DE69636066T2

DE69636066T2 - Variante von herpesvirus-glycoprotein d

Info

Publication number: DE69636066T2
Application number: DE69636066T
Authority: DE
Inventors: Gary H. Havertown COHEN; Roselyn J. Haddonfield EISENBERG; Anthony Philadelphia NICOLA
Original assignee: Competitive Technologies Inc
Current assignee: Competitive Technologies Inc
Priority date: 1995-07-07
Filing date: 1996-07-03
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2016-07-04
Also published as: US5654174A; EP0784686B1; AU705941B2; US5814486A; WO1997003199A1; EP0784686A1; NZ312565A; DE69636066D1; CA2199408C; AU6453496A; ATE324449T1; CA2199408A1; NZ332255A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf neue Glycoprotein D-Moleküle von Herpes Simplex-Virus. Weiter insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Varianten von Glycoprotein D-Molekülen, welche in der Lage sind, die Infektion von Zellen durch Herpes Simplex-Virus zu blockieren.
Hintergrund der Erfindung
Herpes Simplex-Viren (HSV) sind humane Pathogene, welche eine Vielfalt von Krankheitszuständen verursachen, einschließlich Fieberbläschen, Augen- und Genitalinfektionen, lebensbedrohende neonatale Infektionen und Enzephalitis. HSV ist auch dazu in der Lage, latente Infektionen in den Ganglien zu etablieren. Die Stämme, die als HSV-1 (oral) und HSV-2 (genital) bezeichnet werden, sind Mitglieder der Familie der Herpesviridae und werden in die Subfamilie Alphaherpesvirinae und die Gattung Simplex-Virus klassifiziert. Die Viren haben ein umhülltes Doppelstrang-DNA-Genom von 150 Kilobasen (kb) einschließlich mindestens 72 offener Leserahmen, welche für mindestens 11 Glycoproteine kodieren. Die Genome von HSV-1 und HSV-2 zeigen erhebliche Homologie in Regionen, welche dafür bekannt sind, daß sie für Proteine, welche für die antigene Spezifität und/oder die biologische Aktivität verantwortlich sind, kodieren.
Nach der Infektion agieren verschiedene virale Glycoproteine einzeln oder arbeiten zusammen, um HSV an eine empfängliche Zelle zu binden und um die direkte Fusion zwischen der Virion-Hülle und der Zellmembran auszulösen. Glycoprotein D (gD) von HSV ist eine Komponente der Virion-Hülle, welche eine essentielle Rolle beim Eintritt von HSV in empfängliche Säugetierzellen spielt. Der bis jetzt vorliegende Beweis schlägt vor, daß gD an ein zelluläres Molekül anschließend an die initiale Interaktion der HSV-Glycoproteine gC und gB mit Heparansulfat-Proteoglycanen bindet. Die Interaktion zwischen gD und seinem Rezeptor kann den Virus-Zell-Komplex vor der Membranfusion stabilisieren, welche durch andere essentielle Glycoproteine vermittelt wird, wie z.B. gB, gH und gL. Siehe Sisk et al., J. Virol., 68(3): 766–775 (1994) und Tal-Singer et al., J. Virol., 69(7): 4471–4483 (1995). Die Nukleotidsequenz von gD des Patton-Stammes von HSV-1 (gD-1) (SEQ ID NO: 3) wurde zuerst in Watson et al., Science, 218: 381–384 (1982) berichtet. Das gD des HSV-2-Stammes 333 (gD-2) wurde in Muggeridge et al., J. Virol 64(8): 3617–3626 (1990) beschrieben. Die Nukleotidsequenz des Gens von gD-2 des Stammes 333 wird hier in SEQ ID NO: 14 dargelegt.
Die HSV-Glycoproteine waren der Gegenstand von intensiver Forschung bei der Entwicklung von Vaccinen, welche zur Verhinderung von HSV-Infektionen nützlich sind. Siehe z.B. US-Patent Nrn. 4,709,011, welches am 24. November 1987 erteilt wurde; 4,762,708, welches am 9. August 1988 erteilt wurde und 5,149,660, welches am 22. September 1992 erteilt wurde; und zwar alle für Miterfinder dieser Erfindung. Zusätzlich wurden signifikante Bemühungen bei der Entwicklung voni antiviralen Mitteln aufgewendet, wie z.B. Nukleosid-Analoga und Interferone. Nukleosid-Analoga, Idoxuridin, Trifluridin, Vidarabin und Acyclovir interferieren mit der Replikation des HSV-Genoms. Interferone interferieren mit der Translation der viralen Proteine.
Obwohl einige klinische Vorteile bei der Verbesserung der Folgekrankheiten der HSV-Infektion durch die Behandlung mit Nukleosid-Analoga und Interferonen erreicht wurden, kann die Therapie mit beiden Typen der Verbindungen signifikante Nebeneffekte involvieren. Siehe Fields and Knipe, Eds., Fundamental Virology, Chapter 16, Raven Press, New York, New York (1986). Patienten, die mit Acyclovier behandelt wurden, können z.B. lokale Entzündung an den Stellen, wo der Wirkstoff verabreicht wird, renale Dysfunktion und enzephalopathische Veränderungen zeigen. Außerdem wurden HSV-Mutanten beobachtet, welche resistent gegenüber Acyclovir sind, und es wird die Unterdrückung des Wiederauftretens beendet, wenn Acyclovir abgesetzt wird (Straus et al., N. Eng. J Med., 310: 1545–1550 (1984)). Erfahrung bei der Verwendung von Vidarabin hat neurologische Toxizität offenbart. Patienten, welche mit Interferon behandelt werden, können Fieber, Ermüdung, Anorexie, Gewichtsverlust, Übelkeit und Erbrechen, Knochenmark-Suppression, Schmerz an den Injektionsstellen, Lymphadenopathie und schwachen Haarverlust zeigen. Von Fibroplasten-Interferon wurde auch berichtet, daß es die Bildung von Anti-Interferon-Antikörpern induziert.
Johnson DC et al, Journal of Virology, Juni 1990, Seiten 2569–1576 offenbaren die Inhibierung der Infektion (Plaquebildung) von HSV-1 und HSV-2 durch die Behandlung von Zellen mit löslichen Varianten-Formen des gD von HSV-1. Diese Varianten waren am Rest 275 trunkiert.
Daher existiert im Stand der Technik ein Bedarf für zusätzliche Produkte, welche bei der Verhinderung und Behandlung der HSV-Infektion nützlich sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Varianten-Moleküle des gD von HSV zur Verfügung, welche in der Lage sind, die Infektion von Zellen durch HSV-1 und/oder HSV-2 zu verhindern. Es werden auch neue gereinigte und isolierte Polynukleotide (d.h. DNA und RNA, sowohl Sense- als auch Antisense-Stränge), welche für die Varianten-Moleküle des gD kodieren, zur Verfügung gestellt. Es werden speziell Region IV-Varianten des gD-1 von HSV oder deren Fragmente von der Erfindung betrachtet.
