DE69228944T2

DE69228944T2 - Bovines herpesvirus typ 1rekombinantenpolypeptide und vakzine

Info

Publication number: DE69228944T2
Application number: DE69228944T
Authority: DE
Inventors: Lorne Babiuk; David Fitzpatrick; Sylvia Van Den Hurk; Tim Zamb
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 1991-12-11
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 1999-12-02
Anticipated expiration: 2012-12-12
Also published as: WO1993011792A1; EP0618814B1; EP0618814A1; DE69228944D1; EP0888777A3; EP0888777A2; ATE178802T1; US5879895A; US5585264A; US5858989A; ES2130184T3

Description

Technischer Hintergrund

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Krankheitsvorbeugung bei Rindern. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die rekombinante Herstellung bestimmter Rinderherpesvirus Typ 1 (BHV-1)-Antigene, besonders ein verkürztes gIV-Antigen von BHV-1, zur Verwendung in Impfstoffen, um Rinder vor einer Rinderherpesvirus Typ 1- Infektion zu schützen.

Hintergrund

Das Rinderherpesvirus Typ 1 (BHV-1) ist ein wirtschaftlich bedeutendes Pathogen des Rindes. BHV-1, das auch als infektiöses Rinderrhinotracheitisvirus bekannt ist, verursacht schwere Atemwegsinfektionen, Konjunktivitis, Vulvovaginitis, Aborte, Encephalitis und generalisierte Allgemeininfektionen. Falls sich ein Tier von einer Primärinfektion erholt, verbleibt das Virus in dem Wirt in einem latenten Stadium. Die Reaktivierung des Virus kann durch bestimmte endogene oder exogene physische Modifikationen in dem Tier oder experimentell durch Behandlung des Tieres mit Glucokortikoiden, wie Dexamethason, ausgelöst werden.
Bei dem Versuch, BHV-1-Infektionen zu bekämpfen, wurden Impfstoffe mit einem abgetöteten Virus und Lebendimpfstoffe mit einem attenuierten Virus entwickelt. Obwohl diese Impfstoffe anscheinend einen gewissen Grad an Schutz in Rindern hervorrufen, liegt der Immunitätsgrad deutlich unter dem, der erforderlich ist, um einen vollkommenen oder beinahe vollkommenen Schutz vorzusehen. Zum Beispiel beugen die Impfstoffe nicht immer der Entwicklung einer latenten Infektion mit einem virulenten Feldstamm von BHV-1 vor. Außerdem wurde die Sicherheit der Impfstoffe mit einem lebenden Virus angezweifelt. Es wurde vor kurzem gezeigt, daß zwei Lebendimpfstoff-BHV-1-Stämme durch die Verwendung von Dexamethason reaktiviert werden können, was zeigt, daß zumindest einige BHV-1- Impfstoffe selbst eine latente Infektion begründen können. Vgl. z. B. Gerber et al., Am. J. Vet. Res. 39 (1978), 753-760; Jericho et al., Can. J. Com. Med. 47 (1983), 133-139; Pastoret et al., Infect. Immun. 29 (1980), 483-488. Untereinheiten-Impfstoffe, d. h. Impfstoffe, die ausgewählte Proteine beinhalten, die aus dem ganzen Virus getrennt wurden, sehen ein Verfahren zur Überwindung der mit der Verwendung von Impfstoffen mit einem lebenden oder attenuierten Virus verbundenen Probleme vor.
Mehrere Polypeptide von BHV-1 wurden nun untersucht. Misra et al., J. Virol. 40 (1981), 367-378, beschreiben die teilweise Charakterisierung einer Anzahl von BHV-1-Polypeptiden und ihre Immunpräzipitation mit Antiserum. Die Artikel von von Drunen Lind-von den Hurk et al., Virology 135 (1984), 466-479 und von Drunen Littel-von den Hurk et al., Virology 144 (1985), 216-227, betreffen monoclonale Antikörper, die gegen BHV-1-Glykoproteine entwickelt wurden und die Fähigkeit der monoclonalen Antikörper, das Virus zu neutralisieren und bei der Antikörper-abhängigen, Komplement-vermittelten Lyse in vitro mitzuwirken. Vgl. auch Collins et al., J. Virol. 52 (1984), 403-409; Okazaki et al., Virology 150 (1986), 260-264. Der Artikel von von Drunen Littel-von den Hurk et al., Virology 144 (1985), 204-215, betrifft die Reinigung von BHV-1-Glykoproteinen durch Immunadsorptionschromatographie und die Herstellung von Antiserum in Kaninchen. Die Veröffentlichung von von Drunen Littel-von den Hurk et al., J. Clin. Microbiol 23 (1986), 274-282, betrifft die in vitro-Immunreaktivität von gereinigten BHV-1-Glykoproteinen und Rinderantiserum. Okazaki et al., Arch. Virol. 92 (1987), 17-26 beziehen sich auf in vitro-Studien der Reaktivitäten monoclonaler Antikörper gegen BHV-1-Glykoproteine mit infizierten Zellen. Babiuk et al., Virology 159 (1987)57-66 berichten über die Reinigung von gI, gIII und gIV aus virusinfizierten Zellysaten. Diese Literaturstelle offenbart auch, daß gI von BHV-1 dem gB des Herpes simplex-Virus entspricht, gIII dem gC entspricht und gIV dem gD entspricht. Es wurde gezeigt, daß gereinigtes gI, gIII und gIV hohe neutralisierende Antikörperspiegel in Rindern induzieren und bei der Antikörper-abhängigen Zellcytotoxizität von BHV-1-Zellen beteiligt sind. Es wurde auch gezeigt, daß die gereinigten Glykoproteine Rinder vor einer Erkrankung schützen. Babiuk et al., Virology 159 (1987), 57-66. von Drunen Littel-von den Hurk et al., Vaccine 8 (1990), 358-368, bestätigten die Schutzwirkung von gI, gIII und gIV und untersuchten die Epitopspezifität der Immunantwort auf die Glykoprotein-Impfstoffe. Hughes et al., Arch. Virol. 103 (1988), 47-60 identifizierten drei neutralisierende antigene Domänen auf gIV.
Mayfield et al., J. Virol. 47 (1983), 259-264 offenbaren die Clonierung eines BHV-1-Stamms und eine Restriktionskarte. Fitzpatrick et al., Virology 173 (1989), 46-57 beschreiben die Nucleotidsequenz von gIII. Pachl et al., J. Virol. 61 (1987), 315-325 beschreiben die rekombinante Expression eines Glykoproteins des menschlichen Pathogens HSV-1. Es gab jedoch keinen Beweis, daß das rekombinante Polypeptid des menschlichen Virus beim Menschen tatsächlich einen Schutz gewährt. Vgl. auch PCT-Veröffentlichung Nr. WO88/02634, US-Patente Nrn. 4,661,349 und 4,642,333.
Fitzpatrick et al., J. Virol. 62 (1988), 4239-4248 beschreiben die Expression von gI und gIII in LMTK-Zellen der Maus. Es wurde gezeigt, daß die transfizierten Zellen die Produktion neutralisierender Antikörper in Mäusen stimulieren. Fitzpatrick et al. (1990) beschreiben die Expression von deletierten, verkürzten und hybriden Formen von gI und gIII in LMTK-Zellen der Maus und die Epitopkartierung derselben. Tikoo et al., J. Virol. 64 (1990), 5132-5142 offenbaren die Kartierung, Clonierung und Sequenzierung von gIV von BHV-1 sowie die Expression von gIV in Rinderzellen. von Drunen Littel-von den Hurk et al., J. Virol. 63 (1989), 2159-2168 offenbaren die Expression von gI und gIII in einem Vacciniavirusvektor. Die rekombinanten Vektoren riefen eine neutralisierende Antikörperantwort in Rindern hervor, die mit demselben immunisiert worden waren. von Drunen Littel-von den Hurk et al., J. Virol. 65 (Jan. 1991), 263-271 beschreiben die Expression von gIV durch ein rekombinantes Baculovirus. Diese Offenlegung basierte zum Teil auf der vorliegenden Erfindung. Mit dem rekombinanten gIV immunisierte Rinder erzeugten neutralisierende Antikörper dagegen.
Das US-Patent 5,151,267, erteilt am 29. September 1992, offenbart Impfstoffe, umfassend mindestens eine rekombinante antigene Determinante von gI von BHV-1, gIII von BHV-1 und/oder gIV von BHV-1 und die Herstellung davon. Babiuk et al., Virology 159 (1987), 57-66, beschreiben ebenfalls den Schutz von Rindern mit einzelnen viralen BHV-1- Glykoproteinen.
Palmer et al., J. Immunol. 145 (3) (1. August 1990), 1009-1014 erwähnen Plasmide, die die Gene für gI- und gIV-Proteine enthalten, die in eine Osteosarkomzellinie des Hundes transfiziert wurden.
Leary et al., J. Immunol. 145 (2) (15. Juli 1990), 718-723, erwähnen die Clonierung der Glykoproteine gI, gIII und giV in einen RNA-Transkriptionsvektor. Eine Reihe von Fragmenten des gIII-Proteins erlaubte die Identifizierung von zwei Epitopen.

Offenbarung der Erfindung

Es wurde festgestellt, daß rekombinante Untereinheiten-Impfstoffe auf der Grundlage von ausgewählten BHV-1-Glykoproteinen Rinder vor einer Erkrankung schützen. Diese Impfstoffe sind insbesondere beim Schutz von Rindern vor dem Transportfieberkomplex- Syndrom nützlich, das oft eine Infektion mit BHV-1 einschließt. Überraschenderweise gewähren diese Untereinheiten-Impfstoffe einen wesentlich größeren Schutz als Impfstoffe mit einem abgetöteten Virus oder Lebendimpfstoffe mit einem attenuierten Virus gemäß dem Stand der Technik. Die rekombinanten Untereinheiten-Impfstoffe unterdrücken nicht die Immunantwort auf andere Komponenten, die oft in multivalenten Transportfieber-Impfstoffen mit einem attenuierten Virus vorkommen. Außerdem beseitigen die erfindungsgemäßen rekombinanten Untereinheiten-Impfstoffe das Infektionsrisiko durch Lebendvirusimpfstoffe. Es wurde auch festgestellt, daß rekombinante BHV-1-Polypeptide die zum Schutz immunisierter Tiere vor einer Erkrankung erforderlichen richtigen Epitope beibehalten. Sowohl nichtglykosylierte Polypeptide als auch durch heterologe Wirtsorganismen glykosylierte Peptide rufen wirksam Antikörper hervor, die die Virusinfektiosität neutralisieren und die Komplement-vermittelte Zelllyse induzieren. Basierend auf diesen Entdeckungen kann die vorliegende Erfindung in mehreren Ausführungsformen vorliegen.
Die Erfindung betrifft somit ein rekombinantes Untereinheiten-Antigen, umfassend ein Protein, das entweder ein verkürztes gIV-Protein des Rinderherpesvirus Typ 1 (BHV-1) ist, oder ein Protein, das eine der durch das gIV-Protein von BHV-1 hervorgerufenen Immunantwort äquivalente Immunantwort hervorrufen kann und zu mindestens 85% zu dem verkürzten Protein homolog ist, wobei das Protein sezernierbar ist und mindestens ein Polypeptid-neutralisierendes Epitop, nicht aber die gIV-Transmembranankersequenz aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Impfstoffzusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger plus ein rekombinantes Untereinheiten-Antigen, umfassend ein verkürztes gIV-Glykoprotein des Rinderherpesvirus Typ 1 (BHV-1), gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem weiteren rekombinanten Untereinheiten-Antigen, umfassend ein neutralisierendes Epitop des Glykoproteins, ausgewählt aus gI von BHV-1, gIII von BHV-1 und einem zweiten gIV-Protein von BHV-1. Die Herstellung eines verkürzten Proteins erfolgte durch Sekretion. Ein Beispiel eines ein verkürztes gIV von BHV-1 enthaltenden Plasmids ist pG4HUNEO mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 69076.
Gemäß anderen Ausführungsformen betrifft der Gegenstand der Erfindung Nucleotidsequenzen, die Proteine codieren, die zu dem verkürzten gIV von BHV-1 im wesentlichen homolog und funktionell äquivalent sind.
In anderen Ausführungsformen betrifft der Gegenstand der Erfindung DNA-Konstrukte, die eine die folgende Bestandteile umfassende Expressionskassette umfassen: (a) eine DNA-Sequenz, die das Untereinheiten-Antigen codiert; und (b) Kontrollsequenzen, die funktionell mit der codierenden Sequenz verbunden sind, wodurch die codierende Sequenz in einer Wirtszelle transkribiert und translatiert werden kann, und wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen zu der codierenden Sequenz heterolog ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, die stabil mit den vorstehenden DNA-Konstrukten transformiert ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft der Gegenstand der Erfindung Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Untereinheiten-Antigens, umfassend:
(a) Bereitstellung einer Population der vorstehenden Wirtszellen; und
(b) Züchtung der Population der Zellen in einem Wachstumsmedium unter Bedingungen, unter denen das von der Expressionskassette codierte Antigen exprimiert und sezerniert wird; und gegebenenfalls
(c) Gewinnung des sezernierten Antigens aus dem Wachstumsmedium.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung von oder Vorbeugung vor einer BHV-1-Infektion in einem Rind, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer der vorstehend beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen an ein Rind.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann aus der folgenden Offenlegung ohne weiteres deutlich.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist die Nucleotidsequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz eines viralen Clons von gIV. Das Gen codiert ein 417 Aminosäuren langes Peptid. Der rechtwinklige Pfeil markiert die Position der reifen gIV-Sequenz. Mutmaßliche Transmembransequenzen sind unterstrichen.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion des Vaccinia-Expressionsvektors pVV-1.
Fig. 3 veranschaulicht die Konstruktion des Vaccinia-Expressionsvektors pVVSL-1.
Fig. 4 veranschaulicht den Vaccinia-Expressionsvektor pVV-1/gIV, wobei das vollständige gIV-Gen in die BglII-Clonierungsstelle von pVVSL-1 cloniert wurde.
Fig. 5 zeigt den Vaccinia-Expressionsvektor pVV-1/gIVt, der ein modifiziertes gIV-Gen von BHV-1, das in die BglII-Clonierungsstelle von pVVSL-1 insertiert ist, einschließt.
Fig. 6 zeigt verschiedene Clone der BHV-1-Genombank.
Fig. 7 veranschaulicht das E. coli-Expressionsplasmid "pgp11 vollständig", das die vollständige gIb codierende Sequenz einschließlich der die ersten acht Aminosäuren von glc codierenden DNA trägt. Vgl. Beispiel V.
Fig. 8 zeigt das E. coli-Expressionsplasmid pBHC 150Δ, das eine Deletionsmutante des gIII-Gens von BHV-1 trägt. Vgl. Beispiel V.
Fig. 9 zeigt die Clonierungsstrategie und die Konstruktion von pBHDsib. Vgl.

Beispiel V

Fig. 10 veranschaulicht das E. coli-Expressionsplasmid pBHDsib, das ein das reife Protein codierendes gIV-Gen enthält. Vgl. Beispiel V.
Fig. 11 veranschaulicht den Adenovirus-Transfervektor pAdBM5. * gibt die Geninsertionsstelle an. Vgl. Beispiel VI.
Fig. 12 zeigt den Adenovirusvektor pAdBM5.gIV, der das das vollständige gIV codierende Gen einschließt. Vgl. Beispiel VI.
Fig. 13 zeigt die Wirkungen der Immunisierung mit dem verkürzten gIVA-Protein von BHV-1 (- -), verglichen mit gIVA (-O-) und einem Placebo (- -) auf die Virusausscheidung bei Tieren, die BHV-1 ausgesetzt wurden.
Fig. 14 zeigt die tägliche Anzahl kranker Kälber bei der Behandlung mit BHV-IV-Protein, verkürztem BHV-IV-Protein und einem Placebo.
Fig. 15: Struktur von gIV-Deletionen und -Verkürzungen von BHV-1. Die Aminosäuresequenz von gIV ist im oberen Teil der Figur mit der Signalsequenz ( ), der Transmembranankersequenz (\\\\\), den Cysteinresten (5) und potentiellen N-gebundenen Glykosylierungsstellen (↑) schematisch dargestellt. Unter dem Diagramm des intakten gIV werden deletierte oder verkürzte Formen von gIV gezeigt, wobei die vorhandenen Bereiche durch eine durchgehende Linie ( ) angegeben sind. Die jedem Mutantenprotein zugewiesene Bezeichnung ist rechts davon angegeben.
Fig. 16: Vorausgesagte Sekundärstruktur von gIV von BHV-1. Die daräus abgeleitete Aminosäuresequenz von gIV wurde auf alpha-Helix-, beta-Faltblatt- und beta- Drehung-Wahrscheinlichkeiten unter Verwendung einer Version des Algorithmus von Chou und Fasman analysiert. Segmente der alpha-Helix sind in Schleifenform, Segmente der beta- Faltblätter sind in Zickzackform und beta-Drehungen sind als Kurven dargestellt. Cysteinreste (C) und potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen (N) sind angegeben. Die ungefähre Lage der kartierten Epitope ist durch Pfeile angegeben, während der zur richtigen Prozessierung und zum Transport erforderliche Bereich des gIV durch eine Klammer markiert ist.
Die Fig. 17(a) und (b) zeigen die Wirkungen der Immunisierung mit einem Impfstoff mit einem verkürzten gIV von BHV-1.

Ausführliche Beschreibung

Wenn nicht anders angegeben, umfaßt die Durchführung der vorliegenden Erfindung herkömmliche Verfahren der Virologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und DNA- Rekombinantionsverfahren, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Solche Verfahren werden ausführlich in der Literatur erläutert. Vgl. z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, 1989); Maniatis et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, Bd. I & II (Glover D., Hrsg.); Oligonucleotide Synthesis (Gait N., Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames B. & Higgins S., Hrsg., 1985); Transcription and Translation (Hames B. & Higgins S., Hrsg., 1984); Animal Cell Culture (Freshney R., Hrsg., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

A. Definitionen

Die folgende Terminologie wird in Übereinstimmung mit den nachstehend in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung angegebenen Definitionen verwendet.
Eine DNA "codierende Sequenz" ist eine DNA-Sequenz, die in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz sind durch ein Startcodon am 5' (Amino)-Terminus und einem Translationsstoppcodon am 3' (Carboxy)- Terminus festgelegt. Eine codierende Sequenz kann, ist aber nicht darauf begrenzt, prokaryontische Sequenzen, cDNA aus eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryontischer (z. B. Säuger-) DNA und auch synthetische DNA-Sequenzen beinhalten. Ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz ist üblicherweise 3' zu der codierenden Sequenz angeordnet.
Eine "Promotorsequenz" ist ein regulatorischer DNA-Bereich, der fähig ist, die RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts (3'-Richtung) angeordneten codierenden Sequenz zu initiieren. Gemäß der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz am 3'-Terminus über das Translationsstartcodon (ATG) einer codierenden Sequenz gebunden und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), wobei sie die Mindestanzahl von Basen oder Elementen einschließt, die zur Initiation der Transkription in nachweisbar über dem Hintergrund liegenden Mengen erforderlich sind. Innerhalb der Promotorsequenz kommt eine Transkriptionsinitiationsstelle (üblicherweise durch die Kartierung mit Nuclease S1 definiert) sowie für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortliche Proteinbindungsdomänen (Consensus-Sequenzen) vor. Eukaryontische Promotoren enthalten oft, aber nicht immer "TATA"-Boxen und "CAT"-Boxen. Prokaryontische Promotoren enthalten zusätzlich zu den -10- und -35-Consensus-Sequenzen Shine-Dalgarno- Sequenzen.
Der Begriff DNA-"Kontrollsequenzen" verweist zusammenfassend auf Promotorsequenzen, Ribosomenbindungsstellen, Polyadenylierungssignale, Transkriptionsterminationssequenzen, stromaufwärts angeordnete regulatorische Domänen, Enhancer und ähnliche Sequenzen, die gemeinsam für die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen.
Eine codierende Sequenz ist "funktionell verbunden mit" oder "unter der Kontrolle von" Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase an die Promotorsequenz bindet und die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann in das von der codierenden Sequenz codierte Polypeptid translatiert wird.
Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, die durch eine exogene DNA-Sequenz transformiert wurde oder transformiert werden kann.
Eine Zelle wurde durch eine exogene DNA-Sequenz "transformiert", wenn eine solche exogene DNA-Sequenz innerhalb der Zellmembran eingeschleust wurde. Die exogene DNA-Sequenz kann in die das Genom der Zelle ausmachende chromosomale DNA integriert (kovalent gebunden) werden oder auch nicht. In Prokaryonten und Hefen zum Beispiel kann die exogene DNA-Sequenz auf einem episomalen Element, wie einem Plasmid, beibehalten werden. Im Hinblick auf eukaryontische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine, in die die exogene DNA-Sequenz in das Chromosom integriert wurde, so daß sie von Tochterzellen durch Chromosomenreplikation ererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryontischen Zelle veranschaulicht, Zellinien oder Clone zu begründen, die aus einer Population der Tochterzellen bestehen, die die exogene DNA-Sequenz enthalten. Die episomale Replikation ist auch in Säugerzellen möglich, z. B. durch das EBV-ori- und EBNA- Gen enthaltende Plasmide und SV40-Plasmide in COS-Zellen.
Ein "Clon" ist eine Population von Zellen, die von einer einzigen Zelle oder einem gemeinsamen Vorläufer durch Mitose abstammen. Eine "Zellinie" ist ein Clon einer Primärzelle, die in vitro zur Vermehrung für viele Generationen fähig ist.
Zwei DNA- oder Polypeptid-Sequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 85% (vorzugsweise mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95%) der Nucleotide oder Aminosäuren über eine definierte Länge des Moleküls übereinstimmen. DNA-Sequenzen, die im wesentlichen homolog sind, können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter zum Beispiel stringenten Bedingungen gemäß der Definition für das einzelne System identifiziert werden. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. z. B. Maniatis et al., a. a. O.; DNA Cloning, Bd. I & II, a. a. O.; Nucleic Acid Hybridization, a. a. O.
Der Begriff "funktionell äquivalent" bedeutet, daß die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins eine Sequenz ist, die eine Immunantwort hervorruft, wie nachstehend definiert ist, die zu der des spezifizierten immunogenen Polypeptids von BHV-I äquivalent ist.
Ein "heterologer" Bereich eines DNA-Konstrukts ist ein innerhalb eines anderen DNA-Moleküls vorkommendes oder an ein anderes DNA-Molekül gebundenes identifizierbares DNA-Segment, das in der Natur nicht in Verbindung mit dem anderen Molekül vorkommt. Wenn der heterologe Bereich ein virales Gen codiert, wird das Gen folglich üblicher weise von DNA-Sequenzen flankiert, die das virale Gen im Genom des ursprünglichen Virus oder von virusinfizierten Zellen nicht flankieren. Ein anderes Beispiel der heterologen codierenden Sequenz ist ein Konstrukt, worin die codierende Sequenz selbst nicht in der Natur vorkommt (z. B. synthetische Sequenzen mit von dem nativen Gen verschiedenen Codons). Alle Variationen oder natürlich vorkommende Mutationsereignisse erzeugen gemäß des hier verwendeten Begriffs keinen heterologen DNA-Bereich.
Eine das Molekül A enthaltende Zusammensetzung ist "im wesentlichen frei von" Molekül B, wenn mindestens etwa 75 Gew.-% von A + B insgesamt in der Zusammensetzung aus Molekül A bestehen. Vorzugsweise macht Molekül A mindestens etwa 90 Gew.-% von A + B insgesamt in der Zusammensetzung aus, stärker bevorzugt mindestens etwa 99 Gew.-%.
Der Begriff "Rinder-Wirt" bezieht sich auf Rinder einer beliebigen Rasse, für die eine Immunisierung gegen eine BHV-1-Infektion wünschenswert sein kann, sei es, daß der Rinder-Wirt bereits mit BHV-1 infiziert oder latent mit BHV-1 infiziert ist oder nicht. Der Rinder-Wirt kann jedes beliebige Alter aufweisen. Folglich schließt der Begriff Kälber sowie erwachsene Rinder ein.
Der Begriff "native" Proteine oder Polypeptide bezieht sich auf Proteine oder Polypeptide, die aus dem BHV-1-Virus oder aus BHV-1-infizierten Zellen gewonnen werden. Folglich schließt der Begriff "natives BHV-1-Polypeptid" natürlich vorkommende BHV-1- Proteine und Fragmente davon ein. Der Begriff "nicht-native" Polypeptide bezieht sich auf Polypeptide, die durch DNA-Rekombinationsverfahren oder durch direkte Synthese hergestellt werden. Der Begriff "rekombinante" Polypeptide bezieht sich auf Polypeptide, die durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden; d. h., daß sie von Zellen produziert werden, die mit einem exogenen DNA-Konstrukt transformiert wurden, das das gewünschte Polypeptid codiert.
Der Begriff "Antigen" bezieht sich auf ein Molekül, das ein oder mehrere Epitope enthält, die das Immunsystem eines Wirtes stimulieren, um eine humorale und/oder zelluläre antigenspezifische Antwort hervorzurufen. Der Begriff wird auch gleichbedeutend mit dem Begriff "Immunogen" verwendet.
Mit dem Begriff "Untereinheiten-Antigen" ist eine von einem ganzen Virus (lebend oder abgetötet) verschiedene und abgrenzbare Antigenstruktur gemeint. Somit würde ein in einem zellfreien Extrakt enthaltenes Antigen ein "Untereinheiten-Antigen" darstellen, wie auch ein im wesentlichen gereinigtes Antigen.
Ein "Hapten" ist ein Molekül, das ein oder mehrere Epitope enthält, das das Immunsystem eines Wirtes nicht stimuliert, um eine humorale oder zelluläre Antwort hervorzurufen, sofern es nicht an einen Träger gebunden ist.
Der Begriff "Epitop" bezieht sich auf die Stelle auf einem Antigen oder Hapten, an die ein spezifisches Antikörpermolekül bindet. Der Begriff wird auch gleichbedeutend mit "antigenischer Determinante" oder "antigenische Determinantenstelle" verwendet.
Eine "Immunantwort" auf eine Zusammensetzung oder einen Impfstoff ist die Entwicklung einer zellulären und/oder Antikörper-vermittelten Immunantwort in dem Wirt auf die Zusammensetzung oder den Impfstoff von Interesse. Üblicherweise besteht eine solche Antwort darin, daß das Individuum Antikörper, B-Zellen, Helfer-T-Zellen, Suppressor- T-Zellen und/oder cytotoxische T-Zellen produziert, die spezifisch gegen ein oder mehrere in der Zusammensetzung oder dem Impfstoff von Interesse enthaltene Antigene gerichtet sind.
Die Begriffe "immunogenes Polypeptid" und "immunogene Aminosäuresequenz" beziehen sich auf ein Polypeptid bzw. eine Aminosäuresequenz, das bzw. die Antikörper hervorruft/hervorrufen, die die Virusinfektiosität neutralisieren und/oder eine Antikörper-Komplement- oder Antikörper-abhängige Zellcytotoxizität vermitteln, um für einen immunisierten Wirt einen Schutz bereitstellen. Der hier verwendet Begriff "immunogenes Polypeptid" schließt die vollständige (oder beinahe vollständige) Sequenz des gewünschten BHV-1- Glykoproteins oder ein immunogenes Fragment davon ein. Mit dem Begriff "immunogenes Fragment" ist ein Fragment eines Polypeptids gemeint, das ein oder mehrere Epitope einschließt und somit Antikörper hervorruft, die die Virusinfektiosität neutralisieren und/oder eine Antikörper-Komplement- oder Antikörper-abhängige Zellcytotoxizität vermitteln, um für einen immunisierten Wirt einen Schutz bereitzustellen. Solche Fragmente sind üblicherweise mindestens etwa 5 Aminosäuren und vorzugsweise mindestens etwa 10 bis 15 Aminosäuren lang. Es gibt in bezug auf die Länge des Fragments, das beinahe die vollständige Proteinsequenz oder auch ein Fusionsprotein, umfassend Fragmente aus zwei oder mehreren der Untereinheiten-Antigene von BHV-1, umfassen kann, keine kritische obere Grenze.
Der hier verwendete Begriff "Behandlung" bezieht sich entweder (i) auf die Vorbeugung vor einer Infektion oder Reinfektion (Prophylaxe) oder (ii) auf die Verminderung oder Beseitigung von Symptomen einer BHV-1-Infektion (Therapie).

