JP6306700B2 - アルブミン改変体及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性が改善されたアルブミン改変体及びその使用に関し、詳しくは、かかるアルブミン改変体を免疫原の担体として使用することに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、アルブミン／免疫原融合タンパク質を含むワクチン（例えば、粘膜送達用ワクチン）に関する。

アルブミンは、哺乳類の血漿中に見られる天然タンパク質であり、血漿中で最も豊富なタンパク質である。血液の所望の浸透圧を維持するほか、血流中にさまざまな物質を輸送する重要な役割がある。アルブミンは、ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウサギ及びヤギなど多くの種から特性が明らかになっており、異なる供給源のアルブミンが構造的な関係を高度に共有していることがわかっている。

アルブミンは、生体内で新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、この相互作用が、アルブミンの血漿中半減期に重要であることが知られている（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ ２００３；Ｍｏｎｔｏｙｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＦｃＲｎは膜結合型タンパク質であり、アルブミンとＩｇＧを細胞内での分解から救済することがわかっている（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ Ｄ．Ｃ． ａｎｄ Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｓ．（２００７），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ７，７１５−７２５）。したがって、ＦｃＲｎは、ヒトなどの哺乳類の血清中のＩｇＧ及びアルブミンを高濃度に維持することに寄与する二機能性分子である。

ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用は先行技術で明らかにされているが、ＦｃＲｎ−アルブミンの相互作用はあまり明らかにされていない。データによると、ＩｇＧ及びアルブミンはＦｃＲｎ上の別個の部位に非協調的に結合することが指された（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６，３０４４−３０５１；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５，４９８３−４９９０）。マウスＦｃＲｎはマウス及びヒトのＩｇＧに結合する一方、ヒトＦｃＲｎはさらに識別性があると考えられ（Ｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３，１５５１−１５５９）、マウスＩfＧを結合しないことが知られている（Ｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３，１５５１−１５５９）。さらに、ヒトＦｃＲｎは、マウスとヒトの両方のアルブミンを結合するが、マウスＦｃＲｎはヒトのアルブミンを結合しない（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１０）ＪＢＣ）。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、アミノ酸５８５個のポリペプチドとして特徴が十分に明らかになっており、その配列は、Ｐｅｔｅｒｓ，Ｔ．，Ｊｒ．（１９９６）Ａｌｌ ａｂｏｕｔ Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏの記載に見ることができる。ヒト血清アルブミンは、その受容体ＦｃＲｎへの結合が特徴的であり、ｐＨ７．４ではなくｐＨ６．０で結合する。ＨＳＡの血清中半減期はおよそ１９日であることがわかっている。血漿中半減期が短い天然の多様体が同定されており（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９１，１０９７：４９−５４）Ｄ４９４Ｎ置換を有している。この置換により、この多様体に野生型ＨＳＡには存在しないＮ−グリコシル化部位が発生した。血漿中半減期の変化に関与しているのがグリコシル化なのか、またはアミノ酸の変化なのかはわかっていない。

アルブミンは血清中半減期が長く、その特性ゆえに薬物送達に使用されてきた。アルブミンは、これまで、薬理学的に有益な化合物に結合されてきているが（ＷＯ００６９９０２Ａ）、複合体がアルブミンの血漿中半減期を長く維持し、複合体のその長い血漿中半減期は、一般に、有益な治療用化合物単独の血漿中半減期より相当に長いことがわかっている。

さらに、アルブミンは、治療上有益なペプチドと融合されており（ＷＯ０１／７９２７１Ａ、及びＷＯ０３／５９９３４Ａ）、得られた融合体は、典型的に、治療上有益なペプチドの活性を有すると共に、治療上有益なペプチド単独の血漿中半減期よりも血漿中半減期が相当に長い。

アルブミンには、多数のリガンドを結合する能力があり、この特性を利用して、アルブミンへの結合能がある薬物の血漿中半減期を延長させてきた。これは、薬理学的有益化合物をアルブミン結合特性を有する部分に結合させることにより達成された。形成された複合体または融合ポリペプチドの血漿中半減期を決定するものが何かは明らかではないが、それらを構成する、アルブミン及び選択された薬理学的有益化合物／ペプチドによるものと考えられる。治療が意図される適応事項にしたがった特定の薬物またはワクチンの設計を可能にするために、複合体／融合体の構成成分で得られるよりも長い若しくは短い血漿中半減期を達成できるよう、所与のアルブミン複合体またはアルブミン融合ポリペプチドの血漿中半減期を制御できることが望ましいであろう。

本発明は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性が改善されたアルブミン改変体及びその使用に関し、詳しくは、免疫原の担体として、及び治療薬としてのかかるアルブミン改変体の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、アルブミン／免疫原融合タンパク質を含むワクチン（例えば、粘膜送達用ワクチン）に関する。

いくつかの実施形態では、本発明は、野生型のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）より高い親和性でＦｃＲｎに結合する改変型のＨＳＡまたはＭＳＡを提供し、ここで、ポリペプチドは、少なくとも１個の改変型アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｋｄ１０以下、５以下、または１以下（例えば、酸性条件下での測定した値）でＦｃＲｎに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型アルブミンより高いレベルで、極性ヒト細胞を横切って輸送される（例えば、極性ヒト細胞アッセイにおいて４時間後にｎｇ／ｍｌで測定した場合）。いくつかの実施形態では、高いレベルとは、野生型アルブミンより少なくとも２、３、４、５、または１０倍高い。いくつかの実施形態では、有効性は１０ｎｇ／ｍｌ以上である（例えば、１５ｎｇ／ｍｌ以上、または３０ｎｇ／ｍｌ以上）。

いくつかの実施形態では、改変型ポリペプチドは、配列番号１または野生型ＭＳＡと少なくとも８０％、９０％、または９５％同一である。いくつかの実施形態では、改変型アミノ酸は、例えば、配列番号１のＫ５７３Ｙ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ２５３Ａ、Ｔ５２７Ｍ、Ｅ５０５Ｑ、Ｋ５７３Ｐ、Ｋ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｔ５２７Ｍ、Ｖ５４７Ａ、Ｖ５４７Ａ／Ｋ５７３Ｐ、Ｖ５４７Ａ／Ｅ５０５Ｑ／Ｋ５７３Ｐ／Ｔ５２７Ｍ若しくはＫ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑ、ＨＳＡのドメインＩＩＩの欠失、または野生型ＭＳＡのＫ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑのうち１つまたはそれ以上である。

いくつかの実施形態では、本発明は、５７３位、５２３位、５２７位、５０５位の１つまたはそれ以上の対応する位置または配列番号１のドメインＩＩＩにおける変異（例えば、置換変異）または改変型ＭＳＡを含むアルブミン改変体、その断片、またはその融合体を提供し、ここで、当該アルブミンは、ｈＦｃＲｎまたはｍＦｃＲｎに対する結合性が野生型アルブミンより高いまたは低い。いくつかの実施形態では、本発明は、アルブミン改変体の融合タンパク質、及びアルブミンのアミノ酸に結合させた免疫原（例えば、抗原）を提供する。いくつかの実施形態では、野生型アルブミンに比して改変されたＦｃＲｎ結合性は、より高い結合親和性である。いくつかの実施形態では、アルブミン改変体は、配列番号１のＫ５７３Ｙ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ２５３Ａ、Ｔ５２７Ｍ、Ｅ５０５Ｑ、Ｋ５７３Ｐ、Ｋ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑ、Ｖ５４７Ａ、Ｖ５４７Ａ／Ｋ５７３Ｐ、Ｖ５４７Ａ／Ｅ５０５Ｑ／Ｋ５７３Ｐ／Ｔ５２７Ｍまたは、ドメインＩＩＩの欠失である。いくつかの実施形態では、アルブミン改変体は、ＭＳＡのＫ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑである。いくつかの実施形態では、免疫原はチオール基を含むアミノ酸に共有結合で結合している。

いくつかの実施形態では、本発明は、アルブミン改変体、その断片、またはその融合体と免疫原との上記融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、核酸を含む宿主細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記のアルブミン改変体または融合タンパク質及び薬理学的に許容される担体を含む組成物（例えば、ワクチン組成物）を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は粘膜投与用ワクチンとして製剤化される。

いくつかの実施形態では、本発明は、アルブミン改変体、その断片、またはその融合体、及び上記のような免疫原を含む融合タンパク質を被検体に投与することを含む、被検体に免疫応答（例えば、粘膜免疫応答）を誘導する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、被検体を治療するために、アルブミン改変体、その断片、その融合体またはその複合体；及び上記のような免疫原を含む融合タンパク質を使用することを提供する。

さらなる実施形態は、ａ）野生型アルブミンのポリペプチド及び複合体（例えば、免疫原）を含む融合タンパク質と、ｂ）薬理学的に許容される担体とを含むワクチン組成物を提供する。さらなる実施形態は、被検体に免疫応答を誘導する方法及びその使用を提供し、かかる被検体に免疫原に対する免疫応答が引き起こされるような条件下で、前述のワクチン組成物を被検体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物はエアロゾル化されている。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、被検体の粘膜表面に（例えば、経鼻で）送達される。

さらなる実施形態を本明細書に記載する。

野生型ＨＳＡである配列番号１を示す。 （Ａ）及び（Ｂ）は、変異誘導の標的とするＨＳＡの位置の結晶構造図を示す。 アルブミン融合体を作製するためのカセットベクター系を示す。 精製したアルブミン−ＧＳＴ改変体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（Ａ）ＨＳＡ−ＧＳＴ改変体及びＢ（ＭＳＡ−ＧＳＴ改変体）の代表的な非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析である。 ｈＦｃＲｎへのＨＳＡ−ＧＳＴ改変体の結合を示す。（Ａ〜Ｄ）：ｐＨ６．０におけるＷＴ ＨＳＡ−ＧＳＴ及び変異改変体のｈＦｃＲｎへの結合を示すＥＬＩＳＡによる測定値。（Ｅ）：ｐＨ６．０におけるＨＳＡ−ＧＳＴ改変体のｈＦｃＲｎへの相対的結合。ＥＬＩＳＡの結果（Ａ〜Ｄ）に基づき、ＷＴ ＦｃＲｎの結合を１に設定した場合の相対的結合を計算した。結果は、少なくとも３つの独立した実験の代表的なものである。 ＭＳＡ及びＨＳＡ−ＧＳＴ改変体のｈＦｃＲｎ及びｍＦｃＲｎへの結合を示す。ｐＨ６．０におけるＷＴ ＨＳＡ及びＭＳＡ−ＧＳＴ融合体並びに変異改変体の、（Ａ）ｈＦｃＲｎ及び（Ｂ〜Ｄ）ｍＦｃＲｎへの結合を示すＥＬＩＳＡによる測定値。ｐＨ６．０におけるＷＴ ＨＳＡ及びＭＳＡ−ＧＳＴ融合体並びに変異改変体のｈＦｃＲｎへの相対的結合。ｐＨ６．０におけるＷＴ ＨＳＡ及びＭＳＡ−ＧＳＴ融合体並びに変異改変体のｍＦｃＲｎへの相対的結合。ＥＬＩＳＡの結果に基づき、ＷＴを１に設定した場合の相対的結合を計算した。結果は、少なくとも３つの独立した実験の代表的なものである。 ＭＳＡ及びＨＳＡ−ＧＳＴ改変体のｈＦｃＲｎ及びｍＦｃＲｎへの相対的結合を示す。（Ａ）：ｐＨ６．０におけるＭＳＡ及びＨＳＡ−ＧＳＴ改変体（Ａ）ｈＦｃＲｎ及び（Ｂ〜Ｄ）ｍＦｃＲｎへの相対的結合。図６のＥＬＩＳＡの結果に基づき、ＷＴ ＦｃＲｎの結合を１に設定した場合の相対的結合を計算した。結果は、少なくとも３つの独立した実験の代表的なものである。 固定化されたＨＳＡ改変体への単量体ｈＦｃＲｎのＳＰＲ結合を示す。固定化した（Ａ）融合されていないＷＴ ＨＳＡ、（Ｂ）ＷＴ ＨＳＡ−ＧＳＴ、（Ｃ）ＨＳＡ−ＥＱ−ＧＳＴ、（Ｄ）ＨＳＡ−ＩＧ−ＧＳＴ、（Ｅ）ＨＳＡ−ＩＡ−ＧＳＴ、（Ｆ）ＨＳＡ−ＫＰ−ＧＳＴ、及び（Ｇ）ＨＳＡ−ＥＱ／ＴＭ／ＫＰと、そこに注入した滴定量の単量体ｈＦｃＲｎの結合。結合データを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで供給された１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。推定結合動態を表２にまとめている。 極性ヒト上皮細胞層を横切る、工学的に操作されたＨＳＡ融合改変体のＦｃＲｎ介在性経細胞輸送を示す。トランスウェルシステムで増殖させた極性Ｔ８４細胞の頂端膜側から基底外側へ輸送されたＷＴ ＨＳＡ、ＫＡ／ＨＱ ＨＳＡ、及びＫＰ ＨＳＡ融合体量のＥＬＩＳＡによる定量。試料を測定時点０時間及び４時間に基底外側リザーバから採取し、経細胞輸送された量を、経細胞輸送されたＨＳＡ融合体（ｎｇ／ｍｌ）として表している。結果は、４つの独立した実験の平均を表す。 固定化されたＨＳＡ改変体への単量体ｈＦｃＲｎへのＳＰＲ結合を示す。固定化した（Ａ）Ｖ５４７Ａ（１μＭ〜０．０３１μＭ）（Ｂ）Ｖ５４７Ａ／Ｋ５７３Ｐ（１μＭ〜０．０３１μＭ）及び（Ｃ）Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ／Ｖ５４７Ａ／Ｋ５７３Ｐ（０．２５μＭ〜３．９μＭ）に注入した単量体ｈＦｃＲｎの滴定量の結合。 （Ａ〜Ｆ）は、ｐＨ７．４におけるＨＳＡ−ＧＳＴ改変体のｈＦｃＲｎへのＥＬＩＳＡ結合を示す。 （Ａ）及び（Ｂ）は、ＨＳＡ−ＧＳＴ改変体のｈＦｃＲｎへのＥＬＩＳＡ結合を示す。ｐＨ６．０におけるＷＴ ＨＳＡ−ＧＳＴ及び変異改変体のｈＦｃＲｎへの結合を示すＥＬＩＳＡによる測定値。（Ｂ）ｐＨ７．４における、ＷＴ ＨＳＡ−ＧＳＴ及び変異改変体のｈＦｃＲｎへの結合を示すＥＬＩＳＡによる測定値。 極性ヒト細胞を横切る、融合されていないＨＳＡ改変体の経細胞輸送を示す。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムで増殖させた極性Ｔ８４細胞の頂端膜側（Ａ）から基底外側（Ｂ）へ、及びＢ側からＡ側へ輸送された、融合されていないＷＴ ＨＳＡ及びＫＰ量のＥＬＩＳＡによる定量。 極性ヒト細胞を横切る、ＨＳＡ−ＧＳＴ改変体の経細胞輸送を示す。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムで増殖させた極性Ｔ８４細胞の頂端膜側から基底外側へ輸送された、ＨＳＡ ＷＴ、ＥＱ、ＴＭ、及びＫＰ／ＥＱ／ＴＭ ＧＳＴ融合体量のＥＬＩＳＡによる定量。 極性ヒト細胞を横切る、ＨＳＡ−ＧＳＴ改変体の経細胞輸送を示す。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムで増殖させた極性Ｔ８４細胞の頂端膜側から基底外側へ輸送された、ＨＳＡ ＶＡ、ＫＰ／ＶＡ、及びＫＰ／ＥＱ／ＴＭ／ＶＡ ＧＳＴ融合体量のＥＬＩＳＡによる定量。 （Ａ）及び（Ｂ）は、極性ヒト細胞を横切って経細胞輸送されるＮＰ結合ＨＳＡを示す。（Ａ）ＷＴ ＨＳＡまたはＫＡ／ＨＱと結合したＮＰのｐＨ６．０及び７．４における結合を示すＥＬＩＳＡ。

