KR20160072257A - 알부민 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 개선된 친화성을 갖는 알부민 변이체 및 이의 용도 및특히 면역원에 대한 담체로서 상기 알부민 변이체의 용도에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 알부민/면역원 융합 단백질을 포함하는 백신(예를 들어, 점막 전달용 백신)에 관한 것이다.

Description

알부민 변이체 및 이의 용도{ALBUMIN VARIANTS AND USES THEREOF}
본 발명은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 개선된 친화성을 갖는 알부민 변이체 및 이의 용도 및특히 면역원에 대한 담체로서 상기 알부민 변이체의 용도에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 알부민/면역원 융합 단백질을 포함하는 백신(예를 들어, 점막 전달용 백신)에 관한 것이다.
알부민은 이것이 가장 풍부한 단백질인 포유동물의 혈장에서 천연적으로 발견되는 단백질이다. 이것은 혈액의 목적하는 삼투압을 유지하고 또한 혈류에서 다양한 물질을 수송하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 알부민은 인간, 돼지, 마우스, 래트, 토끼 및 염소를 포함하는 많은 종으로부터 특징 분석되었고 상이한 공급원으로부터 기원하는 알부민은 고도의 구조적 관계를 공유하는 것으로 밝혀졌다.
알부민은 생체내에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하고 이러한 상호작용은 알부민의 혈장 반감기를 위해 중요한 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Chaudhury 등 2003; Montoyo 등, 2009). FcRn은 막 결합된 단백질이고 세포내 분해로부터 IgG 뿐만 아니라 알부민을 구제하는 것으로 밝혀졌다(문헌참조: Roopenian D. C. and Akilesh, S. (2007), Nat.Rev. Immunol 7, 715-725.). 따라서, FcRn은 인간과 같은 포유동물의 혈청에서 고수준의 IgG 및 알부민을 유지하는데 기여하는 이기능성 분자이다.
FcRn-IgG 상호작용은 선행 기술분야에 특징 분석되었지만, FcRn-알부민은 훨씬 덜 특징 분석되었다. 데이터는 IgG 및 알부민이 비협력적으로 FcRn의 독특한 부위에 결합함을 지적했다(문헌참조: Andersen 등 (2006), Eur. J. Immunol 36, 3044-3051; Chaudhury 등 (2006), Biochemistry 45, 4983-4990). 마우스 FcRn은 마우스 및 인간으로부터 기원하는 IgG에 결합하는 반면, 인간 FcRn은 보다 차별적인 것으로 보이고(문헌참조: Ober 등 (2001) Int Immunol 13, 1551-1559) 마우스 IfG에 결합하지 않는다(문헌참조: Ober 등 (2001) Int Immunol 13, 1551-1559). 추가로, 인간 FcRn은 마우스와 인간 둘다로부터 기원하는 알부민에 결합하는 반면, 마우스 FcRn은 인간 알부민에 결합하지 않는다 (문헌참조: Andersen 등 (2010) JBC).
인간 혈청 알부민 (HSA)은 585개 아미노산의 폴리펩타이드로서 널리 특징 분석되었고, 이의 서열은 문헌(참조: Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications, Academic Press, Inc., Orlando)에서 찾을 수 있다. 이것은 pH 6.0에서는 결합하지만 pH 7.4에서는 결합하지 않는 이의 수용체 FcRn에 대한 특징적결합을 갖는다. HSA의 혈청 반감기는 대략 19일인 것으로 밝혀졌다. 보다 낮은 혈장 반감기를 갖는 천연 변이체가 동정되었고(문헌참조: Biochim Biophys Acta. 1991, 1097:49-54) 이는 D494N 치환을 갖는다. 상기 치환은 상기 변이체에서 N-당화 부위를 생성시켰고, 이는 야생형 HSA에 존재하지 않는다. 상기 당화 또는 아미노산 전하가 혈장 반감기의 변화에 관여하는지는 공지되어 있지 않다.
알부민은 긴 혈청 반감기를 갖고 이의 성질 때문에 이것은 약물 전달용으로 사용되어 왔다. 알부민은 약제학적으로 이로운 화합물에 접합되었고(WO0069902A), 접합체는 알부민의 긴 혈장 반감기를 유지시켜 수득한 접합체의 혈장 반감기는 일반적으로, 단독의 이로운 치료학적 화합물의 혈장 반감기 보다 상당히 긴 것으로 밝혀졌다.
추가로, 알부민은 치료학적으로 이로운 펩타이드에 융합되었고(문헌참조: WO 01/79271 A 및 WO 03/59934 A), 전형적인 결과는 상기 융합이 치료학적으로 이로운 펩타이드의 활성을 갖고 단독의 치료학적으로 이로운 펩타이드 보다 상당히 긴 혈장 반감기를 갖는다는 것이다.
알부민은 다수의 리간드에 결합하는 능력을 갖고, 이러한 성질은 알부민에 결합하는 능력을 갖는약물의 혈장 반감기를 연장시키기 위해 활용되어 왔다. 이것은 약제학적으로 이로운 화합물을 알부민 결합 성질을 갖는 모이어티에 결합시킴에 의해 성취되었다. 무엇이 형성된 접합체 또는 융합 폴리펩타이드의 혈장 반감기를 결정하는지는 불명확하지만 이는 알부민 및 이들이 구성되는 선택된 약제학적으로 이로운 화합물/펩타이드에 의해 제공되는 것으로 나타난다. 소정의 알부민 접합체 또는 알부민 융합 폴리펩타이드의 혈장 반감기를 조절하여 치료하고자 하는 징후의 특정 세부 사항에 따른 특정 약물 또는 백신을 디자인할 수 있기 위해 접합체/융합체의 성분에 의해 제공되는 것보다 길거나 짧은 혈장 반감기가 성취될 수 있도록 하는 것이 요구될 수 있다.
본 발명은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 개선된 친화성을 갖는 알부민 변이체 및 이의 용도 및 특히 면역원에 대한 담체로서 및 치료제로서 상기 알부민 변이체의 용도에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 알부민/면역원 융합 단백질을 포함하는 백신(예를 들어, 점막 전달용 백신)에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 야생형 HSA 또는 MSA에 상대적으로 증가된 친화성으로 FcRn에 결합하는 변이체 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 마우스 혈청 알부민(MSA)을 제공하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 10 이하, 5 이하 또는 1 이하의 Kd(예를 들어, 산성 조건하에서 측정시)로 FcRn에 결합한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 야생형 알부민 보다 높은 수준으로 양극화된 인간 세포를 횡단하여 수송된다(예를 들어, 양극화된 인간 세포 검정에서 4시간 후 ng/ml로 측정시). 일부 양태에서, 보다 높은 수준은 야생형 알부민 보다 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 10-배 높다. 일부 양태에서, 효율은 10ng/ml 초과(예를 들어, 15ng/ml 초과 또는 30ng/ml 초과)이다.
일부 양태에서, 상기 변이체 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 야생형 MSA와 적어도 80%, 90%, 또는 95% 동일하다. 일부 양태에서, 변이체 아미노산은 예를 들어, 서열번호 1의 K573Y, I523G, I253A, T527M, E505Q, K573P, K573Y/I523G, K573Y/I523G/T527M, K573Y/E505Q/T527M, K573Y/T527M, K573P/I523G, K573P/I523G/T527M, K573P/E505Q/T527M, K573P/T527M, V547A, V547A/K573P, V547A/E505Q/K573P/T527M 또는 K500A/H510Q, HSA의 도메인 III의 결실 또는 야생형 MSA의 K500A/H510Q 중 하나 이상이다.
일부 양태에서, 본 발명은 돌연변이 (예를 들어, 위치 573, 523, 527, 505 중 하나 이상에 상응하는 위치에서 치환 돌연변이), 또는 서열번호 1의 도메인 III 또는 MSA의 변이체를 포함하는 알부민 변이체, 이의 단편 또는 이의 융합체를 제공하고, 여기서, 상기 알부민은 야생형 알부민과 비교하여 hFcRn 또는 mFcRn에 대해 증가되거나 감소된 결합을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명은 알부민 변이체; 및 알부민의 아미노산에 접합된 면역원(예를 들어, 항원)의 융합 단백질을 제공한다. 일부 양태에서, 야생형 알부민과 비교하여 FcRn에 대한 변형된 결합은 증가된 결합 친화성이다. 일부 양태에서, 알부민 변이체는 서열번호 1의 K573Y, I523G, I253A, T527M, E505Q, K573P, K573Y/I523G, K573Y/I523G/T527M, K573Y/E505Q/T527M, K573Y/T527M, K573P/I523G, K573P/I523G/T527M, K573P/E505Q/T527M, K573P/T527M, K500A/H510Q, V547A, V547A/K573P, V547A/E505Q/K573P/T527M, 또는 도메인 III 결실이다. 일부 양태에서, 알부민 변이체는 MSA의 K500A/H510Q이다. 일부 양태에서, 면역원은 티올 그룹을 포함하는 아미노산에 공유적으로 부착된다.
일부 양태에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 알부민 변이체, 이의 단편 또는 이의 융합체-면역원융합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 알부민 변이체 또는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물(예를 들어, 백신 조성물)을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 점막 투여용 백신으로서 제형화된다.
일부 양태에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 알부민 변이체, 이의 단편 또는 이의 융합체, 및 면역원을 포함하는 융합 단백질을 대상체에게 투여함을 포함하는 대상체에서 면역 반응(예를 들어, 점막 면역 반응)을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 대상체를 치료하기 위한 상기된 바와 같은 알부민 변이체, 이의 단편, 이의 융합체 또는 이의 접합체 및 면역원을 포함하는 융합 단백질의 용도를 제공한다.
추가의 양태는 다음을 포함하는 백신 조성물을 제공한다: a) 야생형 알부민 폴리펩타이드 및 접합체(예를 들어, 면역원)을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 약제학적으로 허용되는 담체. 추가의 양태는 대상체가 면역원에 대한 면역 반응을 생성하도록 하는 조건하에서 상기 언급된 백신 조성물을 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법 및 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 백신 조성물은 에어로졸화된다. 일부 양태에서, 백신 조성물은 대상체의 점막 표면(예를 들어, 비강내)으로 전달된다.
추가의 양태가 본원에 기재되어 있다.
도 1은 서열번호 1, 야생형 HSA를 제공한다.
도 2 (A) 및 (B)는 돌연변이유발에 의해 표적화된 HSA 위치의 결정학적 실례를 보여준다.
도 3은 알부민 융합체의 생산을 위한 카세트 벡터 시스템을 보여준다.
도 4는 정제된 알부민-GST 변이체의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. (A) HSA-GST 변이체 및 B (MSA-GST 변이체)의 대표적인 비-환원 SDS-PAGE 겔 분석.
도 5는 HSA-GST 변이체의 hFcRn으로의 결합을 보여준다. (A-D) pH 6.0에서 WT HSA-GST 및 돌연변이 변이체의 hFcRn으로의 결합을 보여주는 ELISA 측정. (E) pH 6.0에서 HSA-GST 변이체의 hFcRn으로의 상대적 결합. 상대적 결합은 WT FcRn 결합이 1로 설정된 ELISA 결과(A-D)를 기준으로 계산하였다. 상기 결과들은 적어도 3개의 독립적 실험을 대표한다.
도 6은 MSA 및 HSA-GST 변이체의 hFcRn 및 mFcRn으로의 결합을 보여준다. pH 6.0에서 돌연변이 변이체 뿐만 아니라 WT HSA 및 MSA-GST 융합체의 (A) hFcRn 및 (B-D) mFcRn으로의 결합을 보여주는 ELISA 측정. pH 6.0에서 돌연변이 융합체 뿐만 아니라 WT HSA 및 MSA-GST 융합체의 hFcRn으로의 상대적 결합. pH 6.0에서 돌연변이 변이체 뿐만 아니라 WT HSA 및 MSA-GST 융합체의mFcRn으로의 상대적 결합. 상대적 결합은 WT가 1로 설정된 ELISA 결과를 토대로 계산하였다. 상기 결과들은 적어도 3개의 독립적 실험을 대표한다.
도 7은 MSA 및 HSA-GST 변이체의 hFcRn 및 mFcRn으로의 상대적 결합을 보여준다. (A) pH 6.0에서 MSA 및 HSA-GST 변이체의 (A) hFcRn 및 (B-D) mFcRn으로의 상대적 결합. 상대적 결합은 WT FcRn 결합이 1로 설정된 도 6에서의 ELISA 결과를 토대로 계산하였다. 상기 결과들은 적어도 3개의 독립적 실험을 대표한다.
도 8은 단량체 hFcRn의 고정화된 HSA 변이체로의 SPR 결합을 보여준다. 고정화된 (A) 비융합된 WT HSA (B) WT HSA-GST, (C), HSA-EQ-GST (D), HSA-IG-GST (E) HSA-IA-GST, (F) HSA-KP-GST 및 (G) HSA-EQ/TM/KP 상으로 주사된 적정량의 단량체 hFcRn의 결합. 결합 데이터는 BIAevaluation 소프트웨어가 구비된 1:1 랑무이르(Langmuir) 결합 모델에 피팅하였다. 평가된 결합 역학은 표 2에 요약한다.
도 9는 양극화된 인간 상피 세포 층을 횡단하도록 가공된 HSA 융합 변이체의 FcRn-매개된 트랜스사이토시스를 보여준다. 트랜스웰 시스템에서 성장한 양극화된 T84 세포의 정점에서 기저외측면으로 수송된 WT HSA, KA/HQ HSA 및 KP HSA 융합체 양의 ELISA 정량. 샘플은 기저외측 저장소로부터 0시간 및 4시간 시점에서 샘플을 수거하였고 트랜스사이토시스된양은 트랜스사이토시스된 ng/ml HSA로서 표현한다. 상기 결과는 4개의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 10은 단량체 hFcRn의 고정화된 HSA 변이체로의 SPR 결합을 보여준다. 고정화된 (A) V547A (1 μM-0.031 μM) (B) V547A/K573P (1 μM-0.031 μM) 및 (C) E505Q/T527M/V547A/K573P (0.25 μM- 3.9 μM) 상에 주사된 적정량의 단량체 hFcRn의 결합.
도 11 (A-F)는 pH 7.4에서 HSA-GST 변이체의 hFcRn으로의 ELISA 결합을 보여준다.
도 12 (A) 및 (B)는 HSA-GST 변이체의 hFcRn으로의 ELISA 결합을 보여준다. pH 6.0에서 WT HSA-GST 및 돌연변이 변이체의 hFcRn으로의 결합을 보여주는 ELISA 측정. (B) pH 7.4에서 hFcRn에 대한 WT HSA-GST 및 돌연변이 변이체의 결합을 보여주는 ELISA 측정.
도 13은 양극화된 인간 세포를 횡단하는 비-융합된 HSA 변이체의 트랜스사이토시스를 보여준다. 트랜스웰 시스템에서 성장한 양극화된 T84 세포의 정점(A)으로부터 기저외측 (B) 측면으로 및 B에서 A 측면으로 수송되는 비-융합된 WT HSA 및 KP 양의 ELISA 정량.
도 14는 양극화된 인간 세포를 횡단하는 HSA-GST 변이체의 트랜스사이토시스를 보여준다. 트랜스웰 시스템에서 성장한 양극화된 T84 세포의 정점에서 기저외측면으로 수송된 HSA WT, EQ, TM 및 KP/EQ/TM GST 융합체 양의 ELISA 정량.
도 15는 양극화된 인간 세포를 횡단하는 HSA-GST 변이체의 트랜스사이토시스를 보여준다. 트랜스웰 시스템에서 성장한 양극화된 T84 세포의 정점에서 기저외측면으로 수송된 HSA VA, KP/VA 및 KP/EQ/TM/VA GST 융합체 양의 ELISA 정량.
도 16 (A) 및 (B)는 양극화된 인간 세포를 횡단하는 HSA 커플링된 NP의 트랜스사이토시스를 보여준다. (A) pH 6.0 및 7.4에서 WT HSA 또는 KA/HQ와 커플링된 NP의 결합을 보여주는 ELISA.
정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알부민"은 HSA와 실질적으로 동일한 3차원 구조를 갖는 단백질을 의미한다. 본 발명에 따른 알부민 단백질의 예는 인간 혈청 알부민, 영장류 혈청 알부민, 예를 들어, 침팬지 혈청 알부민, 고릴라 혈청 알부민, 설치류 혈청 알부민, 예를 들어, 토끼 혈청 알부민, 마우스 알부민 및 래트 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 말 혈청 알부민, 당나귀 혈청 알부민, 햄스터 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민, 양 혈청 알부민, 개 혈청 알부민, 기니아 피그 혈청 알부민, 닭 혈청 알부민 및 돼지 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 서열번호 1에 기재된 바와 같은 HSA 또는 이의 임의의 천연적으로 존재하는 대립유전자는 본 발명에 따른 바람직한 알부민이고 67kDa의 분자량을 갖는다. 당업자는 HSA와 동일한 성질을 필수적으로 갖지만 서열번호 1과 비교하여 하나 또는 소수의 변화를 갖는 천연 대립유전자가 존재할 수 있음을 인지할 것이고, 본 발명자는 또한 상기 천연 대립유전자의 용도를 고려한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알부민의 단편"은 FcRn에 결합하는 보유된 능력을 갖는 알부민부분을 의미한다. 단편은 HSA로부터 유래된 하나의 차단되지 않은 서열로 이루어질 수 있거나 HSA로부터 유래된 2개 이상의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 단편은 대략적으로 20개 초과의 아미노산 잔기, 바람직하게는 30개 초과의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 40개 초과의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 50개 초과의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 75개 초과의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 100개 초과의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 200개 초과의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 300개 초과의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 400개 초과의 아미노산 잔기 및 가장 바람직하게는 500개 초과의 아미노산 잔기의 크기를 갖는다.