B. Allgemeine Verfahren

Das Rinderherpesvirus Typ 1 oder BHV-1 ist ein bekanntes und gut charakterisiertes Virus, von dem viele Stämme bekannt sind. Vgl. z. B. Gibbs et al., Vet. Bull. (London) 47 (1977), 317-343. BHV-1, das auch als infektiöses Rinderrhinotracheitisvirus bekannt ist, ist in bezug auf seine Struktur mit anderen Herpesviren vergleichbar und besitzt ein lineares, doppelsträngiges DNA-Genom von etwa 140 Kilobasenpaaren. BHV-1 kann in infizierten Tieren in einem latenten Zustand verbleiben, wahrscheinlich in Trigeminus- oder Sacralganglien, und kann, wie vorstehend erörtert, relativ einfach reaktiviert werden.
Das erfindungsgemäße Antigen ist ein verkürztes gIV von BHV-1 und wird gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem weiteren Untereinheiten-Antigen verwendet, das eine antigene Determinante umfaßt, die ausgewählt ist aus BHV-1-Glykoproteinen, bestehend aus gI, gIII und einem zweiten gIV. Diese fakultativen Antigene werden im US-Patent 5,151,267, erteilt am 29. September 1992, offenbart.
Die verkürzte gIV-Sequenz muß nur ein "Polypeptid-neutralisierendes Epitop" codieren; d. h. ein Epitop, das Antikörper hervorruft, die die Virusinfektiosität neutralisieren und/oder eine Antikörper-Komplement- oder Antikörper-abhängige Zellcytotoxizität vermitteln, um für einen immunisierten Wirt einen Schutz bereitzustellen. Vgl. z. B. Babiuk et al., Infect. Immun. 12 (1975), 958-963; Babiuk et al., a. a. O. (1987).
Im allgemeinen sind die Polypeptid-Untereinheiten-Antigene üblicherweise mindestens etwa 5 Aminosäuren lang, um ein Epitop zu codieren, und vorzugsweise mindestens etwa 10-15 Aminosäuren lang. Es gibt eine kritische obere Grenze der Länge des Untereinheiten-Antigens, das die gesamte virale Glykoproteinsequenz oder auch ein Fusionsprotein, umfassend die Sequenzen von zwei oder mehreren der viralen Glykoproteine, umfassen kann.
Die verkürzten und fakultativen erfindungsgemäßen Antigene sind rekombinante Polypeptide. Diese rekombinanten Antigene können in Form von partiellen Glykoproteinsequenzen, vollständigen viralen Proteinsequenzen oder auch Fusionsproteinen (z. B. mit einer geeigneten Leader-Sequenz für den rekombinanten Wirt oder mit einer anderen Unter einheiten-Antigensequenz für BHV-1 oder ein anderes Pathogen) vorliegen. Das Antigen muß nicht glykosyliert sein, selbst wenn es von Glykoproteinen stammende Epitope trägt. Die Entwicklung verkürzter gIV-Gen-Konstrukte von BHV-1 diente dazu, die Sekretion von gIV zu steuern, um 1) die gIV-Ausbeuten zu erhöhen und 2) gIV in relativ reiner Form durch einfache Gewinnung aus den Wachstumsmedien herzustellen.
Besonders bevorzugte Epitope zur Durchmusterung der Antigene sind solche Epitope, die auf der Zellmembran von infizierten Wirtszellen exponiert werden, sowie jene Epitope, die die Bindungsstelle auf intakten Virionen umfassen. Solche Epitope können durch eine Analyse mit monoclonalen Antikörpern bestimmt werden. Vgl. z. B. von Drunen Littel-von den Hurk et al., Virology 144 (1985), 216-227 und Okazaki et al., a. a. O. (1987).
Es wird zuweilen bevorzugt, daß in den erfindungsgemäßen Impfstoffen mehr als ein Polypeptid-neutralisierendes Epitop in dem Antigen oder den Antigenen vorliegt. Es kann außerdem wünschenswert sein, Polypeptid-neutralisierende Epitope aus mehr als einem Glykoprotein in das Antigen oder die Antigene einzubeziehen. Dies kann am einfachsten erreicht werden durch die Verwendung eines Polypeptids, das ein verkürztes gIV von BHV-1 allein oder gegebenenfalls zusammen mit der partiellen oder vollständigen Sequenz eines Glykoproteins (das üblicherweise mehr als ein neutralisierendes Epitop umfaßt) codiert oder durch die Verwendung einer Kombination von Polypeptiden, die die Sequenzen von zwei oder drei der viralen Glykoproteine (z. B. gI, gIII und gIV) codieren.
Die erfindungsgemäßen Antigene können an einen Impfstoffträger konjugiert sein. Solche Träger sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, wie Rinderserumalbumin (BSA), menschliches Serumalbumin (HSA) und Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH). Ein besonders bevorzugtes Trägerprotein, das Rotavirus VP6, wird im US-Patent Nr. 5,071,651 offenbart. Die erfindungsgemäßen neutralisierenden Epitope von BHV-1 können auch als Fusionsprotein in teilchenbildende virale Polypeptide eingebaut werden, wie im US-Patent Nr. 4,722,840 und in der EPO-Veröffentlichung Nr. 174,759 beschrieben ist. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen BHV-1-Antigene in ein fremdes Virus (z. B. Vaccinia- oder Adenovirus) eingebaut werden, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist und nachstehend in den Beispielen ausführlicher beschrieben wird.
Das Antigen bzw. die Antigene werden als eine Impfstoffzusammensetzung formuliert, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und gegebenenfalls ein Adjuvans. Solche Formulierungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Im allgemeinen sind die For mulierungen insbesondere für die intramuskuläre Injektion angepaßt, da die intravenöse Injektion üblicherweise nicht zur Anwendung in großem Maßstab bei Haustieren geeignet ist. In einer anderen Ausführungsform werden die Impfstoffe oral oder intranasal verabreicht, und die Untereinheiten werden mit einem geeigneten oralen Träger formuliert. Es kann bevorzugt werden, die erfindungsgemäßen Impfstoffe oral zu verabreichen, um eine mucosale Immunität hervorzurufen, sowie intramuskulär für eine systemischen Immunität. Ein zur parenteralen Injektion geeigneter pharmazeutisch verträglicher Träger ist üblicherweise nicht toxisch und nicht therapeutisch wirksam. Beispiele solcher Träger sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und Hank-Lösung. Nichtwäßrige Träger, wie nichtflüchtige Öle, Sesamöl, Ethyloleat oder Triglyceride, können ebenfalls verwendet werden. Parenterale Träger können auch in Form von Suspensionen vorliegen, die Viskositätsverbesserer enthalten, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Der Träger enthält üblicherweise geringfügige Mengen von Zusätzen, wie Substanzen, die die Isotonie und chemische Stabilität verbessern. Beispiele von Puffern schließen Phosphatpuffer, Bicarbonatpuffer und Tris-Puffer ein, während Beispiele von Konservierungsmitteln Thimerosal, m- oder o-Cresol, Formalin und Benzylalkohol einschließen. Standardformulierungen sind entweder flüssige Injektionspräparate oder Feststoffe, die in einer geeigneten Flüssigkeit als Suspension oder Lösung zur Injektion aufgenommen werden können. So kann der Träger bei einer nichtflüssigen Formulierung Dextrose, menschliches Serumalbumin, Konservierungsmittel etc. umfassen, zu dem vor der Verabreichung steriles Wasser oder sterile Kochsalzlösung zugegeben werden kann.
Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Adjuvanzien bekannt, die auch in den erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen enthalten sein können, z. B. Freundsches Adjuvans, Avridin, Aluminiumsalze [Al(OH)&sub3;, AlPO&sub4;, Al&sub2;(SO&sub4;)&sub8;], Ca&sub3;(PO&sub4;)&sub2;, Saponin, DDA, Pluronic-Verbindungen, Öl-in-Wasser-Emulsionen (enthaltend z. B. Avridin, Dextransulfat, Emulsigen PLUS oder Vitamin E) und Wasser-in-Öl-Emulsionen (enthaltend z. B. Polysorbat 80). Die Wahl des geeigneten Adjuvans und seine Konzentration in der Impfstoffzusammensetzung ist auf dem Fachgebiet bekannt.
Viele Protokolle zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung an Tiere sind auf dem Fachgebiet bekannt. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist parenteral, insbesondere intramuskulär. Die Konzentration des Antigens oder der Antigene in der Impfstoffzusammensetzung ist so gewählt, daß eine wirksame Dosis in dem Rinder-Wirt vorhanden ist, um Antikörper gegen die Polypeptid-neutralisierenden Epitope hervorzurufen. Man nimmt an, daß die Dosierung innerhalb weiter Grenzen nicht entscheidend ist. Die Impfstoffzusammensetzung wird üblicherweise in einer Weise verabreicht, die zwischen etwa 1 bis etwa 1000 ug des Untereinheiten-Antigens in einem geeigneten Volumen des Trägers (z. B. etwa 1-10 ml) verabreicht werden. Vorzugsweise setzt die Dosierung bei einer einzigen Immunisierung etwa 1 bis etwa 500 ug des Untereinheiten-Antigens, stärker bevorzugt etwa 5-10 ug bis etwa 100-200 ug (z. B. 10-100 ug) frei. Es kann auch bevorzugt werden, obgleich wahlweise, eine zweite erneute Immunisierung an das Tier mehrere Wochen bis mehrere Monate nach der ersten Immunisierung zu verabreichen. Um einen langanhaltenden hohen Schutzgrad gegen eine Erkrankung zu gewährleisten, kann es hilfreich sein, periodisch wieder eine Nachimmunisierung an die Tiere zu verabreichen.
Das Antigen kann aus einem Protein hergestellt werden, das aus einem Virus oder virusinfizierten Zellen oder die rekombinanten Glykoproteine exprimierenden Zellen gewonnen wurde. Zum Beispiel können das gereinigte Virus oder virusinfizierte Zellen aufgebrochen oder lysiert und einer Immunadsorptionschromatographie unterzogen werden, um gI, gIII oder gIV zu reinigen. Vgl. z. B. von Drunen Littel-von den Hurk et al., Virology 144 (1985), 204-215. Die Herstellung monoclonaler Antikörper ist auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. z. B. von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1984); Okazaki et al., a. a. O. (1987). Kurz zusammengefaßt wird ein Säugetier, wie eine Maus, mit entweder dem gereinigten Virus oder dem gereinigten viralen Glykoprotein von Interesse (z. B. SDS-PAGE-gereinigt) immunisiert und Antikörper-produzierende B-Lymphocyten gewonnen. Üblicherweise werden diese B-Lymphocyten dann mit einer kontinuierlichen Zellinie fusioniert, um eine unsterbliche Antikörper-produzierende Zellinie herzustellen; d. h. ein Hybridom, Triom etc. Unsterbliche Antikörper-produzierende Zellinien können auch durch andere Verfahren als die Fusion erzeugt werden, wie durch die direkte Transformation von B-Lymphocyten mit onkogener DNA oder die Transfektion mit dem Epstein-Barr-Virus. Vgl. z. B. Schreier M. et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); vgl. auch die US-Patente Nrn. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 und 4,493,890. Native BHV-1-Proteine, die immungereinigt sind, können in ihrer Gesamtheit als Untereinheiten-Antigene verwendet werden oder es können Fragmente der ganzen Proteine, enthaltend die neutralisierenden Epitope, als Untereinheiten-Antigene verwendet werden.
Nicht-native BHV-1-Polypeptide können durch eine Anzahl von Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können neutralisierende Epitope enthaltende Oligopeptide durch bekannte Verfahren synthetisch hergestellt werden. Vgl. z. B. das US-Patent Nr. 4,73,896. Es wird jedoch bevorzugt, die nicht-nativen Polypeptid-Untereinheiten-Antigene durch DNA-Rekombinationsverfahren herzustellen.
Rekombinante Polypeptid-Untereinheiten-Antigene werden erfindungsgemäß hergestellt durch Konstruktion einer Expressionskassette und Transformation einer Wirtszelle damit, um eine Zellinie oder eine Kultur bereitzustellen, die fähig ist, das Untereinheiten- Antigen zu exprimieren, das in der Expressionskassette codiert wird. Der erste Schritt bei der Konstruktion der Expressionskassette ist die Herstellung einer codierenden Sequenz für das Glykoprotein oder die Glykoprotein-Epitope von Interesse. So können die codierenden Sequenzen entweder direkt durch Syntheseverfahren unter Zugrundelegung der offenbarten Sequenz (oder äquivalenten Sequenzen, die die gleichen Aminosäuren codieren) oder durch Verwendung der offenbarten Sequenz zur Konstruktion von Oligonucleotidsonden, um die codierende Sequenz unter Anwendung bekannter Verfahren zu clonieren, hergestellt werden. Vgl. z. B. Mayfield et al., a. a. O. (1983). Die codierende Sequenz kann ganz BHV-1- Glykoprotein-codierende Sequenzen umfassen, oder solche Glykoproteinsequenzen können mit anderen Sequenzen (z. B. Leader-Sequenzen) fusioniert sein, so daß ein Fusionsprotein codiert wird. Vgl. z. B. die US-Patente Nrn. 4,431,739, 4,425,437 und 4,338,397. Synthetische codierende Sequenzen erlauben auch die einfache Konstruktion von codierenden Sequenzen, die BHV-1-Glykoprotein-Analoge oder "Muteine" exprimieren. In einer anderen Ausführungsform können die codierenden Sequenzen für Muteine durch ortsspezifische Mutagenese nativer BHV-1-Nucleotidsequenzen hergestellt werden. Die Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Nachdem eine geeignete codierende Sequenz für das Antigen hergestellt oder isoliert wurde, kann sie in einen geeigneten Vektor oder ein geeignetes Replicon cloniert werden. Zahlreiche Clonierungsvektoren oder Replicons sind dem Fachmann bekannt, und die Wahl eines geeigneten Clonierungsvektors liegt im Ermessen des Fachmanns. Beispiele von rekombinanten DNA-Vektoren zur Clonierung und von Wirtszellen, die transformiert werden können, schließen verschiedene Bakteriophagen-Lambda-Vektoren (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC171 (E. coli), pKT230 (gram-negative Bakterien) pGV1106 (gram-negative Bakterien), pLAFR1 (gram-negative Bakterien), pME290 (gram-negative Nicht-E. coli- Bakterien), pHV 14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Actinophage dC31 (Streptomyces), YIpS (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces), 2-Mikron-Plasmid (Saccharomyces) und das Rinderpapillomavirus (Säugerzellen) ein. Vgl. allgemein DNA Cloning, Bd. I & II, a. a. O.; Maniatis et al., a. a. O.; Perbal, a. a. O.
Um die Konstruktion der Expressionskassetten abzuschließen, wird die codierende Sequenz, wie sie vorstehend für die Antigene beschrieben wurde, dann funktionell mit Kontrollsequenzen (z. B. einem Promotor, etc.) verknüpft, so daß die das Untereinheiten-Antigen codierende DNA-Sequenz in Boten-RNA in der durch die Expressionskassette transformierten Wirtszelle transkribiert wird. Die funktionelle Verknüpfung der das Untereinheiten- Antigen codierenden Sequenz mit geeigneten Kontrollsequenzen, um die Transkription und Translation zu bewirken, ist auf dem Fachgebiet bekannt. Im allgemeinen ist die codierende Sequenz stromabwärts von der Promotorsequenz und beliebigen expressionsregulatorischen Bereichen, wie Enhancern oder einer Operator-Sequenz, angeordnet. Falls die das Untereinheiten-Antigen codierende Sequenz mit einer heterologen codierenden Sequenz oder einem Startcodon verknüpft ist, dann ist es wichtig, die das Untereinheiten-Antigen codierende Sequenz im Leserahmen zu den letzteren einzubringen. Falls der beabsichtige Expressionswirt ein Prokaryont ist, dann ist es auch erforderlich, unter den stromaufwärts angeordneten Kontrollsequenzen eine Ribosomenbindungsstelle einzuschließen. Stromabwärts funktionell verbundene Kontrollsequenzen umfassen üblicherweise eine Transkriptionsterminationssequenz und ein Polyadenylierungssignal (für Säuger-Expressionswirte).
Wenn der gewünschte Expressionswirt ein Prokaryont oder eine Hefezelle ist, sind der Promotor und andere Kontrollsequenzen notwendigerweise zu der das Untereinheiten- Antigen codierenden Sequenz heterolog. Falls die gewählte Expressionswirtszelle eine Säugerzelle ist, können die Kontrollsequenzen homologe BHV-1-Sequenzen oder vorzugsweise heterologe Säuger-Kontrollsequenzen sein. Die Expressionskassette kann zum Beispiel als eine abgegrenzte Moleküleinheit, flankiert von geeigneten Restriktionsstellen, konstruiert werden, oder sie kann durch Insertion der codierenden Sequenz in einen zuvor konstruierten Expressionsvektor mit einer geeigneten Insertionsstelle konstruiert werden.
Eine Anzahl von prokaryontischen Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. z. B. die US-Patente Nrn. 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,342,832; vgl. auch die GB-Veröffentlichungen Nrn. GB-2,121,054; GB-2,008,123; GB-2,007,675 und die Europäische Veröffentlichung Nr. 103,395. Die bevorzugten prokaryontischen Expressionsvektoren sind jene für E. coli. Andere bevorzugte Expressionsvektoren sind solche zur Verwendung in eukaryontischen Systemen. Hefe-Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet ebenfalls bekannt. Vgl. z. B. die US-Patente Nrn. 4,446,235; 4,443,539; 4,430,428; vgl. auch die Europäischen Veröffentlichungen Nrn. 103,409; 100,561 und 96,491.
Einer der bevorzugten erfindungsgemäßen Expressionswirte sind Säugerzellen. Verschiedene Zellinien und Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele geeigneter Säuger-Expressionswirte schließen Nierenzellinien (z. B. CV-1-Affen-Nierenzellinien), Fibroblastenzellinien (z. B. Embryofibroblastenzellinien von Mensch, Maus oder Huhn), Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), HeLa-Zellen, NIH/3T3- und/oder LMTK-Zellen der Maus ein. Die Expression heterologer Proteine in Myelomzellinien unter Verwendung von Immunglobulin-Promotoren ist ebenfalls bekannt. Vgl. z. B. Banerjee et al., Cell 33 (1983), 729-740 und US-Patent Nr. 4,663,281. Die Auswahl einer Säugerzellinie ist nicht entscheidend und auf dem Fachgebiet bekannt. Verschiedene Säuger-Expressionsvektoren, die virale Promotoren (z. B. den frühen Bereich des SV40-Promotors, das Roussarkom-Virus, den LTR-Promotor, etc.) enthalten, sind auf dem Fachgebiet ebenfalls bekannt. Vgl. z. B. Pachl et al., a. a. O. (1987); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 6777-6781; Southern et al., J. Mol. App. Genet. 1 (1982), 327-341 und die PCT- Veröffentlichung Nr. WO87/02062.
Bevorzugte eukaryontische Expressionsvektoren sind solche, welche das Vacciniavirus, das SV40-Virus oder das Roussarkom-Virus verwenden, die auf dem Fachgebiet ebenfalls gut bekannt sind. Vgl. z. B. Mackett et al., J. Virol. 49 (1984), 857; DNA Cloning, Bd. II, 191-211, a. a. O.; die PCT-Veröffentlichung Nr. WO86/07593; Chakrabarty et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 3403.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Expression rekombinanter BHV-1-Polypeptide in Insektenzellen unter Verwendung von Virusvektoren, wie dem Baculovirus. Zum Beispiel wurden mit auf dem Kernpolyeder-Virus von Autographa californica (AcNPV) basierenden Vektoren in Spodoptera frugiperda-Zellen hohe Expressionsraten erzielt. Vgl. z. B. Smith et al., J. Virol. 46 (1983), 584-593; US-Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 07/092,120, a. a. O., und Kanadische Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 545,803, a. a. O.
Im allgemeinen wird ein Wirt (Zelle), der stabil mit einer Expressionskassette für das Untereinheiten-Antigen transformiert wurde, zur Herstellung des rekombinanten Polypeptids gewählt. Ein stabil transformierter Wirt ist einer, worin die Expressionskassette in das Wirtschromosom der Zelle integriert wurde. Im Fall von Bakterien-, Hefe- oder Säuger- Expressionswirten oder ähnlichen kann bevorzugt werden, Expressionswirte auszuwählen, die die Kassette auf einem nicht-integrierenden episomalen Element, wie einem Plasmid, beibehalten. Das Untereinheiten-Antigen wird hergestellt durch Züchten der mit der Expressionskassette transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression eines biologisch aktiven Untereinheiten-Antigen-Polypeptids bewirken. Die zum Herbeiführen der Expression geeigneten Bedingungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und hängen vorwiegend von dem gewählten Expressionssystem und dem gewählten Wirt ab. Das Untereinheiten-Antigen-Polypeptid kann aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt werden. Falls das Expressionssystem das Untereinheiten-Antigen sezerniert, kann das Polypeptid dann direkt aus den Wachstumsmedien gereinigt werden. Falls das Antigen jedoch nicht sezerniert wird, kann es erforderlich sein, die Wirtszellen aufzubrechen und das Untereinheiten-Antigen- Polypeptid aus dem Zellysat zu reinigen. Verschiedene Reinigungsverfahren, wie HPLC und Immunaffinitätschromatographie, sind bekannt, und die Wahl des geeigneten Reinigungs- und Gewinnungsverfahrens ist auf dem Fachgebiet bekannt.
Es ist bekannt, daß das BHV-1 immunsuppressiv sein kann. Dies könnte die Wirksamkeit von anderen bakteriellen oder viralen Impfstoffen beeinflussen, die gleichzeitig mit oder innerhalb weniger Tage mit dem BHV-1-Impfstoff verabreicht werden. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Impfung mit gIV von BHV-1 und/oder einem verkürzten gIV von BHV-1 keine immunsuppressive Wirkung auf andere bakterielle oder virale Impfstoffe hat. Demgemäß kann das Untereinheiten-gIV in Verbindung mit anderen Impfstoffen verwendet werden, ohne daß befürchtet werden muß, daß abgeschwächte Immunantworten auf sie hervorgerufen werden. Jeder bakterielle oder virale Rinderimpfstoff, der eine Infektion vermindert oder verhindert, kann der zweite Impfstoff sein. Solche Stoffe sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und beinhalten, sind aber nicht darauf begrenzt, Impfstoffe gegen Pasteurella haemolytica, Haemophilus somnus, Parainfluenzavirus, Coronavirus, Rotavirus, Adenovirus, respi ratorisches Syncytialvirus vom Rind, Diarrhoeavirus vom Rind ("bovine diarrhea virus") und ähnliche. Daher kann eine große Vielzahl von Koinfektionen gleichzeitig behandelt werden.
Demgemäß umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren zur gleichzeitigen Behandlung oder Vorbeugung vor einer BHV-1-Infektion und einer zweiten Infektion in einem Rind, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Mengen von (1) einer Impfstoffzusammensetzung von BHV-gIV und (2) einem Impfstoff gegen die zweite Infektion und von (I) und (2) umfassenden Zusammensetzungen an das Rind umfaßt.
Ein alternativer Verabreichungsweg umfaßt die Gentherapie oder Nucleinsäure- Immunisierung. So können Nucleotidsequenzen (und begleitende regulatorische Elemente), die die erfindungsgemäßen Proteine codieren, direkt an ein Individuum zu deren in vivo- Transkription und Translation verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Gentransfer durch Transfektion der Zellen oder Gewebe des Individuums ex vivo und erneutes Einschleusen des transformierten Materials in den Wirt erzielt werden. DNA kann direkt, d. h. durch Injektion, in den Wirtsorganismus eingeschleust werden (vgl. die Internationale Veröffentlichung Nr. WO90/11092 und Wolff et al., Science 247 (1990), 1465- 1468). Der Liposomen-vermittelte Gentransfer kann ebenfalls unter Anwendung bekannter Verfahren erreicht werden. Vgl. z. B. Hazinski et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4 (1991), 206-209; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298 (1989), 278-281; Canonico et al., Clin. Res. 39 (1991), 219A und Nabel et al., Science 249 (1990), 1285-1288. Nachweismittel, wie Antikörper, die gegen auf spezifische Zelltypen exprimierte Oberflächenantigene gerichtet sind, können kovalent an die Liposomenoberfläche gebunden werden, so daß die Nucleinsäure in spezifische Gewebe und Zellen transportiert werden kann, die für eine BHV-1- Infektion anfällig sind.