定義
本明細書で使用する用語「アルブミン」は、ＨＳＡと実質的に同一の三次元構造を有するタンパク質を意味する。本発明のアルブミンタンパク質の例には、ヒト血清アルブミン、チンパンジー血清アルブミン、ゴリラ血清アルブミンのような霊長類の血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、マウスアルブミン及びラット血清アルブミンのようなげっ歯類の血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウマの血清アルブミン、ロバ血清アルブミン、ハムスター血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン、及びブタ血清アルブミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。配列番号１に開示のＨＳＡまたは天然に生じるその任意の対立遺伝子は本発明による好ましいアルブミンであり、分子量６７ｋＤａを有する。天然の対立遺伝子は、本質的にＨＳＡと同一の特性を有するが配列番号１に比べ１つまたは少数の変更を有して存在する場合があり、本発明者らはこのような天然の対立遺伝子の使用も意図することを当業者には理解されるであろう。

本明細書で使用する用語「アルブミン断片」は、ＦｃＲｎに対する結合能力を保持しているアルブミンの一部を意味する。断片は、ＨＳＡ由来の中断されていない１配列で構成されてよく、またはＨＳＡ由来の配列を２つまたはそれ以上含んでよい。本発明による断片は、大きさが、およそ２０アミノ酸残基以上、好ましくは３０アミノ酸残基以上、より好ましくは４０アミノ酸残基以上、より好ましくは５０アミノ酸残基以上、より好ましくは７５アミノ酸残基以上、より好ましくは１００アミノ酸残基以上、より好ましくは２００アミノ酸残基以上、より好ましくは３００アミノ酸残基以上、より一層好ましくは４００アミノ酸残基以上、及び最も好ましくは５００アミノ酸残基以上である。

用語「野生型」は、タンパク質に関して使用する場合、細胞、組織、または生物のゲノムによりコードされるタンパク質で、操作して作製した合成タンパク質以外のタンパク質を指す。

ポリペプチドに関して用語「改変体」及び「変異体」を使用する場合、あるアミノ酸配列で、別のアミノ酸配列（通常は関連ポリペプチド）と１つまたはそれ以上のアミノ酸が異なるものを指す。改変体は「保存的」変更を有してよく、ここで、置換アミノ酸は、類似の構造上または化学的特性を有する。保存的アミノ酸置換の一種では、類似の側鎖を有する残基の置換が可能であることを指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の一群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の一群はセリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の一群はアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の一群はフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、ｐ−アミノフェニルアラニンのような非天然アミノ酸、塩基性側鎖を有するアミノ酸の一群はリシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、含硫側鎖を有するアミノ酸の一群はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。ごくまれに、改変体は、「非保存的」変更を有し得る（例えば、グリシンのトリプトファンへの置換）。同様の小さな変更には、アミノ酸の欠失または挿入（すなわち、付加）、またはその両方が含まれる。生物学的活性を消失させることなく置換、挿入または欠失ができるアミノ酸残基の種類及び数を決定する際の手引きは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを使用して見出すことができる。改変体は、機能解析で試験可能である。好ましい改変体は、１０％未満、好ましくは５％未満、さらになお好ましくは２％未満の変更（置換でも欠失などでも）を有する。アミノ酸置換の場合、以下の専門語を使用する：元のアミノ酸、位置、置換アミノ酸。したがって、５７３位におけるリシンのアラニンへの置換は、「Ｋ５７３Ａ」と表され、５７３位におけるリシンのプロリンへの置換はＫ５７３Ｐと表される。複数ある変異は加算記号（「＋」）または「／」で区切られ、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ／Ｓ４１１Ｆ」は、２０５位及び４１１位において、それぞれ、グリシン（Ｇ）がアルギニン（Ｒ）へ、またセリン（Ｓ）がフェニルアラニン（Ｆ）へ置換された変異を表す。

２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「同一性」というパラメータで表される。本発明の目的上、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７６−２７７）、好ましくはバージョン３．０．０以降のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して決定される。使用されるオプションパラメータ１１６４４．０００−ＥＰ７は、ギャップオープンペナルティーが１０、ギャップエクステンションペナルティーが０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅに表示される「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）という出力は同一性パーセントとして使用され、以下のとおり計算される。（同一残基×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）
参照配列内の位置「に対応するアミノ酸位置」という表現及び同様の表現は、一次構造または空間的構造において、参照配列の特定の位置に対応するアミノ酸残基を特定することが意図される。これが、所与の配列を参照配列と整列させ、参照配列の特定の位置と整列するアミノ酸残基を特定することにより可能であることは、当業者には理解されるであろう。例えば、ＨＳＡの５７３位に対応する所与のアルブミン配列のアミノ酸残基を見出すためには、所与のアルブミン配列をＨＳＡと整列させ、ＨＳＡの５７３位と整列しているアミノ酸が、ＨＳＡの５７３位に対応する所与のアルブミン配列のアミノ酸として特定される。

表現Ｘｎｎｎは、アミノ酸残基ＸがＨＳＡの位置ｎｎｎに対応する位置に位置したという意味を意図し、表現ＸｎｎｎＹは、ＨＳＡの位置ｎｎｎに対応する位置に位置した任意のアミノ酸Ｘがアミノ酸残基Ｙに置換されたという意味を意図する。

本明細書で使用する場合、用語「親和性」とは、結合対の２つのメンバー、例えば、アルブミンとＦｃＲｎの結合強度の測定値をいう。Ｋ_ｄは解離定数であり、単位はモル濃度である。親和定数は解離定数の逆数である。親和定数は、この化学物質を表す一般用語として使用される場合がある。親和定数は、結合のエネルギーの直接的な測定値である。Ｋの自然対数は、方程式ΔＧ_０＝−ＲＴ ＬＮ（Ｋ）により、ギブスの結合自由エネルギーに直線的に関連している。式中、Ｒ＝気体定数、温度はケルビン度である。親和性は、例えば、市販のＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲユニット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により実験的に決定してよい。

本明細書で使用する場合、「アルブミン及び複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む融合タンパク質」という場合のような用語「複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、アルブミンに結合した（例えば、融合タンパク質の場合のように共有結合、または非共有結合（例えば、疎水性相互作用を介した）による結合）任意の分子をいう。例としては、ペプチド、ポリペプチド、免疫原、薬物、タンパク質、脂質、低分子、ヌクレオチド、放射性トレーサなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。

本明細書で使用する場合、用語「かかる被検体に免疫応答を引き起こすような条件下で」とは、免疫応答（例えば、自然免疫応答または獲得免疫応答）のあらゆる定性的または定量的な誘導、発生、及び／または刺激をいう。

本明細書で使用する場合、用語「免疫応答」とは、被検体の免疫系による応答をいう。例えば、免疫応答には、Ｔｏｌｌ受容体活性化における検出可能な変化（例えば、増強）、リンホカイン（例えば、サイトカイン（例えば、Ｔｈ１若しくはＴｈ２型サイトカイン）またはケモカイン）の発現及び／若しくは分泌、マクロファージ活性化、樹状細胞活性化、Ｔ細胞活性化（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）、ＮＫ細胞活性化、並びに／またはＢ細胞活性化（例えば、抗体の産生及び／または分泌）が挙げられるが、これに限定されるものではない。免疫応答のさらなる例には、免疫原（例えば、抗原（例えば、免疫原性ポリペプチド））のＭＨＣ分子への結合及び細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）応答の誘導、Ｂ細胞応答（例えば、抗体産生）及び／若しくはヘルパーＴリンパ球応答、及び／または免疫原性ポリペプチドが由来する抗原に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答の誘導、免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞（例えば、いかなる発達段階でも（例えば、形質細胞））の増殖（例えば、細胞集団の成長）、並びに、抗原提示細胞による抗原プロセッシングと抗原提示の促進が挙げられる。免疫応答は、被検体の免疫系が外来物質として認識する免疫原を対象とし得る（例えば、微生物由来の非自己抗原（例えば、病原体）、または外来物質として認識された自己抗原）。したがって、本明細書で使用する場合、「免疫応答」とは、自然免疫応答（例えば、Ｔｏｌｌ受容体シグナル伝達カスケードの活性化）、細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）及び免疫系の非特異的細胞に媒介された応答）、及び液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞に媒介された応答（例えば、抗体の生成及び血漿、リンパ液、及び／または組織液への分泌））を含むが、これらに限定されないあらゆる型の免疫応答を指すと理解されるべきである。用語「免疫応答」は、被検体の免疫系が抗原及び／または免疫原に応答する能力（例えば、免疫原（例えば、病原体）に対する初期応答並びに適応免疫応答の結果である獲得（例えば、記憶）応答の両方）のあらゆる態様を包含することが意図される。

本明細書で使用する場合、用語「免疫」とは、疾患を引き起こし得る微生物（例えば、病原体）に曝露された際の疾患からの保護（例えば、疾患の徴候、症状若しくは状態の予防または減衰（例えば、抑制））をいう。免疫は、それまでに抗原に曝露されたことがなくても存在する自然免疫応答（例えば、非適応免疫応答（例えば、非獲得免疫応答））及び／または獲得免疫応答（例えば、以前の抗原曝露の後でＢ細胞及びＴ細胞に媒介される免疫応答（例えば、その抗原に対して高い特異性と反応性を示す））であり得る。

本明細書で使用する場合、用語「免疫原」とは、被検体に免疫応答を誘導させることができる因子（例えば、微生物（例えば、細菌、ウイルスまたは真菌）及び／またはその部分若しくは成分（例えば、タンパク質抗原））をいう。いくつかの実施形態では、免疫原は、免疫原（例えば、微生物（例えば、病原体または病原体産物））に対する免疫を誘導する。

用語「被験化合物」とは、疾患、病気、疾病、または身体機能障害を治療または予防するために使用できるか、そうでなければ、試料の生理的状態または細胞状態を改変させるために使用できる、あらゆる化学物質、製薬、薬物などをいう。被験化合物は、公知の治療用化合物と潜在的な治療用化合物の両方を含む。被験化合物は、本発明のスクリーニング方法を使用するスクリーニングにより治療用であると決定することができる。「公知の治療用化合物」とは、上記のような治療または予防に有効であることが（例えば、動物試験またはそれまでのヒトへの投与経験を通して）示されている治療用化合物をいう。

本明細書で使用する用語「試料」は、その最も広い意味において使用される。本明細書で使用する場合、用語「試料」はその最も広い意味において使用される。１つの意味では、この用語は組織試料を指し得る。別の意味では、この用語は、任意の供給源から得た切片試料または培養並びに生体試料を含むことが意図される。生体試料は、動物（ヒトを含む）から得てよく、流体、固体、組織、及び気体を包含する。生体試料には、血漿、血清等の血液生成物が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの実施例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものと解釈されるべきではない。ヒト染色体またはヒト染色体に関連する配列を含有しているのではないかと思われる試料は、細胞、細胞から単離された染色体（例えば、中期染色体伸展標本）、ゲノムＤＮＡ（溶解させた、またはサザンブロット法など固体支持体に結合されているもの）、ＲＮＡ（溶解させた、またはノーザンブロット法など固体支持体に結合されているもの）、ｃＤＮＡ（溶解させた、または固体支持体に結合されているもの）等を含んでよい。タンパク質を含有しているのではないかと思われる試料は、細胞、組織の一部分、１つまたはそれ以上のタンパク質を含有する抽出物等を含んでよい。

本発明は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する親和性が改善されたアルブミン改変体及びその使用に関し、詳しくは、かかるアルブミン改変体を免疫原の担体として使用することに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、アルブミン／免疫原融合タンパク質を含むワクチン（例えば、粘膜送達用ワクチン）に関する。

ＦｃＲｎに対するアルブミン上の主な結合部位はＤＩＩＩのＣ末端内に位置することが最初に示された（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２ Ｊａｎ ３；３：６１０；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６ Ａｐｒ １８；４５（１５）：４９８３−９０）。その後、ヒトアルブミンのＤＩＩＩ内の完全保存されていたヒスチジン残基３つ（Ｈｉｓ４６４、Ｈｉｓ５１０及びＨｉｓ５３５）を部位特異的変異誘導により標的にしたところ、３残基すべてが、結合に極めて重要であることが明らかになった（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２、前掲）。ヒトＦｃＲｎ−ヒトアルブミン複合体のドッキングモデルを構築したところ、ＤＩＩＩに加え、ＤＩのＮ末端内の露出したループ２本が受容体に近接していることが示された（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２、前掲）。これらの予測と一致して、最近公表されたヒトアルブミンと複合体を形成するヒトＦｃＲｎの２つの共結晶構造により、ＤＩとＤＩＩＩ双方の寄与が確認された（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１４ Ｍａｒ １４；２８９（１１）：７８１２−２４．；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１３ Ｎｏｖ ５；２１（１１）：１９６６−７８）。共結晶構造の１つは野生型アルブミンを含み、もう１つは４つのアミノ酸置換（Ｖ４１８Ｍ、Ｔ４２０Ａ、Ｅ５０５Ｇ、及びＶ５４７Ａ）を含む工学的に操作されたヒトアルブミン改変体（ＨＳＡ１３）を含んでいる。後者は、ｐＨ６及びｐＨ７．４の両ｐＨにおいてＦｃＲｎに対する親和性が改善されている。２つの共結晶構造は高度に類似した結合形態を示しているが、多少の相違があるのはＨＳＡ１３ ＤＩＩＩに導入された変異によるものと考えられる。さらに、いずれの共結晶構造でも、ＤＩの２本の露出ループがＦｃＲｎと接触していることを示している。

幾つかの研究で、ヒトＦｃＲｎは単量体ＩｇＧ及びＩｇＧ含有免疫複合体の両方を粘膜上皮関門を横断して双方向に輸送できることが示されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｊｕｌ １５；１７５（２）：９６７−７６；Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００４ Ｊｕｎ；２０（６）：７６９−８３；Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００２ Ａｕｇ ５；１９６（３）：３０３−１０．Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００３ Ｊｕｎ ２；１９７（１１）：１６０１；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９ Ｏｃｔ；１０４（７）：９０３−１１；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｍａｒ １；１６６（５）：３２６６−７６））。

ＦｃＲｎを過剰発現する極性化メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を使用したところ、この受容体が頂端膜側、基底外側いずれの側からもＩｇＧを経細胞輸送により輸送することが示された（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｍａｒ １；１６６（５）：３２６６−７６；Ｊｅｒｄｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｆｆｉｃ．２０１０ Ｓｅｐ；１１（９）：１２０５−２０）。

これらの知見から、ＦｃＲｎはアルブミンの経細胞輸送を媒介できるのか否か、また、アルブミンはＦｃＲｎと１：１で結合するが、ＩｇＧはホモ二量体でＦｃＲｎ結合部位が２つあり、ＦｃＲｎとの相互作用で化学量論が役割を果たすのか否かという疑問が生じる。これまでのところ、ＭＤＣＫ細胞を使用した一研究ではアルブミンが経細胞輸送されないことを示している（Ｔｅｓａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｆｆｉｃ．２００６ Ｓｅｐ；７（９）：１１２７−４２）。

