CN108823232A

CN108823232A - 一种艾滋病疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN108823232A
Application number: CN201810359440.4A
Authority: CN
Inventors: 张天宇; 刘燕; 孙彩军; 潘恩祥; 王邦兴; 郭灵敏; 陈凌; 刘志勇
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2018-11-16

Abstract

本发明公开了一种重组质粒，其含有猴免疫缺陷病毒的gp120基因和结核分枝杆菌的至少一种细胞壁载体蛋白的基因；本发明还公开了一种重组的耻垢分枝杆菌，其能稳定表达猴免疫缺陷病毒的gp120基因和结核分枝杆菌的至少一种细胞壁载体蛋白的基因；本发明还公开了一种艾滋病疫苗及其制备方法，该疫苗含有重组的耻垢分枝杆菌。本发明制备的艾滋病疫苗，易于培养，生长迅速，节省时间、人力、物力和财力；本发明的三株表面展示SIV gp120抗原蛋白的重组耻垢分枝杆菌ZWY2疫苗可以将抗原蛋白gp120稳定地表面展示在耻垢分枝杆菌ZWY2表面，其在C57小鼠体内的免疫效果远远优于将抗原蛋白gp120表达在胞内及目前已发表的基于腺病毒载体构建的表面展示gp120的艾滋病疫苗。

Description

一种艾滋病疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，本发明还涉及一种艾滋病疫苗，尤其是一种通过生物技术改造获得的重组耻垢分枝杆菌。

背景技术

自1981年美国疾病控制与预防中心通报了全球首宗艾滋病病例以来，科研人员就一直致力于研发一种安全有效的HIV疫苗以达到预防和治疗艾滋病的目的。目前在HIV的治疗中最著名且有效的是鸡尾酒疗法，即高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Anti-Retroviral Therapy，HAART)，该疗法是将三种或三种以上的抗病毒药物联合使用治疗艾滋病。然而，HAART治疗费用昂贵，对于HIV疫情更加严重的非洲国家以及发展中国家来说，普及的可行性较低^[1]；并且，HAART疗法只能控制病毒复制，不能彻底清除病毒，加之价格昂贵，作用有限且有严重的副作用。

因此，研制有效、安全的HIV疫苗是控制HIV传播的重要手段，即HIV易感者通过接种HIV疫苗发生免疫反应，从而产生对疾病的特异抵抗力，提高免疫水平，达到预防和治疗HIV的目的。经过三十多年的潜心研究，研究者提出了高效的HIV疫苗需要满足诱发机体多重免疫反应的要求，即HIV疫苗不仅仅可以诱导产生抗体，在病毒感染前期中和部分病毒；并且能够诱发细胞免疫，在后期清除被病毒感染的细胞；而且最重要的是，能够在HIV感染初期调动机体抗病毒感染的第一道防线，即粘膜免疫反应系统，从而多管齐下降低HIV病毒载量和HIV的传播速率，以达到预防与治疗HIV的双重目的。其中，粘膜免疫系统作为机体抵抗病原感染的第一道防线，其作用不可忽视。

近年来，性传播成为HIV传播的主要途径，这一变化预示着，HIV的传播开始从传统的高危人群向一般人群扩散^[2]，故可以诱发机体产生粘膜免疫反应的分枝杆菌疫苗载体在HIV疫苗研发中越来越受到重视。早在1991年，Anna Aldovini^[3]等人就尝试将HIV-1的多肽抗原表达在重组BCG(卡介苗)中并发现其可以诱发体液免疫和细胞介导的免疫应答，这一研究结果表明BCG可以被用作活性的、重组疫苗载体来诱发针对外界病原的免疫应答。

耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis，Msmeg)是另一种被广泛研究的分枝杆菌，并且是一种环境中生长的分枝杆菌^[4]。随着对Msmeg作为预防结核病疫苗研究的深入，科研人员了解到与传统的BCG疫苗相比，Msmeg疫苗具如下优势：Msmeg生长较BCG迅速，可快速培养甚至大批量生产^[5]；Msmeg不能进入宿主上皮细胞，毒力相对更低，且在HIV感染者中尚没有致病的案例报道^[6]；Msmeg不能在宿主的吞噬细胞内存留，而BCG却可在宿主的巨噬细胞中存活数月，故Msmeg对人体的安全性更高^[7]；Msmeg不仅可以强烈地刺激巨噬细胞产生生物因子，还可以快速刺激树突状细胞的成熟^[8]；此外，Msmeg也可以更有效的通过MHC-I呈递途径将抗原呈递给相应的免疫细胞^[9]。且前期的实验表明，重组Msmeg构建的HIV疫苗，可以诱发机体产生较强的细胞免疫反应以及长期的粘膜免疫反应^[10]，这对HIV疫苗的研发无疑是带来了希望。

发明内容

基于上述问题，本申请的发明人选择了三种来源于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)的细胞壁载体蛋白Rv1818^[11]，Rv2224^[12]和Rv3763^[13]，在无任何毒力的耻垢分枝杆菌Msmeg疫苗载体的表面展示来源于猴免疫缺陷病毒SIV的gp120蛋白抗原，构建重组菌株；其次，通过亚细胞分离和western-blot实验证明gp120抗原蛋白被展示在Msmeg表面，最后在小鼠体内对三株表面展示的重组HIV疫苗进行了免疫原性评价。

在一个方面，本发明的目的在于提供一种重组质粒，所述重组质粒含有猴免疫缺陷病毒的gp120基因和结核分枝杆菌的至少一种细胞壁载体蛋白的基因。

优选地，所述细胞壁载体蛋白选自结核分枝杆菌的Rv1818、Rv2224和Rv3763。需要说明的是，不同的表面展示蛋白(例如Rv1818、Rv2224和Rv3763)会造成蛋白(例如gp120)从胞内到表面运输速率的不同，蛋白(例如gp120)锚定在表面位置也会受到不同程度的影响，这些因素会影响抗原的表达及空间结构，从而对疫苗的免疫效果产生影响。

更优选地，所述重组质粒按顺时针方向依次含有抗性筛选基因Amp、大肠杆菌复制子oriE、启动子hsp60、运载蛋白基因Rv1818c或/和Rv2224c或/和Rv3763、Linker序列、来源于猴免疫缺陷病毒的抗原基因gp120、人流感血凝素病毒基因标签HA-tag、抗性筛选基因Hyg、整合酶基因Int的融合基因、噬菌体整合位点Attp和整合酶基因Int的融合基因。其中，启动子hsp60的DNA序列如SEQ ID NO:1所示；运载蛋白基因Rv1818c的序列如SEQ ID NO:2所示；运载蛋白基因Rv2224c的序列如SEQ ID NO:3所示；运载蛋白基因Rv3763的序列如SEQID NO:4所示；Linker片段(L)的DNA序列如SEQ ID NO:5所示，其对应的氨基酸序列为GGGGSGGG；猴免疫缺陷病毒SIV的抗原基因gp120的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；人流感血凝素病毒基因标签HA-tag的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，其对应的氨基酸序列为YPYDVPDYA；需要说明的是，抗原蛋白包括来源于SIV或HIV的gp120、gag、gp41蛋白等，但也不限于这几种抗原蛋白，运用本申请的表面展示体系可以展示来源于SIV、HIV以及其它多种疾病的抗原蛋白。

在第二个方面，本发明提供了上述重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

1)分别构建质粒plux1818、plux2224和plux3763：起始质粒p60luxN用限制性内切酶Nde I和Pst I消化后，回收约7kb的功能片段A；以结核分枝杆菌的基因组为模板，分别用引物BX1818f与引物BX1818r扩增出468bp的片段Rv1818c(SEQ ID NO:2)，引物BX2224f和引物BX2224r扩增出738bp的片段Rv2224c(SEQ ID NO:3)，引物BX3763f和引物BX3763r扩增出489bp的片段Rv3763(SEQ ID NO:4)，片段Rv1818c、Rv2224c和Rv3763经Nde I和Pst I酶切后分别与功能片段A进行连接，得到约8.4kb的质粒plux1818，8.7kb的质粒plux2224和8.4kb的质粒plux3763；

2)分别构建质粒plux1818gp、plux2224gp和plux3763gp：质粒plux1818，plux2224和plux3763分别用限制性内切酶BamH I和Hind III消化后，分别回收约7kb、7.3kb和7kb的功能片段B、C和D；以质粒pUCgp120为模板，用引物Gpf与引物Gpr扩增出1.5kp的片段(SEQID NO:6)，片段gp120经Bgl II和Hind III酶切后分别与功能片段B、C和D进行连接，得到约8.4kb的质粒plux1818gp、8.7kb的质粒plux2224gp和8.4kb的质粒plux3763gp；

3)构建质粒pI1818gp、pI2224gp和pI3763gp：质粒plux1818gp、plux2224gp和plux3763gp分别用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化后，分别回收约2.7kb、3.0kb和2.7kb的功能片段E、F和G；质粒pIBCG用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化后，回收约6.1kb的功能片段H，功能片段E、F和G分别与功能片段H进行连接，得到约8.8kb的质粒pI1818gp，9.1kb的质粒pI2224gp和8.8kb的质粒pI3763gp。其中，重组质粒pI1818gp的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；重组质粒pI2224gp的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；重组质粒pI3763gp的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；上述引物BX1818f、BX1818r、BX2224f、BX2224r、BX3763f、BX3763r、Gpf和Gpr的序列依次分别如SEQ ID NO：11～18所示。

在第三个方面，本发明提供了一种重组的耻垢分枝杆菌，所述耻垢分枝杆菌能稳定表达猴免疫缺陷病毒的gp120基因和结核分枝杆菌的至少一种细胞壁载体蛋白的基因。

优选地，所述耻垢分枝杆菌的基因组中含有Hsp60+Rv1818c+Linker+gp120+HA-tag元件序列、Hsp60+Rv2224c+Linker+gp120+HA-tag元件序列和Hsp60+Rv3763+Linker+gp120+HA-tag元件序列中的至少一种。

在第四个方面，本发明提供了一种艾滋病疫苗，所述疫苗含有上述耻垢分枝杆菌。本申请的发明人通过亚细胞组分分离和western-blot实验证明抗原蛋白gp120成功被三个来源于结核分枝杆菌的细胞壁蛋白Rv1818、Rv2224和Rv3763分别展示在耻垢分枝杆菌ZWY2表面；通过C57小鼠体内实验证明三株表面展示SIV gp120抗原蛋白的重组耻垢分枝杆菌艾滋病疫苗的免疫效果远远优于将抗原蛋白gp120表达在胞内的由胞内对照质粒pIgp转化的ZWY2菌株，且它们可以诱发机体的CD3和CD8高效表达IFN-γ、IL-2和TNF-α，甚至可以诱发机体的CD4高效表达IFN-γ和TNF-α；为了支持上述实验，发明人还构建了胞内对照质粒pIgp转化的ZWY2菌株，质粒pIgp(Hsp60+gp120+HA-tag)，除了不含运载蛋白基因和Linker外，其余元件都包含在内。

