JP3723231B2 - アジュバント - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、アジュバント及びそれらのアジュバントを含むワクチンに関する。本発明によれば、アジュバントは、全体の疎水性を維持しながら、アニオン基を供給され得るか又は供給され得ない少なくとも１つの合成疎水性リポ多糖、界面形成性成分及び場合によっては、水性溶質を含むエマルジョンを含んで成る。
【０００２】
それらのアジュバントは、動物又はヒトワクチンの調製に使用され得る。
前記合成の疎水性リポ多糖の一部を形成するポリ多糖は、８〜４０個の炭素原子の直鎖又は枝分れ鎖の脂質基によりエステル化され；それらの脂質基は脂肪族又は不飽和であり得、そして場合によっては、芳香族基を含むことができる。多糖類の糖基に対する脂質基の平均割合は好ましくは、０．２〜４及びより特定には約１であり得る。
【０００３】
場合によっては、リポ多糖は、アニオン基、たとえばホスフェート、スルフェート、ニトレート、又はカルボキシル基、好ましくはスルフェート基を、全体の疎水性を維持しながら、供給される。好ましくは、糖基に対するアニオン基の平均割合は０．１〜２の間である。
【０００４】
ＳＬＰの疎水性は、Griffin の方法(W.C.Griffin, J.Soc.Cosmet.Chem., 1, 311, 1949) に従って決定され、そしてPorter(M.R.Porter, Handbook of surfactants, Blackie, Glasgow and London, 1991 、42ページ）により引用される、水における界面活性剤の外観に親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）により定義される。疎水性ＳＬＰのＨＬＢ値は９以下であり（すなわち、不溶性で且つ不安定な分散体又は安定した不透明な分散体）、そして特にそれは４以下であり得る（すなわち不溶性）。
【０００５】
界面形成性成分の例は次のものである：
ａ．水性相と不混和性の液体、たとえば鉱物、動物、植物又は合成油、又は他の有機液体、
ｂ．不溶性塩、たとえばＡｌ（ＯＨ）3 ，ＡｌＰＯ4 、カルシウム−オキサレート、ひる石、ベントナイト、シリカ、
ｃ．１又は複数のポリマー又はコポリマー、たとえばポリアクリレート、ポリ（メチル−メタクリレート）、ポリシアノアクリレート、多糖、ポリペプチド、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸／グリコール酸）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンの微小粒子／微小球体、
ｄ．親水性物質、たとえばリン脂質、第四アミンの脂質二重層、
ｅ．１又は複数の次の界面活性剤のミセル：
−アニオン性（たとえばカルボキシレート、ポリアルコキシカルボキシレート、Ｎ−アシルサルコシネート、アシル化されたタンパク質加水分解物、スルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、エステル結合を有するスルホネート、アミド結合を有するスルホネート、エーテル結合を有するスルホネート、アルコールスルフェート、ホスフェートエステル）、
−非イオン性（たとえばエトキシレート、アルコールエトキシレート、カルボン酸エステル、グリセロールエステル、ポリオキシエチレンエステル、カルボン酸アミド、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリアルキレンオキシドブロックコポリマー）、
−カチオン性（たとえばアミン、酸素含有アミン、２−アルキル−１−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダゾリン、第四アミン）、及び
−両性（たとえばイミダゾリウム誘導体）の界面活性剤。
【０００６】
実質的な観点から、ＳＬＰ安定配合物と組合され、そして受容体（動物又はヒトのいづれか）により十分に耐えられる界面形成性物質が好ましい。この観点において、動物及び植物起原の油、不溶性塩、たとえばＡｌ（ＯＨ）3 及びＡｌＰＯ4 、及び動物又は植物起原のリン脂質の脂質二重層が特に適切である。
【０００７】
下記に記載される実験においては、鉱油又はスクアランが界面形成性成分として使用される。スクアランは、動物起原の油であり、そして従って生物適合性及び生物分解性が予測されるので好ましい。
【０００８】
水中油又は油中水エマルジョンの安定性を改良するために適切な親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する界面活性剤の例（種々の商標名を含む）は、次のものである：
ａ．アニオン性界面活性剤、たとえばＳａｎｄｏｐａｎ ＫＳＴ；
ｂ．非イオン性界面活性剤、たとえばＢｒｉｊ型番号３０，３５，５８，９８，７２１，Ｔｒｉｔｏｎ型番号Ｎ−５７，Ｘ−１００，Ｘ−１０２，Ｓｐａｎ型番号２０，４０，６０，８０，８５，Ｔｗｅｅｎ型番号２０，２１，４０，６０，８０，８５，Ｐｌａｒｏｎｉｃ型番号ＰＥ１０１００，ＰＥ１０５００，ＲＰＥ２５１０，ＲＰＥ２５２０；
ｃ．カチオン性界面活性剤、たとえばＡｏｑｕａｔ２ＨＴ−７５，Ａｒｏｓａｒｆ ＴＡ１００、ビス（水素化牛脂アルキル）ジメチルアンモニウムクロリド；
ｄ．両性界面活性剤、たとえばＬｏｎｚａｉｎｅ型番号１０Ｓ，１２Ｃ，１６Ｓ，Ｓｃｈｅｒｏｔａｉｎｅ型ＣＡＢ，ＩＡＢ，ＭＡＢ，Ａｍｐｈｏｓａｌ．
【０００９】
下記実験においては、非イオン性界面活性剤及び特にＴｗｅｅｎ８０が、ＳＬＰ及び油のエマルジョンを安定化するために使用された。
【００１０】
動物油の例はスクアラン及びスクアレンである。適切な植物油は、ダイズ、ピーナッツ、ゴマ、ヤシ、等から得られる。鉱油の例は、Ｍａｒｋｏｌ５２，Ｋｒａｋｅｌ，Ｋｒｅｍｏｌ、等である。
【００１１】
本発明のアジュバントに使用するための水性溶質は、たとえば塩溶液、リン酸緩衝溶液又は純粋な水である。
本発明のアジュバントは好ましくは、まず、合成疎水性リポ多糖及び油を混合し、そしてさらに、その油状塊状物を水に分散することによって、又はまず、リポ多糖と界面活性剤とを混合し、水を添加し、そして得られた水相に油を分散することによって調製される。
【００１２】
本発明のアジュバントは、ヒト及び動物のためのワクチンへの使用にも向けられる。そのワクチンは、ウィルス、細菌、マイコプラズマ又は寄生体のために特有な、又は免疫応答の上昇を意図されるいづれか他の物体のために特有な抗原性物質を含むことができる。この抗原性物質はたとえば、生存生物、不活性化された生物又はいわゆるサブユニット（たとえば合成的に又は組換えＤＮＡ法により調製され、又は損なわれていない生物から単離される）から成り又は含むことができる。ワクチンの調製のためには、抗原性物質は、使用の十分前又は使用のすぐ前で混合される。
本発明は次の例によりさらに例示される。
【００１３】
【実施例】
例 １：
アジュバントとしてのＳＬＰ−分散体の使用
下記実験においては、親油性スルホリポ多糖（ＳＬＰ）−誘導体、すなわち約０．１：０．８：１．０のスルフェート：脂質：単糖の平均比を有するＳＬＰ−誘導体が、特にことわらない限り使用された。
【００１４】
異なった実験において使用されるワクチンは、次の態様の１つで調製された：Ｉ．ＳＬＰを適切な濃度で油相（スクアラン）に溶解した。ＳＬＰの溶解は、スクアランをわずかに加熱することによって改良され得た（７０℃）。続いて、油相を、７０℃で予備加熱された水性相（２％Ｔｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液）に添加し、そして激しく撹拌した。得られたプレーエマルジョンを、超音波破壊器により又は微小流動化することによりさらに乳化した。エマルジョンは、油滴が１μｍよりも小さい場合（１０００倍での相対比顕微鏡により測定される）、すぐ使用されると思われる。ワクチンは、１体積のアジュバント溶液（約４℃）と１体積の抗原溶液とを混合することによって調製された。
ＳＬＰの量は、対照としてＦｉｃｏｌｌを用いての糖含有量として表わされる（乾燥材料は約２倍高い）。