Im Allgemeinen beschrieben, unterliegen Varianten-Moleküle des gD-1 der Variation und der Aminosäuresequenz-Modifikation in den Aminosäureresten der „Region IV", umfassend Aminosäuren 277 bis 310 der nativen Sequenz von gD-1 des Patton-Stammes, welche konserviert sind, z.B. als Reste 276 bis 309 von gD-2 des Stammes 333. Modifikationen schließen bevorzugterweise Deletionen von einer oder mehreren Aminosäuren in den Aminosäuren der Region IV 290 bis 300 von gD-1 (Reste 289 bis 299 von gD-2) und am meisten bevorzugt die Deletion von z.B. Aminosäuren 290 bis 299 des gD-1, ein. Eine oder mehrere Aminosäurereste, welche normalerweise in der Region IV nicht anwesend sind, können eine oder mehrere Reste der Region IV, die deletiert wurden, ersetzen. Es wird auch bevorzugt, daß Aminosäuresequenzen der „Transmembran"-Region, die gewöhnlich in nativen gD-1-Proteinen vorhanden sind, deletiert werden, z.B. durch Deletion der Carboxy-terminalen Reste 306 bis 369 von gD-1. Die oben aufgeführten Modifikationen führen nicht dazu, daß eine der nativen potentiellen N-verbundenen Glykosylierungsstellen der gD-1-Polypeptide deletiert wird, so daß von der rekombinanten Expression der Moleküle in Wirtszellen, die zur Glykosylierung in der Lage sind, gewöhnlicherweise erwartet werden wird, daß sie zur Bildung von Glycoprotein-Produkten (ihren wird. Varianten der gD-1-Proteine und Glycoproteine der Erfindung, wenn sie durch rekombinante Methoden produziert werden, können zusätzliche Aminosäurereste als Artefakte des verwendeten Expressionssystems (z.B. Reste, die nach dem Processing der Signalsequenz von Fusionsproteinen verbleiben) oder als ein Ergebnis der Modifikation für Zwecke der Ermöglichung von Protein/Glycoprotein-Isolierung (z.B. eine Carboxy-terminale Polyhistidin-Sequenz) einschließen.
Das derzeit bevorzugte Varianten-Molekül von gD-1, welches als gD-1 (Δ290 bis 299t) bezeichnet wird, ist das Produkt der rekombinanten Expression eines Fusionsproteins, einschließlich des Signalpeptids von Honigbienen-Melittin (Tessier et al., Gene, 98: 177–183 (1990) und gD des Patton-Stamm HSV-1 in Sf9-Zellen, wobei (1) die Aminosäurereste 290 bis 299 des Patton-Stammes des reifen gD-1-Proteins mit den Aminosäureresten Arginin, Lysin, Isoleucin und Phenylalanin ersetzt wurden und (2) die Aminosäurereste 308 bis 369 des Patton-Stammes mit fünf Histidinresten ersetzt wurden. Wenn es in Sf9-Zellen exprimiert wird, führt die Spaltung des Melitin-Signalpeptides zur Anwesenheit von Aspartat- und Prolin-Resten am Aminoterminus des Varianten-Moleküls. Die Aminosäure-Sequenz von gD-1(Δ290–299t) wird in SEQ ID NO: 2 dargestellt und die bevorzugte DNA-Sequenz, welche gD-1(Δ290–299t) kodiert, wird in SEQ ID NO: 1 dargestellt.
Es werden auch Vollängen-gD-Varianten zur Verfügung gestellt, in welchen Schritt (1) oben durchgeführt wird, aber Schritt (2) nicht durchgeführt wird. Die Aminosäuresequenz einer solchen Variante, welche als gD-1(Δ290–299) bezeichnet wird, wird in SEQ ID NO: 11 dargestellt und die bevorzugte DNA-Sequenz, welche gD-1(Δ290–299) kodiert, wird in SEQ ID NO: 10 dargestellt.
Es werden auch autonom replizierende rekombinante Konstruktionen zur Verfügung gestellt, wie z.B. Plasmid- und virale DNA-Vektoren, welche Sequenzen einschließen, die für die Varianten-Moleküle von gD kodieren, und insbesondere Vektoren, worin DNA, die für Varianten-Moleküle von gD kodiert, operativ mit einer endogenen oder exogenen Expressionskontroll-DNA-Sequenz und einem Transkriptions-Terminator verbunden ist.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen mit DNA-Sequenzen der Erfindung auf eine Weise stabil transformiert, die es erlaubt, daß ein gewünschtes Varianten-Molekül von gD oder ein Fragment davon darin exprimiert wird. Wirtszellen, welche Varianten-Moleküle von gD exprimieren, können einer Vielfalt von nützlichen Zwecken dienen. Solche Zellen stellen eine wertvolle Quelle von Immunogen für die Entwicklung von Antikörper-Substanzen dar, welche spezifisch immunoreaktiv mit den gD-Varianten sind. Die Wirtszellen der Erfindung sind auffallend nützlich in Methoden für die Produktion von Varianten-Molekülen von gD oder Fragmenten davon in großem Maßstab, wobei die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium aufgezogen werden und die gewünschten Polypeptid-Produkte aus den Zellen oder aus dem Medium, in welchem die Zellen gewachsen werden, isoliert werden, z.B. mittels Immunoaffinitäts-Reinigung oder Reinigung an Nickel-Affinitätssäulen.
Varianten-Moleküle des gD von HSV können chemisch synthetisiert werden, werden aber bevorzugt mittels rekombinanter Prozeduren produziert, die prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen der Erfindung involvieren. Von der Verwendung von Insekten- (z.B. Sf9-Zellen) oder Säugetier-Wirtszellen wird erwartet, daß solche post-translationalen Modifikationen (z.B. Myristolierung, Glykosylierung, Trunkierung, Lipidation und Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylisierung) zur Verfügung gestellt werden, wie benötigt wird, um den rekombinanten Expressionsprodukten der Erfindung optimale biologische Aktivität zu verleihen. Rekombinante Expressionsprodukte der Erfindung können auch chemisch modifiziert werden, z.B. Modifizierung durch Anhängen von Polyethylenglycol-Gruppen für den Zweck der Verlängerung der Halbwertszeit der Produkte nach intravenöser Verabreichung.
Von der vorliegenden Erfindung werden auch Antikörper umfaßt (z.B. monoklonale und polyklonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper, chimäre Antikörper aus muriner variabler Region und humaner konstanter Region, CDR-gepfropfte Antikörper („CDR-grafted antibodies") und ähnliches. Anti-idiotypische Antikörper, welche spezifisch für den gD-Varianten-Molekül-spezifischen Antikörper sind, werden ebenso umfaßt. Antikörper der Erfindung sind auffallend nützlich bei der Reinigung oder der Dektion von Varianten-Molekülen der Erfindung.
Die Verabreichung von Varianten-Molekülen von gD oder Fragmenten davon an Säugetier-Subjekte, insbesondere Menschen, für den Zweck der Verhinderung der HSV-Infektion und/oder der Verbesserung der pathologischen Folgekrankheiten der HSV-Infektion ist spezifisch umfaßt, wird aber hierin nicht beansprucht. Verschiedene Tiermodelle für die HSV-Infektion sind im Stand der Technik akzeptiert und schließen ein, sind nicht limitiert auf, die Kaninchen- und Maus-Augenmodelle von Herpes-Keratitis [Hill et al., Curr. Eye Res., 6: 1065–1071 (1987) sowie Rock and Fraser, Nature, 302: 523–525 (1983)], kutane Herpes-Infektion von haarlosen (nackten) Mäusen [Metcalf et al., Infect. Immunol., 26: 1164–1171 (1979)], vaginale Lesionen in Meerschweinchen und Maus [Stanberry et al., J. Infect. Dis., 146: 397–404 (1982)], Fußballen-Modell („foot pad model") in Mäusen [Stevens and Cook, Science, 173: 843–845 (1971)], Zosterform-Hautmodell in Mäusen [Hill et al., J. Gen. Virol., 39: 21–28 (1982)] und experimentelle Herpes-Simplex-Enzephalitis, induziert mittels intrace rebraler viraler Inokulation in Mäusen [Tenser, J. Infect. Dis., 147: 956 (1983)]. Für einen Überblick siehe Stevens, Microbiol. Rev., 53: 318–332 (1989) und Stanberry, Current Topics in Microbiol. and Immunol., 179: 15–30 (1992). Die Varianten-Moleküle von gD sollen dem Säugetier in einer Menge verabreicht werden, die ausreichend ist, um die Infektion von empfänglichen Zellen durch HSV zu blockieren. Die Verabreichung kann mittels intravenöser, intramuskulärer, subkutaner, oraler, Zäpfchen-, mukosaler oder topischer Wege sein. Ebenso wird DNA-Immunisierung umfaßt, aber nicht hierin beansprucht, wobei DNA, die für ein Varianten-Molekül des gD der Erfindung kodiert, einem Säugetier zur Verfügung gestellt.
