CN111836641A - 乙型肝炎病毒(hbv)疫苗及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及编码乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原和聚合酶抗原的多核苷酸以及相关的组合。本发明还涉及表达HBV核心和聚合酶抗原的载体，如DNA质粒或病毒载体，以及包含所述表达载体的免疫原性组合物。本发明还涉及利用所述免疫原性组合物来诱导针对HBV的免疫应答或治疗HBV诱导的疾病的方法，特别是在患有慢性HBV感染的个体中。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月19日提交的国际专利申请号PCT/IB2017/058142以及2017年12月19日提交的美国临时专利申请号62/607,426的优先权，其公开内容整体援引加入本文。
电子提交的序列表的引用
本申请包含序列表，其为通过EFS-Web电子提交的ASCII格式的序列表，文件名为“688097-403序列表”，生成日期为2018年12月10日，大小为46.6KB。通过EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分，并且整体援引加入本文。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是一种3.2-kb的小嗜肝DNA病毒，其编码4个开放阅读框以及7种蛋白。约20亿人感染有HBV，并且约2.4亿人患有慢性乙型肝炎感染(慢性HBV)，其特征是血液中持续出现病毒和亚病毒颗粒达6个月以上(1)。持续的HBV感染通过病毒肽和循环抗原长期刺激HBV特异性T细胞受体，导致循环的和肝内HBV特异性CD4+和CD8+T细胞的T细胞耗竭。结果，T细胞多能性降低(即IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IFN-γ的水平降低以及增殖的缺乏)。
自从20世纪80年代以来已经有了安全且有效的针对HBV感染的预防性疫苗，并且是乙型肝炎预防的主要手段(3)。世界卫生组织推荐对所有的婴儿进行疫苗接种，以及在低或中等乙型肝炎流行的国家，对所有的儿童和少年(小于18岁)以及某些处于风险群体中的人进行疫苗接种。由于进行了疫苗接种，世界范围的感染率明显下降。但是预防性疫苗无法治愈已有的HBV感染。
慢性HBV目前用IFN-α和核苷或核苷酸类似物进行治疗，但是由于感染的肝细胞中的称为共价闭环DNA(cccDNA)的细胞内病毒复制中间体的持续出现而无法最终治愈，这种共价闭环DNA充当病毒RNA以及由此导致的新病毒体的模板而起到重要作用。据信，诱导的病毒特异性T细胞和B细胞应答可以有效地消除带有cccDNA的肝细胞。目前靶向HBV聚合酶的疗法抑制病毒血症，但是对于位于核中的cccDNA和循环抗原的相关产生则效果有限。治愈的最严格的形式可以是从有机体中消除HBV cccDNA，这未作为自然发生的结果而被观察到，也并非任何治疗介入的结果。然而，HBV表面抗原(HBsAg)的丧失临床上可信地等效于治愈，因为疾病复发仅在严重免疫抑制的情况下才发生，这又可以通过预防性治疗而加以防止。因此，至少从临床观点出发，HBsAg的丧失与针对HBV最严格形式的免疫重建有关。
例如，就有限治疗过程的持久非治疗(off-treatment)应答而言，已证实用聚乙二醇化的干扰素(pegIFN)-α进行免疫调节比核苷或核苷酸疗法更好。除了直接的抗病毒效果，据报道IFN-α在细胞培养和人源化小鼠中表现出对cccDNA的表观遗传抑制，这导致病毒体繁殖力和转录物的减少(4)。然而，这种疗法仍然具有副作用并且整体应答很低，部分地是因为IFN-α对HBV特异性T细胞仅具有较差的调节影响。具体地，治愈率低(<10％)并且毒性高。类似地，直接起作用的HBV抗病毒剂，即HBV聚合酶抑制剂恩替卡韦(entecavir)和替诺福韦(tenofovir)，在诱导病毒抑制中作为单一疗法是有效的，对于抗药性突变体的出现和肝病进程的连续预防具有高遗传屏障。然而，通过这类HBV聚合酶抑制剂实现由HBsAg丧失或血清学转换(seroconversion)所定义的慢性乙型肝炎的治愈是罕见的。因此，这些抗病毒剂在理论上需要无限期地给药以防止肝病的复发，这类似于人免疫缺陷病毒(HIV)的抗逆转录病毒疗法。
治疗性疫苗接种具有从长期感染的患者消除HBV的潜力(5)。已经研究了许多策略，但是目前尚未证实治疗性疫苗接种的成功。
发明内容
因此，对于具有较高治愈率的有限的良好耐受的治疗，治疗乙型肝炎病毒(HBV)(特别是慢性HBV)的医疗需求尚未满足。本发明通过提供免疫原性组合物以及用于诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)感染的免疫应答的方法来满足这一需求。本发明的免疫原性组合物和方法可以用于向受试者提供治疗性免疫，例如患有慢性HBV感染的受试者。
在一总的方面，本申请涉及一种非天然存在的核酸分子，其编码HBV抗原，例如截短的HBV核心抗原或HBV聚合酶抗原。本申请一实施方案的HBV抗原为共有抗原，其能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答(体液或细胞)，优选在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答，更优选在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
在一实施方案中，本申请的非天然存在的核酸分子编码截短的HBV核心抗原，其由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，并且所述非天然存在的核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同。优选地，所述非天然存在的核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列。
在一实施方案中，本申请的非天然存在的核酸分子编码HBV聚合酶抗原，其包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。优选地，HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。更优选地，非天然存在的核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同，最优选地，与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16 100％相同。
在另一总的方面，本申请涉及一种载体，优选DNA质粒或病毒载体，其包含本申请的非天然存在的核酸分子。
在另一总的方面，本申请涉及一种重组宿主细胞，其包含本申请的非天然存在的核酸分子或载体。
在另一总的方面，本申请涉及一种非天然存在的多肽，其由本申请的非天然存在的核酸分子编码。
在又一总的方面，本申请涉及一种组合物，其包含本申请的非天然存在的核酸分子、载体、重组宿主细胞和非天然存在的多肽中的至少一种，以及药学上可接受的载剂。
在另一总的方面，本申请涉及一种免疫原性组合，特别是试剂盒，其包含：
(a)第一非天然存在的核酸分子，其包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原具有与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；
(b)第二非天然存在的核酸分子，其包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于相同的非天然存在的核酸分子中，或者存在于两种不同的非天然存在的核酸分子中。
在一些实施方案中，本申请的免疫原性组合，特别是试剂盒，包含存在于第一载体中的第一多核苷酸以及存在于第二载体中的第二多核苷酸。优选地，第一载体与第二载体不同。更优选地，载体为质粒载体或病毒载体。更优选地，第一载体和第二载体各自为质粒DNA载体。
在一实施方案中，本申请的免疫原性组合，特别是试剂盒，包含：
a)第一质粒DNA载体，其包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
b)第二质粒DNA载体，其包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或14的氨基酸序列组成；以及
c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体各自还包含抗生素抗性基因和复制起点，并且
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体存在于相同的组合物中或者两种不同的组合物中。
在一具体实施方案中，本申请的免疫原性组合，特别是试剂盒，包含：
a)第一质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；
增强子序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；
第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列；以及
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；
b)第二质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；
第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列；以及
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；以及
c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体各自还包含卡那霉素抗性基因和复制起点，所述卡那霉素抗性基因具有SEQ ID NO:12的多核苷酸序列，所述复制起点具有SEQ ID NO:10的多核苷酸序列，并且
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体存在于相同的组合物中或者两种不同的组合物中。
在其他实施方案中，本申请的免疫原性组合，特别是试剂盒，包含存在于相同载体中的第一多核苷酸和第二多核苷酸。优选地，载体为质粒载体或病毒载体。更优选地，载体为腺病毒载体，例如Ad26或Ad35载体。
在一实施方案中，本申请的免疫原性组合，特别是试剂盒，包含：
a)载体，其包含第一多核苷酸序列和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述第二多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；以及
b)药学上可接受的载剂。
在一具体实施方案中，本申请的免疫原性组合，特别是试剂盒，包含病毒载体，优选腺病毒载体，其从5’端至3’端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列；
第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列；
接头编码序列，其包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列；
第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:24的多核苷酸序列，以及
药学上可接受的载剂。
本申请的其他方面涉及用于制备本申请的多核苷酸、载体、多肽和组合物以及免疫原性组合或试剂盒的方法。
在进一步总的方面，本申请涉及一种在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药免疫原性有效量的本申请的组合物或免疫原性组合。优选地，所述方法在受试者中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答，例如抗体应答和/或T细胞应答。优选地，所述方法在受试者中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，所述方法在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。在一实施方案中，所述方法还包括向受试者给药另一免疫原性剂，优选另一HBV抗原。
在另一方面，本申请涉及一种治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(HBV)诱导的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的本申请的组合物或免疫原性组合。优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，并且所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。在一实施方案中，所述方法还包括向受试者给药另一治疗剂，优选另一抗HBV抗原。
本申请还涉及本申请的组合物、免疫原性组合或试剂盒，用于在诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答，以及本申请的组合物、免疫原性组合或试剂盒在制备用于诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答的药物中的用途。所述用途还可以包括与另一免疫原性剂的组合，优选与另一HBV抗原组合。优选地，受试者患有慢性HBV感染。
本申请还涉及本申请的组合物、免疫原性组合或试剂盒，用于治疗有需要的受试者的HBV诱导的疾病，以及本申请的组合物、免疫原性组合或试剂盒在制备用于治疗有需要的受试者的HBV诱导的疾病的药物中的用途。所述用途还可以包括与另一治疗剂的组合，优选与另一抗HBV抗原组合。优选地，受试者患有慢性HBV感染，并且所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
本发明的其他方面、特征和优势参考以下公开，包括发明详述及其优选实施方案和所附权利要求，会更清楚。
附图说明
参考附图会更好地理解前述发明内容以及下文的发明详述。应当理解本发明并不限于附图中所示的具体实施方案。
在附图中：
图1A-1B示出乙型肝炎病毒的基因组和病毒生命周期；图1A为乙型肝炎病毒(HBV)基因组的图示；在天然(native)病毒中，聚合酶蛋白(Pol)包含编码不同开放阅读框中的包膜蛋白的编码序列；包膜蛋白(pre-S1、pre-S2和S)在相同的开放阅读框中；图1B示出HBV的病毒生命周期。
图2A-2H示出实施例1所述的编码HBV pol和核心抗原的表达盒和DNA质粒的设计和优化；图2A为表达策略的图示，其中HBV核心和pol抗原的编码序列融合在框中；图2B为表达策略的图示，其中核心和pol抗原的编码序列通过核糖体FA2滑动位点表达自单一的质粒；图2C为表达策略的示意图，其中核心和pol抗原表达自两种分别的质粒；图2D为核心抗原在HEK293T细胞中表达的蛋白印迹，所述HEK293T细胞转染有质粒，其表达具有或不具有转录后调控元件WPRE的核心，利用α-核心抗体在细胞裂解物(左)和上清(sup，右)中检测表达；图2E为蛋白印迹分析，其示出在HEK293T细胞中核心表达的比较，所述HEK293T细胞转染有表达核心的质粒，所述质粒包含源自人载脂蛋白A1前体(“AI内含子”)的内含子/外显子序列；1型人T细胞白血病病毒(HTLV-1)长末端重复(LTR)(“HTLV R”)的未翻译的R-U5结构域，或HTLV-1LTR、合成兔β-球蛋白内含子和剪接增强子的三重增强子复合序列(“三重”)；未标记的泳道为纯化的核心蛋白，作为大小标志物；在裂解物(左)和上清(sup，右)中检测表达；三重增强子复合序列的核心抗原表达最高；图2F为核心抗原分泌的蛋白印迹分析，核心抗原分泌使用融合至HBV核心抗原的N末端的不同信号肽进行；对于Cystatin S信号肽观察到最有效的蛋白分泌；图2G为图2A-2C所示的三种表达策略中的每一种优化的HBV核心/pol抗原表达盒的示意图；CMVpr：人CMV-IE启动子；TRE；三重增强子序列；SP：cystatin S信号肽；FA2：FMDV核糖体滑动位点；pA：BGH多腺苷酸化信号；图2H为pDK载体的HBV核心和pol抗原表达的蛋白印迹分析，所述pDK载体含有图2G所示的表达盒的每一个；泳道1和2：pDK-核心；泳道3和4：pDK-pol；泳道5和6：pDK-核心FA2Pol；泳道7和8：pDK-核心-pol融合：抗原由分别的载体编码时，对于细胞和分泌的核心和pol抗原观察到的最一致的表达谱。
图3A-3B为本申请实施方案的DNA质粒的图示；图3A示出编码本申请实施方案的HBV核心抗原的DNA质粒；图3B示出编码本申请实施方案的HBV聚合酶(pol)抗原的DNA质粒；HBV核心和pol抗原在CMV启动子的控制下表达，所述CMV启动子具有N末端cystatin S信号肽，其在表达的抗原从细胞分泌时被切割；质粒的转录调控元件包括位于CMV启动子和编码HBV抗原的多核苷酸序列之间的增强子序列以及位于编码HBV抗原的多核苷酸序列下游的bGH多腺苷酸化序列；第二表达盒反向包含于质粒中，其包括Ampr(bla)启动子控制下的卡那霉素抗性基因；复制起点(pUC)也反向包含在其中。
图4示出，如实施例2所述，用表达HBV核心抗原或HBV pol抗原的不同DNA质粒免疫的Balb/c小鼠的ELISPOT应答；用于刺激分离自各个接种疫苗的动物组的脾细胞的肽池表示为灰度；应答的T细胞的数目标识在y轴上，表示为斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞。
图5示出，如实施例3所述的剂量发现研究，用表达HBV核心抗原和HBV pol抗原的DNA质粒的组合免疫的Balb/C小鼠的ELISPOT应答；用于刺激分离自各个接种疫苗的动物组的脾细胞的肽池表示为灰度；应答的T细胞的数目标识在y轴上，表示为斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞。
图6示出，如实施例4所述的免疫干扰研究，用表达HBV核心抗原和HBV pol抗原的DNA质粒(pDNA)免疫的Balb/c小鼠的ELISPOT应答；组1，单一Core pDNA；组2，单一PolpDNA；组3，混合Core和Pol pDNA；组4，Core和Pol pDNA在不同部位分别施用；用于刺激分离自各个接种疫苗的动物组的脾细胞的肽池表示为灰度；应答的T细胞的数目标识在y轴上，表示为斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞。
图7A和7B示出，如实施例5所述，本申请实施方案的DNA疫苗在NHP中的免疫原性；图7A示出用表达HBV核心和Pol抗原的DNA质粒免疫接种后的IFN-γ细胞因子应答；用于刺激分离自接种疫苗的动物组的PBMC的肽池表示为灰度；应答的T细胞的数目标识在y轴上，表示为斑点形成细胞(SFC)/106个PBMC；图7B示出，通过流式细胞术测量的针对核心、Pol-1和Pol-2肽池的CD4和CD8 T细胞记忆免疫应答；图表示出第76天的结果，表示为针对3个池的％CD4或CD8 T细胞应答(IFN-γ、IL-2和TNF-α)，对每种池扣除仅DMSO介质的背景；CD4应答显示在左边，而CD8应答显示在右边。
图8A和8B为本申请实施方案的腺病毒载体中的表达盒的示意图。图8A示出截短的HBV核心抗原的表达盒，其包含CMV启动子、内含子(源自人ApoAI基因的片段-GenBank登录号X01038的295–523碱基对，带有ApoAI第二内含子)、人免疫球蛋白分泌信号，然后是截短的HBV核心抗原的编码序列和SV40多腺苷酸化信号；图8B示出可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原的融合蛋白的表达盒，除了HBV抗原，其与截短的HBV核心抗原的表达盒相同。
图9示出，如实施例8所述，用HBV腺病毒载体免疫的F1小鼠(C57BL/6x Balb/C)中的ELISPOT应答；用于刺激分离自各个接种疫苗的动物组的脾细胞的HBV核心或聚合酶肽池以黑色(核心)和灰色(pol)标出；X轴示出腺病毒载体剂量和实验组。应答的T细胞的数目标识在y轴上，表示为斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞。
具体实施方式
背景技术和整个说明书中引用或描述各种公开、文章和专利，其整体援引加入本文。本说明书中包括的文档、法规、材料、装置、物品等的讨论用于提供本发明的上下文。这样的讨论并不是承认这些事物的任何或全部构成所公开或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。
除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所用的某些术语具有说明书所列的含义。本文所引用的全部专利、公开的专利申请和出版物援引加入本文，如同全部列入本文一样。
应当注意，如本文以及所附的权利要求所用，除非上下文明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“这个”包括复数指代。
除非另外指明，一系列元素前的术语“至少”应当理解为指代该系列中的每个元素。使用不超过常规的试验，本领域技术人员会认识到或者能够确定本文描述的具体实施方案的许多等同物。这类等同物也涵盖在本发明的范围内。
在整个说明书以及所附的权利要求中，除非上下文明显要求，词语“包含(comprise)”以及变体如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当理解为暗指涵盖指定的整数或步骤或者整数或步骤的集合，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的集合。当用于本文时，术语“包含”可以替换为术语“含有”或“包括”，或者当用于本文时有时替换为术语“具有”。
本文使用的“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。本文使用的“基本上由…组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新特性的材料或步骤。当任何时候在本申请的方面或实施方案的上下文中使用时，任何前述的术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”可以替换为术语“由…组成”或“基本上由…组成”以变化本公开的范围。
如本文所用，多个所列元素之间的连接术语“和/或”应当理解为涵盖单独和组合的选项。例如，当两个元素由“和/或”相连时，第一选项指在没有第二元素的情况下第一元素的适用性。第二选项指在没有第一元素的情况下第一元素的适用性。第三选项指第一元素和第二元素一起适用。这些选项中的任意一个都应理解为落入其含义内，并因此满足本文所用的术语“和/或”的要求。多个选项中的一个以上的并存适用性也应理解为落入其含义内，并因此满足术语“和/或”的要求。
除非另外指明，任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL-1.1mg/mL。类似地，1mg/mL-10mg/mL的浓度范围包括0.9mg/mL-11mg/mL。如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，以及落入该范围内的所有单个数值，包括这样范围内的整数以及值的分数。
短语“百分比(％)序列相同性”或“％相同性”或“与…％相同”，当对于氨基酸序列使用时，描述与构成氨基酸序列全长的氨基酸残基的数目相比，两个或更多个比对的氨基酸序列相同氨基酸的匹配(“命中(hit)”)的数目。换句话说，比较序列并比对序列的最大对应性时，如利用本领域已知的序列比较算法或者手动比对并目视检查测得的，利用比对，对于两个或更多个序列，可以确定相同的氨基酸残基的百分比(例如，氨基酸序列的全长90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％相同性)。因此，进行比较以确定序列相同性的序列可以由于氨基酸的取代、添加或缺失不同。用于比对蛋白序列的合适程序是本领域技术人员已知的。蛋白序列的百分比序列相同性，例如，可以通过程序确定，如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST，如使用NCBI BLAST算法(Altschul SF,et al(1997),Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。
