DE69629674T2 - Dns-sequenzen des humanen cytomegaloviruses - Google Patents

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Description

  • Der Human-Cytomegalovirus (HCMV) ist ein in Menschenpopulationen allgegenwärtiges Agens. Infektionen sind im Allgemeinen asymptomatisch, jedoch können ernsthafte medizinische Komplikationen in immungeschwächten Personen und in kongenital infizierten Neugeborenen auftreten. In immungeschwächten Personen kann die HCMV-Infektion zu interstitiller Pneumonie, Retinitis, die zur Erbildung fortschreitet, und zu disseminierter Infektion führen. Infektionen in Neugeborenen können schwere Schädigungen hervorrufen, wobei mehrere Organe, einschließlich das Zentralnervensystem, involviert sind, und können auch zu Gehörschädigung führen. Die Mechanismen der Pathogenese sind nicht bekannt, obgleich angenommen wird, dass Wirtfaktoren, wie z. B. Zell- und/oder humorale Immunantworten, beteiligt sein könnten. Siehe Alford und Britt, „The Human Herpesviruses", B. Roizman, R. J. Whitley und C. Lopez (Hrsg.), Raven Press, New York, S. 227–55 (1993). Es ist auch vermutet worden, dass genetische Variabilität (entweder strukturelle oder antigene Variabilität oder beide) verschiedener HCMV-Stämme für die Varianz der beobachteten klinischen Manifestationen verantwortlich sein könnten. Pritchett, J. Virol. 36, 152–61 (1980); Lehner, J. Clin. Microbiol. 29, 2494–2502 (1991); Fries, J. Infect. Dis. 169, 769–74 (1994).
  • Beträchtliche Aufmerksamkeit hat in letzter Zeit die Analyse der Stammvariation unter HCMV-Isolaten erlangt. Etwa zwanzig verschiedene HCMV-Stämme sind isoliert und mittels Restriktionsanalyse PCR-amplifizierter DNA-Fragmente differenziert worden. Chou, J. Infect. Dis. 162, 738–42 (1990).
  • Einer der Stämme, der Towne-Stamm, ist zu einem abgeschwächten Lebendimpfstoff entwickelt und mit einigem Erfolg bei Nierentransplantatpatienten verabreicht worden. Siehe Quinnan, Annals of Int. Med. 101, 478–83 (1984); Plotkin, Lancet 1, 528–30 (1984). Town-Stamm-Impfstoffe, die durch „low-passaged" Toledo-Stamm-Virus der Wildform direkt exponiert wurden, erwiesen sich jedoch in einer Studie als resistent gegen Expositionsdosen von nur 10 oder weniger Plaque-bildenden Einheiten (pfu). Plotkin, J. Infect. Dis. 159, 860–65 (1989). Daher scheint der Towne-Stamm übermäßig abgeschwächt, d. h. aufgrund von Reihenpassage in Zellkultur genetisch so umfassend modifiziert zu sein, dass er vermutlich wegen des Verlusts genetischer Information während der Zellpassage signifikante Immunogenität verloren hat. Vorteilhafterweise ist jedoch eine Reaktivierung des Towne-Stammes nie nachgewiesen worden.
  • DNA-Sequenzheterogenität zwischen dem Towne-Stamm und einem weiteren HCMV-Stamm, AD169, ist nachgewiesen worden. Pritchett, J. Virol. 36, 152–61 (1980). (Eine Restriktionskarte des AD169-HCMV-Genoms ist in US-Patent Nr. 4.762.780 offenbart.) Schwankungen im DNA-Gehalt unter anderen isolierten HCMV-Stämmen sind ebenfalls nachgewiesen worden. Huang, Yale J. Biol. and Med. 49, 29–43 (1976). Spaltmuster von Restriktionsenzymverdauungen der HCMV-DNA verschiedener Stämme sind analysiert worden. Kilpatrick, J. Virol. 18, 1095– 1105 (1976); LaFemina, „Structural Organization of the DNA Molecules from Human Cytomegalovirus", in: Animal Virus Genetics, B. N. Field und R. Jaenish (Hrsg.), Academic Press, NY (1980); Chandler, J. Gen. Virol. 67, 2179–92 (1986); Zaia, J. Clin. Microbiol. 28, 2602–07 (1990). Obwohl der grobe strukturelle Aufbau des HCMV-Genoms ermittelt und der Polymorphismus der Restriktionsstellen von Stamm zu Stamm für viele der Stämme kartiert worden ist, sind Unterschiede der DNA-Sequenzen des HCMV-Genoms von Stamm zu Stamm nicht ermittelt worden. Es sind lediglich Teilsequenzen abgeleitet und verglichen worden. Beispielsweise sind die DNA- und Aminosäuresequenzen des Hüllglykoproteins B [gpUL55(gB)] des Towne- sowie AD169-Stamms abgeleitet (siehe Spaete, Virology 167, 207–25 (1988)) und mit verschiedenen klinischen Isolaten verglichen worden (siehe Chou, J. Infect. Dis. 163, 1229–34 (1991)), um konservierte Regionen und Regionen der Variabilität zu identifizieren. Außerdem ist die DNA-Sequenzanalyse bestimmter Regionen des gp58/116-Gens [gpUL55(gB)], des IMP-Gens und des IE-1/2-Enhancers/Promotors zustande gebracht worden. Lehner, J. Clin. Microbiol. 29, 2494–2502 (1991).
  • Während die vollständige DNA-Sequenz des AD169-Stamms von HCMV abgeleitet worden ist (EMBL Zugangsnummer X17403), ist die vollständige DNA-Sequenz des Towne-Stamme unseres Wissens nicht abgeleitet worden, Es ist jedoch vermutet worden, dass dem AD169 und einem weiteren Laborstamm, Davis, zwei bis vier Kilobasenpaare (kb) der DNA-Sequenz des Towne-Stamms an den äußersten Innenabschnitten der beiden L-Wiederholungen fehlen. LeFemina, siehe oben, 52–53.
  • Die Auswirkung von HCMV-Infektionen auf die Gesundheit konnte durch gegenwärtige Behandlungsstrategien und verfügbare Antivirus-Chemotherapien nicht gut beherrscht werden. Präventive Impfstrategien sind erweisen sich wahrscheinlich als wirksam, und zwar aufgrund der Beobachtung, dass seropositive Nierentransplantatempfänger vor schwerer HCMV-Erkrankung geschützt sind und mütterliche Immunität den Fötus vor Erkrankung nach Intrauterininfektion schützt. Marshall und Plotkin, „Cytomegalovirus Vaccines", in: The Human Herpesviruses, B. Roizman, R. J. Whitley und C. Lopez (Hrsg.), Raven Press, New York, S. 381–95 (1993). Jedoch ist das Fehlen eines Tiermodellsystems, dass dazu verwendet werden kann, die Sicherheit und Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten zu testen, ein weiteres Hindernis für die Entwicklung eines Impfstoffs gegen HCMV. Folglich bleibt auf dem Gebiet der Erfindung ein Bedarf für wirksame Impfstoffe zur prophylaktischen Behandlung von HCMV in Menschen bestehen.
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung neue HCMV-DNA-Sequenzen bereit, die auf dem Gebiet der Erfindung vordem nicht anerkannt oder bekannt waren. Diese neuen HCMV-Sequenzen wurden aus den Toledo- und Towne-Stämmen des HCMV isoliert und umfassen DNA, die der Referenzstamm AD169 des HCMV nicht aufweist. Demgemäß stellt die Erfindung in diesem Aspekt neue isolierte Toledo-Stamm-HCMV-DNA-Sequenzen bereit, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 3 dargelegt sind. „Isoliert" bedeutet, wie hierin verwendet, dass die Sequenzen im Wesentlichen frei von anderen Virus-DNA-Sequenzen sind, mit denen die gegenständliche DNA typischerweise in ihrem nativen, d. h. endogenen, Zustand auftritt. Diese neuen Toledo-HCMV-DNA-Sequenzen sind dadurch charakterisiert, dass sie dieselbe oder im Wesentlichen dieselbe Nucleotidsequenz wie in 1 (Seq.-ID Nr. 6) oder aktiven Fragmenten davon umfassen. Die DNA-Sequenzen können nicht-kodierende 5'- und 3'-Sequenzen einschließen, welche die kodierende Sequenz flankieren. Die DNA-Se quenzen können in umgekehrter Orientierung bezüglich der in 1 gezeigten Orientierung vorliegen. Segmente oder Fragmente der in 1 gezeigten DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 6) können neu geordnet oder intern umgekehrt werden. Die DNA-Sequenzen der Erfindung umfassen ferner Nucleotidsequenzen, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz, die der Sequenz in 1 entspricht, zu hybridisieren, oder die üblicherweise in der Lage sind, unter diesen Bedingungen an eine Sequenz, die der Sequenz in 1 entspricht, zu hybridisieren, wenn die Degeneration des genetischen Codes nicht wäre. 1 (Seq.-ID Nr. 6) illustriert die DNA-Sequenz des neuen Toledo-HCMV-Stamms. Einundzwanzig offene Leseraster (ORFs) wurden in dieser Sequenz identifiziert. Die mutmaßlichen Aminosäuresequenzen dieser neuen Toldeo-Stamm-HCMV-ORFs sind in den Sequenzidentifikationsnummern 7 bis 27, Seiten 58 bis 78, s. u., aufgezählt. In 1 sind Ende und Anfang der 21 ORFs durch Pfeile und die Bezeichnungen „UL133", „UL134" usw. gekennzeichnet (siehe unten). In neu angeordneten Sequenzen der Erfindung können neue offene Leseraster erzeugt oder zerstört werden.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung neue HCMV-DNA-Sequenzen bereit, die auf dem Gebiet der Erfindung vordem nicht anerkannt oder bekannt waren. Diese zusätzlichen Sequenzen wurden aus dem Towne-Stamm des HCMV isoliert und umfassen DNA, die im AD169-Stamm oder Towne-Stamm des HCMV nicht vorkommen. Demgemäß stellt die Erfindung in diesem Aspekt neue Towne-Stamm-HCMV-Sequenzen bereit. Diese neuen Towne-HCMV-DNA-Sequenzen sind dadurch charakterisiert, dass sie dieselbe oder im Wesentlichen dieselbe Nucleotidsequenz wie in 2 (Seq.-ID Nr. 1) oder aktive Fragmente davon umfassen. Die DNA-Sequenz kann nicht-kodierende 3'- und 5'-Sequenzen umfassen, welche die kodierende Sequenz flankieren. Die DNA-Sequenzen der Erfindung umfassen ferner Nucleotidsequenzen, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz, die der Sequenz in 2 entspricht, zu hybridisieren, oder die üblicherweise in der Lage sind, unter diesen Bedingungen an eine Sequenz, die der Sequenz in 2 entspricht, zu hybridisieren, wenn die Degeneration des genetischen Codes nicht wäre. 2 (Seq.-ID Nr. 1) illustriert die DNA-Sequenz des neuen, Towne-HCMV-Stamms.
  • Vier ORFs wurden in dieser Sequenz identifiziert. Die mutmaßlichen Aminosäuresequenzen dieser neuen Towne-Stamm-HCMV-ORFs sind in den Sequenzidentifikationsnummern 2 bis 5, Seiten 42 bis 45, s. u., aufgezählt. In 2 sind Anfang und Ende der 4 ORFs durch Pfeile und die Bezeichnungen UL147, UL152, UL153 und UL154 gekennzeichnet.
  • Es versteht sich, dass in den DNA-Sequenzen dieser Erfindung einige oder alle der Signal- und/oder flankierenden Sequenzen ausgenommen sein können. Außerdem können die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung ferner DNA umfassen, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen an eine isolierte DNA-Sequenz in 1 oder 2 (Seq.-ID Nr. 6 und 1) zu hybridisieren, oder die üblicherweise in der Lage sind, unter diesen Bedingungen an eine isolierte DNA-Sequenz in 1 oder 2 zu hybridisieren, wenn die Degeneration des genetischen Codes nicht wäre. Unter „stringenten Bedingungen" werden, wie hierin verwendet, Bedingungen hoher Stringenz verstanden, beispielsweise 6 × SSC, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,1% Natriumdodecylsulfat, 100 μg/ml Lachs-Spermien-DNA und 15% Formamid bei 68°C (siehe Materialien und Verfahren, Teil C, s. u.).
  • RNA-Moleküle, die aus einer oben beschriebenen DNA der Erfindung transkribiert werden, sind ein weiterer Aspekt der Erfindung.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung neue HCMV-Proteine bereit, wie sie in Ansprüchen 9 und 10 dargelegt sind, die im Wesentlichen frei von anderen HCMV-Proteinen sind, mit denen sie typischerweise in ihrem nativen Zustand auftreten. Diese neuen HCMV-Proteine umfassen die offenen Leseraster (ORFs) UL133 (Seq.-ID Nr. 7), UL134 (Seq.-ID Nr. 8), UL135 (Seq.-ID Nr. 9), UL136 (Seq.-ID Nr. 10), UL137 (Seq.-ID Nr. 11), UL138 (Seq.-ID Nr. 12), UL139 (Seq.-ID Nr. 13), UL140 (Seq.-ID Nr. 14), UL141 (Seq.-ID Nr. 15), UL142 (Seq.-ID Nr. 16), UL143 (Seq.-ID Nr. 17), UL144 (Seq.-ID Nr. 18), UL145 (Seq.-ID Nr. 19), UL146 (Seq.-ID Nr. 20), UL147 (Seq.-ID Nr. 21), UL148 (Seq.-ID Nr. 22), UL149 (Seq.-ID Nr. 24), UL150 (Seq.-ID Nr. 25) und/oder UL151 (Seq.-ID Nr. 26), die in der neuen Toledo-Stamm-DNA-Se quenz identifiziert wurden, und UL147 (Seq.-ID Nr. 2), UL152 (Seq.-ID Nr. 3), UL153 (Seq.-ID Nr. 4) und/oder UL154 (Seq.-ID Nr. 5), die in der neuen Towne-Stamm-DNA-Sequenz identifiziert wurden. Zwei weitere HCMV-ORFs, UL130 und UL132 (Seq.-ID Nr. 23 und 27), wurden in der neuen Toledo-Stamm-DNA-Sequenz identifiziert. Diese beiden Sequenzen sind auch in AD169 vorhanden (siehe 5). Die Proteine können durch rekombinante gentechnische Verfahren hergestellt werden. Sie können außerdem aus mit HCMV infizierten zellulären Quellen gereinigt werden. Sie können auch durch chemische Techniken synthetisiert werden. Ein Fachmann kann üblicherweise eine Kombination der oben bezeichneten Verfahren anwenden, um das Protein zu synthetisieren. Außerdem werden Analoga der HCMV-Proteine der Erfindung bereitgestellt und umfassen trunkierte Polypeptide, z. B. Mutanten, in denen sich Variationen der Aminosäuresequenz befinden, welche die biologische Aktivität wie unten definiert beibehalten, und die eine Homologie von zumindest 90% und insbesondere bevorzugt 95% mit den entsprechenden Regionen der HCMV-Towne- oder Toledo-Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 und 26) aufweisen. Beispiele umfassen Polypeptide mit geringfügigen Aminosäurevariationen der nativen Aminosäuresequenzen der HCMV-Toledo- oder Towne-Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 und 26), insbesondere konservative Aminosäureersetzungen. Konservative Ersetzungen sind jene, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die bezüglich ihrer Seitenketten verwandt sind. Genetisch kodierte Aminosäuren werden in Allgemeinen in vier Klassen unterteilt: (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) apolar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen-polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Beispielsweise ist es angemessen, zu erwarten, dass eine einzelne Ersetzung eines Leucins mit einem Isoleucin oder Valin, eines Aspartats mit einem Glutamat, eines Threonins mit einem Serin oder eine ähnliche konservative Ersetzung einer Aminosäure mit einer strukturell verwand ten Aminosäure keine ausgeprägte Wirkung auf die Aktivität oder Funktionalität haben wird.
