ES2206569T3

ES2206569T3 - Nuevas secuencias de adn del citomegalovirus humanos.

Info

Publication number: ES2206569T3
Application number: ES96910560T
Authority: ES
Inventors: Richard Spaete; Tai-An Cha
Original assignee: MedImmune Vaccines Inc
Current assignee: MedImmune Vaccines Inc
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-03-26
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2016-03-26
Also published as: US7208165B2; US20040001850A1; US5925751A; EP0821693B1; EP0821693A4; JPH11503013A; US20060240446A1; ATE248184T1; DK0821693T3; US6040170A; DE69629674D1; AU5372796A; AU706234B2; US6291236B1; PT821693E; EP0821693A1; US6635477B1; DE69629674T2; CA2215328A1; CA2215328C

Abstract

SE DESCRIBEN NUEVAS SECUENCIAS DE ADN DEL CITOMEGALOVIRUS HUMANO TOLEDO Y TOWNE (HCMV) Y PROTEINAS CODIFICADAS POR EL. LAS SECUENCIAS RESULTAN UTILES EN PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA DETECTAR INFECCIONES POR HCMV Y EN COMPOSICIONES INMUNOGENICAS PARA EVITAR INFECCIONES POR HCMV.

Description

Nuevas secuencias de ADN del citomegalovirus humano.

El citomegalovirus humano (HCMV) es un agente ubicuo en las poblaciones humanas. Las infecciones son generalmente asintomáticas, pero pueden tener secuelas médicas serias en individuos inmunocomprometidos y en recién nacidos infectados congénitamente. La infección por HCMV puede resultar en neumonía intersticial, retinitis que progresa hacia ceguera, e infección diseminada. Las infecciones en recién nacidos pueden ser gravemente destructivas, implicando múltiples órganos, incluyendo el sistema nervioso central, y también podrían resultar en lesiones auditivas. Los mecanismos de patogénesis no se conocen, aunque se cree que podrían estar implicados factores huéspedes, tales como respuestas celulares y/o humorales inmunes. Consultar, Alford y Britt, "The Human Herpesvirus", Eds. B. Roizman, R. J. Whitley y C. López, Raven Press, Nueva York, 1993, pp. 227-255. Se ha especulado también que la variabilidad genética (bien estructural, o antigénica, o ambas) entre diferentes cepas de HCMV podría ser responsable de las variaciones observadas en las manifestaciones clínicas. Pritchett, J. Virol. 36:152-161 (1980); Lehner, J. Clin. Microbiol. 29:2494-2502 (1991); Fries, J. Infect. Dis. 169:769-774 (1994).

Recientemente se ha prestado una atención considerable al análisis de la variación de cepas entre aislados de HCMV. Se han aislado unas veinte cepas diferentes de HCMV, y se han diferenciado mediante el análisis de restricción de fragmentos de ADN amplificados mediante PCR. Chou, J. Infect. Dis. 162:738-742 (1990).

Una cepa, la cepa Towne, se ha desarrollado como una vacuna atenuada, viva, y se ha administrado con cierto éxito a pacientes de transplantes renales. Ver Quinnan, Annals of Int. Med. 101:478-483 (1984); Plotkin, Lancet 1:528-530 (1984). Sin embargo, las vacunas de la cepa Towne que fueron directamente desafiadas en un estudio por virus del tipo salvaje de la cepa Toledo con pocos pasajes, se halló que resistían dosis de desafío de sólo 10 unidades formadoras de calvas (pfu) o menos. Plotkin, J. Infect. Dis. 159:860-865 (1989). Por tanto, parece ser que la cepa Towne podría estar excesivamente atenuada, es decir, estar tan extensamente modificada genéticamente, a resultas de su paso en serie en cultivos de células, que ha perdido una inmunogenicidad significativa, presumiblemente debido a la pérdida de información genética durante su paso por células. Sin embargo, de forma ventajosa, la cepa Towne no se ha observado nunca que se reactivara.

Se ha hallado heterogeneidad en la secuencia de ADN entre la cepa Towne y otra cepa de HCMV, AD169. Pritchett, J. Virol. 36:152-161 (1980). (En la patente estadounidense nº 4.762.780 se descubre un mapa de restricción del genoma del HCMV AD169). También se ha detectado la variación en el contenido de ADN entre otras cepas aisladas del HCMV. Huang, Yale J. Biol. and Med. 49:29-43 (1976). Los patrones de corte de las digestiones con enzimas de restricción del ADN de HCMV de varias cepas han sido analizados. Kilpatrick, J. Virol. 18:1095-1105 (1976); LaFemina, "Structural Organization of the DNA Molecules from Human Cytomegalovirus", en Animal Virus Genetics, Eds. B. N. Field y R. Jaenish, Academic Press, N.Y. (1980); Chandler, J. Gen. Virol. 67:2179-2192 (1986); Zaia, J. Clin. Microbiol. 28:2602-2607 (1990). No obstante, aunque se ha determinado la estructural general del genoma del HCMV, y se ha mapado el polimorfismo de sitios de restricción entre cepas para muchas de las cepas, no se han determinado las diferencias entre cepas en las secuencias de ADN del genoma del HCMV. Solo se han deducido y comparado secuencias parciales. Por ejemplo, se han deducido las secuencias de ADN y aminoácidos de las glicoproteína B de la cubierta (gpUL55(gB)] de ambas, las cepas Towne y AD169, ver Spaete, Virology 167:207-225 (1988), y se han comparado con varios aislados clínicos, ver Chou, J. Infect. Dis. 163:1229-1234 (1991), para identificar regiones conservadas y regiones de variabilidad. Además, se ha completado el análisis de la secuencia de ADN de ciertas regiones del gen gp58/116 [gpUL55(gB)], del gen IMP, y del potenciador/promotor IE-1/2. Lehner, J. Clin. Microbiol. 29:2494-2502 (1991).

Mientras que se ha deducido la secuencia de ADN completa de la cepa AD169 del HCMV, (Nº de acceso al EMBL: X17403), la secuencia de ADN completa de la cepa Towne no ha sido deducida, que nosotros sepamos. Sin embargo, se ha especulado que la AD169 y otra cepa de laboratorio, Davis, carecen de dos a cuatro pares de kilobases (k.b.) de la secuencia de ADN, en comparación con la cepa Towne, en la porciones internas extremas de ambas repeticiones L. LeFemina, ver más arriba, en pp. 52-53.

El impacto en la salud pública de las infecciones del HCMV no ha sido bien controlado mediante las estrategias de tratamiento actuales, o mediante las quimioterapias antivirales disponibles. Es probable que las estrategias de vacunas preventivas se muestren eficaces a causa de las observaciones de que los receptores de transplantes renales seropositivos están protegidos de enfermedades del HCMV graves, y de la que inmunidad maternal protege el feto de la enfermedad después de una infección intrauterina. Marshall y Plotkin, "Cytomegalovirus Vaccines", en The Human Herpesviruses, Eds. B. Roizman, R. J. Whitley, y C. Lopez, Raven Press, Nueva York, 1993, pp 381-395. Sin embargo, un obstáculo adicional para el desarrollo de un vacuna contra el HCMV es la ausencia de un sistema modelo animal que pueda usarse para ensayar la seguridad y eficacia de las candidatos a vacuna. En consecuencia, persiste en la técnica una necesidad de vacunas eficaces para el tratamiento profiláctico del HCMV en humanos.

En un aspecto, la invención proporciona secuencias de ADN de HCMV nuevas, no reconocidas o conocidas hasta el momento en la técnica. Estas secuencias de HCMV nuevas se aislaron a partir de las cepas Toledo y Towne del HCMV, y comprenden ADN que no compartido por la cepa de referencia AD169 del HCMV. En consecuencia, en este aspecto la invención proporciona secuencias de ADN nuevas, aisladas, de la cepa Toledo del HCMV, tal como se detalla en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. Tal como se usa en ésta, el término "aislado" significa sustancialmente libre de otras secuencias de ADN viral con la que el ADN sujeto se halla típicamente en su estado nativo, es decir, endógeno. Estas secuencias de ADN nuevas del HCMV Toledo se caracterizan por comprender la misma, o sustancialmente la misma secuencia que la de la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 6), o fragmentos activos de la misma. Las secuencias de ADN podrían incluir secuencias 5' y 3' no codificantes flanqueando la secuencia codificante. Las secuencias de ADN podrían estar en una orientación invertida con respecto a la orientación mostrada en la Figura 1. Los segmentos o fragmentos de la secuencia de ADN mostrada en la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 6) podrían reordenarse o invertirse internamente. Las secuencias de ADN de la invención también comprenden secuencias de nucleótidos capaces de hibridarse en condiciones rigurosas, o la cuales serían capaces de hibridarse bajo dichas condiciones, excepto por la degeneración del código genético, a una secuencia correspondiente a la secuencia de la Figura 1. La Figura 1 (SEC. Nº ID.: 6) ilustra la secuencia de ADN de la nueva cepa Toledo del HCMV. En esta secuencia se identificaron veintiuna pautas de lectura abiertas (ORF). Las secuencias putativas de estas ORF de la nueva cepa Toledo del HCMV se enumeran en la secuencia con los números de identificación 7 a 27, páginas 58 a 78 [en el original], ver más abajo. En la Figura 1, el inicio y final de las 21 ORF se identifica mediante las flechas y las denominaciones "UL133", "UL134", etc. (ver más abajo). En las secuencias reordenadas de la invención, podrían crearse o destruirse nuevas pautas de lectura abiertas.

En otro aspecto, la invención proporciona nuevas secuencias de ADN del HCMV, no reconocidas o conocidas hasta la fecha en la técnica. Estas secuencias adicionales se aislaron a partir de la cepa Towne del HCMV, y comprenden ADN que no es compartido por la cepa AD169 o por la cepa Toledo del HCMV. Estas nuevas secuencias de ADN del HCMV Towne se caracterizan por comprender la misma, o sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que la de la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 1), o fragmentos activos de la misma. La secuencia de ADN podría incluir secuencias 5' y 3' no codificantes flanqueando la secuencia codificante. Las secuencias de ADN de la invención también comprenden secuencias de nucleótidos capaces de hibridarse en condiciones rigurosas, o la cuales serían capaces de hibridarse bajo dichas condiciones, excepto por la degeneración del código genético, a una secuencia correspondiente a la secuencia de la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 1). La Figura 1 (SEC. Nº ID.: 1) ilustra la secuencia de ADN de la nueva cepa Towne del HCMV. En esta secuencia se identificaron cuatro ORF. Las secuencias putativas de estas nuevas ORF se enumeran en la secuencia con los números de identificación 2 a 5, páginas 42 a 45 [en el original], ver más abajo. En la Figura 2, el inicio y final de las 4 ORF se identifica mediante las flechas y las denominaciones "UL147", "UL152", "UL153", y "UL154".

Se entiende que las secuencias de ADN de esta invención podrían excluir algunas o todas las secuencias señales y/o flanqueantes. Además, las secuencias de ADN de la presente invención también comprenden ADN capaz de hibridarse en condiciones rigurosas, o que sería capaz de hibridarse bajo tales condiciones, excepto por la degeneración del código genético, con una secuencia de ADN aislada de la Figura 1 o Figura 2 (SEC. Nº ID.: 6 y 1). Tal como se usa en ésta, el término "condiciones rigurosas" indica condiciones de elevada rigurosidad, por ejemplo 6x SSC, 0,2% polivinilpirrolidona, 0,2% Ficoll, 0,2% de albúmina de suero bovino, 0,1% de sulfato de sodiododecil, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, y 15% de formamida a 68ºC. (Ver Materiales y Procedimientos, Parte C, más abajo). Las moléculas de ARN, transcritas a partir de un ADN de la invención tal como se ha descrito más arriba, son un aspecto adicional de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona nuevas proteínas del HCMV, tal como se detalla en la reivindicación 4 ó reivindicación 10, las cuales están sustancialmente libres de otras proteínas del HCMV, con las cuales se hallan típicamente en su estado nativo. Estas nuevas proteínas del HCMV comprenden las pautas de lectura abiertas (ORF): UL133 (SEC. Nº ID.: 7), UL134 (SEC. Nº ID.: 8), UL135 (SEC. Nº ID.: 9), UL136 (SEC. Nº ID.: 10), UL137 (SEC. Nº ID.: 11), UL138 (SEC. Nº ID.: 12), UL139 (SEC. Nº ID.: 13), UL140 (SEC. Nº ID.: 14), UL141 (SEC. Nº ID.: 15), UL142 (SEC. Nº ID.: 16), UL143 (SEC. Nº ID.: 17), UL144 (SEC. Nº ID.: 18), UL145 (SEC. Nº ID.: 19), UL146 (SEC. Nº ID.: 20), UL147 (SEC. Nº ID.: 21), UL148 (SEC. Nº ID.: 22), UL149 (SEC. Nº ID.: 24), UL150 (SEC. Nº ID.: 25), y/o UL151 (SEC. Nº ID.: 26), identificadas en la secuencia de ADN de la cepa Toledo, y UL147 (SEC. Nº ID.: 2), UL152 (SEC. Nº ID.: 3), UL153 (SEC. Nº ID.: 4), y/o UL154 (SEC. Nº ID.: 5), identificadas en la secuencia de ADN de la cepa Towne. Se identificaron dos ORF adicionales en la secuencia de ADN de la nueva cepa Toledo, UL130 y UL131 (SEC. Nº ID.: 23 y 27). Estas dos secuencias están presentes también en la AD169 (ver Figura 5). Las proteínas podrían producirse mediante técnicas de ingeniería genética recombinante. Adicionalmente, podrían purificarse a partir de fuentes celulares infectadas con el HCMV. También podrían sintetizarse mediante técnicas químicas. Un especialista en la técnica podría aplicar una combinación de las metodologías identificadas más arriba para sintetizar la proteína. Adicionalmente, se proporcionan análogos de las proteínas del HCMV de la invención, e incluyen polipéptidos truncados, por ejemplo, mutantes en los que hay variaciones en la secuencia de aminoácidos, la cual retiene la actividad biológica, tal como se define más abajo, y tienen una homología de al menos el 90%, y más preferiblemente del 95%, con las regiones correspondientes de las secuencias de aminoácidos de las cepas Toledo o Towne del HCMV (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 26). Los ejemplos incluyen polipéptidos con variaciones menores añadidas de aminoácidos a partir de las secuencias de aminoácidos nativas de las secuencias de aminoácidos de las cepas Toledo o Towne del HCMV (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 26); en particular, sustitución conservadora de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras son aquéllas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados por sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) apolares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados = glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces conjuntamente como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con un serina, o una sustitución conservadora similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto importante sobre la actividad o funcionalidad.