如本文所用，术语和短语“联合”、“组合”、“共递送”和“一起给药”，在向受试者给药两种或更多种疗法或组分的上下文中，指同时给药两种或更多种疗法或组分，例如两种载体(如DNA质粒)，或免疫原性组合和佐剂。“同时给药”可以是在至少同一天内给药两种组分。当两种组分“一起给药”或“组合给药”时，它们可以在分别的组合物中，在短时间段内顺序给药，例如24、20、16、12、8或4小时，或者在1小时内；或者它们可以在单一组合物中，在相同时间给药。术语“组合”的使用并不限制向受试者给药疗法或组分的次序。例如，可以在给药第二疗法或组分(如编码HBV抗原的第二DNA质粒)之前(如5分钟至1小时前)、一起或同时或者之后(如5分钟至1小时后)给药第一疗法或组分(如编码HBV抗原的第一DNA质粒)。在一些实施方案中，第一疗法或组分(如编码HBV抗原的第一DNA质粒)和第二疗法或组分(如编码HBV抗原的第二DNA质粒)在相同组合物中给药。在其他实施方案中，第一疗法或组分(如编码HBV抗原的第一DNA质粒)和第二疗法或组分(如编码HBV抗原的第二DNA质粒)在分别的组合物中给药。
如本文所用，“非天然存在的”核酸或多肽指在自然界不存在的核酸或多肽。“非天然存在的”核酸或多肽可以是在是实验室和/或工业环境中合成的、处理的、制造的和/或操纵的。在一些情况下，非天然存在的核酸或多肽可以包括天然存在的核酸或多肽，其是经处理、加工或操纵以表现出天然存在的核酸或多肽在处理前不存在的性质。如本文所用，“非天然存在的”核酸或多肽可以是这样的核酸或多肽，其分离或隔离自发现其的天然来源，并且缺少其与天然来源相关的序列的共价连接。“非天然存在的”核酸或多肽可以重组制备或通过诸如化学合成的其他方法制备。
如本文所用，“受试者”表示任何动物，优选哺乳动物，更优选人，其要进行或已经进行根据本申请的实施方案的方法的治疗。本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、非人灵长类(NHP)如猴或猿、人等，更优选人。
如本文所用，术语“可操作地连接”指连接或相邻，其中描述的组分处于使得它们以意图的方式发挥功能的关系中。例如，与所关注的核酸序列可操作地连接的调节序列能够指导所关注的核酸序列的转录，或者与所关注的氨基酸序列可操作地连接的信号序列能够分泌或跨膜转运所关注的氨基酸序列。
为了帮助本申请的读者，说明书分为若干段落或节，或者涉及本申请的各个实施方案。这些区分并不理解为将段落或节或实施方案的内容与其他段落、节或实施方案分开。相反地，本领域技术人员应当理解，说明书有宽泛的应用，并涵盖可以考虑的各个节、段落和语句的所有组合。任何实施方案的讨论仅是示例性的，并不意图将包括权利要求在内的本公开的范围限制为这些实例。例如，虽然本文所述的本申请的HBV载体(如质粒DNA或病毒载体)的实施方案可以包含特定的组分，包括但不限于以特定次序排列的某些启动子序列、增强子或调节序列、信号肽、HBV抗原的编码序列、多腺苷酸化信号序列等，但是本领域技术人员应当理解本文公开的概念可以等同地应用于可以用于本申请的HBV载体的以其他次序排列的其他组分。本申请涵盖以任何组合使用具有任何序列的任何可用的组分，所述序列可以用于本申请的HBV载体，无论是否明确描述特定的组合。
乙型肝炎病毒(HBV)
如本文所用，“乙型肝炎病毒”或“HBV”指肝病毒科的病毒。HBV为小(如3.2kb)嗜肝DNA病毒，其编码4个开放阅读框和7种蛋白。参见图1A。HBV编码的7种蛋白包括小(S)、中(M)和大(L)表面抗原(HBsAg)或包膜(Env)蛋白、pre-Core蛋白、核心蛋白、病毒聚合酶(Pol)和HBx蛋白。HBV表达三种表面抗原或包膜蛋白L、M和S，其中S为最小的而L为最大的。M和L蛋白中的额外(extra)结构域分别命名为Pre-S2和Pre-S1。核心蛋白是病毒核壳体的亚基。Pol是合成病毒DNA(逆转录酶、RNaseH和引物)所需的，这发生在定位于感染的肝细胞的胞质的核壳体。PreCore是具有N末端信号肽的核心蛋白，并且从感染细胞分泌之前在其N和C末端经蛋白水解加工，即所谓的乙型肝炎e-抗原(HBeAg)。HBx蛋白是共价闭环DNA(cccDNA)的有效转录所需的。HBx并非病毒结构蛋白。除了共享mRNA的核心和聚合酶，HBV的所有病毒蛋白都具有其自身的mRNA。除了蛋白pre-Core之外，HBV病毒蛋白没有经受翻译后蛋白水解加工。
HBV病毒体含有病毒包膜、核壳体以及部分双链DNA基因组的单个拷贝。核壳体包含核心蛋白的120二聚体，并且被嵌入S、M和L病毒包膜或表面抗原蛋白的衣壳膜所覆盖。进入细胞后，病毒脱壳，并且包含衣壳的松弛环状DNA(rcDNA)与共价结合的病毒聚合酶迁移入细胞核。在那个过程中，核心蛋白的磷酸化引起结构变化，暴露核定位信号，使得衣壳与所谓的输入蛋白(importin)发生相互作用。这些输入蛋白介导核心蛋白与核孔复合物的结合，其后衣壳解体并且聚合酶/rcDNA复合物被释放到核中。在核中，rcDNA变为脱蛋白的(除去聚合酶)，并通过宿主DNA修复机制转化为共价闭环DNA(cccDNA)基因组，重叠转录物由其编码HBeAg、HBsAg、核心蛋白、病毒聚合酶和HBx蛋白。核心蛋白、病毒聚合酶和前基因组RNA(pgRNA)在胞质中关联并自组装为包含未成熟pgRNA的衣壳颗粒，其又转化为成熟rcDNA-衣壳并且作为共有中间体起作用，其被包膜并作为感染性病毒颗粒而被分泌，或者运送回核中以补充并维持稳定的cccDNA池(pool)。参见图1B。
迄今为止，基于存在于包膜蛋白上的抗原表位，HBV分为4种血清型(adr、adw、ayr、ayw)，并且基于病毒基因组的序列分为8种基因型(A、B、C、D、E、F、G和H)。HBV基因型分布于不同的地理区域。例如，亚洲最流行的基因型是因型B和C。基因型D在非洲、中东和印度占优势，而基因型A广泛分布于北欧、撒哈拉以南非洲和西非。
HBV抗原
如本文所用，术语“HBV抗原”、“HBV的抗原性多肽”、“HBV抗原性多肽”、“HBV抗原性蛋白”、“HBV免疫原性多肽”和“HBV免疫原”全部都指这样的多肽，其能够在受试者中诱导针对HBV的免疫应答，例如体液和/或细胞介导的应答。HBV抗原可以是HBV的多肽、其片段或表位，或者多种HBV多肽的组合、其部分或衍生物。HBV抗原能够在宿主中引发保护性免疫应答，例如诱导针对病毒疾病或感染的免疫应答，和/或在受试者中产生针对病毒疾病或感染的免疫力(即，接种疫苗)，其保护受试者免于病毒疾病或感染。例如，HBV抗原可以包含来自任何HBV蛋白的多肽或其免疫原性片段，例如源自任何HBV基因型(如基因型A、B、C、D、E、F、G和/或H，或其组合)的HBeAg、pre-core蛋白、HBsAg(S、M或L蛋白)、核心蛋白、病毒聚合酶或HBx蛋白。
(1)HBV核心抗原
如本文所用，术语“HBV核心抗原”、“HBcAg”和“核心抗原”的每一个指HBV抗原，其能够在受试者中诱导针对HBV核心蛋白的免疫应答，例如体液和/或细胞介导的应答。术语“核心”、“核心多肽”和“核心蛋白”的每一个指HBV病毒核心蛋白。全长核心抗原的长度通常为183个氨基酸，并且包括组装结构域(第1-149位氨基酸)和核酸结合结构域(第150-183位氨基酸)。34-残基核酸结合结构域对于前基因组RNA衣壳化是必需的。这个结构域还充当核输入信号。其包含17个精氨酸残基，并且是高度碱性的，与其功能一致。HBV核心蛋白在溶液中是二聚的，二聚体自组装为二十面体衣壳。核心蛋白的每个二聚体具有4个α螺旋束，在两端的侧面是α螺旋结构域。缺少核酸结合结构域的截短的HBV核心蛋白也能形成衣壳。
在本申请的一实施方案中，HBV抗原是截短的HBV核心抗原。如本文所用，“截短的HBV核心抗原”指HBV抗原，其不包含HBV核心蛋白的全长，但是能够在受试者中诱导针对HBV核心蛋白的免疫应答。例如，HBV核心抗原可以进行修饰以缺失核心抗原的高度带正电(富含精氨酸)的C末端的核酸结合结构域的一个或多个氨基酸，所述结构域通常包含17个精氨酸(R)残基。本申请的截短的HBV核心抗原优选为C末端截短的HBV核心蛋白(其不包含HBV核心核输入信号)和/或截短的HBV核心蛋白(C末端HBV核心核输入信号已经从其缺失)。在一实施方案中，截短的HBV核心抗原包含C末端核酸结合结构域中的缺失，例如C末端核酸结合结构域1-34个氨基酸残基的缺失，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸残基，优选缺失所有34个氨基酸残基。在一优选实施方案中，截短的HBV核心抗原包含C末端核酸结合结构域中的缺失，优选缺失所有34个氨基酸残基。
本申请的HBV核心抗原可以是共有序列，其源自多种HBV基因型(如基因型A、B、C、D、E、F、G和H)。如本文所用，“共有序列”表示基于同源蛋白的氨基酸序列比对的人工氨基酸序列，例如通过同源蛋白的氨基酸序列的比对(例如，使用Clustal Omega)确定的。其可以是基于至少100种天然HBV分离物的HBV抗原(如核心、pol等)的序列，在序列比对的每个位置所发现的频率最高的氨基酸残基的计算排序(order)。共有序列可以是非天然存在的，并且可以与天然的病毒序列不同。共有序列可以这样设计，通过利用多序列比对工具比对不同来源的多种HBV抗原序列，并且在可变的比对位置，选择频率最高的氨基酸。优选地，HBV抗原的共有序列源自HBV基因型B、C和D。术语“共有抗原”指具有共有序列的抗原。
本申请的示例性截短的HBV核心抗原缺少核酸结合功能，并且能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答。优选地，截短的HBV核心抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，截短的HBV核心抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
优选地，本申请的HBV核心抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型B、C和D的共有抗原，更优选源自HBV基因型B、C和D的截短的共有抗原。本申请的示例性截短的HBV核心共有抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:14为源自HBV基因型B、C和D的核心共有抗原。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:14含有天然核心抗原的高度带正电(富含精氨酸)的核酸结合结构域的34-氨基酸C末端缺失。
在本申请的一具体实施方案中，HBV核心抗原为截短的HBV抗原，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在另一具体实施方案中，HBV核心抗原为截短的HBV抗原，其由SEQ IDNO:14的氨基酸序列组成。
(2)HBV聚合酶抗原
如本文所用，术语“HBV聚合酶抗原”、“HBV Pol抗原”或“HBV pol抗原”指HBV抗原，其能够在受试者中诱导针对HBV聚合酶的免疫应答，例如体液和/或细胞介导的应答。术语“聚合酶”、“聚合酶多肽”、“Pol”和“pol”的每一个指HBV病毒DNA聚合酶。HBV病毒DNA聚合酶具有4个结构域，从N末端到C末端包括，末端蛋白(TP)结构域，其充当负链DNA合成的引物；间隔子，其对聚合酶功能不关键；逆转录酶(RT)结构域，其用于转录；以及RNase H结构域。
在本申请的一实施方案中，HBV抗原包括HBV Pol抗原，或其任何免疫原性片段或组合。HBV Pol抗原可以含有进一步的修饰以改进抗原的免疫原性，例如通过向聚合酶和/或RNase结构域的活性位点引入突变以降低或基本上消除某些酶促活性。
优选地，本申请的HBV Pol抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性，并且能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答。优选地，HBV Pol抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，HBV Pol抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
因此，在一些实施方案中，HBV Pol抗原为灭活的Pol抗原。在一实施方案中，灭活的HBV Pol抗原包含聚合酶结构域的活性位点中的一个或多个氨基酸突变。在另一实施方案中，灭活的HBV Pol抗原包含RNaseH结构域的活性位点中的一个或多个氨基酸突变。在一优选实施方案中，灭活的HBV pol抗原包含聚合酶结构域和RNaseH结构域的活性位点中的一个或多个氨基酸突变。例如，核苷酸/金属离子结合所必需的HBV pol抗原的聚合酶结构域中的“YXDD”基序可以进行突变，例如用天冬酰胺残基(N)代替一个或多个天冬氨酸残基(D)，消除或降低金属配位功能，从而降低或基本上消除逆转录酶功能。替代“YXDD”基序的突变，或除“YXDD”基序的突变之外，Mg2+配位所需的HBV pol抗原的RNaseH结构域中的“DEDD”也可以进行突变，例如用天冬酰胺残基(N)代替一个或多个天冬氨酸残基(D)，和/或用谷氨酰胺(Q)代替谷氨酸残基(E)，从而降低或基本上消除RNaseH功能。在一具体实施方案中，HBV pol抗原通过以下进行修饰：(1)将聚合酶结构域的“YXDD”基序中的天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)；和(2)将RNaseH结构域的“DEDD”基序中的第一个天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)，并将第一个谷氨酸残基(E)突变为谷氨酰胺残基(N)，从而降低或基本上消除pol抗原的逆转录酶和RNaseH功能。
在本申请的一优选实施方案中，HBV pol抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型B、C和D的共有抗原，更优选源自HBV基因型B、C和D的灭活的共有抗原。本申请的示例性HBV pol共有抗原包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:4至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，例如与SEQ ID NO:4至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:4为源自HBV基因型B、C和D的共有抗原，其包含位于聚合酶和RNaseH结构域的活性位点中的4个突变。具体地，所述4个突变包括聚合酶结构域的“YXDD”基序中天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)，和RNaseH结构域的“DEDD”基序中的第一个天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)和谷氨酸残基(E)突变为谷氨酰胺残基(Q)。
在本申请的一具体实施方案中，HBV pol抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在本申请的其他实施方案中，HBV pol抗原由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
(3)HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原的融合
如本文所用，术语“融合蛋白”或“融合”指单一多肽链，其具有至少两个多肽结构域，所述至少两个多肽结构域通常不存在于单一的天然多肽中。
在本申请的一实施方案中，HBV抗原包含融合蛋白，其包含可操作地连接至HBVPol抗原的截短的HBV核心抗原，或者可操作地连接至截短的HBV核心抗原的HBV Pol抗原，优选通过接头连接。
如本文所用，术语“接头”指化合物或部分，其充当分子桥以可操作地连接两个不同的分子，其中接头的一部分可操作地连接至第一分子，并且其中接头的另一部分可操作地连接至第二分子。例如，在包含第一多肽和第二异源多肽的融合蛋白中，接头主要充当第一和第二多肽之间的间隔子。在一实施方案中，接头由通过肽键连接的氨基酸构成，优选由1-20个通过肽键连接的氨基酸构成，其中所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在一实施方案中，所述1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。优选地，接头由大多数空间上不受妨碍的氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。示例性的接头有聚甘氨酸，特别是(Gly)5、(Gly)8；聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。下文的实施例中所示的一种示例的合适接头为(AlaGly)n，其中n为2-5的整数。
优选地，本申请的融合蛋白能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的HBV核心和HBV Pol的免疫应答。优选地，融合蛋白能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，融合蛋白能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
在本申请的一实施方案中，融合蛋白包含截短的HBV核心抗原、接头和HBV Pol抗原，所述截短的HBV核心抗原具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:14至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，所述HBV Pol抗原具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
在本申请的一优选实施方案中，融合蛋白包含截短的HBV核心抗原、接头和HBVPol抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，所述接头包含(AlaGly)n，其中n为2-5的整数，所述HBV Pol抗原具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。更优选地，本申请的一实施方案的融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在本申请的一实施方案中，融合蛋白还包含信号序列。优选地，信号序列具有SEQID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。更优选地，融合蛋白包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
多核苷酸和载体
在另一总的方面，本申请提供一种非天然存在的核酸分子，其编码本申请的HBV抗原，以及包含所述非天然存在的核酸的载体。非天然存在的核酸分子可以包含编码本申请的HBV抗原的任何多核苷酸序列，其可以利用本领域已知的方法根据本公开来制备。优选地，多核苷酸编码本申请的截短的HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的至少一种。多核苷酸可以为RNA的形式或者DNA的形式，其可以通过重组技术(如克隆)获得或合成(如化学合成)制备。DNA可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列的部分。DNA可以例如包含基因组DNA、cDNA或其组合。多核苷酸还可以为DNA/RNA杂合体。本申请的多核苷酸和载体可以用于重组蛋白制备，在宿主细胞中表达蛋白，或者制备病毒颗粒。优选地，多核苷酸为DNA。
在本申请的一实施方案中，非天然存在的核酸分子包含多核苷酸，所述多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14 98％、99％或100％相同。在本申请一具体的实施方案中，非天然存在的核酸分子编码截短的HBV核心抗原，其由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。
本申请的编码截短的HBV核心抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于这样的多核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同，例如与SEQ ID NO:1或SEQID NO:15至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15 98％、99％或100％相同，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。编码截短的HBV核心抗原的示例性非天然存在的核酸分子具有SEQ ID NO:1或15的多核苷酸序列。
在本申请的一实施方案中，非天然存在的核酸分子编码HBV聚合酶抗原，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。在本申请的一具体实施方案中，非天然存在的核酸分子编码HBV聚合酶抗原，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
本申请的编码HBV Pol抗原的示例性多核苷酸序列包括但不限于这样的多核苷酸序列，其与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16 98％、99％或100％相同，所述HBV Pol抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。编码HBV pol抗原的示例性非天然存在的核酸分子具有SEQ ID NO:3或16的多核苷酸序列。
在本申请的另一实施方案中，非天然存在的核酸分子编码融合蛋白，其包含可操作地连接至HBV Pol抗原的截短的HBV核心抗原，或者可操作地连接至截短的HBV核心抗原的HBV Pol抗原。在一具体的实施方案中，本申请的非天然存在的核酸分子编码截短的HBV核心抗原、接头和HBV聚合酶抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14 100％相同，更优选与SEQ ID NO:14 100％相同；所述HBV聚合酶抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:4 98％、99％或100％相同。在本申请的一具体实施方案中，非天然存在的核酸分子编码融合蛋白，其包含截短的HBV核心抗原、接头和HBV Pol抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，所述接头包含(AlaGly)n，其中n为2-5的整数，所述HBV Pol抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在本申请的一具体实施方案中，非天然存在的核酸分子编码融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
本申请的编码融合蛋白的多核苷酸序列的实例包括但不限于这样的多核苷酸序列，其可操作地连接至接头编码序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同，例如与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1598％、99％或100％相同，所述接头编码序列与SEQ ID NO:22至少90％相同，例如与SEQ IDNO:22至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:22 98％、99％或100％相同，所述接头编码序列进一步可操作地连接至多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16 98％、99％或100％相同。在本申请的一具体实施方案中，编码融合蛋白的非天然存在的核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15，可操作地连接至SEQ ID NO:22，其进一步可操作地连接至SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16。
