사진 밀도가 선형 관계를 갖는다는 가정하에 성립됨을 주의해야 할 것이다. 그럼에도 불구하고, 결과(표 2)는 오토래디오그램에서 가시적으로 관찰할 수 있는 수치로 나타낸다 : rCTXA1/1C(His70→Asn), rCTXA1/1F(Asp9→Glu) 및 rCTXA1/T1(Trp179절단) 유사체의 효소 활성도의 현저한 감소와 rCTXA1/L7(Arg7→Lys), rCTXA1/1B(His44→Asn) 및 rCTXA1/1D(Glu1112→Glu) 유사체의 활성도의 실질적 손실.
외인성 기질이 첨가되지 않을 경우(제4도, 패널 B), 천연 CTXA와 효소적으로 활성인 CTXA1 단백질은 둘다 자체촉매 즉, 효소가 자신에 대한 NAD 가수분해와 ADP-리보스의 전이(시스, 트랜스 또는 둘다)를 촉매하는 것으로 볼 수 있다. 오토래디오그램에 나타난 다중 밴드는 ADP를 리보실화하는 능력을 갖는 E. coli 단백질의 오염물 때문일 것이다 ; 택일적으로, 가망없는 이야기지만, 이들은 소단위체 단백질의 소수의 변형체를 나타내는 것일 수도 있다(예를 들면, 단백질 가수분해로 절단되거나, SDS 내에 일부 잔존하는 2차 구조를 갖는 변형체일 수도 있다). 재조합 CTXA1 제제는 천연 CTX의 A 소단위체보다 자체촉매 과정에서 침전시킬 수 있는 능력이 더 큰 것으로 나타났다. 오토리보실화가 증가하는 이유에 대하여 현재로서 알려진 것은 없지만, 이미 복원된 재조합 단백질에 의해 기질 특이성이 결핍되거나 부적합한 2차 구조를 가짐으로써 재조합 단백질내 민감한 리보실화 부위가 노출되었거나(본원의 특정 실험에서 천연 입체형태를 얻기 위한 시도는 없었다) 또는 자체촉매작용을 안정시키는 원형 재조합 제제내에 ARF(ADP-리보실화 인자)(31-37)가 존재하는 것과 관계가 있을 것이다. 그러나, G 단백질 기질을 위해 적혈구막의 형태로 가할 때(패널 C) ADP-리보실전이효소 반응의 초점은 오토리보실화를 켄칭시키는 이 기질로 옮겨진다.
제5도는 rCTXA1 유사체에서 나타나는 효소 활성도의 손실 및 감소와 동일한 일반적인 형태가, 재조합 소단위체의 rCTXA 변형체(즉, 여전히 공유 결합된 A2 “꼬리“를 갖는 변형체)내에서 동일 잔기 치환이 이루어질 때에도 관찰되었음을 설명하고 있다. 그러나, A2 부위가 존재함으로써 효소적으로 활성인 단백질의 ADP-리보실전이효소가 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 감소는 제6도에 좀더 분명하게 설명되어 있으며 동량의 rCTXA와 rCTXA1을 효소 분석에 이용하고(패널 A), 방사성 표지된 산물을 동일 겔에서 런닝시키면 결과적으로 동일한 오토래디오그래피 노출 시간(패널 B)을 나타낸다. 나타난 바와 같이 rCTXA1은 rCTXA 보다 더 큰 활성도를 갖는다(레인 7과 4비교). 또한 Arg7→Lys 치환체를 갖는 소단위체 구성물 중 어느 것도 G 단백질 기질에 대해 측정가능한 ADP-리보실전이효소 활성도를 갖지 않는다. 유사체내에서 효소 활성도의 손실이 촉매작용을 억제하는 E. coli 오염물에서 기인하지 않는다는 것은, E, coli에서 생산되는 유사체-함유 제제(레인 6과 9)의 존재하에서 G 단백질을 리보실화하는 천연 CTXA의 능력에 의해 분명해진다.