Zusammensetzungen der Erfindung, wenn sie intravenös, intramuskulär oder oral verabreicht werden sollen, sollen in Quantitäten verabreicht werden, so daß Varianten-Moleküle von gD in einer Einheits-Dosis zur Verfügung gestellt werden, die effektiv ist, um die virale Infektiosität zu inhibieren, zum Beispiel Einheitsdosen von 0,01 μg bis 100 mg an gD-Varianten-Molekül pro Kilogramm des Körpergewichts des Säugetier-Empfängers. Wenn die Zusammensetzungen der Erfindung oral oder topisch verabreicht werden sollen, werden sie von ungefähr 0, 0001% bis 20% Varianten-Molekül von gD einschließen. Zusammensetzungen schließen auch therapeutisch akzeptable Träger (z. B. Verdünnungsmittel und/oder Adjuvantien) ein. Für allgemeine Dosierungs- und Formulierungserwägungen siehe Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995).
Es wird ebenso umfaßt, daß die Varianten-Moleküle des gD von HSV als Immunogene in einem Säugetier-Empfänger fungieren können, wenn sie mittels systemischen oder mukosalen Wegen verabreicht werden sollen. Die Immunisierung von Tieren mit Wildtyp-gD stimuliert die Produktion von virus-neutralisierenden Antikörpern und schützt sie vor einer letalen Herausforderung mit HSV-1 und HSV-2 [Long et al., Immunol., 37: 761–764 (1984)]. Die umfaßte duale Natur der Varianten-Moleküle des gD ist ein Vorteil der Erfindung, der nicht mit früheren Anti-HSV-Verbindungen geteilt wird, wie hierin diskutiert.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Zahlreiche andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann offensichtlich sein nach der Berücksichtigung der folgenden detaillierten illustrativen Beschreibung, wobei auf die Abbildung verwiesen wird, wonn:
1a bis 1c schematische Abbildungen der signifikanten Regionen von Vollängen-Wildtyp-gD-1 von HSV, eines Carboxy-terminal trunkierten Wildtyp-gD-1 von HSV, das als gD-1(306t) bezeichnet wird, und einer Region IV-Variante von gD-1 von HSV-, die als gD-1 (Δ290–299t) bezeichnet wird, sind;
2 ein Abgleich der Aminosäuresequenzen von Wildtyp-gD-1 von HSV (SEQ ID NO: 4) und gD-2 (SEQ ID NO: 15) ist;
3a bis 3c schematische Abbildungen der Schritte der Assays zur Plaquebildung (3a), zur Ausbreitung von Zelle zu Zelle (3b) und Virus-Blockierung, HSV-1/lacZ+-Eintritt (3c) sind, die in den Beispielen verwendet wurden;
4a bis 4b grafische Darstellungen sind, die den inhibitorischen Effekt von gD-1 (Δ290–299t) auf die Plaquebildung auf Vero (4a) und BHK (4b)-Zellen, die HSV ausgesetzt wurden, darstellen;
5 eine grafische Darstellung ist, die den Effekt von Hitzedenaturierung auf die Fähigkeit von gD-1(Δ290–299t) darstellt, die Plaquebildung auf BHK-Zellen, die HSV ausgesetzt wurden, zu blockieren;
6 eine grafische Darstellung ist, die den inhibitorischen Effekt von gD-1(Δ290–299t) auf die Ausbreitung von HSV von Zelle zu Zelle in Vero-Zellen illustriert;
7 eine grafische Darstellung ist, die den inhibitorischen Effekt von gD-1(Δ290–299t) auf den Eintritt von HSV in Vero-Zellen darstellt;
8 eine Tabelle ist, die die Ergebnisse der Assays zur Plaquebildung, zur Ausbreitung von Zelle zu Zelle und zum HSV-Eintritt der Erfindung für die Region IV-Varianten-Moleküle von gD-1 der Erfindung zusammenfaßt;
9a und 9b grafische Darstellungen sind, welche entsprechend die Ergebnisse von Assays zur Plaquebildung zeigen, in welchen Wildtyp-gD-1(306t) und Variante gD-1(Δ290-299t) inhibitorische Effekte auf verschiedene HSV-1-Stämme zeigten;
10 eine grafische Darstellung ist, die den Effekt der Variante gD-1(Δ290–299t) auf die Infektiosität von HSV-Viren darstellt, welche resistent gegenüber der Inhibierung durch Wildtyp-gD-l-Protein sind;
11 eine grafische Darstellung ist, die zeigt, daß die inhibitorischen Effekte der Variante gD-1(Δ290–299t) spezifisch für die HSV-Infektion sind und
12 eine grafische Darstellung ist, die deutlich macht, daß Variante gD-1(Δ290–299t) mehr als 100fach effektiver bei der Inhibierung von HSV-2 ist als Wildtyp-gD-1(306t).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zahlreiche Varianten-Moleküle von HSV-1 wurden konstruiert und auf die Fähigkeit analysiert, die Infektiosität des gD-Nullvirus F-gDβ zu retten [Ligas and Johnson, J. Virol., 62: 1486–1494 (1988)]. Varianten-Moleküle mit Mutationen in einer der vier Regionen von gD (Region I, umfassend Aminosäure-Reste 27 bis 43, Region II, umfassend Aminosäure-Reste 126 bis 161, Region III, umfassend Aminosäure-Reste 225 bis 246 und Region IV, umfassend Aminosäure-Reste 277 bis 310) waren nicht in der Lage, die Rettung zu bewirken. Es wurde daher bestimmt, daß die vier Regionen von gD-1 notwendig für den Eintritt von HSV in empfängliche Zellen sind. Eine weitere Analyse der repräsentativen Varianten-Moleküle, wovon jedes Mutationen in einer der Regionen enthielt, identifizierte ein Varianten-Molekül der Region IV von gD mit besonders potenter anti-viraler Aktivität.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, wobei Beispiel 1 die Konstruktion von Vektoren beschreibt, die Varianten-Moleküle von gD-1 der Erfindung kodieren, Beispiel 2 die rekombinante Expression der Varianten in Säugetier- und Insektenzellen beschreibt, Beispiel 3 die Ergebnisse von Analysen zur Konformation der Varianten und der Fähigkeit der Varianten präsentiert, den Nullvirus F-gDβ zu komplementieren, und Beispiel 4 die Ergebnisse von Analysen zur Fähigkeit der Varianten präsentiert, HSV-empfängliche Zellen zu binden und die Infektion von HSV-empfänglichen Zellen durch HSV-1-Stämme zu blockieren. Beispiel 5 beschreibt Assays, die die Fähigkeit von Varianten der Erfindung demonstriert, die Infektion durch verschiedene andere HSV-Stämme zu blockieren, während Beispiel 6 Assays beschreibt, die demonstrieren, daß Varianten die Infektion von empfänglichen Zellen durch HSV-2 blockieren. Beispiel 7 demonstriert die Fähigkeit der Varianten, die Produktion von HSV-neutralisierenden Antikörpern zu induzieren, wenn die Varianten als Immunogene verwendet werden. Beispiel 8 beschreibt Verfahren zur Produktion von monoklonalen Antikörpern, welche spezifisch immunoreaktiv mit den Varianten sind.
Beispiel 1
Varianten von HSV gD-1 wurden mittels Linker-Insertions-Mutagenese konstruiert, wie sie im wesentlichen in Chiang et al., J. Virol., 68(4): 2529–2543 (1994) beschrieben wird.