本申请还涉及一种载体，其包含编码HBV抗原的分离的多核苷酸。如本文所用，“载体”为核酸分子，用于将遗传物质带入其他细胞，在那里其可以进行复制和/或表达。根据本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体(噬菌体、动物病毒和植物病毒)、粘粒和人工染色体(如YAC)。优选地，载体为DNA质粒。载体可以是DNA载体或RNA载体。本领域技术人员根据本公开可以通过标准重组技术可以构建本申请的载体。
本申请的载体可以是表达载体。如本文所用，术语“表达载体”指任何类型的遗传构建体，其包含编码能被转录的RNA的核酸。表达载体包括但不限于用于重组蛋白表达的载体，如DNA质粒或病毒载体，以及用于将核酸递送入受试者以在受试者的组织中表达的载体，如DNA质粒或病毒载体。本领域技术人员应当理解表达载体的设计可以取决于这样的因素：要转化的宿主细胞的选择，期望的蛋白的表达水平等。
本申请的载体可以含有各种调节序列。如本文所用，术语“调节序列”指任何序列，其允许、有助于或调整核酸分子的功能性调节，包括核酸或其衍生物之一(即，mRNA)的复制、倍增、转录、剪接、翻译、稳定性和/或向宿主细胞或有机体的转运。在本公开的上下文中，该术语涵盖启动子、增强子以及其他表达控制元件(如多腺苷酸化信号和影响mRNA稳定性的元件)。
在本申请的一些实施方案中，载体为非病毒载体。非病毒载体的实例包括但不限于DNA质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体等。非病毒载体的实例包括但不限于RNA复制子、mRNA复制子、修饰的mRNA复制子或自扩增mRNA、闭合线性脱氧核糖核酸，例如线性共价闭合DNA，如线性共价闭合双链DNA分子。优选地，非病毒载体为DNA质粒。“DNA质粒”与“DNA质粒载体”、“质粒DNA”或“质粒DNA载体”互换使用，表示双链的，并且通常是环状的DNA序列，其能够在合适的宿主细胞中自主复制。用于表达编码的多核苷酸的DNA质粒通常包含复制起点、多克隆位点和选择标记，其可以例如是抗生素抗性基因。可以使用的合适DNA质粒的实例包括但不限于用于公知的表达系统(包括原核和真核系统)的可商购表达载体，例如pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于在大肠杆菌(Escherichiacoli)中制备和/或表达蛋白；pYES2(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific)，其可以用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中制备和/或表达；
完全杆状病毒表达系统(Thermo Fisher Scientific)，其可以用于在昆虫细胞中制备和/或表达；pcDNATM或pcDNA3TM(Life Technologies,Thermo Fisher Scientific)，其可以用于在哺乳动物细胞中进行高水平组成型蛋白表达；和pVAX或pVAX-1(Life Technologies,Thermo Fisher Scientific)，其可以用于在大部分哺乳动物细胞中高水平瞬时表达所关注的蛋白。通过使用常规的技术和容易获得的起始原料，任何可商购的DNA质粒的骨架可以进行修饰以优化在宿主细胞中的蛋白表达，例如逆转某些元件的方向(如复制起点和/或抗生素抗性盒)，替换质粒内源的启动子(如抗生素抗性盒中的启动子)，和/或替换编码转录的蛋白的多核苷酸序列(如抗生素抗性基因的编码序列)。(参见，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning a Laboratory Manual,Second Ed.Cold Spring Harbor Press(1989))。
优选地，DNA质粒为适合于在哺乳动物宿主细胞中进行蛋白表达的表达载体。适合于在哺乳动物宿主细胞中进行蛋白表达的表达载体包括但不限于pcDNATM、pcDNA3TM、pVAX、pVAX-1、ADVAX、NTC8454等。优选地，表达载体基于pVAX-1，其可以进一步修饰以优化哺乳动物细胞中的蛋白表达。pVAX-1是DNA疫苗中常用的质粒，并且包含强的人巨细胞病毒立即早期(CMV-IE)启动子，随后是牛生长激素(bGH)衍生的多腺苷酸化序列(pA)。pVAX-1还含有pUC复制起点和由小原核启动子驱动的卡那霉素抗性基因，其允许细菌质粒增殖。
本申请的载体还可以是病毒载体。通常，病毒载体为遗传工程改造的病毒，其带有修饰的病毒DNA或RNA，其已经不具备感染性，但仍然包含病毒启动子和转基因，从而允许通过病毒启动子翻译转基因。因为病毒载体经常缺少感染性序列，所以它们要求辅助病毒或包装线以进行大规模转染。可以使用的病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、肠病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)载体、烟草花叶病毒载体、慢病毒(lentiviral)载体、沙粒病毒载体、复制缺陷型沙粒病毒载体或可复制型沙粒病毒载体、双节或三节沙粒病毒、感染性沙粒病毒载体、包含沙粒病毒基因组片段的核酸(其中所述基因组片段的一个开放阅读框是缺失的或功能性失活的(并且由本文所述的编码HBV抗原的核酸代替))、沙粒病毒，例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitidis virus，LCMV)，如克隆13株或MP株、以及沙粒病毒，例如呼宁病毒(Junin virus)，如Candid#1株等。载体还可以是非病毒载体。
优选地，病毒载体是腺病毒载体，如重组腺病毒载体。重组腺病毒载体可以例如源自人腺病毒(HAdV或AdHu)，或猿猴腺病毒，如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV)，或恒河猴腺病毒(rhAd)。优选地，腺病毒载体为重组人腺病毒载体，例如重组人腺病毒血清型26，或重组人腺病毒血清型5、4、35、7、48中的任一种等。在其他实施方案中，腺病毒载体为rhAd载体，如rhAd51、rhAd52或rhAd53。用于本申请的重组病毒载体可以利用本领域已知的方法根据本公开来制备。例如，根据遗传密码的简并性，可以设计编码相同的多肽的一些核酸序列。编码本申请的HBV抗原的多核苷酸可以任选地进行密码子优化以确保宿主细胞(如细菌或哺乳动物细胞)中的恰当表达。密码子优化是本领域中广泛使用的技术，获得密码子优化的多核苷酸的方法会是本领域技术人员根据本公开所熟知的。
本申请的载体，如DNA质粒或病毒载体(特别是腺病毒载体)可以包含任何调节元件以建立载体的常规功能，包括但不限于载体的多核苷酸序列编码的HBV抗原的复制和表达。调节元件包括但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化信号、翻译终止密码子、核糖体结合元件、转录终止子、选择标记、复制起点等。载体可以包含一个或多个表达盒。“表达盒”是载体的一部分，其指导细胞机器来产生RNA和蛋白。表达盒通常包含3个组分：启动子序列、开放阅读框和任选地包含多腺苷酸化信号的3’-未翻译区域(UTR)。开放阅读框(ORF)是阅读框，其含有所关注的蛋白的编码序列(如HBV抗原)，从起始密码子到终止密码子。表达盒的调节元件可以可操作地连接至编码所关注的HBV抗原的多核苷酸序列。如本文所用，术语“可操作地连接”以其最宽泛的合理语境使用，并且指多核苷酸元件以功能性关系连接。多核苷酸当其置于与另一多核苷酸的功能性关系中时，“可操作地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，则其可操作地连接至所述编码序列。适合用于本文所述的表达盒的任何组分可以以任何组合和任何次序使用以制备本申请的载体。
载体可以包含启动子序列，优选在表达盒中，以控制所关注的HBV抗原的表达。术语“启动子”以其常规的含义使用，并且指核苷酸序列，其起始可操作地连接的核苷酸序列的转录。启动子位于其转录的核苷酸序列的相同链的附近。启动子可以是组成型、诱导型或抑制型的。启动子可以是天然存在的或者合成的。启动子可以源自的来源包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物。启动子可以是同源启动子(即，源自与载体相同的遗传来源)或异源启动子(即，源自不同的载体或遗传来源)。例如，如果要使用的载体是DNA质粒，启动子可以是质粒内源的(同源)，或源自其他来源(异源)。优选地，启动子位于表达盒中编码HBV抗原的多核苷酸的上游。
可以使用的启动子的实例包括但不限于来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子，如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV立即早期启动子(CMV-IE)、Epstein Barr病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因的启动子，例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子，天然或合成的。
优选地，启动子为强真核启动子，优选巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)启动子。示例性的CMV-IE启动子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:17。
载体可以包含额外的多核苷序列，其稳定表达的转录物、增强RNA转录物的核输出和/或改善转录-翻译偶联。这类序列的实例包括多腺苷酸化信号和增强子序列。多腺苷酸化信号通常位于载体的表达盒中所关注蛋白(如HBV抗原)的编码序列的下游。增强子序列为调节DNA序列，当由转录因子结合时，其增强相关基因的转录。增强子序列优选位于载体的表达盒中编码HBV抗原的多核苷酸序列的上游，但位于启动子序列的下游。
根据本公开可以使用本领域技术人员已知的任何多腺苷酸化信号。例如，多腺苷酸化信号可以是SV40多腺苷酸化信号(如SEQ ID NO:24)、LTR多腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多腺苷酸化信号或人β-球蛋白多腺苷酸化信号。优选地，多腺苷酸化信号为牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号或SV40多腺苷酸化信号。示例性的bGH多腺苷酸化信号的核苷酸序列示于SEQ ID NO:11。示例性的SV40多腺苷酸化信号的核苷酸序列示于SEQ ID NO:24。
根据本公开可以使用本领域技术人员已知的任何增强子序列。例如，增强子序列可以为人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子(如来自CMV、HA、RSV或EBV的病毒增强子)。具体增强子的实例包括但不限于土拨鼠(Woodchuck)HBV转录后调节元件(WPRE)、源自人载脂蛋白A1前体(ApoAI)的内含子/外显子序列、人T细胞1型白血病病毒(HTLV-1)长末端重复(LTR)的未翻译R-U5结构域、剪接增强子、合成兔β-球蛋白内含子，或其任意组合。优选地，增强子序列为HTLV-1LTR的未翻译R-U5结构域、兔β-球蛋白内含子和剪接增强子的三种组成型元件的复合序列，其在本文中称为“三重增强子序列”。示例性的三重增强子序列的核苷酸序列示于SEQ ID NO:8。另一示例性增强子序列为SEQ IDNO:23所示的ApoAI基因片段。
载体可以包含编码信号肽序列的多核苷酸序列。优选地，编码信号肽序列的多核苷酸序列位于编码HBV抗原的多核苷酸序列的上游。信号肽通常指导蛋白的定位，促进蛋白从其产生的细胞分泌，和/或改善抗原表达和交叉提呈至抗原提呈细胞。信号肽，当从载体表达时，可以存在于HBV抗原的N末端，但被信号肽酶切割，例如当从细胞分泌时。切割了信号肽的表达的蛋白通常称为“成熟蛋白”。根据本公开，可以使用本领域已知的任何信号肽。例如，信号肽可以是cystatin S信号肽；免疫球蛋白(Ig)分泌信号，如Ig重链γ信号肽SPIgG或Ig重链ε信号肽SPIgE。
优选地，信号肽序列为cystatin S信号肽。cystatin S信号肽的示例性核酸和氨基酸序列分布示于SEQ ID NO:5和6。免疫球蛋白分泌信号的示例性核酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:18和19。
诸如DNA质粒的载体还可以包含细菌复制起点和抗生素抗性表达盒以用于在诸如大肠杆菌(E.coli.)的细菌细胞中选择和维持质粒。细菌复制起点和抗生素抗性盒可以在载体中位于编码HBV抗原的表达盒的相同方向或相反(逆向)方向。复制起点(ORI)是起始复制的序列，其使得质粒在细胞中复制和幸存。适合用于本申请的ORI的实例包括但不限于ColE1、pMB1、pUC、pSC101、R6K和15A，优选pUC。pUC ORI的示例性核苷酸序列示于SEQ IDNO:10。
用于在细菌细胞中选择和维持的表达盒通常包含可操作地连接至抗生素抗性基因的启动子序列。优选地，可操作地连接至抗生素抗性基因的启动子序列不同于可操作地连接至编码所关注蛋白(如HBV抗原)的多核苷酸序列的启动子序列。抗生素抗性基因可以是密码子优化的，并且抗生素抗性基因的序列组成通常调整为诸如大肠杆菌的细菌密码子使用。根据本公开可以使用本领域技术人员已知的任何抗生素抗性基因，包括但不限于卡那霉素抗性基因(Kanr)、氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)，以及赋予对氯霉素、博来霉素(bleomycin)、壮观霉素(spectinomycin)、羧苄青霉素等的抗性的基因。
优选地，载体的抗生素表达盒中的抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因(Kanr)。Kanr基因的序列示于SEQ ID NO:13。优选地，Kanr基因是密码子优化的。密码子优化的Kanr基因的示例性核酸序列示于SEQ ID NO:12。Kanr基因可以可操作地连接至其天然启动子，或者Kanr基因可以连接至异源启动子。在具体的实施方案中，Kanr可操作地连接至氨苄青霉素抗性基因(Ampr)启动子，其又称为bla启动子。bla启动子的示例性核苷酸序列示于SEQID NO:9。
在本申请的一具体实施方案中，载体为DNA质粒，其包含表达盒，所述表达盒包含编码选自HBV pol抗原和截短的HBV核心抗原的至少一种HBV抗原的多核苷酸，所述HBV pol抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:4至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；上游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，从5’端至3’端包含，启动子序列(优选SEQ ID NO:7的CMV启动子序列)、增强子序列(优选SEQ ID NO:8的三重增强子序列)和编码信号肽序列(优选具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的cystatin S信号肽)的多核苷酸序列；以及下游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，包含多腺苷酸化信号(优选SEQ ID NO:11的bGH多腺苷酸化信号)。这样的载体还包含抗生素抗性表达盒，其包含编码抗生素基因的多核苷酸，其可操作地连接至SEQ ID NO:9的Ampr(bla)启动子，位于编码抗生素抗性基因的多核苷酸的上游并且与其可操作地连接，所述抗生素抗性基因优选Kanr基因，更优选密码子优化的Kanr基因，其与SEQ ID NO:12至少90％相同，例如与SEQ ID NO:12至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:12 100％相同；和复制起点，优选SEQ ID NO:10的pUC ori。优选地，抗生素抗性盒和复制起点在质粒中以相对于HBV抗原表达盒相反的方向存在。包含上述特征的示例性DNA质粒示于图2A和2B中。
在本申请的另一具体实施方案中，载体为病毒载体，优选腺病毒载体，更优选Ad26或Ad35载体，其包含表达盒，所述表达盒包含多核苷酸，其编码选自HBV pol抗原和截短的HBV核心抗原的至少一种HBV抗原，所述HBV pol抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:4至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，所述截短的HBV核心抗原由SEQ IDNO:14的氨基酸序列组成；上游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，从5’端至3’端包含，启动子序列(优选SEQ ID NO:17的CMV启动子序列)、增强子序列(优选SEQ IDNO:23的ApoAI基因片段序列)和编码信号肽序列(优选免疫球蛋白分泌信号，其具有SEQ IDNO:19的氨基酸序列)的多核苷酸序列；以及下游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，包含多腺苷酸化信号(优选SEQ ID NO:24的SV40多腺苷酸化信号)。
在本申请的一实施方案中，诸如质粒DNA载体或病毒载体(优选腺病毒载体，更优选Ad26或Ad35载体)的载体编码HBV Pol抗原，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。优选地，载体包含HBV Pol抗原的编码序列，其与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3 100％相同。
在本申请的一实施方案中，诸如质粒DNA载体或病毒载体(优选腺病毒载体，更优选Ad26或Ad35载体)的载体编码截短的HBV核心抗原，其由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。优选地，载体包含截短的HBV核心抗原的编码序列，其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列至少90％相同，例如与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15 100％相同。
在本申请更另外的一实施方案中，诸如质粒DNA载体或病毒载体(优选腺病毒载体，更优选Ad26或Ad35载体)的载体编码融合蛋白，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HBV Pol抗原和由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的截短的HBV核心抗原。优选地，载体包含融合蛋白的编码序列，其包含截短的HBV核心抗原的编码序列，其可操作地连接至HBV Pol抗原的编码序列，所述截短的HBV核心抗原的编码序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同，例如与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15 98％、99％或100％相同，更优选为SEQ ID NO:15，所述HBV Pol抗原的编码序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16 98％、99％或100％相同，更优选为SEQ ID NO:16。优选地，截短的HBV核心抗原的编码序列通过接头的编码序列可操作地连接至HBV Pol抗原的编码序列，所述接头的编码序列与SEQ ID NO:22至少90％相同，例如与SEQ ID NO:22至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:22 98％、99％或100％相同。在本申请的具体实施方案中，载体包含融合蛋白的编码序列，其具有SEQ ID NO:15，其可操作地连接至SEQ ID NO:22，其进一步可操作地连接至SEQ ID NO:16。
本申请的编码HBV抗原的多核苷酸和表达载体可以根据本公开由本领域任何已知的方法制备。例如，利用标准分子生物学技术，可以将编码HBV抗原的多核苷酸导入或“克隆”入表达载体，所述标准分子生物学技术例如聚合酶链式反应(PCR)等，这是本领域技术人员熟知的。
细胞、多肽和抗体
本申请还提供细胞，优选分离的细胞，其包含本文所述的任何多核苷酸和载体。所述细胞可以用于例如重组蛋白制备或用于制备病毒颗粒。
因此，本申请的实施方案还涉及一种制备本申请的HBV抗原的方法。所述方法包括用表达载体(所述表达载体包含编码本申请的HBV抗原的多核苷酸，其可操作地连接至启动子)转染宿主细胞，使转染的细胞在适合于表达HBV抗原的条件下生长，并且任选地纯化或分离细胞中表达的HBV抗原。HBV抗原可以通过本领域已知的任何方法从细胞中分离或收集，包括亲和色谱、大小排阻色谱等。用于重组蛋白表达的技术是本领域技术人员根据本公开熟知的。表达的HBV抗原还可以进行研究，而无需纯化或分离表达的蛋白，例如通过分析细胞的上清，所述细胞经编码HBV抗原的表达载体转染，并且在适合于表达HBV抗原的条件下生长。
因此，本申请还提供非天然存在的或重组多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少90％相同。如上文和下文所述，本申请还涵盖编码这些序列的分离的核酸分子，包含可操作地连接至启动子的这些序列的载体，以及包含所述多肽、多核苷酸或载体的组合物。
在本申请的一实施方案中，重组多肽包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。优选地，非天然存在的或重组多肽由SEQ IDNO:2组成。
在本申请的另一实施方案中，非天然存在的或重组多肽包含氨基酸序列，其与SEQID NO:4的氨基酸序列至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。优选地，非天然存在的或重组多肽包含SEQ ID NO:4。
在本申请的另一实施方案中，非天然存在的或重组多肽包含氨基酸序列，其与SEQID NO:14的氨基酸序列至少90％相同，例如与SEQ ID NO:14 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。优选地，非天然存在的或重组多肽由SEQ ID NO:14组成。
本申请还提供抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合本申请的非天然存在的多肽。在本申请的一实施方案中，对本申请的非天然存在的HBV抗原具有特异性的抗体不特异性地结合另一HBV抗原。例如，特异性地结合具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HBV Pol抗原的本申请的抗体不特异性地结合不具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HBV Pol抗原。
如本所用，术语“抗体”包括多克隆、单克隆、嵌合、人源化、Fv、Fab和F(ab′)2抗体；双功能杂合体(如Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17:105,1987)、单链(Huston etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879,1988；Bird et al.,Science 242:423,1988)；以及具有改变的恒定区的抗体(如U.S.Pat.No.5,624,821)。
如本文所用，“特异性地结合”抗原的抗体指以1×10-7M或更小的KD结合抗原的抗体。优选地，“特异性地结合”抗原的抗体以1×10-8M或更小、更优选5×10-9M或更小、1×10- 9M或更小、5×10-10M或更小或者1×10-10M或更小的KD结合抗原。术语“KD”指解离常数，其由Kd比Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以利用本领域已知的方法根据本公开来测定。例如，抗体的KD可以利用表面等离子体共振，如利用生物传感系统(如
系统)，或利用生物层干涉技术(如Octet RED96系统)来测定。
抗体的KD值越小，抗体结合靶抗原的亲和力就越高。
组合物、免疫原性组合和疫苗
