CN1324139C

CN1324139C - 疫苗

Info

Publication number: CN1324139C
Application number: CNB97199045XA
Authority: CN
Inventors: C·帕丘克; K·赫罗尔德
Original assignee: AMERICAN HOUSEHOLD UTILITIES Inc; AMERICAN HOUSEHOLD UTILITIES I
Current assignee: AMERICAN HOUSEHOLD UTILITIES Inc; AMERICAN HOUSEHOLD UTILITIES I
Priority date: 1996-10-23
Filing date: 1997-10-23
Publication date: 2007-07-04
Anticipated expiration: 2017-10-23
Also published as: CN1242053A

Abstract

揭示了保护性和治疗性疫苗。揭示了用于预防或治疗单纯疱疹病毒感染的疫苗。揭示了预防单纯疱疹病毒感染的方法和治疗受单纯疱疹病毒感染的个体的方法，以及制备单纯疱疹病毒的预防性和治疗性疫苗的组合物和方法。

Description

疫苗

发明领域

本发明涉及保护治疗性疫苗，包括单纯疱疹病毒疫苗，涉及预防单纯疱疹病毒感染并治疗受单纯疱疹病毒感染的个体的方法，以及涉及制备单纯疱疹病毒的预防性和治疗性疫苗的组合物和制备方法。

发明背景

单纯疱疹病毒(HSV)包括单纯疱疹病毒1型(HSV1)和单纯疱疹病毒2型(HSV2)，它们严重影响了受病毒感染和未受感染人的健康。人们已经作了大量努力来确定有效的治疗组合物和缓解症状、减少或消除潜伏病毒由于生殖或口腔组织溃疡而激活并显示在存在的方法。另外，预防未感染个体受感染的疫苗也正在开发中。一类正在开发的疫苗是含有纯化的糖蛋白D(gD)的亚单位疫苗。gD蛋白可从HSV-1(gD-1)或HSV-2(gD-2)衍生获得。

尽管这些治疗性组合物和疫苗可以提供一些好处，但是，仍然需要有效的组合物以及免疫接种个体的方法以预防HSV感染和治疗受HSV感染个体。还需要这类预防性和治疗性疫苗的组合物及其制备方法。

发明概述

本发明涉及包括HSV2 gD2在内的分离的单纯疱疹病毒，以及该基因的修饰形式。HSV2 gD2的修饰形式包括缺少功能性跨膜区和/或功能性信号肽的那些形式。

本发明涉及包含编码HSV2 gD2或其修饰形式的核苷酸序列的质粒，该核苷酸序列与在真核细胞表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及一种诱导个体内HSV2 gD2免疫应答的方法，该方法包括向个体给予一种质粒的步骤，该质粒包含编码HSV2 gD2或其修饰形式的核苷酸序列，该核苷酸序列与在真核细胞表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及一种治疗受HSV感染个体的方法，该方法包括向个体给予一种质粒的步骤，该质粒包含编码HSV2 gD2或其修饰形式的核苷酸序列，该核苷酸序列与在真核细胞表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及一种预防个体受HSV感染的方法，该方法包括使用编码HSV2gD2或其修饰形式的核苷酸序列，该核苷酸序列与在真核细胞表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及一种DNA疫苗，该疫苗包括编码HSV2 gD2或其修饰形式的核苷酸序列，该核苷酸序列与在真核细胞中表达所需的调控元件操作性相连。在一些实例中，疫苗包含包的质粒含有括编码HSV2 gD2或其修饰形式的核苷酸序列。在一些实例中，疫苗是易化(facilitatde)的DNA疫苗，它还包含多核苷酸功能增强子或其它易化组分。

附图简述

图1A-1D表示gD构建物。

图2表示Genbank中的HSV gD的序列。

图3A-3E表示各种插入物和HSV gD2编码序列中有gD2缺失的质粒。

图4显示抗体的同型。用标准ELISA测定79天时的IgG1和IgG2A gD2特异性抗体的相对水平。

图5A-5E显示了免疫接种后小鼠脾细胞的淋巴增殖反应。将40μgDNA免疫接种的小鼠的105全脾细胞与每孔20ng gD2一起培养。培育4天后，加1μCi-3H胸苷培育细胞18小时。然后测定3H胸苷摄取来衡量淋巴增殖情况。

图6显示了本发明的构建物。

发明详述

本发明涉及改进的DNA疫苗和疫苗方案，以及疫苗组合物及其制备方法。本发明涉及改进的抗HSV的DNA疫苗和疫苗方案，以及疫苗组合物及其制备方法。本发明提供了可掺入疫苗的HSV2 gD2 cDNA。另外，本发明提供了可掺入疫苗的修饰的HSV2 gD2的编码序列。在一些实例中，修饰的HSV gD2缺乏功能性信号肽。在一些实例中，修饰的HSV gD2缺少功能性跨膜区(TMR)。在一些实例中，经修饰的HSV gD2缺乏功能性信号肽和功能性跨膜区。

野生型或全长构建物含有将gD多肽指向使其糖基化的胞质内质网的信号肽。它通过分泌途径移动到细胞表面，并凭借跨膜区(TMR)(靠近C端的疏水区)与表面膜保持相联。

构建TMR缺失的gD的目的是使其从细胞中分泌出来，被抗原呈递细胞获得，并增强对gD的体液应答。还可增强细胞应答。我们已经证实，转染了该构建物的细胞可将其分泌到培养基中，且没有检测到gD与细胞膜相联。