Diagnostische Tests auf BHV-1-Antikörper

Die rekombinanten Antigene von gI, gIII und/oder gIV von BHV-1 können als Substratreagenzien in Immuntests als Mittel verwendet werden, um Antikörper gegen gI, gIII und/oder gIV von BHV-1 in einer Probe, z. B. Blut, von einem Rind zu identifizieren, um festzustellen, ob das Rind mit BHV-1 infiziert ist, und um die Konzentration der Antikörper in der Probe zu bestimmen. Die Immuntests, in denen die rekombinanten Antigene von gI, gIII und/oder gIV von BHV-1 verwendet werden können, beinhalten, sind aber nicht darauf begrenzt, den Radioimmuntest, die Kompetitionsimmunpräzipitation, den Enzym-gebun denen Immunadsorptionstest, den Immunfluoreszenztest und ähnliche. Der Nachweis ist einfach, schnell, empfindlich und spezifisch. Die rekombinanten Antigene von gI, gIII und/oder gIV von BHV-1 werden in Testzusammensetzungen in einer Konzentration verwendet, die ausreichend ist, um einen nachweisbaren Komplex mit den Antikörpern zu bilden. Die BHV-1-Antigene können mit einer geeigneten Matrix (Trägersubstanz) oder einem geeigneten Träger, wie ein Latexteilchen oder eine Kunststoff-Mikrotiterplatte oder ähnliches, gemischt oder daran gebunden werden. Sie können auch mit einem Enzym, Farbstoff, radioaktiven Marker oder ähnlichem konjugiert werden, abhängig davon, welches immunologische Verfahren angewendet wird. Die Einzelheiten der Durchführung verschiedener Arten von Immuntests sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden auch beschrieben bei Tyssen P., "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" (Hrsg. Burton R.H. und von Knippenberg P.H.), die Offenlegungen davon sind hier unter Bezugnahme eingeschlossen. Demgemäß umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit von oder der Konzentration von Antikörpern gegen BHV-1 in einer Probe unter Verwendung eines Immuntests, wobei der Immuntest dadurch gekennzeichnet ist, daß rekombinante gI-, gIII- und/oder gIV- Antigene von BHV-1 verwendet werden, die mit BHV-1-Antikörpem als Reagens in dem Immuntest reaktiv sind, wobei ein Komplex der BHV-1-Antikörper und der rekombinanten gI-, gIII- und/oder gIV-Antigene von BHV-1 gebildet wird, und die Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit oder der Konzentration des gebildeten Komplexes, der auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von oder die Konzentration der Antikörper hindeutet.
Nachstehend werden Beispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben, die einzig zur Veranschaulichung angegeben werden. Die Beispiele sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise begrenzen, so sind zahlreiche Ausführungsformen innerhalb des Schutzumfangs der Patentansprüche im Hinblick auf die vorliegende Offenlegung für den Fachmann offensichtlich. Es wird angenommen, daß der Fachmann mit den in der Anmeldung angeführten Referenzen vertraut ist (oder ohne Schwierigkeiten Zugang dazu hat), und die Offenlegungen davon sind hier unter Bezugnahme eingeschlossen.

C. Experimenteller Teil

Beispiele

I

Dieses Beispiel veranschaulicht den Schutz von Rindern, die mit aus gereinigten BHV-1-Glykoproteinen hergestellten Untereinheiten-Impfstoffen immunisiert wurden.

I.A. Materialien und Verfahren

I.A.1. Virus und Bakterien

Die Stämme P8-2 und 108 von BHV-1 wurden in Georgia-Rindernierenzellen vermehrt, wie bereits beschrieben wurde. Babiuk et al., Infect. Immun. 12 (1975), 958-963. Zur Virusexposition von Tieren wurde der Stamm 108 verwendet, während zur Glykoproteinisolierung der P8-2-Stamm verwendet wurde.
Eine Kultur von Pasteurella haemolytica (Biotyp A, Serotyp 1) wurde hergestellt, wie bereits beschrieben wurde. Bielefeldt Ohmann et al., J. Infect. Dis. 151 (1985), 937-947. Die Bakterienexposition erfolgte in jedem Fall in der logarithmischen Wachstumsphase und mit einem Titer von 1-2 · 10&sup9; CFU/ml.

I.A.2. Monoclonale Antikörper und Immunadsorptionsreinigung

Monoclonale Antikörper gegen gI, gIII und gIV wurden hergestellt, wie bereits beschrieben wurde. von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1984). Die Clone 1E11- 1F6, 1D6-G11 und 1G6-2D9, die gI, gIII bzw. gIV erkennen, wurden zur Herstellung von Immunadsorptionssäulen ausgewählt.
Die Reinigung von IgG-Fraktionen monoclonaler Antikörper wurde unter Verwendung von Protein A-Sepharose CL-48 (Pharmacia Montreal, Quebec) durchgeführt. L'Italien in Method of Protein Microcharacterization, 279-314 (Shively J.E., Hrsg., 1986). Monoclonales IgG wurde mit 50 mM Triethylamin aus der Protein A-Sepharose-Säule eluiert und gründlich gegen 0,1 M HEPES, pH 7,5 (Kupplungspuffer: CB), dialysiert. Das gereinigte IgG wurde an aktiviertes Affigel-10 (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, Ontario) in einer Konzentration von 5 mg/Protein/ml Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers gebunden.
Die Glykoproteine gI, gIII und gIV wurden aus einem virusinfizierten Zellysat gereinigt, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littet-van den Hurk et al., Virology 144 (1985), 216-227). Vierundzwanzig Stunden nach der Infektion wurden die Kulturen bei einer MOI von 1 geerntet und bei 1000 UpM zentrifugiert, um die infizierten Zellpellets zu erhalten. Die Zellen wurden in 1% Nonidet-P40 (NP-40) und 1% Natriumdesoxycholat (DOC) in 0,10 M Tris-Hydrochlorid und 0,15 M NaCl (pH 7,5) resuspendiert und als Ausgangsmaterial für die Reinigung verwendet.
Immunadsorptionssäulen mit Spezifitäten für gI, gIII bzw. gIV wurden hergestellt. Nach dem Durchgang der Probe über die Säule in Probenauftragspuffer wurde die Säule mit 1 Vol. frischem Probenauftragspuffer vor dem Waschen mit 2 Vol. Waschpuffer [100 mM Tris, 500 mM NaCl, 1% NP-40 (pH 7,5)] ausgetauscht. Der Waschpuffer wurde vor der Elution des spezifisch gebundenen Antigens mit 50 mM Triethylamin aus der Säule mit 2 Vol. Wasser verdrängt. Die eluierten Fraktionen wurden durch Entnahme von 5-50 ul der gesammelten Fraktion und die Durchführung eines nichtquantitativen Bradford-Tests überprüft. Solche Fraktionen, die Protein enthielten, wurden dann zur weiteren Analyse direkt konzentriert. Die Säule wurde zur Wiederverwendung wieder mit Probenauftragspuffer äquilibriert oder in Probenauftragspuffer plus 0,02% Thimerosal gelagert. Die auf diese Weise hergestellten, verwendeten und gelagerten Säulen behielten praktisch ein Jahr eine signifikante Aktivität bei.

I.A.3. Immunisierung und Pathogenexposition

Die gereinigten Glykoproteine wurden mit Avridin (N,N-Dioctadecyl-N,N-bis)-(2- hydroxyethylpropandiamin) wie folgt formuliert: 150 mg Avridin wurden in 1 ml absolutem EtOH gelöst und dann mit 90 ul Tween 80 durch gründliches Mischen vereinigt. Anschließend wurden 4,7 ml Intralipid mit dem Avridin/EtOH vereinigt und durch Mischen mit Hilfe eines Vortexgeräts gründlich gemischt. 4 ml biologischer Puffer, z. B. Hank's gepufferte Salzlösung oder PBS, wurden zu der Lösung zur Vervollständigung der Adjuvanszubereitung gegeben. Der Impfstoff wurde durch Mischen von gleichen Volumina von Antigen und Adjuvanslösungen hergestellt, so daß jedes Tier eine Dosis von 100 ug Glykoprotein + 15 mg Avridin in einem 2 ml-Volumen erhielt.
Gruppen von je fünf Tieren wurden intramuskulär mit den vorstehenden Zubereitungen immunisiert. Einundzwanzig Tage später wurden die Tiere nachgeimpft und dann 3 Wochen nach der Nachimpfung dem Pathogen ausgesetzt. Nichtgeimpfte Kontroll-Kälber wurden mit Avridin (Adjuvans allein) immunisiert. Eine weitere Kontrollgruppe wurde mit einem im Handel erhältlichen Impfstoff mit einem abgetöteten Virus (Triangle 3, Fort Dodge Laboratories, Iowa) immunisiert, wie vom Hersteller empfohlen. Den Tieren wurden Blutproben in 10-tägigen Intervallen zur Beurteilung der Antikörperantworten entnommen.
Nach der Immunisierung wurden die Tiere in eine Isolierbox transportiert und klinisch untersucht, und die Rektaltemperaturen wurden protokolliert und Blutproben für verschiedene immunologische Tests zum Erstellen einer Basislinie der immunologischen Aktivität gesammelt. Die Kälber wurden dann einzeln einem Aerosol von BHV-1 und anschließend 4 Tage später P. haemolytica ausgesetzt. In jedem Fall wurde das Aerosol mit einem DeVilbiss-Zerstäuber, Modell 65 (DeVilbiss, Barry, Ontario, Kanada), erzeugt. Die Behandlung dauerte 4 Minuten im Falle des Virus und 5 Minuten bei P. haemolytica, wie bereits beschrieben wurde. Bielefeldt Ohmann et al., a. a. O. (1985).

I.A.4. SDS-PAGE, Western-Blot, ELISA und ADCC

Die Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wurde in 7,5%igen diskontinuierlichen Plattengelen unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1984); Laemmli, Nature (London) 227 (1970), 680-685).
Das Western-Blot-Verfahren wurde durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1984)). Nach der Elektrophorese wurden die Viruslysate elektrophoretisch auf Nitrocellulosefilter übertragen. Anschließend wurden die Anweisungen zur Verwendung des Bio-Rad (Mississauga, Ontario)-Immuntest-Kits befolgt.
Zum Nachweis der Antikörperantworten von mit gereinigten Glykoproteinen immunisierten Rindern wurde der ELISA im wesentlichen durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1984)). Jedoch wurde affinitätsgereinigtes, Peroxidase-konjugiertes Kaninchen-anti-Rind-IgG (Zymed) in einer Verdünnung von 1 : 3000 als Nachweisantikörper verwendet.
Die Neutralisierungstiter der Rinderseren wurde bestimmt, wie bereits beschrieben wurde (Babiuk et al., a. a. O. (1975)). Zur Bestimmung der Komplement-verstärkten Neutralisierung wurde Meerschweinchenserum (1 : 40 Endverdünnung) zu dem Virus-Antikörper-Gemisch zugegeben. Die Titer wurden als der reziproke Wert der höchsten Antikörperverdünnung angegeben, die verglichen mit der Viruskontrolle eine 50%ige Reduktion der Plaques bewirkte.
ADCC-Tests wurden in Mikrotiterplatten durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (Babiuk et al., a. a. O. (1975)). Das Verhältnis von Effektorzellen (polymorphkernigen Zellen) zu Zielzellen (BHV-1-infizierte, &sup5;¹Cr-markierte GBK-Zellen) betrug 50 : 1. Die Kontrollen bestanden aus BHV-1-infizierten GBK-Zielzellen plus anti-BHV-1-Serum oder Zielzellen mit polymorphkernigen Zellen in Abwesenheit des Antikörpers.

I.A.6. Klinische Beurteilung und Autopsie

Die klinischen Beurteilungen wurden jeden Tag zur gleichen Zeit von zwei unabhängigen Forschern durchgeführt, die nicht über die spezifischen Behandlungen der einzelnen Tiere informiert waren. Die beurteilten Parameter beinhalten Depression, Appetit, Fieber, Konjunktivitis, Rhinitis, Mundatmung, Tracheitis und Lungenentzündung. In jedem Fall wurde gesunden Tieren eine Bewertung von 0 zugewiesen. Klinische Bewertungen von 1-4 wurden kranken Tieren für jeden einzelnen Parameter wie folgt zugewiesen: 4: schwer; 3: deutlich; 2: gering; 1: leicht. Die klinischen Gesamtbewertungen für jedes Tier entsprechen den Summen der Bewertungen für jeden Parameter.
Obduktionsuntersuchungen wurden an Tieren durchgeführt, die starben oder während der Experimente eingeschläfert wurden. Die Nasenluftwege, der Kehlkopf, die Luftröhre und die Lungen wurden untersucht und fotografiert. Virale und bakterielle Läsionen wurden protokolliert. Das Ausmaß einer Lungenentzündung wurde durch ein von Thomson et al., Canad. J. Comp. Med. 39 (1975), 194-207 entwickeltes numerisches Verfahren bewertet. Die pneumonischen Läsionen in jedem Lungenlappen (bis auf den akzessorischen Lappen) wurden entsprechend der Menge des beteiligten Gewebes von 0 bis 5 eingeteilt. Die Gesamtbewertungen für sieben Lungenlappen lagen im Bereich von 0 bis zu einem theoretischen Höchstwert von 35, falls die ganze Lunge betroffen war.

I.A.7. Leukocytenfunktion

Um die Leukocytenfunktion nach einer BHV-1-Exposition zu untersuchen, wurde venöses Blut mit Citratdextrose enthaltenden Spritzen gesammelt. Das Blut wurde bei 1000 g für 20 Minuten zentrifugiert, die Leukocytenmanschette gesammelt, und die peripheren einkernigen Leukocyten im Blut (PBLs) wurden in Ficoll-Hypaque weitere gereinigt, wie bereits beschrieben wurde. Bielefeldt Ohmann et al., a. a. O. (1985). Die polymorphkernigen Neutrophile (PMNs) wurden aus dem Ausgangspellet durch Lyse der Erythrocyten isoliert, wie bereits beschrieben wurde. Die Lebensfähigkeit sowohl der PBLs als auch der PMNs war bei der Bestimmung durch Trypanblau-Exklusion größer als 99%.

(i) Funktionsanalyse der PBLs

Die Lectin-gesteuerte Lymphocytenproliferation wurde analysiert, wie bereits beschrieben wurde. Id. Kurz zusammengefaßt wurden 1 · 10&sup5; PBLs in vierfacher Ausfertigung zu Vertiefungen einer Flachboden-Mikrotiterplatte (Nung, Roskilde, Dänemark) in einem Endvolumen von 200 ul RMPI-1640 plus 5% fötales Rinderserum, 50 mM HEPES und 25 mg Gentamycin (alle Mediumkomponenten stammen von Grand Island Biological Co., Grand Island, NY) zugegeben. Lectine, Phytohämagglutinin (PHA) und Concanavalin A (Con A, Calbiochem, La Jolla, CA), wurden zu den Kulturen zugegeben. Die Kulturen wurden für 72 Stunden inkubiert und mit [Methyl-³H]-Thymidin (H³-Tdr) (Amersham Co., Oakville, Ontario) während den letzten 16-18 Stunden der Inkubation markiert. Die von den PBLs eingebaute Radioaktivitätmenge wurde durch Flüssigszintillationszählung quantitativ bestimmt.

(ii) Funktionsanalyse der PMNs

Die Chemotaxis der PMNs wurde unter Verwendung von Mikrochemotaxiskammern gemessen. Gee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 7215-7218. Kurz zusammengefaßt wurden 25 ul des chemischen Anlockungsmittels zu den unteren Vertiefungen der Chemotaxiskammer gegeben, während die oberen Kammervertiefungen 45 ul PMNs enthielten. Die Chemotaxiskammern wurden für 2 Stunden in einer befeuchteten CO&sub2;- Atmosphäre bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Membranen entfernt, und nichtwandernde Zellen wurden von der Oberfläche abgeschabt. Die Membranen wurden fixiert, mit Giemsa gefärbt und mikroskopisch auf das Vorhandensein von wandernden Zellen untersucht. Die Zellzahlen sind als Mittelwert der Zählungen von drei repräsentativen, stark vergrößerten Mikroskopfeldern angegeben.
Die Luminol-verstärkte Chemilumineszenz wurde durch das Verfahren von Abramson et al. (1982) gemessen. Kurz zusammengefaßt wurden 2 · 10&sup7; Zellen zu 5 ml Hank's balancierte Salzlösung, 400 ul opsonisiertes Zymosan und 20 ul Luminol enthaltenden Fläschchen zugegeben. Unmittelbar nach der Zugabe der Zellen wurde die Reaktion über einen bestimmten Zeitraum unter Verwendung eines Packard Picolite 6500-Luminometers (United Technologies Packard, Downers Grove, IL) verfolgt. Die Ergebnisse werden als CPM/10&sup7; Zellen beim Maximum der Antwort graphisch dargestellt, das bei 45 Minuten auftritt.
Die Superoxidanionenbildung und -freisetzung wurde durch die mit Superoxid- Dismutase (SOD) inhibierbare Reduktion von Ferracytochrom c bestimmt, wie bereits beschrieben wurde. Johnson et al., J. Exp. Med. 148 (1978), 115-127. Alle Proben wurde doppelt und in Suspension in einem Endvolumen von 1 ml analysiert. Die Proben wurden für 45 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Überführen von 1 ml-Aliquots in ein Eisbad und anschließendes Zentrifugieren beendet. Die Cytochrom c-Reduktion wurde mit einem Spektrophotometer bei 550 nm überwacht. Der OD-Wert wurde dann in nm O&sub2;/Zelle umgerechnet.

II

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von nicht-nativen Untereinheiten- Antigenen von BHV-1 in rekombinanten Vacciniavirusvektoren.

II.A. Rekombinante Herstellung von gIV in einem Vacciniavektor

II.A.1. Konstruktion des pVVSL-1-Insertionsvektors

Der pVVSL-1-Insertionsvektor wurde konstruiert, wie in den Fig. 2 und 3 dargestellt. Vacciniavirusvektoren sind bekannt, wie VAC-I und VAC-III, die als ATCC VR-2223 bzw. VR-2224 am 22. Juli 1988 hinterlegt wurden. Genauer wurde der pVV-1- Expressionsvektor von dem pGS-20-Plasmid abgeleitet (von Drunen Littel-von den Hurk et al., J. Virol. 63 (1989), 2159-2168). pGS-20 wurde mit XhoI und AvaI gespalten, mit dem DNA-polI-Klenow-Fragment behandelt, um die Enden in glatte Enden zu überführen, und dann ligiert. Dieses Verfahren hatte die Deletion eines 2200 bp großen Fragments und die Herstellung von pVV-1 (Fig. 2) zur Folge.
pVVSL-1 wurde dann aus Elementen von pVV-1 und einer Gruppe von vier synthetischen Oligonucleotiden konstruiert, die einen adeninreichen Bereich, einen Spacer und eine Consensus-Sequenz aus dem späten Vacciniavirus-Gen-Promotor kennzeichnen. (Dieser Sequenz lag eine von Davison und Moss, J. Mol. Biol. 210 (1989), 771-784 beschriebene Sequenz zugrunde). Ein 3080 bp großes EcoRI-PstI-Fragment und ein 1700 bp großes XmaI-PstI-Fragment wurden aus Restriktionsenzymspaltprodukten von pVV-1 isoliert. Die Fragmente wurden dann zusammen mit den vier Oligonucleotiden ligiert, wobei pVVSL-1 hergestellt wurde. pVVSL-1 weist zwei einzigartige Clonierungsstellen auf: BglII und SmaI (Fig. 3).

II.A.2. Insertion des vollständigen gIV-Gens von BHV-1 in pVVSL-1

Die Verfahren zur Geninsertion und Gewinnung des rekombinanten Vacciniavirus waren dieselben, wie für pGS-20 beschrieben wurden (vgl. von Drunen Littel-von den Hurk et al., J. Virol. 63 (1989), 2159-2168).
Die in Fig. 1 gezeigte gIV-Sequenz von BHV-1 wurde mit der MaeI-Restriktionsendonuclease gespalten. Die so erhaltenen MaeI-Stellen in den Sequenzpositionen 42 und 1344 wurden unter Verwendung von im Handel bezogenen Oligonucleotid-Linkern (Pharmacia) in BglII-Stellen umgewandelt. Das so erhaltene BglII-angepaßte gIV-Gen von BHV-1 wurde dann in die BglII-Clonierungsstelle von pVVSL-1 cloniert, um den Expressionsvektor pVV-1/gIV (Fig. 4) zu erhalten.

II.A.3. Insertion eines verkürzten gIV-Gens von BHV-1 in pVVSL-1

Das Gen für gIV von BHV-1 wurde modifziert, so daß ein Stopcodon im Leserahmen unmittelbar vor dem mutmaßlichen Transmembranbereich des reifen Proteins eingebaut wurde (Fig. 1). Diese Modifizierung des Gens hat die frühe Termination der Translation und die Sekretion des verkürzten Proteins zur Folge. Dieses System hebt die Erfordernis für eine ausgedehnte Prozessierung stromabwärts auf, die mit der Produktion von Antigenen verbunden ist, die mit Membranen assoziiert sind, und es bewirkt eine bis zu 10fache Steigerung der Produktausbeute.
Das BglII-angepaßte Gen für gIV von BHV-1 wurde mit SacII teilweise gespalten. Die SacII-Stelle in Position 1154 (Fig. 1) wurde dann unter Verwendung von im Handel bezogenen Oligonucleotid-Linkern (Pharmacia) in eine XhoI-Stelle umgewandelt. Ein zweiter synthetischer Oligonucleotid-Linker wurde dann in die XhoI-Stelle insertiert, wobei innerhalb des Leserahmens ein Stopcodon erhalten wurde. Das so erhaltene modifizierte gIV- Gen von BHV-1 wurde dann in die BglII-Clonierungsstelle von pVVSL-1 cloniert, wobei der Expressionsvektor pVV-1/gIVt (Fig. 5) erhalten wurde.

