DE69524415T2

DE69524415T2 - UNGESPLEISSTE VARIANTEN DES gp350/220

Info

Publication number: DE69524415T2
Application number: DE69524415T
Authority: DE
Inventors: Winthrop T. Jackman; Richard Spaete
Original assignee: Aviron Inc
Current assignee: MedImmune Vaccines Inc
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2002-08-01
Anticipated expiration: 2015-04-14
Also published as: CA2187908A1; FI118224B; JP3447743B2; NO964431D0; JP2004290199A; SK283446B6; US6054130A; EP0769056A1; CA2187908C; JP4317786B2; EP0769056B1; LV11803A; TW496897B; JP2005333990A; HU221647B1; RU2178807C2; JP2003230396A; CZ305496A3; CN1495262A; DE69524415D1

Description

Das Epstein-Barr-Virus (EBV), ein Mitglied der Herpesvirus-Gruppe, bewirkt beim Menschen infektiöse Mononukleose. Die Krankheit betrifft mehr als 90% der Bevölkerung. Gesundheitsexperten beziffern die Kosten der Krankheit in den Vereinigten Staaten mit 100 Millionen Dollar pro Jahr. Das Virus breitet sich vor allem durch Austausch von Speichel von das Virus abgebenden Individuen aus. Mit EBV infizierte Kinder sind größtenteils asymptomatisch oder weisen sehr schwache Symptome auf, während Jugendliche oder Erwachsene, die sich infizieren, typische infektiöse Mononukleose entwickeln, die durch Fieber, Pharyngitis und Adenopathie gekennzeichnet ist. Infizierte Menschen behalten Anti-EBV-Antikörper für den Rest ihres Lebens und sind somit gegenüber weiterer Infektion immun. Es gibt derzeit keinen im Handel erhältlichen EBV-Impfstoff.
Neben seinen infektiösen Eigenschaften wandelt EBV Lymphozyten in sich rasch teilende Zellen um und ist somit an mehreren unterschiedlichen Lymphomen beteiligt, z. B. im Burkitt-Lymphom und in oraler Haar-Leukoplakie. EBV wurde auch in Gewebeproben aus Nasopharyngal-Tumoren detektiert. Weltweit schätzt man, dass 80.000 Fälle von Nasopharyngal-Krebs auftreten, wobei dieser in ethnischen chinesischen Populationen prävalenter ist.
Die Entwicklung einer lebenden, abgeschwächten Vakzine für EBV ist nach wie vor problematisch. Aufgrund der potenziellen onkogenen Natur von EBV nahmen Forscher davon Abstand, mit lebenden Impfstoffen zu arbeiten. Die vorliegende Erfindung überwindet die mit der Entwicklung lebender Impfstoffe zusammenhängenden Probleme, indem Verfahren und Zusammensetzungen für einen Subunit-Impfstoff entwickelt werden, die kein potenziell onkogenes lebendes Virus benötigt. Ein Subunit- Impfstoff verwendet ein oder mehrere antigene Proteine aus dem Virus, die eine Immunreaktion hervorrufen und Immunität verleihen.
Zwei der wichtigeren antigenen EBV-Proteine sind Glykoprotein(e) gp350/300 und gp220/200, die einen Teil der viralen Membranhülle bilden und es Virusteilchen ermöglichen, sich an Human-Zielzellen zu binden und in diese einzudringen, indem sie mit dem Zellmembranprotein CD21 in Wechselwirkung treten. Siehe Nemerow, J. Virology 61, 1416 (1987). Sie werden schon seit langer Zeit als Subunit-Impfstoffkanndidaten gehandelt, doch Schwierigkeiten beim Erhalten von antigenisch aktivem Protein, das aus nativen Quellen gereinigt ist, und geringe Ausbeuten aus rekombinant produzierten Quellen behinderten die Anstrengungen von Forschern und Impfstoffentwicklern. In der Literatur wird erwähnt, dass diese Proteine eine Vielzahl an Molekulargewichtsbereichen (350 oder 300 kD für eines der Proteine und 220 oder 200 kD für das andere Protein) einnehmen. Das gp350- oder 300-Protein wird hierin als gp350-Protein bezeichnet; das gp220- oder 200-Protein wird hierin als gp220-Protein bezeichnet. Gemeinsam werden beide Proteine als gp350/220-Protein(e) bezeichnet.
Ein alternativ gespleißtes, einzelnes Gen kodiert für die gp350/220-Proteine und führt zur Erzeugung von gp350- und gp220-mRNA-Transkripten; es sind keine natürlich vorkommenden Variationen in den gp350/220-Gen-Spleißstellen bekannt. Das Gen produziert zwei Expressionsprodukte, die gp350- und gp220-Proteine. Der offene Leserahmen für die gp350/220-DNA-Sequenz umfasst 2721 Basenpaare (bp). Der gesamte Leserahmen kodiert für die 907 Aminosäuren von gp350. Siehe die US-A-4.707.358 (Kieff 1987). Die gespleißte Version des Leserahmens deckt 2130 Basen ab und translatiert zu einem gp220-Protein, einer 710-Aminosäuren-Sequenz. Die theoretischen Molekulargewichte des gp350-Proteins und gp220-Proteins sind 95 bzw. 79 kD. Die gemessenen Molekulargewichte des exprimierten gp350-Proeins und gp220-Proteins variieren, betragen aber etwa 350 bzw. 220 kD. Die extensive Glykosylierung der Proteine ist für die Differenz zwischen dem vorhergesagten und dem tatsächlichen Molekulargewicht verantwortlich. In einer Zelle werden das gp350- und das gp220- Protein in einem Molverhältnis von etwa 6 : 1 bis 1 : 1 produziert. Beispielswiese scheint in B95-8-Zellen, die persistierend mit EBV infiziert sind, das Verhältnis zu variieren, kommt aber gelegentlich an den 6 : 1-Bereich heran. Siehe Miller, Proc. Natl. Acad. Sci. 69, 383 (1972).
Die rekombinante Produktion dieser Glykoproteine führte bislang üblicherweise zu einem Gemisch aus gp350- und gp220-Protein. Bislang wurden die gp350/220-Proteine in Rattenhypophyse, Chinahamstereierstock-, VERO-Zellen (Nierenzellen afrikanischer grüner Meerkatzen) sowie in Hefezellen exprimiert. Siehe Whang, J. Virol. 61, 1796 (1982); Motz, Gene 44, 353 (1986); und Emini, Virology 166, 387 (1987). Ein bovines Papillomavirus-Virusexpressionssystem wurde auch dazu verwendet, gp350/200- Proteine in Mäuse-Fibroblastenzellen zu erzeugen. Siehe Madej, Vaccine 10, 777 (1992). Labor- und Impfstoffstämme von Vaccinia-Virus dienten auch dazu, gp250/220- Proteine zu exprimieren. Modifizierte rekombinante Versionen der EBV gp350/220- DNA und -Proteine sind auf dem Gebiet bekannt. Konkret wurden rekombinante trunkierte Konstrukte des gp350/220-Gens ohne die Membran-überspannende Sequenz erzeugt. Solche Konstrukte produzieren ein Gemisch der zwei gp350 und gp220, doch die Deletion der Membran-überspannenden Region erlaubt die Sekretion der Proteine. Siehe Finerty, J. Gen. Viroloy 73, 449 (1992); und Madej, Vaccine 10, 777 (1992). Verschiedene rekombinant produzierte Restriktionsfragmente und Fusionsproteine mit verschiedenen gp350/220-Sequenzen wurden ebenfalls hergestellt und in E. coli exprimiert. Siehe die EP-A-0.173.254 vom 24. Juli 1991.
Die EBV-Forschung in Bezug auf gp350/220 konzentrierte sich entweder auf die Erreichung wirkungsvoller Expression der nativen gp350/220-Sequenz oder auf eine modifizierte Sequenz ohne die Transmembran-Domäne, was zu einem Gemisch der zwei alternativen gespleißten Versionen des nativen oder transmembran-losen Proteins führte, oder auf die Produktion epitoper Fragmentsequenzen in β-Galactosidase- Fusionsproteinen.
Teilweise gereinigte Präparate von gp350/220 sind bekannt. Siehe Finerty, J. Gen. Virology 73, 449 (1992) (rekombinant produziert, partiell gereinigt). In Bezug auf das native gp350/220-Protein führten in den meisten Fällen die Reinigungsverfahren zur Inaktivierung der Antigenität des Proteins, wodurch es zur Verwendung in einem Subunit- Impfstoff ungeeignet war. Hochgereinigte Präparate von antigenisch aktivem gp350- Protein aus nativen, d. h. nicht-rekombinanten Quellen wurden jedoch auch in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Siehe David, J. Immunol. Methods 108, 231 (1988). Außerdem wurde rekombinantes Vakzinenvirus, das gp350/220-Protein exprimiert, dazu verwendet, Baumwoll-Tamarine gegen EBV-induziertes Lymphom zu impfen. Siehe Morgan, J. Med. Virology 25, 189 (1988); Mackett, EMBO J. 4, 3229 (1985); und Mackett, VACCINES '86, S. 293 (Lerner R. A., Chanock R. M., Brown F. (Hrsg.), 1986, Cold Spring Harbor Laboratory). Die virale gp350/220-DNA-Sequenz wurde allerdings bislang noch nicht konstruiert, um die Expression nur einer der alternativen gespleißten Versionen des Gens zu ermöglichen und damit die Produktion von reinem gp350- oder gp220-Protein zu gewährleisten. Es wurde auch noch kein rekombinantes oder mutantes Virus erzeugt, das eines der gp350- oder gp220-Proteine exprimiert.
Im Allgemeinen erleichtern Spleißstellen die Verarbeitung von Prä-mRNA-Molekülen zu mRNA. In Polyoma-Virus sind Spleißstellen für die wirkungsvolle Akkumulierung von späten mRNAs erforderlich. Die Änderung der 3'- und 5'-Spleißstellen in Polyoma- Virus-Transkripten reduzierte oder blockierte die mRNA-Akkumulation. Siehe Treisman, Nature 292, 595 (1981). In SV40-Virus erleichtern exzidierbare intervenierende Sequenzen den mRNA-Transport aus dem Nukleus und die mRNA-Stabilisierung im Nukleus, und da diese Intron/Exon-Verbindungssequenzen die Bindung kleiner, nuklearer RNP-Teilchen erleichtern, geht man davon aus, dass vorgespleißte mRNAs möglicherweise daran scheitern, sich richtig mit Verarbeitungswegen zu assoziieren. Es wurde gezeigt, dass Punktmutationen an Exon/Intron-Spleißstellen die Exon/Intron- Spaltung reduzieren und die Prä-mRNA-Verarbeitung, den Kerntransport und die Stabilität beeinträchtigen können. Siehe Ryu, J. Virology 63, 4386 (1989); und Gross, Nature 286, 643 (1980).
Daher war bis zur vorliegenden Erfindung die Wirkung der Spleißstellen-Modifikation auf die funktionelle Expression und die antigene Aktivität der durch die EBV gp350/220- Sequenz kodierten Proteine bestenfalls unbekannt und unvorhersagbar.
Es existiert die folgende zusätzliche Literatur. EBV-Biology und Krankheit wird im Überblick von Straus, Annal of Int. Med. 118, 45 (1993), beschrieben. Eine Erläuterung des offenen EBV BLLFI-Leserahmens findet sich bei Baer, Nature 310, 207 (1984). Beschreibungen der Epstein-Barr-Virus-gp350/220-DNA und -Aminosäuresequenzen finden sich in Artikeln von Beisel, J. Virology 54, 665 (1985); und Biggin, EMBO J. 3, 1083 (1984); sowie in der US-A-4.707.358 (Kieffet al. 1987). Ein Vergleich von für gp350/220 in Epstein-Barr-Virus-Typen A und B kodierenden DNA-Sequenzen ist bei Lees, Virology 195, 578 (1993), geoffenbart. Monoklonale Antikörper, die neutralisierende Aktivität gegen gp350/220-Glykoprotein von EBV aufweisen, sind in Thorley-Lawson, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 5307 (1980), geoffenbart. Spleißstellen-Konsenssequenzen für Donor- und Akzeptor-Spleißstellen sind bei Mount, Nucleic Acids. Res. 10, 459 (1982), geoffenbart.
In einem Aspekt bietet die Erfindung nicht-spleißende Varianten der EBV gp350/220- DNA-Sequenz. Die DNA-Sequenzen der Erfindung können eine isolierte DNA-Sequenz enthalten, die für die Expression von homogenem gp350-Protein kodiert. Die für gp350- Protein kodierende DNA-Sequenz ist dadurch gekennzeichnet, dass sie die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Nukleotidsequenz wie in Fig. 1 umfasst, worin die nativen Nucleotide an den Donor- und Akzeptorspleißstellen mit nicht-nativen Nucleotiden und Fragmenten davon ersetzt sind. Diese DNA-Sequenz kann nicht-kodierende, die Kodiersequenz flankierende 5' und 3'-Sequenzen und außerdem eine aminoterminale Signalsequenz enthalten. Fig. 1 zeigt die nicht-kodierenden Sequenzen, und das Ende der mutmaßlichen Signalsequenz ist mit einem Stern versehen. Man beachte jedoch, dass die DNA-Sequenzen der Erfindung einige oder alle dieser flankierenden oder Signalsequenzen ausschließen. Die nicht-spleißenden DNA-Sequenzvarianten der Erfindung werden durch Einführen von Mutationen in die DNA-Sequenz aus Fig. 1 an den Donor- und Akzeptorspleißstellen des für gp350/220 kodierenden Gens produziert. Dies eliminiert die Produktion von gp220-Protein, sodass nur das gp350-Protein produziert wird.