단백질과 관련하여 사용되는 경우 용어 "야생형"은 합성 단백질을 생성하도록 조작된 것 외의 다른 세포, 조직 또는 유기체 게놈에 의해 암호화된 단백질을 언급한다.
폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 경우 용어 "변이체" 및 "돌연변이체"는 또 다른, 일반적으로 관련된 폴리펩타이드와 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 언급한다. 상기 변이체는 치환된 아미노산이 유사한 구조 또는 화학적 성질을 갖는 "보존성" 변화를 가질수있다. 보존성 아미노산 치환의 한가지 유형은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환능을 언급한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; p-아미노페닐알라닌과 같은 비천연 아미노산이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존성 아미노산 치환 그룹은: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민. 보다 드물게, 변이체는 "비-보존성" 변화(예를 들어, 글라이신의 트립토판으로의 대체)를 가질 수 있다. 유사한 최소 변형은 또한 아미노산 결실 또는 삽입(즉, 부가) 또는 둘다를 포함할 수 있다. 생물학적 활성을 차단시키는 것 없이 얼마나 많은 아미노산 잔기가 치환되거나, 삽입되거나 결실될 수 있는지를 결정하는데 있어서의 지침은 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, DNAStar 소프트웨어를 사용하여 발견될 수 있다. 변이체는 기능적 검정에서 시험될 수 있다. 바람직한 변이체는 10% 미만, 및 바람직하게는 5% 미만, 보다 더 바람직하게는 2% 미만의 변화(치환, 결실 등인지에 상관없이)를 갖는다. 아미노산 치환을 위해, 하기의 전문용어가 사용된다: 본래의 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서, 위치 573번에서 라이신의 알라닌으로의 치환은 "K573A"로 지정되고 573번 위치에서 라이신의 프롤린으로의 치환은 K573P로 지정된다. 디중 돌연변이는 부가 마크("+") 또는 "/"으로 분리되고, 예를 들어, "Gly205Arg + Ser411Phe" 또는 "G205R/S411F"는 위치 205번 및 411번 각각에서 글라이신(G)이 아르기닌(R)으로 치환되고 세린(S)이 페닐알라닌(F)으로 치환된 돌연변이를 나타낸다.
2개의 아미노산 서열 간에 또는 2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 관련성은 파라미터 "동일성"으로 기재된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 간의 동일성 정도는 Needleman-Wunsch 알고리듬을 사용하여 결정하고 (문헌참조: Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) 이는 EMBOSS 팩키지의 Needle 프로그램에서 수행된 바와 같고 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 등, 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), 바람직하게는 버전 3.0.0 이상이다. 사용되는 임의의 파라미터 11644.000-EP7은 10의 갭 오픈 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버젼) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "최장 동일성"의 결과(-nobrief 옵션을 사용하여 수득된)는 % 동일성으로서 사용되고 다음과 같이 계산된다: (동일한 잔기 x 100)/(정렬 길이 - 정렬에서 갭의 총수).
표준 서열에서 위치에 "상응하는 아미노산 위치"라는 표현 및 유사 표현은 1차 또는 공간 구조에서 표준 서열에서 특정 위치에 상응하는 아미노산 잔기를 동정하기 위해 의도된다. 당업자는 이것이 소정의 서열을 표준 서열과 정렬시키고 표준 서열에서의 특정 위치와 정렬하는아미노산 잔기를 동정함에 의해 수행될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, HSA에서 위치 573번에 상응하는 소정의 알부민 서열에서 아미노산 잔기를 찾기 위해, 소정의 알부민 서열은 HSA와 정렬되고 HSA에서 위치 573번과 정렬하는 아미노산은 HSA에서 573번에 상응하는 소정의 알부민 서열로서 동정된다.
표현 Xnnn은 특정 위치에 위치하는 아미노산 잔기 X를 의미하는 것으로 의도되고, 상기 위치는 HSA에서의 위치 nnn에 상응하고 표현 XnnnY는 HSA에서 위치 nnn에 상응하는 위치에 위치한 임의의 아미노산 X의 아미노산 잔기 Y로의 치환을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "친화성"은 결합쌍, 예를 들어, 알부민과 FcRn의 2개의 구성원 간에 결합 강도의 척도를 언급한다. Kd는 해리 상수이고 몰농도 단위를 갖는다.　 상기 친화성 상수는 해리 상수의 역수이다.　 친화성 상수는 때로는 상기 화학적 실체를 기재하기 위한 일반 용어로서 사용된다.　　 이것은 결합 에너지의 직접적인 척도이다.　 K의 자연 로그는 식 ΔG0 = -RT LN(K)(여기서, R= 기체 상수이고 온도는 켈빈이다)을 통해 결합의 깁스(Gibbs) 자유 에너지와 비례적으로 관련된다. 친화성은 예를 들어, 시판되는 Biacore SPR 단위(GE Healthcare)를 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 실험적으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "알부민 및 접합체를 포함하는 융합 단백질"에서와 같은 용어 "접합체"는 알부민에 부착된 (예를 들어, 융합 단백질에서와 같은 공유적으로 또는 비공유적으로 (예를 들어, 소수성 상호작용을 통한)) 임의의 분자를 언급한다. 이의 예는 펩타이드, 폴리펩타이드, 면역원, 약물, 단백질, 지질, 소분자, 뉴클레오타이드, 방사능 활성 추적자 등을포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상기 대상체가 면역 반응을 생성하도록 하는 조건하에서"는 면역반응(예를 들어, 선천성 또는 후천성)의 임의의 정성적 또는 정량적 유도, 생성 및/또는 자극을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역 반응"은 대상체의 면역계에 의한 반응을 언급한다. 예를 들어, 면역 반응은 톨 수용체 활성화, 림포킨 (예를 들어, 사이토킨 (예를 들어, Th1 또는 Th2형 사이토킨) 또는 케목킨) 발현 및/또는 분비, 마크로파아지 활성화, 수지상 세포 활성화, T 세포 활성화 (예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포), NK 세포 활성화, 및/또는 B 세포 활성화 (예를 들어, 항체 생성 및/또는 분비)에서 검출가능한 변화(예를 들어, 증가)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 면역 반응의 추가의 예는 면역원(예를 들어, 항원(예를 들어, 면역원성 폴리펩타이드))을 MHC 분자에 결합시키고, 세포독성 T 림프구("CTL") 반응을 유도하고, B 세포 반응(예를 들어, 항체 생산) 및/또는 T-헬퍼 림프구 반응, 및/또는 면역원성 폴리펩타이드가 유래되는 항원에 대한 지연형 과민성(DTH) 반응을 유도하고, 면역계(예를 들어, 임의의 발육 단계의 T세포, B 세포(예를 들어, 혈장 세포)의 확장(예를 들어, 세포 집단의 성장) 및 증가된 프로세싱 및 항원 제공 세포에 의한 항원의 제공을 포함한다. 면역 반응은 대상체 면역계가 외래(예를 들어, 미생물(예를 들어, 병원체)로부터 비-자가 항원 또는 외래로서 인지되는 자가-항원)로서 인지하는 면역원에 의한 것일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이 "면역 반응"은 선천성 면역 반응(예를 들어, 톨 수용체 시그날 전달 캐스케이드의 활성화), 세포 매개된 면역 반응(예를 들어, T 세포(예를 들어, 항원 특이적 T 세포) 및 면역계의 비-특이적 세포) 및 체액성 면역 반응(예를 들어, B 세포에 의해 매개된 반응 (예를 들어, 혈장, 림프 및/또는 조직 유체로의 항체의 생성 및 분비를 통한)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 면역 반응을 언급하는 것으로 이해되어야만 한다. 용어 "면역 반응"은 항원 및/또는 면역원(예를 들어, 적응성 면역 반응의 결과인 후천성(예를 들어, 메모리) 반응 뿐만 아니라 면역원(예를 들어, 병원체)에 대한 초기 반응 둘다)에 응답하는 대상체의 면역계의 모든 측면의 능력을 포괄하는 것으로 의미된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역력"은 질환을 유발할 수 있는 미생물 (예를 들어, 병원체)로의노출시 질환으로부터의 보호(예를 들어, 질환의 징후, 증상 또는 병태의 예방 또는 약독화(예를 들어, 억제))를 언급한다. 면역력은 선천성(예를 들어, 항원에 대한 이전의 노출 부재하에 존재하는 비-적응성(예를 들어, 비-후천성) 면역 반응) 및/또는 후천성(예를 들어, 항원에 대한 이전의 노출 후 B 및 T 세포에 의해 매개되는 면역 반응(예를 들어, 항원에 대해 증가된 특이성 및 반응성을 나타내는))일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역원"은 대상체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 제제(예를 들어, 미생물(예를 들어, 세균, 바이러스 또는 진균류) 및/또는 이의 일부 또는 성분(예를 들어, 단백질 항원))을 언급한다. 일부 양태에서, 면역원은 면역원(예를 들어, ., 미생물(예를 들어, 병원체 또는 병원체 생성물))에 대한 면역력을 유발한다.
용어 "시험 화합물"은 질환, 병, 질병 또는 신체 기능의 장애를 치료 또는 예방하거나 샘플의 생리학적 또는 세포성 상태를 변형시키기 위해 사용될 수 있는 임의의 화학적 실체, 약제, 약물 등을 언급한다. 시험 화합물은 공지되고 잠재적인 치료학적 화합물 둘다를 포함한다. 시험 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법을 사용한 스크리닝에 의해 치료학적인 것으로 결정될 수있다. "공지된 치료학적 화합물"은 상기 치료 또는 예방에 효과적인 것으로 보여진 치료학적 화합물 (예를 들어, 인간에게 투여와 함께 동물 시험 또는 사전 경험을 통해)을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 이의 가장 광범위한 의미로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 이의 가장 광범위한 의미로 사용된다. 하나의 의미에서 이것은 조직 샘플을 언급할 수 있다. 또 다른 의미에서, 생물학적 샘플 뿐만 아니라 임의의 공급원으로부터 수득된 표본 또는 배양물을 포함하는 것으로 의미된다. 생물학적 샘플은 동물(인간을 포함하는)로부터 수득될 수 있고 유체, 고체, 조직 또는 기체를 포괄한다. 생물학적 샘플은 혈액 생성물, 예를 들어, 혈장, 혈청 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 예는 본 발명에 적용될 수 있는 샘플 유형을 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 인간 염색체 또는 인간 염색체와 연합된 서열을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 세포, 세포로부터 분리된 염색체(예를 들어, 중기 염색체의 확산물), 게놈 DNA (용액 중에 또는 예를 들어, 서던 블롯 분석을 위한 고체 지지체에 결합된), RNA (용액 중에 또는 예를 들어, 노던 블롯 분석을 위한 고체 지지체에 결합된), cDNA(용액 중에 또는 고체 지지체에 결합된) 등을 포함할 수 있다. 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 세포, 조직 부분, 하나 이상의 단백질 등을 함유하는 추출물을 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 개선된 친화성을 갖는 알부민 변이체 및 이의 용도 및특히 면역원에 대한 담체로서 상기 알부민 변이체의 용도에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 알부민/면역원 융합 단백질을 포함하는 백신(예를 들어, 점막 전달용 백신)에 관한 것이다.
알부민 상의 FcRn에 대한 원칙적 결합 부위는 먼저 C-말단 DIII 내에 위치하는 것으로 나타났다 (문헌참조: Andersen 등, Nat Commun. 2012 Jan 3;3:610; Chaudhury 등 Biochemistry. 2006 Apr 18;45(15):4983-90). 이어서, 부위 지시된 돌연변이 유발에 의한 인간 알부민의 DIII 내의 3개의 완전하게 보존된 히스티딘 잔기(His464, His510 및 His535)의 표적화는 모두가 결합을 위해 중요한 것으로 밝혀졌다 (문헌참조: Andersen 등, 2012, supra). 인간 FcRn-인간 알부민 복합체의 도킹 모델을 작제하였고, 여기서, DIII 뿐만 아니라, N-말단 DI 내에 2개의 노출된 루프는 수용체에 근접해 있는 것으로 나타났다(문헌참조: Andersen 등, 2012, supra). 이들 예측과 일치하여, 인간 알부민과 복합체로 있는 2개의 최근에 공개된 인간 FcRn의 공결정구조는 DI 및 DIII 둘다로부터 기여하는 것으로 확인되었다(문헌참조: Oganesyan 등, J Biol Chem. 2014 Mar 14;289(11):7812-24.; Schmidt 등, Structure. 2013 Nov 5;21(11):1966-78). 공결정 구조 중 하나는 야생형 알부민 및 4개의 아미노산 치환 (V418M, T420A, E505G, 및 V547A)을 갖는 다른 가공된 인간 알부민 변이체(HSA13)를 함유한다. 후자는 pH 6 및 pH 7.4 둘다에서 FcRn에 대해 개선된 친화성을 갖는다. 상기 2개의 공결정 구조는 고도로 유사한 결합 모드를 보여주지만 HSA13 DIII에서 도입된 돌연변이로 인한 것일 가능성 있는 일부 차이가 있다. 추가로, 공결정 구조 둘다는 FcRn과 접촉된 DI에서 2개의 노출된 루프를 보여준다.
여러 연구는 인간 FcRn이 양 방향으로 점막 상피 장벽을 횡단하여 단량체 IgG 및 IgG-함유 면역 복합체 둘다를 수송할 수 있음을 보여주었다(문헌참조: Zhu 등, J Immunol. 2005 Jul 15;175(2):967-76; Yoshida 등, Immunity. 2004 Jun;20(6):769-83; Spiekermann 등, J Exp Med. 2002 Aug 5;196(3):303-10. Erratum in: J Exp Med. 2003 Jun 2;197(11):1601; Dickinson 등, J Clin Invest. 1999 Oct;104(7):903-11; Zhu 등, J Immunol. 2001 Mar 1;166(5):3266-76)).
FcRn을 과발현하는 양극화된 마딘-다비 개 신장(MDCK) 세포를 사용하여 수용체는 정점으로부터 또는 기저외측면으로부터 트랜스사이토시스에 의해 IgG를 수송하는 것으로 입증되었다(문헌참조: Zhu 등, J Immunol. 2001 Mar 1;166(5):3266-76; Jerdeva 등, Traffic. 2010 Sep;11(9):1205-20).
이들 발견은 FcRn이 알부민의 트랜스사이토시스를 매개할 수 있는지와 FcRn과의 상호작용의 화학양론이, IgG가 동종이량체성이고 FcRn에 대한 2개의 결합 부위를 가지면서 알부민이 1:1 방식으로 FcRn을 결합함으로써 역할을 수행하는지의 의문을 일으킨다. 지금까지, MDCK 세포를 사용하는 하나의 연구는 알부민이 트랜스사이토시스되지 않음을 지적한다(문헌참조: Tesar 등, Traffic. 2006 Sep;7(9):1127-42).
효모 디스플레이는 인간 FcRn에 대한 특정 범위의 친화성을 갖는 인간 알부민 변이체를 개발하기 위해 사용되었다. 하나의 상기 변이체 (E505G/V547A)는 인간 FcRn 유전자전이 마우스 및 시노몰구스 몽키에서 반감기를 각각 1.5배 및 1.3배로 연장시키는 중성 pH에서 최소 증가와 함께 pH 6.0에서 10배 초과의 개선된 친화성을 얻었다(문헌참조: Schmidt 등, Structure. 2013 Nov 5;21(11):1966-78).
추가로, 구조적 분석 및 교차-종 결합 분석을 기반으로 하는 방법을 사용하여, 단일 치환된 인간 알부민 변이체(K573P)는 중성 pH에서 검출가능한 결합 없이 산성 pH에서 인간 FcRn에 대해 12배 개선된 친화성을 갖는 것으로 동정되었다(문헌참조: Andersen 등, J Biol Chem. 2014 May 9;289(19):13492-502.). 인간 FcRn 및 시노몰구스 몽키에 대해 유전자전이된 마우스에서 평가되는 경우, 상기 가공된 변이체는 각각 1.4 및 1.6배 연장된 반감기를 보여주었다.
상기된 바와 같이, 본 발명의 양태는 야생형 알부민에 상대적으로 FcRn에 대해 증진되거나 감소된 친화성을 갖는 면역원 및 알부민 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 변형된 FcRn 결합 성질을 갖는 가공된 알부민 변이체 및 유래된 단편은 1) FcRn에 의한 개선된 트랜스사이토시스; 2) 신장 세정 역치 이상의 분자량의 함수로서 개선된 생분포/혈청 반감기; 3) 분해로부터 증가된 FcRn 매개된 구제; 4) 수지상 세포에 의한 FcRn 매개된 증진된 세포내 수송 및 프로세싱으로 인해 MHC 부류 I 및 II 상에 증가된 제공; 5) 점막 전달용의 적합성; 및 6) 알부민이 매우 안정한 분자임에 따라 증가된 열 안정성의 결과로서 개선된 면역원성을 갖는다.