构建信号肽缺失的gD，可使其局限于细胞质中并可能发生错折叠。这就使得更多的gD被运送到蛋白酶体，从而使更多的gD衍生肽能与MHC I类分子复合。这加强了对gD的细胞应答。有两种信号肽缺失型构建物。一种有TMR而另一种则没有。预计两种蛋白均局限于细胞质中，但是由于它们的疏水性不同，它们在细胞质中的分布可能不同。

我们已经证实，转染了这些构建物的细胞所表达的gD局限于细胞质中。没有检测到gD与细胞膜相联，且在转染细胞的培养基中也没有检测到gD。根据表达的gD的分子量来看，它显示出未经糖基化。

图1A显示了HSV gD2蛋白。在一些实例中，疫苗中包括了受调控序列控制的编码该蛋白的核苷酸序列。在一些较佳的实例中，疫苗是DNA疫苗。

图1B显示了有TMR缺失的HSV2 gD2蛋白。在一些实例中，整个TMR是缺失的。在一些实例中，TMR功能由于大部分TMR编码序列缺失而受到抑制。在一些实例中，疫苗中包括了受调控序列控制的编码该蛋白的核苷酸序列。在一些较佳的实例中，疫苗是DNA疫苗。

图1C显示了信号肽缺失的HSV2 gD2蛋白。在一些实例中，整个信号肽是缺失的。在一些实例中，信号肽功能由于大部分信号肽编码序列缺失而受到抑制。在一些实例中，疫苗中包括了受调控序列控制的编码该蛋白的核苷酸序列。在一些较佳的实例中，疫苗是DNA疫苗。

图1D显示了TMR缺失和信号肽缺失的HSV gD2蛋白。在一些实例中，整个TMR是缺失的。在一些实例中，TMR功能由于大部分TMR编码序列缺失而受到抑制。在一些实例中，整个信号肽是缺失的。在一些实例中，信号肽功能由于大部分信号肽编码序列缺失而受到抑制。在一些实例中，疫苗中包括了受调控序列控制的编码该蛋白的核苷酸序列。在一些较佳的实例中，疫苗是DNA疫苗。

图4和5A-5E的数据表明，通过除去HSV gD蛋白的TMR，可以使IgG抗体同型从IgG2a变为IgG1。认为这一变化是表示从主要是TH1应答变为主要是TH2应答，或从细胞应答变为抗体应答的代表性标记。因此，预计细胞释放的细胞因子也将不同。

通过正常固定在膜上的蛋白(如其它疱疹病毒HSV1、HSV2、EBV、CMV、HZV的包膜蛋白)的TMR或膜结合区编码序列的缺失或突变，可获得类似效果。该病毒清单只是部分病毒的清单，本领域普通技术人员很容易选择其它病毒来实施本发明。另外，可采用的其它蛋白包括细胞包膜相联蛋白。同样，通过TMR或其它膜保留信号的除去或缺失，可使进入分泌途径但含有其它膜保留信号(如其它病毒的内质保留信号)的蛋白以及与细胞包膜相联的宿主细胞蛋白分泌。此外，通过加入信号肽和除去膜或细胞区室定位信号，可将细胞或病毒编码的非细胞包膜相联蛋白设计成可分泌性蛋白。

要实现向主要是TH2应答转变的分泌(指膜相联蛋白的分泌)，需要对构建物作下列改变：

1)除去或突变TMR或膜结合区；

2)加入信号或前导序列；

3)共同表达蛋白酶，此酶可在加入的位点处断裂膜结合区；

4)加入可自身断裂的intein编码序列。intein编码序列插入基因中的方式应导致断裂，而此断裂能将TMR与其余基因分开。这样，就可以维持含有免疫表位的TMR蛋白表达，并且使TMR不具有将蛋白固定在细胞包膜上的功能。

如果希望将蛋白保留在细胞内，则可除去信号或前导序列，或者，如果希望使其特异性靶向ER(内质网)，则可以加入ER保留信号和分泌性肽的序列。

从主要为Th1型变为主要为Th2型的免疫应答的能力使我们可以设计出改进的疫苗方案。在一些实例中，可将初次和可能的第一次加强接种设计成产生Th1应答。第一次加强或随后的加强接种则可设计成促进Th2应答，从而赋予疫苗接受者改进的保护力。

在一些较佳的实例中，图1A-1D中描述的构建物被掺入DNA疫苗中。DNA疫苗在美国专利No.5,589,466和美国专利No.5,593,971、PCT/US90/01515、PCT/US93/02338、PVT/US93/048131、PCT/US93/00899及其中引用的在先申请、美国申请号08/642,045(1996年5月6日提交)中有所描述，这些文献均纳入本文作参考。除了上述申请中描述的递送方案外，美国专利No.4,945,050和5,036,006中还描述了另一种递送DNA的方法，这两篇文献也纳入本文作参考。

采用DNA疫苗技术，将包括了如图1A-1D所述的与基因表达所需调控元件操作性相连的编码序列的质粒DNA给予个体。个体细胞摄取了质粒DNA并表达编码序列。如此产生的抗原成为免疫应答针对的靶。针对抗原的免疫应答为个体抵御HSV提供了预防或治疗效果。