Gemäß einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung Verfahren zur Herstellung homogener gp350-Proteine durch Expression der nicht-spleißenden Variante der EBV gp350/220-DNA-Sequenz in einer geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle unter der Steuerung einer geeigneten Expressionskontrollsequenz. In Bezug auf gp350-Proteine bedeutet hierin "homogen" frei oder im Wesentlichen frei von gp220-Protein. Es ist zu beachten, dass homogenes gp350-Protein, das rekombinant in Säugetier- oder Insektenzellen produziert wird, laut Wissensstand der Anmelder bislang noch nie in der wissenschaftlichen Literatur erwähnt wurde.
Die homogenen gp350-Proteine können Deletionen besitzen, die zu einem sekretierten Produkt führen. Solche Deletionen umfassen entweder die Entfernung der Transmembran-Region oder die Entfernung der Transmembran-Region und des verbleibenden C- Terminus von gp350. Solche zusätzlich modifizierten DNA-Sequenzen stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Die Erfindung bietet auch ein rekombinantes DNA-Molekül, das Vektor-DNA und eine DNA-Sequenz umfasst, die für homogenes gp350-Protein kodiert. Das DNA-Molekül besitzt die gp350-Sequenz in operativer Assoziation mit einer geeigneten regulatorischen Sequenz, die die Replikation und Expression von homogenem gp350 in einer ausgewählten Wirtszelle lenken kann. Mit solchen DNA-Molekülen transformierte Wirtszellen zur Verwendung beim Exprimieren von rekombinantem homogenem gp30 werden von der Erfindung ebenfalls bereitgestellt.
Die DNA-Moleküle und transformierten Wirtszellen der Erfindung werden in einem anderen Aspekt der Erfindung verwendet, nämlich in einem neuartigen Verfahren zur Produktion von rekombinantem homogenem gp350-Protein oder Fragmenten davon. In diesem Verfahren wird eine Zelllinie, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die für ein homogenes gp350-Protein oder ein Fragment davon (oder ein wie oben beschriebenes rekombinantes DNA-Molekül) in operativer Assoziation mit einer geeigneten regulatorischen oder Expressionskontrollsequenz kodiert, die zur Expression des Proteins fähig ist, unter zweckentsprechenden Bedingungen kultiviert, die die Expression rekombinanter DNA ermöglichen. Das exprimierte Protein wird dann aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium durch ein geeignetes herkömmliches Mittel geerntet. Das Verfahren kann einige bekannte Zellen als Wirtszellen verwenden, wobei derzeit Säugetier- und Insektenzellen bevorzugt werden.
Die DNA-Sequenzen und Proteine der Erfindung eignen sich zur Produktion therapeutischer und immunogener Verbindungen mit antigenen EBV-Determinanten. Solche Verbindungen kommen für Subunit-Impfstoffe für die prophylaktische Behandlung und Prävention von mit EBV assoziierten Krankheiten wie z. B. Mononukleose, Burkitt- Lymphom und Nasopharyngal-Karzinom in Frage. In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, die zur Prävention und Behandlung von mit EBV in Zusammenhang stehenden Zuständen und Krankheiten beim Menschen verwendet wird, z. B. bei infektiöser Mononukleose, Burkitt-Lymphom und Nasopharyngal-Karzinom. Solche therapeutischen und/oder immunogenen pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen eine immunogen induzierende wirksame Menge eines oder merherer der homogenen gp350-Proteine der Erfindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger wie z. B. Aluminiumhydroxid, Kochsalzlösung und phosphatgepufferter Kochsalzlösung, wie dies auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Unter "immunogen induzierend" ist hierin eine Menge gemeint, die für die Stimulation der Produktion von EBV-Antikörpern in einem Säugetier ausreicht. Alternativ dazu kann der Wirkstoff in Form eines Liposomenhältigen Aggregats verabreicht werden. Zur prophylaktischen Verwendung können solche pharmazeutischen Zusammensetzungen als Subunit-Vakzinen zwecks Verabreichung an Humanpatienten formuliert sein. Patienten können mit einer Dosis geimpft werden, die ausreicht, um Antikörperbildung im Patienten zu stimulieren, und nach sechs Monaten oder einem Jahr erneut geimpft werden.
Fig. 1 zeigt die DNA und Aminosäuresequenz von gp350/220 (aus Beisel, J. Virology 54, 665 (1985)). Die Donor- und Akzeptorspleißstellen sind angezeigt. Die Transmembran-Region ist mit horizontalen Pfeilen abgegrenzt, und ein Stern (*) markiert das Ende der mutmaßlichen Signalsequenz. Die Nucleotid-Nummerierung ist links, die Aminosäuren-Nummerierung rechts angegeben.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion von gp350-Deletion und stellengerichtete Mutanten. Die Plasmidkarten mit den Bezeichnungen pMDTM und pMSTOP veranschaulichen die nicht-spleißenden gp350/220-Varianten der Erfindung. In Abschnitt (A) ist ein lineares Modell des gp350-Proteins dargestellt, das maßstabsmäßig etwa mit dem kodierenden Klon (BLFF1 weiter unten) übereinstimmt. Eine N-terminale Signalsequenz (SS) und die Transmembran-Domäne (TM) sind auf dem Protein angezeigt, und wichtige Restriktionsstellen sind auf dem Gendiagramm zu sehen. Das gp350-Gen wurde in zwei Segmente kloniert, das HindIII/Bfal BLSH1-Fragment und das BanI/HindIII BLSH2- Fragment. SCYT wurde unter Anwendung von Polymerase-Kettenreaktion aus der Region von BLLF1 erzeugt. In (B) ist das Klonierschema für pDTM, pSTOP, pMDTM und pMSTOP dargestellt (Plasmide nicht maßstabsgetreu). Die Details der Klonierung sind in Beispielen 1 und 2 beschrieben. Plasmidkarten sind mit den relevanten Restriktionsstellen, den verwendeten Kloniervektoren und den gp350-Genfragmenten versehen. Spleißstellenmutationen in pMDTM und pMSTOP sind durch Sterne gekennzeichnet.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Immunfällung von homogenem gp350-Protein aus pMDTM-Klonen (analysiert durch SDS-PAGE). Zellen des positiven Vergleichs (GH3Δ19), die eine trunkierte Form des gp350/220-Proteins sekretieren, Zellen des negativen Vergleichs (pEE14) und mehrere pMDTM-Klone wurden metabolisch mit ³&sup5;S- Methionin 5,5 Stunden lang markiert; homogenes gp350-Protein wurde aus den resultierenden Gewebekulturüberständen immungefällt. Für jeden Zelltyp wurden Proben von markierten Gewebekulturüberständen (S) und gp350/220-Niederschlägen (Ip) auf SDS-PAGE (Polyacrylamidgel-Elektrophorese) elektrophoresiert. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind links angegeben.
Fig. 4 veranschaulicht die Ergebnisse der Northern Blot-Analyse von Protein aus in CHO-Zellen exprimierten pMDTM-Klonen (siehe Beispiel 3.4).
Es werden Zusammensetzungen und Verfahren geoffenbart, die klonierte EBV-DNA-Sequenzen umfassen, die für nicht-spleißende Varianten von gp350-Protein kodieren. Solche nicht-spleißenden Varianten werden hierin als homogene gp350-Proteine bezeichnet. Normalerweise werden - wenn das gp350/220-Gen in Säugetierzellen exprimiert wird - zwei Genprodukte erzeugt (gp350 und gp220), was auf die RNA-Spleißung des Gens zurückzuführen ist. Die Erfindung ermöglicht es, dass nur ein Genprodukt, gp350, produziert wird. Die Erfindung sieht die Entfernung einiger oder aller der RNA- Spleißstellensignale im gp350-Gen und das Exprimieren des Gens in einer geeigneten Wirtszelle vor. Mutationen im gp350/220-Gen wurden eingeführt, um die Produktion der 220 kD-Version des Proteins zu verhindern, wenn das gp350/220-Gen in Säugetierzellen exprimiert wird. In der Folge entstehen mRNA-Transkripte, die nur für gp350 kodieren. Die Eliminierung der gp220-Expression unter Verwendung einer nichtspleißenden gp350/220-Gen-Variante führt zur erhöhten Produktion von gp350 gegenüber gp220. Die Produktion von gp220 ist für die Erzeugung einer wirksamen Anti-EBV- Vakzine nicht entscheidend, da gp350 alle potenziellen antigenen Stellen auf gp220 enthält.
Daher bietet ein Aspekt der Erfindung eine DNA-Sequenz, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, die im Wesentlichen die gleiche wie gp350 ist, außer dass die Donorspleißstellen-Codonkodierende Aminosäure 501 und die Akzeptorspleißstellen-Codonkodierende Aminosäure 698 durch Ersetzung nativer Nucleotide mit nicht-nativen Nucleotiden modifiziert wurden. Vorzugsweise sind die nativen Nucleotide durch nicht-native Nucleotiden ersetzt, sodass die Aminosäuresequenz die gleiche bleibt. Konkret wurden im Beispiel die nativen Nucleotide AAGT an der Donorspleißstelle (Nucleotide 1500 bis 1504) und die nativen Nucleotide A und T, die die GG-Akzeptorspleißstelle flankieren (Nucleotide 2091 und 1094) durch Nucleotide GTCA bzw. T und A ersetzt. In der Folge blieben das Glutamin an Aminosäureposition 500 und das Serin an Position 501 infolge dieser Substitution an der Donorstelle unverändert. Ebenso blieben das Threonin an Aminosäureposition 697 und das Glycin an Position 698 infolge der Modifikation der Akzeptorstelle unverändert.
Analog dazu könnten andere Substitutionen als die spezifisch angeführten von Fachleuten auf dem Gebiet problemlos durchgeführt werden, wie dies weiter unten ausführlich erklärt wird.
Die homogenen gp350-Proteine können weiters dadurch gekennzeichnet sein, dass sie eine Aminosäuresequenz aufweisen, die im Wesentlichen die gleiche wie jene aus Fig. 1 ist - von Aminosäure 1 bis 907, von Aminosäure 1 bis 862 oder von Aminosäure 1 bis 907, mit Ausnahme der Aminosäuren 863 bis 881, jeweils mit oder ohne die N- terminale 18 Aminosäuren-Signalsequenz. Außerdem werden Analoge homogener gp350-Proteine bereitgestellt, die Mutanten enthalten, in denen Variationen in der Aminosäuresequenz existieren, die antigene Aktivität beibehalten und vorzugsweise Homologie von zumindest 80%, noch bevorzugter 90%, am bevorzugesten 95%, mit der korrespondierenden Region der homogenen gp350-Proteine aufweisen. Beispiele sind Prtoeine und Polypeptide mit kleineren Aminosäurevariationen aus der Aminosäuresequenz aus Fig. 1; insbesondere konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionen sind jene, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die hinsichtlich ihrer Seitenketten verwandt sind. Genetisch kodierte Aminosäuren sind im Allgemeinen in vier Familien eingeteilt: (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) nicht-polar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal gemeinsam in als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Beispielsweise kann man davon ausgehen, dass eine isolierte Substitution eines Leucins oder eine ähnliche konservative Substitution einer Aminosäure mit einer strukturell verwandten Aminosäure keine starke Auswirkung auf antigene Aktivität oder Funktionalität hat.
Die Erfindung bietet den Vorteil der einfacheren Reinigung von gp350. Da gp350 und gp220 ähnliche biochemische Eigenschaften aufweisen, wird gp220 oft gemeinsam in Präparaten von gp350 gereinigt. Zellen, die nur die nicht-spleißende Variante des gp350/220-Gens exprimieren, vereinfachen die Proteinreinigung. Dies senkt die Kosten der Erzeugung von gp350. Die Erfindung macht auch die biochemische Charakterisierung des Ausgangsmaterials für die gp350-Reinigung einfacher. Da nur eine Spezies vorhanden ist, können die Proteingehalt-Analyse und die Aminosäuresequenz-Analyse erfolgen, ohne auf die Gegenwart einer zweiten Spezies Rücksicht zu nehmen.
Die Erfindung bietet den zusätzlichen Vorteil der gesteigerten gp350-Produktion. Die Prävention von gp350-Genspleißen verschiebt die Zelle von der dualen Produktion von gp350 und gp220 auf die Produktion von nur gp350. In einigen Zellen wurden die Konzentrationen von gp220 auf 30 bis 100% der gp350-Konzentration geschätzt. Bei eliminierter Genspleißung wird die gp350-Produktion infolge des Mangels der gp220-Produktion erhöht.