Ein Gen, das für die Region IV-Variante des gD-1 von HSV: gD-1 (Δ290–299t) kodiert, wurde aus dem Wildtyp-Gen von gD-1 wie folgt konstruiert.
Zuerst wurde ein Plasmid pHC236, enthaltend einen 12 Basen BglII-Linker, eingeführt an Aminosäure 290 von gD-1, wurde mittels Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese [Kunkel et al., Methods Enzymol., 154: 367–382 (1988)] generiert. Das HindIII-Fragment, enthaltend die gesamte kodierende Region von gD-1, wurde aus dem Plasmid pWW78, beschrieben in Muggeridge et al., supra, ausgeschnitten und dann in die HindIII-Stelle von M13 mp18 subkloniert. Die Sequenz der kodierenden Region von Wildtyp gD-1 des Patton-Stammes, welche in dem HindIII-Fragment anwesend ist, ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt. Ein 37 Basen langer mutagener Oligonukleotid-Primer
5' AGTTTGGTGGGAGGAAGATCTTCCTTTGCGGCGCCAC 3' (SEQ ID NO: 5),
welcher mit den Nukleotiden 1171 bis 1196 der SEQ ID NO: 3 korrespondiert und welcher einen 12 bp BglII-Linker (unterstrichen) enthält, wurde verwendet, um die replikative Form (RF) von M13 mp18 zu synthetisieren. Das mutierte gD-1-Gen wurde dann aus RF-DNA ausgeschnitten und in den Expressionsvektor pRSVnt EPA (Chiang et al., supra) eingefügt, welcher das Long Terminal Repeat von Rous-Sarcoma-Virus als einen Promoter und das SV40 frühe Polyadenylierungs-Signal enthält. Das resultierende Konstrukt, welches als pH236 bezeichnet wird, kodiert Vollängen gD-1 mit der Aminosäure Arginin, die Isoleucin in Rest 290 ersetzt, und den Aminosäuren Lysin, Isoleucin, Phenylalanin und Leucin, welche nach dem Arginin-Rest eingefügt sind.
Zweitens wurde ein Plasmid pHC237, enthaltend einen 12 Basen BglII-Linker, eingefügt an Aminosäure 300 von gD-1, durch eine Dreischritt-PCR-Prozedur konstruiert. Das 5'-Segment des gD-1-Gens wurde synthetisiert unter der Verwendung eines gD-1 Stromauf-Primers,
5' CCCAAGCTTATCCTTAAGGTCTCTTT 3' (SEQ ID NO: 6),
welcher mit den Nukleotiden 206 bis 223 von SEQ ID NO: 3 korrespondiert und welcher die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym HindIII (unterstrichen) enthält, um die nachfolgende Insertion in den Expressionsvektor pRSVnt EPA zu ermöglichen, und unter der Verwendung eines Antisense-Strang-Primers,
5' TCGCGGCGTCCTGGAAGATCTTCCGGATCGACGGGAT 3' (SEQ ID NO: 7),
welcher mit den Nukleotiden 1201 bis 1225 von SEQ ID NO: 3 korrespondiert und welcher den BglIII-Linker (unterstrichen) enthält. Die Primer wurden verwendet, um gD-1-Sequenzen aus dem Plasmid pRE4 [Cohen et al., J. Virol., 62: 1932–1940 (1988)] zu amplifizieren. Das 3'-Segment des Gens wurde synthetisiert unter der Verwendung eines Sense-Primers,
5'GAAGATCTTCCGAGAACCAGCGCACCGTC 3' (SEQ ID NO: 8), welcher mit den Nukleotiden 991 bis 1008 von SEQ ID NO: 3 konespondiert, und eines gD-1-Stromab-Primers,
5' CCCAAGCTTCCCGCAGACCTGACCCCC 3' (SEQ ID NO: 9),
welcher mit den Nukleotiden 1449 bis 1466 von SEQ ID NO: 3 korrespondiert und welcher die Erkennungssequenz für HindIII (unterstrichen) enthält, um Sequenzen aus dem Matrizen-Plasmid pRE4 zu amplifizieren. In beiden Fällen wurden 25 Zyklen der Amplifikation durchgeführt; in jedem Zyklus wurde die Matrize bei 94° C für eine Minute denaturiert, die Primer wurden dann an die Matrize bei 55° C für zwei Minuten angelagert und die gebundenen Primer wurden bei 72° C für drei Minuten verlängert. Die 5'- und die 3'-DNA- Segmente wurden durch Elektroelution gereinigt. Die Segmente wurden durch eine zusätzliche Runde der Amplifikation verbunden, wobei die gD-1-Stromauf- und -Stromab-Primer und die 5'- und die 3'-Segmente als Matrizen. Das mutante DNA-Produkt wurde elektroeluiert, mit HindIII verdaut und mit pRSVnt EPA ligiert. Die ordnungsgemäße Orientierung des Inserts wurde mittels Restriktionsenzym-Analyse bestimmt. Das resultierende Plasmid pHC237 kodiert Vollängen-gD-1 mit Arginin, Lysin, Isoleucin und Phenylalanin-Resten eingefügt nach Aminosäure 299.
Drittens wurde das BamHI-BglII-Fragment von pHC236, einschließlich 5'-gD kodierende Sequenzen, mit dem BglII-BamHI-Fragment von pHC237, einschließlich 3'-gD kodierende Sequenzen, ligiert, um das Plasmid pHC240 zu generieren. Dieses Plasmid kodiert das Varianten-Molekül von gD gD-1(Δ290–299). Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz von gD-1(Δ290–299) sind in SEQ ID NOs: 10 bzw. 11 dargestellt.
Viertens wurde in einer weiteren Variante dieses Moleküls das Plasmid pHC240 weiter konstruiert, um das Plasmid, das als pAN258 bezeichnet wird und welches sechs Histidin-Reste an seinem Carboxyl-Terminus enthält und im wäßrigen Medium löslich ist, zu produzieren. Die Aminosäurereste 300 bis 306 des Wildtyp-Proteins von gD-1 korrespondieren mit den Aminosäureresten 295–300 der Variante.
Somit wurde eine lösliche Form der Variante gD-1(Δ290–299) mittels PCR unter der Verwendung des Plasmids pHC240 als Matrize generiert. Der Primer
5' TTTTGGATCCCAAATATGCCTTGGCGGATG 3' (SEQ ID NO: 12),
welcher mit den Nukleotiden 316 bis 334 von SEQ ID NO: 10 konespondiert und eine BamHI-Restriktionsstelle (unterstrichen) enthält, und der Primer
5' GGCGCTGCGGAATGGTAGTAGTAGTAGTAATTGACGTCTTTT 3' (SEQ ID NO: 13),
welcher mit den Nukleotiden 1202 bis 1215 von SEQ ID NO: 10 korrespondiert und einen Tyrosin-Rest und einen Polyhistidin-Schwanz aus sechs Resten (doppelt unterstrichen) und einer PstI-Stelle (unterstrichen) kodiert, wurden verwendet, um das kodierte Protein an Aminosäure 306 von SEQ ID NO: 11 zu trunkieren. Fünfundvierzig Amplifikationszyklen von 1 Minute bei 94°C, 30 Sekunden bei 52°C und 2 Minuten bei 75°C wurden durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte wurden auf einem 1% Agarosegel untersucht und das gewünschte Fragment wurde aus dem Gel gereinigt. Das Fragment wurde danach mit BamHI und PstI verdaut und in das auf die gleiche Weise verdaute Plasmid pVTBac [Tessier et al., supra] für die Verwendung bei der Baculovirus-Expression eingefügt. Das Plasmid pVTBac enthält ein Melittin-Signalpeptid und Spaltstelle (zwei Restestrom auf von dem initialen Lysinrest des reifen Proteins gD-1), um die Sekretion des Proteins von Interesse aus den Baculovirusinfizierten Wirtszellen zu erlauben. Das resultierende Plasmid pAN258 kodiert das Region IV-Varianten-Molekül von gD mit einer Carboxy-terminalen Trunkierung, welches als gD-1(Δ290–299t) bezeichnet wird. Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz der Variante sind in den SEQ ID NOs: 1 bzw. 2 dargestellt.