  • Unter Verwendung der Toledo- oder Towne-Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 und 26) kann der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung andere Polypeptide oder andere DNA-Sequenzen erhalten, die für das HCMV-Toledo- oder -Towne-Protein aus klinischen HCMV-Isolaten kodieren. Beispielsweise kann das Strukturgen durch Variieren einzelner Nucleotide unter Beibehaltung der korrekte(n) Aminosäure(n) manipuliert werden oder durch Variieren der Nucleotide, so dass die Aminosäuren ohne Verlust der Aktivität modifiziert werden. Nucleotide können durch bekannte Techniken, beispielsweise In-vitro-Mutagenese und Primer-Reparatur, substituiert, insertiert oder deletiert werden. Das Strukturgen kann an seinem 3'-Terminus und/oder seinem 5'-Terminus unter Beibehaltung seiner Aktivität trunkiert werden. Es kann weiters wünschenswert sein, einen Abschnitt der HCMV-Toledo- oder -Towne-Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 und 26), insbesondere jenen, der die aminoterminale Domäne umfasst, an eine heterologe kodierende Sequenz zu ligieren und so ein Fusionspeptid des HCMV-Toledo oder -Towne zu erzeugen.
  • Bei der Konstruktion solcher Modifizierungen wird erwartet, dass Änderungen an nicht-konservierten Regionen der HCMV-Toledo- oder -Towne-Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 und 26) vergleichsweise geringe Wirkungen auf die Aktivität bewirken werden, wogegen von Änderungen in den konservierten Regionen, insbesondere in oder nahe der aminoterminalen Domäne, erwartet wird, dass sie stärkere Wirkungen hervorrufen. Aminosäurereste, die zwischen den HCMV-Toledo- oder -Towne-Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 und 26) und zumindest zwei anderen Sequenzen, zum Beispiel aus klinischen HCMV-Isolaten, konserviert sind, sind voraussichtlich keine Kandidaten für die Substitution. Ein Rest, der unter HCMV-Sequenzen und zumindest zwei anderen Sequenzen konservative Variationen zeigt, ist voraussichtlich zu einer ähnlichen konservativen Substitution der HCMV-Sequenzen fähig. Gleichermaßen ist ein Rest, der unter den HCMV-Sequenzen und zumindest drei der anderen Sequenzen nicht konservativ variiert, voraussichtlich entweder zur konservativen oder zur nichtkonservativen Substitution fähig. Bei der Konstruktion von Substitutionen an HCMV-Sequenzen ist das Ersetzen durch eine Aminosäure insbesondere bevorzugt, die sich in der vergleichbar angeglichenen Position einer der anderen Sequenzen findet.
  • Außerdem stellt diese Erfindung einen rekombinanten DNA-Vektor bereit, der Vektor-DNA und eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein HCMV-Toledo-Polypeptid oder HCMV-Towne-Polypeptid kodiert. Der Vektor stellt die HCMV-Toledo- oder -Towne-DNA in operativer Verbindung mit einer regulatorischen Sequenz bereit, die dazu fähig ist, die Replikation und Expression eines HCMV-Toledo- oder -Towne-Proteins in einer ausgewählten Wirtszelle zu steuern. Wirtszellen, die mit solchen Vektoren zur Verwendung beim Exprimieren rekombinanter HCMV-Toledo- oder -Towne-Proteine transformiert sind, werden von dieser Erfindung ebenfalls bereitgestellt. Ebenso bereitgestellt wird ein neues Verfahren zur Herstellung rekombinanter HCMV-Toledo- oder -Towne-Proteine oder Fragmenten davon. In diesem Verfahren wird eine Wirtszelllinie mit einem wie oben beschriebenen Vektor transformiert, der eine DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1 und 6) enthält, die für die Expression eines HCMV-Toledo- oder -Towne-Proteins in operativer Verbindung mit einer geeigneten regulatorischen Sequenz kodiert, die dazu fähig ist, die Replikation und Expression eines HCMV-Toledo- oder -Towne-Proteins zu steuern bzw. zu kontrollieren, wobei die Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, um die Expression der rekombinanten DNA zu ermöglichen. Das exprimierte Protein wird dann aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium unter Verwendung geeigneter herkömmlicher Verfahren gewonnen. Dieses neue Verfahren kann zur Proteinexpression verschiedene bekannte Zellen als Wirtszelllinien einsetzen. Derzeit bevorzugte Zellen sind Säugetierzelllinien, Hefe-, Insekten- und Bakterienzellen. Insbesondere bevorzugt sind Säugetierzelllinien.
  • Die praktische Durchführung der Erfindung setzt, wenn nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA-Manipulation und -Produktion und der Immunologie ein, auf dem Gebiet der Erfindung liegen. Solche Techniken sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe z. B. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989); DNA Cloning, Bd. I und II, D. N. Glover (Hrsg.) (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait (Hrsg.) (1984); Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames und S. J. Higgins (Hrsg.) (1984); Transcription and Translation, B. D. Hames und S. J. Higgins (Hrsg.) (1984); Animal Cell Culture, R. I. Freshney (Hrsg.) (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Reihe: Methods in Enzymology, Academic Press Inc.; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. H. Miller und M. P. Calos (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods in Enzymology, Bd. 154 und 155, Wu und Grossman bzw. Wu (Hrsg.), Mayer und Walker (Hrsg.) (1987); Immunochemical Methods in Cell und Molecular Biology, Academic Press, London, Scopes (1987); Protein Purification: Principles and Practice, 2. Aufl., Springer-Verlag, N.Y.; und Handbook of Experimental Immunology, Bd. I-IV, D. M. Weir und C. C. Blackwell (Hrsg.) (1986).
  • Außerdem stellt diese Erfindung Zusammensetzungen zur Detektion von HCMV-Infektionen im Menschen bereit. Diese Zusammensetzungen umfassen Sonden mit zumindest einem einzelsträngigen Fragment einer Länge von zumindest 10 Basen, bevorzugter 15 Basen, der neuen Toledo-Sequenz und Fragmente, die an diese einzelsträngigen Fragmente unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und nicht mit Human-DNA kreuz-hybridisieren. Außerdem umfassen diese Zusammensetzungen zumindest ein einzelsträngiges Fragment einer Länge von zumindest 10 Basen, bevorzugter 15 Basen, der neuen Towne-Sequenz und Fragmente, die an diese einzelsträngigen Fragmente unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Human-DNA hybridisieren. Solche Sonden-Zusammensetzungen können zusätzlich einen Marker umfassen, der an das Fragment gebunden ist, um ein detektierbares Signal bereitzustellen, wie im US-Patent Nr. 4.762.780 gelehrt wird.
  • Weiters stellt diese Erfindung Verfahren zur Detektion einer HCMV-Infektion in einem menschlichen Wirt bereit. Solche Verfahren umfassen das Kombinieren unter vorherbestimmten stringenten Bedingungen einer klinischen Probe, von der vermutet wird, dass sie HCMV-DNA mit zumindest einem einzelsträngigen DNA-Fragment des neuen Toledo- oder Towne-Stamms von HCMV enthält, das zumindest 10 Basen, bevorzugter 15 Basen, aufweist und nicht mit Human-DNA kreuz-hybridisiert, und das Detektieren der Duplex-Bildung zwischen einzelsträngigen Toledo- oder Towne-Stamm-HCMV-Fragmenten und der Proben-DNA. Alternativ dazu kann PCR verwendet werden, um die Kopieanzahl der viralen Nucleinsäure durch Amplifikation zu erhöhen, um die Identifizierung von HCMV in infizierten Personen zu erleichtern. In einem solchen Fall können die einzelsträngigen Toledo- oder Towne-Stamm-DNA-Sequenzfragmente der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um PCR-Primer für PCR-basierte Amplifikationssysteme zur Diagnose von HCMV zu konstruieren. Solche Systeme sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5.008.182 (Detektion von AIDS-assoziiertem Virus mittels PCR) und Hedrum, PCR Methods and Applications 2, 167–71 (1992) (Detektion von Chlamydia trachomatis mittels PCR und immunomagnetischer Gewinnung).
  • Die DNA-Sequenzen dieser Erfindung können auch zur Herstellung immunisierender Zusammensetzungen verwendet werden. Die neuen Toledo-DNA-Sequenzen werden in den Towne-Stamm oder AD169-Stamm des HCMV rekombiniert, und diese rekombinanten Viren werden auf Wachstumseigenschaften in Endothelzellen oder in Humangeweben getestet, die in SCID-Mäuse transplantiert wurden, oder sie werden im Rattenaugen-Modell getestet. Mocarski, Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 104–08 (1993). Solche Rekombinanten zeigen üblicherweise eine erhöhte Immunogenität gegenüberjener des Towne-125-Stamms, der gegenwärtig beim Menschen in Verwendung steht, ohne die vom Toledo-1-Stamm gezeigte volle Virulenz zu zeigen. Daher sind immunisierende Zusammensetzungen, die entweder den Towne-Stamm oder den AD169-Referenzstamm HCMV enthalten, denen die neue Toledo-DNA-Sequenz oder Analoga oder Fragmente davon zugesetzt worden sind, was eine erhöhte Immunogenität des rekombinanten Virus bewirkt, ein weiterer Aspekt der Erfindung.
  • Die Erfindung umfasst ferner die Verwendung einer wie oben definierten immunogenen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische Behandlung einer mit HCMV in Beziehung stehenden Erkrankung oder Leiden und die Verwendung eines wie oben definierten HCMV-Proteins zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische Behandlung einer mit HCMV in Beziehung stehenden Erkrankung oder Leiden.
  • Andere Aspekte und Vorteile dieser Erfindung werden in der folgenden ausführlichen Beschreibung beschrieben, in der:
  • 1 die neue, aus dem Toledo-Stamm von HCMV isolierte Toledo-DNA-Sequenz der Erfindung illustriert. Die Pfeile bezeichnen die Anfänge und Enden der Nucleotidsequenzen, die für die 21 mutmaßlichen identifizierten Aminosäuresequenzen kodieren.
  • 2 die neue, aus dem Towne-Stamm von HCMV isolierte Towne-DNA-Sequenz der Erfindung illustriert. Die Pfeile bezeichnen die Anfänge und Enden der Nucleotidsequenzen, die für die 4 mutmaßlichen identifizierten Aminosäuresequenzen kodieren.
  • 3 eine schematische Darstellung eines Southern-Blots der restriktionsenzymverdauten Towne- und Toledo-Stamm-HCMV-DNA ist, wie sie in Beispiel 1 ausführlich dargelegt ist. Der Pfeil kennzeichnet eine 5-kbp- (Kilobasenpaar-) Bande der Toledo-DNA am BamHI-Verdau, der die Towne-DNA fehlt, was die Anwesenheit zusätzlicher Toledo-DNA-Sequenz bedeutet.
  • 4 eine zusammengesetzte Autoradiographie der restriktionsenzymverdauten DNA aus AD169-, Towne-, Toledo-HCMV und fünf klinischen Isolaten von HCMV darstellt, wie sie in Beispiel 3 beschrieben sind.
  • 5 eine schematische Darstellung der in den neuen Toledo- und Towne-DNA-Sequenzen identifizierten neuen offenen Leseraster ist.
  • 6 eine schematische Darstellung der relativen Positionen neuer, in genomischer Toledo-DNA, genomischer Towne-DNA identifizierter Sequenzen im Vergleich zu genomischer AD169-Stamm-DNA ist.
  • Ausführliche Beschreibung
  • A. Einführung
  • Die Erfindung stellt zwei neue HCMV-DNA-Sequenzen bereit, die Toledo-Sequenz und Towne-Sequenz genannt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung vordem nicht anerkannt oder bekannt waren. Die Erfindung stellt weiters Immunisierungszusammensetzungen und Verfahren unter Verwendung neuer HCMV-DNA-Sequenzen der Erfindung bereit und stellt ferner andere diagnostische und therapeutische Verwendungen für die Sequenzen und ihre Proteinprodukte bereit. Die neuen DNA-Sequenzen wurden ursprünglich in den Toledo- und Towne-Stämmen von HCMV gefunden. Einzelheiten der Sequenzen und strukturellen Eigenschaften werden in den untenstehenden Beispielen bereitgestellt.
  • Höchst wünschenswert werden immunogene HCMV-Zusammensetzungen bereitgestellt, die Referenzstamm AD169 oder Towne umfassen, zu denen die neuen Toledo-DNA-Sequenzen oder Analoga oder Fragmente davon zugegeben worden sind, um die Immunogenität des übermäßig abgeschwächten Stamms zu erhöhen. Folglich umfasst einer der Aspekte dieser Erfindung isolierte DNA- und entsprechende RNA-Sequenzen, wie sie in 1 und 2 (Seq.-ID Nr. 6 und 1) offenbart sind. „Isoliert" bedeutet, wie hierein verwendet, im Wesentlichen frei von anderen Nucleotid- oder Polypeptidsequenzen, mit denen sich die gegenständliche Nucleotidsequenz oder Polypeptidsequenz typischerweise in ihrem nativen, d. h. endogenen, Zustand findet. In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung isoliertes HCMV-Towne- oder -Toledo-Protein, das von den entsprechenden HCMV-Towne- oder Toledo-DNA-Sequenzen (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 und 27) kodiert wird.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst diagnostische Tests zur Detektion von HCMV-Stamm-Varianten. Kurz gesagt umfassen solche diagnostischen Tests die Verwendung von DNA-Sequenzfragmenten der Erfindung als Primer zum Amplifizieren von mit HCMV in Beziehung stehenden Nucleinsäuren in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) oder durch direkte Detektion durch Hybridisierung. Die diagnostischen Tests der Erfindung können auch die Verwendung spezifischer Antikörper gegen die neuen, durch die hierin offenbarten Toledo- oder Towne-DNA-Sequenzen kodierten ORFs umfassen. Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der mit einer einzigartigen Restriktionsstelle modifizierten neuen DNA-Sequenzen, um als Impfstoffmarker zu agieren.