Die DNA-Sequenz des gp350/220-Gens wird von Beisel, J. Virology 54, 665 (1985); und Biggin, EMBO J. 3, 1083 (1984), beschrieben und ist in Fig. 1 dargestellt. Das Gen ist ein offener Leserahmen von 2721 Basen, die für 907 Aminosäuren kodieren und ein primäres Translationsprodukt von etwa 95 kD spezifizieren. Die Differenz zwischen vorhergesagten und tatsächlichen Werten repräsentiert extensive Glykosylierung des Proteins. 591 Basen (kodieren für 197 Aminosäuren) werden ausgespleißt, um gp220 zu produzieren. Das scheinbare Molekulargewicht von gp350/220-Genprodukten kann auch variieren und von der Art des verwendeten Messsystems, vom Einsatz der Glykosylierungsstelle in unterschiedlichen Zelltypen, von posttranslationalen Verarbeitungsdifferenzen oder selektiver Genmutation abhängen. Die gemessenen Werte variieren in den Produkten unterschiedlicher gp350/220-Gen-Nichtspleißstellen- Varianten, doch der Ausdruck "homogenes gp350-Protein oder Proteine" umfasst Genprodukte der nicht-spleißenden Variante, gegebenenfalls mit zusätzlichen Deletionen oder Mutationen, wie z. B. C-terminalen Deletionen und/oder Transmembran-Modifikationen, die ebenfalls hierin geoffenbart sind. Der Ausdruck "gp220-Protein" bezieht sich auf das alternativ gespleißte gp350/220-Genprodukt mit einem Molekulargewicht von etwa 220 kD. Spleißstellen im gp350/220-Gen wurden durch Vergleich des gp350/220-Gens mit Konsens-Donor- und -Akzeptorspleißsequenzen auf der Basis anderer Gene, vor allem aus eukaryotischen Organismen, identifiziert. Die von Mount, Nucleic Acids Res. 10, 459 (1982), aus der Untersuchung der Spleißstellen in anderen Genen entwickelten Konsenssequenzen sind:
Die mit Sternen versehenen Basen stellen Basen dar, die in 100% aller Spleißstellen auftreten (hochkonserviert). Positionen mit zwei Basen oder einer Base stellen konservierte Positionen dar (nicht hervorgehobene Positionen). Der Schrägstrich zeigt die tatsächliche Spleißstelle an.
Im gp350/220-Gen tritt die Donorspleißstelle nach Nucleotid 1501 und die Akzeptorstelle nach Nucleotid 2092 auf, wie sich dies durch DNA-Sequenzieren (Biggin, EMBO J. 3, 1083 (1984)) des gp350/220-Gens zeigt. (Die hierin und in Fig. 1 verwendete Nummerierung entspricht jener von Biggin.) Die Spleißstelle tritt in der korrespondierenden Genregion im Typ B-Stamm von EBV auf (die Donorspleißstelle nach A1501 und die Akzeptorspleißstelle nach G2029). Die Erfindung umfasst Zusammensetzungen, gebildet unter Verwendung entweder des A- oder B-Stamms oder einer Spleißstelle eines anderen EBV-Stamms zwecks Produktion einer einzelnen Spezies von mRNA aus dem gp350/220-Gen. Die DNA-Sequenz von Typ A des Virus aus Stamm B95-8 wurde in den Beispielen verwendet, doch es hätte ebenso gut die DNA-Sequenz des Stamms vom Typ B verwendet werden können, da die translatierten Genprodukte der Stämme vom Typ A und B zu 98% identisch sind. Dem B-Stamm fehlen die Aminosäuren 507 bis 520 und 570 bis 576. Der Stamm vom Typ A wurde verwendet, da er alle möglichen antigenen gp350-Stellen besitzt. Alternativ dazu könnte EBF gp350/220 mit stammspezifischen Sequenzen gemäß den hierin geoffenbarten Lehren verwendet werden, um stammspezifische homogene EBV gp350-Proteine zu produzieren, deren immunogene Eigenschaften für einen bestimmten Stamm spezifisch sind und die sich daher in immunogenen und/oder therapeutischen Zusammensetzungen für die Prävention oder Behandlung von mit stammspezifischem EBV in Verbindung stehenden Krankheiten eignen. Tabelle 1 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der Wildform der Donor- und Akzeptorspleißstellen.
Um RNA-Spleißen des gp350/220-Gens zu verhindern, wurden Mutationen in die gp350/220-Gen-Nucleinsäuresequenz eingeführt, um die relevanten Basenpaare der RNA-Spleißstelle zu ersetzen. Um eine Spleißstelle nicht-funktionell zu machen, sollte vorzugsweise zumindest eine der Basen von den zwei hochkonservierten Basen, die die Donor- oder die Akzeptorstelle umrahmen, durch nicht-konservierte Basen ersetzt werden, noch bevorzugter sollten zumindest zwei hochkonservierte Basen zu nichtkonservierten Basen mutiert werden. Andere konservierte Basen, die sich mehr als zwei Basen von der Spleißstelle entfernt befinden, können auch durch nicht-konservierte Spleißstellenbasen ersetzt werden, um die Erkennung der Spleißstelle wieter zu verringern. Sowohl die Donor- als auch die Akzeptorstelle können verändert werden, um Spfeißmechanismen zu behindern. Vorzugsweise enthalten sowohl der Donor als auch der Akzeptor zumindest jeweils eine Änderung an einer der vier hochkonservierten Spleißstellen-Basenpositionen, noch bevorzugter zumindest zwei Änderungen an zwei der vier hochkonservierten Spleißstellen-Basenpositionen. Wenn eine Spleißstelle infolge des Wunsches, die Aminosäuresequenz der Wildform beizubehalten, nicht mutierbar ist, ist es vorzuziehen, zumindest zwei Mutationen in die andere Spleißstelle einzuführen.
Die Mutation an den gp350/220-Spleißstellen kann Veränderungen in die Aminosäuresequenz des anschließend exprimierten gp350-Proteins bringen. Vorzugsweise sollten solche Veränderungen konservative Aminosäuresubstitutionen sein. Konservative Substitutionen in der Aminosäuresequenz - im Gegensatz zu nicht-konservativen Änderungen der Aminosäuresequenz - tragen zur Bewahrung antigener Stellen bei. Konservative Aminosäureänderungen können erfolgen, sofern die Basenänderung(en) zu einer entsprechenden Veränderung in den invarianten Donor/Akzeptorbasen führt/führen. Beispielsweise könnte Gly für Ser&sub5;&sub0;&sub1; an der Donorspleißstelle unter Verwendung beliebiger Gly-spezifischer Codons substituiert werden - mit Ausnahme von GGU (die Verwendung von GGU würde das G-Nucleotid bewahren und nicht die gewünschte GT-Substitution im Spleißsignal bewirken). Ebenso wärde an der Akzeptorspleißstelle Gly&sub6;&sub9;&sub8; zu Ala eine konservative Änderung, doch da Ala-Codons mit dem hochkonservierten G-Nucleotid beginnen, würde dies nicht die gewünschte Substitution bewirken. Obwohl Prolin auch eine konservative Aminosäureänderung sein kann, wird Prolin nicht dazu verwendet, eine Aminosäure der Wildform zu ersetzen, da es zur Modifikation der Tertiärstruktur des Proteins und dadurch zur Maskierung einer oder mehrerer antigener gp350-Stellen führen würde. Tabelle 1 zeigt die annehmbaren konservativen Aminosäuresubstitutionen in den Sequenzen der Wildform. Unten in Tabelle 1 ist ein Beispiel für eine Mutation mit konservativen Aminosäureänderungen angeführt. TABELLE 1
Obwohl ein Aspekt der Erfindung eine nicht-spleißende Variante von gp350/220 betrifft, sind möglicherweise auch zusätzliche Mutationen der gp350/220-Kodiersequenz wünschenswert. Um lösliche homogene gp350-Proteine zu produzieren ("lösliche Proteine" sind entweder frei in Lösung oder Membran-assoziiert, aber nicht Membran-integriert) und um z. B. Probleme mit der Zelltoxizität infolge der Expression von gp350 voller Länge als integrales Membranprotein zu vermeiden, wird die Membran-überspannende Region (auch als Transmembranregion bekannt) von gp350 durch Deletion eines Teils oder der Gesamtheit seiner kodierenden DNA-Sequenz modifiziert. Die Membranüberspannende Region von gp350/220 umfasst die Aminosäuren 861 (Methionin) bis 881 (Alanin). Siehe Beisel, J. Virology 54, 665 (1985). Vorzugsweise werden zumindest 8 Aminosäuren der Transmembranregion deletiert, noch bevorzugter zumindest 12 Aminosäuren, am bevorzugtesten zwischen 18 und 21 Aminosäuren. Demzufolge bietet in einem anderen Aspekt die Erfindung nicht-spleißende Varianten von gp350/220-DNA und/oder pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 18, die homogenes gp350-Protein umfassen, das zusätzlich zumindest eine Deletion in der Transmembranregion der gp350/220-DNA und/oder dem homogenen gp350-Protein umfasst, das zur Expression des löslichen homogenen gp350-Proteins führt.
Zusätzlich zur Deletion eines Teils oder der Gesamtheit der Transmembrandomäne der nicht-spleißenden gp350/220-Variante kann die C-terminale Sequenz, die der Transmembrandomäne folgt und die Aminosäuren 881 bis 907 umfasst, gemäß der Erfindung auch zur Gänze oder teilweise deletiert werden, wie dies hierin beschrieben ist. In einem weiteren Aspekt umfasst somit die Erfindung nicht-spleißende Varianten von gp350/220-DNA und/oder pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 18, die homogenes Protein umfassen, das durch Deletion eines Teils oder der Gesamtheit der kodierenden DNA- und/oder Aminosäuresequenz, umfassend die Transmembranregion von gp350/220, und sogar noch weiter durch die Deletion der übrigen C-terminalen DNA und/oder Aminosäuresequenzen von gp350/220 modifiziert ist.
Demzufolge umfasst gemäß einem weiteren Aspekt die Erfindung nicht-spleißende DNA-Sequenzvarianten, die für die homogenen gp350-Proteine der Erfindung kodieren. Solche DNA-Sequenzen umfassen die DNA-Sequenz der kodierenden Aminosäuren 1 bis 907 aus Fig. 1, ferner umfassend die hierin geoffenbarten Nucleotidsubstitutionen, um die Donor- und Akzeptorspleißstellen zu entfernen. Solche DNA-Sequenzen umfassen gegebenenfalls trunkierte DNA-Sequenzen, in denen die Nucleotide, die für die gesamte oder einen Teil der Transmembrandomäne kodieren, und der C-Terminus, der Aminosäuren 861 bis 907 umfasst, deletiert sind, und Deletionsvarianten, in denen die Nucleotide, die für die Gesamtheit oder einen Teil der Transmembrandomäne kodieren, die Aminosäuren 861 bis 881 umfasst, deletiert sind. Die DNA-Sequenzen der Erfindung, die für homogene gp350-Proteine kodieren, können auch DNA umfassen, die unter geeigneten Strengebedingungen an eine isolierte DNA-Sequenz von Fig. 1 hybridisieren kann oder die unter solchen Bedingungen abgesehen von der Degeneriertheit des genetischen Codes hybridisieren könnte. Demzufolge können die DNA-Sequenzen der Erfindung Modifikationen in den nicht-kodierenden Sequenzen, Signalsequenzen oder Kodiersequenzen auf der Basis von Allel-Variation, Speziesvariation oder gezielter Modifikation enthalten.
Diese hierin geoffenbarten nicht-spleißenden gp350/220-DNA-Sequenzvarianten können unter Anwendung auf dem Gebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Die modifizierten DNA-Sequenzen der Erfindung können ebenso mittels bekannter Verfahren rekombinant exprimiert werden, um die homogenen gp350-Proteine der Erfindung zu produzieren. Solche rekombinanten Proteine können gereinigt und in pharmazeutische Zusammensetzungen für die prophylaktische Behandlung und Prävention von EBV- assoziierten Erkrankungen inkorporiert werden.
Die nicht-spleißenden Varianten von gp350/220-DNA der Erfindung können in unterschiedlichen Zelltypen unter Einsatz der geeigneten auf dem Gebiet bekannten Expressionskontrollsysteme rekombinant exprimiert werden. Geeignete auf dem Gebiet bekannte und erhältliche Zellen sind u. a. Hefezellen wie etwa Saccharomyces cerevisiae, bakterielle Zellen wie etwa E. coli und Bacillus subtilis und Säugetierzellen wie etwa GH3-, CHO-, NSO-, MDCK- und C-127-Zellen. Mit Zelltypen verwendete Vektoren werden auf der Grundlage ihrer Verträglichkeit mit dem verwendeten Zelltyp und Expressionskontrollsystem ausgewählt. Zellen und Vektoren, die für Expression sekretierter Produkte des gp350/220-Gens sorgen, sind vorzuziehen. Typischerweise wird E. coli unter Verwnendung von Derivaten von pBR322 transformiert, die unter Einsatz konventioneller Techniken modifiziert wurden, um DNA-Sequenzen für die Expression des gewünschten Proteins zu enthalten, in diesem Fall die nicht-spleißenden Sequenzvarianten von EBV gp350 (mit oder ohne die Sequenzen, die für C-Terminus und/oder Membran-überspannende Region kodieren). pBF322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz, die als Marker verwendet werden können. Siehe Bolivar, Gene 2, 95 (1977). Üblicherweise verwendete Expressionskontrollsequenzen, d. h. Promotoren für die Transkriptionsinitiation und gegebenenfalls ein Operator oder Enhancer, enthalten die β-Lactamase und lac-Promotorsysteme (siehe Chang, Nature 198, 1056 (1977)), das Tryptophan-Promotorsystem (siehe Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1990)) sowie den λ-abgeleiteten PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomen- Bindungsstelle (siehe Shimatake, Nature 292, 128 (1981)). jedes verfügbare Promotorsystem oder Expressionskontrollsystem, das mit prokaryotischen Wirtszellen verträglich ist, kann jedoch verwendet werden. Andere Beispiele für Wirtszellen, Plasmid- und Expressionsvehikel sind in den US-A-4.356.270 (Itakura 1982), US-A- 4.431.739 (Riggs 1984) und US-A-4.440.859 (Rutter 1984) geoffenbart.