Usando las secuencias de aminoácidos de Toledo o Towne (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 26). La obtención de otros polipéptidos, u otras secuencias de ADN codificando la proteína de HCMV Towne o Toledo, a partir de aislados clínicos se halla entre los conocimientos de la técnica. Por ejemplo, el gen estructural puede manipularse variando nucleótidos individuales mientras que se retienen los aminoácidos correctos, o variando los nucleótidos, con objeto de modificar los aminoácidos, sin pérdida de actividad. Los nucleótidos pueden sustituirse, insertarse, o suprimirse mediante técnicas conocidas, incluyendo, por ejemplo, la mutagénesis in vitro y la reparación de cebadores. El gen estructural puede truncarse en su extremos 3' y/o extremo 5' mientras retenga su actividad. También podría ser deseable suprimir la región codificando la secuencia señal, y/o remplazarla con una secuencia heteróloga. También podría ser deseable ligar un porción de las secuencias de aminoácidos de Toledo o Towne (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 26), particularmente aquélla que incluye el dominio amino-terminal, a una secuencia codificante heteróloga, y de ese modo crear un péptido de fusión del HCMV Toledo o Towne.

Al diseñar tales modificaciones, se espera que los cambios en regiones no conservadas de las secuencias de aminoácidos de Toledo o Towne (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 26) tendrán efectos relativamente menores sobre la actividad, mientras que los cambios en las regiones conservadas, y particularmente en, o cerca del dominio amino-terminal, se espera que produzcan efectos mayores. Los residuos aminoácidos que están conservados entre las secuencias de aminoácidos de Toledo o Towne (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 26), y al menos otras dos secuencias, por ejemplo, procedentes de aislados clínicos de HCMV, no se espera que sean candidatos para la sustitución. Un residuo que muestra variaciones conservadoras entre las secuencias del HCMV y al menos dos de las otras secuencias, se espera que sea susceptible de una sustitución conservadora similar de las secuencias del HCMV. De forma similar, un residuo que varía de forma no conservadora entre las secuencias del HCMV y al menos tres de las otras secuencias, se espera que sea susceptible de una sustitución conservadora o no conservadora. Cuando se diseñan sustituciones de las secuencias del HCMV, es especialmente preferido el remplazo con un aminoácido que no se halla en la posición alineada comparable de una de las otras secuencias.

Esta invención proporciona adicionalmente un vector de ADN recombinante que comprende un vector de ADN y una secuencia de ADN que codifica un polipéptido del HCMV Toledo o un polipéptido del HCMV Towne. El vector proporciona el ADN del HCMV Toledo o Towne en un asociación operativa con una secuencia reguladora capaz de dirigir la replicación y expresión de una proteína del HCMV Toledo o Towne en una célula huésped seleccionada. También se proporcionan en esta invención las células huésped transformadas con tales vectores, para su uso en la expresión de proteínas recombinantes de HCMV Toledo o Towne. También se proporciona un proceso novedoso para producir proteínas recombinantes de HCMV Toledo o Towne, o fragmentos activos de las mismas. En este proceso, una línea celular huésped, transformada con un vector tal como se ha descrito más arriba, conteniendo una secuencia de ADN (SEC. Nº ID.: 1 y 6) que codifica la expresión de una proteína de HCMV Toledo o Towne, en asociación operativa con una secuencia regulador apropiada y capaz de dirigir la replicación y controlar la expresión de una proteína de HCMV Toledo o Towne, se cultiva en condiciones apropiadas, permitiendo la expresión del ADN recombinante. La proteína expresada se recolecta a continuación de la célula huésped o del medio de cultivo, usando medios convencionales apropiados. Este proceso novedoso podría emplear varias células conocidas como líneas celulares huéspedes para la expresión de la proteína. Las células actualmente preferidas son líneas celulares de células de mamíferos, levadura, insecto, y bacterias. Las líneas celulares de mamífero son especialmente preferidas.

La práctica de esta invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, manipulación y producción de ADN recombinante, e inmunología, las cuales forman parte de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican detalladamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II, (Ed. D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis, (Ed. M. J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization, (Eds. B. D. Hames y S. J. Higgins, 1984); Transcription and Translation, (EDs. B. D. Hames y S. J. Higgins, 1984); Animal Cell Culture, (Ed. R. I. Freshney, 1986); Immobilized Cells and Enzymes, (IRL PRess, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, (1984); la serie Methods in Enzymology, (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, (Eds. J. H. Miller y M. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology, Volúmenes 154 y 155 (respectivamente, Eds. Wu y Grossman, y Wu), (Eds. Mayer y Walker, 1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, (Academic Press, London), Scopes (1987); Protein Purification: Principles and Practice, 2ª edición, Springer Verlag, N.Y.; y Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (Eds. D. M. Weir y C. C. Blackwell, 1986).

Esta invención proporciona adicionalmente composiciones para detectar infecciones de HCMV en humanos. Estas composiciones comprenden sondas que tienen al menos un fragmento de hebra única de al menos 10 bases de longitud, más preferiblemente 15 bases de longitud, de la nueva secuencia de Toledo, y fragmentos que se hibridan a estos fragmentos de hebra única en condiciones de hibridación rigurosas, y que no se hibridan de forma cruzada con el ADN humano. Adicionalmente, esta composiciones comprenden al menos un fragmento de hebra única de al menos 10 bases de longitud, más preferiblemente 15 bases de longitud, o la nueva secuencia Towne, y fragmentos que se hibridan a estos fragmentos de hebra única en condiciones de hibridación rigurosas, y que no se hibridan de forma cruzada con el ADN humano. Algunas composiciones de sondas podrían comprender adicionalmente una marca, unida al fragmento, para proporcionar una señal detectable, como se enseña en la patente estadounidense nº 4.762.780.

Esta invención proporciona además procedimientos para detectar una infección de HCMV en un huésped humano. Tales procedimientos comprenden combinar, en condiciones de rigurosidad predeterminadas, una muestra clínica sospechosa de contener ADN de HCMV con al menos un fragmento de ADN de hebra única, de la nueva cepa Toledo o Towne de HCMV, que tiene al menos 10 bases, más preferiblemente 15 bases, y que no se hibrida de forma cruzada con el ADN humano, y detectar la formación de dúplexes entre los fragmentos de hebra única de la cepa Toledo o Towne del HCMV y el ADN de la muestra. Alternativamente, la PCR podría usarse para incrementar el número de copias de ácido nucleico viral mediante amplificación para facilitar la identificación de HCMV en individuos infectados. En tal caso, los fragmentos de secuencia de ADN de la cepa Toledo o Towne de la presente invención pueden usarse para construir cebadores de PCR para sistemas de amplificación basados en PCR para el diagnóstico de HCMV. Tales sistemas son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.008.182 (detección mediante PCR de virus asociados con el SIDA), y Hedrum, PCR Methods and Applications 2:167-171 (1992) (detección de Chlamydia trachomatic mediante PCR y recuperación inmunomagnética).

Las secuencias de ADN de esta invención podrían usarse también para preparar composiciones inmunizantes. Las secuencias de ADN de la nueva Toledo se recombinan en la cepa Towne o la cepa AD169 del HCMV, y se ensayan las propiedades de crecimiento de estos virus recombinantes en células endoteliales, o en tejidos humanos transplantados en ratones SCID, o se ensayan en el modelo del ojo de la rata. Mocarski, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:104-108 (1993). Tales recombinantes mostrarán una inmunogenicidad incrementada frente a la mostrada por la cepa Towne-125, en uso actualmente en humanos, sin exhibir la virulencia total mostrada por la cepa Toledo-1. Por tanto, un aspecto adicional de la invención son las composiciones inmunizantes que comprenden, bien la cepa Towne o la cepa de referencia AD169 del HCMV, a la cual se le ha añadido la nueva secuencia de ADN de la Toledo, o fragmentos análogos de la misma, resultando en una inmunogenicidad incrementada del virus recombinante. La invención también incluye el uso de una composición inmunogénica, tal como la definida más arriba, para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico de un enfermedad o condición relacionada con el HCMV, y el uso de un proteína del HCMV, tal como se ha definido más arriba, para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico de una enfermedad o condición relacionada con el HCMV.

Otros aspectos y ventajas de esta invención se describen en la siguiente DESCRIPCIÓN DETALLADA, en la cual:

La Figura 1 ilustra la nueva secuencia de ADN de Toledo de la invención, aislada a partir de la cepa Toledo del HCMV. Las flechas indican los inicios y los finales de las secuencias de nucleótidos que codifican las 21 secuencias de aminoácidos putativas identificadas.

La Figura 2 ilustra la nueva secuencia de ADN de Towne de la invención, aislada a partir de la cepa Towne del HCMV. Las flechas indican los inicios y los finales de las secuencias de nucleótidos que codifican las 21 secuencias de aminoácidos putativas identificadas.

La Figura 3 es la representación esquemática de una transferencia Southern de un ADN de la cepa Towne o Toledo de HCMV, digerido con enzimas de restricción tal como se detalla en el EJEMPLO 1. La flecha indica una banda de 5 p.k.b. (pares de kilobases) del ADN de Toledo en la digestión con BamHI que está ausente en el ADN de Towne, significando la presencia adicional de secuencia de ADN de Toledo.

La Figura 4 ilustra una autoradiografía compuesta del ADN, digerido con enzimas de restricción, procedente de AD169, Towne, Toledo y cinco aislados clínicos del HCMV, tal como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 5 es una representación esquemática de las nuevas pautas de lectura identificadas en las secuencias de ADN de las nuevas Toledo o Towne.

La Figura 6 es una representación esquemática de las posiciones relativas de las nuevas secuencias identificadas en el ADN genómico de Toledo, el ADN genómico de Towne, en una comparación con el ADN genómico de la cepa AD169.

Descripción detallada A. Introducción

La invención proporciona dos secuencia de ADN de HCMV nuevas, denominadas secuencia Toledo y secuencia Towne, no reconocidas o conocidas hasta el momento en la técnica. Esta invención también proporciona composiciones inmunizantes y procedimientos que usan las nuevas secuencias de ADN de HCMV de la invención, y también proporciona otros usos diagnósticos y terapéuticos para las secuencias y sus productos proteicos. Las nuevas secuencias de ADN se hallaron originalmente en las cepas Toledo y Towne del HCMV. Los detalles de las secuencias y de las características estructurales se proporcionan en los Ejemplos más adelante.

Más deseablemente, se proporcionan composiciones inmunogénicas del HCMV que comprenden la cepa de referencia AD169 o la Towne, a las que se les han añadido secuencias de ADN de la nueva Toledo, o análogos o fragmentos de las mismas, con objeto de incrementar la inmunogenicidad de las cepas excesivamente atenuadas. Por tanto, un aspecto de esta invención incluye aislar ADN, y las correspondientes secuencias de ARN, tal como se descubre en las Figuras 1 y 2 (SEC. Nº ID.: 6 y 1). Tal como se usa en ésta, el término "aislado" indica sustancialmente libre de otras secuencias de nucleótidos o polipéptidos con las cuales la secuencia de nucleótidos o polipéptidos sujeto se halla típicamente en su estado nativo, es decir, endógeno. En otro aspecto, la invención comprende proteína de Toledo o Towne del HCMV aislada codificada por las respectivas secuencias de ADN de Toledo o Towne del HCMV (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 26).