  • Es wird erwartet, dass die Erfindung die Produktion von Impfstoffen erlaubt, die Vorteile gegenüber dem gegenwärtigen HCMV-Impfstoff bieten, der übermäßig abgeschwächt und daher nicht beständig wirksam ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Im Spezielleren resultiert die Einführung oder Insertion der neuen Toledo-Stamm-Sequenzen der vorliegenden Erfindung in den Towne-Stamm oder in den AD169-Stamm in der Einführung spezifischer DNA-Sequenzen in das HCMV-Towne-Genom, die unter Anwendung der Zellpassage-Impfstoffe nicht möglich ist. Wesentlich für die Impfstoffherstellung ist, dass dies eine präzise Messung des durch unterschiedliche Fragmente der DNA-Sequenzen der Erfindung eingeführten Abschwächungsgrades ermöglicht, wodurch die kontrollierte Modifikation der Abschwächung des Towne-Stamms ermöglicht wird, die auf dem Gebiet der Erfindung notwendig ist, um die übermäßig abgeschwächte Charakteristik des Towne-Stamms zu korrigieren und seine Funktion als eine immunogene Zusammensetzung zu verbessern.
  • B. Rekombinantes AD169- oder Towne-HCMV
  • Rekombinante AD169- oder Towne-DNA wird durch Cotransfektieren eines die neue Toledo-Sequenz oder Analoga oder Fragmente davon enthaltenden Plasmids und eines selektierbaren Markers, wie z. B. gpt oder β-Galactosidase, in primäre Fibroblastenzellen oder andere Zelllinien, die bekanntermaßen für das Wachstum von CMV permissiv sind, hergeleitet. Rekombinante Viren werden durch Wachstum in Medien selektiert, die Mycophenolsäure enthalten, oder werden nach Aufbringen eines chromogenen Substrats, wie z. B. X-Gal, als blaue Plaque-Phänotypen identifiziert. Rekombinante Viren werden Plaque-gereinigt und mittels Restriktionsenzymanalyse und Southern-Blotting-Verfahren charakterisiert. Die neue Toledo-HCMV-Sequenz oder Analoga oder Fragmente davon können bezüglich der endogenen Promotor- und Transkriptionsterminationssignale unmodifiziert verwendet werden. Alternativ dazu kann die für Toledo-HCMV-Stamm-DNA kodierende Region unter Transkriptionskontrolle eines Promotors, wie z. B. des unmittelbar frühen CMV- (Cytomegalovirus-) Haupt-Promotors, des frühen SV40-Promotors oder eines anderen Virus- oder Zell-Promotors, gestellt werden, der hierin erörterte geeignete Expressionsstärken hervorruft. Modifiziertes Towne- oder AD169-Stamm-HCMV wird in Gewebekulturzellen gezüchtet. Für Experimente mit Säugetieren mit Ausnahme des Menschen werden Zellen, wie z. B. Human-Vorhaut-Fibroblasten- (HF-) oder MRC-5-Zellen verwendet, um das Virus zu vermehren. Das Virus wird aus Kulturen dieser Zellen geerntet, und das isolierte rekombinante Virus wird dann auf seine Fähigkeit hin weiter untersucht, eine Immunantwort auszulösen und für Schutz gegen HCMV-Infektion zu sorgen.
  • Zur Verwendung im Menschen wird das rekombinante Virus aus einer von der FDA zugelassenen Zelllinie in großem Maßstab produziert. Solche Zellen umfassen MRC-5- oder WI-38-Zellen (beide sind primäre diploide Human-Fibroblasten). Das rekombinante Virus wird in der Produktionszelllinie erzeugt, und zwar durch Transfektion von Virus-DNA oder -Capsiden, die aus rekombinantem Virus hergestellt wurden, das aus einer anderen Zelllinie isoliert wurde. Das Transfektionsverfahren sollte die Kontamination der von der FDA zugelassenen Zellen mit adventiven Mitteln oder Kontaminanten aus einer nicht approbierten Zelllinie verhindern. Ein aus den obigen Zelllinien hergestellter HCMV-Virus wird verwendet, um stufenweise größere Flaschen von Gewebekulturzellen zu infizieren. Infizierte Zellen werden als nachfolgende Inokula verwendet. Lebensfähige infizierte Gewebekulturzellen werden aus den Gewebekulturgefäßen unter Verwendung von Trypsin entfernt und einem 1- bis 100fachen (oder größeren) Überschuss nicht infizierter Zellen zugegeben, um stufenweise größere Inokulierungen zu erzielen. Sobald eine optimale Ausbeute erlangt ist, wird das Virus aus den Gewebekulturzellen geerntet. Dieses Verfahren kann wiederholt werden, bis eine Produktion im Großmaßstab erreicht ist. Infizierte Zellen werden aus dem Gewebekulturgefäß entfernt und aufgebrochen, wobei zum Beispiel Ultraschall, Dounce-Homogenisierung oder irgendeine Kombination des obigen angewendet wird. Die Viren werden dann unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Zentrifugationstechniken vom Zellmaterial isoliert. Wenn das Virus einmal isoliert ist, wird ein Stabilisierungsmittel, wie z. B. ein Kohlenhydrat oder Kohlenhydrat-Derivat, zugegeben und das Virus dann aliquotiert und lyophilisiert.
  • C. Immunogene Zusammensetzungen
  • Immunogene Zusammensetzungen können an Patienten verabreicht werden, um HCMV-Infektionen zu verhindern. Die immunogenen Zusammensetzungen verhindern HCMV-Infektionen durch Stimulieren des Immunsystems mit einem abgeschwächten Virus, der unfähig ist, die Erkrankung vollständig zu manifestieren. Ein Hauptvorteil der hierin bereitgestellten immunogenen HCMV-Zusammensetzungen ist es, dass ein erhöhter Grad an Immunogenität eine Verschiebung der wirksamen Prävention einer HCMV-Infektion in der Population bewirkt.
  • Der Towne-Stamm von HCMV dient aufgrund seiner nachgewiesenen Unfähigkeit der Reaktivierung vorzugsweise als Elternstamm. Um immunogene HCMV-Zusammensetzungen herzustellen, werden vollständige, trunkierte und/oder modifizierte neue Toledo-DNA-Sequenzen wie hierin erörtert in einen HCMV-AD169- oder – Towne-Stamm-Virus eingeführt. Die Wirksamkeit der immunogenen Zusammensetzung bei der Prävention von HCMV-Infektionen wird im Menschen gemessen. Men schen werden zunächst mit PFUs im Bereich von 100–20.000 PFU mutiertem Virus je Inokulation inokuliert, wobei PFUs wie hierin erörtert gemessen werden. Nach der ersten Inokulation kann üblicherweise eine zweite Booster-Injektion ähnlicher oder erhöhter Dosis verabreicht werden. Patienten werden nach der ersten oder zweiten Inokulation dem HCMV der Wildform exponiert und das Auftreten von CMV-Infektionen beobachtet. Potentielle Nebenwirkungen des Impfstoffs werden bei freiwilligen Erwachsenen, die vorher dem CMV exponiert waren, überwacht, bevor Patienten inokuliert werden, die niemals CMV-Infektionen entwickelt haben. Abgeschwächtes Virus wird ohne Adjuvans und mit einem physiologisch geeigneten Träger verwendet.
  • Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und hierin erörtert, wird die neue DNA beispielsweise unter Anwendung homologer rekombinanter Techniken in das Towne- oder AD169-Virusgenom insertiert. Die Insertion wird im Allgemeinen in einem Gen vorgenommen, das naturgemäß nicht essentiell ist. Plasmid-Shuttle-Vektoren, welche die Konstruktion rekombinanter Viren außerordentlich erleichtern, sind beschrieben worden. Siehe beispielsweise Spaete und Mocarski, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 7213–17 (1987). Die Expression des von der neuen Toledo-DNA kodierten Polypeptids tritt dann in Zellen oder Personen auf, die mit dem lebenden rekombinanten Virus immunisiert sind.
  • Alternativ dazu können die gereinigten neuen HCMV-Proteine in therapeutischen und/oder immunogenen Untereinheiten-Zusammensetzungen zur Prävention und Behandlung von mit HCMV in Verbindung stehenden Leiden eingesetzt werden. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen eine immunogen-induzierend wirksame Menge eines oder mehrerer Proteine der vorliegenden Erfindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, beispielsweise einem Adjuvans/Antigen-Präsentationssystem, wie z. B. Alaun. Andere Adjuvans/Antigen-Präsentationssysteme, zum Beispiel MF59 (Chiron Corp.), QS-21 (Cambridge Biotech Corp.), 3-DMPL (3-Deacyl-Monophosphoryl-Lipid A) (RibilmmunoChem Research Inc.), inkomplettes Freund'sches Adjuvans (IFA) klinischer Qualität, fusogene Lipo somen, wasserlösliche Polymere oder Iscoms (immunstimulierende Komplexe), können ebenfalls verwendet werden. Andere beispielhafte pharmazeutisch annehmbare Träger oder Lösungen sind Aluminiumhydroxid, Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Die Zusammensetzung kann systemisch verabreicht werden, vorzugsweise subkutan oder intramuskulär in Form einer annehmbaren subkutanen oder intramuskulären Lösung. Eine Inokulation kann auch durch Oberflächensakrifizierung oder durch Inokulation einer Körperhöhle erzielt werden. Die Herstellung solcher Lösungen mit Bezug auf pH, Isotonie, Stabilität und dergleichen liegt im Ermessen das Fachmanns. Das Dosierungsschema wird vom behandelndem Arzt ermittelt, wobei verschiedene Faktoren berücksichtigt werden, die bekanntermaßen die Wirkung von Medikamenten modifizieren, wie z. B. physischer Zustand, Körpergewicht, Geschlecht, Ernährung, Schwere des Leidens, Zeitpunkt der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Dosierungsbereiche umfassen beispielsweise ungefähr 1 μg bis ungefähr 1.000 μg Protein.
  • Bei der praktischen Ausführung der Behandlung dieser Erfindung wird eine immunologisch induzierende, wirksame Menge Protein einem menschlichen Patienten verabreicht, der eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung benötigt. Eine immunologisch induzierende, wirksame Menge einer Zusammensetzung dieser Erfindung erwägt den Bereich von ungefähr 1 Mikrogramm bis ungefähr 1 Milligramm je verabreichter Dosis. Die Anzahl verabreichter Dosen kann in Abhängigkeit von den oben genannten Faktoren variieren.
  • D. Diagnostische Tests und Verwendung als Impfstoffmarker
  • Die neuen Toledo- und Towne-DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können in diagnostischen Tests verwendet werden, um HCMV in einer Probe zu detektieren, um Toledo- und Towne-ähnliche Sequenzen zu detektieren und um Stammunterschiede in klinischen HCMV-Isolaten zu detektieren, indem entweder chemisch synthetisierte oder rekombinante Toledo- oder Towne-DNA-Fragmente verwendet werden. Zusätzlich können die neuen Sequenzen als Impfstoffmarker verwendet wer den, um zwischen einer Person oder Probe, die HCMV der Wildform enthält oder mit diesem infiziert ist, und einer Person oder Probe zu unterscheiden, die einen HCMV-Impfstoff, d. h. einen gegenwärtig in Verwendung stehenden, abgeschwächten HCMV-Lebendimpfstoff, wie z. B. den Towne-Impfstoff, enthält oder mit diesem infiziert ist. In noch einer weiteren Ausführungsform können Fragmente der DNA-Sequenzen auch an sekundäre Nucleinsäuren mit Sequenzen gebunden werden, die entweder einen festen Träger oder andere Detektionssonden zur Verwendung in diagnostischen Tests binden.
  • In einer der Aspekte der Erfindung können Fragmente der neuen Toledo- oder Towne-DNA-Sequenzen (Seq.-ID Nr. 1 und 3), die zumindest zwischen 10 und 20 Nucleotide umfassen, als Primer verwendet werden, um Nucleinsäuren unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannten Polymerasekettenreaktions-(PCR-) Verfahren zu amplifizieren, und können als Sonden in Nucleinsäurehybridisierungstests verwendet werden, um genetisches Zielmaterial, wie z. B. HCMV-DNA, in klinischen Proben (mit oder ohne PCR) zu detektieren. Siehe beispielsweise US-Patente Nr. 4.683.202; 4.683.195; 5.091.310; 5.008.182 und 5.168.039. In einem beispielhaften Test wird eine konservierte Region der neuen DNA-Sequenz unter Virusvarianten als die zu amplifizierende Sequenz gewählt und im diagnostischen Test detektiert. Es werden Oligonucleotidprimer konstruiert, die zumindest im Wesentlichen komplementär (jedoch vorzugsweise identisch) zu der zu amplifizierenden Sequenz sind, und es wird eine Probe, von der vermutet wird, dass sie eine zu detektierende HCMV-Nucleinsäuresequenz enthält, mit Primern für jeden Strang der zu detektierenden HCMV-Nucleinsäuresequenz, vier verschiedenen Desoxynucleotidtriphosphaten und einem Polymerisationsmittel unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen behandelt, so dass zu jedem Primer ein Extensionsprodukt synthetisiert wird, das zu den in der Probe vermuteten HCMV-Nucleinsäuresequenzen komplementär ist, wobei die aus einem der Primer synthetisierten Extensionsprodukte, wenn sie vom Komplement getrennt werden, als Templat zur Synthese des Extensionsprodukts des anderen Primers in einer Polymerasekettenreaktion dienen können. Nach Amplifikation kann das PCR-Produkt durch Zugeben einer gleichermaßen aus der neuen DNA-Sequenz konstruierten markierten Sonde, die zur Hybridisierung mit der amplifizierten Sequenz fähig ist, detektiert werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt ist. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5.008.182.
