KR100217809B1

KR100217809B1 - 재조합 bcg 백신

Info

Publication number: KR100217809B1
Application number: KR1019960701625A
Authority: KR
Inventors: 가즈히로 마쓰오; 요시토모 추조; 아키히로 야마자키; 미쓰오 혼다; 슈도 야마자키; 히로미치 다사카
Original assignee: 슈도 야마자키; 국립예방위생연구소; 에가시라 구니오; 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1995-07-31
Publication date: 1999-09-01
Also published as: ATE258986T1; EP0745386A4; CN1136280A; EP0745386A1; KR960704570A; WO1996004009A1; EP0745386B1; DE69532524D1

Abstract

본 발명은 캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질의 분자표면에 외래 항원 펩티드가 삽입되어 수득되는 융합단백질을 분지하는 미코박테리움 보비스 BCG균을 함유하는 백신에 관한 것이다. 본 발명을 구성하는 BCG는 항산균 유래의 α항원의 분자표면에 외래 항원 펩티드가 삽입되어 수득되는 융합단백질을 분비한다. 상기 융합단백질은 항원성 및 면역원성이 비약적으로 증가되어 있으므로 동물에게 접종되는 경우, 효율적으로 항원을 인식하는 B세포에 의해 인식되고 항원에 대한 항체생산을 유효하게 유도할 수 있다.

BCG자체를 동물에게 접종하면, 동물체내에서 증식을 계속하면서 상기 융합단백질의 분비를 계속하므로 매우 유용한 백신이 된다.

Description

[발명의 명칭]

재조합 BCG백신

[기술분야]

본 발명은 캐리어(carrier)인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질의 분자표면에 외래 항원 펩티드를 삽입하여 수득되는 융합단백질을 분비하는 미코박테리움 보비스 BCG균(Mycobacterium bovis BCG:이하 「BCG」라고 약기한다)을 함유하는 백신에 관한 것이다. 구체적인 예로서는, 캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질이 미코박테리아(Mycobacteria, 항산균)유래의 α항원이고, 외래 항원 펩티드가 AIDS 바이러스 표면항원의 항원 펩티드인 백신을 들 수 있고, 상기한 백신은 AIDS치료용 및 예방용 백신이다.

[배경기술]

BCG를 재조합 DNA기술을 이용하여 개량하고, 이것을 여러 가지의 병원체에 대한 백신에 이용하는 시도는 BCG의 형질전환시스템이 확립된 1988년부터 시작되었다[참조:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6987 (1988)].

BCG는 소(牛)형 결핵균의 악동성 균주이고, 사람에 대한 백신으로서는 유일하게 확인되고 있는 생균백신이다.

또한, 독성이 약하여 안전하고, 강한 보조제활성을 가지며, 효과가 지속적이고, 염가이며, 내열성이고, 경구투여 가능한 등의 특징을 가지고 있다. 따라서, BCG가 육종되어 여러 가지의 병원성 세균 또는 바이러스의 항원, 즉 외래 항원을 발현하게 되면, 매우 유효한 백신의 개발로 연결될 것이라 기대되어 왔다.

그 후, 목적하는 외래 항원을 BCG에서 분비발현시키는 시스템이 확립되어[참조: Infect, Immun., 58, 4049 (1990)], 백신으로의 응용이 기대되었다. 실제로, 미코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii) 유래의 α항원을 캐리어로 사용하고, 이 α항원과 AIDS바이러스 HIV-1의 gag p17의 항원부위(9개의 아미노산을 포함)을 융합시켜 수득되는 융합단백질을 발현분비하는 미코박테리아가 개발되었다[참조:Infect. Immun., 58, 4049 (1990)]. 또한, HIV-1의 감염에 대한 예방 항원 중의 하나인 표면항원내의 제3가변영역(이하, V3 영역 또는 V3 에피토프라 칭한다)의 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드를 발현분비시키는 것도 성공하였다[참조:Vaccine 12, 153 (1994)]. 또한, 해당 V3 영역의 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드는 킬러 T세포 에피토프와 B세포 에피토프 둘다를 포함하고 있다.

이들은 모두 캐리어 단백질로서 미코박테리아 유래의 α항원을 사용하고 있고, 외래 항원 펩티드는 α항원의 C-말단부근의 위치에 융합되어 있다. 즉, 미코박테리아는 융합단백질을 분비한다.

그러나, V3영역의 15개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드와 미코박테리아 유래의 α항원과의 융합단백질을 분비하는 BCG를 마우스에게 접종하더라도, 킬러 T세포는 현저히 유도할 수 있었지만, 항체 생산의 수준은 기대된 정도로 높지 않았다.

BCG이외에도, 최근에는 바이러스 벡터를 사용한 백신개발의 연구가 진행되고 있다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스의 표면단백질 헤마글루티닌[참조:J.Virol. 67, 6659 (1993)]이나 폴리오바이러스의 표면단백질 VP-1[참조: J. Virol. 66, 3161 (1992)]와 같은 다양한 캐리어 단백질을 V3 에피토프와 융합시켜 융합단백질을 디자인하고, 제조합 DNA를 사용하여 각각의 바이러스가 당해 융합단백질을 발현하도록 개량한다. 이렇게 해서 수득되는 키메라 바이러스를 동물에게 면역한 예가 보고되어 있다. 이들 키메라 바이러스에 의해 면역된 동물은 V3 에피토프에 대한 항체를 효율적으로 생산하는 것으로 알려져 왔다.

상기 바이러스 유래의 캐리어 단백질의 고차구조는 이미 밝혀져 있다. 상기 융합단백질에서는 캐리어 단백질의 분자표면에 있는 B세표 에피토프로 되기 쉬운 고리(loop) 부위에, 외래 항원 펩티드가 삽입되어 있다.

[발명의 개시]

본 발명의 목적은 캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질의 분자표면에 외래 항원 펩티드가 삽입되어 수득되는 융합단백질을 분비하는 미코박테리움 보비스 BCG균을 함유하는 백신을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 BCG를 백신으로서 사용할 수 있게 하는 것이다. 구체적으로는 캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질과 외래 항원 펩티드를 융합하여 수득되는 융합단백질을 발현분지하는 BCG를 제조하고, 당해 융합단백질이 킬러 T세포 및 B세포에 의해 에피토프로서 인식되어 킬러 T세포가 효율적으로 유도되고 항체생산의 수준이 현저히 상승되도록 융합단백질을 변형시키는 것이다.

V3영역내의 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드와 미코박테리아 유래의 α항원과의 융합단백질을 분비하는 BCG를 마우스에 접종하더라도 킬러 T세포는 현저히 유도할 수 있지만, 항체생산의 수준은 기대할 정도로 높지 않다는 것에 관하여는 상술한 바와 같다.

또한 V3영역에 대한 항체는 침팬지에 있어서 HIV-1의 감염을 예방하는 것은 이미 공지되어 있다[참조:Nature 345, 622 (1990)]. 따라서 V3 영역에 대한 항체 생산을 유도하는 것으로 기대되는 단백질을 유효 백신 성분으로 하는 것이 최근의 AIDS백신의 개발연구의 주류가 되어왔다. 구체적으로는, V3 영역을 포함하는 표면항원 gp120을 예로 들수 있으며 이 단백질은 유전자 제조합의 기법에 의해 개량된 동물세표 또는 곤충세포에서 생산되어 백신으로 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 백신의 효과는 극히 약하였다.

양측 시도 모두가, 항원이 V3 영역에 대한 항체생산을 현저히 유도하고 그 항체가 AIDS바이러스의 증식을 억제하여 감염을 예방하는 활성을 갖도록 하는 것을 목적으로 하지만 현재까지는 그 효과는 불충분하다. 따라서, AIDS바이러스의 증식을 억제하고 감염을 예방하는 활성을 가지고 있는 항체 생산을 현저히 유도할 수 있는 항원을 제조하여 이것을 백신으로서 사용한다면, 극히 유망한 백신이 될 가능성이 높다.

본 발명자들은 미코박테리움 칸사시 유래의 α항원의 C말단의 위치에 V3 영역내의 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드를 융합시키는 경우 V3 에피토프가 AIDS바이러스 표면 항원산에서 일반적으로 나타나는 천연의 구조를 가지기 어려워 해당 에피토프가 B세포에 의해 인식되기 어려운 것이 아닌가하고 생각하여, 캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질의 분자표면에 외래 항원 펩티드가 삽입되어 수득되는 융합단백질을 분비하는 BCG를 제조하여, 이것을 백신으로서 사용하는 것을 생각하였다.

이를 위해서는 미코박테리아 유래이고 고차구조가 이미 공지되어 있는 캐리어 단백질이 필요하지만, 본 발명에 사용된 α항원을 포함한 미코박테리아 유래의 단백질의 고차구조가 해석된 것은 전무하였다.

본 발명자들은 미코박테리아 유래의 α항원을 캐리어로서 사용하여 외래 항원 펩티드를 발현분비시키는 경우, 미코박테리아 유래의 α항원의 어떤 위치에서 융합시키면 가장 높은 항원성을 실현할 수 있는가를 명백히 하고, 외래 항원에 대한 현저한 항체생산을 유도할 수 있는 백신의 개발에 성공함으로써 본 발명을 완성하였다. 보다 상세히는, 미코박테리움 칸사시 유래의 α항원의 아미노산 서열로부터 예측되는 친수성 영역내의 α항원 자신의 B세포 에피토프(항원결정그룹)를 예측 결정하여 그 부근에 외래 항원 펩티드를 삽입함으로써 높은 항원성을 갖는 융합 단백질을 BCG에서 분비시키는 것에 성공하여, 병원체의 감염을 방지하는 활성을 갖는 항체의 생산을 유도할 수 있는 백신의 개발에 성공한 것이다.

즉, 본 발명은 캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질의 분자표면에, 외래 항원 펩티드가 삽입되어 수득되는 융합단백질을 분비하는 미코박테리움 보비스 BCG균을 함유하는 백신을 제공하는 것이다.

캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질로서는 미코박테리아 유래의 α항원을 들 수 있다. 본 발명의 백신중 바람직한 것은 해당 α항원의 184번째의 Ser잔기와 185번째의 Asp잔기의 사이에 외래 항원 펩티드가 삽입되어 수득되는 융합단백질을 분비하는 미코박테리움 보비스 BCG균을 함유하는 백신이다.