Otro aspecto de esta invención incluye ensayos de diagnóstico para la detección de variantes de cepas del HCMV. En resumen, tales ensayos de diagnóstico incluyen el uso de fragmentos de secuencia de ADN de la invención como cebadores para amplificar ácidos nucleicos relacionados con el HCMV en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o por detección directa mediante hibridación. Los ensayos de diagnóstico de la invención también podrían incluir el uso de anticuerpos específicos contra los nuevos ORF codificados por las secuencias de ADN de Toledo o Towne descubiertas en ésta. Todavía otro aspecto de la invención es el uso de las nuevas secuencias de ADN, modificadas con un único sitio de restricción, para actuar como marcadores de vacunas.

Se anticipa que la invención permitirá la producción de vacunas que ofrecerán ventajas respecto a la actual vacuna del HCMV, la cual está demasiado atenuada, y, por tanto, no es consistentemente efectiva a la hora de elicitar una respuesta inmune. Más específicamente, la introducción o inserción de las nuevas secuencias de la cepa Toledo de la presente invención en la cepa Towne o en la cepa AD169 resultarán en la introducción de secuencias de ADN específicas en el genoma del HCMV Towne, lo que no es posible usando vacunas de pasajes en células. De forma importante para la producción de vacunas, esto permite la medición precisa del grado de atenuación introducido por diferentes fragmentos de las secuencias de ADN de la invención, permitiendo por tanto la modificación controlada de la atenuación de la cepa Towne que se precisa en la técnica para corregir la característica de la cepa Towne de estar demasiado atenuada, y mejorar su función en una composición inmunogénica.

B. HCMV AD169 o Towne recombinante

El ADN de Towne o AD169 recombinante se deriva co-transfectando de un plásmido que contiene las nuevas secuencias de Toledo, o análogos o fragmentos de las mismas, y un marcador seleccionable, tal como el gpt o la \beta-galactosidasa, en células de fibroblastos primarios, u otras líneas celulares conocidas por permitir el crecimiento de CMV. Los virus recombinantes se seleccionan mediante cultivo en medios que contienen ácido micofenólico, o se identifican mediante fenotipos de calvas azules después de aplicar un sustrato cromogénico como la X-gal. Los virus recombinantes se purifican a partir de la calva y se caracterizan mediante análisis con enzimas de restricción y procedimientos de transferencia Southern. La nueva secuencia del HCMV Toledo, o análogos o fragmentos de la misma, podrían usarse sin modificar con respecto a las señales endógenas promotoras y terminadoras de la transcripción. Alternativamente, la región codificante del ADN de la cepa Toledo puede colocarse bajo control transcripcional de un promotor, tal como el promotor temprano inmediato principal del CMV (citomegalovirus), el promotor temprano del SV40, u otro promotor viral o celular que genere niveles de expresión adecuados, tal como se discute en ésta. El HCMV de las cepas Towne o AD169 modificadas se hace crecer en células de cultivo de tejidos. Para experimentos con mamíferos, que no incluyan humanos, se usan células tales los fibroblastos de prepucio humano (HF) o células MRC-5, para propagar el virus. El virus se recolecta a partir de cultivos de estas células y, a continuación se estudia con más detalle el virus recombinante aislado por su capacidad para elicitar una respuesta inmune y proporcionar protección frente a la infección por HCMV.

Para su uso en humanos, el virus recombinante se produce en grandes cantidades a partir de una línea celular aprobada por la FDA. Tales células incluyen las células MRC-5 y WI-38 (ambas son fibroblastos diploides humanos primarios). El virus recombinante se genera en la línea celular de producción mediante transfección de ADN viral, o de cápsides preparadas a partir de virus recombinante aislado a partir de otra línea celular. El procedimiento de transfección debería prevenir la contaminación de las células aprobadas por la FDA con agentes adventicios o contaminantes procedentes de un línea celular no cualificada. Un virus HCMV producido a partir de las anteriores líneas celulares se usará para infectar progresivamente frascos de cultivos mayores de células de cultivos de tejidos. Las células infectadas se usarán en inoculaciones subsiguientes. Las células del cultivo celular infectadas y viables se extraen de los frascos de cultivos celulares usando tripsina, y se añaden hasta un exceso de 1 a 100 veces (o más) de células sin infectar para conseguir progresivamente inoculaciones mayores. Una vez se haya obtenido un rendimiento óptimo, el virus se recolectará a partir de células de cultivos celulares. Este proceso puede repetirse hasta que se alcanza una producción a gran escala. Las células infectadas se recuperarán de los frascos de cultivos celulares y se romperán usando, por ejemplo, sonicación, homogeneización con homogenizador dounce, o alguna combinación de los mismos. Los virus se aíslan a continuación a partir del material celular usando técnicas de centrifugación conocidas en la técnica. Una vez se ha aislado el virus, se añade un agente estabilizador, tal como un carbohidrato o un derivado de carbohidrato, y entonces se alícuota el virus y se liofiliza.

C. Composiciones inmunogénicas

Las composiciones inmunogénicas pueden administrarse a sujetos para prevenir infecciones por HCMV. Las composiciones inmunogénicas previenen las infecciones por HCMV estimulando el sistema inmune con un virus atenuado incapaz de manifestar totalmente la enfermedad. Una ventaja principal de las composiciones inmunogénicas de HCMV proporcionada en ésta es que su grado de inmunogenicidad incrementado resultará en una prevención más efectiva de una infección por HCMV en la población.

La cepa Towne del HCMV servirá preferiblemente como cepa progenitora debido a su incapacidad probada para reactivarse. Para preparar composiciones inmunogénicas de HCMV, se introducen secuencias de ADN de Toledo completas, truncadas y/o modificadas, en un virus de la cepa Towne o AD169 del HCMV, tal como se discute en ésta. La efectividad de la composición inmunogénica para impedir las infecciones por HCMV se medirá en humanos. Los humanos se inocularán primero con PFU que oscilarán desde 100-20.000 PFU de virus mutantes por inoculación, la PFU se miden tal como se discute en ésta. Después de la primera inoculación, usualmente se administrará una segunda inyección de impulso de igual dosis o incrementada. Los sujetos se expondrán entonces a HCMV del tipo salvaje, después de la primera o segunda inoculación, y se observará la presencia de infecciones por CMV. Los posibles efectos secundarios de la vacuna se monitorizarán en voluntarios adultos previamente expuestos al CMV, antes de inocular sujetos que nunca han desarrollado infecciones por CMV. El virus atenuado se usa sin un adyuvante y con un portador fisiológicamente apropiado.

Tal como se conoce en la técnica y se discute en ésta, el nuevo ADN se inserta en el genoma viral de Towne o AD169 usando, por ejemplo, técnicas de recombinación homólogas. La inserción se hace generalmente en un gen que no es esencial en la naturaleza. Han sido descritos vectores lanzadera de plásmidos que facilitan enormemente la construcción de virus recombinantes. Ver, por ejemplo, Spaete y Mocarski, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7213-7217 (1987). La expresión del polipéptido codificado por el ADN de la nueva Toledo ocurre entonces en células o individuos que están inmunizados con el virus recombinantes vivo.

Alternativamente, las nuevas proteínas purificadas del HCMV podrían emplearse en composiciones terapéuticas y/o inmunogénicas para una subunidad, para impedir o tratar condiciones relacionadas con el HCMV. Tales composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad efectiva inmunogénicamente inductora de una o más de las proteínas de la presente invención, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una sistema de presentación adyuvante/antígeno tal como el alum. También podrían usarse otros sistemas de presentación adyuvante/antígeno, por ejemplo, el MF59 (Chiron Corp.), QS-21 (Cambridge Biotech Corp.), 3-DMPL (3-deacil-monofosforil Lípido A) (RibiImmunoChem Research Inc.), adyuvante de Freund incompleto de grado clínico (IFA), liposomas fusogénicos, polímeros solubles en agua, o Iscoms (Complejos estimulantes Inmunes). Otros ejemplos de portadores o soluciones farmacéuticamente aceptables son el hidróxido de aluminio, la solución salina, y la solución salina tamponada con fosfato. La composición puede administrarse sistémicamente, preferiblemente subcutáneamente o intramuscularmente, en formar de una solución subcutánea o intramuscular aceptable. También puede efectuarse la inoculación mediante escarificación de la superficie o mediante la inoculación de una cavidad corporal. La preparación de tales soluciones, con la debida consideración del pH, isotonicidad, estabilidad y similares, se halla dentro de los conocimientos de la técnica. El régimen de dosificación será determinado por el médico encargado, teniendo en consideración varios factores que se sabe modifican la acción de las drogas, tales como, por ejemplo, la condición física, el peso corporal, el sexo, la dieta, la gravedad de la condición, el tiempo de administración, y otros factores clínicos. Los rangos de dosis de ejemplo comprenden entre aproximadamente 1 \mug hasta 1000 \mug de proteína.

Al practicar el procedimiento de tratamiento de esta invención, se administra una cantidad efectiva inmunológicamente inductora de proteína a un paciente humano que precisa de un tratamiento profiláctico o terapéutico. Un cantidad efectiva inmunológicamente inductora de una composición de esta invención se contempla que esté en el rango de aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 1 miligramo por dosis administrada. El número de dosis administradas podría variar, dependiendo de los factores antes mencionados.

D. Ensayos de diagnóstico y uso como marcador de vacunas

Las nuevas secuencias de ADN de Toledo y Towne de la presente invención pueden usarse en ensayos de diagnóstico para detectar HCMV en una muestra, para detectar secuencias similares a la de Toledo y Towne, y para detectar diferencias entre cepas en aislados clínicos de HCMV, usando fragmentos de ADN de Toledo o Towne sintetizados químicamente o recombinantes. Adicionalmente, las nuevas secuencias pueden usarse como un marcador de vacuna para diferenciar entre un individuo o muestra infectado con, o conteniendo HCMV del tipo salvaje, y un individuo o muestra infectada con, o que contiene una vacuna de HCMV, es decir, una vacuna de HCMV viva atenuada actualmente en uso, tal como la vacuna de Towne. En todavía otra realización, los fragmentos de la secuencia de ADN pueden unirse también a ácidos nucleicos secundarios que, o se unen a un soporte sólido o a otras sondas de detección para su uso en ensayos de diagnóstico.

En un aspecto de la invención, pueden usarse fragmentos de las nuevas secuencias de ADN de Toledo o Towne (SEC. Nº ID.: 1 y 3), que comprenden al menos entre 10 y 20 nucleótidos, como cebadores para amplificar ácidos nucleicos usando procedimientos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), bien conocidos en la técnica, y como sondas en ensayos de hibridación de ácido nucleico para detectar material genético diana, tal como el ADN de HCMV en especímenes clínicos (con o sin PCR). Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 4.683.202; 4.683.195; 5.091.310; 5.008.182 y 5.168.039. En un ensayo de ejemplo, se selecciona una región de la nueva secuencia de ADN conservada entre variantes del virus como la secuencia a amplificar y detectar en el ensayo de diagnóstico. Se construyen cebadores oligonucleotídicos, al menos sustancialmente complementarios a (pero preferiblemente idénticos a) la secuencia a amplificar, y se trata una muestra sospechosa de contener una secuencia de ácido nucleico de HCMV a detectar con cebadores para cada hebra de la secuencia de ácido nucleico del HCMV, cuatro trifosfatos de deoxinucleótidos, y un agente de polimerización, en condiciones apropiadas, de tal forma que se sintetiza un producto de extensión de cada cebador que es complementario con las secuencias de ácido nucleico del HCMV que se sospecha hay en la muestra, los cuales productos de extensión sintetizados a partir de un cebador, cuando se separan de su complemento, pueden servir como plantilla para la síntesis del producto de extensión del otro cebador en una reacción en cadena de la polimerasa. Después de la amplificación, el producto de la PCR puede detectarse mediante la adición de una sonda marcada, construida del mismo modo a partir de la nueva secuencia de ADN, capaz de hibridarse con la secuencia amplificada, como es bien conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.008.182.

En otra realización, las sondas o cebadores pueden usarse en un ensayo de marcador de vacuna para detectar una vacuna o infección con el tipo salvaje. Alternativamente, la introducción de un sitio de restricción en la nueva secuencia de ADN proporcionará un marcador de vacuna que puede usarse con fragmentos de PCR para detectar tales diferencias en un digerido de restricción. Tales procedimientos y técnicas para detectar variantes de la secuencia, tales como mutaciones localizadas, con la esperada ubicación o configuración de la mutación, son conocidas en las técnicas y se han aplicado en la detección de la anemia de células falciformes, de la enfermedad de la hemoglobina C, de la diabetes, y otras enfermedades y condiciones, tal como se descubre en la patente estadounidense nº 5.137.806. Estos procedimientos son fácilmente aplicados por un especialista en la técnica para detectar y diferenciar entre infecciones por el tipo salvaje y la vacuna del HCMV.

En otra realización, las nuevas secuencias de ADN de Toledo o Towne pueden usarse, en su totalidad o como fragmentos, para detectar la presencia de secuencias de ADN, secuencias relacionadas, o productos de transcripción en células, tejidos, muestras, y similares, usando técnicas de hibridación de sondas conocidas en la técnica, o conjuntamente con uno de los procedimientos discutidos en ésta. Cuando se usan como sonda de hibridación, los fragmentos de las nuevas secuencias de ADN de la invención tienen preferiblemente de 50-200 nucleótidos de longitud, más preferiblemente 100-300 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente más de 300 nucleótidos de longitud.