Insektenzellen können als Wirtszellen unter Einsatz von Insektenzellen-Expression verwendet werden. Im Falle der Expression in Insektenzellen enthalten im Allgemeinen die Komponenten des Expressionssystems einen Transfervektor, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, das sowohl ein Fragment des Baculovirus-Genoms als auch eine geeignete Restriktionsstelle für das Insertieren des bzw. der zu exprimierenden heterologen Gens bzw. Gene enthält; ein Baculovirus der Wildform mit einer Sequenz, die zum Baculovirus-spezifischen Fragment im Transfervektor homolog ist (dies ermöglicht die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus- Genom); und geeignete Insektenwirtszellen und Wachstumsmedien.
Der derzeit am häufigsten verwendete Transfervektor für das Einführen von Fremdgenen in AcNPV ist pAc373. Viele andere Vektoren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wurden ebenfalls konstruiert. Dazu zählen z. B. pVL985 (der das Polyhedrin- Startcodon von ATG auf ATT verändert und eine BamHl-Klonierstelle 32 bp stromab vom ATT einführt; siehe Luckow und Summers, Virology 17, 31 (1989)).
Das Plasmid enthält üblicherweise das Polyhedrin-Polyadenylierungssignal (Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. 42, 177 (1988)) und ein prokaryotisches Ampicillin-Resistenz-Gen (amp-Gen) sowie enen Replikationsursprung für die Selektion und Vermehrung in E. coli.
Baculovirus-Transfervektoren enthalten üblicherweise einen Baculovirus-Promotor. Ein Baculovirus-Promotor ist jede beliebige DNA-Sequenz, die eine Baculovirus-RNA-Polymerase binden und die Stromab-Transkription (5' bis 3') einer Kodiersequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA initiieren kann. Ein Promotor besitzt eine Transkriptionsinitiationsregion, die sich üblicherweise proximal zum 5'-Ende der Kodiersequenz befindet. Diese Transkriptionsinitiationsregion enthält typischerweise eine RNA- Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle. Ein Baculovirus- Transfervektor kann auch eine zweite als Enhancer bekannte Domäne enthalten, die - falls sie vorhanden ist - üblicherweise distal zum Strukturgen angeordnet ist. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein. Für die Insektenzellen-Expressionstechnologie siehe EP-A-155.476.
Hefe, z. B. Saccharomyces cerevisiae, ist auch als Wirtszelle geeignet. Verschiedene Stämme stehen zur Verfügung und kommen in Frage. Für die Hefeexpression geeignete Plasmidvektoren sind ebenso bekannt wie Promotor- und Expressionskontrollsysteme. Siehe z. B. Myanohara, Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 1 (1983) (PHO5-Promotor); EP-A- 012.873 (Leadersequenzen); Kurtz, Mol. Cell. Biol. 6, 142 (1986); Ito, J. Bacteriol. 153, 163 (1983); und Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 1929 (1979) (Transformationsverfahren und geeignete Vektoren).
Eukaryotische Zellen aus multizellularen Organismen können natürlich auch als Wirtszellen für die Expression von Genen verwendet werden, die für Proteine und Polypeptide von Interesse kodieren. Nützliche Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen sowie Chinahamster-Eierstockzellen (CHO). Mit solchen Zellen kompatible Expressionsvektoren sind auch erhältlich und enthalten typischerweise Promotoren und Expressionskontrollsequenzen wie z. B. die frühen und späten Promotoren von SV40 (siehe Fiers, Nature 273, 113 (1978)) und Promotoren aus Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Rinderpapilloma-Virus oder Vögel-Sarkoma-Virus.Beispiele für Wirtszellen, Promotoren, selektierbare Marker und Techniken sind auch in US-A-5.122.469 (Mather 1992), 4.399.216 (Axel 1983), 4.634.665 (Axel 1987), 4.713.339 (Levinson 1987), 4.656.134 (Ringold 1987), 4.822.736 (Kellems 1989) und 4.874.702 (Fiers 1989) geoffenbart.
Die Transformation geeigneter Wirtszellen erfolgt unter Anwendung von an solche Zellen angepassten Standardtechniken, z. B. CaCl&sub2;-Behandlung für Prokaryoten (siehe Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. 69, 2110 (1972)) und CaPO&sub4;-Fällung für Säugetierzellen (siehe Graham, Virology 52, 546 (1978)). Hefetransformation kann gemäß dem Verfahren von Hsiao, Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 3829 (1979); oder Klebe, Gene 25, 333 (1983); durchgeführt werden.
Die Konstruktion nützlicher Vektoren, die die nicht-spleißende gp350-Sequenzvariante enthalten (mit oder ohne die hierin geoffenbarten zusätzliche Modifikationen, die zur Deletion des C-Terminus und/oder der Membran-überspannenden Region führen) erfolgt unter Anwendung konventioneller, auf dem Gebiet bekannter Ligations- und Restriktionstechniken. Ortsgerichtete DNA-Spaltung erfolgt durch Behandlung mit geeignetem bzw. geeigneten Restriktionsenzym(en) unter Standardbedingungen, die typischerweise vom Hersteller des Restriktionsenzyms detailliert beschrieben sind. Polyacrylamidgel- oder Agarosegel-Elektrophorese kann durchgeführt werden, um die gespaltenen Fragmente mittels Standardtechniken größenmäßig zu trennen und die Fragmente mittels Behandlung mit dem Klenow-Fragment von E. coli Polymerase 1 in Gegenwart der vier Desoxynucleotidtriphosphate an den Enden abzustumpfen. Die Behandlung mit S1 Nuclease hydrolysiert jeden einzeistrangigen Abschnitt. Synthetische Oligonucleotide können z. B. unter Anwendung des auf dem Gebiet bekannten Diethylphosphoamidit-Verfahrens erzeugt werden (siehe US-A-4.415.732 (1983)). Ligationen können unter Verwendung von T4 DNA-Ligase unter Standardbedingungen und -temperaturen erfolgen und korrekte Ligationen durch Transformieren von E. coli oder COS-Zellen mit dem Ligationsgemisch bestätigt werden. Erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder andere Antibiotikaresistenz oder unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten anderen Markern selektiert.
Derartige DNA-Rekombinationstechniken sind ausführlich in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe (1989); "DNA Cloning", Bd. 1 und II (D. N. Glover, Hrsg., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.). Gait, Hrsg., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames, Hrsg., 1984); "Transcription and Translation" (B. D. Hames, Hrsg., 1984), "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, Hrsg., 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. H. Miller, Hrsg., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", 2. Ausgabe (1987, Springer-Verlag NY) und "Handbook of Experimental Immunology", Bd. I-IV (D. M. Weired, 1986). Alle diese hierin erwähnten Druckschriften sind hierin durch Verweis aufgenommen.
Demzufolge umfasst in einem anderen Aspekt die Erfindung Vektoren, die nichtspleißende Varianten von gp350/220-DNA-Sequenzen und Wirtszellen enthalten, und ferner ein Verfahren zur Herstellung einer nicht-spleißenden Variante von gp350/220-Protein durch Kultivieren der Wirtszellen, die einen Vektor enthalten, der eine nicht-spleißende Variante einer gp350/220-DNA-Sequenz trägt, die operabel mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist; dies erfolgt unter Kulturbedingungen, die Expression des homogenen gp350-Proteins ermöglichen.
Das exprimierte homogene gp350 wird aus Zell- und Kulturmedium-Bestandteilen mittels herkömmlicher, auf dem Gebiet bekannter Glykoprotein-Reinigungstechniken gereinigt, z. B. Ultrafiltration, Freifluss-Elektrophorese, Gelfiltrations-Chromatographie, Affinitätschromatographie, SDS-PAGE, Differential-NH&sub4;SO&sub4;-Fällung, Lectinsäulen, Ionenaustauschsäulen und Hydrophobiesäulen. In kleinem Maßstab hergestellte analytische Präparate von gp350 werden am leichtesten durch SDS-PAGE oder Lectin-Affinitätssäulen gereinigt; in kleinem Maßstab hergestellte Präparate zur Verwendung in Impf oder Immunreaktions-Experimenten werden am besten durch Flüssigkeitschromatographie gereinigt. Für die in großem Maßstab erfolgende Produktion kommerziell signifikanter Mengen von gp350 für Impfzusammensetzungen wird eine Kombination von Ultrafiltration, Gelfiltration, Ionenaustausch und Hydrophob-Chromatographie bevorzugt.
Die gereinigten homogenen gp350-Proteine der Erfindung können in therapeutischen und/oder immunogenen Zusammensetzungen zur Prävention und Behandlung von mit EBV in Zusammenhang stehenden Zuständen und Krankheiten wie z. B. infektiöser Mononukleose, Burkitt-Lymphom und Nasopharyngal-Karzinom verwendet werden. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen eine immunogen induzierende wirksame Menge eines oder mehrerer der homogenen gp350-Proteine der Erfindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, z. B. einem Adjuvans/Antigen-Präsentationssystem wie etwa Alaun. Andere Adjuvans/Antigen- Präsentationssysteme, z. B. MF59 (Chiron Corp.), QS-21 (Cambridge Biotech Corp.), 3- DMPL (3-Deacylmonophosphoryllipid A, RibilmmunoChem Research, Inc.), Incomplete Freunds Adjuvant (IFA) in klinischer Reinheit), fusogene Liposome, wasserlösliche Polymere oder Iscome (Immun-stimulierende Komplexe) kommen ebenfalls in Frage. Andere Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Träger oder Lösungen sind Aluminiumhydroxid, Kochsalzlösung und phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Die Zusammensetzung kann vorzugsweise subkutan oder intramuskulär in Form einer annehmbaren subkutanen oder intramuskulären Lösung systemisch verabreicht werden. Impfung kann durch Oberflächenskarifizierung oder durch Impfung eines Körperhohlraums erfolgen. Die Herstellung solcher Lösungen unter Berücksichtigung des pH-Werts, der Isotonie, der Stabilität u. dgl. ist für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig. Das Dosierungsregime wird vom behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren festgelegt, um die Wirkungsweise von Arzneimitteln zu modifizieren; solche Faktoren sind z. B. der körperliche Zustand, das Körpergewicht, das Geschlecht, die Ernährung, der Schweregrad des Zustands, der Verabreichungszeitpunkt und andere klinische Faktoren. Beispiele für Dosierbereiche sind zwischen etwa 1 ug und etwa 1000 ug Protein.
Bei der Durchführung des Behandlungsverfahrens wird eine immunologisch induzierende wirksame Menge an homogenem gp350-Protein an einen Humanpatienten verabreicht, der therapeutische oder prophylaktische Behandlung erfordert. Eine immunologisch induzierende wirksame Menge einer Zusammensetzung der Erfindung liegt im Bereich von etwa 1 ug bis etwa 1 mg pro verabreichter Dosis. Die Anzahl der verabreichten Dosen kann variieren und hängt von den oben erwähnten Faktoren ab. Die Erfindung wird nun durch nachstehende Beispiele beschrieben, die die Erfindung veranschaulichen sollen.