상기 알부민 변이체에 융합된 백신 서브유니트는 FcRn 결합을 방해하지 않는다. 분해로부터 구제하는 FcRn 기능은 MHC 부류 I 및 II 상에 항원 제공을 구동하고 점막 전달용으로 가능하게 하기 때문에, 본 발명의 양태의 백신의 약리역학 및 면역원성은 변이체 알부민 폴리펩타이드에 결합되지 않은 면역원에 상대적으로 개선된다. 따라서, 본 발명의 양태는 기존 백신의 한계를 극복하는 개선된 백신 조성물 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명의 양태의 개발 과정 동안에 수행된 실험은 변화된 FcRn 결합 성질을 갖는 전장 알부민및 이의 유래된 단편을 생성시켰다. 상기 변이체는 유전학적으로 다수의 펩타이드 및 폴딩된 단백질 도메인에 융합되는 경우 보유된 FcRn 결합을 보여주었다.
본 발명의 양태는 점막 전달에 사용하기 위한 백신을 제공한다. 백신 접종 및 점막 전달에서 FcRn의 역할은 Fc-융합에 대한 문헌에서 입증되었고 기재되어 있다. 바이러스 및 세균과 같은 감염성 제제는 점막 표면에서 신체에 진입한다. 근육내 또는 피하 백신접종은 일반적으로 준최적 전달 및 점막 면역계의 활성화로 인해 감염 부위에서 단지 최소의 보호를 제공한다. 고유판(laminar propria) 내에 점막 상피 세포와 면역 이펙터 사이는 밀접하게 연합되어 있고, 따라서 점막 표면을 통한 백신의 전달은 이상적인 방법일 수 있다. 점막은 효율적인 진입을 차단하는 선택적 장벽이다. 본 발명의 양태는 점막 백신을 점막 상피에서 발현되는 FcRn에 표적화함에 의해 상기 문제점을 극복하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이것은 상피 장벽을 횡단하는 온전한 서브유니트 백신의 점막 면역계로의 특이적 수송으로 면역 세포 활성화 및 메모리의 후속적 유도를 보장한다.
점막 전달을 위해 디자인된 본 발명의 양태의 백신은 전장 알부민 또는 변형된 FcRn 결합 성질을 갖는 알부민 돌연변이체 또는 단편으로의 융합(화학적으로 또는 유전학적으로)을 기반으로 하는 치료제 또는 서브유니트 백신(항원/면역원)의 점막 전달을 위한 FcRn 매개된 트랜스사이토시스 경로를 활용한다. 상기 백신은 바이러스 유도된 암의 예방에서 뿐만 아니라 감염(예를 들어, 미생물에 의한)의 예방및 치료에서의 용도를 모색한다. 다른 양태에서, 상기 융합체는 치료제를 특정 점막 신체 부위로 전달하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 양태는 감염/염증 부위로 또는 암 부위로 국소 전달을 위한 방법 및 조성물을제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 HSA의 위치 573번, 253번, 523번, 527번, 및 505번 또는 MSA의 위치 500번 또는 510번 중 하나 이상에서의 치환을 갖는 인간 및 마우스 알부민 변이체를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 변형은 결실이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 변이체는 서열번호 1의 K573Y, I523G, I253A, T527M, E505Q, K573P, K573Y/I523G, K573Y/I523G/T527M, K573Y/E505Q/T527M, K573Y/T527M, K573P/I523G, K573P/I523G/T527M, K573P/E505Q/T527M, K573P/T527M, K500A/H510Q, V547A, V547A/K573P, V547A/E505Q/K573P/T527M 또는 도메인 III 결실이다. 일부 양태에서, 알부민 변이체는 MSA의 K500A/H510Q이다.
본 발명은 기재된 위치에서 치환이 유지되는 한, 기재된 위치 이외의 다른 위치에서 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 알부민 변이체는 야생형 혈청 알부민(예를 들어, 야생형 HSA, 서열번호 1 또는 야생형 MSA)과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일하고, 단, 상기 알부민 변이체는 본원에 기재된 돌연변이 또는 결실 중 하나를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 변이체 알부민의 단편을 제공한다. 상기와 같이, 단편은 바람직하게 서열번호 1(즉, 단편의 모 알부민)의 일부와 바람직하게 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일하다. 일부 양태에서, 본 발명은 변이체 알부민 또는 이의 단편으로 융합된 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기와 같이, 융합 단백질의 일부를 형성하는 변이체 알부민 및 단편은 서열번호 1 또는 이의 일부(즉, 단편의 모 알부민)와 바람직하게 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일하고 본원에 기재된 바와 같은 치환 돌연변이를 포함한다.
일부 양태에서, 변이체 알부민, 단편 및 이의 융합체는 상응하는 야생형 서열과 비교하여 인간 또는 마우스 FcRn에 대해 증가된 친화성을 갖는다. 당업자는 임의의 적합한 방법이, FcRn에 대한 변이체 알부민의 친화성이 FcRn에 대한 모 알부민의 친화성 보다 높은지 또는 낮은지를 결정하기 위해, 예를 들어, 결합 상수(Kd)의 결정 및 비교를 위해 유용할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에 따라, 천연의 HSA에 대한 Kd 보다 낮은 Kd를 갖는 변이체 알부민은 HSA 보다 높은 혈장 반감기를 갖는 것으로 고려되고 천연의 HSA에 대한 Kd 보다 높은 Kd를 갖는 변이체 알부민은 HSA 보다 낮은 혈장 반감기를 갖는 것으로 고려된다.
일부 양태에서, HSA 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 양태에서, 아미노산은 HSA의 위치 547번, 573번, 253번, 523번, 527번, 및 505번에서 또는 MSA의 500번 또는 510번에서 치환된다. 일부 양태에서, 상기 치환은 FcRn에 대해 보다 높은 친화성(예를 들어, 보다 낮은 Kd)을 유도한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 변이체는 10 이하, 5 이하, 또는 1 이하의 Kd를 갖는다. 일부 양태에서, 치환은 보존성이거나 비-보존성 변화이다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 변이체와 유사한 측쇄를 갖는 소정의 위치에서 하나 이상의 변이체는 구체적으로 고려된다(예를 들어, 본원에 기재된 변이체에 상대적인 보존성 변화).
보존성 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환능을 언급한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족 하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 예시적인 보존성 아미노산 치환 그룹은 다음과 같다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민.
유전학적으로 암호화된 아미노산은 4개의 계열로 나누어질 수 있다: (1) 산성 (아스파르테이트, 글루타메이트); (2) 염기성 (라이신, 아르기닌, 히스티딘); (3) 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 및 (4) 비하전된 극성 (글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때로는 공동으로 방향족 아미노산으로 분류된다. 유사한 양상으로, 아미노산 레퍼토리는 (1) 산성 (아스파르테이트, 글루타메이트); (2) 염기성 (라이신, 아르기닌, 히스티딘), (3) 지방족 (글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌)(여기서, 세린 및 트레오닌은 지방족 하이드록실로서 별도로 분류된다); (4) 방향족 (페닐알라닌, 티로신, 트립토판); (5) 아미드 (아스파라긴, 글루타민); 및 (6) 황 함유 (시스테인 및 메티오닌) 으로 분류될 수 있다(예를 들어, 문헌참조: Stryer ed., Biochemistry, pg. 17-21, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981).
일부 양태에서, 변이체는 "비보존성" 변화(예를 들어, 글라이신의 트립토판으로의 대체)를 포함한다. 생물학적 활성을 손상시키는 것 없이 어느 아미노산 잔기가 치환되거나, 삽입되거나 결실될 수 있는지를 결정하는데 있어서의 지침은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 찾을 수 있다.
본 발명에 따른 알부민 또는 이의 단편은 당업계에서 공지된 기술을 사용하여 면역원(예를 들어, 항원)에 접합될 수 있다. 본 발명은 특정 면역원으로 제한되지 않는다. 임의의 면역원 또는 항원성 단편이 사용될 수 있다. 이의 예는 미생물(예를 들어, 병원성 미생물), 종양(예를 들어, 암 백신을 위한) 등으로부터 유래된면역원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 변이체 알부민, 이의 단편 및 융합체는 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 하나의 간편한 방법은 본원에 기재된 치환 돌연변이를 포함하는 모 알부민, 이의 단편 또는 융합폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 클로닝하는 것이다.
본 발명의 변이체 알부민, 이의 단편 및 융합체를 포함하는 융합 단백질은 또한 형질전환된 숙주유기체의 배양 동안에 폴리펩타이드가 성장 배지로 분비되도록 하기 위해 시그날 서열에 연결될 수 있다. 일반적으로 회수 및 정제를 용이하게 하기 위해 변이체 폴리펩타이드가 성장 배지로 분비되도록 하는 것이 유리하다.
변이체 폴리펩타이드를 제조하기 위한 기술은 또한 WO 2009019314(참조문헌으로 포함된)에 기재되어 있고 이들 기술은 또한 본 발명에 적용될 수 있다. 알부민은 진균류 (아스퍼질러스(Aspergillus) (WO06066595), 클리베로마이세스(Klyveromyces) (문헌참조: Fleer 1991, Bio/technology 9, 968-975), 피키아 피키아(Pichia Pichia) (문헌참조: Kobayashi 1998 Therapeutic Apheresis 2, 257-262) 및 사카로마이세스(Saccharomyces) (문헌참조: Sleep1990, Bio/technology 8, 42-46)를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 세균(문헌참조: Pandjaitab 2000, J. Allergy Clin. Immunol 105, 279-285)), 동물(문헌참조: Barash 1993, Transgenic Research 2, 266-276) 및 식물 (감자 및 담배(문헌참조: Sijmons 1990, Bio/technology 8, 217 and Farran 2002, Transgenic Research 11, 337-346)를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 포함하는 숙주 범위에서 재조합 단백질로서 성공적으로 발현되었다. 본 발명의 상기 HSA 도메인 III 유도체, 단편, 또는 이의 변이체는 바람직하게 적합한 숙주 세포에서 재조합적으로 제조된다. 원칙적으로, 적합한 양의 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있고 본 발명에 따른 적합한 숙주 세포를 선택하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 있다. 바람직한 숙주 유기체는 바람직하게 사카로마이카카에 중에서 선택되는 효모이고 보다 바람직하게는사카로마이세스 세레비지애 ( Saccharomyces cerevisiae)이다.
본 발명의 변이체 알부민, 이의 단편 및 융합체를 포함하는 융합 단백질은 여과, 원심분리, 크로마토그래피, 친화성 분리 기술 등과 같은 공지된 분리 기술의 조합을 사용하여 성장 배지로부터 회수되고 정제될 수 있다. 상기 공지된 분리 단계의 특정 조합을 사용하여 본 발명의 변이체 알부민, 이의 단편 및 융합체를 정제하는 것은 통상의 기술자의 기술 범위 내에 있다. 본 발명의 변이체에 적용될 수 있는 정제 기술의 예로서 WO0044772의 교시가 언급될 수 있다.
일부 양태에서, 융합 단백질은 당업계에 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여 융합 핵산으로부터발현된다. 하나 이상의 면역원 폴리펩타이드는 알부민 변이체 또는 이의 단편 구조 또는 이의 임의의 조합내 루프로 삽입되는, 알부민 변이체 또는 이의 단편의 N-말단, C-말단에 융합될 수 있다. 융합 폴리펩타이드의 다양한 성분들을 분리하는 링커 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수있다. 알부민 또는 이의 단편의 융합체에 관한 교시는 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 상기 교시가또한 본 발명에 적용될 수 있음을 인지할 것이다. WO 01/79271 A 및 WO 03/59934 A는 또한 본 발명의 알부민 변이체 및 이의 단편에 융합될 수 있고 이들 예는 또한 본 발명에 적용된다.
알부민 변이체 또는 이의 단편 또는 본 발명에 따른 알부민 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드는 이들의 혈장 반감기가 모 알부민 변이체 또는 이의 단편 또는 상기 알부민 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드와 비교하여 변화된다는 이득을 갖는다. 이것은 알부민 변이체 또는 이의 단편 또는 본 발명에 따른 알부민 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 접합체의 혈장 반감기가 특정 치료학적 목적에 따라 선택될 수 있다는 이점을 갖는다.
다른 양태에서, 알부민 변이체가 면역원에 접합된다. 면역원을 알부민 유도체, 단편 또는 이의 변이체로 면역원을 접합시키기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. WO2009019314는 본 발명에도 적용될 수 있는 기술로서 치료학적 화합물을 폴리펩타이드에 접합시키기에 적합한 기술을 예시하고 있다. 추가로 WO2009019314는 치환된 트랜스페린에 접합될 수 있는 화합물 및 모이어티를 예시하고 있고 이들 예는 또한 본 발명에 적용될 수 있다. WO2009019314의 교시는 본원에서 참조로 포함된다.
HSA는 이의 천연 형태로 접합을 위해 간편하게 사용될 수 있는 하나의 유리 티올 그룹을 함유한다. 상기 측면 내의 특정 양태로서, 본 발명의 변이체 알부민, 이의 단편 및 융합체는 표면 상에 추가의유리 티올 그룹을 생성하도록 제공된 추가의 변형을 포함할 수 있다. 이것은 알부민 유도체, 단편 또는 이의 변이체의 페이 로드가 증가되어 면역원의 하나 이상의 분자가 각각의 알부민 유도체, 단편 또는 이의 변이체에 접합될 수 있거나 2개 이상의 상이한 면역원이 상기 변이체 알부민, 이의 단편 및 융합체의 각각의 분자에 접합될 수 있다는 이득을 갖는다. 상기 표면 상에 추가의 유리 티올 그룹을 제공하도록 변형될 수 있는 특정 잔기의 교시는 참조로 인용된 공계류 특허 출원 (EP 2009 152 625.1)에서 찾을 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 알부민 변이체 또는 야생형 알부민 및 면역원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 알부민/면역원 융합체를 포함하는 조성물의 특정 제형에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 본 발명의 백신 조성물은 융합 단백질에 추가로 하나 이상의 상이한 제제를 포함할 수 있다. 이들 제제 또는 조인자는 보조제, 계면활성제, 첨가제, 완충제, 가용화제, 킬레이터, 오일, 염, 치료학적 제제, 약물, 생활성 제제, 항세균제 및 항미생물제(예를 들어, 항생제, 항바이러스제 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물은 면역 반응을 유도하는 면역원의 능력을 증진시키는 제제 및/또는 조인자(예를 들어, 보조제)를 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 하나 이상의 조인자 또는 제제의 존재는 면역 반응(예를 들어, 보호 면역 반응(예를 들어, 보호 면역화))의 유도를 위해 요구되는 면역원의 양을 감소시킨다. 일부 양태에서, 하나 이상의 조인자 또는 제제의 존재는 세포성(예를 들어, T 세포 매개되는) 또는 체액성(예를 들어, 항체 매개되는) 면역 반응에 대한 면역 반응을 회유하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 치료제에 사용되는 조인자 또는 제제의 유형에 의해 제한되지 않는다.
보조제는 일반적으로 문헌[Vaccine Design--the Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995]에 기재되어 있다. 본 발명은 사용되는 (예를 들어, 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에 사용하기 위한) 보조제의 유형에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 양태에서, 적합한 보조제는 수산화알루미늄 겔(alum) 또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제는 칼슘, 철 또는 아연의 염일 수 있거나 아실화된 티로신 또는 아실화된 당, 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도체화된 폴리사카라이드 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다.
일반적으로, 면역 반응은 항원과 면역계의 세포의 상호작용을 통해 항원에 대해 생성된다. 면역 반응은 광범위하게 2개의 카테고리로 분류될 수 있다: 체액성 및 세포 매개된 면역 반응(예를 들어, 통상적으로 각각 항체 보호 기작 및 세포 이펙터 보호 기작에 의해 특징화됨). 이들 반응 카테고리는 Th1-형 반응(세포 매개된 반응) 및 Th2-형 면역 반응(체액성 반응)으로 호칭된다.
면역 반응의 자극은 중재(예를 들어, 면역원으로의 노출)에 대한 면역계의 세포 또는 성분의 직접적인 또는 간접적인 반응으로부터 비롯될 수 있다. 면역 반응은 면역계의 세포(예를 들어, B 세포, T 세포, 수지상 세포, APC, 마크로파아지, NK 세포, NKT 세포 등)의 활성화, 증식 또는 분화; 마커 및 사이토킨의 상향조절되거나 하향 조절된 발현; IgA, IgM, 또는 IgG 역가의 자극; 비장 비대증(증가된 비장 세포질을 포함하는); 다양한 기관에서 비대증 및 혼합 세포 침윤을 포함하는 많은 방식으로 측정될 수 있다. 면역 자극과 관련하여 평가될 수 있는 면역계의 다른 반응, 세포 및 성분들은 당업계에 공지되어있다.
기작의 이해가 본 발명을 수행하기 위해 필요하지 않고 본 발명은 임의의 특정 작용 기작에 제한되지 않지만, 일부 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 사이토킨의 발현 및 분비(예를 들어, 마크로파아지, 수지상 세포 및 CD4+ T 세포에 의해)를 유도한다. 특정 사이토킨의 발현 조절은 국소적으로 또는 전신적으로 일어날 수 있다. 사이토킨 프로필은 면역 반응에서 T 세포 조절 및 이펙터 기능을 결정할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 일부 양태에서, Th1-형 사이토킨이 유도될 수 있고 따라서, 본 발명의 면역자극 조성물은 세포독성 T 세포를 포함하는 Th1 형 항원 특이적 면역 반응을 촉진시킬 수 있다(예를 들어, 이에 의해 질환의 중증도를 증진시키는데 포함되는 원치 않는 Th2 형 면역 반응(예를 들어, Th2 형 사이토킨(예, IL13)의 생성(예를 들어, 점막 형성의 IL-13 유도))을 회피한다).