II.A.4. Reinigung des rekombinant exprimierten gIV

BSC-1-Zellen wurden in 10% fötales Rinderserum enthaltendem MEM gezüchtet. Konfluente einzellige Schichten wurden mit dem rekombinanten Vacciniavirus, das entweder das vollständige oder das verkürzte gIV von BHV-1 exprimiert und sezerniert, mit einer Multiplizität von 0,1 infiziert. 72 Stunden nach der Infektion oder beim Auftreten einer cytopathischen Gesamtwirkung wurde das rekombinante gIV geerntet.
Zur Ernte des vollständigen gIV wurden die Zellen von der Oberfläche der Kulturflaschen in die Wachstumsmedien abgeschabt, die dann zentrifugiert (1000 g für 20 Minuten) wurden, und das Zellpellet wurde gewonnen. Die Zellen wurden mit einem Detergens aufgebrochen und weiter verarbeitet, wie bereits beschrieben wurde.
Das verkürzte gIV wurde durch Ernten der Medien aus den Kulturflaschen gewonnen. Zelltrümmer wurden durch eine 20-minütige Zentrifugation bei 1000 g entfernt. Die geklärten Medien wurden bis zur Verarbeitung bei -70ºC eingefroren. Nach dem Auftauen wurden die Medien durch einen 0,45 Mikron-Filter gefiltert. Die Detergenzien Nonidet P40 und Na-Desoxycholat wurden dann zu dem Filtrat bis zu Endkonzentrationen von 0,1% gegeben. Das verkürzte gIV wurde dann durch Affinitätschromatographie über für gIV von BHV-1 spezifische Säulen gereinigt, wie bereits beschrieben wurde.

III

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von nicht-nativen Untereinheiten- Antigenen von BHV-1 unter Verwendung eines Baculovirussystems.

III.A. Materialien und Verfahren

III.A.1. Zellen, Viren und Antikörper

S. frugiperda (SF9)-Zellen wurden in TNM-FH-Medium (GIBCO), enthaltend 10% fötales Rinderserum, gemäß der Beschreibung von Summers und Smith (Summers M.D. und Smith G.E., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987), Texas Agricultural Experiment Station, College Station, Tex.) gezüchtet und aufrechterhalten. Virusstämme des Wildtyps AcNPV und rekombinanter Baculoviren wurden in SF9-Zellen hergestellt, wie von Summers und Smith (a. a. O.) beschrieben wurde. Für gIV spezifische monoclonale Antikörper wurden von von Drunen Littel-von den Hurk et al., Virology 160 (1987), 465-472 und Hughes et al., Arch. Virol. 103 (1988), 47-60 entwickelt und charakterisiert. Das zur Identifizierung des rekombinanten gIV verwendete gIV spezifische, monoclonale Antikörpergemisch bestand aus äquivalenten Mengen von 136 (Epitop Ia), 9D6 (Epitop Ib), 3E7 (Epitop II), 10C2 (Epitop IIIa), 4C1 (Epitop IIIb), 2C8 (Epitop IIIc), 3C1 (Epitop IIId) und 3D9S (Epitop IV).

III.A.2. Insertion von BHV-1-Glykoproteinen in den AcMNPV-Transfervektor

Das gIV-Glykoprotein-Gen wurde aus einem Subclon von pSD9 als ein 1,3 kb großes MaeI-Fragment isoliert (Tikoo S.K. et al., J. Virol. 64 (1990), 5132-5142), dessen glatten Enden wiederhergestellt wurden und in das Plasmid pRSV cat (Fitzpatrick D.R. et al., J. Virol. 62 (1988), 4239-4248) insertiert. Das 1,3 kb große BglII-Fragment wurde dann in die BamHI-Stelle des Baculovirus-Transfervektors pVL941 (Luckow V.A. und Summers M.D., Virology I70 (1989), 31-39) subcloniert. Die Plasmid-DNA wurde mittels alkalischer Lyse und Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation durch Standardverfahren präpariert. Nach der Transformation von E. coli JM105 wurden auf LB-Agar, enthaltend 100 ug Ampicillin pro ml, erscheinende Kolonien auf Ampicillin (50 ug/ml) enthaltendes L-Nährmedium überimpft und bei 37ºC über Nacht unter kräftigem Schütteln inkubiert. Präparationen des Plasmids aus jeder Kolonie wurden im kleinen Maßstab hergestellt, und die Anwesenheit des gIV-Gens wurde durch Spalten mit den Endonucleasen AvaI und EcoRV bestätigt. Ein einziger das gIV-Gen in der gewünschten Orientierung enthaltender Clon wurde identifiziert und als pVLgIV bezeichnet. Der Clon pVLgIV wurde in 500 ml L-Nährmedium, enthaltend Ampicillin, überimpft; nach 24 Stunden bei 37ºC wurde das Plasmid durch alkalische Lyse präpariert und durch Gleichgewichtszentrifugation mit CsCI weiter gereinigt.
Ein modifiziertes gIV-Gen von BHV-1, wie in Beispiel II.A.3 beschrieben, das eine verkürzte Form von gIV bereitstellt, wurde mit BglII gespalten, das Fragment wurde isoliert und in die BamHI-Stelle des Baculovirus-Transfervektors pVL941 subcloniert. Dieses Konstrukt wurde als pVLgIVt bezeichnet.
Das vollständig in Plasmid pgB enthaltene gI-Glykoprotein-Gen, das in Beispiel II.B.1 des US-Patents 5,151,267 beschrieben ist, wurde mit BglII und BamHI gespalten und in die BamHI-Stelle des Baculovirus-Transfervektors pVL941 insertiert.
Das in Plasmid p113R1 Bgl 3.0 enthaltene gIII-Glykoprotein-Gen, wie es in Beispiel II.B.1. des US-Patents 5,151,267 beschrieben ist, wurde in die BamHI-Stelle des Baculovirus-Transfervektors pVL941 als ein EcoRI + BamHI-Subfragment übertragen. Dieses Konstrukt wurde als pVLgIII bezeichnet.

III.A.3. Transfektion und Selektion rekombinanter Viren

Nach zwei Ethanolpräzipitationszyklen wurde das gereinigte Plasmid mit einer gleichen Menge von viraler A. californica-DNA gemischt und zur Transfektion von subkonfluenten einzelligen Schichten von SF9-Zellen verwendet, wie von Summers und Smith (a. a. O.) beschrieben wurde. Nach 5-tägiger Inkubation bei 28ºC wurde der Überstand seriell verdünnt und auf konfluente einzellige Schichten von SF9-Zellen überimpft. Nach 1 Stunde wurde ein aus TNM-FH-Medium, enthaltend 6% fötales Rinderserum und 1,5% bei niedriger Temperatur gelierende Agarose, bestehende Deckschicht zugegeben, und die Platten wurden bei 28ºC 5 Tage inkubiert. Rekombinante Baculoviren wurden mittels Plaque-Hybridisierung identifiziert, im wesentlichen wie von Summers und Smith (a. a. O.) beschrieben wurde. Die Polyhedrin-negativen Rekombinanten wurden drei- bis viermal auf SF9-Zellen plaquegereinigt, um kontaminierende Wildtyp-Baculoviren zu entfernen.

III.A.4. Herstellung von Zelllysaten

Um die Expression des rekombinanten gIV zu analysieren, wurden konfluente einzellige Schichten von SF9-Zellen in 35 mm-Petrischalen mit einzelnen Polyhedrin-negativen Rekombinanten mit einer Infektionsmultiplizität von 5 infiziert und 48 Stunden bei 28ºC inkubiert. Die Zellen wurden in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) abgeschabt, bei 150 · g 1 Minute pelletiert und in 50 ul RIPA-Puffer (0,02 M Tris-Hydrochlorid [pH 8,0], 0,15 M NaCl, 1% Natriumdesoxycholat, 1% Nonidet P-40, 10 mM EDTA, 10 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert. Der postnucleäre Überstand wurde gewonnen, mit einem reduzierenden Elektrophoreseprobenpuffer vereinigt und 2 Minuten gekocht.

IV

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von nicht-nativen Untereinheiten- Antigenen von BHV-1 in E. coli-Vektoren.

IV.A. Clonierung und Expression des gI-Gens von BHV-1 in E. coli

Eine BHV-1-Genombank des BHV-1-Stamms Cooper, so wie sie in Form von 12 HindIII-Fragmenten cloniert in pBR322 vorliegt, wurde gemäß den Verfahren von Southern unter Verwendung von Sonden durchmustert, die gB von HSV-1 und dem gB-Gen-Gegenstück des Pseudorabiesvirus (PRV) entsprechen. Ein einziger Clon, pSD 106, wurde gefunden, der die Sonden bindet.
Um die eigentliche codierende Sequenz des gI-Gens von BHV-1 zu spezifizieren, wurde eine ausführliche Restriktionskarte für pSD 106 konstruiert. Die Anwendung der Verfahren von Southern unter Verwendung von verschiedenen Sonden, die für die gB-Amino- und -Carboxytermini von HSV-1 spezifisch sind, lokalisierte das gI-Gen von BHV-1 innerhalb eines KpnI-SalI-Subfragments von pSD 106 (pSD106-KpnI-SalI; Fig. 6).
Es wird nicht erwartet, daß in E. coli produzierte fremde Virusproteine durch Faltung eine Konfiguration einnehmen, die das Protein in dem nativen Virusteilchen nachahmt. Daher besteht das aktivste Immunogen, das von in Bakterien exprimierten Genen erhalten wird, wahrscheinlich aus einem zusammenhängenden Bereich von Aminosäuren, im Gegensatz zu einem, der die Positionierung von zwei oder mehreren aufeinanderfolgenden Sequenzen von Aminosäuren (d. h. die Tertiärstruktur) erfordert. Eine weitere Einschränkung ist, daß E. coli kein Prä-gI zu gIb + gIc prozessiert. So wurde die Hypothese aufgestellt, daß die optimale Formulierung des in Bakterien exprimierten gI aus gIb und gIc besteht, die einzeln exprimiert und dann entweder getrennt oder in Verbindung miteinander verwendet werden.
Zur Konstruktion eines Clons, der den Aminoterminus des reifen gIb + gIc exprimiert, wurde das pSD 106-KpnI-SalI-Fragment mit ApaI gespalten, und die Längen der ApaI- Fragmente wurden durch die Behandlung mit Ba131-Exonuclease randomerisiert. Alle durch die ungenaue Ba131-Aktivität erzeugten asymmetrischen Fragmentenden wurde durch Klenow-Auffüllreaktionen in ein glattes Ende überführt. Das ApaI-gespaltene Plasmid wurde dann mit XmaI gespalten, und die Population der Fragmente, die Sequenzen tragen, die den Aminoterminus von gIb codieren, wurde aus LMP-Agarosegelen als ein 600-520 bp großer verwischter Fleck isoliert. Diese Fragment-Subpopulation wurde dann in die HpaI-XmaI- Stellen von Polink 26 ligiert. Polink 26 war eine modifizierte Form von pBR328 und enthielt ein synthetisches Oligonucleotid, insertiert in die EcoRI- und SalI-Stellen. Das Oligonucleotid enthielt Restriktionsenzymstellen in der folgenden Reihenfolge: EcoRI, XbaI, BglII, BaII, HpaI, ClaI, HindIII, KpnI, BamHI, SmaI, SphI, SacI, XhoI und SalI.
Eine Insertion aus der Clonbank des Aminoterminus von gI wurde durch Spalten von pBHB5' mit BglII und SmaI isoliert und in die BglII- plus SmaI-Stellen des E. coli- Expressionsvektors pHK414 übertragen. Der so erhaltene Clon wurde als pRed30 bezeichnet. Um die Konstruktion der gIb codierenden Sequenz abzuschließen, wurde SmaG als ein 775 bp großes XmaI-Fragment aus pSD106-KpnI-SalI isoliert und in die XmaI-Stelle von pRed30 ligiert, wobei pgp11: βgal hergestellt wurde. Dieses Plasmid wurde in den E. coli-Stamm NF1829 transformiert, der ein gp11: β-Galactosidase-Fusionsprotein von etwa 175 k produzierte (gp11 ist eine andere Bezeichnung für das glb-Peptid). Ein nichtfusioniertes gIb- Peptid wurde durch den Clon "gp11 vollständig" hergestellt. "pgp11 vollständig" (Fig. 7) wurde durch Übertragen des 1340 bp großen BglII-BamHI-Fragments aus pgp11: βgal in das E. coli-Expressionsplasmid pGH346 konstruiert. Das 1340 bp große Fragment trägt die vollständige gIb codierende Sequenz plus DNA, die die ersten acht Aminosäuren von gIb codiert. In NF1829 erzeugt "pgp11 vollständig" ein 60 k-Protein, das spezifisch mit polyclonalen Seren von gIb-BHV-1 und gIb-spezifischen monoclonalen Antikörpern reagiert.

IV. B. Clonierung und Expression des gIII-Gens von BHV-1 in E. coli

Die BHV-1-Genombank wurde durch die Verfahren von Southern unter Verwendung von für die codierende Sequenz von gC von HSV-1 und das gC-Homolog von PRV (PRV-gIII) spezifische Sonden durchmustert. Einer der HindIII-Clone, der als pSD113 (Fig. 6) bezeichnet wurde, hybridisierte mit beiden Sonden. Eine Restriktionsendonucleasekarte des pSD113-Plasmids wurde hergestellt, um den Bereich innerhalb des HindIII-Fragments zu lokalisieren, der spezifisch das gIII-Gen von BHV-1 codiert. Durch die Verwendung einer für das gC-Gen-Homolog von PRV spezifischen Sonde wurde das gIII-Gen von BHV-1 innerhalb eines etwa 2500 bp großen EcoRI-BglII-Subfragments von pSD113 lokalisiert.
Ein zwei Drittel des Carboxyterminus des gIII-Gens von BHV-1 exprimierender E. coli-Clon wurde in der folgenden Weise hergestellt. Das pSD113-EcoRI-BglII-Subfragment von pSD113 wurde mit XmaI gespalten und in die XmaI-Stelle des Plasmids pJS413 insertiert, wobei pBHC3' hergestellt wurde. Das pSD113-EcoRI-BglII-Subfragment von pSD 113 wurde mit PvuI gespalten, und die asymmetrischen PvuI-Enden wurden mit dem Klenow-Enzym behandelt, um sie in glatte Enden zu überführen. Das PvuI-gespaltene Plasmid wurde dann mit ScaI gespalten, und das den Carboxyterminus des gIII-Gens enthaltende 1600 bp große PvuI-SacI-Fragment wurde aus LMP-Agarosegelen gereinigt. Dieses Fragment wurde mit SmaI- plus SacI-Stellen von Plasmid ptac413 ligiert, wobei p113Pvu/413 hergestellt wurde. Die fremden Sequenzen 3' zum Stopcodon wurde durch Austausch des 900 bp großen AvaI-SacI-Fragments von p113Pvu/413 durch das 2220 bp große AvaI-SacI-Fragment aus BHC3' ersetzt. Das neue Plasmid "p113-Pvu-Ende" trug 900 bp des Carboxyterminus des gIII-Gens von BHV-1 im Leserahmen zu dem wiederhergestellten β-Galactosidase-Gen. Der E. coli-Stamm NF1829 wurde mit diesem Plasmid transformiert.
Nach der Induktion mit Lactose produzierten diese Zellen etwa 5% des Gesamtproteins in Form eines gIII-verwandten Proteins. Das Fusionsprodukt wurde in Form von Aggregaten gewonnen und in 10 mMol Harnstoff, pH 9,0, solubilisiert. Das solubilisierte Protein wurde gegen 10 mMol Triethylamin, pH 9,0, dialysiert, um den Harnstoff zu entfernen, und dann mittels Amicon-Filtration bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml BHV-1-Protein konzentriert. Das konzentrierte gIII-Fusionsprotein wurde mit komplettem Freundschen Adjuvans formuliert und intramuskulär in Kaninchen in 1 mg-Dosen injiziert. Die in diesen Kaninchen hervorgerufenen Antiseren wurden zur Immunpräzipitation eines BHV-I-infizierten Zellextrakts verwendet, und es wurde festgestellt, daß sie spezifisch mit dem gIII-Glykoprotein reagieren.
Bei einem Versuch, das vollständige gIII-Gen von BHV-1 in E. coli zu exprimieren, wurde der Expressorclon "113Pvu-Ende" erweitert, so daß er alle gIII codierenden Sequenzen bis zur NcoI-Stelle ("gIII vollständig") umfaßt. Dieser vollständige Clon produzierte keine signifikanten Mengen des gIII-Proteins. Das einfache Entfernen der Signalsequenz und/oder die Addition bevorzugter E. coli-Codons stromaufwärts der gIII-Sequenzen verbesserte die Expression nicht. Um den größtmöglichen E. coli-gIII-Expressorclon herzustellen und das offensichtliche Problem bei der Expression der aminoterminalen Gensequenzen zu umgehen, wurde eine Bank von gIII-Clonen mit randomerisierten Aminotermini erzeugt. Das E. coli-Plasmid "gIII vollständig", das keine signifikanten Mengen des gIII- Proteins exprimiert, wurde mit NcoI gespalten und dann mit Ba131 für unterschiedliche Zeitdauern behandelt. NcoI spaltet am ATG-Codon des gIII-Gens, und die Ba131-Behandlung entfernte Nucleotide beginnend von den NcoI-gespaltenen Enden in unterschiedlichen Ausmaßen. Die Population der Fragmente mit zufälligen Größen wurde mit dem Klenow-Enzym behandelt, um asymmetrische Enden in glatte Enden zu überführen, und dann mit BamHI gespalten. Die Population der NcoI-Ba131-BamHI-Fragmente mit einer Größe im Bereich von 1530 bp bis 1250 bp wurde aus LMP-Agarose isoliert und in die SmaI-BamHI-Stellen von pJS413 ligiert. E. coli NF1829 wurde mit diesem Ligierungsgemisch transformiert und auf McKonkey-Agar ausplattiert. Mutmaßliche Expressorclone wurden als rote Kolonien entnommen. Die positiven Kolonien wurden dann mittels Lactose-Induktion und Proteinanalyse durch eine SDS-PAGE auf eine Proteinproduktion getestet. Es wurden drei Clone gefunden, die gIII als ein β-Galactosidase-Fusionsprotein exprimieren. Es wurde festgestellt, daß sich die Clone hinsichtlich der durch die Ba131-Behandlung entfernte aminoterminale Sequenz unterscheiden: Verlust von 150, 250 bzw. 350 bp. Die gIII-Gen-Insertionen wurden durch eine BglII-BamHI-II-Spaltung der Ba131-Expressorplasmide ausgeschnitten und dann aus LMP- Agarosegelen gereinigt. Jedes gIII tragende Fragment wurde dann in die BglII-BamHI- Stellen des E. coli-Expressorplasmids GH435 ligiert. pGH435 trägt in jedem der drei möglichen Leseraster Stopcodons unmittelbar 3' zu der BamHI-Insertionsstelle. Folglich würde die Expression einer beliebigen Insertion in den BglII- und BamHI-Stellen ein nichtfusioniertes Peptid erzeugen. Der als pBHC150Δ (Fig. 8) bezeichnete größte Ba131- Clon, der eine Deletion von etwa 150 bp am Aminoterminus von gIII aufwies, produzierte nach der Lactose-Induktion ein Peptid von etwa 53 k. Dieses Plasmid wird von dem E. coli- Stamm W3110F'Iq getragen.

IV.C. Expression des vollständigen reifen gIV von BHV-1 in E. coli

Für den Clon pSD98 (Fig. 6) der BHV-1-Genombank wurde festgestellt, daß er zusätzlich zu mehreren anderen mutmaßlichen BHV-1-Genen das gIV-Gen trägt. Eine Restriktionsenzymkartierung von pSD98 kartierte die das gIV-Protein codierenden Sequenzen in einem XmaI-XhoI-Fragment dieses Plasmids. pSD98 wurde mit XmaI und XhoI gespalten, das Fragment wurde isoliert und in das Plasmid Polink 26 insertiert, wobei p98XmaI-XhoI hergestellt wurde.
Die Konstruktion des den E. coli-Expressionsvektor enthaltenden gIV-Gens ist in Fig. 9 dargestellt. Die Signalsequenz kommt in dem reifen gIV-Protein nicht vor und trägt nicht zur Immunogenität des Glykoproteins bei. Deshalb wurde die Signalsequenz durch die Herstellung eines synthetischen Oligonucleotids entfernt, das der codierenden Sequenz der ersten Aminosäure des reifen gIV-Gens von BHV-1 entspricht (d. h. Leu) und sich bis zur SalI-Stelle 88 bp stromabwärts des Starts (ATG) des Gens erstreckt (vgl. Fig. 1). Ein eingebautes asymmetrisches, überhängendes HindIII-Ende wurde unmittelbar 5' zu dem Leu- Codon angehängt, und ein asymmetrisches XmaI-Ende wurde unmittelbar 3' zu der SalI-Stelle angehängt (vgl. Fig. 9). Die überhängenden Hindill- und XmaI-Enden erlaubten die Ligierung des Oligonucleotids in die HindIII- plus XmaI-Stellen des E. coli-Expressionsvektors pHK414. Das so erhaltene Plasmid wurde als BHDsyn43 bezeichnet und wird von dem E. coli-Stamm MC1066 getragen.
Der Aminoterminus des gIV-Clons BHDsyn43 wurde durch Ligieren des 590 bp großen BamHI-SalI-Fragments aus p98XmaI-XhoI in die SalI- plus BamHI-Stellen von BHDsyn43 verlängert. Diese Ligierung erzeugte pBHD5', das die ersten 620 bp der codierenden Sequenz für das reife gIV von BHV-1 trägt. pBHD5' wurde ebenfalls in dem E. coli- Stamm MC 1066 aufrechterhalten.
Ein das vollständige reife gIV von BHV-1 exprimierende E. coli-Clon wurde hergestellt, indem zuerst die in einem 630 bp großen BglII-BamHI-Fragment getragene gIV- Insertion von pBHD5' in die BglII-BamHI-Stellen des E. coli-Expressionsplasmids GH432 übertragen wurde. Der carboxyterminale Anteil des gIV-Gens wurde dann durch Ligieren des 640 bp großen XmaI-Fragments aus pSD98 in die XmaI-Stelle in die neue Konstruktion BHDS'/432 angehängt. Das Plasmid pSD98 war Teil des BHV-1-Stamms Cooper der ursprünglichen BHV-1-Genombank (Fig. 6). Die Bank liegt in Form von 12 HindIII-Clonen des Virusgenoms insertiert in pBR322 vor. Das Plasmid pSD98 wurde als Teil des gIV-Gens identifiziert, zum Teil durch seine Lage im "S"-Bereich des BHV-1-Genoms, die der Lage des gD anderer Herpesviren, z. B. HSV-1 und 2, PRV und EHV-1 entspricht und die Reaktivität in Southern-Blots unter Verwendung einer dem gIV-Gen-Homolog von PRV entsprechenden Sonde.
Das fertige BHV-1-gIV-E. coli-Expressionsplasmid wird als pBHDsib (Fig. 10) bezeichnet und wurde in den E. coli-Stamm W31104'Iq transformiert. Nach Induktion mit Lactose (2% Endkonzentration) stellte pBHDsib ein 58 k-Protein her, das etwa 10% des durch den Clon produzierten Gesamtproteins ausmachte. In einem Western-Blot-Test reagierte das 58 k-Protein spezifisch mit überimmunisiertem Anti-BHV-1-Serum und dem BHV-1-gIV-spezifischen monoclonalen Antikörper 3D9.
Eine Aggregatpräparation von pBHDsib wurde in 50 mMol β-Mercaptoethanol und 0,5% SDS, pH 8,0, solubilisiert. Dosen mit 150 ug des solubilisierten 58 k-Proteins wurden in komplettem Freundschen Adjuvans hergestellt und an Kaninchen durch intramuskuläre Injektion verabreicht. In diesen Tieren induzierte Seren reagierten spezifisch mit einem von gIV nicht zu unterscheidenden Glykoprotein aus BHV-1-infizierten Zellextrakten. Bei der Abschätzung der BHV-1-Virus-neutralisierenden Aktivität in vitro wurde festgestellt, daß die Kaninchenseren einen Plaquereduktionstiter von 1 : 128 aufweisen.

IV.D. Reinigung rekombinanter BHV-1-Glykoproteine

Mit pBHDsib transfizierte E. coli W3110F'Iq-Zellen wurden in mit Ampicillin (50 ug/ml) supplementiertem L-Nährmedium gezüchtet. Kulturen in der späten logarithmischen Wachstumsphase wurden mit entweder 2% Lactose oder 2 mM IPTG induziert. Fünf Stunden nach der Induktion wurden die Kulturen geerntet, die Zellen durch Zentrifugation (2000 g für 20 Minuten) pelletiert und dann mechanisch aufgebrochen. Die Aggregate wurden anschließend durch die Behandlung mit 6 M GuHCl dispergiert und dann dialysiert, um die GuHCl-Konzentration auf 2 M zu verringern.
Die anderen in E. coli exprimierten BHV-1-Glykoproteine wurden in ähnlicher Weise gereinigt.

V

Das folgende Beispiel veranschaulicht die Herstellung von nicht-nativen Untereinheiten-Antigenen von BHV-1 in rekombinanten Adenovirusvektoren.