BEISPIEL 1

Deletion der gp350/220-Transmembranregion und der Transmembranregion bis zum C-Terminus, um pDTM und pSTOP zu erzeugen

Das gp350/220-Gen aus dem EBV B95-8-Stamm (Miller et al., 1972) ist in einer BamHI- Bibliothek als offener Leserahmen mit der Bezeichnung BLLF1 erhältlich (Baer, Nature 310, 207 (1984)). Um die gewünschten Konstrukte zu schaffen (schematisch in Fig. 2B dargestellt), wurde das gp350/220-Gen in zwei Teile kloniert: 1) BLSH1, ein 2,3 kb HindIII/BfaI 3'-Fragment, und 2) BLSH2, ein 337 bp BanI/HindIII 5'-Fragment (Fig. 2A).
Diese Fragmente wurden in Staging-Vektoren kloniert, sodass die Deletionen der Cterminalen Zytoplasma- und/oder Transmembran-kodierenden Domänen durchgeführt werden konnten. Da die BfaI-Stelle am 5'-Ende der für die Transmembran- (TM-) Domäne von gp350 kodierenden Region auftritt, wurde sie dazu verwendet, die TM- Domänendeletionen und TM-Domänendeletionen mit angrenzenden C-Terminusdeletionen zu konstruieren. Unter Verwendung von BfaI war es möglich, Deletionen zu schaffen, die nur zwei Aminosäuren der TM-Region behielten (Tabelle 2).

1. Konstruktion von pDTM aus pSTG1 und pSTG3

Das Plasmid pDTM besteht aus einer gp350/220-Nucleinsäuresequenz, die keine vollständige TM-Kodierregion besitzt. Dieses Konstrukt wurde unter Verwendung zweier Staging-Vektoren, pSTG1 und pSTG3 erzeugt. Ein 450 bp PCR-Produkt, SYCT, das eine BfaI-Stelle am 3'-Ende der TM-Region einführte, wurde unter Einsatz einer BLLF1-Klon- Zielsequenz (Fig. 2) erzeugt. Die verwendeten PCR-Primer sind wie folgt: BfaI
Die BfaI-Stelle von Primer 1 diente dazu, ein BfaI/Xmal-Fragment von SCYT in pSTG1 zu klonieren. Der Rest von Primer 1 entspricht der Aminosäuresequenz, für die Klon BLLF1 kodiert. Primer 2 entspricht einer Region außerhalb des offenen gp350/220- Leserahmens auf der 3'-Seite des Gens. Das SCYT PCR-Fragment wurde mit BfaI und Xmal geschnitten, um ein 136-bp-Fragment zu produzieren, das in einen pMT11-Vektor (Spaete und Mocarski, 1985) gemeinsam mit einem zweiten Fragment, einem BLSH1 HindIII/BfaI-Fragment, kloniert wurde, um pSTG1 zu erzeugen. Die Sequenzierung über die BfaI-Stelle zeigte an, dass die gesamte TM-Aminosäure-Kodierregion deletiert war, mit Ausnahme der Aminosäuren Met und Leu (siehe Tabelle 2). Ein drittes BLLF1- Fragment, BLSH2, wurde in pMT11 kloniert, um pSTG3 zu erzeugen. Ein 16 bp- Banl/Xbal-Oligonucleotidlinker außerhalb der gp350/220-Genkodiersequenz diente dazu, das BLSH2 BanI/HindIII-Fragment in pSTG3 zu klonieren. Ein 2,4 HindIII/Wmal pSTG1-Fragment wurde in einen pEE14-Vektor (Celltech, England) gemeinsam mit einem 0,3 XbaI/HindIIIpSTG3-Fragment kloniert, um das pDTM-Konstrukt abzuschließen.