외래 항원 펩티드로서는 AIDS바이러스 표면항원의 항원펩티드, 특히 AIDS바이러스의 제3가변영역의 항원펩티드를 들 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 백신은, AIDS 바이러스 표면항원의 항원펩티드가 Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(서열번호:1)의 19개의 아미노산 잔기로 이루어진 제3가변영역의 항원펩티드인 미코박테리움 보비스 BCG균을 함유하는 백신, 특히 AIDS치료용 및 예방용 백신이다.

본 발명의 특히 바람직한 다른 백신은, AIDS바이러스 표면항원의 항원 펩티드가 Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala(서열번호:13)의 13개의 아미노산 잔기로 이루어진 gp41유래의 항원펩티드인 미코박테리움 보비스 BCG균을 함유하는 백신, 특히 AIDS치료용 및 예방용 백신이다.

본 발명의 또다른 바람직한 백신은, AIDS바이러스 표면항원과 항원 펩티드가 이하의 19개의 또는 18개의 아미노산 잔기로 이루어진 제3가변영역의 항원 펩티드인 미코박테리움 보비스 BCG균을 함유하는 백신, 특히 AIDS치료용 및 예방용 백신이다.

Asn Thr Arg Lys Ser Val HIs Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp(서열번호:14)(서브타입A: 서아프리카, 중앙아프리카)

Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Gly Glu(서열번호:15)(서브타입B: 납북아메리카, 유럽 및 아시아)

Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Glu(서열번호:16)(서브타입C: 남아프리카, 중앙아프리카)

Asn Thr nArg Gln Arg Thr His Ile Gly Pro Gly Gln Ala Leu Tyr Thr Thr Arg(서열번호:17)(서브타입D: 중앙아프리카)

Asn Thr Arg Thr Ser Ile Thr Ile Gly Pro Gly Gln Val Phe Tyr Arg Thr Gly Asp(서열번호:18)(서브타입E: 태국, 중앙아프리카)

[도면의 간단한 설명]

제1도는 α항원 자신의 B세포 에피토프를 결정하기 위해서 수행한 웨스턴 블로팅(westhern blotting)해석도이다. 왼쪽의 패널(레인1,2,3)이 미코박테리움 칸사시 유래 α항원에 대한 폴리클로날 항체를, 오른쪽의 패널(레인4,5,6)이 BCG유래 α항원에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 결과이다.

레인1,4는 β갈락토시다제를 발현하는 플라스미드 pUR289를 보유하는 에스케리키아 콜라이 EQ192균주(EQ192/pUR289)의 균체추출액을 전기영동한 것이다. 레인 2,5는 β갈락토시다제와 α항원의 38번째의 Leu잔기로부터 57번째의 Ala잔기에 이르는 서열을 갖는 펩티드가 융합된 단백질을 발현하는 플라스미드 pUR289+α-Leu38-Ala57를 보유하는 에스케리키아 콜라이 EQ192균주(EQ192/pUR289+α-Leu38-Ala57)의 균체추출액을 전기영동한 것이다.

레인3,6은 β갈락토시다제와 α항원의 184번째의 Ser 잔기로부터 203번째의 Asn잔기에 이르는 서열을 갖는 펩티드가 융합된 단백질을 발현하는 플라스미드 pUR289+α-Ser184-Asn203를 보유하는 에스케리키아 콜라이 EQ192균주(EQ192/pUR289+α-Ser184-Asn203)의 균체추출액을 전기영동한 것이다.

화살표는 분자량 약12만의 β갈락토시다제 융합단백질의 위치를 나타낸다.

제2도는 α항원과 HIV-1의 V3 에피토프의 융합단백질 분비발현 벡터작제 과정을 나타낸다. 사선의 블록은 미코박테리움 칸사시 유래 α항원(이 도면에서는 α-K로 표시한다.)을 포함하는 DNA단편을, 흰 블록은 미코박테리아 플라스미드의 복제개시영역을 포함하는 DNA단편을, 진한 점의 블록은 HTLVIIIB V3 에피토프의 15개의 아미노산의 합성유전자를, 엷은 점의 블록은 HIV일본균주 V3에피토프 19개의 아미노산의 합성유전자를 나타낸다. Amp, Km, Cm은 각각 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 내성유전자를 나타낸다. pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI) 및 pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)는 HTLVIIIB균주 유래 V3 에피토프 유전자를 각각 PstI 및 XhoI 위치에 도입한 것이고, pIJK-V3(HIV 일본균주-XhoI)는 HIV 일본균주 컨세서스 서열의 V3 에피토프를 XhoI 위치에 도입한 것을 나타낸다.

제3도는 각 재조합 분비벡터를 보유하는 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 및 BCG의 배양상청액중의 단백질을 웨스턴 블로팅에 의해서 해석한 결과를 나타낸다.

레인1은 pIJK-1을 보유하는 미코박테리움 스메그마티스의 배양상청액을 로딩한 대조군이다.

레인2는 pIJK-V3 (HTLVIIIB-XhoI)를 보유하는 미코박테리움 스메그마티스의 배양상청액을 로딩한 것이고, 이는 HTLVIIIB균주 유래의 15개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합된 융합단백질의 항원-항체반응을 본 것이다.

레인3은 pIJK-V3 (HTLVIIIB-PstI)를 보유하는 미코박테리움 스메그마티스의 배양상청액을 로딩한 것이고, 이는 HTLVIIIB균주 유래의 15개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드가 α항원의 279번째의 Gln잔기의 위치에서 융합된 융합 단백질의 항원-항체반응을 본 것이다.

레인4는 레인1과 같다.

레인5는 pIJK-V3(일본균주-XhoI)를 보유하는 미코박테리움 스메그마티스의 배양상청액을 로딩한 것이고, 이는 일본균주 유래의 19개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser 잔기의 위치에서 융합된 융합 단백질의 항원-항체반응을 본 것이다.

레인6은 pIJK-1를 보유하는 미코박테리움 보비스 BCG의 배양상청액을 로딩한 대조군이다.

레인7은 pIJK-V3(일본균주 XhoI)를 보유하는 미코박테리움 보비스 BCG의 배양상청액을 로딩한 것이고, 이는 일본균주 유래의 19개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser 잔기의 위치에서 융합된 융합단백질의 항원-항체반응을 본 것이다.

레인1,2,3의 표지에는 HIV-1 HTLVIIIB 균주의 V3 에피토프를 인식하는 중화모노크로날 항체 gp120N을 사용하였다.

레인4,5,6,7의 표지에는 HIV-1 일본균주의 컨센서스 서열의 V3 에피토프를 인식하는 중화 모노크로날 항체 μ5.5를 사용하였다.

분자량 약 32.000의 위치에서 융합단백질의 밴드가 확인된다.

제4도는 마우스에 있어서의 CTL 유도의 결과를 나타낸다. 제4(a)도는 마우스에서 HIV-V3 특이적 세포 독성 T 임파구의 유도를 나타내고, 제4(b)도는 세포독성 T임파구의 MHC제한을 나타낸다. 가로축은 작용 세포와 표적 세포의 비율을, 세로축은 킬러 T세포에 의해 특이적 분해를 받은 타켓세포의 비율을 나타낸다. BCG-α는 α항원만 발현하는 BCG로 면역한 결과를 나타내고, BCG-V3은 V3 에피토프를 발현하고 있는 BCG로 면역한 결과를 나타낸다. H2d/BCG-V3는 타겟세포로서 P815세포를 사용한 결과를 나타내고 H2k/BCG-V3는 SW5147세포를 타겟세포로서 사용한 결과를 나타낸다.

제5도는 기니아 피그에서 생산된 항체의 임상분리 바이러스의 중화 검정의 결과를 나타낸다. 제5(a)도는 2명의 일본인 HIV 보균자에서 분리되어 검정에 사용된 바이러스의 V3영역의 아미노산서열을 나타낸다. 박스로 둘러싸인 어두운 부분은 중화 에피토프의 영역을 나타낸다. 제5(b)도는 시험관내 중화 검정의 결과를 억제율로 나타낸다. GP-1 및 GP-2는 각각 20마리씩인 제1군 및 제2군의 기니아 피그 혈청 면역 글로불린을 사용한 결과로서, 검은막대, 사선막대, 점막대는 각각 면역 글로불린을 50, 10, 1㎍/㎖의 농도로 검정 시스템에 첨가한 경우를 나타낸다. 세로축은 항체를 가하지 않은 때의 배양상청액중의 p24 항원량을 대조군으로 하여 항체를 첨가할 때의 p24 항원의 감소율(감염억제율)을 나타낸다.

제6도는 태국 A형 및 태국 B형 V3펩티드와의 교차 반응성을 ELISA 법으로 조사한 결과를 나타낸다. 제6(a)도는 태국 A형 펩티드에 대한 ELISA 결과를, 제6b도는 태국 B형 펩티드에 대한 ELISA결과를 나타낸다. 흑색환은 BCG-V3로 면역시킨 기니아 피그 혈청을 사용한 경우를 나타내고, 백색환은 BCG로 면역시키지 않은 정상 기니아 피그의 혈청을 사용한 경우를 나타내고, 세로축은 ELISA의 발색제인 p-니트로페놀의 414nm에서의 흡광도를 나타낸다.

제7도는 BCG-V3로 면역시킨 시노몰구스 원숭이 2마리에서의 항-V3 항체의 시간에 따른 수준의 변화를 나타낸다. 백색환은 #2797의 원숭이를 나타내고, 흑색환은 #2799의 원숭이를 나타내며, 세로축은 V3 펩티드와의 결합역가를 나타낸다. 10x8는 10⁸을 나타낸다.