本申请还涉及组合物、免疫原性组合，更具体地试剂盒，和疫苗，其包含本申请的一种或多种HBV抗原、编码一种或多种HBV抗原的多核苷酸和/或载体。本文所述的任何本申请的HBV抗原、多核苷酸(包括RNA和DNA)和/或载体可以用于本申请的组合物、免疫原性组合或试剂盒和疫苗。
本申请还提供一种组合物，其包含分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其编码截短的HBV核心抗原或者HBV聚合酶抗原，所述截短的HBV核心抗原由与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同的氨基酸序列组成，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列；一种包含所述分离的或非天然存在的核酸分子的载体，和/或一种分离的或非天然存在的多肽，其由所述分离的或非天然存在的核酸分子编码。
在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14100％相同。
在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其编码HBV Pol抗原，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。
在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原；和分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)，其包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码HBV Pol抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:14至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14 100％相同，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。截短的HBV核心抗原和HBV Pol抗原的编码序列可以存在于相同的分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)中，或者存在于两种不同的分离的或非天然存在的核酸分子(DNA或RNA)中。
在本申请的一实施方案中，组合物包含载体，优选DNA质粒或病毒载体(如腺病毒载体)，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14 100％相同。
在本申请的一实施方案中，组合物包含载体，优选DNA质粒或病毒载体(如腺病毒载体)，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码HBV Pol抗原，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。
在本申请的一实施方案中，组合物包含载体，优选DNA质粒或病毒载体(如腺病毒载体)，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14 100％相同；以及载体，优选DNA质粒或病毒载体(如腺病毒载体)，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码HBV Pol抗原，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。包含截短的HBV核心抗原的编码序列的载体和包含HBV Pol抗原的编码序列的载体可以是相同的载体或者两种不同的载体。
在本申请的一实施方案中，组合物包含载体，优选DNA质粒或病毒载体(如腺病毒载体)，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含截短的HBV核心抗原，其可操作地连接至HBV Pol抗原，或者反之亦然，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14 100％相同，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。优选地，融合蛋白还包含接头，其可操作地将截短的HBV核心抗原连接至HBV Pol抗原，或者反之亦然。优选地，接头具有(AlaGly)n的氨基酸序列，其中n为2-5的整数。
在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的截短的HBV核心抗原，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14 100％相同。
在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的HBV Pol抗原，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。
在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的截短的HBV核心抗原和分离的或非天然存在的HBV Pol抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:14 100％相同，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。
在本申请的一实施方案中，组合物包含分离的或非天然存在的融合蛋白，所述融合蛋白包含截短的HBV核心抗原，其可操作地连接至HBV Pol抗原，或者反之亦然，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14 100％相同，所述HBV Pol抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。优选地，融合蛋白还包含接头，其可操作地将截短的HBV核心抗原连接至HBV Pol抗原，或者反之亦然。优选地，接头具有(AlaGly)n的氨基酸序列，其中n为2-5的整数。
本申请还涉及一种免疫原性组合或试剂盒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸表达本申请的实施方案的截短的HBV核心抗原和HBV pol抗原。本文所述的编码本申请的HBV核心和pol抗原的任何多核苷酸和/或载体可以用于本申请的免疫原性组合或试剂盒。
根据本申请的实施方案，疫苗组合或试剂盒包含：
(a)第一非天然存在的核酸分子，其包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原具有与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；
(b)第二非天然存在的核酸分子，其包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于相同的非天然存在的核酸分子或者存在于两种不同的非天然存在的核酸分子中。
根据本申请的实施方案，疫苗组合或试剂盒中的多核苷酸可以是连接的或者分离的，使得从这类多核苷酸表达的HBV抗原融合在一起或者作为分别的蛋白产生，不论从相同或不同的多核苷酸中表达。在一实施方案中，第一和第二多核苷酸存在于分别的载体中，如DNA质粒或病毒载体，在相同或分别的组合物中组合使用，使得表达的蛋白也是分别的蛋白，但是组合使用。在另一实施方案中，第一和第二多核苷酸编码的HBV抗原可以从相同载体表达，从而产生HBV核心-pol融合抗原。任选地，核心和pol抗原可以通过短接头连接或融合在一起。或者，第一和第二多核苷酸编码的HBV抗原可以利用核心和pol抗原编码序列之间的核糖体滑动位点(ribosomal slippage site)(又称为顺式水解酶位点)独立地从单一载体表达。这种策略造成双顺反子表达载体，其中单独的核心和pol抗原从单一的mRNA转录物产生。从这样的双顺反子表达载体产生的核心和pol抗原可以具有额外的N或C末端残基，取决于mRNA转录物上编码序列的排序。可以用于这一目的的核糖体滑动位点的实例包括但不限于来自口蹄疫病毒(FMDV)的FA2滑动位点。另一种可能性是第一和第二多核苷酸编码的HBV抗原可以独立地从两种分别的载体表达，一种表达HBV核心抗原，而另一种表达HBVpol抗原。
在一优选的实施方案中，第一和第二多核苷酸存在于分别的载体中，例如DNA质粒或病毒载体。优选地，分别的载体存在于相同的组合物中。
根据本申请的优选实施方案，免疫原性组合或试剂盒包含存在于第一载体中的第一多核苷酸以及存在于第二载体中的第二多核苷酸。第一和第二载体可以相同或不同。优选地，载体为DNA质粒。
在本申请的一具体实施方案中，免疫原性组合或试剂盒包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含多核苷酸，其编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2 100％相同，所述第二载体包含多核苷酸，其编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少98％相同，优选与SEQ ID NO:4 100％相同。
在本申请的一具体实施方案中，第一载体为第一DNA质粒，并且第二载体为第二DNA质粒。第一和第二DNA质粒各自包含复制起点，优选SEQ ID NO:10的pUC ORI，和抗生素抗性盒，优选包含密码子优化的Kanr基因，其具有与SEQ ID NO:12至少90％相同的核苷酸序列，优选在bla启动子的控制下，例如SEQ ID NO:9所示的bla启动子。第一和第二DNA质粒各自独立地还包含启动子序列、增强子序列和编码信号肽序列的多核苷酸序列中的至少一个，可操作地连接至第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列。优选地，第一和第二DNA质粒各自包含上游序列，其可操作地连接至第一多核苷酸或第二多核苷酸，其中所述上游序列从5’端至3’端包含，SEQ ID NO:7的启动子序列、SEQ ID NO:8的增强子序列以及编码信号肽序列的多核苷酸序列，所述信号肽序列具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。第一和第二DNA质粒各自还可以包含位于HBV抗原的编码序列下游的多腺苷酸化信号，例如SEQ ID NO:11的bGH多腺苷酸化信号。
在本申请的一具体实施方案中，第一载体为第一病毒载体，并且第二载体为第二病毒载体。优选地，第一和第二病毒载体各自为腺病毒载体，更优选Ad26或Ad35载体，其包含表达盒，所述表达盒包含多核苷酸，所述多核苷酸编码本申请的HBV pol抗原或截短的HBV核心抗原；上游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，从5’端至3’端包含，启动子序列(优选SEQ ID NO:17的CMV启动子序列)、增强子序列(优选SEQ ID NO:23的ApoAI基因片段序列)和编码信号肽序列(优选具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的免疫球蛋白分泌信号)的多核苷酸序列；以及下游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，包含多腺苷酸化信号(优选SEQ ID NO:24的SV40多腺苷酸化信号)。
在另一优选的实施方案中，第一和第二多核苷酸存在于单一载体中，例如DNA质粒或病毒载体。优选地，单一载体为腺病毒载体，更优选Ad26载体，其包含表达盒，所述表达盒包含多核苷酸，所述多核苷酸编码本申请的HBV pol抗原和截短的HBV核心抗原，优选地，编码融合蛋白形式的本申请的HBV pol抗原和截短的HBV核心抗原；上游序列，其可操作地连接至编码HBV pol和截短的核心抗原的多核苷酸，从5’端至3’端包含，启动子序列(优选SEQID NO:17的CMV启动子序列)、增强子序列(优选SEQ ID NO:23的ApoAI基因片段序列)和多核苷酸序列，其编码信号肽序列(优选具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的免疫球蛋白分泌信号)；以及下游序列，其可操作地连接至编码HBV抗原的多核苷酸，包含多腺苷酸化信号(优选SEQ ID NO:24的SV40多腺苷酸化信号)。
当本申请的免疫原性组合包含第一载体(如DNA质粒或病毒载体)和第二载体(如DNA质粒或病毒载体)时，第一和第二载体各自的量没有特别的限制。例如，第一DNA质粒和第二DNA质粒可以以按重量10:1-1:10的比例存在，例如按重量10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10的比例。优选地，第一和第二DNA质粒以按重量1:1的比例存在。
本申请的组合物和免疫原性组合可以包含额外的多核苷酸或载体，其编码额外的HBV抗原和/或额外的HBV抗原或其免疫原性片段。但是，在特定的实施方案中，本申请的组合物和免疫原性组合不包含某些抗原。
在一具体的实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合或试剂盒不包含HBsAg或编码HBsAg的多核苷酸序列。
在另一具体的实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合或试剂盒不包含HBVL蛋白或编码HBV L蛋白的多核苷酸序列。
在本申请的另一具体实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合不包含HBV包膜蛋白或编码HBV包膜蛋白的多核苷酸序列。
本申请的组合物和免疫原性组合还可以包含药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂为无毒的，并且不干扰活性成分的效力。药学上可接受的载剂可以包括一种或多种赋形剂，例如粘合剂、崩解剂、溶胀剂、助悬剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、风味剂、甜味剂、防腐剂、染料、增溶剂和包衣剂。药学上可接受的载剂可以包括媒介物，例如脂质(纳米)颗粒。载剂或其他材料的确切性质可以取决于给药途径，例如肌内、皮内、皮下、口服、静脉内、皮肤、粘膜内(例如肠)、鼻内或腹膜内途径。对于液体注射制剂，例如混悬剂和溶液剂，合适的载剂和添加剂包括水、二醇、油、醇、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂，例如散剂、胶囊剂、囊片、软胶囊剂和片剂，合适的载剂和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。对于鼻喷雾剂/吸入剂混合物，水溶液/悬浮液可以包含水、二醇、油、软化剂、稳定剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂、调味剂等作为合适的载剂和添加剂。
本申请的组合物和免疫原性组合可以配制成适合于向受试者给药的任何物质以促进给药和改善效力，包括但不限于口服(肠)给药和肠胃外注射。肠胃外注射包括静脉内注射或输注、皮下注射、皮内注射和肌内注射。本申请的组合物还可以配制为用于其他给药途径，包括经粘膜、眼、直肠、长效植入、舌下给药、舌下给药(under the tongue)、从口腔粘膜绕过门脉循环、吸入或鼻内给药。
在本申请的优选实施方案中，本申请的组合物和免疫原性组合配制为用于肠胃外注射，优选皮下、皮内注射或肌内注射、更优选肌内注射。
根据本申请的实施方案，用于给药的组合物和免疫原性组合通常包括在药学上可接受的载剂中的缓冲溶液，例如含水载剂，例如缓冲盐水等，如磷酸缓冲盐水(PBS)。组合物和免疫原性组合还可以包含近似生理条件所需的药物上可接受的物质，例如pH调节剂和缓冲剂。例如，包含质粒DNA的本申请的组合物或免疫原性组合可以包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为药学上可接受的载剂。质粒DNA可以存在的浓度有，例如0.5mg/mL-5mg/mL、如0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL，优选1mg/mL。
可以根据本领域熟知的方法将本申请的组合物和免疫原性组合配制成疫苗(也称为“免疫原性组合物”)。这类组合物还可以包含佐剂以增强免疫应答。根据本公开，可以通过本领域技术人员熟知的技术来确定制剂中每种组分的最佳比例。
在本申请具体的实施方案中，组合物或免疫原性组合为DNA疫苗。DNA疫苗通常包括细菌质粒，其含有多核苷酸，所述多核苷酸编码强真核启动子控制下的所关注的抗原。一旦质粒递送到宿主的细胞质中，编码的抗原就被内源性产生和加工。所产生的抗原通常诱导体液和细胞介导的免疫应答。DNA疫苗是有利的，至少是因为它们提供改进的安全性，是温度稳定的，可以容易地适合于表达抗原性变体，并且易于制备。本申请的任何DNA质粒可以用于制备这样的DNA疫苗。
在本申请的其他具体实施方案中，组合物或免疫原性组合为RNA疫苗。RNA疫苗通常包含至少一个单链RNA分子，其编码所关注的抗原，例如HBV抗原。与DNA疫苗类似，一旦RNA递送到宿主的细胞质中，编码的抗原就被内源性产生和加工，诱导体液和细胞介导的免疫应答。RNA序列可以是密码子优化的，以改善翻译效率。根据本公开，可以通过本领域已知的任何方法修饰RNA分子，以增强稳定性和/或翻译，例如通过添加如至少30个腺苷残基的polyA尾巴，和/或用修饰的核糖核苷酸(如7-甲基鸟苷帽)给5末端加帽，这可以在RNA合成过程中加入或在RNA转录后进行酶促工程改造。RNA疫苗也可以是由甲病毒表达载体开发的自我复制的RNA疫苗。自我复制RNA疫苗包含复制酶RNA分子，其衍生自属于甲病毒科的病毒，具有控制HBV抗原RNA复制的亚基因组启动子，其后是位于复制酶下游的人工poly A尾巴。
在某些实施方案中，佐剂包含在本申请的组合物或免疫原性组合中，或者与本申请的组合物或免疫原性组合共给药。佐剂的使用是任选的，并且当组合物用于疫苗接种目的时可以进一步增强免疫应答。适合于与本申请的组合物共给药或包含于其中的佐剂应当优选是这样的佐剂，其在人中是潜在安全、良好耐受且有效的。佐剂可以是小分子或抗体，包括但不限于免疫检验点抑制剂(如抗PD1、抗TIM-3等)、toll样受体激动剂(如TLR7激动剂和/或TLR8激动剂)、RIG-1激动剂、IL-15超激动剂(Altor Bioscience)、突变体IRF3和IRF7基因佐剂、STING激动剂(Aduro)、FLT3L基因佐剂、IL-12基因佐剂和IL-7-hyFc。佐剂还可以例如从以下抗HBV剂选择：HBV DNA聚合酶抑制剂；免疫调节剂；toll样受体7调节剂；toll样受体8调节剂；toll样受体3调节剂；干扰素α受体配体；透明质酸酶抑制剂；IL-10的调节剂；HBsAg抑制剂；toll样受体9调节剂；亲环蛋白抑制剂；HBV预防性疫苗；HBV治疗性疫苗；HBV病毒进入抑制剂；靶向病毒mRNA的反义寡核苷酸，更具体地，抗HBV反义寡核苷酸；短干扰RNA(siRNA)，更具体地，抗HBV siRNA；核酸内切酶调节剂；核糖核苷酸还原酶的抑制剂；乙型肝炎病毒E抗原抑制剂；靶向乙型肝炎病毒的表面抗原的HBV抗体；HBV抗体；CCR2趋化因子拮抗剂；胸腺素激动剂；细胞因子，如IL12；衣壳组装调节剂、核蛋白抑制剂(HBV核心或衣壳蛋白抑制剂)；核酸聚合物(NAP)；维甲酸诱导基因1的刺激物；NOD2的刺激物；重组胸腺素α-1；乙型肝炎病毒复制抑制剂；PI3K抑制剂；cccDNA抑制剂；免疫检验点抑制剂，如PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂、TIGIT抑制剂、Lag3抑制剂和CTLA-4抑制剂；表达于免疫细胞(更具体地，T细胞)上的共刺激受体(如CD27、CD28等)的激动剂；BTK抑制剂；用于治疗HBV的其他药物；IDO抑制剂；精氨酸酶抑制剂；和KDM5抑制剂。
本申请还提供制备本申请的组合物和免疫原性组合的方法。制备组合物或免疫原性组合的方法包括将本申请的编码HBV抗原的分离的多核苷酸、载体和/或多肽与一种或多种药学上可接受的载剂混合。本领域技术人员会熟悉用于制备这类组合物的常规技术。
诱导免疫应答的方法
本申请还提供给用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答的方法，其包括向所述受试者给药免疫原性有效量的本申请的组合物免或疫原性组合物。本文所述的本申请的任何组合物和免疫原性组合可以用于本申请的方法。
如本文所用，术语“感染”指导致疾病的物质侵入宿主。如果导致疾病的物质能够侵入宿主，并在该宿主中复制或增殖，则认为其是“感染性”的。感染性物质的实例包括病毒，如HBV和某些腺病毒种、朊病毒、细菌、真菌、原生动物等。“HBV感染”具体地指宿主有机体，例如宿主有机体的细胞和组织被HBV侵入。
短语“诱导免疫应答”，当对于本文所述的方法使用时，涵盖在有需要的受试者中引起针对感染(例如HBV感染)的期望的免疫应答或效果。“诱导免疫应答”还涵盖提供用于针对病原性物质(例如HBV)进行治疗的治疗性免疫。如本文所用，术语“治疗性免疫”或“治疗性免疫应答”表示接种疫苗的受试者能够控制针对其进行了疫苗接种的病原性物质的感染，例如通过接种HBV疫苗而赋予针对HBV感染的免疫。在一实施方案中，“诱导免疫应答”表示在有需要的受试者中产生免疫，例如以提供针对疾病(例如HBV感染)的治疗效果。在某些实施方案中，“诱导免疫应答”指引起或改善针对HBV感染的细胞免疫，例如T细胞应答。在某些实施方案中，“诱导免疫应答”指引起或改善针对HBV感染的体液免疫应答。在某些实施方案中，“诱导免疫应答”指引起或改善针对HBV感染的细胞和体液免疫应答。
如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”表示接种疫苗的受试者能够控制针对其进行了疫苗接种的病原性物质的感染。通常，已经发展了“保护性免疫应答”的受试者仅发展轻度至中度的临床症状或完全没有症状。通常，针对某物质具有“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者不会因为该物质的感染而死亡。
通常，给药本申请的组合物和免疫原性组合，在HBV感染或发展HBV感染的特征性症状后，会具有产生针对HBV的免疫应答的治疗目的，例如用于治疗性疫苗接种。
如本文所用，“免疫原性有效量”或“免疫学有效量”表示组合物、多核苷酸、载体或抗原的量足以在有需要的受试者中诱导期望的免疫效果或免疫应答。免疫原性有效量可以是足以在有需要的受试者中诱导免疫应答的量。免疫原性有效量可以是足以在有需要的受试者中产生免疫的量，例如提供针对疾病(例如HBV感染)的保护效果。免疫原性有效量可以取决于各种因素而变化，例如受试者的身体状况、年龄、体重、健康等；特定的应用，如提供保护性免疫或治疗性免疫；以及特定的疾病，如病毒感染，免疫对于其是期望的。免疫原性有效量可以由本领域技术人员根据本公开容易地确定。
在本申请的具体实施方案中，免疫原性有效量指组合物或免疫原性组合的量，其足以实现1、2、3、4种或更多种以下效果：(i)减少或改善HBV感染或与其相关的症状的严重性；(ii)减少HBV感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)防止HBV感染或与其相关的症状的进展；(iv)使得HBV感染或与其相关的症状消退；(v)防止HBV感染或与其相关的症状发展或发作；(vi)防止HBV感染或与其相关的症状复发；(vii)减少患有HBV感染的受试者的住院治疗；(viii)减少患有HBV感染的受试者的住院长度；(ix)提高患有HBV感染的受试者的存活；(x)消除受试者中的HBV感染；(xi)抑制或减少受试者中的HBV复制；和/或(xii)增强或改进另一疗法的预防或治疗效果。
免疫原性有效量还可以是这样的量，其足以与临床血清学转换演变一致地降低HBsAg水平；实现与受试者的免疫系统的受感染肝细胞的减少相关的持续HBsAg清除；诱导HBV抗原特异性的活化的T细胞群体；和/或实现12个月内HBsAg的持续丧失。目标指数的示例包括低于500个拷贝的HBsAg国际单位(IU)阈值的较低的HBsAg和/或较高的CD8计数。