DNA疫苗包括裸疫苗和易化疫苗。另外，它们还可通过各种方法(包括几种用来给予组织制剂的不同装置)来给药。已出版的文献中有几篇综述文章，它们描述了DNA疫苗技术，并引述了采用该技术获得的许多报道的结果。下列综述文章以及每篇中引用的每篇讨论DNA疫苗技术的参考文献均纳入本文作参考：McDonnel W.M.和F.K.Askari 1996 New Engl.J.Med.334(1)42-45；Robinson，A.1995 Can.Med.Assoc.J.152(10)：1629-1632；Fynan，E.F.等，1995 Int.J.Immunopharmac.17(2)79-83；Pardoll，D.M.和A.M.Beckerleg 1995 Immunity3：165-169；和Spooner等，1995 Gene Therapy 2：173-180。

根据本发明，将图1A-1D中描述的插入物的编码序列插入质粒中，然后将该质粒用于疫苗组合物中。

本文所用的术语“插入物”指编码图1A-1D所述gD2蛋白的核苷酸序列，它包括编码具有无功能性TMR和/或无功能性信号肽的gD2蛋白的核苷酸序列。

本文所用的术语“基因构建物”指包含了插入物的质粒，该插入物与它在真核细胞中表达所需的调控元件操作性相连。DNA表达的调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。另外，基因构建物中还可包括其它元件，如Kozak区。起动和终止信号是所需的调控元件，它们通常被认为是编码序列的一部分。本发明的基因构建物的编码序列包括功能性起动和终止信号。

本发明涉及将基因物质导入个体细胞中以诱导抗HSV免疫应答的方法。该方法包括向所述个体的组织给予DNA的步骤，该DNA包括如图1A-1D所示的插入物的编码序列，该编码序列与表达所需的调控元件操作性相连。

本发明提供了用作DNA疫苗的基因构建物，该构建物包括如图1A-1D所示的那些插入物的编码序列。

在一些实例中，用Watson等1983 Gene 26：307-312(纳入本文作参考)中报道的cDNA来构建插入物。序列公开在Genbank登录号K01408中，其纳入本文作参考，并显示在图2中。Watson克隆的编码序列是268-1449。编码信号肽的序列包括268-342。TMR由1249-1446编码。

在一些实例中，插入物包括整个编码序列。在一些实例中，插入物由整个编码序列组成。

在一些实例中，插入物包括整个编码序列，只是有一个读框移位、缺失或插入使得信号肽不可操纵，而对蛋白的其余部分却没有影响。在一些实例中，编码信号肽的序列缺失，且插入物包含其余的编码序列。在一些实例中，插入物并没有包括编码信号肽的全部序列，例如只包括核苷酸287-1449、297-1449、307-1449、317-1449、327-1449和337-1449的插入物。

在一些实例中，插入物包括整个编码序列，只是有一个读框移位、缺失或插入使得TMR不可操纵，而对蛋白的其余部分却没有影响。在一些实例中，编码TMR的序列缺失，且插入物包含其余的编码序列。在一些实例中，插入物不包括编码TMR的全部序列，例如只包括核苷酸268-1426、268-1406、268-1386、268-1366、268-1346、268-1326、268-1306、268-1286、268-1266和268-1246的插入物。

在一些实例中，插入物包括整个编码序列，只是有一个读框移位、缺失或插入使得信号肽不可操纵，一个读框移位、缺失或插入使得TMR不可操纵，而对蛋白的其余部分却没有影响。在一些实例中，编码信号肽的序列缺失，且插入物包含具有缺失或不可操纵TMR的其余编码序列。在一些实例中，编码TMR的序列缺失，且插入物包含具有缺失或不可操纵信号肽的其余编码序列。在一些例子中，编码信号肽和TMR的序列缺失。在一些实例中，插入物由核苷酸278-1426、288-1386、298-1306、298-1346、318-1266、328-1246和342-1248组成。

在一些实例中，插入物被插入PCT/US94/00899(1994年1月26日提交，1994年8月4日公开，WO94/16737，该文内容纳入本文作参考)中所述的质粒中。在一些实例中，插入物被插入美国专利申请号08/642,045(1996年5月6日提交，该文内容纳入本文作参考)中所述的质粒中。

根据本发明，提供了对个体进行预防性和/或治疗性免疫接种以抵御HSV(包括HSV1和HSV2，尤其是HSV2)的组合物和方法。基因物质(即插入物)编码了靶蛋白(即gD2)，带有或不带有功能性信号肽和/或TMR。此基因物质由个体细胞表达，其作用是引发免疫应答的免疫原性靶。

本发明可用来引发针对HSV2 gD2蛋白的免疫应答。引发的免疫应答可与HSV1 gD1蛋白交叉反应。本发明可用来对个体免疫接种以抵御HSV(尤其是HSV2)，这样，针对HSV2 gD2的免疫应答就提供了抗HSV的保护性免疫力。通过引发指向表达病毒蛋白的受感染细胞的抗HSV gD2免疫应答，本发明可用来与受感染个体内的HSV作斗争。

根据本发明，编码未经修饰或经修饰的HSV2 gD2蛋白的DNA与调控元件操作性相连。DNA表达的调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。另外，基因构建物中还可包括其它元件，如Kozak区。