【００１５】
II. ＳＬＰを有機溶媒（たとえばエタノール、クロロホルム又はジクロロメタン）に溶解し、そして油と共に混合した。溶媒を６０又は７０℃及び低圧での集中的な蒸発により除去した。続いて、油相を、７０℃で予備加熱された水性相（２％のＴｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液）に激しく撹拌しながら添加した。得られるプレーエマルジョンを超音波破壊器又は微小流動化によりさらに乳化した。エマルジョンは、油滴が１μｍよりも小さい場合（１０００倍での相対比顕微鏡により測定される）、すぐ使用されると思われる。ワクチンは、１体積のアジュバント溶液（約４℃）と１体積の抗原溶液とを混合することによって調製された。
【００１６】
III. ＳＬＰをアジュバント溶液（たとえば水中鉱油エマルジョン）に添加し、そしてＳＬＰを超音波破壊器により分散した。アジュバント溶液は、沈殿物がマクロスコーピー（４０倍）及び顕微鏡（４００−及び１０００倍）により見えなければ、すぐ使用されると思われた。１体積のアジュバント溶液を１体積の抗原溶液と混合した。
【００１７】
IV. ＳＬＰ、油、及び２％のＴｗｅｅｎ８０を含む水性相を容器に置き、激しく混合し、そして続いて、超音波破壊器又は微小流動化により、温度を約７０℃に維持しながら、乳化した。そのエマルジョンは、油滴が１μｍよりも小さい場合（１０００倍での相対比顕微鏡により測定される）、すぐ使用されると思われた。ワクチンは、１体積のアジュバント溶液（約４℃）と１体積の抗原溶液とを混合することによって調製された。
【００１８】
Ｖ．ＳＬＰを適切な体積の液体界面活性剤（たとえばＴｗｅｅｎ８０）に溶解し、そして水性相を激しく混合しながら添加し、透明な又は乳白光懸濁液を得た。この懸濁液にスクアランを添加し、そしてその混合物を微小流動化により乳化した。
【００１９】
VI. Ｖと同じであるが、但し、有機溶質におけるＳＬＰを液体界面活性剤（たとえばＴｗｅｅｎ８０）と共に混合し、そして有機相を水性相の添加の前又は後で蒸発せしめた。有意な差異はアジュバント活性に見出されないが、調製方法Ｉ，II，Ｖ及びVIは、比較的容易な方法であり、そして大規模な製造のために容易に適用できるので、好ましい。
【００２０】
典型的なＳＬＰ／Ｓ／Ｗ（スルホリポ多糖／スクアラン／水）アジュバントワクチンは、１ml当たり、次の成分を含んで成る：２．５mgＳＬＰ，０．０５ml（４０mg）のスクアラン、０．０１ml（１０mg）のＴｗｅｅｎ８０。使用されるＳＬＰ誘導体は、０．８／０．１の平均脂質／スルフェート含有率（多糖における単糖当たりの基の数）を有した。
【００２１】
例 ２
マウス及びテンジクネズミにおける種々の抗原のためのアジュバントとしてのＳＬＰ−Ｈ２／スクアラン／水
材料及び方法
動 物
ランダムなＳｗｉｓｓ雌マウス及びテンジクネズミを、オランダのHarlan, Zeist から得た。生後、約１０週で、５匹の動物のグループを、０及び３週目で、０．２mlのワクチンにより皮下（ｓｃ）、腹腔内（ｉｐ）又は筋肉内（ｉｍ）感作し、そして血液を、特にことわらない限り、３及び６週で収集した。
【００２２】
ＳＬＰ−Ｈ２／スクアラン／水アジュバント
有機溶媒（ジクロロメタン又はクロロホルムのいづれか）中、ＳＬＰ−Ｈ２を、スクアラン(Sigma Chem.Comp.St.Louis, USA) と共に混合し、そして有機溶媒を、低圧及び６０℃で少なくとも６時間、Rotavapar(Badil Lab.-Technik AG, Switzerland) での蒸発により除去した。ＳＬＰを含むスクアランを、２％のＴｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ／２％Ｔｗｅｅｎ８０）と共に混合し、そしてその混合物を２段階で乳化した。プレーエマルジョンを、激しく振盪することによって製造した。続いて、そのプレーエマルジョンを、圧力を徐々に高めながら（２００〜６００大気圧）、２又は３回のサイクルで、微小流動化した(Microfluidics Corp.Newton, USA)。得られたエマルジョンを、顕微鏡（１０００倍）及び微小粒子−サイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により油滴の大きさの評価により分析した。その乳化工程は、ほとんどの液滴が１μｍ以下の直径を有し、そして１０μｍ以上の直径を有する粒子が存在しなくなるまでくり返えされた。メルチオレートをＳＬＰ−Ｈ２／Ｓ／水エマルジョンに０．０１％の最終濃度で添加し、そしてアジュバントを４℃で貯蔵した。使用されるアジュバント溶液は、１ml当たり５mgのＳＬＰ，０．１ml（８０mg）のスクアラン及び０．０２ml（２０mg）のＴｗｅｅｎ８０を、特にことわらない限り含んだ。
【００２３】
ワクチン及び予防接種
試験されるワクチンを、１体積の抗原溶液と１体積のアジュバント溶液とを、注射の少なくとも１日前に混合することによって調製した。マウスは、アジュバントを含むか又は含まない次のワクチンのうち１つのワクチン０．２mlを受けた：
ワクチンＩは、投与量当たり１０μｇのジニトロフェニル化されたウシ血清アルブミンを含んだ（実験Ｉ）；
ワクチンIIは、投与量当たり１０μｇのＤＮＰ−ＢＳＡ、１μｇのＭＲＣ−１１及び１０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）を含んだ（実験II）；
ワクチンIII は、投与量当たり１μｇのＭＲＣ−１１及び１０μｇのＯＶＡを含んで（実験III 、IV及びＶ）；そして
ワクチンVIは、５log １０ＴＣＩＤ５０不活性化狂犬病ウィルス粒子（ｉＰＲＶ）、０．４４μｇのＡ／Ｓｗｉｎｅ，０．４μｇのＭＲＣ−１１及び０．２μｇのＸ−７９を含んだ（実験VI）。テンジクネズミに、アジュバントを含む又は含まないワクチンIVを注射した。ワクチンIVの抗原組成物は、ブタＳｕｖａｘｙｎ ｉＡｕｊ／Ｆｌｕ３ワクチンの抗原組成物に相当し、そしてブタのための投与量の１／１０をマウス又はテンジクネズミに注射した。
【００２４】
次のアジュバントをマウスで試験した：
１．投与量当たり４０mgの油を含む、鉱油（Ｍａｒｋｏｌ５２）／リン酸緩衝溶液＋１％Ｔｗｅｅｎ８０（Ｏ／Ｗ）のエマルジョン（グループ１８２）；
２．投与量当たり０．５mgのＳＬＰ及び４０mgの鉱油（Ｍａｒｋｏｌ５２）を含むＳＬＰ／Ｏ／Ｗのエマルジョン（グループ１８８）；
３．投与量当たり８mgのスクアランを含むスクアラン／Ｗ（Ｓ／Ｗ）のエマルジョン（グループ９５１，１０６３，１０８３，１６８８及び２３２２）；
４．投与量当たり０．５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ９５２，９５３，１０６２，１０８２，１６９１，１９６６及び２３３４）；
５．投与量当たり１．０mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６９２）；
６．投与量当たり２．５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６９３）；
７．投与量当たり２mgのスクアランを含むＳ／Ｗのエマルジョン（グループ１６８３）；
８．投与量当たり０．５mgのＳＬＰ及び２mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６８５）；
９．投与量当たり１．０mgのＳＬＰ及び２mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６８６）；
１０．投与量当たり２．５mgのＳＬＰ及び２mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６８７）；
１１．投与量当たり０．５mgのＳＬＰを含む、Ｔｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ／Ｔ）におけるＳＬＰの懸濁液（グループ９７３，９７４，１０６１，１０８１，１９６４及び２３２７）；