ヒトＦｃＲｎに対しある範囲の親和性を有するヒトアルブミン改変体の作製に酵母ディスプレイが使用されている。このような改変体（Ｅ５０５Ｇ／Ｖ５４７Ａ）の１つは、中性ｐＨではわずかな上昇を、また、ｐＨ６．０では１０倍以上の改善された親和性を獲得し、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス及びカニクイザルにおける半減期をそれぞれ、１．５倍及び１．３倍延長させた（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１３ Ｎｏｖ ５；２１（１１）：１９６６−７８）。

さらに、構造解析及び異種間結合解析に基づくアプローチにより、単一置換ヒトアルブミン改変体（Ｋ５７３Ｐ）が同定され、ヒトＦｃＲｎに対する親和性は酸性ｐＨでは１２倍改善され、中性ｐＨでは検出可能な結合はなかった（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１４ Ｍａｙ ９；２８９（１９）：１３４９２−５０２．）。工学的に操作した改変体をヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス及びカニクイザルで評価したところ、それぞれ１．４、及び１．６倍の半減期延長を示した。

上記のように、本発明の実施形態は、ＦｃＲｎに対する親和性が野生型アルブミンより優れているかまたは低い、免疫原及びアルブミン改変体を含む融合タンパク質を提供する。ＦｃＲｎ結合特性が改変された、工学的に操作したアルブミン改変体とそれに由来する断片は、１）ＦｃＲｎによる経細胞輸送の改善；２）腎クリアランス閾値を超える分子量と相関する要素としての生体内分布／血清中半減期の改善；３）ＦｃＲｎ媒介による、分解からの救済の増強；４）ＦｃＲｎ媒介により細胞内輸送及び樹状細胞プロセッシングの向上に起因するＭＨＣクラスＩ及びＩＩ上での提示増加；５）粘膜送達適性；及び６）熱安定性の向上（アルブミンは非常に安定な分子である）の結果、免疫原性が改善されている。

このようなアルブミン改変体に融合させたワクチンサブユニットは、ＦｃＲｎ結合を妨害しない。ＦｃＲｎは分解から救済する機能を果たし、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩに抗原を提示させ、粘膜送達を可能にすることから、本発明の実施形態のワクチンの薬物動態及び免疫原性は、改変アルブミンポリペプチドに結合していない免疫原よりも改善されている。したがって、本発明の実施形態は、現存ワクチンの制約を克服する改善されたワクチン組成物及びその使用を提供する。

本発明の実施形態を発展させる過程で行われた実験で、ＦｃＲｎ結合特性が改変された完全長アルブミン並びにそれに由来する断片を作製した。かかる改変体では、多数のペプチド及び折り畳まれたタンパク質ドメインに遺伝子操作で融合させた場合にＦｃＲｎ結合の保持が示された。

本発明の実施形態は、粘膜送達で使用するためのワクチンを提供する。ワクチン接種及び粘膜送達におけるＦｃＲｎの役割は実証されており、Ｆｃ融合体についての文献に記載がある。ウイルス及び細菌などの感染因子は粘膜表面で体内に入る。筋肉内または皮下ワクチン接種では、粘膜免疫系の送達及び活性化が最適下限であるために通常、感染部位での最小の保護しか提供されない。粘膜上皮細胞と粘膜固有層内の免疫エフェクター細胞との間には近似性・密接な関連があるため、粘膜表面を介したワクチン送達は理想的なアプローチであり得る。粘膜は、侵入を効率的に予防する選択的なバリアである。本発明の実施形態は、粘膜上皮に発現するＦｃＲｎを粘膜ワクチンの標的とさせることによりこの問題を回避するための組成物及び方法を提供する。これにより、無傷のサブユニットワクチンが上皮バリアを横切って粘膜免疫系まで確実かつ特異的に輸送され、結果として、免疫細胞の活性化と記憶が誘導される。

粘膜送達用に設計された、本発明の実施形態のワクチンは、ＦｃＲｎ媒介性の経細胞輸送経路を利用して、ＦｃＲｎ結合特性が改変された完全長アルブミン、またはアルブミン変異体若しくは断片への融合（化学的または遺伝子操作による）に基づいた治療薬物またはサブユニットワクチン（抗原／免疫原）を粘膜送達する。このようなワクチンは、感染（例えば、微生物感染）の予防及び治療、並びに、ウイルス誘導性癌の予防に利用される。その他の実施形態では、融合体を用いて治療薬物を身体の特定粘膜部位に送達する。したがって、本発明の実施形態は、感染／炎症部位または癌の部位に局所的に送達するための方法及び組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＳＡの５７３位、２５３位、５２３位、５２７位、及び５０５位またはＭＳＡの５００位若しくは５１０位に置換を有する、ヒト及びマウスのアルブミン改変体を提供する。いくつかの実施形態では、改変は欠失である。例えば、いくつかの実施形態では、改変体は配列番号１のＫ５７３Ｙ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ２５３Ａ、Ｔ５２７Ｍ、Ｅ５０５Ｑ、Ｋ５７３Ｐ、Ｋ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑ、Ｖ５４７Ａ、Ｖ５４７Ａ／Ｋ５７３Ｐ、Ｖ５４７Ａ／Ｅ５０５Ｑ／Ｋ５７３Ｐ／Ｔ５２７ＭまたはドメインＩＩＩの欠失である。いくつかの実施形態では、アルブミン改変体は、ＭＳＡのＫ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑである。

本発明は、記載位置での置換が維持される限り、記載位置以外の位置に変異（例えば、置換、欠失または付加）を含む改変体を包含する。したがって、いくつかの実施形態では、アルブミン改変体は、野生型血清アルブミン（例えば、野生型ＨＳＡ、配列番号１または野生型ＭＳＡ）と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％同一である。ただし、アルブミン改変体は本明細書に記載の変異または欠失の１つを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、改変アルブミンの断片を提供する。上記のように、かかる断片は、配列番号１（すなわち、断片の親アルブミン）の一部分と好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％同一である。いくつかの実施形態では、本発明は、改変アルブミンまたはその断片に融合された非相同ポリペプチド配列を含む融合タンパク質を提供する。上記のように、融合タンパク質の一部分を形成する改変アルブミン及び断片は、配列番号１またはその部分（すなわち、断片の親アルブミン）と好ましくは、少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であり、本明細書に記載の置換変異を含む。

いくつかの実施形態では、改変アルブミン、その断片及び融合体は、ヒトまたはマウスのＦｃＲｎに対する親和性が対応する野生型配列より高い。改変アルブミンのＦｃＲｎへの親和性は、親アルブミンのＦｃＲｎへの親和性より高いのか、または低いのかを決定する、例えば、結合定数Ｋｄを測定し比較する上で任意の好適な方法が有用な場合があることは当業者には理解されるであろう。したがって、本発明によれば、Ｋｄが天然ＨＳＡより低い改変アルブミンは血漿中半減期がＨＳＡより長いと見なされ、Ｋｄが天然ＨＳＡより高い改変アルブミンは血漿中半減期がＨＳＡより短いと見なされる。

いくつかの実施形態では、ＨＳＡ改変体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＨＳＡの５４７位、５７３位、２５３位、５２３位、５２７位、及び５０５位またはＭＳＡの５００位若しくは５１０位である。いくつかの実施形態では、置換によりＦｃＲｎに対する親和性が高くなる（例えば、Ｋｄ低値）。例えば、いくつかの実施形態では、改変体は１０以下、５以下、または１以下のＫｄを有する。いくつかの実施形態では、置換は保存的または非保存的な変更である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変体と類似の側鎖を有する、所与の位置の１つまたはそれ以上の改変体が具体的に意図される（例えば、本明細書に記載の改変体に対する保存的変更）。

保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の置換可能性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の一群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の一群はセリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の一群はアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の一群はフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の一群はリシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、含硫側鎖を有するアミノ酸の一群はシステイン及びメチオニンである。例示的な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。

遺伝的にコードされるアミノ酸は４つのファミリーに分類できる。すなわち、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（２）塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び（４）荷電していない極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）である。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。同様に、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（２）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）；ただし、セリン及びスレオニンは任意選択で脂肪族ヒドロキシルとして別個にグループ分けされ得る、（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）、及び（６）含硫（システイン及びメチオニン）のようにグループ分けできる（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ ｅｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７〜２１頁、第２版、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１）。

いくつかの実施形態では、改変体には、「非保存的」変更（例えば、グリシンのトリプトファンへの置換）が含まれる。生物学的活性を消失させることなく置換、挿入または欠失が可能なアミノ酸残基の種類を決定する際の手引きは、コンピュータプログラムを使用して見出すことができる。
本発明によるアルブミンまたはその断片を、当該技術分野で公知の技術を使用して免疫原（例えば、抗原）に結合させてよい。本発明は特定の免疫原に限定されるものではない。いかなる免疫原または抗原性断片を用いてもよい。例としは、微生物（例えば、病原性微生物）由来の免疫原、腫瘍（例えば、癌ワクチン用）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の改変アルブミン、その断片、及び融合体は、当業者に周知の技術を使用して調製することができる。好都合な一方法は、本明細書に記載の置換変異を含む親アルブミン、その断片または融合ポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることにより行われる。

形質転換された宿主生物の培養中にポリペプチドを発育培地に分泌させるために、本発明の改変アルブミン、その断片、及び融合体を含む融合タンパク質をシグナル配列に接続してもよい。回収及び精製を容易にするために、改変型ポリペプチドを発育培地に分泌させると一般に都合がよい。

改変体ポリペプチドを調製するための技術もＷＯ２００９０１９３１４（参照により組み入れられる）に開示されており、これらの技術を本発明に適用してもよい。アルブミンは、これまでさまざまな宿主で組換えタンパク質として首尾よく発現されており、これらの宿主には真菌類（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（ＷＯ０６０６６５９５）、クルイベロミセス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（Ｆｌｅｅｒ １９９１，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，９６８−９７５）、ピキアピキア（Ｐｉｃｈｉａ Ｐｉｃｈｉａ）（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ １９９８ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ２，２５７−２６２）、及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（Ｓｌｅｅｐ １９９０，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８，４２−４６）を含むが、これらに限定されない）、細菌類（Ｐａｎｄｊａｉｔａｂ ２０００，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １０５，２７９−２８５））、動物（Ｂａｒａｓｈ １９９３，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２，２６６−２７６）、及び植物（ジャガイモ及びタバコ（Ｓｉｊｍｏｎｓ １９９０，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８，２１７ ａｎｄ Ｆａｒｒａｎ ２００２，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，３３７−３４６）を含むが、これらに限定されない）。本発明のＨＳＡドメインＩＩＩ誘導体、断片、またはその改変体は、好ましくは、好適な宿主細胞で組換えにより産生される。基本的には、ポリペプチドを好適な量で産生できる宿主細胞であればどれを使用してもよく、本発明による好適な宿主細胞の選択は、平均的な当業者の技量の範囲内である。好ましい宿主生物は酵母であり、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｃａｅ）から選択され、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される。

本発明の改変アルブミン、その断片、及び融合体を含む融合タンパク質は、濾過、遠心分離、クロマトグラフィー、アフィニティ分離法等などの公知の分離技術を組み合わせて使用し発育培地から回収及び精製され得る。このような公知の分離工程の特定の組み合わせを使用して本発明の改変アルブミン、その断片、及び融合体を精製するのは平均的な当業者の技量の範囲内である。本発明の改変体に適用され得る精製技術の一例として言及され得るのは、ＷＯ００４４７７２の教示である。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、当技術分野で公知の分子生物学的技術を使用して融合核酸から発現される。１つまたはそれ以上の免疫原ポリペプチドは、アルブミン改変体若しくはその断片のＮ末端、Ｃ末端に融合される、アルブミン改変体構造若しくはその断片構造のループ内に挿入される、またはその任意の組み合わせであってよい。かかるポリペプチドは、融合ポリペプチドのさまざまな構成成分を分離するリンカー配列を含んでも含まなくてもよい。アルブミンまたはその断片の融合体に関する教示は当技術分野で公知であり、このような教示も本発明に適用可能であることを当業者には理解されよう。ＷＯ０１／７９２７１Ａ及びＷＯ０３／５９９３４Ａにも本発明のアルブミン改変体及びその断片に融合され得るポリペプチドの例が含まれており、これらの実施例もまた本発明に適用される。

本発明によるアルブミン改変体若しくはその断片、またはかかるアルブミン改変体若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、親アルブミン改変体若しくはその断片、またはかかる親アルブミン改変体若しくはその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、血漿中半減期が改変されているという利益を有する。このことには、本発明によるアルブミン改変体若しくはその断片、またはかかるアルブミン改変体若しくはその断片を含む融合ポリペプチドを含む複合体の血漿中半減期を、個々の治療的目的に従って選択できるという利点がある。

その他の実施形態では、アルブミン改変体は免疫原に結合している。免疫原をアルブミン誘導体、断片、またはその改変体に結合させる技術は当技術分野で公知である。ＷＯ２００９０１９３１４には治療的化合物をポリペプチドに結合させるため好適な技術例が開示されており、この技術もまた本発明に適用可能である。さらにＷＯ２００９０１９３１４には、置換トランスフェリンに結合し得る化合物及び部分の例が開示されており、これらの例も本発明に適用され得る。ＷＯ２００９０１９３１４の教示は参照により本明細書に含まれる。

ＨＳＡは、その天然形態では遊離チオール基を１つ含有しており、これは結合に好都合に使用され得る。この態様内の特定の実施形態として、本発明の改変アルブミン、その断片、及び融合体は、表面にさらに遊離チオール基を生成させるために与えられた、さらなる修飾を含み得る。このことには、アルブミン誘導体、断片、またはその改変体のペイロードが増加するため、２個以上の免疫原分子をアルブミン誘導体、断片、またはその改変体のいずれにも結合させることができ、または、異なる２種以上の免疫原を改変アルブミン、その断片、及び融合体の各分子に結合させることができるという利点がある。表面にさらなる遊離チオール基が生成されるよう修飾され得る特定の残基に関する教示は、同時係属特許出願（ＥＰ ２００９ １５２ ６２５．１）に記載されており、これは参照により組み入れられたものとする。

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のアルブミン改変体または野生型アルブミン及び免疫原を含むワクチン組成物を提供する。本発明は、アルブミン／免疫原融合体を含む組成物の特定の配合により限定されるものではない。事実、本発明のワクチン組成物は、融合タンパク質に加え異なる２種以上の薬剤を含み得る。これらの薬剤または補因子には、アジュバント、界面活性剤、添加剤、緩衝剤、溶解補助剤、キレート剤、油、塩、治療剤、薬物、生物活性剤、抗菌剤、及び抗微生物剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬等）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含むワクチン組成物は、薬剤及び／または免疫原の免疫応答誘導能力を高める補因子（例えば、アジュバント）を含む。いくつかの好ましい実施形態では、１つまたはそれ以上の補因子または薬剤を存在させることで、免疫応答（例えば、防御免疫応答（例えば、保護的免疫付与））の誘導に必要な免疫原量が減少する。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の補因子または薬剤の存在を利用して、免疫応答を細胞性（例えば、Ｔ細胞媒介性）または液性（例えば、抗体媒介性）の免疫応答に偏らせることができる。本発明は、本発明の治療剤に使用される補因子または薬剤の種類により限定されるものではない。

アジュバントは、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−−ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５に一般記載がある。本発明は、使用アジュバントの種類（例えば、組成物（例えば、医薬組成物）における使用）により限定されるものではない。例えば、いくつかの実施形態では、好適なアジュバントには水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が含まれる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、カルシウム、鉄または亜鉛の塩であってよく、または、アシル化したチロシンの不溶性懸濁液、またはアシル化した糖、陽イオン性若しくは陰イオン性に誘導体化した多糖、またはポリホスファゼンであってよい。