本文所用的术语“可表达形式”指基因构建物含有与插入物操作性相连的必需的调控元件，这样当构建物存在个体细胞内时，插入物可被表达。

当基因构建物被细胞摄取后，可以作为功能性染色体外分子存在于细胞内和/或整合入细胞染色体DNA中。DNA可以导入细胞内，在细胞内DNA以质粒形式的分开的遗传物质，或作为质粒而存留。或者，可将须整合入染色体的线性DNA导入细胞内。当将DNA导入细胞内后，可以加入促进DNA整合入染色体的试剂。DNA分子中还可包括用来促进整合的DNA序列。或者，可给予细胞RNA。也可考虑提供线性微型染色体形式的基因构建物，该微型染色体包括着丝粒、端粒和复制起始点。基因构建物可保留减毒活微生物或存活于细胞中的重组微生物载体的部分遗传物质。当此遗传物质整合入细胞染色体中或保留在染色体外时，基因构建物可以是重组病毒疫苗基因组的一部分。

基因构建物包括核酸分子基因表达所需的调控元件。该元件包括：一个启动子、一个起始密码子、一个终止密码子和一个聚腺苷酸化信号。另外，编码免疫原性靶蛋白的序列的基因表达通常需要增强子。这些元件必须与编码所需蛋白的序列操作性相连，且这些调控元件必须在所给予的个体中可操纵。

起始密码子和终止密码子通常被认为是编码免疫原性靶蛋白的核苷酸序列的一部分。然而，这些元件必须在给予基因构建物的个体内具有功能。起始密码子和终止密码子必须位于编码序列的读框内。

采用的启动子和聚腺苷酸化信号必须在个体细胞内具有功能。

用于实施本发明、尤其是人用基因疫苗生产中的启动子例子包括(但不局限于)来自猴病毒40(SV40)、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)(如HIV长末端重复序列(LTR)启动子)、Moloney病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)(如CMV立即早期启动子)、EB病毒(EBV)、Rous肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及来自人基因(如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白)的启动子。

用于实施本发明、尤其是人用基因疫苗生产中的聚腺苷酸化信号例子包括(但不局限于)SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。特别是，采用了在pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego CA)中的SV40聚腺苷酸化信号(称为SV40聚腺苷酸化信号)。

除了DNA表达所需的调控元件外，DNA分子还可包括其它元件。这类附加的元件包括增强子。增强子可以选自(但不局限于)：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸的增强子和病毒的增强子，如CMV、RSV和EBV的那些增强子。

可向基因构建物提供哺乳动物复制起始点，以使构建物保持在染色体外，并在细胞内产生多拷贝构建物。来自Invitrogen(San Diego，CA)的质粒pCEP4和pREP4含有EB病毒的复制起始点和产生高拷贝游离型复制而非整合的核抗原EBNA-1编码区。

如果出于任何原因，希望消除接受基因构建物的细胞，则可加入附加的元件作为细胞破坏的靶。基因构建物中可包括可表达形式的疱疹胸苷激酶(tK)基因。可将药物9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤给予个体，该药物将导致选择性地杀死产生tK的任何细胞，从而提供了选择性破坏具有基因构建物的细胞的方法。

为了使蛋白生产最大化，可以选择最适合于在给予构建物的细胞中表达基因的调控序列。而且，可以选择在细胞内最有效转录的密码子。本领域普通技术人员可产生在细胞内有功能的DNA构建物。

本发明的方法包括将核酸分子给予个体组织的步骤。在一些较佳的实例中，核酸分子是经肌内、鼻内、腹膜内、皮下、真皮内、或局部、或通过灌洗来给予鞘、直肠、尿道、颊和舌下的粘膜组织。

在一些实例中，将核酸分子与易化剂给药结合递送给细胞。易化剂也指多核苷酸功能增强子或基因疫苗易化剂。易化剂在美国专利申请08/008,342(1993年1月26日提交)、美国专利申请08/029,336(1993年3月11日提交)、美国专利申请08/125,012(1993年9月21日提交)、国际专利申请No.PCT/US95/00899(1994年1月26日提交)中有所描述，这些内容均纳入本文作参考。此外，PCT专利申请No.PCT/US95/04071(1995年3月30日提交)中也描述了易化剂，该文内容纳入本文作参考。与核酸分子结合给药的易化剂可以与核酸分子的混合物形式给药，或者单独地在给予核酸分子前后或同时给药。另外，能起转染剂和/或复制剂和/或炎性剂作用的、且可以与或不与易化剂共同给药的其它试剂包括生长因子、细胞因子和淋巴因子，如干扰素、γ干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、GC-SF、GM-CSF、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和B7.2以及成纤维细胞生长因子、表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、Freund不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A(MPL))、胞壁酰肽、醌类似物和泡囊(如鲨烯)，另外，透明质酸也可与基因构建物结合给药。

在一些较佳的实例中，本发明的基因构建物与选自苯甲酸酯、酰苯胺、脒、氨基甲酸乙酯及其盐酸盐(如局部麻醉剂家族的那些试剂)的易化剂结合给药。

在一些较佳的实例中，易化剂可以是有下式之一的化合物：

Ar-R¹-O-R²-R³或

Ar-N-R¹-R²-R³或

R⁴-N-R⁵-R⁶或

R⁴-O-R¹-N-R⁷，

其中：

Ar是苯、对氨基苯、间氨基苯、邻氨基苯、取代的苯、取代的对氨基苯、取代的间氨基苯、取代的邻氨基苯、其中氨基苯化合物中的氨基是氨基、C₁-C₅烷基胺、C₁-C₅，C₁-C₅二烷基胺，取代的化合物中的取代基是卤素、C₁-C₅烷基和C₁-C₅烷氧基；