ZWY2菌株制备方法包括如下步骤：1)构建胞内对照质粒pIgp：质粒plux1818gp用限制性内切酶BamH I和Hind III消化后，回收约1.5kb的功能片段I；质粒p60luxN用限制性内切酶BamH I和Hind III消化后，回收约6.2的功能片段J，将功能片段I和J进行连接，得到约7.7kb的质粒pluxgp，质粒pluxgp用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化后，回收约2.3kb的功能片段K；质粒pIBCG用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化后，回收约6.1kb的功能片段L，将功能片段I和J进行连接，得到约8.4kb的质粒pIgp；

2)电转化法将上述质粒pluxgp和pIgp转入耻垢分枝杆菌ZWY2中，获得相应的胞内对照质粒pIgp转化的ZWY2菌株。

在第五个方面，本发明提供了上述重组质粒和耻垢分枝杆菌在制备艾滋病疫苗中的应用。

在第六个方面，本发明提供了表面展示SIV gp120抗原蛋白的艾滋病疫苗的制备方法，包括以下步骤：采用电转化法将上述制得的重组质粒pI1818gp、pI2224gp和/或pI3763gp转入耻垢分枝杆菌ZWY2中，获得表面展示SIV gp120抗原蛋白的重组耻垢分枝杆菌(例如下文的pI1818gp菌株、pI2224gp菌株、pI3763gp菌株)，即为所述艾滋病疫苗。应当说明的是，还可以将2种重组质粒，例如pI1818gp和pI2224gp同时转入耻垢分枝杆菌ZWY2中，或者将pI1818gp、pI2224gp和pI3763gp三种重组质粒同时转入耻垢分枝杆菌ZWY2中，以制备艾滋病疫苗。

综上所述，本发明的有益效果为：

1)本发明首次将hsp60启动子基因，三个来源于结核分枝杆菌的细胞壁运载蛋白Rv1818或Rv2224或Rv3763基因，Linker基因，来源于SIV的抗原蛋白gp120基因，以及人流感血凝素病毒基因标签HA-tag基因进行融合表达，分别构建了三个整合型重组质粒pI1818gp(含有Hsp60+Rv1818c+Linker+gp120+HA-tag元件)、pI2224gp(Hsp60+Rv2224c+Linker+gp120+HA-tag元件)和pI3763gp(Hsp60+Rv3763+Linker+gp120+HA-tag)，如图1、图2和图3所示，三者均可整合到分枝杆菌的基因组上进行稳定表达。此外，为了证明这三株疫苗在C57小鼠体内的免疫效果远远优于将抗原蛋白gp120表达在胞内，发明人还构建了没有运载蛋白的整合型胞内对照质粒pIgp(Hsp60+gp120+HA-tag)，除了不含运载蛋白基因和Linker外，其余元件都包含在内，如图4所示；

2)本发明首次采用耻垢分枝杆菌作为艾滋病疫苗设计的载体，其不仅能诱发长期的粘膜免疫反应^[14]，强烈地刺激巨噬细胞产生生物因子，还可以快速刺激树突状细胞的成熟^[8]，并且有效的通过MHC-I呈递途径将抗原呈递给相应的免疫细胞^[9]；此外，其生长迅速，故可以快速培养甚至大批量生产^[5]；同时，其不能进入宿主上皮细胞，也不能在宿主的吞噬细胞内存留，毒力相对更低，故对人体的安全性更高^[7]。此外，有文献报道敲除Ms0615基因能够进一步提高野生型耻垢分枝杆菌作为疫苗载体的安全性^[15]，因此，发明人采用recombineering技术成功地敲除了野生型耻垢分枝杆菌的Ms0615基因，构建了新型无抗性标记的疫苗载体ZWY2(MsmegΔMs0615)^[16]；

3)本发明首次筛选并证明了三个来源于结核分枝杆菌的细胞壁蛋白Rv1818、Rv2224和Rv3763具有运载作用，它们可将与其融合的蛋白运载至细胞壁从而进行表面展示；

4)本发明首次将来源于SIV的抗原蛋白gp120通过三个来源于结核分枝杆菌的细胞壁蛋白Rv1818、Rv2224和Rv3763分别展示在耻垢分枝杆菌ZWY2表面，分别如图6A、6B和6C所示；

5)本发明制备的艾滋病疫苗，易于培养，生长迅速，节省时间、人力、物力和财力。该三株表面展示SIV gp120抗原蛋白的重组耻垢分枝杆菌ZWY2疫苗可以将抗原蛋白gp120稳定地表面展示在耻垢分枝杆菌ZWY2表面，故其在C57小鼠体内的免疫效果远远优于将抗原蛋白gp120表达在胞内及目前已发表的基于腺病毒载体构建的表面展示gp120的艾滋病疫苗，其结果如图7和8所示，研究证实其可以诱发机体产生高效的CD3IFN-γ、CD3IL-2和CD3TNF-α，CD8IFN-γ、CD8IL-2和CD8TNF-α以及CD4IFN-γ和CD4TNF-α。本发明不仅为未来艾滋病疫苗的设计和研发提供了一种新的思路，也为其它疫苗的设计工作提供了一种新的方法。

附图说明

图1为质粒pI1818gp的酶切图谱；

图2为质粒pI2224gp的酶切图谱；

图3为质粒pI3763gp的酶切图谱；

图4为质粒pIgp的构建流程图；其中，digested表示消化；

图5为质粒pI1818gp的构建流程图(质粒pI2224gp和质粒pI3763gp的构建流程图以此类推)；

图6为重组pI1818gp菌株、pI2224gp菌株、pI3763gp菌株、pIgp菌株(对照)和ZWY2(对照)gp120抗原表面展示的western-blot验证图；其中，pIgp和ZWY2菌株作为阴性对照，A为pI1818gp菌株的细胞质、细胞壁和细胞膜的western-blot结果；B为pI2224gp菌株的细胞质、细胞壁和细胞膜的western-blot结果；C为pI3763gp菌株的细胞质、细胞壁和细胞膜的western-blot结果；

图7为一次免疫两周后C57小鼠的各个免疫因子表达图；其中，control表示对照；

图8为二次免疫两周后C57小鼠的各个免疫因子表达图。

具体实施方式

本发明涉及一种通过生物技术改造获得的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis，Msmeg)艾滋病疫苗，具体地，是一种将猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiency virus，SIV)的抗原蛋白gp120展示在细胞壁表面上的重组耻垢分枝杆菌ZWY2。此外，本发明还涉及三株表面展示SIV gp120蛋白的重组耻垢分枝杆菌中的运载蛋白的筛选与验证，即三种不同的表面展示体系的构建。

本发明筛选并验证了三个可以进行表面展示SIV gp120抗原蛋白的结核分枝杆菌细胞壁蛋白Rv1818，Rv2224和Rv3763具有运载作用，即构建了三种不同的表面展示体系。本发明提供了三个表面展示SIV gp120抗原蛋白的重组整合型质粒pI1818gp、pI2224gp和pI3763gp。本发明还提供了三株表面展示SIV gp120抗原蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株。本发明还提供了三株表面展示SIV gp120抗原蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗，并且证明这三株疫苗在C57小鼠体内的免疫效果远远优于将抗原蛋白gp120表达在胞内。

本发明为未来艾滋病疫苗的设计和研发提供一种新思路，也可以为其它疫苗的设计和研发工作提供一种新的方法。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,ArgentineJ.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中PCR反应所用的TransTaq-T DNA Polymerase、dNTP以及相关试剂均购买自北京全式金生物技术；抗生素潮霉素购自美仑生物技术有限公司；大肠杆菌感受态DH5α购买于广州东盛生物科技有限公司；DNA连接反应均采用Takara宝生物公司的T4DNA连接试剂盒；质粒DNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Magen(美基)生物公司。以下实施例中所用到的PCR引物和DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司负责合成。

实施例1重组质粒的构建

(1)构建整合质粒pI1818gp、质粒pI2224gp、质粒pI3763gp和胞内对照质粒pIgp，其结构示意图分别见图1、图2、图3和图4，构建流程分别见图4和图5(质粒pI2224gp和质粒pI3763gp的构建流程图以此类推)。由图1所示，质粒pI1818gp按顺时针方向依次含有抗性筛选基因AmpR，大肠杆菌复制子oriE，启动子hsp60，运载蛋白基因Rv1818c，Linker序列，来源于猴免疫缺陷病毒SIV的抗原基因gp120，人流感血凝素病毒基因标签HA-tag，抗性筛选基因Hyg和整合酶基因Int的融合基因，以及噬菌体整合位点Attp和整合酶基因Int的融合基因；由图2所示，质粒pI2224gp除了运载蛋白基因为Rv2224c外，其余元件与pI1818gp相同；由图3所示，质粒pI3763gp除了运载蛋白基因为Rv3763外，其余元件与pI1818gp相同；由图4所示，胞内对照质粒pIgp除了不含运载蛋白基因和Linker外，其余元件都包含在内。

(2)各元件的功能如下：

AmpR：氨苄青霉素抗性基因(Ampr)是一种筛选标记，用于筛选获得目的菌株。但只在大肠杆菌等细菌中起作用，在分枝杆菌中无作用，因为分枝杆菌对氨苄青霉素天然耐药。

oriE：大肠杆菌复制子(oriE)，负责质粒在大肠杆菌中进行复制的元件。

hsp60：一种分枝杆菌的强启动子，可以启动后续基因的强表达。

Rv1818c：基因Rv1818c编码的蛋白隶属于PE_PGRS家族蛋白，该家族蛋白主要位于分枝杆菌(如M.tuberculosis H37Rv和M.bovis BCG)的细胞壁上，因此该蛋白具有运载功能，可将与其融合的蛋白运载至细胞壁上表达，从而进行表面展示。

Rv2224c：基因Rv2224c编码的蛋白是一种脂蛋白，具有酶活力，故又被称为羧酸酯酶。该蛋白的N-末端含有II类信号肽以及一个半胱氨酸脂蛋白的锚定位点，也已经被证明其可以锚定在结核分枝杆菌的细胞壁上，故该蛋白也具有运载功能，可将与其融合的蛋白运载至细胞壁上表达，从而进行表面展示。

Rv3763：基因Rv3763编码的蛋白又名19KD蛋白(因其分子量为19000Da)或脂蛋白Lpqh，是结核分枝杆菌细胞膜上的一种脂蛋白，故该蛋白也具有运载功能，可将与其融合的蛋白运载至细胞壁上表达，从而进行表面展示。