一般に、免疫応答は、抗原と免疫系細胞の相互作用を介して抗原に対して生じる。免疫応答は大きく分けて２つのカテゴリー、すなわち、液性免疫応答と細胞性免疫応答（例えば、従来より、それぞれ抗体及び細胞の防御エフェクター機構で特徴づけられている）に分けることができる。これらの応答カテゴリーは、Ｔｈ１型応答（細胞性応答）及びＴｈ２型免疫応答（液性応答）と言われている。

免疫応答の刺激は、細胞または免疫系成分が介入（例えば、免疫原への曝露）に対して直接または間接的に応答することにより起こり得る。免疫応答は多くの方法で測定可能であり、これには、免疫系細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＡＰＣ、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞等）の活性化、増殖または分化；マーカー及びサイトカインの上方制御発現または下方制御発現；ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧ抗体価の刺激；脾腫（脾臓細胞数増加を含む）；さまざまな臓器における過形成及び混合細胞浸潤が含まれる。免疫刺激に関して評価可能な免疫系の他の応答、細胞、及びの構成成分は当技術分野で公知である。

本発明の実施に機序の理解は必要というわけではなく、また、本発明はいかなる特定の作用機序にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法はサイトカインの発現と分泌（例えば、マクロファージ、樹状細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞による）を誘導する。特定サイトカインの発現の調節は局所的または全身で起こり得る。サイトカインの特性が免疫応答におけるＴ細胞の調節機能及びエフェクター機能を決定し得ることが知られている。いくつかの実施形態では、Ｔｈ１型サイトカインが誘導され得るため、本発明の免疫刺激組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞を含めＴｈ１型の抗原特異的免疫応答を促進することができる（例えば、これにより、望ましくないＴｈ２型免疫応答（例えば、疾患重症度の悪化（例えば、ＩＬ−１３による粘液形成の誘導）に関与するＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−１３）の産生）回避される）。

サイトカインは細胞応答を指示する役割を果たす。ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞は、Ｂ細胞及び他のＴ細胞など他の免疫系細胞に作用する可溶性因子を産生することにより哺乳類の免疫応答を調整する。多くの成熟したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は２つのサイトカイン特性、Ｔｈ１またはＴｈ２のいずれかを発現する。Ｔｈ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、及び高レベルのＴＮＦ−αを分泌する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、及び低レベルのＴＮＦ−αを発現する。Ｔｈ１型サイトカインは、マウスではＩｇＧ２ａへ、またヒトではＩｇＧ１へ免疫グロブリンがクラススイッチされることを特徴とする液性免疫及び細胞性免疫の両方を促進する。Ｔｈ１応答は、遅延型過敏症及び自己免疫疾患に関連していてもよい。Ｔｈ２型サイトカインは主に液性免疫を誘導し、またＩｇＧ１及びＩｇＥへのクラススイッチを誘導する。Ｔｈ１応答に関連した抗体アイソタイプは一般に中和しオプソニン化する能力を有するが、Ｔｈ２応答に関連した抗体アイソタイプはアレルギー反応にさらに関連している。

幾つかの因子は、Ｔｈ１型若しくはＴｈ２型応答のいずれかへの免疫応答の偏りに影響することが示されている。最も良く特徴がわかっている調節因子はサイトカインである。ＩＬ−１２とＩＦＮ−γは正のＴｈ１調節因子と負のＴｈ２調節因子である。ＩＬ−１２はＩＦＮ−γの産生を促進し、ＩＦＮ−γは正のフィードバックをＩＬ−１２に与える。ＩＬ−４及びＩＬ−１０は、Ｔｈ２サイトカイン特性の確立に重要であり、Ｔｈ１によるサイトカイン産生を下方制御すると思われる。

したがって、好ましい実施形態では、本発明は、被検体に免疫原を含む組成物を投与することを含む、被検体にＴｈ１型免疫応答を惹起する方法を提供する。しかし、その他の実施形態では、本発明は、被検体に免疫原を含む組成物を投与することを含む、被検体にＴｈ２型免疫応答を惹起する（例えば、Ｔ細胞媒介性応答のバランスをとることが所望される場合）方法を提供する。さらに好ましい実施形態では、免疫応答をＴｈ１型またはＴｈ２型免疫応答のいずれかに偏らせるために、アジュバントを使用できる（例えば、本発明の組成物と同時投与できる）。例えば、Ｔｈ２応答または弱いＴｈ１応答を誘導するアジュバントには、ａｌｕｍ、サポニン、及びＳＢ−Ａｓ４が挙げられるが、これに限定されるものではない。Ｔｈ１応答を誘導するアジュバントにはＭＰＬ、ＭＤＰ、ＩＳＣＯＭＳ、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、及びＳＢ−ＡＳ２が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

他の幾つかの種類のＴｈ１型免疫原を本発明の組成物及び方法に（例えば、アジュバントとして）使用できる。これらには以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、モノホスホリル脂質Ａ（例えば、特に３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ））を使用する。３Ｄ−ＭＰＬは、Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｍｏｎｔａｎａが製造する周知のアジュバントである。化学的には、４、５、または６本のアシル化鎖を有する３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物として供給されることが多い。いくつかの実施形態では、ジホスホリル脂質Ａ及びその３−Ｏ−脱アシル化した改変体を使用する。これら免疫原の各々は、ＧＢ２１２２２０４Ｂに記載の方法（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）により精製及び調製することができる。精製及び合成された他のリポ多糖については記載がある（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，００５，０９９及びＥＰ ０ ７２９ ４７３；Ｈｉｌｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９（４）：３９２−６；Ｈｉｌｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６０（１）：１４１−６；並びにＥＰ ０ ５４９ ０７４を参照のこと。これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。いくつかの実施形態では、３Ｄ−ＭＰＬは微粒子製剤の形態で使用される（例えば、ＥＰ ０ ６８９ ４５４に記載の直径０．２μｍ未満の小粒径であり、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。

いくつかの実施形態では、サポニンを本発明の組成物に免疫原（例えば、Ｔｈ１型アジュバント）として使用する。サポニンは、周知のアジュバントである（例えば、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ（１９９６）Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ 第２巻、３６３〜３８６頁を参照のこと）。サポニンの例として、Ｑｕｉｌ Ａ（南米産の樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮由来）、及びその画分が挙げられる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０５７，５４０；Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ，１９９６，１２（１−２）：１−５５；及びＥＰ ０ ３６２ ２７９を参照のこと。これら各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。他にも本発明に有用であることが意図されるのは、溶血性サポニンＱＳ７、ＱＳ１７、及びＱＳ２１である（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分；例えば、Ｋｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４６，４３１−４３７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０５７，５４０；ＷＯ９６／３３７３９；ＷＯ９６／１１７１１、及びＥＰ ０ ３６２ ２７９を参照のこと。これら各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。他にも有用であることが意図されるのは、ＱＳ２１及びポリソルベートまたはシクロデキストリンの組み合わせである（例えば、ＷＯ９９／１０００８を参照のこと。なお、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

いくつかの実施形態では、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（「ＣｐＧ」）を含有する免疫原性オリゴヌクレオチドをアジュバントとして使用する。ＣｐＧは、ＤＮＡに存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。ＣｐＧは、全身投与及び粘膜経路投与の場合のアジュバントであるとして当技術分野で公知である（例えば、ＷＯ９６／０２５５５，ＥＰ４６８５２０，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６０（２）：８７０−８７６；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１（９）：４４６３−６；及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐ．Ｎｏ．２００５０２３８６６０を参照のこと。なお、これら各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。例えば、いくつかの実施形態では、免疫刺激性配列はプリン−プリン−Ｃ−Ｇ−ピリミジン−ピリミジンであり、ここで、ＣＧモチーフはメチル化されていない。

本発明の実施に機序の理解は必要というわけではなく、また、本発明はいかなる特定の作用機序にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のＣｐＧオリゴヌクレオチドを存在させると、ナチュラルキラー細胞（ＩＦＮ−γを生産する）及びマクロファージなどのさまざまな免疫サブセットが活性化される。いくつかの実施形態では、免疫応答を誘導するためにＣｐＧオリゴヌクレオチドを本発明の組成物に配合する。いくつかの実施形態では、ＣｐＧの自由溶液を抗原と共に同時投与する（例えば、溶液内に存在（例えば、ＷＯ９６／０２５５５を参照のこと。なお、参照により本明細書に組み入れられる）。いくつかの実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは抗原に共有結合により結合している（例えば、ＷＯ９８／１６２４７を参照のこと。なお、参照により本明細書に組み入れられたものとする）、または水酸化アルミニウムなどの担体と共に配合されている（例えば、Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．，ＵＳＡ，１９９８，９５（２６），１５５５３−８を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントのようなアジュバント、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４等）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子等）、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱−不安定性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３（野生型アミノ酸の６３位がリシンに置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（野生型アミノ酸の７２位がアルギニンに置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（野生型アミノ酸の１０９位がセリンに置換されている）、及びＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（野生型アミノ酸の９位がリシンに置換され、１２９位がグリシンに置換されている）のような細菌性ＡＤＰ−リボシル化毒素の解毒変異体（例えば、ＷＯ９３／１３２０２及びＷＯ９２／１９２６５を参照のこと。なお、これら各々は参照により本明細書に組み入れられたものとする）、並びに他の免疫原性物質（例えば、本発明の組成物の有効性を高めるもの）を本発明の免疫原を含む組成物と共に使用する。

本発明に使用されるアジュバントの別の例には、ポリ（ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＵＳＡ）；モノホスホリル脂質Ａなどのリポ多糖誘導体（ＭＰＬ；Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）、及びトレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）；ＯＭ−１７４（脂質Ａに関連したグルコサミン二糖；ＯＭ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ，Ｍｅｙｒｉｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；及びリーシュマニア伸長因子（精製リーシュマニアタンパク質；Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）が挙げられる。

アジュバントを免疫原を含む組成物に加えるか、またはアジュバントを担体、例えばリポソームまたは金属塩（例えば、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム））と配合してから組成物と合わせる、または同時投与を行ってよい。

いくつかの実施形態では、免疫原を含む組成物は単一のアジュバントを含む。その他の実施形態では、組成物は２種またはそれ以上のアジュバントを含む（例えば、ＷＯ９４／００１５３；ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９６／３３７３９；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１；及びＷＯ９４／００１５３を参照のこと。なお、これら各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。

いくつかの実施形態では、免疫原を含む組成物は１種またはそれ以上の粘膜付着剤を含む（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ａｐｐ．Ｎｏ．２００５０２８１８４３を参照のこと。なお、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。本発明は、使用する粘膜付着剤の種類により限定されるものではない。事実、多種多様な粘膜付着剤が本発明に有用であると意図され、これらにはポリ（アクリル酸）（例えば、カーボポール及びポリカルボフィル）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ）、多糖（例えば、アルギン酸塩及びキトサン）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、レクチン、線毛タンパク質、及びカルボキシメチルセルロースの架橋された誘導体を含むが、これらに限定されない。本発明の実施に機序の理解は必要というわけではなく、また、本発明はいかなる特定の作用機序にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、粘膜付着剤（例えば、免疫原を含む組成物中）を使用すると、粘膜付着剤を使用しない場合の持続時間及び／または免疫原への曝露量と比べ、粘膜付着剤を使用した場合に被検体が経験する持続時間及び／または免疫原への曝露量が増加するため、被検体（例えば、本発明組成物を投与）の免疫応答誘導が高められる。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、無菌水性調製物を含んでよい。許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル溶液、リン酸緩衝生理食塩液及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、無菌、不揮発性油は、従来より溶媒または懸濁媒として使用される。これを目的とする場合、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含め、あらゆるブランドな不揮発性の鉱物油または非鉱物油を用いることができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は注入可能物質の調製に使用される。粘膜投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または他の経路による投与に好適な担体配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに記載されている。

本発明の免疫原を含む組成物は、治療に（例えば、免疫応答を高めるため）または予防として（例えば、免疫化するため（例えば、疾患の徴候または症状を予防するため））使用することができる。本発明の免疫原を含む組成物は、多数の異なる送達経路及び送達方法により被検体に投与可能である。

例えば、本発明の組成物は、溶液中に懸濁させて表面に塗布する；溶液中に懸濁させてスプレーアプリケーターを使用して表面にスプレーする；粘膜付着剤と混合して表面（例えば、粘膜表面）に塗布する（例えば、スプレーするかまたは拭く）；鼻用及び／または膣用アプリケーター上に載置または含浸させて塗布する；放出制御機構により塗布する；リポソームとして塗布する；またはポリマー上に塗布する方法を含むが、これらに限定されない複数の方法により被検体に（例えば、粘膜（例えば、鼻粘膜、腟粘膜等）を介して）投与可能である。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物を経粘膜で投与する（例えば、標準的技術を使用して行う。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５（例えば、経鼻、肺、膣、及び直腸による技術を含む粘膜送達法について）、並びに、欧州公開第５１７，５６５号及びＩｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．，１９９４，２９：１３３−１４１（例えば、経鼻投与法について）を参照のこと。なお、これら各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。別法として、本発明の組成物は、標準的技術を使用して経皮または経皮吸収により投与され得る、（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｒｉｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、第１９版、１９９５を参照のこと）。本発明は、投与経路により限定されるものではない。

本発明の実施に機序の理解は必要というわけではなく、また、本発明はいかなる特定の作用機序にも限定されるものではないが、抗原の粘膜投与は、多くの病原体の侵入経路である粘膜表面での防御免疫応答（例えば、粘膜免疫）の誘導に非常に有効であることが示されているため、いくつかの実施形態では、粘膜ワクチン接種が好ましい投与経路である。さらに、経鼻ワクチン接種のような粘膜ワクチン接種で、鼻粘膜だけではなく性器粘膜などの離れた粘膜部位に粘膜免疫が誘導され得る（例えば、Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：２６５−２７６，１９８７を参照のこと）。より有利なことに、さらに好ましい実施形態では、粘膜ワクチン接種により粘膜免疫応答の誘導に加え、全身免疫も誘導される。いくつかの実施形態では、非経口ではない投与（例えば、ワクチンの粘膜投与）により、全身免疫感作のための効率的かつ好都合な方法が提供される（例えば、非経口または粘膜ワクチン接種による誘導（例えば、強い全身免疫を持続させるために複数の追加免疫を使用する場合））。

いくつかの実施形態では、本発明の免疫原を含む組成物をて使用して、本発明の組成物を粘膜経路（例えば、経口／消化または経鼻経路）により投与することを手段として、疾患に罹患しやすい、または罹患している被検体を保護または治療してよい。代替粘膜経路には、腟内経路及び直腸内経路が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、経鼻投与経路を使用し、本明細書では「経鼻投与」または「経鼻ワクチン接種」という。経鼻ワクチン接種の方法は当技術分野において周知であり、飛沫またはスプレー形態のワクチンを免疫化するべき被験者の鼻咽頭内に投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、噴霧化またはエアロゾル化した組成物を提供する。経口投与用の胃耐性カプセル剤などの腸溶性製剤、直腸または膣投与用の坐剤もまた本発明の一部をなす。本発明の組成物は、経口経路で投与してもよい。これらの状況下では、免疫原を含む組成物は、薬理学的に許容される賦形剤を含んでよく、かつ／またはアルカリ緩衝剤、若しくは腸溶カプセル剤を含む。経鼻送達用製剤には、デキストランまたはシクロデキストラン及びアジュバントとしてサポニンが含まれたものが含まれ得る。

本発明の組成物は、膣経路で投与してもよい。かかる場合は、免疫原を含む組成物は、膣用クリーム及び坐剤の薬理学的に許容される賦形剤及び／または乳化剤、ポリマー（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ）、並びに他の公知の安定化剤を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明の組成物を直腸経路で投与する。この場合、組成物は、直腸用坐剤を形成するために当技術分野で公知の賦形剤及び／またはワックス及びポリマーを含んでよい。