１２．投与量当たり０．２mgのＳＬＰを含む、Ｔｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ／Ｔ）におけるＳＬＰの懸濁液（グループ１９６２）；及び１３．投与量当たり８mgのスクアラン及び０．５mgのＦｉｃｏｌｌを含むＳ／Ｗ＋Ｆｉｃｏｌｌのエマルジョン（グループ１９９８）。
【００２５】
次のアジュバントをテンジクネズミで試験した：
１．投与量当たり４０mgの油（Ｍａｒｋｏｌ５２）を含むＯ／Ｗのエマルジョ ン（実験IV、グループ１；実験Ｖ、グループ２）；
２．投与量当たり８mgのスクアランを含むＳ／Ｗのエマルジョン（実験Ｉ、グループ２；実験II、グループ４；実験III 、グループ９；実験IV、グループ６；実験Ｖ、グループ３）；
３．投与量当たり０．５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（実験Ｉ、グループ３；実験II、グループ５；実験III 、グループ１０；実験Ｖ、グループ８）；
４．投与量当たり０．２５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（実験IV、グループ７）；
５．投与量当たり１．２５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（実験IV、グループ８）。
【００２６】
次のアジュバントをブタで試験した：
１．投与量当たり４００mgの油を含むＯ／Ｗのエマルジョン；
２．投与量当たり８０mgのスクアランを含むＳ／Ｗのエマルジョン；
３．投与量当たり５mgのＳＬＰ及び８０mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン；及び
４．投与量当たり５mgのＳＬＰを含む、ＰＢＳ／ＴにおけるＳＬＰの懸濁液。
【００２７】
血清における抗体力価の決定
抗−ＤＮＰ−ＢＳＡ抗体応答を、指示細胞としてジニトロフェニル化された羊赤血球細胞（ＤＮＰ−ＳＲＢＣ）を用いて、血球凝集（ＨＡ）反応により測定した。手短に言及すれば、血清を、丸底の９６ウェルプレートにおいて、１％の正常なウサギ血清を含む塩溶液（羊赤血球細胞により予備吸着された）により連続的に２倍に希釈し、そしてＤＮＰ−ＳＲＢＣ懸濁液を添加した。ちょうど凝集を付与する逆血清希釈度がその力価であると思われた。抗−ＯＶＡ抗体応答を、ＯＶＡにより結合されるＳＲＢＣの血球凝集により測定した。
【００２８】
抗−ｉＰＲＶ抗体力価を、血清中和試験（ＳＮ）により測定した。手短に言及すれは、血清を９６−ウェルプレートにおいて２倍に連続的に希釈した。その血清希釈溶液を、１００ＴＣＩＤ５０のＡｕｊｅｓｚｋｙウィルス懸濁液と組合した。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、ウェル当たり２．１０ｅ４ＰＤ５−細胞を血清−ウィルス混合物に添加した。３７℃での５日間のインキュベーションの後、ウィルスプラークを数え、そしてウィルスの５０％中和を引き起こす血清の逆希釈度がその抗体力価であると思われた。
【００２９】
抗−ｉＦｌｕ抗体力価を、血球凝集阻害反応（ＨＩ）により測定した。血清を、９６−ウェル丸底プレートにおいて１体積の血清を４体積のカオリン（それぞれ５０μｌ＋２００μｌ）に添加することによって、カオリンにより前処理した。室温で３０分間のインキュベーションの後、カオリンを回転除去し、そして上清液を集め、そして丸底の９６−ウェル丸底プレートにおいて、０．１％のＢＳＡを含むベロナール緩衝溶液に連続的に２倍に希釈した。インフルエンザウィルスの４つのＨＡ単位をウェルに添加し、そしてプレートを室温で１時間インキュベートした。ニワトリ赤血球細胞を、０．１％のＢＳＡを含むベロナール緩衝溶液により３度洗浄し、そして０．２５％の濃度でウェルに添加した。３０分後及び２時間以内に、凝集が検出され、そして血球凝集の阻害を示す最高の逆血清希釈度がその力価であると思われた。
【００３０】
結 果
マウスにおけるアジュバント性
種々の抗原に対する抗体応答のためにＳＬＰ／Ｓ／Ｗのアジュバント性を、６種の別々の実験においてマウスで研究した（表１）。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗの効果を、アジュバントを含まない、ＳＬＰ，Ｓ／Ｗ，Ｏ／Ｗ又は抗原と比較した。ＤＮＰ−ＢＳＡに対する抗体応答は、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗにより有意に増強されたが、しかしＯ／Ｗによりは増強されなかった（実験Ｉ）。ＳＬＰは単独でＳＬＰ／Ｓ／Ｗよりも効果的でなく、そしてＳ／Ｗは、ＳＬＰ又はＳＬＰ／Ｓ／Ｗの両者よりも効果的でなかった（実験III)。抗−ＭＲＣ−１１抗体応答は、試験される種々のアジュバントにより有意に刺激された。ＳＬＰ／Ｓ／ＷはＳ／Ｗ単独よりもより効果的である（但し実験IIを除く）。ＳＬＰは単独で、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗのアジュバント性に相当するか（実験IIIa，IIIb及びVIb)、又はそれよりも低い（実験II，Ｖ，VIa)相当のアジュバント性を示した。抗−ＭＲＣ−１１抗体応答は、ＳＬＰの投与量の上昇及びＳＬＰ／Ｓ／Ｗおけるスクアランの量の上昇と共に高まった（実験Ｖ）。ＯＶＡに対する抗体応答は、ＳＬＰ，Ｓ／Ｗ及びＳＬＰ／Ｓ／Ｗにより増強されたが、しかしＳＬＰ／Ｓ／ＷはＳＬＰ又はＳ／Ｗのみよりも有意により効果的であった（実験II，IIIa，IIIb及びIV）。抗−ＯＶＡ応答のためのＳＬＰ／Ｓ／Ｗのアジュバント性は、試験された範囲内でのＳＬＰ又はスクアランの量の上昇と共に上昇しなかった。ｉＰＲＶに対する体液性応答を測定し、そしてＳＬＰ／Ｓ／Ｗはその応答を有意に増強し（実験VIa 及びVIb)、そしてＳ／Ｗよりもより効果的であることがわかった。ＳＬＰは単独で、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗとほぼ同じくらい効果的であった。それらの結果は下記表１Ａ及び１Ｂに要約される。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】
テンジュクネズミにおけるアジュバント性
ブタｉＰＲＶ＋ｉＦｌｕ３ワクチンに対する抗体応答に対するＳＬＰ／Ｓ／Ｗの効果を、テンジュクネズミにおけるＳ／Ｗ及びＯ／Ｗの効果と比較した。この動物種は、ブタワクチン、及びｉＰＲＶ及びｉＦｌｕ成分に対する抗体応答のためのモデルとして集中的に使用されており、そしてブタにおけるワクチンの効能のための表示であると思われる。
【００３４】
５匹の動物のグループを、０週及び３週で、ワクチン０．２mlにより皮下感作し、そして抗体力価を６週で測定した。次のワクチン組成物が試験された：
ａ．不活性化された狂犬病ウィルスのためのＳＬＰ／Ｓ／Ｗ（表２；実験Ｉ−Ｖ）、
ｂ．活性化されたインフルエンザウィルス株Ａ／Ｓｗｉｎｅ，ＭＲＣ−１１及びＸ−７９のためのＳＬＰ／Ｓ／Ｗ（実験IV及びＶ）。
実験Ｉ−III は、ｉＰＲＶに対する抗体力価が水中スクアラン（Ｓ／Ｗ）及びＳＬＰ／Ｓ／Ｗにより有意に増強され、そしてＳＬＰ／Ｓ／ＷがＳ／Ｗよりも効果的であることを示す。
【００３５】
【表３】
【００３６】
実験IV及びＶにおいては、抗−ｉＰＲＶ抗体力価における小さな差異が種々のグループ間に見出された。しかしながら、それらの実験においては、抗−ｉＦｌｕ３抗体における有意な差異が見出された。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ及びＯ／Ｗは、Ｓ／Ｗ又は抗原のみよりも高い抗体力価を誘発した。ＳＬＰ／Ｓ／ＷはＯ／Ｗと同じくらい効果的であった。
【００３７】
例 ３
ブタにおけるｉＰＲＶ，ｉＦｌｕ、およひ生存ＰＲＶのためのアジュバントとしてのＳＬＰ−Ｈ２／スクアラン／水
材料及び方法
ブ タ
生後約１０週の５匹のブタのグループを、この実験に使用した。動物を、０週及び３週でワクチン２．０mlにより範囲内感作し、そして血液を６週で集めた。
【００３８】