Linker：该基因片段除了负责将Rv1818c基因与gp120基因连接外，另一个目的是避免载体蛋白Rv1818与靶蛋白gp120在蛋白结构折叠时相互间空间位阻产生干扰。

gp120：来源于猴免疫缺陷病毒SIV的抗原基因，可以编码产生抗原蛋白gp120，研究发现该抗原蛋白可以诱发机体产生以VRC01为代表的超强广谱中和抗体，把既往单抗仅中和20％-30％全球流行的中和谱提升到90％以上。

HA-tag：人流感血凝素病毒基因标签，主要是作为抗原蛋白gp120的标签，便于进行后续的western-blot验证。

Hyg：表示潮霉素B抗性基是一种筛选标记，用于筛选获得目的菌株，可在大肠杆菌和分枝杆菌中都起作用。

Int：整合酶基因可以表达出整合酶，主要作用是将质粒整合进分枝杆菌的基因组中。

Attp：噬菌体整合位点(attP)，整合酶获得表达后，可通过结合此位点将整个质粒整合进分枝杆菌的基因组中的attB位点。即此位点的主要作用是被整合酶Int结合，起到整合至基因组的作用。

(3)质粒pI1818gp、pI2224gp、pI3763gp和pIgp的具体构建方法如下：

1、质粒plux1818、plux2224和plux3763的构建：

1)如图5所示，起始质粒p60luxN(由本实验室自己构建，质粒图谱见图4，具体构建方法见参考文献17)用限制性内切酶Nde I和Pst I消化后，去掉luxAB基因的部分片段，回收约7kb的功能片段A；

2)以结核分枝杆菌(已灭活)的基因组为模板，分别用引物BX1818f(SEQ ID NO:11)与引物BX1818r(SEQ ID NO:12)扩增出468bp的片段Rv1818c(SEQ ID NO:2)，引物BX2224f(SEQ ID NO:13)和引物BX2224r(SEQ ID NO:14)扩增出738bp的片段Rv2224c(SEQID NO:3)，引物BX3763f(SEQ ID NO:15)和引物BX3763r(SEQ ID NO:16)扩增出489bp的片段Rv3763(SEQ ID NO:4)，片段Rv1818c、Rv2224c和Rv3763经Nde I和Pst I消化后分别与功能片段A混合后，加入连接酶进行连接，分别获得重组质粒plux1818、plux2224和plux3763，分别转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含潮霉素抗性的LB固体平板分别筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中分别培养后，分别提取质粒plux1818(约8.3kb)、plux2224(约8.5kb)和plux3763(约8.3kb)。

3)用Pst I和Xba I分别消化鉴定质粒plux1818、plux2224和plux3763，正确的plux1818质粒经酶切后跑胶结果应该是800bp和7.9kb处各有一条带，正确的plux2224质粒经酶切后跑胶结果应该是1kb和7.9kb处各有一条带，正确的plux3763质粒经酶切后跑胶结果应该是800bp和7.9kb处各有一条带。将酶切正确的质粒送去测序，分别选取出Rv1818c、Rv2224c和Rv3763片段均不存在突变的质粒进行后续实验，测序采用的引物分别是BX1818f与BX1818r，BX2224f和BX2224r，以及BX3763f和BX3763r。

2、质粒plux1818gp、plux2224gp和plux3763gp的构建：

1)质粒plux1818，plux2224和plux3763分别用限制性内切酶BamH I和Hind III消化后，均去掉luxAB的剩余片段，分别回收约7kb、7.3kb和7kb的功能片段B、C和D；

2)以质粒pUCgp120(由中国科学院广州生物医药与健康研究院陈凌实验室馈赠)为模板，用引物Gpf(SEQ ID NO:17)与引物Gpr(SEQ ID NO:18)扩增出1.5kp的片段(SEQ IDNO:6)，片段gp120经Bgl II(BamH I的同尾酶)和Hind III酶切后分别与功能片段B、C和D混合后，加入连接酶进行连接，分别获得重组质粒plux1818gp、plux2224gp和plux3763gp，分别转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含潮霉素抗性的LB固体平板分别筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中分别培养后，分别提取质粒plux1818gp(约8.2kb)、plux2224gp(约8.4kb)和plux3763gp(约8.2kb)。

3)用Nde I和Hind III分别消化鉴定质粒plux1818gp、plux2224gp和plux3763gp，正确的plux1818gp质粒经酶切后跑胶结果应该是2kb和6.2kb处各有一条带，正确的plux2224gp质粒经酶切后跑胶结果应该是2.2kb和6.2kb处各有一条带，正确的plux3763gp质粒经酶切后跑胶结果应该是2kb和6.2kb处各有一条带。再将酶切正确的质粒送去测序，分别选取出gp120片段均不存在突变的质粒进行后续实验，测序采用的引物是Gpf与Gpr。

3、质粒pI1818gp、pI2224gp和pI3763gp的构建：

1)质粒plux1818gp、plux2224gp和plux3763gp分别用限制性内切酶Kpn I和HindIII消化后，分别回收约2.7kb、3.0kb和2.7kb的功能片段E、F和G；

2)质粒pIBCG用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化后，回收约6.1kb的功能片段H，功能片段E、F和G分别与功能片段H进行连接，得到质粒pI1818gp、pI2224gp和pI3763gp；分别转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含潮霉素抗性的LB固体平板分别筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中分别培养后，分别提取质粒pI1818gp(约8.8kb)、pI2224gp(约9.0kb)和pI3763gp(约8.8kb)；

3)用Kpn I和Hind III分别消化鉴定质粒pI1818gp、pI2224gp和pI3763gp，正确的pI1818gp质粒经酶切后跑胶结果应该是2.7kb和6.1kb处各有一条带，正确的pI2224gp质粒经酶切后跑胶结果应该是2.9kb和6.1kb处各有一条带，正确的plux3763gp质粒经酶切后跑胶结果应该是2.7kb和6.1kb处各有一条带。再将酶切正确的质粒送去测序，分别选取出gp120片段均不存在突变的质粒进行后续实验，测序采用的引物是Gpf与Gpr。

4、胞内对照质粒pIgp的构建：

1)构建流程如图4所示，质粒plux1818gp用限制性内切酶BamH I和Hind III消化后，回收约1.5kb的功能片段I；质粒p60luxN用限制性内切酶BamH I和Hind III消化后，回收约6.2的功能片段J，得到质粒pluxgp；转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含潮霉素抗性的LB固体平板分别筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中分别培养后，提取质粒pluxgp(约7.7kb)；

2)质粒pluxgp用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化后，回收约2.3kb的功能片段K；质粒pIBCG用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化后，回收约6.1kb的功能片段L，得到质粒pluxgp；转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含潮霉素抗性的LB固体平板分别筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中分别培养后，提取质粒pIgp(约8.4kb)。

实施例2重组耻垢分枝杆菌的构建

将实施例1构建的相关质粒转化进入耻垢分枝杆菌ZWY2中，并用western-blot验证各个菌株中抗原蛋白基因gp120的表达，且表达在耻垢分枝杆菌ZWY2菌株的表面。具体操作如下：

1、转化：

将质粒pI1818gp、pI2224gp、pI3763gp和pIgp通过电转化的方法将其分别转入耻垢分枝杆菌ZWY2中(转化方法见参考文献18)，获得相应的转化株，分别命名为pI1818gp菌株、pI2224gp菌株、pI3763gp菌株和pIgp菌株，其中，pI1818gp菌株、pI2224gp菌株、pI3763gp菌株即为艾滋病疫苗。

2、Western-blot验证抗原蛋白基因gp120的表面展示：

首先对pI1818gp菌株、pI2224gp菌株、pI3763gp菌株、pIgp菌株和ZWY2进行亚细胞组分分离实验，分别得到上述菌株的细胞壁、细胞膜和细胞质组分，然后分别对上述菌株的三个组分做western-blot，从而验证SIV gp120的表面展示效果，其中pIgp菌株和ZWY2菌株作为阴性对照。

1)亚细胞组分分离：

菌株pI1818gp菌株、pI2224gp菌株、pI3763gp菌株、pIgp菌株和ZWY2的亚细胞组分分离实验见参考文献19，分别得到上述5个菌株的细胞壁、细胞膜和细胞质组分。

2)Western-blot表达与鉴定分析

对5个菌株pI1818gp菌株、pI2224gp菌株、pI3763gp菌株、pIgp菌株和ZWY2的细胞壁、细胞膜和细胞质组分分别进行western-blot实验验证，具体操作见参考文献20，验证结果如图6所示。

实施例3艾滋病疫苗免疫原性测试

通过动物实验评价实施例2艾滋病疫苗的免疫原性，将购自北京维通利华实验动物技术有限公司的84只6周龄的C57BL/6雌鼠随机分7组，分别为pI1818gp菌株组、pI2224gp菌株组、pI3763gp菌株组、pIgp菌株组、ZWY2组、PBS组(阴性对照)和腺病毒载体Ad5SIV-env组(阳性对照，由中国科学院广州生物医药与健康研究院陈凌研究员馈赠)，各组动物数量如表1，本动物实验的IACUC号为2017024。

表1小鼠分组及免疫细则

具体操作如下：

1)菌体制备及免疫，具体操作如下：

a.将菌体疫苗pI1818gp菌株、pI2224gp菌株、pI3763gp菌株、pIgp菌株和ZWY2接种在含有30mL 7H9培养基(含10％OADC)的50mL锥形瓶中，37℃摇床中培养至OD在0.6-0.8；

b.将上述5种菌体吸取100uL于15mL离心管中，加入9.9mL 7H9培养基(含10％OADC)中，4000r/min室温离心后加入10mL PBS重悬，于4000r/min离心；重复用PBS上洗涤三次；最后将各组菌液重悬在10mLPBS中，用于注射；

c.采取皮下注射免疫两次，期间间隔2周。

2)第一次免疫2周后胞内细胞因子表达水平的检测，具体操作如下：

①分离脾细胞：将眼球取血后的小鼠断颈处死，泡在75％酒精里；超净台取脾，取下后放在含DPBS的细胞皿里；新皿中放4mL 1×小鼠淋巴细胞分离液，将脾放在灭菌的200目尼龙网中研磨直至成白色；将含脾细胞的分离液转移到15mL离心管中，小心地在上层放入500-1000uL的RPMI1640培养基；室温800g离心30min，升降速调3-4档；1mL移液枪吸取淋巴细胞层，加入约10mL RPMI1640培养基，上下颠倒洗，室温离心250g，5-10min；吸泵去掉上层培养基，再洗一次；R10重悬后(1mL/每脾)计数(取40uL加入40uL台盼蓝中)；

②细胞计数后调整细胞浓度至2×106/200uL(100万/孔，200uL/孔，加入到96孔培养板，培养基为R10)；

③在上述细胞悬液中加入特异性抗原肽，阴性对照孔加入相应浓度的DMSO，阳性对照加入PMA(40ng/ml)+离子霉素(1000ng/ml)，37℃，5％CO2培养1-2h；