いくつかの実施形態では、初回免疫及び追加免疫ワクチン接種の両方に同一投与経路（例えば、粘膜投与）が選択される。いくつかの実施形態では、複数の投与経路を（例えば、同時に、または、別法として、順次）使用して免疫応答を惹起する。

例えば、いくつかの実施形態では、免疫原を含む組成物は、初回免疫または追加免疫いずれのワクチン接種レジメンにおいても被検体の粘膜表面に投与される。別法として、いくつかの実施形態では、組成物は初回免疫または追加免疫いずれのワクチン接種レジメンにおいても全身投与される。いくつかの実施形態では、免疫原を含む組成物は、粘膜投与による初回免疫ワクチン接種レジメン、及び全身投与による追加免疫レジメンで被検体に投与される。いくつかの実施形態では、免疫原を含む組成物は、全身投与による初回免疫ワクチン接種レジメン、及び粘膜投与による追加免疫レジメンで被検体に投与される。全身投与経路の例には、非経口、筋肉内、皮内、経皮吸収、皮下、腹腔内または静脈内の各投与が挙げられるが、これに限定されるものではない。免疫原を含む組成物は、予防及び治療のいずれの目的にも使用され得る。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、経肺送達により投与される。例えば、本発明の組成物は、吸入により被検体（例えば、ヒト）の肺に送達可能である（例えば、これにより、肺上皮被覆を横切り血流に入る（例えば、Ａｄｊｅｉ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９０；７：５６５−５６９；Ａｄｊｅｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １９９０；６３：１３５−１４４；Ｂｒａｑｕｅｔ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９８９ １４３−１４６；Ｈｕｂｂａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第ＩＩＩ巻、２０６〜２１２頁；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９；８４：１１４５−１１４６；Ｏｓｗｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．“Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，１９９０；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ；Ｄｅｂｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８；１４０：３４８２−３４８８；及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２８４，６５６（Ｐｌａｔｚら）を参照のこと。なお、これら各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。薬物を経肺送達し全身作用させるための方法及び組成物は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４５１，５６９（Ｗｏｎｇら）に記載されており、参照により本明細書に組み入れられたものとする。また、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６５１，６５５（Ｌｉｃａｌｓｉら）もを参照のこと））。

本発明を実施する際に使用がさらに意図されるのは、医薬品の肺及び／または鼻粘膜への送達用に設計された広範な機械的デバイスであり、噴霧器、定量噴霧式吸入器、及びパウダー吸入器などが含まれるが、これらに限定はされず、これらはいずれも当業者には馴染みのあるものである。本発明を実施するために好適な市販デバイスの具体例をいくつか挙げると、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量噴霧式吸入器（Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）；及びＳｐｉｎｈａｌｅｒパウダー吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）がある。このようなデバイスはいずれも治療剤の調剤に好適な配合物を使用する必要がある。典型的に、各製剤は使用のデバイスタイプに特異的であり、通常の希釈剤、アジュバント、界面活性剤、担体及び／または治療に有用な他の薬剤に加え、適切な噴射物質を使用する場合がある。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロ粒子、包接複合体、または他の種類の担体の使用が意図される。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明の免疫原を含む組成物を、疾患に罹患しやすい、または罹患している被検体を保護及び／または治療するために、経粘膜、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮吸収、経肺、静脈内、皮下といった投与経路または本明細書に記載の他の投与経路での組成物投与を手段として使用してよい。ワクチン調製物を全身投与する方法には、従来の注射器と針、または固形ワクチンの弾丸式送達用に設計されたデバイス（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ９９／２７９６１を参照のこと）、または無針圧液ジェットデバイス（例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられるＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５９６，５５６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，９９３，４１２を参照のこと）、または経皮吸収パッチ剤（例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ９７／４８４４０；ＷＯ９８／２８０３７を参照のこと）が含まれ得る。本発明は、皮膚に塗布される抗原の免疫原性を高めるために使用してもよい（経皮吸収または経皮送達；例えば、ＷＯ９８／２０７３４；ＷＯ９８／２８０３７を参照のこと。なお、これら各々は参照により本明細書に組み入れられたものとする）。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のワクチン組成物が予め充填されている全身投与用の送達デバイスを提供する。

本発明は、本発明の組成物を投与される（例えば、免疫応答を惹起するため（例えば、防御免疫（例えば、粘膜及び／または全身の免疫）を引き起こすため）））被検体の種類により限定されるものではない。実際に、さまざまな被検体が、本発明組成物の投与が有益であると意図される。好ましい実施形態では、被検体はヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト被検体は、それまでに微生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））に曝露されたことがある、または曝露されると考えられるあらゆる年齢のヒト被験者（例えば、成人、小児、乳児等）である。いくつかの実施形態では、ヒト被検体は、病原性微生物に直接曝露される可能性が一層高い被験者、または、病原体への曝露後に疾患の徴候及び症状を示す可能性が一層高い被験者（例えば、免疫が抑制されている被検体）である。いくつかの実施形態では、一般市民に本発明の組成物を（例えば、疾患の発生または広がりを予防するために）投与（例えば、ワクチン接種）する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、一群の人々（例えば、地域、都市、州及び／または国の母集団）に自身の健康のために（例えば、疾患の予防または治療のため）ワクチン接種するために利用される。いくつかの実施形態では、被検体は、非ヒト哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、若しくは他の家畜動物；またはマウス、ラット、ウサギまたは他の動物）である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、研究の場で（例えば、研究用動物を用いて）利用される。

本発明の組成物は、粘膜、経口、経皮吸収、経鼻、非経口の経路または本明細書に記載の他の経路のような任意の経路での投与用に配合され得る。組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒、薬用ドロップ、フォーム、クリームまたは液体調製物を含むがこれらに限定されない、１つまたはそれ以上の異なる任意の形態であってよい。

本発明の局所製剤は、例えば、軟膏、クリームまたはローション、フォーム、及びエアロゾルとして提供されてよく、軟膏及びクリームには防腐剤、溶媒（例えば、浸透補助）、及び軟化剤などの適切な一般添加剤が含有され得る。

局所製剤には、皮膚を介した有効成分の浸透を高める薬剤も含まれ得る。例示的な薬剤には、Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピロリドンと細胞エンベロープ障害性化合物（ｃｅｌｌ−ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の二成分を組み合わせたもの、糖エステルとスルホキシドまたはホスフィンオキシドとの組み合わせ、及びショ糖モノオレイン酸エステル、デシルメチルスルホキシド、及びアルコールが含まれる。

皮膚浸透を高める他の例示的な物質には、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ポリソルベート８０）；ソルビタンモノオレアート（スパン８０）；ｐ−イソオクチルポリオキシエチレンフェノールポリマー（Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ−１３３０）；ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（Ｔｗｅｅｎ８５）；ジオクチルナトリウムスルホこはく酸；及びサルコシン酸ナトリウム（Ｓａｒｃｏｓｙｌ ＮＬ−９７）；及び他の薬理学的に許容される界面活性剤を含むが、これらに限定されない界面活性剤または湿潤剤が含まれる。

本発明のある実施形態では、組成物は、１つまたはそれ以上のアルコール、亜鉛含有化合物、軟化剤、湿潤剤、濃稠化剤及び／またはゲル化剤、中和剤、及び界面活性剤をさらに含んでよい。配合物に使用する水は、好ましくは中性ｐＨのイオン交換水である。局所製剤のさらなる添加物には、シリコーン液、染料、着香剤、ｐＨ調整剤、及びビタミン類が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、クリームまたは軟膏用基剤及びローション用のエタノールまたはオレイルアルコールのような適合性のある従来の担体を含有してもよい。このような担体は、製剤の約１％から最高約９８％まで含まれてよい。軟膏基剤は、ワセリン、鉱物油、セレシン、ラノリンアルコール、パンテノール、グリセリン、ビサボロール、ココアバター等を１種またはそれ以上含むことができる。

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、フォームとして配合及び使用され得る。医薬フォームには、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー、及びリポソームなどの、これらに限定されない配合物が含まれる。これらの配合物は基本的には性質は似ているが、その構成成分及び最終生成物の軟度が異なる。本発明の組成物は、従来より医薬組成物に見られる他の補助的構成成分をさらに含有し得る。したがって、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬または抗炎症薬などの適合性のある薬理学的活性物質をさらに含有してよく、または、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、濃稠化剤、及び安定化剤のような、本発明の組成物のさまざまな剤形を物理的に製剤化する際に有用な別の物質を含有してよい。ただし、このような物質は、添加した際に、本発明組成物の構成成分の生物活性が異常に妨害されないことが好ましい。配合物は滅菌可能であり、所望であれば、免疫原または他の製剤構成成分と有害な相互作用をしない補助剤（例えば、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を促すための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤、及び／または芳香性物質等）と混合可能である。いくつかの実施形態では、本発明の免疫刺激組成物は、薬理学的に許容される塩の形態で投与される。塩を使用する場合、薬理学的に許容される塩を使用すべきであるが、薬理学的に許容されない塩を好都合に使用すればその薬理学的に許容される塩が調製され得る。そのような塩には、以下の酸から調製される塩があるがこれらに限定されるものではない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、こはく酸、ナフタレン−２−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、カルボン酸群のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩のような、アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製することができる。

好適な緩衝剤には、酢酸及び塩（１〜２ｗ／ｖ％）；クエン酸及び塩（１〜３ｗ／ｖ％）；ホウ酸及び塩（０．５〜２．５ｗ／ｖ％）；及びリン酸及び塩（０．８〜２ｗ／ｖ％）が挙げられるが、これに限定されるものではない。好適な防腐剤には、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３ｗ／ｖ％）；クロロブタノール（０．３〜０．９ｗ／ｖ％）；パラベン（０．０１〜０．２５ｗ／ｖ％）、及びチメロサール（０．００４〜０．０２ｗ／ｖ％）が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を、１種またはそれ以上の抗生物質と同時投与する。例えば、１種またはそれ以上の抗生物質を、本組成物投与と同時、投与前及び／または投与後に投与してよい。本発明は、同時投与する抗生物質の種類により限定されるものではない。実際、多種多様な抗生物質が同時投与されてよく、これらには、βラクタム系抗生物質、ペニシリン系（天然ペニシリン、アミノペニシリン、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、カルボキシペニシリン（ｃａｒｂｏｘｙ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ）、ウレイドペニシリンなど）、セファロスポリン系（第１世代、第２世代、及び第３世代セファロスポリン）、及び他のβ−ラクタム系（イミペネム、モノバクタム系など）、βラクタマーゼ阻害薬、バンコマイシン、アミノ配糖体系とスペクチノマイシン、テトラサイクリン系、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、メトロニダゾール、ポリミキシン、ドキシサイクリン、キノロン系（例えば、シプロフロキサシン）、スルホンアミド系、トリメトプリム、並びにキノリンが含まれるが、これらに限定されない。

現在、細菌性、真菌性及びウイルス性感染の治療に使できる膨大な量の抗微生物剤が入手可能である。一般クラスのこうした薬物及びその作用機序に関する包括的な学術論文について、当業者はＧｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ “Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ” Ｅｄｓ．Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂ．ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、第４３〜５０章，１９９６（参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）を参照にする。一般に、これらの薬剤には、細胞壁合成を阻害する薬剤（例えば、ペニシリン系、セファロスポリン系、シクロセリン、バンコマイシン、バシトラシン）；及びイミダゾール系抗真菌薬（例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール及びクロトリマゾール）；直接作用して微生物の細胞膜を破壊する薬剤（例えば、ポリミキシン及びコリスチメタートなどの洗浄液、及び抗真菌薬のニスタチンとアムホテリシンＢ）；リボソームサブユニットに作用してタンパク質合成を阻害する薬剤（例えば、クロラムフェニコール、テトラサイクリン系、エリスロマイシン、及びクリンダマイシン）；タンパク質合成を改変し細胞死をもたらす薬剤（例えば、アミノ配糖体系）；核酸代謝に影響を与える薬剤（例えば、リファマイシン及びキノロン系）；代謝拮抗薬（例えば、トリメトプリム及びスルホンアミド系）；並びにＤＮＡ合成に必須のウイルスの酵素を阻害して作用するジドブジン、ガンシクロビル、ビダラビン、及びアシクロビルなどの核酸類似体が挙げられる。抗微生物剤をさまざまに組み合わせて使用してよい。

本発明には、免疫原を１種またはそれ以上のさらなる活性剤及び／または免疫刺激剤と共に含むワクチン組成物（例えば、異なる免疫原、抗生物質、抗酸化剤等を含む組成物）の同時投与を行う方法も含まれる。実際、本発明の組成物を同時投与することにより従来技術の免疫刺激方法（例えば、免疫化方法）及び／または医薬組成物を改善させる方法を提供することが本発明のさらなる態様である。同時投与手順では、薬剤は、同時に、または順次投与され得る。一実施形態では、他の活性剤（複数可）を投与する前に本明細書に記載の組成物を投与する。医薬製剤及び投与方法は本明細書に記載されるいかなるものでもよい。さらに、同時投与する２種以上の薬剤の各々を、異なる方法（例えば、経路）または異なる製剤を使用して投与してよい。同時投与されるさらなる薬剤（例えば、抗生物質、アジュバント等）は、現在、臨床使用されている薬剤を含むがそれら限定されない、当該技術で周知のいずれの薬剤でも可能である。

いくつかの実施形態では、免疫原を含む組成物を２つ以上経路で被検体に投与する。例えば、病原性微生物に対する防御免疫応答（例えば、免疫）があると有益であろうと考えられる被検体では、粘膜投与（例えば、経鼻投与または本明細書に記載の他の粘膜経路）を受け、追加で、１つまたはそれ以上の他の経路で投与（例えば、非経口または経肺投与（例えば、噴霧器、吸入器、または本明細書に記載の他の方法による））を受けることが有益であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原または生免疫原の由来となる物に対する粘膜免疫並びに全身免疫の両方を誘導するために粘膜経路による投与で十分である。その他の実施形態では、複数の経路による投与は粘膜免疫及び全身免疫の両方を与えるために役立つ。したがって、本発明の実施に機序の理解は必要というわけではなく、また、本発明はいかなる特定の作用機序にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、複数の投与経路（例えば、免疫化（例えば、本組成物の粘膜投与並びに気道または非経口投与））で本発明の組成物の投与を受けた被検体は、１つの経路でしか組成物を投与されなかった被検体より免疫原に対する免疫応答が強くなり得ることが意図される。

他の送達システムには、時間放出型、遅延放出型または徐放性送達システムが含まれる。このようなシステムにより、組成物の反復投与を回避することができ、被検体及び医師にとっての利便性が高まる。多種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサラート（ｃｏｐｏｌｙｏｘａｌａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ酸無水物のようなポリマー系システムが含まれる。上述のポリマーの薬物含有マイクロカプセルは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０７５，１０９に記載されており、参照により本明細書に組み入れられたものとする。送達システムには、非ポリマー系システム、すなわち、コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸またはモノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドなどの中性脂肪のようなステロールを含む脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチド系システム；ワックスコーティング；従来の結合剤及び賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分的融合インプラント等も含まれる。具体的実施例としては、（ａ）本発明の薬剤がＵ．Ｓ．Ｐａｔ Ｎｏｓ．４，４５２，７７５、４，６７５，１８９、及び５，７３６，１５２（それぞれ参照により本明細書に組み入れられたものとする）に記載のようなマトリックス内に入った形態で含有されているエロージョン（侵食）システム、並びに（ｂ）Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．３，８５４，４８０、５，１３３，９７４、及び５，４０７，６８６（それぞれ参照により本明細書に組み入れられたものとする）に記載のようなポリマーから活性成分が制御された速度で透過する拡散システム挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、ポンプ系ハードウェア送達システムを使用でき、中には移植に適合したものもある。

いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物を被検体に投与する前に希釈可能な濃縮用量で製剤化する。例えば、本明細書で提供される特定用量のうち任意の１つまたはそれ以上の用量が被検体に投薬されるよう、濃縮組成物を希釈したものを被検体に投与してよい。いくつかの実施形態では、濃縮組成物の希釈は、濃縮組成物中にナノエマルジョン及び免疫原０．５〜５０％を含む組成物が被検体に投与されるよう（例えば、単回投与で）行われ得る。濃縮組成物は、本発明の組成物を多数の被検体に投与され得る場合（例えば、診療所、病院、学校等での免疫接種）に有用であると意図される。いくつかの実施形態では、本発明の免疫原を含む組成物（例えば、濃縮組成物）は、１週間以上、いくつかの実施形態では２週間以上、いくつかの実施形態では３週間以上、いくつかの実施形態では４週間以上、いくつかの実施形態では５週間以上、いくつかの実施形態では６週間以上室温で安定である。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物を初回投与（例えば、初回ワクチン接種）した後、初回、２回目、３回目、４回目、５回目、６回目、７回目、８回目、９回目、１０回目、及び／または１１回目以降の投与に続き、１回またはそれ以上の追加免疫投与を（例えば、約２週間後、約３週間後、約４週間後、約５週間後、約６週間後、約７週間後、約８週間後、約１０週間後、約３か月後、約４か月後、約６か月後、約９か月後、約１年後、約２年後、約３年後、約５年後、約１０年後）被検体に行ってよい。本発明の実施に機序の理解は必要というわけではなく、また、本発明はいかなる特定の作用機序にも限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、追加免疫投与で免疫原を再導入することで被検体における強い全身免疫が可能になる。追加免疫は、初回免疫応答のために投与された製剤と同一のものを用いることができ、または、免疫原を含有する異なる製剤を用いることも可能である。投与レジメンは、少なくとも一部は、その被検体の必要性によっても決定され、また、医師の判断にも依存することとなる。

投与単位は、被検体の体重、年齢、及び健康状態などこれらに限定されない幾つかの因子に対して比例して増加または減少し得る。さらに、その後の投与（例えば、追加免疫投与）の投与単位を増加または減少させてよい。

本発明の組成物及び方法は、研究の場を含めさまざまな場で利用されるであろうことが意図される。例えば、本発明の組成物及び方法は、免疫系の研究（例えば、適応免疫応答（例えば、防御免疫応答（例えば、粘膜免疫または全身免疫））の特徴付け）にも利用される。本発明により提供される組成物及び方法の使用には、ヒト及び非ヒト被検体並びにそれらの被検体に由来する試料が包含され、また、これらの被検体を使用する調査研究用途も包含される。本発明の組成物及び方法は、アルブミン改変体、免疫原、及び他の構成成分の研究及び最適化、並びに新たな構成成分のスクリーニングに有用でもある。したがって、本発明が任意の特定被検体及び／または適用する場に限定されることは意図されていない。

本発明は、本明細書に含まれるワクチン組成物を含むキットをさらに提供する。いくつかの実施形態では、キットには、ワクチン投与に必要、十分または有用なコンポーネントがすべて含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、ワクチン投与用デバイス（例えば、針または他の注射デバイス）、温度制御コンポーネント（例えば、冷蔵または他の冷却コンポーネント）、衛生コンポーネント（例えば、注射部位消毒用のアルコールスワブ）、及びワクチン投与の指示書を含む。

実施例１
アルブミン改変体の工学的操作
材料及び方法
アルブミン改変体をコードする発現ベクターの構築
ＧＳＴをコードするｃＤＮＡセグメントに融合したマウス及びヒトのアルブミン改変体をコードするｃＤＮＡをクローニングするためにｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。先に記載があるように（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，３６７−３７２（２０１０）；Ｂｅｒｎｔｚｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２９８，９３−１０４（２００５））、全ベクターともエプスタイン−バーウイスルの複製起点（ＯｒｉＰ）もコードする。ＭＳＡ及びＨＳＡ遺伝子（表１）をコードするｃＤＮＡ断片はいずれもＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ（ＮＪ，ＵＳＡ）社に依頼しｐＵＣ５７ベクター内に作製した。ｐＵＣ５７ベクター両端に制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩを隣接させた。アミノ酸のグリシン−セリン（ＧＳ）伸長部をコードするＤＮＡ配列（（ＧＧＳ）４ＧＧ）のＮ末端にＧＳＴ配列を融合させた。ｐｃＤＮＡ３−ＨＳＡｗｔ−ＧＳＴ−ＯｒｉＰ及びｐｃＤＮＡ３−ＨＳＡｂａｒｔｉｎ−ＧＳＴ−ＯｒｉＰの両ベクターについては先に記載がある（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０、前掲）。

アルブミン改変体の作製
接着性ＨＥＫ２９３Ｅ細胞の一過的トランスフェクションをポリエチレンイミン（ＰＥＩＭａｘ；ＭＷ ４０００；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）を使用して行った。トランスフェクションに先立ち、Ｔ１７５ボトル（５０ｍｌ）内で９５％コンフルエントな状態まで細胞を増殖させた。６２．５μｇのプラスミドＤＮＡを３．７５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（溶液１）及び２５μｌのＰＥＩ−ＭＡＸ（６．４５ｍｇ／ｍｌ）及び３．７５ｍｌのｄＨ２Ｏと混合した。次いで、溶液１と２を混合し室温で３０分間インキュベーションを行ってから、播種した細胞に混合物を加えた。トランスフェクション後２日ごとに最高１２日まで上清を回収した。

ＧＳＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を使用して、ＧＳＴタグの付いたＭＳＡ及びＨＳＡ改変体を精製した。カラムをＢｉｏＬｏｇｉｃワークステーション及びレコーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に連結し、製造者のプロトコルに従って精製を行った。簡単に言えば、１００ｍｌの１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．２）を使用してカラムの予備平衡を行ってから、０．２２μｍ吸引フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用い０．０５％アジ化ナトリウムを流量１〜２ｍｌ／分で用いて上清を滅菌ろ過した。その後、２００ｍｌの１×ＰＢＳ／０．０５％アジドを添加して非特異的結合物を洗い流した。結合したＧＳＴ融合体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に希釈した１０ｍＭ還元型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５０ｍｌで溶出させた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、溶出した画分を採取し、再濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）して１×ＰＢＳ／０．０５％アジドに緩衝液を交換した。全画分を濃度０．５〜１ｍｇ／ｍｌで−２０℃にて保存した。カラムを洗浄し２０％エタノールに４℃で保存した。

マウス及びヒトのＦｃＲｎの作製
マウス及びヒトのＨｉｓタグ付き切断型単量体ＦｃＲｎ（ｍＦｃＲｎ及びｈＦｃＲｎ）を、本質的には先に記載のように（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２９，２８１９−２８２５（１９９９）；Ｐｏｐｏｖ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３，５２１−５３０（１９９６））バキュロウイルス発現ベクター系を使用して作製した。受容体は、Ｎｉ^２＋イオンが供給されたＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を使用して精製した。使用に先立ち、０．０５％アジ化ナトリウム含有１×ＰＢＳでカラムの予備平衡を行った。上清のｐＨを１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ１０．９）を用いてｐＨ７．２に調整してから、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムに流量５ｍｌ分^−１で添加した。２００ｍｌの１×ＰＢＳに続き５０ｍｌの２５ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳで洗浄後、結合した受容体を５０ｍｌの２５０ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）で溶出させた。タンパク質を、Ａｍｉｃｒｏｎ Ｕｌｔｒａ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して再濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）し１×ＰＢＳに緩衝液を交換してから、製造者のプロトコルに従いＨｉＬｏａｄ２６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００プレップグレードカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、溶出した画分をプール及び再濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）し、４℃で保存した。

酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ウサギＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をマイクロタイターウェル（Ｎｕｎｃ）にコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳ／４％スキムミルクで１時間室温でブロックし、ｐＨ６．０のＰＢＳ／０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ／Ｔ）で４回洗浄した。可溶性ｍＦｃＲｎまたはｈＦｃＲｎ（２０μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ／Ｔ／４％スキムミルク（ｐＨ６．０）に希釈し、ウェルに加え、１．５時間室温でインキュベートしてから、上記のように洗浄した。続いて、ＧＳＴタグの付いたアルブミン改変体（５μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ／Ｔ／４％スキムミルク（ｐＨ６．０）で希釈し、ウェルに室温で２時間加えた。上記のように洗浄した後、ＰＢＳ／Ｔ／４％スキムミルクｐＨ６．０で希釈した（１：４０００）ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ＧＳＴ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えて１時間インキュベートした。続いて、ウェルを上記のように洗浄し、結合したアルブミン改変体をテトラメチルベンジジン基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して検出した。１００μｌの１Ｍ ＨＣｌ添加後、分光光度計Ｓｕｎｒｉｓｅ（ＴＥＣＡＮ）を使用して４５０ｎｍで吸光を測定した。

表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）
ＳＰＲによる実験をＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施し、アミンカップリング（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＧＳＴ融合アルブミン改変体をＣＭ５チップに固定化した。本質的に製造者による記載のとおり、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に２μｇ／ｍｌずつ注入した。チップ表面の未反応部分を１Ｍエタノールアミンでブロックした。実験は、ランニング試料または希釈試料いずれにもリン酸緩衝液（６７ｍＭリン酸緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）（ｐＨ６．０または７．４）を用いて行った。動態測定は、Ｈｉｓタグの付いた単量体ｈＦｃＲｎの系列希釈（１．０〜０．０１５μＭ）を、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４で固定化したアルブミン改変体に２５℃にて流量５０μＬ／分で注入して実施した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアで提供される簡便なラングミュア１：１リガンド結合モデルを使用して反応速度値を計算した。平均二乗を表す統計データχ^２で表記されるフィッティングの近似性は、すべての親和性推定値において２．０以下であった。非特異的結合及び大量の緩衝液作用を補正するため、対照群であるＣＭ５表面及びブランク注射から得た結合応答を各相互作用曲線から引いた。

Ｔ８４経細胞輸送アッセイ
ヒト上皮細胞株Ｔ８４（ＡＴＣＣ）を、１０％熱非働化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌｇ、及び５０Ｕ／ｍｌ ＰＳ（すべてＢｉｏ−Ｗｉｔｔａｋｅｒ製）を添加した、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＨａｍ Ｆ−１２培地（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に維持した。細胞を、ＣＯ_２５％、空気９５％の加湿インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。ＰＴＦＥメンブレンを備えた細孔径０．４μｍのトランスウェルフィルター（１．１２ｃｍ^２）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）を載せ、発育培地内でインキュベートしてから１．０ｘ１０^６細胞／ウェルを播種した。経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）をＭＩＬＬＩＣＥＬＬ−ＥＲＳボルト−オームメーター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用して連日測定した。ＴＥＲ値が１０００〜１５００Ωｘｃｍ^２に達するまで４〜６日間細胞を培養した。発育培地を連日交換した。

実験に先立ち、Ｔ８４の単層を洗浄し、Ｈａｎｋ ＨＢＳＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で１時間インキュベートした。頂端膜から基底外側への輸送を測定するため、２００μｌの正規化ＨＳＡ改変体（２０〜３０μｇ／ｍｌ）を頂端膜側に加え、その後、０時間及び４時間目に５００μｌ ＨＢＳＳ緩衝液の入った基底外側リザーバから培地４００μｌを採取した。

結果
ｈＦｃＲｎ結合が促進または抑制された、単一点変異をＣ末端ＤＩＩＩ内に有する工学操作された各種のＨＳＡ改変体を作製した。このようなＨＳＡ改変体は、ｈＦｃＲｎ−ＨＳＡ複合体のドッキングモデルの評価（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３，６１０ ２０１２）に基づき構築された。ここで、単一点変異または変異の組み合わせによりｈＦｃＲｎへの結合にどのような影響があるのかを調べるため、変異を選択してＨＳＡのＤＩＩＩに導入した。さらに、変異改変体のいくつかとＩ５２３Ｇを組み合わせた（ＷＯ２０１２１１２１８Ａ１；参照によりその全体が本明細書に組み入れられたものとする）。

５個の単一変異体；Ｅ５０５Ｑ（ＥＱ）、Ｔ５２７Ｍ（ＴＭ）、Ｉ５２３Ｇ（ＩＧ）、Ｋ５７３Ｙ（ＫＹ）、及びＫ５７３Ｐ（ＫＰ）、及びこれらの変異１０（表１に記載のとおり）をＨＳＡのＤＩＩＩ内に導入した。ＷＴ ＨＳＡの作製に加え、ｈＦｃＲｎ結合を大幅に低下させたことが先に示されている２点変異の組み合わせ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２、前掲）に基づく二重変異体Ｋ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑ（ＫＡ／ＨＱ）を複数作製した。変異アミノ酸を図２のＨＳＡ結晶構造図で強調表示している。

図２は、ＨＳＡの結晶構造を示す。ＨＳＡのＤＩＩＩ内における変異アミノ酸位置の構造上の位置。図はＨＳＡの全体的な構造アーキテクチャを示す。ＤＩ−ＤＩＩ及びＤＩＩＩはそれぞれ灰色及び明灰色で示され、変異位置Ｋ５００Ａ（ＫＡ）、Ｈ５１０Ｑ（ＨＱ）（ＫＡ／ＨＱ）、Ｅ５０５Ｑ（ＥＱ）、Ｔ５２７Ｍ（ＴＭ）Ｉ５２３Ｇ（ＩＧ）、Ｋ５７３Ｙ（ＫＹ）、及びＫ５７３Ｐ（ＫＰ）は色付きの球形で強調表示されている。図は、ＨＳＡ５の結晶構造データ及びＰｙＭＯＬプログラムを使用して作成した。

図３は、Ｃ末端に抗原を融合させたアルブミンを構築するためのクローニングカセット概略図を示す。完全長アルブミンをコードするｃＤＮＡを制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ内にサブクローニングし、ＤＩＩＩセグメントのみをコードするｃＤＮＡ断片を制限部位ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ上にサブクローニングした。ＤＩＩＩサブクローニングできるようサイレント変異によりＢａｍＨＩ制限部位をアルブミンｃＤＮＡ配列に導入した。ＧＳ−リンカー配列をアルブミンをコードするｃＤＮＡと融合ＧＳＴタンパク質の間に導入した。抗原をコードするｃＤＮＡを制限部位ＸｈｏＩ及びＡｐａＩ上にサブクローニングした。

図４は、精製アルブミン−ＧＳＴ改変体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（Ａ）ＨＳＡ−ＧＳＴ改変体及び（ＭＳＡ−ＧＳＴ改変体）の代表的非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析。各改変体３μｇをゲルに塗布した。ＨＳＡ及びＭＳＡ改変体をＨＥＫ２９３Ｅ細胞の一過的トランスフェクションにより作製した。完全長改変体の他に、ｈＦｃＲｎ１を結合しないことが先に示されている、ほぼ全ＤＩＩＩを欠失している切断型ＨＳＡ改変体（Ｂａｒｔｉｎ）を含めた。回収した上清をプールし、ろ過してからＧＳＴｒａｐ ＦＦカラムに通した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して精製改変体の完全性を分析し、その後、クマシー染色を行った。分子量が約７０ｋＤａで移動したＨＳＡ Ｂａｒｔｉｎを除き、すべての改変体は１００〜１１０ｋＤａに相当する主バンドとして移動し、いずれも予想分子量にしたがっていた。