제8도는 BCG-V3로 면역한지 4주후의 시노몰구스 원숭이의 혈청 항체를 사용한 HIV-1 MN균주 중화 검정 결과를 나타낸다. 제8(a)도는 BCG-V3 접종물 30mg으로 면역된지 4주후 MN균주 중화 활성을, 제8(b)도는 BCG-V3접종물 5mg으로 면역된지 4주후 NM균주 중화 활성을 나타낸다. #2796 및 #2797는 30mg의 BCG-V3를, #2798 및 #2799는 5mg의 BCG-V3를 접종한 원숭이를 나타낸다. 검은막대, 진한 점 막대, 엷은 점의 막대는 각각 면역글로불린을 10, 3, 1㎍/㎖의 농도로 검정 시스템에 첨가한 경우를 나타낸다. μ5.5는 양성 대조군으로서 사용한 중화 모노크로날 항체이다. 세로축은 제5도와 같이, HIV-1 p24 항원 생산의 억제율을 나타낸다.

제9도는 일본균주 V3의 컨세서스 서열을 갖는 HIV-1-SIV 키메라 바이러스 NM-3rNJ1의 작제의 개략도를 나타낸다. 백색막대는 SIVmac(마카카 원숭이 유래의 SIV) 유래 DNA, 흑색막대는 HIV-1(HTLVIIIB) 유래 DNA, 엷은 점의 막대는 일본균주 V3 영역을 포함하는 DNA를 나타낸다.

제10도는 바이러스 챌린지 4주 후의 키메라 바이러스 감염예방 실험의 결과를 나타낸다. 가로축은 M8166 세포와의 공동배양에 사용한 원숭이 말초형 단핵구의 수를, 세로축은 공동배양 1주째의 배양상청액중의 키메라 바이러스량을 p27 항원농도로 나타낸 것이다. 백색사각형은 BCG로 면역시키지 않은 정상 원숭이, 흑색환은 #2797, 백색환은 #2799의 말초혈 단핵구를 사용한 경우를 나타낸다.

제11도는 gp41 중화 에피토프(6개의 아미노산 및 13개의 아미노산)의 BCG에서의 분비발현 결과를 나타낸다. 레인1은 BCG-α, 레인2는 BCG-gp41-X6, 레인3은 BCG-gp41-X13의 배양상청액의 단백질을 15% SDS-PAGE 분획후, 웨스턴 블로팅 분석한 것이고, 표지에는 HIV-1 gp41을 인식하는 중화 모노크로날 항체 2F5를 사용하였다.

[발명의 상세한 설명]

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명을 구성하는 캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질이란 BCG에서 분비되는 단백질이다.

구체적인 예로서는 미코박테리아 유래의 α항원을 들 수 있다. 특히 바람직한 것은 후술하는 실시예에서 사용하고 있는 미코박테리움 칸사시 유래의 α항원이지만, α항원은 이외의 미코박테리아종에도 넓게 존재하는 교차 반응성의 단백질이다. 지금까지 그 1차 구조가 밝혀져 있는 것은 BCG[참조: J. Bacteriol. 170, 3847(1988)], 미코박테리움 칸사시[참조: Infect. Immun. 58, 550(1990)], 미코박테리움 아비움[참조: Infect. Immun. 61, 1173(1993)], 미코박테리움 인트라셀라레[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 1466(1993)] 및 미코박테리움 라프라에[참조: Mol. Microbio. 6, 153(1992)]유래의 5종이다. 모두 아미노산 서열의 상동성이 80% 정도로 높다. 더욱이, 수친화성 프로필(친수성-소수성 플롯)을 비교하면 상당히 유사하기 때문에, 분자의 표면에 나타나는 친수성영역의 위치는 여러 α항원간에서 보존되어 있다. 따라서, 캐리어로서는 여러 가지의 미코박테리아 유래의 α항원을 사용할 수 있다.

캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질의 분자표면에 위치하는 부위가 단백질의 아미노산 서열중 어느 부분인가를 결정하는 방법은 단백질의 고차구조가 밝혀져 있는 경우에는 그것에 근거하여 수행된다. 그러나, 단백질의 고차구조를 완전히 밝히는 것은 극히 곤란하다. 그리하여, 실제로는 우선 호프 앤드 우즈(Hopp and Wools)의 방법[참조:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 3824(1981)]에 의해서 단백질의 친수성 영역을 결정한다. 단백질의 분자표면에는 친수성의 아미노산 잔기가 모여있는 것이 많기 때문에, 친수성 영역을 실제의 분자표면의 영역으로 추정하게 된다. 다음에, 실제로 그 영역이 분비단백질 자신을 인식하는 항체와 반응하는지의 여부를 조사하여, 반응하면 분자표면의 영역인 것이 증명되게 된다. 이어서, 상기 영역에 외래 항원 펩티드가 삽입되도록 융합단백질을 디자인한다. 친수성 영역이 실제의 분자표면의 영역과 일치하고 있는지의 여부를 확인하기 위해서는 디자인한 융합단백질을 실제로 제조하여 항원성을 조사함과 동시에, 이것을 분비발현하는 BCG를 동물에게 면역하여 삽입된 외래 항원 펩티드가 컬러 T세포에 의해 에피토프로서 인식되고, B세포에 의해 에피토프로서 인식되어 결과적으로 킬러 T세포를 효율적으로 유도하고 항체생산의 수준이 현저히 상승되는 것을 확인함으로써 수행한다.

캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비 단백질로서 미코박테리움 칸사시 유래의 α항원을 사용하는 경우에는 α항원의 184번째의 Ser 잔기와 185번째의 Asp 잔기부근의 영역이 분자표면의 영역이다. 따라서, 184번째의 Ser 잔기와 185번째의 Asp 잔기의 사이에 외래 항원 펩티드가 삽입되게 된다.

본 발명을 구성하는 외래 항원 페티드란, 동물에게 면역되는 경우 킬러 T세포에 의해 에피토프로서 인식되거나 B세포에 의해 에피토프로서 인식되어 결과적으로 킬러 T세포를 효율적으로 유도하거나 항체생산의 수준을 현저히 상승시키는 것이다. 본 발명의 목적 중 하나는 세균성 혹은 바이러스성 질환의 치료 및 예방에 사용되는 백신을 제공하는 것이기 때문에, 외래 항원 펩티드는 해당질환의 원인이 되는 세균 혹은 바이러스를 구성하는 단백질의 일부인 것이 바람직하다. 구체적인 예로서는 AIDS바이러스를 구성하는 단백질을 들 수 있고, 특히 AIDS바이러스 표면항원의 항원펩티드가 바람직하고, 더욱 구체적으로 Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(서열번호:1)의 19개의 아미노산 잔기로 이루어지는 제3가변영역(V3 에피토프)의 항원펩티드가 가장 바람직하다.

AIDS바이러스 표면항원 gp120은 N-말단측으로부터 C1, V1, V2, C2, V3, C3, V4, C4, V5, C5의 순서대로 아미노산 서열이 비교적 보존되어 있는 불변영역(C)과 변이가 많은 가변영역(V)이 거의 교대로 존재하고, 그 중에서 C2와 C3사이의 영역을 제3가변영역이라고 부르고, 그 속에 있는 항원영역을 V3 에피토프라고 부른다. 구체적으로는, gp120의 303번째와 338번째의 2개의 Cys잔기 사이의 영역이다. 이 영역은, 라로사(LaRosa)등[참조: Science 249, 932(1990)]이 도시한 바와 같이 상당히 변이가 심한 영역이기는 하지만, 여러 가지의 변이주에 있어서 바이러스의 증식을 강하게 억제하는 항체의 인식부위(B세포 에피토프)로 되어 있고, 이 항체에 의해 침팬지에 있어서 AIDS바이러스의 감염을 예방할 수 있다. 또한 이 영역은 HLA-A2 및 A3를 갖는 사람에게 인식되는 킬러 T세포의 에피토프이기도 하기 때문에, 중화항체의 생산과 킬러 T세포 모두를 유도할 수 있는 AIDS백신개발을 위한 외래 항원 펩디드로서 가장 바람직하다.

V3에피토프의 유전자는 C2 및 C3영역중의 염기서열을 기준으로 하여 합성된 프라이머에 의한 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)법[참조: Science 230, 1350(1985)]에 의해 취득할 수 있다. 또한, PCR법으로 얻어진 DNA단편을 적당한 벡터에 클로닝하여 염기서열을 결정하고, 이것을 바탕으로 DNA를 화학적으로 합성하는 것에 의해서 취득하는 것도 가능하다.

이어서, 캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질의 분자표면에 외래 항원 펩티드를 삽입하여 수득되는 융합단백질을 분비하는 BCG를 제조하는 방법을 설명한다. 당해 융합단백질을 BCG에 발현분비시키는 수단의 하나로는 제조합 DNA 기술에 의해 융합단백질을 암호화 하는 DNA를 제조하고, 해당 DNA를 BCG의 세포에 도입하여, 이 DNA를 세포내에 안정하게 보유시킨 후, DNA를 발현시켜 융합단백질을 분비시키는 방법이 있다.

이하 재조합 DNA 기술에 의해 목적하는 BCG를 제조하는 방법을 설명한다.

여기에서는 캐리어인 시그날 펩티드를 갖는 분비단백질이 미코박테리움 칸사시 유래의 α항원이고, α항원의 184번째의 Ser잔기와 185번째의 Asp잔기의 사이에 외래 항원 펩티드로서 AIDS바이러스 표면항원의 항원펩티드, 즉 Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Thy Ala Thr Gly Ser(서열번호:1)의 9개의 아미노산 잔기로 이루어지는 제3가변영역의 항원펩티드가 삽입되어 있는 경우를 예로 들어 설명한다.

엠 칸사시 유래의 α항원의 친수성영역에 외래 항원 펩티드가 삽입되어 수득되는 융합단백질을 BCG에서 발현부비시키기 위해서는 이미 공지된 α항원 분비벡터 pIJK-1[참조: Infect. Immun. 58, 4049(1990)]중의 α항원 유전자중의 친수성 영역에 대응하는 위치에 있는 적당한 제한효소 위치에 외래 항원 펩티드를 코드하는 합성 DNA를 삽입하여 수득되는 재조합 분비벡터를 BCG에 도입한다.