E. Producción de vectores y virus quiméricos

Las nuevas secuencias de ADN de la invención pueden expresarse en diferentes vectores usando diferentes técnicas conocidas en la técnica, lo que resulta en la generación de virus quiméricos. Las técnicas útiles y conocidas incluyen la transferencia de marcador o la recombinación homóloga, la ligación in vitro directa, la tecnología del vector defectuoso y la generación de amplicón (ver, por ejemplo, Frenkel, N. et al., Gene Transfer and Cancer, editado por M. L. Pearson y N. L. Sternberg (1984), Kwong A. D. y Frenkel, Virology 142:421-425 (1985), la patente estadounidense (nº de serie 07/923.015, por Roizman). Los vectores usados en tales técnicas incluyen los cósmidos, plásmidos, y los virus infecciosos o defectuosos. Tales vectores son conocidos en la técnica. Un cósmido, tal como se usa en ésta, es un plásmido que contiene un sitio cos del bacteriófago lambda. El sitio cos es la señal cis para el empaquetado del ADN de lambda. Por tanto, un cósmido, a diferencia de un plásmido, puede ser empaquetado in vitro con elevada eficiencia en una cabeza de lambda. Esta técnica permite la clonación de fragmentos muy grandes (30-45 p.k.b.) de ADN. La cotransfección de cósmidos que se solapan puede usarse para construir mutantes de citomegalovirus humanos siguiendo los procedimientos de Kemble, J. Virology 70:2044-2048 (1996). Los vectores pueden ser de hebra única o de doble hebra, y prepararse tanto con ADN como con ARN.

Generalmente, la secuencia de ADN se inserta en le vector sola o unida a otro ADN genómico de HCMV. En usos de la ligación in vitro directa, se usa la secuencia aislada sola. En la recombinación homóloga y transferencia de marcador se requieren secuencias de ácido nucleico flanqueantes para efectuar la transferencia de la secuencia a un genoma viral de HCMV. Para su uso en complementación viral usando cósmidos, y otros vectores discutidos en ésta, la secuencia (o un fragmento de la misma) en un vector está preferiblemente unida operativamente a al menos 1 k.b. del ácido nucleico genómico del HCMV, y más preferiblemente a al menos 5 k.b. de ácido nucleico del HCMV. El ácido nucleico genómico del HCMV puede usarse en un lado o en ambos lados de la pauta de lectura abierta. Si sólo va a usarse una región específica de la pauta de lectura abierta para generar un virus mutante, se inserta en un vector una pauta de lectura abierta o un fragmento de la misma.

F. Nueva proteína de Toledo y Towne

Otro aspecto de la invención incluye el aislamiento de proteínas codificadas por la secuencia de ADN de Toledo o Towne tal como se enseña en ésta. Las proteínas pueden usarse para estudiar o modificar el ciclo vital del HCMV, porque codifican glicoproteínas de superficie que podrían ser inmunogénicas, y responder a tropismos de tejidos, o influenciar la respuesta inmune en un individuo infectado. Tales proteínas podrían, por tanto, usarse en la producción de una vacuna de subunidad contra el CMV. La construcción de tales candidatos de vacunas de subunidades contra el CMV es conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, Spaete, Virology 167:207-225 (1988).

Mediante análisis de ORF se han identificado veintiuna proteínas nuevas de Toledo y cuatro de Towne. Las nuevas proteínas de Toledo incluyen la UL130 (SEC. Nº ID.: 23), UL132 (SEC. Nº ID.: 27), UL133 (SEC. Nº ID.: 7), UL134 (SEC. Nº ID.: 8), UL135 (SEC. Nº ID.: 9), UL136 (SEC. Nº ID.: 10), UL137 (SEC. Nº ID.: 11), UL138 (SEC. Nº ID.: 12), UL139 (SEC. Nº ID.: 13), UL140 (SEC. Nº ID.: 14), UL141 (SEC. Nº ID.: 15), UL142 (SEC. Nº ID.: 16), UL143 (SEC. Nº ID.: 17), UL144 (SEC. Nº ID.: 18), UL145 (SEC. Nº ID.: 19), UL146 (SEC. Nº ID.: 20), UL147 (SEC. Nº ID.: 21), UL148 (SEC. Nº ID.: 22), 7 (SEC. Nº ID.: 24), UL150 (SEC. Nº ID.: 25), y/o UL151 (SEC. Nº ID.: 26). La UL130 está codificada por los nucleótidos 13.109 a 13.753, tal como muestra la Figura 1. La UL132 está codificada por los nucleótidos 11.673 a 12.485, tal como muestra la Figura 1. La UL133 está codificada por los nucleótidos 51 a 824, tal como muestra la Figura 1. La UL134 está codificada por los nucleótidos 541 a 1068, tal como muestra la Figura 1. La UL135 está codificada por los nucleótidos 941 a 1927, tal como muestra la Figura 1. La UL136 está codificada por los nucleótidos 2018 a 2740, tal como muestra la Figura 1. La UL137 está codificada por los nucleótidos 2599 a 2890, tal como muestra la Figura 1. La UL138 está codificada por los nucleótidos 2823 a 3332, tal como muestra la Figura 1. La UL139 está codificada por los nucleótidos 3895 a 4302, tal como muestra la Figura 1. La UL140 está codificada por los nucleótidos 4484 a 4828, tal como muestra la Figura 1. La UL141 está codificada por los nucleótidos 5098 a 6375, tal como muestra la Figura 1. La UL142 está codificada por los nucleótidos 6448 a 7368, tal como muestra la Figura 1. La UL143 está codificada por los nucleótidos 7353 a 7631, tal como muestra la Figura 1. La UL144 está codificada por los nucleótidos 8008 a 8538, tal como muestra la Figura 1. La UL145 está codificada por los nucleótidos 8867 a 9169, tal como muestra la Figura 1. La UL146 está codificada por los nucleótidos 9450 a 9803, tal como muestra la Figura 1. La UL147 está codificada por los nucleótidos 9868 a 10.347, tal como muestra la Figura 1. La UL148 está codificada por los nucleótidos 10.646 a 11.596, tal como muestra la Figura 1. La UL149 está codificada por los nucleótidos 15.756 a 16.124, tal como muestra la Figura 1. La UL150 está codificada por los nucleótidos 15.874 a 17.802, tal como muestra la Figura 1. La UL151 está codificada por los nucleótidos 17.289 a 18.299, tal como muestra la Figura 1.

Las nuevas proteínas de Towne incluyen la UL147, UL152, UL153 y UL154 (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4 y 5, respectivamente). La UL147 está codificada por los nucleótidos 841 a 1321, tal como muestra la Figura 2. La UL152 está codificada por los nucleótidos 1365 a 1721, tal como muestra la Figura 2. La UL153 está codificada por los nucleótidos 2501 a 3337, tal como muestra la Figura 2. La UL154 está codificada por los nucleótidos 3512 a 4711, tal como muestra la Figura 2.

"Proteína o proteínas de Toledo y/o Towne", tal como se usa en ésta, se refiere a las anteriores secuencias, enumeradas también en el listado de secuencias. "Proteína o proteínas de Toledo y/o Towne" se refiere también a una proteína homóloga procedente de cualquier cepa o aislado clínico de HCMV, incluyendo proteínas del HCMV que son al menos un 90% homólogas con las secuencias de aminoácidos de Toledo o Towne (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26 y 27). La proteína de Toledo o Towne puede modificarse para afectar el ciclo vital del HCMV mediante supresión, inserción y sustitución en la secuencia de ADN, tal como se discute en esta, o mediante síntesis química de una secuencia de aminoácidos diferente, o mediante modificación química. Las proteínas truncadas pueden formarse mediante supresión de una porción de la secuencia de ADN, o mediante la introducción de señal(es) de terminación en la secuencia de ADN. Las supresiones preferidas a la proteína corresponden a una secuencia o secuencias de aminoácidos suprimidas que contienen al menos un aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en Glu, Asp, Arg, Lys, Cys y Pro. Más preferiblemente, la secuencia o secuencias de aminoácidos suprimidas contienen al menos dos aminoácidos seleccionados de entre el grupo consistente en Glu, Asp, Arg, Lys, Cys y Pro. Más preferiblemente, la secuencia o secuencias de aminoácidos suprimidas contienen al menos dos prolinas.

Otras mutaciones de la proteína útiles para modificar el ciclo vital del HCMV incluyen, pero no se limitan a, la modificación de los sitios de fosforilación por cAMP (Arg/Lys-Arg/Lys-X-X-Asp/Glu) y/o de miristilización (Glicina-X1-X2-X3-Ser/Thr-X-X-Asp/Glu; en donde X1 no es Glu, Asp, Arg, Lys, His, Pro, Phe, Tyr, Trp, en donde X2 es cualquier aminoácido, y en donde X2 no es Pro), o modificaciones de sitios de fosforilación de la PKC (Ser/Thr-X-Arg/Lys), y/o sitios de glicosilación unida a N (Asn-X-Ser/Thr, en donde X no es Pro).

Las secuencias de ADN de Toledo o Towne, los análogos o fragmentos de la misma pueden expresarse en un mamífero, insecto, o microorganismo huésped. El polinucleótido se inserta en un vector de expresión apropiado, compatible con el tipo de célula huésped empleado, y está operativamente unido a los elementos de control dentro del vector. La construcción del vector emplea técnicas que son conocidas en la técnica. El corte del ADN específico en un sitio implicado en tal construcción se realiza mediante tratamiento con enzimas de restricción apropiados, bajo condiciones que generalmente están especificadas por el fabricante de estos enzimas disponibles comercialmente. Un vector de expresión apropiado es uno que es compatible con la función deseada (por ejemplo, expresión transitoria, expresión a largo plazo, integración, replicación, amplificación), y en el cual los elementos de control son compatibles con la célula huésped.

Expresión en células de mamífero

Los vectores apropiados para la replicación en células de mamífero son conocidos en la técnica, y pueden incluir replicones virales, o secuencias que aseguran la integración de la secuencia que codifica el ADN de Toledo o Towne en el genoma del huésped. Los ejemplos de vectores incluyen aquéllos derivados del SV40, retrovirus, virus del papiloma bovino, virus de la viruela vacuna, otros herpesvirus y adenovirus.

Tales vectores de expresión en mamíferos apropiados contienen un promotor para mediar la transcripción de secuencias de ADN ajenas y, opcionalmente, un potenciador. Los promotores apropiados son conocidos en la técnicas e incluyen promotores virales tales como los procedentes del SV40, del citomegalovirus (CMV), del virus del sarcoma de Rous (RSV), de adenovirus (ADV), y del virus del papiloma bovino (BPV).

La presencia opcional de un potenciador, combinado con el promotor descrito más arriba, típicamente incrementará los niveles de expresión. Un potenciador es cualquier secuencia de ADN reguladora que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando se une a promotores endógenos o heterólogos, iniciándose la síntesis en el sitio de inicio normal del mARN. Los potenciadores son también activos cuando se colocan cadena arriba o cadena abajo respecto del sitio de inicio de la transcripción, tanto en orientación normal como invertida, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos del promotor. Ver Maniatis, Science 236:1237 (1987), Alberts, Molecular Biology of the Cell, 2ª edición (1989). Los potenciadores derivados de virus podrían ser particularmente útiles, puesto que típicamente tienen un rango de huéspedes más amplio. Los ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano del SV40 (ver Dijkema, EMBO J. 4:761 (1985), y los potenciadores/promotores derivados de la repetición terminal larga (LTR) del RSV (ver Gorman, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777 (1982b)), y del citomegalovirus humano (ver Boshart, Cell 41:521 (1985)). Adicionalmente, algunos potenciadores son regulables y devienen activos sólo en la presencia de un inductor, tal como una hormona o ion metálico (ver Sassone-Corsi y Borelli, Trends Genet. 2:215 (1986)); Maniatis, Science 236:1237 (1987). Además, el vector de expresión puede incluir, y típicamente incluirá una secuencia de terminación y secuencias de adición poli(A), las cuales están operativamente unidas a la secuencia codificante de Toledo o Towne.

Las secuencias que causan la amplificación del gen también podrían incluirse de forma deseable en el vector de expresión, o en otro vector que es co-traducido con el vector de expresión que contiene una secuencia de ADN de Toledo o Towne, como lo son las secuencias que codifican marcadores seleccionables. Los marcadores seleccionables para células de mamíferos son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la quinasa de timidina, la reductasa del dihidrofolato (junto con el metotrexato como un amplificador de la DHFR), la fosfotransferasa de aminoglicósido, la fosfotransferasa de la higromicina B, la sintetasa de asparagina, la deaminasa de adenosina, la metalotioneína, y genes de resistencia a antibióticos como la neomicina.

El vector que codifica una proteína o polipéptido nuevo de Toledo o Towne de esta invención puede usarse para la transformación de una célula huésped de mamífero apropiada. La transformación puede ser mediante cualquier procedimiento conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, el empaquetado del polinucleótido en un virus y la transducción de un célula huésped con el virus. El procedimiento de transformación usado depende del huésped a transformar. Los procedimientos para la introducción de un polinucleótido heterólogo en células de mamífero son conocidos en la técnica, e incluyen la transfección mediada por dextrano, la precipitación con fosfato cálcico. la transfección mediada con polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, la encapsulación de polinucleótido(s) en liposomas, y la microinyección directa del ADN en el núcleo.