R¹是C＝O；

R²是C₁-C₁₀烷基，包括支链烷基；

R³是氢、胺、C₁-C₅烷基胺、C₁-C₅，C₁-C₅二烷基胺；

R²+R³可以形成环烷基，C₁-C₁₀烷基取代的环烷基、环脂族胺、C₁-C₁₀烷基取代的环脂族胺、杂环、C₁-C₁₀烷基取代的杂环，包括C₁-C₁₀烷基N-取代的杂环；

R⁴是Ar，R²或C₁-C₅烷氧基、环烷基、C₁-C₁₀烷基取代的环烷基、环脂族胺、C₁-C₁₀烷基取代的环脂族胺、杂环、C₁-C₁₀烷基取代的杂环和C₁-C₁₀烷氧基取代的杂环，包括C₁-C₁₀烷基N-取代的杂环；

R⁵是C＝NH；

R⁶是Ar，R²或C₁-C₅烷氧基、环烷基、C₁-C₁₀烷基取代的环烷基、环脂族胺、C₁-C₁₀烷基取代的环脂族胺、杂环、C₁-C₁₀烷基取代的杂环和C₁-C₁₀烷氧基取代的杂环，包括C₁-C₁₀烷基N-取代的杂环；和

R⁷是Ar，R²或C₁-C₅烷氧基、环烷基、C₁-C₁₀烷基取代的环烷基、环脂族胺、C₁-C₁₀烷基取代的环脂族胺、杂环、C₁-C₁₀烷基取代的杂环和C₁-C₁₀烷氧基取代的杂环和C₁-C₁₀烷氧基取代的杂环(包括C₁-C₁₀烷基N-取代的杂环)。

酯的例子包括：苯甲酸酯，如哌吡卡因、甲丙卡因和异布卡因；对氨基苯甲酸酯，如普鲁卡因、四卡因、丁乙胺、丙氧卡因和氯普鲁卡因；间氨基苯甲酸酯，包括间莫诺卡因(metabuthamine)和间丁氧卡因；和邻乙氧基苯甲酸酯，如邻乙氧卡因。酰苯胺的例子包括利多卡因、衣铁卡因、卡波卡因、丁哌卡因、吡咯卡因和丙胺卡因。这些化合物的其它例子包括辛可卡因、苯佐卡因、达克罗宁、普莫卡因、丙美卡因、布他卡因、奥布卡因、卡布卡因(carbocaine)、甲基布比卡因、布他星苦味酸盐(butasin picrate)、非那卡因、第奥散(diothan)、鲁卡因(luccaine)、吲卡因(intracaine)、努普卡因(nupercaine)、美布卡卡因、匹多卡因、二苯胺和植物衍生的双环物如可卡因、西那莫卡因(cinnamoylcocaine)、特鲁西啉(truxilline)和古柯乙烯(cocaethylene)和所有这些化合物与盐酸盐的复合物。

在较佳的实例中，易化剂是丁哌卡因。丁哌卡因与卡波卡因间的差别是丁哌卡因的N丁基代替了卡玻卡因的N甲基。该N处可有C1-C10的化合物。化合物可用卤素来替代，如普鲁卡因和氯普鲁卡因。酰苯胺是较佳的。

易化剂可在给予基因构建前后或同时给予。易化剂和基因构建物可配制入同一组合物中。

丁哌卡因-HCI在化学上命名为2-哌啶羧酰胺、1-丁基-N-(2，6-二甲基苯基)-单盐酸盐，一水合物，它可从商业上多种途径获得用于药物用途，包括从AstraPharmaceutical Products Inc.(Westboro，MA)和Sanofi Winthrop Pharmaceuticals(New York，NY)Eastman Kodak(Rochester，NY)购得。在商业上，丁哌卡因与和不与羟苯甲酸甲酯、与和不与肾上腺素一起配制。这些制剂均可采用。商业上购得用于药物用途的浓度为0.25％、0.5％和0.75％，这些浓度可用于本发明中。如果需要，可以配制能诱导所需效果的其它浓度，尤其是0.05-0.1％间的浓度。根据本发明，可给予约250μg至10mg的丁哌卡因。在一些实例中，给予了约250μg至约7.5mg。在一些实例中，给予了约0.05mg至约5.0mg。在一些实例中，给予了约0.5mg至约3.0mg。在一些实例中，给予了约5至50μg。例如，在一些实例中，在给予疫苗前后或同时，在疫苗接种相同部位处给予50μl至约2ml(较佳的为50μl至约1500μl，更佳的为大约1ml)0.25-0.50％丁哌卡因盐酸和0.1％羟苯甲酸甲酯的等渗药学载体。同样，在一些实例中，在给予疫苗前后或同时，在疫苗接种相同部位处给予50μl至约2ml(较佳的为50μl至约1500μl，更佳的为大约1ml)0.25-0.50％丁哌卡因盐酸盐的等渗药学载体，丁哌卡因和其它所有类似的活性化合物，尤其是局部麻醉要相关家族的那些化合物，它们的给药浓度为细胞摄取基因构建物提供了所需的易化。

在本发明的一些实例中，在给予基因构建物前，首先对个体注射给予易化剂。即，在给予基因构建物前一周至10天时，首先将易化剂注射给个体。在一些实例中，在给予基因构建物之前或之后，给个体注射易化剂1至5天，在一些实例中为注射24小时。或者，既然使用，易化剂可在给予基因构建物同时、数分钟之前或之后给予。因此，易化剂和基因构建物可以组合成单一的药物组合物。