ワクチン及び予防接種
試験されるワクチンは、１体積の抗原溶液及び１体積のアジュバント溶液を含んだ。抗原溶液は、６log １０ＴＣＩＤ５０不活性化狂犬病ウィルス粒子、４．４μｇのインフルエンザウィルス株Ａ／Ｓｗｉｎｅ，４．０μｇのＭＲＣ−１１及び２．０μｇのＸ−７９を含んだ。使用されるアジュバント溶液は、前記のようなＳＬＰ／Ｓ／Ｗ（アジュバント１ml当たりＳＬＰ５mg及びスクアラン８０mg）又は標準の水中鉱油エマルジョン（５０％鉱油）のいづれかであった。凍結乾燥された生存ＰＲＶを、希釈溶液又はアジュバント溶液（希釈剤により前もって１：１に希釈された）に再構成し、そして１０分以内に注射した。
【００３９】
結 果
ｉＰＲＶ及びｉＦＬＵ３に対する抗体応答の刺激
５種々の別々の実験において、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗのアジュバント性を、ブタにおける標準のＯ／Ｗのアジュバント性と比較した。少なくとも５匹のブタのグループを、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ又は標準のＯ／Ｗにより組合されたｉＰＲＶ＋ｉＦＬＵ３、又はアジュバントを含まないｉＰＲＶ＋ｉＦＬＵ３により感作した（表３）。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる感作の後に測定された抗−ｉＰＲＶ抗体力価は、Ｏ／Ｗにより誘発された力価とは有意に異ならなかった（ｐ＞０．２０）。５種のうち４種の実験において、異なったインフルエンザウィルス株に対する３〜４倍高い力価が、標準のＯ／Ｗに比較して、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる注射の後、検出された。その結果及び統計学的分析の組合せがＡ／Ｓｗｉｎｅ（ｐ＜０．０１），ＭＲＣ−１１（ｐ＜０．０１）及びＸ７９（ｐ＜０．０１）に対する力価において有意な上昇を証明した。
【００４０】
【表４】
【００４１】
７匹のブタのグループを、０週及び３週で、ｉＰＲＶ＋ｉＦｌｕ３＋アジュバントにより感作した。
抗体力価を６週で測定した。上昇因子を次の式により計算した：２ｅ（ＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる力価−Ｏ／Ｗによる力価）。ＳＬＰ／Ｓ／ＷとＯ／Ｗとの間の差異のＰ値を、スチューデント試験により計算した。＞０．０５の他は、有意ではないと思われた。ＮＳ：有意でない；Ｓ：有意。実験IVのグループ１の１５匹の動物のうち４匹の動物は、インフルエンザ株ＭＲＣ−１１に対する有意な抗体応答を生成しなかったが（それらの動物における平均力価は＜５．６であった）、しかし他の抗原に対する正常な応答が測定された。
【００４２】
【表５】
【００４３】
生存ＰＲＶに対する抗体応答の刺激
４種の別々の実験において、生存ＰＲＶに対する抗体応答に対するＳＬＰ／Ｓ／Ｗ及び標準のＯ／Ｗの効果を研究した。ブタを２度感作し、そして抗−ＰＲＶ抗体力価を、個々の感作の３週間後に測定した。すべての場合、低い〜中ぐらいの高さの抗体力価が、最初の注射の後に観察され、そして力価は、第２回目の感作により高まった（表４）。希釈剤における生存ＰＲＶと比較して、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ及びＯ／Ｗは、最初の感作の後、抗体力価をわずかに高めた。２回目の感作の後、抗体力価はＳＬＰ／Ｓ／Ｗ及びＯ／Ｗにより有意に高められた。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗは２３倍の上昇を誘発し、そしてＯ／Ｗは抗−ＰＲＶ抗体力価の７倍の上昇を引き起こした。
【００４４】
生存ＰＲＶ＋アジュバントとしてのＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる感作による挑戦の後、ウィルス排泄の低下
ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ又はＯ／Ｗのいづれかを含む生存ＰＲＶワクチンの効能を、挑戦の後、ウィルス排泄の測定により調べた。動物を、第２回目の感作の５週間後、鼻腔内挑戦し、そして扁桃腺からのスワブにおけるウィルス力価を、１４日の連続した日の間、モニターした（図１）。力価は、１０log ＴＣＩＤ50として表わされる。
【００４５】
感作されていない動物は、挑戦後１１〜２４日間、多量のＰＲＶを排泄した。対照グループの５匹の動物のうち２匹は、試験の期間内に死亡した。アジュバントなしでの動物の感作は、排泄されるウィルスの期間及び力価の両者を減じた。
【００４６】
ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ又はＯ／Ｗのいづれかに再構成されたＰＲＶによる感作は、排泄の期間及び排泄されるウィルスの量の追加の低下を引き起こした。Ｏ／Ｗにより、少なくとも４log １０のウィルス力価が４日間、排泄され、そしてＳＬＰ／Ｓ／Ｗにより、３．５log １０の最大ウィルス力価が単に１日で測定された。合計のウィルス排泄は、挑戦の後、log ウィルス力価対時間の曲線（ＡＵＣ）下の面積を計算することによって決定された。対照動物のＡＵＣは、１００％であるように思われた。アジュバントなしに抗原を受けた動物のＡＵＣは５７％であった。Ｏ／Ｗ及びＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる感作は、それぞれ３９％及び２６％のＡＵＣをもたらした。
【００４７】
例 ４
ニワトリにおけるアジュバント性
１０匹のニワトリのグループを、０週及び３週で、ワクチン０．５mlにより感作し、そして抗体力価を０．３及び６週で測定した。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗを、不活性化されたニューカッスル病（ＮＣＤ）ウィルスと共に混合した。それらの結果は表５に示される。
【００４８】
【表６】
【００４９】
例 ５
免疫調節活性対免疫アジュバント性
特異滴免疫応答に対する非特異的耐性（特許出願ＥＰ２９５，７４９号）に対する証明された刺激活性を有する親水性ＳＬＰ−誘導体の効果を研究した。異なった動物モデルにおいて、０．１／０．８の平均スルフェート／脂質比を有する疎水性ＳＬＰ−誘導体のアジュバント性を、０．６／０．０１又は１．６／０．８の平均スルフェート／脂質比を有する親水性ＳＬＰ−誘導体のアジュバント性と比較した。異なったＳＬＰ／Ｓ／Ｗエマルジョンを、１μｍ以下の油滴を有するＳ／ＷのエマルジョンにＳＬＰを添加し、そして続いてそのエマルジョンを超音波処理することによって調製した。５匹のマウス又はテンジクネズミのグループを、投与量当たり０．５mgのＳＬＰ−誘導体及び８mgのスクアランを含んで成るワクチン０．２mlによりｓｃ感作した。ブタを、投与量当たり５mgのＳＬＰ−誘導体及び８０mgのスクアランを含んで成るワクチン２．０mlにより感作した。結果は下記表６に示される。
【００５０】
【表７】
【００５１】
種々の抗原に関する及び種々の動物種における実験の結果から、Ｓ／Ｗにおける疎水性ＳＬＰはＳ／Ｗにおける親水性ＳＬＰよりもより効果的なアジュバントであることが明らかに観察される。
【図面の簡単な説明】
【図１】これは、扁桃腺からのスワブにおけるウィルス力価の１４日間の連続した日の間でのモニターを示す。
本発明は、アジュバント及びそれらのアジュバントを含むワクチンに関する。本発明によれば、アジュバントは、全体の疎水性を維持しながら、アニオン基を供給され得るか又は供給され得ない少なくとも１つの合成疎水性リポ多糖、界面形成性成分及び場合によっては、水性溶質を含むエマルジョンを含んで成る。
【０００２】
それらのアジュバントは、動物又はヒトワクチンの調製に使用され得る。
前記合成の疎水性リポ多糖の一部を形成するポリ多糖は、８〜４０個の炭素原子の直鎖又は枝分れ鎖の脂質基によりエステル化され；それらの脂質基は脂肪族又は不飽和であり得、そして場合によっては、芳香族基を含むことができる。多糖類の糖基に対する脂質基の平均割合は好ましくは、０．２〜４及びより特定には約１であり得る。