V.A. Expression von gIV von BHV-1 unter Verwendung von Adenovirusvektoren

In einer Form lag diesem Expressionssystem das menschliche Adenovirus Serotyp 5 zugrunde. Die E1- und E3-Bereiche des Virus wurden deletiert, um die Anpassung der großen Geninsertionen in dem Virusgenom zu erleichtern. 293-Zellen, mit DNA des menschlichen Adenovirus Typ 5 transformierte menschliche Nierenzellen, exprimieren die viralen E1-Proteine konstitutiv. Als Ergebnis stellt die Kombination von Vektoren auf Grundlage des menschlichen Adenovirus vom Typ 5 und 293-Zellen ein ideales Expressionssystem dar.
Der Transfervektor pAdBMS (Fig. 11) wurde entwickelt, um fremde Gensequenzen in das menschliche Adenovirus Serotyp 5 zu insertieren. Der Vektor enthält den späten Adenovirus-Hauptpromotor (Ad2MLP), Enhancer-Sequenzen und Polyadenylierungssequenzen, flankiert von den E1 flankierenden Sequenzen des Adenovirus Serotyp 5. Eine einzigartige BamHI-Stelle ist stromabwärts des MLP angeordnet und wird zur Insertion fremder Gene verwendet.
Für die Expression von entweder dem vollständigen gIV von BHV-1 oder dem verkürzten gIV von BHV-1 wurden die vorstehend beschriebenen geeigneten Genkonstrukte mit BglII gespalten und in die dephosphorylierte BamHI-Stelle von pAdBMS insertiert. Fig. 12 veranschaulicht den das vollständige gIV codierende Gen einschließenden Adenovirusvektor pAdBM5.gIV. Die Plasmid-DNA wurde mit ClaI gespalten, mit gereinigter DNA des menschlichen Adenovirus Serotyp 5 gemischt und zur Transfektion von 293-Zellen unter Anwendung des Calciumphosphatverfahrens verwendet. Die transfizierten Zellen wurden ausplattiert und bei 37ºC inkubiert, bis sich eine cytopathische Wirkung entwickelte. Der Überstand dieser Kulturen wurde dann entfernt und zur Reinfektion von 293-Zellen verwendet. Rekombinante Virione, die gIV von BHV-1 exprimierten, wurden identifiziert, selektiert und dann durch den Plaquetest weiter gereinigt.

V.B. Reinigung des rekombinanten exprimierten gIV von BHV-1

293-Zellen wurden in MEM, enthaltend 10% fötales Rinderserum und supplementiert mit 1 · Vitaminen und Mineralien, gezüchtet. Konfluente einzellige Schichten wurden mit dem gIV von BHV-1 exprimierenden rekombinanten Adenovirus mit einer Multiplizität von 0,1 infiziert. 24 Stunden nach der Infektion oder beim Auftreten einer cytopathischen Gesamtwirkung wurde das rekombinante gIV geerntet.
Für das vollständige gIV wurden die Zellen von der Oberfläche der Kulturflaschen in die Wachstumsmedien abgeschabt, die dann zentrifugiert (1000 g für 20 Minuten) wurden und das Zellpellet wurde gewonnen. Die Zellen wurden mit einem Detergens aufgebrochen und weiter behandelt, wie bereits beschrieben wurde.
Das verkürzte gIV wurde durch Ernten der Medien aus den Kulturflaschen gewonnen. Zelltrümmer wurden durch eine 20-minütige Zentrifugation bei 1000 g entfernt. Die geklärten Medien wurden bis zur Verarbeitung bei -70ºC eingefroren. Das verkürzte gIV wurde durch Affinitätschromatographie über für gIV von BHV-1 spezifische Säulen gereinigt, wie bereits beschrieben wurde.

VI

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit von rekombinant hergestellten Untereinheiten-Antigenen von BHV-1.

VI.A. Materialien und Verfahren

VI.A.1. Zellen und Viren

E. coli-Zellen wurden in L-Nährmedium gezüchtet. Madin-Darby-Rindernieren (MDBK) -zellen, BSC-1-Zellen und 293-Zellen wurden in essentiellem Eagle-Minimalmedium (MEM; GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, USA), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS; GIBCO), gezüchtet. Spodoptera frugiperda (SF9)-Zellen wurden in 10% FBS enthaltendem TNM-FH-Medium (GIBCO) gezüchtet und aufrechterhalten. Die BHV-1-Stämme P8-2 und 108 wurden in MDBK-Zellen vermehrt, wie bereits beschrieben wurde (Babiuk et al., Infect. Immun. 12 (1975), 958). Das aus Nasenabstrichen gewonnene Virus wurde durch Plaquetitration auf MDBK-Zellen in Mikrotiterplatten mit einem Antikörperüberzug quantifiziert, wie bereits beschrieben wurde (Rouse et al., J. Immunol. 113 (1974), 1391). Das Vacciniavirus (WR-Stamm) und ein rekombinantes Vacciniavirus wurden in BCS-1-Zellen gemäß der Beschreibung in Beispiel II vermehrt. Das menschliche Adenovirus Typ 5 und ein rekombinantes Adenovirus wurden gemäß der Beschreibung in Beispiel V in 293-Zellen gezüchtet. Virusstämme des Baculovirus AcNPV und ein rekombinantes Virus wurden in SF9-Zellen hergestellt, wie von Summers und Smith (Summers et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Texas Agricultural Experiment Station Research Bulletin Nr. 1555 (1987), Texas Agricultural Experiment Station, College Station, Tex.) beschrieben wurde.

VI.A.2. Rekombinante Expression von gIV

gIV von BHV-1 wurde in E. coli, Baculovirus, SF9-Zellen, Adenovirus, Vacciniavirus und Säugerzellen rekombinant exprimiert, wie in den vorstehenden Beispielen erläutert wurde.

VI.A.3. Herstellung von Immunadsorptionssäulen

Die IgG-Fraktion des gIV-spezifischen monoclonalen Antikörpers 3D1Gb wurde unter Verwendung einer Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Montreal, Quebec, Kanada)-Säule aus Ascitesflüssigkeit präpariert. Das gereinigte IgG wurde gründlich gegen 0,1 M HEPES, pH 7,5, dialysiert und an aktiviertes Affigel-10 (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, Ontario, Kanada) in einer Konzentration von 5 mg Protein pro ml Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers gebunden. Für jede der verschiedenen gIV-Arten wurde eine Immunadsorptionssäule gepackt.

VI.A.4. Reinigung der Glykoproteine

Das gIV-Glykoprotein wurde aus BHV-1 (Stamm P8-2)-infizierten MDBK-Zellen, mit dem rekombinanten AcNPV infizierten SF9-Zellen, mit dem rekombinanten Adenovirus infizierten 293-Zellen oder mit dem rekombinanten Vacciniavirus infizierten BSC-1-Zellen gereinigt. Aus den virusinfizierten Zellen wurden Zelllysate hergestellt, im wesentlichen wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk et al., Virology 144 (1985), 204- 215). Kurz zusammengefaßt wurden die Zellen geerntet, bei 1000 UpM zentrifugiert und in 10 mM Tris-Hydrochlorid, 150 mM NaCl, pH 7,5, enthaltend 1% Nonidet p40 (NP-40) und 1% Natriumdesoxycholat, resuspendiert. Nachdem die Zellysate dreimal über Säulen mit dem jeweiligen gIV-spezifischen monoclonalen Antikörper geleitet worden waren, wurden die Säulen mit einem Volumen Probenauftragspuffer und zwei Volumina Waschpuffer (10 mM Tris-Hydrochlorid, 500 mM NaCl, 0,1% NP-40, pH 7,5) gewaschen. Das spezifisch gebundene Antigen wurde mit 50 mM Diethylamin, pH 11,5, eluiert, unmittelbar danach mit 1 M Tris-Hydrochlorid, pH 7, neutralisiert und an einer Amicon YM30-Membran konzentriert. Die Säulen wurden zur Wiederverwendung wieder in Probenauftragspuffer äquilibriert oder in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,02% Natriumazid, gelagert. Der Proteingehalt wurde mit dem Bio-Rad-Proteinbestimmungs-Kit bestimmt. Die Reinheit wurde durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese allein und in Verbindung mit dem Western-Blot-Verfahren abgeschätzt. Schließlich wurden die gereinigten Proteine auf geeignete Zellen appliziert, um sie auf eine verbleibende Virusaufnahme zu testen.

VI.A.5. Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wurde in 10%igen diskontinuierlichen Gelen unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (Laemmli U.K., Nature 227 (1970), 680-685).

VI.A.6. Immunisierung

Gruppen von je acht Kälbern wurden intramuskulär mit 25 ug des gereinigten gIV, das von BHV-1, Baculovirus, Adenovirus oder Vacciniavirus produziert wurde, oder 100 ug von in E. coli produziertem gIV immunisiert. Die Glykoproteine wurden mit dem Adjuvans Avridin vereinigt, wie bereits beschrieben wurde (Babiuk et al., Virology 159 (1987), 57-66). Eine Kontrollgruppe wurde mit Avridin allein geimpft. Einundzwanzig Tage später wurden die Tiere nachgeimpft und dann vierzehn Tage nach der Nachimmunisierung BHV-1 ausgesetzt. Den Tieren wurden Blutproben zum Zeitpunkt der ersten Immunisierung, der Nachimmunisierung und der Exposition sowie zehn Tage nach der Exposition zur Bewertung der Antikörperantworten entnommen.

VI.A.7. Experimentelle Exposition

Vierzehn Tage nach der zweiten Immunisierung wurden die Tiere in eine Isolierbox transportiert und klinisch untersucht. Ihr Gewicht und ihre Rektaltemperatur wurde bestimmt und protokolliert. Blutproben und Nasenabstriche wurden zum Feststellen von Basislinienwerten gesammelt. Die Kälber wurden dann einzeln einem Aerosol von 10&sup7; PFU pro ml des BHV-1-Stamms 108 ausgesetzt, das mit einem DeVilbis-Zerstäuber, Modell 65 (DeVilbis, Barrie, Ontario, Kanada) erzeugt wurde. Die Dauer der Behandlung betrug 4 Minuten pro Kalb.

VI.A.8. Klinische Beurteilung

Die klinischen Beurteilungen wurden jeden Tag zur gleichen Zeit von zwei unabhängigen Forschern durchgeführt, die nicht über die spezifischen Behandlungen der einzelnen Tiere informiert waren. Die bewerteten Parameter beinhalten Depression, Appetit, Fieber, Konjunktivitis, Rhinitis, Mundatmung und Tracheitis. In jedem Fall wurde gesunden Tieren eine Bewertung von 0 zugewiesen. Klinische Bewertungen von 1-4 wurden kranken Tieren für jeden einzelnen Parameter wie folgt zugewiesen: 4: schwer; 3: deutlich; 2: gering; 1: leicht. Die Temperaturen wurden jeden Tag gemessen, und Nasenabstriche wurden jeden zweiten Tag gesammelt und am gleichen Tag verarbeitet. Blutproben wurden zehn Tage nach der Exposition entnommen.

VI.A.9. Enzym-gebundener Immunsorptionstest (ELISA)

Um die gIV-spezifischen Antikörperantworten der Kälber zu bestimmen, wurde der ELISA im wesentlichen durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk, Virology 135 (1984), 466). Polystyrol-Mikrotiterplatten (Immulon 2, Dynatech Laboratories Inc., Alexandria, VA, USA) wurden mit 0,05 ug gereinigtem gIV pro Vertiefung beschichtet und mit seriell verdünnten Rinderseren inkubiert. Affinitätsgereinigtes Meerrettichperoxidase (HRPO)-konjugiertes Kaninchen-anti-Rind-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA) in einer Verdünnung von 1 : 5000 wurde als Nachweisantikörper verwendet. Die Antikörper-Isotypen wurden in einem indirekten ELISA unter Verwendung von gIV-beschichteten Platten und Isotyp-spezifischen monoclonalen Antikörpern (bereitgestellt von Dr. K. Nielsen, Agriculture Canada, Animal Diseases Research Institute, Nepean) bestimmt. Affinitätsgereinigtes HRPO-konjugiertes Ziege-anti- Maus-IgG (Boehringer-Mannheim, Dorval, Quebec, Kanada) in einer Verdünnung von 1 : 10 000 wurde als Nachweisantikörper verwendet.

VI.A.10. Kompetitiver Antikörperbindungstest (CBA)

Der CBA basierte auf dem ELISA, der modifiziert wurde, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littet-van den Hurk et al., Virology 144 (1985), 216-227). Kurz zusammengefaßt wurden gIV-beschichtete Platten mit seriell verdünnten Kompetitor-Antikörpern aus den gIV immunisierten Kälbern inkubiert. Nach einer 3-stündigen Inkubation bei 37ºC wurden die Platten gewaschen und mit HRPO-konjugierten monoclonalen Antikörpern inkubiert, die für acht verschiedene Epitope auf gIV spezifisch waren (von Drunen Littet-van den Hurk, Virology 135 (1984), 466 und Hughes et al., Arch. Virol. 103 (1988), 47). Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wurden die Platten erneut gewaschen und entwickelt. Die prozentuale Hemmung wurde unter Verwendung der Formel [100 · (A-B)/A] berechnet, worin A die Absorption in Abwesenheit des Kompetitor-Antikörpers und B die Absorption in Gegenwart des monospezifischen Kompetitor-Antikörpers ist.

VI.A.11. Neutralisierungstest

Die Neutralisierungstiter der Rinderseren wurden bestimmt, wie bereits beschrieben wurde (Babiuk L.A. et al., Infect. Immun. 12 (1975), 958). Die Titer wurden als der reziproke Wert der höchsten Antikörperverdünnung angegeben, die verglichen mit der Viruskontrolle eine 50%ige Reduktion der Plaques bewirkte. Die Neutralisierungstiter wurden auch für die Nasenabstriche der immunisierten Tiere bestimmt und in der gleichen Weise berechnet.

VI.B. Ergebnisse

VI.B.1. Reinigung von authentischem und rekombinantem gIV

Authentische und rekombinante gIVs wurden an Säulen mit gIV-spezifischen monoclonalen Antikörpern gereinigt. Alle rekombinanten gIV-Glykoproteine wurden in größeren Mengen produziert als das authentische gIV von BHV-1 (Tabelle 1).

Tabelle 1

Herkunft von gIV aAusbeute 1 (ug/10&sup6; Zellen)
BHV-1 1-2.5
Baculovirus 15-35
Adenovirus 3.5-8.5
Vacciniavirus 2.5-5.5
E. coli b500-1000
a Die Ausbeuten von gIV aus Säugerzellen wurden mit dem Bio-Rad-Proteinbestimmungs- Kit bestimmt.
b Die Ausbeuten von gIV aus E. coli werden in ug pro Liter angegeben und representieren Werte, die im Labormaßstab vor einer Optimierung erhalten wurden.
Die Reinheit der Glykoproteinpräparationen wurde durch eine SDS-PAGE abgeschätzt. Alle rekombinanten Formen von gIV banden spezifisch an die Säulen. Die apparenten Molekulargewichte des authentischen gIV und des gIV von Vacciniavirus und Adenovirus waren identisch, was zeigt, daß die Prozessierung und Glykosylierung des authentischen gIV in MDBK-Zellen und des rekombinanten gIV in BSC-1- oder 293-Zellen vergleichbar ist. Rekombinantes gIV aus dem Baculovirus wies jedoch ein apparentes Molekulargewicht von 63 kDa auf, das geringer ist als das der authentischen 71 kDa-Form. Zusätzlich zu der 63 kDa-Art wurden vier Banden mit einem geringeren apparenten Molekulargewicht beobachtet. Diese Banden wurden übereinstimmend sowohl in reinen als auch in rohen Präparationen von gIV aus dem Baculovirus beobachtet. Rekombinantes gIV aus E. coli wies ein apparentes Molekulargewicht von 54 kDa auf, das dem Molekulargewicht der nichtglykosylierten Form von gIV entspricht (von Drunen Littel-von den Hurk, Virology 59 (1986), 401-410). Da etwa 50% der gesamten Proteinpräparation aus E. coli aus gIV bestand, wurde dieses rekombinante Protein nicht weiter gereinigt. Das gIV von E. coli war nicht dimerisiert, während das gIV aus dem Baculovirus im Vergleich zu dem authentischen gIV einen viel geringeren Dimerisierungsgrad zeigte.

VI.B.2. Immunantworten auf das authentische und das rekombinante gIV

Um zu bestimmen, ob die unterschiedlichen Formen des rekombinanten gIV das gleiche Schutzvermögen wie das authentische gIV aufweisen, wurden sie in einem BHV-1- Expositionsexperiment, wie oben beschrieben wurde, beurteilt. Die Qualität und die Spezifität der gesamten Antikörperantwort nach der Immunisierung wurde in einem ELISA unter Verwendung von authentischem gIV, gI oder gIII als Antigene bestimmt. Nach einer Immunisierung wurden hohe Spiegel von gIV-spezifischen Antikörpern in den Seren aller immunisierten Tiere nachgewiesen. Die Antikörpertiter erhöhten sich nach der Nachimmunisierung. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den durch gIV von BHV-1, Baculovirus, Adenovirus oder Vacciniavirus induzierten Antikörpertitern. Jedoch waren die durch gIV von E. coli induzierten Antikörpertiter nach der Nachimmunisierung um das Fünffache höher. Keines der Tiere reagierte mit gI oder gIII, was die Spezifität der Immunantwort zeigt. In keinem Fall entwickelten die Placebo-geimpften Tiere eine Immunantwort.
Um die Wirksamkeit der Glykoprotein-spezifischen Antikörper bei der Vorbeugung vor einer Infektion vorherzusagen, wurden die neutralisierenden Serum-Antikörpertiter bestimmt. Nach einer Immunisierung induzierte gIV aus BHV-1, Baculovirus, Adenovirus und Vaccinavirus ausreichend gute Spiegel neutralisierender Antikörper, die auf sehr hohe Spiegel nach der Nachimmunisierung anstiegen. Wieder gab es im wesentlichen keinen Unterschied zwischen den Immunantworten dieser vier Formen von gIV. Im Gegensatz dazu gab es einen signifikanten Unterschied hinsichtlich der neutralisierenden Antikörperantwort von gIV aus E. coli. Auch nach zwei Immunisierungen war der durch diese Form von gIV induzierte neutralisierende Antikörpertiter niedriger als der durch eine Immunisierung mit einer der anderen Formen von gIV induzierte Spiegel.
Der Beitrag der Antikörper-Isotypen zu der Immunantwort wurde durch einen indirekten ELISA untersucht. Die IgG1-Titer waren höher als die IgG2-Titer während des Zeitraums vor der Exposition. Die IgG1-Titer erreichten nach zwei Immunisierungen ihre Höchstwerte und begannen dann, sich einem Plateau zu nähern und nach der Exposition abzufallen. Die IgG2-Titer waren anfangs niedriger, stiegen aber im allgemeinen nach der Exposition kontinuierlich an. Die IgM-Titer waren während der Dauer des Experiments viel niedriger als die IgG1- oder IgG2-Titer. Die Antikörper-Isotypen waren im allgemeinen zwischen den mit den verschiedenen Formen des rekombinanten gIV immunisierten Gruppen vergleichbar. Jedoch waren die durch gIV aus E. coli induzierten IgM-Spiegel wesentlich höher als jene, die durch die anderen Formen von gIV induziert wurden. Die IgG1-Antwort war in dieser Gruppe jedoch langsamer.

VI.B.3. Epitopspezifität der Immunantwort auf authentisches und rekombinantes gIV

Rekombinantes gIV aus E. coli induzierte einen niedrigeren Spiegel neutralisierender Antikörper gegen BHV-1 als die anderen rekombinanten gIVs, obwohl die Antikörperantwort insgesamt äquivalent oder stärker war. Um festzustellen, welches der neutralisierenden Epitope auf gIV erkannt wurde, wurden die Seren aller immunisierten Tiere im Hinblick auf die Epitopspezifität getestet. Sieben neutralisierende Epitope (Epitope Ia, Ib, II, IIIa, IIIb, IIIc und IIId) und ein nicht-neutralisierendes Epitop (Epitop IV) wurden auf gIV kartiert (Hughes et al., Arch. Virol. 103 (1988), 47). Alle Epitope auf gIV wurden von mit gIV von BHV-1, Baculovirus, Adenovirus oder Vacciniavirus immunisierten Tieren erkannt; die Blockierung variierte in Abhängigkeit von dem Epitop zwischen 30 und 95%. Diese Werte korrelieren gut mit bereits beschriebenen Werten zwischen 30 und 85% (von Drunen Littel-von den Hurk, Vaccine 8 (1990), 358-368). Jedoch wurden die neutralisierenden Epitope auf gIV entweder gar nicht (Ia, Ib, II, IIIa und IIIb) oder kaum (IIIc und IIId) von mit gIV aus E. coli immunisierten Tieren erkannt. Das einzige Epitop, das von diesen Tieren gut erkannt wurde, war das nicht-neutralisierende Epitop IV. Diese Ergebnisse deuten an, daß die neutralisierenden Epitope auf gIV, von denen die meisten konformationsabhängig sind (Hughes et al., Arch. Virol. 103 (1988), 47), auf gIV von Baculovirus, Adenovirus und Vacciniavirus, aber nicht auf gIV von E. coli vorliegen.

VI.B.4. Schutz vor einer Exposition mit BHV-1

Alle Tiere wurden einem Aerosol von BHV-1 ausgesetzt. Vor der Exposition waren alle Tiere gesund, und sie wiesen eine normale Rektaltemperatur auf. Innerhalb von 24 Stunden nach der Infektion begannen die Tiere in der Placebo immunisierten Gruppe jedoch einen scharfen Temperaturanstieg zu zeigen. Die Temperaturen erhöhten sich bis drei Tage nach der Infektion weiter, wonach sie wieder abfielen. In der gIV geimpften Gruppe gab es keinen signifikanten Temperaturanstieg, jedoch hatten die mit gIV von E. coli immunisierten Tiere während den ersten zwei Tagen nach der Infektion etwas erhöhte Temperaturen. Zusätzlich zu den Temperaturantworten wurden die Kälber klinisch auf Anzeichen für eine Erkrankung der Atemwege beurteilt. Die klinischen Krankheitsbewertungen korrelierten gut mit den Temperaturantworten. Die Tiere in der Placebo immunisierten Gruppe zeigten Anzeichen einer klinischen Erkrankung von Tag 1 bis Tag 7 nach der Exposition, während die mit gIV von BHV-1, Baculovirus, Adenovirus oder Vacciniavirus immunisierten Gruppen überhaupt keine Krankheit hatten. Die Gruppe, die gIV von E. coli erhalten hatte, zeigte während drei Tagen nach der Infektion eine leichte Krankheit. Eine weitere objektive Morbiditätsbeurteilung ist das Ausmaß des Gewichtsverlusts von BHV-1 ausgesetzten Tieren. Der in der Placebo immunisierten Gruppe beobachtete Gewichtsverlust spiegelt die Anorexie als Ergebnis der Morbidität aufgrund der Virusexposition wider. Im Gegensatz zu der Placeboimmunisierten Gruppe hatten gIV immunisierte Tiere einen geringen oder keinen Gewichtsverlust während den 8 Tagen nach der Exposition.

VI.B.5. Induktion einer mucosalen Immunität

Mit Ausnahme der mit gIV von E. coli immunisierten Gruppe waren alle mit dem authentischen oder rekombinanten gIV geimpften Tiere bei einer BHV-1-Exposition vor der Krankheit völlig geschützt. Um festzustellen, ob sie auch vor einer Virusinfektion geschützt waren, wurde das Ausmaß der Virusausscheidung aus den Nasenluftwegen bewertet. Im wesentlichen kein Virus wurde aus den Nasenabstrichen von mit gIV von BHV-1, Baculovirus, Adenovirus oder Vacciniavirus geimpften Tieren gewonnen. Ein Tier in jeder der mit gIV von Baculovirus und Adenovirus geimpften Gruppen schied das Virus für einen Tag aus. Im Gegensatz dazu schieden alle mit gIV von E. coli oder einem Placebo immunisierten Tiere das Virus für 7 bis 9 Tage nach der Exposition aus. Diese Daten deuteten an, daß die intramuskuläre Immunisierung mit einem Untereinheiten-Impfstoff eine mucosale Immunität in den Nasenluftwegen induziert und auf diese Weise einer Virusinfektion vorbeugt. Außerdem scheint das Ausmaß der mucosalen Immunität mit dem Spiegel der neutralisierenden Antikörper im Serum zu korrelieren. Um das Vorhandensein einer mucosalen Immunantwort in den Nasenluftwegen zu bestätigen, wurden die Antikörpertiter in den Nasenabstrichen bestimmt. Am Tag der Exposition wiesen mit gIV von BHV-1, Baculovirus, Adenovirus oder Vacciniavirus geimpfte Gruppen mittlere neutralisierende Antikörpertiter zwischen 25 und 65 auf. Die gIV-spezifischen ELISA-Titer korrelierten gut mit den neutralisierenden Antikörperlitern. Die mit gIV von E. coli immunisierte Gruppe wies keine neutralisierenden Antikörper in den Nasensekreten auf, obwohl die gIV-spezifischen Antikörperspiegel insgesamt so hoch wie in den anderen Gruppen waren. In den Nasensekreten wurden keine gI- oder gIII- spezifischen Antikörper nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Diese Daten korrelieren gut mit den Antikörperspiegeln im Serum.

VII

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von gI von BHV-1 durch rekombinante Baculovirusvektoren.