Gene, die Vollängen- und trunkierte Region I-, II- und III-Varianten-Moleküle des gD-1 von HSV kodieren, wurden durch gleiche rekombinante DNA-Standardmethoden konstruiert. Die Vollängen-Varianten wurden als gD-1(∇34), gD-1(∇126) bzw. gD-1(∇243) bezeichnet und die trunkierten Varianten wurden als gD-1(∇34t), gD-1(∇126t), gD-1(∇243t), gD-1(Δ277-290t) bzw. gD-1(Δ277-300t) bezeichnet. Die Vollängen- und trunkierten Varianten gD- 1(∇34) und gD-1(∇34t) enthielten ein Glycin an Position 34 anstelle des Valin-Restes an Position 34 des Wildtyps von gD-1 und Lysin, Isoleucin, Phenylalanin und Leucin-Reste eingefügt nach dem Glycin; gD-1(∇126) und gD-1(∇126t) enthielten ein Glycin anstelle des Alanin-Restes an der Position 126 des Wildtyps von gD-1 und enthielten Lysin, Isoleucin, Phenylalanin und Prolin-Reste eingefügt nach dem Glycin und gD-1(∇243) und gD-1(∇243t) enthielten einen Glycin-Rest an Position 234 und enthielten Glycin, Arginin, Serin und Serin-Reste eingefügt nach dem Glycin. Den trunkierten Varianten gD-1(Δ277–290t) und gD-1(Δ277–300t) fehlten die Patton-Reste 277 bis 290 beziehungsweise 277–300; sie waren trunkiert an der Patton-Aminosäure 306 und enthielten fünf zusätzliche Histidin-Reste nach dem Carboxyl-Terminus. Ein Gen, das eine sekretierte Version des Wildtyps von gD-1, bezeichnet als gD-1(306t), enthaltend Patton-Stamm gD-1-Reste 1 bis 307 und fünf zusätzliche Histidin-Reste am Carboxyl-Terminus, kodiert, wurde ebenso konstruiert, um ein lösliches Kontrollprotein zur Verfügung zu stellen.
1 ist eine schematische Abbildung, welche signifikante Merkmale des Wildtyps von gD-1 und der trunkierten Moleküle des Wildtyps gD-1(306t) und gD-1(Δ290–299t), Cystein-Reste (c), Disulfid-Brücken (S-S) und potentielle N-verbundene Glykosylierungsstellen zeigt.
Beispiel 2
Vollängen-Varianten-Moleküle von gD wurden in COS-1 oder L-Zellen exprimiert, welche mit den in Beispiel 1 beschriebenen Genen transfiziert wurden, mittels einer modifizierten Calciumphosphat-DNA-Copräzipitationsmethode, die in Cohen et al., supra beschrieben ist. Die Vollängen-Varianten können auch unter der Verwendung von Baculovirus-Vektoren in Sf9-Zellen exprimiert werden [Landolfi et al., Vaccine, 11: 407–414 (1993)].
Trunkierte Varianten-Moleküle von gD wurden in Sf9-Zellen exprimiert. pVTbac-Vektoren, die die Gene enthielten, welche die Varianten kodieren, wurden mit Wildtyp-Bacoluvirus-DNA in der Form von BaculoGold (Pharmingen, San Diego, CA) linearer DNA in die Sf9-Zellen co-transfiziert. Co-Transfektion wurde durch kationische Liposomen (Lipofectin, GIBCO, Grand Island, NY) gemäß der Spezifikationen des Herstellers vermittelt. Rekombinante Virus-Vorräte wurden so präpariert, wie im wesentlichen in Sisk et al., supra beschrieben. Um trunkierte Varianten-Moleküle von gD zu exprimieren, wurden Suspensionskulturen von Sf9-Zellen mit einem der rekombinanten Virus-Vorräte infiziert, Zellen wurden pelletiert und das Medium, was die Varianten-Moleküle von gD enthält, wurde Immunoaffinitäts-Chromatographie an einer DL-6 (produziert mittels Hybridoma ATCC HB 8606)-IgG-Sepharose-Säule, wie beschrieben in Sisk et al., supra, unterzogen, um die Varianten zu reinigen. Varianten gD-1(Δ277–290t) und gD-1(Δ277–300t), in welchen das Epitop deletiert war, welches von dem DL-6-Antikörper erkannt wird, können mittels Immunoaffinitäts-Chromatographie unter der Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für andere Epitope von gD-1 sind, gereinigt werden, wie zum Beispiel mittels Antikörpern, die in Muggeridge et al., Chapter 20 in van Regenmortel and Neurath, Eds., Immunochemistry of Viruses, II, The Basis for Serodiagnosis and Vaccines, Elsevier Science Publishers (1990), beschrieben sind.
Beispiel 3
Die strukturellen und funktionellen Charakteristika der Varianten-Moleküle von gD-1 im Vergleich zum Wildtyp von gD-1 wurden mit Hilfe verschiedener Assays untersucht.
Die strukturelle Integrität der Varianten wurde beurteilt durch Messung der Fähigkeit jeder Variante, an monoklonale Antikörper zu binden, welche diskontinuierliche gD-1-Epitope erkennen, als eine Widerspiegelung der Konformation; durch Studium der Zelloberflächen-Expression als eine Widerspiegelung des ordnungsgemäßen Transportes und durch Messung der Proteinintegration als eine Indikation ungenauer Faltung. Die Varianten wurden auch mittels Circular-Dichroismus untersucht.
Fünf monoklonale Antikörper (AP7, HD1, DL11, ABD und DL2), welche fünf verschiedene gD-1 diskontinuierliche Epitope erkennen (Chian et al., supra und Muggeridge et al., supra), wurden verwendet, um die antigene Konformation der Varianten zu untersuchen. Cytoplasma-Extrakte, welche Vollängen-Varianten enthalten, wurden aus COS-1-Zellen 40 Stunden nach der Transfektion präpariert und auf Antikörper-Bindung mittels Western blot untersucht. Baculovirus-produzierte trunkierte Region I, II, III und IV-Varianten wurden auf Antikörperbindung mittels ELISA untersucht. Die Bindung der Antikörper an die trunkierten Varianten war ähnlich zu derjenigen, welche für die Vollängen-Varianten-Moleküle gesehen wurde. In jedem Fall wurden die Varianten-Proteine noch von einem oder mehreren der monoklonalen Antikörper gebunden, die konformationale Epitope erkennen, was anzeigt, daß die Konformation der gD-Varianten nicht grob durch die Mutationen verändert wurde. Die Region IV-Variante wurde von allen außer dem monoklonalen Antikörper AP7 gebunden, was anzeigt, daß ihre Konformation am ähnlichsten zum Wildtyp von gD war. In Anbetracht der erheblichen Homologie zwischen Wildtyp-gD-1 und Wildtyp-gD-2 [siehe 2, welche einen Abgleich der Aminosäuresequenz von gD-1 des Patton-Stammes (SEQ ID NO: 4) und der Aminosäuresequenz von gD-2 des Stammes 333 (SEQ ID NO: 15) darstellt], zieht die Erfindung speziell in Erwägung, daß Region IV-Varianten von gD-2, welche Mutationen enthalten, die mit denen der gD-1-Mutationen korrespondieren, wie hierin beschrieben, ähnliche Charakteristika haben werden.