  • In einer weiteren Ausführungsform können die Sonden oder Primer in einem Impfstoffmarkertest verwendet werden, um einen Impfstoff oder eine Infektion der Wildform zu detektieren. Alternativ dazu stellt die Einführung einer Restriktionsstelle in die neue DNA-Sequenz üblicherweise einen Impfstoffmarker bereit, der mit PCR-Fragmenten verwendet werden kann, um solche Unterschiede in einem Restriktionsverdau zu detektieren. Solche Verfahren und Techniken zur Detektion von Sequenzvarianten, wie z. B. Punktmutationen mit der erwarteten Lage oder Anordnung der Mutation, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind bei der Detektion von Sichelzellenanämie, Hämoglobin-C-Krankheit, Diabetes und anderen Krankheiten und Leiden angewendet worden, wie in US-Patent Nr. 5.137.806 offenbart ist. Diese Verfahren können vom Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung leicht angewendet werden und differenzieren zwischen Wildform- und Impfstoftinfektionen bei HCMV.
  • In einer weiteren Ausführungsform können die neuen Toledo- oder Towne-DNA-Sequenzen als Ganzes oder als Fragmente verwendet werden, um die Gegenwart von DNA-Sequenzen, verwandten Sequenzen oder Transkriptionsprodukten in Zellen, Geweben und Proben und dergleichen unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Hybridisierungssondentechniken oder in Verbindung mit einem der hierin erörterten Verfahren zu detektieren. Wenn sie als Hybridisierungssonde verwendet werden, sind Fragmente der neuen DNA-Sequenzen der Erfindung vorzugsweise 50–200 Nucleotide lang, bevorzugter 100–300 Nucleotide lang und insbesondere bevorzugt mehr als 300 Nucleotide lang.
  • E. Produktion von Vektor und chimärem Virus
  • Die neuen DNA-Sequenzen der Erfindung können in verschiedenen Vektoren unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken exprimiert wer den, die in der Erzeugung eines chimären Virus resultiert. Zweckdienliche und bekannte Techniken umfassen Markertransfer oder homologe Rekombination, direkte In-vitro-Ligation, unvollständige Vektor-Technologie und Ampliconerzeugung (siehe z. B. N. Frenkel et al., Gene Transfer and Cancer, M. L. Pearson und N. L. Sternberg (Hrsg.) (1984), A. D. Kwong und Frenkel, Virology 142, 421–425 (1985); US-Patent Seriennummer 07/923.015 von Roizman). In solchen Techniken verwendete Vektoren umfassen Cosmide, Plasmide und infektiöse und defekte Viren. Solche Vektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ein hierin verwendetes Cosmid ist ein Plasmid, das eine Lambda-Bakteriophagen-cos-Stelle aufweist. Die cos-Stelle ist das cis-Signal zur Verpackung der Lambda-DNA. Daher kann ein Cosmid im Gegensatz zu einem Plasmid mit hoher Effizienz in vitro in einen Lambda-Kopf verpackt werden. Diese Technik ermöglicht die Klonierung sehr großer (30–45 kbp) DNA-Fragmente. Die Cotransfektion überlappender Cosmide kann verwendet werden, um Human-Cytomegalovirus-Mutanten nach den Verfahren von Kemble, J. Virology 70, 2044–48 (1996), zu konstruieren. Die Vektoren können entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und entweder aus DNA oder aus RNA bestehen.
  • Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz für sich alleine oder an andere genomische HCMV-DNA gebunden in den Vektor insertiert. Bei direkten In-vitro-Ligationsanwendungen wird die isolierte Sequenz für sich alleine verwendet. Bei homologer Rekombination sind Markertransfer-flankierende Nucleinsäuresequenzen erforderlich, um den Transfer der Sequenz in ein virales HCMV-Genom zu bewirken. Zur Verwendung bei viraler Komplementierung unter Verwendung von Cosmiden und anderen hierin erörterten Vektoren ist die Sequenz (oder ein Fragment davon) in einem Vektor vorzugsweise operativ an zumindest 1 kb genomischer HCMV-Nucleinsäure und bevorzugter an zumindest 5 kb HCMV-Nucleinsäure gebunden. Die genomische HCMV-Nucleinsäure kann sich an einer Seite oder an beiden Seiten des offenen Leserasters befinden. Wenn nur eine spezielle Region des offenen Leserasters zur Erzeugung eines mutierten Virus zu verwenden ist, wird ein offenes Leseraster oder Fragment davon in einen Vektor insertiert.
  • F. Neues Toledo- und Towne-Protein
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst die isolierten Proteine, die wie hierin gelehrt von der Toledo- oder Towne-DNA-Sequenz kodiert werden. Die Proteine können verwendet werden, um den Lebenszyklus von HCMV zu untersuchen oder zu modifizieren, da sie für Oberflächen-Glykoproteine kodieren könnten, die immunogen und für Gewebetropismus verantwortlich sein könnten oder die Immunantwort einer infizierten Person beeinflussen könnten. Solche Proteine könnten daher bei der Produktion eines Untereinheit-Impfstoffs gegen CMV verwendet werden. Die Konstruktion solcher CMV-Untereinheit-Impfstoffkandidaten ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Siehe beispielsweise Spaete, Virology 167, 207–25 (1988).
  • Einundzwanzig neue Toledo- und vier neue Towne-Proteine sind mittels ORF-Analyse identifiziert worden. Die neuen Toledo-Proteine umfassen UL130 (Seq.-ID Nr. 23), UL132 (Seq.-ID Nr. 27), UL133 (Seq.-ID Nr. 7), UL134 (Seq.-ID Nr. 8), UL135 (Seq.-ID Nr. 9), UL136 (Seq.-ID Nr. 10), UL137 (Seq.-ID Nr. 11), UL138 (Seq.-ID Nr. 12), UL139 (Seq.-ID Nr. 13), UL140 (Seq.-ID Nr. 14), UL141 (Seq.-ID Nr. 15), UL142 (Seq.-ID Nr. 16), UL143 (Seq.-ID Nr. 17), UL144 (Seq.-ID Nr. 18), UL145 (Seq.-ID Nr. 19), UL146 (Seq.-ID Nr. 20), UL147 (Seq.-ID Nr. 21), UL148 (Seq.-ID Nr. 22), UL149 (Seq.-ID Nr. 24), UL150 (Seq.-ID Nr. 25) und/oder UL151 (Seq.-ID Nr. 26). UL130 wird von den Nucleotiden 13.109 bis 13.753 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL132 wird von den Nucleotiden 11.673 bis 12.485 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL133 wird von den Nucleotiden 51 bis 824 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL134 wird von den Nucleotiden 541 bis 1.068 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL135 wird von den Nucleotiden 941 bis 1.927 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL136 wird von den Nucleotiden 2.018 bis 2.740 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL137 wird von den Nucleotiden 2.599 bis 2.890 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL138 wird von den Nucleotiden 2.823 bis 3.332 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL139 wird von den Nucleotiden 3.895 bis 4.302 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL140 wird von den Nucleotiden 4.484 bis 4.828 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL141 wird von den Nucleotiden 5.098 bis 6.375 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL142 wird von den Nucleotiden 6.448 bis 7.368 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL143 wird von den Nucleotiden 7.353 bis 7.631 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL144 wird von den Nucleotiden 8.008 bis 8.538 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL145 wird von den Nucleotiden 8.867 bis 9.169 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL146 wird von den Nucleotiden 9.450 bis 9.803 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL147 wird von den Nucleotiden 9.868 bis 10.347 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL148 wird von den Nucleotiden 10.646 bis 11.596 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL149 wird von den Nucleotiden 15.756 bis 16.124 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL150 wird von den Nucleotiden 15.874 bis 17.802 kodiert, wie in 1 gezeigt ist. UL151 wird von den Nucleotiden 17.289 bis 18.299 kodiert, wie in 1 gezeigt ist.
  • Die neuen Toledo-Proteine umfassen UL147, UL152, UL153 und UL154 (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4 bzw. 5). UL147 wird von den Nucleotiden 841 bis 1.321 kodiert, wie in 2 gezeigt ist. UL152 wird von den Nucleotiden 1.365 bis 1.721 kodiert, wie in 2 gezeigt ist. UL153 wird von den Nucleotiden 2.501 bis 3.337 kodiert, wie in 2 gezeigt ist. UL154 wird von den Nucleotiden 3.512 bis 4.711 kodiert, wie in 2 gezeigt ist.
  • „Toledo- und/oder Towne-Protein oder -Proteine" bezieht sich wie hierin verwendet auf die obigen Sequenzen, die auch in der Sequenzliste aufgezählt sind. „Toledo- und/oder Towne-Protein oder -Proteine" bezieht sich ferner auf ein homologes Protein aus einem beliebigen Stamm oder klinischen Isolat von HCMV, einschließlich HCMV-Proteine, die zumindest 90% homolog zu den Toledo- oder Towne-Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 und 27) sind. Das Toledo- oder Towne-Protein kann modifiziert werden, um den HCMV-Lebenszyklus durch Deletion, Insertion oder Substitution in der DNA-Sequenz wie hierin erörtert oder durch chemische Synthese einer anderen Aminosäuresequenz oder durch chemische Modifizierung zu beeinflussen. Trunkierte Proteine können durch Deletion eines Abschnitts der DNA-Sequenz oder durch Einführung eines/von Terminationssignals/en in die DNA-Sequenz gebildet werden. Bevorzugte Deletionen am Protein entsprechen der deletierten Aminosäure sequenz oder Sequenzen, die zumindest eine Aminosäure enthalten, die aus der aus Glu, Asp, Arg, Lys, Cys und Pro bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Bevorzugter enthält/enthalten die deletierte(n) Aminosäuresequenz(en) zumindest zwei Proline.
  • Andere Mutationen des Proteins, die beim Modifizieren des HCMV-Lebenszyklus zweckdienlich sind, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Modifizierungen der cAMP-Phosphorylierung (Arg/Lys-Arg/Lys-X-X-Asp/Glu) und/oder Myristylierungsstellen (Glycin-X1-X2-X3-Ser/Thr-X-X-Asp/Glu; wobei X1 nicht Glu, Asp, Arg, Lys, His, Pro, Phe, Tyr, Trp ist, wobei X2 eine beliebige Aminosäure ist und wobei X3 nicht Pro ist) oder Modifizierung der PKC-Phosphorylierungsstellen (Ser/Thr-X-Arg/Lys) und/oder N-verknüpften Glykosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr; wobei X nicht Pro ist).
  • Die Toledo- oder Towne-DNA-Sequenzen, Analoga oder Fragmente davon können in einem Säugetier-, Insekten- oder Mikroorganismen-Wirt exprimiert werden. Das Polynucleotid wird in einen geeigneten, mit der eingesetzten Wirtszellenart kompatiblen Expressionsvektor insertiert und ist operativ an die Kontrollelemente innerhalb dieses Vektors gebunden. Die Vektorkonstruktion setzt Techniken ein, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die ortsspezifische DNA-Spaltung, die bei einer solchen Konstruktion involviert ist, wird durch Behandeln mit geeigneten Restriktionsenzymen unter Bedingungen durchgeführt, die im Allgemeinen vom Hersteller dieser im Handel erhältlichen Enzyme genau angegeben sind. Ein geeigneter Expressionsvektor ist einer, der mit der gewünschten Funktion (z. B. vorübergehende Expression, Langzeit-Expression, Integration, Replikation, Amplifikation) kompatibel ist und in dem die Kontrollelemente mit der Wirtszelle kompatibel sind.
  • Säugetierzellexpression
  • Zur Replikation in Säugetierzellen geeignete Vektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können virale Replikons oder Sequenzen umfassen, welche die Integration der für die Toledo- oder Towne-DNA kodierenden Sequenz in das Wirtsgenom gewährleisten. Beispielhafte Vektoren umfassen jene, die sich von SV40, Retroviren, Rinderpapillomavirus, Vacciniavirus, anderen Herpesviren und Adenovirus herleiten.
  • Solche geeigneten Säugetier-Expressionsvektoren enthalten einen Promotor, um die Transkription fremder DNA-Sequenzen zu vermitteln, und gegebenenfalls einen Enhancer. Geeignete Promotoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen virale Promotoren, wie z. B. jene aus SV40, Cytomegalovirus (CMV), Rous-Sarkomvirus (RSV), Adenovirus (ADV) und Rinderpapillomavirus (BPV).
  • Die optionale Gegenwart eines Enhancers erhöht in Kombination mit dem oben beschriebenen Promotor üblicherweise die Expressionslevel. Ein Enhancer ist eine beliebige regulatorische DNA-Sequenz, welche die Transkription bis zum 1000fachen stimuliert, wenn er an endogene oder heterologe Promotoren gebunden ist, wobei die Synthese an der normalen mRNA-Startstelle beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn sie stromauf oder stromab der Transkriptionsinitiationsstelle, entweder in normaler oder umgekehrter Orientierung, oder in einem Abstand von mehr als 1.000 Nucleotiden vom Promotor platziert werden. Siehe Maniatis, Science 236, 1237 (1987), Alberts, Molecular Biology of the Cell, 2. Aufl. (1989). Von Viren hergeleitete Enhancer können besonders zweckdienlich sein, weil sie typischerweise einen breiteren Wirtsbereich aufweisen. Beispiele umfassen den frühen SV40-Gen-Enhancer (siehe Dijkema, EMBO J. 4, 761 (1985)) und die Enhancer/Promotoren, die von der langen terminalen Wiederholung (LTR) des RSV (siehe Gorman, Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 6777 (1982b)) und vom Human-Cytomegalovirus (siehe Boshart, Cell 41, 521 (1985)) hergeleitet sind. Zusätzlich sind einige Enhancer regulierbar und werden nur in Gegenwart eines Induktors, wie z. B. eines Hormons oder Metallions, aktiv (siehe Sassone-Corsi und Borelli, Trends Genet. 2, 215 (1986); Maniatis, Science 236, 1237 (1987)). Der Expressionsvektor kann und wird typischerweise außerdem eine Terminationssequenz und Poly(A)-Additionssequenzen umfassen, die operativ an die für Toledo oder Towne kodierende Sequenz gebunden sind.
  • Sequenzen, welche die Amplifikation des Gens verursachen, können wünschenswerterweise ebenfalls in den Expressionsvektor oder in einen anderen Vektor aufgenommen werden, der mit dem Expressionsvektor cotranslatiert wird, der eine Towne- oder Toledo-DNA-Sequenz enthält, sowie auch Sequenzen, die für selektierbare Marker kodieren. Selektierbare Marken für Säugetierzellen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen beispielsweise Thymidin-Kinase, Dihydrofolat-Reduktase (gemeinsam mit Methotrexat als DHFR-Amplifikator), Aminoglykosidphospho-Transferase, Hygromycin-B-Phospho-Transferase, Asparagin-Synthetase, Adenosin-Deaminase, Metallothionein und Antibiotikaresistenzgene, wie z. B. Neomycin.