【０００３】
場合によっては、リポ多糖は、アニオン基、たとえばホスフェート、スルフェート、ニトレート、又はカルボキシル基、好ましくはスルフェート基を、全体の疎水性を維持しながら、供給される。好ましくは、糖基に対するアニオン基の平均割合は０．１〜２の間である。
【０００４】
ＳＬＰの疎水性は、Griffin の方法(W.C.Griffin, J.Soc.Cosmet.Chem., 1, 311, 1949) に従って決定され、そしてPorter(M.R.Porter, Handbook of surfactants, Blackie, Glasgow and London, 1991 、42ページ）により引用される、水における界面活性剤の外観に親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）により定義される。疎水性ＳＬＰのＨＬＢ値は９以下であり（すなわち、不溶性で且つ不安定な分散体又は安定した不透明な分散体）、そして特にそれは４以下であり得る（すなわち不溶性）。
【０００５】
界面形成性成分の例は次のものである：
ａ．水性相と不混和性の液体、たとえば鉱物、動物、植物又は合成油、又は他の有機液体、
ｂ．不溶性塩、たとえばＡｌ（ＯＨ）3 ，ＡｌＰＯ4 、カルシウム−オキサレート、ひる石、ベントナイト、シリカ、
ｃ．１又は複数のポリマー又はコポリマー、たとえばポリアクリレート、ポリ（メチル−メタクリレート）、ポリシアノアクリレート、多糖、ポリペプチド、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸／グリコール酸）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンの微小粒子／微小球体、
ｄ．親水性物質、たとえばリン脂質、第四アミンの脂質二重層、
ｅ．１又は複数の次の界面活性剤のミセル：
−アニオン性（たとえばカルボキシレート、ポリアルコキシカルボキシレート、Ｎ−アシルサルコシネート、アシル化されたタンパク質加水分解物、スルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、エステル結合を有するスルホネート、アミド結合を有するスルホネート、エーテル結合を有するスルホネート、アルコールスルフェート、ホスフェートエステル）、
−非イオン性（たとえばエトキシレート、アルコールエトキシレート、カルボン酸エステル、グリセロールエステル、ポリオキシエチレンエステル、カルボン酸アミド、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリアルキレンオキシドブロックコポリマー）、
−カチオン性（たとえばアミン、酸素含有アミン、２−アルキル−１−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダゾリン、第四アミン）、及び
−両性（たとえばイミダゾリウム誘導体）の界面活性剤。
【０００６】
実質的な観点から、ＳＬＰ安定配合物と組合され、そして受容体（動物又はヒトのいづれか）により十分に耐えられる界面形成性物質が好ましい。この観点において、動物及び植物起原の油、不溶性塩、たとえばＡｌ（ＯＨ）3 及びＡｌＰＯ4 、及び動物又は植物起原のリン脂質の脂質二重層が特に適切である。
【０００７】
下記に記載される実験においては、鉱油又はスクアランが界面形成性成分として使用される。スクアランは、動物起原の油であり、そして従って生物適合性及び生物分解性が予測されるので好ましい。
【０００８】
水中油又は油中水エマルジョンの安定性を改良するために適切な親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する界面活性剤の例（種々の商標名を含む）は、次のものである：
ａ．アニオン性界面活性剤、たとえばＳａｎｄｏｐａｎ ＫＳＴ；
ｂ．非イオン性界面活性剤、たとえばＢｒｉｊ型番号３０，３５，５８，９８，７２１，Ｔｒｉｔｏｎ型番号Ｎ−５７，Ｘ−１００，Ｘ−１０２，Ｓｐａｎ型番号２０，４０，６０，８０，８５，Ｔｗｅｅｎ型番号２０，２１，４０，６０，８０，８５，Ｐｌａｒｏｎｉｃ型番号ＰＥ１０１００，ＰＥ１０５００，ＲＰＥ２５１０，ＲＰＥ２５２０；
ｃ．カチオン性界面活性剤、たとえばＡｏｑｕａｔ２ＨＴ−７５，Ａｒｏｓａｒｆ ＴＡ１００、ビス（水素化牛脂アルキル）ジメチルアンモニウムクロリド；
ｄ．両性界面活性剤、たとえばＬｏｎｚａｉｎｅ型番号１０Ｓ，１２Ｃ，１６Ｓ，Ｓｃｈｅｒｏｔａｉｎｅ型ＣＡＢ，ＩＡＢ，ＭＡＢ，Ａｍｐｈｏｓａｌ．
【０００９】
下記実験においては、非イオン性界面活性剤及び特にＴｗｅｅｎ８０が、ＳＬＰ及び油のエマルジョンを安定化するために使用された。
【００１０】
動物油の例はスクアラン及びスクアレンである。適切な植物油は、ダイズ、ピーナッツ、ゴマ、ヤシ、等から得られる。鉱油の例は、Ｍａｒｋｏｌ５２，Ｋｒａｋｅｌ，Ｋｒｅｍｏｌ、等である。
【００１１】
本発明のアジュバントに使用するための水性溶質は、たとえば塩溶液、リン酸緩衝溶液又は純粋な水である。
本発明のアジュバントは好ましくは、まず、合成疎水性リポ多糖及び油を混合し、そしてさらに、その油状塊状物を水に分散することによって、又はまず、リポ多糖と界面活性剤とを混合し、水を添加し、そして得られた水相に油を分散することによって調製される。
【００１２】
本発明のアジュバントは、ヒト及び動物のためのワクチンへの使用にも向けられる。そのワクチンは、ウィルス、細菌、マイコプラズマ又は寄生体のために特有な、又は免疫応答の上昇を意図されるいづれか他の物体のために特有な抗原性物質を含むことができる。この抗原性物質はたとえば、生存生物、不活性化された生物又はいわゆるサブユニット（たとえば合成的に又は組換えＤＮＡ法により調製され、又は損なわれていない生物から単離される）から成り又は含むことができる。ワクチンの調製のためには、抗原性物質は、使用の十分前又は使用のすぐ前で混合される。
本発明は次の例によりさらに例示される。
【００１３】
【実施例】
例 １：
アジュバントとしてのＳＬＰ−分散体の使用
下記実験においては、親油性スルホリポ多糖（ＳＬＰ）−誘導体、すなわち約０．１：０．８：１．０のスルフェート：脂質：単糖の平均比を有するＳＬＰ−誘導体が、特にことわらない限り使用された。
【００１４】
異なった実験において使用されるワクチンは、次の態様の１つで調製された：Ｉ．ＳＬＰを適切な濃度で油相（スクアラン）に溶解した。ＳＬＰの溶解は、スクアランをわずかに加熱することによって改良され得た（７０℃）。続いて、油相を、７０℃で予備加熱された水性相（２％Ｔｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液）に添加し、そして激しく撹拌した。得られたプレーエマルジョンを、超音波破壊器により又は微小流動化することによりさらに乳化した。エマルジョンは、油滴が１μｍよりも小さい場合（１０００倍での相対比顕微鏡により測定される）、すぐ使用されると思われる。ワクチンは、１体積のアジュバント溶液（約４℃）と１体積の抗原溶液とを混合することによって調製された。
ＳＬＰの量は、対照としてＦｉｃｏｌｌを用いての糖含有量として表わされる（乾燥材料は約２倍高い）。
【００１５】
II. ＳＬＰを有機溶媒（たとえばエタノール、クロロホルム又はジクロロメタン）に溶解し、そして油と共に混合した。溶媒を６０又は７０℃及び低圧での集中的な蒸発により除去した。続いて、油相を、７０℃で予備加熱された水性相（２％のＴｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液）に激しく撹拌しながら添加した。得られるプレーエマルジョンを超音波破壊器又は微小流動化によりさらに乳化した。エマルジョンは、油滴が１μｍよりも小さい場合（１０００倍での相対比顕微鏡により測定される）、すぐ使用されると思われる。ワクチンは、１体積のアジュバント溶液（約４℃）と１体積の抗原溶液とを混合することによって調製された。
【００１６】