예를 들면, α항원의 친수성영역의 하나인 184번째의 Ser 잔기와 185번째의 Asp잔기에 대응하는 DNA에는 XhoI제한 효소 위치가 있는 것을 이용하여, pIJK-1의 XhoI위치에 HIV-1 표면항원으로서 19개의 아미노산 잔기로 이루어지는 V3영역 펩티드를 코드하는 합성 DNA를 α항원유전자의 해독영역에 합쳐서 도입함으로써 재조합 분비 벡터를 얻을 수 있다.

pIJK-1을 이용하지 않는 경우에는 우선 미코박테리움 칸사시의 α항원을 코드하는 DNA를 제조한다. 이 DNA는 시그날 펩티드를 코드하는 영역도 포함하도록 한다.

이 DNA의 제조방법은 마쓰오(Matsuo) 등의 문헌[참조:Infect. Immun. 58, 550)]에 기재되어 있는 방법을 채택한다. 다음에 BCG의 세포내에서 안정하게 보유되는 플라스미드 pIS18를 제조한다. 이 플라스미드의 제조방법에는 스나퍼(Snapper) 등의 문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6987(1988)]에 기재되는 방법을 채택한다. 이어서 수득된 해당 플라스미드를 적당한 제한효소로 절단하여 직쇄상으로 하고 이것과 DNA를 연결하여 재조합 DNA를 수득한다. 절단의 위치는 플라스미드가 BCG세포내에서 안정하게 유지되는데 필요하지 않는 영역에 위치되어야 한다. 또한, 이 DNA가 발현되기 위해서는 이 DNA가 미코박테리움 칸사시의 α항원을 코드하는 DNA의 발현을 조절하는 영역, 예를들면 프로모터가 포함되어 있는 것이 바람직하다. 재조합 DNA를 재조합 분비벡터 작제의 출발물질로 사용한다.

재조합 분비벡터 혹은 재조합 DNA를 BCG에 도입하는 방법에는 전기 천공법이 있다. 이 방법은 스나퍼 등의 문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6987(1988)]에 기재되어 있다.

또한, 재조합 분비벡터 또는 재조합 DNA를 BCG이외에도 미코박테리움 스메그마티스라고 하는 여러 가지의 항상균에 전기천공법으로 도입하는 것도 가능하다. 재조합 분비벡터 또는 재조합 DNA는 미코박테리움 스메그마티스의 세포내에서도 안정하게 유지되고, 또한 융합단백질도 발현분비한다.

본 발명의 BCG 또는 미코박테리움 스메그마티스가 분비하는 융합단백질의 항원성의 평가는 BCG 또는 미코박테리움 스메그마티스를 미들부룩(Middlebrook) 7H9 배지[Difco사 제품] 또는 소오톤(Sauton) 배지[참조: J. Bacteriol. 169, 839(1987)]중에서 배양하고, 그 배양상청액중의 단백질과 목적하는 외래항원을 인식하는 항체와의 반응성을 웨스턴 블로팅법[참조: J. BActeriol, 170, 3847(1988)]에서 해석함에 의해 실시할 수 있다. 항체로서는, 목적하는 외래 항원 펩티드 또는 이 펩티드를 포함하는 항원단백질을 보조제와 함께 면역시켜 수득되는 래비트 혈청(폴리클로날 항체)을 사용할 수 있다. 또는 면역한 후의 마우스의 비장세포를 통상적인 방법[참조: Eur. J. Immunol. 6, 511(1976)]에 의하여 골수종세포와 융합시켜 수득되는 하이브리도마중에서 목적하는 외래 항원 펩티드와 반응하는 항체를 생산하고 있는 균주를 선택하고, 그 세포균주를 배양함으로써 수득되는 모노클로날 항체도 사용할 수 있다. 항원-항체반응의 결과, 목적하는 항원펩티드가 융합되지 않은 캐리어 단백질과 항체와의 반응성보다도 융합단백질과 항체와의 반응성이 높으면, 당해 융합단백질은 목적하는 외래 항원 펩티드로부터 유래되는 항원성이 있다고 판단할 수 있다.

BCG의 항체생산능을 동물모델을 사용하여 검정하는 경우에는 목적하는 외래 항원 펩티드 또는 해당 펩티드를 포함하는 항원단백질을 적당한 고체상에 담지시키고 이것과 BCG로 면역시킨 동물의 항혈청과의 반응을 효소면역측정법(ELISA법) 또는 웨스턴 블로팅법으로 측정함으로써 수행한다.

또한, 생산된 항체의 각종 병원체에 대한 유효성은 각각의 병원체마다 확인법은 다르지만, 대별하여 시험관 내에서의 증식억제실험과 생체 내에서의 증식억제실험의 두가지가 있다. 전자의 구체적인 예로서는 AIDS바이러스로 감염 가능한 사람의 세포균주의 배양액에 항체와 AIDS바이러스를 첨가하여 이것을 일정기간 배양하고 배양종료시의 배양상청액중의 바이러스입자를 통상적인 방법에 의해 정량함으로써 증식억제효과를 평가하는 방법이 있다. 후자의 예로서는, 중증 복합 면역부전(SCID)마우스와 같은 T세포와 B세포가 결손된 마우스에게 AIDS바이러스로 감염 가능한 사람의 말초혈 림프구를 이식한 동물모델을 사용한다. 즉, 항체와 AIDS바이러스를 SCID마우스에게 투여하여, SCID마우스혈중에서의 바이러스 증식 억제를 평가하는 방법이다.

한편, CTL유도능은 마우스 시스템에서는 이미 통상적인 방법이다. 목적하는 항원펩티드를 펄스한 세포를 표적으로 하는⁵¹Cr 방출[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3105(1988)에 의한 CTL측정법으로 확인할 수 있다.

융합단백질을 발현분비하는 BCG는 백신으로서 사용할 수 있다. BCG세포의 현탁액에는 생리식염수, 인산염 완충액 등을 사용하면 된다. 사람 및 동물에의 투여는 통상 피하접종으로써 행하지만, 경우에 따라서 경구투여, 정맥주사 등이라도 백신효과가 얻어진다. 투여량은 피하접종인 경우 2x10⁷개의 생균으로 정해지고 있고, 생후 3개월의 신생아부터 접종가능하지만, 결핵감염자라든지 투레르클린반응 양성의 사람에게는 접종할 수 없다. 접종후의 부작용은 주로 국소 림프절의 종창, 국소 궤양등이며 중독인 예는 극히 적다.

본 발명을 구성하는 BCG는 항산균 유래의 α항원의 분자표면에 외래 항원 펩티드가 삽입되어 수득되는 융합 단백질을 분비한다. 당해 융합단백질로서는 외래 항원 펩티드에 기인하는 항원성 및 면역원성이 비약적으로 증가되고 있기 때문에 동물에게 접종하면 효율적으로 외래 항원을 인식하는 B세포에 의해 인식되고 해당 항원에 대한 항체생산을 효과적으로 유도할 수 있다. BCG자체를 동물에게 접종하면 동물체내에서 증식을 계속하면서 융합단백질을 계쏙 분비하므로 매우 유용한 백신이 된다.

HIV-1과 같은 여러 가지의 병원체 유래의 B세포 에피토프는 분자표면에서 α나선형 또는 β시트라고 하는 2차구조를 취하고 있지 않은 고리의 부위에 있는 경우가 많다. 본 발명에 의해 제공되는 융합단백질을 분비하는 재조합 분비벡터는 이들 여러 가지의 병원체 유래의 B세포 에피토프가 천연의 구조를 거의 보존한 채 높은 항원성을 갖게 하여 BCG로부터 분비발현시킬 수 있다. 이 BCG 균주는 높은 면역원성을 갖는 백신이므로 여러 가지으 바이러스, 세균, 기생충 등의 감염을 예방하기 위해서 필수적인 높은 역가의 항체생산과 현저한 CTL활성을 유도할 수 있다.

[실시예]

이하에 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 또한 실시예의 기술에 있어서는 이하의 약칭을 사용한다.

A:아데닌, C:시토신, G:구아닌, T:티민, DNA:데옥시리보핵산, Ala:알라닌, Arg:아르기닌, Asn:아스파라긴, Asp:아스파르트산, Gln:글루타민, Glu:글루탐산, Gly:글리신, His:히스티딘, Ile:이소루이신, Leu:루이신, Lys:리신, Met:메티오닌, Pro:프롤린, Ser:세린, Thr:트레오닌, Trp:트립토판, Tyr:티로신, Val:발린, CTL:세포독성 T세포, ELISA:효소면역측정법, IPTG:이소프로필-β-D-티오갈락토시드, HIV:사람면역결핍 바이러스, TBS:트리스 완충된 염수, PBS:인산염 완충된 염수, SDS-PAGE:나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미이드 겔 전기 영동, MHC:주요 조직 적합항원, SCID:중증 복합 면역 부전증, TCID50:50% 조직 배양감염량.

[실시예 1]

α항원의 B세포 에피토프의 결정

우선, α항원의 친수성 영역내의 확실하게 분자표면에 노출되어 있는 영역을 탐색하기 위해서 α항원 자신의 B세포 에피토프를 결정한다. 미코박테리움 칸사시 유래 α항원의 수친화성 프로필[참조:Infect. Immun. 58, 550(1990)]을 검토하여, α항원에 있어서 친수성이 가장 높은 영역 2개 부분을 선택하고, 이 영역에 상당하는 약 20개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 코드하는 2종류의 DNA를 합성한다.

하나는 이 α항원의 38번째의 Leu잔기로부터 57번째의 Ala잔기에 이르는 서열을 갖는 펩티드를 코드하며 그 서열은

(서열번호:2, 서열번호:3)이다.

다른 하나는 α항원의 184번째의 Ser 잔기로부터 203번째의 Asn잔기에 이르는 서열을 갖는 펩티드를 코드하며 그 서열은

(서열번호:4, 서열번호:5)이다.