在一些实例中，可给予基因构建物而不给予易化剂，即制剂中不含易化剂，采用基因构建物不与易化剂结合给药的给药方法。

单纯疱疹病毒2型糖蛋白D(gD)基因编码了与病毒包膜和受感染细胞质膜相联的糖蛋白。gD编码的信号肽将新生多肽转运到内质网腔中，新生多肽在内质网腔中进入分泌途径并被糖基化和折叠。蛋白通过疏水C-端区域(称为跨膜区或TMR)与质膜保持相联。

用表达单纯疱疹病毒2型糖蛋白D基因的质粒进行DNA免疫接种，在几个动物模型中显示能诱导体液和细胞免疫应答。在小鼠中，发现由最初的gD表达质粒产生的免疫应答主要是TH1型或细胞应答。我们已经证实，如果对基因加以修饰使疫苗质粒组件表达的主要为分泌形式的gD，则在接种期内可以诱导出TH2型或体液应答。编码的蛋白与天然gD2蛋白的不同之处仅仅在于缺失最后66个编码TMR的氨基酸。我们已经证实，工程改造的编码TMR缺失蛋白的构建物所表达的蛋白主要被分泌入转染细胞的培养基中。只有少量蛋白保持与细胞相联。已经表明，高水平的可溶性抗原会刺激Th2应答，而低剂量的可溶性抗原则刺激产生IL-12导致Th1应答(Abbas，A.K.Murphy，K.M.，Sher，A.(1996)Functionaldiversity of helper T lymphocytes.Nature 381：787-793)。设计出有利于抗原分泌的构建物会促进Th2型免疫应答。

因此，本发明涉及工程改造的多核苷酸构建物，该构建物能表达出诱导所需TH1或TH2型免疫应答的抗原蛋白，还涉及含有并能表达这些工程改造的多核苷酸构建物的质粒或其它载体构建物，以及用这些构建物来免疫接种哺乳动物以实现所需TH1或TH2免疫应答的方法。在一个所希望的实例中，本发明涉及工程改造一种或一组基因的方法，以使编码蛋白从细胞中分泌出来，从而能产生TH2型应答。在另一个所希望的实例中，本发明涉及一种免疫接种的方法，其中首先用编码诱导TH1型应答蛋白的质粒免疫接种哺乳动物至少一次，然后用能有效分泌该蛋白的质粒系统来免疫接种，从而使应答向TH2型应答变化。在一些应用中，本发明涉及一种方法，其中首先用诱导TH2型应答的多核苷酸疫苗来免疫接种哺乳动物，然后用促进TH1型应答的疫苗来强化。在本发明的另一个实例中，通过用促进TH1和TH2型应答的一种或多种疫苗组合物同时免疫接种，实现TH1和TH2型应答。

本发明的构建物可按下述方法进行工程改造：

在一个较佳的实例中，经修饰的构建物含有TMR缺失，结果所表达的抗原蛋白分泌入胞外区室得到增加，从而增强了TH2型或体液免疫应答。在一个较佳的实例中，经修饰的构建物含有信号或前导肽缺失，该缺失使得表达的抗原蛋白局限于细胞内胞质区室中，从而增强了TH1型或细胞免疫应答。在另一个较佳的实例中，信号和TMR均缺失，导致免疫原性蛋白的表达局限于胞质区室内，从而增强了TH1型或细胞免疫应答。

下面描述了一组使细胞相联蛋白分泌的方法。首先，需要在不进入分泌途径的细胞相联蛋白氨基端工程改造出一个信号肽。这是这些蛋白中的一些实现有效分泌的全部需求，而这些蛋白中的另一些则还需作进一步修饰。例如，通常不分泌的一些蛋白可能含有与膜相互作用的区域，而这种相互作用可能抑制那些蛋白的分泌。或者，这些蛋白可能含有使蛋白局限于某些亚细胞区室(如胞核)内的基序，这些序列也可能组织蛋白的有效分泌。因此，需要通过缺失或突变来破坏这些区域。在许多情况下，这些序列是已知的，而在其它情况下，可通过扫描序列来确定其与已知区域和定位基序的同源性。在其它情况下，可对未经鉴定的抑制性序列作图并通过选择基于诱变的方法来破坏抑制性序列。

对于正常进入分泌途径、但是通过膜保留区或使蛋白局限在分泌途径的亚细胞区室的结构区域而与细胞维持相联的蛋白，首先必须除去这些区域。这些区域可通过缺失或突变来除去。在一些情况下，这些蛋白基因编码的天然信号肽可能不能有效地将蛋白转运到内质网中。在这些情况下，可用异源信号肽来代替天然信号肽。异源信号肽的一个例子是HSV2 gD基因编码的信号肽。