III. ＳＬＰをアジュバント溶液（たとえば水中鉱油エマルジョン）に添加し、そしてＳＬＰを超音波破壊器により分散した。アジュバント溶液は、沈殿物がマクロスコーピー（４０倍）及び顕微鏡（４００−及び１０００倍）により見えなければ、すぐ使用されると思われた。１体積のアジュバント溶液を１体積の抗原溶液と混合した。
【００１７】
IV. ＳＬＰ、油、及び２％のＴｗｅｅｎ８０を含む水性相を容器に置き、激しく混合し、そして続いて、超音波破壊器又は微小流動化により、温度を約７０℃に維持しながら、乳化した。そのエマルジョンは、油滴が１μｍよりも小さい場合（１０００倍での相対比顕微鏡により測定される）、すぐ使用されると思われた。ワクチンは、１体積のアジュバント溶液（約４℃）と１体積の抗原溶液とを混合することによって調製された。
【００１８】
Ｖ．ＳＬＰを適切な体積の液体界面活性剤（たとえばＴｗｅｅｎ８０）に溶解し、そして水性相を激しく混合しながら添加し、透明な又は乳白光懸濁液を得た。この懸濁液にスクアランを添加し、そしてその混合物を微小流動化により乳化した。
【００１９】
VI. Ｖと同じであるが、但し、有機溶質におけるＳＬＰを液体界面活性剤（たとえばＴｗｅｅｎ８０）と共に混合し、そして有機相を水性相の添加の前又は後で蒸発せしめた。有意な差異はアジュバント活性に見出されないが、調製方法Ｉ，II，Ｖ及びVIは、比較的容易な方法であり、そして大規模な製造のために容易に適用できるので、好ましい。
【００２０】
典型的なＳＬＰ／Ｓ／Ｗ（スルホリポ多糖／スクアラン／水）アジュバントワクチンは、１ml当たり、次の成分を含んで成る：２．５mgＳＬＰ，０．０５ml（４０mg）のスクアラン、０．０１ml（１０mg）のＴｗｅｅｎ８０。使用されるＳＬＰ誘導体は、０．８／０．１の平均脂質／スルフェート含有率（多糖における単糖当たりの基の数）を有した。
【００２１】
例 ２
マウス及びテンジクネズミにおける種々の抗原のためのアジュバントとしてのＳＬＰ−Ｈ２／スクアラン／水
材料及び方法
動 物
ランダムなＳｗｉｓｓ雌マウス及びテンジクネズミを、オランダのHarlan, Zeist から得た。生後、約１０週で、５匹の動物のグループを、０及び３週目で、０．２mlのワクチンにより皮下（ｓｃ）、腹腔内（ｉｐ）又は筋肉内（ｉｍ）感作し、そして血液を、特にことわらない限り、３及び６週で収集した。
【００２２】
ＳＬＰ−Ｈ２／スクアラン／水アジュバント
有機溶媒（ジクロロメタン又はクロロホルムのいづれか）中、ＳＬＰ−Ｈ２を、スクアラン(Sigma Chem.Comp.St.Louis, USA) と共に混合し、そして有機溶媒を、低圧及び６０℃で少なくとも６時間、Rotavapar(Badil Lab.-Technik AG, Switzerland) での蒸発により除去した。ＳＬＰを含むスクアランを、２％のＴｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ／２％Ｔｗｅｅｎ８０）と共に混合し、そしてその混合物を２段階で乳化した。プレーエマルジョンを、激しく振盪することによって製造した。続いて、そのプレーエマルジョンを、圧力を徐々に高めながら（２００〜６００大気圧）、２又は３回のサイクルで、微小流動化した(Microfluidics Corp.Newton, USA)。得られたエマルジョンを、顕微鏡（１０００倍）及び微小粒子−サイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により油滴の大きさの評価により分析した。その乳化工程は、ほとんどの液滴が１μｍ以下の直径を有し、そして１０μｍ以上の直径を有する粒子が存在しなくなるまでくり返えされた。メルチオレートをＳＬＰ−Ｈ２／Ｓ／水エマルジョンに０．０１％の最終濃度で添加し、そしてアジュバントを４℃で貯蔵した。使用されるアジュバント溶液は、１ml当たり５mgのＳＬＰ，０．１ml（８０mg）のスクアラン及び０．０２ml（２０mg）のＴｗｅｅｎ８０を、特にことわらない限り含んだ。
【００２３】
ワクチン及び予防接種
試験されるワクチンを、１体積の抗原溶液と１体積のアジュバント溶液とを、注射の少なくとも１日前に混合することによって調製した。マウスは、アジュバントを含むか又は含まない次のワクチンのうち１つのワクチン０．２mlを受けた：
ワクチンＩは、投与量当たり１０μｇのジニトロフェニル化されたウシ血清アルブミンを含んだ（実験Ｉ）；
ワクチンIIは、投与量当たり１０μｇのＤＮＰ−ＢＳＡ、１μｇのＭＲＣ−１１及び１０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）を含んだ（実験II）；
ワクチンIII は、投与量当たり１μｇのＭＲＣ−１１及び１０μｇのＯＶＡを含んで（実験III 、IV及びＶ）；そして
ワクチンVIは、５log １０ＴＣＩＤ５０不活性化狂犬病ウィルス粒子（ｉＰＲＶ）、０．４４μｇのＡ／Ｓｗｉｎｅ，０．４μｇのＭＲＣ−１１及び０．２μｇのＸ−７９を含んだ（実験VI）。テンジクネズミに、アジュバントを含む又は含まないワクチンIVを注射した。ワクチンIVの抗原組成物は、ブタＳｕｖａｘｙｎ ｉＡｕｊ／Ｆｌｕ３ワクチンの抗原組成物に相当し、そしてブタのための投与量の１／１０をマウス又はテンジクネズミに注射した。
【００２４】
次のアジュバントをマウスで試験した：
１．投与量当たり４０mgの油を含む、鉱油（Ｍａｒｋｏｌ５２）／リン酸緩衝溶液＋１％Ｔｗｅｅｎ８０（Ｏ／Ｗ）のエマルジョン（グループ１８２）；
２．投与量当たり０．５mgのＳＬＰ及び４０mgの鉱油（Ｍａｒｋｏｌ５２）を含むＳＬＰ／Ｏ／Ｗのエマルジョン（グループ１８８）；
３．投与量当たり８mgのスクアランを含むスクアラン／Ｗ（Ｓ／Ｗ）のエマルジョン（グループ９５１，１０６３，１０８３，１６８８及び２３２２）；
４．投与量当たり０．５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ９５２，９５３，１０６２，１０８２，１６９１，１９６６及び２３３４）；
５．投与量当たり１．０mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６９２）；
６．投与量当たり２．５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６９３）；
７．投与量当たり２mgのスクアランを含むＳ／Ｗのエマルジョン（グループ１６８３）；
８．投与量当たり０．５mgのＳＬＰ及び２mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６８５）；
９．投与量当たり１．０mgのＳＬＰ及び２mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６８６）；
１０．投与量当たり２．５mgのＳＬＰ及び２mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（グループ１６８７）；
１１．投与量当たり０．５mgのＳＬＰを含む、Ｔｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ／Ｔ）におけるＳＬＰの懸濁液（グループ９７３，９７４，１０６１，１０８１，１９６４及び２３２７）；
１２．投与量当たり０．２mgのＳＬＰを含む、Ｔｗｅｅｎ８０を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ／Ｔ）におけるＳＬＰの懸濁液（グループ１９６２）；及び１３．投与量当たり８mgのスクアラン及び０．５mgのＦｉｃｏｌｌを含むＳ／Ｗ＋Ｆｉｃｏｌｌのエマルジョン（グループ１９９８）。
【００２５】
次のアジュバントをテンジクネズミで試験した：
１．投与量当たり４０mgの油（Ｍａｒｋｏｌ５２）を含むＯ／Ｗのエマルジョ ン（実験IV、グループ１；実験Ｖ、グループ２）；
２．投与量当たり８mgのスクアランを含むＳ／Ｗのエマルジョン（実験Ｉ、グループ２；実験II、グループ４；実験III 、グループ９；実験IV、グループ６；実験Ｖ、グループ３）；