각각의 DNA를 β갈락토시다제 유전자의 최하류(목적 생성물의 C-말단에 상당한다)에 융합시켜 수득되는 DNA를 에스케리키아 콜라이 세포내에서 발현시켜 2종의 융합단백질을 수득한다. 즉, 각각의 DNA단편을 각각 BamHI절단된 pUR289 플라스미드[참조:EMBO J. 3, 1429(1984)]와 연결하여 수득된 재조합 DNA를 에스케리키아 콜라이 EQ192균주에 도입한다. 각각의 형질전화체를 각각 37℃에서 암피실린을 50㎍/㎖ 포함하는 L-브로쓰에서 3시간 진탕배양한 후, IPTG를 최종농도 1mM이 되도록 가하고, 또한 30℃에서 2시간 배양한다. 원심분리에 의하여 수집한 균체를 각각 1/10용량의 TBS완충액에 현탁하고, 200W에서 15분간 초음파 처리하여 2개의 균체 추출액을 수득한다. 각각의 추출액중에는 목적하는 융합단백질이 포함되어 있다. 각 추출액 10㎕를 각각 7.5% SDS-PAGE전기영동시키고, 전기영동에 의해서 분획된 단백질을 니트로셀룰로스 필터에 블로팅하고, 미코박테리움 칸사시 유래 α항원에 대한 래비트 폴리클로날 항체 및 BCG유래 α항원에 대한 래비트 폴리클로날 항체 각각과의 반응성을 웨스턴 블로팅법으로 조사한다(제1도 참조).

β갈락토시다제의 융합된 38번째의 Leu 잔기로부터 57번째의 Ala잔기에 이르는 서열을 갖는 펩티드는 어느쪽의 항체와도 반응하지 않았지만(레인2,5), β갈락토시다제에 융합된 184번째의 Ser잔기로부터 203번째의 Asn잔기에 이르는 서열을 갖는 펩티드는 양쪽의 항체와 높은 반응성을 가졌다(레인3,6). 결국, 184번째의 Ser잔기로부터 203번째의 Asn잔기에 이르는 영역에 상기 2종의 항산균에 공통하는 B세포 에피토프가 존재하는 것을 알았다. 이 영역이 α항원 분자의 표면에 노출되어 있는 부분으로 추측되었다.

제1도의 각 레인을 설명하면, 레인 1,4는, β-갈락토시다제를 발현하는 플라스미드 pUR289를 보유하는 에스케리키아 콜라이 EQ192주의 균체추출액을 전기영동한 것이다. 레인 2,5는 β-갈락토시다제와 α항원의 38번째의 Leu잔기로부터 57번째의 Ala잔기에 이르는 서열을 갖는 펩티드가 융합된 단백질을 발현하는 플라스미드 pUR289+α-Leu38-Ala57을 보유하는 에스케리키아 콜라이 EQ192균주의 균체 추출액을 전기영동한 것이다. 레인3,6은, β-갈락토시다제와 α항원의 184번째의 Ser잔기로부터 203번째의 Asn잔기에 이르는 서열을 갖는 펩티드가 융합된 단백질을 발현하는 플라스미드 pUR289+α-Ser184-Asn203를 보유하는 에스케리키아 콜라이 EQ192균주의 균체추출액을 전기영동한 것이다. 레인1,2,3에서는 미코박테리움 칸사시 유래 α항원에 대한 래비트 폴리클로날 항체로 표지한다. 레인4,5,6에서는 BCG유래 α항원에 대한 래비트 폴리클로날 항체로 표지한다. 도면중에 보이는 밴드는 β-갈락토시다제 융합단백질에 상당하는 것이다.

[실시예 2]

HIV-1 표면항원 V3 에피토프를 포함하는 융합단백질 분비벡터의 작제

α항원의 184번째의 Ser잔기로부터 203번째의 Asn잔기에 이르는 영역이 분자표면에 나와 있다고 추측되므로 α항원 유전자중의 184번째의 Ser 잔기의 위치에 상응하는 XhoI 위치를 이용하여, HIV-1 표면항원 V3에피토프를 α항원과 융합시켜 융합단백질을 BCG 및 미코박테리움 스메그마티스에서 분비시키는 것을 시도한다. 이하의 설명은 제2도를 참조하면 이해가 용이하다.

HIV-1(HTLVIIIB균주) V3에피토프중 Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys(서열번호:6)의 15개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를, 상기 184번째의 Ser 잔기의 위치(DNA에서는 XhoI부위의 위치)에서 융합시켜 수득되는 융합단백질을 취득하기 위해서, α항원유전자를 포함하는 플라스미드 pKAH200을 XhoI으로 완전히 절단하여 생성되는 DNA단편을 분리하고 벡터 DNA로 한다. 한편, 15개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 코드하는 유전자를 화학적으로 합성한다. 그 서열은

(서열번호:7, 서열번호:8)이다. 합성 DNA를 상기 벡터 DNA와 연결하여 수득되는 재조합 DNA를 에스케리키아 콜라이 HB101주에 도입하여, 형질전화균주내에서 재조합 DNA를 증폭한다. 다음에, 융합단백질 유전자를 KpnI단편으로서 잘라내기 위해서, pUC벡터 유래의 HindIII위치에 KpnI링커를 삽입한다. 수득된 플라스미드를 KpnI로 절단하여 융합단백질 유전자를 포함하는 KpnI-KpnI DNA단편을 단리한다.

KpnI-KpnI DNA단편을 미코박테리아/에스케리키아 콜라이 셔틀벡터 pIS18[참조:Infect. Immun. 58, 4049(1990)]의 KpnI위치에 클로닝하여 재조합 분비벡터를 수득한다. pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)로 명명한다.

HIV-1(HTLVIIIB균주) V3에피토프와 α항원이 융합하여 수득되는 융합단백질 중 대조군을 BCG 및 미코박테리움 스메그마티스로부터 분비시키기 위해 필요한 재조합 분비벡터를 작제한다. 여기에서는 HIV-1(HTLVIIIB균주) V3 에피토프중 Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys(서열번호:6)의 15개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 α항원 C-말단부근의 279번째의 Gln잔기의 위치에 대응하는 PstI위치에서 융합시킨 융합단백질을 대조군으로 한다. α항원 유전자를 포함하는 플라스미드 pKAH200를 PstI로 완전히 절단하여 생성하는 DNA단편을 분리하고, 벡터DNA로 한다. 한편, 15개의 아미노산을 코드하는 유전자를 화학적으로 합성한다. 서열은,

(서열번호:9, 서열번호:10)이다.

합성 DNA를 상기 벡터 DNA와 연결하여 수득되는 재조합 DNA를 에스케리키아 콜라이 HB101균주에 도입하여, 형질전환균주 내에서 재조합 DNA를 증폭한다. 다음에, 융합단백질 유전자를 KpnI단편으로서 잘라내기 위해서, pUC벡터 유래의 HindIII위치에, KpnI링커를 삽입한다. 수득된 플라스미드를 KpnI로 절단하여 융합단백질 유전자를 포함하는 KpnI-KpnI DNA단편을 단리한다. KpnI-KpnI DNA단편을 미코박테리아-에스케리키아 콜라이 셔틀벡터 pIS18[참조:Infect. Immun. 58, 4049(1990)]의 KpnI위치에 클로닝하여 재조합 분비벡터를 수득한다. pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)로 명명한다.

[실시예 3]

HIV-1 V3에피토프-α항원 융합단백질의 미코박테리움 스메그마티스로부터의 발현분비

실시예 2에서 작제한 재조합 분비벡터 pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI) 및 pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)를 각각 미코박테리움 스메그마티스 ATCC607균주에 공지의 방법[참조:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6987(1988)]으로 도입한다. 수득된 각각의 형질전환체를 카나마이신 30㎍/㎖을 포함하는 소오톤배지[참조:J. Bacteriol, 169, 839(1987)] 70㎖중, 37℃에서 2주간 정치배양한 뒤 원심분리와 밀리포어필터로 제균하여 배양상청액을 제조한다. 각각의 배양상청액의 0.5㎖에 등량의 10% 트리클로로 아세트산 수용액을 가하여 0℃에서 30분간 배양한 후, 원심 분리하여 단백질을 침전시킨다. 각각의 침전을 20㎕의 SDS-PAGE용 샘플완충액(60mM트리스, 2% SDS, 5% 2-머캅토에탄올, 10% 글리세린, 0.1% 브로모페놀블루)에 현탁시키고, 95℃에서 5분간 가열하여 용해시켜 전기영동용 샘플로 한다. 각각의 샘플을 15% SDS-PAGE전기영동에 제공하여 분획화한다. 전기영동후 통상적인 방법에 따라서 단백질을 니트로셀룰로스 막 필터에 블로팅하여 웨스턴 블로팅법으로써 해석한다. 결과를 제3도에 나타낸다.

HTLVIIIB균주 유래의 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 α항원의 279번째의 Gln잔기의 위치에서 융합된 융합단백질(레인3)과 비교하여, HTLVIIIB균주 유래의 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합된 융합단백질(레인2)의 쪽이 HIV-1의 V3에피토프에 대한 중화 모노크로날 항체 gp120N에 대한 반응성이 50 내지 100배 높았다. 결국, V3 에피토프를 α항원의 분자표면에 노출시키는 방식으로 발현시킴으로써 V3에피토프의 항원성을 비약적으로 향상시킬 수 있었다.

제3도의 각 레인을 설명하면 레인1은 α항원만을 분비시키기 위한 벡터인 pIJK-1[참조:Infect. Immun. 58, 4049(1990)]을 보유하는 미코박테리움 스메그마티스의 배양상청액을 로딩시킨 것이다. 레인 2는 pIJK-V3(HTLVIIIB-XhoI)를 보유하는 미코박테리움 스메그마티스의 배양상청액을 로딩시킨 것이고, 이는 HTLVIIIB균주 유래의 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합된 융합단백질의 항원-항체반응을 본 것이다. 레인3는 pIJK-V3(HTLVIIIB-PstI)를 보유하는 미코박테리움 스메그마티스의 배양상청액을 로딩시킨 것이고, 이는 HTLVIIIB균주 유래의 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 α항원의 279번째의 Gln잔기의 위치에서 융합된 융합단백질의 항원-항체반응을 본 것이다.

표지에는 HIV-1의 V3에피토프에 대한 중화 모노크로날 항체 gp120N을 사용하였으며, 이 항체는 듀폰사(미국)에서 입수가능하다.

[실시예 4]

HIV-1(일본균주) 표면항원 V3 에피토프를 포함하는 융합단백질 분비벡터의 작제

실시예 2,3에서는 HIV-1(HTLVIIIB균주)V3에피토프내의 Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Phe Val Thr Ile Gly Lys(서열번호:6)의 15개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합되어 수득되는 융합단백질에 대해 실험하였다. 여기에서는 HIV-1(일본균주) V3 에피토프내의 Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(서열번호:1)의 19개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합되어 수득되는 융합단백질에 대하여 실험을 수행한다.