序列缺失可通过构建物本身的序列缺失或突变来实现(图6)。或者，在一些情况下，当抑制性序列作为独特的区域存在(即它们在整个蛋白中没受修饰(marbled))时，它们位于蛋白C端，且出于免疫原性目的希望在构建物中保留这些序列，则可以这样来工程改造构建物，即，使这些序列不与注定要分泌的蛋白部分共价连接。这可通过在蛋白分泌部分与蛋白的抑制分泌的序列部分之间插入编码某个蛋白酶的位点来实现。该蛋白酶位点是某蛋白酶的断裂位点，对于表达疫苗蛋白的细胞而言，此蛋白酶是内源性的。或者，此蛋白酶可以反式提供在编码疫苗蛋白的同一构建物中，或在与疫苗质粒共同注射的另一分开的质粒上。在这种情况下，断裂不依赖于表达疫苗质粒细胞内天然存在的蛋白酶。在此蛋白待分开的区域之间加入自断裂蛋白酶(如polio 3C蛋白酶(2)或intein(3))也是可行的。在有些情况下则不能通过蛋白酶方法来除去抑制性区域。例如，亚细胞定位区域首先被表达成前体多肽的一部分(在蛋白水解前)，并能有效地干扰新生多肽转运到内质网中。在这种情况下，则必须通过缺失或定点突变来除去该区域。另外，还必须确定内质网中是否会发生所需的蛋白水解反应。

定向分泌的另一个考虑因素是蛋白在胞外区室中的稳定性。如果蛋白不稳定，则可通过使其与另一肽或蛋白(如融合蛋白)融合来提高其稳定性，维持其抗原性。在一些情况下，可用融合蛋白来装配血清稳定颗粒。

本发明还涉及工程改造的能表达成装配颗粒的融合蛋白的多核苷酸构建物，以及用这些多核苷酸构建物免疫接种的方法。这些蛋白不仅稳定，而且其大小可被APC(抗原呈递细胞)优先摄取，并且被加工后由MHC1类和2类分子提呈。

被修饰成其编码的蛋白主要是分泌蛋白的本发明构建物，对于诱导TH2型应答或体液应答所需的许多抗原是合适的，例如在抗病毒、寄生虫和细菌感染的预防性疫苗中的抗原。选用来表达的蛋白是组成病毒颗粒、寄生虫、细菌或孢子的抗原性蛋白，然而，本身并非传染性生物体一部分、却与受感染细胞的膜特殊相联的蛋白也可作为表达的靶，因为针对这些抗原的体液应答能通过补体途径或ADCC途径而导致细胞死亡。

实施例

实施例1

插入物TMR由37个核苷酸的HSV2 gD2 5′侧接序列以及编码HSV gD2前导肽和成熟蛋白的前302个氨基酸的序列组成。其羧基端缺失66个氨基酸。构建物有3′HSV gD2侧接序列的1个核苷酸。

将该插入物克隆到载体APL-400-004中，制得如图3A所示的APL-400-004TMR。

在一些实例中，制得第二个构建物APL-400-024。该质粒与APL-400-004 TMR相同，只是载体APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美国专利申请08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性结构所代替。

实施例2

插入物L_-1包括9bp的侧接HSV2 gD2的ATG的真实(authentic)5′序列，其后是ATG、再后是从氨基酸26起的成熟蛋白编码区的编码序列。包括前导肽的前25个氨基酸的编码序列已经缺失。插入物还包括约550bp侧接终止密码子的3′序列。

将该插入物克隆到载体APL-400-004中，制得如图3B所示的APL-400-004L_-1，它还包括39bp的来自TA载体(PCR II，In Vitrogen)的5′真实侧接(5′)序列。

在一些例子中，制得第二构建物APL-400-024L_-1。该质粒与APL-400-004 L_-1相同，只是载体APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美国专利申请08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性结构所代替。

实施例3

插入物L_-11包括41bp的侧接HSV2 gD2的ATG的真实5′序列，其后是ATG、再后是从氨基酸26起的成熟蛋白编码区的编码序列。包括前导肽的前25个氨基酸的编码序列已经缺失。该插入物还包括约550bp的终止密码子后的3′序列。

将该插入物克隆到载体APL-400-004中，制得如图3C所示的APL-400-004L_-11。

在一些例子中，制得第二构建物APL-400-024L_-11。该质粒与APL-400-004 L_-11相同，只是载体APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美国专利申请08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性结构所代替。

实施例4

插入物L_-3包括41bp的侧接HSV2 gD2的ATG的真实5′序列，其后是ATG，ATG后有6个bp以保留Kozak位点，再后是从氨基酸26起的成熟蛋白编码区的编码序列。包括前导肽的前25个氨基酸的编码序列已经缺失。该插入物还包括约550bp的终止密码子后的3′序列。

将该插入物克隆到载体APL-400-004中，制得如图3D所示的APL-400-004L_-3。

在一些例子中，制得第二构建物APL-400-024 L_-3。该质粒与APL-400-004 L_-3相同，只是载体APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美国专利申请08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性结构所代替。

实施例5

插入物L_-3TMR包括41bp的侧接HSV2gD2的ATG的真实5′序列，其后是ATG，ATG后有6个bp以保留Kozak位点，再后是从氨基酸26起的成熟蛋白编码区的编码序列。包括前导肽的前25个氨基酸的编码序列以及成熟蛋白羧基端66个氨基酸(包括了跨膜区)的编码序列已经缺失。该插入物还包括1bp的终止密码子后的3′序列。

将该插入物克隆到载体APL-400-004中，制得如图3E所示的APL-400-004 L_-3TMR。

在一些例子中，制得第二构建物APL-400-024 L_-3TMR。该质粒与APL-400-004 L_-3相同，只是载体APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美国专利申请08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性结构所代替。

实施例6

在第0天和第14天用20μg DNA/0.4％丁哌卡因给小鼠免疫接种。小鼠在第14天和第42天取血，测定血清中抗gD抗体的存在。用TMR缺失型免疫接种的小鼠表现出体液应答升高，比用全长HSV gD构建物免疫接种的小鼠更高。用信号肽缺失型免疫接种的小鼠没有检测到有血清抗体转变。