Las líneas celulares disponibles como huéspedes para la expresión son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo, pero no limitada a las células ováricas de hámster chino (CHO), las células HeLa, las células renales de cría de hámster (BHK), las células renales de mono (COS), las células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, las Hep G2), y un cierto número de otras líneas celulares.

Expresión en células de insecto

Los componentes de un sistema de expresión en células de insecto incluyen un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano, el cual contiene ambos, un fragmento del genoma del baculovirus y un sitio de restricción apropiado para la inserción del gen o genes heterólogos a expresar; un baculovirus del tipo salvaje con una secuencia homóloga al fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma del baculovirus); y células huésped de insecto apropiadas y medio de cultivo. Los ejemplos de vectores de transferencia para introducir genes ajenos en células de insecto incluyen el pAc373 y el pVL985. Ver Luckow y Summers, Virology 17:31 (1989).

El plásmido puede contener también la señal de poliadenilación polihedrón, y un gen procariota de resistencia a la ampicilina (amp) y un origen de replicación para la selección y propagación en E. coli. Ver Miller, Ann. Rev. Microbiol. 42:177 (1988).

Los vectores de transferencia para baculovirus usualmente contienen un promotor de baculovirus, esto es, una secuencia de ADN capaz de unir una polimerasa de ARN de baculovirus e iniciar la transcripción cadena abajo (5' a 3') de una secuencia codificante (por ejemplo, un gen estructural) en mARN. El promotor tendrá una región de inicio de la transcripción, la cual está usualmente ubicada en situación proximal al extremo 5' de la secuencia codificante, y típicamente incluye un sitio de unión para polimerasa de ARN y un sitio de inicio de la transcripción. Un vector de transferencia para baculovirus también puede tener un potenciador, el cual, si está presente, está habitualmente en posición distal respecto el gene estructural. La expresión puede ser regulada o constitutiva.

Expresión en levaduras y bacterias

Un sistema de expresión en levadura puede incluir típicamente uno o más de los siguientes: una secuencia promotora, una secuencia acompañante de la fusión, una secuencia líder, una secuencia de terminación de la transcripción. Un promotor de levadura, capaz de unir la polimerasa de ARN de levadura e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo, un gen estructural) en mARN, tendrá una región de inicio de la transcripción usualmente ubicada en posición proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción típicamente incluye un sitio de unión a la polimerasa de ARN (una caja "TATA") y un sitio de inicio de la transcripción. El promotor de levadura puede tener también una secuencia activadora cadena arriba, usualmente en posición distal respecto el gen estructural. La secuencia activadora permite la expresión inducible de la secuencia de ADN heteróloga deseada. La expresión constitutiva ocurren en ausencia de una secuencia activadora. La expresión regulada puede ser tanto positiva como negativa, potenciando o reduciendo de ese modo la transcripción.

Los promotores de levadura particularmente útiles incluyen los de la deshidrogenasa de alcohol (ADH) (patente EP publicada con el número 284.044), de la enolasa, de la glucoquinasa, de la isomerasa de glucosa-6-fosfato, de la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato (GAP o GAP-DH), de la hexoquinasa, de la fosfofructoquinasa, de la mutasa de 3-fosfoglicerato, y de la quinasa de piruvato (PyK) (patente EP publicada con el número 329.203). El gen PHO5 de levadura, que codifica la fosfatasa ácida, proporciona también secuencias promotoras útiles. Ver Myanohara, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:1 (1983).

Una secuencia de Toledo o Towne, un análogo o fragmento activo de la misma, puede expresarse intracelularmente en levadura. Una secuencia promotora puede unirse directamente con la secuencia o fragmento, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína recombinante será siempre una metionina, la cual está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N-terminal puede cortarse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Las proteínas de fusión expresadas intracelularmente proporcionan una alternativa a la expresión directa de una secuencia. Típicamente, una secuencia de ADN que codifica la porción N-terminal de una proteína estable, un acompañante de fusión, se fusiona al extremo 5' del ADN heterólogo que codifica el polipéptido deseado. A partir de su expresión, esta construcción proporciona una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la superóxido dismutasa (SOD) humana o de levadura puede unirse al extremo 5' de una secuencia y expresarse en levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos podría codificar o no un sitio suprimible. Ver, por ejemplo, la patente EP con nº de publicación 196.056. Alternativamente, los polipéptidos pueden secretarse también, a partir de la célula hacia el medio de cultivo, mediante la creación de una proteína de fusión que formada por un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción del polipéptido en levaduras o bacterias. Preferiblemente, hay sitios de procesado codificados entre el fragmento líder y la secuencia que pueden cortarse in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia líder típicamente codifica un péptido señal formado por aminoácidos hidrofóbicos, el cual dirige la secreción de la proteína a partir de la célula. El ADN codificando secuencias señalizadoras apropiadas puede derivarse a partir de genes de proteínas de levadura secretadas, tales como el gen de la invertasa de levadura (patente EP con nº de publicación 12.873) y el gen del factor-A (patente estadounidense nº 4.588.684). Alternativamente, pueden usarse líderes no originarios de levaduras, tales como el líder del interferón, para proporcionan la secreción en levadura (patente EP con nº de publicación 60.057). Las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura son regiones reguladoras ubicadas 3' respecto el codón de detención de la traducción. Éstas, junto con el promotor, flanquean la secuencia codificante heteróloga deseadas. Estas secuencias flanqueantes dirigen la transcripción de un mARN, el cual puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN.

Típicamente, los componentes descritos más arriba, que comprenden una secuencia promotora, líder (si se desea) y codificante de interés, y una secuencia de terminación de las transcripción, se colocan juntos en plásmidos capaces de mantenerse estables en un huésped tal como levadura o bacteria. El plásmido puede tener dos sistemas de replicación, de forma que puede mantenerse como un vector lanzadera, por ejemplo, en levadura para la expresión y en un huésped procariota para su clonación y amplificación. Los ejemplos de tales vectores lanzadera levadura-bacteria incluyen el YEp24 (ver Botstein, Gene 8:17-24 (1979)), pCI/I (ver Brake, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646 (1984)), y YRp17 (ver Stinchcomb, J. Mol. Biol. 158:157 (1982)). Además, el plásmido puede ser tanto un plásmido con un número elevado o bajo de copias. Un plásmido con un número elevado de copias generalmente tendrá un número de copias que oscilará desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 200, y típicamente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 150. Un huésped que contenga un plásmido con un número elevado de copias tendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20. Podría seleccionarse tanto un vector con un número elevado o bajo de copias, dependiendo del efecto del vector sobre el huésped y de los polipéptidos. Ver, por ejemplo, Brake et al., ver más arriba.

Alternativamente, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma de levadura con un vector de integración. Los vectores de integración típicamente contienen al menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura, la cual permite la integración del vector, y preferiblemente contiene dos secuencias homólogas flanqueando la construcción de expresión. Ver Orr-Weaver, Methods in Enzymology 101:228-245 (1983) y Rine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750 (1983).

Típicamente, los vectores extracromosómicos y de integración pueden contener marcadores seleccionables parar permitir la selección de cepas de levadura que hayan sido transformadas. Los marcadores seleccionable pueden incluir genes biosintéticos que pueden expresarse en la levadura huésped, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, y ALG7, y el gen de la resistencia G418, los cuales confieren a las células de levadura resistencia respectivamente contra la tunicamicina y el G418. Además, un marcador seleccionable apropiado puede proporcionar también levaduras con la capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos, tales como metales. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite a las levaduras crecer en presencia de iones de cobre. Ver Butt, Microbiol. Rev. 51:351 (1987).

Alternativamente, algunos de los componentes descritos más arriba pueden disponerse juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están formados típicamente por un marcador seleccionable, que o se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, tal como se ha descrito más arriba. Se han desarrollado muchos vectores de expresión y transformación, o extracromosómicos o integrantes, para la transformación en muchas levaduras. Los ejemplos de líneas de levaduras son Candida albicans (Kurtz, Mol. Cell. Biol. 6:142 (1986)), Candida maltosa (Kunze, J. Basic Microbiol. 25:141 (1985)), Hansenula polymorpha (Gleeson, J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) y Roggenkamp, Mol. Gen. Genet. 202:302 (1986)), Kluyveromyces fragilis (Das, J. Bacteriol. 158:1165 (1984)), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt, J. Bacteriol. 154:737 (1983) y Van den Berg, Bio/Technology 8:135 (1990), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929 (1978) e Ito, J. Bacteriol. 153:163 (1983)), Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature 300:706 (1981)), y Yarrowia lipolytica (Davidow, Curr. Genet. 10:380-471 (1985) y Gaillardin, Curr. Genet. 10:49 (1985)).

Los procedimientos para introducir ADN exógeno en huéspedes de levadura son bien conocidos en la técnica, e incluyen típicamente, o la transformación de esferoplastos o de células de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación usualmente varían con las especies de levaduras a transformar. Consultar las publicaciones listadas en el parágrafo anterior para técnicas de transformación apropiadas.

Adicionalmente, el gen o fragmento del mismo puede expresarse en un sistema bacteriano. En tal sistema, un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unir la polimerasa de ARN bacteriana e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo, un gen heterólogo deseado) en mARN. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que está usualmente ubicada de forma proximal respecto el extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción típicamente incluye un sitio de unión a la polimerasa de mARN y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano puede tener también un segundo dominio denominado un operador, el cual puede solapar un sitio de unión de polimerasa de mARN adyacente en el cual se inicia la síntesis del ARN. El operador permite una transcripción regulada negativamente (inducible), ya que una proteína represora del gen puede unirse al operador e inhibir de ese modo la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede ocurrir en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, la regulación positiva puede conseguirse mediante una secuencia unidora de proteína activadora de genes, las cual, si está presente, está habitualmente en situación proximal (5') respecto la secuencia de unión de la polimerasa de ARN. Un ejemplo de proteína activadora de genes es la proteína activadora catabólica (CAP), la cual ayuda a que se inicie la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli). Ver Raibaud, Ann. Rev. Genet. 18:173 (1984). Por tanto, la expresión regulada puede ser positiva o negativa, potenciando o reduciendo de ese modo la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de vías metabólicas proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen las secuencias promotoras derivadas de enzimas que metabolizan azúcares, tales como la galactosa, lactosa (lac) (ver Chang, Nature 198:1056 (1977)), y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticos tales como el triptófano (trp) (ver Goeddel, Nuc. Acids Res. 8:4057 (1981), Yelverton, Nuc. Acids Res. 9:731 (1981), patente estadounidense nº 4.738.921 y patente EP con nº de publicación 36.776 y 121.775). El sistema promotor de la lactomasa (bla) (ver Weissmann, Interferon 3 (ed. I. Gresser), el sistema del promotor PL del bacteriófago lambda (ver Shimatake, Nature 292:128 (1981), y el sistema promotor del T5 (patente estadounidense nº 4.689.406) también proporcionan secuencias promotoras útiles.

Además, los promotores sintéticos que no ocurren en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófago pueden unirse con las secuencias operón de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético tal como el promotor tac (ver patente estadounidense nº 4.551.433, Amann, Gene 25:167 (1983) y de Boer, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21 (1983)). Un promotor bacteriano puede incluir promotores que ocurren de forma natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unir la polimerasa de ARN bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que ocurre de forma natural y que no es de origen bacteriano puede unirse con una polimerasa de ARN compatible para producir niveles elevados de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema promotor/polimerasa de ARN del bacteriófago T7 es un ejemplo (ver Studier, J. Mol. Biol. 189:113 (1986) y Tabor, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074 (1985)).

Además de una secuencia promotora funcional, un sitio de unión a ribosomas eficiente también es útil para la expresión de la secuencia de ADN, o de un fragmento de la misma, en procariotas. En E. coli, el sitio de unión de ribosomas se denomina secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud ubicada 3-11 nucleótidos cadena arriba respecto el codón de inicio (ver Shine, Nature 254:34 (1975)). Se cree que la secuencia SD promueve la unión del mARN al ribosoma emparejando las bases entre la secuencia SD y el extremo 3' del rRNA de 16S de E coli (ver Steitz, Biological Regulation and Development: Gene Expression, ed. R. F. Goldberger, 1979).

Las nuevas proteínas de Toledo o Towne de la expresión pueden expresarse intracelularmente. Una secuencia promotora puede unirse directamente a una secuencia nueva de Toledo o Towne, a un análogo o fragmento de la misma, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N-terminal será una metionina, la cual está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N-terminal puede separarse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno, o mediante incubación in vivo o in vitro con una peptidasa bacteriana de metionina N-terminal. Ver la patente EP con nº de publicación 219.237.