사이토킨은 T 세포 반응을 지시하는데 역할을 수행한다. 헬퍼 (CD4+) T 세포는 B 및 다른 T 세포를 포함하는 다른 면역계 세포 상에 작용하는 가용성 인자들의 생산을 통해 포유동물의 면역 반응을 지휘한다. 대부분의 성숙한 CD4+T 헬퍼 세포는 2개의 사이토킨 프로필 중 하나를 발현한다: Th1 또는 Th2. Th1-형 CD4+ T 세포는 IL-2, IL-3, IFN-γ, GM-CSF 및 고수준의 TNF-α를 분비한다. Th2 세포는 IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, GM-CSF 및 저수준의 TNF-α를 발현한다. Th1 형 사이토킨은 마우스에서 IgG2a 및 인간에서 IgG1로 스위칭하는 면역글로불린 부류에 의해 특징화되는 세포 매개된 면역력 및 체액성 면역력 둘다를 촉진시킨다. Th1 반응은 또한 지연형 과민성 및 자가면역 질환과 연합될 수 있다. Th2 형 사이토킨은 주로 체액성 면역력을 유도하고 IgG1 및 IgE로의 클래스 스위칭을 유도한다. Th1 반응과 연합된 항체 이소형은 일반적으로 중화 및 옵소닌 작용 능력을 갖는 반면 Th2 반응과 연합된 것들은 알레르기 반응과 보다 연합되어 있다.
여러 인자들은 Th 1 또는 Th2 형 반응에 대한 면역 반응의 회유에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 최상의 특징화된 조절제는 사이토킨이다. IL-12 및 IFN-γ는 양성 Th1 및 음성 Th2 조절제이다. IL-12는 IFN- γ 생산을 촉진하고 IFN-γ는 IL-12에 대한 양성 피드백을 제공한다. IL-4 및 IL-10은 Th2 사이토킨 프로필을 확립하고 Th1 사이토킨 생산을 하향 조절하기 위해 중요한 것으로 보인다.
따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명은 면역원을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는 대상체에서 Th1 형 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 그러나, 다른 양태에서, 본 발명은 면역원을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는 대상체에서 Th2 형 면역 반응을 자극하는 (예를 들어, T 세포 매개된 반응의 균형이 요구되는 경우) 방법을 제공한다. 추가의 바람직한 양태에서, 보조제는 Th1 또는 Th2 형 면역 반응을 회유하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 본 발명의 조성물과 동시 투여될 수 있다). 예를 들어, Th2 또는 약한 Th1 반응을 유도하는 보조제는 alum, 사포닌 및 SB-As4를 포함하지만이에 제한되지 않는다. Th1 반응을 유도하는 보조제는 MPL, MDP, ISCOMS, IL-12, IFN- γ, 및 SB-AS2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
여러 다른 유형의 Th1-형 면역원이 본 발명의 조성물 및 방법(예를 들어, 보조제로서)에 사용될 수 있다. 이들은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 모노포스포릴 지질 A (예를 들어, 특히 3-탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL))가 사용된다. 3D-MPL은 제조원(Ribi Immunochem, Montana)에 의해 제조되는 널리 공지된 보조제이다. 화학적으로, 이것은 흔히 4, 5, 또는 6 아실화된 쇄와 3-탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 혼합물로서 공급된다. 일부 양태에서, 디포스포릴 지질 A, 및 이의 3-O-탈아실화된 변이체가 사용된다. 이들 면역원 각각은 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 GB 2122204B에 기재된 방법에 의해 정제되고 제조될 수 있다. 정제된 다른 것과 합성 지질폴리사카라이드는 문헌(참조: 예를 들어, U.S. Pat. No. 6,005,099 및 EP 0 729 473; Hilgers 등, 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6; Hilgers 등, 1987, Immunology, 60(1):141-6; 및 EP 0 549 074, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 3D-MPL은 미립자 제형 형태(예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 EP 0 689 454에 기재된, 직경이 0.2 μm 미만인 작은 입자 크기를 갖는)로 사용된다.
일부 양태에서, 사포닌은 본 발명의 조성물에서 면역원(예를 들어, Th1-형 보조제)으로서 사용된다. 사포닌은 널리 공지된 보조제이다(문헌참조: 예를 들어, Lacaille-Dubois and Wagner (1996) Phytomedicine vol 2 pp 363-386). 사포닌의 예는 쿠일(Quil) A (남아메리카 나무 쿠일라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 나무껍질로부터 유래된), 및 이의 분획(문헌참조: 예를 들어, U.S. Pat. No. 5,057,540; Kensil, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; 및 EP 0 362 279, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 인용됨)을 포함한다. 또한 본 발명에 유용한 것으로 고려되는 것은 용혈 사포닌 QS7, QS17, 및 QS21 (쿠일 A의 HPLC 정제된 분획물; 문헌참조: 예를 들어, Kensil 등 (1991). J. Immunology 146,431-437, U.S. Pat. No. 5,057,540; WO 96/33739; WO 96/11711 및 EP 0 362 279, 이의 각각은 전문이 본원에 참조로서 인용된다)이다. 또한 유용한 것으로 고려되는 것은 QS21 및 폴리소르베이트 또는 사이클로덱스트린의 배합물이다(문헌참조: 예를 들어, WO 99/10008, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다).
일부 양태에서, 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오타이드 ("CpG")를 함유하는 면역원성 올리고뉴클레오타이드는 보조제로서 사용된다. CpG는 DNA에 존재하는 사이토신-구아노신 디뉴클레오타이드 모티프에 대한 약어이다. CpG는 전신 및 점막 경로 둘다에 의해 투여되는 경우 보조제인 것으로서 당업계에 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, WO 96/02555, EP 468520, Davis 등, J.Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie and Davis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463-6; 및 미국 특허 출원 번호 20050238660, 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다). 예를 들어, 일부 양태에서, 면역자극 서열은 퓨린-퓨린-C-G-피리미딘-피리미딘이고; 여기서, CG 모티프는 메틸화되어 있지 않다.
기작의 이해가 본 발명을 수행하는데 필요하지 않고 본 발명은 임의의 특정 작용 기작에 제한되지 않지만, 일부 양태에서, 하나 이상의 CpG 올리고뉴클레오타이드의 존재는 천연 킬러 세포(이는 IFN-γ를 생산한다) 및 마크로파아지를 포함하는 다양한 면역 서브세트를 활성화시킨다. 일부 양태에서, CpG 올리고뉴클레오타이드는 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 조성물로 제형화된다. 일부 양태에서, CpG의 유리 용액은 항원(예를 들어, 용애 내 존재하는)과 함께 동시 투여된다 (문헌참조: 예를 들어, WO 96/02555; 참조로서 본원에 인용됨). 일부 양태에서, CpG 올리고뉴클레오타이드는 항원에 공유적으로 접합되거나(문헌참조: 예를 들어, WO 98/16247, 본원에 참조로서 인용됨), 수산화알루미늄과 같은 담체와 제형화된다(문헌참조: 예를 들어, Brazolot-Millan 등, Proc.Natl.AcadSci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).
일부 양태에서, 완전 프룬트 보조제 및 불완전 프룬트 보조제와 같은 보조제, 사이토킨(예를 들어, 인터류킨(예를 들어, IL-2, IFN-γ, IL-4, 등), 마크로파아지 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자 등), 콜레라 독소(CT)와 같은 세균 ADP-리보실화 독소, 백일해 독소(PT) 또는 E. 콜라이 열 불안정한 독소 (LT), 특히 LT-K63 (여기서, 라이신은 위치 63번에서 야생형 아미노산을치환한다) LT-R72 (여기서, 아르기닌은 위치 72번에서 야생형 아미노산을 치환한다), CT-S109 (여기서, 세린은 위치 109번에서 야생형 아미노산을 치환한다), 및 PT-K9/G129(여기서, 라이신은 위치 9번에서 야생형 아미노산을 치환하고 글라이신은 위치 129번에서 치환된다)의 탈독소화된 돌연변이체 (문헌참조: 예를 들어, WO93/13202 및 WO92/19265, 이의 각각은 본원에 참조로서 인용된다), 및 다른 면역원성 물질(예를 들어, 본 발명의 조성물의 효과를 증진시키는)은 본 발명의 면역원을 포함하는 조성물과 함께 사용된다.
본 발명에서의 용도를 모색하는 보조제의 추가의 예는 폴리(디(카복실아토페녹시)포스파젠(PCPP 중합체; 바이러스 연구 기관, USA); 모노포스포릴 지질 A와 같은 지질폴리사카라이드의 유도체 (문헌참조: MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), 무라밀 디펩타이드 (MDP; Ribi) 및 트레오닐-무라밀 디펩타이드 (t-MDP; Ribi); OM-174 (지질 A와 관련된 글루코사민 디사카라이드; OM Pharma SA, Meyrin, Switzerland); 및 레슈마니아 연장 인자 (정제된 레이슈마니아 단백질; Corixa Corporation, Seattle, Wash.)를 포함한다.
보조제는 면역원을 포함하는 조성물에 첨가될 수 있거나, 보조제는 조성물과 배합하기 전에 또는동시 투여하기 전에 담체, 예를 들어, 리포좀 또는 금속 염(예를 들어, 알루미늄 염 (예를 들어, 수산화알루미늄))과 제형화될 수 있다.
일부 양태에서, 면역원을 포함하는 조성물은 단일 보조제를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 2개 이상의 보조제를 포함한다(문헌참조: 예를 들어, WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241; 및 WO 94/00153, 이의 각각은 전문이 본원에 참조로서 인용된다).
일부 양태에서, 면역원을 포함하는 조성물은 하나 이상의 점막접착제를 포함한다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 20050281843, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다). 본 발명은 사용되는 점막접착제의 유형에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 점막접착제는 본 발명에 유용한 것으로 고려되고, 폴리(아크릴산)의 가교결합된 유도체 (예를 들어, 카보폴 및 폴리카보필), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리사카라이드(예를 들어, 알기네이트 및 키토산), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 렉틴, 핌브리아 단백질, 및 카복시메틸셀룰로스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 기작의 이해가 본 발명을 수행하기 위해 필요하지 않고 본 발명이 임의의 특정 작용 기작으로 제한되지 않지만, 일부 양태에서, 점막접착제(예를 들어, 면역원을 포함하는 조성물에서)의 용도는 점막접착제가 사용되는 경우, 점막접착제 사용의 부재하에 면역원에 대한 노출 지속기간 및/또는 양과 비교하여 대상체가 경험하는 면역원에 대한 노출의 지속기간 및/또는 양의 증가로 인해 대상체(예를 들어, 본 발명의 조성물이 투여된)에서 면역 반응의 유도를 증진시킨다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 멸균 수성 제제를 포함할 수 있다. 허용되는 비히클 및 용매는 물, 링거 용액, 인산 완충 식염수 및 등장성 염화나트륨 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 멸균 비휘발성 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 임의의 블랜드 비휘발성 무기물 또는 비-무기물 오일이 사용될 수 있고 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함한다. 추가로, 올레산과 같은 지방산은 주사제에서의 용도를 모색한다. 점막, 피하, 근육내, 복강내, 정맥내 또는 다른 경로를 통한 투여를 위해 적합한 담체 제형은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 면역원을 포함하는 조성물은 치료학적으로 (예를 들어, 면역 반응을 증진시키기 위해) 또는 예방학적으로 (예를 들어, 면역화를 위해(예를 들어, 질환의 징후 또는 증상을 예방하기 위해)) 사용될 수 있다. 본 발명의 면역원을 포함하는 조성물은 다수의 상이한 전달 경로 및 방법을 통해 대상체에게 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 다수의 방법에 의해 대상체에게 투여(예를 들어, 점막으로(예를 들어, 비강 점막, 질 점막 등))될 수 있고, 이는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 용액 중에 현탁되고 표면에 적용됨; 용액 중에 현탁되고 분무 어플리케이터를 사용하여 표면 상으로 분무함; 점막접착제와 혼합하고 표면(예를 들어, 점막 표면) 상으로 적용함(예를 들어, 분무 또는 닦기); 비강 및/또는 질 어플리케이터 상에 놓여지거나 여기에 함침되고 적용됨; 조절 방출 기작에 의해 적용됨; 리포좀으로서 적용됨; 또는 중합체 상에 적용됨.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 점막으로 투여된다(예를 들어, 표준 기술을 사용하여; 문헌참조: 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995 (예를 들어, 비강내, 폐내, 질내 및 직장내 기술을 포함하는 점막 전달 기술에 대해), 및 European Publication No. 517,565 및 Illum 등, J. Controlled Rel., 1994, 29:133-141 (예를 들어, 비강내 투여 기술에 대해), 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 인용됨). 대안적으로, 본 발명의 조성물은 표준 기술을 사용하여 피부로 또는 경피로 투여될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Remington: The Science arid Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995). 본 발명은 투여 경로에 의해 제한되지 않는다.
기작의 이해는 본 발명을 수행하기 위해 필요하지 않고 본 발명은 임의의 특정 작용 기작에 의해제한되지 않지만, 일부 양태에서, 점막 백신접종은 항원의 점막 투여가 많은 병원체의 진입 경로인 점막 표면에서 보호 면역 반응(예를 들어, 점막 면역력)을 유도하는 보다 큰 효능을 보여주기 때문에 바람직한 투여 경로이다. 추가로, 비강내 백신접종과 같은 점막 백신접종은 비강 점막에서뿐만 아니라 생식기 점막과 같은 원거리 점막 부위에서 점막 면역력을 유도할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Mestecky, Journal of Clinical Immunology, 7:265-276, 1987). 보다 유리하게, 추가의 바람직한 양태에서, 점막 면역 반응을 유도하는 것뿐만 아니라 점막 백신접종은 또한 전신 면역력을 유도한다. 일부 양태에서, 비경구가 아닌 투여(예를 들어, 백신의 점막 투여)는 전신 면역력을 부스팅하기 위한 (예를 들어, 비경구 또는 점막 백신 접종에 의해 유도되는(예를 들어, 다중 부스트가 왕성한 전신 면역력을 유지하는데 사용되는 경우)) 효율적이고 간편한 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 면역원을 포함하는 조성물은 점막 경로(예를 들어, 경구/기도 또는 비강 경로)를 통해 본 발명의 조성물을 투여함에 의해 질환에 민감하거나 앓고 있는 대상체를 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 대안적 점막 경로는 질내 및 직장내 경로를 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 투여의 비강 경로가 사용되고 본원에서 "비강내 투여" 또는 "비강내 백신 접종"으로 호칭된다. 비강내 백신 접종 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 면역화될 대상체의 인두로 백신의 적가제 또는분무 형태로 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 분무 또는 에어로졸 조성물이 제공된다. 경구 투여용의 위 내성 캡슐과 같은 장용 제형, 직장 또는 질내 투여용 좌제가 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 본 발명의 조성물은 또한 경구 경로를 통해 투여될 수 있다. 이들 상황하에서, 면역원을 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하고/하거나알칼리 완충제 또는 장용 캡슐을 포함할 수 있다. 비강 전달을 위한 제형은 보조제로서 덱스트란 또는 사이클로덱스트란 및 사포닌과의 제형을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 질 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기 경우에, 면역원을 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 유화제, 중합체(예를 들어, CARBOPOL), 및 질 크림 및 좌제의 다른 공지된 안정화제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 직장 경로를 통해 투여된다. 상기 경우에, 조성물은 부형제 및/또는 왁스 및 직장 좌제를 형성하기 위해 당업계에 공지된 중합체를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 동일한 투여 경로(예를 들어, 점막 투여)는 프라이밍 및 부스팅 백신접종 둘다에 대해 선택된다. 일부 양태에서, 다중 투여 경로는 면역 반응을 자극하기 위해 사용된다(예를 들어, 동시에 또는 번갈아서 또는 연속으로).
예를 들어, 일부 양태에서, 면역원을 포함하는 조성물은 프라이밍 또는 부스팅 백신접종 용법으로대상체의 점막 표면으로 투여된다. 대안적으로, 일부 양태에서, 상기 조성물은 프라이밍 또는 부스팅 백신접종 용법으로 전신적으로투여된다. 일부 양태에서, 면역원을 포함하는 조성물은 점막 투여를 통한 프라이밍 백신접종 용법 및 전신성 투여를 통한 부스팅 용법으로 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, 면역원을 포함하는 조성물은 전신 투여를 통한 프라이밍 백신접종 용법 및 점막 투여를 통한 부스팅 용법으로 대상체에게 투여된다. 전신 투여 경로의 예는 비경구, 근육내, 피내, 경피, 피하, 복강내 또는 정맥 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 면역원을 포함하는 조성물은 예방학적 및 치료학적 목적 둘다를 위해 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 폐 전달에 의해 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 흡입(예를 들어, 이에 의해 폐 상피 라이닝을 거쳐 혈류로 횡단하는)을 통해 대상체(예를 들어, 인간)의 폐로 전달될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Adjei, 등 Pharmaceutical Research 1990; 7:565-569; Adjei, 등 Int. J. Pharmaceutics 1990; 63:135-144; Braquet, 등 J. Cardiovascular Pharmacology 1989 143-146; Hubbard, 등 (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206-212; Smith, 등 J. Clin. Invest. 1989;84:1145-1146; Oswein, 등 "Aerosolization of Proteins", 1990; Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado; Debs, 등 J. Immunol. 1988; 140:3482-3488; and U.S. Pat. No. 5,284,656 to Platz, 등, 이의 각각은 전문이 본원에 참조로서 인용된다). 전신 효과를 위한 약물의 폐 전달 방법 및 조성물은 문헌(참조: Pat. No. 5,451,569 to Wong, 등, 참조로서 인용됨; 또한 참조: U.S. Pat. No. 6,651,655 to Licalsi 등, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨))에 기재되어 있다.