作为一般性指导，当对于DNA质粒使用时，免疫原性有效量可以为约0.1mg/mL-10mg/mL的总DNA质粒，例如0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL.0.75mg/mL1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL。优选地，免疫原性有效量的DNA质粒为8mg/mL以下，更优选6mg/mL以下，甚至更优选3-4mg/mL。免疫原性有效量可以来自一种载体或质粒，或者来自多种载体或质粒。免疫原性有效量可以在单一的组合物中给药，或者在多个组合物中给药，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个组合物(例如，片剂、胶囊剂或注射剂，或者适合于皮内递送的任何组合物，如利用皮内递送贴剂进行皮内递送)，其中多种胶囊剂或注射剂的给药一起向受试者提供免疫原性有效量。例如，当使用两种DNA质粒时，免疫原性有效量可以是3-4mg/mL，即每种质粒1.5-2mg/mL。在所谓的初免-加强方案中，还可以向受试者给药免疫原性有效量，然后向相同的受试者给药另一剂量的免疫原性有效量。初免-加强方案的一般概念是疫苗领域技术人员熟知的。按需要，还可以任选地向方案中加入进一步加强的给药。
通过混合两种质粒并将混合物递送至单一的解剖学部位，可以向受试者给药免疫原性组合，其包含两种DNA质粒，例如编码HBV核心抗原的第一DNA质粒和编码HBV pol抗原的第二DNA质粒。或者可以进行两种分别的免疫接种，各自递送单一的表达质粒。在这类方案中，无论两种质粒在单一免疫接种中作为混合物或者在两个分别的免疫接种中给药，第一DNA质粒和第二DNA质粒可以以按重量10:1-1:10的比例给药，例如按重量10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。优选地，第一DNA质粒和第二DNA质粒以按重量1:1的比例给药。
优选地，要根据本申请的方法治疗的受试者为HBV感染的受试者，特别是患有慢性HBV感染的受试者。急性HBV感染的特征在于固有免疫系统的有效激活，补充有后续的广泛适应性反应(例如，HBV特异性T细胞，中和抗体)，其通常造成成功抑制复制或者去除受感染的肝细胞。相比之下，这类反应由于高病毒和抗原负荷而受损或减少，例如HBV包膜蛋白大量产生并且可以在1,000倍过量于感染性病毒的亚病毒颗粒中释放。
慢性HBV感染描述为阶段(phase)，特征在于病毒负荷、肝酶水平(坏死炎性(necroinflammatory)活性)、HBeAg或HBsAg负荷，或者这些抗原的抗体的存在。cccDNA水平保持相对恒定，约10-50个拷贝/细胞，虽然病毒血症可以变化很大。cccDNA物质的持续导致慢性。更具体地，慢性HBV感染的阶段包括(i)免疫耐受阶段，其特征在于高病毒负荷以及正常的或最小提升的肝酶；(ii)免疫激活HBeAg阳性阶段，其中观察到较低或下降水平的病毒复制，伴随有明显升高水平的肝酶；(iii)无活性HBsAg载体(carrier)阶段，这是低复制状态，具有血清中的低病毒负荷和正常的肝酶水平，其可能伴随HBeAg血清学转换；以及(iv)HBeAg阴性阶段，其中周期性地发生病毒复制(再激活)，伴有肝酶水平的波动，pre-core和/或基本核心(basal core)启动子中的突变是常见的，使得受感染的细胞不产生HBeAg。
如本文所用，“慢性HBV感染”指受试者具有HBV可检测的存在6个月以上。患有慢性HBV感染的受试者可以处于慢性HBV感染的任何阶段。慢性HBV感染根据本领域中通常的含义理解。慢性HBV感染可以例如特征在于急性HBV感染后持续存在HBsAg达6个月或更长。例如，本文所指的慢性HBV感染遵循疾病预防控制中心(CDC)发布的定义，根据该定义，慢性HBV感染可以由实验室标准来表征，例如(i)乙型肝炎B核心抗原(IgM抗-HBc)的IgM抗体阴性，并且乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)或乙型肝炎病毒DNA的核酸测试阳性；或者(ii)HBsAg或HBV DNA的核酸测试阳性，或者HBeAg至少相隔6个月两次阳性。
优选地，免疫原性有效量指本申请的组合物或免疫原性组合的量，其足以治疗慢性HBV感染。
在一些实施方案中，患有慢性HBV感染的受试者正进行核苷类似物(NUC)治疗，并且是NUC抑制的。如本文所用，“NUC抑制”指受试者具有不可检测的HBV病毒水平和稳定的丙氨酸转氨酶(ALT)水平达至少6个月。核苷/核苷酸类似物治疗的实例包括HBV聚合酶抑制剂，例如恩替卡韦(entecavir)和替诺福韦(tenofovir)。优选地，患有慢性HBV感染的受试者不患有晚期肝纤维化或肝硬化。这样的受试者通常会具有纤维化的3以下的METAVIR分数和9kPa以下的肝脏瞬时弹性硬度检查(fibroscan)结果。METAVIR分数为评分系统，其通常用于评价乙型肝炎患者的肝活检中的组织病理学评价的炎症和纤维化的程度。该评分系统指定两个标准化数字，一个反映炎症程度，而另一个反映纤维化程度。
据信慢性HBV的消除或减少可能实现包括病毒诱导的肝硬化和肝细胞癌在内的严重肝病的早期疾病阻断。因此，本申请的方法还可以用作治疗HBV诱导的疾病的疗法。HBV诱导的疾病的实例包括但不限于肝硬化、癌症(如肝细胞癌)和纤维化，特别是特征在于纤维化的3或更高的METAVIR分数的晚期纤维化。在这类实施方案中，免疫原性有效量是这样的量，其足以实现12个月内HBsAg的持续丧失以及临床疾病(如肝硬化、肝细胞癌等)的明显减少。
本申请实施方案的方法还包括向有需要的受试者给药另一免疫原性剂(如另一HBV抗原或其他抗原)或另一抗HBV剂(如核苷类似物或其他抗HBV剂)，与本申请的组合物组合。例如，另一抗HBV剂或免疫原性剂可以是小分子或抗体，包括但不限于免疫检验点抑制剂(如抗PD1、抗TIM-3等)、toll样受体激动剂(如TLR7激动剂和/或TLR8激动剂)、RIG-1激动剂、IL-15超激动剂(Altor Bioscience)、突变体IRF3和IRF7基因佐剂、STING激动剂(Aduro)、FLT3L基因佐剂、IL-12基因佐剂、IL-7-hyFc；结合HBV env的CAR-T(S-CAR细胞)；衣壳组装调节剂；cccDNA抑制剂、HBV聚合酶抑制剂(如恩替卡韦和替诺福韦)。一种或多种其他抗HBV活性剂可以是例如，小分子、抗体或其抗原结合片段、多肽、蛋白或核酸。一种或多种其他抗HBV剂可以例如选自HBV DNA聚合酶抑制剂；免疫调节剂；toll样受体7调节剂；toll样受体8调节剂；toll样受体3调节剂；干扰素α受体配体；透明质酸酶抑制剂；IL-10的调节剂；HBsAg抑制剂；toll样受体9调节剂；亲环蛋白抑制剂；HBV预防性疫苗；HBV治疗性疫苗；HBV病毒进入抑制剂；靶向病毒mRNA的反义寡核苷酸，更具体地，抗HBV反义寡核苷酸；短干扰RNA(siRNA)，更具体地，抗HBV siRNA；核酸内切酶调节剂；核糖核苷酸还原酶的抑制剂；乙型肝炎病毒E抗原抑制剂；靶向乙型肝炎病毒的表面抗原的HBV抗体；HBV抗体；CCR2趋化因子拮抗剂；胸腺素激动剂；细胞因子，如IL12；衣壳组装调节剂、核蛋白抑制剂(HBV核心或衣壳蛋白抑制剂)；核酸聚合物(NAP)；维甲酸诱导基因1的刺激物；NOD2的刺激物；重组胸腺素alpha-1；乙型肝炎病毒复制抑制剂；PI3K抑制剂；cccDNA抑制剂；免疫检验点抑制剂，如PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂、TIGIT抑制剂、Lag3抑制剂和CTLA-4抑制剂；表达于免疫细胞(更具体地，T细胞)上的共刺激受体(如CD27、CD28等)的激动剂；BTK抑制剂；用于治疗HBV的其他药物；IDO抑制剂；精氨酸酶抑制剂；和KDM5抑制剂。
递送方法
根据本公开，可以通过本领域任何已知的方法将本申请的组合物和免疫原性组合向受试者给药，包括但不限于肠胃外给药(如肌内、皮下、静脉内或皮内注射)、口服给药、经皮给药和经鼻给药。优选地，组合物和免疫原性组合通过肠胃外给药(如通过肌内注射或皮内注射)或经皮给药。
在本申请的一些实施方案中，其中组合物或免疫原性组合包含一种或多种DNA质粒，给药可以通过皮肤注射进行，例如肌内或皮内注射，优选肌内注射。肌内注射可与电穿孔结合，即施加电场以促进DNA质粒向细胞的递送。如本文所用，术语“电穿孔”指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观途径(孔)。在体内电穿孔过程中，将适当强度和持续时间的电场施加到细胞上，诱导细胞膜通透性增强的瞬态，从而使细胞能够吸收自行无法穿过细胞膜的分子。通过电穿孔产生这样的孔促进生物分子，如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物等从细胞膜的一侧通过到另一侧。体内电穿孔用于递送DNA疫苗已显示显著增加宿主细胞对质粒的吸收，同时还导致注射部位的轻度至中度炎症。因此，与常规注射相比，皮内或肌内电穿孔显著改善转染效率和免疫应答(例如分别高达1,000倍和100倍)。
在典型的实施方案中，将电穿孔与肌内注射结合。但是，也可以将电穿孔与其他形式的肠胃外给药相结合，例如皮内注射、皮下注射等。
可以使用电穿孔装置来完成通过电穿孔对本申请的组合物、免疫原性组合或疫苗的给药，所述电穿孔装置可以配置成将能量脉冲有效传递至哺乳动物期望的组织，以造成细胞膜内可逆孔的形成。电穿孔装置可以包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔组件可以包括电穿孔设备的以下组件中的一个或多个：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件、电源和电源开关。可以使用体内电穿孔装置完成电穿孔。可以促进本申请的组合物和免疫原性组合递送的电穿孔装置和电穿孔方法，特别是包括DNA质粒那些，的实例包括
(InovioPharmaceuticals,Blue Bell,PA)、Elgen electroporator(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)Tri-GridTM递送系统(Ichor Medical Systems,Inc.,San Diego,CA92121)，以及以下中描述的那些：美国专利号7,664,545、美国专利号8,209,006、美国专利号9,452,285、美国专利号5,273,525、美国专利号6,110,161、美国专利号6,261,281、美国专利号6,958,060和美国专利号6,939,862、美国专利号7,328,064、美国专利号6,041,252、美国专利号5,873,849、美国专利号6,278,895、美国专利号6,319,901、美国专利号6,912,417、美国专利号8,187,249、美国专利号9,364,664、美国专利号9,802,035、美国专利号6,117,660以及国际专利申请公布WO2017172838，其整体援引加入本文。体内电穿孔装置的其他实例描述于与本申请同一天提交的国际专利申请，题为“递送乙型肝炎病毒(HBV)疫苗的方法和装置”，代理人案号688097-405WO1，其内容整体援引加入本文。本申请还涵盖用于递送本申请的组合物和免疫原性组合的脉冲电场的用途，例如如美国专利号6,697,669所描述，其整体援引加入本文。
本申请的其他实施方案中，其中组合物或免疫原性组合包含一种或多种DNA质粒，给药方法是经皮给药。经皮给药可以与表皮皮肤磨损结合使用，以促进DNA质粒向细胞的递送。例如，皮肤病贴剂可以用于表皮皮肤磨损。在去除皮肤病学贴剂后，可以将组合物或免疫原性组合沉积在磨损的皮肤上。
递送方法不限于上述实施方案，并且可以使用用于细胞内递送的任何方式。本申请的方法考虑的其他细胞内递送方法包括但不限于脂质体包封、纳米颗粒等。
佐剂
在本申请的一些实施方案中，诱导针对HBV的免疫应答的方法还包括给药佐剂。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，并且定义为一种或多种引起免疫系统刺激的物质。在本文上下文中，佐剂用于增强对本申请的HBV抗原和抗原性HBV多肽的免疫应答。
根据本申请的实施方案，佐剂可以存在于本申请的免疫原性组合或组合物中，或者在分别的组合物中给药。佐剂可以是例如小分子或抗体。适合用于本申请的佐剂的实例包括但不限于免疫检验点抑制剂(如抗PD1、抗TIM-3等)、toll样受体激动剂(如TLR7和/或TLR8激动剂)、RIG-1激动剂、IL-15超激动剂(Altor Bioscience)、突变体IRF3和IRF7基因佐剂、STING激动剂(Aduro)、FLT3L基因佐剂、IL-12基因佐剂和IL-7-hyFc。佐剂的实例例如可以从以下抗HBV剂中选择：HBV DNA聚合酶抑制剂；免疫调节剂；toll样受体7调节剂；toll样受体8调节剂；toll样受体3调节剂；干扰素α受体配体；透明质酸酶抑制剂；IL-10的调节剂；HBsAg抑制剂；toll样受体9调节剂；亲环蛋白抑制剂；HBV预防性疫苗；HBV治疗性疫苗；HBV病毒进入抑制剂；靶向病毒mRNA的反义寡核苷酸，更具体地，抗HBV反义寡核苷酸；短干扰RNA(siRNA)，更具体地，抗HBV siRNA；核酸内切酶调节剂；核糖核苷酸还原酶的抑制剂；乙型肝炎病毒E抗原抑制剂；靶向乙型肝炎病毒的表面抗原的HBV抗体；HBV抗体；CCR2趋化因子拮抗剂；胸腺素激动剂；细胞因子，如IL12；衣壳组装调节剂、核蛋白抑制剂(HBV核心或衣壳蛋白抑制剂)；核酸聚合物(NAP)；维甲酸诱导基因1的刺激物；NOD2的刺激物；重组胸腺素α-1；乙型肝炎病毒复制抑制剂；PI3K抑制剂；cccDNA抑制剂；免疫检验点抑制剂，如PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂、TIGIT抑制剂、Lag3抑制剂和CTLA-4抑制剂；表达于免疫细胞(更具体地，T细胞)上的共刺激受体(如CD27、CD28等)的激动剂；BTK抑制剂；用于治疗HBV的其他药物；IDO抑制剂；精氨酸酶抑制剂；和KDM5抑制剂。
本申请的组合物和免疫原性组合还可以与至少一种其他抗HBV剂联合给药。适合于与本申请一起使用的抗HBV剂的实例包括但不限于小分子、抗体和/或结合HBV env的CAR-T疗法(S-CAR细胞)、衣壳组装调节剂、TLR激动剂(如TLR7和/或TLR8激动剂)、cccDNA抑制剂、HBV聚合酶抑制剂(如恩替卡韦和替诺福韦)和/或免疫检验点抑制剂等。至少一种抗HBV剂例如可以从以下选择：HBV DNA聚合酶抑制剂；免疫调节剂；toll样受体7调节剂；toll样受体8调节剂；toll样受体3调节剂；干扰素α受体配体；透明质酸酶抑制剂；IL-10的调节剂；HBsAg抑制剂；toll样受体9调节剂；亲环蛋白抑制剂；HBV预防性疫苗；HBV治疗性疫苗；HBV病毒进入抑制剂；靶向病毒mRNA的反义寡核苷酸，更具体地，抗HBV反义寡核苷酸；短干扰RNA(siRNA)，更具体地，抗HBV siRNA；核酸内切酶调节剂；核糖核苷酸还原酶的抑制剂；乙型肝炎病毒E抗原抑制剂；靶向乙型肝炎病毒的表面抗原的HBV抗体；HBV抗体；CCR2趋化因子拮抗剂；胸腺素激动剂；细胞因子，如IL12；衣壳组装调节剂、核蛋白抑制剂(HBV核心或衣壳蛋白抑制剂)；核酸聚合物(NAP)；维甲酸诱导基因1的刺激物；NOD2的刺激物；重组胸腺素α-1；乙型肝炎病毒复制抑制剂；PI3K抑制剂；cccDNA抑制剂；免疫检验点抑制剂，如PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂、TIM-3抑制剂、TIGIT抑制剂、Lag3抑制剂和CTLA-4抑制剂；表达于免疫细胞(更具体地，T细胞)上的共刺激受体(如CD27、CD28等)的激动剂；BTK抑制剂；用于治疗HBV的其他药物；IDO抑制剂；精氨酸酶抑制剂；和KDM5抑制剂。这类抗HBV剂可以与本申请的组合物和免疫原性组合同时或顺序给药。
初免/加强免疫的方法
本申请的实施方案还考虑，在所谓的初免-加强方案中，向受试者给药免疫原性有效量的组合物或免疫原性组合，然后向相同的受试者给药另一剂量的免疫原性有效量的组合物或免疫原性组合。因此，在一实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合是用于引发(priming)免疫应答的初免疫苗。在另一实施方案中，本申请的组合物或免疫原性组合是用于加强(boosting)免疫应答的加强疫苗。本申请的初免和加强疫苗可以用于本文所述的本申请的方法。初免-加强(prime-boost)方案的一般概念是疫苗领域技术人员熟知的。本文所述的本申请的任何组合物和免疫原性组合可以用作初免和/或加强疫苗，用于引发和/或加强针对HBV的免疫应答。
在本申请的一些实施方案中，可以给药本申请的组合物或免疫原性组合，以用于引发免疫。可以再给药组合物或免疫原性组合，以用于加强免疫。若需要，可以任选地在方案中加入进一步的加强给药组合物或疫苗组合。本申请的组合物中可以存在佐剂以用于加强免疫，存在于分别的组合物中，来与本申请的组合物或免疫原性组合一起给药以加强免疫，或者其自身作为加强免疫给药。在方案中包括佐剂的那些实施方案中，佐剂优选用于加强免疫。
初免-加强方案的示例性且非限制性的实例包括向受试者给药单一剂量的免疫原性有效量的本申请的组合物或免疫原性组合以引发免疫应答，然后给药另一剂量的免疫原性有效量的本申请的组合物或免疫原性组合以加强免疫应答，其中初次给药的引发免疫后约2-6周、优选4周，首次给药加强免疫。任选地，初次给药引发免疫后约10-14周、优选12周，给药进一步加强免疫的组合物或免疫原性组合或其他佐剂。
试剂盒
本文还提供一种试剂盒，其包含本申请的免疫原性组合。试剂盒可以包含分别的组合物中的第一多核苷酸和第二多核苷酸，或者试剂盒可以包含单一组合物中的第一多核苷酸和第二多核苷酸。试剂盒还可以进一步包含一种或多种佐剂或免疫刺激剂和/或其他抗HBV剂。
在动物或人有机体内给药后诱导或刺激抗HBV免疫应答的能力可以使用本领域标准的各种测定法在体外或体内进行评估。对于评估免疫应答的出现和激活的可用技术的一般描述可以参见例如Coligan et al.(1992and 1994,Current Protocols inImmunology；ed.J Wiley&Sons Inc,National Institute of Health)。细胞免疫性的测量可以通过以下进行：测量活化的效应细胞分泌的细胞因子谱(profile)，包括源自CD4+和CD8+T细胞的那些(例如，通过ELISPOT定量产生IL-10或IFNγ的细胞)，确定免疫效应细胞的活化状态(例如，通过经典的[3H]胸苷吸收或基于流式细胞术的测定进行的T细胞增殖测定)，通过测定敏化的受试者中抗原特异性T淋巴细胞(如细胞毒性测定中的肽特异性裂解等)。
刺激细胞和/或体液应答的能力可以通过抗体结合和/或竞争性结合来确定(参见，例如Harlow,1989,Antibodies,Cold Spring Harbor Press)。例如，可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量响应于给药提供免疫原的组合物而产生的抗体的效价。免疫应答也可以通过中和抗体测定来测量，其中病毒的中和定义为通过特异性抗体对病毒的反应/抑制/中和而丧失的感染性。免疫应答还可以通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定来测量。
实施方案
实施方案，第1节
实施方案1包括一种分离或非天然存在的核酸分子，其包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14 100％相同；优选地，所述截短的HBV核心抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；更优选地，所述截短的HBV核心抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；进一步优选地，所述截短的HBV核心抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答；并且最优选地，所述截短的HBV核心抗原编码序列包含多核苷酸，其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同，例如与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:15 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
实施方案2包括实施方案1的非天然存在的核酸分子，其中所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。
实施方案3包括实施方案1或实施方案2的非天然存在的核酸分子，其还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至HBV聚合酶抗原的信号序列。
实施方案4包括实施方案3的非天然存在的核酸分子，其中所述信号序列包含SEQID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:18的多核苷酸序列编码。
实施方案5包括实施方案1-4中任一项的非天然存在的核酸分子，其中编码截短的核心HBV抗原的多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同。
实施方案6包括实施方案5的非天然存在的核酸分子，其中编码截短的核心HBV抗原的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列。
实施方案7包括一种非天然存在的核酸分子，其包含第一多核苷酸序列，其编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含氨基酸序列，所述HBV聚合酶抗原与SEQ ID NO:4至少98％相同，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。
实施方案8包括实施方案7的非天然存在的核酸分子，其中所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
实施方案9包括实施方案7的非天然存在的核酸分子，其中所述HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
实施方案10包括实施方案7-9中任一项的非天然存在的核酸分子，其还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至HBV聚合酶抗原的信号序列。
实施方案11包括实施方案10的非天然存在的核酸分子，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；优选地，所述信号由SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:18的多核苷酸序列编码。
实施方案12包括实施方案7-11中任一项的非天然存在的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同。
实施方案13包括实施方案12的非天然存在的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16的多核苷酸序列。
实施方案14包括实施方案7-13中任一项的非天然存在的核酸分子，其还包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。
实施方案15包括实施方案14的非天然存在的核酸分子，其中所述第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同。
实施方案16包括实施方案15的非天然存在的核酸分子，其中所述第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列。
实施方案17包括实施方案14-16中任一项的非天然存在的核酸分子，其编码融合蛋白，所述融合蛋白包含可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。
实施方案18包括实施方案17的非天然存在的核酸分子，其中所述融合蛋白包含通过接头可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。
实施方案19包括实施方案18的非天然存在的核酸分子，其中所述接头包含(AlaGly)n的氨基酸序列，并且n为2-5的整数；优选地，所述接头由包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列编码。
实施方案20包括实施方案19的非天然存在的核酸分子，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