독성 활성도(ADP-리보실전이효소)의 주요 표식의 실질적인 제거 또는 그들의 감소로 인해, 그들의 rCTXA 유사체 상대물 뿐만 아니라 pCTXA1/L7/1156, pCTXA1/1B/1156, pCTXA1/1C/1156, pCTXA1/1D/1156, pCTXA1/1F/1156 및 pCTXA1/T1/1156 클론에 의해 생산된 재조합 CTXA1 유사체 분자는 더 안전한 백신내에서 CTXB와 결합하거나 단독으로 적용될 것으로 예상된다. 상기 기술한 돌연변이는 천연 CTX 소단위체의 일반적이고 방어적이며 면역원성인 특성을 감소시킨다고 여겨지지는 않는다. 따라서 본 발명의 CTXA와 CTXA1 유사체는 완전 톡소이드 형태로 CTXB 소단위체와 결합시켜 적용한다. CTXB 소단위체는 CTXA와 CTXA1에 대한 면역 반응을 증가시키며 또한 그 역도 성립하고, 각각은 방어 에피토프를 가질 것이다. CTXB 소단위체는 콜레라균으로부터 유도될 수 있고 소단위체 및 그들의 유사체를 유전공학 처리할 수도 있다. 유전공학 처리된 소단위체 산물은 융합 단백질 및 비융합 단백질을 포함할 수 있다.
상기 기술한 것과 동일한 전략을 콜레라 독소의 CTXA 소단위체의 부가적인 재조합 유사체를 제조하는 데 사용하였다. 합성 올리고뉴클레오티드는 표 3에 기술한 링커 돌연변이유발 또는 부위-특이 프라이밍에 의한 돌연변이유발에 의해 코돈을 치환하는 데 이용하였다. 간단히 말해서, 합성 올리고뉴클레오디드가 적합한 코돈 치환을 갖는 것을 제외하고는 유사체 CTXA1/1F(Asp9→Glu)에 대한 상기 기술한 바와 동일한 링커 돌연변이유발에 의해 유사체 CTXA1/1J(Asp9→Tyr)를 제조하였다. 유사체 CTXA1/1K(Ser10→Gly), CTXA1/1L(Arg11→Lys) 및 CTXA1/1M(Arg11→His) 구성물의 경우, 다음과 같은 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 부위-특이 프라이밍에 의해 신규한 Drall(Eco01091로 공지됨)를 CTXA1 유전자내로 삽입하였다 :
이 부위를 삽입함으로써 유전자 중 이 부위에서 링커 돌연변이유발을 가능하게 하여(상기 언급한 삽입부위의 왼쪽에 존재하는 상기 Ndel 부위 및 삽입부위의 오른쪽에 새로 생긴 Drall 부위를 이용) 이들 세 유사체를 생성시키는 코돈 교체를 이룬다. 부위-특이 프라이밍은 결과적으로 유사체 CTXA1/1N(His44→Tyr), CTXA1/1”0”(His44→Gin), CTXA1/1P(His44→Val), CTXA1/1Q(His70→Tyr), CTXA1/1R(His70→Gin) 및 CTXA1/1S(His70→Val)가 되도록 코돈을 교체하는데 이용되는 방법이다.
2가지를 제외한 각각의 상기 유사체를 재조합 E. coli 내에서 발현시키고 분리한 세포 봉입체가 인체 적혈구막 제제내에 있는 GSα를 ADP-리보실화하는 능력이 있는지 실험하였으며, 특히 His44와 His70유사체의 경우에는 GSα를 ADP-리보실화할 수 있는 그들의 효소 능력 및/또는 배양된 인체 포피 섬유아세포 H27(샌프란시스코 소재 유니버시티 오브 캘리포니아로부터 구입)의 막 제제내에 있는 투불린을 ADP-리보실화할 수 있는 그들의 능력에 대해 실험하였다. 2가지 제외된 것 중의 하나인 유사체 CTXA1/1J(Asp9→Tyr)는 재조합적으로 발현되지만 활성도를 분석할 수 없었고, 유사체 CTXA1/1L(Arg11→Lys)은 링커를 합성하고 클로닝을 실시하였으나 제대로 된 서열을 갖는 클론이 분리되지 않았다.