본 발명의 수행에 사용하기 위해 추가로 고려되는 것은 약제학적 제제의 폐 및/또는 비강 점막 전달을 위해 디자인된 광범위한 기계 장치이고, 분무기, 계량된 용량 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하지만 이에 제한되지 않고 이 모두는 당업자에게 친숙하다. 본 발명의 수행을 위해 적합한 시판되는 장치의 일부 특정 예는 Ultravent 분무기(제조원: Mallinckrodt Inc., St. Louis, Mo.); Acorn II 분무기(제조원: Marquest Medical Products, Englewood, Colo.); 벤톨린 계량된용량 흡입기(제조원: Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.); 및 Spinhaler 분말 흡입기(제조원: Fisons Corp., Bedford, Mass.)이다. 모든 상기 장치는 치료제의 분배를 위해 적합한 제형의 사용을 요구한다. 전형적으로, 각각의 제형은 사용되는 장치 유형에 특이적이고 통상의 희석제, 보조제, 계면활성제, 담체 및/또는 치료에 유용한 다른 제제에 추가로 적당한 촉진제 물질의 사용을 포함할 수 있다. 또한, 리포좀, 미세캡슐 또는 미소구, 봉입 복합체 또는 다른 유형의 담체의 사용이 고려된다.
따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 면역원을 포함하는 조성물은 상기 조성물을 점막, 근육내, 복강내, 피내, 경피, 폐, 정맥내, 피하 또는 본원에 기재된 다른 투여 경로에 의해 투여함에 의해 질환에 민감하거나 앓고 있는 대상체를 보호하고/하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 백신 제제의 전신 투여 방법은 통상의 시린지 및 니들 또는 고체 백신의 탄도 전달을 위해 디자인된 장치(문헌참조: 예를 들어, WO 99/27961, 참조로 인용됨), 또는 니들 없는 압력 액체 제트 장치(문헌참조: 예를 들어, U.S. Pat. No. 4,596,556; U.S. Pat. No. 5,993,412, 이의 각각은 본원에 참조로 인용됨), 또는 경피 패치제(문헌참조: 예를 들어, WO 97/48440; WO 98/28037, 이의 각각은 본원에 참조로 인용됨)를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 피부에 적용되는(경피 또는 경피성 전달; 문헌참조: 예를 들어, WO 98/20734 ; WO 98/28037, 이의 각각은 본원에 참조로서 인용됨) 항원의 면역원성을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물로 예비 충전된 전신 투여용 전달 장치를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 조성물이 투여된(예를 들어, 면역 반응을 자극하기 위해(예를 들어, 보호 면역력(예를 들어, 점막 및/또는 전신 면역력)을 생성하기 위해)) 대상체의 유형에 제한되지 않는다. 실제로, 광범위한 대상체는 본 발명의 조성물의 투여로부터 이득될 수 있는 것으로 고려된다. 바람직한 양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 양태에서, 인간 대상체는 임의의 연령(예를 들어, 성인, 어린이, 유아 등)이고 이는 미생물(예를 들어, 이. 콜라이)에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 대상체이다. 일부 양태에서, 인간 대상체는 병원성 미생물에 직접 노출 가능서이 높은 대상체 또는 병원체 노출 후 질환 징후 및 증상을 나타낼 가능성이 높은 대상체(예를 들어, 면역 억제된 대상체)이다. 일부 양태에서, 일반 대중은 (예를 들어, 질환의 발생 또는 전염을 방지하기 위해) 본 발명의 조성물을 투여받는다(예를 들어, 백신 접종된다). 예를 들어, 일부 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이들 자신의 건강을 위해 (예를 들어, 질환을 예방하거나 치료하기 위해) 대중 집단(예를 들어, 지역, 도시, 주 및/또는 국가 집단)에 백신 접종하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물(예를 들어, 돼지, 소, 염소, 말, 양 또는 다른 가축; 또는 마우스, 래트, 토끼 또는 다른 동물)이다. 일부 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 연구 세팅(예를 들어, 연구 동물과 함께)에서 사용된다.
본 발명의 조성물은 임의의 경로, 예를 들어, 점막, 경구, 경피, 비강내, 비경구 또는 본원에 기재된 다른 경로에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 정제, 캡슐, 산제, 입제, 로젠지, 발포제, 크림 또는 액제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 하나 이상의 상이한 형태일 수 있다.
본 발명의 국소 제형은 예를 들어, 연고, 크림 또는 로션, 발포제 및 에어로졸로서 제공될 수 있고 방부제, 용매(예를 들어, 침투를 원조하기 위해) 및 연고 및 크림에서의 유화제와 같은 적당한 통상의 첨가제를 함유할 수 있다.
국소 제형은 또한 피부를 통해 활성 성분의 침투를 증진시키는 제제를 포함할 수 있다. 예시적 제제는 N-(하이드록시에틸) 피롤리돈 및 세포 외피 붕괴 화합물의 이원 배합물, 설폭사이드 또는 포스핀 옥사이드와 배합된 당 에스테르, 및 슈크로스 모노올레에이트, 데실 메틸 설폭사이드 및 알코올을 포함한다.
피부 침투를 증가시키는 다른 예시적 물질은 계면활성제 또는 습윤제를 포함하고, 이는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트(폴리소르베이트 80); 소르비탄 모노-올레에이트(Span 80); p-이소옥틸 폴리옥시에틸렌-페놀 중합체(Triton WR-1330); 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레에이트(Tween 85); 디옥틸 나트륨 설프오숙시네이트; 및 나트륨 사르코시네이트(Sarcosyl NL-97); 및 다른 약제학적으로 허용되는 계면활성제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 양태에서, 조성물은 추가로 하나 이상의 알코올, 아연-함유 화합물, 유화제, 습윤화제, 증점제 및/또는 겔화제, 중화제 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 제형에 사용되는 물은 바람직하게 중성 pH를 갖는 탈이온수이다. 국소 제형 중에 추가의 첨가제는 실리콘 유체, 염료, 향제, pH 조정제 및 비타민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
국소 제형은 또한 크림 또는 연고 기제 및 로션용 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 혼화성인 통상의 담체를 함유할 수 있다. 상기 담체는 제형의 약 1% 내지 약 98% 이하로 존재할 수 있다. 상기 연고 기제는 하나 이상의 석유, 무기물 오일, 세레신, 라놀린 알코올, 판테놀, 글리세린, 비사볼롤, 코코아 버터 등을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 발포제로서 제형화되고 사용될 수 있다. 약제학적 발포제는 이에 제한되지 않는 에멀젼, 미세유제, 크림, 젤리 및 리포좀과 같은 제형을 포함한다. 천연에서 기본적으로 유사하지만 이들 제형은 최종 생성물의 성분 및 점도에서 다양하다.
본 발명의 조성물은 추가로 약제학적 조성물 중에 통상적으로 발견되는 다른 보조 성분들을 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 조성물은 예를 들어, 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 소염제와 같은 추가의 혼화성의 약제학적-- 활성 물질을 함유할 수 있거나 염료, 향제, 방부제, 항산화제, 혼탁제, 증점제 및 안정화제와 같은, 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는데 유용한 추가의 물질을 함유할 수 있다. 그러나, 첨가되는 경우 상기 물질은 바람직하게 본 발명의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해하지 않는다. 상기 제형은 안정화될 수 있고 경우에 따라 제형의 면역원 또는 다른 성분들과 해롭게 상호작용하지 않는 보조제(예를 들어, 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤화제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충제, 착색제, 향제 및/또는 방향족 물질 등)와 혼합될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은 약제학적으로 허용되는 염 형태로 투여된다. 사용되는 경우, 상기 염은 약제학적으로 허용가능해야 하고 비-약제학적으로 허용되는 염이 약제학적으로 허용되는 이의 염을 제조하기 위해 간편하게 사용될 수 있다. 상기 염은 하기의 산으로부터 제조되는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 설폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 설폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-설폰산 및 벤젠 설폰산. 또한, 상기 염은 카복실산 그룹의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염으로서 제조될 수 있다.
적합한 완충제는 아세트산 및 염 (1-2% w/v); 시트르산 및 염 (1-3% w/v); 붕소산 및 염 (0.5-2.5% w/v); 및 인산 및 염 (0.8-2% w/v)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 방부제는 벤즈알코늄 클로라이드(0.003-0.03% w/v); 클로로부탄올 (0.3-0.9% w/v); 파라벤 (0.01-0.25% w/v) 및 티메로살(0.004-0.02% w/v)을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 백신 조성물은 하나 이상의 항생제와 동시 투여된다. 예를 들어, 하나 이상의 항생제는 조성물의 투여 전 및/또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명은 동시 투여되는 항생제 유형에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 항생제가 동시 투여될 수 있고 이는 β-락탐 항생제, 페니실린(예를 들어, 천연 페니실린, 아미노페니실린, 페니실리나제-내성 페니실린, 카복시 페니실린, 우레이도 페니실린), 세팔로스포린 (제1 세대, 제2 세대, 및 제3 세대 세팔로스포린), 및 다른 β-락탐(예를 들어, 이미페넴, 모노박탐), β-락타마제 억제제, 반코마이신, 아미노글리코사이드 및 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 린코마이신, 클린다마이신, 리팜핀, 메트로니다졸, 폴리믹신, 독시사이클린, 퀴놀론(예를 들어, 시프로플록사신), 설폰아미드, 트리메토프림, 및 퀴놀린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
세균, 진균류 및 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위한 현재 시판되는 대량의 항미생물 제제가 있다. 상기 약물의 일반적 분류 및 이들의 작용 기작에 대한 포괄적인 참고를 위해 당업자는 문헌(Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics" Eds. Hardman 등, 9th Edition, Pub. McGraw Hill, chapters 43 through 50, 1996, (본원에서 이의 전문이 참조로 인용됨))을 참조한다. 일반적으로, 이들 제제는 세포벽 합성을 억제하는 제제 (예를 들어, 페니실린, 세팔로스포린, 사이클로세린, 반코마이신, 바시트라신); 및 이미다졸 항진균제(예를 들어, 마코나졸, 케토나졸 및 클로트리마졸); 미생물의 세포막을 직접 붕괴시키는 작용을 하는 제제(예를 들어, 폴믹신 및 콜리스티메트에이트 및 항진균 니스타틴 및 암포테리신 B와 같은 세제); 리보솜 서브유니트에 영향을 주어 단백질 합성을 억제하는 제제(예를 들어, 클로르암페니콜, 테트라사이클린, 에르트로마이신 및 클린다마이신); 단백질 합성을 변형시켜 세포사를 유도하는 제제(예를 들어 , 아미노글리코사이드); 핵산 대사에 영향을 주는 제제(예를 들어, 리파마이신 및 퀴놀론); 항대사물 (예를 들어, 트리메토프림 및 설폰아미드); 및 DNA 합성을 위해 필수적인 바이러스 효소를 억제하는 작용을 하는 지도부딘, 갱사이클로비르, 비다라빈 및 아사이클로비르와 같은 핵산 유사체를 포함한다. 항미생물제의 다양한 배합물이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 추가의 활성 및/또는 면역자극 제제(예를 들어, 상이한 면역원, 항생제, 항산화제 등을 포함하는 조성물)와 함께 면역원을 포함하는 백신 조성물의 동시 투여를 포함하는 방법을 포함한다. 실제로, 본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 조성물을 동시 투여함에 의해 종래 기술의 면역 자극 방법(예를 들어, 면역화 방법) 및/또는 약제학적 조성물을 증진시키기 위한 방법을 제공하는 것이다. 동시 투여 과정에서, 상기 제제는 동시에 또는 연속으로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 조성물은 다른 활성제(들) 전에 투여된다. 약제학적 제형 및 투여 방식은 본원에 기재된 임의의 것들일 수 있다. 추가로, 2개 이상의 동시 투여되는 제제는 각각 상이한 방식(예를 들어, 경로) 또는 상이한 제형을사용하여 투여될 수 있다. 동시에 투여될 추가의 제제(예를 들어, 항생제, 보조제 등)는 현재 임상 사용중에 있는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 널리 공지된 임의의 제제일 수 있다.
일부 양태에서, 면역원을 포함하는 조성물은 하나 이상의 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 병원성 미생물에 대한 보호 면역 반응(예를 들어, 면역력)을 갖는 것으로 이득이 되는 대상체는 점막 투여 (예를 들어, 본원에 기재된 비강 투여 또는 다른 점막 경로)를 받고 추가로 하나 이상의 다른 경로의 투여(예를 들어, 비경구 또는 폐 투여(예를 들어, 분무기, 흡입기 또는 본원에 기재된 다른 방법))를 받아 이득이 될 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 점막 경로를 통한 투여는 면역원에 대한 또는 면역원이 유래되는 유기체에 대한 전신 면역력 및 점막 면역력 둘다를 유도하기에 충분하다. 다른 양태에서, 다중 경로를 통한 투여는 점막 및 전신 면역력 둘다를 제공하도록 작용한다. 따라서, 기작의 이해가 본 발명을 수행하기 위해 필요하지 않고 본 발명은 임의의 특정 작용 기작에 제한되지 않지만, 일부 양태에서, 다중 투여 경로를 통해 본 발명의 조성물을 투여 받은(예를 들어, 면역화(예를 들어, 상기 조성물의 점막 및 기도 또는 비경구 투여)) 대상체는 단지 하나의 경로를 통해 조성물이 투여된 대상체 보다 면역원에 대해 강한 면역 반응을 가질 수 있는 것으로 고려된다.
다른 전달 시스템은 시간-방출, 지연 방출 또는 연장 방출 전달 시스템을 포함할 수 있다. 상기 시스템은 조성물의 반복적인 투여를 회피하여 대상체 및 의사에게의 편리를 증가시킬 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 가용하고 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 폴리(락타이드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프롤락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리하이드록시부티르산 및 폴리무수물과 같은 중합체 기반 시스템을 포함한다. 약물을 함유하는 이전 중합체의 미세캡슐은 예를 들어, 문헌(U.S. Pat. No. 5,075,109, 참조로서 인용됨)에 기재되어 있다. 전달 시스템은 또한 다음의 비-중합체 시스템을 포함한다: 콜레스테롤과 같은 스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 및 모노-디 및 트리-글리세라이드와 같은 지방산 또는 중성 지방을 포함하는 지질; 하이드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩타이드 기반 시스템; 왁스 코팅물; 통상의 결합제 및 부형제를 사용한 타정된 정제; 부분적으로 융합된 이식체 등. 특정 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: (a) 본 발명의 제제가 문헌(참조: U.S. Pat. Nos. 4,452,775, 4,675,189, 및 5,736,152, 이의 각각은 본원에 참조로 인용됨)에 기재된 것들과 같은 매트릭스내의 형태로 함유된 부식 시스템 및 (b) 활성 성분이 문헌(참조: U.S. Pat. Nos. 3,854,480, 5,133,974 및 5,407,686, 이의 각각은 참조로서 본원에 인용된다)에 기재된 것들과 같은 중합체로부터의 조절 속도로 침투하는 확산 시스템. 추가로, 펌프 기반 하드웨어 전달 시스템이 사용될 수 있고 이의 일부는 이식을 위해 채택된다.
일부 양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 대상체에게 투여하기 전 희석될 수 있는 농축된 용량으로 제형화된다. 예를 들어, 농축된 조성물의 희석물은 대상체가 본원에 제공된 임의의 하나 이상의 특정 용량을투여받도록 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 농축된 조성물의 희석물은 대상체가 농축된 조성물 중에 존재하는 난에멀젼 및 면역원 0.5 내지 50%를 포함하는 조성물을 투여(예를 들어, 단일 용량)받도록 제조될 수 있다. 농축된 조성물은 대다수의 대상체가 본 발명의 조성물을 투여받는 시설물(예를 들어, 면역화 클리닉, 병원, 학교 등)에서 유용한 것으로 고려된다. 일부 양태에서, 본 발명의 면역원을 포함하는 조성물(예를 들어, 농축된 조성물)은 1주 초과 동안 실온에서 안정하고, 일부 양태에서는 2주 초과 동안, 일부 양태에서, 3주 초과 동안, 일부 양태에서, 4주 초과 동안, 일부 양태에서, 5주 초과 동안, 및 일부 양태에서 6주 초과 동안 안정하다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물의 초기 투여(예를 들어, 초기 백신 접종) 후, 대상체는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 및/또는 제10 초과의 투여에 이어서 하나 이상의 부스트 투여(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 10주, 약 3개월, 약 4개월, 약 6개월, 약 9개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 5년, 약 10년)를 투여받을 수 있다. 기작의 이해가 본 발명을 수행할 필요는 없고 본 발명은 임의의 특정 작용 기작으로 제한되지 않지만, 일부 양태에서, 부스트 용량의 면역원의 재도입은 대상체에서 왕성한 전신 면역을 가능하게 한다. 상기 부스트는 1차 면역 반응 동안 주어진 동일한 제형과 함께 있거나 면역원을 함유하는 다른 제형과 함께 존재할 수 있다. 투여 용법은 또한 적어도 부분적으로 대상체의 필요성에 의해 결정되고 수행자의 판단에 의존한다.