④加入稀释后的BFA 10ul(brefeldin，布雷菲德菌素，阻断剂)混匀。(BFA配置：例：50孔*200ul细胞悬液＝10000ul，10ul BFA原液加入490ul R10,取10ul稀释后的BFA再加入200ul体积的培养孔即BFA原液稀释1000倍)，37℃，5％CO2培养16h或过夜；

⑤吹打均匀细胞，转移至流式管中(12×75mm聚苯乙烯管)。加入1mLPBS洗液，混匀后300g室温离心10min；弃上清，分别加入CD8-Perep，CD3-APC(每种流式抗体加1uL/孔，设置单染作为对照)。振荡2-3s后，室温避光放置25-30min；

⑥加入1mL PBS洗液，混匀后300g室温离心10min；重复洗涤一次；振荡混匀细胞，然后加入250uL cytofix/cytoperm(直接加原液)混匀后，避光4℃反应20min；加入1mL 1×perm/wash；400g离心8min，弃上清；重复洗涤一次；

⑦弃上清，分别加入5uL 5倍稀释后的抗体CD3-BV421、CD4-FITC GK 1.5、CD8APCRat anti-mouse 53-6.7、IFN-γPE Rat anti-mouse XMG 1.2、IL-2APC-cy7Rat anti-mouseJES6-5H4和TNF-αPE-cy7Rat anti-mouse MP6-XT2，然后混匀；避光4℃反应30-60min；加入1mL 1×perm/wash，400g离心8min；弃上清，加入1mLPBS悬液，混匀后400g室温离心10min；

⑧弃上清后每管加入350uL PBS。振荡混匀，直接上机，若短时间内无法上机检测则继续进行第⑨步；

⑨加入30uL/管10％甲醛，振荡10-20s；4℃避光保存，24h内上机检测；注意：在C6流式细胞仪上检测(最多可检测4色荧光)，用Cell Quest软件获取数据，然后用Flowjo软件分析)，结果见图7。

3)第二次免疫2周后胞内细胞因子表达水平的检测，具体操作如下：

见上2)，即与第一免疫2周后胞内细胞因子表达水平的检测操作相同，结果见图8。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

参考文献：

[1]Mills E J,Nachega J B,Bangsberg D R,et al.Adherence to HAART:asystematic review of developed and developing nation patient-reportedbarriers and facilitators[J].PLoS medicine,2006,3(11):e438.

[2]Baral S D,Poteat T,S,et al.Worldwide burden of HIV intransgender women:a systematic review and meta-analysis[J].The lancetinfectious diseases,2013,13(3):214-222.

[3]Aldovini A,Young R A.Humoral and cell-mediated immune responses tolive recombinant BCG–HIV vaccines[J].Nature,1991,351(6326):479.

[4]Tsukamura M.Properties of Mycobacterium smegmatis freshly isolatedfrom soil[J].Japanese journal of microbiology,1976,20(4):355-356.

[5]Barry III,Clifton E."Mycobacterium smegmatis:an absurd model fortuberculosis？"Trends in microbiology,2001,9(10):473-474.

[6]Newton J A,Weiss P J,Bowler W A,et al.Soft-tissue infection due toMycobacterium smegmatis:report of two cases[J].Clinical infectious diseases,1993,16(4):531-533.

[7]Via L E,Deretic D,ulmer R J,et al.Arrest of mycobacterialphagosome maturation is caused by a block in vesicle fusion between stagescontrolled by rab5and rab7[J].Journal of biological chemistry,1997,272(20):13326-13331.

[8]Yadav M,Roach S K,Schorey J S.Increased mitogen-activated proteinkinase activity and TNF-αproduction associated with Mycobacterium smegmatis-but not Mycobacterium avium-infected macrophages requires prolongedstimulation of the calmodulin/calmodulin kinase and cyclic AMP/proteinkinaseA pathways[J].The journal of immunology,2004,172(9):5588-5597.

[9]Neyrolles O,Gould K,Gares M P,et al.Lipoprotein access to MHCclass I presentation during infection of murine macrophages with livemycobacteria[J].The journal of immunology,2001,166(1):447-457.

[10]Yu J S,Peacock J W,Vanleeuwen S,et al.Generation of mucosal anti-human immunodeficiency virus type 1T-cell responses by recombinantMycobacterium smegmatis[J].Clinical and vaccine immunology,2006,13(11):1204-1211.

[11]Michael J.Brennan,et al.Evidence that Mycobacterial PE_PGRSProtein Are Cell Surface Constituents That Influence Interactions with OtherCells.Infection and Immunity,Dec.2001,p.7326-7333.

[12]Jyothi Rengarajan,Elissa Murphy,Arnold Park,Cassandra L Krone,Erick C.Hett,Barry R.Bloom,Laurie H.Glimcher,and Erick J.Rubin.Mycobacteriumtuberculosis Rv2224c modulates innate immune responses[J].PNAS,2008,vol.105,No.1.

[13]Sudhir Sinha,et al.Immunogenic membrane-associated proteins ofMycobacterium tuberculosis revealed by proteomics.Microbiology,2005,151:2411-2419.

[14]Neutra M R,Kozlowski P A.Mucosal vaccines:the promise and thechallenge[J].Nature reviews immunology,2006,6(2):148-158.

[15]Sweeney K A,Dao D N,Goldberg M F,et al.A recombinantMycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity againstMycobacterium tuberculosis[J].Nature medicine,2011,17(10):1261-1268.

[16]Yang F,Tan Y,Liu J,et al.Efficient construction of unmarkedrecombinant mycobacteria using an improved system[J].Journal ofmicrobiological methods,2014,103:29-36.

[17]Liu,T.,Wang,B.,Guo,J.,Zhou,Y.,Julius,M.,Njire,M.,Cao,Y.,Wu,T.,Liu,Z.,Wang,C.,Xu,Y.and Zhang,T.(2015).Role of folP1 and folP2 genes in theaction of sulfamethoxazole and trimethoprim against mycobacteria.J MicrobiolBiotechnol 25(9):1559-67.

[18]Snapper,S.B.,Melton,R.E,Mustafa,S,Kieser,T and Jacobs,WR.Isolation and Characterization of Efficient Plasmid Transformation Mutantsof Mycobacterium smegmatis.Mol.Microbiol.1990,4:1911-1919.

[19]Mandana Rezwan,Marie-Antoinette Laneele,Peter Sander,MamadouDaffe.Breaking down the wall:Fraction of Mycobacteria.Journal ofMicrobiological Methods,2007,68:32-39.

[20]Mahmood T,Yang P-C.Western Blot:Technique,Theory,and TroubleShooting.North American Journal of Medical Sciences.2012；4(9):429-434.

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种艾滋病疫苗及其制备方法

<130> 2018

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggccattgcg aagtgattgg atcggggatg aaaccggggg tcaccgggtg acggcaaccc 60