Wenn sie mittels Circular-Dicroismus untersucht wurden, ähnelten die Region III- und Region IV-Varianten [gD-1(∇243) und gD-1(Δ290–299t)] in der Sekundärstruktur gD-l(306t), jedoch unterschieden sich die Region I-Variante gD-1(∇34) und die Region II-Variante gD-1(∇126) in der Sekundärstruktur.
Um die funktionellen Charakteristika der Varianten-Moleküle von gD-1 zu untersuchen, wurde schließlich die Fähigkeit der Varianten, die Infektiosität von gD-Null Virus F-gDβ zu retten, untersucht. Der Virus repliziert in VD60-Zellen und bildet Plaques auf VD60-Zellen, welche ein integriertes gD-Gen unter der Kontrolle ihres eigenen Promotors enthalten. Lzellen, welche transient mit Genen transfiziert wurden, die eine Variante kodieren, wurden dann mit F-gDβ superinfiziert. Pseudotyp-Partikel wurden geerntet und auf VD-60-Zellen getitert (titered). Die Anzahl der Plaques mißt das Ausmaß, in welchem das Varianten-Molekül von gD die Infektiosität des Nullvirus rettete. Wenn die Infektiosität mit Wildtypgen von gD gerettet wurde, waren die Ausbeuten typischerweise 2 × 10⁶ PFU an Abkömmlingen extrazellulärer Virus und 10⁶ PFU an intrazellulärem Virus. Die Virusausbeuten von Wildtyp-gD wurden als 100% angesehen. Die Region I, II, III und IV-Varianten-Moleküle von gD-1 waren in der Lage, den Nullvirus in einigen Fällen nur in sehr niedrigen Spiegeln und in anderen Fällen überhaupt nicht zu ergänzen.
Diese Experimente zeigen an, daß während Mutationen in den Regionen I, II, III und IV geringe Effekte auf die Konformation der Varianten-Moleküle von gD-1 hatten, die Mutationen dennoch profunde Effekte auf die funktionellen Charakteristika der Moleküle hatten.
Beispiel 4
Die funktionellen Eigenschaften der Baculovirus-produzierten trunkierten Varianten-Moleküle von gD wurden weiterhin in Assays zur Zellbindung und zur Blockierung von HSV untersucht.
Die Bindung der Varianten an fixierte Vero- und BHK-Zellen wurde mittels ELISA gemessen, wie von Tal-Singer et al., supra beschrieben. Das trunkierte Wildtyp gD-1 (306t) und die trunkierten Region I, II, III und IV-Varianten-Moleküle von gD-1 banden alle die fixierten Zellen.
Die Fähigkeit der Varianten, die HSV-1-Infektion von empfänglichen Zellen zu blockieren, wurde durch drei Assays gemessen, welche in 3 schematisiert sind: ein Assay zur Plaquebildung; ein Assay zur Ausbreitung von Zelle zu Zelle und ein Assay zum Eintritt von HSV-1/lacZ+.
Die Plaquebildungs-Assays wurden durchgeführt, wie in Tal-Singer et al., supra beschrieben. Kurz gesagt, es wurden Monoschichten von Vero- oder BHK-Zellen in 48-Well-Platten mit Region I, II, III oder IV-Varianten oder BSA, verdünnt in 5% DMEM, für 1,5 Stunden bei 4°C behandelt. HSV-1-Stamm NS wurde bei 50 PFU pro Well für 1,5 Stunden addiert und danach mit Variante oder BSA behandelt. Nach 24 Stunden bei 37°C wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden fixiert und luftgetrocknet. Virus-Titer wurden durch Immunoperoxidase-Assay bestimmt und die Menge an Variante, die benötigt wurde, um die HSV-Infektion zu blockieren, wurde titriert. Die Ergebnisse der Assays für das trunkierte Wildtyp gD-1-Molekül und die Variante gD-1 (Δ290–299t) werden in den 4a und 4b präsentiert. Wenn die Menge an Wildtyp gD-1 (306t), die benötigt wurde, um die Infektion um mehr als 60% blockieren, gleich 1 ist, dann schaffte es die Region I-Variante gD-1 (∇34t) überhaupt nicht, die Infektion zu blockieren, dann blockierte die Region III-Variante gD-1 (∇234t) halb so gut wie Wildtyp und dann blockierte die Region II-Variante gD-1 (∇126t) so gut wie Wildtyp. Im Vergleich zu diesen Ergebnissen zeigte sich eine signifikante Steigerung in der Fähigkeit, die Infektion zu blockieren, bei der Region IV-Variante gD-1 (Δ290–299t). Diese war in der Lage, die Infektion durch HSV-1 ungefähr 400mal besser zu blockieren als Wildtyp gD-1.
Wenn die Variante gD-1 (Δ290–299t) durch Erhitzen auf 65°C für fünf Minuten denaturiert wurde und danach auf 4°C gekühlt wurde, ehe der Plaquebildung-Assay durchgeführt wurde, war die Variante zur Blockade der HSV-1-Infektion nicht in der Lage. Die Hitzedenaturierung zerstört die Sekundär- und Tertiärstruktur von gD, aber läßt die Disulfidbrücken intakt. Siehe 5.
Die Region IV-Variante gD-1 (Δ290–299t) zeigte ähnliche Blockierungswirkungen in den Assays zur Ausbreitung von Zelle zu Zelle und zum Eintritt von HSV/lacZ+.
Der Assay zur Zell-zu-Zell-Ausbreitung wurde auf dieselbe Weise durchgeführt wie der Plaquebildungs-Assay, außer daß die gD-Proteine nicht eher als drei Stunden, nachdem die Zellen mit HSV-1 infiziert wurden, addiert wurden. Die Ergebnisse der Assays werden in 6 präsentiert.
In den HSV/lacZ+-Assays wurden konfluente Monoschichten von Vero-Zellen in 96-Well-Kulturplatten mit Variante, verdünnt in DMEM (Bio Whittaker, Walkersville, MD) + 5% fötalem Rinderserum, für 90 Minuten bei 4°C vorinkubiert. Zu jedem Well wurden 1,5 × 10⁴ PFU/Well an 7134 Virus, einem HSV-1 KOS-Stamm mit beiden Kopien von ICPO-Gen ersetzt mit E. coli lacZ-Gen [Cai et al., J Virol., 63: 4579–4589 (1989)], korrespondierend mit einem MOI von ungefähr 0,4, für 90 Minuten bei 4°C addiert. Nach vier Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit 0,5% NP40 lysiert. Die NP40-Lysate wurden auf eine neue 96-Well-Platte transferiert. Die (3-Galactosidase-Aktivität wurde durch Addition von CPRG (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)-Substratlösung detektiert. Die Absorption wurde bei 570 nm unter der Verwendung eines Microplate Biokinetics Reader (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) gemessen. Die Ergebnisse des Assays werden in 7 präsentiert.
Die Ergebnisse der drei Typen der Assays werden in 8 zusammengefaßt, worin micromolare Mengen an Protein gezeigt werden, die notwenig für eine 50% Inhibierung von 50 PFU HSV (oder für 50% Inhibierung von 1,5 × 10⁴ PFU, wie gemessen durch beta-Galatosidase-Produktion für die ein „Eintritts"-Werte) sind, und worin „NE" anzeigt, daß das Protein keinen Effekt hatte. Es ist klar, daß, während die gD-1-Varianten ähnliche Konformationen und Zellbindungs-Eigenschaften zeigen, daß die Region IV-Variante eine signifikant potentere HSV-inhibitorische Verbindung ist.