이러한 분석결과는 제4도와 제7도에 도시하였고, 표 4에 요약정리 하였으며, 제4도는 표 1에 보고된 유사체에 대한 비교자료를 제공한다. 제7도와 표 4에 기술한 부가적인 유사체 중에 3가지(CTXA1/1N, CTXA1/1”0”, CTXA1/1P)는 His44에서 상이한 치환체를 갖는다. 앞서 기술한 유사체 CTXA1/1B(His44→Asn)의 활성도 손실 이외에 이들 유사체내에서 효소 활성도가 검출되지 않은 것으로 보아, His44에서 특정 치환이 이루어짐으로써 다량체 분자의 고유의 독성 활성도를 갖는 콜레라 독소의 소단위체가 불활성화되었음을 알 수 있다. 이러한 결과를 근거로, 상기 잔기에서의 어떠한 치환도 그러한 불활성화를 유도할 수 있다는 사실은 당연한 것이다.
His70이 치환된 세 유사체(CTXA1/1Q, CTXA1/1R, CTXA1/1S)에 대하여도 기술되어 있다. 이들 유사체는 표 1에 나타나 있는 유사체 CTXA1/1C(His70→Asn)이외의 다른 것이다. 제7도에 도시한 바와 같이, 4개의 모든 His70유사체가 다른 비-GSα 단백질 기질(예를 들면, H27 섬유아세포내에 있는 투불린)을 ADP-리보실화하는 능력을 보유하는 것은 사실이지만, GSα 기질을 ADP-리보실화하는 능력은 감소되었다. 그러므로, His70의 치환으로 콜레라 독소에 대한 질병특유의 세포독성 반응에 관계한다고 여겨지는 특이한 GSα 기질에 대한 CTXA1의 활성도가 현저히 감소하는 결과가 초래되었다. 이러한 치환이 완전독소 중합체 형성에 관계하는 CTXA1에서 이루어졌다면 전반적으로 독성이 결핍되는 것과는 달리 약독화된 콜레라 독소 분자가 되기 쉽다.
부가적인 2개의 유사체에 대한 분석은 제8도에 도시하였다. CTXA1/1K(Ser10→Gly)는 천연 CTXA 분자와 관련된 촉매 활성도를 지닌다. Arg11에 대한 His의 치환(CTXA1/1M) 결과 거의 또는 전혀 측정할 수 없을 정도로 효소 활성도가 소실된 유사체가 생성된다. CTXA1/1L(Arg11→Lys) 유사체는 분석과 분리시 현저히 감소된 활성도를 가질 것으로 여겨지는데, 그 결과는 표 1에 밝혀진 바에 의해 뒷받침된다(Arg7→Lys 참조).
[표 3]
[표 4]
CTXA1 유사체에 대한 ADP-리보실전이효소 활성도
[1] SDS-PAGE 및 오토래디오그래피에 의해 가시화 되었을 시 ; [+], 완전한 활성도 ; [±], 감소된 활성도 ; [-], 활성도가 검출되지 않음 ; n.d., 측정되지 않음.