  • Der Vektor, der für ein neues Toledo- oder Towne-Protein oder -Polypeptid dieser Erfindung kodiert, kann zur Transformation einer geeigneten Säugetierwirtszelle verwendet werden. Die Transformation kann durch jedes bekannte Verfahren zur Polynucleotideinführung in eine Wirtszelle erfolgen, einschließlich beispielsweise Verpackung des Polynulceotids in ein Virus und Transduktion einer Wirtszelle mit dem Virus. Das verwendete Transformationsverfahren hängt vom zu transformierenden Wirt ab. Verfahren zur Einführung eines heterologen Polynucleotids in Säugetierzellen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphatpräzipitation, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Einkapselung des/der Polynucleotid(e) in Liposomen und direkte Mikroinjektion der DNA in Kerne.
  • Als Wirte zur Expression verfügbare Säugetierzelllinien sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen zahlreiche immortalisierte Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen, HeLa-Zellen, Babyhamster-Nieren- (BHK-) Zellen, Affennierenzellen (COS), hepatozelluläre Humankarzinomzellen (z. B. Hep G2) und eine Reihe anderer Zelllinien.
  • Insektenzellenexpression
  • Die Komponenten eines Insektenzellenexpressionssystems umfassen einen Transfervektor, für gewöhnlich ein bakterielles Plasmid, das ein Fragment des Baculovirus-Genoms sowie eine zweckdienliche Restriktionsstelle zur Insertion des/der zu exprimierenden heterologen Gens/Gene enthält; ein Baculovirus der Wildform mit einer Sequenz, die zum Baculovirus-spezifischen Fragment im Transfervektor homolog ist (dies ermöglicht die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus-Genom); und geeignete Insektenwirtszellen und Wachstumsmedien. Beispielhafte Transfervektoren zur Einführung fremder Gene in Insektenzellen umfassen pAc373 und pVL985. Siehe Luckow und Summers, Virology 17, 31 (1989).
  • Das Plasmid kann auch das Polyeder-Polyadenylierungssignal und ein prokaryotisches Ampicillinresistenz- (amp-) Gen und einen Replikationsstartpunkt zur Selektion und Vermehrung in E. coli enthalten. Siehe Miller, Ann. Rev. Microbiol. 42, 177 (1988).
  • Baculovirus-Transfervektoren enthalten für gewöhnlich einen Baculovirus-Promotor, d. h. eine DNA-Sequenz, die dazu fähig ist, eine Baculovirus-RNA-Polymerase zu binden und die Stromab- (5' → 3'-) Transkription einer kodierenden Sequenz (z. B. Strukturgen) in mRNA zu initiieren. Der Promotor weist üblicherweise eine Transkriptionsinitiationsregion auf, die für gewöhnlich proximal zum 5'-Ende der kodierenden Sequenz platziert wird und typischerweise eine RNA-Polymerasebindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle umfasst. Ein Baculovirus-Transfervektor kann ferner einen Enhancer aufweisen, der sich, falls er vorhanden ist, für gewöhnlich distal des Strukturgens befindet. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
  • Hefe- und Bakterienexpression
  • Ein Hefeexpressionssystem kann typischerweise eines oder mehrere von Folgendem umfassen: eine Promotorsequenz, Fusionspartnersequenz, Leadersequenz, Transkriptionsterminationssequenz. Ein Hefepromotor, der fähig ist, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die Stromab- (3'-) Transkription einer kodierenden Sequenz (z. B. Strukturgen) in mRNA zu initiieren, weist üblicherweise eine Transkriptionsinitiationsregion auf, die für gewöhnlich proximal zum 5'-Ende der kodierenden Sequenz platziert ist. Diese Transkriptionsinitiationsregion umfasst typischerweise eine RNA-Polymerasebindungsstelle (eine „TATA-Box") und eine Transkriptionsinitiationsstelle. Der Hefepromotor kann ferner eine Stromauf-Aktivatorsequenz aufweisen, die sich für gewöhnlich distal zum Strukturgen befindet. Die Aktivatorsequenz ermöglicht die induzierbare Expression der gewünschten heterologen DNA-Sequenz. Konstitutive Expression tritt in Abwesenheit einer Aktivatorsequenz auf. Regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder vermindert wird.
  • Insbesondere zweckdienliche Hefepromotoren umfassen Alkohol-Dehydrogenase (ADH) (EP-Patent Nr. 284.044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phospho-Fructokinase, 3-Phosphogycerat-Mutase und Pyruvat-Kinase (PyK) (EP-Patent Nr. 329.203). Das für Saure Phosphatase kodierende Hefe-PHO5-Gen stellt ebenfalls zweckdienliche Promotorsequenzen bereit. Siehe Myanohara, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1 (1983).
  • Eine Toledo- oder Towne-DNA-Sequenz, ein Analogon oder ein aktives Fragment davon kann intrazellulär in Hefe exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt an die Sequenz oder das Fragment gebunden werden, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin ist, das vom ATG-Startcodon kodiert wird. Wenn gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus durch In-vitro-Inkubation mit Bromcyan vom Protein abgespalten werden.
  • Intrazellulär exprimierte Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression einer Sequenz bereit. Typischerweise wird eine DNA-Sequenz, die für den N- terminalen Abschnitt eines stabilen Proteins, eines Fusionspartners, kodiert, an das 5'-Ende heterologer DNA fusioniert, die für das gewünschte Polypeptid kodiert. Bei Expression sorgt dieses Konstrukt üblicherweise für eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. Beispielsweise kann das Hefe- oder Human-Superoxid-Dismutase(SOD-) Gen an den 5'-Terminus einer Sequenz gebunden und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann für eine spaltbare Stelle kodieren oder auch nicht. Siehe z. B. EP-Patent Nr. 196.056. Alternativ dazu können die Polypeptide auch aus der Zelle in das Wachstumsmedium sekretiert werden, indem ein Fusionsprotein erzeugt wird, das ein Leadersequenzfragment umfasst, das für die Sekretion der Polypeptide in Hefe oder Bakterien sorgt. Vorzugsweise liegen zwischen dem Leaderfragment und der Sequenz kodierte Prozessierungsstellen vor, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenzfragment kodiert typischerweise für ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren umfasst, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Für geeignete Signalsequenzen kodierende DNA kann von Genen für sekretierte Hefeproteine, wie z. B. dem Hefe-Invertase-Gen (EP-Patent Nr. 12.873) und dem A-Faktor-Gen (US-Patent Nr. 4.588.684), hergeleitet werden. Alternativ dazu können Leader, die nicht von Hefe stammen, wie z. B. ein Interferon-Leader, verwendet werden, um für die Sekretion in Hefe zu sorgen (EP-Patent Nr. 60.057). Von der Hefe erkannte Transkriptionsterminationssequenzen sind 3' des Translationsstopcodons lokalisierte Regulationsregionen. Gemeinsam mit dem Promotor flankieren sie die gewünschte heterologe kodierende Sequenz. Diese flankierenden Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das von der DNA kodierte Polypeptid translatiert werden kann.
  • Typischerweise werden die oben beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, Leader (falls erwünscht), eine kodierende Sequenz von Interesse und Transkriptionsterminationssequenz umfassen, gemeinsam in Plasmide platziert, die fähig sind, in einem Wirt, wie z. B. Hefe oder Bakterien, stabil zu bleiben. Das Plasmid kann zwei Replikationssysteme aufweisen, so dass es als Shuttle-Vektor erhalten werden kann, beispielsweise in Hefe zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt zur Klonierung und Amplifikation. Beispiele solcher Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektoren umfassen YEp24 (siehe Botstein, Gene 8, 17–24 (1979)), pC1/1 (siehe Brake, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4642–4646 (1984)) und YRp17 (siehe Stinchcomb, J. Mol. Biol. 158, 157 (1982)). Außerdem kann das Plasmid entweder ein Plasmid mit niedriger Kopiezahl oder eines mit hoher Kopiezahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopiezahl weist im Allgemeinen eine Kopiezahl im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 200, und typischerweise ungefähr 10 bis ungefähr 150, auf. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopiezahl enthält, weist vorzugsweise zumindest ungefähr 10 und bevorzugter zumindest etwa 20 auf. Es kann entweder ein Vektor mit hoher Kopiezahl oder einer mit niedriger Kopiezahl in Abhängigkeit von der Wirkung auf den Wirt des Vektors und der Polypeptide gewählt werden. Siehe z. B. Brake et al., s. o.
  • Alternativ dazu können die Expressionskonstrukte mit einem Integrationsvektor in das Hefe-Genom integriert werden. Integrationsvektoren enthalten typischerweise zumindest eine zu einem Hefe-Chromosom homologe Sequenz, welche die Integration des Vektors ermöglicht, und enthalten vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Siehe Orr-Weaver, Methods in Enzymol. 101, 228–245 (1983) und Rine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6750 (1983).
  • Typischerweise können extrachromosomale und integrierende Expressionsvektoren selektierbare Marker enthalten, um die Selektion von Hefestämmen zu ermöglichen, die transformiert worden sind. Selektierbare Marken können biosynthetische Gene umfassen, die im Hefewirt exprimiert werden können, wie z. B. ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7 und das G418-Resistenzgen, die den Hefezellen Resistenz gegen Tunicamycin bzw. G418 verleihen. Außerdem kann ein geeigneter selektierbarer Marken die Hefe mit der Fähigkeit ausstatten, in Gegenwart toxischer Verbindungen, wie z. B. Metall, zu wachsen. Beispielsweise erlaubt die Gegenwarf von CUP1 das Wachstum der Hefe in der Gegenwart von Kupferionen. Siehe Butt, Microbiol. Rev. 51, 351 (1987).
  • Alternativ dazu können einige der oben beschriebenen Komponenten zusammen in Transformationsvektoren gegeben werden. Transformationsvektoren umfassen typischerweise einen selektierbaren Marken, der entweder in einem Replikon erhalten oder wie oben beschrieben in einen integrierbaren Vektor entwickelt wird. Entweder extrachromosomale oder integrierende Expressions- und Transformationsvektoren sind zur Transformation in viele Hefen entwickelt worden. Beispielhafte Hefezelllinien sind Candida albicans (Kurtz, Mol. Cell Biol. 6, 142 (1986)), Candida maltosa (Kunze, J. Basic Microbiol. 25, 141 (1985)), Hansenula polymorpha (Gleeson, J. Gen. Microbiol. 132, 3459 (1986) und Roggenkamp, Mol. Gen. Genet. 202, 302 (1986)), Kluyveromyces fragilis (Das, J. Bacteriol. 158, 1165 (1984)), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt, J. Bacteriol. 154, 737 (1983) und Van den Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990)), Pichia guillerimondii (Kunze, J. Basic Microbiol. 25, 141 (1985)); Pichia pastoris (Cregg, Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978) und Ito, J. Bacteriol. 153, 163 (1983)), Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 300, 706 (1981)) und Yarrowia lipolytica (Davidow, Curr. Genet. 10, 380471 (1985) und Gaillardin, Curr. Genet. 10, 49 (1985)).
  • Verfahren zur Einführung exogener DNA in Hefewirte sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt und umfassen typischerweise entweder die Transformation von Sphäroblasten oder von intakten, mit Alkalikationen behandelten Hefezellen. Transformationsverfahren variieren für gewöhnlich mit den zu transformierenden Hefespezies. Siehe die im vorstehenden Abschnitt aufgezählten Publikationen zu geeigneten Transformationstechniken.
  • Außerdem kann das Gen oder ein Fragment davon in einem bakteriellen System exprimiert werden. In einem solchen System ist ein bakterieller Promotor jegliche DNA, die dazu fähig ist, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Stromab- (3'-) Transkription einer kodierenden Sequenz (z. B. eines gewünschten heterologen Gens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor weist üblicherweise eine Transkriptionsinitiationsregion auf, die für gewöhnlich proximal des 5'-Endes der kodierenden Se quenz platziert ist. Diese Transkriptionsinitiationsregion umfässt typischerweise eine RNA-Polymerasebindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle. Ein bakterieller Promotor kann auch eine zweite Domäne aufweisen, die Operator genannt wird, der eine benachbarte RNA-Polymerasebindungsstelle, an der die RNA-Synthese beginnt, überlappen kann. Der Operator ermöglicht eine negativ regulierte (induzierbare) Transkription, da ein Repressorprotein an den Operator binden und dadurch die Transkription eines spezifischen Gens hemmen kann. Konstitutive Expression kann in Abwesenheit negativer regulatorischer Elemente, wie z. B. des Operators, auftreten. Außerdem kann positive Regulation durch eine Genaktivator-Proteinbindungssequenz erzielt werden, die sich, falls vorhanden, für gewöhnlich proximal (5') der RNA-Polymerasebindungssequenz befindet. Ein Beispiel eines Genaktivatorproteins ist des Katabolitaktivatorprotein (CAP), das die Initiation der Transkription des lac-Operons in Escherichia coli (E. coli) unterstützt. Siehe Raibaud, Ann. Rev. Genet. 18, 173 (1984). Regulierte Expression kann daher entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder vermindert wird.
  • Sequenzen, die für Enzyme des metabolischen Stoffwechselweges kodieren, stellen besonders zweckdienliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen Promotorsequenzen, die sich von Zucker metabolisierenden Enzymen herleiten, wie z. B. Galactose, Lactose (lac) (siehe Chang, Nature 198, 1056 (1977)) und Maltose. Weitere Beispiele umfassen Promotorsequenzen, die sich von biosynthetischen Enzymen, wie z. B. Tryptophan (trp), herleiten (siehe Goeddel, Nuc. Acids Res. 8, 4057 (1981), Yelverton, Nuc. Acids Res. 9, 731 (1981), US-Patent Nr. 4.738.921 und EP-Patente Nr. 36.776 und 121.775). Das Lactomase- (bla-) Promotorsystem (siehe Weissmann, Interferon 3, I. Gresser (Hrsg.)), das Bakteriophagen-Lambda-PL-Promotorsystem (siehe Shimatake, Nature 292, 128 (128)) und das T5-Promotorsystem (US-Patent Nr. 4.689.406) stellen ebenfalls zweckdienliche Promotorsequenzen bereit.