Claims

1.一种经修饰的基因在生产组合物中的应用，所述基因编码缺失功能性信号肽的单纯疱疹病毒糖蛋白D抗原，所述经修饰基因受指导所述抗原在所述细胞中表达的调控序列控制，所述组合物用于提高哺乳动物对象对单纯疱疹病毒感染的细胞免疫应答。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述经修饰基因编码的所述抗原缺少功能性细胞膜保留区。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述经修饰基因编码的所述抗原含有功能性细胞膜保留区。

4.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物还包含促进多核苷酸被细胞摄取的多核苷酸功能增强子，所述多核苷酸功能增强子选自苯甲酸酯、酰苯胺、脒、氨基甲酸乙酯、局部麻醉剂和其盐酸盐。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗原是单纯疱疹病毒1型糖蛋白D或单纯疱疹病毒2型糖蛋白D。

6.一种经修饰的基因在生产一种组合物中的应用，该基因编码具有功能性信号肽区但缺少功能性细胞膜保留区的单纯疱疹病毒糖蛋白D抗原，所述经修饰基因受指导所述抗原在所述细胞中表达的调控序列控制，所述组合物用于增强哺乳动物对象对单纯疱疹病毒感染的体液免疫应答。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述抗原是单纯疱疹病毒1型糖蛋白D或单纯疱疹病毒2型糖蛋白D。

8.根据权利要求6所述的应用，其中所述组合物还包含促进多核苷酸被细胞摄取的多核苷酸功能增强子，所述多核苷酸功能增强子选自苯甲酸酯、酰苯胺、脒、氨基甲酸乙酯、局部麻醉剂和其盐酸盐。

9.经修饰基因(a)和(b)在生产两组分组合物中的应用，经修饰基因(a)编码缺少功能性信号肽的第一抗原，所述经修饰基因受指导所述抗原在所述细胞中表达的调控序列控制；经修饰基因(b)编码缺少功能性细胞膜保留区的第二抗原，所述经修饰基因受指导所述第二抗原在所述细胞中表达和分泌的调控序列控制，

该组合物通过向所述对象细胞输送组分(a)来增强哺乳动物对象的细胞免疫应答，通过向所述对象细胞输送组分(b)来诱导所述对象中的体液免疫应答提高，

其中所述第一抗原和所述第二抗原各自是单纯疱疹病毒糖蛋白D。

10.根据权利要求9所述的应用，包含基本同时递送组分(a)和(b)，或以任何次序先后递送此二组分。

11.根据权利要求9所述的应用，包含将所述组分与促进多核苷酸被细胞摄取的多核苷酸功能增强子联合给药，所述多核苷酸功能增强子选自苯甲酸酯、酰苯胺、脒、氨基甲酸乙酯、局部麻醉剂和其盐酸盐。

12.根据权利要求9所述的应用，其中所述第一抗原和所述第二抗原是同一抗原。

13.根据权利要求9所述的应用，其中所述第～抗原和所述第二抗原是不同的抗原。

14.根据权利要求9所述的应用，其中所述第一和第二抗原独立选自单纯疱疹病毒1型糖蛋白D或单纯疱疹病毒2型糖蛋白D。

15.一种药物组合物，它包括：

(a)编码缺少功能性信号肽的单纯疱疹病毒糖蛋白D抗原的经修饰基因，所述经修饰基因受指导所述抗原在细胞中表达的调控序列控制；

(b)药学上可接受的载体；和

(c)任选的促进多核苷酸被细胞摄取的多核苷酸功能增强子，所述多核苷酸功能增强子选自苯甲酸酯、酰苯胺、脒、氨基甲酸乙酯、局部麻醉剂和其盐酸盐。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述抗原选自单纯疱疹病毒1型糖蛋白D或单纯疱疹病毒2型糖蛋白D。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述经修饰的糖蛋白D基因包括选自

(a)SEQ ID NO：1的核苷酸343至1449；

(b)SEQ ID NO：1的核苷酸287至1449；

(c)SEQ ID NO：1的核苷酸297至1449；

(d)SEQ ID NO：1的核苷酸307至1449；

(e)SEQ ID NO：1的核苷酸317至1449；

(f)SEQ ID NO：1的核苷酸327至1449；

(g)SEQ ID NO：1的核苷酸337至1449。

18.一种用作诱导体液免疫应答的疫苗的药物组合物，它包括：

(a)编码缺少功能性跨膜区的单纯疱疹病毒糖蛋白D抗原的经修饰基因，所述经修饰基因受指导所述抗原在细胞中表达的调控序列控制；

(b)药学上可接受的载体；和

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述抗原选自单纯疱疹病毒1型糖蛋白D和单纯疱疹病毒2型糖蛋白D。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述糖蛋白D基因包括图2 SEQ IDNO：1的序列，该序列在选自(a)核苷酸1247至1446、(b)核苷酸1249至1446、(c)核苷酸1267至1446、(d)核苷酸1287至1446、(e)核苷酸1307至1446、(f)核苷酸1327至1446、(g)核苷酸1367至1446、(h)核苷酸1387至1446、(i)核苷酸1407至1446、(j)核苷酸1427至1446和(k)核苷酸1347至1446的核苷酸序列中有缺失。