투여 단위는 대상체의 체중, 연령 및 건강 상태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 인자를 기반으로 비례적으로 증가되거나 감소될 수 있다. 추가로, 투여 단위는 후속적 투여(예를 들어, 부스트 투여)를 위해 증가되거나 감소될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법이 연구 시설물을 포함하는 다양한 시설물에서 용도를 모색하는 것으로고려된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 면역계의 연구(예를 들어, 적응성 면역 반응(예를 들어, 점막 또는 전신 면역력))의 특징 분석)에서의 용도를 모색한다. 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 방법의 사용은 인간 및 비-인간 대상체 및 상기 대상체로부터의 샘플을 포함하고 또한 이들 대상체를 사용한 연구 적용을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 알부민 변이체, 면역원 및 다른 성분들을 연구하고 최적화하고 새로운 성분을 스크리닝하기 위해 유용하다. 따라서, 본 발명은 임의의 특정 대상체 및/또는 응용 시설물로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 추가로 본원에 포함된 백신 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 키트는 백신을 투여하기 위해 필요하거나, 충분하거나 유용한 모든 성분들을 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 상기 키트는 백신을 투여하기 위한 장치(예를 들어, 니들 또는 다른 주사 장치), 온도 조절 부품(예를 들어, 냉장 또는 다른 냉각 부품), 소독 부품(주사 부위를 소독하기 위한 알코올 면봉) 및 백신을 투여하기 위한 지침서를 포함한다.
실시예 1
알부민 변이체의 가공
재료 및 방법
알부민 변이체를 암호화하는 발현 벡터의 작제
pcDNA3 벡터(Invitrogen)는 GST를 암호화하는 cDNA 분절에 융합된 마우스 및 인간 알부민 변이체를 암호화하는 cDNA의 클로닝을 위해 사용하였다. 모든 벡터는 또한 이전에 기재된 바와 같이 엡슈타인-바르 바이러스 복제 오리진(OriP)을 암호화한다(문헌참조: Andersen 등, Clinical biochemistry 43, 367-372 (2010); Berntzen, 등 Journal of immunological methods 298, 93-104 (2005)). MSA 및 HSA 유전자들을 암호화하는cDNA 단편 (표 1)은 모두 제조원(GenScript Inc (NJ, USA))의 pUC57 벡터에 정렬되었고 수득되었다. pUC57 벡터는 제한 부위 HindIII 및 XhoI로 플랭킹하였다. 글라이신-세린(GS) 스트레치의 아미노산((GGS)4GG)을 암호화하는 DNA 서열은 N-말단에 융합된 GST 서열이다. 상기 벡터 pcDNA3-HSAwt-GST-OriP 및 pcDNA3-HSAbartin-GST-OriP는 이전에 기재되었다 (문헌참조: Andersen 등, 2010, supra).
알부민 변이체의 제조
접착 HEK293E 세포의 일시적 형질감염은 폴리에틸렌이민(PEIMax; MW 4000; Polysciences, Inc, Warrington)을 사용하여 수행하였다. 형질감염 전에, 세포는 T175 병(50 ml)에서 95% 컨플루언스때까지 성장시켰다. 62.5 μg의 플라스미드 DNA는 3.75 ml의 OptiMEM 배지 (Invitrogen) (용액 1) 및 25 μl의 PEI-MAX (6.45 mg/ml) 및 3.75 ml의 dH2O와 혼합하였다. 이어서, 용액 1 및 2는 혼합함에 이어서 상기 혼합물을 씨딩된 세포로 첨가하기 전에 RT에서 30분 동안 항온처리하였다. 형질감염 후 12일까지 동안 제2일 마다 상등액을 수거하였다.
GSTrap FF 칼럼 (GE Healthcare, UK)을 사용하여 GST-태그된 MSA 및 HSA 변이체를 정제하였다. 상기 칼럼을 바이오로직 워크스테이션(BioLogic workstation) 및 레코더(BIO-RAD)에 커플링시키고, 정제는 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 100 ml의 1xPBS/0.05% 아지드화나트륨 (pH 7.2)을 사용하여 상등액을 0.22 μm 진공 필터(Corning)로 멸균 여과하기 전에 칼럼을 예비 평형화시키고 0.05% 아지드화나트륨을 1-2ml/분의 유속으로 적용하였다. 이어서, 200 ml의 1xPBS/0.05% 아지드는 비특이적 결합을 세척 제거하기 위해 적용하였다. 결합된 GST-융합체는 50mM의 Tris-HCl(pH 8.0) 중에서 희석된 50 ml의 10 mM 환원 글루타티온 (Sigma-Aldrich)으로 용출시켰다. 용출된 분획물을 수거하고, 상향 농축시키고, Amicon Ultra-10 칼럼 (Millipore)을 사용하여 1xPBS/0.05% 아지드로 완충액 변화시켰다. 모든 분획물은 0.5-1 mg/ml의 농도로 -20 ℃에서 저장하였다. 상기 칼럼을 세척하고 4 ℃에서 20% 에탄올 중에서 저장하였다.
마우스 및 인간 FcRn의 제조
절단된 단량체성 His-태그된 마우스 및 인간 FcRn (mFcRn 및 hFcRn)은 필수적으로 이전에 기재된 바와 같이 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 사용하여 제조하였다(문헌참조: Kim 등, European journal of immunology 29, 2819-2825 (1999); Popov, S. 등 Molecular immunology 33, 521-530 (1996)). 수용체는 Ni2+ 이온과 함께 공급된 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare, UK)을 사용하여 정제하였다. 사용 전에, 상기 칼럼은 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 1xPBS로 예비 평형화시켰다. 5ml 분-1의 유속으로 HisTrap HP 칼럼에 적용하기 전에 상등액의 pH는 1xPBS/0.05% 아지드화나트륨 (pH 10.9)을 사용하여 pH 7.2로 조정하였다. 200ml의 1xPBS에 이어서 50 ml의 25 mM 이미다졸/1xPBS로 세척한 후, 결합된 수용체는 50 ml의 250 mM 이미다졸/1xPBS (pH 7.2-7.4)로 용출시켰다. 단백질은 제조 프로토콜에 따라 하이로드(HiLoad) 26/600 Superdex 200 프렙 등급 칼럼 (GE Healthcare) 상에 적용하기 전에 Amicron Ultra-10 칼럼(Millipore)을 사용하여 상향농축시키고 1xPBS로 완충액 변화시켰다. 용출된 분획물을 모으고 Amicon Ultra 칼럼(Millipore)을 사용하여 상향 농축시키고 4 ℃에서 저장하였다.
효소 결합된 면역흡착 검정 (ELISA)
토끼 IgG (10 μg/ml) (Southern Biotech)는 미세역가 웰(Nunc)에 코팅시키고 4ºC에서 밤새 항온처리하였다. 이어서, 웰은 실온에서 1시간 동안 PBS/4% 스킴 밀크로 차단시키고 PBS/0.005% Tween20 (PBS/T) pH 6.0에서 4회 세척하였다. 가용성 mFcRn 또는 hFcRn (20 μg/ml)은 PBS/T/4% 스킴 밀크 pH 6.0으로 희석시키고 웰에 첨가하고 상기된 바와 같이 세척 전에 실온에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 상기 GST-태그된 알부민 변이체 (5 μg/ml)는 PBS/T/4% 스킴밀크 pH 6.0에서 희석시키고 실온에서 2시간 동안 웰에 첨가하였다. 상기와 같이 세척한 후, PBS/T/4% 스킴 밀크 pH 6.0에서 희석된(1:4000) 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항-GST 항체 (GE Healthcare)를 첨가하고 1시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 상기 웰은 상기된 바와 같이 세척하고 결합된 알부민 변이체는 테트라메틸벤지딘 기질을 사용하여 검출하였다 (Calbiochem). 흡광도는 100 μl의 1 M HCl을 첨가한 후 선라이즈 분광광도기(TECAN)을 사용하여 450nm에서 측정하였다.
표면 플라스몬 공명 ( SPR )
SPR 실험은 BIAcore 3000 장비 (GE Healthcare) 상에서 수행하였고 아민 커플링 (GE Healthcare)은 CM5 칩 상에서 GST-융합된 알부민 변이체의 고정화를 위해 사용하였다. 각각 2 μg/ml를 필수적으로 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 pH 5.0에서 10mM 나트륨 아세테이트(GE Healthcare) 중에서 주사하였다. 칩 표면 상의 미반응된 모이어티는 1M 에탄올아민으로 차단하였다. 실험은 샘플의 전개 또는 희석 둘다를 위해 인산 완충액 (pH 6.0 또는 7.4에서 67 mm 인산 완충액, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20)과 함께 수행하였다. 역학적 측정은 25 ℃에서 50 μL/분의 유속으로 pH 6.0 또는 7.4에서 고정화된 알부민 변이체 상에 단량체성 His-태그된 hFcRn (1.0-0.015 μM)의 연속 희석물을 주사함에 의해 수행하였다. 역학적 속도 값은 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 제공된 단순한 Langmuir 1:1 리간드 결합 모델을 사용하여 계산하였다. 평균 평방제곱을 나타내는 통계학적 값 χ2에 의해 기재된 피트의 폐쇄는 모든 친화성 평가에서 2.0 미만이었다. 비특이적 결합 및 벌크 완충액 효과를 보정하기 위해, 대조군 CM5 표면 및 블랭크 주사로부터 수득된 결합 반응은 각각의 상호작용 곡선으로부터 공제하였다.
T84 트랜스사이토시스 검정
인간 상피 세포주 T84 (ATCC)는 10% 열 불활성화된 FBS, 2mM Lg 및 50U/ml PS(모두 제조원(Bio-Wittaker))가 공급된 둘베코 변형 이글 배지 DMEM(Invitrogen) 및 HAM의 F-12 배지(1:1)(Invitrogen)에 유지시켰다. 상기 세포를 습화된 5% CO2, 95% 공기 항온처리기에서 37 ℃에서 항온처리하였다. PTFE 막을 갖고 0.4 m 공극 크기(Corning Costar, MA, USA)를 갖는 트랜스웰 필터(1.12 cm2)는 1.0x106 세포/웰을 씨딩하기 전에 성장 배지에서 ON 항온처리하였다. 트랜스상피 내성 (TER)(이는 MILLICELL-ERS volt-ohm 계량기(MILLIPORE)를 사용하여 매일 측정하였다). 상기 세포는 1000-1500 Ωxcm2의 TER 값에 도달하기 전에 4 내지 6일 동안 배양하였다. 성장 배지는 매일 교환하였다.
실험 전에, T84 단층을 세척하고 행크 HBSS 완충액 (Invitrogen)에서 1시간 동안 항온처리하였다. 정점에서 기저외측 수송의 측정을 위해, 200μl의 정상화된 HSA 변이체 (20-30 μg/ml)를 정점 측면에 첨가하고 이어서 기저외측 저장소로부터 500 μl HBSS 완충액으로 0 및 4시간째에 400 μl의 배지를 샘플링하였다.
표 1. 알부민 변이체를 암호화하는 작제된 벡터
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결과
hFcRn으로의 증가되거나 감소된 결합과 함께, C-말단 DIII 내 단일 점 돌연변이를 갖는 가공된 HSA 변이체 범위를 제조하였다. 상기 HSA 변이체는 hFcRn-HSA 복합체의 도킹 모델의 조사를 기초로 작제하였다(Andersen 등, Nature communications 3, 610 2012). 여기서, 선택된 돌연변이를 HSA의 DIII로 도입하여 단일 점 돌연변이 또는 돌연변이의 조합이 hFcRn으로의 결합에 어떻게 영향을 미치는지를 조사하였다. 추가로, 일부 돌연변이 변이체는 I523G와 조합하였다(WO201211218A1; 전문이 본원에서 참조로 인용된다).
5개의 단일 돌연변이; E505Q (EQ), T527M (TM), I523G (IG), K573Y (KY), 및 K573P (KP), 및 이들 돌연변이 중 10개 (표 1에 기재된 바와 같이)를 HSA의 DIII에 도입하였다. WT HSA를 제조하는 것뿐만 아니라, 이중 돌연변이체 K500A/H510Q (KA/HQ)는 hFcRn으로의 결합을 크게 감소시키는 것으로 이전에 나타난 2개의 점 돌연변이의 조합을 기초로 제조하였다 (Andersen 등, 2012, supra). 돌연변이된 아미노산은 도 2에서 HSA의 결정 구조 도시에서 강조된다.
도 2는 HSA의 결정 구조를 보여준다. HSA의 DIII 내에 돌연변이된 아미노산 위치의 구조적 위치. 상기 도면은 HSA의 전체 구조적 구성을 보여준다. 상기 DI-DII 및 DIII는 각각 회색 및 담회색으로 나타내고, 돌연변이된 위치 K500A (KA), H510Q (HQ) (KA/HQ), E505Q (EQ), T527M (TM) I523G (IG), K573Y (KY) 및 K573P (KP)는 착색 구형으로 강조한다. HSA5 및 프로그램 PyMOL에 대해 결정학적 데이터를 사용하여 도시하였다.
도 3은 C-말단 융합된 항원과 알부민의 작제를 위한 클로닝 카세트의 도식적 개요를 보여준다. 전장 알부민을 암호화하는 cDNA는 제한 부위 HindIII 및 XhoI로 서브클로닝하고, 단지 DIII 분절을 암호화하는 cDNA 단편은 제한 부위 BamHI 및 XhoI 상으로 서브클로닝하였다. BamHI 제한 부위는 사일런스 돌연변이에 의해 알부민 cDNA 서열로 도입하여 DIII 서브클로닝을가능하게 하였다. GS-링커 서열은 알부민 및 융합된 GST 단백질을 암호화하는 cDNA 사이에 도입하였다. 항원을 암호화하는 cDNA는 제한 부위 XhoI 및 ApaI 상으로 서브클로닝하였다.
도 4는 정제된 알부민-GST 변이체의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. (A) HSA-GST 변이체 및 (MSA-GST 변이체)의 대표적인 비-환원 SDS-PAGE 겔 분석. 3 μg의 각각의 변이체는 겔상에 적용하였다. HSA 및 MSA 변이체는 HEK293E 세포의 일시적 형질감염에 의해 제조하였다. 전장 변이체에 추가로, 이전에 hFcRn1에 결합하지 않는 것으로 이전에 나타난 거의 전체 DIII(Bartin)이 없는 절단된 HSA 변이체가 포함되었다. 수거된 상등액을 모으고 GSTrap FF 칼럼에 적용하기 전에 여과하였다. 정제된 변이체의 통합은 비-환원 SDS-PAGE를 사용함에 이어서 코마시 염색으로 분석하였다. 대략 70kDa의 분자량으로 이동한 HSA Bartin을 제외한 모든 변이체는 100-110 kDa에 상응하는 주요 밴드로서 이동하였고 모두는 예상된 분자량에 일치하였다.
산성 pH에서 알부민 융합체의 결합 능력을 비교하기 위해, 적정량의 정상화된 HSA-GST 변이체를 토끼 IgG 상에 포획된 hFcRn으로 첨가하고 결합된 알부민 변이체는 염소로부터 기원하는 HRP-접합된 항-GST 항체를 사용하여 검출하였다(도 5a-d). hFcRn으로의 결합은 WT HSA의 결합을 1.0으로 설정하여 계산하였다(도 5c). 단일 점 돌연변이 중, EQ, IG 및 TM은 WT 보다 2 내지 3배 우수한 결합에서 적절한 개선을 나타냈고 이어서 KP 및 KY는 WT보다 5배 이상 강하게 결합하였다. 2개 또는 3개의 돌연변이를 조합하여 추가의 결합력 획득을 유도하였고, 여기서, 돌연변이체 KP/IG, KY/EQ/TM 및 KY/IG/TM은 KY에 이어서 KY/IG 및 KP/IG/TM과 비교하여 약간 개선된 결합을 보여주었고, 가장 강한 결합은 KY/TM, KP/TM 및 KP/EQ/TM에 대해서 검출되었고 이들은 결합 강도에서 6배의 개선을 보여주었다. 따라서, 단일 돌연변이 중에서 KY 및 KP가 가장 강하게 결합하고 TM 및 EQ와 이들의 조합은 최상의 결합제가 되도록 하였다.
산성 pH에서 알부민 융합의 결합 능력을 비교하기 위해, 적정된 양의 정상화된 MSA 및 HSA-GST 변이체를 토끼 IgG 상에 포획된 (도 6a) hFcRn 및 (도 6b-d) mFcRn에 첨가하고, 결합된 알부민 변이체는 염소 기원의 HRP-접합된 항-GST 항체를 사용하여 검출하였다.
hFcRn (도 6a) 및 mFcRn (도 6b-d)로의 결합은 WT MSA의 결합을 1.0으로 설정하여 계산하였다(도 7). KP는 hFcRn에 대해 MSA 보다 3배 강하게 결합하는 나타났고 수용체는 HSA 보다는 MSA에 보다 강하게 결합하였다. HSA 및 MSA KA/HQ 돌연변이는 hFcRn 또는 mFcRn에 결합하지 않았다. 추가로, 어떠한 검출가능한 결합이 HSA에 대한 mFcRn에서 나타나지 않았다. 단일 점 돌연변이 중, 이들 중 어떠한 것도 mFcRn에 대해 MSA 보다 강하게 결합하지 않았고 KP와 IG의 조합은 WT MSA 보다 2배 우수하게 결합하는 적절한 개선을 유도하였다. 추가로, 하기의 조합 KP/TM, KP/IG/TM 및 KP/EQ/TM은 WT MSA와 대비되는 상대적인 결합에서 4 내지 6배 높은 개선을 획득했다.