  • Außerdem fungieren synthetische Promotoren, die nicht in der Natur auftreten, ebenfalls als bakterielle Promotoren. Beispielsweise können Transkriptionsaktivierungs sequenzen aus einem Bakterien- oder Bakteriophagen-Promotor mit den Operonsequenzen eines anderen Bakterien- oder Bakteriophagen-Promotors verknüpft werden, wodurch ein synthetischer Hybridpromotor, wie z. B. der tac-Promotor, erzeugt wird (siehe US-Patent Nr. 4.551.433, Amann, Gene 25, 167 (1983) und de Boer, Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 21 (1983)). Ein bakterieller Promotor kann natürlich auftretende Promotoren nicht-bakteriellen Ursprungs umfassen, welche die Fähigkeit aufweisen, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Ein natürlich auftretender Promotor nicht-bakteriellen Ursprungs kann mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Expressionslevel mancher Gene in Prokaryoten hervorzurufen. Das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase/Promotor-System ist dafür beispielgebend (siehe Studier, J. Mol. Biol. 189, 113 (1986) und Tabor, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 1074 (1985)).
  • Zusätzlich zu einer funktionsfähigen Promotorsequenz ist eine effiziente Ribosombindungsstelle zur Expression der DNA-Sequenz oder eines Fragments davon in Prokaryoten ebenfalls zweckdienlich. In E. coli wird die Ribosombindungsstelle Shine-Dalgarno- (SD-) Sequenz genannt und umfasst ein Initiationscodon (ATG) und eine 3–9 Nucleotide lange Sequenz, die 3–11 Nucleotide stromauf des Initiationscodons lokalisiert ist (siehe Shine, Nature 254, 334 (1975)). Von der SD-Sequenz wird angenommen, dass sie die Bindung von mRNA an das Ribosom durch die Paarung von Basen zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der 16S-rRNA von E. coli fördert (siehe Steitz, Biological Regulation and Development: Gene Expression, R. F. Goldberger (Hrsg.) (1979)).
  • Die neuen Toledo- oder Towne-Proteine der Erfindung können intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt an eine neue Toledo- oder Towne-DNA-Sequenz, ein Analogon oder Fragment davon gebunden werden, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure des N-Terminus immer ein Methionin ist, das vom ATG-Startcodon kodiert wird. Wenn gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus durch In-vitro-Inkubation mit Bromcyan oder entweder durch In-vivo- oder durch In vitro-Inkubation mit einer bakteriellen N-terminalen Methionin-Peptidase vom Protein abgespalten werden. Siehe EP-Patent Nr. 219.237.
  • Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression bereit. Typischerweise wird eine DNA-Sequenz, die für den N-terminalen Abschnitt eines endogenen bakteriellen Proteins oder eines anderen stabilen Proteins kodiert, an das 5'-Ende von heterologen kodierenden Sequenzen fusioniert. Bei Expression sorgt dieses Konstrukt üblicherweise für eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. Zum Beispiel kann das Bakteriophagen-Lambda-Zell-Gen an den 5'-Terminus eines Sequenzfragments davon gebunden und in Bakterien exprimiert werden. Das resultierende Fusionsprotein behält vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym (Faktor Xa) bei, um das Bakteriophagenprotein von der Sequenz oder vom Fragment davon abzuspalten (siehe Nagai, Nature 309, 810 (1984)). Fusionsproteine können auch mit Sequenzen aus dem lacZ-Gen (Jia, Gene 60, 197 (1987)), dem trpE-Gen (Allen, J. Biotechnol. 5, 93 (1987) und Makoff, J. Gen. Microbiol. 135, 11 (1989)) und dem Chey-Gen (EP-Patent Nr. 324.647) hergestellt werden. Die DNA-Sequenz an der Verknüpfungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann für eine spaltbare Stelle kodieren oder auch nicht. Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region hergestellt, die vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym beibehält (z. B. Ubiquitinspezifische Prozessierungs-Protease), um das Ubiquitin vom Polypeptid abzuspalten. Über dieses Verfahren können reife Towne- oder Toledo-Polypeptide isoliert werden. Siehe Miller, Bio/Technology 7, 698 (1989).
  • Alternativ dazu können Proteine und Polypeptide auch durch Erzeugung chimärer DNA-Moleküle aus der Zelle sekretiert werden, die für ein Fusionsprotein kodieren, das ein Signalpeptidsequenzfragment umfasst, das für die Sekretion der Proteine oder Polypeptide in Bakterien sorgt. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 4.336.336.) Das Signalsequenzfragment kodiert typischerweise für ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der sich zwischen innerer und äußerer Membran der Zelle befindet (Gram-negative Bakterien), ausgeschieden. Vorzugsweise liegen Prozessierungsstellen vor, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können und zwischen Signalpeptidfragment und Protein oder Polypeptid kodiert sind.
  • DNA, die für geeignete Signalsequenzen kodieren, können von Genen für sekretierte bakterielle Proteine, wie z. B. das Außenmembranprotein-Gen von E. coli (ompA) (Masui, Experimental Manipulation of Gene Expression (1983) und Ghrayeb, EMBO J. 3, 2437 (1984)) und die Signalsequenz der Alkalischen Phosphatase von E. coli (phoA) (siehe Oka, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 7212 (1985)) hergeleitet werden. Die Signalsequenz des Alpha-Amylase-Gens aus verschiedenen Bacillus-Stämmen kann verwendet werden, um heterologe Proteine aus B. subtilis zu sekretieren (siehe Palva, Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 5582 (1982) und EP-Patent Nr. 244.042).
  • Von Bakterien erkannte Transkriptionsterminationssequenzen sind 3' des Translationscodons lokalisierte Regulationssequenzen. Gemeinsam mit dem Promotor flankieren sie die kodierende Sequenz. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das von der DNA-Sequenz kodierte Towne- oder Toledo-Protein oder Polypeptid translatiert werden kann. Transkriptionsterminationssequenzen umfassen häufig DNA-Sequenzen von ungefähr 50 Nucleotiden, die in der Lage sind, Bäumchenstrukturen zu bilden, welche die Termination der Transkription unterstützen. Beispiele umfassen Transkriptionsterminationssequenzen, die sich von Genen mit starken Promotoren, wie z. B. dem trp-Gen in E. coli sowie anderen biosynthetischen Genen, herleiten.
  • Typischerweise werden Promotor, Signalsequenz (falls erwünscht), kodierende Sequenz von Interesse und Transkriptionsterminationssequenz in einem extrachromosomalen Element (z. B. einem Plasmid) erhalten, das zur stabilen Erhaltung im bakteriellen Wirt fähig ist. Das Plasmid weist üblicherweise ein Replikationssystem auf, was folglich seine Erhaltung im bakteriellen Wirt entweder für Expression oder für Klonierung und Amplifikation ermöglicht. Außerdem kann das Plasmid entweder ein Plasmid mit hoher Kopiezahl oder eines mit niedriger Kopiezahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopiezahl weist im Allgemeinen eine Kopiezahl im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 200 und typischerweise ungefähr 10 bis ungefähr 150 auf. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopiezahl enthält, enthält für gewöhnlich vorzugsweise zumindest ungefähr 10 und bevorzugter zumindest ungefähr 20 Plasmide.
  • Alternativ dazu können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das bakterielle Genom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten typischerweise zumindest eine Sequenz, die zum bakteriellen Chromosom homolog ist, welche die Integration des Vektors ermöglicht. Integrationen scheinen aus der Rekombination zwischen der homologen DNA im Vektor und dem bakteriellen Chromosom zu resultieren. Siehe EP-Patent Nr. 127.328.
  • Typischerweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion bakterieller Stämme zu ermöglichen, die transformiert worden sind. Selektierbare Marker können im bakteriellen Wirt exprimiert werden und können Gene umfassen, welche die Bakterien gegen Arzneimittel, wie z. B. Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin, resistent machen (siehe Davies, Ann. Rev. Microbiol. 32, 469 (1978)). Selektierbare Marker können auch biosynthetische Gene, wie z. B. jene in den Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthesewegen, umfassen.
  • Alternativ dazu können manche der oben beschriebenen Komponenten gemeinsam in Transformationsvektoren gegeben werden. Transformationsvektoren umfassen typischerweise einen selektierbaren Marker, der wie oben beschrieben entweder in einem extrachromosomalen Vektor oder einem integrierenden Vektor erhalten wird.
  • Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale oder integrierende, sind für die Transformation in zahlreiche Bakterien entwickelt worden. Beispielgebend sind die Expressionsvektoren, die in Palva, Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 5582 (1982), EP-Patenten Nr. 036.259 und 063.953 und PCT-Patent WO 84/04541 (für B. subtilis); in Shimatake, Nature 292, 128 (1981), Amann, Gene 40, 183 (1985), Studier, J. Mol. Biol. 189, 113 (1986) und EP-Patenten Nr. 036.776, 136.829 und 136.907 (für E. coli); in Powell, Appl. Environ. Microbiol. 54, 655 (1988) und US-Patent Nr. 4.745.056 (für Streptococcus) offenbart sind.
  • Verfahren der Einführung exogener DNA in bakterielle Wirte sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt und umfassen typischerweise die Transformation von entweder mit CaCl2 oder anderen Mitteln, wie z. B. zweiwertigen Kationen und DMSO, behandelten Bakterien. DNA kann auch durch Elektroporation in bakterielle Zellen eingeführt werden. Beispielhafte Verfahren finden sich in Masson, FEMS Microbiol. Lett. 60, 273 (1989), Palva, Proc. Natl. Acad. Sci 79, 5582 (1982), EP-Patenten Nr. 036.259 und 063.953 und PCT-Patent Nr. WO 84/04541 für Bacillus-Transformation. Zur Campylobacter-Transformation siehe z. B. Miller, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 856 (1988), und Wang, J. Bacteriol. 172, 949 (1990). Für E. coli siehe z. B. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. 69, 2110 (1973), Dower, Nucl. Acids Res. 16, 6127 (1988), Kushner, Genetic Engineering: Proceedings of the international Symposium on Genetic Engineering, H. W. Boyer und S. Nicosia (Hrsg.), Mandel, J. Mol. Biol. 53, 159 (1970) und Taketo, Biochem. Biophys. Acta 949, 318 (1988). Für Lactobacillus und Pseudomonas siehe z. B. Chassy, FEMS Microbiol. Lett. 44, 173 (1987), bzw. Fiedler, Anal. Biochem. 170, 38 (1988). Für Streptococcus siehe z. B. Augustin, FEMS Microbiol. Lett. 66, 203 (1990), Barany, J. Bacteriol. 144, 698 (1980), Harlander, Streptococcal Genetics, J. Ferretti und R. Curtiss III (Hrsg.) (1987), Perry, Infec. Immun. 32, 1295 (1981), Powell, Appl. Environ. Microbiol. 54, 655 (1988) und Somkuti, Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1, 412 (1987).
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele illustriert.
  • Materialien und Verfahren
  • A. Zellen und Virus
  • Human-CMV-Stämme AD169, Towne und Toledo wurden von E. S. Mocarski (Stanford University) erhalten und wurden für alle Experimente verwendet. Zwei dieser Stämme sind auch über ATCC, Hinterlegungsnummern VR-538 (AD169) und VR-977 (Towne), erhältlich. Das Virus wurde in Kulturen aus Vorhaut-Fibroblasten- (HF-) Zellen gezüchtet, und zwar mit Dulbecco's Modified-Eagle's-Medium (DME) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) wie früher in Spaete und Mocarski, J. Virol. 56, 135–43 (1985), beschrieben, jedoch ergänzt mit 10% Fötalkälberserum (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS), L-Glutamin (2 mM), Penicillin (100 Units/ml), Streptomycin (0,1 mg/ml) und Pyruvat (1 mM). Um CMV-DNAs der AD169-, Towne- und Toledo-Stämme durch Zentrifugation zum Gleichgewicht an NaI-Gradienten wie früher in Spaete und Mocarski, J. Virol. 54, 817–24 (1985), beschrieben herzustellen, wurden Rollflaschen mit den CMV-Stämmen in einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,001 Plaque-bildenden Einheiten (pfu)/Zelle infiziert, um die Produktion defekter Virusteilchen zu minimieren. Die infizierten Zellen wurden vier Tage nach der Infektion mit frischem Medium versorgt. Acht Tage nach der Infektion, als der Zell-Monolayer gut infiziert war, wurden die Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen in 10 ml Medium je Rollflasche geschabt und bei 1.000 Umdrehungen pro Minute (Upm) für 10 Minuten pelletiert. Die Pellets wurden in 2,0 ml 0,01 M Tris und 0,01 EDTA (TE) (pH 7,4) mit 1% NP40, 1% Desoxycholat resuspendiert und auf Eis inkubiert, bis alle Zellkerne bei Betrachtung unter dem Mikroskop lysiert waren. Die Lysate wurden in ein 2059-Röhrchen (Falcon) transferiert und bei 2.600 Upm für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
  • Die Überstände wurden in ein anderes 2059-Röhrchen transferiert, und es wurden 50 μg/ml RNAse (Worthington, DNase-frei) zugegeben, unmittelbar gefolgt von Proteinase K (200 μmg/ml) und 1% Natriumdodecylsulfat (SDS). Die Überstände wurden in einem Wasserbad bei 65°C für 60 Minuten inkubiert, mit TE (pH 7,4) auf 16 ml gebracht und zu 24 ml gesättigtem NaI und 0,15 ml Ethidiumbromid (5 mg/ml) zugegeben. Die Proberi wurden bei 55.000 Upm bei 20°C für 24 Stunden in einem Beckman Ti70-Rotor bis zum Gleichgewicht zentrifugiert. Virale DNA enthaltende Fraktionen wurden mit in TE äquilibriertem Butanol unter sanftem Schwenken extrahiert, gefolgt von Zentrifugation bei 3.000 Upm für 10 Minuten bei 20°C, und sie wurden nochmals 2- bis 3-mal mit Butanol extrahiert, um das Volumen zu verringern. Die Proben wurden mit einem gleichen Volumen von mit TE äquilibriertem Isoamylalkohol extrahiert, zentrifugiert und nochmals extrahiert. Die DNA wurde drei Mal gegen TE mit 1% Phenol und 1 M NaCl dialysiert. Die OD260 und OD280 wurden gemessen, um die Reinheit der AD169-, Toledo- und Towne-DNA zu bestimmen.
  • Klinische Isolate wurden von M. Fiala (Rancho Mirage, CA) und S. Chou (Oregon Health Sciences University) erhalten. Die schnelle Isolierung viraler DNA HCMV-infizierter Zellen wurde wie vorher in Spaete und Frenkel, Cell 30, 295–304 (1982), beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die DNA vor der Reinigung nicht radioaktiv markiert wurde. Kurz gesagt wurden infizierte Zell-Monolayer (25 cm2-Flaschen) zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und in 1,0 ml einer Lösung von 0,1 M NaCl, TE, pH 8,0, 0,05% SDS und 0,1 mg/ml Proteinase K lysiert. Die Lysate wurden 2–24 Stunden bei 37°C inkubiert, zweimal mit 1 Volumen Phenol, 1 Volumen Chloroform extrahiert, gefolgt von Zentrifugation bei 2.500 Upm für 5 Minuten, um die Phasen zu trennen. Die wässrige Phase wurde zweimal mit 1 Volumen Ether extrahiert und die DNA mit 0,1 Volumina 3 M NaAC und zwei Volumina Ethanol oder Isopropanol präzipitiert. Die DNA wurde gekühlt, mittels Zentrifugation gesammelt oder an einem Glasstab aufgewickelt, getrocknet und in TE resuspendiert.