2. Konstruktion von pSTOP unter Einsatz der Vektoren pSTG2 und pSTG3

Das Plasmid pSTOP umfasst ein gp350/220-Gen, dem enie TM-Region und die C-terminale Zytoplasma-Region angrenzend an die TM-Region fehlt. Um dieses Konstrukt zu schaffen, wurde ein 16 bp-BfaI/EcoRl-Oligonucleotidlinker mit Stopcodons (unterstrichen) in drei Rahmen nach den kohäsiven BfaI-Enden geschaffen (siehe unten):
Der 5'-Überhang (TA) der oberen Sequenz ist ein kohäsives Ende für eine BfaI-Restriktionsstelle und der 5'-Überhang (TTAA) der unteren Sequenz ein kohäsives EcoRI-Ende. Dieser 16 bp-Linker diente dazu, ein BLSH1 HindIII/BfaI-Fragment in pMT11 zu klonieren, um pSTG2 zu schaffen. ein 2,3 kb pSTG2 HindIII/EcoRI-Fragment und das pSTG3 0,3 kb-XbaI/HindIII-Fragment wurden in pEE14 kloniert, um pSTOP zu schaffen.

3. Vergleich der Wildform-, pDTM- und pSTOP-Sequenzen in der TM-Region

Die Oligonucleotidsequenz und translatierte Aminosäuresequenz der Wildform-, pSTOP- und pDTM-3'-Enden von gp350 DNA und Aminosäuresequenzen werden in nachstehender Tabelle 2 gezeigt. Die Pfeile geben den Beginn und das Ende der TM der Wildform an. Nur zwei Aminosäuren aus der TM sind in pDTM und pSTOP vorhanden, Met&sub8;&sub6;&sub1; und Leu&sub8;&sub6;&sub2; (siehe auch Fig. 1). Man beachte, dass ein Stopcodon unmittelbar Leu&sub8;&sub6;&sub2; in pSTOP folgt. in pDTM ist die frühere Position der deletierten TM-Region als "ΔTM" markiert. In der Tabelle sind die nativen Aminosäuren angegeben. TABELLE 2 3'-Ende der gp350-Sequenz der Wildform

DTM

BEISPIEL 2

Entfernung des gp350/220-Gen-Donor- und Akzeptorspleißstellen zur Schaffung von pMDTM und pMSTOP

Um für homogene Produktion eines gp350-Proteins zu sorgen, wurden die hochkonservierten und konservierten Basen der gp350/220-Gen-Spleißstelle verändert. Vier Basen wurden in der Donorspleißstelle verändert, darunter das hochkonserviertes GT-Paar, das in 100% aller Spleißstellen auftritt. Zwei konservierte Donorstellenpaare, AA, wurden mit GT ersetzt. Die zwei hochkonservierten (invarianten) Donorspleißstellen-Basen wurden von GT Auf CA verändert. An der Akzeptorspleißstelle wurde nur eine der hochkonservierten Akzeptorspleißstellen-Basen verändert, um die Aminosäuresequenz zu bewahren. Eine zweite konservierte Akzeptorspleißstellen-Base wurde verändert (siehe Tabelle 3). Tabelle 3 fasst die Basen zusammen, die in den Donor- und Akzeptorspleißstellen des gp350/220-Gens verändert wurden. TABELLE 3: EBV gp350/200-Gen-Spleißstellenänderungen
Die durch Oligonucleotid-basierte Mutagenese veränderten Basen sind in den Mutantensequenzen mit einem Stern versehen. Die tatsächliche Spleißstelle ist durch einen Pfeil angezeigt, und die kodierten Aminosäuren sind ebenfalls zu sehen. Es ist zu beachten, dass die Aminosäuresequenz infolge der Nucleotidsubstitutionen nicht verändert wird.
Diese Nucleotidsubstitutionen zu Wildorm-gp350/220-Donorspleißstellen- und Akzeptorspleißstellen-DNA-Sequenzen erfolgten mittels Oligonucleotid-mediierter Mutagenese. Ein modifizierter Phagenvektor, M13TAC, diente zur Produktion von Mutationen (siehe Zoller, M. E. und Smith, M., Methods of Enzymol. 100, 568 (1983)). BamHI/Xhol- Fragmente der gp350/220-Nucleotidsequenz wurden in den Polylinker von Plasmid M13TAC unter Verwendung von Asp718 und BamH1-Restriktionsstellen auf dem Polylinker kloniert und mit einem 19 bp-Oligonucleotidlinker kombiniert, der kohäsive Asp718- und Xhol-Enden enthält. Die Plasmide M13DTM und M13STOP aus Beispiel 1 (Fig. 2B) wurden für die Mutagenese herangezogen.
Zwei 42-Mer-Oligonucleotide, PrDonor1 und PrAcceptor1, wurden zur Verwendung in der Mutagenese gebildet. Jedes war konstruiert, um komplementär zu gp350/220-Gensequenzen zu sein, die entweder auf den Donor- oder Akzeptorspleißstellen zentriert sind. Die einzige Region der Oligonucleotide, die nicht zum gp350/220-Gen komplementär war, waren die Basen, die die gewünschten Mutationen darstellen. Die Mutagenese-Oligonucleotide umfassten Folgendes: PrDonor1
Die Sequenz der Mutagenese-Oligonucleotide wird als "Primer" bezeichnet, während die die gp350/220-Gen-Spleißstellen überspannende DN-Sequenz als "EBV" bezeichnet wird. Basen, die sich infolge der Mutagenese änderten, sind mit einem Stern versehen. Die strichlierte Linie zeigt die Spleißposition an.
Die Oligonucleotide PrDonor1 und PrAcceptor1 wurden an einzelstrangige Klone von M13-DTM und M13-STOP hybridisiert. T4 DNA-Polymerase-Holoenzym wurde dazu verwendet, doppelstrangige M13 DNA zu produzieren, und E. coli mit der doppelstrangigen DNA transformiert. Unter Verwendung des Vektors M13TAC konnte jeder Klon, der die gewünschte Mutation enthielt, durch eine Farbveränderung von weiß zu blau in Gegenwart von X-gal und Isothiopropylgalactat identifiziert. Blaue Plaques wurden selektiert und gezüchtet und DNA-Sequenzieren über Spleißverbindungen für die Endidentifikation von Klonmutanten herangezogen, die als M13-MDTM und M13- MSTOP bezeichnet wurden.
Nach dem Identifizieren von die gewünschten Mutationen enthaltenden Klonen wurden BamHI/Xhol-Fragmente aus M13-MDTM und M13-MSTOP geschnitten und in pDTM- oder pSTOP-Rückgrate religiert, um die Konstrukte pMDTM bzw. pMSTOP zu schaffen. Diese Konstrukte wurden in CHO-Zellen transfiziert, um die nicht-spleißenden gp350/220-DNA-Sequenzvarianten zu exprimieren (siehe Beispiel 3).

BEISPIEL 3

Expression von gp350 in CHO-Zellen

1. Transfektion von gp350/220-Genkonstrukten

Ein Verfahren zur Erzeugung großer Mengen an homogenem gp350-Protein der Erfindung aus Säugetierzellen umfasst die Konstruktion von Zellen, die mehrere Kopien der heterologen gp350-DNA-Sequenz enthalten. Die heterologe DNA-Sequenz ist operabel mit einem amplifizierbaren Marker verbunden, in diesem Beispiel das Glutamin- Synthetase-Gen, für das Zellen unter Einsatz von Methioninsulfoximin amplifiziert werden können.
Die in Beispiel 2 erzeugten pMDTM- und pMSTOP-Vektoren wurden wie oben in CHO-Zellen transfiziert (gemäß den Verfahren von Crockett, Bio/Technology 8, 662 (1990); und dem "Celltech Instruction Manual for the glutamine synthetase gene amplification system" (1992)).
CHO-K1-Zellen (ATCC CCR61) wurden in Glutamin-freiem EMEM (Eagles Minimal Essential Medium), ergänzt mit 10% Rinderfötenserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, MEM (Modified Eagles Medium), nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 mM Natriumpyruvat (alle von JRH Biosciences), konserviert. Das Medium war auch mit 60 mg/ml Glutaminsäure, 60 mg/mf Asparagin, 7 mg/ml Adenosin, 7 mg/ml Guanosin, 7 mg/ml Cytidin, 7 mg/ml Uridin und 2,4 mg/ml Thymidin (alle von Sigma) ergänzt. Dieses Medienpräparat wurde während der gesamten Transfektion verwendet, wobei Abweichungen von dieser Rezeptur angemerkt wurden.
Einen Tag vor der Transfektion wurden 10 cm-Schalen mit 3 · 10&sup6; CHO-K1-Zellen beimpft. Am Tag der Transfektion wurden die Zellen mit 10 ml serumfreiem Medium pro Schale gewaschen. Plasmid-DNA (aus den pMDTM-, pMSTOP-Plasmiden) wurde durch CaPO&sub4;-Fällung unter Anwendung konventioneller Techniken aufgebracht. 10 pg Pfasmid-DNA-Niederschlag wurden mit den CHO-K1-Zellen plus 2 ml serumfreiem Mdeium 4,5 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Es wurden drei Replikate jeder der vier Plasmid-DNA-Transfektionen vorgenommen. Die Zellen wurden 1,5 Minuten lang mit 15% Glycerin in HEPES-gepufferter Salzlösung abgeschreckt. Nach Ausspülen mit serumfreiem Medium wurden die Zellen wieder mit serumhältigen Medium ergänzt und 24 Stunden lang inkubiert.
Am folgenden Tag wurde das Medium insofern geändert, als es 10% dialysiertes Rinderfötenserum (JRH Biosciences) enthielt, und durch die Zugabe von 25 uM Methioninsulfoximin (Sigma) amplifiziert. Zellen wurden mit Methioninsulfoximin enthaltendem Medium jeden dritten bis fünften Tag versetzt, bis die amplifizierten Klone groß genug für das Ernten waren (etwa 13 bis 14 Tage später). Klone wurden geerntet, indem Kolonien mit einer sterilen 200 ul-Pipetman-Spitze abgeschabt und in einen Napf einer 96-Napf-Platte in Medium ohne Methioninsulfoximim übertragen wurden. Ein bis zwei Tage später wurde das Medium mit Medium plus 25 uM Methioninsulfoximim ersetzt. Nach vier Tagen wurden die Kulturüberstände geerntet und auf Proteinprodukte in einem ELISA-Test geprüft (weiter unten besprochen).
CHO-Zellen wurden auch mit dem pEE14-Vergleichsvektor alleine (enthält keine EBV- Sequenzen) transfiziert und 24 Klone von CHO-pEE14 geerntet und auf Platten übertragen, um als Vergleiche zu dienen. (Die Vergleichsklone uwrden auf der Basis des Überlebens in Methioninsulfoximim identifiziert.)