[rCTX 소단위체의 시험관내 회합]
완전독소 분자들을 개량하기 위하여 시험관내에서 천연 콜레라 독소를 해리하여 각 소단위체들을 재회합시킬 수 있는 많은 방법들이 문헌에 기술되어 있다(36, 37), 백일해 독소의 소단위체에 대한 시험관내 재회합 또한 천연 소단위체에 대한 문헌에 기술되어 있다(38-40). 유사한 방법으로 시험관내에서 재조합 CTX 소단위체들을 분리, 회합하여 완전독소-유사종을 형성시킨 후 이것을 정제할 수 있다. 일반적으로, 발현시켜 회수한 다음에 각 소단위체들을 천연 CTX 완전독소에 밝혀진 소단위체 비율을 계산한 화학양론적 비율(세포 봉입체 제제 형일 경우에는 특정 소단위체 단백질의 상대적 함량을 기초로 계산함)로 결합시킨다. 카오트로픽제(chaotropic agent)나 세정제 또는 둘다를 함유하는 수용액에 제제를 용해시킨다. 제제를 환원 조건(일반적으로 환원제를 이용하거나 수소대기 하에서, 또는 둘다를 이용)하에 둔 다음 산화시켜(산화제를 이용하거나 산소가 풍부한 대기 하에서, 또는 둘다를 이용) 꼭 필요한 분자내 이황화물 다리를 재형성시켰다. 완전독소-유사종 내로의 소단위체들의 화합은 카오트로픽제 또는 세정제 가용화제를 감소시키거나 제거함으로써 수행할 수 있다. 이것은 투석, 크로마토 그래피에 의한 여과 및 완충용액 교환을 포함하여 다양한 방법에 의해 실시할 수 있다. 그런 다음 완전독소-유사종을 종래의 방법, 예를들어, 이온 교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 친화 크로마토그래피에 의해 정제한다. 만일 A 소단위체의 세포 봉입체 시료를 부가하지 않는다면, 유사한 방법에 의해 A 소단위체가 없는 B 중합체 종을 회수할 수도 있음을 주목해야 한다.
본 발명의 유전공학 처리된 유사체 소단위체들을 종래의 방법에 의해 톡소이드화 콜레라 백신내로 제형화할 수 있다. 본 발명의 콜레라 독소와 같이 “유전적으로” 비활성화된 독소의 경우에는, 이들 생성물이 비병원성 유기체에서 생성되고 전체-세포 콜레라 백신에 반하여 반응을 유도할 것이라고 일반적으로 용인되는 효소 활성도가 본래부터 없기 때문에 부가적인 비활성화 단계(화학적 처리 또는 열처리와 같은)는 보통 필요로 하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 특히 내독소 함량에 관해서는 재조합 생성물의 순도를 조절하는 것이 필요하다. 일반적으로, 재조합 완전톡소이드, 재조합 완전톡소이드-유사 거대분자, 재조합 B 소단위체 거대분자, 재조합 B 소단위체 단독 또는 아마도 B 소단위체 재조합 유사체 및 잠재적인 접종항원으로서 본 발명에 기술된 A 소단위체 유사체 단독 조차도 90% 이상 균질하게 정제할 수 있었다. 만약 존재한다면, 불순물의 자연량 및 추정량은 내독소 오염의 정도가 각 조절 작용의 기준과 일치하는 지를 확실히 하기 위하여 계산되어야 한다.
비경구적인 수송을 위하여, 백신 물질을 알루미늄 보조액상에 정상적으로 흡착시켜야 한다. 이것은 적어도 두가지 방법에 의해 수행할 수 있다 : 미리 형성된 명반과의 침전 및 알루미늄과의 침전. 그런다음 백신 항원의 투여량 농도가 일반적으로 5-100㎕/투여량 범위이고 명반의 양이 보통 1.5mg/투여량을 초과하지 않도록, 흡착된 침전물을 부형제 내에 재현탁시킨다 ; 부피/투여량은 0.1-1.0㎖의 범위이다. 현탁용 부형제는 일반적으로 완충용액(예를들어, 인산완충식염수, pH 7.0)이며, 안정제(예를 들어, 글리세롤)를 부가할 수도 있고 세균에 의한 오염을 방지하고 저장 수명을 연장시키기 위하여 방부제(예를들어, 0.01% 티메로살)를 함유할 수도 있다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 증식가능한 벡터 계를 통한, 재조합 콜레라 톡소이드 또는 그것의 부성분의 제제화 및 수송은 그 계의 성질에 의존할 것이다. 예를들어, A 또는 A 및 B 소단위체에 대한 유전자를 운반하는 재조합(돌연변이체) 콜레라균, 살모넬라(Salmonella)속 sp., 종두 바이러스, 또는 아데노바이러스를 경구를 통해 수송할 때 이것이 장으로 이동할 수 있도록 장용제피(enteric-coated) 전달 운반체로 캡슐화하거나 또는 점막 표면에서 방어 기능을 하는 분비성 면역글로불린 A 항체를 유도하기 위하여 기도를 표적으로 하는 분무가능한 형(예를 들어, 리포솜)으로 캡슐화할 것이다. 택일적으로, 백신에 대한 다른 경구형은 문헌에 기술되어 있는 방법을 본 항원인자에 맞도록 적절히 변형시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 재조합 콜레라균 균주를 동결건조시켜 중탄산 완충용액과 혼합하여 위의 산도를 중화시킬 수 있다(41) ; 또는 본 발명의 완전톡소이드는 사균된 전체-세포 백신을 보충하기에 적당히 완화된 기포성 정제형으로 이용될 수 있다(1).