센서그램 (도 8)은 산성 pH에서 hFcRn에 결합하는데 있어서 큰 차이를 보여준다. 결합 곡선은 1:1 결합 모델에 피팅하였고 유래된 결합 역학은 표 2에 열거한다. 여기서, GST로의 융합은 이전의 결과와 일치되게, hFcRn에 결합하는 것에 대해 매우 최소의 네가티브 영향을 갖는 것으로 나타났다(문헌참조: Andersen 등, J Biol Chem. 2013 Aug 16;288(33):24277-85). EQ 및 IG 돌연변이체는 WT 대응물 보다 hFcRn에 대해 6배 초과로 우수하게 결합하는 것으로 나타났고 IA는 이들 돌연변이체 만큼 거의 양호하게 결합하였다. 추가로, KP 돌연변이체는 결합이 14배 개선되었고 3중 돌연변이체 EQ/TM/KP는 180배 초과에 상응하는 가능 큰 개선을 보여주었다.
상피 장벽을 거쳐 IgG를 수송하는 FcRn의 능력은 널리 확립되었다(Dickinson 등, 1999; McCarthy 등, 2000). 그러나, 상피 세포에서발현된 FcRn이 HSA를 수송할 수 있는지의 여부는 입증되지 않았다. 따라서, HSA가 내인성 hFcRn을 발현하는 상피 층을 거쳐 FcRn 의존성 방식으로 수송될 수 있는지를 조사하기 위해, 트랜스웰 시스템을 사용하여 FcRn 매개된 IgG 수송을 측정하였다. 먼저, WT HSA는 KA/HQ와 비교하였고 동등한 양의 이들을 트랜스웰 시스템의 정점 저장소에 첨가하였고, 여기서, 인간 상피 세포주 T84는 양극화된 단층으로서 성장하였다. 샘플은 정점 측면으로의 첨가 후 0 및 4시간 시점에서 기저외측 저장소로부터 수거하였다. 수송된 HSA 융합체는 ELISA를 사용하여 정량하였고, 여기서, 상기 융합체는 항-GST 항체 상에서 포획하고 결합된 융합체는 HRP-접합된 항-HSA 항체를 사용하여 검출한다. 수송 효능에서 두드러진 차이는 WT 융합체가 hFcRn으로의 결합이 없는 이중 돌연변이체 보다 5배 더 많이 수송되는 것으로 검출되었다(도 9). 따라서, 이들 데이터는 인간 상피에서 발현된 FcRn이 세포 층을 거쳐 HSA를 트랜스사이토스할 수 있음을 강하게 지지한다.
이어서, hFcRn으로의 개선된 결합을 갖는 HSA 변이체가 이의 WT 대응물 보다 효율적으로 트랜스사이토스되는지를 평가하였다. 단일 KP 돌연변이의 도입이 WT와 비교하여 거의 3배 수송 효능을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (도 9).
표 2.
Figure pct00002
실시예 2
C-말단 DIII 내에 점 돌연변이를 갖는 가공된 HSA 돌연변이체는 hFcRn으로의 결합을 증가시켰다. 상기 HSA 변이체는 hFcRn-HSA 복합체 1, 및 V547의 도킹 모델의 조사를 기초로 작제하였다(문헌(참조: Eleven Biopharmaceuticals (WO 2013075066 A2)에 기재된 바와 같이). 여기서, 돌연변이의 조합은 HSA의 DIII로 도입하여 이들이 hFcRn으로의 결합에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다.
재료 및 방법
알부민 변이체를 암호화하는 발현 벡터의 작제
pcDNA3 벡터 (Invitrogen)는 GST를 암호화하는 cDNA 분절에 융합된 인간 혈청 알부민 변이체를 암호화하는 cDNA의 클로닝을 위해 사용하였다. 모든 벡터는 또한 이전에 기재된 바와 같이 엡슈타인-바르 바이러스 복제 오리진(OriP)을 암호화한다(문헌참조: Andersen 등, 2010, supra; Berntzen 등, supra). HSA 유전자를 암호화하는 cDNA 단편은 pUC57 벡터(제조원: GenScript Inc (NJ, USA)에 모두 정렬되고 수득되었다. pUC57 벡터는 제한 부위 HindIII 및 XhoI로 플랭킹하였다. 글라이신-세린(GS) 스트레치의 아미노산((GGS)4GG)을 암호화하는 DNA 서열은 N-말단에 융합된 GST 서열이다. 벡터 pcDNA3-HSAwt-GST-OriP는 이전에 기재되었다(문헌참조: Andersen 등, 2010, supra).
알부민 변이체의 제조
접착 HEK293E 세포의 일시적 형질감염은 폴리에틸렌이민(PEIMax; MW 4000; Polysciences, Inc, Warrington)을 사용하여 수행하였다. 형질감염 전에, 세포는 T175 병(50 ml)에서 95% 컨플루언스때까지 성장시켰다. 62.5 μg의 플라스미드 DNA는 3.75 ml의 OptiMEM 배지 (Invitrogen) (용액 1) 및 25 μl의 PEI-MAX (6.45 mg/ml) 및 3.75 ml의 dH2O와 혼합하였다. 이어서, 용액 1 및 2는 혼합함에 이어서 상기 혼합물을 씨딩된 세포로 첨가하기 전에 RT에서 30분 동안 항온처리하였다. 형질감염 후 12일까지 동안 제2일 마다 상등액을 수거하였다.
GSTrap FF 칼럼 (GE Healthcare, UK)을 사용하여 GST-태그된 HSA 변이체를 정제하였다. 상기 칼럼을 바이오로직 워크스테이션(BioLogic workstation) 및 레코더(BIO-RAD)에 커플링시키고, 정제는 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 100 ml의 1xPBS/0.05% 아지드화나트륨 (pH 7.2)을 사용하여 상등액을 0.22 μm 진공 필터(Corning)로 멸균 여과하기 전에 칼럼을 예비 평형화시키고 0.05% 아지드화나트륨을 1-2ml/분의 유속으로 적용하였다. 이어서, 200 ml의 1xPBS/0.05% 아지드는 비특이적 결합을 세척 제거하기 위해 적용하였다. 결합된 HSA GST-융합체는 50mM의 Tris-HCl(pH 8.0) 중에서 희석된 50 ml의 10 mM 환원 글루타티온 (Sigma-Aldrich)으로 용출시켰다. 용출된 분획물을 수거하고, 상향 농축시키고, Amicon Ultra-10 칼럼 (Millipore)을 사용하여 1xPBS/0.05% 아지드로 완충액 변화시켰다. 모든 분획물은 0.5-1 mg/ml의 농도로 -20 ℃에서 저장하였다. 상기 칼럼을 세척하고 4 ℃에서 20% 에탄올 중에서 저장하였다.
인간 FcRn의 제조
절단된 단량체성 His-태그된 인간 FcRn (hFcRn)은 필수적으로 이전에 기재된 바와 같이 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 사용하여 제조하였다(문헌참조: Kim 등, supra; Popov 등, supra). 수용체는 Ni2 + 이온과 함께 공급된 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare, UK)을 사용하여 정제하였다. 사용 전에, 상기 칼럼은 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 1xPBS로 예비 평형화시켰다. 5ml 분-1의 유속으로 HisTrap HP 칼럼에 적용하기 전에 상등액의 pH는 1xPBS/0.05% 아지드화나트륨 (pH 10.9)을 사용하여 pH 7.2로 조정하였다. 200ml의 1xPBS에 이어서 50 ml의 25 mM 이미다졸/1xPBS로 세척한 후, 결합된 수용체는 50 ml의 250 mM 이미다졸/1xPBS (pH 7.2-7.4)로 용출시켰다. 단백질은 제조 프로토콜에 따라 하이로드(HiLoad) 26/600 Superdex 200 프렙 등급 칼럼 (GE Healthcare) 상에 적용하기 전에 Amicron Ultra-10 칼럼(Millipore)을 사용하여 상향농축시키고 1xPBS로 완충액 변화시켰다. 용출된 분획물을 모으고 Amicon Ultra 칼럼(Millipore)을 사용하여 상향 농축시키고 4 ℃에서 저장하였다.
표면 플라스몬 공명 ( SPR )
SPR 실험은 BIAcore 3000 장비 (GE Healthcare) 상에서 수행하고 아민 커플링 (GE Healthcare)은 CM5 칩 상에서 GST-융합된 HSA의 고정화를 위해 사용하였다. 각각 2 μg/ml를 필수적으로 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 pH 5.0에서 10mM 나트륨 아세테이트(GE Healthcare) 중에서 주사하였다. 칩 표면 상의 미반응된 모이어티는 1M 에탄올아민으로 차단하였다. 실험은 샘플의 전개 또는 희석 둘다를 위해 인산 완충액 (pH 6.0 또는 7.4에서 67 mm 인산 완충액, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20)과 함께 수행하였다. 역학적 측정은 25 ℃에서 50 μL/분의 유속으로 pH 6.0에서 고정화된 HSA 변이체 상에 단량체성 His-태그된 hFcRn (1.0-0.015 μM)의 연속 희석물을 주사함에 의해 수행하였다. 역학적 속도 값은 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 제공된 단순한 Langmuir 1:1 리간드 결합 모델을 사용하여 계산하였다. 평균 평방제곱을 나타내는 통계학적 값 χ2에 의해 기재된 피트의 폐쇄는 모든 친화성 평가에서 2.0 미만이었다. 비특이적 결합 및 벌크 완충액 효과를 보정하기 위해, 대조군 CM5 표면 및 블랭크 주사로부터 수득된 결합 반응은 각각의 상호작용 곡선으로부터 공제하였다.
결과
표 3. hFcRn에 대한 HSA DII 돌연변이체의 결합 역학
Figure pct00003
HSA 변이체는 칩 상에 고정화시키고(약 500 RU) hFcRn의 연속 희석물을 주사하였다. 역학적 속도 상수는 단순 1차 (1:1) 생분자 상호작용 모델을 사용하여 수득되었다. 역학적 값은 3회 평균을 나타낸다. 결과는 표 3 및 도 10에 나타낸다.
K573P와 조합된 V547A는 pH 6.0에서 WT HSA와 비교하여 200배 초과로 KD를 개선시켰고 이것은 엄격하게 pH 의존적으로 결합한다.
E505Q, T527M 및 K573P와 조합된 V547A는 WT HSA와 비교하여 KD를 1400배 초과로 개선시키고 이것은 덜 pH 의존적으로 결합한다.
상기 표적화된 아미노산 잔기는 도 2에서 HSA의 결정 구조 도시에서 강조된다.
실시예 3
hFcRn으로 변화된 결합을 갖는 HSA 변이체의 디자인
hFcRn으로의 증가되거나 감소된 결합과 함께, C-말단 DIII 내에 단일 점 돌연변이를 갖는 범위의 가공된 HSA 변이체를 제조하였다. 상기 HSA 변이체는 hFcRn-HSA 복합체의 도킹 모델의 조사를 기초로 작제하였다(Andersen 등, Nature communications 3, 610 2012). 여기서, 선택된 돌연변이를 HSA의 DIII로 도입하여 단일 점 돌연변이 또는 돌연변이의 조합이 hFcRn으로의 결합에 어떻게 영향을 미치는지를 조사하였다. 추가로, 일부 돌연변이 변이체는 I523G 또는 V547A와 조합하였다(WO201211218A1 및 WO 2013075066A2; 본원에서 이의 전문이 참조로 인용된다).
6개의 단일 돌연변이체; E505Q (EQ), T527M (TM), I523G (IG), V547A (VA) K573Y (KY), 및 K573P (KP), 및 이들 돌연변이체 중 10개의 조합 (표 4에 열거된 바와 같은)이 HSA의 DIII 내로 도입되었다. WT HSA를 제조하는 것뿐만 아니라, 이중 돌연변이체 K500A/H510Q (KA/HQ)는 hFcRn으로의 결합을 크게 감소시키는 것으로 이전에 나타난 2개의 점 돌연변이의 조합을 기초로 제조하였다 (Andersen 등, 2012, supra). 돌연변이된 아미노산은 도 2에서 HSA의 결정 구조 도시에서 강조된다.
표 4. 알부민 GST 변이체를 암호화하는 작제된 벡터
Figure pct00004
HSA 변이체를 암호화하는 발현 벡터의 작제
pcDNA3 벡터 (Invitrogen)는 GST 태그를 암호화하는 cDNA 단편에 융합된 HSA 변이체를 암호화하는 cDNA를 클로닝하기 위해 사용하였다. 모든 벡터는 또한 이전에 기재된 바와 같은 엡슈타인-바르 바이러스 복제 오리진(OriP)을 암호화한다 (Andersen 등, Clinical biochemistry 43, 367-372; Berntzen 등, (2005) Journal of immunological methods 298, 93-104). HSA 유전자를 암호화하는 cDNA 단편은 제조원(GenScript Inc (NJ, USA))의 pUC57 벡터에 모두 정렬되었고 수득되었다. pUC57 벡터는 제한 부위 HindIII 및 XhoI로 플랭킹하였다. 글라이신-세린(GS) 스트레치의 아미노산((GGS)4GG)을 암호화하는 DNA 서열은 N-말단에 융합된 GST 서열이다. 상기 벡터 pcDNA3-HSAwt-GST-OriP 및 pcDNA3-HSAbartin-GST-OriP는 이전에 기재되었다 (Anderson 등, 2010, supra).
HSA 융합 변이체의 제조
접착 HEK293E 세포의 일시적 형질감염은 폴리에틸렌이민(PEIMax; MW 4000; Polysciences, Inc, Warrington)을 사용하여 수행하였다. 형질감염 전에, 세포는 T175 병(50 ml)에서 95% 컨플루언스때까지 성장시켰다. 62.5 μg의 플라스미드 DNA는 3.75 ml의 OptiMEM 배지 (Invitrogen) (용액 1) 및 25 μl의 PEI-MAX (6.45 mg/ml) 및 3.75 ml의 dH2O와 혼합하였다. 이어서, 용액 1 및 2는 혼합함에 이어서 상기 혼합물을 씨딩된 세포로 첨가하기 전에 RT에서 30분 동안 항온처리하였다. 형질감염 후 12일까지 동안 제2일 마다 상등액을 수거하였다.
GSTrap FF 칼럼 (GE Healthcare, UK)을 사용하여 GST-태그된 HSA 변이체를 정제하였다. 상기 칼럼을 바이오로직 워크스테이션(BioLogic workstation) 및 레코더(BIO-RAD)에 커플링시키고, 정제는 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 100 ml의 1xPBS/0.05% 아지드화나트륨 (pH 7.2)을 사용하여 상등액을 0.22 μm 진공 필터(Corning)로 멸균 여과하기 전에 칼럼을 예비 평형화시키고 0.05% 아지드화나트륨을 1-2ml/분의 유속으로 적용하였다. 이어서, 200 ml의 1xPBS/0.05% 아지드는 비특이적 결합을 세척 제거하기 위해 적용하였다. 결합된 HSA GST-융합체는 50mM의 Tris-HCl(pH 8.0) 중에서 희석된 50 ml의 10 mM 환원 글루타티온 (Sigma-Aldrich)으로 용출시켰다. 용출된 분획물을 수거하고, 상향 농축시키고, Amicon Ultra-10 칼럼 (Millipore)을 사용하여 1xPBS/0.05% 아지드로 완충액 변화시켰다. 모든 분획물은 0.5-1 mg/ml의 농도로 -20 ℃에서 저장하였다. 상기 칼럼을 세척하고 4 ℃에서 20% 에탄올 중에서 저장하였다.
인간 FcRn의 제조
절단된 단량체성 His-태그된 hFcRn은 필수적으로 이전에 기재된 바와 같이 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 사용하여 제조하였다(Kim 등, (1999) European journal of immunology 29, 2819-2825; Popov 등, (1996) Molecular immunology 33, 521-530) 수용체는 Ni2 + 이온 (GE Healthcare, UK)이 공급된 HisTrap HP 칼럼을 사용하여 정제하였다. 사용 전에, 상기 칼럼은 0.05% 아지드화나트륨을 함유하는 1xPBS로 예비 평형화시켰다. 5ml 분-1의 유속으로 HisTrap HP 칼럼에 적용하기 전에 상등액의 pH는 1xPBS/0.05% 아지드화나트륨 (pH 10.9)을 사용하여 pH 7.2로 조정하였다. 200ml의 1xPBS에 이어서 50 ml의 25 mM 이미다졸/1xPBS로 세척한 후, 결합된 수용체는 50 ml의 250 mM 이미다졸/1xPBS (pH 7.2-7.4)로 용출시켰다. 단백질은 제조 프로토콜에 따라 하이로드(HiLoad) 26/600 Superdex 200 프렙 등급 칼럼 (GE Healthcare) 상에 적용하기 전에 Amicron Ultra-10 칼럼(Millipore)을 사용하여 상향농축시키고 1xPBS로 완충액 변화시켰다. 용출된 분획물을 모으고 Amicon Ultra 칼럼(Millipore)을 사용하여 상향 농축시키고 4 ℃에서 저장하였다.