cgctacttac gctggccggg cgcagtgccc gcgacggacg gctcaagttg tcctcgctgc 120

cactcgctgc gacgacgggc ctggcctcac cgtcccgacc tacgactcac cggtcgcgag 180

tgccaacgtt attcttagca ctcgcctatg ccgagtgcaa gaagccccgc accgggtcat 240

gcccctcgtt cgaccttgtc ctcggccctc cgatccgggt gagtatgttc ggcccatgac 300

cgccaacgac aacaagaccc gtaaatggtc ggccgcagac gtccccgatc aaagcgggcg 360

cgtcgttgtg gtcacctcta gatcgattaa gcc 393

<210> 2

<211> 445

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 2

tcatttgtgg tcacgatccc ggaggcgcta gcggcggtgg cgaccgattt ggcgggtatc 60

gggtcgacga tcggcaccgc caacgcggcc gccgcggtcc cgaccacgac ggtgttggcc 120

gccgccgccg atgaggtgtc ggcggcgatg gcggcattgt tctccggaca cgcccaggcc 180

tatcaggcgc tgagcgccca ggcggcgctg tttcacgagc agttcgtgcg ggcgctcacc 240

gccggggcgg gctcgtatgc ggccgccgag gccgccagcg cggccccgct agagggtgtg 300

ctcgacgtga tcaacgcccc cgccctggcg ctgttggggc gcccactgat cggtaacgga 360

gccaacgggg ccccggggac cggggcaaac ggcggcgacg gcggaatctt gatcggcaac 420

ggcgggggtg gctcgggtgg cggtg 445

<210> 3

<211> 707

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 3

ggggcatgag gctgtctcgc cgcgacaaga tcgcgcgcat gctgttgatc tgggccgcgc 60

tcgccgccgt ggcgttggtt cttgtgggct gcatccgcgt ggtcggggga cgcgctcgta 120

tggcggagcc gaagctgggc cagccggtgg agtggacacc gtgccggtcg tcaaacccgc 180

aagtaaagat ccccggcggc gcgttatgcg gcaagctcgc tgtaccggtc gactacgacc 240

gccccgatgg tgacgtggcg gcgctggcgc tgattcgctt tccggcgacg ggagacaaga 300

tcggttcgct ggtcataaat cccggtggac ccggcgaatc cggtatcgag gccgccttgg 360

gcgtcttcca gacattgccg aagcgggtgc acgaaaggtt cgacctggtt gggttcgacc 420

cccgcggggt ggcgtcgtcc cggccggcga tctggtgcaa ctccgatgcc gacaacgacc 480

ggctgcgggc cgagccgcag gttgactaca gccgggaggg tgtggcgcac atcgagaacg 540

agaccaagca attcgtcggt cgctgtgtgg acaagatggg caagaacttt ctggcccatg 600

tcgggacggt caacgtcgcc aaggacctgg atgccattcg cgcggcgttg ggcgacgaca 660

agctgaccta cctgggctac tcgggcgggg gtggctcggg tggcggt 707

<210> 4

<211> 459

<212> DNA

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 4

gaagcgtgga ctgacggtcg cggtagccgg agccgccatt ctggtcgcag gtctttccgg 60

atgttcaagc aacaagtcga ctacaggaag cggtgagacc acgaccgcgg caggcacgac 120

ggcaagcccc ggcgccgcct ccgggccgaa ggtcgtcatc gacggtaagg accagaacgt 180

caccggctcc gtggtgtgca caaccgcggc cggcaatgtc aacatcgcga tcggcggggc 240

ggcgaccggc attgccgccg tgctcaccga cggcaaccct ccggaggtga agtccgttgg 300

gctcggtaac gtcaacggcg tcacgctggg atacacgtcg ggcaccggac agggtaacgc 360

ctcggcaacc aaggacggca gccactacaa gatcactggg accgctaccg gggtcgacat 420

ggccaacccg atgggcgggg gtggctcggg tggcggtgg 459

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcgggggtg gctcgggtgg cggt 24

<210> 6

<211> 1515

<212> DNA

<213> Simian Immunodeficiency Virus

<400> 6

atgctgtatg tgacagtctt ctatggcgtg cctgcctgga ggaatgccac catccccctg 60

ttctgtgcca ccaagaacag ggacacctgg ggcaccaccc agtgcctgcc tgacaatggc 120

gactactctg aggtggccct gaatgtgaca gagtcctttg atgcctggaa caacacagtg 180

acagagcagg ccattgagga tgtctggcag ctgtttgaga cctccatcaa gccatgtgtg 240

aagctgtccc ccctgtgcat caccatgagg tgcaacaagt ctgagacaga caggtggggc 300

ctgaccaagt ccatcaccac cacagcctcc accacctcca ccacagcctc tgccaaggtg 360

gacatggtga atgagacctc ctcctgcatt gcccaggaca actgcacagg cctggagcag 420

gagcagatga tctcctgcaa gttcaacatg acaggcctga agagggacaa gaagaaggag 480

tacaatgaga cctggtactc tgctgacctg gtctgtgagc agggcaacaa cacaggcaat 540

gagtccaggt gctacatgaa ccactgcaac acctctgtga tccaggagtc ctgtgacaag 600

cactactggg atgccatcag gttcaggtac tgtgcccccc ctggctatgc cctgctgagg 660

tgcaatgaca ccaactactc tggcttcatg cccaagtgct ccaaggtggt ggtctcctcc 720

tgcaccagga tgatggagac ccagacctcc acctggtttg gcttcaatgg caccagggct 780

gagaacagga cctacatcta ctggcatggc agggacaaca ggaccatcat ctccctgaac 840

aagtactaca acctgaccat gaagtgcagg aggcctggca acaagacagt gctgcctgtg 900

accatcatgt ctggcctggt cttccactcc cagcccatca atgacaggcc caagcaggcc 960

tggtgctggt ttggcggcaa gtggaaggat gccatcaagg aggtgaagca gaccattgtg 1020

aagcatccca ggtacacagg caccaacaac acagacaaga tcaacctgac agcccctggc 1080

ggcggcgacc ctgaggtgac cttcatgtgg accaactgca ggggcgagtt cctgtactgc 1140

aagatgaact ggttcctgaa ctgggtggag gacaggaaca cagccaacca gaagcccaag 1200

gagcagcaca agaggaacta tgtgccatgc cacatcaggc agatcatcaa cacctggcac 1260

aaggtgggca agaatgtcta cctgcccccc agggagggcg acctgacctg caactccaca 1320

gtgacctccc tgattgccaa cattgactgg attgatggca accagaccaa catcaccatg 1380

tctgctgagg tggctgagct gtacaggctg gagctgggcg actacaagct ggtggagatc 1440

acccccattg gcctggcccc cacagatgtg aagaggtaca ccacaggcgg cacctccagg 1500

aacaagaggc tgcag 1515

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tacccatacg atgttccaga ttacgct 27