アルブミン融合体の酸性ｐＨでの結合能を比較するため、ウサギＩｇＧ上に捕捉したｈＦｃＲｎに滴定量の正規化ＨＳＡ−ＧＳＴ改変体を加え、ＨＲＰ結合ヤギ由来抗ＧＳＴ抗体を用いて結合したアルブミン改変体を検出した（図５Ａ〜Ｄ）。ｈＦｃＲｎへの結合を、ＷＴ ＨＳＡの結合を１．０に設定して計算した（図５Ｃ）。単一点変異体では、ＥＱ、ＩＧ及びＴＭは、ＷＴより２〜３倍高い中程度の結合改善を示し、続く、ＫＰ及びＫＹはＷＴより５倍強く結合した。２または３か所の変異を組み合わせた結果、さらなる結合が獲得され、ＫＰ／ＩＧ、ＫＹ／ＥＱ／ＴＭ及びＫＹ／ＩＧ／ＴＭの各変異体は、ＫＹと比較してわずかな結合改善を示し、それにＫＹ／ＩＧ及びＫＰ／ＩＧ／ＴＭが続く一方、最も強い結合はＫＹ／ＴＭ、ＫＰ／ＴＭ及びＫＰ／ＥＱ／ＴＭで検出され、結合強度で６倍の改善が示された。したがって、単一変異体のうちＫＹ及びＫＰは最も強く結合し、これらとＴＭ及びＥＱとの組み合わせで最良の結合体が得られた。

アルブミン融合体の酸性ｐＨでの結合能を比較するため、ウサギＩｇＧ上に捕捉した（図６Ａ）ｈＦｃＲｎ及び（図６Ｂ−Ｄ）ｍＦｃＲｎに滴定量の正規化ＭＳＡ及びＨＳＡ−ＧＳＴ改変体を加え、結合したアルブミン改変体をヤギ由来ＨＲＰ結合抗ＧＳＴ抗体を用いて検出した。

ｈＦｃＲｎ（図６Ａ）及びｍＦｃＲｎ（図６Ｂ−Ｄ）への結合を、ＷＴ ＭＳＡの結合を１．０に設定して計算した（図７）。ＫＰは、ｈＦｃＲｎに対しＭＳＡより３倍強い結合を示し、受容体はＨＳＡよりＭＳＡに強く結合した。ＨＳＡ及びＭＳＡ ＫＡ／ＨＱ変異体はｈＦｃＲｎにもｍＦｃＲｎにも結合しなかった。さらに、ＨＳＡに対するｍＦｃＲｎの検出可能な結合は認められなかった。単一点変異体では、ｍＦｃＲｎにＭＳＡより強く結合したものはなく、ＫＰとＩＧを組み合わせたことにより、ＷＴ ＭＳＡより２倍高い中程度の結合改善がもたらされた。さらに、以下の組み合わせ、ＫＰ／ＴＭ、ＫＰ／ＩＧ／ＴＭ、及びＫＰ／ＥＱ／ＴＭでは、ＷＴ ＭＳＡと比較して相対的な結合で４〜６倍の改善を獲得した。

センサーグラムにより（図８）、酸性ｐＨでのｈＦｃＲｎへの結合において大きな差が示された。結合曲線を１：１結合モデルにフィットさせ、得られた結合動態は表２に記載されている。ここで、ＧＳＴに融合させても、ｈＦｃＲｎへの結合には非常に軽微な負の影響があるだけであることが示され、先の結果（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ａｕｇ １６；２８８（３３）：２４２７７−８５）と一致していた。ＥＱ及びＩＧの各変異体は、対応するＷＴより６倍以上良好にｈＦｃＲｎに結合することが示され、ＩＡはこれらの変異体とほぼ同程度で良好に結合した。さらに、ＫＰ変異体は結合が１４倍改善され、三重変異体ＥＱ／ＴＭ／ＫＰでは１８０倍以上に相当する最も大きな改善が示された。

ＦｃＲｎが上皮関門を横切ってＩｇＧを輸送する能力は十分に確立されている（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；ＭｃＣａｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。しかしながら、上皮細胞に発現したＦｃＲｎがＨＳＡを輸送できるか否かについては、明らかにされていない。したがって、内因性ｈＦｃＲｎを発現する上皮層を横切ってＦｃＲｎ依存的にＨＳＡが輸送され得るのか否かを調べるため、トランスウェルシステムを使用してＦｃＲｎ介在性のＩｇＧ輸送を測定した。まず、ＷＴ ＨＳＡとＫＡ／ＨＱを比較し、これらの等量を、ヒト上皮細胞株Ｔ８４を極性単層として増殖させたトランスウェルシステムの頂端膜リザーバに加えた。試料を、頂端膜側への付加から０時間及び４時間の各測定時点で基底外側リザーバから採取した。融合体を抗ＧＳＴ抗体に捕捉させたＥＬＩＳＡを使用して輸送されたＨＳＡ融合体を定量し、結合した融合体をＨＲＰ結合抗ＨＳＡ抗体を使用して検出した。輸送有効性で著しい差が検出され、ｈＦｃＲｎへの結合が欠失している二重変異体より５倍多いＷＴ融合体が輸送されていた（図９）。したがって、これらのデータは、ヒト上皮に発現するＦｃＲｎが細胞層を横切ってＨＳＡを経細胞輸送する能力があることを強く支持している。

次に、ｈＦｃＲｎへの結合が改善されたＨＳＡ改変体は、その対応するＷＴよりも効率的に経細胞輸送されたのか否かを評価した。ＫＰ単一変異を導入することにより輸送の有効性がＷＴに比べてほぼ３倍上昇したことがわかった（図９）。

実施例２
ｈＦｃＲｎへの結合が促進された、Ｃ末端ＤＩＩＩ内に点変異を有する工学操作したＨＳＡ改変体であった。ＨＳＡ改変体を、ｈＦｃＲｎ−ＨＳＡ複合体１及びＶ５４７のドッキングモデルの評価に基づき構築した（バイオ製薬企業１１社による記載（ＷＯ２０１３０７５０６６ Ａ２）。ここで、変異の組み合わせによりｈＦｃＲｎへの結合にどう影響するかを調べるため、変異の組み合わせをＨＳＡのＤＩＩＩ内に導入した。

材料及び方法
アルブミン改変体をコードする発現ベクターの構築
ＧＳＴをコードするｃＤＮＡセグメントに融合させた、ヒト血清アルブミン改変体をコードするｃＤＮＡのクローニングに、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。先に記載があるように、全ベクターとも、エプスタイン−バーウイスルの複製起点（ＯｒｉＰ）もコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０、前掲；Ｂｅｒｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．、前掲）。ＨＳＡ遺伝子をコードするｃＤＮＡ断片はいずれもＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ（ＮＪ，ＵＳＡ）社に依頼しｐＵＣ５７ベクター内に得たものである。ｐＵＣ５７ベクター両端に制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩを隣接させた。アミノ酸のグリシン−セリン（ＧＳ）伸長部をコードするＤＮＡ配列（（ＧＧＳ）４ＧＧ）のＮ末端にＧＳＴ配列を融合させた。ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＳＡｗｔ−ＧＳＴ−ＯｒｉＰについては、先に記載がある（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０、前掲）。

アルブミン改変体の作製
接着性ＨＥＫ２９３Ｅ細胞の一過的トランスフェクションをポリエチレンイミンを使用して行った（ＰＥＩＭａｘ；ＭＷ ４０００；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）。トランスフェクションに先立ち、細胞をＴ１７５ボトル（５０ ｍｌ）内で９５％コンフルエントな状態まで増殖させた。６２．５μｇのプラスミドＤＮＡを、３．７５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（溶液１）及び２５μｌのＰＥＩ−ＭＡＸ（６．４５ｍｇ／ｍｌ）及び３．７５ｍｌのｄＨ２Ｏと混合した。次いで、溶液１及び２を混合した後、室温で３０分間インキュベーションを行ってから、播種した細胞に混合物を加えた。トランスフェクション後２日ごとに最高１２日まで上清を回収した。

ＧＳＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を使用して、ＧＳＴタグの付いたＨＳＡ改変体を精製した。カラムをＢｉｏＬｏｇｉｃワークステーション及びレコーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に連結し、製造者のプロトコルに従って精製を行った。簡単に言えば、１００ｍｌの１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．２）を使用してカラムの予備平衡を行ってから、０．２２μｍ吸引フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用い０．０５％アジ化ナトリウムを流量１〜２ｍｌ／分で用いて上清を滅菌ろ過した。その後、２００ｍｌの１×ＰＢＳ／０．０５％アジドを添加して非特異的結合物を洗い流した。結合したＨＳＡ−ＧＳＴ融合体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に希釈した１０ｍＭ還元型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５０ｍｌで溶出させた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、溶出した画分を採取し、再濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）して１×ＰＢＳ／０．０５％アジドに緩衝液を交換した。全画分を濃度０．５〜１ｍｇ／ｍｌで−２０℃にて保存した。カラムを洗浄し２０％エタノールに４℃で保存した。

ヒトＦｃＲｎの作製
本質的には先に記載があるように（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、前掲；Ｐｏｐｏｖ ｅｔ ａｌ．、前掲）、切断型単量体のＨｉｓタグの付いたヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）をバキュロウイルス発現ベクター系を使用して作製した。Ｎｉ^２＋イオンが供給されたＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を使用して受容体を精製した。カラム使用前に、０．０５％アジ化ナトリウム含有１×ＰＢＳでカラムの予備平衡を行った。上清のｐＨを１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ１０．９）を用いてｐＨ７．２に調整してから、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムに流量５ｍｌ分^−１で添加した。２００ｍｌの１×ＰＢＳに続き５０ｍｌの２５ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳで洗浄後、結合した受容体を５０ｍｌの２５０ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）で溶出させた。タンパク質を、Ａｍｉｃｒｏｎ Ｕｌｔｒａ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して再濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）し１×ＰＢＳに緩衝液を交換してから、製造者のプロトコルに従いＨｉＬｏａｄ２６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００プレップグレードカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、溶出した画分をプール及び再濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）し、４℃で保存した。

表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）
ＳＰＲによる実験をＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施し、アミンカップリング（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＧＳＴ融合ＨＳＡをＣＭ５チップに固定化した。本質的に製造者による記載のとおり、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に２μｇ／ｍｌずつ注入した。チップ表面の未反応部分を１Ｍエタノールアミンでブロックした。実験は、ランニング試料または希釈試料いずれにもリン酸緩衝液（６７ｍＭリン酸緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）（ｐＨ６．０または７．４）を用いて行った。動態測定は、Ｈｉｓタグの付いた単量体ｈＦｃＲｎの系列希釈（１．０〜０．０１５μＭ）を、固定化したＨＳＡ改変体にｐＨ６．０、２５℃にて流量５０μｌ／分で注入して実施した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアで提供される簡便なラングミュア１：１リガンド結合モデルを使用して反応速度値を計算した。平均二乗を表す統計データχ^２で表記されるフィッティングの近似性は、すべての親和性推定値において２．０以下であった。非特異的結合及び大量の緩衝液作用を補正するため、対照群であるＣＭ５表面及びブランク注射から得た結合応答を各相互作用曲線から引いた。

結果

ＨＳＡ改変体をチップに固定化し（約５００ＲＵ）、ｈＦｃＲｎの系列希釈を注入した。反応速度定数は、簡便な一次（１：１）二分子間相互作用モデルを使用して得た。反応速度値は、三連測定の平均値である。結果を、表３及び図１０に示す。

Ｋ５７３Ｐと組み合わせたＶ５４７Ａでは、ｐＨ６．０において、ＷＴ ＨＳＡより２００倍以上ＫＤが改善され、極めてｐＨ依存的に結合する。

Ｅ５０５Ｑ、Ｔ５２７Ｍ及びＫ５７３Ｐと組み合わせたＶ５４７Ａでは、ＷＴ ＨＳＡより１４００倍以上ＫＤが改善されたが、結合のｐＨ依存性は低めである。

目標アミノ酸残基は、図２中ＨＳＡの結晶構造図で強調表示されている。

実施例３
ｈＦｃＲｎ結合性が改変されたＨＳＡ改変体の設計
ｈＦｃＲｎ結合が促進または抑制された、単一点変異をＣ末端ＤＩＩＩ内に有する工学操作された各種のＨＳＡ改変体を作製した。このようなＨＳＡ改変体は、ｈＦｃＲｎ−ＨＳＡ複合体のドッキングモデルの評価（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３，６１０ ２０１２）に基づき構築された。ここで、単一点変異または変異の組み合わせによりｈＦｃＲｎへの結合にどのような影響があるのかを調べるため、変異を選択してＨＳＡのＤＩＩＩに導入した。さらに、変異改変体のいくつかを、Ｉ５２３ＧまたはＶ５４７Ａと組み合わせた（ＷＯ２０１２１１２１８Ａ１及びＷＯ２０１３０７５０６６Ａ２；参照によりその全体が本明細書に組み入れられたものとする）。

６個の単一変異体、すなわち、Ｅ５０５Ｑ（ＥＱ）、Ｔ５２７Ｍ（ＴＭ）、Ｉ５２３Ｇ（ＩＧ）、Ｖ５４７Ａ（ＶＡ）Ｋ５７３Ｙ（ＫＹ）、及びＫ５７３Ｐ（ＫＰ）、並びにこれらを組み合わせた１０の変異（表４に記載のとおり）をＨＳＡのＤＩＩＩ内に導入した。ＷＴ ＨＳＡの作製に加え、ｈＦｃＲｎ結合を大幅に低下させたことが先に示されている２点変異の組み合わせ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２、前掲）に基づき二重変異体Ｋ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑ（ＫＡ／ＨＱ）を複数作製した。変異アミノ酸を図２のＨＳＡ結晶構造図で強調表示している。

ＨＳＡ改変体をコードする発現ベクターの構築
ＧＳＴタグをコードするｃＤＮＡセグメントに融合させた、ＨＳＡ改変体をコードするｃＤＮＡのクローニングに、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。先に記載があるように、全ベクターとも、エプスタイン−バーウイスルの複製起点（ＯｒｉＰ）もコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，３６７−３７２； Ｂｅｒｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２９８，９３−１０４）。ＨＳＡ遺伝子をコードするｃＤＮＡ断片はいずれもＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ（ＮＪ，ＵＳＡ）社に依頼しｐＵＣ５７ベクター内に得たものである。ｐＵＣ５７ベクター両端に制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩを隣接させた。アミノ酸のグリシン−セリン（ＧＳ）伸長部をコードするＤＮＡ配列（（ＧＧＳ）４ＧＧ）のＮ末端にＧＳＴ配列を融合させた。ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＳＡｗｔ−ＧＳＴ−ＯｒｉＰ及びｐｃＤＮＡ３−ＨＳＡｂａｒｔｉｎ−ＧＳＴ−ＯｒｉＰは先に記載がある（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０、前掲）。

ＨＳＡ融合改変体
接着性ＨＥＫ２９３Ｅ細胞の一過的トランスフェクションをポリエチレンイミンを使用して行った（ＰＥＩＭａｘ；ＭＷ ４０００；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）。トランスフェクションに先立ち、細胞をＴ１７５ボトル（５０ ｍｌ）内で９５％コンフルエントな状態まで増殖させた。６２．５μｇのプラスミドＤＮＡを、３．７５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（溶液１）及び２５μｌのＰＥＩ−ＭＡＸ（６．４５ｍｇ／ｍｌ）及び３．７５ｍｌのｄＨ２Ｏと混合した。次いで、溶液１及び２を混合した後、室温で３０分間インキュベーションを行ってから、播種した細胞に混合物を加えた。トランスフェクション後２日ごとに最高１２日まで上清を回収した。

ＧＳＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を使用して、ＧＳＴタグの付いたＨＳＡ改変体を精製した。カラムをＢｉｏＬｏｇｉｃワークステーション及びレコーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に連結し、製造者のプロトコルに従って精製を行った。簡単に言えば、１００ｍｌの１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．２）を使用してカラムの予備平衡を行ってから、０．２２μｍ吸引フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用い０．０５％アジ化ナトリウムを流量１〜２ｍｌ／分で用いて上清を滅菌ろ過した。その後、２００ｍｌの１×ＰＢＳ／０．０５％アジドを添加して非特異的結合物を洗い流した。結合したＨＳＡ−ＧＳＴ融合体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に希釈した１０ｍＭ還元型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５０ｍｌで溶出させた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、溶出した画分を採取し、再濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）して１×ＰＢＳ／０．０５％アジドに緩衝液を交換した。全画分を濃度０．５〜１ｍｇ／ｍｌで−２０℃にて保存した。カラムを洗浄し２０％エタノールに４℃で保存した。

ヒトＦｃＲｎの作製
切断型単量体のＨｉｓタグの付いたｈＦｃＲｎを、本質的には先に記載があるように（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２９，２８１９−２８２５；Ｐｏｐｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３，５２１−５３０）バキュロウイルス発現ベクター系を使用して作製した。Ｎｉ^２＋イオンが供給されたＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を使用して受容体を精製した。カラム使用前に、０．０５％アジ化ナトリウム含有１×ＰＢＳでカラムの予備平衡を行った。上清のｐＨを１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ１０．９）を用いてｐＨ７．２に調整してから、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムに流量５ｍｌ分^−１で添加した。２００ｍｌの１×ＰＢＳに続き５０ｍｌの２５ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳで洗浄後、結合した受容体を５０ｍｌの２５０ｍＭイミダゾール／１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）で溶出させた。タンパク質を、Ａｍｉｃｒｏｎ Ｕｌｔｒａ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して再濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）し１×ＰＢＳに緩衝液を交換してから、製造者のプロトコルに従いＨｉＬｏａｄ２６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００プレップグレードカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、溶出した画分をプール及び再濃縮（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）し、４℃で保存した。

酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸（１０μｇ／ｍｌ）に対する特異性を有する抗ヒトＩｇＧ１変異改変体（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ）をマイクロタイターウェル（Ｎｕｎｃ）にコーティングして、ＧＳＴ融合ＨＳＡ改変体のスクリーニングを行った。プレートを４℃で一晩インキュベートしてからウェルをＰＢＳ／４％スキムミルクで１時間室温にてブロックし、その後、ＰＢＳ／Ｔ（ｐＨ６．０）で４回洗浄した。Ｈｉｓタグの付いたｈＦｃＲｎ（２０μｇ／ｍｌ）の一定量をＰＢＳ／Ｔ／４％スキムミルク（ｐＨ６．０）に希釈し、ウェルに加え、２時間室温でインキュベートしてからウェルを上記のように洗浄した。続いて、５μｇ／ｍｌのＧＳＴタグ付きＷＴ ＨＳＡ及び変異改変体をＰＢＳ／Ｔ／４％スキムミルク（ｐＨ６．０）で希釈し、ウェルに室温で２時間加えた。上記のように洗浄した後、ＰＢＳ／Ｔ／４％スキムミルク（ｐＨ６．０）に希釈した（１：３０００）ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ＧＳＴ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を次に加え、１時間インキュベートした。洗浄後、結合したＨＳＡ改変体を、テトラメチルベンジジン基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して検出した。Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計（ＴＥＣＡＮ）を使用して６２０ｎｍで吸光を測定した。

表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）
ＳＰＲによる実験をＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施し、アミンカップリング（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＧＳＴ融合ＨＳＡ改変体をＣＭ５チップに固定化した。本質的に製造者による記載のとおり、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に２μｇ／ｍｌずつ注入した。チップ表面の未反応部分を１Ｍエタノールアミンでブロックした。実験は、ランニング試料または希釈試料いずれにもリン酸緩衝液（６７ｍＭリン酸緩衝液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）（ｐＨ６．０または７．４）を用いて行った。動態測定は、Ｈｉｓタグの付いた単量体ｈＦｃＲｎの系列希釈（１．０〜０．０１５μＭ）を、固定化したＨＳＡ改変体にｐＨ６．０、２５℃にて流量５０μｌ／分で注入して実施した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアで提供される簡便なラングミュア１：１リガンド結合モデルを使用して反応速度値を計算した。平均二乗を表す統計データχ^２で表記されるフィッティングの近似性は、すべての親和性推定値において５．０以下であった。非特異的結合及び大量の緩衝液作用を補正するため、対照群であるＣＭ５表面及びブランク注射から得た結合応答を各相互作用曲線から引いた。

カルボキシル基でコーティングされたＭｏｌｄａｙ ＩＯＮに対するＨＳＡ改変体のカップリング
１，５ｍｌ ＣＬ−３０Ｑ０２−ＣＡ（５ｍｇ Ｆｅ／ｍｌ）（ＢｉｏＰａｌ）を、１００ＭＷＣＯスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）に緩衝液交換を行った。カルボキシル基の活性化を、ＥＤＣ及びＮＨＳ溶液（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をそれぞれ６００μｌ及び９００μｌ加え、その後、回転ホイール上で室温にて２０分インキュベーションして行った。未反応試薬を除去するため、カラム製造者の使用法に従って５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化されたＮＡＰ−Ｇ−２５カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に活性化した粒子を通した。ＣＬ−３０Ｑ０２−ＣＡの１ｍｌあたり２ｍｇのＨＳＡ改変体（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶解）を使用し、混合後、回転ホイール上で室温にて１２０分インキュベートした。続いて、カップリングした粒子の緩衝液を１００ＭＷＣＯスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で１×ＰＢＳ／０．０５％アジドに交換し、４℃で保存した。

Ｔ８４経細胞輸送アッセイ
ヒト上皮細胞株Ｔ８４（ＡＴＣＣ）を、１０％熱非働化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌｇ及び５０Ｕ／ｍｌ ＰＳ（いずれもＢｉｏ−Ｗｉｔｔａｋｅｒ製）を添加した、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＨａｍ Ｆ−１２培地（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に維持した。細胞を、ＣＯ_２５％、空気９５％の加湿インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。ＰＴＦＥメンブレンを備えた細孔径０．４μｍのトランスウェルフィルター（１．１２ｃｍ^２）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）を載せ、発育培地内でインキュベートしてから１．０ｘ１０^６細胞／ウェルを播種した。経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）をＭＩＬＬＩＣＥＬＬ−ＥＲＳボルト−オームメーター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用して連日測定した。ＴＥＲ値が１０００〜１５００Ωｘｃｍ^２に達するまで４〜６日間細胞を培養した。発育培地を連日交換した。

実験に先立ち、Ｔ８４の単層を洗浄し、Ｈａｎｋ ＨＢＳＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で１時間インキュベートした。頂端膜から基底外側への輸送を測定するため、２００μｌの正規化ＨＳＡ改変体（２０〜３０μｇ／ｍｌ）またはＭｏｌｄａｙ ＩＯＮにカップリングしたＨＳＡ改変体（１００μｌ／ｍｌ、１Ｍ ＭＥＳでｐＨ６．０に調整）を頂端膜側に加えた後、０時間及び４時間目に５００μｌ ＨＢＳＳ緩衝液の入った基底外側リザーバから培地４００μｌを採取した。反対方向への輸送を測定するアッセイでは、５００μｌのＨＳＡ（８μｇ／ｍｌ）を基底外側に加え、その後、０時間及び４時間目に２００μｌ ＨＢＳＳ緩衝液の入った頂端膜リザーバから培地１５０μｌを採取した。

Ｔ８４細胞を横切って輸送されたＨＳＡ改変体及び複合体ＥＬＩＳＡを使用して定量した。既知濃度のＨＳＡ改変体を標準として使用した。ヤギ由来抗ＧＳＴ抗体（１：５０００に希釈）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはヤギ由来抗ＨＳＡ抗体（１：２０００に希釈）（Ｓｉｇｍａ）を１×ＰＢＳに入れ、９６ウェルＮＵＮＣプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次に、２００μｌの４％Ｓ／ＰＢＳを使用してウェルを１時間ブロックしてからＰＢＳ／Ｔで４回洗浄し、その後、Ｓ／Ｔ／ＰＢＳに希釈した滴定量の回収培地を加えた。プレートを室温で１時間インキュベートしてから上記のように洗浄した。続いて、Ｓ／Ｔ／ＰＢＳ中に１：５０００で希釈したマウス由来ＨＲＰ結合抗ＨＳＡ抗体（Ａｂｃａｍ）を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄してから３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（Ｍｅｒｃｋ）１００μｌを加えた。Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計（ＴＥＣＡＮ）を使用して吸光を６２０ｎｍで測定した。

結果
中性ｐＨにおけるＨＳＡ融合体の結合能を比較するため、正規化ＨＳＡ−ＧＳＴ改変体をヒトＩｇＧ変異体上に捕捉したｈＦｃＲｎに加え、結合したＨＳＡ−ＧＳＴ改変体を、ヤギ由来ＨＲＰ結合抗ＧＳＴ抗体を使用して検出し（図１１Ｆ）、これにより、変異改変体は中性ｐＨでは１つも受容体に結合しなかったことが示された（図１１）。

酸性ｐＨにおけるＨＳＡ融合体の結合能を比較するため、正規化ＨＳＡ−ＧＳＴ改変体の滴定量をヒトＩｇＧ変異体上に捕捉したｈＦｃＲｎに加え、結合したＨＳＡ−ＧＳＴ改変体を、ヤギ由来ＨＲＰ結合抗ＧＳＴ抗体を使用して検出した。ｐＨ６．０において、ＫＰ及びＶＡは同程度に良好で、ＷＴよりかなり良好に結合し、ＫＰ／ＶＡの組み合わせはさらに結合が向上していたが、ＫＰ／ＥＱ／ＴＭ／ＶＡはすべての変異体のうち最も強く結合した。中性ｐＨにおいて、強く結合したＫＰ／ＥＱ／ＴＭ／ＶＡを除いては検出可能な結合を見せた変異改変体はなかった。

内因性ｈＦｃＲｎを発現する上皮層を横切ってＦｃＲｎ依存的にＨＳＡが輸送され得るのか否かを調べるため、トランスウェルシステムを使用してＦｃＲｎ介在性のＩｇＧ輸送を測定した。まず、融合されていないＷＴ ＨＳＡ及びＫＰの輸送を双方向で測定した。効率的輸送は、頂端膜から基底外側方向のみで、ＷＴより多量のＫＰ輸送が示された（図１５）。基底外側から頂端膜方向では、輸送されたＫＰ改変体は少量しか認められず、ＷＴは全く検出されなかった（図１３）。

さらに、ＷＴ ＨＳＡ−ＧＳＴをＫＡ／ＨＱ−ＧＳＴと比較し、これらを等量ずつトランスウェルシステムの頂端膜リザーバに加えた。頂端膜側への付加から０時間及び４時間の各測定時点で基底外側リザーバから試料を採取した。融合体を抗ＧＳＴ抗体に捕捉させたＥＬＩＳＡを使用して輸送されたＨＳＡ融合体を定量し、結合した融合体をＨＲＰ結合抗ＨＳＡ抗体を使用して検出した。輸送有効性で著しい差が検出され、ｈＦｃＲｎへの結合が欠失している二重変異体（ＫＡ／ＨＱ）より５倍多いＷＴ融合体が輸送されていた（図１４）。したがって、これらのデータは、ヒト上皮に発現するＦｃＲｎは、細胞層を横切ってＨＳＡを経細胞輸送する能力があることを強く支持している。次に、ｈＦｃＲｎへの結合が改善されたＨＳＡ改変体（ＫＰ）が対応するＷＴより効率的に経細胞輸送されるか否かを評価した（図１４）。ＫＰ単一変異を導入することにより輸送の有効性がＷＴに比べてほぼ３倍上昇したことがわかった（図１６）。単一変異体ＥＱ及びＴＭはＷＴよりも効率的に輸送されたがＫＰには及ばず、また、ＫＰ／ＴＭ／ＥＱの組み合わせではＫＰに対し約２倍の輸送向上がもたらされた（図１４）。

次に、頂端膜から基底外側へのＶＡの経細胞輸送と、ＫＰ／ＶＡ及びＫＰ／ＴＭ／ＥＱ／ＶＡとを比較したところ、ＫＰ／ＶＡはＶＡより３倍効率的に輸送されたが（図１５）、両ｐＨ条件で強く結合するＫＰ／ＴＭ／ＥＱ／ＶＡは輸送されなかったことがわかった（図１５）。

次に取り組んだのは、ＨＳＡに結合したＮＰが極性細胞層を横切って往復できるのか否かということであった。ＷＴ ＨＳＡ及びＫＡ／ＨＱを、ＦｃＲｎの結合部位から遠位にあるＤＩ内の遊離システイン残基を介して部位特異的にＮＰに結合させた。ＮＰを頂端膜側に加え、細胞を横切って輸送され基底外側に放出された量を定量したところ、ＷＴ ＨＳＡに結合したＮＰがＫＡ／ＨＱより２倍多く輸送されたことが示された（図１６）。

上記明細書で言及されたすべての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、記載にある本発明の方法及びシステムのさまざまな変更及び変形は当業者に明らかとなろう。本発明は具体的な好ましい実施形態と関連させて記載されているが、主張される本発明がこのような具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されるべきである。事実、関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するための記載方法の各種変更は、以下の請求項の範囲内であることが意図される。

Claims (12)

1. 野生型のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）より高い親和性でＦｃＲｎに結合する、少なくとも１個の改変型アミノ酸を含む改変型のＨＳＡまたはＭＳＡポリペプチドであって、
   配列番号１の５４７位、５７３位、５２３位、５２７位、５００位、及び５０５位またはＭＳＡの５００位若しくは５１０位のアミノ酸の１またはそれ以上の位置に置換を有し、
   前記置換が、配列番号１のＫ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ、Ｖ５４７Ａ／Ｋ５７３Ｐ、Ｖ５４７Ａ／Ｅ５０５Ｑ／Ｋ５７３Ｐ／Ｔ５２７Ｍ、及びＫ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑ、ならびに野生型ＭＳＡのＫ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑからなる群から選択されるポリペプチド。
2. 前記置換が、配列番号１のＫ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｙ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｙ／Ｔ５２７Ｍ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ、Ｋ５７３Ｐ／Ｉ５２３Ｇ／Ｔ５２７Ｍ、及びＫ５７３Ｐ／Ｅ５０５Ｑ／Ｔ５２７Ｍからなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記置換が、配列番号１のＶ５４７Ａ／Ｋ５７３Ｐ及びＶ５４７Ａ／Ｅ５０５Ｑ／Ｋ５７３Ｐ／Ｔ５２７Ｍからなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
4. 前記置換が、配列番号１のＫ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑ、及び野生型ＭＳＡのＫ５００Ａ／Ｈ５１０Ｑからなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
5. ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド、及びｂ）複合体を含む、融合タンパク質。
6. 前記複合体が免疫原である、請求項５に記載の融合タンパク質。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする、核酸。
8. 請求項７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
9. 請求項５または６に記載の融合タンパク質及び薬理学的に許容される担体を含む、ワクチン組成物。
10. 被検体に免疫応答を引き起こすための、請求項９に記載のワクチン組成物。
11. 被検体の粘膜表面に送達される、請求項１０に記載のワクチン組成物。
12. 経鼻または吸入を介して送達される、請求項１１に記載のワクチン組成物。

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