효소 결합된 면역흡착 검정 (ELISA)
GST 융합된 HSA 변이체의 스크리닝은 미세역가 웰(Nunc)에서 4-하이드록시-3-요오도-5-니트로페닐아세트산(10 μg/ml)에 대한 특이성으로 항-인간 IgG1 돌연변이 변이체(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F)를 코팅함에 의해 수행하였다. 플레이트는 웰을 1시간 동안 실온에서 PBS/4% 스킴 밀크로 차단하기 전에 4℃에서 밤새 항온처리함에 이어서 PBS/T pH 6.0에서 4회 세척하였다. 일정량의 His-태그된 hFcRn (20 μg/ml)은 PBS/T/4% 스킴 밀크 pH 6.0에서 희석하고 웰에 첨가하고 웰을 상기와 같이 세척하기 전에 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 5 μg/ml의 GST-태그된 WT HSA 및 돌연변이 변이체를 PBS/T/4% 스킴 밀크 pH 6.0 중에서 희석하고 실온에서 2시간 동안 웰에 첨가하였다. 상기와 같이 세척한 후, 이어서 PBS/T/4% 스킴 밀크 pH 6.0 중에 희석(1:3000)된 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항-GST 항체 (GE Healthcare)를 첨가하고 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, 결합된 HSA 변이체는 테트라메틸벤지딘 기질(Calbiochem)을 사용하여 검출하였다. 흡광도는 선라이즈 분광광도기(TECAN)를 사용하여 620nm에서 측정하였다.
표면 플라스몬 공명 ( SPR )
SPR 실험은 BIAcore 3000 장비 (GE Healthcare) 상에서 수행하고 아민 커플링 (GE Healthcare)은 CM5 칩 상에서 GST-융합된 HSA 변이체의 고정화를 위해 사용하였다. 각각 2 μg/ml를 필수적으로 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 pH 5.0에서 10mM 나트륨 아세테이트(GE Healthcare) 중에서 주사하였다. 칩 표면 상의 미반응된 모이어티는 1M 에탄올아민으로 차단하였다. 실험은 샘플의 전개 또는 희석 둘다를 위해 인산 완충액 (pH 6.0 또는 7.4에서 67 mm 인산 완충액, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20)과 함께 수행하였다. 역학적 측정은 25 ℃에서 50 μL/분의 유속으로 pH 6.0에서 고정화된 HSA 변이체 상에 단량체성 His-태그된 hFcRn (1.0-0.015 μM)의 연속 희석물을 주사함에 의해 수행하였다. 역학적 속도 값은 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 제공된 단순한 Langmuir 1:1 리간드 결합 모델을 사용하여 계산하였다. 평균 평방제곱을 나타내는 통계학적 값 χ2에 의해 기재된 피트의 폐쇄는 모든 친화성 평가에서 5.0 미만이었다. 비특이적 결합 및 벌크 완충액 효과를 보정하기 위해, 대조군 CM5 표면 및 블랭크 주사로부터 수득된 결합 반응은 각각의 상호작용 곡선으로부터 공제하였다.
HSA 변이체의 카복실 코팅된 몰데이 ( Molday ) ION으로의 커플링.
1.5ml의 CL-30Q02-CA (5 mg Fe/ml) (BioPal)는 100 MWCO 스핀 칼럼 (Millipore)과 함께 50mM MES(pH 5.5)로 완충제 변화시켰다. 카복실 그룹의 활성화는 각각 600 μl 및 900 μl의 EDC 및 NHS 용액 (GE healthcare)을 첨가함에 이어서 회전 휠 상에서 실온에서 20분 항온처리함에 의해 수행하였다. 미반응된 시약을 제거하기 위해, 상기 활성화된 입자는 칼럼 제조업자의 지시에 따라 50 mM MES 완충액(pH 5.5)으로 평형화시킨 NAP-G-25 칼럼(GE healthcare) 상에 통과시켰다. 2 mg의 HSA 변이체(0.1M 중탄산나트륨 (pH 8.0) 중에 용해된)를 CL-30Q02-CA ml 당 사용하고 혼합 후 RT에서 회전 휠 상에서 120분 항온처리하였다. 후속적으로, 커플링된 입자는 100MWCO 스핀 칼럼 (Millipore)을 사용하여 1xPBS/0.05% 아지드로 완충제 변화시키고 4 ℃에서 저장하였다.
T84 트랜스사이토시스 검정
인간 상피 세포주 T84 (ATCC)는 10% 열 불활성화된 FBS, 2mM Lg 및 50U/ml PS(모두 제조원(Bio-Wittaker))가 공급된 둘베코 변형 이글 배지 DMEM(Invitrogen) 및 HAM의 F-12 배지(1:1)(Invitrogen)에 유지시켰다. 상기 세포를 습화된 5% CO2, 95% 공기 항온처리기에서 37 ℃에서 항온처리하였다. PTFE 막을 갖고 0.4 μm 공극 크기(Corning Costar, MA, USA)를 갖는 트랜스웰 필터(1.12 cm2)는 1.0x106 세포/웰을 씨딩하기 전에 성장 배지에서 ON 항온처리하였다. 트랜스상피 내성 (TER)(이는 MILLICELL-ERS volt-ohm 계량기(MILLIPORE)를 사용하여 매일 측정하였다). 상기 세포는 1000-1500 Ωxcm2의 TER 값에 도달하기 전에 4 내지 6일 동안 배양하였다. 성장 배지는 매일 교환하였다.
실험 전에, T84 단층을 세척하고 행크 HBSS 완충액 (Invitrogen)에서 1시간 동안 항온처리하였다. 정점에서 기저외측 수송의 측정을 위해, 200μl의 정상화된 HSA 변이체 (20-30 μg/ml) 또는 몰데이 ION(μl/ml, 1M MES로 조정된 pH 6.0)에 커플링된 HSA 변이체를 정점 측면에 첨가하고 이어서 기저외측 저장소로부터 500 μl HBSS 완충액으로 0 및 4시간째에 400 μl의 배지를 샘플링하였다. 반대 방향에서의 수송을 측정하는 검정에서, 500 μl HSA (8 μg/ml)를 기저외측 측면으로 첨가함에 이어서 정점 저장소로부터 0 및 4시간째에 200 μl HBSS 완충액으로 150μl의 배지를 샘플링하였다.
T84 세포를 거치는 HSA 변이체 및 접합체의 수송은 ELISA를 사용하여 정량하였다. 공지된 농도의 HSA 변이체는 표준물로서 사용하였다. 1xPBS 중에서 염소로부터의 항-GST 항체(1:5000으로 희석됨) (GE healthcare) 또는 염소로부터의항-HSA 항체(1:2000으로 희석됨)(Sigma)를 96-웰 NUNC 플레이트에 코팅시키고 4 ℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음에, PBS/T로 4회 세척하기 전에 1시간 동안 웰을 200 μl의 4% S/PBS를 사용하여 차단시킴에 이어서 S/T/PBS 중에 희석된 적정량의 수거된 배지를 첨가하였다. 상기 플레이트는 상기와 같이 세척 전에 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, S/T/PBS 중에서 1:5000으로 희석된 마우스 (Abcam) 기원의 HRP-접합된 항-HSA 항체를 첨가하고 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 상기 플레이트는 100 ml의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 용액 (Merck)을 첨가하기 전에 상기와 같이 세척하였다. 흡광도는 선라이즈 분광광도계(TECAN)를 사용하여 620nm에서 측정하였다.
결과
중성 pH에서 HSA 융합체의 결합 후보물을 비교하기 위해, 정상화된 HSA-GST 변이체를 인간 IgG 돌연변이체상에 포획된 hFcRn에 첨가하고 결합된 HSA-GST 변이체는 염소 기원의 HRP-접합된 항-GST 항체를 사용하여 검출하였고(도 11f), 이것은 어떠한 돌연변이 변이체가 중성 pH에서 수용체에 결합하지 않음을 보여주었다 (도 11).
산성 pH에서 HSA 융합체의 결합 능력을 비교하기 위해, 적정량의 정상화된 HSA-GST 변이체를 인간 IgG 돌연변이체상에 포획된 hFcRn에 첨가하고 결합된 HSA-GST 변이체는 염소 기원의 HRP-접합된 항-GST 항체를 사용하여 검출하였다. KP 및 VA는 균등하게 잘 결합하고 WT 보다 상당히 우수하고 KP/VA의 조합은 추가로 개선시킨반면 KP/EQ/TM/VA는 pH 6.0에서 모든 돌연변이체 중에서 가장 강하게 결합하였다. 중성 pH에서, 돌연변이 변이체 중 어떠한 것도 강하게 결합하는 KP/EQ/TM/VA를 제외하고는 검출가능한 결합을 보여주지 않았다.
HSA가 내인성 hFcRn을 발현하는 상피 층을 거쳐 FcRn-의존성 양상으로 수송될 수 있는지를 조사하기 위해, 트랜스웰 시스템을 사용하여 FcRn 매개된 IgG 수송을 측정하였다. 먼저, 비융합된 WT HSA 및 KP의 수송은 양 방향으로 측정하였다. 효율적인 수송은 단지 정점에서 기저외측 방향으로 측정하였고, 여기서, KP는 WT 보다 많이 수송되는 것으로 나타났다(도 15). 기저외측에서 정점 방향에서, 단지 최소량의 KP 변이체가 수송되는 것으로 나타났고 어떠한 WT는 검출되지 않았다(도 13).
추가로, WT HSA-GST는 KA/HQ-GST와 비교하였고, 동등한 양의 이들을 트랜스웰 시스템의 정점저장소로 첨가하였다. 샘플은 정점 측면으로의 첨가 후 0 및 4시간 시점에서 기저외측 저장소로부터 수거하였다. 수송된 HSA 융합체는 ELISA를 사용하여 정량하였고, 여기서, 상기 융합체는 항-GST 항체 상에서 포획하고 결합된 융합체는 HRP-접합된 항-HSA 항체를 사용하여 검출한다. 수송 효능에서 두드러진 차이는 WT 융합체가 hFcRn으로의 결합이 없는 이중 돌연변이체 (KA/HQ) 보다 5배 더 많이 수송되는 것으로 검출되었다 (도 14). 따라서, 이들 데이터는 인간 상피에서 발현된 FcRn이 세포 층을 거쳐 HSA를 트랜스사이토스할 수 있음을 강하게 지지한다. 이어서, hFcRn으로의 개선된 결합을 갖는 HSA 변이체(KP)가 WT 대응물 보다 더 효율적으로 트랜스사이토스되는지의 여부를 평가하였다(도 14). 단일 KP 돌연변이의 도입이 WT와 비교하여 거의 3배까지 수송 효율을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (도 16). 단일 돌연변이체 EQ 및 TM은 KP를 제외하고는 WT 보다 더 효율적으로 수송되었고 KP/TM/EQ 의 조합은 대략 KP와 비교하여 대략 2배 증진된 수송을 유도하였다(도 14).
다음에, VA의 정점에서 기저외측으로의 트랜스사이토시스는 KP/VA 및 KP/TM/EQ/VA의 것과 비교하였고, KP/VA가 VA 보다 3배 더 효율적으로 수송되는 것으로 밝혀졌고(도 15), 2개의 pH 조건에서 강하게 결합하는 KP/TM/EQ/VA는 수송되지 않았다(도 15).
이어서, HSA에 접합된 NP가 양극화된 세포 층을 거쳐 셔틀될 수 있는지를 평가하였다. WT HSA 및 KA/HQ는 FcRn에 대한 결합 부위로부터 원거리에 있는 DI 내에서 유리 시스테인 잔기를 통해 NP에 부위 특이적으로 접합되었다. NP는 정점 측면으로 첨가하였고 세포를 거쳐 수송되고 기저외측에서 방출되는 양을 정량하고 WT HSA에 접합된 NP가 KA/HQ 보다 2배 더 많이 수송됨을 보여주었다(도 16).
상기 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 문헌은 본원에서 참조로 인용된다. 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 취지로부터 벗어나는것 없이 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 양태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 바와 같은 발명이 상기 특이적 양태로 과도하게 제한되지 말아야하는 것으로 이해되어야만 한다. 실제로, 관련 분야에서 당업자에게 자명한 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기의 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
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Claims (43)

  1. 야생형 HSA 또는 MSA에 상대적으로 증가된 친화성으로 FcRn에 결합하는 변이체 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 마우스 혈청 알부민 폴리펩타이드(MSA)로서, 상기 폴리펩타이드가 적어도 하나의 변이체 아미노산을 포함하는, 변이체 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 마우스 혈청 알부민 폴리펩타이드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 10nM 이하의 Kd로 HSA 또는 MSA에 결합하는, 폴리펩타이드.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 5nM 이하의 Kd로 HSA 또는 MSA에 결합하는, 폴리펩타이드.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 1nM 이하의 Kd로 HSA 또는 MSA에 결합하는, 폴리펩타이드.
  5. 청구항 2 내지 4 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 Kd가 산성 pH에서 측정되는, 폴리펩타이드.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 야생형 알부민 보다 높은 수준에서 양극화된 인간 세포를 횡단하여 수송되는, 폴리펩타이드.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 수송 수준이 양극화된 인간 세포 검정에서 4시간 후 ng/ml로 측정되는, 폴리펩타이드.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 더 높은 수준이 야생형 알부민 보다 적어도 2배 높은, 폴리펩타이드.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 더 높은 수준이 야생형 알부민 보다 적어도 3배 높은, 폴리펩타이드.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 더 높은 수준이 야생형 알부민 보다 적어도 5배 높은, 폴리펩타이드.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 변이체 폴리펩타이드가 서열번호 1과 적어도 80% 동일한, 폴리펩타이드.
  12. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 변이체 폴리펩타이드가 서열번호 1과 적어도 90% 동일한, 폴리펩타이드.
  13. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 변이체 폴리펩타이드가 서열번호 1과 적어도 95% 동일한, 폴리펩타이드.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 치환이 서열번호 1의 아미노산 547, 573, 523, 253, 527, 500, 및 505 중 하나 이상 또는 MSA의 위치 500 또는 510에 있는, 폴리펩타이드.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 치환이 서열번호 1의 K573Y, I523G, I523A, T527M, E505Q, K573P, K573Y/I523G, K573Y/I523G/T527M, K573Y/E505Q/T527M, K573Y/T527M, K573P/I523G, K573P/I523G/T527M, K573P/E505Q/T527M, K573P/T527M, V547A, V547A/K573P, V547A/E505Q/K573P/T527M, 또는 K500A/H510Q, HSA의 도메인 III의 결실 또는 야생형 MSA의 K500A/H510Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  16. 변이체 인간 혈청 알부민(HSA) 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 547, 573, 523, 253, 527, 500, 및 505로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열번호 1의 위치에서 하나 이상의 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 치환이 K573Y, I523G, I523A, T527M, E505Q, K573P, K573Y/I523G, K573Y/I523G/T527M, K573Y/E505Q/T527M, K573Y/T527M, K573P/I523G, K573P/I523G/T527M, K573P/E505Q/T527M, K573P/T527M, V547A, V547A/K573P, V547A/E505Q/K573P/T527M 및 K500A/H510Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  18. 변이체 인간 혈청 알부민 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 1의 도메인 III의 결실을 포함하는, 폴리펩타이드.
  19. 변이체 마우스 혈청 알부민(MSA) 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 야생형 MSA의 위치 500번 및/또는 510번에서의 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 치환이 야생형 MSA의 K500A/H510Q인, 폴리펩타이드.
  21. a) 알부민 변이체, 이의 단편 또는 이의 융합체; 및 b) 접합체를 포함하는 융합 단백질.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 알부민 변이체가 야생형 알부민과 비교하여 증가된 결합 친화성으로FcRn에 결합하는, 융합 단백질.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 알부민 변이체가 청구항 1 내지 20 중 어느 한 청구항의 알부민 변이체인, 융합 단백질.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 접합체가 티올 그룹을 포함하는 아미노산에 공유적으로 접합된, 융합 단백질.
  25. 청구항 21 내지 24 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 접합체가 면역원인, 융합 단백질.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 면역원이 대상체에서 면역 반응을 유도하는, 융합 단백질.
  27. 청구항 1 내지 26 중 어느 한 청구항의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  28. 청구항 27의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  29. 청구항 21 내지 26 중 어느 한 청구항의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신 조성물.
  30. 대상체가 면역 반응을 생성시키는 조건하에서 청구항 29의 백신 조성물을 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 백신이 대상체의 점막 표면으로 전달되는, 방법.
  32. 청구항 30에 있어서, 상기 백신이 비강내로 또는 흡입을 통해 전달되는, 방법.
  33. 대상체에서 면역 반응을 유발하기 위한 청구항 29의 백신 조성물의 용도.
  34. 백신 조성물에서 청구항 21 내지 26 중 어느 한 청구항의 융합 단백질의 용도.
  35. 하기를 포함하는 백신 조성물:
    a) 야생형 알부민 폴리펩타이드 및 접합체를 포함하는 융합 단백질; 및
    b) 약제학적으로 허용되는 담체.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 접합체가 면역원인, 백신 조성물.
  37. 청구항 35에 있어서, 상기 백신이 에어로졸화된, 백신 조성물.
  38. 대상체가 면역원에 대해 면역 반응을 생성하도록 하는 조건하에 청구항 34 내지 36 중 어느 한 청구항의 백신 조성물을 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 백신 조성물이 상기 대상체의 점막 표면으로 전달되는, 방법.
  40. 청구항 38에 있어서, 상기 백신 조성물이 비강내로 전달되는, 방법.
  41. 상기 면역원에 대해 대상체에서 면역 반응을 생성하기 위한 청구항 35 내지 37 중 어느 한 청구항의 백신 조성물의 용도.
  42. 청구항 40에 있어서, 상기 백신 조성물이 상기 대상체의 점막 표면으로 전달되는, 용도.
  43. 청구항 40에 있어서, 상기 백신 조성물이 비강내로 전달되는, 용도.
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