  • B. Plasmid-DNA
  • Die Plasmide pXbaI E, pXbaI T und pXbaI Q (Thomsen und Stinski (1981)), welche die Towne-Stamm-Karteneinheiten 0,69 bis 0,8 repräsentieren, wurden von M. Stinski (University of Iowa) erhalten.
  • Klon 65 wurde durch Klonierung eines Gel-extrahierten BamHI-verdauten Toledo-DNA-Fragments in die BamHI-Stelle des Plasmids pGEM®-3Zf+ (Promega, Madison, WI) hergeleitet. Zusammenfassend wurden fünf μg Toledo-DNA mit 40 Units BamHI verdaut und in einem präparativen 1%igen Niedrigschmelzpunkt-Agarosegel für 490 Voltstunden in 1 × TAE-Puffer der Elektrophorese, unterzogen. Toledo-DNA, die bei ca. 5 Kilobasenpaaren (kbp) wanderte, wurde herausgeschnitten und die Agarose mit 2 Units β-Agarase I (New England BioLabs, Beverly, MA) verdaut. Dieses DNA-Fragment wurde mit 2 Volumina Isopropanol präzipitiert, auf 20°C abgekühlt, in einer Eppendorf-Zentrifuge für 15 Minuten zentrifugiert, getrocknet und in 50 μl TE resuspendiert. Das Gel-extrahierte Fragment wurde an BamHI-verdautes pGEM®-3Zf+ unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England BioLabs, Beverly, MA) ligiert und ein Aliquot des Ligationsgemisches verwendet, um kompetente Escherichia coli XL-1-Blues (Stratagene, La Jolla, CA) mittels Calciumschockverfahren (Mandel und Higa (1970)) oder mittels Elektroporation unter Anwendung der im Pulse Controller Guide von BioRad (Richmond, CA) publizierten Verfahren zu transformieren.
  • Cosmid 1 ist ein ungefähr 53 kbp großes, teilweise verdautes HindIII-Fragment der Toledo-DNA, das sich über 0,69 bis 0,87 Karteneinheiten erstreckt, die in das von E. S. Mocarski (Stanford University) erhaltene Cosmid pHC79 (Hohn und Collins (1980)) kloniert sind. Aus Cosmid 1 wurden die Folgenden subkloniert:
    Klone 4 und C1300 wurden durch Klonieren BamHI-verdauter Fragmente des in einen Bluescript-M13+-Plasmidvektor klonierten Cosmids 1 hergeleitet. Als solche stellen diese Klone Toledo-DNA-Sequenz-umspannende Abschnitte des Cosmids 1 dar.
  • Klon C23K wurde als vollständiges BamHI-verdautes Fragment von Cosmid-1-DNA hergeleitet und durch Ligation zirkularisiert.
  • C. Herstellung radioaktiv markierter Sonden und Hybridisierung
  • Plasmid- oder vitale DNA wurde mittels Nick-Translation (Rigby et al. (1977)) mit einem Set (Boehringer Mannheim) unter Verwendung von [α32P]dCTP (Amersham Corp.) radioaktiv markiert. Hybridisierungen an immobilisierte CMV-DNA wurde im Wesentlichen wie von Spaete und Mocarski, J. Virol. 54, 817–24 (1985), beschrieben durchgeführt, jedoch bei 68°C in einer Lösung von 6 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl plus 0,015 M Natriumcitrat), 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll, 0,2% Rinderserumalbumin und 0,1% Natriumdodecylsulfat, wobei die Menge an Lachsspermien-DNA von 25 μg/ml auf 100 μg/ml geändert und 30% Formamid auf 15% verringert wurde.
  • Die DNA wurde nach Restriktionsenzymverdau und Elektrophorese in 1%igen Agarosegelen mittels Standardtechniken (Maniatis et al. (1982)) auf Hybond-N+-Nylontransfermembranen (Amersham Corp.) übertragen. Die DNA wurde mit 120.000 Mikrojoule/cm2 UV-Bestrahlung unter Verwendung eines UV Crosslinker 1000 (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) an die Membran vernetzt. Die Membranen wurden 1 Stunde bei 68°C in Lösung A (6 × SSC, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,1% Natriumdodecylsulfat, 100 μg/ml Lachsspermien-DNA und 15% Formamid) vorhybridisiert, und dann wurde Nicktranslatierte [α32P]-markierte Sonde in einer 100 μg/ml Lachsspermien-DNA enthaltenden Lösung durch Aufkochen für fünf Minuten denaturiert, auf Eis schockgefroren, der Membran zugegeben und über Nacht bei 68°C hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde nicht anellierte Sonde durch dreimaliges Spülen der Membran drei Mal mit 2 × SCC entfernt, gefolgt von Inkubation in Lösung A ohne Lachsspermien-DNA bei 68°C für 15 Minuten. Der Waschvorgang wurde wiederholt, der Blot mit einer großen Menge 2 × SCC bei Raumtemperatur gespült, die Membran luftgetrocknet und mittels Kodak-X-AR-Film autoradiographiert.
  • D. Bestimmung und Analyse der Nucleotidsequenz
  • Alle Nucleotidsequenzen wurden mittels Didesoxynucleotid-Kettenterminationsverfahren (Sangen et al. (1977)) bestimmt. Eine Reihe von Templaten wurde zur Sequenzierung hergestellt; sie umfassten einzelsträngige Phagen-DNA, doppelsträngige Plasmid- und Cosmid-DNA, genomische Virus-DNA und PCR-Produkte. Manuelle und automatische Sequenzierung (mit einem ABI-373A-Gerät) wurden eingesetzt. Es wurden Einzyklus- sowie Mehrzyklus-Sequenzierungsprotokolle verwendet. Die Se quenz wurde für beide Stränge bestimmt. Mehrdeutige Regionen wurden nach Korrekturlesen durch weitere Sequenzierung korrigiert. Die zur Sequenzierung verwendeten Primer wurden an einem ABI-392-Gerät (Applied Biosystems) synthetisiert. „Contig" und Analyse der Sequenz wurde mittels MacDNASIS (Hitachi) durchgeführt. Die Homologie-Suchen wurden mittels BLAST-Programm durch NCBI Services durchgeführt.
  • Beispiel 1: Identifizierung neuer Sequenzen in den Genomen von CMV-Towne- und -Toledo-Stamm-Isolaten
  • Um die Kreuzdarstellung von DNA-Sequenzen in den Towne- und Toledo-Stämmen von CMV zu bestimmen, wurde virale DNA aus jedem Stamm vollständig mit XbaI, ClaI, BamHI, BgIII, EcoRI und HindIII verdaut. Nach Elektrophorese über ein 1%iges Agarosegel wurden die CMV-DNAs in 0,2 M NaCl/0,6 M NaOH denaturiert, in 0,6 M NaCl/1 M Tris, pH 7,5, in situ neutralisiert und das Gel in 20 × SCC für 30 Minuten getränkt. Stereo-Blots wurden hergestellt, indem Hybond-N+-Nylonmembranen (Amersham Corp.) identischer Größe auf beide Seiten des Gels aufgegeben und die DNAs in beide Richtungen mittels Kapillarwirkung von Papiertüchern transferiert wurden. Nach dem Blotten über Nacht in 20 × SCC wurden die Membranen in 2 × SSC gewaschen und durch UV-Bestrahlung wie oben beschrieben immobilisiert.
  • DNA-Sonden von Towne- und Toledo-DNA mit einer durchschnittlichen Größe von 500 bp wurden durch Ultraschallbehandeln von 10 μg jeder DNA in einem 2063-Röhrchen (Falcon Plastics) mittels 4 Pulsen von je 10 Sekunden bei Einstellung 3 an einem Ultraschallgerät von Heat Systems Inc. (Farmingdale, NY) hergestellt. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die viralen DNAs mit den Restriktionsenzymen AvaI, BanI und BfaI verdaut, um die Größenkomplexität der Sonden-DNA weiter zu vermindern. Diese Enzyme wurden ausgewählt, weil eine Suche der AD169-DNA-Datenbasensequenzen (EMBL-Hinterlegungsnummer X17403) reichlich vorhandene Spaltstellen erkennen ließ (326, 386 bzw. 341); ihre Restriktionsenzymverdauungspuffer kompatibel sind und ihre nicht Stellen überlappen. Mit Ethidiumbromid gefärb te Gele der auf diese Weise hergestellten abgeschnittenen vitalen DNAs zeigten eine Reihe von DNA-Größen von 1.300 bp bis zu weniger als 100 bp, wobei der Großteil der DNA bei ungefähr 300 bp migrierte, wie durch Comigration mit HaeIII-verdautem ∅X174-DNA-Standardmarker (New England BioLabs, Beverly, MA) beurteilt wurde. Die Towne- und Toledo-abgeschnittene Sonden-DNA wurden dann unter Verwendung von [α32P]dCTP (Amersham Corp.) wie oben beschrieben Nick-translatiert, und es wurde jede Sonde auf Stereo-Blots immobilisierter, restriktionsenzymverdauter Towne- und Toledo-DNAs aufgegeben. Nach Hybridisierung und Autoradiographie wurden die Hybridisierungsmuster analysiert, um die Fragmente an jedem DNA-Profil zu ermitteln, die nicht mit der heterologen Stamm-Sonde, jedoch mit der homologen Stamm-Sonde hybridisierten. Beispielsweise offenbarte der Verlust eines Signals für die markante 5-kbp-Bande am BamHI-Verdau von Toledo-DNA bei Verwendung der Towne-Sonde, die vorhanden war, wenn Toledo-DNA verwendet wurde, um diese selbst zu sondieren, eine Region von Sequenzdivergenz zwischen den beiden Isolaten (siehe 3).
  • Dieses 5-kbp-Fragment wurde durch Gelextraktion wie oben beschrieben kloniert und Klon 65 genannt. Die Klon-65-Toledo-DNA wurde vollständig sequenziert und mit der Towne-DNA-Sequenz verglichen, die aus dem pXbaI-T-Klon, der sich als divergent von AD169-DNA-Sequenzen erwiesen hat (siehe Beispiel 2 unten), erzeugt wurden. Die vollständige Sequenz von Klon 65 ist in 1 gezeigt. In 1 beginnt Klon 65 mit Nucleotid 4664 und endet mit Nucleotid 9327. Überraschenderweise teilten die DNA aus dem pXbaI-T-Klon der Towne-DNA (1.856 bp) und Klon 65 der Toledo-DNA (4.668 bp) 104 bp Sequenzidentität. Der kleine Abschnitt von Sequenzhomologie ermöglichte die Kartierung der Region der Toledo-DNA-Divergenz zur Grenze der Unique-Long- (UL-) Komponente und der invertierten Wiederholungen (alternativ IRL- oder b'-Sequenzen genannt) auf den AD169- und Towne-DNA-Karten. Diese neu isolierten Toledo-Stamm-Nucleotidsequenzen aus Klon 65 waren im Referenz-Laborstamm AD169, der von Chee und Mitarbeitern vollständig sequenziert worden ist (EMBL-Hinterlegungsnummer X17403), nicht vorhanden.
  • Beispiel 2: Identifizierung neuer Sequenzen im Genom von CMV-Towne, die im Referenzstamm AD169 nicht auftreten
  • Es ist eine DNA-Sequenzheterogenität zwischen Towne-Stamm und AD169-Stamm gefunden worden. Siehe Pritchett, J. Virology 36, 152–61 (1980). Obgleich der grobe strukturelle Aufbau des CMV-Genoms ermittelt worden ist und Stamm-zu-Stamm-Restriktionsstellenpolymorphismen für viele Stämme kartiert worden sind, sind jedoch Stamm-zu-Stamm-Unterschiede auf der Nucleotid-Ebene nicht ermittelt worden. Der Laborstamm AD169 war das erste CMV-Isolat, das sequenziert worden ist, und hat als Referenzstamm bei der genauen Bestimmung der genetischen Komplexität des CMV-Genoms gedient.
  • Um Nucleotidsequenz-Unterschiede zwischen Towne und AD169 zu untersuchen, konzentrierten sich die Erfinder auf diejenige Region, die sich im Toledo-Stamm als divergent erwiesen hat, d. h. die Grenze zwischen UL-Komponente und den b'-Sequenzen, wie in Beispiel 1 ausführlich erklärt ist. Plasmid pXbaI T wurde unter Verwendung des NEBlotTM-PhototypeTM-Detektionssets (New England Biolabs, Beverly, MA) markiert und als Sonde an Blots immobilisierter restriktionsenzymverdauter Towne-, Toledo- und AD169-DNAs verwendet. Zusammenfassend wurde pXbaI T mit PvuII linearisiert, in Ethanol präzipitiert und in 34 μl nucleasefreiem Wasser resuspendiert. Das Plasmid wurde in siedendem Wasser für fünf Minuten denaturiert, für fünf Minuten auf Eis schockgekühlt und kurz bei 4°C zentrifugiert. Die folgenden Reagenzien wurden dem Röhrchen in der aufgezählten Reihenfolge zugegeben: 10 μl 5 × Markierungsgemisch, 5 μl dNTP-Gemisch, 1 μl DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment). Das Gemisch wurde bei 37°C für 6 Stunden inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 5 μl 0,2 M EDTA, pH 8,0, terminiert. Die Sonde wurde durch Zugeben von 5 μl 4 M LiCl und 150 μl Ethanol, Abkühlen auf –80°C für 30 Minuten präzipitiert, in einer Eppendorf-Zentrifuge pelletiert, mit 70% Ethanol gewaschen und in 20 μl des vom Set bereitgestellten Resuspensionspuffers resuspendiert. Die Hybridisierungsreaktion war im Wesentlichen die oben beschriebene, mit der Ausnahme, dass die Membran nach der Hybridisierung zweimal in 2 × SCC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten gewaschen wurde, gefolgt von zwei Waschvorgängen in 0,1 × SCC, 0,1% SDS bei 68°C für 15 Minuten. Die Detektionsreaktionen binden die biotinylierten Sonden an Alkalische Phosphatase über eine Streptavidin-Brücke, und die hybridisierte Sonde wurde durch Spaltung des Lumigen-PPD-Substrats sichtbar gemacht. Die Blockierungsschritte, Streptavidin-Inkubation, Inkubation mit Alkalischer Phosphatase und Lumigen-PPD-Reaktion wurden wie im Set-Handbuch beschrieben durchgeführt. Die Belichtung von Kodak-XAR-Film mit den Blots zeigte, dass wie erwartet (i) ein XbaI-verdautes Fragment von 1,85 kbp (XbaI T) an mit pXbaI-T-sondierte Towne-DNA hybridisierte und (ii) ein comigrierendes, XbaI-verdautes Fragment in Toledo-DNA vorhanden war. Die AD169-DNA zeigte keinerlei Hybridisierungssignal an irgendwelchen der Restriktionsenzymverdau-Muster. Die Nucleotidsequenz von pXbaI T bestätigte das vollständige Fehlen von Identität der Towne-DNA und AD169-DNA. Die Nucleotidsequenzierung der Cosmid 1-DNA (B. Plasmid-DNA in Materialien und Verfahren, siehe oben) aus Toledo zeigte eine umfassende Sequenzidentität zwischen der neu identifizierten Towne-DNA und der Toledo-DNA von Cosmid 1 in dieser Region. Überraschenderweise war die Orientierung der Sequenz in Toledo relativ zu Towne invertiert.