VII.A. Materialien und Verfahren

VII.A.1. Zellen, Viren und Antikörper

Madin-Darby-Rindernieren (MDBK)-zellen wurden in essentiellem Eagle-Minimalmedium (Grand Island Biological Co., Grand Island, NY), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (GIBCO), gezüchtet. Virusstämme des BHV-1-Stamms Cooper wurden in MDKB-Zellen gezüchtet, wie bereits beschrieben wurde (Babiuk et al., Infect. Immun. 12 (1975), 958-963). Spodoptera frugiperda (SF9)-Zellen wurden in TNM-FH- Medium (GIBCO), enthaltend 10% FBS, gemäß den von Summers und Smith (Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555 (1987), College Station, TX) gezüchtet und aufrechterhalten. Virusstämme des Wildtyp-AcNPV und eines rekombinanten Virus wurden in SF9-Zellen hergestellt, wie von Summers und Smith (a. a. O., 1975) beschrieben wurde. Für gI spezifische monoclonale Antikörper wurden von von Drunen Littel-von den Hurk et al. (Virology 135 (1984), 466-479) entwickelt und charakterisiert. Das zur Identifizierung eines rekombinanten gI verwendete gI-spezifische monoclonale Antikörpergemisch bestand aus äquivalenten Mengen von 1B10 (Epitop I), 3F3 (Epitop II), 1E11 (Epitop III), 1F8 (Epitop IVa), 5G2 (Epitop IVb), 3G11 (Epitop IVb), 5G11 (Epitop IVc), 6G11 (Epitop IVc), 1F10 (Epitop V) und 2C5 (Epitop V).

VII.A.2. Insertion von gI-DNA von BHV-1 in den Transfervektor

Eine Kassette des gI-Glykoprotein-Gens wurde in Plasmid pSV2Neo hergestellt, wie bereits beschrieben wurde (Fitzpatrick et al., J. Virol. 62 (1988), 4239-4248). Das Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuclease BglII gespalten, und das das gI-Gen darstellende Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in die BamHI- Stelle des Baculovirus-Transfervektors pVL941 ligiert. Nach Transformation des E. coli- Stamms JM105 wurden auf L-Agar, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, erscheinende Kolonien auf Ampicillin enthaltendes L-Nährmedium überimpft und bei 37ºC über Nacht unter kräftigem Schütteln inkubiert. Präparationen des Plasmids aus jeder Kolonie wurden im kleinen Maßstab hergestellt, und die Anwesenheit des gI-Gens wurde durch Spalten mit den Endonucleasen AvaI und EcoRV bestätigt. Ein einziger Clon wurde identifiziert, der das gI- Gen in der gewünschten Orientierung enthielt, und als pV1gB bezeichnet. Der Clon pV1gB wurde in 500 ml L-Nährmedium, enthaltend Ampicillin, überimpft, und nach 24 Stunden bei 37ºC wurde das Plasmid durch alkalische Lyse präpariert und durch Gleichgewichtszentrifugation mit CsCl weiter gereinigt.

VII.A.3. Transfektion und Selektion rekombinanter Viren

Nach zwei Ethanolpräzipitationszyklen wurde das gereinigte Plasmid mit gleichem Volumen viraler DNA von A. californica gemischt und zur Transfektion subkonfluenter einzelliger Schichten von SF9-Zellen verwendet, wie von Summers und Smith, a. a. O. (1987), beschrieben wurde. Rekombinante Baculoviren wurden durch Plaque-Hybridisierung identifiziert, im wesentlichen wie von Summers und Smith, a. a. O. (1987), beschrieben wurde. Die Polyhedrin-negativen Rekombinanten wurden drei- bis viermal auf SF9-Zellen plaquegereinigt, um das kontaminierende Wildtyp-Baculovirus zu entfernen.

VII.A.4. Herstellung von Zelllysaten

Um die Expression des rekombinanten gI zu untersuchen, wurden konfluente einzellige Schichten von SF9-Zellen in 35 mm-Petrischalen mit einzelnen Polyhedrin-negativen Rekombinanten mit einer MOI von 5 infiziert und 48 Stunden bei 28ºC inkubiert. Die Zellen wurden in PBS abgeschabt, bei 150 · g 1 Minute pelletiert und in 50 ul RIPA-Puffer (0,02 M Tris-Hydrochlorid [pH 8,0], 0,15 M NaCl, 1% 10 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF]) resuspendiert. Der postnucleäre Überstand wurde gesammelt, und 5 ul wurden mit reduzierendem Elektrophoreseprobenpuffer vereinigt und für die Analyse durch eine SDS-PAGE und das Immunoblotting-Verfahren 2 Minuten gekocht. Um die ungefähren Ausbeuten des rekombinanten gI zu bestimmen, wurden SF9-Zellen in einzelligen Schichten oder Suspensionskulturen mit dem rekombinanten Virus mit einer MOI von 1 infiziert. Die Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion geerntet, mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer in einer Konzentration von 1 · 10&sup7; Zellen/ml zur Analyse durch einen ELISA resuspendiert. Äquivalente Proben von nichtinfizierten Zellen und/oder mit dem Elternvirus infizierten Zellen waren immer als Kontrollen eingeschlossen.

VII.A.5. Analyse der Kohlenhydrate

Die Proteine wurden mit Endoglykosidase H oder Glykopeptidase F gespalten, wie von Ronin et al., Biochemistry 26 (1987), 5848-5853, beschrieben wurde. Infizierte Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, und 2 · 10&sup5; Zellen wurden in 10 ul eines geeigneten Enzyminkubationspuffers resuspendiert. Die Spaltung mit Glykopeptidase F (Boehringer- Mannheim, Laval, Quebec, Kanada) wurde in 50 mM Tris-Hydrochlorid (pH 8,6), 25 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% 2-Mercaptoethanol, 0,2% SDS und 1,5 E Enzym durchgeführt. Die Spaltung mit Endo H (Boehringer-Mannheim) wurde in 0,1 M Natriumacetat (pH 5), 0,15 M Natriumchlorid, 1% Triton X-100, 1% 2-Mercaptoethanol, 0,2% SDS und 1,5 E Enzym durchgeführt. Die Zellen wurden 18 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Proteine wurden durch Zugabe von 1 ml eiskaltem Aceton und Zentrifugieren präzipitiert. Sie wurden einer SDS-PAGE, gefolgt von einer Immunoblot-Analyse, unterzogen. Tunicamycin wurde zu mit dem rekombinanten AcNPV infizierten SF9-Zellen oder BHV-1-infizierten MDBK-Zellen zum Zeitpunkt der Infektion aus einer Stammlösung von 1 mg/ml in Ethanol gegeben. Die SF9-Zellen wurden 48 Stunden nach der Infektion geerntet, und die MDBK-Zellen wurden 24 Stunden nach der Infektion geerntet.

VII.A.6. SDS-PAGE, Immunoblot und ELISA

Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde in 8,5%igen oder 10%igen diskontinuierlichen Polyacrylamidgelen durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1984)). Die Elektrophorese wurden unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Die Proteinbanden wurden durch Färben mit Coomassie-Brillantblau sichtbar gemacht. Um das von dem Baculovirus produzierte rekombinante gI zu identifizieren, wurde ein Immunoblot-Test durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1984)). Kurz zusammengefaßt wurden die Zelllysate nach der Elektrophorese elektrophoretisch auf Nitrocellulosefilter übertragen. Anschließend wurden die Anweisungen zur Verwendung des Bio- Rad (Mississauga, Ontario)-Immunoblot-Test-Kits befolgt. Ein gI-positives rekombinantes Baculovirus, bezeichnet als Bac-gI, wurde durch Züchtung auf SF9-Zellen vermehrt. Die Überstände dieser Infektion wurden bei 4ºC gelagert und in allen nachfolgenden Experimenten verwendet.
Sandwich- und indirekte ELISA-Tests wurden verwendet, um die Ausbeuten des Glykoproteins gI in mit dem rekombinanten Baculovirus infizierten SF9-Zellen zu bestimmen. Bei dem Sandwich-Test wurden Mikrotiterplatten mit der IgG-Fraktion von überimmunisiertem Rinderserum als Abfangantikörper beschichtet und dann mit Lysaten von mit dem rekombinanten Virus infizierten Zellen und Kontrollzellen oder affinitätsgereinigtem Standard-gI inkubiert. Bei dem indirekten Test wurden die Zelllysate und Glykoproteine direkt an die Mikrotiterplatten adsorpiert. Gemische von gI-spezifischen monoclonalen Antikörpern, gefolgt von Meerrettichperoxidase (HRPO)-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG (Boehringer- Mannheim), wurden zum Nachweis verwendet, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1984)). Die Reaktion wurde unter Verwendung von 0,8 mg/ml 5-Aminosalicylsäure und 0,006% H&sub2;O&sub2; sichtbar gemacht, wie beschrieben wurde.

VII.A.7. Immunfluoreszenz und Durchflußcytometrie

Die Expression des Glykoproteins gI in mit dem rekombinanten Baculovirus infizierten SF9-Zellen wurde 24, 48 und 72 Stunden nach der Infektion bestimmt. Kurz zusammengefaßt wurden die Zellen in PBS gewaschen, und Cytospin-Ausstriche wurden hergestellt und in Methanol fixiert. Sie wurden 30 Minuten bei 37ºC mit einer 1 : 100-Verdünnung eines gI-spezifischen monoclonalen Antikörpergemisches inkubiert und in PBS und ddH&sub2;O gewaschen. Sie wurden mit Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem (FITC) Kaninchen-anti- Maus-IgG (Boehringer-Mannheim) 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und vor dem Fixieren in PBS-Glycerin für Untersuchungszwecke noch einmal gewaschen. Für die Oberflächenfärbung und die Durchflußcytometrie-Analyse wurden die Zellen in PBS, enthaltend 0,2% Gelatine und 0,03% NaN&sub3; (PBSG), in einer Konzentration von 4 · 10&sup7; Zellen/ml suspendiert. Sie wurden in Mikrotiterplatten in einer Konzentration von 2 · 10&sup6;-Zellen pro Vertiefung ausplattiert und mit seriellen Verdünnungen der monoclonalen Antikörpergemische 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden sie in PBSG gewaschen und dann mit FITC- Kaninchen-anti-Maus-IgG 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen in 2% Formaldehyd fixiert und mit einem EPICS CS (Coulter Electronics, Ltd.)- Durchflußcytometer analysiert, wie anderweitig beschrieben wurde (Campos et al., Cell Immunol. 120 (1989), 259-269). Der Prozentsatz der positiven Zellen wurde unter Verwendung des Immuno-Programms (Coulter Electronics. Ltd., MDAPS-System) für die Analyse von Immunfluoreszenzhistogrammen berechnet.

VII.A.8. Zellfusionstest

Einzellige Schichten von SF9-Zellen in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen wurden mit dem rekombinanten Virus mit einer MOI von 5-10 PFU pro Zelle infiziert. 36 Stunden nach der Infektion wurde das Medium durch auf einen pH-Bereich von 5,0 bis 6,5 eingestelltes TNM-FH-Medium ersetzt. Die Syncytienbildung wurde unter einem Phasenkontrastmikroskop (Zeiss Modell IM35; Vergrößerung 200 x) überwacht. Monospezifische und monoclonale Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1 : 100 zum Zeitpunkt der pH- Verschiebung zugegeben.

VII.A.9. Immunisierung von Rindern

Das Glykoprotein gI wurde durch Immunadsorptionschromatographie aus Bac-gI- infizierten SF9-Zellen oder BHV-1-infizierten MDBK-Zellen gereinigt, wie bereits ausführlich beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk und Babiuk, Virology 144 (1985), 204-215). Gruppen von je acht Tieren wurden mit 10 ug affinitätsgereinigtem, rekombinantem oder authentischem gI in EmulsigenTM PLUS in einem Verhältnis von 7 : 3 (Vol./Vol.), wie vom Hersteller (MVP Laboratories, Ralston, NL) angegeben, immunisiert. Die Tiere wurden mit Hilfe einer Spritze intramuskulär geimpft, und sie erhielten 28 Tage später eine Nachimmunisierung. Zum Zeitpunkt der Immunisierung und zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde ihnen zur Bewertung der Antikörperantworten Blut entnommen. Die Antikörperantwort auf gI in den geimpften Tieren wurde in einem Immunoblot-Test mit gereinigtem BHV-1 als Antigen nachgewiesen, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk et al., Vaccine 8 (1990), 358-368).

VII.B. Ergebnisse

VII.B.1. Herstellung des rekombinanten gI-Glykoproteins in SF9-Zellen

gI-Gen-Insertionen enthaltende Rekombinanten wurden auf ihre Fähigkeit zur Produktion des Glykoproteins I von BHV-1 nach der Infektion von SF9-Zellen getestet. Alle der gI-Rekombinanten beeinflußten die Synthese eines Polypeptids mit einem apparenten Molekulargewicht von 166 kDa, das auf einem Coomassie-Brillantblau-gefärbten Gel 48 Stunden nach der Infektion sichtbar war. Dieses Protein fehlte in nichtinfizierten Zellen und in mit dem Eltern-Baculovirus infizierten Zellen. Um die Identität dieses Glykoproteins zu be stätigen, wurden Immunoblot-Analysen mit Bac-gI-infizierten SF9-Zellen und BHV-1-infizierten MDBK-Zellen durchgeführt. Ein gI-spezifisches monoclonales Antikörpergemisch, das die 130 k-, 74 k- und 55 k-Komponenten des authentischen gI in BHV-1-infizierten MDBK-Zellen erkennt, reagierte mit drei Polypeptiden mit apparenten Molekulargewichten von 116 kDa, 63 kDa und 52 kDa in Bac-gI-infizierten SF9-Zellen. Dies deutet an, daß die terminale Glykosylierung von gI in mit dem rekombinanten Virus infizierten SF9-Zellen nicht stattgefunden hat. Rekombinantes gI wurde in infizierten SF9-Zellen gespalten, aber nicht mit der gleichen Effizienz wie authentisches gI. Keine Reaktion wurden zwischen den gI-spezifischen monoclonalen Antikörpern und mit dem Eltern-Baculovirus infizierten SF9- Zellen beobachtet.

VII.B.2. Prozessierung von gI in Säuger- und Insektenzellen

Um den beobachteten Unterschied hinsichtlich des Molekulargewichts zwischen dem rekombinanten und authentischen gI weiter zu untersuchen, wurden Bac-gI-infizierte SF9-Zellen und BHV-1-infizierte MDBK-Zellen mit Tunicamycin, einem Inhibitor der N-gebundenen Glykosylierung, behandelt. In diesen Zellen wurde nur ein Polypeptid mit einem apparenten Molekulargewicht von 105 k beobachtet, das dem vor kurzem identifizierten Polypeptidgerüst des authentischen gI entspricht (von Drunen Littet-van den Hurk und Babiuk, J. Virol. 59 (1986), 401-410). Dieses Experiment bewies, daß das verminderte Molekulargewicht des in Insektenzellen exprimierten gI auf die unvollständige Glykosylierung zurückzuführen war. Um den Typ des an das rekombinante und das authentische gI gebundenen Kohlenhydrats zu vergleichen, wurden beide Glykoproteine einer Spaltung mit Endo H oder Endo F unterzogen. Die Spaltung mit Endo H führte zu einer leichten Abnahme des apparenten Molekulargewichts des authentischen gIa und gIc, aber hatte keine Wirkung auf gIb, was frühere Studien bestätigt (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1986)). Der größere Teil des rekombinanten gla und glc war gegen Endo H empfindlich, was die Anwesenheit von Oligosacchariden vom mannosereichen Typ zeigt. Jedoch war das rekombinante gIb nicht gegen Endo H empfindlich, was andeutet, daß diese Oligosaccharide getrimmt werden. Alle rekombinanten und authentischen Formen von gI waren für Endo F empfindlich, was auf Vorläufermoleküle mit vergleichbaren apparenten Molekulargewichten in BHV-1- und Bac-gI-infizierten Zellen hinweist.
Sowohl das authentische als auch das rekombinante gI wird während der Prozessierung zum reifen Polypeptid gespalten. Jedoch ist der Spaltprozeß in Säugerzellen unvollständig und in Insektenzellen sogar noch weniger effizient. Es wurde vorgeschlagen, daß die Arg-Arg-Ala-Arg-Arg-Sequenz (501-505), die in dem mit HSV-1 nicht ähnlichen Bereich vorkommt, die Prozessierungsstelle für gII von PRV (Robbins et al., J. Virol. 61 (1987), 2691-2701) und gI von BHV-1 (Whitbeck et al., J. Virol. 62 (1988), 3319-3327) sein könnte. Um die Position der Spaltstelle des authentischen sowie rekombinanten gI zu bestätigen, sequenzierten die hier genannten Anmelder den N-Terminus des glc-Glykoproteins aus infizierten MDBK- und SF9-Zellen. Diese Analyse bestätigte, daß die ersten 12 N-terminalen Aminosäuren des authentischen und rekombinanten gIc den Positionen 506-517 entsprechen. Da das rekombinante gI an der gleichen Stelle wie das authentische gI gespalten wurde, ist die verminderte Spaltungseffizienz wahrscheinlich auf das Vorhandensein von verhältnismäßig geringen Enzymmengen in Baculovirus infizierten Zellen zurückzuführen, verglichen mit den großen Mengen von gI, die in diesen Zellen produziert werden. Die N-terminale Sequenzierung des gIb-Glykoproteins zeigte, daß die Signalsequenz in MDBK- und SF9-Zellen abgespalten wird, und daß der aminoterminale Rest des authentischen sowie des rekombinanten gI Arg-68 ist.

VII.B.3. Expressionskinetik und -rate des rekombinanten gI-Glykoproteins

Die in mit dem rekombinanten Baculovirus infizierten SF9-Zellen synthetisierte Menge von gI wurde durch einen mit affinitätsgereinigtem, rekombinantem gI standardisierten ELISA quantitativ bestimmt. Als einzellige Schichten in 35 mm-Petrischalen gezüchtete SF9-Zellen wurden mit Bac-gI mit einer MOI von 5 infiziert, und Aliquots von 1 · 10&sup6; Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion geerntet. Zelllysate wurden hergestellt, und die Expressionsrate des rekombinanten gI wurde mit dem ELISA bestimmt. Immunreaktives gI konnte ab 24 Stunden nach der Infektion nachgewiesen werden, und die stärkste Expression wurde zwischen 36 und 48 Stunden beobachtet, wonach eine leichte Abnahme des meßbaren Glykoproteins eintrat. Dieser Abfall spiegelt vermutlich die Zelllyse und den folgenden Abbau des Glykoproteins wider. Diese Analyse zeigte, daß bei maximalen Expressionsraten 30 ug gI pro 10&sup6; Zellen hergestellt wurden. Um die Möglichkeit zu untersuchen, rekombinantes gI in einem größeren Maßstab zu produzieren, wurden SF9- Zellen in Suspensionskulturen gezüchtet und mit dem rekombinantem Baculovirus mit einer MOI von 1 infiziert. Ergänzend zur Ausbeute mittels ELISA wurde die Lebensfähigkeit der Zellen und der Prozentsatz der infizierten Zellen bestimmt. Die durchflußcytometrische Analyse zeigte einen Anstieg des Prozentsatzes der infizierten Zellen (y-Achse) sowie der Proteingesamtausbeute (x-Achse) mit der Zeit. Der Prozentsatz der infizierten Zellen erhöhte sich allmählich und erreichte Höchstwerte von 85% 72 Stunden nach der Infektion, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen auf 25% gefallen war. Die Lebensfähigkeit der Zellen war zu gering für die durchflußcytometrische Analyse über diesen Zeitpunkt hinaus. Die Analyse durch einen ELISA zeigte, daß bis zu 35 ug gI pro 10&sup6; Zellen hergestellt wurden. Dies zeigte die Durchführbarkeit der Züchtung des rekombinanten Baculovirus in einem größeren Maßstab und daß dennoch gute Ausbeuten des Glykoproteins erhalten werden.

VII.B.4. Intrazelluläre Lokalisierung des rekombinanten gI in SF9-Zellen

Die intrazelluläre Verteilung des rekombinanten gI-Glykoproteins wurde durch einen indirekten Immunfluoreszenztest untersucht. 48 Stunden nach der Infektion war das rekombinante gI vorwiegend in den perinuclearen Membranen der infizierten SF9-Zellen lokalisiert. Um festzustellen, ob das rekombinante gI auf der Oberfläche von infizierten Zellen präsentiert wurde, wurde eine Immunfluoreszenzanalyse mit nichtfixierten Zellen durchgeführt. Die Lokalisierung von gI wurde durch eine helle Fluoreszenz auf der Oberfläche nachgewiesen. Mit dem Wildtyp-AcNPV infizierte Kontrollzellen zeigten mit einer Reihe von gI-spezifischen monoclonalen Antikörpern keine Fluoreszenz (nicht gezeigt).

VII.B.5. Fusogene Eigenschaften des rekombinanten gI in Insektenzellen

Es wurde vor kurzem gezeigt, daß eine der funktionellen Eigenschaften von gI seine Fähigkeit ist, in Abwesenheit von anderen Virusproteinen eine Zellfusion zu induzieren (Fitzpatrick et al., a. a. O. (1988); J. Gen. Virol., 71 (1990), 1215-1219). Um festzustellen, ob diese funktionelle Eigenschaft von dem rekombinanten Protein beibehalten wurde, wurden SF9-Zellen mit Bac-gI infiziert. Die Fusion der Insektenzellen war unter Standardkulturbedingungen nicht deutlich, aber nach einer Verschiebung des pH auf 5,4 wurde die Fusion in Bac-gI-infizierten SF9-Zellen innerhalb von zwei Stunden erkennbar. Die in diesen Zellen beobachtete Syncytienbildung nahm über einen Beobachtungszeitraum von 8 Stunden weiter zu. Der Zusatz von gI-spezifischem Kaninchenserum oder eines Gemisches von gI-spezifi schen monoclonalen Antikörpern inhibierte die Fusion durch gI vollständig, wie in Tabelle 2 angegeben ist.

Tabelle 2:

Inhibierung der durch in Baculovirus exprimiertes gI vermittelten Fusionsaktivität

Behandlung a Fusionsaktivität (%)b

TNM-FH, pH 5.4 80
Trypsin 80
Normales Rabs 80
gI-spezifisches Rabs 0
Kontroll-Mabs 80
gI-spezifisches Mabe-Gemisch o
1B10 Mab (I) 5
3F3 Mab (II) 80
1E11 Mab (III) 80
1F8 Mab (IVa) 80
5G2 Mnb (IVb) 10
5G11 Mab (IVc) 60
1F10 Mab (V) 80
a. Die Zellfusion wurde 36 Stunden nach der Infektion durch den Austausch des Zellkulturmediums durch TNM-FH, pH 5,4, induziert. Zum Zeitpunkt der pH-Verschiebung wurde eine Endverdünnung von 1 : 100 von Rabs (Kaninchenserum) oder MAbs (monoclonale Antikörper) zu dem Medium gegeben. Die Behandlung mit 20 ug Trypsin wurde für 10 Minuten unmittelbar vor der pH-Verschiebung nach 36 Stunden durchgeführt.
b. Die Zellen wurden 8 Stunden nach der pH-Verschiebung gezählt. Der Prozentsatz der fusionierten Zellen wurde mit einer Gesamtzahl von 400 Zellen berechnet und auf die nächste Dezimalzahl abgerundet.
Wenn die Medien einzelne monoclonale Antikörper beinhalteten, wurde die Fusion praktisch vollständig durch die monoclonalen Antikörper 1B10 (Epitop I) und 5G2 (Epitop IVb) und teilweise durch 5G11 (Epitop IVc) inhibiert. Der Zusatz von Trypsin zum Zeitpunkt der pH-Verschiebung beeinflußte die Fusionsaktivität nicht.