이하의 설명은 제2도를 참조하면 이해가 용이하다.

HIV-1(일본균주)V3에피토프내의 Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Ser(서열번호:1)의 19개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치(DNA내의 XhoI 위치)에서 융합시켜 수득되는 융합단백질을 취득하기 위해서, α항원 유전자를 포함하는 플라스미드 pKAH200을 XhoI로 완전히 절단하여 생성하는 DNA단편을 분리하여 벡터DNA로 한다. 한편, 19개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 코드하는 유전자를 화학적으로 합성한다. 그 서열은

(서열번호:11, 서열번호:12)이다.

이 합성 DNA를 상기 벡터DNA와 연결하여 수득되는 재조합 DNA를 에스케리키아 콜라이 HB101주에 도입하여 형질전환균주 내에서 재조합 DNA를 증폭한다. 다음에, 융합단백질 유전자를 KpnI단편으로서 잘라내기 위하여 pUC벡터 유래의 HindIII위치에, KpnI링커를 삽입한다. 수득된 플라스미드를 KpnI로 절단하여 융합단백질 유전자를 포함하는 KpnI-KpnI DNA단편을 단리한다. KpnI-KpnI DNA단편을 미코박테리아-에스케리키아 콜라이 셔틀벡터 pIS18[참조:Infect. Immun. 58, 4049(1990)]의 KpnI위치에 클로닝하여 재조합 분비벡터를 얻는다. pIJK-V3(일본균주-XhoI)로 명명한다.

[실시예 5]

HIV-1 V3 에피토프-α항원 융합단백질의 미코박테리움 스메그마티스 및 BCG에서의 발현분비

실시예 4에서 작제한 재조합 분비벡터 pIJK-V3(일본균주-XhoI)를 미코박테리움 스메그마티스 ATCC607균주에 공지의 방법[참조:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6987(1988)]으로 도입한다. 수득된 각각의 형질전환체를 카나마이신 30㎍/㎖을 포함하는 소오톤배지[참조:J. Bacteriol, 169, 839(1987)] 70㎖중, 37℃에서 2주간 정치배양한 뒤 원심분리와 밀리포어필터로 제균하여 배양상청액을 제조한다. 배양상청액의 0.5㎖에 등량의 10% 트리클로로 아세트산 수용액을 첨가하여 0℃로 30분간 배양한 후, 원심 분리하여 단백질을 침전시킨다. 침전을 20㎕의 SDS-PAGE용 샘플완충액(60mM트리스, 2% SDS, 5% 2-머캅토에탄올, 10% 글리세린, 0.1% 브로모페놀블루)에 현탁시키고, 95℃에서 5분간 가열하여 용해시켜 전기영동용 샘플로 한다. 샘플을 15% SDS-PAGE전기영동에 제공하여 분획화한다. 전기영동후 통상적인 방법에 따라서 단백질을 니트로셀룰로스 막 필터에 블로팅하여 웨스턴 블로팅법으로써 해석한다. 결과를 제3도에 나타낸다.

일본균주 유래의 19개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합된 융합단백질도 HIV-1의 V3에피토프에 대한 중화 모노크로날 항체 μ5.5에 대하여 강하게 반응하는 것이 판명하였다.(레인5). 결국, HIV-1(일본균주)의 V3 에피토프를 α항원의 분자표면에 노출시키는 방식으로 발현시킴으로써 V3에피토프의 항원성을 비약적으로 향상시킬 수 있었다.

제3도의 각 레인을 설명하면 레인4는 pIJK-1을 보유하는 미코박테리움 스메그마티스의 배양상청액을 로딩시킨 대조군이다. 레인 5는 pIJK-V3(일본균주-XhoI)를 보유하는 미코박테리움 스메그마티스의 배양상청액을 로딩시킨 것이고, 일본균주 유래의 19개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합된 융합단백질의 항원-항체반응을 본 것이다.

표지에는 HIV-1의 V3에피토프에 대한 중화 모노크로날 항체 μ5.5를 사용하였으며, 이는 상기 19개의 아미노산 잔기의 펩티드(서열번호:1)의 양단에 Cys잔기를 부가한 펩티드의 3분자 중합물을 마우스에게 면역하여 비장세포를 마우스 골수종세포와 융합시켜 수득된 하이브리도마를 배양함에 의해 취득한 것이다.

일본인 AIDS보균자 유래 바이러스로 가장 많이 보이는 HIV-1균주에 대한 백신을 개발한다고 하는 관점에서, HIV-1일본균주 유래의 19개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합된 융합단백질을 BCG에서 분비시킨다. 실험 방법은 미코박테리움 스메그마티스인 경우에 준한다.

분비된 융합단백질을 웨스턴 블로팅법으로써 해석한 결과를 제3도에 나타낸다. HIV-1일본균주 유래의 19개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합된 융합단백질이 BCG에서 분비되는 경우에서도, HIV-1의 V3에피토프에 대한 중화 모노크로날 항체 μ5.5에 대하여 강하게 반응한다는 것이 판명된다(레인 7). 수득된 BCG균주를 BCG-V3라 명명하여, 이하의 동물 실험에 사용한다. 미코박테리움 보비스 BCG-V3는 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학기술연구소에 기탁되어 있다. 수탁번호는 FERM BP-4759이다.

제3도의 각 레인을 설명하면 레인 6인 pIJK-1을 보유하는 미코박테리움 보비스 BCG의 배양상청액을 로딩시킨 대조군이다. 레인7은 pIJK-V3(일본균주-XhoI)를 보유하는 미코박테리움 보비스 BCG의 배양상청액을 로딩시킨 것이고, 이는 일본균주 유래의 19개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 α항원의 184번째의 Ser잔기의 위치에서 융합된 융합단백질의 항원-항체반응을 본 것이다.

표지에는 HIV-1의 V3 에피토프에 대한 중화 모노크로날 항체 μ5.5를 사용한다.

[실시예 6]

기니아 피그에서 HIV-1 V3부위에 대한 항체생산

BCG-V3 및 미코박테리움 칸사시 유래의 α항원만 발현하는 BCG-α를 각각 미들브룩 7H9배지(Difco사 제품)5㎖중, 37℃에서 진탕배양하고, OD 610nm가 약 06에 도달한 시점(대수증식기)에서 집균하여, PBS에서 1회 세정후, 10㎖씩의 PBS에 현탁한다. BCG-V3 의 균액 1㎖(5㎎, 약 108세포의 BCG)을 기니아 피그 4마리에 피하 접종하고 BCG-α의 균액을 별도의 기니아 피그 3마리에 피하접종하여, 6주후에 채혈하여, 항-V3 항체역가를 V3펩티드(19개의 아미노산)항원을 사용한 ELISA법에 의해 측정한다(표 1). 음성대조군의 BCG-α면역 기니아 피그에서는 항체역가가 거의 검출한계 이하인데 비하여, BGC-V3 면역 기니아 피그에서는 4마리 전부 120 내지 640배를 초과하는 높은 역가의 항체생산이 유도되었다. 이 중 2마리의 역가는 침팬지에 있어서 HIV-1의 감염예방을 하는데 충분한 수준[참조: Nature 345, 622(1990)]이었다.

표 1은 기니아 피그에서 항-V3항체의 생산을 조사한 결과를 나타낸다. 정상, BCG-V3-1 내지 4, 및 BCG-α-K-1 내지 3은 각각, 아무것도 접종하지 않은 기니아 피그, BCG-V3를 면역한 4마리 기니아 피그, BCG-α를 면역한 3마리의 기니아 피그를 나타낸다.

[실시예 7]

BCG-V3 접종 기니아 피그혈청의 시험관내 바이러스 중화활성의 측정

실시예 6에서 수득한 4마리의 BCG-V3접종 기니아 피그의 6주째의 혈청을 사용하여 시험관내에서 바이러스 중화활성을 조사한다. 사람의 말초혈 림프구를 식물성 헤마글루티닌으로 자극한지 1일 후 브러스트화한 세포에 HIV-1 MN균주 2000 TCID와 기니아 피그혈청의 면역 글로불린 분획분을 37℃에서 1시간 예비배양한 혼합물을 첨가하여, 약 1주간 배양하여 세포변성효과가 나타난 시점에서 배양상청액의 HIV입자를 코어단백질 p24측정 ELISA킷트를 사용하여 측정한다. 결과를 표 2에 나타낸다. 정상 기니아 피그 혈청을 사용한 대조군으로서는 보이지 않은 현저한 HIV-1중화활성이 4마리의 기니아 피그 모두에서 인정되어, 실시예 6에서 수득된 항-V3항체가 실제로 HIV-1의 증식을 억제하는 활성을 갖는 것을 알았다.

표 2는 각각 바이러스와의 반응에 사용한 기니아 피그 혈청 면역 글로불린량에 있어서의 세포배양 상청액중의 p24 단백질농도를 pg/㎖단위로 나타낸 것으로, 정상 기니아 피그 혈청을 사용한 경우보다도 p24 단백질농도가 낮으면 중화활성이 있다고 하는 것을 나타낸다.

정상은 정상 기니아 피그 혈청, BCG-V3-1 내지 BCG-V3-4는 BCG-V3 접종된 4마리의 기니아 피그 혈청, μ5.5.은 중화 모노크로날 항체를 나타낸다. 표적 세포 배양상청액중의 바이러스 코어단백질 p24량을 pg/㎖ 단위로 표시한다.

[실시예 8]

BCG-V3접종 기니아 피그 혈청의 SCID베이지 마우스를 사용한 생체내 바이러스 중화활성의 측정

SCID 베이지 마우스(T, B세포 외에 천연 킬러세포도 결손된 마우스)의 복강에 2x10개의 사람말초혈 림프구를 접종하고, 2주 후에 HIV-1 MN균주 약6000 TCID과 실시예 6에서 수득된 BCG-V3 접종 기니아 피그 혈청의 면역 글로불린 분획분 10㎎을 동시에 정맥내 주사한다. 84시간 후에 채혈하고, 각각의 표적세포를 모아, 식물성 헤마글루티닌으로 자극한 사람말초혈 림프구와 동시에 7일간 배양하여, 배양상청액의 바이러스량을 실시예 7과 같이 측정한다. 결과를 표 3에 나타낸다. 각각의 표적세포에서, 정상 기니아 피그 혈청을 사용한 경우는 약 100pg/㎖의 p24 농도가 검출한계 이하로 억제되었다. 이는 혈청중의 항-V3항체가 생체내에 있어서도 HIV-1을 중화하는 활성을 가지며 SCID마우스중의 말초혈 림프구에 대한 감염을 예방한다는 것을 알았다.