Beispiel 5
Baculovirus-produzierte Region IV-Varianten-Moleküle von gD der Erfindung wurden auch in Assays zur Plaquebildung, wie in Beispiel 4 beschrieben, auf die Fähigkeit untersucht, die Infektion von empfänglichen Zellen durch verschiedene HSV-1-Stämme sowie durch zwei mutante HSV-Stämme, deren Infektiosität nicht durch Wildtyp gD-1 (306t) blockiert wird, zu blockieren. Die verschiedenen Stämme können durch Vergleich ihre Nukleotid- und Aminosäuresequenzen unterschieden werden.
Wenn der Wildtyp gD-1 (306t) und das Varianten-Molekül von gD-1 (Δ290–299t) in Assays zur Plaquebildung getestet wurden, in welchen HSV-Stämme HFEM, KOS und 17 verwendet wurden, zeigte das Varianten-Molekül gD-1 (Δ290–299t) einen gesteigerten inhibitorischen Effekt auf jeden Stamm im Vergleich zum Wildtyp von gD-1. Vergleiche 9a (306t) und 9b (Δ290–299t). Diese Ergebnisse sind konsistent mit den Ergebnissen, die für HSV-1-Stamm NS im vorangehenden Beispiel präsentiert wurden. Weiterhin war die Variante gD-1 (Δ290–299t) in der Lage, die Infektion von mutanten HSV-1-Stämmen rid1 und rid2 zu inhibieren (10), während das Wildtyp-Molekül dies nicht vermochte. Die Mutantenstämme rid1 und rid2 wurden durch Passagieren von HSV-1-Stamm KOS an gD-exprimierende Zellen generiert, um Viren zu selektieren, welche die Fähigkeit von Wildtyp gD-1, die Infektiosität der Viren zu inhibieren, überwinden. Siehe Dean et al., Virology, 199: 67–89 (1994). Weder Wildtyp gD-1 (Daten nicht gezeigt) noch die Variante gD-1 (Δ290–299t) waren in der Lage, die Infektion durch den mutanten HSV-1-Stamm ANG zu inhibieren (9). Der ANG-Virusstamm wird in Dean et al., J Virol., 69(8): 5171–5176 (1995) als ein Stamm beschrieben, welcher fast vollständig resistent gegenüber gD-vermittelter Interferenz ist (d.h. das ANG-Virus kann Zellen infizieren, die gD exprimieren).
Die Tabelle 1 unten legt die Konzentration an gD-1-Molekül dar, die für eine 50% Inhibierung von 50 PFU HSV notwendig ist, wie in den Assays zur Plaquebildung gemessen. In der Tabelle zeigt „NE" an, daß das Molekül keinen Effekt auf die Infektiosität des angezeigten Virus-Stammes hat, und „ – – „ zeigt an, daß der Wert nicht berechnet werden kann.
Tabelle 1
Die Region IV-Variante gD-1 (Δ290–299t) kann daher Herpesviren effektiver inhibieren als das Wildtyp-Protein von gD-2 und kann Herpesviren inhibieren, die Wildtyp gD-1 (306t) nicht inhibieren kann.
Beispiel 6
Die Fähigkeit von gD-1-Molekülen, andere Herpesviren zu inhibieren, wurde ebenso untersucht. Das Varianten-Molekül gD-1 (Δ290–299t), wurde in Assays zur Plaquebildung (Beispiel 4) getestet, welche den Stamm 333 von HSV-2 und bovines Herpes 1 (BHV-1), ein verwandtes Alphaherpesvirus, involvieren. Wie in 11 gezeigt, inhibierte die Variante Δ290–299t HSV-1 aber nicht BHV-1, was demonstriert, daß ihre inhibitorische Fähigkeit spezifisch für die HSV-Infektion ist.
Weiterhin inhibiert das Varianten-Molekül gD-1 (Δ290–299t) HSV-2 bei einem IC₅₀-Spiegel von 1,5 nm während Wildtyp gD-1 HSV-2 bei einem IC₅₀-Spiegel von 164 nm inhibierte. Demnach hatte gD-1 (Δ290–299t) einen 109-fach größeren Effekt auf die Plaquebildung von HSV-2 als Wildtyp gD-1 (306t).
Beispiel 7
Polyklonale Antikörper, die für Wildtyp gD-1 (306t) und das Varianten-Molekül gD-1 (Δ290-299t) spezifisch sind, wurden in Kaninchen ausgelöst. Die polyklonalen Antikörper wurden dann auf die Fähigkeit, HSV-1-Infektionisität zu neutralisieren, untersucht.
Zwei Kaninchen (bezeichnet als R122 und R123) wurden mit einer Inokulation von 100 μg gereinigtem gD-1 (306t) initial immunisiert, während zwei Kaninchen (bezeichnet als R130 und R131) initial mit einer Inokulation von 100 μg gereinigtem gD-1 (Δ299–299t) immunisiert wurden. Beide Sätze an initialen Inokula wurden im Verhältnis von 1:1 mit komplettem Freund's Adjuvans gemischt und subkutan in inguinale und axillare Regionen und intramuskulär in hintere Extremitäten gegeben. Es wurden nicht mehr als 0,2 ml pro subkutaner Stelle und nicht mehr als 0,5 ml pro intramuskulärer Stelle verabreicht. Nach zwei Wochen erhielt jedes Kaninchen eine Sekundärinjektion („was boosted") von 50 μg des entsprechenden Antigens gemischt in einem Verhältnis von 1:1 mit inkomplettem Freund's Adjuvans. Die ersten Injektionen („boosts") (und alle nachfolgenden Injektionen) wurden subkutan entlang des Rückens und intramuskulär in die hinteren Extremitäten gegeben. Es wurden nicht mehr al 0,2 ml pro subkutaner Stelle und nicht mehr als 0,5 ml pro intramuskulärer Stelle verabreicht. Die Kaninchen wurden gleichermaßen in den Wochen 3, 7, 10 und 14 injiziert („boosted"). Testblutungen wurden in den Wochen 5, 8, 11 und 16 entnommen. Neutralisierungs-Assays wurden mit polyklonalen Sera von der vierten Blutung durchgeführt.
Die polyklonalen Antikörper wurden auf die Fähigkeit untersucht, die HSV-1-Infektioisität zu neutralisieren. Die Fähigkeit der Antikörper, die Infektioisität zu inhibieren, zeigt an, daß die antigene Konformation des Varianten-Moleküls von gD gleich zu der des Wildtyp-Moleküls ist. Von Wildtyp-gD ist bekannt, daß es die Produktion von potenten Virus-neutralisierenden Antikörpern induziert, wenn es in Tiere injiziert wird.
Die Kaninchen-Sera wurden bei 56°C für 30 Minuten hitzebehandelt, um das Complement zu inaktivieren. Vero-Zellen wurden in 48-Well-Platten gewachsen, bis die Monoschicht nahezu konfluent war. Serielle 2-fache Verdünnungen von Serum wurden in DMEM-Medium, enthaltend 5% fötales Rinderserum (FBS), präpariert, danach mit einem gleichen Volumen an HSV-1-Stamm KOS in demselben Medium gemischt. Die Virus-Konzentration wurde eingestellt, um ungefähr 100 Plaques pro Well in der 48-Well-Platte bei Abwesenheit von neutrali sierendem Antikörper zu ergeben. Jede Mischung aus Virus und Kaninchen-Serum wurde im Duplikat auf die Vero-Zell-Monoschichten ausplattiert und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Jedes Well der 48-Well-Platte wurde dann mit Medium überschichtet und bei 37°C inkubiert, bis sich sichtbare Plaques entwickelten. Das Medium wurde entfernt und die Zellen wurden mit einer Mischung aus Methanol und Aceton fixiert und getrocknet. Die Plaques wurden durch Inkubation der Monoschichten mit einem Cocktail aus Antikörpern gegen die Glykoproteine gD, gB und gC visualisiert, danach wurde ein „Schwarz-Plaque-Assay" unter der Verwendung von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Protein A durchgeführt, gefolgt von der Addition des Substrats 4-Chlor-1-Naphtol. Die Plaques wurden danach gezählt. Die Ergebnisse der Assays werden in Tabelle 2 unten präsentiert, wobei der Titer-Wert die Verdünnung des Antikörpers ist, welche die HSV-1-Plaqueanzahl um 50% reduzierte.