VII.B.6. Antigene und immunogene Eigenschaften des in SF9-Zellen exprimierten gI

Die antigenen Eigenschaften des rekombinanten gI wurden unter Verwendung einer Reihe von gI-spezifischen monoclonalen Antikörpern beurteilt. Die von diesen monoclonalen Antikörpern erkannten Epitope wurden bereits identifiziert und charakterisiert (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1985); Fitzpatrick et al., Virology 176 (1990), 145- 157). Die Reaktivität aller dieser monoclonalen Antikörper in einem ELISA (Tabelle 3b) deutete an, daß alle der auf dem authentischen Glykoprotein identifizierten Epitope auch auf dem rekombinanten gI-Glykoprotein vorhanden waren.
Die Reaktion zwischen den monoclonalen Antikörpern und den zwei Kohlenhydrat-abhängigen Epitopen IVa und IVc (von Drunen Littel-von den Hurk et al. (1990b)) war auf dem rekombinanten gI schwächer als auf dem authentischen gI, was mit dem Fehlen der terminalen Glykosylierung von gI in SF9-Zellen übereinstimmt. Die Epitope I, II und III scheinen jedoch auf dem rekombinanten gI reaktiver zu sein als auf seinem authentischen Gegenstück.
Um die Immunogenität des rekombinanten und des authentischen gI zu vergleichen, wurden Kälber mit affinitätsgereinigtem Glykoprotein aus mit dem rekombinanten Bac-gI infizierten SF9-Zellen oder BHV-1-infizierten MDBK-Zellen immunisiert. Zwei Immunisierungen mit dem rekombinanten oder authentischen gI in Emulsigen PLUS riefen Antikörper hervor, die mit gI von BHV-I in einem Immunoblot-Test reaktiv waren. Die durch das rekombinante und authentische gI induzierten Antikörpertiter waren sehr ähnlich (Tabelle 3a). Tabelle 3a Immunantwort auf authentisches und rekombinantes gI
a Die Tiere erhielten zwei intramuskuläre Immunisierungen mit authentischem gI, rekombinantem gI oder PBS (Placebo) in Emulsigen PLUS.
b Die ELISA-Titer wurden gegen affinitätsgereinigtes gI bestimmt und als der reziproke Wert der höchsten Verdünnung angegeben, die bei einer Messung von zwei Standardabweichungen über dem Wert der Negativkontrolle erhalten wurde. Tabelle 3b
a. Von von Drunen Littel et al. (1984) entwickelte monoclonale Antikörper.
b. Durch kompetitive Bindungstests festgelegte gI-Epitope (von Drunen Littel-von den Hurk et al. (1985)).
c. Die Neutralisierungstiter wurden für Ascitesflüssigkeiten in Gegenwart von Meerschweinchenserum als Komplementquelle bestimmt. - = Titer < 4; +/- = Titer < 100; + = Titer > 100; ++ = Titer > 10 000 (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1985)).
d. Der Antigentiter wurde als der reziproke Wert der höchsten Verdünnung der infizierten Zellen angegeben, die einen Ablesewert von mindestens 0,05 OD (492 nm) ergab. Eine 1 : 100-Verdünnung entspricht 2 · 10&sup4; Zellen.
Die Reaktion zwischen den monoclonalen Antikörpern und zwei Kohlenhydratabhängigen Epitopen (IVa und IVc; von Drunen Littel-von den Hurk et al., J. Gen. Virol. 71 (1990), 2053-2063) war auf dem rekombinanten gI schwächer als auf dem authentischen gI, was mit dem Fehlen der terminalen Glykosylierung von gI in SF9-Zellen übereinstimmt. Die Epitope I, II und III scheinen jedoch auf dem rekombinanten gI reaktiver zu sein als auf seinem authentischen Gegenstück.
Um die Immunogenität des rekombinanten gI zu untersuchen, wurden Rinder mit 10 ug affinitätsgereinigtem Glykoprotein aus mit dem rekombinanten Baculovirus infizierten SF9-Zellen immunisiert. Zwei Immunisierungen mit dem rekombinanten gI in Emulsigen riefen Antikörper hervor, die mit gI von BHV-1 in einem Immunoblot-Test reaktiv waren.

VIII

Konstruktion eines rekombinanten AcMNPV, das sezerniertes gIV von BHV-1 exprimiert.

VIII.A.

Die in "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures" von Summers und Smith beschriebenen Standardprotokolle wurden verwendet, um die vorstehende Rekombinante zu erzeugen. Die Anmelder verwendeten den Genaustauschvektor pAcYM1 (vgl. Ann. Rev. Microbiol. 42, 177), um die Insertion des modifizierten gIV-Gens (vgl. nachstehend) in den Polyhedron-Genlocus von AcMNPV zu steuern. Folglich wurde die gIV-Genexpression durch den Polyhedron-Gen-Promotor gesteuert, und das rekombinante Virus zeigte einen Polyhedron-negativen Phänotyp.
Die folgenden Verfahren wurden angewendet, um das zur Herstellung eines Baculovirus, das fähig ist, gIV aus infizierten Zellen zu sezernieren, erforderliche Insertionsplasmid zu erzeugen. Die das vollständige gIV-Gen codierende Sequenz ist in einem einzigen 1303 bp großen MaeI-Fragment (vgl. die gIV-Gensequenz von Fig. 1 + die Restriktionsendonucleasekarte von Fig. 15) enthalten. Eine MaeI-Stelle liegt etwa 45 bp stromaufwärts des Gen-Initiationscodons und etwa 10 bp stromabwärts des Stopcodons vor. Dieses MaeI- Subfragment wurde aus dem HindIII-K-Fragment von BHV-1 isoliert und mit T4-DNA- Polymerase behandelt, um die Enden in glatte Enden zu überführen. Das modifizierte Fragment wurde dann in die BglII-Stelle (ebenfalls mit T4-DNA-Polymerase behandelt) eines Clonierungsvektors insertiert. Dieses Verfahren stellte die BglII-Clonierungsstellen wieder her, so daß die das gIV-Gen codierende Sequenz nun von einzigartigen BglII-Stellen flankiert wurde. Zur Herstellung eines Konstrukts, das die gIV-Glykoprotein-Sekretion erlaubt, wurde das BglII-modifizierte Plasmid zuerst teilweise mit SacII gespalten, und ein TAB-Linker (TCGAGC) wurde angehängt, um eine einzigartige XhoI-Stelle an der C-terminalen SacII-Stelle (lokalisiert bei 1115 bp in der begleitenden gIV-Gensequenz) zu erzeugen. Die C-terminale SacII-Stelle befindet sich genau am 5'-Terminus der Sequenz, die die gIV-Transmembransequenz codiert. Das neue Plasmid wurde dann mit XhoI gespalten, die glatten Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase wiederhergestellt, gefolgt von der Insertion einer dreiphasigen Translationsstopcodon-Linker (CTAGCTAGCTAG)-Sequenz, die die frühzeitige Translationstermination am 5'-Terminus der Ankersequenz des gIV-Gens bewirkt. Das modifizierte gIV-Genkonstrukt wurde durch Spalten mit BglII ausgeschnitten und dann in die BamHI-Clonierungsstelle von pAcYM1 insertiert. Die richtige Orientierung des gIV-Gens wurde durch die Kartierung asymmetrischer Restriktionsendonucleasestellen innerhalb der Insertion hinsichtlich der einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen im pAcYM1-Gerüst überprüft. Dieses fertige Konstrukt wurde zur Co-Transfektion von SF9- Zellen zusammen mit gereinigter genomischer DNA des Wildtyp-AcMNPV durch die von Smith und Summers beschriebenen Verfahren verwendet (Summers et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Texas Agricultural Experiment Station Research Bulletin Nr. 1555 (1987), Texas Agricultural Experiment Station, College Station, Tex.).

VIII.B.

Einzelne Polyhedron-negative Plaques wurden isoliert (vgl. Plaque-Reinigungsverfahren), durch Züchtung auf SF9-Zellen vermehrt und auf die Expression von sezerniertem gIV durch eine Western-Analyse von serumfreien Wachstumsmedien (Ex-Cell 400, JR Scientific) getestet, die aus virusinfizierten Zellen (MOI 1,0) 48 Stunden nach der Infektion gewonnen wurden. Die Analysen der Anmelder zeigten, daß etwa 70% des gesamten von diesem Virus produzierte gIV in die Medien sezerniert wurden.

VIII.C.

Gruppen von sechs Tieren wurden in einem dreiwöchigen Intervall intramuskulär mit 25 ug des rohen verkürzten gIV, das von Baculovirus infizierten SF9-Zellen produziert worden war, immunisiert. Das tgIV wurde mit dem Adjuvans Avridin kombiniert, wie bereits beschrieben wurde (Babiuk et al. (1987)). Eine Kontrollgruppe wurde nur mit Avridin geimpft. Einundzwanzig Tage später wurden die Tiere nachgeimpft und dann vierzehn Tage nach der Nachimmunisierung BHV-1 ausgesetzt. Den Tieren wurden zum Zeitpunkt der ersten Immunisierung, der Nachimmunisierung und der Exposition sowie zehn Tage nach der Exposition Blutproben zur Bewertung der Antikörperantworten entnommen. Eine Immunisierung mit dem verkürzten gIV induzierte keine nachweisbaren Mengen von neutralisierenden Serum-Antikörpern gegen BHV-1. Jedoch wurden nach der Nachimmunisierung beträchtliche Titer von neutralisierenden Serum-Antikörpern bei allen geimpften Tieren beobachtet (Tabelle 4). Nach der Exposition mit BHV-1 zeigten die Tiere in den Placebo-immunisierten Gruppen von Tag 1 bis zum Tag 7 nach der Infektion Anzeichen einer klinischen Erkrankung (Fig. 17a), während die mit dem verkürzten gIV immunisierte Gruppe eine sehr leichte Erkrankung durchmachten. Alle Tiere in der Placebo-Gruppe schieden mindestens 10 Tage lang hohe Virustiter aus, während in der geimpften Gruppe nur ein Tier 5 Tage lang sehr niedrige Virustiter ausschied (Fig. 17b).
Die Ergebnisse dieser Immunisierungsexperimente sind nachstehend in Tabelle 4 und in den Fig. 17(a) und 17(b) gezeigt. Tabelle 4 Serum-Neutralisierungstiter: Mittelwert + Wertebereich
a Gruppen von 6 Tieren wurden zweimal in einem dreiwöchigen Intervall mit 25 ug des rohen verkürzten gIV aus dem Baculovirus in Avridin immunisiert.
b Geometnscher Mittelwert der neutralisierenden Serum-Antikörpertiter und Wertebereiche in Klammern. Wenn kein Bereich angegeben ist, wiesen alle Tiere den gleichen Titer: < 2 auf.

IX

IX.A.1. Zellen und Viren

Madin-Darby-Rindernieren (MDBK)-zellen, BSC-1-Zellen und menschliche Thymidinkinase-negative (TK) 143-Zellen wurden als einzellige Schichten in essentiellem Eagle-Minimalmedium (MEM) (GIBCO/BRL, Mississauga, Ontario, Kanada), supplementiert mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) (GIBCO/BRL, Mississauga, Ontario, Kanada), gezüchtet. LMTIK&supmin;-Zellen wurden in essentiellem Dulbecco-Minimalmedium (DMEM) (GIBCO/BRL, Mississauga, Ontario, Kanada), supplementiert mit 5% FBS, gezüchtet. Der P8-2-Stamm von BHV-1 wurde in MDBK-Zellen vermehrt und quantifiziert, wie von Rouse et al. (J. Immunol. 113 (1974), 1391-1398) beschrieben wurde. Wildtyp- (WR-Starnm) und rekombinante VVs wurden in BSC-1-Zellen und LMTK&supmin;-Zellen vermehrt (Mackett et al., J. Gen. Virol. 49 (1984), 857-864).

IX.A.2. Konstruktion rekombinanter Plasmide

Restriktionsendonucleasen und andere DNA-modifizierende Enzyme wurden von Pharmacia (Dorval, Quebec, Kanada) und New England Biolabs (Mississauga, Ontario, Kanada) bezogen und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.

Konstruktion des RSV 1.3- und RSV 1.3X-Plasmids:

Das vollständige gIV-Gen wurde aus Plasmid pRSDneogIV (Tikoo et al., J. Virol. 64 (1990), 5132-5142) als ein 1,3 Kilobasen (kb) großes BglII-Fragment ausgeschnitten und in das BglII-gespaltene pRSV-0 (Fitzpatrick et al., J. Virol. 62 (1988), 4239-4248) insertiert, wobei das pRSV 1.3-Plasmid erzeugt wurde. Dieses Plasmid wurde teilweise mit SacII gespalten, und ein TAB-Linker (pTCGAGC) wurde angehängt (Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 4202-4206), wobei eine einzigartige XhoI-Stelle an der C-terminalen SacII-Stelle erzeugt wurde. Dieses Plasmid wurde als pRSV 1.3X bezeichnet. Alle folgenden Deletionen und Verkürzungen wurde so konstruiert, daß sie bei einem dieser Plasmide beginnen.
a) Plasmid pSTgIV: Das gIV-Gen wurde aus Plasmid pRSDneogIV (Tikoo et al., a. a. O. (1990)) als ein 1,3 kb großes BglII-Fragment subcloniert, mit T4-DNA-Polymerase behandelt und mit dem SmaI-gespaltenen pGS20 (Mackett et al., a. a. O. (1984)) ligiert.
b) Plasmid pSTgIVd1: Das Plasmid pRSVI.3X wurde mit XhoI gespalten, die glatten Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase wiederhergestellt, gefolgt von der Insertion einer dreiphasigen Stopcodon-NheI-Linker (pCTAGCTAGCTAG)-Sequenz. Die DNA wurde dann mit NheI gespalten und religiert. Das verkürzte gIV-Gen wurde in die SmaI-Stelle von pGS20 als ein BglII-Fragment mit wiederhergestellten glatten Enden insertiert.
c) Plasmide pSTgIVd2 und pSTgIVd5: Das Plasmid pRSV1.3 wurde mit NarI teilweise gespalten, und eine dreiphasige Stopcodon-HpaI-Linker (pd[TTAAGTTAACTTAA])- Sequenz wurde nach der Behandlung des NarI-gespaltenen Plasmids mit T4-DNA-Polymerase insertiert. Die DNA wurde schließlich mit HarI gespalten und religiert. Die Insertion des Linkers in eine der zwei NarI-Stellen im gIV-Gen wurde durch Restriktionsendonucleasekartierung bestätigt. Diese zwei Verkürzungen wurden getrennt in die SmaI-Stelle von pGS20 als ein BglII-Fragment mit wiederhergestellten glatten Enden cloniert, wobei das Plasmid pSTgIVd2 (HpaI-Linker-Insertion an der 3'-NarI-Stelle) und das Plasmid pSTgIVd5 (HpaI-Linker-Insertion an der 5'-NarI-Stelle) erzeugt wurde.
d) Plasmid pSTgIVd3: Das Plasmid pRSV1.3 wurde teilweise mit SalI gespalten, die glatten Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase wiederhergestellt, gefolgt von der Ligierung mit einer dreiphasigen Stopcodon-NheI-Linker (pCTAGCTAGCTAG)-Sequenz. Die DNA wurde mit NheI gespalten und religiert. Das verkürzte Gen wurde in die SmaI-Stelle von pGS20 als ein BglII-Fragment mit wiederhergestellten glatten Enden cloniert.
e) Plasmid pSTgIVd4: Das Plasmid pRSV1.3 wurde mit SmaI gespalten, das große Fragment wurde gereinigt und dann mit einer dreiphasigen Stopcodon-NheI-Linker (pCTAGCTAGCTAG)-Sequenz ligiert. Die DNA wurde mit NheI gespalten und religiert. Das verkürzte Gen wurde in die SmaI-Stelle von pGS20 als ein BglII-Fragment mit wiederhergestellten glatten Enden insertiert.
f) Plasmid pSTgIVd6: Das Plasmid pRSV1.3X wurde mit DraIII und XhoI vollständig gespalten. Das große Fragment wurde gereinigt, die glatten Enden wurden mit T4- DNA-Polymerase wiederhergestellt und es wurde ligiert. Die partielle Gendeletion wurde in die SmaI-Stelle von pGS20 als ein BglII-Fragment mit wiederhergestellten glatten Enden insertiert.
g) Plasmid pSTgIVd7: Das Plasmid pRSV1.3 wurde mit SalI vollständig gespalten, und das große Fragment wurde gereinigt und religiert. Die partielle Gendeletion würde in die SmaI-Stelle von pGS20 als ein BglII-Fragment mit wiederhergestellten glatten Enden insertiert.
h) Plasmid pSTgIVd8: Das Plasmid pRSV1.3X wurde mit XhoI gespalten und mit Mungbohnen-Nuclease behandelt, um glatte Enden zu erzeugen. Dann wurde die DNA teilweise mit XmaI gespalten und mit dem Klenow-Enzym behandelt, und das große Fragment wurde dann gereinigt und religiert. Die partielle Gendeletion wurde in die SmaI-Stelle von pGS20 als ein BglII-Fragment mit wiederhergestellten glatten Enden insertiert.
i) Plasmid pSTgIVd9: Das Plasmid pRSV1.3 wurde teilweise mit SalI gespalten, gefolgt von der vollständigen Spaltung mit XhoI. Das große Fragment wurde gereinigt, die glatten Enden wurden wiederhergestellt und dann wurde es religiert. Die partielle Gendeletion wurde in die SmaI-Stelle von pGS20 als ein BglII-Fragment mit wiederhergestellten glatten Enden insertiert.

IX.A.3. Isolierung von rekombinanten Vacciniaviren

Die gewünschten rekombinanten VVs wurden durch homologe Rekombination hergestellt, wie bereits beschrieben wurde (Mackett et al., "DNA Cloning: A Practical Approach" (1985), 191-211, hrsg. von Clover D.M., Oxford, IRL Press). Eine wieder konfluente einzellige Schicht (75 cm²) von BSC-1-Zellen wurde mit dem Wildtyp-VV (WR- Stamm) mit einer Infektionsmultiplizität von 0,05 PFU/Zelle infiziert. 4 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen durch eine milde Trypsinierung gesammelt, dreimal mit HEPES- Puffer (pH 7,1) gewaschen und auf eine Konzentration von 1-2 · 10&sup6; Zellen/ml in HEPES- Puffer (pH 7,1) eingestellt. Etwa 10 ug der in einem Cäsiumchloridgradienten gereinigten, linearisierten Plasmid-DNA wurden mit 750 ul der infizierten Zellsuspension gemischt und in einer Elektroporationsküvette 10 Minuten vor und unmittelbar nach der Elektroporation bei 200 Volt und 500 uFD unter Verwendung einer Bio-Rad Gene Pulser-Vorrichtung auf Eis gestellt. Die Zellen wurden dann in 10% FBS enthaltendem MEM verdünnt und bei 37ºC inkubiert. Nach 2-3 Tagen, um die Virusreplikation zuzulassen, wurden transfizierte Zellen und Überstände gesammelt, zweimal eingefroren und aufgetaut und 20 Sekunden mit Ultraschall behandelt, um das Virus freizusetzen. Mutmaßliche Rekombinanten wurden durch Ausplattieren der beschallten Überstände auf TKM143-Zellen und Überschichten mit 1% Agarose in Wachstumsmedium, enthaltend 5-Brom-2'-desoxyuridin (25 ug/ml), selektiert. Nach 3 Tagen wurden die TKY-Plaques durch Färben der einzelligen Schicht mit Neutralrot sichtbar gemacht, einzeln entnommen und auf BSC-1-Zellen gezüchtet, um das Virus zu vermehren. Rekombinante VVs wurden durch Durchmustern der TK--Plaques auf eine gIV- Expression mittels Immuncytochemie vor der erneuten Plaquebildung und der Herstellung von Virusstämmen in LMTK&supmin;-Zellen selektiert.

IX.A.4. Polyclonale und monoclonale Antikörper

Die Produktion und Charakterisierung von gIV-spezifischen monoclonalen Antikörpern (MAbs), insbesondere ihre Reaktivität mit nativem oder denaturiertem gIV, ihre Neutralisierungsaktivität und Gruppierung auf Grundlage von Kompetitionsbindungstests, wurde beschrieben (Hughes et al., Arch. Virol. 103 (1988), 47-60 und von Drunen Littel-von den Hurk et al., J. Gen. Virol. 71 (1990), 2053-2063). Vor der Verwendung wurden die MAb- Ascitesflüssigkeiten geklärt und gefiltert. Monospezifische polyclonale gIV spezifische Antiseren, die in Kaninchen produziert wurden, sind beschrieben worden (Hughes et al., a. a. O. (1988)).

IX.A.5. Proteinexpression

Zur Immunpräzipitation wurden LMTK&supmin;-Zellen mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 infiziert. Zehn Stunden nach der Infektion wurden die Zellen gewaschen und in Cystein-Methionin-freiem DMEM 90 Minuten vor der Markierung mit [³&sup5;S]-Cystein-Methionin (100 uCl/ml) inkubiert. Nach einer 4- bis 8-stündigen Markierung wurden die Zellen und/- oder das Medium geerntet. In "Pulse-Chase"-Experimenten wurden die Zellen 10 Stunden nach der Infektion mit 150 uCl [³&sup5;S]-Methionin-Cystein 15 Minuten markiert. Abhängig von dem spezifischen Experiment wurden die Zellen entweder sofort geerntet oder der Marker entfernt und die Zellen für unterschiedliche Zeiträume in DMEM, enthaltend einen Überschuß an kaltem Methionin ("Chase"), inkubiert. Die Proteine wurden aus dem Medium oder aus den infizierten Zellen immunpräzipitiert, mit modifiziertem RIPA-Puffer lysiert und durch eine SDS-PAGE analysiert, wie bereits beschrieben wurde (von Drunen Littel-von den Hurk, a. a. O. (1990)).

IX.A.6. Enzymbehandlungen

Die immunpräzipitierten Proteine wurden in 20 ul 0,5% SDS durch 3-minütiges Kochen eluiert. Die eluierten Proteine wurden mit 20 mE Endo H in 0,125 M Natriumcitrat, pH 5,5, 0,1 M 2-Mercaptoethanol, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 0,1% SDS gespalten. Zur Analyse durch eine SDS-PAGE wurden die gespaltenen Proteine mit eiskaltem Aceton präzipitiert, in Elektrophoreseprobenpuffer resuspendiert und vor der Analyse 3 Minuten gekocht (von Drunen Littel-von den Hurk, a. a. O. (1990)).

IX.A.7. Immunperoxidasefärbung

In Lab-Tek-Kammer-Objektträgern mit 4 Vertiefungen gezüchtete LMTK&supmin;-Zellen wurden mit dem geeigneten rekombinanten VV mit einer MOI von 5 infiziert. Nach 16- stündiger Inkubation wurden die Zellen mit 3% Paraformaldehyd 15 Minuten bei 4ºC fixiert (Oberflächenfärbung) und durch das Immunperoxidasefärbeverfahren gefärbt, wie bereits beschrieben wurde (Fitzpatrick et al., a. a. O. (1988)).

Ergebnisse

IX.B.

Um die Struktur und Funktion verschiedener Domänen von gIV zu untersuchen, wurde das vollständige offene Leseraster und die mutierten Formen (interne Deletionen oder Verkürzungen) des gIV-Gens (Fig. 15) in den VV-Expressionsvektor pGS20 cloniert (Fig. 2), um rekombinante VVs zu erzeugen, die hier als STgIV, die das Wildtyp-gIV exprimieren, bzw. STgIVd1 bis STgIVd9, die die mutierten Proteine d1 bis d9 exprimieren, bezeichnet wurden.

IX.B.1. Charakterisierung der durch rekombinante VVs hergestellten Protein

Um das Produkt des Wildtyp-gIV-Gens zu untersuchen, wurden LMTK&supmin;-Zellen mit dem rekombinanten VV STgIV infiziert und mit [³&sup5;S]-Cystein-Methionin über den Stoffwechsel markiert. Zum Vergleich mit dem authentischen gIV wurden MDBK-Zellen mit BHV-1 infiziert und in ähnlicher Weise mit [³&sup5;S]-Cystein-Methionin markiert. Die radioaktiv markierten Proteine wurden mit Kaninchen-anti-gIV-Antiserum immunpräzipitiert und durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert.
Die Radioimmunopräzipitation der mit dem rekombinanten VV pSTgIV infizierten Zellen ergab eine Proteinhauptbande mit einem Molekulargewicht von etwa 71 kDa, die gemeinsam mit dem authentischen gIV-Protein wanderte, das in BHV-1-infizierten Zellen produziert wurde. In nichtinfizierten Zellen oder mit dem Wildtyp-VV infizierten Zellen wurde keine vergleichbare Bande beobachtet. Dies legt nahe, daß das in LMTK&supmin;-Zellen produzierte rekombinante gIV in ähnlicher Weise wie das authentische gIV post-translational modifiziert wurde. Die von den Rekombinanten, die deletierte oder verkürzte Formen von gIV tragen, produzierten Proteine wurden ebenfalls durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die mutierten Formen d1-d9 des gIV-Proteins wurden als einzelne Banden mit etwa den erwarteten Molekulargewichten nachgewiesen, ausgenommen d7, das viel langsamer wanderte als erwartet. Diese abweichende Beweglichkeit des d7- Proteins scheint auf die Addition von O-gebundenen Oligosacchariden zurückzuführen zu sein (Tikoo et al., unveröffentlichte Daten).