2. ELISA-Test

Nach der Transfektion wurden 241 Klone von CHO-pMDTM und 158 Klone von CHOpMSTOP geerntet und gezüchtet. Überstände dieser Klone uwrden auf gp350-Protein- Produktion getestet. 96-Napf-Platten wurden mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-Antigp350/220-Antikörper (Antikörper MDP1; zur Verfügung gestellt von Andrew Morgan), verdünnt 1 : 2000 in 50 mM Natriumboratpuffer, pH 9, beschichtet. Die Platten wurden 3 bis 4 Stunden lang bei 37ºC inkubiert und dreimal mit PBS + 0,05% Tween 20 unter Verwendung eines Nung lmmunoWachers gewaschen. Nach dem Trockentupfen wurden die Platten durch Inkubieren mit 2% BSA in PBS + 0,01% Thimerosal 0,5 Stunden lang bei 37ºC blockiert und erneut gewaschen. Überstände aus den transfizierten und Vergleichszellen wurden den Näpfen zugesetzt und 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden dann mit dem primären Detektionsantikörper, einem monoklonalen Mäuse-Antikörper gegen gp350/200 (Antikörper #C65221 M; Biodesign International) bei 1 mg/ml, verdünnt in PBS-Waschpuffer, 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit dem zweiten Antikörper, Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Ziegen-F(ab)2-Fragmenten gegen Mäuse- Immunglobuline (Human-Ig-absorbiert, Biosource International), 0,7 ug/ml in PBS+ 0,05% BSA und 0,01% Thimerosal 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mittels ABTS (Pierce Chemicals), gelöst in Stable Peroxide Substrate Buffer (Pierce Chemicals) bei Raumtemperatur 0,5 Stunden lang, entwickelt. Die Reaktion wurde mit 1% SDS abgebrochen, und die Platten wurden bei 405 und 650 nm Wellenlängen mittels eines Vmax ELISA-Plattenlesegeräts von Molecular Devices gelesen. 24 pMDTM- und 18 pMSTOP-Klorie testeten auf sekretiertes gp350 positiv. Die Klone mit dem stärksten ELISA-Signal wurden zwecks Scaling-up und weitere Tests in einem Western Blot- und Radioimmunfällungs-Test auf 24-Napf-Platten übertragen.

3. Western Blot- und Radioimmunfällungs-Test

Beim anfänglichen Screenen wurden Gewebekulturüberstände aus den pMDTM-Transfektionen auf Aktivität in einem Western Blot untersucht. CHO-Zellen-Überstände wurden auf 5% SDS-PAGE-Gelen gereinigt, über Nacht auf Nitrocellulose übertragen und mit Antigp350-Antikörpern sondiert. 7 pMDTM-Klone stellten sich in der Western Blot-Analyse als positiv für gp350 heraus.
Die im Western Blot positiven pMDTM-Klone wurden durch Radioimmunfällung auf die Gegenwart von gp220 weiter untersucht. Ausgewählte transformierte pMDTM-Zellen, pEE14-Vergleichszellen und GH3Δ19-Vergleichszellen (unten beschrieben) wurden über Nacht in 6-Napf-Platten gezüchtet, sodass sie am Tag des Experiments zu etwa ³/&sub4; konfluent waren. Jeder Napf enthielt etwa 5 · 10&sup6; Zellen. Für das Markieren wurde das Medium aus jedem Napf entfernt und mit 0,7 ml Methionin-freiem MEM (10% Kalbsfötenserum) + 100 uCi³&sup5;S-Methionin ersetzt. Die Zellen wurden 5,5 Stunden lang bei 37ºC inkubiert und dann 5 Minuten lang bei 4000 U/min mikrozentrifugiert. Homogenes gp350-Protein im Überstand wurde durch Zugabe von 10 pl Sepharose- Protein A (Sigma) in einer 50% Aufschlämmung und 20 ul monoklonalem Antigp350/220 (Antikörper #C65221M, 100 mg/ml; Biodesign International) unter Schütteln über Nacht bei 4ºC immungefällt. Das Gemisch wurde bei 2000 U/min 2 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge pelletiert und viermal mit mehreren Volumina phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Nach der letzten Waschung wurde die gesamte Flüssigkeit aus dem Pellet entfernt und mit 50 Pl Proteingel-Probenpuffer ersetzt. Die den gefällten Immunkomplex enthaltenden Proben wurden 5 Minuten lang gekocht und auf 5% SDS-PAGE laufen gelassen. Immunniederschläge wurden mit Gelproben von Gewebekulturüberständen, 1 : 1 mit Proteinprobepuffer vermischt, verglichen. Das Gel wurde getrocknet und mit Hyperfilm β-Max (Amersham) autoradiographiert.
Fig. 3 zeigt die Autoradiographie-Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse der Radioimmunfällung. Die als positiver Vergleich verwendete Zelllinie war GH3Δ19 (zur Verfügung gestellt von Elliot Keiff; Whang et al., 1987). GH3Δ19-Zellen sekretieren eine trunkierte Form des gp350/220-Proteins, dem die Transmembran- und die C-terminale Zytoplasma-Domänen fehlen. Zur Verwendung als negativer Vergleich wurden CHO- Zellen mit dem pEE14-Vektor alleine transfiziert und durch Methioninsulfoximin parallel zur pMDTM-Transfektion selektiert. In Fig. 3 sind Überstände ("S") in ungerade nummerierten Spuren und abwechselnd dazu Immunniederschläge ("Ip") in gerade nummerierten Spuren dargestellt. In Vergleichsspur 2 führt die Fällung aus den GH3- Δ19-Vergleichszellen zu zwei starken Proteinbanden bei etwa 220 und 350 kD, was die Produktion der trunkierten Spleißvarianten-gp350- und gp220-Proteine in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 zeigt. Wie erwartet, sind diese immungefällten Banden in Bezug auf den radiomarkierten Gewebekulturüberstand (nicht-immungefällte Probe) in Spur 1 konzentriert. Wie erwartet, sieht man keine Banden im negativen Vergleich (Spur 4), da der pEE14-Vektor keine der gp350/220-Konsrukte enthält.
SDS-PAGE-Analyse der Immunfällung aus Überständen von pMDTM-Klonen in de Spuren 6, 8 und 10 führt zu einer einzelnen starken Bande bei etwa 350 kD, was der höhermolekularen Spezies in der GH3Δ19-Vergleichsspur 2 entspricht. Im Gegensatz zur HG3Δ19-Vergleichsspur jedoch fehlt eine zusätzliche starke Bande bei etwa 220 kD in den Spuren 6, 8 und 10, obwohl in Spur 8 eine sehr schwache Bande zu sehen ist, die bei etwas geringerem Molekulargewicht migriert. Dies könnte ein Abbauprodukt, ein co-gefälltes Zellprodukt oder eine kleine Menge an gp220-Protein sein, das sich aus der Fehltranslation oder einem Mutationsereignis ergibt, das die deletierten Donor- und Akzeptorspleißstellen zum nativen Nucleotid oder Aminosäuresequenzen zurückführt. Starke Einzelbanden von etwa 350 kD wurden in fünf anderen getesteten MTDM- Replikaten festgestellt (Daten nicht dargestellt).
Es ist unwahrscheinlich, dass das komplette Fehlen der Bande bei 220 kD in den Spuren 6 und 10 auf ineffektive Fällung aus MDTM-Überständen zurückzuführen ist, da in der 355-markierten GH3Δ19-Vergleichsspur (2) eine Bande bei 220 kD leicht visualisiert ist. Zusätzliche Tests unter Verwendung der pDTM-Konstrukte von Beispiel 1, die Spleißstellen der Wildform enthalten, führen zu zwei starken Banden bei 350 und 220 kD. Daher belegen diese Ergebnisse, dass die Deletion der Spleißstellen die Produktion von gp350-Protein in Abwesenheit der Produktion von gp220-Protein bewirkt.
Dieses homogene gp350-Protein, exprimiert in CHO-Zelllinien oder in anderen Säugetier- oder Nicht-Säugetier-Zelllinien, kann maßstäblich vergrößert und homogenes gp350-Protein isoliert und aus konditioniertem Medium aus der Zelllinie gereinigt werden; hier kommen auf dem Gebiet bekannte Verfahren zur Anwendung, z. B. Techniken wie etwa Lectin-Affinitätschromatographie, RP-HPLC, FPLC, Gelfiltration u. dgl. Siehe David, J. Immunol. Methods 108, 231 (1988); und Madej, Vaccine 10, 777 (1992).

4. Northern Blot-Analyse von pMDTM-Protein

In diesem Experiment wird durch Nothern Blot aufgezeigt, dass MDTM-1-Zellen gp350- RNA und nicht gp220-RNA ergeben, was auf einer anderen Ebene bestätigt, dass Spleißstellen-Mutationen die gp220-Produktion verhindern.
Zu gp350 komplementäre DNA-Sonden wurden aus pDTM gebildet (siehe Beispiel 1). Ein gp350/220-Sondentemplat, XP464, wurde als 464 bp-Xhol/PstI pDTM-Fragment isoliert. XP464 erkennt sowohl gp350 als auch gp220. Um die gp350-spezifische Sonde AN537 zu erzeugen, wurde pDTM mit Ncol und Ndel geschnitten, zwei überlappende 580 bp-Fragmente wurden isoliert, und dieses Gemisch wurde mit XmnI geschnitten, um ein kontaminierendes Fragment zu eliminieren, und mit Alul geschnitten, um ein 537 bp-Alul/Ndel-Fragment zu liefern, das im Inneren der gp350/220-Spleißstellen liegt. AN537 ist für die aus gp220 gespleißte Region spezifisch und somit für gp350-Message spezifisch. DNA-Sonden wurden durch 32P-dCTP-Nicktranslation (Amersham) unter Verwendung der DNA-Fragmente XP464 und AN537 markiert.
Vollzellen-RNA wurde im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Chomczyunski und Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156-59 (1987), erzeugt. Medien aus zwei T-250-Kolben mit jeweils CHO-pEE14 (negative Vergleichszelllinie, siehe Beispiel 1). CHO-MDTM-1 und CHO-DTM-7-Zellen, 90% Konfluenz, wurden abgeblasen und die Zellen lysiert und in Denaturierungspuffer (10 ml 4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, pH 7, 0,5% Sarkosyl, 100 mM 2-Mercaptotehanol) abgeschabt. Jeweils 10 ml Lysat wurden mit 1 ml 2 M Natriumacetat, pH 4, 10 ml gesättigtem Phenol, pH 4,5, und 2 ml Chloroform/Isoamylalkohol ergänzt. Das Lysat wurde auf Eis 15 Minuten lang inkubiert, 10.000 · g 20 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert und die obere wässrige Phase entfernt. RNA wurde aus der wässrigen Phase durch Zugabe eines Volumens Isopropanaol bei 20ºC 1 Stunde lang gefällt, bei 4ºC pelletiert, in Denaturierungspuffer resuspendiert und erneut gefällt. Das RNA-Pellet wurde 1X in 70% Ethanol gewaschen, in einem Speed-Vac getrocknet und in mit DEPC behandeltem Wasser resuspendiert.
DTM-7- und MDTM-1-Vollzellen-RNA wurde 15 Minuten lang bei 65ºC in 15% Formamid und 6% Formaldehyd denaturiert, auf 1% Agarose/6,6% Formaldehydgelen laufen gelassen, durch Kapillarwirkung auf Nitrocellulose übertragen und mit markiertem XP464 und AN537 sondiert. Die DNA-Sonden wurden durch 5-minütiges Kochen denaturiert, in 5 · SSPE bei 65ºC über Nacht hybridisiert und die Nitrocellulose unter Bedingungen hoher Strenge gewaschen. Autoradiographie erfolgte mit einem Bio-Rad Phosphorimager.
Northern Blots von Vollzellen-RNA aus CHO-MDTM-Zellen zeigen den Wirkungsgrad von Spleißmutationen beim Verhindern von gp220-spezifischer RNA-Produktion. Die gp350-spezifische Sonde, AN537, band sich nur an eine Spezies von RNA in MDTM-1 und DTM-7-Zellen (Fig. 4, Spuren 1 und 2), was man von einer gp350-spezifischen Sonde erwarten konnte. Die XP464-Sonde, die sowohl für gp350- als auch für gp220-RNA spezifisch ist, erkannte zwei Spezies in DTM-7 und eine einzige höhermolekulare Bande in MDTM-1 (Fig. 4, Spuren 4 und 3), wie dies zu erwarten ist, wenn Spleißmutationen gp220-Message-Produktion in MDTM-1 verhindern. Obwohl die MDTM-1-Spuren für gp350-spezifische RNA überladen sind, ist keine klar erkennbare gp220-RNA zu sehen. Der Grund für den Unterschied in der scheinbaren Mobilität der gp350-Message in MDTM-1 gegenüber den DTM-7-Spuren ist unbekannt. Die MDTM-1-Spezies ist im Vergleich zu DTM-7 überladen, was die Migration im Gel beeinträchtigen kann. Die gp350-Message läuft nahe einer großen ribosomalen RNA-Bande auf dem Gel, was das scheinbare Molekulargewicht verzerren kann. Jedenfalls legt die Gegenwart einer einzigen zu gp350-DNA-Sequenzen komplementären Spezies nahe, dass dieses Signal gp350-mRNA darstellt. Somit können Mutationen in den Donor- und Akzeptorspleißstellen gp220-Message-Produktion wirkungsvoll verhindern, wie dies Northern Blots belegen. Dieses Ergebnis wird durch Radioimmunfällung unter Verwendung monoklonaler für gp350/220 spezifischer Antikörper sowie durch Western Blots von MDTM-1- und DTM-7-Überständen bestätigt.