实施方案21包括实施方案17-20中任一项的非天然存在的核酸分子，其中所述融合蛋白还包含信号序列；优选地，所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；更优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:18的多核苷酸序列编码。
实施方案22包括实施方案7-21中任一项的非天然存在的核酸分子，其还包含启动子序列、任选存在的一个或多个额外的调节序列；优选地，所述启动子序列包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:17的多核苷酸序列，并且所述额外的调节序列选自SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:23的增强子序列和SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:24的多腺苷酸化信号序列。
实施方案23包括实施方案7-22中任一项的非天然存在的核酸分子，其中所述非天然存在的核酸分子不编码选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
实施方案24包括一种载体，其包含实施方案1-24中任一项的非天然存在的核酸分子。
实施方案25包括实施方案24的载体，其中所述非天然存在的核酸分子从5’端至3’端包含，启动子序列、增强子序列、信号肽编码序列、第一多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列，任选地，所述非天然存在的核酸分子还包含第二多核苷酸序列。
实施方案26包括实施方案24或25的载体，其中所述载体为质粒DNA载体，并且所述质粒DNA载体还包含复制起点和抗生素抗性基因。
实施方案27包括实施方案26的载体，其中所述质粒DNA载体包含复制起点，其包含SEQ ID NO:10的多核苷酸序列；抗生素抗性基因，其包含SEQ ID NO:12的多核苷酸序列；启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；增强子序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列；和多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；以及任选存在的第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。
实施方案28包括实施方案24或25的载体，其中所述载体为腺病毒载体，优选Ad26或Ad35载体。
实施方案29包括实施方案28的载体，其中所述载体为Ad26载体，其包含实施方案1-6中任一项的非天然存在的核酸，其编码截短的核心HBV抗原。
实施方案30包括实施方案28的载体，其中所述载体为Ad26载体，其包含实施方案7-13中任一项的非天然存在的核酸，其编码HBV聚合酶抗原。
实施方案31包括实施方案28的载体，其中所述载体为Ad26载体，其包含实施方案17-21中任一项的非天然存在的核酸，其编码融合蛋白。
实施方案31a包括实施方案28-31中任一项的载体，其中所述腺病毒载体包含：启动子序列，其包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列；调节序列，其包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列；第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列；接头编码序列，其包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列；第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列；和多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:24的多核苷酸序列。
实施方案32包括实施方案1-32中任一项的非天然存在的核酸分子编码的非天然存在的多肽。
实施方案33包括一种宿主细胞，其包含实施方案1-23中任一项的非天然存在的核酸分子或者实施方案24-32中任一项的载体。
实施方案34包括一种组合物，其包含实施方案1-23中任一项的非天然存在的核酸分子、实施方案24-32中任一项的载体或者实施方案33的非天然存在的多肽，以及药学上可接受的载剂。
实施方案35包括实施方案34的组合物，其包含实施方案7-13中任一项的第一多核苷酸、实施方案14-16中任一项的第二多核苷酸以及药学上可接受的载剂，其中所述第一和第二多核苷酸不包含在相同的核酸分子中或相同的核酸载体中。
实施方案36包括实施方案35的组合物，其中所述第一和第二多核苷酸包含在两种分别的载体中，优选腺病毒载体，更优选Ad26载体。
实施方案37包括一种试剂盒，其包含：
(a)第一非天然存在的核酸分子，其包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原具有与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；
(b)第二非天然存在的核酸分子，其包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于相同的非天然存在的核酸分子中，或者存在于两种不同的非天然存在的核酸分子中。
实施方案38包括实施方案37的试剂盒，其中所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；并且更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8T细胞应答。
实施方案39包括实施方案37的试剂盒，其中所述HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
实施方案40包括实施方案37-39中任一项的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然的核酸分子中的至少一个还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码信号序列，所述信号序列可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原和所述截短的HBV核心抗原中的至少一个。
实施方案41包括实施方案40的试剂盒，其中所述信号序列独立地包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；优选地，所述信号序列独立地由SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:18的多核苷酸序列编码。
实施方案42包括实施方案37-41中任一项的试剂盒，其中所述第一多核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同。
实施方案43包括实施方案42的试剂盒，其中所述第一多核苷酸序列包含SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:16的多核苷酸序列。
实施方案44包括实施方案37-43中任一项的试剂盒，其中所述第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同。
实施方案45包括实施方案44的试剂盒，其中所述第二多核苷酸序列包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列。
实施方案46包括实施方案37-45中任一项的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然的核酸分子中的至少一个还包含启动子序列，任选存在的增强子序列，并且还任选包含多腺苷酸化信号序列；优选地，所述启动子序列具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:17的多核苷酸序列，所述增强子序列独立地具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:23的多核苷酸序列，并且所述多腺苷酸化信号序列独立地具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:24的多核苷酸序列。
实施方案47包括实施方案37-46中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒不包含编码选自以下的HBV抗原的核酸分子：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原；也不包含选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
实施方案48包括实施方案37-47中任一项的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于相同的载体中。
实施方案49包括实施方案48的试剂盒，其中所述载体编码所述HBV聚合酶抗原和所述截短的HBV核心抗原，作为两种分别的蛋白。
实施方案50包括实施方案49的试剂盒，其中所述载体编码融合蛋白，其包含截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原。
实施方案51包括实施方案50的试剂盒，其中所述融合蛋白包含截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原通过接头可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原。
实施方案52包括实施方案51的试剂盒，其中所述接头包含(AlaGly)n的氨基酸序列，其中n为2-5的整数；优选地，所述接头由包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列编码。
实施方案53包括实施方案52的试剂盒，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
实施方案54包括实施方案53的试剂盒，其中所述融合蛋白还包含信号序列；优选地，所述信号序列具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；更优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:18的多核苷酸序列编码。
实施方案55包括施方案54的试剂盒，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
实施方案56包括实施方案48-55中任一项的试剂盒，其中所述载体从5’端至3’端包含，启动子序列、增强子序列、信号肽编码序列、第二多核苷酸序列、接头编码序列、第一多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列。
实施方案57包括实施方案56的试剂盒，其中所述载体为腺病毒载体，优选Ad26或Ad35载体。
实施方案58包括实施方案57的试剂盒，其中所述腺病毒载体包含启动子序列，其包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列；调节序列，其包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列；第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列；接头编码序列，其包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列；第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列；和多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:24的多核苷酸序列。
实施方案59包括实施方案58的试剂盒，其中所述试剂盒不包含编码选自以下的HBV抗原的核酸分子：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原；也不包含选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
实施方案60包括实施方案37-59中任一项的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于两种不同的载体中。
实施方案61包括实施方案60的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子存在于第一质粒DNA载体中，而所述第二非天然存在的核酸分子存在于第二质粒DNA载体中。
实施方案62包括实施方案61的试剂盒，其中所述第一和第二质粒DNA载体各自包含复制起点、抗生素抗性基因，并且从5’端至3’端包含启动子序列、调节序列、信号肽编码序列、第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列。
实施方案63包括实施方案62的试剂盒，其中所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因，其具有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:12至少90％相同，优选与SEQID NO:12 100％相同。
实施方案64包括实施方案63的试剂盒，其包含
(a)第一质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；
第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；
(b)第二质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；
第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体各自还包含卡那霉素抗性基因和复制起点，所述卡那霉素抗性基因具有SEQ ID NO:12的多核苷酸序列，所述复制起点具有SEQ ID NO:10的多核苷酸序列，并且
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体处于相同组合物中或者两种不同的组合物中。
实施方案65包括实施方案60的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子存在于第一腺病毒载体中，优选Ad26载体；而所述第二非天然存在的核酸分子存在于第二腺病毒载体中，优选Ad26载体。
实施方案66包括实施方案65的试剂盒，其中所述第一和第二腺病毒载体各自从5’端至3’端包含，启动子序列、调节序列、信号肽编码序列、第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列。
实施方案67包括实施方案66的试剂盒，其包含
(a)第一Ad26载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列；
第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:24的多核苷酸序列；
(b)第二Ad26载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:17多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列；
第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:24的多核苷酸序列；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一Ad26载体和所述第二Ad26载体各自处于相同的组合物中或者两种不同的组合物中。
实施方案68包括实施方案64-67中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒不包含编码选自以下的HBV抗原的核酸分子：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原；也不包含选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
实施方案69包括实施方案34-36中任一项的组合物或者实施方案37-68中任一项的试剂盒，用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答；优选地，所述受试者患有慢性HBV感染。
实施方案70包括实施方案34-36中任一项的组合物或者实施方案37-68中任一项的试剂盒与另一免疫原性剂的组合，优选与另一HBV抗原的组合，用于在需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答；优选地，所述受试者患有慢性HBV感染。
实施方案71包括实施方案34-36中任一项的组合物或者实施方案37-68中任一项的试剂盒，用于治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(HBV)诱导的疾病；优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，并且所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
实施方案72包括实施方案34-36中任一项的组合物或者实施方案37-68中任一项的试剂盒与另一治疗剂的组合，优选与另一抗HBV剂的组合，用于治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(HBV)诱导的疾病；优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，并且所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
实施方案，第2节
实施方案1包括一种非天然存在的核酸分子，其包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少98％相同，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性。
实施方案2包括实施方案1的非天然存在的核酸分子，其中所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
实施方案3包括实施方案1的非天然存在的核酸分子，其中所述HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
实施方案4包括实施方案1-3中任一项的非天然存在的核酸分子，其还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码可操作地连接至HBV聚合酶抗原的信号序列。
实施方案5包括实施方案4的非天然存在的核酸分子，其中所述信号序列包含SEQID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:18的多核苷酸序列编码。
实施方案6包括实施方案1-5中任选一项的非天然存在的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同。
实施方案7包括实施方案6的非天然存在的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16的多核苷酸序列。
实施方案8包括实施方案1-7中任一项的非天然存在的核酸分子，其还包含第二多核苷酸序列，其编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:14的氨基酸序列组成。
实施方案9包括实施方案8的非天然存在的核酸分子，其中所述第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同。
实施方案10包括实施方案9的非天然存在的核酸分子，其中所述第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列。
实施方案11包括实施方案8-10中任一项的非天然存在的核酸分子，其编码融合蛋白，所述融合蛋白包含可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。
实施方案12包括实施方案11的非天然存在的核酸分子，其中所述融合蛋白包含通过接头可操作地连接至HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。
实施方案13包括实施方案12的非天然存在的核酸分子，其中所述接头包含(AlaGly)n的氨基酸序列，并且n为2-5的整数；优选地，所述接头由包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列编码。
实施方案14包括实施方案13的非天然存在的核酸分子，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
实施方案15包括实施方案11-14中任一项的非天然存在的核酸分子，其中所述融合蛋白还包含信号序列；优选地，所述信号序列包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；更优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:18的多核苷酸序列编码。
实施方案16包括实施方案1-15中任一项的非天然存在的核酸分子，其还包含启动子序列、任选存在的一个或多个额外的调节序列；优选地，所述启动子序列包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:17的多核苷酸序列，并且所述额外的调节序列选自SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:24的多腺苷酸化信号序列。
实施方案17包含实施方案1-16中任一项的非天然存在的核酸分子，其中所述非天然存在的核酸分子不编码选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
实施方案18包括一种载体，其包含实施方案1-17中任一项的非天然存在的核酸分子。
实施方案19包括实施方案18的载体，其中所述非天然存在的核酸分子从5’端至3’端包含，启动子序列、增强子序列、信号肽编码序列、第一多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列，任选地，所述非天然存在的核酸分子还包含第二多核苷酸序列。
实施方案20包括实施方案18或19的载体，其中所述载体为质粒DNA载体，并且所述质粒DNA载体还包含复制起点和抗生素抗性基因。
实施方案21包括实施方案20的载体，其中所述质粒DNA载体包含复制起点，其包含SEQ ID NO:10的多核苷酸序列；抗生素抗性基因，其包含SEQ ID NO:12的多核苷酸序列；启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；增强子序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列；和多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；以及任选存在的第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。
实施方案22包括实施方案18或19的载体，其中所述载体为腺病毒载体，优选Ad26或Ad35载体。
实施方案23包括实施方案22的载体，其中所述腺病毒载体包含启动子序列，其包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列；调节序列，其包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列；第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列；接头编码序列，其包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列；第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列；和多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:24的多核苷酸序列。