  • Beispiel 3: Identifizierung neuer Toledo-DNA-Sequenzen in den Genomen neuerer klinischer Isolate, die im Referenzstamm AD169 nicht auftreten
  • Um die Durchdringung der durch Klon 65 repräsentierten Sequenzen in neueren klinischen Isolaten zu ermitteln, wurden fünf repräsentative klinische Isolate (HCMVF, C128, C354, C793 und C980) mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI gemeinsam mit den wie oben im Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben hergestellten Toledo-, Towne- und AD169-DNAs verdaut, der Agarose-Elektrophorese unterzogen, auf eine Hybond-N+-Nylontransfermembran übertragen und mit dem Nick-translatiertem [α32P]-markiertem Klon 65 gemäß den im Abschnitt Materialien und Verfahren dargelegten Verfahren sondiert. Wie in 4 zu erkennen ist, zeigten die Autoradiographien, dass Homologie in allen der klinischen Isolate detektiert wurde. In 4 ist eine Bande bei etwa 5 kbp in Lane 1 sichtbar (die Toldeo-DNA), die in Towne-DNA auftritt (Lane 2), in Lane 3 fehlt (die AD169-DNA) und in Lanes 4 bis 8 sichtbar ist (die klinischen Isolate HCMVF, C128, C354, C793 und C980). Diese Ergebnisse beweisen, dass die im Toledo-Stamm von HCMV gefundene, neu isolierte Sequenz auch in den neueren klinischen Isolaten, nicht jedoch im AD169-Referenzstamm vorhanden ist. Die Nucleotidsequenzanalyse offenbart, dass der Grund für das schwache Hybridisierungssignal gegen das Towne-DNA-Fragment das Vorliegen von nur 151 Nucleotiden Sequenzidentität mit Towne-DNA ist. Die gemeinsamen 104-bp-Sequenzidentität in Beispiel 1 ist für ein schwaches Hybridisierungssignal gegen XbaI-„T"-klassierte Fragmente aus Towne- sowie Toledo-DNAs verantwortlich, die in den XbaI-Verdauungen zu sehen ist (Lanes 9 und 10). Der XbaI-Verdau der klinischen Isolate (Lanes 12 bis 16) zeigen auch Hybridisierung an mehrere hochmolekulare Banden. Die Analyse dieser und anderer Genome der klinischen Isolate mit anderen Sonden in dieser Region hat gezeigt, dass die gemeinsamen Sequenzen in einigen Isolaten relativ zur Orientierung im Toledo-Stamm in invertierter Orientierung vorliegen könnten.
  • 6 ist eine schematische Darstellung der relativen Positionen der neuen, in genomischer Toledo-DNA identifizierten Sequenzen, genomischer Towne-DNA im Vergleich zu genomischer AD169-Stamm-DNA. Die gestrichelten Linien grenzen die Region des Genoms ab, wo sich homologe und divergente Sequenzen finden. Die oberste Linie stellt eine Toledo-DNA-Restriktionskarte dar, die BamHI- (mit „B" gekennzeichnet) und XbaI- (durch „X" gekennzeichnet) Restriktionsenzymstellen zeigt, die sich zwischen den durch verkehrte Dreiecke gekennzeichneten Nucleotiden 175068 und 188843 (nummeriert in Bezug auf die AD169-DNA-Sequenz – EMBL-Hinterlegungsnummer X14703) Homologie-Bruchstellen erstrecken. Die Subklone 4, 1300, C23K und 65 der Toledo-DNA-Sequenz sind in Kästchen über der Karte gezeigt. Eine invertierte Homologieregion bezüglich Towne ist durch die verkehrten Dreiecke zwischen den Nucleotiden 178221 und 175082 gekennzeichnet. Einzigartige Sequenzen sind durch eine dünne Linie und invertierte Wiederholungssequenzen durch starke Linien, b'a'c', gekennzeichnet. Das Ende der c'-Wiederholungen ist mit einem Pfeil am Nucleotid 191412 gekennzeichnet. Die mittlere Linie stellt eine Towne-DNA-Restriktionskarte dar, die BamHI- (B) und XbaI- (X) Restriktionsenzymstellen, wie oben für Toledo beschrieben, und XbaI-Klone E, T und Q in Kästchen darunter zeigt. Schattierte Flächen zeigen homologe Regionen, die mit Toledo-DNA geteilt werden, jedoch in ihrer Orientierung invertiert sind. Die gezeigten Nucleotid-Zahlen sind mit Bezug auf die AD-169-DNA-Sequenz gezeigt. Unbestimmte Ausdehnung von b'-Wiederholungssequenzen im Towne-Stamm ist durch dünne Linien an der AD169-Stamm-Nucleotidreferenz 180034 gekennzeichnet. Die Linie am unteren Ende illustriert das in Prototyp-Orientierung dargestellte AD169-Genom. Einzigartige Sequenzen sind durch eine dünne Linie dargestellt und invertierte Wiederholungen der langen (UL) und kurzen (UL) Komponenten sind durch Boxen, ab-b'a' und a'c'-ca, gekennzeichnet. Die α-Sequenz ist eine terminale direkte Wiederholung mit einer invertierten Kopie (α') ab der Verbindungsstelle der langen und kurzen Komponenten. Die Länge der AD169-DNA-Sequenz ist als 229354 Nucleotide gekennzeichnet, und die Kartenposition der inneren Wiederholungen ist mit Nucleotid-Referenznummern und Pfeilen gekennzeichnet.
  • Beispiel 4: Analyse der offenen Leseraster der neuen Toledo- und Towne-DNA-Sequenzen
  • Die neuen Toledo- und Towne-Sequenzen kodierten für potentielle offene Leseraster (ORFs). Unter Verwendung eines willkürlich gewählten Parameters von 10 Kilodalton als das minimale berechnete Proteinmolekulargewicht wurden 36 ORFs in der neuen Toledo-Sequenz und insgesamt 4 ORFs in der neuen Towne-Sequenz identifiziert. Die mutmaßlichen Aminosäuresequenzen dieser ORFs sind in der Sequenzauflistung dargelegt (Seq.-ID Nr. 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 und 27). 5 zeigt eine schematische Darstellung dieser ORFs in den neuen Toledo- und Towne-DNA-Sequenzen gemeinsam mit vorher publizierten AD169-ORFs der entsprechenden Region. Diesen ORFs wurden Namen zugeordnet, beginnend von UL133 als erstes ORF an der linken Seite des UL in der Toledo-Sequenz. Dem ersten ORF in der neuen Towne-Sequenz, von dem festgestellt wurde, dass es in der hierin offenbarten neuen Toledosequenz zugegen ist, wurde der Name UL147 zugeteilt. Von UL130 und UL132 in AD169 wurde ermittelt, dass in der neuen Toledo-Sequenz vorhanden sind. Außerdem wiesen UL153 und UL154 Regionen mit Homologie zu IRL14 bzw. IRL12 auf. Alle ORFs wurden in den nicht-redundanten NCBI-Datenbanken unter Anwendung des BLASTP-Programms auf homologe Sequenzen durchsucht. Unter allen durchsuchten ORFs identifizierte nur UL132 ein Homolog in der Datenbank, wobei es sich um HCMV mtrIII (GenBank-Hinterlegungsnummer X75606) handelte, das 76% Identität auf der Aminosäureebene aufwies. Der ausgefüllte Kreis kennzeichnete die ORFs, welche die potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellensequenz N-X(-P)-S/T aufwiesen. Diese potentiellen Glykoproteine könnten als antigene oder immunogene Moleküle biologisch von Bedeutung sein.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (18)

  1. Isolierte DNA-Sequenz, umfassend: (a) eine DNA-Sequenz, die der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 6 entspricht; (b) eine DNA-Sequenz, die der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 entspricht; oder (c) eine DNA-Sequenz, die der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 6 in umgekehrter Ausrichtung entspricht.
  2. Isolierte DNA-Sequenz, die einen vollständigen offenen Leseraster von menschlichem Cytomegalovirus umfasst, worin der offene Leseraster für ein Protein mit einer in Seq.-ID Nr. 2, Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5, Seq.-ID Nr. 7, Seq.-ID Nr. 8, Seq.-ID Nr. 9, Seq.-ID Nr. 10, Seq.-ID Nr. 11, Seq.-ID Nr. 12, Seq.-ID Nr. 13, Seq.-ID Nr. 14, Seq.-ID Nr. 15, Seq.-ID Nr. 16, Seq.-ID Nr. 17, Seq.-ID Nr. 18, Seq.-ID Nr. 19, Seq.-ID Nr. 20, Seq.-ID Nr. 21, Seq.-ID Nr. 22, Seq.-ID Nr. 24, Seq.-ID Nr. 25 oder Seq.-ID Nr. 26 dargelegten Aminosäuresequenz kodiert.
  3. Isolierte DNA-Sequenz, die fähig ist, unter verschärften Bedingungen an eine DNA-Sequenz zu hybridisieren, die für ein Protein mit einer in Seq.-ID Nr. 2, Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 7, Seq.-ID Nr. 8, Seq.-ID Nr. 9, Seq.-ID Nr. 10, Seq.-ID Nr. 11, Seq.-ID Nr. 12, Seq.-ID Nr. 13, Seq.-ID Nr. 14, Seq.-ID Nr. 15, Seq.-ID Nr. 16, Seq.-ID Nr. 17, Seq.-ID Nr. 18, Seq.-ID Nr. 19, Seq.-ID Nr. 20, Seq.-ID Nr. 21, Seq.-ID Nr. 24, Seq.-ID Nr. 25 oder Seq.-ID Nr. 26 dargelegten Aminosäuresequenz kodiert, und worin als verschärfte Hybridisierungsbedingungen 6 × SSC, 0,2% Polvinylpyrrolidin, 0,2% Ficoll, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,1% Natriumdodecylsulfat, 100 μm Lachssperma-DNA und 15% Formamid bei 68°C eingesetzt werden.
  4. Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 2 oder 3, worin die isolierte DNA-Sequenz ein replizierbares Genom von Cytomegalovirus umfasst, das für ein infektiöses menschliches Cytomegalovirus kodiert.
  5. Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin die isolierte DNA-Sequenz ein replizierbares Genom von Cytomegalovirus umfasst, das für ein infektiöses menschliches Cytomegalovirus kodiert.
  6. RNA-Molekül, das von einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4 transkribiert ist.
  7. Vektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
  8. Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in operativer Assoziation mit einer Expressionskontrollsequenz transformiert ist, die fähig ist, die Replikation und Expression der DNA-Sequenz zu steuern.
  9. HCMV-Protein, für das eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4 kodiert.
  10. Protein, das Folgendes umfasst: (a) ein HCMV-Protein mit einer in Seq.-ID Nr. 2, Seq.-ID Nr. 3, Seq.-ID Nr. 4, Seq.-ID Nr. 5, Seq.-ID Nr. 7, Seq.-ID Nr. 8, Seq.-ID Nr. 9, Seq.-ID Nr. 10, Seq.-ID Nr. 11, Seq.-ID Nr. 12, Seq.-ID Nr. 13, Seq.-ID Nr. 14, Seq.-ID Nr. 15, Seq.-ID Nr. 16, Seq.-ID Nr. 17, Seq.-ID Nr. 18, Seq.-ID Nr. 19, Seq.-ID Nr. 20, Seq.-ID Nr. 21, Seq.-ID Nr. 22, Seq.-ID Nr. 24 Seq.-ID Nr. 25 oder Seq.-ID Nr. 26 dargelegten Aminosäuresequenz; (b) ein Protein, das zumindest 90% Aminosäuresequenzhomologie mit einem unter (a) definierten HCMV-Protein aufweist.
  11. Verfahren zur Produktion eines HCMV-Proteins, welches das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 8 in einem geeigneten Kulturmedium und das Isolieren des Proteins aus dem Medium umfasst.
  12. Verfahren zur Produktion von rekombinantem HCMV, umfassend: (a) das Transfizieren eines Plasmids, das eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält, und (i) das Transfizieren viraler DNA, die AD169 oder Towne-Stamm-HCMV umfasst, oder (ii) das Superinfizieren von AD169 oder Towne-Stamm-HCMV in eine Zelllinie, die für das Wachstum von CMV permissiv ist; und (b) das Isolieren von rekombinantem HCMV aus der Zelllinie.
  13. Immunogene Zusammensetzung, die nach einem Verfahren nach Anspruch 12 erzeugtes rekombinantes HCMV umfasst.
  14. Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung nach Anspruch 13 zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Behandlung einer mit HCMV verbundenen Erkrankung oder Affektion.
  15. Verfahren zum Detektieren einer HCMV-Infektion bei einem Menschen, umfassend: (i) das Kombinieren einer klinischen Probe, von der vermutet wird, dass sie HCMV-DNA enthält, unter vorbestimmten verschärften Bedingungen mit zumindest einem einstrangigen DNA-Fragment einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die zumindest 10 Basen aufweist und nicht mit Human-DNA kreuzhybridisiert; und (ii) das Detektieren von Duplex-Bildung zwischen dem einstrangigen DNA-Fragment und der Proben-DNA.
  16. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein, für das eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert, im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  17. HCMV-Protein nach Anspruch 9 oder 10 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
  18. Verwendung eines HCMV-Proteins nach Anspruch 9 oder 10 zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Behandlung einer mit HCMV verbundenen Erkrankung oder Affektion.
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