３．投与量当たり０．５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（実験Ｉ、グループ３；実験II、グループ５；実験III 、グループ１０；実験Ｖ、グループ８）；
４．投与量当たり０．２５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（実験IV、グループ７）；
５．投与量当たり１．２５mgのＳＬＰ及び８mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン（実験IV、グループ８）。
【００２６】
次のアジュバントをブタで試験した：
１．投与量当たり４００mgの油を含むＯ／Ｗのエマルジョン；
２．投与量当たり８０mgのスクアランを含むＳ／Ｗのエマルジョン；
３．投与量当たり５mgのＳＬＰ及び８０mgのスクアランを含むＳＬＰ／Ｓ／Ｗのエマルジョン；及び
４．投与量当たり５mgのＳＬＰを含む、ＰＢＳ／ＴにおけるＳＬＰの懸濁液。
【００２７】
血清における抗体力価の決定
抗−ＤＮＰ−ＢＳＡ抗体応答を、指示細胞としてジニトロフェニル化された羊赤血球細胞（ＤＮＰ−ＳＲＢＣ）を用いて、血球凝集（ＨＡ）反応により測定した。手短に言及すれば、血清を、丸底の９６ウェルプレートにおいて、１％の正常なウサギ血清を含む塩溶液（羊赤血球細胞により予備吸着された）により連続的に２倍に希釈し、そしてＤＮＰ−ＳＲＢＣ懸濁液を添加した。ちょうど凝集を付与する逆血清希釈度がその力価であると思われた。抗−ＯＶＡ抗体応答を、ＯＶＡにより結合されるＳＲＢＣの血球凝集により測定した。
【００２８】
抗−ｉＰＲＶ抗体力価を、血清中和試験（ＳＮ）により測定した。手短に言及すれは、血清を９６−ウェルプレートにおいて２倍に連続的に希釈した。その血清希釈溶液を、１００ＴＣＩＤ５０のＡｕｊｅｓｚｋｙウィルス懸濁液と組合した。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、ウェル当たり２．１０ｅ４ＰＤ５−細胞を血清−ウィルス混合物に添加した。３７℃での５日間のインキュベーションの後、ウィルスプラークを数え、そしてウィルスの５０％中和を引き起こす血清の逆希釈度がその抗体力価であると思われた。
【００２９】
抗−ｉＦｌｕ抗体力価を、血球凝集阻害反応（ＨＩ）により測定した。血清を、９６−ウェル丸底プレートにおいて１体積の血清を４体積のカオリン（それぞれ５０μｌ＋２００μｌ）に添加することによって、カオリンにより前処理した。室温で３０分間のインキュベーションの後、カオリンを回転除去し、そして上清液を集め、そして丸底の９６−ウェル丸底プレートにおいて、０．１％のＢＳＡを含むベロナール緩衝溶液に連続的に２倍に希釈した。インフルエンザウィルスの４つのＨＡ単位をウェルに添加し、そしてプレートを室温で１時間インキュベートした。ニワトリ赤血球細胞を、０．１％のＢＳＡを含むベロナール緩衝溶液により３度洗浄し、そして０．２５％の濃度でウェルに添加した。３０分後及び２時間以内に、凝集が検出され、そして血球凝集の阻害を示す最高の逆血清希釈度がその力価であると思われた。
【００３０】
結 果
マウスにおけるアジュバント性
種々の抗原に対する抗体応答のためにＳＬＰ／Ｓ／Ｗのアジュバント性を、６種の別々の実験においてマウスで研究した（表１）。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗの効果を、アジュバントを含まない、ＳＬＰ，Ｓ／Ｗ，Ｏ／Ｗ又は抗原と比較した。ＤＮＰ−ＢＳＡに対する抗体応答は、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗにより有意に増強されたが、しかしＯ／Ｗによりは増強されなかった（実験Ｉ）。ＳＬＰは単独でＳＬＰ／Ｓ／Ｗよりも効果的でなく、そしてＳ／Ｗは、ＳＬＰ又はＳＬＰ／Ｓ／Ｗの両者よりも効果的でなかった（実験III)。抗−ＭＲＣ−１１抗体応答は、試験される種々のアジュバントにより有意に刺激された。ＳＬＰ／Ｓ／ＷはＳ／Ｗ単独よりもより効果的である（但し実験IIを除く）。ＳＬＰは単独で、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗのアジュバント性に相当するか（実験IIIa，IIIb及びVIb)、又はそれよりも低い（実験II，Ｖ，VIa)相当のアジュバント性を示した。抗−ＭＲＣ−１１抗体応答は、ＳＬＰの投与量の上昇及びＳＬＰ／Ｓ／Ｗおけるスクアランの量の上昇と共に高まった（実験Ｖ）。ＯＶＡに対する抗体応答は、ＳＬＰ，Ｓ／Ｗ及びＳＬＰ／Ｓ／Ｗにより増強されたが、しかしＳＬＰ／Ｓ／ＷはＳＬＰ又はＳ／Ｗのみよりも有意により効果的であった（実験II，IIIa，IIIb及びIV）。抗−ＯＶＡ応答のためのＳＬＰ／Ｓ／Ｗのアジュバント性は、試験された範囲内でのＳＬＰ又はスクアランの量の上昇と共に上昇しなかった。ｉＰＲＶに対する体液性応答を測定し、そしてＳＬＰ／Ｓ／Ｗはその応答を有意に増強し（実験VIa 及びVIb)、そしてＳ／Ｗよりもより効果的であることがわかった。ＳＬＰは単独で、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗとほぼ同じくらい効果的であった。それらの結果は下記表１Ａ及び１Ｂに要約される。
【００３１】
【表１】
【表２】
テンジュクネズミにおけるアジュバント性
ブタｉＰＲＶ＋ｉＦｌｕ３ワクチンに対する抗体応答に対するＳＬＰ／Ｓ／Ｗの効果を、テンジュクネズミにおけるＳ／Ｗ及びＯ／Ｗの効果と比較した。この動物種は、ブタワクチン、及びｉＰＲＶ及びｉＦｌｕ成分に対する抗体応答のためのモデルとして集中的に使用されており、そしてブタにおけるワクチンの効能のための表示であると思われる。
【００３４】
５匹の動物のグループを、０週及び３週で、ワクチン０．２mlにより皮下感作し、そして抗体力価を６週で測定した。次のワクチン組成物が試験された：
ａ．不活性化された狂犬病ウィルスのためのＳＬＰ／Ｓ／Ｗ（表２；実験Ｉ−Ｖ）、
ｂ．活性化されたインフルエンザウィルス株Ａ／Ｓｗｉｎｅ，ＭＲＣ−１１及びＸ−７９のためのＳＬＰ／Ｓ／Ｗ（実験IV及びＶ）。
実験Ｉ−III は、ｉＰＲＶに対する抗体力価が水中スクアラン（Ｓ／Ｗ）及びＳＬＰ／Ｓ／Ｗにより有意に増強され、そしてＳＬＰ／Ｓ／ＷがＳ／Ｗよりも効果的であることを示す。
【００３５】
【表３】
実験IV及びＶにおいては、抗−ｉＰＲＶ抗体力価における小さな差異が種々のグループ間に見出された。しかしながら、それらの実験においては、抗−ｉＦｌｕ３抗体における有意な差異が見出された。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ及びＯ／Ｗは、Ｓ／Ｗ又は抗原のみよりも高い抗体力価を誘発した。ＳＬＰ／Ｓ／ＷはＯ／Ｗと同じくらい効果的であった。
【００３７】
例 ３
ブタにおけるｉＰＲＶ，ｉＦｌｕ、およひ生存ＰＲＶのためのアジュバントとしてのＳＬＰ−Ｈ２／スクアラン／水
材料及び方法
ブ タ
生後約１０週の５匹のブタのグループを、この実験に使用した。動物を、０週及び３週でワクチン２．０mlにより範囲内感作し、そして血液を６週で集めた。
【００３８】
ワクチン及び予防接種
試験されるワクチンは、１体積の抗原溶液及び１体積のアジュバント溶液を含んだ。抗原溶液は、６log １０ＴＣＩＤ５０不活性化狂犬病ウィルス粒子、４．４μｇのインフルエンザウィルス株Ａ／Ｓｗｉｎｅ，４．０μｇのＭＲＣ−１１及び２．０μｇのＸ−７９を含んだ。使用されるアジュバント溶液は、前記のようなＳＬＰ／Ｓ／Ｗ（アジュバント１ml当たりＳＬＰ５mg及びスクアラン８０mg）又は標準の水中鉱油エマルジョン（５０％鉱油）のいづれかであった。凍結乾燥された生存ＰＲＶを、希釈溶液又はアジュバント溶液（希釈剤により前もって１：１に希釈された）に再構成し、そして１０分以内に注射した。
【００３９】
結 果
ｉＰＲＶ及びｉＦＬＵ３に対する抗体応答の刺激