표 3은 HIV-1 MN균주와 기니아 피그 혈청 면역 글로불린이 투여된 SCID베이지 마우스의 말초혈 단핵구, 복강 검출세포, 비장세포의 배양상청액중의 p24 단백질 농도를 pg/㎖단위로 표시한 것으로 30는 검출한계이하를 나타낸다.

2x10개의 사람말초혈 림프구를 복강에 접종하고 2주후 SCID베이지 마우스에 HIV MN균주와 기니아 피그 혈청 IgG 10㎎을 정맥내 주사하며, 84시간 후의 세포를 모아 배양하고, 7일 후의 배양상청액의 바이러스 코어단백질 p24량을 pg/㎖단위로 표시한다.

[실시예 9]

마우스에 있어서의 CTL의 유도

Balb/c 마우스 5마리에 0.1mg의 BCG-V3를 피하접종하고, 2주후의 비장세포를 분리하여, 10㎍/㎖의 V3 펩티드(19개의 아미노산)으로 7일간 재작극하여 작용세포로 한다. 한편, V3 펩티드를 펄스한 P815 세포(MHC 제1형:H2d)를 표적 세포로하여, CTL1활성을 Cr방출법으로 조사한 바, 5마리 전부에서 현저한 CTL활성의 유도를 보였다.(제4(a)도). 또한, 표적 세포를 MHC 제1형 H2k 분자를 갖는 SW5147 세포로 한 경우, 활성이 보이지 않았으므로 이 활성은 MHC 제1형에 한정된 CTL에 의한 것임을 알았다(제4(b)도).

[실시예 10]

BCG-V3접종 기니아 피그 혈청의, 임상적으로 분리된 바이러스 중화활성 측정

AIDS감염 에방 후보백신으로서 주목되었던 서브유니트 gp120백신(유전자 재조합 동물세포에 의해 생산)에서 유도되는 중화항체는 MN균주와 같은 실험실균주는 중화할 수 있지만, 임상분리균주는 중화할 수 없다는 것이 보고되어 있다[참조:AIDS Res. Human Retroviruses 10, 631-632(1994)]. 따라서 새롭게 BCG-V3 5mg을 1군에 20마리씩 2군의 총40마리에 피하접종하여, 6주간후의 혈청항체의 임상분리 HIV-1균주 중화활성을, 실시예 7과 같은 시험관내 중화 검정에 의해 측정한다. 사용한 임상분리 바이러스 HIV-A 및 HIV-B는 각각 일본인 HIV보균자의 말초혈 단핵구를 식물성 헤마글루티닌 자극후, 정상적인 사람의 말초혈 단핵구와 RPM1640배지(GIBCO사 제품)에서 공동배양하여 수득한다. 배양상청액중의 세포-비 함유 바이러스 RNA를 추출하여, OD3 프라이머(nt 7345 내지 7369=5'AAATTCCCCTCCACAATTAAAACTG-3')(서열번호:19) 와 역전사효소를 사용하여 DNA로 역전사한다. 이것을 주형으로 하고, 또한 V3 영역을 끼운 2종의 프라이머 EB2(nt 6989 내지 7009에 BamHI 인식서열을 가한 것=5'-GCCGGATCCTCAACTCAACTGCTGTTAAAT3')(서열번호:20) 및 EC2(nt 7314 내지 7336에 PstI 인식서열과 정지콘돈을 가한 것=5'-GCTCTGCAGTCAAATTTCTGGGTCCCCTCCTGACC-3')(서열번호:21)를 사용한 PCR 반응에 의해 DNA를 증폭후, BamHI와 PstI로 절단한 단편을 pUC18 벡터에 클론화한다. 클론화된 DNA의 염기서열을 373A DNA 서열분석기(Applied Biosystems-Perkin Elmer Co.)에 의해 결정하고, V3 영역의 아미노산 서열을 추정한다(제5(a)도). 임상적으로 분리된 바이러스 100TCID과 면역 기니아 피그 20마리의 혼합혈청에서 프로테인A세파로스(파마시아 P-L Biochemicals) 칼럼으로 정제한 면역 글로블린 분획분을 혼합하고, 37℃에서 60분간 배양한 후, 10개의 식물성 헤마글루티닌으로 자극한 정상인 말초혈 단핵구와 혼합하고, 37℃에서 60분간 배양한 후, 10개의 식물성 헤마글루티닌으로 자극한 정상인 말초혈 단핵구와 혼합하고, 37℃에서 60분간 진탕한다. 세포를 PBS에서 세정후, 재조합 사람 IL-2(40uL 유니트/㎖)를 포함하는 RPM1640 배지중에서 7일간 배양하여, 상청액중의 HIV량을 p24항원 ELISA 킷트(도쿄 소재의 다이나보트사 제품)로 측정한다. 항체를 시스템에 가하지 않은 대조군의 p24량과 항체를 첨가한 경우의 p24 량의 비율(억제율)로 중화활성을 나타낸 결과를 제5(b)도에 나타낸다.

A 및 B 2종의 바이러스에 대하여, GP-1, GP-2의 2군의 기니아 피그 혈청에 대하여 같은 실험을 행한 경우, BCG- α로 면역시킨 기니아 피그 또는 BCG-V3로 면역시키지 않은 기니아 피그의 혈청 면역 글로블린에는 거의 중화활성이 인정되지 않은데 반하여, BCG-V3 면역군에서는 90% 억제농도가 1㎍/㎖정도인 매우 강한 중화활성이 인정되었다. 이들 2종의 바이러스의 V3영역중의 중화 에피토프(제5(a)도의 어두운 부분)의 아미노산 서열은, BCG-V3에 삽입된 일본형 균주의 컨센서스 서열 또는 HIV MN균주와 완전히 일치하고 있고, 적어도 V3 중화 에피토프의 아미노산 서열이 일치하고 있는 바이러스이면 실제로 HIV 보균자로부터 분리된 균주라도 MN균주와 같은 실험실에서 계대되어 있는 바이러스와 같이 중화할 수 있다는 것이 판명되었다.

[실시예 11]

기니아 피그에서 생산된 항V3 항체의 교차반응성

실시예 10에서 제조된 1군 20마리의 혼합혈청(BCG-V3 면역후 6주)를 사용하여, 태국A형, 및 태국B형 V3 영역에 대한 교차반응성을 조사한다. 통상, 바이러스 분류상, cladeB에 속하는 북미형(MN균주) 및 일본균주와 cladeE에 속하는 태국형주는 혈청학적으로 교차하지 않는 것으로 되어 있다. 태국A형 V3 펩티드 19개의 아미노산(Asn Thr Arg Thr Ser Ile Thr Ile Gly Pro Gly Gln Val Phe Tyr Arg Thr Gly Asp)(서열번호:18) 및 태국B형 V3펩티드 19개의 아미노산 (Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Leu Gly Pro Gly Gln Ala Trp Tyr Thr Thr Gly Gln)(서열번호:22)이 각각 캐리어 단백질인 키홀림페트 헤모시아닌(KLH)에 결합된 항원을 사용한 ELISA법으로 교차반응성을 조사한다. 결과를 제6도에 나타낸다.

대조군의 정상 기니아 피그 혈청에서는 거의 반응성이 없지만, BCG-V3 면역시킨 기니아 피그 혈청은 태국A형 및 태국B형 V3 펩티드와 반응성을 가지므로 이는 북미형, 일본형 이외에도 태국형 바이러스를 중화하는 활성을 갖는다는 가능성이 시사되었다.

[실시예 12]

원숭이에서의 중화항체생산

시노몰구스 숫컷 원숭이 4마리(7세 내지 8세, #2796 내지 #2799)중 2마리(#2796, #2798)에 BCG-V3 30㎎(6x10개 세포)을, 나머지의 2마리(#2798, #2799)에 5㎎(1x10개 세포)을 피하접종하여, 2,4,6,8,12,27주에서의 혈청중의 항-V3항체역가를 KLH와 결합된 V3 펩티드(19개의 아미노산)항원을 사용한 ELISA법으로 측정한다. 4마리의 모든 원숭이에서 항체생산이 유도된다. #2797와 #2799의 2마리에 대하여, 항체역가의 추이를 제7도에 나타낸다. 10을 초과하는 높은 역가의 항체생산이 인정되었지만, 면역후 10주를 지나가면 서서히 역가가 저하하는 경향을 보였다. 4주째의 혈청항체의 HIV-1 MN균주 중화활성을 실시예 10과 같은 시험관내 중화 검정으로 조사한다. 결과를 제8도에 나타낸다. 모든 원숭이의 혈청항체가 중화활성이 있고, 특히 BCG-V3 5㎎을 접종한 원숭이(#2798, #2799)에서는 90% 억제농도가 약 10㎍/㎖인 강한 바이러스 중화활성이 있다는 것을 알았다.

[실시예 13]

원숭이에서의 HIV-SIV 키메라 바이러스(SHIV)의 감염예방

시노몰구스 원숭이에 감염가능한 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)의 외피(gp120, gp41 부분)를 HIV-1의 것으로 치환한 HIV-SIV 키메라 바이러스(SHIV)도, 마찬가지로 시노몰구스 원숭이에 감염 가능하다는 것이 보고되어 있다. 외피부분을 HIV-1(HTLVIIIB균주) 유래의 것으로 전환한 NM-3rN의 분자클론의 V3영역[참조:J. Virol. 65, 3514(1991)]을 HIV-1일본균주 유래의 서열로 치환한 키메라 바이러스 NM-3rNJ1을 작제한다. 작제의 방법을 제9도에 나타낸다. NM-3rN 유전자에서 외피부분을 EcoRI과 HpaI로 잘라내어, HincII위치에 HpaI 링커(다까라 슈조사 제품)를 삽입한 pUC18의 EcoR-HpaI 위치에 서브클로닝한다. 수득된 플라스미드를 BgIII로 절단하여, 큰 단편을 분리하여 벡터로 한다.