IX.B.2. Antigenstruktur der gIV-Proteine

Um die antigenen Eigenschaften des Wildtyp-gIV zu untersuchen, wurde das radioaktiv markierte Protein aus VV STgIV-infizierten Zelllysaten mit gIV-spezifischen MAbs (Hughes et al., a. a. O. (1988) und von Drunen Littel-von den Hurk et al., Virology 135 (1984), 466-479) immunpräzipitiert und durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Zusätzlich zur Erkennung des rekombinanten gIV durch MAbs, die gegen die kontinuierlichen Epitope Ib (MAb 9D6), IV (MAb 3D9S) und IIIa (MAb 10C2) gerichtet sind, wurde das Protein auch von MAbs erkannt, die gegen die diskontinuierlichen Epitope Ib (MAb 136), II (MAb 3E7), IIIc (MAb 2C8), IIId (MAb 3C1) und IIIb (MAb 4C1) gerichtet sind. Dies legt nahe, daß die Antigenstruktur des in mit VV STgIV-infizierten Zellen produzierten gIV mit der von gIV vergleichbar ist, das von BHV-1-infizierten Zellen produziert wurde.
Zur Lokalisierung der antigenen Stellen auf dem gIV-Glykoprotein wurden die mutierten Proteine in ähnlicher Weise aus rekombinant infizierten Zelllysaten mit einzelnen MAbs immunpräzipitiert und durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die Ergebnisse waren wie folgt:
a) Eine von dem rekombinanten VV STgIVd1 exprimierte verkürzte Form von gIV (AAs 1-355), die 62 Aminosäuren am Carboxyterminus, einschließlich der Transmembranankersequenz, nicht aufweist, reagierte mit allen gIV-spezifischen MAbs, die sowohl kontinuierliche als auch diskontinuierliche Epitope erkennen.
b) Eine von dem rekombinanten VV STgIVd2 exprimierte verkürzte Form von gIV (AAs 1-320), die 97 Aminosäuren am Carboxyterminus nicht aufweist, reagierte mit allen MAbs, ausgenommen 3D9S (der ein kontinuierliches Epitop erkennt) und 136 (der ein diskontinuierliches Epitop erkennt). Die Reaktivität der MAbs 2C8 und 4C1 für dieses Protein war ebenfalls vermindert.
c) Eine von dem rekombinanten VV STgIVd3 exprimierte verkürzte Form von gIV (AAs 1-244), die 173 Aminosäuren am Carboxyterminus nicht aufweist, reagierte nur mit MAb 9D6, der ein kontinuierliches Epitop erkennt.
d) Eine von dem rekombinanten VV STgIVd4 exprimierte verkürzte Form von gIV (AAs 1-216), die 201 Aminosäuren am Carboxyterminus nicht aufweist, reagierte ebenfalls nur mit MAb 9D6.
e) Eine von dem rekombinanten VV STgIVd5 exprimierte verkürzte Form von gIV (AAs 1-164), die 253 Aminosäuren am Carboxyterminus nicht aufweist, reagierte mit keinem der MAbs.
f) Eine von dem rekombinanten VV STgIVd6 exprimierte deletierte Form von gIV, die 265 AAs von Rest 90 bis 354 in der extrazellulären Domäne von gIV nicht aufweist, reagierte ebenfalls mit keinem der MAbs.
g) Eine von dem rekombinanten VV STgIVd7 exprimierte deletierte Form von gIV, die 213 Reste von AAs 32-244 im extrazellulären Bereich von gIV nicht aufweist, reagierte nur mit MAb 3D9S, der ein kontinuierliches Epitop erkennt.
h) Eine von dem rekombinanten pSTgIVd8 exprimierte deletierte Form von gIV, die 139 AAs von Rest 218-355 im extrazellulären Bereich von gIV nicht aufweist, reagierte nur mit MAb 9D6.
i) Eine von dem rekombinanten VV STgIVd9 exprimierte deletierte Form von gIV, die 112 Reste von AAs 245-355 im extrazellulären Bereich von gIV nicht aufweist, reagierte nur mit MAb 9D6.
Diese Beobachtungen legen nahe, daß die Bindungsstellen für MAb 9D6 und 3D9 zwischen den Aminosäuren 164-216 bzw. Aminosäuren 320-355 liegen. Außerdem sind die Aminosäuren 244-320 für die Bildung der diskontinuierlichen Epitope wichtig, die von den MAbs 2C8 und 4C1 erkannt werden, während die Aminosäuren 320-355 für die Bildung des diskontinuierlichen Epitops, das von MAb 136 erkannt wird, entscheidend sind.

IX.B.3. Sekretion der verkürzten gIV-Proteine

Um festzustellen, ob verkürzte Formen von gIV wirksam in das Medium sezerniert werden, wurden mit rekombinanten VVs infizierte LMTK&supmin;-Zellen 10 Stunden nach Beginn der Infektion mit [³&sup5;S]-Cystein-Methionin für 4-8 Stunden markiert. Die Zellkulturüberstände wurden mit polyclonalem Kaninchen-anti-gIV-Antiserum immunpräzipitiert. Die von rekombinanten VV STgIVd1 und VV STgIVd2 exprimierten Proteine wurden im Medium nachgewiesen, während Proteine, die bei oder stromaufwärts von Aminosäure 244 verkürzt waren (VV STgIVd3 bis VV STgIVd5), zu keinem Zeitpunkt im Medium nachgewiesen wurden. Dies legt nahe, daß die Aminosäuren 244-320 zur wirksamen Sekretion der verkürzten gIV- Moleküle erforderlich sind und bestätigte die frühere Beobachtung der Anmelder bezüglich der Lage der Transmembranankerdomäne zwischen den Aminosäuren 361 bis 389 (Tikoo et al., a. a. O. (1990)).

IX.C.1..

Eine Reihe von Strategien wurde angewendet, um die antigenen Stellen eines viralen Glykoproteins zu lokalisieren. Da die Induktion einer protektiven humoralen Immunantwort von der Konformation des gIV abhängig ist, erlaubte der Ansatz der Expression deletierter und verkürzter Formen von gIV in Säugerzellen durch rekombinante Vacciniaviren die Kartierung der Bindungsstellen verschiedener MAbs in gIV und die Untersuchung der Auswirkung dieser Mutationen auf die native Struktur des Glykoproteins (Fig. 16). Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um die funktionellen Domänen des Glykoproteins D von HSV-1 zu lokalisieren (Cohen et al., J. Virol. 62 (1988), 1932-1940).
Um die Gültigkeit dieses Ansatzes zu bestätigen, zeigte die Insertion des vollständigen gIV-Gens in das Vaccinavirus, daß von dem rekombinanten VV STgIV exprimiertes gIV ein antigenes Profil aufwies, das von dem nach einer Virusinfektion synthetisierten authentischen gIV nicht zu unterscheiden war (Hughes et al. (1988) und von Drunen Littel- van den Hurk et al., a. a. O. (1986)). Diese Ergebnisse bestätigen und erweitern die bereits für rekombinantes gIV, das in transfizierten Rinderzellen exprimiert wurde, beschriebenen Beobachtungen (Tikoo et al., a. a. O. (1990)).
Vier antigene Domänen von gIV wurden unter Verwendung einer Reihe von MAbs bereits identifiziert (Hughes et al. (1988) und von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1986)). Die Domäne I besteht aus zwei Epitopen: Epitop Ia ist ein kontinuierliches Epitop, das von MAb 9D6 erkannt wird, und Epitop Ib ist ein diskontinuierliches Epitop, das von MAb 136 erkannt wird. Die vorliegenden Ergebnisse deuten an, daß das Epitop Ia zwischen den Resten 164-216 lokalisiert ist, und daß ein Teil des Epitops Ib zwischen den Resten 320- 355 lokalisiert ist. Der zweite Teil des Epitops Ib ist stromaufwärts von Rest 245, möglicherweise stromaufwärts von Rest 216, aber stromabwärts von Rest 31 lokalisiert. Dieser Annahme liegt die Tatsache zugrunde, daß das rekombinante VV STgIVd7, das ein mutiertes Protein exprimiert, das die Reste 32-244 nicht aufweist, nicht von MAb 136 erkannt wird. Außerdem zeigen kompetitive Bindungsexperimente an, daß entweder diese zwei Epitope Aminosäuren gemeinsam haben oder daß sie in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander liegen (Hughes et al., a. a. O. (1988)).
Die Domäne II von gIV ist durch ein diskontinuierliches Epitop gekennzeichnet, das von MAb 3E7 erkannt wird. Dieses Epitop befindet sich stromaufwärts des Restes 320, und mindestens ein Teil des Epitops befindet sich stromaufwärts von Rest 245. Dieser Annahme liegen zwei Beobachtungen zugrunde. Erstens, falls sich die Bindungsstelle ganz aus Resten zwischen 245-320 zusammensetzt, sollte das von dem rekombinanten VV STgIVd7 exprimierte Protein von MAb 3E7 erkannt werden. Zweitens wird das Epitop durch die Zugabe von Reduktionsmitteln zerstört, und alle Cysteinreste, die möglicherweise zu einer Disulfidbindung beitragen könnten, befinden sich zwischen den Resten 74 bis 214.
Die Domäne III ist durch vier Epitope gekennzeichnet, wobei für drei von ihnen gezeigt wurde, daß sie diskontinuierlich sind (Hughes et al., a. a. O. (1988)). Die Analyse der von dem rekombinanten VV STgIVd2, VV STgIVd7 und VV STgIVd9 exprimierten mutierten Proteine zeigt an, daß die Bindungsstelle für MAb 10C2, der das kontinuierliche Epitop IIIa erkennt, in unmittelbarer Nachbarschaft zu den Aminosäuren 244 und 245 liegt. Die von den konformationsabhängigen MAbs 4C1, 2C8 bzw. 3C1 erkannten Epitope IIIb, IIIc und IIId befinden sich zwischen den Aminosäuren 19 bis 320.
Die Domäne IV ist durch ein kontinuierliches Epitop gekennzeichnet, das von dem nicht-neutralisierenden MAb 3D9S erkannt wird. Dieses Epitop wurde zwischen den Resten 320-355 kartiert.
Die Bildung von diskontinuierlichen Epitopen hängt von bestimmten Tertiärstrukturen von gIV ab, die zum Teil Disulfidbrücken einschließen. Die Beobachtung, daß die MAbs, die diskontinuierliche Epitope (die durch Reduktionsmittel zerstört werden) erkennen, mit den Resten 1-355 reagieren, legt nahe, daß dieses Polypeptid sein normales Disulfidbrückenmuster beibehält. Sechs der sieben innerhalb der Reste 75 bis 213 befindlichen gIV-Cysteinreste spielen wahrscheinlich bei der Struktur dieser diskontinuierlichen Epitope eine Rolle. Interessanterweise sind diese sechs Cysteinreste in allen bisher identifizierten gIV-Homologen gleich ausgerichtet (Tikoo et al., a. a. O. (1990)). Alle sechs Cysteinreste sind bei der intramolekularen Disulfidbrückenbildung in gD von HSV-1 beteiligt (Wilcox et al., J. Virol. 62 (1988), 1941-1947), was nahelegt, daß sie für die Struktur und die Funktion des Proteins wichtig sind (Long et al., J. Virol 64 (1990), 5542-5552). Das Cystein am Rest 376 befindet sich innerhalb der Transmembrandomäne von gIV und ist an der Bildung dieser Epitope nicht beteiligt, was anzeigt, daß dieses Cystein nicht an der intramolekularen Disulfidbindung in gIV beteiligt ist, die zum Erreichen der richtigen Tertiärstruktur erforderlich ist. Eine ähnliche Beobachtung wurde zuvor für das gD-Glykoprotein von HSV-1 gemacht (Wilcox et al., a. a. O. (1988)).
Frühere Studien haben das Vorhandensein von sowohl N-gebundenen als auch O-gebundenen Oligosacchariden in gIV gezeigt (von Drunen Littel-von den Hurk et al., a. a. O. (1986)). In BHV-1-infizierten Zellen werden die N-gebundenen Oligosaccharide aus mannosereichen Oligosacchariden, die auf Vorläufer-gIV (pgIV) vorliegen, zu komplexen Oligosacchariden des reifen gIVs prozessiert, das zur Oberfläche der infizierten Zelle transportiert und auch in die Virushülle eingebaut wird (Marshall et al., J. Virol. 57 (1986), 745-753 und von Drunen Littel-von den Hurk, a. a. O. (1986)). 24 Stunden nach der Infektion liegt der größte Teil des Proteins in der reifen Form vor. Eine im wesentlichen vergleichbare Transport- und Prozessierungskinetik wurde für das von VV STgIV produzierte rekombinante gIV beobachtet, was zeigt, daß VV ein annehmbarer Vektor zur Expression von BHV-1-Glykoproteinen ist.
Die Prozessierung und der Transport eines viralen Glykoproteins über den Exocytoseweg ist von seinen Konformations- und Struktursignalen abhängig, die die Lage von N-gebundenen Glykosylierungsstellen, die Position von Cysteinresten, die Disulfidbrücken bilden, die die Aneinanderlagerung von Resten auf dem Molekül begünstigen und zur Membraninsertion, Verankerung, lokalen Faltung von Monomeren und Bildung von Oligomeren erforderliche Aminosäurereste einschließen können (Guan et al., Cell 42 (1985), 489- 496; Kreis et al., Cell 46 (1986), 929-937; Rose et al., Ann. Rev. Cell Biol. 4 (1988), 257-288 und Wilcox et al., a. a. O. (1988)). Veränderungen eines beliebigen dieser Signale können die Prozessierung und/oder den Transport eines Glykoproteins beeinflussen. Die Ergebnisse dieser Studien deuten an, daß das Ausmaß der Prozessierung der genetisch veränderten gIV- Mutantenproteine mit dem Transport der Proteine zur Zelloberfläche bzw. in die Medien korreliert. Jedoch war der Verlust der Fähigkeit zur Bildung von diskontinuierlichen Epitopen nicht mit dem Verlust der Transportfähigkeit des Mutantenproteins zur Zelloberfläche bzw. in die Medien verbunden. Alle die Aminosäuren 245-320 enthaltenden Mutantenproteine (d1, d2, d7) wurden aus einem Vorläufer zu einem Produkt prozessiert, das Endo H resistente Oligosaccharide enthielt und waren auf der Oberfläche der Zelle lokalisiert oder wurden in das Medium sezerniert, wenn die Transmembranankersequenz auch deletiert war. Diese Ergebnisse legen nahe, daß diese Proteine die für die richtige Faltung, Prozessierung und folglich den Transport des Proteins zur Zelloberfläche notwendigen Signale beibehielten. Im Gegensatz dazu wurden alle Mutanten, die die Aminosäuren 245-320 nicht aufwiesen (d3, d4, d5, d6, d8, d9) nicht von dem Vorläufer in die Produktform prozessiert und nicht zur Zelloberfläche transportiert oder in das Medium sezerniert. Außerdem lagen praktisch alle Oligosaccharide in der mannosereichen Form vor, was andeutet, daß diese Mutantenproteine im endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten werden. In diesem Organell übernehmen membrangebundene und sekretorische Proteine mannosereiche Oligosaccharide, falten sich und oligomerisieren in vielen Fällen (Rose et al., a. a. O. (1988)). Im endoplasmatischen Retikulum werden sowohl falsch gefaltete als auch nicht zusammengelagerte Untereinheiten zurückgehalten und durch Wechselwirkungen mit dort vorkommenden Zellproteinen am weiteren Transport gehindert (Rose et al., a. a. O. (1988)). Die veränderte Prozessierung und der veränderte Transport der Mutanten, die die Aminosäuren 245-320 nicht aufweisen, könnte auf die falsche Faltung der Proteine zurückzuführen zu sein, jedoch konnten die Anmelder keine Proteinaggregation nachweisen (Daten nicht gezeigt), wie sie bei den anderen falsch gefalteten Proteinen beobachtet wurde (Wilcox et al., a. a. O. (1988)). Alternativ könnte eine Blockierung des Transports auf das Fehlen der innerhalb der Reste 245-320 vorkommenden erforderlichen Signale zurückzuführen sein. Vorläufige Studien deuten darauf hin, daß die O-gebundenen Oligosaccharide an in diesem Bereich lokalisierte Serin/Threoninreste gebunden sind (Tikoo et al., unveröffentlichte Daten). Es ist möglich, daß das Fehlen von entweder Aminosäuresequenz- oder Proteinmodifikationen, die in diesem Bereich vorkommen, für die beobachteten Wirkungen verantwortlich sein können.

X

X.A.

Tierversuche wurden mit dem vollständigen gIV (gIVA) und dem verkürzten gIV (TgIVA) durchgeführt, und die Ergebnisse wurden gemäß der vorstehenden Beschreibung in VII analysiert.

X.B. Ergebnisse

Die Analyse der von den geimpften Tieren erhaltenen Serumproben zeigte, daß sowohl das vollständige gIV (gIV) als auch das verkürzte gIV (TgIV), die wie vorstehend in XI hergestellt wurden, bei der Bestimmung durch einen ELISA und Plaque-Reduktionstests starke Immunantworten hervorriefen, wie nachstehend in den Tabellen 5 und 6 gezeigt ist. Bezeichnenderweise enthalten Nasensekrete auch neutralisierende Antikörper, wie nachstehend in Tabelle 6 angegeben ist. Die klinische Untersuchung deutete darauf hin, daß gIV und TgIV die Virusausscheidung und die Krankheitstage signifikant verringerten. Die Placebo-Tiere erlagen in jedem Fall einer BHV-1-Infektion, wie durch die herkömmliche Virusausscheidung (Fig. 13) und die länger anhaltende Krankheit (Fig. 14) gezeigt wurde. Tabelle 5: ELISA-Test Tabelle 6

XI

XI.A. BHV-1-DNA-Immunisierungs-Teil

XI.A.1. Reagensherstellung

Plasmid-DNA wurde durch Züchten des E. coli-Stamms Hb101 hergestellt, der mit pRSO (Fitzpatrick D.R. et al., Journal of Virology 62 (1988), 4239-4248) und pRSgIV (Tikoo S.K. et al., Journal of Virology 64 (1990), 5132-5142) transformiert worden war. Die Plasmid-DNA wurde extrahiert und in CsCI-Gradienten gereinigt, gefolgt von einer Dialyse gegen destilliertes Wasser und einer Ethanolpräzipitation. Das gereinigte Plasmid wurde in 0,85%iger Salzlösung solubilisiert.

XI.A.1.2. Impfung

Die Plasmid-DNA wurde durch intramuskuläre Injektion in vier Stellen in die Hinterhand von Hereford-Kälbern verabreicht. Das Volumen der Injektionen betrug 2 ml, wobei das Plasmid in einer Konzentration von 62,5 ug/ml vorlag. In regelmäßigen Abständen wurde venöses Blut entnommen; die Anwesenheit von BHV-1-gIV-spezifischen IgG-Antikörpern wurde mittels ELISA, Western-Blots und Neutralisierungstests bestimmt.

XI.B. Ergebnisse

Durch Western-Blots wurde eine gIV-Gen-spezifische Immunantwort nachgewiesen, und es wurden IgG-ELISA-Titer von 3200 erzielt. Plaque-Reduktionstests zeigen Serum-Neutralisierungstiter von Werten um 48 an (ein Titer von 16 korreliert sehr gut mit einem Schutz vor der Krankheit).

XII

Verwendung von rekombinanten BHV-1-Proteinen für diagnostische Zwecke.

XII.A.

Die rekombinanten gI-, gIII- oder gIV-Proteine von BHV-1 können als Antigene in immunologischen Standardtests, zum Beispiel ELISA-Tests, zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern gegen BHV-1 verwendet werden. Auf diese Weise kann der immunologi sche Status eines Tieres im Hinblick auf eine vorliegende Infektion oder eine Prädisposition für BHV-1 beurteilt werden.
Die rekombinanten gI-, gIII- oder gIV-Proteine wurden in Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt und zum Beschichten der Vertiefungen einer ELISA-Platte in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 1 ug Protein/Vertiefung verwendet. Nach einer mindestens einstündigen Inkubation wurden die Platten gewaschen und Verdünnungen von Tierseren in einer seriellen Weise zu der Platte gegeben. Die Entwicklung des ELISA wurde fortgeführt, wie in Beispiel X beschrieben ist.

XII.B.

Die entwickelte ELISA-Platte zeigte an, daß mit BHV-1 infizierte Tiere nachweisbare Mengen von Antiseren aufwiesen, die für gI, gIII oder gIV spezifisch waren, und daß jedes dieser rekombinanten BHV-1-Proteine zur Verwendung bei der Diagnose einer BHV-1- Infektion geeignet wäre.

Hinterlegung der biologischen Materialien

Die folgenden Materialien wurden oder werden falls erforderlich bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, während der Anhängigkeit dieser Anmeldung hinterlegt. Diese Hinterlegungen werden unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die Hinterlegung von Mikroorganismen aufrechterhalten. Die Nucleotidsequenzen der hinterlegten Materialien sind hier unter Bezugnahme eingeschlossen, sowie die dadurch codierten Sequenzen von Polypeptiden. Im Falle einer Diskrepanz zwischen einer hier ausdrücklich offenbarten Sequenz und einer hinterlegten Sequenz, ist die hinterlegte Sequenz maßgeblich. Die Hinterlegung der Sequenz stellt keine Erteilung einer Lizenz zur Herstellung, Verwendung oder zum Verkauf irgendeines der hinterlegten Materialien dar.
Obwohl die vorliegende Erfindung vorstehend durch bestimmte spezifische Ausführungsformen veranschaulicht wurde, ist nicht beabsichtigt, daß die spezifischen Beispiele den Schutzumfang der Erfindung, wie er in den beigefügten Patentansprüchen beschrieben ist, begrenzen sollen.

Claims

1. Rekombinantes Untereinheiten-Antigen, das ein Protein umfaßt, das entweder ein verkürztes gIV-Protein des Rinderherpesvirus Typ 1 (BHV-1) ist oder ein Protein, das eine der durch das gIV-Protein von BHV-1 hervorgerufenen Immunantwort äquivalente Immunantwort hervorrufen kann und zu mindestens 85% zu dem verkürzten Protein homolog ist, wobei das Protein sezernierbar ist und mindestens ein Polypeptid-neutralisierendes Epitop, nicht aber die gIV-Transmembranankersequenz aufweist.

2. Rekombinantes Antigen nach Anspruch 1, das das Protein in Verknüpfung mit einer anderen BHV Typ 1-Untereinheiten-Antigensequenz umfaßt.

3. Rekombinantes Antigen nach Anspruch 1, wobei das Protein die verkürzte Form von gIV ist, die als dI (Aminosäuren 1-355) oder als d2 (1-320) dargestellt ist.

4. Impfstoffzusammensetzung, die mindestens ein rekombinantes Untereinheiten-Antigen nach einem der vorstehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

5. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 4, die weiterhin eine oder mehrere antigene Determinanten von gI, gIII oder eines zweiten gIV von BHV-1 umfaßt.

6. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, die weiterhin eine oder mehrere andere antigene Determinanten eines zweiten (jedoch unterschiedlichen) gIV von BHV-1 umfaßt.

7. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, die weiterhin ein Adjuvans umfaßt.

8. Nucleotidsequenz, die ein rekombinantes Untereinheiten- Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.

9. Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 8, die ein Antigen mit der fortlaufenden Aminosäuresequenz 1 bis 355 von gIV von BHV-1 umfaßt, die aber die 62 Aminosäuren lange Sequenz am Carboxyterminus (die die Transmembranankersequenz einschließt) nicht aufweist.

10. DNA-Konstrukt, das eine folgende Bestandteile umfassende Expressionskassette umfaßt:

(a) eine DNA-Sequenz, die ein rekombinantes Untereinheiten-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert; und

(b) Kontrollsequenzen, die funktionell mit der codierenden Sequenz verbunden sind und ihre Transkription und Translation in einer Wirtszelle erlauben, wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen zu der codierenden Sequenz heterolog ist.

11. DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen ein Stoppcodon im Leserahmen unmittelbar vor dem mutmaßlichen Transmembranbereich des reifen Polypeptids ist.

12. Virus, das ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 10 oder 11 enthält.

13. Virus nach Anspruch 12, das ein rekombinantes Vacciniavirus, Baculovirus oder Adenovirus ist.

14. Wirt, der stabil mit einem DNA-Konstrukt nach Anspruch 10 oder 11 oder einem Virus nach Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.

15. Wirt nach Anspruch 14, der ein Prokaryont, gegebenenfalls E. coli, ist.

16. Wirt nach Anspruch 14, der ein Eukaryont ist.

17. Wirt nach Anspruch 16, wobei der Eukaryont eine Insekten- oder Säugerzelle ist.

18. Wirt nach Anspruch 17, wobei die Säugerzelle mit einem rekombinanten Adenovirusvektor, einem rekombinanten Roussarkom-Virusvektor oder einem rekombinanten Affenvirusvektor transformiert ist.

19. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Untereinheiten-Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Bereitstellung einer Population von Wirten, die Zellen nach Anspruch 17 oder 18 sind;

(b) Züchtung der Population der Zellen unter Bedingungen, unter denen das von der Expressionskassette codierte Antigen exprimiert und sezerniert wird; und

(c) gegebenenfalls Gewinnung des verkürzten gIV-Polypeptids von BHV-1 aus den Wachstumsmedien.

20. Rekombinantes Untereinheiten-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von oder zur Vorbeugung vor einer Infektion in einem Rind durch Therapie.

21. Verwendung eines rekombinanten Untereinheiten-Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von oder Vorbeugung vor einer BHV-1-Infektion in einem Rind.

22. Verwendung eines rekombinanten Untereinheiten-Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und eines Impfstoffs gegen eine zweite bakterielle oder virale Infektion zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen Behandlung von oder zur gleichzeitigen Vorbeugung vor einer BHV-1-Infektion und einer zweiten bakteriellen oder viralen Infektion in einem Rind.

23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei die zweite Infektion durch Pasteurella haemolytica oder Haemophilus somnus, Parainfluenzavirus, Coronavirus, Rotavirus, Adenovirus, respiratorisches Syncytialvirus vom Rind oder Diarrhoeavirus vom Rind ("bovine diarrhoea virus") verursacht wird.