BEISPIEL 4

Testen der homogenen gp350-Proteine auf immunogene Aktivität

Die gereinigten homogenen gp350-Proteine werden in geeignete Vehikel zur Verabreichung inkorporiert und wie folgt an Mäuse verabreicht.
Ein Adjuvans-Vehikel-Zweifachkonzentrat wird durch Mischen von Pluronic L121 und Squalan in 0,4% (Vol./Vol.) Tween 80 in phosphatgepufferter Salzlösung mit (Thr¹) MDP gemäß dem Verfahren von David, J. Immunol. Methods 108, 231 (1988); und Allison, J. Immunol. Methods 95, 157 (1986), hergestellt.
Die Zusammensetzung zur Verabreichung wird durch Zugabe gleicher Volumina Protein und Adjuvans-Vehikel am Tag der Verabreichung hergestellt. Der Proteingehalt sollte im Bereich von 5 bis 50 ug pro Dosis liegen.
BALB/c-Mäuse werden mit drei intramuskulären 0,1 ml-Injektionen bei 0,21 und 42 Tagen immunisiert. Eine Vorimmunisierungs- und nachfolgende Blutproben werden 10 Tage nach jeder Injektion aus dem retroorbitalen Sinus gezogen.
Serum-Antikörperwerte werden durch ELISA gemäß der Vorgangsweise von Beispiel 3 bestimmt. EBV-neutralisierende Antikörper in den Seren werden durch ihre Fähigkeit quantifiziert, Transformation von Nabelschnurblut-Lymphozyten durch EBV in vitro zu hemmen; dies erfolgt gemäß den Verfahren von Moss, J. Gen. Virol. 17, 233 (1972); und De Schryver, Int. J. Cancer 13, 353 (1974).
Alternativ dazu werden weiße New Zealand-Kaninchen durch intramuskuläre Verabreichung von fünf Dosen Protein (im obigen Adjuvans emulgiert) nach 0, 21, 42, 63 und 84 Tagen geimpft. Die Dosis sollte innerhalb des Bereichs von etwa 5 bis etwa 50 pg pro Impfung liegen. Serum wird zwei Wochen nach der letzten Dosis erhalten und auf Antikörpertiter gegen das Antigen, kreuzreaktiven Antikörper gegen virales gp350/220 aus B95-8-Zellen und auf in vitro EBV-neutralisierende Aktivität gemäß den Verfahren von Emini, Virology 166, 387 (1988), untersucht.
Da die Fähigkeit des EBV gp350/220-Proteins, protektive Immunität in einem Tiermodell von EBV-Infektion zu induzieren, bereits ermittelt wurde (siehe Epstein, Clin. Exp. Immunol. 63, 485 (1986)), kann man ähnliche positive Ergebnisse aufgrund der Verabreichung einer homogenen gp350-Proteinzusammensetzung erwarten.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER: Spaete, Richard und Jackman, Wintrhop, T.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Nichtspleißende Varianten von gp350/220
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 19
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Cooley Godward Castro Huddleson & Tatum
(B) STRASSE: 5 Palo Alto Square
(C) STADT: Palo Alto
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94306
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Floppydisk
(B) COMPUTER: 1BM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version 1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 08/229.291
(B) EINREICH DATUM: 18. April 1994
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALTNERTRETER:
(A) NAME: Luann Cserr
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 31.822
(C) KENNZAHLZEICHEN: AVIR-003/00US
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 415/843-5163
(B) TELEFAX: 415/857-0663
(C) TELEX: 380816 CooleyPA
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 1:
GGATCCTAGA CTGCGCCTTT AGGCGTA 27
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 2:
GACTGCGCCT TTAGGCGTA 19
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 3:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 4:
GGATCCTCTG TTCCTTCTGC TCCAGTG 27
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Basen paare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 5:
TCTGTTCCTT CTGCTCCAGT G 21
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 16 Basen paare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 6:
TATAGACTAG TCTAGG 16
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 7:
ATCTGATCAG ATCCTTAA 18
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 8:
AACCTCTCCA TGCTAGTACT GGTCATGGCG GACTGCGCC 39·
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 9:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 10:
AACCTCTCCA TGCTATAGAC TAGTTCTAGG 30
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 11:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 12:
AACCTCTCCA TGCTAGACTG CGCC 24
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 13:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 14:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 14:
GGTCATGTCG GGGGCCTTTG ACTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG 42
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 15:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 15:
GGTCATGTCG GGGGCCTTAC TrrCTGTGCC GTTGTCCCAT GG 42
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 16
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 16:
CTGTGTTATA TTTTCACCTC CAGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG 42
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 17:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Oligomer-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 17:
CTGTGTTATA TTTTCACCAC CTGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG 42
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 18:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3833 Basen paare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 1014..3734 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 18: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 19
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 907 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 19:

Claims

1. Isolierte DNA-Sequenz, die entweder für

EBV gp350-Protein oder

eine verkürzte Version von EBV gp350 kodiert, worin die verkürzte Version eine Löschung der gesamten oder eines Teils der Membran-überspannenden Region, eine Löschung der gesamten oder eines Teils der Membran-überspannenden Region und des gesamten oder eines Teils des verbleibenden C-Terminus und/oder eine Löschung der gesamten oder eines Teils der Signalsequenz aufweist,

wobei die DNA-Sequenz eine Mutation an einer oder mehreren Spleißstellen aufweist, welche die Bildung eines gp220-mRNA-Transkripts verhindert.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin die DNA für eine verkürzte Version von EBV gp350 kodiert, die eine Löschung von zumindest 8 Aminosäuren in der Membranüberspannenden Region aufweist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 2, die für eine verkürzte Version von EBV gp350 kodiert, die eine Löschung von Met&sub8;&sub6;&sub1; bis Ala&sub8;&sub8;&sub1; aufweist, wie in Fig. 1 (Seq.-ID Nr. 18) gezeigt.

4. DNA-Sequenz nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Mutation an einer oder mehreren Spleißstellen eine Mutation in der Donor-Spleißstelle umfasst.

5. DNA-Sequenz nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Mutation an einer oder mehreren Spleißstellen eine Mutation in der Akzeptor-Spleißstelle umfasst.

6. DNA-Sequenz nach Anspruch 5, worin zumindest ein natives Nukleotid an Codon 501 von Seq.-ID Nr. 18, das für Serin kodiert, durch ein nicht-natives Nukleotid ersetzt ist und worin zumindest ein natives Nukleotid an Codon 698 von Seq.-ID Nr. 18, das für Glycin kodiert, durch ein nicht-natives Nukleotid ersetzt ist.

7. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin die DNA für die gleiche Aminosäuresequenz kodiert wie eine Sequenz, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

(a) Codons 19-862 von Seq.-ID Nr. 18;

(b) Codons 1-862 von Seq.-ID Nr. 18;

(c) Codons 19-862 und 882-907 von Seq.-ID Nr. 18; und

(d) Codons 1-862 und 882-907 von Seq.-ID Nr. 18.

8. DNA-Sequenz nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Mutation an einer oder mehreren Spleißstellen keine Veränderung in der Aminosäuresequenz herbeiführt, für welche die DNA-Sequenz kodiert.

9. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Mutation an einer oder mehreren Spleißstellen eine Veränderung in der Aminosäuresequenz herbeiführt, für welche die DNA-Sequenz kodiert.

10. DNA-Sequenz nach Anspruch 9, worin die Änderung der Aminosäuresequenz eine konservative Änderung ist.

11. Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der vorangegangenen Ansprüche.

12. Wirtszelle, transformiert mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in operativer Assoziation mit einer Expressionskontrollsequenz, welche die Replikation und Expression der DNA-Sequenz steuern kann.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, die eine eukaryotische Zelle ist.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, die eine Insekten- oder Säugetierzeile ist.

15. Wirtszelle nach Anspruch 14, die eine Säugetierzelle ist.

16. Verfahren, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in einem geeigneten Kulturmedium und das Isolieren des gp350-Proteins aus der Zelle oder dem Kulturmedium.

17. Verfahren nach Anspruch 16, weiters umfassend den Schritt des Vermischens des gp350-Proteins mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend homogenes, glykosyliertes EBV gp350-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das eine Löschung des gesamten oder eines Teils des Membran-überspannenden Bereichs aufweist, im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, worin die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von gp220 ist.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin das EBV gp350-Protein auch eine Löschung des gesamten oder eines Teils des verbleibenden C-Terminus aufweist.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin das EBV gp350-Protein eine Löschung der Aminosäuren 863 bis 907, wie in Fig. 1 (Seq.-ID Nr. 18) gezeigt, aufweist.