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a la expresión directa. Típicamente, una secuencia de ADN que codifica la porción N-terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona al extremo 5' de secuencias codificantes heterólogas. Esta construcción, a partir de su expresión, proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la célula del bacteriófago lambda puede unirse al extremo 5' de un fragmento de secuencia de la misma, y expresarse en bacteria. La proteína de fusión resultante preferiblemente retiene un sitio para que un enzima procesador (factor Xa) separe la proteína del bacteriófago de la secuencia o fragmento de la misma (ver Nagai, Nature 309:810 (1984)). Una proteína de fusión también puede prepararse con secuencias procedentes del gen lacZ (Jia, Gene 60:197 (1987)), del gen trpE (Allen, J. Biotechnol. 5:93 (1987)) y Makoff, J. Gen. Microbiol. 135:11 (1989), y del gen Chey (patente EP con nº de publicación 324.647). La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos podría codificar o no un sitio suprimible. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina (por ejemplo, una proteasa de procesamiento específica para ubiquitina) para separar la ubiquitina del polipéptido. A través de este procedimiento, pueden aislarse polipéptidos maduros de Toledo o Towne. Ver Miller, Bio/Technology 7:698 (1989).

Alternativamente, las proteínas o polipéptidos pueden secretarse también a partir de la células mediante la creación de moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión que comprende un fragmento de una secuencia de un péptido señal para la secreción de las proteínas o polipéptidos en bacterias. (Ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.336.336). El fragmento de la secuencia señal típicamente codifica un péptido señal formado por aminoácidos hidrofóbicos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. La proteína o se secreta hacia el medio de cultivo (bacterias gram-positivas) o hacia el espacio periplasmático, ubicado entre las membranas interna y externa de la célula (bacterias gram-negativas). Preferiblemente hay sitios de procesamiento, los cuales pueden cortarse bien in vivo o in vitro, codificados entre el fragmento del péptido señal y la proteína o polipéptido.

El ADN que codifica secuencias señal apropiadas puede derivarse a partir de genes de proteínas bacterianas secretadas, tales como el gen de la proteína de membrana externa de E. coli (ompA) (Masui, Experimental Manipulation of Gene Expression (1983) y Ghrayeb, EMBO J. 3:2437 (1984)), y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) (ver Oka, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212 (1985)). La secuencia señal del gen de la alfa-amilasa procedente de varias cepas de Bacilus puede usarse para secretar proteínas heterólogas a partir de B. subtilis (ver Palva, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:5582 (1982) y la patente EP con nº de publicación 244.042).

Las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por bacterias son regiones reguladoras ubicadas 3' respecto el codón de paro de la traducción. Flanquean, junto con el promotor, la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mARN, el cual puede traducirse en la proteína o polipéptido de Toledo o Towne codificado por la secuencia de ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción frecuentemente incluyen secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos, capaces de formar estructuras con forma de bucle de tronco que ayudan a finalizar la transcripción. Los ejemplos incluyen las secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli, así como otros genes biosintéticos.

Típicamente, el promotor, la secuencia señalizadora (si se desea), la secuencia codificante de interés, y la secuencia de terminación de la transcripción se mantienen en un elemento extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) capaz de mantenerse estable en el huésped bacteriano. El plásmido tendrá un sistema de replicación, permitiendo por tanto que se mantenga en el huésped bacteriano tanto para su expresión o para su clonación y amplificación. Además, el plásmido puede ser un plásmido con un número elevado o bajo de copias. Un plásmido con un número elevado de copias tendrá generalmente un número de copias que oscilará desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 200, y típicamente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 150. Un huésped que contenga un plásmido con un número elevado de copias contendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 plásmidos.

Alternativamente, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración contienen típicamente al menos una secuencia homóloga con el cromosoma bacteriano, la cual permite que se integre el vector. La integración parece resultar de recombinaciones entre ADN homólogos en el vector y el cromosoma bacteriano. Ver, por ejemplo, la patente EP con nº de publicación 127.328.

Típicamente, las construcciones de expresión extracromosómicas e integradoras pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que hayan sido transformadas. Los marcadores seleccionables pueden expresarse en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que hacen a la bacteria resistente a drogas tales como la ampicilina, el cloramfenicol, al eritromicina, la kanamicina (neomicina) y la tetraciclina (ver Davies, Ann. Rev. Microbiol. 32:469 (1978)). Los marcadores seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, tales como los de las vías biosintéticas de la histidina, triptófano y leucina.

Alternativamente, algunos de los componentes descritos más arriba pueden disponerse juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están típicamente formados por un marcador seleccionable, el cual se mantiene bien en un vector extracromosómico, bien en un vector que se integra, tal como se ha descrito más arriba.

Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, bien extracromosómicos o integradores, para la transformación en muchas bacterias. Son ejemplos los vectores de expresión descubiertos en Palva, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:5582 (1982), las patentes EP con nº de publicación 036.259 y 063.953, y la publicación de patente PCT WO84/04.541 (para B subtilis); en Shimatake, Nature 292:128 (1981), Amann, Gene 40:183 (1985), Studier, J. Mol. Biol. 189:113 (1986), y las patentes EP con nº de publicación 036.776, 136.829 y 136.907 (para E. coli); en Powell, Appl. Environ. Microbiol. 54:655 (1988) y en la patente estadounidense nº 4.745.056 (para Streptococcus).

Los procedimientos para introducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos son bien conocidos en la técnica, y típicamente incluyen la transformación de bacterias tratadas con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. En ADN puede introducirse también en células bacterianas mediante electroporación. Las metodologías de ejemplo pueden hallarse en Masson, FEMS Microbiol. Let. 60:273 (1989), Palva, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:5582 (1982), las patentes EP con nº de publicación 036.259 y 063.953, y la patente PCT publicada como WO-84/05.541 para la transformación de Bacillis. Para la transformación de campylobacter consultar, por ejemplo, Miller, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856 (1988) y Wang, J. Bacteriol. 172:949 (1990). Para E. coli consultar, por ejemplo, Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110 (1973), Dower, Nuc. Acids. Res. 16:6127 (1988); Kushner, Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (Eds. H. W. Boyer y S. Nicosia); Mandel, J. Mol. Biol. 53:159 (1970) y Taketo, Biochem. Biophys. Acta 949:318 (1988). Para Lactobacillus y Pseudomonas consultar, por ejemplo, Chassy, FEMS Microbiol. Let. 44:173 (1987) y Fiedler, Anal. Biochem. 170:38 (1988), respectivamente. Para Streptococcus consultar, por ejemplo, Augustin, FEMS Microbiol. Let. 66:203 (1990); Barany, J. Bacteriol. 144:698 (1980); Harlander, Streptococcal Genetics (Eds. J. Ferretti y R. Curtiss III) (1987); Perry, Infec. Immun. 32:1295 (1981); Powell, Appl. Environ. Microbiol. 54:655 (1988) y Somkuti, Proc. 4th Evr. Cong. Biotechology 1:412 (1987).

La presente invención se ilustra mediante los ejemplos siguientes.

Materiales y procedimientos A. Células y virus

Las cepas AD169, Towne y Toledo del CMV humano se obtuvieron de E. S. Mocarski (Stanford University) y se usaron en todos los experimentos. Dos de estas cepas estaban también disponibles a través de la ATCC, nº de acceso VR-538 (AD169) y VR-977 (Towne). Los virus se cultivaron en células de fibroblastos de prepucio humano (HF) con medio de Dulbecco modificado por Eagle (DME) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) tal como se ha descrito previamente en Spaete y Mocarski, J. Virol. 56:135-143 (1985), pero suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS), L-glutamina (2 mM), penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml), y piruvato (1 mM). Para preparar los ADN de las cepas AD169, Towne y Toledo de CMV mediante centrifugación hasta el equilibrio en gradiente de NaI, tal como se habían descrito previamente Spaete y Mocarski, J. Virol. 54:817-824 (1985), se infectaron botellas rotatorias con las cepas de CMV a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001 unidades formadoras de calvas (pfu)/célula para minimizar la producción de partículas de virus defectuosas. Las células infectadas se alimentaron de nuevo con medio a los cuatro días después de la infección. A los ocho días después de la infección, cuando la monocapa estaba bien infectada, se rasparon las células en tubos cónicos de 50 ml, en 10 ml de medio por botella rotatoria, y se apelotonaron a 1000 revoluciones por minuto (r.p.m.) durante 10 minutos. Los precipitados se resuspendieron en 2,0 ml de Tris 0,01 M y EDTA 0,01 (TE) (pH 7,4) con un 1% de NP40, un 1% de deoxicolato, y se incubaron sobre hielo hasta que todos los núcleos celulares estaban lisados cuando se observaban al microscopio. Los lisados se transfirieron a tubos 2059 (Falcon) y se centrifugaron a 2600 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se transfirieron a otros tubos 2059, y se añadió RNAsa (Worthington-libre de ADNasa) a 50 \mug/ml, seguida inmediatamente por Proteinasa K (200 \mug/ml) y sodiododecilsulfato (SDS). Los sobrenadantes se incubaron en un baño de agua a 65ºC durante 60 minutos, se llevaron hasta 16 ml con TE, pH 7,4, se añadieron a 24 ml de NaI saturado y 0,15 ml de bromuro de etidio (5 mg/ml). Se centrifugaron las muestras hasta su equilibrio a 55.000 r.p.m., a 20ºC, durante 24 horas, en un rotor Beckman Ti70. Las fracciones que contenían el ADN viral se extrajeron con butanol equilibrado con TE con agitación suave, seguida por centrifugación a 3000 r.p.m. durante 10 minutos a 20ºC, y se extrajeron aún más de 2 a 3 veces con butanol para reducir el volumen. Las muestras se extrajeron con un volumen igual de alcohol isoamílico equilibrado con TE, se agitaron, y se extrajeron de nuevo. El ADN se dializó respecto tres cambios de TE con 1% de fenol y NaCl 1 M. Se leyeron la OD_{260} y la OD_{280} para determinar la pureza del ADN de AD160, Toledo y Towne.

Los aislados clínicos se obtuvieron de M. Fiala (Rancho Mirage, CA) y S. Choyu (Oregon Health Sciences University). El aislamiento rápido del ADN viral de células infectadas por el HCMV se realizó tal como ha sido previamente descrito en Spaete y Frenkel, Cell 30:295-304 (1982), excepto que el ADN no se marcó radiactivamente antes de su purificación. En resumen, las monocapas de células infectadas (frascos de 25 cm^{2}) se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se lisaron en 1,0 ml de una solución 0,1 M de NaCl, TE, pH 8,0, SDS al 0,05%, y 0,1 mg/ml de Proteinasa K. Los lisados de incubaron 2-24 horas a 37ºC, se extrajeron dos veces con 1 volumen de fenol, 1 volumen de cloroformo, seguidos por centrifugación a 2500 r.p.m. durante 5 minutos para separar las fases. La fase acuosa se extrajo dos veces con 1 volumen de éter y el ADN se precipitó con 0,1 volúmenes de NaAC 4 M y dos volúmenes de etanol o isopropanol. Se congeló el ADN, se recolectó mediante centrifugación o enrollado sobre una vara de vidrio, se secó y se resuspendió en TE.

B. ADN plasmídico

Los plásmidos pXbal E, pXbal T y pXbal Q (Thomsen y Stinski, 1981), representando las unidades 0,69 a 0,8 del mapa de la cepa Towne, se obtuvieron de M. Stinski (University of Iowa).

El clon 65 se derivó mediante clonación de un fragmento de ADN de Toledo, digerido con BamHI y extraído en gel, en el sitio BamHI del plásmido pGEM®-3Zf+ (Promega, Madison, WI). En resumen, cinco \mug de ADN de Toledo se digirieron con 40 unidades de BamHI y se electroforesaron en un gel preparativo de agarosa de bajo punto de fusión, al 1%, a 490 voltios hora, en tampón TAE 1x. El ADN de Toledo que migraba a cerca de 5 pares de kilobases (kpb) se cortó, y se digirió la agarosa con 2 unidades de \beta-agarasa I (New England BioLabs, Beverly, MA). Este fragmento de ADN se precipitó con 2 volúmenes de isopropanol, se congeló a -20ºC, se centrifugó en una centrífuga Eppendorf durante 15 minutos, se secó y resuspendió en 50 \mul de TE. El fragmento extraído del gel se ligó a pGEM®-3Zf+ digerido con BamHI usando la ligasa de ADN de T4 (New England BioLabs, Berverly, MA), y una alícuota de la mezcla de ligación se usó para transformar Escherichia coli XL-1 Blues competente (Stratagene, La Jolla, CA) mediante el procedimiento de choque con calcio (Mandel y Riga, 1970), o mediante electroporación usando procedimientos como el escrito en la Pulse Controller Guide publicada por BioRad (Richmond, CA).

El Cósmido 1 es fragmento de ADN de Toledo de aproximadamente 53 kbp, digerido parcialmente con HindIII, que abarca 0,69 a 0,87 unidades de mapa clonadas en el cósmido pHC79 (Hohn y Collins, 1980) obtenido de E. S. Mocarski (Stanford University). Los siguientes se subclonaron a partir del Cósmido 1:

: Los clones 4 y C1300 se derivaron mediante clonación de fragmentos digeridos con BamHI procedentes del Cósmido 1 en un vector plasmídico Bluescript M13+. Como tales, estos clones representan secuencia de ADN de Toledo que abarca porciones del Cósmido 1.