５種々の別々の実験において、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗのアジュバント性を、ブタにおける標準のＯ／Ｗのアジュバント性と比較した。少なくとも５匹のブタのグループを、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ又は標準のＯ／Ｗにより組合されたｉＰＲＶ＋ｉＦＬＵ３、又はアジュバントを含まないｉＰＲＶ＋ｉＦＬＵ３により感作した（表３）。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる感作の後に測定された抗−ｉＰＲＶ抗体力価は、Ｏ／Ｗにより誘発された力価とは有意に異ならなかった（ｐ＞０．２０）。５種のうち４種の実験において、異なったインフルエンザウィルス株に対する３〜４倍高い力価が、標準のＯ／Ｗに比較して、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる注射の後、検出された。その結果及び統計学的分析の組合せがＡ／Ｓｗｉｎｅ（ｐ＜０．０１），ＭＲＣ−１１（ｐ＜０．０１）及びＸ７９（ｐ＜０．０１）に対する力価において有意な上昇を証明した。
【００４０】
【表４】
７匹のブタのグループを、０週及び３週で、ｉＰＲＶ＋ｉＦｌｕ３＋アジュバントにより感作した。
抗体力価を６週で測定した。上昇因子を次の式により計算した：２ｅ（ＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる力価−Ｏ／Ｗによる力価）。ＳＬＰ／Ｓ／ＷとＯ／Ｗとの間の差異のＰ値を、スチューデント試験により計算した。＞０．０５の他は、有意ではないと思われた。ＮＳ：有意でない；Ｓ：有意。実験IVのグループ１の１５匹の動物のうち４匹の動物は、インフルエンザ株ＭＲＣ−１１に対する有意な抗体応答を生成しなかったが（それらの動物における平均力価は＜５．６であった）、しかし他の抗原に対する正常な応答が測定された。
【００４２】
【表５】
生存ＰＲＶに対する抗体応答の刺激
４種の別々の実験において、生存ＰＲＶに対する抗体応答に対するＳＬＰ／Ｓ／Ｗ及び標準のＯ／Ｗの効果を研究した。ブタを２度感作し、そして抗−ＰＲＶ抗体力価を、個々の感作の３週間後に測定した。すべての場合、低い〜中ぐらいの高さの抗体力価が、最初の注射の後に観察され、そして力価は、第２回目の感作により高まった（表４）。希釈剤における生存ＰＲＶと比較して、ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ及びＯ／Ｗは、最初の感作の後、抗体力価をわずかに高めた。２回目の感作の後、抗体力価はＳＬＰ／Ｓ／Ｗ及びＯ／Ｗにより有意に高められた。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗは２３倍の上昇を誘発し、そしてＯ／Ｗは抗−ＰＲＶ抗体力価の７倍の上昇を引き起こした。
【００４４】
生存ＰＲＶ＋アジュバントとしてのＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる感作による挑戦の後、ウィルス排泄の低下
ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ又はＯ／Ｗのいづれかを含む生存ＰＲＶワクチンの効能を、挑戦の後、ウィルス排泄の測定により調べた。動物を、第２回目の感作の５週間後、鼻腔内挑戦し、そして扁桃腺からのスワブにおけるウィルス力価を、１４日の連続した日の間、モニターした（図１）。力価は、１０log ＴＣＩＤ50として表わされる。
【００４５】
感作されていない動物は、挑戦後１１〜２４日間、多量のＰＲＶを排泄した。対照グループの５匹の動物のうち２匹は、試験の期間内に死亡した。アジュバントなしでの動物の感作は、排泄されるウィルスの期間及び力価の両者を減じた。
【００４６】
ＳＬＰ／Ｓ／Ｗ又はＯ／Ｗのいづれかに再構成されたＰＲＶによる感作は、排泄の期間及び排泄されるウィルスの量の追加の低下を引き起こした。Ｏ／Ｗにより、少なくとも４log １０のウィルス力価が４日間、排泄され、そしてＳＬＰ／Ｓ／Ｗにより、３．５log １０の最大ウィルス力価が単に１日で測定された。合計のウィルス排泄は、挑戦の後、log ウィルス力価対時間の曲線（ＡＵＣ）下の面積を計算することによって決定された。対照動物のＡＵＣは、１００％であるように思われた。アジュバントなしに抗原を受けた動物のＡＵＣは５７％であった。Ｏ／Ｗ及びＳＬＰ／Ｓ／Ｗによる感作は、それぞれ３９％及び２６％のＡＵＣをもたらした。
【００４７】
例 ４
ニワトリにおけるアジュバント性
１０匹のニワトリのグループを、０週及び３週で、ワクチン０．５mlにより感作し、そして抗体力価を０．３及び６週で測定した。ＳＬＰ／Ｓ／Ｗを、不活性化されたニューカッスル病（ＮＣＤ）ウィルスと共に混合した。それらの結果は表５に示される。
【００４８】
【表６】
例 ５
免疫調節活性対免疫アジュバント性
特異滴免疫応答に対する非特異的耐性（特許出願ＥＰ２９５，７４９号）に対する証明された刺激活性を有する親水性ＳＬＰ−誘導体の効果を研究した。異なった動物モデルにおいて、０．１／０．８の平均スルフェート／脂質比を有する疎水性ＳＬＰ−誘導体のアジュバント性を、０．６／０．０１又は１．６／０．８の平均スルフェート／脂質比を有する親水性ＳＬＰ−誘導体のアジュバント性と比較した。異なったＳＬＰ／Ｓ／Ｗエマルジョンを、１μｍ以下の油滴を有するＳ／ＷのエマルジョンにＳＬＰを添加し、そして続いてそのエマルジョンを超音波処理することによって調製した。５匹のマウス又はテンジクネズミのグループを、投与量当たり０．５mgのＳＬＰ−誘導体及び８mgのスクアランを含んで成るワクチン０．２mlによりｓｃ感作した。ブタを、投与量当たり５mgのＳＬＰ−誘導体及び８０mgのスクアランを含んで成るワクチン２．０mlにより感作した。結果は下記表６に示される。
【００５０】
【表７】
種々の抗原に関する及び種々の動物種における実験の結果から、Ｓ／Ｗにおける疎水性ＳＬＰはＳ／Ｗにおける親水性ＳＬＰよりもより効果的なアジュバントであることが明らかに観察される。
【図面の簡単な説明】
【図１】これは、扁桃腺からのスワブにおけるウィルス力価の１４日間の連続した日の間でのモニターを示す。
Claims (13)
- ワクチン抗原と共に、スルフェート基及び脂質基を有し且つ平均スルフェート/脂質比が0.1/0.8である合成疎水性リポ多糖少なくとも１種、界面形成性成分及び場合によっては水性溶質を含んで成る免疫アジュバント組成物。
- 前記リポ多糖が、糖基に対する0.8 の脂質基の平均割合を有する請求項１記載のアジュバント組成物。
- 前記リポ多糖が、全体の疎水性を維持しながら、アニオン基を供給される請求項１又は２記載のアジュバント組成物。
- 前記リポ多糖が４以下の親水性−親油性バランス（HLB）を有する請求項１〜３のいずれか１項記載のアジュバント組成物。
- 前記界面形成性成分が水性相と不混和性の液体である請求項１〜４のいづれか１項記載のアジュバント組成物。
- 前記界面形成性成分が水性相において不溶性の固体である請求項１〜５のいずれか１項記載のアジュバント組成物。
- 請求項１〜６のいずれか１項記載の免疫アジュバント組成物及び免疫原を含むワクチン。
- ワクチンと共に使用するための、スルフェート基及び脂質基を有し且つ平均スルフェート/脂質比が0.1/0.8である合成疎水性リポ多糖少なくとも１種、界面形成性成分及び場合によっては水性溶質を含んで成る免疫アジュバント組成物。
- 前記リポ多糖が糖基に対する0.8 の脂質基の平均割合を有する請求項８記載のアジュバント組成物。
- 前記リポ多糖が、全体の疎水性を維持しながら、アニオン基を供給される請求項８又は９記載のアジュバント組成物。
- 前記リポ多糖が４以下の親水性−親油性バランス（HLB）を有する請求項８〜10のいずれか１項記載のアジュバント組成物。
- 前記界面形成性成分が水性相と不混和性の液体である請求項８〜11のいずれか１項記載のアジュバント組成物。
- 前記界面形成性成分が水性相において不溶性の固体である請求項８〜12のいずれか１項記載のアジュバント組成物。
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