<210> 8

<211> 8843

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 60

aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 120

gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 180

ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 240

gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 300

tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 360

attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 420

tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 480

agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 540

aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 600

tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 660

cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 720

tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 780

tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 840

tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 900

tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 960

aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 1020

gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 1080

tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 1140

aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 1200

aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 1260

tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 1320

gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 1380

cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 1440

acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 1500

cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 1560

cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 1620

aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 1680

gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 1740

atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 1800

tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 1860

gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 1920

agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 1980

cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 2040

gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 2100

gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc 2160

caagcgcgca attaaccctc actaaaggga acaaaagctg ggtaccgcag cgagtcagtg 2220

agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 2280

cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 2340

attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 2400

cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 2460

gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctccaccgc 2520

ggtggcggcc gctctagagg tgaccacaac gacgcgcccg ctttgatcgg ggacgtctgc 2580

ggccgaccat ttacgggtct tgttgtcgtt ggcggtcatg ggccgaacat actcacccgg 2640

atcggagggc cgaggacaag gtcgaacgag gggcatgacc cggtgcgggg cttcttgcac 2700

tcggcatagg cgagtgctaa gaataacgtt ggcactcgcg accggtgagt cgtaggtcgg 2760

gacggtgagg ccaggcccgt cgtcgcagcg agtggcagcg aggacaactt gagccgtccg 2820

tcgcgggcac tgcgcccggc cagcgtaagt agcggggttg ccgtcacccg gtgacccccg 2880

gtttcatccc cgatccaatc acttcgcaat ggccaagaca attgccatat gtcatttgtg 2940

gtcacgatcc cggaggcgct agcggcggtg gcgaccgatt tggcgggtat cgggtcgacg 3000

atcggcaccg ccaacgcggc cgccgcggtc ccgaccacga cggtgttggc cgccgccgcc 3060

gatgaggtgt cggcggcgat ggcggcattg ttctccggac acgcccaggc ctatcaggcg 3120

ctgagcgccc aggcggcgct gtttcacgag cagttcgtgc gggcgctcac cgccggggcg 3180

ggctcgtatg cggccgccga ggccgccagc gcggccccgc tagagggtgt gctcgacgtg 3240

atcaacgccc ccgccctggc gctgttgggg cgcccactga tcggtaacgg agccaacggg 3300

gccccgggga ccggggcaaa cggcggcgac ggcggaatct tgatcggcaa cggcgggggt 3360

ggctcgggtg gcggtggatc cggcgggggt ggctcgatgc tgtatgtgac agtcttctat 3420

ggcgtgcctg cctggaggaa tgccaccatc cccctgttct gtgccaccaa gaacagggac 3480

acctggggca ccacccagtg cctgcctgac aatggcgact actctgaggt ggccctgaat 3540

gtgacagagt cctttgatgc ctggaacaac acagtgacag agcaggccat tgaggatgtc 3600

tggcagctgt ttgagacctc catcaagcca tgtgtgaagc tgtcccccct gtgcatcacc 3660

atgaggtgca acaagtctga gacagacagg tggggcctga ccaagtccat caccaccaca 3720

gcctccacca cctccaccac agcctctgcc aaggtggaca tggtgaatga gacctcctcc 3780

tgcattgccc aggacaactg cacaggcctg gagcaggagc agatgatctc ctgcaagttc 3840

aacatgacag gcctgaagag ggacaagaag aaggagtaca atgagacctg gtactctgct 3900

gacctggtct gtgagcaggg caacaacaca ggcaatgagt ccaggtgcta catgaaccac 3960

tgcaacacct ctgtgatcca ggagtcctgt gacaagcact actgggatgc catcaggttc 4020

aggtactgtg ccccccctgg ctatgccctg ctgaggtgca atgacaccaa ctactctggc 4080

ttcatgccca agtgctccaa ggtggtggtc tcctcctgca ccaggatgat ggagacccag 4140

acctccacct ggtttggctt caatggcacc agggctgaga acaggaccta catctactgg 4200

catggcaggg acaacaggac catcatctcc ctgaacaagt actacaacct gaccatgaag 4260

tgcaggaggc ctggcaacaa gacagtgctg cctgtgacca tcatgtctgg cctggtcttc 4320

cactcccagc ccatcaatga caggcccaag caggcctggt gctggtttgg cggcaagtgg 4380

aaggatgcca tcaaggaggt gaagcagacc attgtgaagc atcccaggta cacaggcacc 4440

aacaacacag acaagatcaa cctgacagcc cctggcggcg gcgaccctga ggtgaccttc 4500

atgtggacca actgcagggg cgagttcctg tactgcaaga tgaactggtt cctgaactgg 4560

gtggaggaca ggaacacagc caaccagaag cccaaggagc agcacaagag gaactatgtg 4620

ccatgccaca tcaggcagat catcaacacc tggcacaagg tgggcaagaa tgtctacctg 4680

ccccccaggg agggcgacct gacctgcaac tccacagtga cctccctgat tgccaacatt 4740

gactggattg atggcaacca gaccaacatc accatgtctg ctgaggtggc tgagctgtac 4800

aggctggagc tgggcgacta caagctggtg gagatcaccc ccattggcct ggcccccaca 4860

gatgtgaaga ggtacaccac aggcggcacc tccaggaaca agaggctgca gtacccatac 4920

gatgttccag attacgctta aactagtgaa ttcaagctta accgaagcgt ttgatagttg 4980

actgcagctc gagtaagccg ataagcgaca ttatgtcaag tcccgggtct agaccggccg 5040

tgcggaatta agccggcccg taccctgtga atagaggtcc gctgtgacac aagaatccct 5100

gttacttctc gaccgtattg attcggatga ttcctacgcg agcctgcgga acgaccagga 5160

gttctgggag ccgctggccc gccgagccct ggaggagctc gggctgccgg tgccgccggt 5220

gctgcgggtg cccggcgaga gcaccaaccc cgtactggtc ggcgagcccg gcccggtgat 5280

caagctgttc ggcgagcact ggtgcggtcc ggagagcctc gcgtcggagt cggaggcgta 5340

cgcggtcctg gcggacgccc cggttccggt gccccgcctc ctcggccgcg gcgagctgcg 5400

gcccggcacc ggagcctggc cgtggcccta cctggtgatg agccggatga ccggcaccac 5460

ctggcggtcc gcgatggacg gcacgaccga ccggaacgcg ctgctcgccc tggcccgcga 5520

actcggccgg gtgctcggac ggctgcacag ggtgccgctg accgggaaca ccgtgctcac 5580

cccccattcc gaggtcttcc cggaactgct gcgggaacgc cgcgcggcga ccgtcgagga 5640

ccaccgcggg tggggctacc tctcgccccg gctgctggac cgcctggagg actggctgcc 5700

ggacgtggac acgctgctgg ccggccgcga accccggttc gtccacggcg acctgcacgg 5760

gaccaacatc ttcgtggacc tggccgcgac cgaggtcacc gggatcgtcg acttcaccga 5820

cgtctatgcg ggagactccc gctacagcct ggtgcaactg catctcaacg ccttccgggg 5880

cgaccgcgag atcctggccg cgctgctcga cggggcgcag tggaagcgga ccgaggactt 5940

cgcccgcgaa ctgctcgcct tcaccttcct gcacgacttc gaggtgttcg aggagacccc 6000

gctggatctc tccggcttca ccgatccgga ggaactggcg cagttcctct gggggccgcc 6060

ggacaccgcc cccggcgcct gaatctagac tagtttggaa gaatgggtgt ctgccgacca 6120

catatgggcc ggtcaagata ggtttttacc ccctctcggc tgcatcctct aagtggaaag 6180

aaattgcagg tcgtagaagc gcgttgaagc ctgagagttg cacaggagtt gcaacccggt 6240

agccttgttc acgacgagag gagacctagt tggcacgtcg cggatgggga tcgctgaaga 6300

ctcagcgcag cgggaggatc caagcctcat acgtcaaccc gcaggacggt gtgaggtact 6360

acgcgctgca gacctacgac aacaagatgg acgccgaagc ctggctcgcg ggcgagaagc 6420

ggctcatcga gatggagacc tggacccctc cacaggaccg ggcgaagaag gcagccgcca 6480

gcgccatcac gctggaggag tacacccgga agtggctcgt ggagcgcgac ctcgcagacg 6540

gcaccaggga tctgtacagc gggcacgcgg agcgccgcat ctacccggtg ctaggtgaag 6600

tggcggtcac agagatgacg ccagctctgg tgcgtgcgtg gtgggccggg atgggtagga 6660

agcacccgac tgcccgccgg catgcctaca acgtcctccg ggcggtgatg aacacagcgg 6720

tcgaggacaa gctgatcgca gagaacccgt gccggatcga gcagaaggca gccgatgagc 6780

gcgacgtaga ggcgctgacg cctgaggagc tggacatcgt cgccgctgag atcttcgagc 6840

actaccggat cgcggcatac atcctggcgt ggacgagcct ccggttcgga gagctgatcg 6900

agcttcgccg caaggacatc gtggacgacg gcatgacgat gaagctccgg gtgcgccgtg 6960

gcgcttcccg cgtggggaac aagatcgtcg ttggcaacgc caagaccgtc cggtcgaagc 7020

gtcctgtgac ggttccgcct cacgtcgcgg agatgatccg agcgcacatg aaggaccgta 7080

cgaagatgaa caagggcccc gaggcattcc tggtgaccac gacgcagggc aaccggctgt 7140

cgaagtccgc gttcaccaag tcgctgaagc gtggctacgc caagatcggt cggccggaac 7200

tccgcatcca cgacctccgc gctgtcggcg ctacgttcgc cgctcaggca ggtgcgacga 7260

ccaaggagct gatggcccgt ctcggtcaca cgactcctag gatggcgatg aagtaccaga 7320

tggcgtctga ggcccgcgac gaggctatcg ctgaggcgat gtccaagctg gccaagacct 7380

cctgaaacgc aaaaagcccc cctcccaagg acactgagat cgattaagcc gataagcgac 7440

attatgtcaa gtctcgaggt cggggatcct ctagagtcga ccaccaaggg caccatctct 7500

gcttgggcca ccccgttggc cgcagccagc tcgctgagag ccgtgaacga cagggcgaac 7560

gccagcccgc cgacggcgag ggttccgacc gctgcaactc ccggtgcaac cttgtcccgg 7620

tctattctct tcactgcacc agctccaatc tggtgtgaat gcccctcgtc tgttcgcgca 7680

ggcggggggc tctattcgtt tgtcagcatc gaaagtagcc agatcaggga tgcgttgcaa 7740

ccgcgtatgc ccaggtcaga agagtcgcac aagagttgca gacccctgga aagaaaaatg 7800

gccagagggc gaaaacaccc tctgaccagc ggagcgggcg acgggaatcg aacccgcgta 7860

gctagtttgg aagaatgggt gtctgccgac cacatatggg ccggtcaaga taggttttta 7920

ccccctctcg gctgcatcct ctaagtggaa agaaattgca ggtcgtagaa gcgcgttgaa 7980

gcctgagagt tgcacaggag ttgcaacccg gtagccttgt tcacgacgag aggagaccta 8040

gttggcacgt cgcggatggg gatcgctgaa gactcagcgc agcgggagga tccaagcctc 8100

atacgtcaac ccgcaggacg gtgtgaggta ctacgcgctg cagcccgggg gatccactag 8160

ttctagagcg gccgccaccg cggtggagct ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattacg 8220

cgcgctcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac 8280

ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 8340

ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atgggacgcg ccctgtagcg 8400

gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 8460

ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 8520

cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 8580

tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 8640

cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 8700

ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga 8760

tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 8820

aaatattaac gcttacaatt tag 8843

<210> 9

<211> 9111

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 60

aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 120

gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 180

ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 240

gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 300

tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 360

attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 420

tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 480

agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 540

aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 600

tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 660

cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 720

tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 780

tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 840

tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 900

tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 960

aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 1020

gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 1080

tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 1140

aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 1200

aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 1260

tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 1320

gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 1380

cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 1440

acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 1500

cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 1560

cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 1620

aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 1680

gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 1740

atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 1800

tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 1860

gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 1920

agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 1980

cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 2040

gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 2100

gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc 2160

caagcgcgca attaaccctc actaaaggga acaaaagctg ggtaccgcag cgagtcagtg 2220

agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 2280

cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 2340

attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 2400

cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 2460

gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctccaccgc 2520

ggtggcggcc gctctagagg tgaccacaac gacgcgcccg ctttgatcgg ggacgtctgc 2580

ggccgaccat ttacgggtct tgttgtcgtt ggcggtcatg ggccgaacat actcacccgg 2640

atcggagggc cgaggacaag gtcgaacgag gggcatgacc cggtgcgggg cttcttgcac 2700

tcggcatagg cgagtgctaa gaataacgtt ggcactcgcg accggtgagt cgtaggtcgg 2760

gacggtgagg ccaggcccgt cgtcgcagcg agtggcagcg aggacaactt gagccgtccg 2820

tcgcgggcac tgcgcccggc cagcgtaagt agcggggttg ccgtcacccg gtgacccccg 2880

gtttcatccc cgatccaatc acttcgcaat ggccaagaca attgcggatc tcatatgggg 2940

catgaggctg tctcgccgcg acaagatcgc gcgcatgctg ttgatctggg ccgcgctcgc 3000

cgccgtggcg ttggttcttg tgggctgcat ccgcgtggtc gggggacgcg ctcgtatggc 3060

ggagccgaag ctgggccagc cggtggagtg gacaccgtgc cggtcgtcaa acccgcaagt 3120

aaagatcccc ggcggcgcgt tatgcggcaa gctcgctgta ccggtcgact acgaccgccc 3180

cgatggtgac gtggcggcgc tggcgctgat tcgctttccg gcgacgggag acaagatcgg 3240

ttcgctggtc ataaatcccg gtggacccgg cgaatccggt atcgaggccg ccttgggcgt 3300

cttccagaca ttgccgaagc gggtgcacga aaggttcgac ctggttgggt tcgacccccg 3360

cggggtggcg tcgtcccggc cggcgatctg gtgcaactcc gatgccgaca acgaccggct 3420

gcgggccgag ccgcaggttg actacagccg ggagggtgtg gcgcacatcg agaacgagac 3480

caagcaattc gtcggtcgct gtgtggacaa gatgggcaag aactttctgg cccatgtcgg 3540

gacggtcaac gtcgccaagg acctggatgc cattcgcgcg gcgttgggcg acgacaagct 3600

gacctacctg ggctactcgg gcgggggtgg ctcgggtggc ggtggatccg gcgggggtgg 3660

ctcgatgctg tatgtgacag tcttctatgg cgtgcctgcc tggaggaatg ccaccatccc 3720

cctgttctgt gccaccaaga acagggacac ctggggcacc acccagtgcc tgcctgacaa 3780

tggcgactac tctgaggtgg ccctgaatgt gacagagtcc tttgatgcct ggaacaacac 3840

agtgacagag caggccattg aggatgtctg gcagctgttt gagacctcca tcaagccatg 3900

tgtgaagctg tcccccctgt gcatcaccat gaggtgcaac aagtctgaga cagacaggtg 3960

gggcctgacc aagtccatca ccaccacagc ctccaccacc tccaccacag cctctgccaa 4020

ggtggacatg gtgaatgaga cctcctcctg cattgcccag gacaactgca caggcctgga 4080

gcaggagcag atgatctcct gcaagttcaa catgacaggc ctgaagaggg acaagaagaa 4140

ggagtacaat gagacctggt actctgctga cctggtctgt gagcagggca acaacacagg 4200

caatgagtcc aggtgctaca tgaaccactg caacacctct gtgatccagg agtcctgtga 4260

caagcactac tgggatgcca tcaggttcag gtactgtgcc ccccctggct atgccctgct 4320

gaggtgcaat gacaccaact actctggctt catgcccaag tgctccaagg tggtggtctc 4380

ctcctgcacc aggatgatgg agacccagac ctccacctgg tttggcttca atggcaccag 4440

ggctgagaac aggacctaca tctactggca tggcagggac aacaggacca tcatctccct 4500

gaacaagtac tacaacctga ccatgaagtg caggaggcct ggcaacaaga cagtgctgcc 4560

tgtgaccatc atgtctggcc tggtcttcca ctcccagccc atcaatgaca ggcccaagca 4620

ggcctggtgc tggtttggcg gcaagtggaa ggatgccatc aaggaggtga agcagaccat 4680

tgtgaagcat cccaggtaca caggcaccaa caacacagac aagatcaacc tgacagcccc 4740

tggcggcggc gaccctgagg tgaccttcat gtggaccaac tgcaggggcg agttcctgta 4800

ctgcaagatg aactggttcc tgaactgggt ggaggacagg aacacagcca accagaagcc 4860

caaggagcag cacaagagga actatgtgcc atgccacatc aggcagatca tcaacacctg 4920

gcacaaggtg ggcaagaatg tctacctgcc ccccagggag ggcgacctga cctgcaactc 4980

cacagtgacc tccctgattg ccaacattga ctggattgat ggcaaccaga ccaacatcac 5040

catgtctgct gaggtggctg agctgtacag gctggagctg ggcgactaca agctggtgga 5100

gatcaccccc attggcctgg cccccacaga tgtgaagagg tacaccacag gcggcacctc 5160

caggaacaag aggctgcagt acccatacga tgttccagat tacgcttaaa ctagtgaatt 5220

caagcttaac cgaagcgttt gatagttgac tgcagctcga gtaagccgat aagcgacatt 5280

atgtcaagtc ccgggtctag accggccgtg cggaattaag ccggcccgta ccctgtgaat 5340

agaggtccgc tgtgacacaa gaatccctgt tacttctcga ccgtattgat tcggatgatt 5400

cctacgcgag cctgcggaac gaccaggagt tctgggagcc gctggcccgc cgagccctgg 5460

aggagctcgg gctgccggtg ccgccggtgc tgcgggtgcc cggcgagagc accaaccccg 5520

tactggtcgg cgagcccggc ccggtgatca agctgttcgg cgagcactgg tgcggtccgg 5580

agagcctcgc gtcggagtcg gaggcgtacg cggtcctggc ggacgccccg gttccggtgc 5640

cccgcctcct cggccgcggc gagctgcggc ccggcaccgg agcctggccg tggccctacc 5700

tggtgatgag ccggatgacc ggcaccacct ggcggtccgc gatggacggc acgaccgacc 5760

ggaacgcgct gctcgccctg gcccgcgaac tcggccgggt gctcggacgg ctgcacaggg 5820

tgccgctgac cgggaacacc gtgctcaccc cccattccga ggtcttcccg gaactgctgc 5880

gggaacgccg cgcggcgacc gtcgaggacc accgcgggtg gggctacctc tcgccccggc 5940

tgctggaccg cctggaggac tggctgccgg acgtggacac gctgctggcc ggccgcgaac 6000

cccggttcgt ccacggcgac ctgcacggga ccaacatctt cgtggacctg gccgcgaccg 6060

aggtcaccgg gatcgtcgac ttcaccgacg tctatgcggg agactcccgc tacagcctgg 6120

tgcaactgca tctcaacgcc ttccggggcg accgcgagat cctggccgcg ctgctcgacg 6180

gggcgcagtg gaagcggacc gaggacttcg cccgcgaact gctcgccttc accttcctgc 6240

acgacttcga ggtgttcgag gagaccccgc tggatctctc cggcttcacc gatccggagg 6300

aactggcgca gttcctctgg gggccgccgg acaccgcccc cggcgcctga atctagacta 6360

gtttggaaga atgggtgtct gccgaccaca tatgggccgg tcaagatagg tttttacccc 6420

ctctcggctg catcctctaa gtggaaagaa attgcaggtc gtagaagcgc gttgaagcct 6480

gagagttgca caggagttgc aacccggtag ccttgttcac gacgagagga gacctagttg 6540

gcacgtcgcg gatggggatc gctgaagact cagcgcagcg ggaggatcca agcctcatac 6600

gtcaacccgc aggacggtgt gaggtactac gcgctgcaga cctacgacaa caagatggac 6660

gccgaagcct ggctcgcggg cgagaagcgg ctcatcgaga tggagacctg gacccctcca 6720

caggaccggg cgaagaaggc agccgccagc gccatcacgc tggaggagta cacccggaag 6780

tggctcgtgg agcgcgacct cgcagacggc accagggatc tgtacagcgg gcacgcggag 6840

cgccgcatct acccggtgct aggtgaagtg gcggtcacag agatgacgcc agctctggtg 6900

cgtgcgtggt gggccgggat gggtaggaag cacccgactg cccgccggca tgcctacaac 6960

gtcctccggg cggtgatgaa cacagcggtc gaggacaagc tgatcgcaga gaacccgtgc 7020

cggatcgagc agaaggcagc cgatgagcgc gacgtagagg cgctgacgcc tgaggagctg 7080

gacatcgtcg ccgctgagat cttcgagcac taccggatcg cggcatacat cctggcgtgg 7140

acgagcctcc ggttcggaga gctgatcgag cttcgccgca aggacatcgt ggacgacggc 7200

atgacgatga agctccgggt gcgccgtggc gcttcccgcg tggggaacaa gatcgtcgtt 7260

ggcaacgcca agaccgtccg gtcgaagcgt cctgtgacgg ttccgcctca cgtcgcggag 7320

atgatccgag cgcacatgaa ggaccgtacg aagatgaaca agggccccga ggcattcctg 7380

gtgaccacga cgcagggcaa ccggctgtcg aagtccgcgt tcaccaagtc gctgaagcgt 7440

ggctacgcca agatcggtcg gccggaactc cgcatccacg acctccgcgc tgtcggcgct 7500

acgttcgccg ctcaggcagg tgcgacgacc aaggagctga tggcccgtct cggtcacacg 7560

actcctagga tggcgatgaa gtaccagatg gcgtctgagg cccgcgacga ggctatcgct 7620

gaggcgatgt ccaagctggc caagacctcc tgaaacgcaa aaagcccccc tcccaaggac 7680

actgagatcg attaagccga taagcgacat tatgtcaagt ctcgaggtcg gggatcctct 7740

agagtcgacc accaagggca ccatctctgc ttgggccacc ccgttggccg cagccagctc 7800

gctgagagcc gtgaacgaca gggcgaacgc cagcccgccg acggcgaggg ttccgaccgc 7860

tgcaactccc ggtgcaacct tgtcccggtc tattctcttc actgcaccag ctccaatctg 7920

gtgtgaatgc ccctcgtctg ttcgcgcagg cggggggctc tattcgtttg tcagcatcga 7980

aagtagccag atcagggatg cgttgcaacc gcgtatgccc aggtcagaag agtcgcacaa 8040

gagttgcaga cccctggaaa gaaaaatggc cagagggcga aaacaccctc tgaccagcgg 8100

agcgggcgac gggaatcgaa cccgcgtagc tagtttggaa gaatgggtgt ctgccgacca 8160

catatgggcc ggtcaagata ggtttttacc ccctctcggc tgcatcctct aagtggaaag 8220

aaattgcagg tcgtagaagc gcgttgaagc ctgagagttg cacaggagtt gcaacccggt 8280

agccttgttc acgacgagag gagacctagt tggcacgtcg cggatgggga tcgctgaaga 8340

ctcagcgcag cgggaggatc caagcctcat acgtcaaccc gcaggacggt gtgaggtact 8400

acgcgctgca gcccggggga tccactagtt ctagagcggc cgccaccgcg gtggagctcc 8460

aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 8520

gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 8580

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 8640

aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 8700

cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 8760

tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 8820

gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 8880

tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 8940

ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 9000

tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 9060

taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta g 9111

<210> 10

<211> 8862

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 60

aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 120

gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 180

ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 240

gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 300

tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 360

attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 420

tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 480

agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 540

aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 600

tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 660

cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 720

tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 780

tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 840

tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 900

tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 960

aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 1020

gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 1080

tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 1140

aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 1200

aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 1260

tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 1320

gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 1380

cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 1440

acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 1500

cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 1560

cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 1620

aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 1680

gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 1740

atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 1800

tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 1860

gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 1920

agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 1980

cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 2040

gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 2100

gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc 2160

caagcgcgca attaaccctc actaaaggga acaaaagctg ggtaccgcag cgagtcagtg 2220

agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 2280

cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 2340

attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 2400

cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 2460

gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctccaccgc 2520

ggtggcggcc gctctagagg tgaccacaac gacgcgcccg ctttgatcgg ggacgtctgc 2580

ggccgaccat ttacgggtct tgttgtcgtt ggcggtcatg ggccgaacat actcacccgg 2640

atcggagggc cgaggacaag gtcgaacgag gggcatgacc cggtgcgggg cttcttgcac 2700

tcggcatagg cgagtgctaa gaataacgtt ggcactcgcg accggtgagt cgtaggtcgg 2760

gacggtgagg ccaggcccgt cgtcgcagcg agtggcagcg aggacaactt gagccgtccg 2820

tcgcgggcac tgcgcccggc cagcgtaagt agcggggttg ccgtcacccg gtgacccccg 2880

gtttcatccc cgatccaatc acttcgcaat ggccaagaca attgcggatc tcatatggaa 2940

gcgtggactg acggtcgcgg tagccggagc cgccattctg gtcgcaggtc tttccggatg 3000

ttcaagcaac aagtcgacta caggaagcgg tgagaccacg accgcggcag gcacgacggc 3060

aagccccggc gccgcctccg ggccgaaggt cgtcatcgac ggtaaggacc agaacgtcac 3120

cggctccgtg gtgtgcacaa ccgcggccgg caatgtcaac atcgcgatcg gcggggcggc 3180

gaccggcatt gccgccgtgc tcaccgacgg caaccctccg gaggtgaagt ccgttgggct 3240

cggtaacgtc aacggcgtca cgctgggata cacgtcgggc accggacagg gtaacgcctc 3300

ggcaaccaag gacggcagcc actacaagat cactgggacc gctaccgggg tcgacatggc 3360

caacccgatg ggcgggggtg gctcgggtgg cggtggatcc ggcgggggtg gctcgatgct 3420

gtatgtgaca gtcttctatg gcgtgcctgc ctggaggaat gccaccatcc ccctgttctg 3480

tgccaccaag aacagggaca cctggggcac cacccagtgc ctgcctgaca atggcgacta 3540

ctctgaggtg gccctgaatg tgacagagtc ctttgatgcc tggaacaaca cagtgacaga 3600

gcaggccatt gaggatgtct ggcagctgtt tgagacctcc atcaagccat gtgtgaagct 3660

gtcccccctg tgcatcacca tgaggtgcaa caagtctgag acagacaggt ggggcctgac 3720

caagtccatc accaccacag cctccaccac ctccaccaca gcctctgcca aggtggacat 3780

ggtgaatgag acctcctcct gcattgccca ggacaactgc acaggcctgg agcaggagca 3840

gatgatctcc tgcaagttca acatgacagg cctgaagagg gacaagaaga aggagtacaa 3900

tgagacctgg tactctgctg acctggtctg tgagcagggc aacaacacag gcaatgagtc 3960

caggtgctac atgaaccact gcaacacctc tgtgatccag gagtcctgtg acaagcacta 4020

ctgggatgcc atcaggttca ggtactgtgc cccccctggc tatgccctgc tgaggtgcaa 4080

tgacaccaac tactctggct tcatgcccaa gtgctccaag gtggtggtct cctcctgcac 4140

caggatgatg gagacccaga cctccacctg gtttggcttc aatggcacca gggctgagaa 4200

caggacctac atctactggc atggcaggga caacaggacc atcatctccc tgaacaagta 4260

ctacaacctg accatgaagt gcaggaggcc tggcaacaag acagtgctgc ctgtgaccat 4320

catgtctggc ctggtcttcc actcccagcc catcaatgac aggcccaagc aggcctggtg 4380

ctggtttggc ggcaagtgga aggatgccat caaggaggtg aagcagacca ttgtgaagca 4440

tcccaggtac acaggcacca acaacacaga caagatcaac ctgacagccc ctggcggcgg 4500

cgaccctgag gtgaccttca tgtggaccaa ctgcaggggc gagttcctgt actgcaagat 4560

gaactggttc ctgaactggg tggaggacag gaacacagcc aaccagaagc ccaaggagca 4620

gcacaagagg aactatgtgc catgccacat caggcagatc atcaacacct ggcacaaggt 4680

gggcaagaat gtctacctgc cccccaggga gggcgacctg acctgcaact ccacagtgac 4740

ctccctgatt gccaacattg actggattga tggcaaccag accaacatca ccatgtctgc 4800

tgaggtggct gagctgtaca ggctggagct gggcgactac aagctggtgg agatcacccc 4860

cattggcctg gcccccacag atgtgaagag gtacaccaca ggcggcacct ccaggaacaa 4920

gaggctgcag tacccatacg atgttccaga ttacgcttaa actagtgaat tcaagcttaa 4980

ccgaagcgtt tgatagttga ctgcagctcg agtaagccga taagcgacat tatgtcaagt 5040

cccgggtcta gaccggccgt gcggaattaa gccggcccgt accctgtgaa tagaggtccg 5100

ctgtgacaca agaatccctg ttacttctcg accgtattga ttcggatgat tcctacgcga 5160

gcctgcggaa cgaccaggag ttctgggagc cgctggcccg ccgagccctg gaggagctcg 5220

ggctgccggt gccgccggtg ctgcgggtgc ccggcgagag caccaacccc gtactggtcg 5280

gcgagcccgg cccggtgatc aagctgttcg gcgagcactg gtgcggtccg gagagcctcg 5340

cgtcggagtc ggaggcgtac gcggtcctgg cggacgcccc ggttccggtg ccccgcctcc 5400

tcggccgcgg cgagctgcgg cccggcaccg gagcctggcc gtggccctac ctggtgatga 5460

gccggatgac cggcaccacc tggcggtccg cgatggacgg cacgaccgac cggaacgcgc 5520

tgctcgccct ggcccgcgaa ctcggccggg tgctcggacg gctgcacagg gtgccgctga 5580

ccgggaacac cgtgctcacc ccccattccg aggtcttccc ggaactgctg cgggaacgcc 5640

gcgcggcgac cgtcgaggac caccgcgggt ggggctacct ctcgccccgg ctgctggacc 5700

gcctggagga ctggctgccg gacgtggaca cgctgctggc cggccgcgaa ccccggttcg 5760

tccacggcga cctgcacggg accaacatct tcgtggacct ggccgcgacc gaggtcaccg 5820

ggatcgtcga cttcaccgac gtctatgcgg gagactcccg ctacagcctg gtgcaactgc 5880

atctcaacgc cttccggggc gaccgcgaga tcctggccgc gctgctcgac ggggcgcagt 5940

ggaagcggac cgaggacttc gcccgcgaac tgctcgcctt caccttcctg cacgacttcg 6000

aggtgttcga ggagaccccg ctggatctct ccggcttcac cgatccggag gaactggcgc 6060

agttcctctg ggggccgccg gacaccgccc ccggcgcctg aatctagact agtttggaag 6120

aatgggtgtc tgccgaccac atatgggccg gtcaagatag gtttttaccc cctctcggct 6180

gcatcctcta agtggaaaga aattgcaggt cgtagaagcg cgttgaagcc tgagagttgc 6240

acaggagttg caacccggta gccttgttca cgacgagagg agacctagtt ggcacgtcgc 6300

ggatggggat cgctgaagac tcagcgcagc gggaggatcc aagcctcata cgtcaacccg 6360

caggacggtg tgaggtacta cgcgctgcag acctacgaca acaagatgga cgccgaagcc 6420

tggctcgcgg gcgagaagcg gctcatcgag atggagacct ggacccctcc acaggaccgg 6480

gcgaagaagg cagccgccag cgccatcacg ctggaggagt acacccggaa gtggctcgtg 6540

gagcgcgacc tcgcagacgg caccagggat ctgtacagcg ggcacgcgga gcgccgcatc 6600

tacccggtgc taggtgaagt ggcggtcaca gagatgacgc cagctctggt gcgtgcgtgg 6660

tgggccggga tgggtaggaa gcacccgact gcccgccggc atgcctacaa cgtcctccgg 6720

gcggtgatga acacagcggt cgaggacaag ctgatcgcag agaacccgtg ccggatcgag 6780

cagaaggcag ccgatgagcg cgacgtagag gcgctgacgc ctgaggagct ggacatcgtc 6840

gccgctgaga tcttcgagca ctaccggatc gcggcataca tcctggcgtg gacgagcctc 6900

cggttcggag agctgatcga gcttcgccgc aaggacatcg tggacgacgg catgacgatg 6960

aagctccggg tgcgccgtgg cgcttcccgc gtggggaaca agatcgtcgt tggcaacgcc 7020

aagaccgtcc ggtcgaagcg tcctgtgacg gttccgcctc acgtcgcgga gatgatccga 7080

gcgcacatga aggaccgtac gaagatgaac aagggccccg aggcattcct ggtgaccacg 7140

acgcagggca accggctgtc gaagtccgcg ttcaccaagt cgctgaagcg tggctacgcc 7200

aagatcggtc ggccggaact ccgcatccac gacctccgcg ctgtcggcgc tacgttcgcc 7260

gctcaggcag gtgcgacgac caaggagctg atggcccgtc tcggtcacac gactcctagg 7320

atggcgatga agtaccagat ggcgtctgag gcccgcgacg aggctatcgc tgaggcgatg 7380

tccaagctgg ccaagacctc ctgaaacgca aaaagccccc ctcccaagga cactgagatc 7440

gattaagccg ataagcgaca ttatgtcaag tctcgaggtc ggggatcctc tagagtcgac 7500

caccaagggc accatctctg cttgggccac cccgttggcc gcagccagct cgctgagagc 7560

cgtgaacgac agggcgaacg ccagcccgcc gacggcgagg gttccgaccg ctgcaactcc 7620

cggtgcaacc ttgtcccggt ctattctctt cactgcacca gctccaatct ggtgtgaatg 7680

cccctcgtct gttcgcgcag gcggggggct ctattcgttt gtcagcatcg aaagtagcca 7740

gatcagggat gcgttgcaac cgcgtatgcc caggtcagaa gagtcgcaca agagttgcag 7800

acccctggaa agaaaaatgg ccagagggcg aaaacaccct ctgaccagcg gagcgggcga 7860

cgggaatcga acccgcgtag ctagtttgga agaatgggtg tctgccgacc acatatgggc 7920

cggtcaagat aggtttttac cccctctcgg ctgcatcctc taagtggaaa gaaattgcag 7980

gtcgtagaag cgcgttgaag cctgagagtt gcacaggagt tgcaacccgg tagccttgtt 8040

cacgacgaga ggagacctag ttggcacgtc gcggatgggg atcgctgaag actcagcgca 8100

gcgggaggat ccaagcctca tacgtcaacc cgcaggacgg tgtgaggtac tacgcgctgc 8160

agcccggggg atccactagt tctagagcgg ccgccaccgc ggtggagctc caattcgccc 8220

tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 8280

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 8340

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 8400

tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 8460

accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 8520

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 8580

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 8640

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 8700

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 8760

ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 8820

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg cttacaattt ag 8862

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

taggtaccca tatgtcattt gtggtcacg 29

<210> 12

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agactgcagg gatccaccgc cacccgagcc acccccgccg ttgccgatca ag 52

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

taaggtacca gatctcatat ggggcatgag gctgtctcgc cgcgacaag 49

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agactgcagg atccaccgcc acccgagcca cccccgcccg agtagcccag gtaggtcagc 60

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

taaggtacca gatctcatat ggaagcgtgg actgacggtc gcggtag 47

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agactgcagg atccaccgcc acccgagcca cccccgccca tcgggttggc catgtcgacc 60

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgggatccgg cgggggtggc tcgatgctgt atgtgacagt c 41

<210> 18

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cccaagcttg aattcactag tttaagcgta atctggaaca tcgtatgggt actgcagcct 60

cttgttcctg gaggt 75

Claims

1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有猴免疫缺陷病毒的gp120基因和结核分枝杆菌的至少一种细胞壁载体蛋白的基因。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述细胞壁载体蛋白选自结核分枝杆菌的Rv1818、Rv2224和Rv3763。

3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒按顺时针方向依次含有抗性筛选基因Amp、大肠杆菌复制子oriE、启动子hsp60、运载蛋白基因Rv1818c或/和Rv2224c或/和Rv3763、Linker序列、来源于猴免疫缺陷病毒的抗原基因gp120、人流感血凝素病毒基因标签HA-tag、抗性筛选基因Hyg、整合酶基因Int的融合基因、噬菌体整合位点Attp和整合酶基因Int的融合基因。

4.权利要求3的重组质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)分别构建质粒plux1818、plux2224和plux3763：起始质粒p60luxN用限制性内切酶Nde I和Pst I消化后，回收约7kb的功能片段A；以结核分枝杆菌的基因组为模板，分别用引物BX1818f与引物BX1818r扩增出468bp的片段Rv1818c，引物BX2224f和引物BX2224r扩增出738bp的片段Rv2224c，引物BX3763f和引物BX3763r扩增出489bp的片段Rv3763，片段Rv1818c、Rv2224c和Rv3763经Nde I和Pst I酶切后分别与功能片段A进行连接，得到约8.4kb的质粒plux1818，8.7kb的质粒plux2224和8.4kb的质粒plux3763；

2)分别构建质粒plux1818gp、plux2224gp和plux3763gp：质粒plux1818，plux2224和plux3763分别用限制性内切酶BamH I和Hind III消化后，分别回收约7kb、7.3kb和7kb的功能片段B、C和D；以质粒pUCgp120为模板，用引物Gpf与引物Gpr扩增出1.5kp的片段，片段gp120经Bgl II和Hind III酶切后分别与功能片段B、C和D进行连接，得到约8.4kb的质粒plux1818gp、8.7kb的质粒plux2224gp和8.4kb的质粒plux3763gp；

3)构建质粒pI1818gp、pI2224gp和pI3763gp：质粒plux1818gp、plux2224gp和plux3763gp分别用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化后，分别回收约2.7kb、3.0kb和2.7kb的功能片段E、F和G；质粒pIBCG用限制性内切酶Kpn I和Hind III消化后，回收约6.1kb的功能片段H，功能片段E、F和G分别与功能片段H进行连接，得到约8.8kb的质粒pI1818gp，9.1kb的质粒pI2224gp和8.8kb的质粒pI3763gp。

5.一种重组的耻垢分枝杆菌，其特征在于，所述耻垢分枝杆菌能稳定表达猴免疫缺陷病毒的gp120基因和结核分枝杆菌的至少一种细胞壁载体蛋白的基因。

6.根据权利要求5所述的耻垢分枝杆菌，其特征在于，所述耻垢分枝杆菌的基因组中含有

Hsp60+Rv1818c+Linker+gp120+HA-tag元件序列、

Hsp60+Rv2224c+Linker+gp120+HA-tag元件序列和

Hsp60+Rv3763+Linker+gp120+HA-tag元件序列中的至少一种。

7.一种艾滋病疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求5或6的耻垢分枝杆菌。

8.权利要求1～3的重组质粒和/或权利要求5或6的耻垢分枝杆菌在制备艾滋病疫苗中的应用。

9.表面展示SIV gp120抗原蛋白的艾滋病疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用电转化法将权利要求4制得的重组质粒pI1818gp、pI2224gp和/或pI3763gp转入耻垢分枝杆菌ZWY2中，获得表面展示SIV gp120抗原蛋白的重组耻垢分枝杆菌，即为所述艾滋病疫苗。