: El clon C23K se derivó como un fragmento completo del ADN del Cósmido 1, digerido con BamHI y circularizado mediante ligación.

C. Preparación de sondas marcadas radiactivamente e hibridación

El ADN plasmídico o viral se marcó radiactivamente in vitro mediante traducción con muescas (Rigby et al., 1977) con un equipo (Boehringer Mannheim), y usando [\alpha^{32}P]dCTP (Amersham Corp.). Las hibridaciones a ADN de CMV inmovilizado se realizaron esencialmente como describieron Spaete y Mocarski, J. Virol. 54:817-824 (1985), pero a 68ºC en una solución de 6x SSC (1x SSC es NaCl 0,15, más citrato sódico 0,015 M), 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de Ficoll, 0,2% de albúmina de suero bovino, y 0,1% de sodiododecilsulfato, con la cantidad de ADN de esperma de salmón cambiada de 25 \mug/ml a 100 \mug/ml, y reduciéndose el 30% de formamida al 15%.

El ADN se transfirió a membranas de transferencia de nilón Hybond-N+ (Amersham Corp.), después de su digestión con enzima de restricción y electroforesis en geles de agarosa al 1%, mediante técnicas estándares (Maniatis et al., 1982). El ADN se entrecruzó con la membrana con 120.000 microjoules/cm^{2} de irradiación UV, usando un UV Crosslinker 1000 (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Las membranas de pre-hibridaron durante 1 hora a 68ºC en una solución A (6x SSC, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de Ficoll, 0,2% de albúmina de suero bovino, 0,1% de sodiododecilsulfato, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, y 15% de formamida); a continuación, la sonda marcada con [\alpha^{32}P] y traducida con muescas, en una solución que contenía 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, se desnaturalizó hirviéndola durante cinco minutos, se enfrió rápidamente sobre hielo, se añadió a la membrana y se dejó hibridar durante la noche a 68ºC. Después de la hibridación, la sonda sin templar se retiró lavando la membrana con 3x de 2x SSC, seguida por reincubación en solución A que carecía de ADN de esperma de salmón, a 68ºC, durante 15 minutos. El procedimiento de lavado se repitió, se lavó la transferencia en un gran volumen de 2xSSC a temperatura ambiente, se secó la membrana con aire y se autoradiografió usando película Kodak X-AR.

D. Determinación y análisis de la secuencia de nucleótidos

Todas las secuencias de ácido nucleico se determinaron mediante el procedimiento de terminación de la cadena con dideoxinucleótido (Sanger et al., 1977). Se prepararon una variedad de plantillas para secuenciar; éstas incluían ADN de fago de hebra única, ADN de cósmido y plásmido de doble hebra, ADN genómico viral, y productos de la PCR. Se emplearon la secuenciación manual y automática (con un instrumento ABI 373A). Se usaron ambos, protocolos de un ciclo y de múltiples ciclos. La secuencia se determinó para ambas hebras. Las regiones ambiguas se corrigieron mediante secuenciación adicional después de corregir las pruebas. Los cebadores usados para la secuenciación se sintetizaron en un instrumento ABI 392 (Applied Biosystems). Los análisis de contig y de la secuencia se realizaron usando MacDANSIS (Hitachi). Las búsquedas de homología se realizaron usando el programa BLAST a través de los servicios NCBI.

Ejemplo 1 Identificación de secuencias nuevas en el genoma de aislados de las cepas Towne y Toledo de CMV

Para determinar la representación cruzada de las secuencias de ADN en las cepas Towne y Toledo de CMV, el ADN viral procedente de cada cepa se digirió hasta su conclusión con XbaI, ClaI, BamHI, BgIHI, EcoRI, y HindIII. Después de su electroforesis a través de un gel de agarosa al 1%, los ADN de CMV se desnaturalizaron en NaCl 0,2 M/NaOH 0,6 M, se neutralizaron en NaCl 0,6 M/Tris 1 M, pH 7,5, in situ, y el gel se sumergió en 20x SSC durante 30 minutos. Se prepararon transferencias en estéreo colocando membranas de nilón Hybond-N+ de igual tamaño (Amerham Corp.) sobre cada cara del gel, y transfiriendo los ADN a las membranas en ambas direcciones usando la acción capilar de toallitas de papel. Después de transferir durante la noche en 20x SSC, se lavaron las membranas en 2x SSC, y los ADN se inmovilizaron sobre las membranas mediante irradiación con UV tal como se ha descrito más arriba.

Se prepararon sondas de ADN con ADN de Toledo y Towne con un promedio de 500 p.b. sonicando 10 \mug de cada ADN en un tubo 2063 (Falcon Plastics), usando 4 pulsos de 10 segundos cada uno, a un ajuste de 3 en un sonicador de Heat Systems Inc. (Farmingdale, NY). A continuación de la sonicación, los ADN virales se digirieron con los enzimas de restricción AvaI, BanI y BfaI, para reducir aún más la complejidad de tamaño de la sonda de ADN. Se escogieron estos enzimas porque una búsqueda de las secuencias de ADN de AD169 en las bases de datos (EMBL, número de acceso X17403), reveló abundante sitios de corte (326, 386 y 341, respectivamente); sus tampones de digestión con enzimas de restricción son compatibles; y sus sitios no se solapan. Los geles teñidos con bromuro de etidio de los ADN virales trasquilados preparados de este modo, revelaron un rango de tamaños de ADN desde 1300 p.b. hasta menos de 100 p.b., con la mayoría de ADN migrando a aproximadamente 300 p.b., tal como se juzgó mediante migración simultánea con un marcador estándar de ADN de \varnothingX174 digerido con HaeIII (New England BioLabs, Beverly, MA). El ADN de la sonda trasquilada de Towne y Toledo se tradujo a continuación con muescas usando [\alpha^{32}P]dCTP (Amersham Corp.), tal como se ha descrito más arriba, y cada sonda se aplicó a transferencias estéreo de ADN de Towne y Toledo inmovilizado, y digerido con enzimas de restricción. Después de su hibridación y autoradiografía, se analizaron los patrones de hibridación para determinar los fragmentos en cada perfil de ADN que no se habían hibridado con la sonda de la cepa heteróloga, pero que sí se hibridaban con la sonda de la cepa homóloga. Por ejemplo, la pérdida de una señal para un banda prominente de 5 p.k.b. en el digerido con BamHI del ADN de Toledo, cuando se usaba la sonda de Towne, la cual estaba presente cuando se usaba el ADN de Toledo para verificarse a sí mismo, revelaron una región de divergencia de secuencia entre los dos aislados (ver la Figura 3).

Este fragmento de 5 p.k.b. se clonó mediante extracción del gel, tal como se ha descrito más arriba, y se denominó clon 65. El ADN de Toledo del clon 65 se secuenció en su totalidad y se comparó con la secuencia de ADN de Towne generada a partir del clon pXbal T, el cual mostraba que era divergente de las secuencias de ADN de AD169 (ver Ejemplo 2, más adelante). La secuencia completa del clon 65 se muestra en la Figura 1. En la Figura 1, el clon 65 empieza con el nucleótido 4664 y termina con el nucleótido 9327. Sorprendentemente, el ADN procedente del clon pXbal T del ADN de Towne (1856 p.b.) y el clon 65 del ADN de Toledo (4668 p.b.) compartían 104 p.b. de identidad de secuencia. Este pequeño trozo de homología de secuencia permitió el mapado de la región de divergencia del ADN de Toledo hasta la frontera del componente Único Largo (U_{L}), y las repeticiones invertidas (denominadas alternativamente IRL o secuencias b') en los mapas de ADN de AD169 y Towne. Estas secuencias recién aisladas de nucleótidos de la cepa Toledo procedentes del clon 65 no estaban representadas en la cepa de laboratorio de referencia, AD169, la cual había sido secuenciada en su totalidad por Chee y colegas (EMBL, nº de acceso X17403).

Ejemplo 2 Identificación de secuencias nuevas en el genoma de CMV Towne no halladas en la cepa de referencia AD169

Se ha hallado heterogeneidad de secuencia de ADN entre la cepa Towne y la cepa AD169. Ver, Pritchett, J. Virology 36:152-161 (1980). No obstante, aunque la organización estructural general del genoma del CMV ha sido determinada, y los polimorfismos de sitios de restricción entre cepas han sido mapados para muchas cepas, las diferencias entre cepas a nivel de nucleótido no han sido determinadas. La cepa de laboratorio AD169 fue el primer aislado de CMV que se secuenció y ha servido como cepa de referencia para definir la complejidad genética del genoma del CMV.

Con objeto de examinar las diferencias de secuencia de nucleótidos entre la Towne y la AD169, nos concentramos en la región que se había mostrado era divergente en la cepa Toledo, es decir, la frontera entre el componente U_{L} y las secuencias b', tal como se ha explicado con detalle en el EJEMPLO 1. El plásmido pXbal T se marcó usando el equipo de detección NEBlot™ Phototope™ (New England BioLabs, Beverly, MA), y se usó como una sonda en transferencias de ADN de AD169, Toledo y Towne digerido con enzimas de restricción e inmovilizado. En resume, el pXbal T se linealizó con PvuII, se precipitó con etanol y se resuspendió en 34 \mul de agua libre de nucleasas. El plásmido se desnaturalizó en agua hirviendo durante cinco minutos, se enfrió rápidamente sobre hielo durante cinco minutos, y se centrifugó brevemente a 4ºC. Los siguientes reactivos se añadieron a un tubo en el orden indicado: 10 \mul de 5x mezcla de marcaje, 5 \mul de mezcla de dNTP, 1 \mul de polimerasa I de ADN (fragmento Klenow). Se incubó la mezcla a 37ºC durante 6 horas, y se terminó la reacción añadiendo 5 \mul de EDTA 0,2 M, pH 8,0. La sonda se precipitó añadiendo 5 \mul de LiCl 4 M y 150 \mul de etanol, congelando a -80ºC durante 30 minutos, se precipitó en una centrífuga Eppendorf, se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 20 \mul de Tampón de Resuspensión tal como lo suministraba el equipo. La reacción de hibridación fue esencialmente como se ha descrito más arriba, excepto que después de la hibridación la membrana se lavó dos veces en 2x SSC, 0,1% de SDS, a temperatura ambiente durante 5 minutos cada una, seguidas por dos lavados en 0,1x SSC, 0,1% de SDS, a 68ºC durante 15 minutos. Las reacciones de detección unen las sondas biotiniladas a la fosfatasa alcalina a través de un puente de estreptoavidina, y la sonda fue visualizada mediante corte del sustrato Lumigen-PPD. Los pasos de bloqueo, incubación con estreptoavidina, incubación con fosfatasa alcalina, y la reacción con Lumigen-PPD se realizaron tal como se describe en el manual del equipo. La exposición de las transferencias a película Kodak XAR reveló que, tal como se esperaba, (i) un fragmento digerido con XbaI de 1,85 p.k.b. de tamaño (XbaI T) se hibridaba con ADN de Towne sondeado con pXbal T, y (ii) en el ADN de Toledo había un fragmento digerido con XbaI que migraba conjuntamente. El ADN de AD169 no consiguió mostrar ninguna señal de hibridación en ninguno de los patrones de digestión con enzimas de restricción. La secuencia de nucleótidos del pXbal T confirmó la total ausencia de identidad del ADN de Towne y del ADN de AD169. La secuenciación de nucleótidos del ADN del Cósmido 1 (ver B. ADN plasmídico en Materiales y Procedimientos, más arriba) procedente de Toledo reveló una extensa identidad de secuencia entre el ADN recién identificado de Towne y el ADN de Toledo del cósmido 1 en esta región. Sorprendentemente, la orientación de la secuencia estaba invertida en Toledo en relación a Towne.

Ejemplo 3 Identificación de secuencias nuevas de ADN de Toledo en los genomas de asilados clínicos recientes, y no halladas en la cepa de referencia AD169

Para determinar la penetración de las secuencias representadas por el clon 65 en aislados clínicos recientes, se digirieron cinco aislados clínicos representativos (HCMVF, C128, C354, C793 y C980) con los enzimas de restricción BamHI y XbaI, junto con los ADN de Toledo, Towne y AD169 preparados tal como se describe más arriba en la sección MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS, se electroforesaron a través de agarosa, se transfirieron a membrana de transferencia de nilón Hybond-N+, y se sondearon con el clon 65 marcado con [\alpha^{32}P], traducido con muescas, de acuerdo con los procedimientos detallados en la sección de MATERIALES y PROCEDIMIENTOS. Como puede observarse en la Figura 4, las autoradiografías revelaron que se detectaba homología en la totalidad de los aislados clínicos. En la Figura 4, una banda de aproximadamente 5 p.k.b está visible en el carril 1 (el ADN de Toledo), aparece en el ADN de Towne (carril 2), está ausente en el carril 3 (el ADN de AD169), y visible en los carriles 4 a 8 (los aislados clínicos HCMVF, C128, C354, C793 y C980). Estos resultados demuestran que la secuencia recién aislada, que se halla en la cepa Toledo del HCMV, también está presente en los aislados clínicos recientes, pero no está presente en la cepa de referencia AD169. El análisis de la secuencia de nucleótidos revela que la razón de la débil señal de hibridación al fragmento de ADN de Towne se debe a la existencia de tan sólo 151 nucleótidos de identidad de secuencia con el ADN de Towne. La identidad de 104 p.b. compartidas del Ejemplo 1 es responsable de la débil señal de hibridación con los fragmentos de tamaño "T" de XbaI procedentes de ambos, los ADN de Towne y Toledo, observada en las digestiones con XbaI (carriles 9 y 10). La digestión con XbaI de los aislados clínicos (carriles 12 a 16) revela también la hibridación a múltiples bandas de peso molecular elevado. El análisis de estos y otros genomas de aislados clínicos con otras sondas en la región ha relevado que las secuencias compartidas podrían estar en orientación invertida en algunos aislados en relación a la orientación en la cepa Toledo.