实施方案24包括实施方案1-17中任一项的非天然存在的核酸分子编码的非天然存在的多肽。
实施方案25包括一种宿主细胞，其包含实施方案1-17中任一项的非天然存在的核酸分子或实施方案18-23中任一项的载体。
实施方案26包括一种组合物，其包含实施方案1-17中任一项的非天然存在的核酸分子、实施方案18-23中任一项的载体或实施方案24的非天然存在的多肽，以及药学上可接受的载剂。
实施方案27包括实施方案26的组合物，其包含实施方案1-7中任一项的第一多核苷酸、实施方案8-10中任一项的第二多核苷酸，以及药学上可接受的载剂，其中所述第一和第二多核苷酸不包含在相同的核酸分子中或者相同的核酸载体中。
实施方案28包括一种试剂盒，其包含
(a)第一非天然存在的核酸分子，其包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原具有与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；
(b)第二非天然存在的核酸分子，其包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于相同的非天然存在的核酸分子中，或者存在于两种不同的非天然存在的核酸分子中。
实施方案29包括实施方案28的试剂盒，其中所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；并且更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8T细胞应答。
实施方案30包括实施方案29的试剂盒，其中所述HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
实施方案31包括实施方案28-30中任一项的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然的核酸分子中的至少一个还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码信号序列，所述信号序列可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原和所述截短的HBV核心抗原中的至少一个。
实施方案32包括实施方案31的试剂盒，其中所述信号序列独立地包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；优选地，所述信号序列独立地由SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:18的多核苷酸序列编码。
实施方案33包括实施方案28-32中任一项的试剂盒，其中所述第一多核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同。
实施方案34包括实施方案33的试剂盒，其中所述第一多核苷酸序列包含SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:16的多核苷酸序列。
实施方案35包括实施方案28-34中任一项的试剂盒，其中所述第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同。
实施方案36包括实施方案35的试剂盒，其中所述第二多核苷酸序列包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列。
实施方案37包括实施方案28-36中任一项的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然的核酸分子中的至少一个还包含启动子序列，任选存在的增强子序列，并且还任选包含多腺苷酸化信号序列；优选地，所述启动子序列具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:17的多核苷酸序列，所述增强子序列独立地具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:23的多核苷酸序列，并且所述多腺苷酸化信号序列独立地具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:24的多核苷酸序列。
实施方案38包括实施方案28-37中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒不包含编码选自以下的HBV抗原的核酸分子：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原；也不包含选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
实施方案39包括实施方案28-38中任一项的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于相同的载体中。
实施方案40包括实施方案39的试剂盒，其中所述载体编码所述HBV聚合酶抗原和所述截短的HBV核心抗原，作为两种分别的蛋白。
实施方案41包括实施方案39的试剂盒，其中所述载体编码融合蛋白，其包含可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。
实施方案42包括实施方案41的试剂盒，其中所述融合蛋白包含通过接头可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原的截短的HBV核心抗原。
实施方案43包括实施方案42的试剂盒，其中所述接头包含(AlaGly)n的氨基酸序列，其中n为2-5的整数；优选地，所述接头由SEQ ID NO:22的多核苷酸序列编码。
实施方案44包括实施方案43的试剂盒，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
实施方案45包括实施方案44的试剂盒，其中所述融合蛋白还包含信号序列；优选地，所述信号序列具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；更优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:18的多核苷酸序列编码。
实施方案46包括实施方案45的试剂盒，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
实施方案47包括实施方案41-46中任一项的试剂盒，其中所述载体从5’端至3’端包含，启动子序列、增强子序列、信号肽编码序列、第二多核苷酸序列、接头编码序列、第一多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列。
实施方案48包括实施方案47的试剂盒，其中所述载体为腺病毒载体，优选Ad26或Ad35载体。
实施方案49包括实施方案48的试剂盒，其中所述腺病毒载体包含启动子序列，其包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列；调节序列，其包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列；第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列；接头编码序列，其包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列；第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列；和多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:24的多核苷酸序列。
实施方案50包括实施方案49的试剂盒，其中所述试剂盒不包含编码选自以下的HBV抗原的核酸分子：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原；也不包含选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
实施方案51包括实施方案28-38中任一项的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于两种不同的载体中。
实施方案52包括实施方案51的试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子存在于第一质粒DNA载体中，而所述第二非天然存在的核酸分子存在于第二质粒DNA载体中。
实施方案53包括实施方案52的试剂盒，其中所述第一和第二质粒DNA载体各自包含复制起点、抗生素抗性基因，并且从5’端至3’端包含启动子序列、调节序列、信号肽编码序列、第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列。
实施方案54包括实施方案53的试剂盒，其中所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因，其具有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:12至少90％相同，优选与SEQID NO:12 100％相同。
实施方案55包括实施方案54的试剂盒，其包含
(a)第一质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；
第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；
(b)第二质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；
第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体各自还包含卡那霉素抗性基因和复制起点，所述卡那霉素抗性基因具有SEQ ID NO:12的多核苷酸序列，所述复制起点具有SEQ ID NO:10的多核苷酸序列，并且
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体处于相同组合物中或者两种不同的组合物中。
实施方案56包括实施方案55的试剂盒，其中所述试剂盒不包含编码选自以下的HBV抗原的核酸分子：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原；也不包含选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
实施方案57包括实施方案26的组合物或实施方案27-55中任一项的试剂盒，用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答；优选地，所述受试者患有慢性HBV感染。
实施方案58包括实施方案26的组合物或者实施方案27-55中任一项的试剂盒与另一免疫原性剂的组合，优选与另一HBV抗原的组合，用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答；优选地，所述受试者患有慢性HBV感染。
实施方案59包括实施方案26或27的组合物或者实施方案28-56中任一项的试剂盒，用于治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(HBV)诱导的疾病；优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，并且所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
实施方案60包括实施方案26或27的组合物或者实施方案28-56中任一项的试剂盒与另一治疗剂的组合，优选与另一抗HBV剂的组合，用于治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(HBV)诱导的疾病；优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，并且所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
实施例
本申请的以下实施例用于进一步说明本申请的性质。应当理解，以下实施例并不限制本申请，并且本申请的范围由所附权利要求书确定。
实施例1：HBV核心和Pol抗原序列的产生和质粒优化
据认为肝炎核心蛋白上的T细胞表位对消除乙型肝炎感染很重要，并且乙型肝炎病毒蛋白(如聚合酶)可能有助于提高应答的广度。因此，选择乙型肝炎核心蛋白和聚合酶蛋白作为抗原，用于设计治疗性乙型肝炎病毒(HBV)疫苗。
HBV核心和聚合酶抗原共有序列的衍生
HBV pol和核心抗原共有序列基于HBV基因型B、C和D产生。从不同来源获得不同HBV序列，并分别对核心和聚合酶蛋白进行比对。随后将所有亚型(A-H)的原始序列比对限于HBV基因型B、C和D。为每种亚型分别和所有联合(joint)BCD序列中的每种蛋白进行比对来定义共有序列。在可变比对位置，共有序列中使用频率最高的氨基酸。
HBV核心抗原的优化
通过缺失天然病毒蛋白来优化HBV核心抗原共有序列。具体地，缺失对应于C端高度带正电区段的34个氨基酸，这是前基因组RNA封装所必需的。
HBV
Pol抗原的优化
通过改变4个残基以消除逆转录酶和RNAseH酶促活性来优化HBV pol抗原共有序列。具体地，将逆转录酶结构域的“YXDD”基序中的天冬氨酸残基(D)变为天冬酰胺残基(N)，以消除任何配位功能，从而消除核苷酸/金属离子结合。此外，在RNaseH结构域的“DEDD”基序中，将第一个天冬氨酸残基(D)变为天冬酰胺残基(N)，并且将第一个谷氨酸残基(E)变为谷氨酰胺残基(A)，以消除Mg2+配位。此外，对HBV pol抗原的序列进行密码子优化，以扰乱包膜蛋白的内部开放阅读框，包括S蛋白以及具有N末端延伸的S蛋白pre-S1和pre-S2。结果，去除了包膜蛋白(pre-S1、pre-S2和S蛋白)和X蛋白的开放阅读框。
HBV核心和Pol抗原表达策略的优化
测试了三种不同的策略，以从质粒载体获得核心和pol抗原的最大和相等表达：(1)将HBV核心和pol抗原在框架内融合，并在编码序列之间插入小的AGAG以产生单一的Core-Pol融合蛋白(图2A)；(2)通过核糖体滑动位点(特别是口蹄疫(FMDV)的FA2滑动位点)从一个质粒表达核心和pol抗原，以产生双顺反子表达载体，其从单一的mRNA表达单独的核心和pol抗原(图2B)；以及(3)两个分别的质粒，其分别编码HBV核心和pol抗原(图2C)。
体外表达分析
将上述三种表达策略中的每种的共有HBV核心和pol抗原的编码序列克隆到市售表达质粒pcDNA3.1中。用载体转染HEK-293T细胞，并使用HBV核心特异性抗原通过蛋白印迹评估蛋白表达。
转录后调节元件的优化
通过稳定初级转录物，促进其核输出，和/或改善转录-翻译偶联，评估4种不同的转录后调节元件对蛋白表达的增强：(1)土拨鼠HBV转录后调节元件(WPRE)(GenBank:J04514.1)；(2)衍生自人载脂蛋白A1前体的内含子/外显子序列(GenBank:X01038.1)；(3)人T细胞1型白血病病毒(HTLV-1)长末端重复(LTR)的未翻译R-U5结构域(GenBank:KM023768.1)；和(4)HTLV-1LTR、合成兔β-球蛋白内含子(GenBank:V00882.1)和剪接增强子的复合序列(三重复合序列)。在质粒中的CMV启动子和HBV抗原编码序列之间引入增强子序列。在存在和不存在WPRE元件(图2D)下，从质粒中表达时，通过蛋白印迹没有观察到核心抗原表达的显著的差异。然而，当通过蛋白印迹评估具有其他3个转录后调节序列的质粒的HEK293T转染细胞中的核心抗原表达时，三重增强子序列造成最强的核心抗原表达(图2E)。
有效蛋白分泌的信号肽的选择
对HBV核心抗原的N末端框架内引入的3种不同信号肽进行评估：(1)Ig重链γ信号肽SPIgG(BAA75024.1)；(2)Ig重链ε信号肽SPIgE(AAB59424.1)；和(3)Cystatin S前体信号肽SPCS(NP_0018901.1)。使用Signal P预测程序在计算机上(in silico)优化信号肽切割位点以进行核心融合。通过分析上清中的核心蛋白水平来确定分泌效率。使用在N末端融合的3种不同信号肽进行核心抗原分泌的蛋白印迹分析表明，Cystatin S信号肽造成最有效的蛋白分泌(图2F)。
DNA疫苗载体优化
将优化的表达盒克隆入DNA疫苗载体pVax-1中(Life Technologies,ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)，所述表达盒在具有N末端Cystatin S信号肽序列的HBV抗原编码序列的上游包含三重复合增强子序列。pVax-1中的表达盒包含人CMV-IE启动子，其后是牛生长激素(BGH)衍生的多腺苷酸化序列(pA)。细菌性繁殖由pUC ori复制子驱动，并且卡那霉素抗性基因(Kan R)由小真核启动子驱动。pUC ori复制、KanR表达盒和由CMV-IE启动子驱动的表达盒都在质粒骨架内处于相同的方向。然而，与在pcDNA3.1载体中观察到的表达水平相比，在pVax-1载体中观察到核心抗原表达的明显降低。
采用几种策略来改善蛋白表达：(1)将整个pUCori-KanR盒逆转为逆时针方向(pVD-core)；和(2)改变KanR基因的密码子使用，并用来自pcDNA3.1载体的Amp启动子代替Kan启动子(pDK-core)。两种策略都恢复核心抗原的表达，但使用pDK载体时核心抗原表达最高，pDK载体包含经密码子调整的Kan R基因、AmpR启动子(代替KanR启动子)和pUCori-KanR盒的反向定向。将图2G中所示的4种不同HBV核心/pol抗原优化的表达盒导入pDK质粒骨架，以测试图2A-2C中所示的3种表达策略的每一种。使用核心和pol特异性抗体，通过蛋白印迹分析，在体外检测这些质粒的核心和pol抗原表达。当核心和pol抗原由分别的载体(即，单独的DNA载体pDK-core和pDK-pol)(图2H)编码时，获得细胞的和分泌的核心和pol抗原最一致的表达谱。pDK-pol和pDK-core载体的示意图分别示于图3A和图3B。
实施例2：表达融合的截短的HBV核心抗原和HBV Pol抗原的腺病毒载体的产生
腺病毒载体的创建设计为从单一的开放阅读框表达的融合蛋白。还可以设想用于表达两种蛋白的额外构型，例如，使用两个分别的表达盒，或使用2A样序列来分开两个序列。
腺病毒载体的表达盒的设计
表达盒(示意于图8A和图8B)包含CMV启动子(SEQ ID NO:17)、内含子(SEQ ID NO:23)(衍生自人ApoAI基因的片段-GenBank登录号X01038的295–523碱基对，带有ApoAI第二内含子)，然后是优化的编码序列–单独的核心或者核心和聚合酶融合蛋白，其前面是人免疫球蛋白分泌信号编码序列(SEQ ID NO:18)，然后是SV40多腺苷酸化信号(SEQ ID NO:24)。
包括分泌信号是因为过去的经验表明，某些带有分泌的转基因的腺病毒载体的可制造性得到改善，而没有影响引发的T细胞应答(小鼠实验)。
核心蛋白的最后两个残基(VV)和聚合酶蛋白的前两个残基(MP)如果融合导致连接序列(VVMP)，其存在于人多巴胺受体蛋白(D3亚型)，以及侧翼的同源性。
在核心和聚合酶序列之间插入AGAG接头消除这种同源性，并且在人蛋白质组的Blast中没有进一步的命中。
实施例3：小鼠中DNA疫苗的体内免疫原性研究
在小鼠中测试免疫治疗性DNA疫苗，其包含编码HBV核心抗原或HBV聚合酶抗原的DNA质粒。研究的目的是意图检测，通过电穿孔肌内递送入BALB/c小鼠后，疫苗诱导的T细胞应答。最初的免疫原性研究侧重于确定引入的HBV抗原会引起的细胞免疫应答。
具体地，测试的质粒包括pDK-Pol质粒和pDK-Core质粒，分别如图3A和3B所示，并且如以上实施例1所述。pDK-Pol质粒编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的聚合酶抗原，而pDK-Core质粒编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核心抗原。首先，测试每个质粒各自诱导的T细胞应答。使用市售的TriGridTM肌内递送系统(TDS-IM)，通过电穿孔将DNA质粒(pDNA)疫苗肌内递送至Balb/c小鼠，该系统适用于颅骨胫骨的小鼠模型中。关于通过电穿孔将DNA肌内递送至小鼠的方法和装置的其他描述，参见国际专利申请公开WO2017172838以及与本申请同一天提交的美国专利申请(题为“递送乙型肝炎病毒(HBV)疫苗的方法和装置”，代理人案号688097-405U1)，这些公开整体援引加入本文。具体地，将TDS-IM v1.0装置的TDS-IM阵列经皮插入选定的肌肉中，所述装置具有电极阵列，电极间距为2.5mm，电极直径为0.030英寸，导电长度为3.2mm，有效穿透深度为3.2mm，并且电极的菱形配置的主轴与肌肉纤维的方向平行。插入电极后，开始注射以在肌肉中分布DNA(如0.020ml)。IM注射完成后，局部施加250V/cm的电场(施加的电压为59.4-65.6V，施加的电流极限小于4A，0.16A/秒)，总持续时间约为400ms，6个总脉冲的10％占空比(即，在约400ms持续时间内总共主动施加约40ms的电压)。电穿孔程序完成后，将TriGridTM阵列移走并使动物恢复。如表1所总结，对BALB/c小鼠进行了高剂量(20μg)给药。6只小鼠给药编码HBV核心抗原的质粒DNA(pDK-core；第1组)，6只小鼠给药编码HBV pol抗原的质粒DNA(pDK-pol；第2组)，并且2只小鼠接受空载体作为阴性对照。动物间隔两周接受两次DNA免疫接种，并且最后一次免疫接种后一周收集脾细胞。
表1:小鼠免疫接种实验设计的初步研究
CT，颅骨胫骨肌肉；EP，电穿孔。
通过IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)分析和定量抗原特异性应答。在这个测定中，将免疫的动物分离的脾细胞与覆盖Core蛋白、Pol蛋白或小肽前导和连接序列(每种肽2μg/ml)的肽池(pool)一起孵育过夜。这些池由重叠11个残基的15元(mer)肽组成，所述11个残基与Core和Pol疫苗载体的基因型BCD共有序列匹配。94kDa的大HBV Pol蛋白在中间分裂成两个肽池。用同源肽池刺激抗原特异性T细胞，并使用ELISPOT测定评估IFN-γ阳性T细胞。通过恰当的抗体以及随后显色检测为微孔板上的有色斑点(称为斑点形成细胞(SFC))来观察单个抗原特异性T细胞的IFN-γ释放。
在用DNA疫苗质粒pDK-Core免疫的小鼠(第1组)中，获得了针对HBV Core的明显T细胞应答，达到1,000个SFC/106个细胞(图4)。针对Pol 1肽池的Pol T细胞应答是强烈的(～1,000个SFC/106个细胞)。弱的Pol-2定向的抗Pol细胞应答可能是由于小鼠中MHC多样性有限，一种称为T细胞免疫优势的现象，定义为对一种抗原的不同表位的不平等识别。进行确认性研究，确认这项研究中获得的结果(数据未显示)。
上述结果表明，用编码HBV抗原的DNA质粒疫苗进行疫苗接种诱导针对给药的HBV抗原的细胞免疫应答。
实施例4：pDK-Core/pDK-Pol质粒组合在小鼠中的剂量发现研究
这项使用组合质粒的剂量发现研究的目的是评估，使用不同DNA剂量，将编码HBV核心和pol抗原的DNA质粒(pDNA)载体的混合物施用于一个部位在小鼠中的免疫应答。在这项研究中，在小鼠中测试免疫治疗性DNA疫苗，其包含实施例1中所述的pDK-pol和pDK-core质粒两种质粒的1:1(w/v)混合物。如实施例3中所述，通过电穿孔将DNA疫苗肌内递送到Balb/c小鼠的一个解剖学部位。如表2所总结，将组合的表达Core和表达Pol的质粒以每个部位每种质粒10μg、1μg和0.1μg的DNA进行疫苗接种。每组测试8只小鼠，并向2只小鼠给药空载体作为阴性对照。动物间隔三周接受两次DNA免疫接种，最后一次免疫接种后一周收集脾细胞。
表2:组合质粒剂量发现研究的小鼠免疫接种实验设计
pDNA，质粒DNA；CT，颅骨胫骨肌肉；EP，电穿孔。