한편, 실시예 10에서 서술한 일본인 HIV보균자 A의 혈액중에서 분리된 바이러스 RNA를 DNA로 역전사시키고 PCR 법으로 증폭하며, BamHI-PstI 단편으로서 pUC18에 서브클로닝한 후, BgIII로 절단하여, V3영역을 포함하는 DNA단편을 잘라내고, 상기 벡터와 연결하여 재조합 플라스미드를 수득한다. 이 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 HB101균주에 도입하여 수득된 형질전환균내에서 증폭한다. 이 플라스미드를 EcoRI와 HpaI로 절단하여 수득되는 작은 단편과 NM-3rN을 EcoRI과 HpaI로 절단하여 수득되는 큰단편을 연결하여, 일본균주 유래의 HIV-1의 V3영역의 유전자를 갖는 NM-3rNJ1을 수득한다. NM-3rNi1플라스미드를 통상적인 방법으로 인산칼슘법으로 M8166세포에 형질감염하여, RPM1640배지중에서 1주간 배양한다. 상청액에 방출된 바이러스(SHIV) 를 재차 M8166세포에 감염시켜, 1주후의 배양상청액 중의 바이러스를 감염실험에 사용한다.

#2979 및 #2799의 2마리의 원숭이에게 면역후 38주의 시점에서, 이.콜라이에서 발현하여 아밀로스 수지 칼럼으로 정제한 말토스 결합단백질과 α항원의 융합단백질에 V3의 19개의 아미노산의 펩티드가 삽입된 융합단백질 100㎍씩을 피하접종으로 추가면역하고, 2주후에 항-V3 항체역가의 상승을 확인한 후, SHIV(MN) 10TCID을 정맥내 주사한다. 바이러스 챌린지후, 2,4,6주째에 채혈하여, 분리한 말초현단핵구 5x10개로부터의 2배 희석계열 각각을 M8166세포와 동시에 배양하여, 1주후의 배양상청액중의 키메라 바이러스의 농도를 SIV p27 항원 정량 ELISA 킷트(오르토사 제품)로 정량한다. 4주째의 결과를 제10도에 나타낸다. #2797에서는 2.5x10개 이상의 세포농도에서 키메라 바이러스의 감염이 인정되었지만, 시노몰구스 원숭이에 키메라 바이러스 10TCID을 접종한 음성대조군 보다는 생산된 바이러스량이 상당히 낮은 수준으로 억제되었다. #2799에서는 전혀 키메라 바이러스가 검출되지 않았으며, SHIV감염으로부터 완전히 예방되어 있는 것으로 판명되었다.

[실시예 14]

HIV-1 gp41 중화 에피토프 발현 BCG균주의 확립

HIV-1 V3에피토프이외의 B세포 에피토프 중에서 바이러스의 중화에 강하게 작용하는 항체가 인식한다고 보고되어 있는 gp41 중화 에피토프[참조:J. Virol. 67, 6642-6647(1993)]를 α항원과의 융합단백질로서 분비발현하는 재조합 BCG를 작제한다. 이 방법은 실시예 2 및 3과 같이, V3에피토프의 대신에 gp41 에피토프의 6개의 아미노산( Glu Leu Asp Lys Trp Ala)(서열번호:23) 및 N말단측에 연장된 13개의 아미노산(Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala)(서열번호:13)의 펩티드를 코드하는 유전자(XhoI 인식부위에 삽입가능한 부착말단을 가진다)를 화학적으로 합성하여, 클로닝에 사용한다. 그 서열은

(서열번호:24, 서열번호:25)(6개의 아미노산을 코드) 및

(서열번호:26, 서열번호:27)(13개의 아미노산을 코드)이다. 이들의 DNS단편을 제2도에 나타낸 V3 에피토프의 경우와 같이 플라스미드 pKAH200을 XhoI에서 완전히 절단하여 수득되는 벡터 DNA에 연결하여 수득되는 재조합 DNA를 에스케리키아 콜라이 HB101주에 도입하고 형질전환체에서 재조합 DNA를 증폭한다. 다음에 융합단백질 유전자를 KpnI단편으로서 잘라내기 위하여, pUC 벡터 유래의 HindIII위치에 KpnI 링커를 삽입하여 수득된 플라스미드를 KpnIㅡ로 절단하여 KpnI-KpnI DNA단편을 단리한다. 이 DNA단편을 pIS18벡터의 KpnI위치에 클로닝하여, 재조합 분비벡터를 수득한다. 6개의 아미노산에 관하여는 pIJKgp41-X6으로 명명하고, 13개의 아미노산에 관하여는 pIJKgp41-X13으로 명명하였다.

이 벡터를 BCG 동경균주에 공지의 방법[참조:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6987(1988)]으로 도입한다. 수득된 각각의 형질전환체를 카나마이신 30㎍/㎖을 포함하는 미들브룩 7H9배지(Difco사 제품) 5㎖에서 37℃에서 6주간 진탕 배양하였다. 상청액을 밀리포어필터로 제균후, 등량의 2배농도 SDS-PAGE 샘플완충액을 가하고, 95℃에서 5분간 가열하여, 15% SDS-PAGE에 제공한다. 분획후, 통상적인 방법대로 니트로셀룰로스 필터에 블로팅하여 웨스턴 블로팅법으로써 해석한다. 결과를 제11도에 나타낸다. gp41 에피토프를 인식하는 중화 모노크로날 항체 2F5(Waldheim Pharmazeutika, Austria)와 반응성은 pIJKgp41-X6을 보유하는 BCG(레인2), pIJKgp41-X13을 보유하는 BCG(렌인3) 모두에서, 현저하고, 후자의 반응성이 약간 강하였다. V3이외의 중화 에피토프에 대하여도 마찬가지로 α항원의 분자표면에 삽입하여, BCG에서 분비발현시킬 수 있다는 것을 알았다. 이들 BCG균주를 각각 BCG-gp41-X6(6개의 아미노산), BCG-gp41-X13(13개의 아미노산)으로 명명한다.

[서열 목록]

서열번호:1

서열의 길이:19

서열의 형:아미노산

위상:직쇄상

서열의 종류:펩타이드

기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1

서열

서열번호:2

서열의 길이:61

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:3

서열의 길이:61

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:4

서열의 길이:64

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:5

서열의 길이:64

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:6

서열의 길이:15

서열의 형:아미노산

위상:직쇄상

서열의 종류:펩티드

기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1

서열

서열번호:7

서열의 길이:51

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:8

서열의 길이:51

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:9

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서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:10

서열의 길이:53

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

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서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:11

서열의 길이:60

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

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서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:12

서열의 길이:60

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:13

서열의 길이:13

서열의 형:아미노산

위상:직쇄상

서열의 종류:펩티드

기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1

서열

서열번호:14

서열의 길이:19

서열의 형:아미노산

위상:직쇄상

서열의 종류:펩티드

기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1

서열

서열번호:15

서열의 길이:19

서열의 형:아미노산

위상:직쇄상

서열의 종류:펩티드

기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1

서열

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서열의 형:아미노산

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기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1

서열

서열번호:17

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서열의 형:아미노산

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서열의 종류:펩티드

기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1

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서열번호:18

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기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1

서열

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서열의 길이:25

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:20

서열의 길이:30

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:21

서열의 길이:35

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:22

서열의 길이:19

서열의 형:아미노산

위상:직쇄상

서열의 종류:펩티드

기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1

서열

서열번호:23

서열의 길이:6

서열의 형:아미노산

위상:직쇄상

서열의 종류:펩티드

기원:

생물명:사람면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)

균주명:HIV-1 일본균주

서열

서열번호:24

서열의 길이:24

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:25

서열의 길이:24

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:26

서열의 길이:45

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

서열번호:27

서열의 길이:45

서열의 형:핵산

쇄의 수:일본쇄

위상:직쇄상

서열의 종류:다른 핵산 합성 DNA

서열

Claims

미코박테리아(mycobacteria)의 α항원의 아미노산 서열중 184번 내지 203번 사이 영역내의 인접한 아미노산 사이에 외래 항원 펩티드가 삽입된 미코박테리아의 α항원인 융합 단백질.
제1항에 있어서, 외래 항원 펩티드가 α항원의 아미노산 서열중 184번째 잔기와 185번째 잔기 사이에 삽입된 융합 단백질.
제2항에 있어서, 184번 잔기가 Ser이고 185번 잔기가 Asp인 융합 단백질.
제1항에 있어서, α항원이 미코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii)의 α항원인 융합 단백질.
제1항에 있어서, 외래 항원 펩티드가 최대 19개 아미노산 잔기 길이를 갖는 융합 단백질.
제1항에 있어서, 외래 항원 펩티드가 α항원의 분자 표면상으로 삽입된 융합 단백질.
제1항에 있어서, 외래 항원 펩티드가 HIV-1 표면 항원의 항원 펩티드인 융합 단백질.
제7항에 있어서, 외래 항원 펩티드가 HIV-1의 제3 가변영역을 포함하는 융합 단백질.
제7항에 있어서, 외래 항원 펩티드가 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
제7항에 있어서, 외래 항원 펩티드가 서열 번호 14, 15, 16, 17 또는 18의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
제7항에 있어서, 외래 항원 펩티드가 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG를 제1항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 DNA서열로 형질전화시킴을 포함하여, 제1항에 따른 융합 단백질을 생산하는 방법.
제1항에 따른 융합 단백질을 분비하는 미코박테리움 보비스 BCG.
미코박테리움 보비스 BCG를 제1항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 DNA서열로 형질전환시킴을 포함하여, 제13항에 따른 미코박테리움 보비스 BCG를 제조하는 방법.
제13항에 따른 미코박테리움 보비스 BCG를 포함하는 백신.
미코박테리움 보비스 BCG를 제1항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 DNA서열로 형질전환시킴을 포함하여, 제15항에 따른 백신을 제조하는 방법.