La Figura 6 es una ilustración esquemática de las posiciones relativas de las nuevas secuencias identificadas en el ADN genómico de Toledo, el ADN genómico de Towne, en una comparación con el ADN genómico de la cepa AD169. Las líneas de guiones delimitan la región del genoma en donde se hallan las secuencias homólogas y divergentes. La línea superior ilustra un mapa de restricción de ADN de Toledo mostrando sitios de restricción BamHI (indicados por "B") y XbaI (indicados por "X") que se extienden entre los puntos de rotura de la homología, identificados por triángulos invertidos en los nucleótidos 175.068 y 188.843 (numerados con referencia a la secuencia de ADN de AD169, número de acceso X17403 en EMBL). Los subclones 4, 1300, C23K y 65 de la secuencia de ADN de Toledo se muestran en recuadros por encima del mapa. Se muestra una región invertida de homología con respecto a Towne mediante los triángulos invertidos entre los nucleótidos 178.221 y 175.082. Las secuencias únicas se muestran mediante una línea fina, unas secuencias de repeticiones invertidas mediante líneas gruesas, b'a'c'. El final de las repeticiones c' se muestra con una flecha en el nucleótido 191.412. La línea del medio ilustra un mapa de restricción del ADN de Towne mostrando sitios de enzimas de restricción BamHI (B) y XbaI (X) tal como se ha descrito más arriba para Toledo, y mostrando los clone E, T y Q de XbaI en recuadros más abajo. Las áreas sombreadas se refieren a regiones homólogas compartidas con el ADN de Toledo pero invertidas en su orientación. Los números de nucleótidos mostrados lo son por referencia a la secuencia de ADN de AD169. La extensión indeterminada de las secuencias de repetición b' en la cepa Towne se muestran mediante líneas delgadas en el nucleótido de referencia 180.034 de la cepa AD169. La línea inferior ilustra el genoma de AD169 mostrado en la orientación del prototipo. Las secuencias únicas se muestran mediante una línea delgada, y la repeticiones invertidas de los componentes largo (U_{L}) y corto (U_{S}) se denotan mediante recuadros, ab-b'a' y a'c'-ca. La secuencia a es una repetición directa terminal con una copia invertida (a') en la unión de los componentes largo y corto. La longitud de la secuencia de ADN de AD169 se indica como 229.354 nucleótidos y la posición del mapa de la repeticiones internas se muestra con los números de referencia de los nucleótidos y con flechas.

Ejemplo 4 Análisis de la pauta de lectura abierta de las nuevas secuencias de Toledo y Towne

La secuencias nuevas de Toledo y Towne codifican pautas de lectura abiertas (ORF) potenciales. Usando un parámetro arbitrario de 10 kilodaltones como el mínimo peso molecular de proteína calculado, se identificaron un total de 36 ORF en la nueva secuencia de Toledo, y se identificaron un total de 4 ORF en la nueva secuencia de Towne. Las secuencias de aminoácidos putativas de estas ORF se detallan en el listado de secuencias (SEC. Nº ID.: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 27). La Figura 5 muestra la presentación esquemática de estas ORF en las nuevas secuencias de ADN de Toledo y Towne, junto con las ORF de AD169 de la región correspondiente previamente descritas. Se asignaron nombres a estas ORF empezando desde UL133 como la primera ORF en el extremo izquierdo de la UL en la secuencia de Toledo. La primera ORF en la nueva secuencia de Towne se asignó a UL147, la cual se determinó que estaba presente en la nueva secuencia de Toledo descrita en ésta. Se determinó que UL130 y UL132 de AD169 estaban presentes en la nueva secuencia de Toledo. Adicionalmente, UL153 y UL154 presentaban regiones de homología con IRL14 e IRL12 respectivamente. Todas las ORF se examinaron en busca de secuencias homólogas en las bases de datos no redundantes del NCBI usando el programa BLASTP. Entre las ORF buscadas, sólo la UL132 identificó un homólogo en la base de datos, la cual fue la mtrIII del HCMV (Nº de acceso a GenBank X75606), presentando un 76% de identidad a nivel de aminoácidos. El círculo sólido identifica las ORF que contenían el potencial de secuencias de sitios de glicosilación unidos a N, N-X(-P)-S/T. Estas glicoproteína potenciales podrían ser biológicamente significativas como moléculas antigénicas o inmunogénicas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Spaete, Richard

\hskip 3,3cm

Cha, Tai-An

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVAS SECUENCIAS DE CITOMEGALOVIRUS HUMANO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SEQUENCIAS: 27

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Luann, Cserr, Attorney at Law

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 750 Arimo Avenue

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: Oakland

\vskip0.333000\baselineskip

(D): ESTADO: CA

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAIS: EE.UU.

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94610

\vskip0.666000\baselineskip

(v): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/414.926

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE REGISTRO: 31 de marzo de 1995

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE LEGAL/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Cserr, Luann

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 31.822

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: AVIR 11 WO

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4711 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: CMV humano

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CEPA: Towne

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: complemento (845...1321)

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto="UL147"

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: complemento (1368...1721)

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto="UL152"

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: complemento (2504...3337)

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto="UL153"

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: complemento (3515...4711)

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto="UL154"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

111

1

121

120

2

200

3

300

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID. Nº 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TIPOLÓGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 278 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 399 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

900

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18318 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADL (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: CMV humano

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CEPA: Toledo

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 511...1281

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL133"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1401...2384

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL135"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 2478...3197

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL136"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3283...3789

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL138"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 4355...4759

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL139"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 4944...5285

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL140"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 5558...6832

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL141"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 6908...7825

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL142"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 7813...8088

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL143"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 8468...8995

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL144"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9327...9626

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL145"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9910...10260

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL146"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 10328...10804

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL147"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 11106...12053

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL148"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 12133...12942

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL132"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 13569...14210

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL130"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 16216...16581

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL149"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1004...1528

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL134"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3063...3350

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL137"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 16337...18262

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL150"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 17752...18759

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto=" UL151"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. N°: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

1100

12

1200

13

1300

14

15

16

17

1700

18

1800

19

1900

20

2000

21

2100

22

2200

23

2300

24

2400

25

2500

26

2600

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 257 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.01

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...257

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL133

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

27

2700

28

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 175 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.02

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...175

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL134

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 328 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.03

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...328

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL135

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

31

3100

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 240 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.04

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...240

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL136

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

32

112

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.05

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...96

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL137

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 169 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.06

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...169

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL138

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

33

3300

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 135 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.07

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...135

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL139

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.08

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...114

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL140

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 425 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.09

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...425

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL141

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

3700

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 306 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.10

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...306

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL133

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

38

3800

39

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 92 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.11

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...92

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL143

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 176 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.12

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...176

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL144

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.13

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...100

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL145

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 117 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.14

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...117

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL146

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.15

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...159

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL147

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

46

4600

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 316 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.16

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...316

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL148

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

47

4700

48

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 214 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.19

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...214

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL130

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 122 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.20

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...122

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL149

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

51

5100

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 642 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.21

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...642

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL150

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

5300

54

5400

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 336 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.22

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...336

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL151

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

55

5500

56

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. Nº 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 270 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: tol.23

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1...270

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /label=UL132

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 27:

57

Claims

1. Secuencia de ADN aislada que comprende:

(a): una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEC. Nº ID.: 6;

(b): una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEC. Nº ID.: 1; o

(c): una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEC. Nº ID.: 6 en una orientación invertida.

2. Secuencia de ADN aislada que comprende un marco de lectura abierto completo del citomegalovirus humano, en donde el marco de lectura abierto codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 2, SEC. Nº ID.: 3, SEC. Nº ID.: 4, SEC. Nº ID.: 7, SEC. Nº ID.: 8, SEC. Nº ID.: 9, SEC. Nº ID.: 10, SEC. Nº ID.: 11, SEC. Nº ID.: 12, SEC. Nº ID.: 13, SEC. Nº ID.: 14, SEC. Nº ID.: 15, SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 17, SEC. Nº ID.: 18, SEC. Nº ID.: 19, SEC. Nº ID.: 20, SEC. Nº ID.: 21, SEC. Nº ID.: 22, SEC. Nº ID.: 24, SEC. Nº ID.: 25 o SEC. Nº ID.: 26.

3. Secuencia de ADN aislada que es capaz de hibridarse bajo condiciones rigurosas con una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 2, SEC. Nº ID.: 3, SEC. Nº ID.: 7, SEC. Nº ID.: 8, SEC. Nº ID.: 9, SEC. Nº ID.: 10, SEC. Nº ID.: 11, SEC. Nº ID.: 12, SEC. Nº ID.: 13, SEC. Nº ID.: 14, SEC. Nº ID.: 15, SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 17, SEC. Nº ID.: 18, SEC. Nº ID.: 19, SEC. Nº ID.: 20, SEC. Nº ID.: 21, SEC. Nº ID.: 24, SEC. Nº ID.: 25 o SEC. Nº ID.: 26, y en donde las condiciones de hibridación rigurosas emplean 6x SSC, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de Ficoll, 0,2% de albúmina de suero bovino, 0,1% de dodecilsulfato de sodio, 100 \mug de ADN de esperma de salmón, y 15% de formamida a 68ºC.

4. Secuencia de ADN aislada de la reivindicación 2 o reivindicación 3, en donde dicha secuencia de ADN aislada comprende un genoma replicable de citomegalovirus que codifica un citomegalovirus humano infeccioso.

5. Secuencia de ADN aislada de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de ADN aislada comprende un genoma replicable de citomegalovirus que codifica un citomegalovirus humano infeccioso.

6. Molécula de ARN transcrita a partir de una secuencia de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

7. Vector que comprende una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Célula hospedadora transformada con una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en una asociación operativa con una secuencia de control de la expresión capaz de dirigir la replicación y expresión de dicha secuencia de ADN.

9. Proteína del HCMV codificada por una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

10. Proteína que comprende:

(a): una proteína de HCMV que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 2, SEC. Nº ID.: 3, SEC. Nº ID.: 4, SEC. Nº ID.: 5, SEC. Nº ID.: 7, SEC. Nº ID.: 8, SEC. Nº ID.: 9, SEC. Nº ID.: 10, SEC. Nº ID.: 11, SEC. Nº ID.: 12, SEC. Nº ID.: 13, SEC. Nº ID.: 14, SEC. Nº ID.: 15, SEC. Nº ID.: 16, SEC. Nº ID.: 17, SEC. Nº ID.: 18, SEC. Nº ID.: 19, SEC. Nº ID.: 20, SEC. Nº ID.: 21, SEC. Nº ID.: 22, SEC. Nº ID.: 24, SEC. Nº ID.: 25 o SEC. Nº ID.: 26;

(b): una proteína que tiene al menos una homología de secuencia de aminoácidos del 90% con una proteína del HCMV tal como se define en (a).

11. Procedimiento para producir una proteína de HCMV que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 8 en un medio de cultivo apropiado, y aislar dicha proteína de dicho medio.

12. Procedimiento para producir un HCMV recombinante que comprende:

(a): transfectar un plásmido que contiene una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y (i) transfectar ADN viral que comprende HCMV de la cepa AD169 o Towne, o (ii) superinfectar HCMV de la cepa AD169 o Towne en una línea celular permisiva para el crecimiento de CMV; y

(b): aislar dicho HCMV recombinante a partir de dicha línea celular.

13. Composición inmunogénica que comprende un HCMV recombinante construido mediante el procedimiento de la reivindicación 12.

14. Utilización de una composición inmunogénica de la reivindicación 13 para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico de una enfermedad o condición relacionada con el HCMV.

15. Procedimiento para detectar una infección por HCMV en un humano, que comprende:

(i): combinar bajo condiciones de rigurosidad predeterminadas una muestra clínica sospechosa de contener ADN de HCMV, con al menos un fragmento de ADN de hebra única de una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene al menos 10 bases y que no se hibrida de forma cruzada con ADN humano; y,

(ii): detectar la formación de dúplex entre dicho fragmento de ADN de hebra única y la muestra de ADN.

16. Composición farmacéutica que comprende una proteína codificada por una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.

17. Proteína de HCMV de la reivindicación 9 o reivindicación 10 para su utilización en un procedimiento de tratamiento médico.

18. Utilización de una proteína de HCMV de la reivindicación 9 o reivindicación 10 para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico de una enfermedad o condición relacionada con el HCMV.