如实施例1所述，通过IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)分析和定量抗原特异性应答。在用由质粒pDK-Core和pDK-Pol组成的组合DNA疫苗免疫的BALB/c小鼠中，获得针对Core和Pol的可观的T细胞应答(图5)。在用10μg每种质粒免疫的第1组和仅用1μg每种质粒免疫的第2组之间，免疫应答的强度没有统计学差异。这个结果表明，T细胞应答在表达Core抗原的质粒和表达Pol抗原的质粒约1μg时达到最大水平。然而，在低10倍的DNA暴露下，即每种质粒0.1μg，观察到SFC明显减少。针对Pol 1肽池的Pol T细胞应答占主导。弱的Pol-2定向的抗Pol细胞应答可能是由于近交小鼠中MHC多样性有限，一种称为T细胞免疫优势的现象，定义为对一种抗原的不同表位的不平等识别。
以上结果表明，在用表达HBV核心和pol抗原的DNA质粒的组合免疫的小鼠中，在每种质粒1μg的剂量下，发现可观的T细胞应答，在0.1μg/质粒的剂量下，仍观察到一些免疫应答。
实施例5：在小鼠中的免疫干扰研究
出于实际原因，期望将HBV核心和pol抗原DNA疫苗的组合开发为组合(混合)载体制剂。但是，多价疫苗可能会产生免疫优势，并且针对次优势(sub-dominant)抗原的免疫应答可能会钝化。因此，评估了免疫干扰，即与任一载体在不同解剖学部位的免疫接种相比，给药两种表达抗原的质粒混合在一起的组合而降低的Core-特异性细胞应答和/或Pol-特异性细胞应答。
如实施例3中所述，通过电穿孔，用pDK-core和/或pDK-pol DNA质粒肌内为Balb/c小鼠接种疫苗。如表3所总结，以5μg/部位的剂量给药DNA质粒(pDNA)，单独或者在一个部位组合(混合)给药，或者在分别的部位组合给药。动物间隔三周接受两次DNA免疫接种，最后一次免疫接种后一周收集脾细胞。
表3：免疫干扰研究的小鼠免疫接种实验设计
CT，颅骨胫骨肌肉。
如实施例1所述，通过IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)分析和定量抗原特异性应答。在这个实验中，于BALB/c小鼠中证实了强烈的Core-特异性和Pol-特异性抗原应答(图6)。基于第3组(其中两种质粒混合并施用于相同部位)和第4组(其中在两个不同部位单独电穿孔表达核心和pol抗原的pDNA)获得的基本相同的T细胞应答，未观察到显著的免疫干扰。第1组中的一只动物表现出低的异常Pol-2-池定向的应答。在C57/Bl6小鼠中重复相同的实验，获得相当的结果。
上述结果表明，当将两种HBV抗原表达质粒pDK-Core和pDK-Pol组合时，基本上没有观察到免疫干扰。
实施例6：DNA疫苗在非人灵长类中的效力评估
这项研究的目的是评估通过电穿孔肌内递送的治疗性HBV DNA疫苗的效力，并诱导和测量食蟹猴(Macaca fascicularis)中的HBV特异性T细胞应答/细胞活化。
疫苗
这项研究中使用的疫苗是分别编码HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原的两种分别的DNA质粒的组合。具体地，DNA质粒是pDK-Pol质粒(编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原)和pDK-Core质粒(编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HBV核心抗原)，分别如图3A和图3B所示，并如实施例1所述。
DNA质粒以两种质粒的1:1(w/w)混合物给药，在一个解剖学部位递送。将非人灵长类(NHP)用适用于NHP模型的TriGridTM肌内递送系统(TDS-IM)电穿孔。参见国际专利申请公开WO2017172838以及与本申请同一天提交的美国专利申请(题为“递送乙型肝炎病毒(HBV)疫苗的方法和装置”，代理人案号688097-405U1)关于通过电穿孔将DNA肌内递送至NHP的方法和装置的其他描述，这些公开整体援引加入本文。具体地，将具有电极阵列的TDS-IMv1.0或TDS-IM v2.0的TDS-IM阵列经皮插入选定的肌肉中，所述电极阵列在电极之间具有6.0mm的间距并且电极直径分别为0.021或0.023英寸，电极的菱形配置的主轴与肌肉纤维的方向平行。对于TDS-IM v1.0或TDS-IM v2.0，导电长度为5.0mm，而对于TDS-IM v1.0有效穿透深度为15.5mm，对于TDS-IM v2.0为9.0mm。插入电极后，开始注射以在肌肉中分布DNA(如1.0ml)。IM注射完成后，局部施加250V/cm的电场(施加的电压为142.4-157.6V，施加的电流极限为0.6-4A，0.16A/秒)，总持续时间约为400ms，6个总脉冲的10％占空比(即，在约400ms持续时间内总共主动施加约40ms的电压)。电穿孔程序完成后，将TriGridTM阵列移走并使动物恢复。最初的免疫原性研究侧重于确定引入的HBV抗原会引起的细胞免疫应答。
非人灵长类
食蟹猕猴(n＝30)来自中国(Covance Research Products Inc.USA)，在研究开始时年龄为2.5-5岁，体重为3.0-5.0kg。根据兽医指南和National Research Council,Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals,8th Edition,Washington DC:NationalAcademies Press(2011)，将它们安置在富足的环境中。在开始研究之前，使动物适应2周。在每次质粒电穿孔给药之前，用氯胺酮麻醉猴子。每次免疫接种后2周，在含有肝素钠的小瓶中收集血液。使用ficoll梯度分离PBMC，并将其储存在液氮罐中直至分析。
非人灵长类中的肌内/电穿孔给药
如表4所总结，在第0、36和62天进行3次(第1组)质粒给药。通过电穿孔给药pDK-Core(1.0mg)和pDK-Pol(1.0mg)，递送系统设置为四头肌(股外侧肌)中的注射深度为19mm(短)。对于每次注射，向另一条腿部肌肉给药。含有DNA质粒的注射器装有适合NHP四头肌的注射深度限制器，用于向肌肉注射约10mm的目标深度，菱形配置的长轴与肌肉纤维的方向平行。IM注射完成后，立即激活电穿孔设备，造成对肌肉每厘米电极间距最高250V的振幅的电刺激，在400mS的间隔内总共进行最高40mS的持续时间。在第0、14、50和76天收集样品，并通过ELISPOT和细胞内细胞因子染色进行分析。
表4：NHP疫苗接种实验设计
ELISPOT分析
使用灵长类IFN-γELISpot试剂盒(R&D Systems,USA,Cat No.EL961)，通过IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)，分析和定量抗原特异性应答。在该试验中，将免疫的动物分离的PBMC在一式三份的孔中与覆盖Core蛋白和Pol蛋白的肽池(2μg/ml)一起孵育过夜。这些池由重叠11个残基的15元(mer)肽组成，所述11个残基与Core和Pol疫苗载体的基因型ABCD共有序列匹配。这些肽以90％的纯度(JPT,Germany)合成。94kDa的大HBV Pol蛋白在中间分裂为两个肽池。通过适当的抗体以及随后显色检测为微孔板上的有色斑点(称为斑点形成细胞(SFC))来观察单个抗原特异性T细胞的IFN-γ释放。结果示于图7A。
细胞内细胞因子染色(ICS)
细胞内细胞因子染色(ICS)用于研究疫苗诱导的T细胞应答。将冷冻的PBMC解冻，并在10％FBS，RPMI培养基中休息过夜，然后在10％FBS，RPMI培养基中用与疫苗-插入物匹配的Core、Pol-1或Pol-2肽池(2ug/μl)、DMSO或白细胞活化鸡尾酒(Leukocyte Activationcocktail)刺激达6小时，所述培养基含有Golgiplug蛋白转运抑制剂(1ug/μl)。将刺激的细胞用可固定的成活力染料eFluor 780(65-0865-14,eBioscience)染色，并用固定/通透溶液(554714,BD Biosciences)处理20分钟，然后用如下表5所示的细胞内染色混合物染色30分钟。使用具有适当的单色补偿对照的Fortessa流式细胞仪和来获取染色的细胞。应答强度报告为刺激后表达IFN-γ，TNF-α或IL-2的CD4+或CD8+T细胞的百分比。结果示于图7B。
表5：用于细胞内细胞因子染色测定的抗体组
BD Biosciences
结果
ELISPOT数据(图7A)显示两次免疫接种后强烈的Core和Pol-2应答。第三免疫接种大大提高了IFN-γ的强度。Pol-1肽池引起的中等应答通过第三免疫接种也得到改善，尽管没有Core和Pol-2那样大。第76天的数据仅包含来自4个NHP的结果，因为未能成功从第5只猴子抽取血液。各组之间的高度差异是由于NHP源自远交群(outbred stock)，而遗传多样性可以解释不同的免疫应答。
ICS测定数据(图7B)显示，来自HBV肽刺激的细胞因子应答是CD8驱动的，并且对Core和Pol-2肽池具有特异性，如先前使用ELISPOT所观察到的。ICS测定中应答的NHP为ELISPOT测定中应答的相同个体。尽管一些个别的ICS应答未如在ELISPOT数据中看到的那样显示阳性，但这可能归因于ELISPOT测定较高的灵敏度。
结论
以上结果表明，在通过电穿孔肌内注射pDK-Core和pDK-Pol疫苗的组合进行免疫的NHP中，每种质粒1.0mg的剂量就观察到可观的T细胞应答，两次免疫接种后检测到肽特异性应答，在3次免疫接种后有甚至更大的应答。在第76天，ELISPOT测定结果表明，肽池Core、Pol-1和Pol-2在每只测试的NHP(4/5NHP)中均诱导阳性IFN-γT细胞应答。对来自免疫的NHP的PBMC的ICS测定显示，HBV肽特异性应答是CD8驱动的，针对Core和Pol-2肽池的应答最高。
实施例7：DNA疫苗在人受试者中的效力评估
在人受试者中评估通过电穿孔肌内递送的治疗性HBV DNA疫苗的效力。
人受试者
人受试者是患有慢性HBV感染的成年患者，其是HBsAg阳性的。人受试者正接受HBV聚合酶抑制剂(恩替卡韦或替诺福韦)治疗。
疫苗
向人患者给药分别编码HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原的两种分别的DNA质粒的组合。具体地，DNA质粒是pDK-Pol质粒(编码具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原)和pDK-Core质粒(编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HBV核心抗原)，分别如图3A和图3B所示，并且如实施例1所述。根据随机、安慰剂对照递增剂量试验，以两种质粒的1:1混合物，以不同剂量给药DNA质粒，具体地，总质粒的剂量为0.25mg、1mg和6mg。
人受试者中的肌内/电穿孔给药
使用适合用于人的TriGridTM肌内递送系统(TDS-IM)，通过2-3次肌内免疫接种，经由电穿孔，将DNA质粒给药于人受试者。一些患者接受安慰剂(即，缺乏HBV抗原编码序列的质粒)作为对照。适用于人的TriGridTM肌内递送系统(TDS-IM)用于通过电穿孔递送质粒DNA。参见国际专利申请公开WO2017172838以及与本申请同一天提交的美国专利申请(题为“递送乙型肝炎病毒(HBV)疫苗的方法和装置”，代理人案号688097-405U1)关于通过电穿孔将DNA肌内递送至人的方法和装置的其他描述，这些公开整体援引加入本文。例如，可以将具有电极阵列的TDS-IM v2.0的TDS-IM阵列经皮插入选定的肌肉中，所述电极阵列在电极之间具有6.0mm的间距并且电极直径为0.023英寸，电极的菱形配置的主轴与肌肉纤维的方向平行。导电长度可以为5.0mm，而有效穿透深度可以为19mm。插入电极后，开始注射以在肌肉中分布DNA(如1.0ml)。IM注射完成后，局部施加250V/cm的电场(施加的电压为142.4-157.6V，施加的电流极限为0.6-4A，0.16A/秒)，总持续时间约为400ms，6个总脉冲的10％占空比(即，在约400ms持续时间内总共主动施加约40ms的电压)。电穿孔程序完成后，将TriGridTM阵列移走并使人受试者恢复。
在免疫接种后的各个时间点从患者收集血液样品。免疫接种后3-6个月，在患者中评估免疫接种后HBsAg水平的发展，特别是与临床血清学转换演变一致的水平。免疫接种后6-12个月，在患者中评估HBsAg的持续丧失和临床疾病(如肝硬化、肝细胞癌)的减少。
实施例8：小鼠中腺病毒载体的体内免疫原性研究
在小鼠中测试了包含编码HBV核心抗原或HBV聚合酶抗原的腺病毒载体的免疫治疗性疫苗。本研究的目的是检测肌内递送入F1小鼠(C57BL/6x Balb/C)后疫苗诱导的T细胞应答。最初的免疫原性研究侧重于确定引入的HBV抗原会引起的细胞免疫应答。具体地，测试的腺病毒载体包含如图8A和图8B所示的表达盒。
体内免疫原性研究
为评估腺病毒疫苗的体内免疫原性，向F1小鼠肌内给药HBV腺病毒载体。这些免疫原性研究侧重于确定由HBV抗原核心和聚合酶引起的细胞免疫应答。向F1小鼠的给药如表6所总结。动物接受一种HBV腺病毒载体免疫接种。9周后收集脾细胞。
表6：用腺病毒载体对小鼠免疫接种的实验设计
IM：肌内；vp：病毒颗粒；
HBV腺病毒载体的免疫原性的评估
通过IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)分析和定量抗原特异性应答。在这个测定中，将免疫的动物分离的脾细胞与覆盖Core和Pol蛋白的肽池(每种肽2μg/ml)一起孵育。这些池由重叠11个残基的15元(mer)肽组成，所述11个残基与Core和Pol腺病毒载体的基因型ABCD共有序列匹配。94kDa的大HBV Pol蛋白在中间分裂为两个肽池。在ELISPOT中，通过恰当的抗体以及随后显色检测为微孔板上的有色斑点(称为斑点形成细胞(SFC))来观察单个抗原特异性T细胞的IFN-γ释放。
结果示于图9。从结果可以看出，HBV腺病毒载体，特别是Core Pol融合和Core腺病毒载体的组合引起Core和Pol特异性T细胞应答。这些数据表明，编码HBV核心和pol抗原的腺病毒载体在F1小鼠中产生针对核心和pol的稳健的(robust)T细胞应答。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且可以对上述实施方案进行改变而不脱离本发明的广泛发明构思。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，而是旨在涵盖由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的修改。
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Claims (25)
1.一种组合物，其包含：
(a)第一非天然存在的核酸分子，其包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原具有与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；
(b)第二非天然存在的核酸分子，其包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少95％相同的氨基酸序列组成；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于相同的非天然存在的核酸分子中，或者存在于两种不同的非天然存在的核酸分子中。
2.一种试剂盒，其包含：
(a)第一非天然存在的核酸分子，其包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原具有与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；
(b)第二非天然存在的核酸分子，其包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同的氨基酸序列组成；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于相同的非天然存在的核酸分子中，或者存在于两种不同的非天然存在的核酸分子中。
3.权利要求1或2的组合物或试剂盒，其中
所述第一多核苷酸编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列；并且
所述第二多核苷酸编码HBV核心抗原，所述HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。
4.权利要求1或2的组合物或试剂盒，其中
所述第一多核苷酸编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
5.权利要求1-4中任一项的组合物或试剂盒，其中
所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子中的至少一个还包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码信号序列，所述信号序列可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原和所述截短的HBV核心抗原中的至少一个。
6.权利要求5的组合物或试剂盒，其中
所述信号序列独立地包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，
优选地，所述信号序列由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:18的多核苷酸序列编码。
7.权利要求1-6中任一项的组合物或试剂盒，其中
所述第一多核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同。
8.权利要求7的组合物或试剂盒，其中
所述第一多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16的多核苷酸序列。
9.权利要求1-8中任一项的组合物或试剂盒，其中
所述第二多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同。
10.权利要求9的组合物或试剂盒，其中
所述第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的组合物或试剂盒，其中
所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于相同的载体中。
12.权利要求11的组合物或试剂盒，其中
所述载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含所述截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原，任选地通过接头连接。
13.权利要求12的组合物或试剂盒，其中
所述融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
14.权利要求12或13的组合物或试剂盒，其中
所述载体，从5’端至3’端包含，启动子序列、增强子序列、信号肽编码序列、第二多核苷酸序列、接头编码序列、第一多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列。
15.权利要求14的组合物或试剂盒，其中
所述载体为腺病毒载体，优选Ad26或Ad35载体。
16.权利要求15的组合物或试剂盒，其中
所述腺病毒载体包含
启动子序列，其包含SEQ ID NO:17的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列；
第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列；
接头编码序列，其包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列；
第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列；以及
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:24的多核苷酸序列。
17.权利要求1-10中任一项的组合物或试剂盒，其中
所述第一非天然存在的核酸分子和所述第二非天然存在的核酸分子存在于两种不同的载体中。
18.权利要求17的组合物或试剂盒，其中
所述第一非天然存在的核酸分子存在于第一质粒DNA载体中，并且
所述第二非天然存在的核酸分子存在于第二质粒DNA载体中。
19.权利要求18的组合物或试剂盒，其中
所述第一质粒DNA载体和第二质粒DNA载体各自包含复制起点、抗生素抗性基因，并且从5’端至3’端各自包含，启动子序列、调节序列、信号肽编码序列、第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列。
20.权利要求19的组合物或试剂盒，其中
所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因，其具有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:12至少90％相同，优选与SEQ ID NO:12 100％相同。
21.权利要求20的组合物或试剂盒，其包含
(a)第一质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；
第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；
(b)第二质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含，
启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列；
调节序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列；
信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；
第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；以及
(c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体各自还包含卡那霉素抗性基因和复制起点，所述卡那霉素抗性基因具有SEQ ID NO:12的多核苷酸序列，所述复制起点具有SEQ ID NO:10的多核苷酸序列，并且
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体处于相同组合物中或者两种不同的组合物中。
22.权利要求1-21中任一项的组合物或试剂盒，用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒的免疫应答，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染。
23.权利要求1-21中任一项的组合物或试剂盒，用于治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(HBV)诱导的疾病，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，并且所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
24.一种非天然存在的核酸分子，其包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性，其中所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答，优选地所述HBV聚合酶抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答，并且更优选地，所述HBV聚合酶抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答；任选地，所述非天然存在的核酸分子还包含第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码截短的HBV核心抗原，所述HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。
25.权利要求24的非天然存在的核酸分子，其编码融合蛋白，所述融合蛋白包含截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原可操作地连接至所述HBV聚合酶抗原，任选地通过接头连接。
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