Tabelle 2
Die polyklonalen Kaninchen-Antisera von Wildtyp und gD-1 (Δ290–299t) hatten ähnliche Neutralisations-Titer, was vorschlägt, daß gD-1 (Δ290–299t) Wildtyp-Immunogenität beibehält. Dieses Ergebnis ist konsistent mit den Analysen der dreidimensionellen Struktur, die in Beispiel 3 präsentiert wird.
Beispiel 8
Monoklonale Antikörper, die spezifisch für gD-Varianten der Erfindung sind, können wie folgt generiert werden.
Um monoklonale Antikörper zu generieren, werden weibliche Balb/c Mäuse mit 50 μg eines Varianten-Moleküls von gD-1 immunisiert. Das Immunogen wird in komplettem Freund's Adjuvans präpariert, mit nachfolgenden Sekundärinjektionen („boosts") (25 μg Antigen in inkomplettem Freund's) in einem Intervall von ungefähr 21 Tagen. Zellinien, die monoklonale Antikörper produzieren, werden wie folgt isoliert. Kurz gesagt, es wird eine Einzelzell-Suspension durch Suspendieren von immunisieren Maus-Milzzellen in serumfreiem RPMI 1640, supplementiert mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (RPMI) (Gibco, Kanada), gebildet. Die Suspension wird durch einen sterilen 70-Mesh Nitex Zell-Abscheider („cell strainer") (Becton Dickinson, Parsippany, NJ) filtriert und zweimal durch Zentrifugieren bei 200 g für 5 Minuten g gewaschen und das Pellet wird in 20 ml serumfreien RPMI resuspendiert. Thymozyten, die aus drei naiven Balb/c Mäusen entnommen wurden, wurden auf diese Weise präpariert.
NS-1 Mylelomazellen, welche in der Log-Phase in RPMI mit 11% fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) für drei Tage vor der Fusion gehalten wurden, werden bei 200 g für 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet wird zweimal gewaschen, wie im vorangehenden Absatz beschrieben. Nach dem Waschen wird jede Zellsuspension auf ein Endvolumen von 10 ml in serumfreiem RPMI gebracht und 10 μl werden 10:100 verdünnt. 20 μl jeder Verdünnung werden entfernt, mit 20 μl 0,4% Trypan Blau-Färbemittel in 0,85% Saline (Gibco) gemischt, auf ein Hemacytometer geladen und gezählt.
2 × 10⁸ Milzzellen werden mit 4 × 10⁷ NS-1-Zellen kombiniert, zentrifugiert und der Überstand wird aspiriert. Das Zell-Pellet wird entfernt („dislodged") durch Klopfen des Röhrchens und 2 ml von 37°C PEG 1500 (50% in 75 mM Hepes, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) werden unter Rühren über den Zeitraum von 1 Minute addiert, gefolgt durch Addition von 14 ml an serumfreiem RPMI über 7 Minuten. Zusätzliche 16 ml RPMI werden addiert und die Zellen werden bei 200 g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstandes wird das Pellet in 200 ml RPMI, enthaltend 15% FBS, 100 μM Natrium-Hypoxanthin, 0,4 μM Aminopterin, 16 μM Thymidin (HAT) (Gibco), 25 Einheiten/ml IL-6 (Mallinckrodt, Folcrost, PA) und 1,5 × 10⁶ Thymozyten/ml resuspendiert. Die Suspension wird in zehn 96-Well Gewebekultur-Platten mit flachem Boden verteilt, 200 μl/Well. Die Zellen in den Platten werden 3 bis 4-mal zwischen Fusionieren und Durchsuchen gefüttert durch Aspirieren von ungefähr der Hälfte des Mediums aus jedem Well mit einer 18G Nadel und Nachfüllen von Plattierungs-Medium, wie oben beschrieben, außer enthaltend 10 Einheiten/ml IL-6 und ohne Thymozyten.
Die Fusionen werden durchsucht, wenn das Zellwachstum 60–80% Konfluenz erreicht (Tag 7 bis 9) mittels ELISA an der bestimmten gD-1-Variante, welche als das Immunogen verwendet wurde, im Vergleich zum Wildtyp gD-1 und/oder anderen Varianten-Molekülen von gD-1. Immunlon 4-Platten (Dynatech, Cambridge, MA) werden bei 4°C über Nacht mit 100 ng/Well Protein in 30 mM Carbonatpuffer, pH 9.6 beschichtet. Die Platten werden mit 100 μg/Well an 0,5% Fischhaut-Gelatine in PBS für eine Stunde bei 37°C blockiert, dreimal mit PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) gewaschen und 50 μl Kulturüberstand werden addiert. Nach der Inkubation bei 37°C für 30 Minuten und Waschen, wie oben beschrieben, werden 50 μl Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziege-Anti-Maus-IgG(fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), verdünnt 1:3500 in PBST, addiert. Die Platten werden wie oben inkubiert, viermal mit PBST gewaschen und 100 μl Substrat, bestehend aus 1 mg/ml o-Phenyldiamin und 0,1 μl/ml H₂O₂ in 100 mM Citrat, pH 4,5 werden addiert. Die Farbreaktion wird nach 5 bis 10 Minuten durch die Addition von 50 μl 15% H₂SO₄ gestoppt. A₄₉₀ wird an einem Platten-Lesegerät abgelesen.
Die Wells, welche bevorzugte Reaktivität der Varianten-Präparation von Interesse über die Kontroll-Präparationen zeigen, werden in limitierenden Verdünnungen ausplattiert, um monoklonale Zellinien zu isolieren, welche Antikörper produzieren, die spezifisch für dieses Varianten-Molekül von gD-1 sind. Sequenzprotokoll

37

Claims

Varianten-Molekül des Glycoproteins D von Herpes Simplex-Virus, umfassend Aminosäuren 1 bis 300 von SEQ ID NO: 2.
Varianten-Molekül nach Anspruch 1, des weiteren umfassend Aminosäuren –2 und –1 von SEQ ID NO: 2.
Varianten-Molekül nach Anspruch 1, des weiteren umfassend Aminosäuren 301 bis 306 von SEQ ID NO: 2.
Molekül gD-1(Δ290–299t), umfassend Aminosäuren –2 bis 306 von SEQ ID NO: 2.
Polynukleotid, kodierend für das Protein nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4.
Polynukleotid nach Anspruch 5, das ein DNA-Molekül ist.
DNA-Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 6.
DNA-Vektor nach Anspruch 7, worin besagtes Polynukleotid operativ mit einer Expressionskontroll-DNA-Sequenz verbunden ist.
Wirtszelle, stabil transformiert oder transfiziert mit einem Polynukleotid nach Anspruch 6.
Verfahren zur Herstellung eines Varianten-Moleküls des Glycoproteins D von Herpes Simplex-Virus, umfassend das Wachsen lassen einer Wirtszelle gemäß Anspruch 9 in einem geeigneten Nährmedium, und Isolieren des besagten Proteins aus der Zelle oder dem Medium seines Wachstums.
Antikörper spezifisch für das Varianten-Molekül nach Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4.
Antikörper nach Anspruch 11, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Anti-idiotypischer Antikörper, spezifisch für den Antikörper nach Anspruch 12.
Zusammensetzung, umfassend ein Varianten-Molekül gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4 und einen akzeptablen Träger.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 14 für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Infektion von anfälligen Zellen durch Herpes Simplex-Virus.