본 발명은 특히 E. coli에서의 재조합 생성에 관하여 설명하고 있지만, 본원에 기술된 바와 같은 유사체 소단위체의 돌연변이유발에 대한 원리는 다른 재조합 숙주세포 및 발현계와 관련하여 이용될 수 있으며, 독소의 다른 불활성화된 유사체를 생성할 수도 있음을 본 분야의 숙련된 기술자들은 이해할 것이다. 또한 완전툭소이드 내로의 돌연변이 유사체의 회합은 원래의 세포에서, 예를들어 시험관내 보다는 콜레라균에서 동종 재조합을 통해 발생할 수 있음을 이해해야 한다. 첨부하는 본 발명의 특허청구의 범위 내에서 가능한 모든 변형 및 개량을 본 발명에 포함하고자 한다.
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Claims (9)
- 감소되거나 소실된 ADP-리보실전이효소 촉매 활성도를 갖는 콜레라 독소의 촉매성 소단위체 A의 유사체를 암호하는 재조합 DNA 분자로서, 상기 유사체가 제1(a)도에 나타낸 성숙한 촉매성 소단위체 A의 천연서열내 아르기닌-7, 아르기닌-11, 아스파르트산-9, 히스티딘-44, 히스티딘-70 및 글루타민산-112 중에서 선택한 부위 중 하나 또는 그 이상에서 부위-특이 돌연변이를 포함하거나 트립토판-179에서 시작되는 카르복실 말단 부분의 절단을 포함하는 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 유사체가 콜레라 독소를 중화시키는 면역 반응을 유도함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 재조합 DNA 분자는 ADP-리보실전이효소 활성도의 분석에 의해 결정된 바와 같이 덜 활성적이나 불활성인 촉매성 소단위체의 유사체를 생성하는 부위-특이 돌연변이유발에 의해 수득함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 감소되거나 소실된 ADP-리보실전이효소 촉매 활성도를 갖는 콜레라 독소 소단위체 A의 유사체로서, 이 유사체는 제1(a)도에 나타낸 성숙한 촉매성 소단위체 A의 천연서열내 아르기닌-7, 아르기닌-11, 아스파르트산-9, 히스티딘-44, 히스티딘-70 및 글루타민산-112 중에서 선택한 부위 중 하나 또는 그 이상에서 부위-특이 돌연변이를 포함하거나 트립토판-179에서 시작되는 카르복실 말단 부분이 절단된 유사체.
- 제4항에 있어서, 콜레라 독소를 중화시키는 면역 반응을 유도함을 특징으로 하는 유사체.
- 제4항에 있어서, 유사체는 ADP-리보실전이효소 활성도의 분석에 의해 결정된 바와 같이 덜 활성적이거나 불활성인 촉매성 소단위체의 돌연변이를 일으키는 부위-특이 돌연변이유발에 의해 수득함을 특징으로 하는 유사체.
- 폴리펩티드 생성물이나 제1항의 DNA 분자에 의해 암호화된 생성물을 발현시킬 수 있는, 상기 DNA 분자로 형질전환시킨 원핵 또는 전핵세포.
- 제7항에 따른 E. coli 숙주세포.
- 제7항에 따른 콜레라균(Vibrio cholerae) 숙주세포.
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